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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
EDUARDO CROSARA RONCOLATO
ScFv’s produzidos por Phage Display, específicos para a peçonha
de Bothrops jararacussu, inibem ações tóxicas das peçonhas de
Bothrops jararaca, Bothrops pauloensis e Bothrops moojeni
RIBEIRÃO PRETO
2009
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EDUARDO CROSARA RONCOLATO
ScFv’s produzidos por Phage Display, específicos para a peçonha
de Bothrops jararacussu, inibem ações tóxicas das peçonhas de
Bothrops jararaca, Bothrops pauloensis e Bothrops moojeni
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para a
obtenção do título de Mestre.
Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada.
Orientador: Prof. Dr. José Elpidio Barbosa
RIBEIRÃO PRETO
2009
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Roncolato, Eduardo Crosara
ScFv’s produzidos por Phage Display, específicos para a peçonha de Bothrops
jararacussu, inibem a ação tóxica das peçonhas de Bothrops jararaca, Bothrops
pauloensis e Bothrops moojeni.
Ribeirão Preto, 2009
102 p. : il. ; 30cm
Dissertação de Mestrado. Apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/USP – Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada.
Orientador: Barbosa, José Elpidio.
1. “Phage Display”, 2. scFv, 3. Fosfolipase A2
5
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Lúcia e João
pelo apoio, amor e incentivo incessantes.
Aos meus avós, Nono e Nona,
com certeza, estão orgulhosos.
6
AGRADECIMENTOS
‐ Aos meus pais João e Lúcia;
‐ Ao programa de Pós‐Graduação em Imunologia Básica e Aplicada;
‐ Ao meu orientador, José Elpidio Barbosa;
‐ Aos colegas de laboratório;
‐ A equipe do Biotério da Clínica Médica, Adalberto, Maurício e Rui;
‐ Ao Centro de Métodos Quantitativos, CEMEQ;
‐ Ao serpentário da FMRP;
‐ Às minhas irmãs, Heloisa e Ana Angélica, e também à Danylowa;
‐ Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
7
EPÍGRAFE
"A adversidade desperta em nós capacidades que,
em circunstâncias favoráveis, teriam permanecido adormecidas"
Horácio
8
RESUMO
Roncolato, E. C. “ScFv’s produzidos por Phage Display, específicos para a
peçonha de Bothrops jararacussu, inibem a ação tóxica das peçonhas de
Bothrops jararaca, Bothrops pauloensis e Bothrops moojeni.” 2009. 102 f.
Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade
de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.
O uso de antivenenos permanece como o principal tratamento dos acidentes
ofídicos desde o final do século 19. A terapia clássica se baseia na administração de
soros obtidos a partir do sangue coletado de eqüinos imunizados, contudo, gera o
risco do desenvolvimento de doenças relacionadas à hipersensibilidade, além do
elevado custo de produção e manutenção dos biotérios. Diante disso, buscam‐se
alternativas para a produção de antivenenos. Uma delas é a tecnologia de “Phage
Display”, que oferece a possibilidade da obtenção de fragmentos de anticorpos
humanos recombinantes, específicos para as toxinas desejadas. Sua utilização, a
princípio, eliminaria a necessidade de imunização animal e, por conseqüência, os
inconvenientes do uso de soros heterólogos, reduzindo custos de produção e se
adequando às normas do bem‐estar animal.
Partindo dessa técnica, Tamarozzi (Tamarozzi, Soares et al. 2006)
selecionou, a partir da biblioteca de fagos‐anticorpos Griffin.1 (MRC, Cambridge,
UK), quatro clones produtores de scFv’s capazes de inibir as atividades
fosfolipásica e miotóxica da peçonha de Bothrops jararacussu. Sabendo da
existência de similaridades estruturais entre as enzimas de ação tóxica das
serpentes do Gênero Bothrops sp. (Gutierrez and Lomonte 1995), buscou‐se avaliar
9
a ação desses anticorpos citados, na inibição de atividades das peçonhas das
Bothrops jararaca, Bothrops pauloensis e Bothrops moojeni. Os clones referidos,
expandidos como fagos‐anticorpos que apresentam o fragmento do anticorpo em
sua superfície, se mostraram capazes de reconhecer as peçonhas botrópicas em
ensaio de ELISA. Os fragmentos de anticorpos solúveis, derivados dos fagos-
anticorpos mencionados, foram utilizados em experimentos “in vitro” que
avaliaram a inibição da atividade fosfolipásica das peçonhas botrópicas. Os
sobrenadantes contendo os fragmentos solúveis foram capazes de inibir parte
desta atividade, quando comparados à ação do sobrenadante de uma cultura
controle.
Alguns métodos foram testados buscando purificar os fragmentos de
anticorpos recombinantes. Através das técnicas de gel filtração ou afinidade dos
scFv’s à proteína L, não foram obtidos resultados satisfatórios. A purificação foi
realizada, com sucesso, a partir da interação da cauda de hexa‐histidina dos scFv’s
ao íon níquel, ligado à uma resina de agarose.
Os ensaios “in vitro”, desta vez utilizando os fragmentos purificados,
comprovaram sua função na inibição da atividade fosfolipásica das peçonhas
botrópicas avaliadas. A partir destes ensaios, o clone que revelou maior eficiência
nesta inibição foi selecionado dentre os quatro em questão. Os ensaios “in vivo”
seguintes evidenciaram a capacidade deste clone em inibir também a
miotoxicidade, além de retardar e em alguns casos, até mesmo evitar a letalidade
decorrente da ação das peçonhas das Bothrops jararacussu, Bothrops jararaca,
Bothrops pauloensis e Bothrops moojeni.
10
ABSTRACT
Roncolato, E. C. "ScFv's produced by Phage Display, specific for the Bothrops
jararacussu venom, inhibit the action of Bothrops jararaca, Bothrops pauloensis and
Bothrops moojeni venoms." 2009. 102 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2009.
Since the end of the 19th century, the use of antivenoms has remained as
the main treatment for snake bites. The classical therapy is based on the
administration of serum, obtained from blood of immunized horses. However, this
raises the risk of developing diseases related to hypersensitivity and increases the
cost of production and maintenance of the bioterium. Given this, alternatives are
being looked to improve the production of antivenoms. The Phage Display
technology offers the possibility of obtaining recombinant human antibody
fragments specific for the interest toxins. Its use, in principle, eliminates the animal
immunization and, consequently, the disadvantages of the heterologous sera use,
reducing production costs and would fit the standards for animal welfare.
Based on this technique, Tamarozzi (Tamarozzi, Smith et al. 2006) selected
from the phage antibodies library Griffin.1 (MRC, Cambridge, UK), four clones
producing scFv's capable of inhibiting the phospholipase and myotoxic activities of
the Bothrops jararacussu venom. Knowing the existence of structural similarities
between the Bothrops sp. venoms toxic action enzymes (Gutierrez and Lomonte
1995), we analyzed the effect of these antibodies cited in the activity inhibition of
the Bothrops jararaca, Bothrops pauloensis and Bothrops moojeni venoms. The
11
referred clones, expanded like a phages expressing antibody fragments on its
surface, have been shown to recognize the bothropic venom in ELISA test. The
soluble antibody fragments, derived from the phage antibodies mentioned, were
used in “in vitro” experiments that assessed the phospholipase activity inhibition
of bothropic venom. The supernatants containing the soluble fragments were able
to inhibit part of this activity, when compared to the action of a control culture
supernatant.
Some methods have been tested aiming to purify the recombinant antibody
fragments. Through the techniques of gel filtration or affinity of scFv's to L protein
satisfactory results were not obtained. The purification was carried out
successfully from the interaction of the tag of hexa‐histidine of scFv's to the ion
nickel, linked to an agarose resin.
Tests “in vitro”, using the purified fragments, confirmed its role in the
phospholipase activity inhibition of bothropic venom evaluated. From these tests,
the clone that showed greater efficacy in this inhibition was selected among the
four in question. Subsequent tests “in vivo” demonstrated the capacity of this clone
also to inhibit the myotoxicity, and slow, or in some cases even avoid, the lethality
resulting from the action of the Bothrops jararacussu, Bothrops jararaca, Bothrops
moojeni and Bothrops pauloensis venom.
12
LISTA
DE
SIGLAS
D.O. Densidade óptica
DL
50
Dose letal média
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
H
2
O
2
Água oxigenada
IPTG Isopropil‐β‐D‐tiogalactosídeo
LB Broth base
MPBS Solução fosfato salina contendo leito em pó
MRC “Medical Research Council”
OPD Orto‐fenileno diamino
PBS Solução salina tamponada com fosfato
PBST Solução salina tamponada com fosfato contendo Tween
PEG/NaCl Solução de polietilenoglicol contendo cloreto de sódio
scFv “Single‐chain Fv”
(fragmento de anticorpo contendo apenas a porção variável)
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
NaOH Hidróxido de Sódio
NiNTA Resina de níquel
u.f.p. Unidade formadora de colônia
EDTA Ácido Etileno Diaminotetracético
H
2
SO
4
Ácido Sulfúrico
MgSO
4
Sulfato de Magnésio
DEAE “Diethylaminoethyl”
PLA2 Fosfolipase A
2
13
LISTA
DE
SÍMBOLOS
°C Grau(s) Celsius
rpm Rotações por minuto
mcL Microlitro(s)
mL Mililitro(s)
mcg Micro‐grama(s)
mg Mili‐grama(s)
mcM Micro‐molar
mM Mili‐molar
M Molar
nm Nanômetro
min Minuto(s)
h Hora(s)
pH Potencial hidrogeniônico
g /G grama/ Gravidade
kDa Quilo Dalton
Mr Massa molecular relativa
14
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ......................................................................................................................................16
JUSTIFICATIVA....................................................................................................................................28
OBJETIVOS ............................................................................................................................................29
1. Objetivo Geral ..............................................................................................................................29
2. Objetivos Específicos ................................................................................................................29
MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................................30
1. Animais ..........................................................................................................................................30
2. Obtenção das peçonhas ...........................................................................................................31
3. Biblioteca de anticorpos e seleção de Fagos ...................................................................32
4. Amplificação e recuperação dos Fagos‐anticorpos ......................................................33
5. Análise dos fagos‐anticorpos precipitados ......................................................................35
6. Produção dos scFv’s ..................................................................................................................36
6.1. Infecção da Bactéria HB2151.......................................................................................36
7. Padronização das condições de produção dos scFv’s ..................................................37
7.1. Obtenção do scFv a partir do sobrenadante de cultura ....................................37
7.2. Obtenção de scFv a partir do espaço periplasmático ........................................38
8. Purificação dos fragmentos de anticorpos .......................................................................40
8.1. Gel filtração e HPLC .........................................................................................................40
8.2. Coluna de Afinidade por Proteína‐L ..........................................................................41
8.3. Coluna de Afinidade ao Níquel ‐ Ni‐NTA .................................................................42
9. Inibição de atividade tóxica da peçonha ...........................................................................43
9.1. Ensaios de hemólise indireta .......................................................................................43
9.1.1. Ensaio Cinético “in vitro” de Hemólise Indireta ...............................................43
9.1.2. Ensaio Cinético “in vitro” de Inibição de Hemólise Indireta utilizando
sobrenadantes de cultura .......................................................................................................44
9.1.3. Ensaio “in vitro” de Hemólise Indireta de Ponto Final ..................................45
9.1.4. Ensaio “in vitro” de Inibição de Hemólise Indireta de Ponto Final
utilizando scFv’s purificados .................................................................................................46
9.1.5. Ensaio Cinético “in vitro” de Hemólise Indireta ...............................................46
15
9.1.6. Ensaio Cinético “in vitro” de Inibição Hemólise Indireta utilizando scFv’s
purificados ....................................................................................................................................47
9.2. Inibição de letalidade – Neutralização “in vivo” ...................................................47
9.2.1. Determinação da DL
50
................................................................................................48
9.2.2. Avaliação “in vivo” da miotoxicidade ...................................................................49
9.2.3. Teste de inibição da letalidade ...............................................................................50
RESULTADOS .......................................................................................................................................51
1. Amplificação e recuperação dos Fagos‐anticorpos ......................................................51
2. Análise dos fagos‐anticorpos precipitados ......................................................................52
3. Produção de scFv’s ....................................................................................................................54
3.1. Obtenção do scFv a partir do sobrenadante de cultura ....................................54
3.2. Obtenção de scFv a partir do espaço periplasmático .........................................55
4. Purificação dos fragmentos de anticorpos .......................................................................56
4.1. Gel filtração e HPLC .........................................................................................................56
4.2. Coluna de Afinidade por Proteína‐L ..........................................................................58
4.3. Coluna de Afinidade Ni‐NTA ........................................................................................59
5. Inibição de atividades tóxicas da peçonha .......................................................................61
5.1. Ensaios de hemólise indireta .......................................................................................61
5.1.1. Ensaio Cinético “in vitro” de Hemólise Indireta ...............................................61
5.1.2. Ensaio Cinético “in vitro” de Inibição de Hemólise Indireta utilizando
sobrenadantes de cultura .......................................................................................................63
5.2. Inibição de letalidade – Neutralização “in vivo” ...................................................73
5.2.1. Determinação da DL
50
................................................................................................73
5.2.2. Ensaio “in vivo” de miotoxicidade .........................................................................75
5.2.3. Ensaio “in vivo” de inibição de miotoxicidade ..................................................76
5.2.4. Teste de inibição da letalidade ...............................................................................78
DISCUSSÃO ...........................................................................................................................................80
CONCLUSÕES .......................................................................................................................................89
PERSPECTIVAS ...................................................................................................................................90
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................91
APÊNDICE .............................................................................................................................................99
16
INTRODUÇÃO
Estima‐se que existam aproximadamente 3.000 espécies de serpentes no
mundo. Destas 10% a 14% são consideradas peçonhentas. No Brasil, as serpentes
peçonhentas pertencem sobretudo aos gêneros Bothrops sp., Crotalus, Lachesis e
Micrurus. O gênero Bothrops sp. é representado por aproximadamente 30 espécies,
distribuídas por todo o território nacional, sendo as mais conhecidas: B. atrox,
encontrada no norte do Brasil; B. erythromelas, encontrada na região nordeste; B.
neuwiedi pauloensis, encontrada em todo território nacional exceto na região norte
do país; B. jararaca, distribuída na região sul e sudeste; B. jararacussu, encontrada
no cerrado da região central e em florestas tropicais do sudeste e B. alternatus,
distribuída principalmente no sul do país (FUNASA 2001).
Figura 01. Distribuição geográfica das espécies de Bothrops sp. envolvidas no
presente trabalho (FUNASA 2001).
17
As serpentes pertencentes ao gênero Bothrops sp. possuem cauda lisa, não
tem chocalho e as suas cores variam muito, dependendo da espécie e da região
onde vivem. São popularmente conhecidas como jararaca, ouricana, jararacuçu,
urutu‐cruzeira, jararaca do rabo branco, malha de sapo, patrona, surucu‐curana,
combóia e caiçaca. Habitam zonas rurais e periferias de grandes cidades,
preferindo ambientes úmidos como matas e áreas cultivadas e locais onde haja
facilidade para proliferação de roedores (paióis, celeiros, depósitos de lenha). Tem
hábitos predominantemente noturnos ou crepusculares. Podem apresentar
comportamento agressivo quando se sentem ameaçadas, desferindo botes sem
produzir ruídos. (FUNASA 2001).
Dados da Organização Mundial de Saúde apontam a ocorrência de
2.500.000 acidentes por serpentes peçonhentas anualmente em todo mundo,
gerando cerca de 125.000 mortes (Chippaux 1998).
No Brasil, a Coordenação Nacional de Controle de Zoonoses e Animais
Peçonhentos (CNCZAP) órgão vinculado ao Ministério da Saúde, registrou no
período de 1990 a 1993, 81.611 acidentes envolvendo serpentes. Dentre os casos
em que o gênero da serpente foi informado, cerca de 90% deles foram atribuídos
às serpentes do gênero Bothrops sp., 7,7% ao gênero Crotalus, 1,4% ao gênero
Lachesis e 0,4% ao gênero Micrurus. Ainda entre estes 81.611 casos notificados,
359 evoluíram ao óbito. Excluindo‐se os 2.361 casos informados como “não
peçonhentos”, a letalidade geral para o Brasil foi de 0,45%. (FUNASA 2001). Dados
recentes mostram que em 2008, 1793 casos foram notificados e, até outubro do
corrente ano, mais 1219 acidentes por serpentes peçonhentas foram registrados
no estado de São Paulo, resultando em 4 óbitos (CVE 2009).
18
Gênero N. Casos N. Óbitos Letalidade (%)
Bothrops 59.619 185 0,31
Crotalus 5.072 95 1,87
Lachesis 939 9 0,95
Micrurus 281 1 0,36
Não informado 13.339 69 0,52
Total 79.250 359 0,45
Tabela 01. Letalidade dos acidentes ofídicos por gênero de serpente no Brasil,
1990 – 1993 (FUNASA 2001).
A peçonha das serpentes do gênero Bothrops sp. é constituída de uma
mistura complexa de substancias ativas, incluindo metaloproteases, toxinas,
enzimas, peptídeos, nucleotídeos, aminas biogênicas, carboidratos, sais, ácidos
orgânicos, esterases e fosfolipases A2 secretadas (Chaves, Barboza et al. 1995). Os
envenenamentos botrópicos se caracterizam por induzir estado de choque,
promover alterações cardiovasculares, exercer atividade proteolítica, com
pronunciado efeito local, necrose tecidual, hemorragia e edema (Mebs and Ownby
1990). Essas alterações decorrem dos efeitos aditivos ou sinérgicos das diferentes
toxinas e enzimas presentes nas respectivas peçonhas (Sanchez, Freitas et al.
1992)
Alguns dos principais efeitos tóxicos produzidos pelas peçonhas botrópicas
são decorrentes da atividade de enzimas chamadas fosfolipases A2. Estas enzimas
catalisam a hidrólise da ligação 2‐acil éster de 3‐sn‐fosfolipídeos, liberando ácidos
graxos livres e lisofosfatídeos, na presença de Ca
2+
(Waite 1987).
19
Associada à sua função catalítica primária, as PLA2 induzem diversos
efeitos como cardiotoxicidade (Fletcher, Rapuano et al. 1981), miotoxicidade
(Mebs and Samejima 1986), iniciação e/ou agregação plaquetária (Yuan, Jackson et
al. 1993), hemólise (Condrea, Yang et al. 1981), anticoagulação (Alvarado and
Gutierrez 1988), entre outros.
Todas as miotoxinas botrópicas são PLA2 (Gutierrez and Lomonte 1995). Essas
miotoxinas são comumente divididas em dois grupos de acordo com o aminoácido
presente na posição 49 de sua estrutura primária. Essa região está diretamente
ligada à atividade catalítica da enzima, pois, corresponde ao domínio de ligação da
molécula ao íon Cálcio. As PLA2s cataliticamente ativas possuem um ácido
aspártico nesta posição. A substituição deste aminoácido por uma lisina
impossibilita sua ligação ao íon. Sua capacidade de estabilizar a estrutura
tetraédrica, característica da enzima cataliticamente ativa, é perdida, porém, por
mecanismos não muito bem esclarecidos, sua atividade miotóxica é conservada
(Maraganore, Merutka et al. 1984). A região responsável pela atividade miotóxica
na enzima Lis‐49 tem sido motivo de estudo freqüente. Estudos utilizando
peptídeos sintéticos ou mutações pontuais na estrutura da molécula indicam que a
região C terminal está diretamente envolvida nessa atividade (Ward, Chioato et al.
2002; Chioato, Aragao et al. 2007). O modelo aceito atualmente revela a interação
de resíduos de aminoácidos com carga positiva da região C terminal da molécula
com fosfolipídios aniônicos associados às membranas celulares (Lomonte, Angulo
et al. 2003).
20
A homologia estrutural entre as PLA2 nas diversas peçonhas botrópicas é
comum. Estão listados na Tabela 02 alguns exemplos, como a BthTX‐1 encontrada
na peçonha de Bothrops jararacussu (Homsi‐Brandeburgo, Queiroz et al. 1988;
Cintra, Marangoni et al. 1993), BjPLA‐2 presente na peçonha de Bothrops jararaca
(Serrano, Reichl et al. 1999), MjTX‐1 purificada a partir da peçonha de Bothrops
moojeni (Soares, Andriao‐Escarso et al. 2000) e a BnSP‐7 extraída da peçonha de
Bothrops neuwiedi pauloensis (Soares, Guerra‐Sa et al. 2000).
21
PLA2/AA 1 10 20
BthTX-I S L F
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K
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G
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PLA2/AA 101 110 120
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PLA2/AA 130 133
BthTX-I L K
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D
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Bj-PLA2 − G
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C
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Q
E
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E
P
Tabela 02. Seqüência primária de fosfolipases presentes em peçonhas botrópicas.
BthTX‐1 ‐ Bothrops jararacussu
BjPLA‐2 ‐ Bothrops jararaca
MjTX‐1 ‐ Bothrops moojeni
BnSP‐7 ‐ Bothrops neuwiedi pauloensis
22
Em 1887, Sewall, buscando proteção frente às toxinas animais, mostrou que
após sucessivas administrações de uma mistura de glicerina e toxina extraída da
serpente Sistrurus catenatus, os pássaros imunizados se tornavam seis vezes mais
resistentes à DL
50
desta peçonha, do que pássaros que não haviam sido tratados
previamente (Sewall 1887). No ano seguinte a possibilidade de transferência de
proteção frente à difterotoxina, utilizando o sangue de outro animal imunizado, foi
identificada por Emile Roux e Alesandre Yersin (Roux and Yersin 1888). Em 1890,
trabalhos envolvendo difteria e tétano, Emil Von Behring em Shibasaburo Kitasato
confirmaram a transferência de imunidade passiva (von Behring and Kitasato
1991). Em 1894, Albert Calmette (Calmette 1984) observou que o soro de animais
imunizados possuía atividade terapêutica, sendo o primeiro a preparar antiveneno
comercial para uso médico contra picadas de serpentes indianas. Ele assim tornou‐
se o promotor da terapia antiveneno conhecida atualmente (Chippaux and Goyffon
1998).
A partir desta metologia, muitos cientistas iniciaram o desenvolvimento de
antivenenos em seus países, incluindo Vital Brazil no Brasil em 1905. Brazil
desenvolveu importante trabalho com antivenenos em trabalhadores nas
plantações de café, vítimas de acidentes principalmente envolvendo Crotalus
durissus terrificus e Bothrops jararaca. Segundo Brazil, no início do século passado,
a cada ano 3.000 mortes eram decorrentes de acidentes por serpentes
peçonhentas no Estado de São Paulo, o que significa uma taxa de mortalidade de
aproximadamente 25%, a maior parte destas devido a envenenamento botrópico.
Conhecedor dos trabalhos do Dr. Calmette envolvendo soro anti‐Naja, Vital Brazil
decidiu testar este soro monovalente (Hawgood 1992). O soro anti‐Naja provou
23
ser ineficaz no tratamento do envenenamento experimental para a peçonha de
cada uma destas serpentes. Testando seus dois antivenenos, anticrotálico e
antibotrópico, Vital Brazil demonstrou a ação específica e a importância de um
antiveneno polivalente no tratamento de tais acidentes (Hawgood 1999).
Os antivenenos consistem de uma solução rica em anticorpos, obtida a
partir do plasma purificado por precipitação com sulfato de amônio (MVE 1993).
Estes anticorpos são obtidos a partir de inoculo, em cavalos, de amostras contra as
quais se deseja uma resposta imune. O cavalo, pelo seu grande porte, permite a
coleta de grandes volumes de plasma, ricos em anticorpos antiveneno
(Schvartsman 1992). Os soros produzidos por este método têm funcionado há
mais de um século, e até hoje compõem a principal terapia aos envenenamentos
por animais peçonhentos. Porém, deve‐se lembrar que a manutenção de grandes
biotérios adaptados ao rebanho eqüino é dispendiosa. Outra questão importante é
o fato de que os próprios anticorpos do cavalo, heterólogos, induzem muitas vezes
reações de hipersensibilidade, como anafilaxia e “Doença do Soro” nos pacientes
tratados. Quanto à composição destes soros, somente 1 a 2,5% dos anticorpos são
específicos para a peçonha utilizada na imunização, à maior parte, mais de 97%,
não possuem atividades neutralizantes e, podem até mesmo ser prejudiciais ao
tratamento. Atualmente, a FUNED e o Instituto Butantan são as instituições
brasileiras que produzem o soro específico para a peçonha Botrópica por este
método.
Buscam‐se então, alternativas para produzir antivenenos reduzindo custos
e, poupando os animais necessários às imunizações tradicionais, descartando‐se a
24
utilização de anticorpos heterólogos. A produção de antivenenos por engenharia
genética surge como uma promissora possibilidade.
Em 1985, George Smith criou uma ferramenta que permite selecionar e
produzir peptídeos de interesse em meio a um amplo repertório, através de sua
expressão na superfície de fagos, a técnica de “Phage Display” (Smith 1985).
Posteriormente, em 1990, a expressão de fragmentos de anticorpos também na
superfície de fagos (McCafferty, Griffiths et al. 1990) possibilitou obtenção de
fragmentos com especificidade de interesse, dispensando o processo de
imunização animal ou a construção de hibridomas (Roque, Lowe et al. 2004). A
seleção dos fragmentos de anticorpos dentre um amplo repertório mimetiza a
estratégia de produção de anticorpos utilizada pelo sistema imune humoral.
Por esta técnica, a partir de bibliotecas específicas, podem ser obtidos
fragmentos de anticorpos Fab, scFv, entre outros. Uma das vantagens da utilização
das bibliotecas de scFv’s, está no pequeno tamanho do gene responsável pela
codificação desse fragmento, permitindo a construção de bibliotecas
geneticamente estáveis. Uma biblioteca de scFv’s é produzida unindo‐se domínios
variáveis de cadeia leve e pesada por um peptídeo “linker”, sendo, este scFv, ligado
à proteína gP3 constituinte do capsídeo do fago (McCafferty, Griffiths et al. 1990).
25
Figura 02. Representação da estrutura de um anticorpo humano e de seus
fragmentos. Modificado de (http://jbiol.com/content/figures/jbiol64‐1.jpg
)
A técnica de “Phage Display” vem sendo utilizada para produção de
fragmentos de anticorpos capazes de neutralizar atividades tóxicas de diversas
espécies de animais. Uma neurotoxina presente na peçonha da serpente Naja
kaothia foi neutralizada por scFv’s produzidos por Kasem Kulkweav e
colaboradores (Kulkeaw, Sakolvaree et al. 2009). Fragmentos Fab humanos,
produzidos por Francesca Bugli e colaboradores, foram capazes de inibir a
letalidade em camundongos, decorrente da atividade tóxica da peçonha da aranha
conhecida como Viúva negra (Bugli, Graffeo et al. 2008).
Em nosso laboratório utilizamos a biblioteca Griffin.1, uma biblioteca de
scFv’s, expressos na superfície de bacteriófagos, que possui um repertório sintético
de aproximadamente 10
12
clones, para a produção de anticorpos monoclonais
humanos, inclusive frente à toxinas animais (Tamarozzi, Soares et al. 2006;
Oliveira, Soares et al. 2009).
26
A forma de seleção do fragmento de anticorpo dentre o repertório da
biblioteca é o chamado “bio‐panning”. Por esse método, os fagos‐anticorpos são
selecionados após incubação da biblioteca junto ao antígeno de interesse. Os fagos
não ligantes são descartados. (Clackson, Hoogenboom et al. 1991).
Fig. 03 Delineamento do método “Bio‐panning” de seleção de fagos-anticorpos
(modificado http://www.creative‐biolabs.com/phagedisplay_files/20071129211449879.jpg)
27
Partindo dessa possibilidade, Tamarozzi (Tamarozzi, Soares et al. 2006)
selecionou e produziu fragmentos de anticorpos solúveis que se mostraram
capazes de inibir a atividade fosfolipásica e miotóxica da peçonha de Bothrops
jararacussu.
Sabendo da relação antigênica, funcional e estrutural, existente entre as
fosfolipases das peçonhas botrópicas (Gutierrez and Lomonte 1995), o objetivo
deste trabalho foi, avaliar se os scFv’s capazes de impedir as atividades
fosfolipásica e miotóxica da peçonha de Bothrops jararacussu, são também
competentes na inibição de ações tóxicas das peçonhas de Bothrops jararaca,
Bothrops pauloensis e Bothrops moojeni.
28
JUSTIFICATIVA
O número de acidentes por serpentes do gênero Bothrops sp. ainda é
significativo, mesmo nos dias atuais. A terapia clássica, desenvolvida há mais de
um século, é a principal forma de tratamento nesses casos de envenenamento. Sua
produção não sofreu grandes alterações desde a metodologia original. Entretanto,
o surgimento de novas tecnologias abre caminho para o desenvolvimento de uma
estratégia terapêutica alternativa ou complementar, aos soros convencionais,
evitando os inconvenientes do seu uso, reduzindo custos e poupando a utilização
de animais para sua produção. Sendo assim, este trabalho visa desenvolver e
aplicar uma forma de tratamento para estes acidentes, utilizando uma ferramenta
moderna e arrojada da ciência em engenharia genética. Poderá contribuir com o
trabalho de Vital Brazil, que há mais de um século tem sido a principal forma de
tratamento dos envenenamentos por animais peçonhentos.
29
OBJETIVOS
1. O
BJETIVO
G
ERAL
O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência no reconhecimento e
inibição de ações tóxicas das peçonhas de Bothrops jararaca, Bothrops pauloensis e
Bothrops moojeni, por scFv’s específicos para a peçonha de Bothrops jararacussu.
2. O
BJETIVOS
E
SPECÍFICOS
– Avaliar se os fagos‐anticorpos selecionados por Tamarozzi frente à peçonha
de Bothrops jararacussu reconhecem as toxinas das outras peçonhas
botrópicas;
– Produzir fragmentos de anticorpos solúveis (scFv’s) monoclonais, a partir
dos seus respectivos fagos‐anticorpos, com habilidade de reconhecimento
comum às peçonhas analisadas;
– Purificar os scFv’s;
– Verificar se os scFv’s purificados são capazes de inibir ou reduzir a
atividade fosfolipásica das peçonhas “in vitro”;
– Avaliar se os fragmentos de anticorpos são capazes de atenuar a
miotoxicidade ou ainda, retardar ou impedir a letalidade decorrente da
atividade das peçonhas “in vivo”.
30
MATERIAIS
E
MÉTODOS
1. A
NIMAIS
Os experimentos em que foram determinadas as doses letais médias (DL
50
)
referentes a cada uma das peçonhas botrópicas, além dos ensaios de miotoxicidade
e letalidade, utilizaram fêmeas de camundongos Swiss, com o peso entre 15 e 25 g,
cedidos pelo Biotério Central da FMRP. O protocolo n.⁰ 048/2009 de
experimentação animal do referente trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética
em Experimentação Animal (documento em anexo).
31
2. O
BTENÇÃO DAS PEÇONHAS
As peçonhas botrópicas foram obtidas junto ao serpentário da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP, sendo as serpentes provenientes de
diferentes regiões do estado de São Paulo. A extração foi realizada através da
compressão das glândulas de veneno (Figura 04), aplicando‐se uma pressão
moderada na parte de trás da cabeça, mantendo a serpente com sua boca aberta e
suas presas apoiadas num recipiente de vidro por onde flui a peçonha. As amostras
foram diluídas em água ultrapura (Millipore Billerica, MA 01821,USA), dosadas e
armazenadas à ‐20 °C em alíquotas de 100 mcL.
Figura 04. Método de coleta das peçonhas
32
3. B
IBLIOTECA DE ANTICORPOS E SELEÇÃO DE
F
AGOS
Tamarozzi (Tamarozzi, Soares et al. 2006) utilizou, para selecionar fagos‐
anticorpos específicos para a peçonha de Bothrops jararacussu, a biblioteca
genômica de bacteriófagos “Griffin. 1” (H. Griffin, MRC, Cambridge, Reino Unido,
dados não publicados), constituída pela reclonagem sintética das regiões variáveis
das cadeias leve (V
L
) e pesada (V
H
) de vetores da biblioteca lox dentro do vetor de
fagomídeo pHEN2, que produz fragmentos de anticorpos humanos do tipo scFv,
clonados em fusão com a proteína gP3 (pIII) do bacteriófago M13. O protocolo
adotado foi o indicado pelo MRC. O método utilizado para a seleção dos fagos foi o
“bio‐panning”, utilizando um imunotubo (IT) de poliestireno (Nunc®, Kamstrup,
Dinamarca, 5 mL) como fase sólida para a ligação do antígeno, seguido de
incubação da biblioteca, lavagem e eluição dos fagos‐anticorpos específicos. Foram
realizados quatro turnos de seleção, sempre frente à peçonha bruta da serpente
Bothrops jararacussu. Ensaios “in vitro”, avaliaram a capacidade de inibição da
atividade hemolítica dessa peçonha. Foram testados aproximadamente 200 clones,
na forma de fagos‐anticorpos monoclonais, dentre os quais, os quatro utilizados no
atual trabalho foram escolhidos. São eles P1F2, P1E11, P2B6 e P2B7.
33
4. A
MPLIFICAÇÃO E RECUPERAÇÃO DOS
F
AGOS
‐
ANTICORPOS
No presente trabalho, os fagomídeos selecionados por Tamarozzi
(Tamarozzi, Soares et al. 2006) expandiram‐se como fagos que apresentam o scFv
em sua superfície, através da infecção das E. coli TG1, utilizando os fagos
auxiliadores VCS‐M13.
Foram retirados 25 µl da suspensão de bactérias em estoque, inoculando
em 50 mL de LB com 100 µg/mL de ampicilina e 1% de glicose, em frasco tipo
erlenmeyer de policarbonato estéril 250 mL (Corning®, NY, EUA). Vale destacar
que a D.O.
600
inicial não foi maior que 0,1 (Bioespectro®, Espectrofotômetro SP22).
Esta cultura foi incubada a 37 °C, a 300 rpm (Shaker Lab Line®, 4628) até que a
D.O.
600
alcançasse 0,5.
Da cultura em crescimento exponencial e D.O.
600
apropriada, foram
retirados 10 mL para a infecção com os fagos auxiliadores. Para isso, foi calculado
o volume da solução de VCS‐M13 (1x10
12
fagos/mL) para uma relação de 1:20
entre o número de bactérias e as partículas de fagos auxiliadores, considerando
que a leitura 1,0, de uma cultura à D.O.
600,
corresponde aproximadamente a 8 x10
8
bactérias por mL. Os fagos auxiliadores foram adicionados e, a cultura mantida a
37 °C em banho‐maria, por 30 minutos, sem agitação, para permitir a infecção.
Após a incubação, a cultura foi transferida para um tubo tipo Falcon de 50
mL e centrifugada a 3.000 xg (centrífuga IEC, OM2438, MA, EUA) por 30 minutos a
4°C. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado ressuspendido e transferido
para frasco tipo erlenmeyer de policarbonato estéril de 250 mL com 50 mL de LB,
acrescido de 100 µg/mL de ampicilina e 25 µg/mL de canamicina (Sigma®,
St.
34
Louis, EUA). Esta nova cultura foi incubada a 30 °C por uma noite, com agitação a
300 rpm.
No dia seguinte, 40 mL foram centrifugados a 3.000 xg (centrífuga IEC,
OM2438, MA, EUA) por 30 minutos, a 4 °C. O sobrenadante foi recolhido e o
precipitado desprezado. Ao sobrenadante foram acrescentados 8 mL (1/5 do
volume) de uma solução de PEG/NaCl (20% Polietilenoglicol 6000 ‐ Across
Orgânics® New Jersey, EUA, 2,5 M NaCl ‐ Sigma®
St. Louis, EUA). A mistura foi
fortemente agitada e deixada por 2 horas em repouso no gelo. Após o processo, foi
centrifugada por 1 hora a 3.000 xg (centrífuga IEC, OM2438, MA, EUA) a 4 °C, e o
sobrenadante foi desprezado. O precipitado foi ressuspendido em 1,5 mL de PBS
pH 7,2 e novamente centrifugado em microcentrífuga a 11.600 xg por 5 minutos
(Microfuge E
TM
, Beckman®, Palo Alto), para remover os restos celulares. Com o
objetivo de se titular os fagos precipitados, foram transferidos 10 mL de uma
cultura de E. coli TG1 em crescimento exponencial (D.O.
600
entre 0,4 e 0,5) para um
frasco de polipropileno estéril de 50 mL (Falcon®) e foi adicionado 1 mcL de cada
solução de fagos precipitados obtidos anteriormente, incubando‐se durante 30
minutos, a 37 °C, em banho‐maria sem agitação, para permitir a infecção. Após esse
período, foram feitas 5 diluições seriadas a 1/10 das E. coli TG1 infectada as quais
foram plaqueadas em cinco placas circulares (placas de Petri) contendo meio LB‐
ágar suplementado com 100 µg/mL de ampicilina e 1% de glicose (foram
plaqueados 50 µl de cada diluição em cada placa) mantendo‐as a 37°C durante
uma noite. Para determinar o título dos fagos‐anticorpos foi feita a contagem das
colônias presentes nas placas de Petri, e os números obtidos foram aplicados na
seguinte fórmula [(número de colônias X fator de diluição)/volume aplicado na
placa] X 1000.
35
5. A
NÁLISE DOS FAGOS
‐
ANTICORPOS PRECIPITADOS
Os fagos‐anticorpos precipitados foram testados em ensaio de ELISA
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) quanto à sua capacidade de reconhecer
proteínas presentes nas outras peçonhas botrópicas testadas. Para isso foi
utilizada uma placa de ELISA (Costar®, Corning Incorporated, NY, EUA, fundo
plano, 96 poços) sensibilizada com 10 mcg por poço de peçonha bruta diluída em
carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6 (volume total 100mcL), incubada por uma
noite a 4 ⁰C. Para controle positivo, um poço foi sensibilizado com VCSM13 na
concentração 10
9
u.f.p./poço e, como controle negativo, foi utilizado um poço não
sensibilizado, em volumes finais de 100 mcL. O conteúdo dos poços foi descartado
e a placa foi lavada 3 vezes com PBS pH 7,2. Após bloqueio utilizando 200 mcL de
MPBS 2% por 2 horas a 37 °C, a placa foi lavada 3 vezes com PBS pH 7,2 e incubada
com 50 mcL dos fagos‐anticorpos precipitados. A placa foi incubada por 90
minutos à temperatura ambiente e em seguida lavada 3 vezes com PBS Tween
0,05% pH 7,2 e 3 vezes com PBS pH7,2. Após lavagem foram adicionados
anticorpos policlonais de coelho anti‐VCSM13 marcados com peroxidase diluídos
1:1000 em MPBS 1% pH 7,2. Após 60 minutos à temperatura ambiente a foi lavada
novamente com PBS Tween 0,05% pH 7,2 e logo após com PBS pH 7,2. Foi
adicionado então, a cada poço, 100 mcL de substrato OPD‐H
2
O
2
(2mg de OPD Acros
Organics, Fischer Scentific International, Inc., Hampton EUA, em 10mL de PBS e 30
mcL de H
2
O
2
30 volumes). Após 20 minutos a reação foi interrompida com a adição
de 50 mcL de ácido sulfúrico 1 M e a leitura feita em leitor de ELISA (Molecular
Devices, Sunnyvale, EUA) em comprimento de onda de 490 nm.
36
6. P
RODUÇÃO DOS SC
F
V
’
S
6.1. I
NFECÇÃO DA
B
ACTÉRIA
HB2151
Baseado no resultado obtido no ensaio de ELISA de fagos‐anticorpos, os
clones que apresentaram a capacidade de reconhecimento comum entre as
peçonhas testadas, foram escolhidos para expressão de fragmentos solúveis de
anticorpos. Para isso, eles foram utilizados para infectar bactérias E. coli HB2151
(Carter, Bedouelle et al. 1985), linhagem não supressora [k12, ara, D(lac‐pro),
thi/F’proA+B, laclqZDM15.
Um inoculo de E. coli HB2151 foi feito a 5 mL de LB em um Falcon® de 50
mL, e deixado a 37 ⁰C, sob agitação constante de 300 rpm, por uma noite. No dia
seguinte, 50 mcL da cultura saturada foram transferidos para um tubo Falcon® de
50 mL contendo 5 mL de LB. A cultura foi incubada a 37 ⁰C, sob agitação constante
de 300 rpm, até atingir 0,5 em D.O.
600
. Após atingir a D.O. requerida, foram
transferidos 200 mcL por poço, para 4 poços de uma placa de cultura de 96 poços.
A seguir, foram transferidos 10 mcL do sobrenadante de cada fago‐anticorpo
precipitado selecionado após o ensaio de ELISA, e a placa foi incubada na estufa a
37 ⁰C, por 30 minutos. Em seqüência foram transferidos 5 mcL de cada cultura
infectada para 4 tubos do tipo Falcon® de 50 mL contendo 5 mL de LB
suplementado com 100 mcg/mL de ampicilina e 1% de glicose, mantendo‐os por
uma noite, a 37 ⁰C, em rotação 300 rpm. No dia seguinte, foram feitas alíquotas de
1 mL de cultura, adicionado 1 mL de solução crio protetora (65% glicerol, 0,1M
MgSO
4
e 0,025M de Tris‐HCl pH 8,0) e estocados a ‐80⁰C.
37
7. P
ADRONIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE PRODUÇÃO DOS SC
F
V
’
S
Os marcadores originalmente encontrados nos scFv’s, como c‐myc e cauda
de hexa‐histidina, podem ser perdidos por ação de proteases durante os processos
de fermentação e obtenção dos anticorpos. Com a intenção de aperfeiçoar a forma
de produção e purificação dos fragmentos solúveis, buscou‐se padronizar os
métodos envolvidos.
7.1. O
BTENÇÃO DO SC
F
V A PARTIR DO SOBRENADANTE DE CULTURA
Para a produção do fragmento de anticorpo, a partir do sobrenadante da
cultura, HB2151 correspondente ao clone de interesse foi inoculada a 5 mL de
meio LB suplementado com ampicilina 100 mcg/mL, em um tubo do tipo Falcon®
de 50 mL, e mantido a 37 °C, 300 rpm, por uma noite. No dia seguinte, os 5 mL de
cultura saturada foram transferidos para um frasco tipo erlenmeyer de
policarbonato estéril de 1000 mL contendo 245 mL de meio LB complementado
com ampicilina 100 mcg/mL e glicose 0,1%, e a cultura foi mantida a 37 °C, 300
r.p.m até a D.O.
600
0,9. A seguir, foi acrescentado IPTG, até uma concentração final
de 1 mM. As culturas foram deixadas sob agitação a 300rpm, 37°C por 16 horas e,
em seguida, centrifugadas 3 vezes a 4000 xg (centrífuga IEC, OM2438, MA, EUA), 4
°C por 30 minutos e o sobrenadante filtrado em filtro de 0,2 mcm (Corning, NY
14831, Germany).
Com a finalidade de se concentrar as proteínas presentes no meio, foi
escolhido o processo de precipitação por sulfato de amônio 55%. Por este método,
38
o sal foi adicionado lentamente ao sobrenadante, sob agitação lenta em banho de
gelo até que a concentração alcançasse 55%. Ao fim do processo, a amostra foi
mantida sob agitação lenta em banho de gelo durante duas horas, seguida de
repouso em geladeira por outras duas horas. A amostra foi centrifugada a 4000 xg
(centrífuga IEC, OM2438, MA, EUA), 4 °C por 60 minutos, o sobrenadante
descartado e o precipitado ressuspendido em água ultrapura (Millipore Billerica,
MA 01821,USA). A amostra foi dialisada exaustivamente contra PBS pH 7,2.
Outro processo, também utilizado para concentração das proteínas
presentes no sobrenadante, foi a liofilização. As amostras foram congeladas e
mantidas no Liofilizador (Liotop, Liobras, São Carlos, SP) até que não fosse mais
visível a presença de umidade. O material liofilizado foi ressuspendido utilizando
água ultrapura (Millipore Billerica, MA 01821,USA).
7.2. O
BTENÇÃO DE SC
F
V A PARTIR DO ESPAÇO PERIPLASMÁTICO
Para a produção e extração do scFv a partir do espaço periplasmático, E.
Coli HB2151, infectada pelos clones de interesse, foi inoculada a 5 mL de LB,
suplementado com ampicilina 100 mcg/mL, em um tubo do tipo Falcon® de 50
mL, e incubado a 37 °C, 300 rpm, por uma noite. No dia seguinte os 5 mL de cultura
saturada foram transferidos para um frasco tipo erlenmeyer de policarbonato
estéril de 1000 mL, contendo 245 mL de meio LB suplementado com ampicilina
100 mcg/mL, glicose 0,1%, e mantido a 37 °C, 300 rpm até que a densidade óptica
da cultura aferida em 600 nm alcançasse 0,6. Foi adicionado IPTG à cultura, até
concentração final de 1 mM, e mantida a 30 °C, 300 rpm, por mais 5 horas. Após
39
esse período a cultura foi centrifugada a 4000 xg (centrífuga IEC, OM2438, MA,
EUA) durante 40 minutos. Após a primeira centrifugação, o sobrenadante foi
descartado e o precipitado pesado e ressuspendido em volume calculado a partir
do seu peso. Foram utilizados 80 mL de Tris‐Cl 30 mM, 20% de sacarose, pH 8,0
para ressuspender cada grama de precipitado. As células foram mantidas em
banho de gelo e foi adicionado EDTA 500 mM pH 8,0, gota a gota, até que a
concentração final atingisse 1mM. Após banho de gelo por 10 minutos com
agitação suave, foram então centrifugadas a 8000 xg durante 20 minutos.
Novamente o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em
MgSO
4
5mM, no mesmo volume correspondente à primeira centrifugação. As
células foram mantidas novamente em banho de gelo, sob movimentos circulares
suaves, durante 10 minutos e novamente centrifugadas a 8000 xg durante 20
minutos. O sobrenadante, contendo o extrato do periplasma foi então analisado em
eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%.
40
8. P
URIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE ANTICORPOS
8.1. G
EL FILTRAÇÃO E
HPLC
Uma das formas de purificação adotadas no trabalho foi a gel filtração em
G75, seguida de seu aperfeiçoamento por meio de HPLC (High Performance Liquid
Chromatography). Para isso, o sobrenadante de cultura liofilizado foi aplicado a
uma coluna de gelfiltração G‐75 (Sephadex G‐75, Superfine, Pharmacia, Uppsala,
Suécia, em coluna Sigma®
St. Louis, EUA, 0,5 m x 10 mm), em tampão bicarbonato
de amônio pH 8,0 com um fluxo de 100 mcL por minuto. As amostras foram
recolhidas e mensuradas em espectrofotômetro a 280 nm (Beckman, D.U. 640,
U.S.A.). Todas as amostras que apresentaram absorbância nesse filtro foram
analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%. As amostras que
revelaram bandas de aproximadamente 28 kDa, foram reunidas e liofilizadas para
aplicação no HPLC.
Após liofilização, 1 mL de amostra foi aplicado por vez, em uma coluna de
DEAE (DEAE Sephadex, Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.). Após o equilíbrio, o processo
de eluição foi iniciado com a aplicação de tampão bicarbonato de amônio 50 mM,
pH 8,0, fluxo de 3mL por minuto. Todos os picos apresentados durante 40 minutos
foram recolhidos. Após esse período, a solução de eluição foi substituída por
bicarbonato de amônio 50mM, pH 8,0, NaCl 0,1M, e foram coletados todos os picos
até o decorrer de 1h e 30 minutos do início da purificação. A solução foi novamente
substituída por bicarbonato de amônio 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,25 M, e os picos
recolhidos. Com 2 horas e 20 minutos de purificação, a solução anterior foi
41
substituída por bicarbonato de amônio 50 mM NaCl 1 M e os picos apresentados
foram coletados, encerrando a purificação em 3 horas. Todos os picos foram,
dialisados contra água ultrapura (Milipore Billerica, MA 01821,USA) e alíquotas
foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida 12% para a
determinação do pico de eluição do scFv puro.
8.2. C
OLUNA DE
A
FINIDADE POR
P
ROTEÍNA
‐L
Outro método testado buscando a purificação dos scFv’s foi o princípio de
afinidade à proteína L. Para isso, o extrato de periplasma ou sobrenadante de
cultura contendo os scFv’s foram filtrados em filtro 0,2 mcM (Corning, NY, USA) e
dialisados contra tampão PBS pH 7,2.
A coluna CBindDtm L (Fluka, Buchs, Switzerland) de 1 mL foi equilibrada
com 5 mL de PBS pH 7,2. Foram adicionados 5 mL de amostra à coluna, e o efluente
reaplicado 20 vezes e, em seguida, foi recolhido e armazenado a ‐20 °C para
posterior análise. A coluna foi lavada com 20 mL PBS pH 7,2 e o lavado também foi
recolhido para análise. A eluição foi feita utilizando 5 mL de glicina 0,1M, pH 2,2,
sendo imediatamente neutralizados, adicionando a cada mL de material eluído,
500 mcL de tampão tris base, 1 M, pH 8,0. A coluna foi reequilibrada com 10 mL de
PBS pH 7,2. As amostras foram analisadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida a 12%.
42
8.3. C
OLUNA DE
A
FINIDADE AO
N
ÍQUEL
‐
N
I
‐NTA
Os fragmentos recombinantes presentes no material extraído do espaço
periplasmático podem, ainda, estar expressando seus marcadores moleculares,
possibilitando formas de purificação mais eficientes. A técnica escolhida, no caso,
foi uma coluna de afinidade de níquel (Ni‐NTA) que possui forte interação com a
cauda de poli‐histidina dos scFv’s. O protocolo utilizado foi indicado pelo guia The
QIAexpressionist (QIAexpressionist 2003) que acompanhava o produto.
O extrato do periplasma ou sobrenadante de cultura foi dialisado
exaustivamente contra tampão de diálise (NaH
2
PO
4
xH
2
O 50 mM, NaCl 300 mM e
imidazol (Acros) 1 mM, pH8,0). O volume dialisado foi dividido em alíquotas de 50
mL e cada uma delas foi incubada durante uma noite, a 4 °C, 20 rpm em contato
com 1 mL de Ni‐NTA agarose (Qiagen, Duesseldorf, Germany) 50% (resina de
agarose ligada à níquel). Uma coluna foi carregada com cada mistura e os efluentes
coletados para análise. Foram feitas 3 lavagens com 5 mL de PBS pH 8,0 em cada
coluna, e outras 3 lavagens com 5 mL de tampão de lavagem (NaH
2
PO
4
xH
2
O 50mM,
NaCl 300mM e imidazol 20mM, pH 8,0) tendo os volumes coletados. Os scFv’s
foram eluídos utilizando 2 volumes de 3 mL de tampão de eluição (NaH
2
PO
4
xH
2
O
50 mM, NaCl 300 mM e imidazol 250 mM, pH 8,0). Alíquotas dos efluentes,
lavagens e eluições foram avaliadas por eletroforese em gel de poliacrilamida 12%.
43
9. I
NIBIÇÃO DE ATIVIDADE TÓXICA DA PEÇONHA
9.1. E
NSAIOS DE HEMÓLISE INDIRETA
9.1.1. E
NSAIO
C
INÉTICO
“
IN VITRO
”
DE
H
EMÓLISE
I
NDIRETA
Este método avalia por turbidimetria, a lise indireta de hemácias, em função
do tempo, no decorrer de 60 minutos, com leituras em intervalos de 10 minutos,
em comprimento de onda de 700 nm. Sendo assim, 350 mcL de sobrenadante de
uma cultura de HB2151 não infectada, 16 horas após a adição de IPTG e
precipitado por sulfato de amônio 55%, foram adicionados a cubetas de leitura em
espectrofotômetro, junto à concentrações variáveis das peçonhas avaliadas. As
reações foram incubadas durante 60 minutos, a 37 °C. Foram adicionados 100 mcL
de hemácias lavadas 0,5%, 15 mcL de gema de ovo diluída ¼ em solução salina
0,9%, além de 535 mcL de Tris‐HCl 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl
2
2,5 mM pH 7,4.
Como controle negativo, ao sobrenadante de cultura foi adicionado apenas solução
salina 0,9%, na ausência de qualquer peçonha. O controle branco foi preparado a
partir de uma reação contendo dose em excesso de uma das peçonhas, 60 minutos
antes do início das demais incubações. Mantendo as reações a 37°C, foram feitas
medições a cada 10 minutos.
44
9.1.2. E
NSAIO
C
INÉTICO
“
IN VITRO
”
DE
I
NIBIÇÃO DE
H
EMÓLISE
I
NDIRETA
UTILIZANDO SOBRENADANTES DE CULTURA
Neste experimento foram utilizados os sobrenadantes das culturas de
HB2151, devidamente infectadas pelos fagos‐anticorpos de interesse, 16 horas
após a adição de IPTG. Como controle positivo, cada peçonha testada foi incubada
junto ao sobrenadante de uma cultura de HB2151, não infectada. Como controle
negativo, os sobrenadantes das culturas de HB2151, infectadas pelos fagos‐
anticorpos de interesse, foram incubados junto à solução salina 0,9%, na ausência
da peçonha avaliada. Desse modo, as doses das peçonhas, já definidas no
experimento anterior, foram incubadas junto à 350 mcL dos sobrenadantes de
cultura referentes à cada um dos clones, durante 60 minutos, a 37 °C. Ao fim da
incubação, a solução foi transferida a cubetas de leitura, contendo 100 mcL de
hemácias lavadas 0,5%, 15 mcL de gema de ovo diluída ¼ em solução salina 0,9%,
além de 535 mcL de Tris‐HCl 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl
2
2,5 mM pH 7,4. Foram
realizadas aferições, como anteriormente descrito.
45
9.1.3. E
NSAIO
“
IN VITRO
”
DE
H
EMÓLISE
I
NDIRETA DE
P
ONTO
F
INAL
Este experimento foi adaptado da técnica utilizada por Tambourgi
(Tambourgi, dos Santos et al. 1994), na qual a ação fosfolipásica da peçonha é
avaliada, colorimetricamente, em 412 nm, após 60 minutos de reação.
Com o objetivo de minimizar eventuais erros de procedimentos, comuns
quando são produzidas reações reunindo vários componentes, foi preparada uma
solução de hemólise, a partir da qual foram retiradas alíquotas para a utilização
nos experimentos seguintes. Essa solução foi composta de 9,0 mL de tampão Tris‐
HCl 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl
2
2,5 mM, pH 7,4, além de 3 mcL de papa de
hemácias lavadas, e 50 mcL de uma solução de gema de ovo diluída ¼ em solução
salina 0,9% estéril.
Foram adicionados 900 mcL da solução de hemólise descrita, em tubos
Eppendorf de 1,5 mL, além de concentrações variadas das peçonhas botrópicas
avaliadas. Foram adicionados ainda, 100 mcL de solução salina 0,9% para
preencher o volume que, no ensaio de inibição dessa atividade seria
correspondente ao scFv. Como controle branco, foi preparada uma amostra sem a
adição de qualquer peçonha. As reações foram mantidas a 37 °C, durante 60
minutos, e posteriormente centrifugadas a 11.600 xg por 5 minutos (Microfuge
E
TM
, Beckman®, Palo Alto). Os sobrenadantes foram avaliados em
espectrofotômetro, em 412 nm (Beckman, D.U. 640, U.S.A.).
46
9.1.4. E
NSAIO
“
IN VITRO
”
DE
I
NIBIÇÃO DE
H
EMÓLISE
I
NDIRETA DE
P
ONTO
F
INAL UTILIZANDO SC
F
V
’
S PURIFICADOS
As doses definidas anteriormente, foram incubadas junto aos fragmentos
recombinantes, nas proporções 1:1, 2:1, 3:1 e 4:1, de scFv em relação a peçonha,
durante 60 minutos, a 37 °C. Após a incubação, a reação foi transferida para um
tubo Eppendorf de 1,5 mL contendo 900 mcL da solução de hemólise. Após 60
minutos, as amostras foram centrifugadas, e analisadas em espectrofotômetro,
como no ensaio anterior.
9.1.5. E
NSAIO
C
INÉTICO
“
IN VITRO
”
DE
H
EMÓLISE
I
NDIRETA
Esta técnica foi adaptada do método padronizado por Tamarozzi
(Tamarozzi, Soares et al. 2006). Concentrações variáveis de cada peçonha foram
incubadas junto à 900 mcL da solução de hemólise descrita, e 100 mcL de solução
salina 0,9%. Como controle branco foi preparada uma reação contendo dose em
excesso de uma das peçonhas, 60 minutos antes do início das demais incubações. A
atividade fosfolipásica foi avaliada em função do tempo, ao longo de 30 minutos,
com medidas a cada 3 minutos, em 700 nm, mantendo a temperatura a 37 °C.
47
9.1.6. E
NSAIO
C
INÉTICO
“
IN VITRO
”
DE
I
NIBIÇÃO
H
EMÓLISE
I
NDIRETA
UTILIZANDO SC
F
V
’
S PURIFICADOS
O clone que apresentou a melhor capacidade de inibição nos experimentos
anteriores foi escolhido para a continuidade dos testes. As doses de cada peçonha
determinadas para este ensaio, foram incubadas junto ao clone selecionado
purificado. As amostras foram mantidas a 37 °C durante 60 minutos. Em seguida, a
reação foi transferida a cubetas de leitura, foram adicionados 900 mcL da solução
de hemólise, realizando medições a cada 3 minutos, em 700 nm, mantendo a
temperatura a 37 °C.
9.2. I
NIBIÇÃO DE LETALIDADE
–
N
EUTRALIZAÇÃO
“
IN VIVO
”
Para a utilização dos fragmentos de anticorpos solúveis, nos ensaios “in
vivo”, foi utilizada uma coluna de polimixina B (Sigma n. P.1411, St. Louis, MO,
U.S.A.) para eliminação de lipopolissacarídeos (LPS) contaminantes. O protocolo
utilizado foi o indicado pelo fabricante.
48
9.2.1. D
ETERMINAÇÃO DA
DL
50
A determinação da DL
50
foi realizada de acordo com o protocolo de Karber
(Karber 1937). Grupos de 8 camundongos fêmeas (swiss, 18‐22g) receberam,
intravenosamente (i.v.) pela veia caudal, 4 diferentes doses de cada peçonha,
dissolvidas em 100 mcL de solução salina 0,9% estéril, variando de acordo com um
fator multiplicador. Um grupo controle recebeu apenas 100 mcL de salina 0,9%.
Todas as mortes ocorridas em até 24 horas após a aplicação das peçonhas foram
registradas. Após esse período os animais foram sacrificados em câmara de CO
2
.
Os dados foram modelados através da curva logística. Os ajustes dos
modelos foram realizados através da análise Bayesiana. Esta consiste na obtenção
de medidas resumos ou distribuições a posteriori para os parâmetros de interesse.
As medidas ou distribuições são obtidas combinando informações a priori sobre os
parâmetros de interesse (distribuição a priori) e informações contidas na amostra
(função de verossimilhança).
Para a obtenção de amostras da distribuição a posteriori conjunta dos
parâmetros de interesse, foram utilizados métodos de simulação de Monte Carlo
em Cadeias de Markov. Para isso, foram geradas amostras das distribuições
condicionais, utilizando o algoritmo Gibbs Sampling (Casela and George 1992) ou o
algoritmo de Metropolis‐Hastings (Chib and Greenberg 1995) quando essas
distribuições condicionais não são conhecidas. Para a obtenção dos resultados foi
utilizado o software Winbugs. Os cálculos foram realizados com o auxílio do Centro
de Métodos Quantitativos (CEMEQ), da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
49
9.2.2. A
VALIAÇÃO
“
IN VIVO
”
DA MIOTOXICIDADE
E
NSAIO
“
IN VIVO
”
DE INIBIÇÃO DE MIOTOXICIDADE
Foram divididos grupos de quatro fêmeas de camundongos Swiss (18‐20g).
Em um deles foi aplicado (i.m.), no músculo gastrocnemio direito, 50% da DL
50
de
cada peçonha, dissolvida em 200 mcL de solução salina 0,9% estéril. Outro grupo
recebeu a mesma concentração de cada peçonha, previamente incubada junto ao
scFv, seguindo a relação fragmento de anticorpo:peçonha também determinada.
Camundongos controle receberam 200 mcL de solução salina 0,9% estéril, ou
somente scFv. Três horas após a injeção, a extremidade da cauda dos animais foi
seccionada e por gotejamento foram retirados cerca de 100 mcL de sangue em
tubos do tipo Eppendorf de 0,5 mL. As amostras foram centrifugadas a 11.600 xg
(Microfuge E
TM
, Beckman®, Palo Alto) e a atividade plasmática da creatina cinase
(CK) foi quantificada através de um kit apropriado (Doles, GO, Brasil). Sua
atividade foi expressa em unidades/L, que consiste na quantidade de enzima que
produz 1 umol de NADH, nas condições do ensaio. As análises de variância
(ANOVA) foram feitas utilizando o procedimento PROC GLM do software SAS versão
9. Para a diferença entre os grupos foram utilizados os contrastes ortogonais.
Novamente os cálculos foram realizados com o apoio do Centro de Métodos
Quantitativos (CEMEQ), da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
50
9.2.3. T
ESTE DE INIBIÇÃO DA LETALIDADE
Para o ensaio de inibição da letalidade, novamente foram separados grupos
de quatro fêmeas de camundongos Swiss (18‐22g). Os animais do primeiro grupo
receberam, intravenosamente pela veia caudal, 2xDL
50
referente à cada peçonha.
Foi aplicado nos animais do segundo grupo a mesma dose de cada peçonha,
previamente incubada junto ao scFv na razão empregada nos testes anteriores.
Como controle, foram administrados o mesmo volume em solução salina 0,9% ou a
mesma concentração de apenas scFv em dois outros grupos. Mortes ocorridas nas
24 horas seguintes ao desafio foram registradas. Após esse período os animais
foram sacrificados em câmara de CO
2
.
51
RESULTADOS
1. A
MPLIFICAÇÃO E RECUPERAÇÃO DOS
F
AGOS
‐
ANTICORPOS
Os fagos‐anticorpos selecionados por Tamarozzi (Tamarozzi, Soares et al.
2006) foram utilizados para infecção das E. coli TG1 e, a partir daí, expandiram‐se
como partículas de fagos que apresentam anticorpo em sua superfície, utilizando
os fagos auxiliadores VCS‐M13. Os títulos referentes a cada um dos quatro clones
selecionados estão presentes na figura 05.
Figura 05. Título dos fagos-anticorpos precipitados obtidos após quatro turnos de
seleção frente à peçonha bruta de Bothrops jararacussu. Os fagos citados foram
amplificados com auxílio de fagos VCSM13 e titulados após infecção de bactérias E.
coli TG1 e cultivo em meio sólido.
52
2. A
NÁLISE DOS FAGOS
‐
ANTICORPOS PRECIPITADOS
Com a finalidade de avaliar a capacidade de reconhecimento das diferentes
peçonhas botrópicas, pelos fagos‐anticorpos precipitados, um ensaio de ELISA foi
realizado. Na figura 06 estão apresentadas as medições feitas em 490 nm,
proporcionais a ligação dos fagos às toxinas botrópicas. Como controle positivo foi
utilizado o fago auxiliar VCS‐M13, que difere fenotipicamente dos fagos‐anticorpos
apenas pela ausência do scFv ligado à proteína gP3. Foi possível confirmar a
reconhecimento das diferentes peçonhas botrópicas, pelos fagos‐anticorpos
selecionados frente à peçonha de Bothrops jararacussu.
53
Figura 06. Ensaio de ELISA utilizando os fagos-anticorpos precipitados contra as
peçonhas de B. jararacussu, B. jararaca, B. moojeni e B. pauloensis. Poços de uma
placa de ELISA foram sensibilizados com 10 mcg de cada peçonha. Como controle
positivo foi sensibilizado um poço com 50 mcL de uma solução contendo 10
9
u.f.p./mL de fagos auxiliadores (VCSM13). Como controle negativo foi utilizado um
poço não sensibilizado. Nos poços teste foram utilizados 50 mcL dos fagos‐
anticorpos precipitados, acrescidos de 50 mcL de MBPS 1% em cada poço. A
presença de fagos‐anticorpos específicos foi medida através da reação entre
anticorpos secundários conjugados à enzima peroxidase e o substrato OPD/H
2
O
2
.
54
3. P
RODUÇÃO DE SC
F
V
’
S
3.1. O
BTENÇÃO DO SC
F
V A PARTIR DO SOBRENADANTE DE CULTURA
Formas de obtenção dos scFv’s foram testadas e padronizadas ao longo do
trabalho. Dentre elas está a precipitação do sobrenadante de cultura, contendo o
fragmento solúvel, por sulfato de amônio 55%, resultado apresentado na figura 07.
A seta indica a banda correspondente aos fragmentos solúveis.
Figura 07. Perfil eletroforético do sobrenadante de cultura precipitado por sulfato
de amônio. Gel de poliacrilamida a 12% contendo o padrão de peso molecular
seguido do sobrenadante contendo o scFv, clone P1F2, indicado pela seta, corados
pela prata.
*Mr: Massa molecular relativa
55
3.2. O
BTENÇÃO DE SC
F
V A PARTIR DO ESPAÇO PERIPLASMÁTICO
Foi avaliada a obtenção dos scFv’s a partir do material contido no espaço
periplasmático bacteriano, considerando que os fragmentos recombinantes
produzidos pela bactéria HB2151 são exportados até esse compartimento, e
posteriormente secretados para o meio externo. A figura 08 apresenta o perfil
protéico do extrato periplasmático de uma cultura de HB2151, infectada pelo clone
P2B7, em comparação ao sobrenadante dessa mesma cultura em diferentes
estágios.
Figura 08. Gel de poliacrilamida a 12% apresentando o perfil eletroforético do
sobrenadante da cultura de HB2151 infectada pelo clone P2B7, antes da adição do
IPTG (1) e 5 horas após sua adição (2), além do extrato periplasmático dessa
cultura (3), corados pela prata. A seta indica a banda que corresponde ao
fragmento do anticorpo recombinante.
1 2 3
56
4. P
URIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE ANTICORPOS
4.1. G
EL FILTRAÇÃO E
HPLC
Soares e Tamarozzi (Soares 2005; Tamarozzi, Soares et al. 2006)
encontraram dificuldades na purificação dos scFv’s, à partir dos sobrenadantes de
cultura, utilizando métodos baseados na expressão de marcadores moleculares
desses fragmentos. Sendo assim, foram testadas técnicas alternativas que não
envolviam os marcadores. A primeira delas foi a gel filtração. O sobrenadante de
uma cultura de HB2151 infectada pelo clone P1F2, precipitado por sulfato de
amônio, foi aplicado a uma coluna de G‐75. O produto dessa purificação foi
aprimorado em cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), resultado que
está apresentado na figura 09. A purificação foi realizada com sucesso, sendo
obtida uma fração protéica livre de contaminantes. Entretanto, ensaios
preliminares utilizando esse fragmento purificado, demonstraram a perda de sua
habilidade em inibir a atividade fosfolipásica das peçonhas botrópicas.
57
Figura 09. Perfil eletroforético da solução contendo scFv purificado. Gel de
poliacrilamida a 12% contendo padrão de peso molecular e o fragmento
recombinante purificado por gel filtração em G‐75, posteriormente aprimorado em
HPLC, indicado pela seta, corados pela prata.
58
4.2. C
OLUNA DE
A
FINIDADE POR
P
ROTEÍNA
‐L
A proteína L, extraída da bactéria Peptostreptococcus Magnus, possui
afinidade a regiões constantes em cadeias leves do tipo kappa, nos domínios
variáveis, sendo uma possibilidade de purificação de scFv’s freqüentemente
utilizada. Assim, testando formas de purificação dos fragmentos recombinantes, foi
utilizada uma coluna de afinidade à Proteína L (CBindD
tm
L ‐ Fluka, Buchs,
Switzerland). Os scFv’s produzidos a partir da biblioteca Griffin.1 possuem
domínios variáveis correspondentes às duas cadeias leves, tipo kappa e lambda.
Seguindo o protocolo indicado pelo fabricante, não foram obtidas frações
purificadas para nenhum dos quatro clones testados. Resultado que indica,
provavelmente, que scFv’s selecionados são constituídos de domínios variáveis das
cadeias leves do tipo lambda, o que impossibilita sua purificação seguindo esse
método.
59
4.3. C
OLUNA DE
A
FINIDADE
N
I
‐NTA
Os fragmentos de anticorpos, produzidos pela biblioteca Griffin.1,
apresentam peptídeos que facilitam sua detecção e purificação. Nesse caso, os
peptídeos, ou tags, são o c‐myc (detectado pelo anticorpo monoclonal 9E10) e a
cauda de hexa‐histidina (que exibe forte interação com matrizes de íons metálicos
imobilizados ‐ IMAC) (Terpe 2003). Os fragmentos solúveis, presentes no
compartimento periplasmático bacteriano, possivelmente mantém a expressão de
seus marcadores, ao contrário dos scFv’s obtidos a partir do sobrenadante de
cultura. Sua purificação pela interação da cauda de hexa‐histidina ao íon níquel
(Ni‐NTA agarose ‐ Qiagen, Duesseldorf, Germany) foi a alternativa testada que
ofereceu os melhores resultados. Por esse método foi possível purificar os
fragmentos recombinantes conforme apresentado na figura 10. Ensaios
preliminares indicaram que sua função de inibição da atividade fosfolipásica das
peçonhas botrópicas permanecia conservada.
60
Figura 10. Perfil eletroforético da solução contendo o scFv purificado. Gel de
poliacrilamida a 12% apresentando o padrão de peso molecular e a amostra do
extrato do periplasma bacteriano após a purificação em coluna de afinidade ao íon
níquel (Ni‐Nta), contendo scFv indicado pela seta, corados pela prata.
61
5. I
NIBIÇÃO DE ATIVIDADES TÓXICAS DA PEÇONHA
5.1. E
NSAIOS DE HEMÓLISE INDIRETA
5.1.1. E
NSAIO
C
INÉTICO
“
IN VITRO
”
DE
H
EMÓLISE
I
NDIRETA
Em primeiro lugar foi avaliada a inibição da atividade fosfolipásica das
peçonhas botrópicas pelos fragmentos de anticorpos solúveis, ainda diluídos no
sobrenadante de cultura. A análise foi feita através de um ensaio cinético de
hemólise indireta, utilizando fosfatidilcolina da gema de ovo como substrato, na
presença de cloreto de cálcio. Antes que a inibição dessa atividade fosse avaliada,
inicialmente foram definidas as doses mínimas necessárias à geração de hemólise
nítida, comparando‐se a uma reação 100% hemolisada. As concentrações foram
definidas, diluídas no sobrenadante de uma cultura HB2151 não infectada, que não
apresentava scFv’s. Esse procedimento foi realizado como controle do teste, já que
a inibição da atividade fosfolipásica seria avaliada utilizando fragmentos de
anticorpos contidos em um meio semelhante.
Após testar diferentes concentrações foi definida a dose de 30,0 mcg para
cada uma das peçonhas botrópicas. O resultado desse experimento está expresso
na figura 11.
62
Figura 11. Ensaio cinético, “in vitro”, da atividade hemolítica indireta das peçonhas
botrópicas, dissolvidas no sobrenadante de cultura de HB2151, não infectada.
Foram adicionados 30 mcg das peçonhas brutas a 350 mcL de sobrenadante de
cultura e, em seguida, acrescentados 100 mcL de hemácias lavadas 0,5%, 15 mcL
de gema de ovo diluída ¼, além de 535 mcL de tampão tris contendo cloreto de
cálcio. Como controle negativo, uma amostra foi preparada sem a adição de
qualquer peçonha. Foram feitas medições a cada 10 minutos, a 37 °C, em 700 nm.
63
5.1.2. E
NSAIO
C
INÉTICO
“
IN VITRO
”
DE
I
NIBIÇÃO DE
H
EMÓLISE
I
NDIRETA
UTILIZANDO SOBRENADANTES DE CULTURA
Determinadas as doses de cada uma das peçonhas, capazes de gerar
hemólise clara, foi avaliada a habilidade dos scFv’s em inibir esse efeito. As
representações gráficas das medições de cada clone estão apresentadas na figura
12. Em todos os casos foi possível observar a capacidade que os scFv’s possuem,
diluídos nos sobrenadantes de cultura de HB2151, de inibir parte do efeito
hemolítico decorrente da atividade fosfolipásica das peçonhas avaliadas.
64
Figuras 12. Ensaio cinético, “in vitro”, de inibição da atividade hemolítica indireta
das peçonhas de B. jararacussu (A), B. jararaca (B), B. moojeni (C) e B. pauloensis
(D), utilizando os fragmentos solúveis diluídos nos sobrenadantes de cultura.
Foram incubados 30 mcg das peçonhas botrópicas junto a 350 mcL dos
sobrenadantes contendo os scFv’s, clones P1F2 ( ), P1E11 ( ), P2B6 ( )
e P2B7 ( ). Como controle positivo, cada peçonha foi incubada junto ao
sobrenadante de uma cultura de HB2151 não infectada ( ). O controle negativo
foi obtido sem a adição de qualquer toxina ( ). Após a incubação foram
adicionados 100 mcL de hemácias lavadas 0,5%, 15 mcL de gema de ovo diluída ¼,
além de 535 mcL de tampão tris contendo cloreto de cálcio. As medições foram
realizadas a cada 10 minutos, em 700 nm, a 37°C.
65
5.1.3. E
NSAIO
“
IN VITRO
”
DE
H
EMÓLISE
I
NDIRETA DE
P
ONTO
F
INAL
Foi confirmado, então, que os scFv’s, selecionados frente à peçonha de B.
jararacussu, dispersos nos sobrenadantes de cultura, foram capazes de inibir parte
da atividade fosfolipásica das demais peçonhas botrópicas avaliadas. Após o
sucesso da purificação desses fragmentos novos ensaios foram realizados. O
primeiro deles seguiu o mesmo princípio de hemólise anterior, porém, realizando
apenas uma leitura ao fim de 60 minutos de reação, em 412 nm.
Foram definidas primeiramente as mínimas doses das peçonhas capazes de
causar hemólise nítida, para que posteriormente, fosse avaliada a atividade de
inibição dessa atividade pelos scFv’s purificados.
Após alguns testes as doses obtidas foram de 5,0 mcg para a peçonha da
Bothrops jararacussu, 8,0 mcg para as peçonhas das B. jararaca e B. moojeni e 10
mcg para a peçonha da B. pauloensis, como apresentado na figura 13.
66
Figura 13. Ensaio, “in vitro”, de hemólise indireta de ponto final decorrente da
atividade fosfolipásica das peçonhas botrópicas. As concentrações descritas de
cada peçonha, diluídas em 100 mcL de solução salina 0,9%, foram adicionadas a
900 mcL da solução de hemólise. Como controle negativo não foi adicionada
nenhuma das peçonhas testadas. Após 60 minutos, a 37 °C, as amostras foram
centrifugadas e os sobrenadantes mensurados em espectrofotômetro, em 412 nm.
67
5.1.4. E
NSAIO
“
IN VITRO
”
DE
I
NIBIÇÃO DA
H
EMÓLISE
I
NDIRETA DE
P
ONTO
F
INAL UTILIZANDO SC
F
V
’
S PURIFICADOS
As doses das peçonhas botrópicas definidas no experimento anterior, foram
incubadas junto aos scFv’s purificados, nas razões scFv:peçonha bruta 1:1, 2:1, 3:1
e 4:1, durante 60 minutos, a 37 °C. Os resultados apresentados na figura 13 são
aqueles obtidos a partir da incubação das peçonhas junto aos fragmentos solúveis
na proporção de 3:1, relação em que foram observados os melhores resultados.
Como descrito, os fragmentos de anticorpos purificados foram hábeis em
inibir parte da atividade fosfolipásica das peçonhas avaliadas. Foi possível
observar também, que o clone P2B7 apresentou a capacidade de inibição pouco
superior aos demais clones e, por isso, foi selecionado para utilização nos
experimentos seguintes.
68
Figura 14. Ensaio, “in vitro”, de inibição de hemólise indireta de ponto final,
utilizando scFv’s purificados. Foram incubados 5,0 e 10,0 mcg das peçonhas de
Bothrops jararacussu (A) e B. pauloensis (B), respectivamente, além de 8,0 mcg das
peçonhas de B. jararaca (C) e B. moojeni (D), junto aos fragmentos de anticorpos
purificados na razão 3:1. Logo após foram acrescentados 900 mcL da solução de
hemólise já descrita e novamente incubados. As amostras foram centrifugadas e o
sobrenadante aferido em 412 nm.
69
5.1.5. E
NSAIO
C
INÉTICO
“
IN VITRO
”
DE
H
EMÓLISE
I
NDIRETA
Um ensaio cinético “in vitro” de hemólise indireta foi novamente realizado,
seguido de outro teste de inibição dessa atividade. Desta vez, no entanto, a inibição
avaliada foi decorrente da atividade dos scFv’s purificados, derivados do clone
P2B7.
Foi necessário definir, mais uma vez, as mínimas concentrações de cada
peçonha capazes de gerar hemólise evidente, nesse caso para reações de 30
minutos. Sendo assim, diferentes doses foram diluídas em 100 mcL de solução
salina 0,9%, e adicionadas a 900 mcL da solução de hemólise descrita
anteriormente.
A figura 15 exibe os resultados apresentados pela atividade de 10,0 mcg da
peçonha de B. jararacussu, 15,0 mcg de B. jararaca e B. moojeni e 20,0 mcg da
peçonha da B. pauloensis.
70
Figura 15. Ensaio cinético, “in vitro”, de hemólise indireta, decorrente da atividade
fosfolipásica das peçonhas botrópicas. Foram adicionadas 10,0 mcg da peçonha de
B. jararacussu ( ), ou 15,0 mcg de B. jararaca ( ) e B. moojeni ( ), ou
ainda 20,0 mcg da peçonha de B. pauloensis ( ), diluídas em 100 mcL de
solução salina 0,9%, a 900 mcL da solução de hemólise. Ao controle negativo não
foi adicionado nenhuma das peçonhas em teste ( ). As amostras foram
mantidas a 37 °C, com medições registradas a cada 3 minutos em 700 nm.
71
5.1.6. E
NSAIO
C
INÉTICO
“
IN VITRO
”
DE
I
NIBIÇÃO
H
EMÓLISE
I
NDIRETA
UTILIZANDO SC
F
V
’
S PURIFICADOS
Determinadas as mínimas concentrações de cada peçonha testada, capazes
de gerar hemólise evidente, foi avaliada a capacidade de inibição da atividade
fosfolipásica pelos scFv’s purificados, derivados do clone P2B7. As peçonhas
botrópicas foram incubadas junto aos fragmentos solúveis, na proporção 3:1,
scFv:peçonha bruta, durante 60 minutos, a 37 °C. Os resultados apresentados na
figura 16 comprovam a capacidade que os fragmentos solúveis derivados do clone
P2B7 possuem de inibir parte da atividade fosfolipásica das peçonhas testadas.
Foram realizados, na seqüência, os ensaios “in vivo”.
72
Figura 16. Ensaio cinético, “in vitro”, da inibição da hemólise indireta
decorrente da atividade fosfolipásica, pelo clone P2B7 purificado. Foram
incubados 10,0 mcg da peçonha de B. jararacussu (A), 15,0 mcg de B. jararaca (B) e
B. moojeni (C) e 20,0 mcg da peçonha da B. pauloensis (D) junto aos scFv’s, clone
P2B7 purificado ( ). Como controle negativo não foi acrescido nenhuma das
peçonhas ( ). No controle positivo não foram adicionados os scFv’s ( ).
Foram acrescentados 900 mcL da solução de hemólise às amostras, realizando
medições a cada 3 minutos, em 700 nm, a 37 °C.
73
5.2. I
NIBIÇÃO DE LETALIDADE
–
N
EUTRALIZAÇÃO
“
IN VIVO
”
5.2.1. D
ETERMINAÇÃO DA
DL
50
A toxicidade das peçonhas animais é dependente da idade, localização
geográfica, condições climáticas, dieta, sexo, e até mesmo do procedimento de
extração da peçonha (Chippaux, Williams et al. 1991). Tomando por base essa
informação, foi necessária a determinação da DL
50
de cada peçonha envolvida no
trabalho. A figura 17 compara as curvas ajustadas com a dose letal média marcada
por um asterisco, e as freqüências observadas da amostra indicadas por cruzes. Foi
verificado um bom ajuste do modelo, considerando que os valores preditos estão
próximos dos observados.
74
Figura 17. Modelo logístico ajustado à proporção de camundongos mortos.
Os resultados das estimativas das doses letais médias para cada peçonha
são apontados na Tabela 3.
Tabela 03. Doses letais médias, referentes a cada peçonha botrópica testada, em
função do peso das fêmeas de camundongos Swiss, em g/kg.
75
5.2.2. E
NSAIO
“
IN VIVO
”
DE MIOTOXICIDADE
Valores séricos elevados da enzima creatina cinase (CK) estão presentes em
casos de lesão muscular esquelética, sendo um potencial marcador para avaliação
da atividade mionecrosante das peçonhas botrópicas. Assim, fêmeas de
camundongos Swiss receberam 50% da DL
50
de cada peçonha botrópica, no
músculo gastrocnemio direito. Essa aplicação foi determinante para o nítido
aumento da atividade da enzima muscular nas amostras colhidas, quando
comparada ao grupo em que foi administrada apenas solução salina 0,9%. A figura
18 apresenta os resultados obtidos.
Figura 18. Ensaio, “in vivo”, de miotoxicidade gerada pelas peçonhas das serpentes
do gênero Bothrops sp.. A atividade sérica da enzima creatina cinase (CK) foi
mensurada após a administração, I.M., de 50% da DL
50
de cada peçonha botrópica,
ou apenas solução salina estéril 0,9%, em fêmeas de camundongos Swiss.
76
5.2.3. E
NSAIO
“
IN VIVO
”
DE INIBIÇÃO DE MIOTOXICIDADE
Depois de confirmada a elevação da atividade da enzima CK, decorrente da
atividade miotóxica das peçonhas botrópicas, a habilidade do clone P2B7 em inibir
esse efeito foi testado. Para isso, as peçonhas foram previamente incubadas junto
aos fragmentos recombinantes, clone P2B7, sendo posteriormente injetadas I.M.,
em fêmeas de camundongos Swiss, como descrito.
A figura 19 evidencia a inibição da atividade miotóxica das peçonhas
botrópicas, resultante da ação dos fragmentos de anticorpos, clone P2B7.
77
Figura 19. Ensaio, “in vivo”, de inibição da atividade miotóxica das peçonhas
botrópicas pelos fragmentos purificados. Os scFv’s, clone P2B7, foram incubados
junto a 50% das DL
50
de cada peçonha, na proporção 3:1. As amostras foram
aplicadas, I.M., em grupos de quatro fêmeas de camundongos Swiss. Camundongos
controle receberam apenas solução salina ou a mesma concentração dos
fragmentos recombinantes. Após 3 horas da injeção das amostras, a atividade
enzimática foi determinada utilizando kit específico.
78
5.2.4. T
ESTE DE INIBIÇÃO DA LETALIDADE
Neste experimento foi avaliada a capacidade de os fragmentos
recombinantes, clone P2B7, em evitar as mortes decorrentes da ação tóxica das
peçonhas botrópicas. Os animais receberam 2xDL
50
de cada peçonha, ou essa
mesma dose previamente incubada junto ao scFv P2B7, na proporção 3:1. Animais
controle, receberam o mesmo volume de solução salina 0,9% ou a mesma
concentração de scFv. Os resultados apresentados na figura 20 evidenciam a
habilidade do clone P2B7 em retardar a letalidade dos animais. Sua atividade foi
responsável, inclusive, por evitar essa conseqüência, quando testado frente às
peçonhas de B. jararacussu (A) e B. pauloensis (D).
79
Figura 20. Ensaio de inibição da letalidade decorrente da toxicidade das peçonhas
das serpentes B. jararacussu (A), B. jararaca (B), B. moojeni (C) e B. pauloensis (D).
Os animais receberam 2xDL
50
de cada peçonha ( ), ou a mesma dose
previamente incubada junto aos scFv’s, clone P2B7 ( ). Camundongos controle
receberam apenas solução salina estéril 0,9% ( ) ou a mesma concentração de
scFv ( ). Mortes durante 24 horas foram registradas.
80
DISCUSSÃO
As terapias clássicas para os envenenamentos por animais peçonhentos têm
funcionado ao longo dos anos. Todavia, as ferramentas científicas recentes
possibilitam o estudo e desenvolvimento de alternativas ainda mais eficientes. A
produção de antivenenos constituídos por anticorpos humanos é uma das
possibilidades promissoras que a engenharia genética permite atualmente.
Utilizando a tecnologia de “Phage Display”, Tamarozzi e colaboradores
selecionaram fragmentos de anticorpos humanos recombinantes com capacidade
de inibir as ações fosfolipásica e miotóxica da peçonha de Bothrops jararacussu
(Tamarozzi, Soares et al. 2006). As enzimas tóxicas presentes nas peçonhas de
Bothrops sp. possuem importante homologia estrutural, funcional e antigênica
(Gutierrez and Lomonte 1995). Por essa razão, trabalhos anteriores descreveram o
reconhecimento, e inibição, das fosfolipases de diferentes espécies botrópicas
utilizando anticorpos produzidos por animais imunizados frente a peçonha de uma
única espécie (da Silva, Lima et al. 1990; Camey, Velarde et al. 2002). O presente
trabalho propõe a utilização dos fragmentos de anticorpos humanos, selecionados
por Tamarozzi e colaboradores, na neutralização da ação de toxinas presentes nas
peçonhas de Bothrops jararaca, B. moojeni e B. pauloensis.
Os scFv’s citados foram obtidos a partir de fagos‐anticorpos selecionados
pelo método “bio‐panning”. Seguindo essa técnica, a peçonha bruta de Bothrops
jararacussu foi imobilizada em um imunotubo de poliestireno, acompanhado da
incubação junto à biblioteca, e eliminação dos fagos não ligantes. Após quatro
turnos de seleção, foram escolhidos os fagos‐anticorpos monoclonais que
81
demonstraram os melhores resultados na inibição, “in vitro”, da atividade
fosfolipásica da peçonha de Bothrops jararacussu.
No atual estudo, primeiramente foi testado o reconhecimento das demais
peçonhas do gênero Bothrops sp. por fagos‐anticorpos selecionados por Tamarozzi
e colaboradores, em um ensaio de ELISA. O resultado confirmou a expectativa de
reconhecimento comum entre as proteínas presentes nas peçonhas avaliadas. O
passo seguinte foi padronizar uma forma de obtenção dos scFv’s para seu uso nos
ensaios seguintes.
Após a infecção de bactérias E. coli, da linhagem não supressora HB2151
pelos fagos-anticorpos, os scFv’s são produzidos e transportados até o periplasma,
sendo posteriormente secretados para o meio extracelular. Dessa forma, os
sobrenadantes das culturas contendo os fragmentos de anticorpos solúveis
permitem testes preliminares de funcionalidade.
A atividade fosfolipásica da peçonha botrópica pode ser avaliada
indiretamente, em um ensaio cinético, turbidimétrico, em que ocorre hemólise,
utilizando fosfatidilcolina da gema de ovo como substrato, na presença de cloreto
de cálcio. A fosfatidilcolina é quebrada em lisofosfatidilcolina, que se acumula na
membrana das hemácias, desestabilizando‐as, causando hemólise. Esse método foi
padronizado em nosso laboratório.
A reação de hemólise, decorrente da atividade fosfolipásica, poderia sofrer
interferência de proteínas que compõem o sobrenadante de uma cultura de E. coli.,
fenômeno semelhante ao descrito por Mota e colaboradores. O trabalho envolveu a
avaliação da atividade pró‐coagulante de uma serinoprotease purificada da
peçonha de B. jararacussu e sua inibição por uma fração enriquecida de scFv’s,
82
obtida por cromatografia. Os pesquisadores observaram que frações do
sobrenadante das culturas de E. coli HB2151, na ausência dos fragmentos de
anticorpos, inibiram a atividade da serinoprotease citada (Mota 2006). No
presente estudo, foram realizados controles incubando as peçonhas botrópicas
junto ao sobrenadante de uma cultura de HB2151 não infectada, que não
apresentava scFv’s. A reação de hemólise não demonstrou ter sido influenciada
nesse caso. Esse dado comprovou a capacidade que os scFv’s, contidos nos
sobrenadantes de cultura, possuíam de inibir parte da atividade fosfolipásica das
peçonhas avaliadas (figura 12).
Nos trabalhos de Soares e Tamarozzi (Soares 2005; Tamarozzi, Soares et al.
2006) foram descritas dificuldades no processo de purificação dos scFv’s através
de seus marcadores moleculares c‐myc e cauda de hexa‐histidina. O c‐myc é um
segmento da proteína oncogênica humana de 10 aminoácidos e 1200 Daltons,
detectado pelo anticorpo monoclonal 9E10. A cauda de hexa‐histidina possui
afinidade a matrizes de íons metálicos imobilizados ‐ IMAC (Terpe 2003). Esses
peptídeos são apresentados externamente aos domínios globulares do fragmento
solúvel. Essa característica favorece sua localização, porém os expõem à ação de
proteases, comuns em um sobrenadante de cultura saturado. Com base nas
experiências citadas, métodos alternativos foram testados. Contudo, não foram
obtidos scFv’s devidamente purificados para a seqüência do trabalho.
Buscando trabalhos em que a expressão e purificação de scFv’s foram bem
sucedidas (Lim, Li et al. 2004; Zhu, Liao et al. 2006), a extração do material contido
no espaço periplasmático bacteriano surgiu como uma opção promissora. Nesse
compartimento celular, as proteínas expressas ainda não sofreram ação direta de
83
proteases. A partir desse material foi possível purificar os scFv’s através da
afinidade à sua cauda de hexa‐histidina. Foi utilizada então, uma coluna de
afinidade ao níquel (Ni‐NTa), que interage com esse peptídeo presente nos scFv’s.
Por esse método, foram obtidos fragmentos recombinantes em um grau de pureza
satisfatório. Além disso, ensaios preliminares mostraram que sua função
permanecia inalterada.
As peçonhas botrópicas são compostas de uma coleção de miotoxinas com
estruturas típicas de PLA2 (Gutierrez and Lomonte 1995). Essa característica
impediu o cálculo de uma relação molar entre os scFv’s, selecionados frente à
peçonha bruta de Bothrops jararacussu, e as enzimas tóxicas presentes nas demais
peçonhas. Essa determinação é possível quando a seleção dos scFv’s é feita frente a
toxinas purificadas. Além disso, no trabalho de Tamarozzi e colaboradores
(Tamarozzi, Soares et al. 2006), não foram obtidos fragmentos recombinantes em
um grau de pureza que permitisse sua dosagem com precisão, fato que
impossibilitou definir uma relação entre as concentrações dos scFv’s e peçonha. No
trabalho atual, a purificação dos scFv’s possibilitou a realização de ensaios mais
precisos, permitindo definir relações entre as massas totais dos scFv’s e peçonhas
brutas.
O primeiro ensaio utilizando o fragmento purificado foi a inibição da
atividade hemolítica indireta, após sessenta minutos de reação. Nesse
experimento, foi observado que a hemólise era menor à medida que se aumentava
a proporção dos scFv’s em relação à peçonha. Contudo, a razão 4:1 não constituiu
maior inibição da hemólise em relação a anterior, 3:1, indicando provável
saturação das ligações entre os scFv’s e seus epítopos.
84
Os resultados obtidos, até então, revelaram que o clone P2B7 possui a
capacidade de inibição da atividade fosfolipásica pouco superior aos demais. Por
essa razão, foi escolhido para os ensaios seguintes.
A inibição, “in vitro”, da ação das PLA2s das peçonhas botrópicas, pelos
scFv’s, clone P2B7, foi avaliada cineticamente. Nesse teste a hemólise deveria
ocorrer em até 30 minutos, evitando a precipitação das hemácias em pilhas,
conhecidas como “rouleaux”. Esse fenômeno, em um ensaio turbidimétrico,
interfere diretamente na medição espectrofotométrica. Definidas as doses de cada
peçonha para o referido tempo de reação, essas foram incubadas junto ao clone
P2B7. Os resultados apresentados na figura 16 confirmam a capacidade desse
clone em inibir, “in vitro”, parte da atividade hemolítica das peçonhas botrópicas
testadas.
Para a realização dos ensaios “in vivo”, foi necessário determinar a DL
50
para cada peçonha botrópica, se adequando ao modelo animal empregado. Os
valores dessas doses descritos na literatura são variáveis. Esse fato é justificado
pelos diferentes modelos animais utilizados, além da variação da toxicidade da
peçonha, influenciada por fatores como a idade do animal, dieta, sexo, e até mesmo
do procedimento de extração da peçonha (Chippaux, Williams et al. 1991). O
método para realização dos experimentos seguiu o protocolo de Karber (Karber
1937), e os cálculos foram realizados com o auxílio do Centro de Métodos
Quantitativos (CEMEQ), da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
Os fragmentos de anticorpos humanos recombinantes, scFv’s, antes de
serem usados nos ensaios “in vivo”, foram purificados da contaminação por LPS,
85
utilizando uma coluna de polimixina B que é capaz de se ligar a essas moléculas,
possibilitando o recolhimento do efluente livre do contaminante.
O primeiro ensaio “in vivo” realizado foi a inibição da miotoxicidade através da
avaliação da atividade enzimática de creatina cinase (CK), liberada em casos de
lesão de tecido muscular esquelético. Os resultados evidenciam o fato de que, a
incubação prévia das toxinas botrópicas junto ao scFv, clone P2B7, foi responsável
por reduzir visivelmente a atividade da enzima CK, o que indica mínima lesão de
tecido muscular (figura 19). O domínio catalítico das PLA2s não é o responsável
pelos efeitos farmacológicos apresentados por essas enzimas (Arni and Ward
1996). Dado confirmado pelos resultados obtidos por Cardoso e colaboradores. No
trabalho, os pesquisadores selecionaram scFv’s capazes de inibir efeitos
neurotóxicos, “in vivo”, da principal fosfolipase da peçonha de Crotalus durissus
terrificus, a crotoxina. No entanto, esses mesmos fragmentos de anticorpos não
demonstraram efeito sobre a atividade fosfolipásica, “in vitro”, dessa toxina
(Cardoso, Nato et al. 2000). Calderon e colaboradores imunizaram camundongos
com o peptídeo sintético correspondente a região 115‐129 da estrutura primária
de uma fosfolipase miotóxica presente na peçonha de Bothrops asper. A resposta
dos animais a essa imunização garantiu proteção frente à miotoxicidade dessa
enzima em um desafio posterior. Foi identificada, então, a região que determina a
atividade miotóxica dessas enzimas (Calderon and Lomonte 1999). Em
concordância com esse resultado, estudos realizando mutações pontuais na
estrutura primária da toxina BthTX‐1 mostraram que os resíduos de Arginina e
Lisina, presentes nas posições 117 e 122, são essenciais para sua atividade
miotóxica (Chioato, De Oliveira et al. 2002). No presente estudo, os scFv’s, clone
86
P2B7, foram capazes de inibir, “in vitro”, parte da atividade catalítica primária, no
ensaio de hemólise indireta. Além disso, sua atividade praticamente suprimiu, “in
vivo”, a ação miotóxica produto da atividade das PLA2s botrópicas. Sugere‐se que a
região em que os scFv’s, clone P2B7, se ligam na molécula da enzima interfere na a
sua atividade catalítica primária, mas, essencialmente determina sua
miotoxicidade.
Em seqüência, foi realizado um ensaio de inibição da letalidade decorrente
da atividade das toxinas botrópicas. A administração das peçonhas brutas causou a
morte dos animais em, no máximo, 25 minutos após a aplicação. Os animais que
receberam as peçonhas previamente incubadas junto aos scFv’s, clone P2B7,
tiveram seu tempo de sobrevida estendido. Entretanto, a proteção conferida pelos
fragmentos de anticorpos evitou a morte de somente um deles, nos ensaios
envolvendo as peçonhas das serpentes B. jararacussu e B. pauloensis (figura 20). A
participação de uma PLA2 da peçonha de Bothrops alternatus no efeito letal dessa
espécie foi proposta por Nisenbom e colaboradores. No estudo citado, o quadro
clínico e lesões histológicas dos animais que receberam a peçonha bruta da
serpente foram semelhantes, porém, pouco mais acentuados, do que os
apresentados pelos animais que receberam a enzima purificada. Além disso, nesse
mesmo ensaio, a sobrevida foi menor no grupo de animais em que foi administrada
a peçonha bruta. Os pesquisadores propõem que a letalidade nesse tipo de
envenenamento é fundamentalmente provocada pela atividade das PLA2s.
Entretanto, as demais toxinas atuam sinergicamente, potencializando os efeitos
que determinam a morte do animal (Nisenbom, Perazzo et al. 1986). Os scFv’s,
clone P2B7, não inibiram a atividade catalítica primária das fosfolipases “in vitro”,
87
na mesma proporção com que suprimiram a miotoxicidade “in vivo”. A morte dos
animais, no corrente ensaio, poderia ser resultado da atividade catalítica, apenas
parcialmente inibida, associada à ação das demais substâncias tóxicas presentes
nas peçonhas. Sendo assim, fragmentos de anticorpos com a capacidade de
suprimir a atividade miotóxica, associada ao bloqueio da função catalítica das
fosfolipases botrópicas, em teoria, compõem um antiveneno eficiente para os
envenenamentos botrópicos.
O tratamento dos acidentes causados por serpentes do gênero Bothrops sp.
pode ser feito utilizando um soro misto, denominado SABC, ou soro antibotrópico‐
crotálico. Ele é formado pela associação de anticorpos produzidos por animais
imunizados com peçonhas das serpentes do gênero Bothrops sp. e Crotalus sp. Seu
emprego é justificado pela homologia também presente entre as PLA2s das
peçonhas desses dois gêneros. Alguns trabalhos confirmam a possibilidade de
inibição da atividade fosfolipásica da peçonha de B. jararacussu por antivenenos
crotálicos (dos‐Santos, Goncalves et al. 1992; Beghini, da Cruz‐Hofling et al. 2005).
Com isso, existe a possibilidade de os scFv’s selecionados frente à peçonha bruta
da serpente Crotalus durissus terrificus, por Oliveira (Oliveira, Soares et al. 2009),
hábeis em inibir parte da sua atividade fosfolipásica, também exercerem função
sobre as toxinas botrópicas. Assim, talvez, a ação sinérgica dos fragmentos de
anticorpos selecionados frente às duas espécies, poderia gerar ainda mais proteção
contra as peçonhas das serpentes do gênero Bothrops sp.
Em nosso laboratório, Pucca produziu fragmentos de anticorpos humanos
recombinantes, capazes de neutralizar as ações deletérias da peçonha de Tityus
serrulatus (escorpião amarelo) (Pucca 2009). A seleção dos fagos‐anticorpos nesse
88
trabalho foi feita inicialmente diante da peçonha bruta do animal. Posteriormente,
a partir dos fagos‐anticorpos pré‐selecionados, foi realizada uma nova seleção
frente à toxina majoritária purificada. Assim, foi possível encontrar um clone,
produtor de scFv’s, que inibiu a atividade da toxina citada utilizando razões
molares de 1:1.
No atual trabalho, os resultados poderiam ser ainda melhores caso fossem
selecionados scFv’s frente a enzimas tóxicas purificadas, buscando regiões
relacionadas a suas funções, conservadas nas demais estruturas.
Sabe‐se que nem todos os anticorpos presentes no soro eqüino são
específicos para as enzimas com atividade tóxica presentes na peçonha utilizada na
imunização animal. E ainda, mesmo entre os anticorpos específicos para essas
toxinas, existem aqueles que não possuem atividade neutralizante. Além disso, o
desenvolvimento de doenças relacionadas à hipersensibilidade é preocupação
comum após a administração de proteínas heterólogas. Por essas razões, a união
de vários clones produtores de scFv’s específicos, e neutralizantes, a cada uma das
peçonhas do gênero Bothros sp., apresenta‐se como uma estratégia que mantém
suas vantagens, em relação aos soros convencionais, na produção de um
antiveneno.
89
CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, pode‐se concluir que:
− Os fagos-anticorpos específicos para a peçonha bruta de Bothrops
jararacussu selecionados por Tamarozzi (Tamarozzi, Soares et al. 2006)
reconhecem as peçonhas das espécies B. jararaca, B. pauloensis e B. moojeni;
− A produção e purificação dos fragmentos de anticorpos solúveis foram
realizadas com sucesso;
− Os fragmentos de anticorpos scFv’s referentes aos 4 clones, purificados e
testados, são capazes de inibir, “in vitro”, parte da atividade fosfolipásica
das peçonhas botrópicas avaliadas;
− A atividade dos fragmentos de anticorpos purificados, referentes ao clone
P2B7, reduziu significativamente a miotoxicidade, “in vivo”, causada pelas
peçonhas testadas. A ação desses scFv’s foi responsável por retardar, ou até
mesmo evitar a letalidade decorrente da atividade tóxica das peçonhas das
serpentes do gênero Bothrops sp..
90
PERSPECTIVAS
− Testar o efeito dos scFv’s selecionados frente à peçonha bruta de Crotalus
durissus terrificus sobre atividades tóxicas das peçonhas botrópicas, para
utilizá‐los em sinergia aos já definidos;
− Selecionar clones produtores de scFv’s específicos a toxinas botrópicas
purificadas, capazes de neutralizar eficientemente suas funções;
− Testar os scFv’s selecionados frente às toxinas purificadas, comparando seu
desempenho em relação aos fragmentos empregados no trabalho atual;
− Definir a seqüência primária dos scFv’s que melhor desempenharem papel
neutralizante;
− Caracterizar a interação entre o scFv e o domínio funcional de cada toxina,
buscando meios de aprimorar a afinidade dessa ligação, com o objetivo de
se obter anticorpos ainda mais eficientes.
91
R
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99
A
PÊNDICE
Solução salina tamponada com fosfato
(PBS)-10X concentrada pH 7,2
Reagentes Quantidade
NaCl 5,84g
Na
2
HPO
4
4,72g
Na
2
HPO
4.
H
2
O 2,64g
Água ultra pura q.s.p 1L
Meio LB caldo
Reagentes Quantidade
LB 20g
Água ultra pura q.s.p 1L
Meio LB Ágar
Reagentes Quantidade
NaCl 5,84g
Na
2
HPO
4
4,72g
Na
2
HPO
4.
H
2
O 2,64g
Água ultra pura q.s.p 1L
Meio LB com ampicilina e Glicose
Reagentes Quantidade
Meio LB caldo 50 mL
ampicilina (100mg/mL)
50 mcL
Glicose 20% 2,5 mL
Meio LB com ampicilina e Canamicina
Reagentes Quantidade
Meio LB caldo 50 mL
ampicilina (100mg/mL)
50 mcL
Kanamicina (50mg/mL) 25 mcL
Solução PEG20% - NaCl 2,5M
Reagentes Quantidade
PEG 6000 200 g
NaCl
146g
Água ultra pura q.s.p 1L
Tampão Carbonato-Bicarbonato
0,05M, pH9,6
Reagentes Quantidade
Na
2
CO
3
0,0635 g
NaHCO
3
0,1176 g
Água ultra pura q.s.p. 40mL
Solução Crioprotetora – Frozen-Stock
Reagentes Quantidade
Glicerol 65%
65mL
MgSO
4
0,1M 2,4647 g
Tris 0,025M 2,5mL
Água ultra pura q.s.p. 100mL
Gel de Poliacrilamida com dodecil
sulfato de sódio
(SDS-PAGE)- GEL de separação (12%)
Reagentes Quantidade
Tris/HCl 2M, pH8,8
1,13mL
Acrilamida:Bis (30:0,8%)
2,4mL
Água ultra pura 2,3mL
TEMED 7mcL
Persulfato de amônio
10%
38mcL
Gel de Poliacrilamida com dodecil
sulfato de sódio
(SDS-PAGE)
GEL de Empilhamento (12%)
Reagentes Quantidade
Tris/HCl 2M, pH6,8
125mcL
Acrilamida:Bis (30:0,8%)
332mcL
Água ultra pura 1,47mL
TEMED 3mcL
Persulfato de amônio
10%
25mcL
Solução para corrida do Gel
Tampão do Eletrodo
(tampão de corrida)
Reagentes Quantidade
Tris
3g
Glicina
14,4g
SDS 10% 10mL
Água ultra pura
q.s.p 1000mL
Solução para Coloração por Prata
Solução Fixadora
Reagentes Quantidade
Metanol
50%
Ácido acético
12%
Formaldeído 37%
50mcL
Solução para Coloração por Prata
Solução Etanol
Reagentes
Quantidade
Etanol
50%
Solução para Coloração por Prata
Solução Tiosulfato
Reagentes Quantidade
Na
2
S
2
O
3
0,8mM
20mg
Água ultra pura q.s.p. 100mL
Solução para Coloração por Prata
Solução Nitrato de Prata
Reagentes Quantidade
AgNO
3
400mg 0,4g
Formaldeído 37%
75mcL
Água ultra pura q.s.p. 100mL
Solução para Coloração por Prata
Solução de Carbonato de Sódio
Reagentes Quantidade
Na
2
CO
3
6% 6 g
Formaldeído 37%
50mcL
Na
2
S
2
O
3
0,8mM 2 mL
Água ultra pura q.s.p. 100mL
Solução Coloração por Prata
Solução Reveladora
Reagentes Quantidade
Metanol 50%
Ácido acético
12%
Solução Coloração por Prata
Solução Lavagem
Reagentes
Quantidade
Metanol 50%
Solução para Extração de Periplasma
Solução de Tris/Sacarose pH 8,0
Reagentes Quantidade
Tris‐Cl 30mM 2,36 g
Sacarose 20%
100g
Água ultra pura
q.s.p. 500mL
Solução para Extração de Periplasma
Solução de EDTA
Reagentes Quantidade
EDTA 500mM 7,3 g
Água ultra pura
q.s.p. 50mL
Solução para Extração de Periplasma
Solução de Sulfato de Magnésio
Reagentes Quantidade
MgSO
4
5mM 0,615 g
Água ultra pura
q.s.p. 500mL
Solução para Purificação scFv
Tampão de Lise pH 8,0
Reagentes Quantidade
Na
2
PO
4.
H
2
O 50mM
13,8 g
NaCl 300mM 35,08g
imidazol 10mM
1,36g
Água ultra pura q.s.p. 2000mL
Solução para Purificação scFv
Tampão de Lavagem pH 8,0
Reagentes Quantidade
Na
2
PO
4.
H
2
O 50mM
0,345 g
NaCl 300mM 0,87 g
imidazol 20mM
0,068 g
Água ultra pura q.s.p. 50mL
Solução para Purificação scFv
Tampão de Eluição pH 8,0
Reagentes Quantidade
Na
2
PO
4.
H
2
O 50mM 0,345 g
NaCl 300mM 0,87 g
imidazol 250mM
0,85 g
Água ultra pura q.s.p. 50mL
ANEXO
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Milhares de Livros para Download:
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Baixar livros de Teologia
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Baixar livros de Turismo
