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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
GABRIELA TRENTIN SCORTEGAGNA
Análise da expressão de genes relacionados a células T
reguladoras, Th17, Th1 e Th2 em pacientes com doenças
autoimunes submetidos ao transplante autólogo de células tronco
hematopoiéticas
Ribeirão Preto
2010
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GABRIELA TRENTIN SCORTEGAGNA
Análise da expressão de genes relacionados a células T
reguladoras, Th17, Th1 e Th2 em pacientes com doenças
autoimunes submetidos ao transplante autólogo de células tronco
hematopoiéticas
Orientador: Prof. Dr. Júlio César Voltarelli
Ribeirão Preto
2010
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Imunologia Básica e
Aplicada da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto – Universidade de São
Paulo para obtenção do Título de Mestre
em Ciências
Área de Concentração: Imunologia Básica
e Aplicada
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Scortegagna, Gabriela Trentin
Análise da expressão de genes relacionados a células T
reguladoras, Th17, Th1 e Th2 em pacientes com doenças
autoimunes submetidos ao transplante autólogo de células tronco
hematopoiéticas. Ribeirão Preto, 2010.
179p. : il. ; 30cm.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo - Área
de concentração: Imunologia Básica e Aplicada
Orientador: Voltarelli, Júlio César
1. autoimunidade. 2. expressão gênica. 3. diabetes mellitus tipo 1.
4. esclerose múltipla. 5. transplante autólogo de células tronco
hematopoéticas
FOLHA DE APROVAÇÃO
SCORTEGAGNA, G. T. Análise da expressão de genes relacionados a células T
reguladoras, Th17, Th1 e Th2 em pacientes com doenças autoimunes
submetidos ao transplante autólogo de células tronco hematopoiéticas.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Imunologia Básica e
Aplicada da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de mestre em Ciências – Área de concentração: Imunologia
Básica e Aplicada.
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. ____________________________________________________________
Instituição: ________________________ Assinatura: ________________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________
Instituição: ________________________ Assinatura: ________________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________
Instituição: ________________________ Assinatura: ________________________
Trabalho realizado no Laboratório de Biologia Celular e Laboratório de Biologia Molecular do
Hemocentro de Ribeirão Preto / Centro de Terapia Celular / Instituto Nacional de Ciência e
Tecnologia de Células Tronco e Terapia Celular, Ribeirão Preto, SP, Brasil com auxilio
financeiro da Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
À minha mãe, Léa Maria Trentin, por fazer de mim quem sou,
Ao meu pai, Norberto Scortegagna, por sempre preconizar meus estudos,
Ao meu avô, Higidino (Dino) Trentin, pela “veia” sistemática herdada e que se faz
fundamental em meu trabalho.
Aos pacientes, médicos e pesquisadores,
“Mostremos valor, constância,
Nesta ímpia e injusta guerra,
Sirvam nossas façanhas
De modelo a toda a Terra.
Mas não basta pra ser livre
Ser forte, aguerrido e bravo;
Povo que não tem virtude,
Acaba por ser escravo.
Mostremos valor, constância,
Nesta ímpia e injusta guerra,
Sirvam nossas façanhas
De modelo a toda a Terra.”
Francisco Pinto da Fontoura
(trecho suprimido do Hino Rio-Grandense)
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Júlio César Voltarelli por quem tenho uma grande admiração e respeito, pela
personalidade, competência, coragem e pioneirismo em seu trabalho, e pela oportunidade dada a
mim para realização deste trabalho e participação neste estudo clínico.
A Dr. Kelen Cristina Ribeiro Malmegrim de Farias pela oportunidade e confiança depositada
em mim para realização deste trabalho. Obrigada por todo o incentivo e dedicação ao grupo.
Ao Prof. Dr. Auro Nomizo pela amizade, pelo apoio, pelas dicas sempre pertinentes, por
compartilhar sua experiência em “fazer/pensar ciência”, pelo ensinamento de como ministrar uma
belíssima aula, e por todo o carinho e incentivo que foram fundamentais para este estágio da minha
formação.
À Profa. Dra. Simone Kashima Haddad pela colaboração e auxílio prestado ao longo o deste
trabalho.
A Juliana Ueda e Carolina Caliari, que muito além de colegas de laboratório/orientador/pós-
graduação, são acima de tudo companheiras e amigas, daquelas que a gente leva tempo para
encontrar, mas que ficam conosco por toda a vida. Gurias, sou grata a vocês por tudo!!! Ju e Carol,
vocês foram o maior ganho pessoal que eu tive durante o mestrado! E recentemente, para
transformar o trio em quarteto fantástico, incorporamos a Mariana, que “é das nossas”!!! Mari,
obrigada a você também por alegrar nosso ambiente de trabalho e por ter embarcado nessa canoa
conosco!!!
A Gislane pelo treinamento nas técnicas moleculares, por boa parte do banco de cDNA‟s
utilizado neste trabalho, por todo o auxílio durante esse tempo, e principalmente pela amizade fora e
dentro do laboratório.
Ao Apoio Técnico do Laboratório de Biologia Celular do Centro Regional de Hemoterapia de
Ribeirão Preto do HC-FMRP-USP. O trabalho de vocês foi e é de fundamental importância para que
as pesquisas se realizem! Agradeço às atuais bolsistas, Amanda e Helô, por toda a ajuda no
desenvolvimento deste projeto. Agradeço também à Carmen pela eficiência e pronto auxílio nas
questões “administrativas” do laboratório. E em especial, agradeço ao Mário por encher as caixinhas
de ponteiras para mim, além de encher minha paciência, ou é ao contrário?!?! (hehe)
Ao Laboratório de Biologia Molecular do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto
do HC-FMRP-USP, laboratório no qual a maior parte dos experimentos foram realizados. Em
especial, agradeço às funcionárias Evandra e Rochele, e aos pós-graduandos deste laboratório pelo
auxílio, paciência e por compartilharem o laboratório comigo durante estes dois anos de trabalho. E
Maums, obrigada por colocar e tirar as placas do aparelho quando eu estava em aula!
À Anne Marie e Cris Ayres do Laboratório de Genética Molecular e Bioinformática do Centro
Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto do HC-FMRP-USP pela simpatia, disponibilidade em
ajudar e dividir a bancada quando necessário, e pelos suportes de placas e reagentes emprestados.
À Dalila pelo auxílio com o real-time. À Adri pela simpatia e por desligar os aparelhos inúmeras vezes,
poupando-me de retornar ao laboratório para desligá-los.
Ao “Seu Lu” do Laboratório de Transferência Gênica do Centro Regional de Hemoterapia de
Ribeirão Preto do HC-FMRP-USP por todo auxílio técnico e administrativo no laboratório. À Marcela,
que abençoadamente me emprestou as pipetas automáticas a fim de evitar uma lesão permanente
em minha mão direita e facilitar, bem como agilizar minhas pipetagens de real-time.
Ao Antônio Roberto do Laboratório de Hematologia do HC-FMRP-USP, por colocar as minhas
placas pra correr no aparelho praticamente todos os dias!!! Você sabe que sua ajuda foi fundamental
para que eu terminasse os experimentos! Obrigada e desculpe e “aluguel” do seu tempo.
À equipe médica da Unidade de Transplante de medula Óssea do Hospital das Clínicas da
FMRP-USP, pelo acompanhamento dos pacientes e encaminhamento das amostras. Também, à
equipe de enfermagem da mesma unidade atenção, paciência e coleta das amostras dos pacientes.
Aos profissionais da Biblioteca do Hemocentro, Rodrigo, Cíntia e Guilherme, pela atenção,
competência, disponibilidade no auxílio, carinho e amizade durante este tempo de convivência. À
Alessandra pelas traduções dos resumos e amizade dentro e fora do Hemocentro.
A todos os amigos do Hemocentro, que graças a Deus são muitos, por tornar minha vida
mais alegre e me proporcionar momentos de descontração e aprendizagem. Ma, Dai, Turco,
Maurício, Lucas, Mário, Danilo, Larissa, Tathi, Aline, Kátia, Virgínia, Mariana, Jorge, Maria Fernanda,
Alê, Júlia, Germano, Francisco, Ricardo (baiano), Felipe, Mariane, Flávia, Kamilla, Natanael,
Ferzinha, Nati, Ana Elisa, Júlio (do computador), Lindolfo, e quem por ventura eu tiver esquecido,
obrigada por tudo pessoal!
A todos os funcionários do Hemocentro! Às meninas da portaria pela simpatia, aos guardas
que tantas noites zelaram pela minha segurança no retorno ao lar, aos funcionários da copa, da
limpeza, em especial ao Marquito, fã incondicional das “Ladies”. Ao pessoal da coleta e recepção, aos
rapazes da manutenção, CPD, administração, RH e almoxarifado pelos serviços prestados e pela
simpatia. Obrigado a todos vocês! Alguns que inclusive foram doadores voluntários para esta
pesquisa, para vocês, um OBRIGADA mais que especial!
Ao Programa de Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada, do Departamento de
Imunologia e Bioquímica da FMRP-USP, pela excelente formação que nos proporciona. Em especial,
agradeço à Ana, que sempre me ajudou com muita atenção e carinho.
Aos amigos da Pós-Graduação, que são muitos para citar. Agradeço a vocês por
compartilharem comigo todas as etapas desse processo de formação acadêmica. Em especial à
“Tropa de Elite” do curso do “BOPE” (Imunologia Celular 2008, com Capitão Santana) e aos amigos
de corredor e “Silvão”: Elyara (bat), Ju, Carol, Nadi, Paola, Carol (the crazy), Fernanda, Jaqueline,
Cássia, Rafa, DuZé, Tiago (Pará), Ricardo (Qjo), Breno, Bruno, Eduardo, Diego, Tiago, Djalma, Guri,
e mais um montão de aspirantes a imunologistas.
. À minha família materna e paterna, que lá dos pampas, sempre mandou energias positivas e
boas vibrações, e sempre rezou para o bem estar desta desertora que se bandeou pra SP (hehe).
Obrigada pela torcida de vocês, pelo apoio, pelos cuidados a mim dedicados, pelo amor incondicional
e pela compreensão da minha ausência. Saibam que, mesmo de longe, o carinho de vocês ajudou a
me manter nesta caminhada e superar os desafios, sem me sentir sozinha neste propósito.
A todos muito obrigada!
RESUMO
SCORTEGAGNA, G. T. Análise da expressão de genes relacionados a células T
reguladoras, Th17, Th1 e Th2 em pacientes com doenças autoimunes submetidos ao
transplante autólogo de células tronco hematopoiéticas. 2010. 179f. Dissertação
(Mestrado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão
Preto, 2010.
Ensaios clínicos têm demonstrado que a imunoablação seguida de transplante autólogo de
células tronco hematopoiéticas (TACTH) é capaz de suprimir a atividade inflamatória em pacientes
com doenças autoimunes (DAIs) e pode induzir remissões clínicas prolongadas nesses pacientes,
mas o mecanismo de ação do TACTH ainda não é bem esclarecido. O objetivo deste trabalho foi
analisar a expressão de genes relacionados a células T reguladoras, Th17, Th1 e Th2 em pacientes
com diabete melito tipo 1 (DM-1, N=22) e pacientes com esclerose múltipla (EM, N=17),
sequencialmente após o TACTH. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram
isoladas dos controles e de pacientes nos períodos pré-transplante, D+180, D+360, D+540, D+720,
D+900 e D+1080 pós-transplante. As PBMC foram utilizadas para extração de RNA, síntese de
cDNA, quantificação da expressão por PCR em tempo real dos genes IL-10, TGF-β, Foxp3, CD25,
GITR, CTLA-4, PD-1, IL-17, IL-23, IL-25, IL-27, GATA3, STAT-6, IL-6, IL-4, IFN-γ, TNF-α, STAT-1,
STAT-4, STAT-3, IL-21. Os resultados de expressão gênica foram representados por fold change
calculados através do método 2^
-ΔΔC
T
. Em relação aos controles, os pacientes com DM-1, no período
PRE, apresentaram expressão elevada dos genes IL-10 (8.5x, p<0.0001), CTLA-4 (1.2x, p=0.01), IL-
27 (2.5x, p=0.04) e GATA3 (4.1x, p=0.001), e após o transplante, em pelo menos um período do
seguimento, essa expressão atingiu níveis normais, enquanto os genes IL-6 e IL-17 aumentaram sua
expressão, em 29.5x (p<0.0001) e 2.9x (p=0.01) respectivamente, ambos no D+540. Os pacientes
com EM apresentaram no período PRE, em relação aos controles, níveis de expressão elevados dos
genes IL-10 (12.3x, p<0.0001), PD-1 (2.8x, p=0.04), IL-6 (5.4x, p=0.04), IL-27 (13.4x, p<0.0001), e
diminuídos do gene CD25 (0.2x, p=0.01), e em pelo menos um período do seguimento pós-
transplante, exceto para IL-27, esses níveis se normalizaram, enquanto CTLA-4 e TNF-α elevaram
sua expressão, respectivamente, em 1.4x (p=0.02, D+720) e 11.6x (p=0.001, D+540). Esses
resultados sugerem que a terapia de IAD/TACTH modulou a expressão destes genes, em ambas as
doenças, o que pode ter contribuído para a remissão clínica desses pacientes.
Palavras-chave: Transplante de células tronco hematopoiéticas, Doenças autoimunes, Diabete
melito do tipo 1, Esclerose múltipla, expressão gênica, PCR em Tempo Real.
ABSTRACT
SCORTEGAGNA, G. T Evaluation of gene expression related to T regulatory, Th17, Th1
and Th2 cells in autoimmune diseases’ patients submitted to autologous
hematopoietic stem cell transplantation. 2010. 179f. Dissertation (Master). - Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010.
Clinical trials have indicated that autologous hematopoietic stem cell transplantation
(AHSCT) can persistently suppress inflammatory disease activity in a subset of patients with
autoimmune diseases (AIDs), but the mechanism of action of the AHSCT has not yet been totally
elucidated yet. The aim of this study was to evaluate the expression of gene expression of T
reg
, Th17,
Th1 e Th2 T cells in patients with type 1 diabetes mellitus (DM-1; N=22) and multiple sclerosis (MS;
N=17) who received AHSCT. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from controls
and patients at pre-transplantation, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 and D+1080 post-
transplantation. PBMC were used for RNA extraction, cDNA synthesis, gene quantification of IL-10,
TGF-β, Foxp3, CD25, GITR, CTLA-4, PD-1, IL-17, IL-23, IL-25, IL-27, GATA3, STAT-6, IL-6, IL-4,
IFN-γ, TNF-α, STAT-1, STAT-4, STAT-3 e IL-21. Results are expressed as fold-changes by 2^
-ΔΔC
T
method. Concerning the healthy controls, results from T1DM patients at pre-transplantation, indicated
upregulation of IL-10 (8.5 fold, p<0.0001), CTLA-4 (1.2 fold, p=0.01), IL-27 (2.5 fold, p=0.04) and
GATA3 (4.1 fold, p=0.001) genes, and at least one time point after transplantation, these expressions
were normalized while IL-6 and IL-17 were upregulated 29.5 fold (p<0.0001) and 2.9 fold (p=0.01)
respectively, both at D+540. MS patients showed high gene expression levels of IL-10 (12.3 fold,
p<0.0001), PD-1 (2.8 fold, p=0.04), IL-6 (5.4 fold, p=0.04), IL-27 (13.4 fold, p<0.0001), and low level of
CD25 (0.2 fold, p=0.01) at PRE in relation to control, and at least one time point after transplantation,
this expression was normalized, except IL-27, while CTLA-4 and TNF-α were upregulated,
respectively 1.4 fold (p=0.02, D+720) and 11.6 fold (p=0.001, D+540). These results suggest a
modulation by HDIT/AHSCT of these genes, in both diseases, which might contribute to clinical
remission of theses patients.
Keywords: Hematopoietic stem cell transplantation, Autoimmune diseases, Type 1 diabetes, Multiple
Sclerosis, gene expression, Real Time PCR.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Esquema do procedimento da terapia de imunossupressão em altas doses seguida do TACTH utilizado na
unidade de TMO do HCFMRP-USP...................................................................................................................
36
Figura 2 – Seguimento pós-transplante dos 22 pacientes diabéticos estudados quanto ao uso de insulina ao longo do
seguimento.........................................................................................................................................................
47
Figura 3 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição Foxp3 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
49
Figura 4 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição Foxp3 em células mononucleares de pacientes com
DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
50
Figura 5 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-10 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
50
Figura 6 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-10 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
51
Figura 7 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TGF-β em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
51
Figura 8 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TGF- β em células mononucleares de pacientes com DM-1 no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
52
Figura 9 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CD25 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
52
Figura 10 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CD25 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
53
Figura 11 – Quantificação relativa de RNAm da molécula PD-1 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
53
Figura 12 – Quantificação relativa de RNAm da molécula PD-1 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
54
Figura 13 – Quantificação relativa de RNAm da molécula GITR em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
54
Figura 14 – Quantificação relativa de RNAm da molécula GITR em células mononucleares de pacientes com DM-1 no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
55
Figura 15 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CTLA-4 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
55
Figura 16 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CTLA-4 em células mononucleares de pacientes com DM-1
no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
56
Figura 17 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição RORγt em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
57
Figura 18 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição RORγt em células mononucleares de pacientes
com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
57
Figura 19 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-3 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
58
Figura 20 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-3 em células mononucleares de pacientes
com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
58
Figura 21 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-6 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
59
Figura 22 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-6 em células mononucleares de pacientes com
DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
59
Figura 23 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-17 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
60
Figura 24 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-17 em células mononucleares de pacientes com
DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
60
Figura 25 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-21 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
61
Figura 26 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-21 em células mononucleares de pacientes com
DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
61
Figura 27 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-23 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
62
Figura 28 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-23 em células mononucleares de pacientes com
DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
62
Figura 29 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-27 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
63
Figura 30 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-27 em células mononucleares de pacientes com
DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
63
Figura 31 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição T-bet em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
64
Figura 32 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição T-bet em células mononucleares de pacientes com
DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
64
Figura 33 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-1 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
65
Figura 34 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-1 em células mononucleares de pacientes
com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
65
Figura 35 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-4 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC ........................................................................................................................................
66
Figura 36 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-4 em células mononucleares de pacientes
com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
66
Figura 37 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IFN-γ em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
67
Figura 38 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IFN-γ em células mononucleares de pacientes com
DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
67
Figura 39 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição TNF-α em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
68
Figura 40 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição TNF-α em células mononucleares de pacientes
com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
68
Figura 41 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição GATA3 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
69
Figura 42 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição GATA3 em células mononucleares de pacientes
com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
69
Figura 43 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-6 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
70
Figura 44 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-6 em células mononucleares de pacientes
com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
70
Figura 45 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-4 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
71
Figura 46 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-4 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
71
Figura 47 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição Foxp3 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
80
Figura 48 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição Foxp3 em células mononucleares de pacientes
com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
80
Figura 49 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-10 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
81
Figura 50 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-10 em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
81
Figura 51 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TGF-β em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
82
Figura 52 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TGF-β em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
82
Figura 53 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CD25 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
83
Figura 54 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CD25 em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
83
Figura 55 – Quantificação relativa de RNAm da molécula PD-1 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
84
Figura 56 – Quantificação relativa de RNAm da molécula PD-1 em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
84
Figura 57 – Quantificação relativa de RNAm da molécula GITR em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
85
Figura 58 – Quantificação relativa de RNAm da molécula GITR em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
85
Figura 59 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CTLA-4 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
86
Figura 60 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CTLA-4 em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
86
Figura 61 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição RORγt em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
87
Figura 62 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição RORγt em células mononucleares de pacientes
com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
87
Figura 63 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-3 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
88
Figura 64 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-3 em células mononucleares de pacientes
com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE......................................................................................................................
88
Figura 65 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-6 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
89
Figura 66 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-6 em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
89
Figura 67 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-17 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
90
Figura 68 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-17 em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
90
Figura 69 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-21 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
91
Figura 70 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-21 em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
91
Figura 71 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-23 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
92
Figura 72 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-23 em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
92
Figura 73 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-27 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
93
Figura 74 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-27 em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
93
Figura 75 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição T-bet em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
94
Figura 76 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição T-bet em células mononucleares de pacientes com
EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
94
Figura 77 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-1 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
95
Figura 78 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-1 em células mononucleares de pacientes
com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
95
Figura 79 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-4 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
96
Figura 80 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-4 em células mononucleares de pacientes
com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
96
Figura 81 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IFN-γ em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
97
Figura 82 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IFN-γ em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
97
Figura 83 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TNF-α em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
98
Figura 84 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TNF-α em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
98
Figura 85 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição GATA3 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
99
Figura 86 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição GATA3 em células mononucleares de pacientes
com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
99
Figura 87 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-6 em células mononucleares de indivíduos
controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-
TACTH. Calibrador IC.........................................................................................................................................
100
Figura 88 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-6 em células mononucleares de pacientes
com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080. Calibrador período PRE.......................................................................................................................
100
Figura 89 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-4 em células mononucleares de indivíduos controle e
pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH.
Calibrador IC.......................................................................................................................................................
101
Figura 90 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-4 em células mononucleares de pacientes com EM no
período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080.
Calibrador período PRE......................................................................................................................................
101
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Características demográficas e dados clínico-laboratoriais dos pacientes com DM-1 no período pré-
transplante...............................................................................................................................................................................
33
Tabela 2 – Características demográficas e dados clínico-laboratoriais dos pacientes com EM do período pré-TACTH......
34
Tabela 3 – Características demográficas do grupo controle referente aos pacientes com DM-1..........................................
37
Tabela 4 - Características demográficas do grupo controle referente aos pacientes com EM...............................................
38
Tabela 5 – Pareamento das características dos grupos de pacientes de todas as DAI com seu respectivo grupo de
indivíduos controles (IC)..........................................................................................................................................................
38
Tabela 6 – TaqMan
®
Gene Expression Assays utilizados para análise da expressão gênica dos pacientes e
controles..................................................................................................................................................................................
42
Tabela 7 – Resumo dos resultados de expressão dos genes alvos nos pacientes DM-1 em relação ao grupo
IC.............................................................................................................................................................................................
74
Tabela 8 – Resumo dos resultados de expressão dos genes alvos nos pacientes DM-1 em relação ao período
PRE.........................................................................................................................................................................................
75
Tabela 9 – Comparação da expressão relativa dos genes alvos nos pacientes de DM-1 em Rc calibrados em relação ao
grupo em Rm...........................................................................................................................................................................
76
Tabela 10 – Avaliação clínica pós-TACTH nos pacientes com esclerose múltipla.................................................................
78
Tabela 11 – Resumo dos resultados de expressão dos genes alvos nos pacientes EM em relação ao grupo
IC.............................................................................................................................................................................................
103
Tabela 12 – Resumo dos resultados de expressão dos genes alvos nos pacientes EM em relação ao período
PRE.........................................................................................................................................................................................
104
Tabela 13 – Comparação da expressão relativa dos genes alvos nos pacientes de EM em Rc calibrados em relação ao
grupo em Rm...........................................................................................................................................................................
105
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AR Artrite reumatóide
ATG do inglês “anti-thymocyte-globulin” ou globulina anti-timocitária
AUC do inglês “area under the curve”, área sob a curva
BCR do inglês “B cell receptor”, ou receptor de célula B
BEAM BiCNU , etoposídeo, citarabina, melfalan
CD do inglês "cluster of differentiation", ou grupamento de diferenciação
CD25 do inglês “alpha chain of the IL-2 receptor”, ou cadeia alfa do receptor de IL-2
cDNA DNA complementar
CSF do inglês “Cerebrospinal fluid “, ou líquido cérebro-espinhal
C
T
do inglês “cycle threshold”
CTH Célula tronco hematopoiética
CTLA-4 do inglês “citotoxic T lymphocyte-associated molecule-4”, ou molécula 4 associada ao
linfócito T citotóxico
D+ Dias após transplante
DAI Doença autoimune
DEPC Dietilpirocarbonato
DM-1 Diabete melito do tipo 1
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA do inglês “desoxirobonucleic acid”, ou ácido desoxirribonucléico
dNTP Desoxi-nucleotídeos trifosfato
EAE do inglês “experimental autoimmune encephalomyelitis”, ou encefalomielite
autoimune experimental
EBV do inglês “Epstein-Barr virus”, ou vírus Epstein-Barr
EDSS do inglês “Expanded Disability Status Score”
EDTA do inglês “ethylenediamine tetraacetic acid”, ou ác. etilenodiamino tetra-acético
EM Esclerose múltipla
EM-PP Esclerose múltipla progressiva primária
EM-PS Esclerose múltipla progressiva secundária
EM-SR Esclerose múltipla surto-remissiva
Foxp3 do inglês “forkhead box P3”
GAD do inglês “glutamic acid decarboxylase”, ou ácido glutâmico descarboxilase
GAPDH do inglês “Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase”
G-CSF do inglês “granulocyte-colony stimulating factor” ou fator estimulador de colônias granulocíticas
GITR do inglês “glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor”
Hb A
1C
Hemoglobina glicosilada A
1C
HLA do inglês “Human Leukocyte Antigens”, ou antígenos leucocitários humanos
IA do inglês “tyrosine phosphatase-like protein”, ou proteína similar a tirosina fosfatase
IAD Imunossupressão em altas doses
IC Indivíduos controles
ICA do inglês “Islet cell antibodies”, autoanticorpos anti-ilhotas
IFN Interferon
IIT do inglês “Intensive insulin therapy”, ou terapia intensiva com insulina
IL Interleucina
IRM Imagem por ressonância magnética
kDa Quilodalton
LES Lúpus eritematoso sistêmico,
MBP do inglês “myelin basic protein”, ou proteína básica da mielina
MHC do inglês “Major Histocompatibility Complex” ou Complexo Principal de Histocompatibilidade
MOG do inglês ”myelin oligodendrocyte glycoprotein”, ou glicoproteína da mielina do oligodendrócito
mTEC do inglês “medulary thymic epithelial cells”, ou células epiteliais tímicas medulares
N
2
Nitrogênio molecular
NK do inglês “natural killer”, ou matadoras naturais
PBS do inglês “phosphate buffer saline”, ou tampão fosfato salina
PCR do inglês "polymerase chain reaction", ou reação de polimerização em cadeia
PD-1 do inglês “Programmed death 1”
PLP do inglês “proteolipid protein”, ou proteolipídeo
Pré-mob Pré-mobilização
q.s.p Quantidade suficiente para
Rc Recaída clínica
Rm Remissão clínica
RMN Ressonância magnética nuclear
RNA do inglês “ribonucleic acid” ou ácido ribonucléico
RNAr Ácido ribonucléico ribossômico
RPMI meio Roswell Park Memorial Institute
SNC Sistema nervoso central
SNP do inglês “single-nucleotide polymorphism”, ou polimorfismo de nucleotídeo único
TA Temperatura ambiente
TACTH Transplante autólogo de células tronco hematopoiéticas
TAE do inglês “Tris-acetate-EDTA”, ou tampão Tris-Acetato-EDTA
TBP do inglês “TATA box binding protein”
TCR do inglês “T cell receptor”, ou receptor de célula T
TCTH Transplante de células tronco hematopoiéticas
T
H
do inglês “T helper”, ou T auxiliar
T
reg
Célula T reguladora
Tris Tris-hidroximetil aminometano básico
Tx Transplante
UI Unidade internacional
LISTA DE SÍMBOLOS
Alfa
Beta
Gama
Kappa
μ Micro
η Nano
Delta
Marca registrada
Trademark
^ Expoente
% Porcentagem
± mais ou menos
°C grau Celsius
λ lambda
V volts
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 16
1.1 Autotolerância e autoimunidade ............................................................................................ 16
1.2 Doenças autoimunes ............................................................................................................. 18
1.3 Diabete melito do tipo 1 ......................................................................................................... 19
1.4 Esclerose múltipla ................................................................................................................. 22
1.5 Transplante autólogo de células tronco hematopoéticas em doenças autoimunes ............. 26
2 Objetivos ........................................................................................................................................ 30
2.1 Objetivo geral ........................................................................................................................ 30
2.2 Objetivos específicos............................................................................................................. 30
3 Casuística, Material e Métodos ...................................................................................................... 32
3.1 Pacientes com doenças autoimunes..................................................................................... 32
3.2 Controles saudáveis .............................................................................................................. 37
3.3 Isolamento das células mononucleares periféricas .............................................................. 39
3.4 Extração de RNA pelo método de Trizol ............................................................................... 39
3.5 Síntese de cDNA ................................................................................................................... 40
3.6 PCR em Tempo Real ............................................................................................................ 41
3.7 Análise estatística.................................................................................................................. 44
4 Resultados ..................................................................................................................................... 46
4.1 Resultados de DM-1 .............................................................................................................. 46
4.1.1 Resultados Clínico-laboratoriais de DM-1 ......................................................................... 46
4.1.2 Resultados de Expressão Gênica de DM-1 ...................................................................... 49
4.1.3 Análise descritiva da Remissão x Recaída dos pacientes com DM-1 .............................. 76
4.2 Resultados de EM ................................................................................................................. 77
4.2.1 Resultados Clínico-laboratoriais de EM ............................................................................ 77
4.2.2 Resultados de Expressão Gênica de EM.......................................................................... 79
4.2.3 Análise descritiva da Remissão x Recaída dos pacientes com EM ............................... 104
5 Discussão ..................................................................................................................................... 107
6 CONCLUSOES ............................................................................................................................ 118
7 Referências .................................................................................................................................. 120
8 Apêndices..................................................................................................................................... 125
“No meio da dificuldade encontra-se a oportunidade”
Albert Einstein (1879-1955)
Físico alemão
I
I
N
N
T
T
R
R
O
O
D
D
U
U
Ç
Ç
Ã
Ã
O
O
Introdução 16
1 INTRODUÇÃO
Pode-se definir uma doença autoimune (DAI) como sendo uma síndrome clínica causada
pela ativação de células T ou B, ou ambas, na ausência do avanço de uma infecção ou outras
causas perceptíveis (Davidson; Diamond, 2001). O que leva a quebra dos mecanismos de tolerância
e a progressão da autoimunidade permanece um mistério (Selmi, 2007). De fato, há vários
tratamentos que aliviam os sintomas dessas doenças sem de fato haver conhecimento total sobre a
etiologia das mesmas (Williams, 2007). Além disso, na maioria das vezes, o tratamento ocorre anos
depois do início do processo patogênico, e apesar do crescente conhecimento a respeito dos
processos celulares e moleculares envolvidos, os alvos mais eficazes para a imunoterapia na fase
crônica da doença não são evidentes (Feldmann; Steinman, 2005).
Os critérios para determinar se uma doença é autoimune compreendem: (1) prova direta
através da transferência de células T patogênicas ou autoanticorpos patogênicos, (2) evidências
indiretas baseadas na reprodução da doença autoimune em modelos experimentais e (3) evidências
clínicas de que a doença responde a agentes imunossupressores (Rose; Bona, 1993).
1.1 Autotolerância e autoimunidade
Para facilitar o entendimento dos aspectos relacionados com as doenças autoimunes (DAIs)
é de fundamental importância levantar alguns conceitos sobre tolerância imunológica e
autoimunidade.
Uma característica chave do sistema imunológico é a capacidade de discriminação entre
antígenos próprios e não-próprios, tendo a capacidade de manter a tolerância aos antígenos próprios
e ainda assim ser capaz de responder efetivamente contra patógenos e células malignas (Pan et al.,
2008). A tolerância imunológica, também chamada de autotolerância, pode ser definida como a não-
responsividade aos autoantígenos devido à exposição prévia aos mesmos. Indivíduos normais são,
portanto, tolerantes aos antígenos próprios devido aos processos de tolerância central e periférica
atuantes no sistema imune (Rioux; Abbas, 2005).
Dentre os TCRs (T cell receptor, ou receptores de células T) e BCRs (B cell receptor, ou
receptores de células B) gerados pela recombinação V(D)J, cerca de 20 a 50% ligam-se com
afinidade potencialmente perigosa à autoantígenos (Goodnow et al., 2005). Uma vez que somente 3-
8% da população desenvolve doenças autoimunes, é notável a existência de mecanismos indutores
Introdução 17
de tolerância no organismo, já que esse número imenso de receptores autorreativos é bem regulado
na maioria das pessoas (Laufer, 2008).
Os mecanismos de tolerância imunológica podem ser divididos, como já mencionado, em
mecanismos de tolerância central e periférica. Na tolerância central, linfócitos imaturos que
reconhecem antígenos próprios com alta afinidade nos órgãos linfóides centrais (medula óssea para
as células B e timo para as células T) morrem por apoptose (deleção clonal), sofrem “edição” do
receptor, ou são funcionalmente “inativados” (anergia clonal) (Walker; Abbas, 2002; Goodnow et al.,
2005). O principal processo atuante na tolerância central é a seleção negativa, que compreende a
morte induzida pela interação de alta afinidade/avidez entre um TCR específico e seu autoantígeno
durante o desenvolvimento dos timócitos. As células epiteliais tímicas medulares (mTECs)
apresentam a habilidade de expressar proteínas tecido-específicas que são usualmente expressas
fora do timo, e esta expressão promíscua tem importância na indução da tolerância central e
prevenção da autominudade (Ohashi, 2003).
Uma significante fração de BCRs e TCRs autorreativos escapa desses mecanismos de
tolerância central, ou pela baixa avidez de interação com o autoantígenos ou pela insuficiente
expressão desses autoantígenos no órgão linfóide primário, e assim mecanismos periféricos são
requeridos para essas células. Na tolerância periférica, os linfócitos autorreativos maduros que
encontram autoantígenos na periferia são mortos por apoptose induzida por ativação, são
funcionalmente “inativados” (anergia clonal), ou são controlados por mecanismos supressores
mediados por células T reguladoras (T
regs
) (Walker; Abbas, 2002; Goodnow et al., 2005). Evidências
acumuladas durante os últimos 15 anos têm indicado um importante papel das T
regs
na manutenção
da tolerância periférica e na regulação negativa de várias respostas (Pan et al., 2008).
A visão atual sobre tolerância imunológica reconhece que um nível baixo de autorreatividade
é fisiológico e crucial para o funcionamento normal do sistema imune (Dighiero; Rose, 1999), uma
vez que os autoantígenos ajudam a formar o repertório de linfócitos maduros e a sobrevivência dos
mesmos na periferia requer exposições contínuas a antígenos próprios (Goldrath; Bevan, 1999).
Além disso, não existem diferenças fundamentais entre as estruturas de antígenos próprios e de
antígenos não-próprios, o que reforça a idéia de que os linfócitos evoluíram para responder a
antígenos somente em certos microambientes (citocinas e outros fatores inflamatórios). De fato, a
presença de quantidades mensuráveis de autoanticorpos fisiológicos no soro indica que estes estão
presentes no repertório funcional de receptores. A teoria mais aceita que explicaria a produção de
autoanticorpos nas doenças autoimunes é a de que os autoanticorpos patológicos resultariam da
pressão seletiva exercida pelo autoantígeno no clone de linfócito B autorreativo, porém fisiológico,
que acarretaria em mutações somáticas resultando na formação de autoanticorpos patogênicos.
Assim, este autoanticorpo resultante seria produzido por uma população de célula B distinta daquela
que originalmente produzia autoanticorpos fisiológicos (Dighiero; Rose, 1999).
Via de regra, todos os indivíduos são tolerantes aos seus antígenos potenciais, e a falha da
autotolerância é a causa fundamental da autoimunidade (Rioux; Abbas, 2005). Sendo assim, o
desafio é entender como a autorreatividade fisiológica se torna um processo patológico e como as
Introdução 18
células imunes, principalmente células T e B, contribuem para a injúria tecidual (Davidson; Diamond,
2001).
1.2 Doenças autoimunes
As doenças autoimunes (DAIs) compõem um grupo complexo e heterogêneo de doenças que
atingem cerca de 5 a 8% da população mundial (Baechler et al., 2006) e compreendem mais de 70
desordens crônicas (Whitacre, 2001) que podem ser classificadas de acordo com os órgãos e tecidos
lesados pela resposta imune, sendo denominadas de doenças autoimunes órgão-específicas quando
as células autorreativas e autoanticorpos são direcionados contra componentes próprios expressos
somente num tecido ou tipo celular específico (por exemplo, diabete melito do tipo 1 e esclerose
múltipla); e de doenças autoimunes sistêmicas quando esses mesmos componentes imunológicos
são direcionados contra autoantígenos usualmente expressos numa grande variedade de tecidos (por
exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica e artrite reumatóide). Assim, podemos
dizer que as DAIs são caracterizadas pela perda da tolerância imunológica a antígenos próprios com
conseqüente destruição tecidual por células autorreativas e autoanticorpos (Davidson; Diamond,
2001; Marrack; Kappler; Kotzin, 2001; Rosa et al., 2007; Selmi, 2007). Essa quebra da autotolerância
pode ser ocasionada por infecções ou outros mecanismos, como anormalidades genéticas ou fatores
ambientais (Pan et al., 2008).
As DAIs são a terceira causa de morbidade e mortalidade, ficando atrás das doenças
cardíacas e do câncer (Notkins, 2002). Por isso, constituem um importante grupo de doenças que
debilita e/ou leva a óbito os indivíduos afetados, uma vez que são muito difíceis de tratar e
impossíveis de curar, uma vez que os alvos da resposta imune, os autoantígenos, não podem ser
eliminados. Assim, as doenças autoimunes representam um problema econômico-social relevante,
principalmente por afetar freqüentemente adultos jovens (Rioux; Abbas, 2005). Desde as primeiras
descrições, foi observado que a freqüência de mulheres afetadas por DAIs era maior que a de
homens, sendo essa distribuição entre os gêneros mais pronunciada em algumas DAIs e menos em
outras. Para a esclerose múltipla, por exemplo, a incidência é de 60-75% no gênero feminino; já para
o diabete melito do tipo 1 a razão feminino:masculino é de aproximadamente 1:1. Além da
prevalência, os gêneros exibem diferenças na apresentação clínica das doenças, ou seja, há um
dimorfismo sexual na resposta imune, já que os hormônios sexuais apresentam efeito modulatório
sob a mesma (Whitacre, 2001).
Embora os mecanismos pelos quais as DAIs se desenvolvam ainda não sejam
completamente esclarecidos, acredita-se que o seu desencadeamento seja resultante da interação
entre fatores genéticos, ambientais e de regulação imunológica (Fathman et al., 2005). Assim, a
Introdução 19
quantidade e qualidade da resposta imune, bem como o ambiente de indução da resposta e a
genética do hospedeiro determinam as possíveis conseqüências patológicas (Mackay; Leskovsek;
Rose, 2008). O próprio repertório de receptores de células B e T (BCRs e TCRs) são resultantes da
interação do repertório genético do indivíduo com o ambiente (Rioux; Abbas, 2005). As baixas taxas
de concordância entre gêmeos monozigóticos sugerem uma contribuição fundamental de fatores
ambientais para o desenvolvimento da autoimunidade. Os genes de suscetibilidade descritos são
relacionados a moléculas de HLA, citocinas, moléculas co-estimuladoras, vias de sinalização de
apoptose, receptores de antígenos, células reguladoras, depuração de imunocomplexos, dentre
outros (Marrack; Kappler; Kotzin, 2001; Baechler et al., 2006; Mackay; Leskovsek; Rose, 2008). De
maneira geral, podemos dizer que as doenças autoimunes se desenvolvem quando linfócitos
autorreativos escapam dos mecanismos de tolerância imunológica, são ativados e começam a atacar
os tecidos próprios do organismo (Rioux; Abbas, 2005).
O presente trabalho envolveu duas DAIs em particular, o diabete melito do tipo 1 e a
esclerose múltipla e, portando, somente as mesmas serão detalhadas nesta introdução.
1.3 Diabete melito do tipo 1
O diabete melito do tipo 1 (DM-1), também chamado de diabete juvenil ou diabete insulino-
dependente, é uma doença caracterizada pela deficiência na produção de insulina, resultante da
destruição seletiva das células β das ilhotas de Langerhans no pâncreas. (Notkins, 2002; Narendran;
Estella; Fourlanos, 2005; Knip; Siljander, 2008). O estágio precoce do DM-1 é caracterizado pela
insulite, ou seja, pela infiltração das ilhotas pancreáticas por células mononucleares, incluindo
linfócitos T autorreativos. Já o segundo estágio é o diabete propriamente dito, fase na qual a doença
é diagnosticada. Neste estágio clínico, cerca de 80-90% das células β pancreáticas já foram
destruídas, o que leva à ausência de insulina, resultando num estado de hiperglicemia que, se não
tratado, ocasiona complicações crônicas graves, como problemas vasculares, insuficiência renal,
cegueira, doença cardíaca, úlceras crônicas e, nos casos mais graves, distúrbios metabólicos que
progressivamente levam à depressão do sistema nervoso central, coma e morte (Notkins, 2002;
Eisenbarth, 2007; Ichinose; Kawasaki; Eguchi, 2007).
Esta DAI atinge principalmente crianças, adolescentes e adultos jovens de origem
caucasiana, com pico de incidência entre cinco e 15 anos de idade, embora possa aparecer em
indivíduos em qualquer faixa etária. O DM-1 é uma doença autoimune crônica e multifatorial cujo
desencadeamento envolve fatores genéticos, ambientais e imunológicos. Diferenças na
susceptibilidade genética e a importância dos fatores ambientais são evidenciadas pela taxa de
incidência do DM-1, que varia de 0,3-0,4% na população mundial de acordo com o grupo étnico e
localização geográfica (Voltarelli, 2004; Gillespie, 2006).
Introdução 20
Dentre os fatores genéticos, alguns alelos de HLA de classe II ou combinações de alelos
(haplótipos) estão fortemente relacionados com a susceptibilidade ao diabete, como é o caso do
haplótipo DR4-DQ8 e DR3-DQ2 que apresentam uma importância particular por estarem presentes
em 90% das crianças com DM-1. Essa forte associação com polimorfismos do HLA de classe II chega
a conferir 50% de susceptibilidade, tornando a genotipagem do HLA uma ferramenta importante para
a determinação do risco de um indivíduo desenvolver diabete melito do tipo 1 (Notkins, 2002; Roep,
2003; Gillespie, 2006; Brorsson et al., 2010). O gene da insulina é o segundo fator genético mais
importante, contribuindo em 10% para susceptibilidade ao DM-1. Um polimorfismo nesse gene estaria
envolvido na redução da expressão da insulina no timo e assim linfócitos T autorreativos para insulina
escapariam da deleção (Devendra; Eisenbarth, 2003; Goodnow et al., 2005). Já um alelo do gene que
codifica um regulador negativo da ativação de células T, a molécula 4 associada ao linfócito T
citotóxico (CTLA-4), é considerado o terceiro locus de susceptibilidade (Gillespie, 2006; Ichinose;
Kawasaki; Eguchi, 2007; Mackay; Leskovsek; Rose, 2008). Há outros estudos mostrando outras
associações, tais como, o polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) no gene transdutor de sinal e
ativador da transcrição-4 (STAT-4) que está associado à susceptibilidade ao DM-1. Essa forma
variante desse fator de transcrição está relacionada com outras doenças autoimunes, como artrite
reumatóide (AR) e lúpus eritematoso sistêmico (LES), provavelmente por defeitos na sinalização da
via IL-12. A falta de sinalização via STAT-4 protege contra diabete, enfatizando o importante papel do
STAT-4 na patogênese do diabete melito do tipo 1 (Mackay; Leskovsek; Rose, 2008; Zervou et al.,
2008).
A baixa taxa de concordância entre gêmeos monozigóticos (30-40%), sugere que, embora
haja considerável contribuição genética, fatores ambientais são necessários para o
desencadeamento da doença. Assim, os fatores ambientais podem acelerar ou retardar o processo
patogênico do DM-1, e dentre estes fatores estão as infecções virais (especialmente pelos vírus da
rubéola e coxsackie B4), toxinas, dieta na infância, influências climáticas (maioria dos casos ocorre
entre outono e inverno), medicamentos e estresse (Knip; Akerblom, 1999; Gillespie, 2006). Os fatores
imunológicos serão discutidos adiante.
A presença de autoanticorpos anti-ilhotas (ICAs) é um ótimo marcados para distinguir a DM-1
de outras formas de diabete, pois é o primeiro sinal detectável da destruição autoimune das ilhotas
(Knip; Siljander, 2008). Os três principais autoanticorpos encontrados no soro de pacientes com DM-1
são contra a isoforma de 65 kDa do ácido glutâmico descarboxilase (GAD65), os peptídeos derivados
da insulina, e a proteína similar a tirosina fosfatase (IA-2) (Notkins; Lernmark, 2001; Notkins, 2002;
Ichinose; Kawasaki; Eguchi, 2007). Esses autoanticorpos são usados para a investigação do curso e
patogênese da doença, mas são especialmente úteis na fase pré-clínica do DM-1 por precederem o
diagnóstico em muitos meses ou anos (Sosenko et al., 2008). Em pacientes recém-diagnosticados,
mais de 90% apresentam autoanticorpos para um ou mais desses autoantígenos, sendo o
autoantígeno mais comum e persistente o GAD65 (Notkins; Lernmark, 2001; Notkins, 2002; Gillespie,
2006; Eisenbarth, 2007). Os valores de anticorpo anti-GAD65 podem predizer em 84-95% o
requerimento futuro de insulina (Narendran; Estella; Fourlanos, 2005).
Introdução 21
Embora importantes como marcadores, não se acredita que os autoanticorpos exerçam o
papel principal na destruição das células β (Roep, 2003). Conceitualmente, o DM-1 é uma doença
autoimune mediada por resposta celular contra as ilhotas (Notkins, 2002). O conteúdo da insulite
reforça essa afirmação, uma vez que o infiltrado inflamatório é composto por células mononucleares,
em sua maioria linfócitos T CD8
+
, seguidos de macrófagos, linfócitos T CD4
+
, linfócitos B (Ichinose;
Kawasaki; Eguchi, 2007; Knip; Siljander, 2008), células NK e células dendríticas (Roep, 2003). Assim,
podemos dizer que em conjunto, os componentes imunológicos que atuam na destruição das células
β pancreáticas incluem a infiltração de linfócitos ativados, anticorpos e componentes do sistema do
complemento (Narendran; Estella; Fourlanos, 2005).
São vários os mecanismos que contribuem para a destruição das células pancreáticas,
dentre eles citamos principalmente a ação de linfócitos T citotóxicos, reações imunes mediadas por
células T CD4
+
de padrão T
H
1, autoanticorpos e também reações mediadas pela produção local de
IL-1 e TNF- . Estas citocinas produzidas pelos macrófagos, que estão presentes no infiltrado
inflamatório no pâncreas, inibem a secreção de insulina, potencializando a hiperglicemia gerada pela
destruição das células pancreáticas (COOKE et al, 2001; NARENDRAN et al., 2005). Além da
associação com o padrão T
H
1, há evidências demonstrando o envolvimento do padrão de resposta
T
H
17 (Ichinose; Kawasaki; Eguchi, 2007), uma recente linhagem de célula T CD4
+
efetoras
descoberta, distintas de T
H
1 e T
H
2. É o lançamento de moléculas citotóxicas, como citocinas,
granzima B, perforina, e direta sinalização via Fas, sobre às células que leva a morte das mesmas.
Células T CD4
+
e CD8
+
ativadas agem em colaboração para ativar a morte celular por apoptose.
Citocinas de linfócito T, como IL-1, IFN-γ e TNF-α, aumentam a morte celular pela regulação positiva
de Fas e Fas ligante e pela estimulação da produção de óxido nítrico e radicais livres. Os
subconjuntos de células T
H
1 e T
H
17 e suas citocinas, INF- γ, TNF-α, e IL-2, IL-12, IL-17 e IL-18
respectivamente, intensificam a morte celular (Ichinose; Kawasaki; Eguchi, 2007).
Como foi mencionado anteriormente, no desencadeamento da autoimune há a participação
de fatores imunológicos, especialmente relacionados com a perda da tolerância periférica. Uma vez
que o sistema imune desenvolveu vários mecanismos para estabelecer e manter a autotolerância, é
compreensível que qualquer alteração nesse sistema possa ser o gatilho para o início de um
processo autoimune. Nosso organismo produz endogenamente uma subpopulação de células T que
é altamente especializada para a função supressora, denominadas células T reguladoras (T
regs
), e
anormalidades no número ou função dessas células podem ser uma das causas do desenvolvimento
de DAIs. Atualmente, foram descritas diferentes populações de células T com potencial supressor que
estariam envolvidas na manutenção da homeostase e prevenção da autoimunidade, como por
exemplo, T
regs
naturais (células T CD4
+
CD25
+
Foxp3
+
naturais), T
regs
induzidas (células T
CD4
+
CD25
+
Foxp3
+
induzidas), células T reguladoras 1 (T
R
1), linfócitos T helper 3 (T
H
3), células T
CD8
+
reguladoras (Sakaguchi, 2005; Suzuki et al., 2008), e células NKT (Yawata et al., 2008) e
outras. Porém, os mecanismos de geração e função ainda não foram realmente comprovados para
todas essas populações. A função crítica do controle de respostas imunes indesejadas contra
autoantígenos tem sido atribuída à população de células T CD4
+
CD25
+
Foxp3
+
, que expressa
Introdução 22
constitutivamente a cadeia α do receptor da IL-2 (CD25) e o fator de transcrição Foxp3, que é
considerado o gene controlador do desenvolvimento das T
regs
(Ichinose; Kawasaki; Eguchi, 2007). Os
três mecanismos de supressão são por contato célula-célula, secreção de citocinas anti-inflamatórias,
e citotoxidade celular (Suzuki et al., 2008).
Uma vez que as T
regs
apresentam a capacidade de suprimir a ação de células T efetoras, o
fato de indivíduos portadores de DM-1 possuírem um número reduzido de células T
regs
circulantes
(Chen et al., 2005) indica que qualquer desregulação da função destas células irá contribuir para a
patogênese do DM-1 (Lindley et al., 2005). Não somente no número pode estar o problema, mas
também na função, já que em alguns estudos, as T
regs
CD4
+
CD25
+
isoladas de pacientes com DM-1
apresentaram função supressora reduzida in vitro (Ichinose; Kawasaki; Eguchi, 2007). Ademais, o
desenvolvimento das T
regs
e sua função dependem da ação pleiotrópica da citocina TGF-β cuja
requisição também é feita para o desenvolvimento das células T
H
17, apontando o quão complexo e
delicado é esse balanço de citocinas no microambiente durante o desenvolvimento e ativação das
subpopulações celulares.
A terapia intensiva com insulina (IIT) é considerada o tratamento padrão-ouro para o DM-1,
mas, além de não ser a cura para a doença, pode provocar episódios de hipoglicemia e não impede o
desenvolvimento das complicações a longo prazo características da doença (Burn, 2010). Assim, com
o intuito de corrigir os distúrbios imunológicos dos pacientes com DM-1, novas abordagens
terapêutica tem sido propostas, dentre elas: o transplante de pâncreas ou de ilhotas pancreáticas,
indução de tolerância oral à insulina, anticorpo monoclonal humanizado anti-CD3, que tem efeito
imunossupressor e gera populações de células com propriedades imunorregulatórias, dentro outros
(Masteller; Bluestone, 2002; Voltarelli, 2004; Narendran; Estella; Fourlanos, 2005; Gillespie, 2006;
Prud'homme; Draghia-Akli; Wang, 2007; Kin, 2010). Uma terapia alternativa promissora é a terapia de
imunossupressão em altas doses somada à infusão de células tronco hematopoiéticas autólogas, que
têm o potencial de impedir a destruição das células β pancreáticas e, ainda, induzir remissões clínicas
significativas e prolongadas nos pacientes (VOLTARELLI, 2004; VOLTARELLI et al., 2007; COURI e
VOLTARELLI, 2008). Essa terapia será abordada em maiores detalhes no decorrer das seções.
1.4 Esclerose múltipla
A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune órgão-específica, crônica e inflamatória,
mediada por células T autorreativas, de padrão T
H
1. É caracterizada por lesões inflamatórias,
associadas à formação de placas escleróticas, que destroem a bainha de mielina dos neurônios no
sistema nervoso central (SNC), afetando cérebro, medula espinhal e nervos ópticos, sem ataque
direto aos nervos periféricos. O curso da doença neurológica é variado e a maior parte do processo
patológico é silencioso (Compston; Coles, 2002; Achiron et al., 2004; Sospedra; Martin, 2005; Trapp;
Nave, 2008; Hurwitz, 2009). Os sintomas também são variados, incluem fraqueza motora, visão
Introdução 23
reduzida e falta de coordenação motora, podendo causar invalidez e por sua vez um grande impacto
sócio-econômico, uma vez que afeta indivíduos entre 20-30 anos de idade em média. Além das
limitações neurológicas, a EM reduz o tempo de vida em 7-8 anos em média, 50% dos pacientes são
incapazes de realizar tarefas domésticas e/ou trabalhar após 10 anos do início da doença. E após 25
anos de seu início, a EM torna 50% dos pacientes cadeirantes (Lutton; Winston; Rodman, 2004;
Trapp; Nave, 2008).
Em 85% dos pacientes, a doença é clinicamente caracterizada como EM surto-remissiva
(EM-SR), com déficits neurológicos recorrentes e reversíveis. As recaídas (ou “surtos”) são
subagudas, os sintomas se desenvolvem durante horas a dias, persistem por dias a semanas e
depois se dissipam. Esses surtos são causados por inflamação local associada a edema que
resultam na desmielinização dos neurônios locais. O infiltrado inflamatório que rompe a barreira
hematoencefálica é composto de linfócitos T autorreativos e monócitos, que em conjunto promovem a
destruição da mielina local. Uma vez solucionado o edema, os pacientes entram em remissão clínica.
Para esta forma clínica de EM, EM-SR, as mulheres são significativamente mais suscetíveis que os
homens, na proporção de 2:1 (Lutton; Winston; Rodman, 2004; Trapp; Nave, 2008), apresentando
variáveis clínica, como recaídas mais freqüentes, e mecanismos de expressão gênica próprias do
gênero, o que já leva os pesquisadores a pensar numa imunoterapia gênero-dependente no futuro
(Achiron; Gurevich, 2009). A quantidade de surtos varia de paciente para paciente, mas em média
ocorrem de 1 a 2 episódios por ano, e este estágio da doença pode durar de anos a décadas. Após 8-
20 anos, a maioria dos pacientes com EM-SR passa para a segunda fase da doença, denominada
EM progressiva secundária (EM-PS), caracterizada pelo declínio neurológico continuo e irreversível,
não-associado a surtos. Esta forma da doença é mais grave uma vez que, enquanto a EM-SR era
sensível ao tratamento com imunossupressão, formas tardias de EM-PS tendem a não responder ao
tratamento convencional. Existe ainda a forma de EM progressiva primária (EM-PP) que atinge 15%
dos pacientes com EM. Surtos são raros ou inexistentes nesta forma de EM, e o início clínico da
doença ocorre mais cedo, em média aos 29 anos, enquanto a EM-SR ocorre aos 39 anos de idade
em média. Além disso, para a forma EM-PP, não há diferença de incidência entre os gêneros (Trapp;
Nave, 2008; Hurwitz, 2009).
Há uma constante reavaliação dos critérios de diagnóstico devido à complexidade da doença
e variadas formas clínicas, mas ainda o mais apropriado diagnóstico é feito de acordo com os critérios
de McDonald (Polman et al., 2005), apoiado por exames de imagem por ressonância magnética
(IRM), líquido cefalorraquidiano, potenciais evocados e outros (Hurwitz, 2009) . O tempo de
diagnostico tem grande relevância para as medidas terapêuticas, uma vez que há uma janela no
começo da evolução da doença, a fase inflamatória, na qual a imunomodulação promove um grande
benefício, com efeito duradouro sobre a incapacidade a longo prazo do paciente. A alta freqüência de
surtos durante o primeiro ano correlaciona-se com o maior comprometimento neuronal ao longo da
evolução da doença, e por isso melhor tratamento nesta fase inicial é de extrema importância, mesmo
porque as intervenções imunoterapêuticas na fase de EM-PS não são efetivas (Alvarez-Cermeno;
Costa-Frossard; Villar, 2010). Devido à característica altamente debilitante da doença, tem sido
Introdução 24
demonstrado a importância do desenvolvimento de intervenções multidisciplinares de reabilitação dos
pacientes, que podem ser usadas em todas as fases da doença (Burks; Bigley; Hill, 2009).
Como nas demais DAIs, a etiologia da EM permanece desconhecida e fatores genéticos,
ambientais e imunológicos são atribuídos ao seu desencadeamento. A EM afeta de 0,05-0,15% das
pessoas de origem caucasiana, enquanto é raramente observada em asiáticos e africanos (Hemmer;
Archelos; Hartung, 2002). Quanto maior for o grau de parentesco com um indivíduo afetado, maiores
são as chances de desenvolver a doença. Para parentes de primeiro grau o risco chega a
aproximadamente 20-50 vezes, e a taxa de concordância entre gêmeos idênticos varia de 20-35%
(Sospedra; Martin, 2005). Fortes associações genéticas com determinados alelos de HLA de classe II
também são observados, respondendo por 17-62% do risco genético para EM (Haines et al., 1998).
Dentre os genes que conferem suscetibilidade podemos citar o HLA-DR, em particular o alelo HLA-
DR15 em caucasianos, e o HLA-DQ (Laaksonen et al., 2002; Van Der Mei et al., 2009). Outros
polimorfismos também têm sido associados com a maior suscetibilidade a EM, como polimorfismos
da molécula CTLA-4 (Dincic et al., 2006; Mackay; Leskovsek; Rose, 2008), os polimorfismos dos
genes da IL-2 e IL-7 e das cadeias α dos seus respectivos receptores (IL-2RA e IL-7RA) (Hafler et al.,
2007; Sawcer, 2009; Cavanillas et al., 2010), e os polimorfismos de TLR3 e TLR9 (Ji et al., 2010). O
polimorfismo no locus do gene STAT-3, um componente crítico no processo autoimune dependente
de célula T
H
17, cuja associação é positiva para outras DAIs, não mostrou associação para o
desenvolvimento da EM em estudo recente (Cenit et al., 2010).
Fatores ambientais também compõem o grupo de fatores de risco. Dentre eles estão as
infecções virais, especificamente pelo vírus Epstein-Barr (EBV), bacterianas (Chlamydia
pneumoniae), além de influências hormonais, tabagismo, deficiência de vitamina D, dieta (Lunemann
et al., 2006; Lunemann et al., 2009). Para a participação da infecção viral por EBV no
desencadeamento da doença, a hipótese é de que não é o vírus per se a causa crítica, mas sim a
idade em que o indivíduo adquire a infecção (Lauer, 2010). Corroborando com essa hipótese, não há
infecção ativa de EBV no cérebro e líquido cérebro-espinhal (CSF) de pacientes com EM, sugerindo
que a infecção é o gatilho, mas não está presente nas lesões ativas da EM (Sargsyan et al., 2010).
Em relação às regiões geográficas do planeta, podemos dizer que a EM é mais comum nas regiões
temperadas e mais raras nas tropicais, porém há exceções. O fato da migração entre as regiões
alterar o risco de desenvolvimento da doença apóia a idéia da forte influência ambiental na etiologia
da EM (Sawcer, 2009).
As lesões no SNC são mediadas por células do sistema imune, e são as células T CD4
+
T
H
1
autorreativas, produtoras de IFN- , a população que desempenha o papel central na patogênese da
EM. As células T CD8
+
estão diretamente envolvidas na função efetora que promove a injúria do
SNC, prova disso é a presença de pronunciada expansão clonal de células T citotóxicas observada
em análises do CSF de pacientes com EM-SR (Muraro et al., 2006). O fato de que a expressão de
MHC de classe I é induzida em neurônios danificados também reforça o papel dos linfócitos T CD8
+
na injúria tissular.
Introdução 25
O infiltrado inflamatório é constituído de células B e T, macrófagos e micróglia ativada.
Anatomicamente, os linfócitos T estão presentes no sangue e no líquor, enquanto que os macrófagos
ativados estão nas placas escleróticas (Lutton; Winston; Rodman, 2004). Na meninge de pacientes
com EM-PS, também foram encontrados folículos ectópicos, que são similares aos folículos linfóides
de células B com centros germinais. Essas estruturas são formadas por células B em proliferação,
plasmócitos, células T e células dendríticas e possivelmente são sítios de produção, ativação e
proliferação de células B e T reativas a autoantígenos do SNC (Serafini et al., 2004). O
microambiente inflamatório contém uma variedade de substâncias que levam à injúria dos axônios,
como enzimas proteolíticas, citocinas, moléculas oxidativas, e radicais livres produzidos por células
ativadas do sistema imune e por células da glia (Trapp; Nave, 2008).
Têm surgido trabalhos indicando o papel das células T CD4
+
T
H
17 em patologias
autoimunes (Kikly et al., 2006; Bettelli; Oukka; Kuchroo, 2007). Várias condições autoimunes,
previamente assumidas como desordens mediadas por linfócitos T de padrão T
H
1, agora parecem
envolver também células de padrão T
H
17. Na patogênese da EAE (experimental autoimmune
encephalomyelitis), que é o modelo experimental da EM, já foi demonstrada a participação das
células T
H
17 (Miller et al., 2007). Em lesões de pacientes com EM foi observada a expressão de IL-17
e IL-23 (Tzartos et al., 2008), e acredita-se que a expansão de células T
H
17 possa contribuir para a
infiltração de células T anti-mielina específicas (Stromnes et al., 2008). A própria micróglia presente
no CNS tem a capacidade de produzir IL-23, IL-6 e TGF-β, possivelmente contribuindo para a
diferenciação e expansão dessa subpopulação celular (Racke, 2009).
Os principais autoantígenos na EM são a MBP (myelin basic protein), a PLP (proteolipid
protein) e a MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein). Essas proteínas são alvos das células T
autorreativas e dos autoanticorpos (Sospedra; Martin, 2005). Altos níveis de imunoglobulina são
encontrados no líquido cefalorraquidiano de pacientes com EM, mas não no soro, indicando a
produção local desses autoanticorpos. Porém, para efeito de diagnóstico e prognóstico da doença,
nenhum autoanticorpo específico conhecido até o momento é exclusivo de amostras de indivíduos
afetados por EM (Eggert; Zettl; Neeck, 2010).
Algumas terapias utilizadas no tratamento da EM envolvem a utilização de anticorpos
monoclonais, moléculas quiméricas, terapias orais, imunossupressores, imunomoduladores e células
tronco hematopoiéticas (Harrison; Calabresi, 2009). Desde 1993, seis terapias com drogas
imunomoduladoras tiveram seus benefícios provados por rigorosos ensaios clínicos de fase III (Coyle,
2009). As terapias existentes são parcialmente efetivas na intermitência dos danos inflamatórios
contínuos e na progressão da doença. Por ser uma doença complexa e provavelmente heterogênea
entre os pacientes, a combinação de estratégias terapêuticas tem potencial mais efetivo para o
tratamento da EM e já vem sendo utilizada, com vários regimes de combinação e ótimos resultados
(Conway; Cohen, 2010).
A imunossupressão em altas doses (IAD) seguida pelo transplante autólogo de células
tronco hematopoiéticas (TACTH) é uma nova estratégia terapêutica para doenças autoimunes e já
vem sendo utilizada em alguns centros de referência no tratamento da EM. Essa terapia tem
mostrado resultados positivos no tratamento da EM grave e refratária aos tratamentos convencionais.
Introdução 26
O intuito do IAD/TACTH é eliminar células autorreativas pela imunoablação e reconstituir o sistema
imune pela infusão de células tronco hematopoiéticas, restabelecendo a tolerância imunológica (Burt
et al., 2002; Lutton; Winston; Rodman, 2004; Sun et al., 2004; Burt et al., 2005; Muraro et al., 2005;
Burt et al., 2008)
1.5 Transplante autólogo de células tronco hematopoiéticas em doenças
autoimunes
Apesar dos bons resultados das terapias convencionais, alguns pacientes apresentam
formas de autoimunidade graves, progressivas e refratárias a esses tratamentos, e para estes
pacientes, o transplante autólogo de células tronco hematopoiéticas (TACTH) tem sido nos últimos
anos uma alternativa terapêutica. O transplante autólogo tem sido preferido ao TCTH alogênico
devido à elevada toxicidade e potencial rejeição observados neste segundo tipo de transplante.
O TACTH envolve a administração de células tronco hematopoiéticas que possuem a
capacidade de auto-renovação e de originar todos os tipos celulares maduros do sistema
hematopoiético e imunológico. O receptor é preparado para o transplante por um tratamento com
imunossupressor potente seguido pela infusão de células tronco hematopoiéticas autólogas, que
foram coletadas do próprio paciente antes da imunossupressão, para a reconstituição dos sistemas
hematopoiético e imunológico do receptor, evitando citopenias prolongadas (Sykes; Nikolic, 2005;
Burt et al., 2008).
O objetivo do transplante é destruir as células do sistema imune autorreativas e produzir um
novo sistema imune funcional, bem como substituir as células do tecido lesadas durante o curso da
doença. Resultados significantes a cerca do restabelecimento da tolerância e a diminuição da recaída
das DAIs, tem sido descritos após o transplante de células tronco em pacientes com doenças
autoimunes no Brasil e em todo mundo. Esses resultados sugerem que o transplante de células
tronco tem o potencial de se tornar uma importante abordagem terapêutica no tratamento de várias
DAIs (Rosa et al., 2007)
Têm sido demonstrado em ensaios clínicos que a imunossupressão em altas doses seguida
do TACTH é capaz de suprimir a atividade inflamatória em pacientes com DAI e pode induzir
remissões clínicas prolongadas, mas o mecanismo de ação do transplante ainda não está bem
elucidado. A idéia do TACTH é que a imunossupressão intensa possa eliminar os linfócitos
autorreativos e que o sistema imune reconstituído possa restabelecer a tolerância imunológica
(Bohgaki; Atsumi; Koike, 2008; Burt et al., 2008)
As três hipóteses, não mutuamente exclusivas, que explicariam os mecanismos de ação do
TACTH em DAI são: 1) a imunoablação intensa elimina a resposta imunológica patogênica; 2) o
TACTH reconstitui um novo sistema imune autotolerante; 3) as células tronco hematopoiéticas
Introdução 27
promovem reparo tecidual (Burt et al., 2002; Muraro; Martin, 2003). Atualmente, o mecanismo mais
aceito é a reprogramação do sistema imunológico após o TACTH, constituindo uma junção das duas
primeiras hipóteses citadas anteriormente. Conforme esse mecanismo, a imunossupressão em altas
doses eliminaria os linfócitos B e T autorreativos de memória e em seguida, baseando-se na premissa
de que fatores ambientais têm papel no desencadeamento das DAI, seria possível que a eliminação
do repertório de células B e T pré-existente permita que o sistema imunológico do paciente reinicie do
zero, gerando novos linfócitos B e T que sejam autotolerantes após o transplante (Sykes; Nikolic,
2005; Burt et al., 2008).
Não está claro se as células B e T de memória são completamente removidas do sistema
hematopoiético, linfóide e de órgãos alvos, por qualquer que seja o regime de condicionamento. Por
isso, a imunoablação incompleta pode ser responsável pelas recaídas precoces observadas em
alguns ensaios clínicos de TACTH (Tyndall; Saccardi, 2005). No entanto, mesmo com a
imunoablação incompleta, há evidências de melhora e remissão da DAI após o TACTH (Muraro;
Douek, 2006).
Dados de ensaios clínicos sugerem que o TACTH é viável e pode levar a remissão das DAI.
Embora os resultados variem de acordo com a doença, mais de um terço dos pacientes tem
apresentado remissões completas e prolongadas, freqüentemente sem necessidade de uso de
drogas imunossupressoras (Burt et al., 2003; Tyndall; Saccardi, 2005; Burt et al., 2008). Em algumas
doenças, no entanto, recaídas são relativamente freqüentes. Mesmo assim, dos pacientes que
recaem, vários passam a responder aos tratamentos convencionais que não eram efetivos antes do
transplante.
No Brasil, desde 2001, o grupo de pesquisa coordenado pelo Prof. Dr. Julio César Voltarelli
do Centro Regional de Hemoterapia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) da
Universidade de São Paulo (USP) têm estudado os mecanismos de ação do TACTH no tratamento de
DAI órgão-específicas e analisado as mudanças induzidas no sistema imune do paciente em
remissão e recaída após este tipo de transplante. Com esta finalidade, recentemente Farias (2006)
avaliou a reconstituição imunológica em pacientes transplantados com DM-1 e EM e verificou que
esta reconstituição foi alcançada via mecanismos periféricos timo-independentes. Os resultados
indicaram uma melhora nos mecanismos reguladores da resposta imune, observado pelo aumento de
células T reguladoras, que podem contribuir para o restabelecimento da tolerância imunológica, bem
como mudanças qualitativas e quantitativas na composição do repertório de células T nesses
pacientes submetidos ao TACTH.
Atualmente existem 35 ensaios clínicos em andamento, utilizando o TACTH para o
tratamento de DAIs, registrados no banco de dados ClinicalTrials.gov. Destes, 2 são para tratamento
do DM-1 e 5 para EM. Desses ensaios para EM, 4 já estão completos e o único em andamento é um
ensaio de fase III, cujo nosso grupo de pesquisa participa. Até 2008, o ensaio clínico brasileiro para
DM-1 era inédito no mundo, e foi baseado na segurança do tratamento comprovada pelos resultados
da fase I do nosso grupo, que um grupo chinês, coordenado pelo Dr. Guang Ning, elaborou esse
estudo registrado recentemente. A proposta, os critérios de inclusão e os procedimentos da terapias
são iguais ao ensaio clinico brasileiro, com pequenas diferenças, como a idade de inclusão dos
Introdução 28
pacientes e o tempo de seguimento pós-TACTH. Enquanto o ensaio brasileiro inclui pacientes entre
12 e 35 anos de idade e segue 5 anos de acompanhamento pós-transplante, o ensaio chinês inclui
pacientes de 14 a 35 anos e faz o seguimento de 3 anos pós-transplante.
Os resultados apresentados nesta dissertação fazem parte dos estudos brasileiros sobre os
mecanismos de ação da terapia de imunossupressão em altas doses (IAD) seguida do TACTH,
avaliando o possível papel de genes relacionados aos linfócitos T na patogênese do DM-1 e EM e no
restabelecimento da tolerância imunológica após o TACTH.
“Devemos julgar um homem mais pelas suas perguntas que pelas respostas”
Voltaire (1694-1778)
Filósofo francês
O
O
B
B
J
J
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T
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I
I
V
V
O
O
S
S
Objetivos 30
2 Objetivos
2.1 Objetivo geral
Avaliar a expressão de genes relacionados a células T reguladoras, T
H
17, T
H
1 e T
H
2 em
pacientes com diabete melito do tipo 1 (DM-1) e com esclerose múltipla (EM) antes e em vários
períodos após o tratamento com imunossupressão em altas doses seguida pelo transplante autólogo
de células tronco hematopoiéticas (TACTH), visando relacionar os seus possíveis papéis na
patogênese dessas doenças autoimunes, bem como determinar o efeito da terapia de
imunossupressão em altas doses seguida pelo TACTH na modulação desses genes nos pacientes
com DM-1 e EM.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar, previamente (período pré-transplante) e durante o seguimento de 3 anos após
tratamento (períodos pós-transplante: D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080):
1. A expressão de genes relacionados a células T reguladoras, tais como genes de citocinas (IL-
10, TGF- ), fatores de transcrição (Foxp3) e outras moléculas tais como CD25, PD-1, GITR e
CTLA-4, em células mononucleares do sangue periférico;
2. A expressão de genes relacionados a células T
H
17, tais como genes de citocinas (IL-6, TGF-
, IL-17, IL-23, IL-25 e IL-27) e fatores de transcrição (ROR t, STAT-3), em células
mononucleares do sangue periférico;
3. A expressão de genes relacionados a células T
H
1 e T
H
2, tais como genes de citocinas (IL-10,
IL-4, IFN- , TNF- ) e fatores de transcrição (GATA3, STAT-6, T-bet, STAT-1, STAT-4), em
células mononucleares do sangue periférico;
4. Comparar a expressão dos genes nos pacientes com DM-1 e EM ao perfil de expressão
obtido nos indivíduos controles.
"Todo grande progresso da ciência resultou de uma nova audácia da imaginação"
John Dewey (1859-1952)
Filósofo e pedagogo norte-americano
C
C
A
A
S
S
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I
I
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É
T
T
O
O
D
D
O
O
S
S
Casuística, Materiais e Métodos 32
3 Casuística, Material e Métodos
3.1 Pacientes com doenças autoimunes
Foram incluídos neste estudo pacientes com diabete melito do tipo 1 e esclerose múltipla,
submetidos ao tratamento com imunossupressão em altas doses (IAD) seguida de transplante
autólogo de células tronco hematopoiéticas (TACTH) de dezembro de 2002 a dezembro de 2008, na
Unidade de Transplante de Medula Óssea (TMO) do Hospital das Clínicas da FMRP-USP. Os
protocolos de transplante específicos para cada uma destas doenças autoimunes estudadas foram
aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas da FMRP-USP (Diabete melito do tipo 1 -
Proc. 10095/02, Esclerose múltipla - Proc. 2693/2001) e pela Comissão Nacional de Ética em
Pesquisa – CONEP (Diabete melito do tipo 1 - RG 7160, Esclerose múltipla - RG 2944). Ao todo,
foram transplantados 22 pacientes com esclerose múltipla, mas apenas 17 foram incluídos neste
estudo, e 24 pacientes com diabete melito do tipo 1, dos quais 22 foram incluídos neste trabalho.
Os critérios de inclusão dos pacientes com DM-1 para realização do TACTH foram: idade
inferior a 35 anos, diagnóstico de DM-1 estabelecido recentemente, até no máximo seis semanas, ou
até o primeiro episódio de cetoacidose diabética e positividade para anticorpos anti-GAD65.
Os parâmetros laboratoriais avaliados nesses pacientes selecionados incluíram: dosagem
de glicose (mg/dL), dose de insulina (UI/kg/dia), porcentagem de hemoglobina glicosilada A
1C
(Hb
A
1C)
, títulos de autoanticorpos GAD65 (UI/mL) e níveis séricos de peptídeo-C ( g/mL). Em relação à
dosagem de glicose, a Associação Americana de Diabetes recomenda níveis de glicemias de jejum e
pré-prandiais entre 90 mg/dL e 130 mg/dL e de Hb A
1C
menor que 7,0% (STANDARDS OF MEDICAL
CARE IN DIABETES, 2006). Entretanto, a Associação Americana de Endocrinologia e a Federação
Internacional de Diabetes sugerem que os níveis de Hb A
1C
devam ser mantidos em níveis ainda mais
baixos (<6,5%) (AMERICAN COLLEGE OF ENDOCRINOLOGY AND AMERICAN DIABETES
ASSOCIATION, 2006). Os resultados de dosagem dos níveis séricos de anticorpos anti-GAD65 são
considerados positivos quando forem maior que 1,0 U/mL (Voltarelli et al., 2007). O peptídeo-C, co-
armazenado e co-secretado com a insulina em quantidades equimolares, representa a produção de
insulina endógena pelo pâncreas. Os níveis séricos de peptídeo-C devem estar entre 0,5 e 3,0 ηg/mL
(Rodacki et al., 2008).
Os critérios de seleção dos pacientes com EM para realização do transplante foram: idade
entre 18 e 60 anos, diagnóstico clínico estabelecido de EM de acordo com os critérios de McDonald
(Polman et al., 2005), presença de imagens típicas de EM detectadas por ressonância magnética
nuclear (RMN), pacientes com EM de evolução progressiva (formas progressiva secundária,
progressiva primária ou surto-remissiva) (Lublin; Reingold, 1996), duração da doença superior ou
igual a um ano, resposta insatisfatória às terapias convencionais (IFN- e pulsoterapia com
corticosteróides), EDSS (Expanded Disability Status Score) entre 3,0-6,5, progressão das
Casuística, Materiais e Métodos 33
incapacidades mantida por pelo menos seis meses nos últimos dois anos e elevação de 1,5 ponto no
EDSS (quando o inicial estava entre 3,0 e 5,0) ou de 1,0 ponto ou mais, se o EDSS inicial era de 5,5
ou maior. O EDSS constitui uma escala de medida da incapacidade, ou seja, uma avaliação das
condições neurológicas do paciente, que varia de 0 (exame neurológico normal) a 10 (óbito).
Tabela 1 – Características demográficas e dados clínico-laboratoriais dos pacientes com DM-1 no período pré-transplante.
P
P
A
A
C
C
I
I
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S
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)
DM 01
M/24
36,0
477
0,48
12.01.04
71
DM 02
M/27
49,0
589
0,29
15.03.04
69
DM 03
M/21
1,1
381
0,39
03.05.04
67
DM 04
M/15
22,0
321
0,36
05.07.04
65
DM 05
M/16
51,0
404
0,52
03.02.05
58
DM 06
M/14
17,0
504
0,26
03.05.05
55
DM 07
F/20
4,0
391
0,48
25.05.05
55
DM 08
M/16
48,0
314
0,35
12.09.05
51
DM 09
F/18
102,0
330
0,42
20.09.05
51
DM 10
F/17
44,0
612
0,61
10.10.05
50
DM 11
M/16
11,0
130
0,10
22.11.05
49
DM 12
F/15
11,0
581
0,22
03.05.06
43
DM 13
M/24
24,0
269
0,28
05.06.06
42
DM 14
M/31
37,0
273
0,32
17.07.06
41
DM 15
M/16
21,1
291
0,66
28.08.06
40
DM 16
M/14
5,3
384
0,30
20.07.07
29
DM 17
M/18
2,9
236
0,35
10.08.07
28
DM 18
M/22
7,0
324
0,25
10.08.07
28
DM 19
F/16
1,1
439
0,34
09.10.07
26
DM 20
M/14
16,0
793
0,23
05.11.07
25
DM 21
M/13
29,0
485
1,00
20.12.07
24
DM 22
F/15
10,0
390
0,44
31.03.08
21
TACTH, Transplante autólogo de células tronco hematopoiéticas. Níveis séricos de anticorpos anti-GAD antibodies foram dosados por radioimunoensaio
usando kits comerciais (R.S.R. Limited, Cardiff, UK), laboratórios do Hospital das Clínicas da FMRP-USP. Resultados foram considerados positivos se >
1U/mL. Regime de Mobilização: Ciclofosfamida (2g/m
2
) + G-CSF (10 μg/Kg/dia). Regime de condicionamento: Ciclofosfamida (4X 50 mg/Kg/dia) + ATG
coelho (4,5 mg). ND, não determinado.
Casuística, Materiais e Métodos 34
Os pacientes com EM submetidos ao TACTH apresentavam formas progressivas da
doença, refratárias ao tratamento com corticosteróides e interferon-β. Dentre os 17 pacientes
avaliados, três apresentavam a forma surto-remissiva da doença, três a forma progressiva primária e
11 a forma progressiva secundária.
As tabelas 1 e 2 resumem as principais características demográficas dos pacientes com
DM-1 (Tabela 1) e EM (Tabela 2). Nessas tabelas, há também a descrição de dados clínicos e
laboratoriais anteriores ao transplante e informações sobre o regime de condicionamento utilizado nos
pacientes.
Tabela 2 – Características demográficas e dados clínico-laboratoriais dos pacientes com EM do período pré-TACTH.
P
P
A
A
C
C
I
I
E
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-
T
T
A
A
C
C
T
T
H
H
(
(
M
M
E
E
S
S
E
E
S
S
)
)
EM 01
M/37
PS
Ausência
BEAM + ATG cavalo
19.05.03
79
EM 02
M/51
PS
Ausência
BEAM + ATG cavalo
16.06.03
78
EM 03
M/51
PS
Presença
BEAM + ATG cavalo
04.10.03
74
EM 04
F/42
PS
Ausência
BEAM + ATG cavalo
19.02.04
70
EM 05
F/42
PS
ND
BEAM + ATG cavalo
02.06.04
66
EM 06
M/21
PP
Presença
BEAM + ATG cavalo
22.07.04
65
EM 07
M/52
PP
Ausência
BEAM + ATG cavalo
09.09.04
63
EM 08
M/45
PS
Ausência
Ciclof + ATG coelho
11.05.05
55
EM 09
F/48
SR
Ausência
Ciclof + ATG coelho
10.06.05
54
EM 10
M/54
PP
Ausência
Ciclof + ATG Coelho
21.06.05
54
EM 11
F/34
PS
Ausência
Ciclof + ATG coelho
23.08.05
52
EM 12
F/42
PS
Ausência
Ciclof + ATG coelho
20.10.05
50
EM 13
M/50
PS
Ausência
Ciclof + ATG coelho
04.11.05
49
EM 14
F/35
PS
Ausência
Ciclof + ATG coelho
01.02.06
46
EM 15
F/37
SR
Ausência
Ciclof + ATG coelho
22.02.06
46
EM 16
F/31
SR
Presença
Ciclof + ATG coelho
23.03.06
45
EM 17
M/33
PS
Ausência
Ciclof + ATG coelho
11.04.06
44
TACTH, Transplante autólogo de células tronco hematopoiéticas; EM, esclerose múltipla; PS, esclerose múltipla progressiva secundária; PP, esclerose
múltipla primária progressiva; SR, esclerose múltipla surto-remissiva; RMN, Ressonância Magnética Nuclear; Ausência, ausência de lesões de atividade
inflamatória por RMN; Presença, presença de lesões de atividade inflamatória por RMN; BEAM, BCNU, etoposídeo, aracitin, melfalan; ATG, Antithimocyte
globulin, G-CFS, Granulocyte-colony stimulating factor; ND, não determinado. Regime de mobilização: Ciclofosfamida (2g/m
2
) + G-CSF (10 μg/Kg/dia).
Regime de condicionamento: BEAM + ATG cavalo (6x 15mg/kg/dia), ou Ciclofosfamida (4 x 50 mg/Kg/dia) + ATG coelho (4,5 mg).
O esquema do tratamento de imunossupressão em altas doses (IAD) seguido do TACTH foi
constituído por quatro etapas: fase de mobilização das células tronco hematopoiéticas (CTH) para o
sangue periférico, fase de condicionamento constituída pela administração de droga
imunossupressora (ciclofosfamida) em altas doses, fase de infusão ou transplante propriamente dito
Casuística, Materiais e Métodos 35
das CTH autólogas e a fase de seguimento dos pacientes nos diferentes períodos pós-transplante
(D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080).
Fase de mobilização das células tronco hematopoiéticas: As CTH foram mobilizadas da medula
óssea para o sangue periférico nesses pacientes com ciclofosfamida (2 g/m
2
) e fator estimulador de
colônias granulocíticas (G-CSF) (10 μg/Kg/dia). O início da coleta foi determinado pela contagem de
leucócitos e de células CD34
+
no sangue periférico: leucócitos >1000/mm
3
e células CD34
+
>10
células/mm
3
. A aférese foi realizada uma ou duas vezes até atingir o valor mínimo de 3,0 x 10
6
CD34
+
/kg de peso. Foram coletadas entre 5,8-23,1 x 10
6
células CD34
+
/kg (média 10,6 x 10
6
/kg) dos
pacientes com DM-1 e entre 3,4-25,1 x 10
6
células CD34
+
/kg (média 8,5 x 10
6
/kg) dos pacientes com
EM. Após a coleta, as CTH autólogas foram criopreservadas e armazenadas em nitrogênio líquido até
o momento do transplante.
Fase de condicionamento: Os pacientes com DM-1 receberam ciclofosfamida (4x 50 mg/Kg/dia) e
globulina anti-timocitária (ATG) de coelho (4,5 mg). Os sete primeiros pacientes com EM receberam
um regime de condicionamento constituído de poliquimioterapia denominada BEAM (BiCNU ,
etoposídeo, citarabina e melfalan) associado à ATG de cavalo (6x 15mg/kg/dia) e os outros dez
pacientes com EM foram submetidos ao mesmo regime de condicionamento dos pacientes com DM-
1.
Infusão das células tronco hematopoiéticas: A infusão das CTH ocorreu no dia zero, que é a data
em que o transplante foi realizado. Foram administrados G-CSF (5 μg/Kg/dia) no dia +5 até o dia no
qual a contagem de neutrófilos atingisse valor >1,000/mm
3
. Na maioria dos pacientes foi infundida a
quantidade total de células CD34
+
coletadas. O esquema desta terapia de imunossupressão em altas
doses seguida do TACTH realizada pela equipe do TMO do HCFMRP-USP está ilustrado na Figura 1.
Seguimento do paciente pós-TACTH: Os pacientes permaneceram internados na Unidade de TMO
do HCFMRP-USP até a enxertia e em seguimento ambulatorial intensivo no Hospital-Dia até
aproximadamente 60 dias após o transplante. Após esse período, os pacientes retornaram às suas
residências e compareceram a consultas periódicas de acompanhamento no ambulatório da Unidade
de TMO do HCFMRP-USP.
Casuística, Materiais e Métodos 36
Figura 1 – Esquema do procedimento da terapia de imunossupressão em altas doses seguida do
TACTH utilizado na unidade de TMO do HCFMRP-USP (adaptado do livro “Células tronco: A nova fronteira da
medicina”, Zago e Covas, 2006).
Foram colhidas amostras de sangue periférico dos pacientes aproximadamente nos seguintes
períodos: pré-mobilização (ou basal, ou pré-transplante), dias D+180, D+360, D+540, D+720, D+900
e D+1080 pós-transplante. As coletas das amostras de sangue periférico e soro foram adaptadas aos
retornos dos pacientes ao hospital após o transplante. Portanto, nem sempre as datas das coletas
coincidiram exatamente com as datas programadas citadas anteriormente. Além disso, nem todos os
pacientes possuem amostras coletadas de todos os períodos citados acima, devido principalmente ao
estado clínico do paciente ou ao não comparecimento do paciente aos retornos determinados.
A avaliação da resposta clinica-laboratorial à terapia de imunossupressão em altas doses
seguida pelo TACTH dos pacientes com DM-1 foi realizada por meio da determinação dos seguintes
parâmetros laboratoriais: dose de insulina utilizada, concentração de Hb A1
C
, títulos de anticorpos
anti-GAD65 e níveis séricos de peptídeo-C proinsulínico. A Hb A1
C
indica os níveis de glicose no
sangue de um paciente, fornecendo uma média das glicemias nos últimos três meses. Os níveis de
peptídeo-C são diretamente relacionados à massa de células pancreáticas.
Para os pacientes com EM, a resposta clínica à terapia seguida do TACTH foi avaliada pela
freqüência e intensidade de recaídas clínicas observadas pelo exame neurológico, pelo valor de
EDSS e pelo número e volume de lesões ativas observadas pela RMN. O aumento de 1,0 ou mais
pontos na escala EDSS em dois exames repetidos, num intervalo mínimo de três meses, caracteriza
progressão neurológica da EM. Por outro lado, a diminuição de 1,0 ou mais pontos na escala EDSS
em dois exames repetidos, num intervalo mínimo de três meses, caracteriza melhora e conseqüente
remissão da doença (Kurtzke, 1983).
Casuística, Materiais e Métodos 37
3.2 Controles saudáveis
As amostras de sangue periférico utilizadas como controles foram obtidas de indivíduos
saudáveis, doadores voluntários de repetição do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto
(CRH) do Hospital das Clínicas da FMRP-USP, sob consentimento informado. Nos Apêndices A e B
encontram-se os modelos dos termos assinados pelos voluntários menores de idade e pelos maiores
de idade, respectivamente.
Tabela 3 – Características demográficas do grupo controle referente aos pacientes com DM-1.
Grupo IC do DM-1
Controles
Idade
Sexo
C 01 DM
21
Feminino
C 02 DM
21
Feminino
C 03 DM
22
Feminino
C 04 DM
16
Feminino
C 05 DM
16
Feminino
C 06 DM
16
Feminino
C 07 DM
17
Feminino
C 08 DM
17
Feminino
C 09 DM
29
Masculino
C 10 DM
22
Masculino
C 11 DM
31
Masculino
C 12 DM
24
Masculino
C 13 DM
19
Masculino
C 14 DM
22
Masculino
C 15 DM
26
Masculino
C 16 DM
25
Masculino
C 17 DM
29
Masculino
C 18 DM
27
Masculino
C 19 DM
17
Masculino
C 20 DM
16
Masculino
Foram coletados 10 mL de sangue periférico dos indivíduos do grupo controle em tubo
contendo o anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético). O sangue obtido foi utilizado
para o isolamento de células mononucleares. As Tabelas 3 e 4 mostram as características
demográficas básicas de cada indivíduos dos grupos controle dos pacientes com DM-1 e EM,
respectivamente.
Casuística, Materiais e Métodos 38
Tabela 4 - Características demográficas do grupo controle referente aos pacientes com EM.
Grupo IC do EM
Controles
Idade
Sexo
C 01 EM
33
Feminino
C 02 EM
46
Feminino
C 03 EM
31
Feminino
C 04 EM
45
Feminino
C 05 EM
44
Feminino
C 06 EM
44
Feminino
C 07 EM
38
Feminino
C 08 EM
30
Feminino
C 09 EM
40
Feminino
C 10 EM
22
Masculino
C 11 EM
32
Masculino
C 12 EM
54
Masculino
C 13 EM
39
Masculino
C 14 EM
42
Masculino
C 15 EM
59
Masculino
C 16 EM
44
Masculino
C 17 EM
37
Masculino
C 18 EM
32
Masculino
Tabela 5 – Pareamento das características dos grupos de pacientes de cada DAI com seu respectivo grupo de
indivíduos controles (IC).
Grupos
N
Sexo
Faixa etária
(média±SD)
Pacientes DM-1
22
16 M
06 F
15 – 31
(19,0 ± 4,6)
Controles DM-1
20
12 M
08 F
16 – 31
(21,6 ± 4,6)
Pacientes EM
17
08 M
09 F
21 – 54
(41,5 ± 8,9)
Controles EM
18
09 M
09 F
22 – 59
(39,5 ± 8,9)
M – masculino; F – feminino.
Casuística, Materiais e Métodos 39
Para cada doença foi formado um grupo de indivíduos controles (grupo IC) próprio. O grupo
controle para comparação dos resultados obtidos aos dos pacientes com DM-1 foi composto por 20
indivíduos saudáveis, 12 do sexo masculino e 8 do sexo feminino, com idade entre 16 a 31 anos
(21,6 + 4,6). O grupo controle dos pacientes com EM foi composto por 18 indivíduos saudáveis,
sendo 9 do sexo masculino e 9 do sexo feminino, com faixa etária de 22 a 59 (39,5 + 8,9). Esses
dados estão agrupados na Tabela 5.
3.3 Isolamento das células mononucleares periféricas
Amostras de 50-70 mL sangue periférico de pacientes com DAIs pré ou pós-TACTH, colhidos
na presença de heparina sódica (14UI/mL), foram separadas por centrifugação em gradiente de
densidade. As amostras foram diluídas 1:2 em tampão fosfato (PBS), aplicadas cuidadosamente
sobre Ficoll Hypaque (d=1,077, Sigma), e centrifugadas a 500g por 30 minutos a temperatura
ambiente (TA) para obtenção da camada de células mononucleares. As células presentes na
interfase plasma-Ficoll Hypaque foram cuidadosamente coletadas e lavadas duas vezes com PBS,
ressuspensas em RPMI 1640 contendo 10% soro fetal bovino, e contadas em câmara de Neubauer.
Para congelamento, 0,5x10
7
células mononucleares foram ressuspensas em solução de
congelamento (soro fetal bovino + 10% de DMSO). As células foram aliquotadas em vials de
congelamento de 1 mL geladas e colocadas em freezer a -20°C por 30 minutos, transferidas para
freezer -80°C overnight e depois para um tanque de N
2
líquido. Para extração de RNA, 1x10
7
células
foram ressuspensas e lisadas em 1 mL de Trizol e estocadas em freezer -80°C até a extração.
Toda a metodologia, a partir deste item, procurou atender às exigências mínimas (Bustin et
al., 2009) para a garantir a confiabilidade dos resultados gerados.
3.4 Extração de RNA pelo método de Trizol
A extração do RNA das células mononucleares do sangue periférico foi realizada pelo método
descrito por Chomzynski e Sacchi (1987), o qual utiliza solução de Trizol (Life Technologies, Grand
Island, NY, USA) para isolamento de RNA total. Trizol é uma solução monofásica de fenol e
isotiocianato de guanidina que rompe a célula mantendo a integridade do RNA. Partindo de uma
suspensão de aproximadamente de 1x10
7
células mononucleares lisadas em 1 mL de Trizol,
adicionou-se 0,005 mL de glicogênio (20μg/μL) e 0,2 mL de clorofórmio para cada mL de trizol,
seguido de agitação vigorosa por aproximadamente 15 segundos. O material foi posteriormente
incubado por 2 a 3 minutos a TA e centrifugado por 15 minutos a 12.000g a 4
o
C. Após esta
centrifugação ocorre a separação da solução em três fases (aquosa, interface e orgânica). A fase
Casuística, Materiais e Métodos 40
aquosa foi transferida para um novo tubo contendo 0,5 mL de álcool isopropílico para cada mL de
trizol, para a precipitação do RNA. Este tubo foi homogeneizado por inversão, seguido de incubação
overnight a -20°C e então centrifugado novamente a 12.000g por 15 minutos a 4
o
C. O sobrenadante
foi removido e o “pellet” de RNA lavado com etanol 70% diluído em água DEPC (Dietilpirocarbonato,
Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha) seguido de centrifugação a 7.500g por 5 minutos a 4
o
C. O RNA
assim obtido foi deixado secar por 5 minutos para evaporação do etanol e então ressuspendido em
13 µL de água DEPC. Após extração, o RNA obtido foi quantificado através de leitura em
espectrofotômetro (Beckman, DU530, Fullerton, CA, USA) nos comprimentos de onda (λ) de 260 e
280 nm. O grau de pureza da amostra foi verificado através da análise da relação entre 260 e 280nm.
Sendo considerada uma boa extração aquela que apresentou valores entre 1,6 a 1,8. Para o cálculo
da concentração da amostra considerou-se que a densidade ótica (DO) igual a 1 corresponde a 40 µg
de RNA /mL no comprimento de onda de 260 nm (Sambrook, 1989). Para cada amostra foi feito o
ajuste da concentração para 1,0 μg/μL e este material foi mantido a -80
o
C até o momento da
transcrição. Para observação da pureza e integridade do RNA, as amostras foram carregadas em gel
de agarose 1% em tampão TAE 1x corado com Brometo de Etídeo (0,5 µg/mL) e submetidas à
corrida eletroforética a 80 V durante 90 minutos. As bandas observadas correspondem aos RNAr
28S, 18S e 5S. As maiores bandas, 28S e 18S devem aparecer no gel na proporção 2:1
respectivamente. A banda 5S deve aparecer menos intensa possível, pois quanto mais intensa essa
banda maior o nível de degradação do RNA.
3.5 Síntese de cDNA
Após constatação da qualidade e pureza do RNA, a transcrição reversa do RNA para cDNA
foi realizada utilizando um kit comercial (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied
Biosystems). Foram adicionados num tubo de 0,2 mL: 2µg de RNA total, 10µL de 10X RT Buffer,
10,4µL de 25X dNTP Mix (100 mM), 10μL de 10X RT Random Primers, 5μL de MultiScribe
TM
Reverse
Transcriptase, 0,3μL de RNaseOUT
TM
(40U/µL) e água DEPC q.s.p. 100µL. A reação foi gentilmente
misturada e colocada em termociclador programado para 1 ciclo de 10 min a 25°C seguido de 2 horas
a 37°C. Em seguida, a reação foi mantida a 4°C, e posteriormente o cDNA foi estocado a -20
o
C.
Validação da transcrição
O gene da β-actina tem sido comumente utilizado como controle da reação de transcrição do
RNA em cDNA. Para esta reação foram utilizados 2 µL do cDNA transcrito, 5 µL de tampão para PCR
10X, 1,5 µL de 1,5 mM MgCl
2
, 1 µL de 10 mM dNTP mix, 1 µL de cada "primer" (10 µM), 0,4 µL de
Taq polimerase (5 unidades/µL) e água DEPC q.s.p. 50µL. A reação foi misturada e centrifugada
Casuística, Materiais e Métodos 41
brevemente, colocada em termociclador pré-aquecido a 94
o
C, e submetida a um passo de
desnaturação inicial por 2 minutos a 94
o
C, seguido por 30 ciclos de PCR (desnaturação a 94
o
C por 15
segundos, anelamento a 55
o
C por 30 segundos e extensão a 72
o
C por 1 minuto, completados por
uma extensão final de 5 minutos a 72
o
C). Em seguida, a reação foi mantida a 4°C. O produto desta
reação foi carregado em gel de agarose 1% corado com Brometo de Etídeo (0,5µg/mL) e submetido à
corrida eletroforética a 100 V durante 40 minutos. O tamanho esperado do produto de PCR é de
120pb.
3.6 PCR em Tempo Real
As reações de PCR em Tempo Real foram realizadas em placas de 96 poços, utilizando os
reagentes TaqMan
TM
(Applied Biosystems, USA) e o equipamento 7500 Real Time PCR system
(Applied Biosystems, USA). As sondas referentes aos 23 genes-alvo e aos 2 endógenos que foram
utilizadas no experimento estão listadas na Tabela 6. Os genes endógenos GAPDH (Glyceraldehyde-
3-phosphate dehydrogenase) (P/N 4326317E, Applied Biosystems) e TBP (TATA box binding protein)
(P/N 4326322E) foram utilizados como genes de referência para normalizar as reações de PCR para
a quantidade e qualidade de RNA total usada nas reações de transcrição reversa.
A determinação da intensidade de fluorescência na reação foi feita pelo cálculo do ΔRn (ΔRn =
Rn
+
- Rn
-
), onde Rn
+
= intensidade de emissão do FAM/VIC > intensidade de emissão do ROX em um
dado momento da reação, e Rn
-
= intensidade de emissão do FAM/VIC < intensidade de emissão do
ROX, antes da amplificação. O composto ROX é utilizado como controle interno passivo, pois a
fluorescência que emite tem intensidade constante durante toda a reação, enquanto que o a
fluorescência emitida pelo FAM aumenta à medida que as sondas MGB são liberadas durante cada
ciclo de amplificação.
Durante os ciclos iniciais da reação, não há acúmulo de produtos de amplificação e os valores
de ΔRn permanecem na linha de base (fluorescência do ROX > FAM/VIC). Na fase logarítmica da
reação ocorre acúmulo dos produtos de amplificação e a ΔRn ultrapassa a linha de base. Para a
quantificação relativa, após a reação foi estabelecido um valor de ΔRn, que é uma linha de corte
(threshold) para cada curva de amplificação, definida acima da fluorescência inespecífica. O número
do ciclo em que a ΔRn da amostra cruza o threshold corresponde ao C
T
(cycle threshold) da amostra.
O valor de C
T
é preditivo da quantidade de RNAm alvo presente na amostra.
Na padronização das reações de PCR em tempo real, os cDNAs e sondas para os genes
endógenos e para os alvos foram titulados e foi calculada a eficiência da amplificação para as
reações. Para a padronização, foram testados diferentes volumes de reação (50μL, 25μL, 20μL, 15μL
e 10μL) e diferentes diluições de cDNA (puro, 4 diluições de fator 2 e 4 diluições de fator 5). Todas as
reações foram feitas em triplicatas. Nas placas foram corridos simultaneamente o mesmo cDNA (em
diferentes diluições) com as diferentes sondas, a fim de se construir uma curva de eficiência para
validar o método de análise 2
-ΔΔC
T
.
Casuística, Materiais e Métodos 42
Tabela 6 – TaqMan
®
Gene Expression Assays utilizados para análise da expressão gênica dos pacientes e controles.
Gene Symbol
RefSeq
Gene Name
Assay ID
Probe
GAPDH
NM_002046.33
Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
P/N 4326317E
VIC/MGB
TBP
NM55654.1
TATA box binding protein
P/N 4326322E
VIC/MGB
IL-10
NM_000572.2
interleukin 10
Hs00174086_m1
FAM/MGB
TGFB1 (TGF-β)
NM_000660.3
transforming growth factor, beta 1
(Camurati-Engelmann disease)
Hs00171257_m1
FAM/MGB
FOXP3
NM_014009.2
forkhead box P3
Hs00203958_m1
FAM/MGB
IL2RA (CD25)
NM_000417.1
interleukin 2 receptor, alpha
Hs00166229_m1
FAM/MGB
PDCD1 (PD-1)
NM_005018.1
programmed cell death 1
Hs00169472_m1
FAM/MGB
TNFRSF18 (GITR)
NM_148901.1
NM_148902.1
NM_004195.2
tumor necrosis factor receptor superfamily,
member 18
Hs00188346_m1
FAM/MGB
CTLA4
NM_001037631.1
NM_005214.3
cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
Hs00175480_m1
FAM/MGB
IL6
NM_000600.1
interleukin 6 (interferon, beta 2)
Hs00174131_m1
FAM/MGB
IL17A
NM_002190.2
interleukin 17A
Hs00174383_m1
FAM/MGB
IL21
NM_021803.2
interleukin 21
Hs00222327_m1
FAM/MGB
IL23A
NM_016584.2
interleukin 23, alpha subunit p19
Hs00372324_m1
FAM/MGB
IL25
NM_172314.1
NM_022789.2
interleukin 25
Hs00224471_m1
FAM/MGB
IL27
NM_145659.3
interleukin 27
Hs00377366_m1
FAM/MGB
RORC (RORγt)
NM_001001523.1
NM_005060.3
RAR-related orphan receptor C
Hs01076112_m1
FAM/MGB
STAT3
NM_213662.1
NM_139276.2
NM_003150.3
signal transducer and activator of
transcription 3 (acute-phase response
factor)
Hs01047580_m1
FAM/MGB
IL4
NM_172348.1
NM_000589.2
interleukin 4
Hs00174122_m1
FAM/MGB
IFNG
NM_000619.2
Interferon, gamma
Hs99999041_m1
FAM/MGB
TNF
NM_000594.2
tumor necrosis factor (TNF superfamily,
member 2)
Hs00174128_m1
FAM/MGB
GATA3
NM_001002295.1
NM_002051.2
GATA binding protein 3
Hs00231122_m1
FAM/MGB
Casuística, Materiais e Métodos 43
STAT6
NM_003153.3
signal transducer and activator of
transcription 6, interleukin-4 induced
Hs00598618_m1
FAM/MGB
TBX21 (T-bet)
NM_013351.1
T-box 21
Hs00203436_m1
FAM/MGB
STAT1
NM_139266.1
NM_007315.2
signal transducer and activator of
transcription 1, 91kDa
Hs00234829_m1
FAM/MGB
STAT4
NM_003151.2
signal transducer and activator of
transcription 4
Hs00231372_m1
FAM/MGB
Para o cálculo da eficiência foi utilizada a equação E = 10
(-1/slope)
, onde E corresponde à
eficiência e slope corresponde ao coeficiente de angulação da curva (Pfaffl, 2001). Para cada gene
estudado foi realizada uma reação com diluições seriadas de amostra de cDNA (1/2 a 1/16) e a sonda
de interesse. Os valores de C
T
obtidos foram plotados em gráfico para cálculo do slope e da
eficiência. O método de 2
-ΔΔC
T
, só pode ser usado para cálculo da quantificação relativa se eficiência
do gene algo for igual à eficiência do(s) gene(s) endógeno(s), e ambas sejam iguais a 100% (± 10%).
São apresentados no Apêndice C dados referente à padronização de cada gene, como valor
de threshold, baseline, C
T
, Slope e R
2
(determinado pelo 7500 Software v2.0), equação de regressão
e R
2
(calculados a partir da curva de diluição). No Apêndice D são apresentadas as razões entre a
expressão dos genes endógenos nos diferentes grupos de amostras/tratamentos. Todas as razões
foram próximas a 1, o que indica ausência de variação na expressão do gene controle endógeno
entre os diferentes grupos/tratamentos. Assim validamos a escolha do GAPDH e do TBP como
controles endógenos.
Cada reação singleplex de PCR em tempo real foi composta por 50% de 2X TaqMan®
Universal PCR Master Mix, 5% de 20X Control Primers and Probe, 2μL de cDNA e Rnase-free water
suficiente para completar o volume final. As corridas foram submetidas às condições de
termociclagem universal, composta por dois passos iniciais de desnaturação (2 min a 50°C, seguido
de 10 min a 95°C), e 40 ciclos com um passo de desnaturação (15 seg a 95°C) e outro de
anelamento/extensão (1 min a 60°C). Os dados foram coletados no último passo de cada ciclo (1 min
a 60°C).
Os ensaios de expressão dos genes alvos e endógenos das amostras, tanto dos pacientes
como do grupo controle, foram realizadas em singleplex, conforme protocolo descrito anteriormente, e
cada amostra foi corrida em triplicata. Foram considerados valores de C
T
s válidos somente os quais
nas triplicatas o desvio padrão foi <0,5. Foram desconsideradas as amostras que não amplificaram ou
amplificaram com C
T
≥ 39.
Em nosso projeto, a normalização e quantificação relativa da expressão gênica foram
realizadas pelo método de 2
-ΔΔC
T
(Livak et al., 2001), onde C
T
= threshold cicle (ciclo da reação em
que a fluorescência da amostras excede o threshold), e ΔΔC
T
= (C
T, alvo
- C
T, endógeno
)
pós-transplante
- (C
T,
alvo
- C
T, endógeno
)
pré-transplante.
Usando o método de 2
-ΔΔC
T
, os dados são representados como diferença
(em vezes) na expressão gênica, que foi normalizada para um ou mais genes endógenos de
referência e é relativa a um controle (ou calibrador). Em nossos experimentos, foram realizadas duas
análises. Na primeira, o calibrador usado foi o valor basal ou pré-transplante. Para o calibrador, o
Casuística, Materiais e Métodos 44
ΔΔC
T
é igual a zero e 2
0
é igual a um, assim mudança na expressão gênica relativa ao período pré-
transplante é igual a um. Para os períodos pós-transplante, o valor de 2
-ΔΔC
T
indica a diferença (em
vezes) na expressão gênica relativa ao período pré-transplante. Na segunda análise, usamos como
calibrador os valores de expressão dos indivíduos controles, para assim, obtermos a diferença na
expressão gênica dos pacientes com doença autoimune em relação a indivíduos saudáveis. Assim o
cálculo desta análise foi ΔΔC
T
= (C
T, alvo
- C
T, endógeno
)
pacientes
- (C
T, alvo
- C
T, endógeno
)
controles
.
3.7 Análise estatística
Para a realização da análise estatística, procuramos a acessória do Centro de Métodos
Quantitativos (CEMEQ) do HC-FRMP-USP.
Foram propostos modelos lineares de efeitos mistos (McLean et al, 1991) para comparar os
resultados de expressão relativa dos genes alvos nos pacientes, com DM-1 e EM, no período PRE-
transplante versus os diferentes períodos pós-TACTH (D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e
D+1080), bem como no grupo controle versus pacientes.
Os modelos lineares de efeitos mistos (efeitos aleatórios e fixos) são utilizados na análise
de dados onde as respostas de um mesmo indivíduo estão agrupadas e a suposição de
independência entre observações num mesmo grupo não é adequada. Neste modelo utilizado, foram
considerados como efeito aleatório os indivíduos e, como efeitos fixos, os grupos e os períodos. Tal
modelo, tem como pressuposto, que o resíduo obtido através da diferença entre os valores preditos
pelo modelo e os valores observados tenha distribuição normal com média 0 e variância constante.
Nas situações onde tal pressuposto não foi observado, ou seja, quando os resíduos não
apresentaram distribuição normal, transformações na variável resposta foram utilizadas. O ajuste do
modelo foi feito através do software SAS versão 9.
Foram considerados significantes os testes estatísticos cujo valor de p <0,05. No Apêndice
E estão apresentadas as tabelas descritivas dos dados de DM-1 para todos os grupos bem como
todas as variáveis. E no Apêndice F estão apresentadas as tabelas referentes à descrição dos dados
de EM.
"A ciência é a tentativa de compreender a realidade. É uma atividade quase religiosa,
na mais ampla acepção da palavra"
George Wald (1906-1997)
Bioquímico norte-americano
R
R
E
E
S
S
U
U
L
L
T
T
A
A
D
D
O
O
S
S
Resultados 46
4 Resultados
Com o objetivo de caracterizar a nível molecular a presença dos diferentes padrões de células T
(T
reg
, T
H
17, T
H
1 e T
H
2) nos pacientes com DM-1 e EM, antes e após o tratamento com a IAD/TACTH, para
assim investigar os mecanismos imunológicos envolvidos na remissão dessas doenças após a terapia,
analisamos a expressão gênica de várias moléculas, fatores de transcrição e citocinas envolvidas na
diferenciação e ativação dos referidos padrões de células T. Esta abordagem molecular visou esclarecer
os mecanismos de ação e os benefícios do TACTH no tratamento do DM-1 e da EM, o que é necessário
para uma aplicação mais ampla do TACTH como tratamento dessas doenças. Além disso, esse estudo
poderá auxiliar o entendimento do papel das células Th17 na patologia do DM-1 e EM humanas, pouco
elucidado até o momento, particularmente para o DM-1, possibilitando futuramente o desenvolvimento de
novas formas terapêuticas para o tratamento dessa doença.
Os 23 genes alvos foram agrupados de acordo com sua relação aos diferentes padrões de célula
T, porém, há genes (IL-10 e TGF-β) que tem conexão com mais de um padrão de resposta, dependendo
da sua presença ou ausência principalmente. Didaticamente estes genes foram enquadrados em um dos
padrões relacionados, e a contextualização dos resultados, abordando ambos os padrões, será feita
posteriormente.
Para ambas as doenças, bem como para o grupo de indivíduos controles, o mesmo painel de
genes foram analisados a partir de células mononucleares isoladas do sangue periférico. Iremos abordar
os resultados de cada doença separadamente, apresentando primeiramente os resultados clínicos dos
pacientes, seguido dos resultados de expressão gênica dos mesmos.
Todas as análises de expressão dos genes nas células mononucleares dos pacientes com DM-1 e EM
foram realizadas comparando-se o período pré-mob ao grupo controle da referida DAI, com o intuito de
avaliar a expressão diferencial na doença em relação a indivíduos sadios. Também foram comparados os
períodos de seguimento pós-tx dos pacientes ao grupo de indivíduos controles para determinação da
possível recuperação da expressão de alguns genes a níveis similares ao grupo controle após o tx.
Após estas análises, o próximo objetivo foi verificar o impacto da terapia de IAD/TACTH nos níveis
de RNAm dos diferentes padrões de células T nos pacientes. Para tanto, comparamos a expressão obtida
no pré-mob aos demais períodos de seguimento pós-tx (D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080)
e com isso observamos as mudanças de expressão gênica em relação à doença basal.
4.1 Resultados de DM-1
4.1.1 Resultados Clínico-laboratoriais de DM-1
Dentre os 22 pacientes diabéticos incluídos neste trabalho, que foram submetidos à IAD/TACTH e
acompanhados durantes três anos após o transplante (D+1080), onze apresentaram remissão clínica
completa, ou seja, ficaram independentes do uso de insulina. Oito recaíram durante o seguimento, porém,
Resultados 47
chegaram a atingir a remissão completa da doença, ficando livres do uso de insulina por algum
tempo, e três pacientes não responderam à terapia desde o princípio, sendo que o uso de insulina
exógena não foi suspenso em nenhum momento (Figura 2).
Figura 2 – Seguimento pós-transplante dos 22 pacientes diabéticos estudados quanto ao
uso de insulina ao longo do seguimento. PS – Perda do seguimento
O paciente DM1 não respondeu a terapia desde o princípio, provavelmente por ter
apresentado episódios de cetoacidose diabética ao diagnóstico, o que indica reserva muito baixa de
células pancreáticas, dado confirmado pela dosagem dos níveis de peptídeo-C em seu soro. Esse
paciente necessitou de altas doses de insulina e interrompeu o seguimento ambulatorial após um ano
de transplante. Os pacientes DM19 e DM 21 também não responderam ao tratamento desde o
princípio, o primeiro devido ao desenvolvimento de cetoacidose antes do tratamento, e o segundo
pela indevida administração de corticosteróides juntamente com a infusão celular. Assim, foram
necessárias doses crescentes de insulina exógena para o controle glicêmico desses pacientes.
O paciente DM19 recaiu após 18 meses de remissão, já os pacientes DM11 e DM15
necessitaram de uso de insulina exógena após 12 meses de remissão clínica, enquanto os pacientes
DM16 e DM18 recaíram, ambos, após 24 meses. O paciente DM22 permaneceu em remissão clínica
por 9 meses e recaiu em seguida. Os pacientes DM7 e DM10 entraram em remissão clínica somente
após 20 e 12 meses do TACTH, e recaíram, respectivamente, após 7 e 9 meses livres de insulina. É
interessante ressaltar que dos 8 pacientes que recaíram, 4 o fizeram após infecção do trato
respiratório superior. Os pacientes que alcançaram remissão completa e recaíram após um tempo,
0 180 360 540 720 900 1080
DM 22
DM 21
DM 20
DM 19
DM 18
DM 17
DM 16
DM 15
DM 14
DM 13
DM 12
DM 11
DM 10
DM 9
DM 8
DM 7
DM 6
DM 5
DM 4
DM 3
DM 2
DM 1
Dias pós-TACTH
Pacientes
Seguimento pós-tranplante - Insulina
livre de insulina
S
PS
Resultados 48
passaram a fazer uso de baixas doses de insulina para o controle glicêmico, inferiores à dose
requerida no período pré-mob.
Os dados clínicos e laboratoriais foram publicados pelo grupo do Dr. Júlio Voltarelli
recentemente e só serão citados neste trabalho (Voltarelli et al., 2007; Couri et al., 2009). Por tanto,
as diferenças estatísticas apontadas são referentes aos dados clínicos já publicados, e englobam os
resultados dos 23 pacientes transplantados. Como atualmente, o seguimento da maioria dos
pacientes é superior a 3 anos e este trabalho analisa a expressão gênica somente durante os 3
primeiros anos pós-tx, foram extraídos das publicações os dados referentes aos 36 meses (D+1080)
de acompanhamento.
A porcentagem de hemoglobina glicosilada (Hb A
1C
) diminuiu significativamente após o
transplante. Onze de quatorze pacientes que apresentavam valores acima de 7% Hb A
1C
antes do
tratamento, dentro de 3 meses pós-tx passaram a apresentar valores inferiores a esse nível e esta
diminuição foi mantida durante o seguimento. Esta redução da porcentagem de Hb A
1C
indica controle
glicêmico na maioria desses pacientes. No grupo de pacientes que ficaram continuamente livres de
insulina exógena, a média da porcentagem de Hb A
1C
, que foi de 8.0% no período pré-tx, diminui
significativamente para 5.4%, 5.7%, 5.7% e 5.5%, respectivamente, nos períodos de 3, 12, 24 e 36
meses pós-tx.
Os níveis séricos de anticorpos anti-GAD65 diminuíram significativamente do período pré-tx
(média: 31,8 U/mL) para o período D+180 (média: 17,3 U/mL). Esse parâmetro laboratorial não foi
mensurado no período D+540 e em relação aos demais períodos de seguimento, não foram
observadas diferenças estatísticas significativas. No paciente DM3, este auto-anticorpo não foi
detectado aos seis, 12 e 24 meses pós-transplante. No paciente DM10, os níveis de anti-GAD65
aumentaram do período pré (4,0 U/mL) para o D+180 (14,0 U/mL) e D+720 (15,0 U/mL). Nos demais
pacientes os níveis desses auto-anticorpos foram menores nos períodos pós-TACTH quando
comparados aos níveis observados no período pré-tx.
Os níveis séricos de peptídeo-C aumentaram significativamente após o tratamento, indicando
aumento da produção de insulina endógena pelas células pancreáticas dos pacientes. No período
pré-tx, a média dos níveis de peptídeo-C foi de 1.3ηg/mL, aumentando para 4.0ηg/mL no período
D+180, 3.7ηg/mL no D+360, e 4.5ηg/mL no período D+720. Este parâmetro laboratorial não foi
mensurado nos pacientes no período D+540. No grupo continuamente livres de insulina, a média (SE)
da área sob a curva (AUC) dos níveis de peptídeo-C no pré-tx (225.0 [75.2] ηg/mL por 2h) aumentou
significativamente para 785.4 (90.3) ηg/mL por 2h no período D+720, e para 728.1 (144.4) ηg/mL por
2h no período D+1080.
Para os pacientes que apresentaram remissão clínica transitória, mesmo com a necessidade
da insulino-terapia, a média (SE) da área sob a curva (AUC) dos níveis de peptídeo-C pré-tx (148.9
[75.2] ηg/mL por 2h) também apresentou significativo aumento no D+1080 (546.8 [96.9] ηg/mL por
2h).
Esses resultados clínicos demonstram que, o tratamento com IAD/TACTH em pacientes com
DM-1 recém diagnostica, resultou no aumento da função das células β em todos os pacientes, exceto
um, e induziu uma prolongada independência de insulina exógena na maioria dos pacientes.
Resultados 49
4.1.2 Resultados de Expressão Gênica de DM-1
4.1.2.1 Genes relacionados às células T reguladoras
Os genes relacionados às células T reguladoras (T
regs
) analisados foram: o fator de transcrição
Foxp3; as citocinas IL-10 e TGF-β; e as moléculas CD25, PD-1, GITR e CTLA-4.
Quando comparada com o grupo IC (Figura 3), a expressão relativa do RNAm do Foxp3 não
apresentou diferença estatística em nenhum dos períodos analisados, mesmo com o pronunciado
aumento no período D+1080. Porém, quando comparada com os níveis no período PRE (Figura 4), a
expressão do fator de transcrição Foxp3 aumentou em 1,961x (p=0,001) no período D+720 e 2,937x
(p<0,0001) no período D+1080. Vale observar este considerável aumento da expressão de Foxp3 no
último período de acompanhamento (D+1080), de 2,937x (p<0,0001) em relação ao PRE e 2,427x em
relação ao IC.
Como observado na Figura 5, a quantificação relativa do RNAm da citocina IL-10 nas amostras
dos pacientes com DM-1 antes e após o tx, em relação ao grupo IC, mostrou-se significativamente
aumentada em todos os períodos analisados, exceto no período D+900, quando a expressão não
apresentou diferença estatística do grupo IC. Já no período PRE, os pacientes apresentaram níveis
de RNAm 8,54x (p<0,0001) mais expresso que os IC. Nos seguimentos pós-tx, houve uma
modulação da expressão de IL-10, porém, em nenhum período os níveis de IL-10 mostraram-se
inferiores ao do grupo IC, e no último período de seguimento (D+1080) a expressão foi 5,95x
(p=0,0051) maior que o grupo IC.
Figura 3 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição Foxp3 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos
períodos PRE, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam
as médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição Foxp3 nos períodos analisados para
os pacientes em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição
dos dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 50
Figura 4 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição Foxp3 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais
períodos pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais
representam as médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição Foxp3 nos períodos de
seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C)
Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Os níveis de expressão da IL-10 nos períodos pós-tx em relação aos níveis PRE-tx (Figura 6)
apresentaram-se diminuídos no decorrer do seguimento, porém sem diferença estatística para os
períodos D+180 e D+1080. No período D+360, D+540, D+720 e D+900, houve diminuição da
expressão da IL-10 em 0,451x (p=0,0046), 0,385x (p=0,0086), 0,428x (p=0,0373) e 0,177x
(p<0,0001), respectivamente. É interessante ressaltar que a expressão da IL-10 no período D+900
em relação aos IC não apresentou diferença estatística, porém, em relação ao período PRE-tx, houve
queda da expressão em 0,177x (p<0,0001), indicando que esta diminuição da expressão da IL-10 aos
D+900 fez com que este gene atingisse níveis normais de expressão, iguais aos IC, neste período.
Figura 5 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-10 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da IL-10 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao
calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A
e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 51
Figura 6 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-10 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da IL-10 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em
relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Para citocina TGF-β, em relação ao calibrador IC (Figura 7), a expressão relativa do RNAm não
se mostrou estatisticamente diferente em todos os períodos analisados dos pacientes de DM-1.
Mesmo assim, podemos observar que no período PRE, havia uma expressão de 2,666x maior que os
IC e ao longo do seguimento, em geral, houve diminuição dos níveis de RNAm, terminando o
seguimento aos D+1080 com expressão similar ao IC (0,838x). Já em relação ao calibrador PRE
(Figura 8), após o tx, houve queda de 0,469x (p=0,0003) no período D+360, 0,444x (p=0,0447) no
período D+900 e 0,224x (p<0,0001) no período D+1080. Esta diminuição significativa na expressão
de TGF-β, aos D+1080 em relação ao PRE (Figura 8), coincide com a chegada aos níveis de
expressão semelhantes aos IC observada no período D+1080 quando calibrado com IC (Figura 7).
Figura 7 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TGF-β em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina TGF-β nos períodos analisados para os pacientes em relação
ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 52
Figura 8 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TGF- β em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina TGF- β nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Para a molécula CD25, quando a expressão relativa foi comparada com o grupo IC (Figura 9),
não obtivemos diferença estatística para os períodos analisados, porém, observamos que no período
PRE, os pacientes mostravam níveis de expressão similares aos IC, e ao final do seguimento
(D+1080) essa expressão quase dobrou (1,708x mais expresso). Quando comparado com o período
PRE (Figura 10), já aos D+720 houve aumento de 2,041x (p=0,0133) na expressão de CD25 e esse
aumento da expressão chegou a 2,516x (p=0,011) aos D+1080.
Figura 9 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CD25 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula CD25 nos períodos analisados para os pacientes em relação
ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 53
Figura 10 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CD25 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula CD25 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Em relação aos níveis de expressão de PD-1 no grupo IC, a expressão nos pacientes antes e
após o tx não mostrou diferença estatística, contudo observamos na Figura 11, que antes do tx
(período PRE), os pacientes já mostravam uma expressão maior de PD-1, e ao longo do seguimento
esse aumento foi mantido. Quando calibrado com o período PRE (Figura 12), os valores de
expressão para PD-1 nos períodos pós-tx, assumiram um aumento de 1,727x (p=0,0062) no período
D+180 e 1,459x (p=0,0491) no período D+540, seguido de queda na expressa de 0,24x (p=0,0002)
no período D+900. Ao final do seguimento, no período D+1080, a expressão de RNAm da molécula
PD-1 alcançou o mesmo nível do período PRE-tx, que em relação ao grupo IC, ainda se manteve
aumentado em 2,23x.
Figura 11 – Quantificação relativa de RNAm da molécula PD-1 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180,
D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula PD-1 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao
calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A
e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 54
Figura 12 – Quantificação relativa de RNAm da molécula PD-1 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula PD-1 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em
relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Para a molécula GITR, não houve diferença na expressão do RNAm dos pacientes em relação
ao grupo IC (Figura 13), porém, quando os períodos pós-tx foram calibrados com o período PRE
(Figura 14), observou-se um aumento de 1,261x (p=0,0235) no período D+720.
Figura 13 – Quantificação relativa de RNAm da molécula GITR em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180,
D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula GITR nos períodos analisados para os pacientes em relação ao
calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A
e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Calibrando a expressão do RNAm da molécula CTLA-4 dos pacientes em relação ao grupo IC
(Figura 15), observamos que no período PRE, os níveis de expressão estavam 1,2x (p=0,0124)
maiores que os IC, e após o tx houve aumento de 1,743x (p=0,0015) e 1,997x (p=0,0031) na
expressão de CTLA-4 nos períodos D+540 e D+720, respectivamente. Quando a expressão pós-tx é
calibrada com o período PRE (Figura 16), não observamos diferença estatística entre os períodos
analisados, mesmo para os tempos pós-tx que apresentaram aumento em relação a expressão no
Resultados 55
período PRE (D+540, D+720 e D+1080). Apesar de não haver diferença estatística, no período
D+1080, os pacientes apresentaram níveis de expressão de CTLA-4 elevados, tanto em relação ao
grupo IC quanto em relação ao período PRE.
Figura 14 – Quantificação relativa de RNAm da molécula GITR em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula GITR nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em
relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 15 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CTLA-4 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180,
D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula CTLA-4 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao
calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A
e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 56
Figura 16 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CTLA-4 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula CTLA-4 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em
relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
4.1.2.2 Genes relacionados às células T
H
17
Relacionados às células T
H
17 foram analisados os genes dos fatores de transcrição RORγt e
STAT-3 e os genes das citocinas IL-6, TGF-β, IL-17, IL-21, IL-23, IL-25, IL-27. A expressão de TGF-β
está mostrada na Figura 7 (Calibrador IC) e Figura 8 (Calibrador PRE), e já foi descrita na sessão
anterior. Não houve detecção da expressão de IL-25 nas amostras/diluição estudas, tanto dos
pacientes quanto dos indivíduos controles, provavelmente por ser um transcrito de baixa expressão, e
por isso a análise da citocina IL-25 foi deixada fora do estudo.
A expressão do fator de transcrição RORγt, quando calibrado com os valores de expressão
obtidos dos IC, não apresentou diferença estatística em relação ao calibrador. Observamos na Figura
17, que no período PRE a expressão de RORγt estava um pouco inferior aos IC, e no seguimento
pós-tx, somente no período D+720, os níveis de expressão de RORγt superaram o valor obtido nos
IC, voltando a cair em D+900 e chegando a níveis similares ao período PRE, e ainda inferior ao IC, no
D+1080, último período do seguimento pós-tx.
Quando calibramos a expressão do fator de transcrição RORγt dos períodos pós-tx com os
valores obtidos no período PRE (Figura 18), observamos que logo aos D+180 houve uma queda de
0,627x (p=0,0053) nos níveis de expressão de RORγt, e aos D+360 a expressão foi de 0,44x
(p<0,0001). Já no período D+720, houve um aumento de 1,678x (p=0,0239) em relação ao calibrador
PRE, seguida de diminuição de 0,575x (p=0,0136) no período D+900. Ao final do seguimento, no
período D+1080, os níveis de expressão de RORγt encontravam-se similares ao período PRE.
Resultados 57
Figura 17 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição RORγt em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição RORγt nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 18 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição RORγt em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição RORγt nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Para o fator de transcrição STAT-3, observamos (Figura 19) que quando a expressão foi
calibrada em relação aos IC, não observamos diferença nos seguimentos pós-tx analisados. No
período PRE, a expressão de STAT-3 apresentou-se levemente inferior aos IC, já nos períodos
D+540 e D+720, os níveis de expressão mostraram-se praticamente iguais ao calibrador IC. No
período D+1080, a expressão de STAT-3 terminou o seguimento 0,432x menor que o calibrador IC.
Em relação ao calibrador PRE (Figura 20), o fator de transcrição STAT-3 apresentou-se 0,402x
(p=0,0007) menos expresso no período D+360 e 0,388x (p=0,0175) menos expresso no período
D+900. O aumento na expressão observado nos períodos D+540 e D+720 não chegou a ser
Resultados 58
significativamente diferente ao nível de expressão no período PRE. Ao final do seguimento (D+1080),
a expressão de STAT-3 não diferiu do período PRE.
Figura 19 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-3 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-3 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 20 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-3 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos
pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição STAT-3 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Para a citocinas IL-6, quando o calibrador escolhido foi IC (Figura 21), os níveis de expressão
no período PRE não se mostraram diferentes de IC, porém, no decorrer do seguimento, os níveis de
IL-6 mostraram-se aumentados em relação aos IC, chegando a 16,562x (p=0,0002) mais expresso no
período D+180 e 29,507x (p<0,0001) no período D+540. Apesar se numericamente inferiores à esses
picos de expressão, os períodos D+360, D+720 e D+1080 também se mostraram com expressão
superior aos IC, com valores de fold change de 5,796x (p=0,0159), 5,889x (p=0,0305) e 5,891x
(p=0,0452) respectivamente.
Resultados 59
Já em relação ao período PRE (Figura 22), os períodos pós-tx não mostraram diferença
estatística nos níveis de expressão da citocina IL-6. Mesmo assim, observamos que os mesmos
períodos que mostraram grande aumento de expressão em relação ao grupo IC, também estavam
com fold change elevado em relação ao PRE (D+180 com 5,679x e D+540 com 10,119x). Os valores
de expressão da IL-6 mostraram-se com grande dispersão entre as amostras componentes do
mesmo período (Figuras 21A e 22A), por isso a estatística só apresentou p valor significativo para os
períodos onde a média de ΔΔC
T
do grupo encontrou-se dentro da faixa mais densa de expressão
gênica dos indivíduos do mesmo período.
Figura 21 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-6 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição IL-6 nos períodos analisados para os pacientes em
relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 22 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-6 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição IL-6 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 60
O transcrito da citocina IL-17 mostrou-se de baixa expressão já que poucas amostras
apresentaram níveis detectáveis do RNAm dessa citocina (Figuras 23A e 24A). Os níveis de RNAm
dessa citocina, quando calibrado com IC (Figura 23), mostraram-se aumentada em 2,932x (p=0,0195)
no período D+540, já para os demais períodos, incluindo PRE, não houve diferença em relação aos
níveis do grupo IC. Quando a expressão do RNAm da IL-17 nos períodos de seguimento pós-tx foram
calibradas com o período PRE, não obtivemos diferenças estatísticas entre os períodos analisados,
mostrando que essa citocina manteve-se ao longo do seguimento com níveis de expressão similares
ao período PRE.
Figura 23 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-17 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição IL-17 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 24 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-17 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição IL-17 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 61
Apesar do aumento de 5,041x no período D+1080 em relação aos IC, não houve diferença
estatística na expressão gênica do transcrito da citocina IL-21 quando calibrada com a expressão nos
IC (Figura 25). Já quando calibrada com PRE, a expressão de IL-21 mostrou-se significativamente
aumentada em 2,449x (p=0,0218) no período D+1080. A diferença na quantidade de indivíduos
observadas nos gráficos de dispersão (Figura 25A e 26A) é devido ao fato de que o RNAm da IL-21
foi testado em todas as amostras do grupo IC e somente em oito pacientes de DM-1, uma vez que a
quantidade de sonda para este alvo era limitada.
Figura 25 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-21 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição IL-21 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 26 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-21 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição IL-21 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 62
Não houve diferença na expressão do RNAm da citocina IL-23 nos pacientes quando
calibrado em relação aos IC (Figura 27), porém, observamos que, tanto no período PRE quanto no
decorrer do seguimento, os valores de expressão nos pacientes mostraram-se superiores aos IC. Já
quando calibrado com o período PRE (Figura 28), observamos uma diminuição de 0,606X (p=0,02)
no período de seguimento D+360, 0,326X (p=0,0009) no período D+900 e 0,61X (p=0,0493) no
período D+1080.
Figura 27 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-23 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição IL-23 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 28. Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-23 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição IL-23 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Para o transcrito da citocina IL-27, calibrado em relação aos IC (Figura 29), observamos que
a expressão dessa citocina já se encontrava significativamente aumentada em 2,526X (p=0,0421) no
Resultados 63
período PRE, e esse aumento firmou-se ao longo do seguimento, chegando a 6,402X (p<0,0001) no
D+180, 5,141X (p=0,0005) no D+360, 5,248X (p=0,0005) no D+540, 3,687X (p=0,006) no D+720 e
terminando com 3,719X (p=0,0329) no D+1080, ao final do seguimento pós-tx. Somente a expressão
de IL-27 no período D+900 não diferiu em relação ao grupo IC.
Figura 29 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-27 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição IL-27 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 30 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IL-27 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição IL-27 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Já em relação ao período PRE (Figura 30), os níveis de expressão do RNAm para citocina IL-
27 aumentaram significativamente nos três primeiros períodos pós-tx, D+180 (2,376X, p=0,0004),
D+360 (1,829X, p=0,0061) e D+540 (1,947X, p=0,0053), respectivamente. Nos três últimos períodos
analisados, os níveis de expressão foram semelhantes ao período PRE.
Resultados 64
4.1.2.3 Genes relacionados às células Th1
Os genes relacionados às células Th1 analisados foram: os fatores de transcrição T-bet, STAT-
1 e STAT-4; as citocinas IFN-γ e TNF-α.
Para o fator de transcrição T-bet, não houve diferença estatística quando os níveis de
expressão dos períodos analisados foram calibrados tanto com o grupo IC quanto com PRE, devido a
dispersão dos valores de ΔΔC
T
como observado nas Figuras 31A e 32A. O mesmo resultado foi
obtido para os fatores de transcrição STAT-1 (Figuras 33 e 34) e STAT-4 (Figuras 35 e 36).
Figura 31 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição T-bet em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição T-bet nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 32 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição T-bet em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição T-bet nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 65
Figura 33 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-1 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-1 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 34 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-1 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos
pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição STAT-1 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
A expressão do RNAm da citocina IFN-γ, quando calibrada com os níveis de expressão do
grupo IC (Figura 37), não apresentou diferença estatística. Já quando calibrada em relação ao
período PRE (Figura 38), observou-se um aumento de 1,879X (p=0,0144) logo no período D+180,
seguido pelo aumento de 2,455X (p=0,0005) no D+540 e 3,943X (p<0,0001) no último período
analisado, D+1080.
Resultados 66
Figura 35 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-4 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-4 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 36 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-4 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos
pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição STAT-4 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 67
Figura 37 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IFN-γ em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição IFN-γ nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 38 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição IFN-γ em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição IFN-γ nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
A citocina TNF-α, também não apresentou diferença na expressão do seu RNAm quando
calibrada em relação ao grupo IC (Figura 39), e logo no período D+180, quando calibrado com
período PRE (Figura 40), mostrou-se 2,145X (p=0,04) mais expressa e 2,63X (p=0,0083) aumentada
no período D+540.
Resultados 68
Figura 39 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição TNF-α em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição TNF-α nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 40 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição TNF-α em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição TNF-α nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
4.1.2.4 Genes relacionados às células Th2
Os genes relacionados às células Th2 analisados foram: os fatores de transcrição GATA3 e
STAT-6; as citocinas IL-4 e IL-10.
Em relação ao grupo IC, a expressão relativa do fator de transcrição GATA3 (Figura 41)
estava 4,078X (p=0,0019) maior no período PRE, 4,334X (p=0,0016) no D+180 e 3,81X (p=0,0039)
no D+540. Já nos últimos períodos de seguimento pós-tx, os níveis de GATA3 dos pacientes ficaram
estatisticamente iguais aos do grupo IC. Relativo ao calibrador PRE (Figura 42), houve diminuição
Resultados 69
significativa da expressão em 0,41X (p=0,0005) no período D+360, 0,497X (p=0,0107) no período
D+720, 0,671X (p=0,0333) no D+900 e 0,449X (p=0,0034) no D+1080, coincidindo com a
normalização dos níveis de RNAm de GATA3 em relação aos IC observada para esses períodos na
Figura 41.
Figura 41 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição GATA3 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição GATA3 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 42 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição GATA3 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos
pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição GATA3 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 70
Figura 43 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-6 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-6 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 44 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-6 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos
pós-TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa fator de transcrição STAT-6 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
O segundo fator de transcrição do padrão Th2 analisado foi o STAT-6, que em relação ao
grupo IC (Figura 43) não apresentou diferença na sua expressão. Já em relação ao período PRE
(Figura 44), o período D+720 apresentou um aumento na expressão de STAT-6 de 2,632X, com p
valor de 0,0009.
Os resultados da expressão gênica da citocina IL-10 já foram relatados na primeira sessão
(Figuras 5 e 6). Para a IL-4, não observamos diferença na expressão do RNAm quando calibrado em
relação ao grupo IC (Figura 45), já quando o período PRE foi usado como calibrador (Figura 46),
Resultados 71
observamos uma queda na expressão relativa de 0,336X (p=0,0195) no período D+360 e de 0,222X
(p=0,0037) no período D+900.
Figura 45 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-4 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com DM-1 nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina IL-4 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, sem
diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 46 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-4 em células mononucleares de pacientes com DM-1 no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da citocina IL-4 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Para facilitar a visualização geral do fold change de todos os resultados e comparações, são
apresentadas as Tabelas 7 e 8, onde o fold change (menor, igual ou maior) está representado por
símbolos ( , = ou , respectivamente). Obviamente, a visualização dos dados direto nas tabelas,
inclusive comparando uma com a outra, é a melhor maneira de observar os resultados, bem como a
consulta às respectivas figuras se necessário. Mesmo assim, os dados destas tabelas serão descritos
a seguir.
Resultados 72
Na Tabela 7, está apresentado o resumo dos resultados de expressão gênica dos 22 genes
analisados pré- e pós-tx em comparação com os indivíduos controles (IC). Neste panorama geral,
observamos que a maioria dos genes não apresentou diferenças em seus níveis de expressão, tanto
quando a expressão PRE, quanto a PÓS, foi comparada com a expressão do grupo IC. No entanto,
houve mudanças significativas na expressão de alguns genes que, no período PRE estavam com
seus níveis de expressão elevados ou iguais em relação ao grupo IC, e após o tx (PÓS)
apresentaram níveis diferentes em relação ao IC.
Dos genes relacionados com as T
regs
, a expressão da IL-10, no período PRE dos pacientes,
estava significativamente aumentada em relação ao grupo controle e, após o tx, a expressão atingiu o
mesmo nível que IC, preditos como normais, em pelo menos um período do seguimento (D+900). Os
níveis de CTLA-4, que também estavam aumentados no período PRE em relação ao controle,
atingiram o mesmo patamar que os controles nos períodos D+180, D+360 e D+1080 (Tabela 7).
Em relação ao padrão T
H
2, o fator de transcrição GATA3, que apresentava maior expressão
no período PRE, comparado com IC, apresentou níveis similares aos controles no período D+360 e
do D+540 até o final do seguimento (Tabela 7).
Já em relação ao padrão T
H
17, a citocina IL-6 que não apresentava diferença em sua
expressão no período PRE, durante o seguimento pós-tx, passou a apresentar maiores níveis em
todos os períodos quando comparada com IC, exceto no período D+900, enquanto que a citocina IL-
17, que no período PRE também não mostrou diferença em relação ao IC, expressou maiores níveis
de RNAm somente em um período pós-tx (D+540). A citocina IL-27 estava com maior expressão no
PRE comparado com IC, e após o tx, chegou a normalizar sua expressão no período D+900. Os
genes relacionados ao padrão T
H
1 não apresentaram diferenças de expressão em PRE, nem POS-tx
quando comparados com o grupo controle.
Contudo, confrontando os dados da Tabela 8 com os da Tabela 7, observamos que, mesmo
sem diferença em relação aos níveis normais (Tabela 7), quando a expressão gênica pós-tx é
comparada com os níveis pré-tx (Tabela 8), os resultados dos períodos pós-tx mostram alterações
significativas em relação aos níveis de expressão na doença basal (período pré-tx). Como por
exemplo, o aumento da expressão do fator de transcrição Foxp3 das T
regs
em dois períodos de
seguimento pós-tx (D+720 e D+1080), que foi significativo em relação ao pré-tx, porém não chegou a
diferenciar essa expressão em relação aos níveis normais (IC). O mesmo é observado em relação a
molécula CD25, que apresentou aumentos importantes no período pós-tx (D+720 e D+1080), sem
assim ultrapassar os níveis encontrado nos controles.
A citocina TGF-β teve seus níveis de expressão diminuídos em três períodos pós-tx (D+360,
D+900 e D+1080) quando comparado com a expressão PRE (Tabela 8), mas esse declínio não
atingiu níveis inferiores aos normais (Tabela 7). Os níveis de expressão da molécula PD-1
aumentaram em dois períodos pós-tx e diminuíram em um período (Tabela 8), sem alterar a
expressão em relação ao IC. Houve aumento da expressão de GITR no período D+720 pós-tx
(Tabela 8), sem que esse aumento superasse o nível normal de IC (Tabela 7). Neste mesmo sentido,
as três quedas e um aumento na expressão do fator RORγt durante o seguimento pós-tx (calibrado
em relação ao PRE), não alterou a expressão em relação aos níveis normais (Tabela 7). A diminuição
Resultados 73
em dois períodos pós-tx do fator de transcrição STAT-3 (Tabela 8), também não diferenciou a
expressão de STAT-3 do normal (Tabela 7).
Os níveis de RNAm da citocina IL-21 aumentaram no último período pós-tx em relação ao
PRE (Tabela 8), mas não se diferenciaram dos níveis normais (Tabela 7). Para a IL-23, ocorreu uma
maior expressão em três períodos pós-tx (Tabela 8) comparado com PRE, e não houve alteração em
relação aos níveis normais de IC, tanto POS quanto PRE (Tabela 7). A expressão relativa das
citocinas IFN-γ e TNF-α aumentou em no mínimo dois períodos após o tx em relação ao pré (Tabela
8), mas não chegou a diferenciar essa expressão em relação aos níveis normais (IC).
A diminuição de IL-10 aos D+900 (PRExPOS; Tabela 8) fez com que os níveis alcançassem
valores normais (POSxIC; Tabela 7). A expressão do fator GATA-3, que estava aumentada no
período PRE, D+180 e D+540 em relação aos controles (Tabela 7), apresentou queda em seus níveis
nos demais períodos (Tabela 8) em relação ao PRE, o que fez com que os níveis de expressão se
normalizassem nesses períodos (D+360, D+720, D+900 e D+1080) em relação aos controles (Tabela
7). Outro fator de transcrição, STAT-6, mostrou maior expressão em pelo menos um período pós-tx
em relação ao pré (Tabela 8), mas em relação aos indivíduos normais não houve diferença (Tabela
7). A diminuição dos níveis de RNAm da IL-4 em dois períodos pós-tx (Tabela 8), não representaram
diferença na expressão quando comparado com os controles (Tabela 7).
A molécula CTLA-4 não alterou significativamente a expressão pós-tx relativo aos níveis pré
(Tabela 8), porém, espantosamente, chegou a atingir níveis normais (iguais ao IC) durante o
seguimento (Tabela 7).
A citocina IL-6 pós-tx se manteve igual ao pré-tx (Tabela 8), que por sua vez estavam iguais
ao IC (Tabela 7), porém estranhamente aumentaram durante os seguimentos pós-tx, se igualando
novamente aos controles somente no período D+900. Outro resultado espantoso é o aumento da
expressão de IL-17 no D+540 em relação aos níveis normais (Tabela 7), sendo que no período pré-tx
em relação aos IC (Tabela 7) e em relação ao seguimento pós-tx (Tabela 8) não houve diferença.
Os níveis de expressão da citocina IL-27, que estavam aumentados no período PRE em
relação aos controles, atingiram a expressão normal no período D+900 (Tabela 7), porém neste
mesmo período, quando a expressão foi calibrada em relação aos níveis pré-tx, não houve diferença
(Tabela 8). Os fatores de transcrição T-bet, STAT-1 e STAT-4 não alteraram significativamente sua
expressão em relação a nenhum dos calibradores.
Resultados 74
Tabela 7 – Resumo dos resultados de expressão do genes alvos nos pacientes DM-1 em relação ao grupo IC.
Gene
PRE x IC
PÓS X IC
T
reg
Foxp3
=
=
IL-10
todos, = D+900
TGF-β
=
=
CD25
=
=
PD-1
=
=
GITR
=
=
CTLA-4
D+540-900, = demais
T
H
17
RORγt
=
=
STAT-3
=
=
IL-6
=
todos, = D+900
IL-17
=
D+540
IL-21
=
=
IL-23
=
=
IL-27
todos, = D+900
T
H
1
T-bet
=
=
STAT-1
=
=
STAT-4
=
=
IFN-γ
=
=
TNF-α
=
=
T
H
2
GATA3
D+180 e 540, = demais
STAT-6
=
=
IL-4
=
=
As setas representam aumento ( ) ou diminuição ( ) estatisticamente significativa em relação ao
grupo IC; (=) representa ausência de diferença estatística entre os fold change comparados; PÓS –
todos os períodos pós-tx, o sinal usado resume o comportamento geral do gene durante os 6
períodos pós-tx; exceções são especificadas; sinais destacados apontam os resultados mais
interessantes;
Resultados 75
Tabela 8 – Resumo dos resultados de expressão do genes alvos nos pacientes DM-1 em relação ao período PRE.
Gene
D+180
D+360
D+540
D+720
D+900
D+1080
T
reg
Foxp3
=
=
IL-10
=
=
TGF-β
=
=
=
CD25
=
=
PD-1
=
=
=
GITR
=
=
=
=
=
CTLA-4
=
=
=
=
=
=
T
H
17
RORγt
=
=
STAT-3
=
=
=
=
IL-6
=
=
=
=
=
=
IL-17
=
=
=
=
=
=
IL-21
=
=
=
=
=
IL-23
=
=
=
IL-27
=
=
=
T
H
1
T-bet
=
=
=
=
=
=
STAT-1
=
=
=
=
=
=
STAT-4
=
=
=
=
=
=
IFN-γ
=
=
=
TNF-α
=
=
=
=
T
H
2
GATA3
=
=
STAT-6
=
=
=
=
=
IL-4
=
=
=
=
As setas representam aumento ( ) ou diminuição ( ) estatisticamente significativa em relação ao período PRE; (=) representa ausência de diferença
estatística entre os fold change comparados;
Resultados 76
4.1.3 Análise descritiva da Remissão x Recaída dos pacientes com DM-1
As recaídas clínicas dos pacientes de DM-1 analisados, ocorreram entre os seguimentos
D+360 (n=3), D+540 (n=1), D+720 (n=3) e D+900 (n=1). A divisão dos dados de expressão gênica
em grupos de pacientes em remissão clínica (grupo Rm) e em recaída clínica (grupo Rc), fez com que
o n amostral ficasse insuficiente para uma análise estatística de confiança, por esse motivo a análise
será apenas descritiva, procurando indícios na possível diferença de expressão entre os dois grupos
que possa ter relação com a recaída clínica observada. No Apêndice G estão apresentadas as
tabelas referentes à descrição dos dados de DM-1 separados por grupo de Rm e Rc. Já no Apêndice
H estão apresentados os gráficos de dispersão e fold change desta análise, e na Tabela 9 está
apresentado o resumo da expressão dos genes analisados, quando comparado os níveis de RNAm
dos pacientes em Rc em relação aos pacientes em Rm (calibrador).
Tabela 9 – Comparação da expressão relativa dos genes alvos nos pacientes de DM-1 em Rc calibrados em relação
ao grupo em Rm.
Gene
PRE
D+180
D+360
D+540
D+720
D+900
D+1080
T
reg
Foxp3
=
IL-10
=
TGF-β
=
=
CD25
PD-1
=
=
GITR
CTLA-4
=
=
T
H
17
RORγt
=
STAT-3
=
IL-6
IL-17
=
=
=
IL-21
IL-23
=
IL-27
=
=
T
H
1
T-bet
=
STAT-1
=
STAT-4
=
=
IFN-γ
=
TNF-α
=
T
H
2
GATA3
STAT-6
=
=
IL-4
=
=
As setas representam aumento ( ) ou diminuição ( ) do fold change em relação ao grupo Rm; (=) representa fold changes praticamente iguais entre os grupos
comparados; sinais destacados apontam os períodos em que o maior n de pacientes recaíram;
Resultados 77
Conforme a Tabela 9, analisando especialmente os períodos D+360 e D+720, observamos
que a expressão de IL-10, CD25, PD-1 e CTLA-4 estava diminuída nos pacientes que recaíram, em
pelo menos um desses períodos. Já STAT-3, IL-6 e IL-21 estavam aumentadas nesses pacientes,
pelo menos em um dos períodos. A expressão de STAT-1, IFN-γ e TNF-α também estavam
aumentadas nos pacientes em recaída clínica. Já os genes GATA3, STAT-6 e IL-4, apresentaram
níveis de RNAm inferiores nesses pacientes, em relação aos pacientes em remissão.
4.2 Resultados de EM
4.2.1 Resultados Clínico-laboratoriais de EM
Dentre os 22 pacientes com EM transplantados, 3 pacientes foram a óbito após o transplante
(pacientes condicionados com BEAM + ATG de cavalo), 5 pacientes apresentaram ausência de
reposta ao tratamento e progressão neurológica, 12 pacientes obtiveram estabilização clínica da
doença e 2 pacientes apresentaram um melhora clínica parcial e mantiveram-se sem uso de
imunossupressão. Dois pacientes apresentaram a princípio resposta parcial ou estabilização da
doença, mas posteriormente sofreram uma progressão neurológica e ausência de resposta ao
tratamento. Dentre os 5 pacientes que mostraram ausência de reposta e progressão neurológica, 3
apresentavam EM-PS, um apresentava EM-PP e outro apresentava EM-SR. Em resumo,
aproximadamente 2/3 dos pacientes com EM apresentaram uma estabilização clínica ou melhora
clínica parcial da doença (N=14).
De maio de 2005 em diante, os pacientes com EM passaram a ser imunossuprimidos com um
novo regime de condicionamento: ciclofosfamida (200 mg/kg/d) associada a ATG de coelho. Onze
pacientes foram transplantados com esse novo esquema e os resultados obtidos foram mais
favoráveis do que os observados com o esquema anterior de imunossupressão, constituído de
poliquimioterapia (BEAM) mais ATG de cavalo. Com esse novo esquema de condicionamento, não
houve mortalidade precoce causada por complicações agudas do transplante, por exemplo infecções.
Do total de 22 pacientes de EM transplantados, 17 foram incluídos neste estudo de análise de
expressão gênica. A avaliação clínica pós-tx desses pacientes (Tabela 10) demonstra que 4
pacientes tiveram uma diminuição do EDSS (sendo todos pacientes transplantados com o novo
regime de condicionamento), 5 pacientes apresentaram um aumento do EDSS e 8 pacientes
mostraram uma estabilização do EDSS após o transplante.
Resultados 78
Tabela 10 – Avaliação clínica pós-TACTH nos pacientes com esclerose múltipla.
P
P
A
A
C
C
I
I
E
E
N
N
T
T
E
E
T
T
I
I
P
P
O
O
E
E
M
M
E
E
D
D
S
S
S
S
P
P
R
R
É
É
-
-
T
T
A
A
C
C
T
T
H
H
M
M
E
E
L
L
H
H
O
O
R
R
E
E
D
D
S
S
S
S
P
P
Ó
Ó
S
S
-
-
T
T
A
A
C
C
T
T
H
H
E
E
D
D
S
S
S
S
P
P
Ó
Ó
S
S
-
-
T
T
A
A
C
C
T
T
H
H
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(
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Ú
L
L
T
T
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M
M
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A
A
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A
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Ç
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)
M
M
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L
L
H
H
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R
R
R
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S
P
P
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T
A
A
C
C
L
L
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I
I
C
C
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P
P
Ó
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S
S
-
-
T
T
A
A
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C
T
T
H
H
R
R
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S
S
P
P
O
O
S
S
T
T
A
A
C
C
L
L
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I
C
C
A
A
A
A
V
V
A
A
L
L
I
I
A
A
Ç
Ç
Ã
Ã
O
O
C
C
L
L
Í
Í
N
N
I
I
C
C
A
A
–
–
C
C
O
O
N
N
S
S
I
I
D
D
E
E
R
R
A
A
Ç
Ç
Õ
Õ
E
E
S
S
EM 01
PS
6,5
6,0
6,5
SD
SD
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 02
PS
6,5
7,5
7,5
PR
NR
Progressão neurológica
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 03
PS
6,5
7,5
7,5
SD
NR
Progressão neurológica após infecção
fúngica pulmonar
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 04
PS
6,5
7,5
7,5
SD
NR
Progressão neurológica após cardiopatia
autonômica
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 05
PS
7,0
7,0
9,0
NR
NR
Progressão neurológica após H. zoster e
pericardite bacteriana
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 06
PP
6,5
6,5
6,5
SD
SD
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 07
PP
6,5
6,5
7,0
SD
NR
Progressão neurológica
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 08
PS
6,5
6,5
6,5
SD
SD
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 09
SR
4,5
2,5
3,0
SD
PR
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 10
PP
6,5
6,0
6,0
SD
PR
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 11
PS
6,5
6,5
6,5
SD
SD
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 12
PS
6,0
6,0
6,0
SD
SD
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 13
PS
6,5
6,5
6,5
SD
SD
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 14
PS
6,5
6,5
6,5
SD
SD
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 15
SR
4,5
2,5
2,5
PR
PR
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
EM 16
SR
6,5
5,0
5,0
SD
PR
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
Resultados 79
EM 17
PS
6,5
6,5
6,5
NR
SD
Ausência de lesões de atividade por
RMN
Permanência de lesões desmielinizantes
sequelares antigas
TACTH, Transplante autólogo de células tronco hematopoiéticas; EM, esclerose múltipla; EDSS, Expanded Disability Status Score; RMN, Ressonância Magnética
Nuclear; PS, esclerose múltipla progressiva secundária; PP, esclerose múltipla primária progressiva; SR, esclerose múltipla surto-remissiva; ND, Não determinado .
Pacientes 1-7: condicionados com BEAM + ATG de cavalo. Pacientes 8-17: condicionados com ciclofosfamida + ATG de coelho. Resposta clínica pós-transplante: NR=
ausência de resposta clínica; PR= resposta clínica parcial; SD= estabilização da doença.
Após o transplante, todos os pacientes apresentaram ausência de novas lesões inflamatórias
agudas no tecido nervoso (lesões de atividade), detectadas através de imagens de ressonância
magnética por captura de gadolíneo. A ausência de lesões de atividade ou de novas lesões após o
transplante, indica um efeito profundo do TACTH nos componente inflamatórios da patogênese da
EM, consistente com outros estudos (Muraro et al., 2005). Por outro lado, na maioria dos casos,
houve a permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas já encontradas nos pacientes
antes do tratamento.
Dos cinco pacientes em recaída após a terapia de imunossupressão em altas doses seguida
pelo TACTH, quatro apresentavam EM-PS e um EM-PP, sendo que todos estes foram submetidos ao
regime de condicionamento com BEAM e ATG de cavalo. Dentre esses pacientes que sofreram
progressão neurológica, dois apresentaram a princípio resposta parcial (EM02) ou estabilização da
doença (EM07), mas posteriormente progrediram neurologicamente, indicando a ausência de
resposta ao tratamento. O paciente EM03 recaiu possivelmente devido a infecção fúngica pulmonar, a
paciente EM04 após cardiopatia autonômica e a paciente EM05 por infecção pelo Herpes zoster e
pericardite bacteriana.
Todos estes resultados clínicos dos pacientes com EM estão em fase de publicação pelo
grupo do Prof. Dr. Julio César Voltarelli e colaboradores.
4.2.2 Resultados de Expressão Gênica de EM
4.2.2.1 Genes relacionados às células T reguladoras
O mesmo painel de genes relacionados aos diferentes padrões de célula T analisados para
DM-1 foram analisados também para EM.
A expressão do fator de transcrição Foxp3 nas amostras dos pacientes de EM não
apresentou diferença em seus níveis quando comparada com a expressão do grupo IC, bem como
não houve diferença dos níveis pós-tx em relação ao período PRE (Figuras 47 e 48,
respectivamente). Contudo, observamos que a expressão no período PRE estava diminuída (0,585x)
em relação ao grupo IC, e que ao longo do seguimento, especialmente no período D+720, houve um
aumento nos níveis de RNAm do Foxp3 (Figura 47). Em relação ao período PRE (Figura 48), houve
aumento de 1,662x e 1,792x nos períodos D+540 e D+720, respectivamente.
Resultados 80
Figura 47 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição Foxp3 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição Foxp3 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 48 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição Foxp3 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa do fator de transcrição Foxp3 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Como observado na Figura 49, a quantificação relativa do RNAm da citocina IL-10 nas
amostras dos pacientes com EM antes e após o tx, em relação ao grupo IC, mostrou-se
significativamente aumentada em todos os períodos analisados, exceto no período D+900, quando a
expressão não apresentou diferença estatística do grupo IC. Este resultado foi igual para a análise
em DM-1. Já no período PRE, os pacientes apresentaram níveis de RNAm 12,271x (p<0,0001) mais
expresso que os IC. Nos seguimentos pós-tx, houve uma modulação da expressão de IL-10, porém,
Resultados 81
em nenhum período os níveis de IL-10 mostraram-se inferiores ao do grupo IC, e no último período de
seguimento (D+1080) a expressão foi 4,939x (p=0,0068) maior que o grupo IC.
Os níveis de expressão da IL-10 nos períodos pós-tx em relação aos níveis PRE-tx (Figura 50)
apresentaram-se diminuídos no decorrer do seguimento. No período D+180, D+900 e D+1080, houve
diminuição da expressão da IL-10 em 0,517x (p=0,0098), 0,307x (p<0,0001) e 0,535x (p=0,0094),
respectivamente. É interessante ressaltar que a expressão da IL-10 no período D+900 em relação
aos IC não apresentou diferença estatística, porém, em relação ao período PRE-tx, houve queda da
expressão em 0,307x (p<0,0001), indicando que esta diminuição da expressão da IL-10 aos D+900
fez com que este gene atingisse níveis normais de expressão, iguais aos IC, neste período.
Figura 49 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-10 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina IL-10 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, com
respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 50 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-10 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da citocina IL-10 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 82
Para citocina TGF-β, em relação ao calibrador IC (Figura 51), a expressão relativa do RNAm
não se mostrou estatisticamente diferente em todos os períodos analisados dos pacientes de EM.
Mesmo assim, podemos observar que no período PRE, havia Expressão de 1,847x maior que os IC e
ao longo do seguimento, em geral, houve diminuição dos níveis de RNAm, exceto pelo aumento de
3,256x no período D+540. No termino do seguimento, aos D+1080, a expressão foi similar ao IC
(1,116x). Em relação ao calibrador PRE (Figura 52), após o tx também não houve diferença
estatística na expressão da citocina TGF-β, mesmo com o aumento da expressão em 2,172x no
período D+540.
Figura 51 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TGF-β em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina TGF-β nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, sem
diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 52 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TGF-β em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da citocina TGF-β nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 83
Para a molécula CD25, quando a expressão relativa foi comparada com o grupo IC (Figura 53),
no período PRE a expressão mostrou-se 0,257x (p=0,0116) diminuída. No decorrer do seguimento,
somente nos períodos D+720 e D+1080, a expressão de CD25 não foi significativamente diferente do
grupo IC. Quando comparado com o período PRE (Figura 54), os períodos pós-tx não mostraram
níveis de expressão diferentes do calibrador, mesmo com o aumento de 1,873x aos D+1080.
Em relação aos níveis de expressão de PD-1 calibrados com o grupo IC (Figura 55), a
expressão nos pacientes antes e após o tx se mostrou aumentada em 2,797x (p=0,0451) no período
PRE, elevando-se ainda mais nos períodos D+180 (4,488x, p=0,0007), D+360 (3,937x, p=0,0074),
D+540 (4,857x, p=0,0013) e D+720 (4,345x, p=0,0041). Contudo, observamos na Figura 56, que esse
aumento pós-tx, quando calibrado em relação ao período PRE, não apresentou diferença
significativa.
Figura 53 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CD25 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula CD25 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, com
respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 54 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CD25 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da molécula CD25 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 84
Figura 55 – Quantificação relativa de RNAm da molécula PD-1 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula PD-1 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, com
respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 56 – Quantificação relativa de RNAm da molécula PD-1 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da molécula PD-1 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Para a molécula GITR, não houve diferença na expressão do RNAm dos pacientes em relação
ao grupo IC (Figura 57), nem em relação ao calibrador PRE (Figura 58). Mesmo a queda observada a
partir do período D+720 até o D+1080 em relação ao PRE, manteve os níveis de GITR um pouco
acima dos níveis do grupo IC.
Calibrando a expressão do RNAm da molécula CTLA-4 dos pacientes em relação ao grupo IC
(Figura 59), observamos que nos períodos D+360 e D+720, os níveis de expressão estavam mais
elevados em 1,03x (p=0,0357) e 1,493x (p=0,0258), respectivamente, e diminuídos em 0,79x
(p=0,0481) no período D+540. Quando a expressão pós-tx é calibrada com o período PRE (Figura
60), não observamos diferença estatística entre os períodos analisados, mesmo para os tempos pós-
tx que apresentaram aumento em relação a expressão do grupo IC. Apesar de não haver diferença
Resultados 85
estatística, no período D+720, os pacientes apresentaram níveis de expressão de CTLA-4 quase
duas vezes maior (1,972x) que no período PRE.
Figura 57 – Quantificação relativa de RNAm da molécula GITR em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula GITR nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, sem
diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 58 – Quantificação relativa de RNAm da molécula GITR em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da molécula GITR nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 86
Figura 59 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CTLA-4 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180,
D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da molécula CTLA-4 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao
calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A
e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 60 – Quantificação relativa de RNAm da molécula CTLA-4 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da molécula CTLA-4 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
4.2.2.2 Genes relacionados às células T
H
17
Relacionados às células T
H
17 foram analisados os genes dos fatores de transcrição RORγt e
STAT-3 e os genes das citocinas IL-6, TGF-β, IL-17, IL-21, IL-23, IL-25, IL-27. A expressão de TGF-β
está mostrada na Figura 51 (Calibrador IC) e Figura 52 (Calibrador PRE), e já foi descrita na sessão
anterior. Não houve detecção da expressão de IL-25 nas amostras/diluição estudas, tanto dos
Resultados 87
pacientes quanto dos indivíduos controles, provavelmente por ser um transcrito de baixa expressão, e
por isso a análise da citocina IL-25 foi deixada fora do estudo.
A expressão do fator de transcrição RORγt, quando calibrado com os valores de expressão
obtidos dos IC, não apresentou diferença estatística em relação ao calibrador. Observamos na Figura
61, que no período PRE a expressão de RORγt estava elevada em 1,6x em relação aos IC, e durante
o seguimento pós-tx, os níveis de expressão de RORγt foram diminuindo, e ao final do seguimento
(D+1080) estavam 0,52x menos expressos que no grupo IC.
Quando calibramos a expressão do fator de transcrição RORγt dos períodos pós-tx com os
valores obtidos no período PRE (Figura 62), observamos que logo aos D+180 houve uma queda de
0,377x (p<0,0001) nos níveis de expressão de RORγt, e aos D+360 a expressão foi de 0,386x
(p<0,0001), chegando a 0,284x menos expresso (p=0,0003) no período D+1080.
Figura 61 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição RORγt em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição RORγt nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 62 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição RORγt em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa do fator de transcrição RORγt nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 88
Para o fator de transcrição STAT-3, observamos (Figura 63) que, quando a expressão foi
calibrada em relação aos IC, não observamos diferença nos seguimentos pós-tx analisados. O
mesmo resultado foi observado quando calibramos a expressão de STAT-3 com o período PRE
(Figura 64).
Figura 63 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-3 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-3 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 64 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-3 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa do fator de transcrição STAT-3 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Para a citocinas IL-6, quando o calibrador escolhido foi IC (Figura 65), os níveis de
expressão no período PRE se mostraram 5,377x aumentados (p=0,0495), e no decorrer do
seguimento, os níveis de IL-6 se mantiveram aumentados em relação aos IC, chegando a 12,726x
(p=0,0058) mais expresso no período D+180 e 14,551x (p=0,0034) no período D+540.
Resultados 89
Já em relação ao período PRE (Figura 66), os períodos pós-tx não mostraram diferença
estatística nos níveis de expressão da citocina IL-6. Mesmo assim, observamos que os mesmos
períodos que mostraram grande aumento de expressão em relação ao grupo IC, também estavam
com fold change elevado em relação ao PRE (D+180 com 2,15x, D+540 com 2,7x, D+720 com
2,159x, D+900 com 1,894x e D+1080 com 1,896x). Os valores de expressão da IL-6 mostraram-se
com grande dispersão entre as amostras componentes do mesmo período (Figuras 65A e 66A), por
isso a estatística só apresentou p valor significativo para os períodos onde a média de ΔΔC
T
do grupo
encontrou-se dentro da faixa mais densa de expressão gênica dos indivíduos do mesmo período.
Figura 65 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-6 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina IL-6 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, com
respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 66 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-6 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180,
D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da citocina IL-6 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 90
O transcrito da citocina IL-17 mostrou-se de baixa expressão já que poucas amostras
apresentaram níveis detectáveis do RNAm dessa citocina (Figuras 67A e 68A). Os níveis de RNAm
dessa citocina, quando calibrado com IC (Figura 67), e quando calibrados com PRE (Figura 68), não
mostraram diferença estatística entre os grupos comparados. Porém, na Figura 67, observamos que
no período PRE, a expressão de IL-17 encontrava-se 1,424x mais expresso em relação ao IC, e no
decorrer do seguimento essa expressão diminuiu, chegando a estar no último período 0,255x menos
expresso que no período PRE (Figura 68).
Figura 67 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-17 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina IL-17 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, sem
diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 68 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-17 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da citocina IL-17 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Não houve diferença estatística na expressão gênica do transcrito da citocina IL-21 quando
calibrada com a expressão nos IC (Figura 69), apesar da expressão de 0,255x menos do período
Resultados 91
PRE. Já quando calibrada com PRE (Figura 70), a expressão de IL-21 mostrou-se significativamente
aumentada em 1,634x (p=0,0481) no período D+180, 2,162x (p=0,0049) no D+360, 3,56x (p<0,001)
no período D+720 e 2,094x no período D+1080 (p=0,0264). A diferença na quantidade de indivíduos
observadas nos gráficos de dispersão (Figura 69A e 70A) é devido ao fato de que o RNAm da IL-21
foi testado em todas as amostras do grupo IC e somente em oito pacientes de EM, uma vez que a
quantidade de sonda para este alvo era limitada.
Figura 69 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-21 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina IL-21 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, sem
diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 70 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-21 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da citocina IL-21 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Não houve diferença na expressão do RNAm da citocina IL-23 nos pacientes quando
calibrado em relação aos IC (Figura 71), e tão pouco quando calibrado com PRE (Figura 72).
Resultados 92
Figura 71 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-23 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina IL-23 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, sem
diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 72 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-23 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da citocina IL-23 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Para o transcrito da citocina IL-27, calibrado em relação aos IC (Figura 73), observamos que
a expressão dessa citocina já se encontrava significativamente aumentada em 13,4x (p<0,0001) no
período PRE, e esse aumento firmou-se em todos os períodos ao longo do seguimento. Este
resultado é similar ao encontrado para o mesmo gene nos pacientes de DM-1 calibrados com seu
respectivo grupo IC (Figura 29). Já em relação ao período PRE (Figura 74), os níveis de expressão
do RNAm para citocina IL-27 não apresentaram diferença significante nos períodos pós-tx, mesmo
com a diminuição de 0,341x no período D+900 em relação ao período PRE.
Resultados 93
Figura 73 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-27 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina IL-27 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, com
respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 74 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-27 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da citocina IL-27 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
4.2.2.3 Genes relacionados às células T
H
1
Os genes relacionados às células T
H
1 analisados foram: os fatores de transcrição T-bet,
STAT-1 e STAT-4; as citocinas IFN-γ e TNF-α.
Para o fator de transcrição T-bet, não houve diferença estatística quando os níveis de
expressão dos períodos analisados foram calibrados tanto com o grupo IC (Figura 75). Podemos
observar que no período PRE, a expressão do T-bet estava 0,385x menor que o grupo IC e que o
Resultados 94
único período no qual a expressão de T-bet superou os níveis de IC, foi no D+720, quando ocorreu
um aumento de 1,3x. Já em relação ao período PRE (Figura 76), observamos que em todos os
períodos pós-tx analisados, houve aumento significativo da expressão deste fator de transcrição,
chegando a atingir 4,146x maior nível de expressão no período D+720 (p<0,0001).
Figura 75 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição T-bet em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição T-bet nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 76 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição T-bet em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa do fator de transcrição T-bet nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Para os fatores de transcrição STAT-1 e STAT-4, não foram observadas diferenças nos
níveis de expressão desses RNAm quando calibrados com os valores do grupo IC (Figura 77 e 78,
respectivamente), e nem quando calibrados em relação ao período PRE (Figuras 79 e 80,
respectivamente). O mesmo resultado foi observado para a expressão do RNAm da citocina IFN-γ,
Resultados 95
tanto quando calibrada com os níveis de expressão do grupo IC (Figura 81), quanto em relação ao
calibrador PRE (Figura 82).
Figura 77 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-1 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-1 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 78 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-1 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa do fator de transcrição STAT-1 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 96
Figura 79 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-4 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-4 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 80 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-4 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa do fator de transcrição STAT-4 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 97
Figura 81 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IFN-γ em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina IFN-γ nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, sem
diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 82 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IFN-γ em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da citocina IFN-γ nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
A citocina TNF-α, apresentou diferença na expressão do seu RNAm, quando calibrada em
relação ao grupo IC (Figura 83), nos períodos D+540 (aumento de 11,645x, p=0,0013), D+720
(aumento de 7,599x, p=0,0074) e D+1080 (aumento de 6,996x, p=0,019). Quando calibrado com o
período PRE (Figura 84), os níveis de expressão do TNF-α só apresentaram aumento significativo no
período D+540 (p=0,0061).
Resultados 98
Figura 83 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TNF-α em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina TNF-α nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, com
respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 84 – Quantificação relativa de RNAm da citocina TNF-α em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da citocina TNF-α nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, com respectivos valores de p para os períodos com diferença estatística em relação ao calibrador.
4.2.2.4 Genes relacionados às células Th2
Os genes relacionados às células Th2 analisados foram: os fatores de transcrição GATA3 e
STAT-6; as citocinas IL-4 e IL-10.
Em relação ao calibrador IC (Figura 85) e em relação ao período PRE (Figura 86), a
expressão relativa do fator de transcrição GATA3 não mostrou diferença estatística entre as
comparações. Porém, podemos observar (Figura 85) que os níveis de GATA3 apresentaram-se
sempre superiores ao encontrado no grupo IC, em todos os períodos analisados.
Resultados 99
Figura 85 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição GATA3 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição GATA3 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 86 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição GATA3 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa do fator de transcrição GATA3 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
O segundo fator de transcrição do padrão Th2 analisado foi o STAT-6, que em relação ao
grupo IC (Figura 87) não apresentou diferença na sua expressão, e em relação ao período PRE
(Figura 88), apesar do aumento de 2,137x no período D+540, não houve diferença significante na
expressão de STAT-6 nos períodos pós-tx.
Os resultados da expressão gênica da citocina IL-10 já foram relatados na sessão anterior
(Figuras 49 e 50). Para a IL-4, não observamos diferença na expressão do RNAm quando calibrado
em relação ao grupo IC (Figura 89), nem quando o período PRE foi usado como calibrador (Figura
90), apesar do aumento observado na expressão dessa citocina no período D+1080 em ambas as
comparações.
Resultados 100
Figura 87 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-6 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE,
D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A
linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-6 nos períodos analisados para os pacientes
em relação ao calibrador IC. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados
apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 88 – Quantificação relativa de RNAm do fator de transcrição STAT-6 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-
TACTH, D+180, D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as
médias. A linha pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa do fator de transcrição STAT-6 nos períodos de seguimento pós-tx dos
pacientes em relação ao calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos
dados apresentados em A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Resultados 101
Figura 89 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-4 em células mononucleares de indivíduos controle e pacientes com EM nos períodos PRE, D+180, D+360,
D+540, D+720, D+900 e D+1080 pós-TACTH. Calibrador IC. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha pontilhada
indica a média de ΔΔC
T
do grupo calibrador. (B). Expressão relativa de RNAm da citocina IL-4 nos períodos analisados para os pacientes em relação ao calibrador IC.
Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em A e B, sem
diferença estatística em relação ao calibrador.
Figura 90 – Quantificação relativa de RNAm da citocina IL-4 em células mononucleares de pacientes com EM no período PRE-tx e demais períodos pós-TACTH, D+180,
D+360, D+540, D+720, D+900 e D+1080. Calibrador período PRE. (A). Gráfico de dispersão das amostras. As barras horizontais representam as médias. A linha
pontilhada indica a média de ΔΔC
T
do período calibrador. (B). Expressão relativa da citocina IL-4 nos períodos de seguimento pós-tx dos pacientes em relação ao
calibrador PRE. Valores expressos em x-fold (vezes) mais ou menos expresso em relação ao calibrador. (*) p≤0.05. (C) Tabela de descrição dos dados apresentados em
A e B, sem diferença estatística em relação ao calibrador.
Como na sessão anterior, para facilitar a visualização geral do fold change de todos os
resultados e comparações, são apresentadas as Tabelas 11 e 12, onde o fold change (menor, igual
ou maior) está representado por símbolos ( , = ou , respectivamente). Obviamente, a visualização
dos dados direto nas tabelas, inclusive comparando uma com a outra, é a melhor maneira de
observar os resultados, bem como a consulta às respectivas figuras se necessário. Mesmo assim, os
dados destas tabelas serão descritos a seguir.
Na Tabela 11, está apresentado o resumo dos resultados de expressão gênica dos 22 genes
analisados pré- e pós-tx dos pacientes com EM em comparação com os indivíduos controles (IC).
Neste panorama geral, observamos que vários genes, como Foxp3, TGF-β, GITR, RORγt, STAT-3,
Resultados 102
IL-17, IL-21, IL-23, T-bet, STAT-1, STAT-4, IFN-γ, GATA3, STAT-6 e IL-4 não apresentaram
diferenças em seus níveis de expressão, tanto quando a expressão PRE, quanto a PÓS, foi
comparada com a expressão do grupo IC. No entanto, houve mudanças significativas na expressão
dos outros genes que, no período PRE estavam com seus níveis de expressão em relação ao grupo
IC elevados, diminuídos ou iguais, e após o tx (PÓS) apresentaram níveis diferentes em relação ao
mesmo calibrador.
A expressão da IL-10, por exemplo, no período PRE dos pacientes, estava significativamente
aumentada em relação ao grupo controle e, após o tx, a expressão atingiu o mesmo nível que IC,
preditos como normais, em pelo menos um período do seguimento (D+900). É interessante ressaltar
que este resultado foi igual para essa comparação nas amostras de DM-1 e seus controles.
Os níveis de CD25, que estavam diminuídos no período PRE em relação ao controle,
passaram a apresentar os mesmos níveis que os controles nos períodos D+720 e D+1080 (Tabela
11). Já a molécula PD-1, que estava aumentada no período PRE em relação ao controle, passou a
expressar os mesmos níveis de RNAm que os controles nos períodos D+900 e D+1080. E a
expressão relativa de CTLA-4, que apresentava níveis iguais ao IC no período PRE, superou os
níveis normais nos períodos D+360 até D+720 do seguimento (Tabela 11).
A citocina IL-6 que apresentava maior expressão no período PRE, comparado com IC,
alcançou o patamar de expressão dos controles no período D+360 pós-tx. Já a citocina TNF-α, cuja
expressão não mostrou diferença no período PRE (Tabela 11), durante o seguimento pós-tx, passou
a apresentar maiores níveis em vários períodos (D+540, D+720 e D+1080) quando comparada com
IC.
Quando confrontados os dados da Tabela 11 com os da Tabela 12, observamos que, mesmo
sem diferença em relação aos níveis normais (Tabela 11), quando a expressão gênica pós-tx é
comparada com os níveis pré-tx (Tabela 12), os resultados dos períodos pós-tx mostram alterações
significativas em relação aos níveis de expressão na doença basal (período pré-tx).
Similar ao resultado da citocina IL-10 nos pacientes diabéticos, nos pacientes de EM, a
diminuição desse transcrito no período D+900 (Tabela 12) coincidiu com a normalização dos níveis
de expressão deste período em relação aos controles (Tabela 11).
A molécula CD25 não apresentou diferenças na expressão pós-tx em relação aos níveis pré-
tx (Tabela 12), que por sua vez estavam menores em relação ao IC (Tabela 11), porém
estranhamente nos períodos D+720 e D+1080 os níveis de CD25 se igualaram aos controles (Tabela
11). Semelhantemente, a expressão de PD-1 também não apresentou diferenças na avaliação pós-tx
em relação aos níveis pré-tx (Tabela 12), mas estes por sua vez estavam maiores em relação ao IC
(Tabela 11), e de maneira intrigante nos períodos D+900 e D+1080 os níveis dessa molécula se
igualaram aos controles (Tabela 11).
A diminuição dos níveis do fator de transcrição RORγt em três períodos de seguimento pós-tx
(D+180, D+360 e D+1080), que foi significativo em relação ao pré-tx, não chegou a diferenciar essa
expressão em relação aos níveis normais (IC). De modo semelhante, foi observado em relação a IL-
21, que os aumentos em vários períodos pós-tx (Tabela 12), não chegaram a ultrapassar os níveis
encontrado nos controles (Tabela 11).
Resultados 103
Para o fator de transcrição T-bet, houve aumento significativo em todos os períodos pós-tx
analisados em relação ao PRE (Tabela 12), porém os níveis de RNAm ficaram no mesmo patamar
que os encontrados nos controles (Tabela 11).
A citocina TNF-α apresentou aumento no período D+540 calibrado com PRE (Tabela 12), e
esse aumento coincidiu com o elevado nível desse transcrito no período em questão calibrado com IC
(Tabela 11). Porém, contraditoriamente, outros períodos também se mostraram elevados após o tx
em relação aos níveis de IC (D+720 e D+1080), enquanto que estes mesmos períodos apresentaram
níveis similares ao PRE (Tabela 12), que por sua vez era similar ao IC (Tabela 11).
Não apresentaram diferenças em ambas as comparações os genes Foxp3, TGF-β, GITR,
STAT-3, IL-17, IL-23, STAT-1, STAT-4, IFN-γ, GATA3, STAT-6 e IL-4 (Tabelas 11 e 12).
Tabela 11 – Resumo dos resultados de expressão dos genes alvos nos pacientes EM relação ao grupo IC.
Gene
PRE x IC
PÓS X IC
T
reg
Foxp3
=
=
IL-10
todos, = D+900
TGF-β
=
=
CD25
= D+720, D+1080
PD-1
= D+900-1080
GITR
=
=
CTLA-4
=
D+360-720
T
H
17
RORγt
=
=
STAT-3
=
=
IL-6
todos, = D+360
IL-17
=
=
IL-21
=
=
IL-23
=
=
IL-27
todos
T
H
1
T-bet
=
=
STAT-1
=
=
STAT-4
=
=
IFN-γ
=
=
TNF-α
=
D+540-720, D+1080
T
H
2
GATA3
=
=
STAT-6
=
=
IL-4
=
=
As setas representam aumento ( ) ou diminuição ( ) estatisticamente significativa em relação ao
grupo IC; (=) representa ausência de diferença estatística entre os fold changes comparados; PÓS –
todos os períodos pós-tx, o sinal usado resume o comportamento geral do gene durante os 6
períodos pós-tx; exceções são especificadas; sinais destacados apontam os resultados mais
interessantes;
Resultados 104
Tabela 12 – Resumo dos resultados de expressão dos genes alvos nos pacientes EM em relação ao período PRE.
Gene
D+180
D+360
D+540
D+720
D+900
D+1080
T
reg
Foxp3
=
=
=
=
=
=
IL-10
=
=
=
TGF-β
=
=
=
=
=
=
CD25
=
=
=
=
=
=
PD-1
=
=
=
=
=
=
GITR
=
=
=
=
=
=
CTLA-4
=
=
=
=
=
=
T
H
17
RORγt
=
=
=
STAT-3
=
=
=
=
=
=
IL-6
=
=
=
=
=
=
IL-17
=
=
=
=
=
=
IL-21
=
=
IL-23
=
=
=
=
=
=
IL-27
=
=
=
=
=
=
T
H
1
T-bet
STAT-1
=
=
=
=
=
=
STAT-4
=
=
=
=
=
=
IFN-γ
=
=
=
=
=
=
TNF-α
=
=
=
=
=
T
H
2
GATA3
=
=
=
=
=
=
STAT-6
=
=
=
=
=
=
IL-4
=
=
=
=
=
=
As setas representam aumento ( ) ou diminuição ( ) estatisticamente significativa em relação ao período PRE; (=) representa ausência de diferença
estatística entre os fold changes comparados; sinais destacados apontam os resultados mais interessantes;
4.2.3 Análise descritiva da Remissão x Recaída dos pacientes com EM
Da mesma forma que para os dados de DM-1, a divisão dos dados de expressão gênica em
grupos de pacientes de EM em remissão clínica (grupo Rm) e em recaída clínica (grupo Rc), fez com
que o n amostral ficasse insuficiente para uma análise estatística de confiança, e também, por esse
motivo a análise será apenas descritiva, procurando indícios da possível diferença de expressão entre
os dois grupos que possa ter relação com a recaída clínica observada. No Apêndice I estão
apresentadas as tabelas referentes à descrição dos dados de EM separados por grupo de Rm e Rc.
Já no Apêndice J estão apresentados os gráficos de dispersão e fold change desta análise, e na
Tabela 13 está apresentado o resumo da expressão dos genes analisados, quando comparado os
níveis de RNAm dos pacientes em Rc em relação aos pacientes em Rm (calibrador). Dos cinco
pacientes que recaíram após-tx, dois não responderam desde o início, um apresentou surto após 1
(D+360) ano de seguimento e dois apresentaram surtos após 2 anos (D+720) de seguimento.
Resultados 105
Tabela 13 – Comparação da expressão relativa dos genes alvos nos pacientes de EM em Rc calibrados em relação ao
grupo em Rm.
Gene
PRE
D+180
D+360
D+540
D+720
D+900
D+1080
T
reg
Foxp3
IL-10
=
=
=
TGF-β
=
=
CD25
=
=
PD-1
=
=
=
GITR
=
=
CTLA-4
=
T
H
17
RORγt
STAT-3
=
IL-6
=
IL-17
IL-21
=
IL-23
=
IL-27
=
=
T
H
1
T-bet
=
STAT-1
STAT-4
=
IFN-γ
=
=
TNF-α
=
=
T
H
2
GATA3
=
STAT-6
IL-4
As setas representam aumento ( ) ou diminuição ( ) do fold change em relação ao grupo Rm; (=) representa fold changes praticamente iguais entre os
grupos comparados; sinais destacados apontam os períodos em que o maior n de pacientes recaíram;
Conforme a Tabela 13, analisando especialmente o período D+720, observamos que
somente a expressão da molécula GITR estava diminuída nos pacientes que recaíram. Já todos os
RNAm, exceto um (IL-23), relacionados com o padrão T
H
17 estavam aumentadas nesses pacientes.
Da mesma maneira, todos os genes relacionados com o padrão T
H
1 e T
H
2 estavam elevados em
relação aos pacientes com remissão clínica.
“Eu quase que nada não sei. Mas desconfio de muita coisa”.
Guimarães Rosa (1908-1967)
Escritor brasileiro
D
D
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
Discussão 107
5 Discussão
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a expressão de genes relacionados
a células T reguladoras, T
H
17, T
H
1 e T
H
2 em pacientes com diabete melito do tipo 1 (DM-1)
e com esclerose múltipla (EM) antes e em vários períodos após o tratamento com
imunossupressão em altas doses seguida pelo transplante autólogo de células tronco
hematopoiéticas (TACTH), visando relacionar os seus possíveis papéis na patogênese
dessas doenças autoimunes, bem como determinar o efeito da terapia de imunossupressão
em altas doses seguida pelo TACTH na modulação desses genes nos pacientes com DM-1
e EM.
Para a análise do perfil gênico na autoimunidade, há duas opções de tecidos para
amostras: sangue periférico e o órgão alvo/linfonodo drenante. O sangue periférico contém
uma complexa mistura de tipos celulares, o que pode complicar a interpretação dos
resultados. Além disso, no caso de DAIs órgão-específicas, há sempre as questões sobre a
relevância das células importantes na patogêneses da doença que estão amostradas no
sangue (Baechler et al., 2006). As análises foram feitas a partir de células mononucleares
do sangue periférico, e por isso, talvez os resultados a respeito do envolvimento desses
genes alvos na patogênese dessas doenças, não tenham sido tão esclarecedores como
imaginado, uma vez que as células patogênicas estão concentradas no órgão-alvo e/ou
linfonodos drenantes, e estão representadas no sangue periférico de maneira muito esparsa
(Notkins; Lernmark, 2001). Outro aspecto é a exigência do acesso a células frescas, que
contudo é uma limitação séria neste aspecto, e há uma necessidade de desenvolver ensaios
robustos e reprodutíveis baseados no uso de células congeladas (Eisenbarth, 2007).
Mesmo com essa questão relacionada com a amostra, estudos de expressão
gênica neste tipo de amostra têm sido realizados e mudanças na expressão gênica após
tratamentos, como com IFN-β, já foram avaliadas. Os resultados desses estudos avaliando
a expressão gênica após tratamentos indicam que esta é uma boa ferramenta para ser
utilizada na predição de respostas a terapias, podendo se tornar um marcador de progresso
de DAIs órgão-específicas, objetivo o qual também é alvo de pesquisas. Nesses estudos, de
maneira geral, genes associados com a transdução de sinal e interação célula-célula,
proteínas estruturais, enzimas metabólicas, e tráfico intracelular bem como vários fatores de
transcrição, proteínas ligantes de DNA, ativação de linfócitos, e genes inflamatórios tem sido
identificados. Porém, nenhum sendo preditivo para o começo ou progressão da doença ou
resposta à terapias (Baechler et al., 2006).
Discussão 108
Existem muitas evidências indicando que o desencadeamento da DM-1 é
determinado pelo balanço entre linfócitos T reguladores e patogênicos. O DM-1 é talvez a
doença autoimune mais estudada e com maior progresso da compreensão dos fatores
genéticos envolvidos. A autoimunidade contra as células β reflete um processo altamente
dinâmico, e a preservação funcional dessas células tem sido relatada como um fator
extremamente importante para o sucesso das terapias propostas (Eisenbarth, 2007). Neste
sentido, os resultados clínicos do nosso tratamento apontam a preservação funcional das
células β remanescentes através do aumento dos níveis de peptídeo-C observado após o
transplante.
Porém, a presença de autoimunidade nas ilhotas, não necessariamente implica na
perda da função das células β. Pacientes podem permanecer persistir com a função de
célula β anormal durante alguns anos sem desenvolver o DM-1. Isto sugere que o período
pré-clínico é muito mais longo do que pensado, fazendo com que se leve em conta
intervenções que podem salvar a massa de célula β residual e atrasar ou até prevenir o DM-
1 (Narendran; Estella; Fourlanos, 2005), como é o caso do IAD/TACTH. Essas e outras
observações indicam que qualquer intervenção que manipule a resposta do sistema
imunológico teria a probabilidade de obter mais sucesso se iniciada tão logo que possível
depois da aparência dos primeiros sinais de destruição autoimune das células β (Eisenbarth,
2007; Couri; Voltarelli, 2008).
Pode haver uma janela crítica de 1 ano da intervenção imune depois da
emergência dos primeiros sinais do processo de doença autoimune (Eisenbarth, 2007).
Como em nosso caso, o tempo para intervenção é drasticamente menor, uma vez que os
pacientes obrigatoriamente são recém-diagnosticados (no máximo 6 semanas). Por isso,
ensaios de resposta imune celulares têm de ser padronizados, uma vez que têm o potencial
de servir como marcadores representativos de resultado clínicos em ensaios de intervenção
imunes. A exigência do acesso a células frescas, fator crítico neste aspecto, deve ser levada
em conta para se desenvolver ensaios confiáveis a partir de células congeladas (Eisenbarth,
2007). Além do mais, mais esforços devem ser postos na obtenção de tecido pancreático e
de linfonodos drenantes de pacientes com DM-1 pré-clínico e com doença recém-
diagnosticada para a concretização de estudos de caracterização de respostas de células T
antígeno-específicas.
Macrófagos e células dendríticas são as primeira células a infiltrarem as ilhotas
pancreáticas, e além de apresentarem antígenos das células β aos linfócitos, uma vez
ativados, produzem citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6,TNF-α e IFN-β) e óxido nítrico, e
contribuem também para a destruição das células β (Mathis et al, 2001). Em nossos
resultados dos pacientes com DM-1, após o transplante os níveis de RNAm da citocina pró-
inflamatória IL-6 aumentaram em relação aos níveis encontrados nos controles, indicando a
Discussão 109
modulação da expressão desse gene pelo tratamento com AID/TACTH. Porém, precisamos
correlacionar esse dado de expressão gênica com os dados de imunofenotipagem do
sangue total desses pacientes. Essa análise irá nos fornecer o número total, bem como a
porcentagem de cada tipo celular que compõem as células mononucleares do sangue
periférico. Com esses dados, poderemos sugerir se há ou não correlação entre o aumento
da citocina IL-6 em nossos pacientes de EM após o transplante com o potencial dano às
células β, e de qual ou quais populações é mais provável que está se originando esses
RNAm observados em nossos experimentos, se dos macrófagos, células dendriticas e/ou
linfócitos T
H
17.
O fator de transcrição STAT-4 é expresso em monócitos do sangue periférico
ativados, células dendríticas e macrófagos nos sítios de inflamação; e participa de várias
vias de sinalização de citocinas importantes, como IL-12, IFN-1 e IL-23. STAT4 participa da
sinalização crítica do desenvolvimento da resposta imunológica protetora contra infecções
(padrão T
H
1, produção de IFN-γ) (Zervou et al., 2008). Em nossos resultados, não houve
diferença na expressão de STAT-4, mas a expressão de IFN-γ mostrou-se aumentada nos
períodos pós-transplante dos pacientes de DM-1 quando comparado com os níveis pré-
transplante.
Caso houvesse um n amostral maior que possibilitasse a análise estatística entre
remissão e recaída, e esses resultados fossem mantidos, seria possível sugerir que os
pacientes que sofreram recaída clínica se encontravam, neste momento, com baixa
expressão de genes relacionados com T
regs
e T
H
2, e alta expressão de genes pró-
inflamatórios, de padrão T
H
1. A expressão elevada de genes relacionados ao padrão T
H
17,
também pró-inflamatórios, poderia sugerir a participação dessas células na patogênese do
DM-1. Diferentemente, para EM, caso houvesse um n amostral maior que possibilitasse a
análise estatística entre remissão e recaída, e esses resultados fossem mantidos, não seria
possível sugerir que os pacientes que sofreram surtos se encontravam com algum padrão
específico mais ou menos expresso neste dado momento que pudesse se relacionar com o
estado clínico observado, uma vez que todos os RNAm, exceto GITR e IL-23, estavam com
níveis elevados em comparação aos pacientes em remissão.
A grande variabilidade dos resultados, em relação à progressão da doença,
compromete os ensaios clínicos de EM, que por isso, acabam por necessitar de centenas de
pacientes para que tenham o poder estatístico suficiente para demonstrar a eficiência do
tratamento em questão, ou seja, a fim de constituir uma prova clínica (Trapp; Nave, 2008).
Em um estudo que investigou, a partir de amostra de sangue de pacientes com
diversas formas de EM e pacientes não tratados, o transcriptoma (RNAm) de genes
relacionados à regulação translacional, fosforilação oxidativa, sinapse imunológica e vias de
Discussão 110
apresentação de antígeno (Gandhi et al., 2010), observou-se uma assinatura gênica de
desregulação da atividade de células T nas amostras de pacientes não tratados.Nossos
dados apontam que, em relação aos controles, somente a expressão da molécula CD25
encontra-se diminuída nos pacientes.
Em nossos resultados dos pacientes com EM, após o transplante os níveis de
RNAm da citocina pró-inflamatória TNF-α aumentaram em relação aos níveis encontrados
nos controles, indicando a modulação da expressão desse gene pelo tratamento com
AID/TACTH. Porém, precisamos correlacionar esse dado de expressão gênica com os
dados de imunofenotipagem do sangue total desses pacientes. Essa análise irá nos fornecer
o número total, bem como a porcentagem de cada tipo celular que compõem as células
mononucleares do sangue periférico. Com esses dados, poderemos sugerir se há ou não
correlação entre o aumento dessa citocina e a resposta ao transplante.
Para EM, caso houvesse um n amostral maior que possibilitasse a análise
estatística entre remissão e recaída, e esses resultados fossem mantidos, não seria possível
sugerir que os pacientes que sofreram surtos se encontravam com algum padrão específico
mais ou menos expresso neste dado momento que pudesse se relacionar com o estado
clínico observado, uma vez que todos os RNAm, exceto GITR e IL-23, estavam com níveis
elevados em comparação aos pacientes em remissão.
Um estudo, em modelo experimental (EAE), detectou a indução de células T CD8
+
autorreativas para neuroantígenos, semelhante ao já observado em pacientes com EM,
porém, surpreendentemente, a transferência adotiva dessas células foi capaz de impedir a
indução e o avanço da EAE (York et al., 2010). Essas células, com propriedades
inesperadas, foram chamadas de células T CD8
+
reguladoras, neuroespecíficas, e detectou-
se que elas produzem IFN-γ e perforina e são capazes de eliminar células T CD4
+
neuro-
antígeno-específicas, sugerindo este como sendo o mecanismo citotóxico/supressor dessas
células. Timócitos CD8
+
CD25
+
CTLA-4
+
GITR
+
Foxp3
+
apresentam similaridades com os
timócitos CD4
+
CD25
+
naturais (Suzuki et al., 2008). A expressão relativa de CTLA-4 nas
amostras dos pacientes diabéticos após o transplante atingiu os níveis normais (IC), e nos
pacientes de EM, o mesmo gene aumentou sua expressão após a terapia em relação aos
controles, sugerindo a melhora deste mecanismo de regulação após o transplante nestes
pacientes. Ainda referente às amostras de EM, a molécula CD25
+
mostrou-se com níveis de
RNAm pré-transplante menores que o controle e, após o tratamento, essa expressão
normalizou, atingindo os mesmos níveis em relação ao IC.
Experimentos in vitro têm mostrado na literatura, que a expressão de moléculas de
MHC de classe II pode ser induzidas nas células β pela combinação de IFN-γ e TNF-α,
tornando possível a ativação local de células T autorreativas naïve nas ilhotas (Knip;
Siljander, 2008). Após a terapia, os transcritos de TNF-α aumentaram nos pacientes com
Discussão 111
EM tratados, em relação aos controles, mostrando a modulação deste gene resultante do
tratamento. Mas o mesmo não foi detectado para o IFN-γ em nossas amostras.
A potencial assinatura transcricional entre diversas doenças autoimunes foi
investigada por alguns grupos. Em um estudo os dados de DM-1 e EM clusterizaram juntos
entre si e separados do controle saudável e das outras DAIs. Na avaliação geral, os autores
identificaram 95 genes com a expressão aumentada e 117 genes com expressão diminuída,
comuns a todas as DAIs incluídas no estudo (Maas 2002). Cruzando os dados de vários
estudos, foi determinado como „assinatura autoimune‟ um grupo de 209 genes que estão
diferencialmente expressos no grupo de pacientes com diversas DAIs comparados com
indivíduos saudáveis (Baechler 2006). Ao compararmos as semelhanças encontradas entre
os resultados do nosso grupo de DM-1 e EM, encontramos dados interessantes. Dentre
eles: STAT-1 e STAT-4 não apresentaram diferença em sua expressão, tanto na
comparação PRExPÓS, quanto PacientexControle; para os genes que apresentaram
diferença estatística entre as comparações (IL-10, CTLA-4, IL-6, IL-21, IL-27, RORγt e TNF-
α), foi observado o mesmo perfil de expressão (aumento ou diminuição em relação ao
calibrador). A expressão de IL-10, CTLA-4, IL-6 e IL-27 estava aumentada nos pacientes de
ambas as doenças em relação aos seus respectivos controles, Já na comparação
PRExPOS, a IL-10 se apresentou menos expressa nos períodos pós-transplante, enquanto
a IL-21 aumentou, o RORγt de modo geral diminuiu e a citocina TNF-α aumentou.
Um trabalho recente indica que existe um defeito no número de células na
população de linfócitos T CD8
+
CD28
+
reguladores em pacientes com DM-1 e EM (Mikulkova
et al., 2010), mas em nossos resultados, o painel de genes relacionados com o padrão T
regulador, de modo geral, não apontou claramente diferenças na expressão gênica.
Estudos que comparam a expressão gênica por microarray de diferentes tipos de
lesões da EM com controles saudáveis, mostram que os genes regulados positivamente na
EM estão principalmente relacionados com o sistema imune, por exemplo, os genes de
várias citocinas e seus receptores, dentre eles a IL-17 e TNF. Além das diferenças em
relação aos controles saudáveis, foram encontradas diferenças na expressão gênica das
lesões agudas e crônicas. Além de haver diferença na expressão das regiões da mesma
lesão (borda e centro) (Baechler et al., 2006). De encontro a esses dados, após o
transplante, em pelo menos um período do seguimento de 3 anos, a expressão dos genes
CTLA-4 (T
reg
) e TNF-α (T
H
1) atingiram valores maiores de expressão, em relação ao grupo
controle, nos pacientes de EM.
Em outro estudo, 80% dos genes, entre os 30 com maior diferença de expressão,
eram relacionados a categoria de pró- e anti-apoptóticos, sugerindo um equilíbrio entre a
resistência e a susceptibilidade dos linfócitos ao processo de apoptose nos pacientes com
Discussão 112
EM (Baechler et al., 2006). Recentemente, outro trabalho do nosso grupo (Oliveira, 2008
dados em fase de publicação) apontou o normalização da expressão de genes anti-
apoptóticos e pró-apoptóticos nos nossos pacientes com EM, ou seja, indicando que a
terapia de imunossupressão em altas doses seguida do TACTH modulou a expressão
destes genes. Neste mesmo trabalho, a expressão dos genes anti-apoptótico nas células
mononucleares dos pacientes com EM em remissão clínica da doença foi diferente dos
pacientes em progressão neurológica pós-IAD/TACTH. Os níveis de RNAm dessas
moléculas estavam reduzidos nos pacientes que não responderam ao tratamento. O
trabalho ainda apontou que o aumento da expressão dos genes pró-apoptóticos
correlacionou-se inversamente aos valores de EDSS dos pacientes com EM após o TACTH.
Além disso, os dados sugeriram que o desequilíbrio de expressão observado quanto as
moléculas anti-apoptóticas e pró-apoptóticas nos pacientes com EM (mas também com as
de DM-1 avaliados) parece contribuir para a resistência dos linfócitos autorreativos à
apoptose e a sua persistência na circulação (Oliveira, 2008). Os resultados também
sugerem que as moléculas pró-apoptóticas provavelmente participam dos mecanismos
moleculares envolvidos na fisiopatologia do DM-1 e da EM.
No Brasil, desde 2001, o grupo de pesquisa coordenado pelo Prof. Dr. Julio César
Voltarelli do Centro Regional de Hemoterapia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
(FMRP) da Universidade de São Paulo (USP) têm estudado os mecanismos de ação do
TACTH no tratamento de DAI órgão-específicas e analisado as mudanças induzidas no
sistema imune do paciente em remissão e recaída após este tipo de transplante. Com esta
finalidade, recentemente Farias (2006) avaliou a reconstituição imunológica em pacientes
transplantados com DM-1 e EM e verificou que esta reconstituição foi alcançada via
mecanismos periféricos timo-independentes. Os resultados indicaram uma melhora nos
mecanismos reguladores da resposta imune, observado pelo aumento de células T
reguladoras, que podem contribuir para o restabelecimento da tolerância imunológica, bem
como mudanças qualitativas e quantitativas na composição do repertório de células T
nesses pacientes submetidos ao TACTH.
O racional principal para aplicação do TACTH em DAIs foi a idéia de que a
imunodepleção intensa poderia eliminar o repertório de células T auto-reativas patogênicas,
e que a reconstituição de um novo sistema imune a partir dos precursores hematopoiéticos
poderia restabelecer a tolerância imunológica, interrompendo a atividade inflamatória e
prevenindo recaídas da doença.
Apesar do rápido acúmulo de experiência clínica, os dados sobre os mecanismos
potenciais de ação do TACTH em doenças autoimunes humanas propostos foram, em parte
baseados na extrapolação de modelos experimentais (Van Bekkum et al., 2003). Em geral,
os resultados de reconstituição imunológica após o TACTH em DAIs são similares aos
Discussão 113
obtidos em doenças onco-hematológicas (Toubert e Charron, 2001; Thiel et al., 2004;
Auletta e Lazarus, 2005). Uma diferença importante é que as DAIs são freqüentemente
associadas com anormalidades pré-transplante, como alterações de citocinas e restrição do
repertório do TCR. Ainda existem várias dúvidas sobre os mecanismos de reconstituição
imunológica após o TACTH em pacientes com DAIs, apesar dos avanços recentes nessa
área,
Conforme sugerido por Muraro e Douek (2006), embora os eventos de
reconstituição imunológica possam afetar diferencialmente células que reconhecem
antígenos próprios ou não-próprios, não existe razão para sugerir que o TACTH tenha
efeitos seletivos sobre células T específicas para diferentes auto-antígenos, associados a
DAIs distintas. Assim, vários conceitos sobre o TACTH em DAIs, adquiridos principalmente
nos últimos dois anos, podem ser aplicados a todas as DAIs. Entretanto, deve ser
considerado que a heterogeneidade clínica e imunopatológica entre as DAIs e dentro delas,
possa introduzir diferenças variáveis entre os efeitos do TACTH no sistema imune, na
reconstituição imunológica e nos resultados clínicos (Farias, 2006).
Após a imunossupressão em altas doses, cujo objetivo é a linfoablação e
conseqüente eliminação das células auto-reativas patogênicas, as células tronco
hematopoiéticas autólogas são infundidas como um suporte hematopoiético para encurtar a
duração do período de citopenia pós-transplante e diminuir os risco de infecções. A
proporção do repertório de células T que deve ser eliminada para a eficácia clínica do
TACTH ainda gera controvérsias.
Resultados de TACTH em EM mostraram que, mesmo com um condicionamento de
alta intensidade (ciclofosfamida seguida de irradiação corpórea total e ATG), e purificação
das células tronco CD34
+
, o repertório de células T não foi completamente substituído por
novas especificidades (Muraro et al., 2005). Além disso, nesse trabalho a persistência de
clones pré-existentes antes do transplante não foi associada com a persistência da atividade
inflamatória da doença, sugerindo que a eficácia do TACTH pode não necessitar de uma
imunoablação completa nos pacientes e que devem existir outros mecanismos que levam à
remissão após o transplante.
A imunossupressão em altas doses leva a um período de linfopenia que favorece a
proliferação de células T maduras residuais que sobreviveram ao regime de
condicionamento ou foram reinfundidas com as células tronco no momento do transplante
(Laylor et al., 2005). Por outro lado, a sobrevivência de muitos clones de células T de
memória auto-reativas poderia levar à ineficácia do tratamento.
A reconstituição hematopoiética (de neutrófilos, plaquetas e monócitos) foi rápida
em nossos pacientes (Farias, 2006). A reconstituição da imunidade inata após transplantes
é caracteristicamente mais rápida do que a da imunidade adaptativa. A reconstituição
Discussão 114
numérica de células da imunidade inata, como as células NK e células dendríticas, cuja
produção e maturação ocorrem na medula óssea, ocorre rapidamente após o transplante
(Burt et al., 1998; Sun et al., 2004; Farge et al., 2005; Muraro et al., 2005)
Interessantemente, foi descrito que o G-CSF, usado para a mobilização das células
tronco para o sangue periférico e para encurtar o período de neutropenia pós-transplante,
promove a diferenciação de células T
H
2 que produzem IL-4 e IL-10 (Sloand et al., 2000).
Além disso, foi descrito que o G-CSF aumenta a expressão de marcadores de ativação nas
células mobilizadas (Tayebi et al., 2001). Uma vez ativados, monócitos presentes no enxerto
são capazes de suprimir a proliferação de células T, via produção de IL-10 (Mielcarek et al.,
1998). Mas nossos resultados não encontraram alteração neste sentido na expressão
desses genes.
Em geral, após o TACTH, a reconstituição numérica de linfócitos B ocorre
rapidamente, precede a recuperação de células T. Embora o número de linfócitos B comece
a normalizar, em torno de três meses pós-TACTH, a função das células B pode levar até
mais de dois anos para normalizar completamente (Guillaume et al., 1998; Auletta e
Lazarus, 2005). Deficiências na resposta humoral de pacientes após o TACTH são
atribuídas à falta ou diminuição do estímulo por células T CD4
+
helper, uma vez que o
número de células T CD4
+
diminui drasticamente no período pós-transplante.
Em nosso trabalho, a observação de que os níveis de anticorpos anti-GAD65
diminuíram, porém não desapareceram na maioria dos pacientes com DM após o
transplante, sugere que o regime de condicionamento não foi capaz de eliminar
completamente células B de memória auto-reativas, ou que algumas delas foram
reinfundidas novamente com as células tronco no transplante (Farias, 2006).
A primeira fase da reconstituição imunológica caracteriza-se pela expansão de
células T residuais que sobreviveram à imunossupressão em altas doses ou que foram
reinfundidas no transplante juntamente com as células tronco, em resposta a sinais
homeostáticos (Jameson et al., 2002). A proliferação homeostática periférica é responsável
pela rápida restauração da população de células T, principalmente em pacientes mais
velhos, devido à produção tímica limitada de células T naïve e, nessa fase, a maioria das
células T apresenta um fenótipo de memória, principalmente de linfócitos T CD8
+
(Farias,
2006). A proliferação homeostática não foi suficiente para restabelecer a população de
linfócitos T CD4
+
durante o período pós-transplante analisado (1 ano para DM-1 e 2 anos
para EM). Nossos resultados corroboram outros estudos de reconstituição imunológica em
doenças autoimunes, nos quais os pacientes foram acompanhados por no máximo um ano
após o transplante.
Discussão 115
Nesse cenário, pode-se questionar como a expansão homeostática periférica de
células T autólogas maduras conseguiria (mesmo que temporariamente) reconstituir um
repertório tolerante em um paciente com uma doença autoimune pré-existente.
Recentemente, Douek et al. (2000) mostraram a persistência de uma significante
função tímica e do potencial para recuperação completa e mesmo aumento do número de
células T naïve após TCTH em adultos, através de um método novo de detecção de células
recém-emigrantes do timo. Esse mesmo tipo de análise está em andamento nas amostras
dos nossos pacientes.
Em trabalho anterior do nosso grupo (Farias,2006), na avaliação do perfil de
citocinas após o transplante, através da pela quantificação fenotípica de células T no sangue
periférico, detectou-se um aumento na porcentagem de células T CD4
+
e CD8
+
produtoras
de citocinas do padrão T
H
1 (INF- e TNF- ), que está associado ao aumento de linfócitos T
de memória central e efetora, as subpopulações celulares predominantes nesse período da
reconstituição imunológica (até 1 ano para DM-1 e 2 anos para EM). Ocorreu uma
diminuição na freqüência de células T CD4
+
e CD8
+
positivas para a citocina IL-2 após o
transplante, que está associada ao número diminuído de células T naïve nos pacientes. Em
geral, foi observado um aumento da porcentagem de células T CD4
+
e CD8
+
produtoras de
citocinas do padrão T
H
2 (IL-4, IL-5 e IL-10), no período de pré-condicionamento e em vários
períodos após o TACTH. Essa presença de um maior número de células com perfil T
H
2
poderia ter um papel na supressão da atividade inflamatória da doença nesses pacientes.
Os dados de expressão gênica para os genes desse perfil de resposta, mostram que desde
o período pré-transplante os pacientes já apresentavam níveis de expressão de RNAm para
IL-10 aumentados em relação ao controle.
Em trabalhos anteriores com esses pacientes, também foram observadas
mudanças na composição do repertório de células T após o TACTH, evidenciadas por
alterações qualitativas e quantitativas dos picos de CDR3 das famílias V . O que sugere
uma mudança profunda na composição do repertório de células T após o TACTH, que
poderia explicar a indução da remissão da doença autoimune nos pacientes.
Foi observada uma rápida reconstituição de células T CD4
+
CD25
high
após o
transplante, que sugere uma expansão homeostática preferencial dessas células dentro da
população de células T CD4
+
, durante a fase linfopênica da reconstituição imunológica.
Porém, os dados de expressão dos genes relacionado a essas células não acompanharam
igualmente esse aumento verificado em trabalho antecessor.
Os resultados apresentados nesta dissertação fazem parte dos estudos brasileiros
sobre os mecanismos de ação da terapia de imunossupressão em altas doses (IAD) seguida
do TACTH, avaliando o possível papel de genes relacionados aos linfócitos T na
Discussão 116
patogênese do DM-1 e EM e no restabelecimento da tolerância imunológica após o TACTH.
Porém, nossos resultados mais conclusivos para ambas as doenças se referem ao perfil
encontrado nos pacientes em relação aos controles e como esse perfil foi alterado com o
tratamento IAD/TACTH. Para o objetivo de investigar os mecanismos de ação do
transplante, ou seja, análises feitas nos genes pré e pós terapia, são necessárias mais
análises complementares e sobretudo a correlação dos dados de expressão gênica com os
demais dados das diferentes abordagens que esses pacientes estão sendo investigados
pelos demais integrantes do nosso grupo de pesquisa.
Neste trabalho, obtivemos resultados bem contraditórios para a expressão de
alguns genes, como por exemplo IL-6, Il-17 e CTLA-4. Esses dados não mostram alterações
significativas na expressão pós-tx em relação ao período PRE, porém, o mesmo gene,
quando calibrado em relação ao grupo controle, mostra-se diferentemente expresso tanto no
período pré quanto em pelo menos um dos seguimentos pós-transplantes. Ademais, além
dessas contrariedades nos resultados, houve conformidades e semelhanças entre as
doenças autoimunes, como os resultados de GATA3 e IL-10, respectivamente. Os
resultados de ambas as comparações para a variável GATA3 estavam em conformidade
com o esperado, uma vez que, os períodos pós-tx que se mostraram diferentemente
expressos em relação ao pré-tx, foram os mesmos que estavam diferentemente expressos
quando comparados com os controles (Tabela 7 e 8). Para tentar explicar os resultados
obtidos, mais análises e correlações com dados já existentes dessas mesmas amostras
necessitam ser feitas.
Esse trabalho faz parte de um grande projeto, que em seu final, poderá elucidar os
mecanismos envolvidos na remissão clinica observada nos pacientes com DAIs submetidos
ao IAD/TACTH. Por essa razão, somado ao fato que não foram analisadas a expressão
protéica dos genes estudados por este projeto, tão pouco a função efetora das células
desses pacientes antes e após o transplante, per se, estes resultados de expressão gênica
relatados, não são conclusivos, são parte integrante de uma ampla abordagem celular e
molecular a qual estes pacientes estão sendo submetidos ao longo desses anos.
Discussão 117
"A ciência serve para nos dar uma idéia de quão extensa é a nossa ignorância."
Félicité Robert de Lamennais (1782-1854)
Filósofo e escritor francês
C
C
O
O
N
N
C
C
L
L
U
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S
S
Õ
Õ
E
E
S
S
Conclusões 118
6 CONCLUSOES
1. As células mononucleares dos pacientes com DM-1, antes do transplante,
apresentaram expressão elevada dos genes IL-10, CTLA-4 (relacionados a células T
reguladoras), IL-27 (padrão T
H
17) e GATA3 (padrão T
H
2) em relação aos controles;
2. Após o transplante, em pelo menos um período do seguimento de 3 anos, a expressão
dos genes IL-10, CTLA-4 (T
reg
), IL-27 (padrão T
H
17) e GATA3 (padrão T
H
2) nos pacientes
com DM-1 atingiram níveis similares ao grupo controles, ou seja, a terapia de
IAD/TACTH modulou a expressão destes genes;
3. Após o transplante, em pelo menos um período do seguimento de 3 anos, a expressão
dos genes IL-6 e IL-17 (T
H
17) atingiram valores elevados em relação ao grupo controle,
ou seja, a terapia de IAD/TACTH modulou a expressão destes genes;
4. As células mononucleares dos pacientes com EM, antes do transplante, apresentaram
expressão elevada dos genes IL-10, PD-1 (relacionados a células T reguladoras) e IL-6,
IL-27 (padrão T
H
17) e diminuída do gene CD25 (T
reg
) em relação aos controles;
5. Após o transplante, em pelo menos um período do seguimento de 3 anos, a expressão
dos genes IL-10, PD-1, CD25 (T
reg
) e IL-6 (T
H
17) nos pacientes com DM-1 atingiram
níveis similares ao grupo controles, ou seja, a terapia de IAD/TACTH modulou a
expressão destes genes;
6. Após o transplante, em pelo menos um período do seguimento de 3 anos, a expressão
dos genes CTLA-4 (T
reg
) e TNF-α (T
H
1) atingiram valores elevados em relação ao grupo
controle, ou seja, a terapia de IAD/TACTH modulou a expressão destes genes;
R
R
E
E
F
F
E
E
R
R
Ê
Ê
N
N
C
C
I
I
A
A
S
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8 Apêndices
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