( PDF ) Desenvolvimento de método para determinação de resíduos de pesticidas em frutas exóticas por dispersão da matriz em fase sólida cromatografia líquida de alta eficiência com detector espectrofotométric

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA

NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE

RESÍDUOS DE PESTICIDAS EM FRUTAS EXÓTICAS POR DISPERSÃO DA

MATRIZ EM FASE SÓLIDA E CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA

EFICIÊNCIA COM DETECTOR ESPECTROFOTOMÉTRICO DE ABSORÇÃO

NO UV-VIS COM ARRANJO DE DIODOS

Márcia Beatriz Reis Fróes

SÃO CRISTOVÃO/SE

2010

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Milhares de livros grátis para download.

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE

RESÍDUOS DE PESTICIDAS EM FRUTAS EXÓTICAS POR DISPERSÃO DA

MATRIZ EM FASE SÓLIDA E CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA

EFICIÊNCIA COM DETECTOR ESPECTROFOTOMÉTRICO DE ABSORÇÃO

NO UV-VIS COM ARRANJO DE DIODOS

Márcia Beatriz Reis Fróes

ORIENTADOR: Prof. Dr. Sandro Navickiene

SÃO CRISTOVÃO/SE

2010

Dissertação apresentada ao

Núcleo de Pós-Graduação em Química

da Universidade Federal de Sergipe

como um dos pré-requisitos para

obtenção do título de Mestre em

Química.

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

F926d

Fróes, Márcia Beatriz Reis

Desenvolvimento de método para determinação de resíduos de

pesticidas em frutas exóticas por dispersão da matriz em fase

sólida cromatografia líquida de alta eficiência com detector

espectrofotométrico de absorção no UV-VIS com arranjo de diodos

/ Márcia Beatriz Reis Fróes. – São Cristóvão, 2010.

vii, 77 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Química) – Programa de Pós-

Graduação em Química, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e

Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe, 2010.

Orientador: Prof. Dr. Sandro Navickiene

1. Pesticidas. 2. Açaí. 3. Cupuaçu. 4. Análise química. I.

Título.

CDU 543.393/.42

Quem tem consciência para ter coragem

quem tem a força de saber que existe

e no centro da própria engrenagem

inventa a contramola que resiste,

quem não vacila mesmo derrotado

quem já perdido nunca desespera

e envolto em tempestade, decepado

entre os dentes segura a primavera.

João Ricardo-João Apolinário

Às razões da minha vida:

meus filhos Ana Beatriz e Tarcisio José,

meus pais Maria Terezinha e José Reis,

meu esposo Wesley,

DEDICO.

AGRADECIMENTOS

Como descreve o dicionário: 1. Ato ou efeito de agradecer. 2. Gratidão,

reconhecimento. Aí, vai a tentativa de fazer uma análise de traços:

Meu muito obrigada...

... à Deus, Pai celestial, pela constante interseção nessa caminhada.

... ao Professor Dr. Sandro Navickiene pela dedicação, orientação e paciência,

um exemplo de responsabilidade e compromisso.

... ao Prof. Dr. Walkmário de Paula Lemos , pesquisador A da Embrapa

Amazônia Oriental, pelo auxílio no conhecimento da cultura de açaí e pelo envio

de material.

... ao M. Sc. Adauto Maurício Tavares,pesquisador da Embrapa Amazônia

Ocidental, pelas informações sobre pragas da cultura de cupuaçu.

... a Engª M. Sc. Maria das Graças Parada, pesquisadora da Ceplac na Bahia,

pelas informações e disposição.

... ao colega Pedro Henrique pelos primeiros passos no conhecimento da técnica

de MSPD.

... ao colega Adalberto Menezes por despertar a necessidade de se observar os

mínimos detalhes do equipamento em HPLC.

... ao amigo Fabrício pela ajuda e incentivo na busca por resultados.

... ao amigo Marcell pelas conversas sobre validação e sua planilha, Deus está

contigo sempre.

... aos colegas do METABIO, em especial a Danielle, Alan Diego e Emmanuel

pelas dicas na utilização de equipamentos.

... aos amigos do LEMOM Juliana, Valéria, Tássia, André e Bruno pela

disposição e momentos de relaxamento.

...aos professores do Departamento de Química Nivan Bezerra, Paulo César,

Valéria, Carlos Alexandre, Reinaldo Cestari, Luciane Pimenta, José do

Patrocínio, Alberto Wisniewski, Maria De Lara e Elisângela Passos.

... ao Prof. Haroldo Dórea pelo incentivo e amizade.

... aos professores Ilza Dalmázio e Marcelo Rosa pelo auxílio na qualificação.

... aos colegas do LCP Michel, Samia, Gisele, Daniela, Danielle, Alain, Sergio,

Alex, Ricardo, Débora, Rui.

... aos amigos Rogério, Claudia e Amanda pelo companheirismo, incentivo, sem

vocês esse mestrado não teria sido o mesmo.

... a amiga Vanessa pela ajuda nos gráficos e desenhos.

... ao amigo Elissandro pela constante prontidão.

... aos meus filhos Ana Beatriz e Tarcisio José, vocês são tudo pra mim, amo

demais.

... aos meus pais Maria Terezinha e José Reis pelo amor incondicional, amo

muito vocês.

... a minha irmã Magda Tereza, sei que onde estás olha sempre por mim. (in

memorian).

... ao meu esposo Wesley pelas noites de luz acessa, ausências compreendidas,

você é muito especial.

... a minha sogra Edileuza.

... a Cicera pelos cuidados com meus filhos e minha casa.

... à minha família, em especial minha prima Cristiane, juntas nessa caminhada.

... aos colegas de turma de mestrado, em especial Luciano, Isaias, Sandra,

Marcos.

... aos funcionários da COOPERTALSE pela contribuição em minhas idas e

vindas (Estância-Aracaju), em especial Juarez, Henrique, Hélio e Flau.

...aos meus (ex) alunos e colegas de trabalho do colégio Estadual Arabela

Ribeiro, da Escola Madre Tabernacúlo (hoje, Dom Coutinho) e João Nascimento

Filho pelo apoio.

... a Secretária Municipal de Educação de Estância e Secretária Estadual de

Educação de Sergipe pela licença para estudos concedida neste período.

... Universidade Federal de Sergipe pelo ensino gratuito e de qualidade.

... a CNPq pelo auxílio financeiro.

... a todos que de alguma forma ajudaram a realização deste projeto.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................. i

LISTA DE TABELAS ............................................................................................ iv

LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS ............................................................. v

ABSTRACT ......................................................................................................... viii

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 1

2. OBJETIVOS ...................................................................................................... 4

2.1 – Objetivo Geral .............................................................................................. 4

2.2 – Objetivos Específicos ................................................................................... 4

3. JUSTIFICATIVA ................................................................................................ 5

4. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................ 6

4.1 - Pesticidas ..................................................................................................... 6

4.2 – Frutas exóticas ........................................................................................... 12

4.2.1 – Açaí ......................................................................................................... 12

4.2.1.1 – Pragas do açaizeiro ............................................................................. 13

4.2.2 – Cupuaçu.................................................................................................. 14

4.2.2.1 – Pragas do cupuaçuzeiro ...................................................................... 15

4.3 – Dispersão da matriz em fase sólida ........................................................... 16

4.4 – Cromatografia líquida de alta eficiência ..................................................... 21

4.5 - Validação do método analítico .................................................................... 23

4.5.1 - Linearidade .............................................................................................. 23

4.5.2 - Seletividade ............................................................................................. 24

4.5.3 - Precisão ................................................................................................... 25

4.5.4 - Exatidão ................................................................................................... 25

4.5.5 - Limite de detecção (LD) ........................................................................... 26

4.5.6 - Limite de quantificação (LQ) .................................................................... 26

5. EXPERIMENTAL ............................................................................................ 28

5.1 – Materiais .................................................................................................... 28

5.2 – Reagentes e adsorventes .......................................................................... 28

5.3 – Padrões e soluções de pesticidas .............................................................. 28

5.4 – Equipamentos ............................................................................................ 29

5.5 – Preparação da amostra de fruta ................................................................ 32

5.5.1 – Preparação da amostra de açaí .............................................................. 32

5.5.1.1 - Fruto ..................................................................................................... 32

5.5.1.2 - Polpa de açaí ........................................................................................ 33

5.5.1.3 - Polpa de açaí liofilizada ........................................................................ 33

5.5.2 – Preparação da amostra de cupuaçu ....................................................... 33

5.5.2.1 - Fruto ..................................................................................................... 34

5.6 – Condições cromatográficas de análise ...................................................... 35

5.7 – Métodos de extração ................................................................................. 35

5.7.1 – Método de extração de pesticidas de açaí e cupuaçu por MSPD ........... 35

5.8 - Limpeza da vidraria .................................................................................... 37

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 38

6.1 - Seleção dos pesticidas para o estudo ........................................................ 38

6.2 – Otimização das condições cromatográficas ............................................... 38

6.3 – Ensaios para otimização da extração por MSPD ....................................... 42

6.3.1 – Ensaios para otimização da extração de pesticidas da matriz açaí por

MSPD ................................................................................................................. 43

6.3.2 – Ensaios para otimização da extração de pesticidas da matriz cupuaçu

por MSPD ........................................................................................................... 51

6.4 - Validação do método analítico .................................................................... 53

6.4.1 - Linearidade .............................................................................................. 53

6.4.2 - Seletividade ............................................................................................. 66

6.4.4 - Exatidão ................................................................................................... 68

6.3.5 - Limite de Detecção .................................................................................. 69

6.4.6 - Limite de quantificação ............................................................................ 70

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 71

8. REFERÊNCIAS .............................................................................................. 72

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura química dos pesticidas selecionados para estudo. ....................................... 11

Figura 2: Açaizeiro (NOGUEIRA et al., 2006) ............................................................................ 12

Figura 3: Cupuaçuzeiro (EMBRAPA, 2009) ............................................................................... 15

Figura 4: Esquema da dispersão da matriz em fase sólida, adaptado de BARKER, 2007

(BEZERRA, 2009). .................................................................................................................... 17

Figura 5: Esquema básico do equipamento HPLC, adaptado de CASS et al., 2001. .................. 21

Figura 6: Balança analítica (Sartorius TE214S).......................................................................... 29

Figura 7: Liofilizador L101 da marca LIOTOP. ........................................................................... 30

Figura 8: Sistema para SPE Vacuum Manifold (Varian, Walnut Creck, CA, EUA). ...................... 30

Figura 9: Evaporador rotatório (Fisatom 802D). ......................................................................... 30

Figura 10: Lavadora ultra-sonica (Unique). ................................................................................ 31

Figura 11: Cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector espectrofotométrico com

arranjo de fotodiodos Shimadzu (Quioto, Japão) modelo Prominence........................................ 31

Figura 12: Sistema de ultrapurificação de água Milli-Q. ............................................................. 31

Figura 13: Preparação da amostra do fruto açaí. ....................................................................... 32

Figura 14: Procedimento manual para separação da polpa e casca das sementes de açaí. ....... 33

Figura 15: Amostra de cupuaçu da região da Bahia. .................................................................. 34

Figura 16: Etapas da preparação da amostra de cupuaçu. ........................................................ 34

Figura 17: Fluxograma do método de extração de pesticidas de açaí e cupuaçu por MSPD. ..... 36

Figura 18: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão dos pesticidas em

solvente acetonitrila (8 µg mL

-1

) nas condições otimizadas, sendo: 1) bromuconazol; 2)

fenbuconazol; 3) parationa-metílica; 4) cresoxim-metílico e 5) teflubenzuron. Para

condições cromatográficas de análise, ver item 5.6. .................................................................. 39

Figura 19: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão de bromuconazol

em solvente acetonitrila (8 µg mL

-1

) com seu espectro de UV. ................................................... 40

Figura 20: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão de fenbuconazol

em solvente acetonitrila (8µg mL

-1

) com seu espectro de UV. .................................................... 40

Figura 21: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão de parationa-

metílica em solvente acetonitrila (8 µg mL

-1

) com seu espectro de UV. ...................................... 41

Figura 22: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão de cresoxim-

metílico em solvente acetonitrila (8 µg mL

-1

) com seu espectro de UV. ...................................... 41

Figura 23: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão de teflubenzuron

em solvente acetonitrila (8 µg mL

-1

) com seu espectro de UV. ................................................... 42

Figura 24: Eficiência na recuperação (%) dos pesticidas de acaí utilizando alumina neutra

como suporte sólido, variando o uso de MgSO

na homogeneização amostra:suporte

sólido e adsorvente auxiliar na coluna e eluição com 20 mL de acetato de etila. ........................ 44

Figura 25: Eficiência na recuperação (%) dos pesticidas de acaí utilizando Florisil como

suporte sólido, variando o uso de MgSO

na homogeneização amostra:suporte sólido e

adsorvente auxiliar na coluna e eluição com 20 mL de acetato de etila. ..................................... 44

Figura 26: Eficiência na recuperação (%) dos pesticidas de açaí, utilizando alumina neutra

como suporte sólido, variando a utilização de adsorvente auxiliar e eluição com 20 mL de

acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v. ................................................................ 45

Figura 27: Eficiência na recuperação (%) dos pesticidas de açaí utilizando alumina neutra

como suporte sólido, variando a utilização de adsorvente auxiliar e eluição com 20 mL de

acetato de etila:ciclohexano na proporção 1:1, v/v. .................................................................... 46

Figura 28: Eficiência na recuperação (%) dos pesticidas de açaí, utilizando alumina neutra

como suporte sólido, variando o uso ou não de carvão ativado e o tipo de solvente de

eluição. ..................................................................................................................................... 47

Figura 29: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da amostra controle do fruto de açaí.

Para as condições otimizadas, ver itens 5.6 e 5.7.1. .................................................................. 48

Figura 30: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da amostra controle da polpa

comercial de açaí. Para condições otimizadas, ver itens 5.6 e 5.7.1. ......................................... 48

Figura 31: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da polpa comercial de açaí liofilizada.

Para condições otimizadas, ver itens 5.6 e 5.7.1. ...................................................................... 48

Figura 32: Eficiência na recuperação (%) dos pesticidas de açaí, utilizando a alumina

neutra como suporte sólido na proporção 1:3 (m/m), amostra:suporte sólido e eluição com

20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v. ................................................. 49

Figura 33: Eficiência na recuperação (%) dos pesticidas de açaí, utilizando a alumina

neutra como suporte sólido na proporção 1:3 (m/m), amostra:suporte sólido e eluição com

20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção 1:1, v/v. .................................................... 50

Figura 34: Eficiência na recuperação (%) dos pesticidas de cupuaçu, utilizando alumina

neutra como suporte sólido, variando o uso de MgSO

na homogeneização

amostra:suporte sólido e adsorvente auxiliar na coluna e eluição com 20 mL de acetato de

etila. .......................................................................................................................................... 51

Figura 35: Eficiência na recuperação (%) dos pesticidas de cupuaçu, utilizando sílica como

suporte sólido, variando o uso de MgSO

na homogeneização amostra:suporte sólido e

adsorvente auxiliar na coluna e eluição com 20 mL de acetato de etila. ..................................... 52

Figura 36: Eficiência na recuperação (%) dos pesticidas de cupuaçu utilizando a alumina

neutra como suporte sólido na proporção 1:3 (m/m), amostra:suporte sólido, com o uso ou

não de carvão ativado. .............................................................................................................. 53

iii

Figura 37: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analizados por HPLC-

UV/DAD: (a) bromuconazol e (b) fenbuconazol. ........................................................................ 55

Figura 38: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-

UV/DAD: (a) parationa-metílica e (b) cresoxim-metílico. ............................................................ 56

Figura 39: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-

UV/DAD: (a) teflubenzuron. ....................................................................................................... 57

Figura 40: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato

da matriz açaí e analisados por HPLC-UV/DAD: (a) bromuconazol. ........................................... 57

Figura 41: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato

da matriz açaí e analisados por HPLC-UV/DAD: (a) fenbuconazol e (b) parationa-metílica. ....... 58

Figura 42: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato

da matriz açaí e analisados por HPLC-UV-DAD: (d) cresoxim-metílico e (e) teflubenzuron. ....... 59

Figura 43: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-

UV/DAD: (a) bromuconazol e (b) fenbuconazol. ........................................................................ 61

Figura 44: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-

UV/DAD: (a) parationa-metílica e (b) cresoxim-metílico. ............................................................ 62

Figura 45: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-

UV/DAD: (a) teflubenzuron. ....................................................................................................... 63

Figura 46: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato

da matriz cupuaçu: (a) bromuconazol. ....................................................................................... 63

Figura 47: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato

da matriz cupuaçu: (a) fenbuconazol e (b) parationa-metílica. ................................................... 64

Figura 48: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato

da matriz cupuaçu: (a) cresoxim-metílico e (b) teflubenzuron. .................................................... 65

Figura 49: Cromatogramas por obtidos no HPLC-UV/DAD da amostra testemunha de açaí

(a), da solução padrão dos pesticidas 2 µg mL

-1

no extrato da matriz (b), do processo de

extração no nível de fortificação de 2 µg mL

-1

(c), sendo: 1) bromuconazol, 2)

fenbuconazol, 3) parationa-metílica, 4) cresoxim-metílico, 5) teflubenzuron e I)

interferentes da matriz. Para condições cromatográficas ver item 5.6. ....................................... 66

Figura 50: Cromatogramas obtidos por HPLC-UV/DAD da amostra testemunha de

cupuaçu(a), da solução padrão dos pesticidas 2 µg mL

-1

no extrato da matriz cupuaçu (b),

do processo de extração no nível de fortificação de 2 µg mL

-1

(c), sendo: 1)

bromuconazol, 2) fenbuconazol, 3) parationa-metílica, 4) cresoxim-metílico, 5)

teflubenzuron e I) interferentes da matriz de cupuaçu. Para condições cromatográficas ver

item 5.6. .................................................................................................................................... 67

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Características dos pesticidas selecionados para estudo. ............................................ 9

Tabela 2: Características físicas dos pesticidas selecionados para estudo. ............................... 10

Tabela 3: Solubilidade dos pesticidas estudados. ...................................................................... 10

Tabela 4: Principais pragas do açaizeiro e as indicações de métodos de controle. .................... 14

Tabela 5: Principais pragas do cupuaçuzeiro e as recomendações de controle. ........................ 15

Tabela 6: Utilização de MSPD para a extração de resíduos de pesticidas de

frutas/verduras (vegetais). ......................................................................................................... 19

Tabela 7: Comprimento de onda mínimo dos solventes mais utilizados nesse trabalho. ............ 23

Tabela 8: Programação do gradiente binário de eluição em HPLC-UV/DAD. ............................. 35

Tabela 9: Tempos de retenção dos pesticidas estudados nas condições cromatográficas

otimizadas. ................................................................................................................................ 39

Tabela 10: Valores dos coeficientes de correlação e equação da reta para os pesticidas

em solvente acetonitrila e analisados por HPLC-UV/DAD. ......................................................... 54

Tabela 11: Valores dos coeficientes de correlação e equação da reta para os pesticidas

preparados no extrato da matriz açaí e analisados por HPLC-UV/DAD. ..................................... 54

Tabela 12: Valores dos coeficientes de correlação e equação da reta para os pesticidas

em solvente acetonitrila e analisados por HPLC-UV/DAD. ......................................................... 60

Tabela 13: Valores dos coeficientes de correlação e equação da reta para os pesticidas

preparados no extrato da matriz cupuaçu e analisados por HPLC-UV/DAD. .............................. 60

Tabela 14: Valores de recuperação média e coeficiente de variação dos pesticidas em

matriz açaí por MSPD e HPLC-UV/DAD. ................................................................................... 69

Tabela 15: Limite de detecção dos pesticidas utilizando MSPD e HPLC-UV/DAD para a

matriz açaí. ............................................................................................................................... 69

Tabela 16: Limite de quantificação dos pesticidas utilizando MSPD e HPLC-UV/DAD para

a matriz açaí. ............................................................................................................................ 70

LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS

ACN - acetonitrila

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

- fase sólida à base de sílica modificada com grupos octil

- fase sólida à base de sílica modificada com grupos octildecil

CV - coeficiente de variação

DCM - diclorometano

- Dose Letal para 50% da População

EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

FAO – Organização das Nações Unidas de Agricultura e Alimentos

GC - Cromatografia à gás (Gas chromatography)

GC-MS – Cromatografia à gás acoplada à espectrometria de massa (Gas

chromatography coupled to mass apectrometry).

GC-ECD – Cromatografia à gás com detector por captura de elétrons (Gas

chromatography with electron capture detector).

HA - Hidrocarbonetos aromáticos

HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência (High performance liquid

chromatography)

HPLC-UV/DAD - Cromatografia líquida de alta eficiência com detector

espectrofotométrico de absorção no ultravioleta/visível com arranjo de fotodiodos

(High performance liquid chromatography with UV detection of absorption in the

ultraviolet/visible with a photodiode array).

IBAMA - Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais

INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade

LC-MS/MS – Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa

seqüencial (Liquid chromatography-tandem mass spectrometry).

LD - limite de detecção

LQ - limite de quantificação

MSPD – Dispersão da matriz em fase sólida (Matrix Solid-Phase Dispersion).

PCNB - pentacloronitrobenzeno

r - coeficiente de correlação

RSD - desvio padrão relativo

UV-Vis – Ultravioleta visível.

vii

RESUMO

As frutas constituem uma excelente fonte de alimentação, proporcionando

importantes benefícios à saúde. O consumo de frutas com novos sabores e

características nutricionais elevadas, chamadas de superfrutas, tem sido uma

tendência mundial, entre elas se encontram o açaí e o cupuaçu. A presença de

resíduos de pesticidas em alimentos constitui um risco a saúde da população,

sendo importante o estudo de métodos analíticos para a determinação de seus

resíduos. A literatura não registra método para a determinação de pesticidas em

açaí e cupuaçu. Neste contexto, este trabalho tem como objetivo o

desenvolvimento de um método baseado na MSPD e HPLC-UV/DAD para a

determinação dos pesticidas bromuconazol, fenbuconazol, parationa-metílica,

cresoxim-metílico e teflubenzuron em frutas exóticas, açaí e cupuaçu. O método

de extração por dispersão da matriz em fase sólida foi desenvolvido, testando-se

diferentes tipos e quantidades de suporte sólido (alumina neutra, Florisil, sílica e

) e os solventes orgânicos (15 a 30 mL) acetato de etila, diclorometano,

ciclohexano e acetonitrila. Os melhores resultados para os pesticidas

bromuconazol, fenbuconazol, parationa-metílica e cresoxim-metílico em análise

por HPLC-UV/DAD foram obtidas na utilização da proporção 1:3 (m/m)

amostra:suporte sólido do solvente alumina neutra, sem etapa de limpeza

(clean-up), e eluição com 20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção

1:1, v/v. Para a matriz açaí, valores de recuperação entre 57-119 % e valores de

coeficientes de variação na faixa de 1,4-20 % para os níveis de concentração 1,

2 e 6 µg mL

-1

, com limites de detecção e quantificação do método entre 0,1- 0,9

µg g

-1

e 0,4 -2,1 µg g

-1

, respectivamente. Para a matriz cupuaçu, valores de

recuperação entre 57 - 69 %,ao nível de concentração de 2 µg g

-1

Palavras chave: frutas; açaí; cupuaçu; pesticidas; MSPD; HPLC-UV/DAD.

viii

ABSTRACT

The fruits are an excellent source of nutrition, providing significant health

benefits. The consumption of fruits with new flavors and high nutritional

characteristics, called superfruits has been a worldwide trend, among them are

assai and cupuassu. The presence of pesticide residues in food is a risk to the

population's health. For this reagor, it is important to develop analytical methods

for pesticide residues determination. The literature does not describe method for

determination of pesticides in assai and cupuassu. In this context, this work aims

to develop a new method based on MSPD and HPLC-UV/DAD determination of

bromuconazole, fenbuconazole, parathion methyl, kresoxm-methyl and

teflubenzuron in exotic fruits, assai and cupuassu. The extraction method based

on matrix solid phase dispersion was developed and validated using different

types and amounts of sorbents (neutral alumina, Florisil, silica and C

) and

organic solvents (15-30 mL) ethyl acetate, dichloromethane, cyclohexane and

acetonitrile. The best results for bromuconazole, fenbuconazole, parathion-

methyl and kresoxim-methyl by HPLC-UV/DAD analysis were obtained using 1:3

(w / w) sample: the solid support (neutral alumina) ratio, without clean-up, and

eluted with 20 mL of ethyl acetate: cyclohexane 1:1, v / v ratio. For assai,

recovery values ranged from 57 to 119% with coefficients of variation values

ranging from 1.4 to 20% for concentration levels 1, 2 and 6 µg mL

-1

. Detection

and quantification limits ranged from 0.1 to 0.9 µg g

-1

and 0.4 to 2.1 µg g

-1

respectively. For cupuassu, recovery values were between 57-69%, the

concentration level of 2 µg g

-1

Keywords: fruits, assai, cupuassu, pesticides, MSPD, HPLC-UV/DAD

1. INTRODUÇÃO

As frutas constituem uma excelente fonte de alimentação, proporcionando

importantes benefícios à saúde (CARDOSO et al., 2004). Com isso, o consumo

de frutas com novos sabores e características nutricionais elevadas, que tragam

em sua composição compostos importantes para a saúde humana em curto,

médio e longo prazo vem crescendo, sendo uma tendência mundial. Essas

frutas estão sendo chamadas de superfrutas

( GIACOMETTI, 2007; MATTIASO,

2008).

O açaizeiro e o cupuaçuzeiro são originários da Região Amazônica, seus

frutos, o açaí e o cupuaçu, respectivamente, despontam como importantes

produtos agrícolas de exportação, com amplas perspectivas de mercado, dada

as suas características nutricionais (superfrutas) e o interesse de outros países

pelos produtos provenientes da região amazônica, deixando de serem obtidos

exclusivamente do extrativismo, passando a ser cultivados em grandes áreas

(QUEIROZ et al., 200; OLIVEIRA et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2004(b)), e

expandido para outras regiões do país, como por exemplo, a produção de açaí

na região sul do estado da Bahia (PITA, 2008).

As culturas agrícolas estão sujeitas aos ataques de pragas como insetos,

ácaros e fungos, o que prejudica a comercialização destes produtos,

ocasionando perdas econômicas, sendo necessário efetuar processos

mitigadores, como a utilização de pesticidas para controlar a ação das pragas

Uma nova categoria de mercado criada para promover frutas comuns ou raras, com alto poder

antioxidante, que ajudam a combater os radicais livres trazendo benefícios a saúde, prevenindo

doenças. A palavra superfrutas, é na verdade, um conceito mercadológico no sentido de agrupar

características nutricionais aos seus derivados. A denominação surgiu dentro do conceito de

alimentos funcionais, já bastante conhecido, embora para frutas seja mais recente e ainda

desconhecido no Brasil. Internacionalmente, as superfrutas estão em evidência devido,

principalmente aos seus processados, entre eles, os sucos, que são oferecidos como receita de

saúde (MATTIASO, 2008).

(CARVALHO, 2009). Os açaizeiros são normalmente atacados por insetos,

enquanto os cupuaçuzeiros, por fungos (SOUZA, 2002; BENCHIMOL, 2004).

Existem diversas classes químicas de pesticidas, cuja escolha e uso

devem ser feitos segundo recomendações técnicas para não trazer prejuízos

maiores à cultura ou a seus consumidores. O acúmulo excessivo dos pesticidas

pode causar danos à saúde da população, contaminação do solo e dos

mananciais (BAIRD, 2002; BARBOSA, 2004; GRISOLIA, 2005).

Atualmente não existe pesticida registrado no Ministério da Agricultura

para uso nas culturas de açaí e cupuaçu

. O que existe é um conjunto de

recomendações de controle baseado em pesquisas realizadas principalmente

por pesquisadores da EMBRAPA em conjunto com instituições de ensino.

Quando essas recomendações não resolvem ou tem efeitos demorados, o

agricultor recorre ao uso de pesticidas indicados para aquela praga em outra

cultura (PORTES, 2008).

A literatura não registra método para determinação de pesticidas em açaí

e cupuaçu.

A técnica de dispersão da matriz em fase sólida tem encontrado

aplicações específicas em processos analíticos para preparação, extração e

fracionamento de amostras sólidas e semi-sólidas, sendo muito utilizada para a

determinação de resíduos de pesticidas e outros contaminantes em matrizes

ambientais e alimentares. A sua simplicidade de execução e flexibilidade têm

contribuído para que seja escolhida como procedimento de extração frente a

outras técnicas clássicas

para esses fins (BARKER, 2007; CAPRIOTTI et al.,

2010). Aliada a ela está a cromatografia líquida de alta eficiência que tem a

capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande

variedade de compostos presentes em diversos tipos de amostras, em escala de

O sistema brasileiro exige estudo de resíduos em cada cultura e não em grupos de culturas,

como recomenda a FAO. E um estudo de resíduo custa cerca de R$ 60 mil, para cada uma das

muitas pragas em uma cultura (OLIVEIRA, 2008).

Entre as técnicas clássicas temos a extração líquido-líquido (LLE) e extração em fase sólida

(SPE).

tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e detectabilidade

(COLLINS et al., 2006).

Diante deste contexto, o presente trabalho visa desenvolver um método

eficiente, rápido e de baixo custo para determinação de resíduos dos pesticidas

bromuconazol, cresoxim-metílico, fenbuconazol, parationa-metílica e

teflubenzuron em açaí e cupuaçu, utilizando as técnicas de dispersão da matriz

em fase sólida (MSPD) e cromatografia líquida de alta eficiência com detector de

UV-Vis com arranjo de diodos.

2. OBJETIVOS

2.1 – Objetivo Geral

Desenvolver um método analítico para determinar resíduos de pesticidas

em frutas exóticas, utilizando dispersão da matriz em fase sólida e cromatografia

líquida de alta eficiência com detector espectrofotométrico de absorção no UV-

Vis com arranjo de diodos.

2.2 – Objetivos Específicos

• Selecionar pesticidas que estejam ligados direta ou indiretamente as

culturas de açaí e de cupuaçu.

• Obter as condições cromatográficas ideais de análise dos pesticidas

selecionados por HPLC-UV/DAD.

• Desenvolver um método para extrair os resíduos dos pesticidas

bromuconazol, cresoxim-metílico, fenbuconazol, parationa-metílica e

teflubenzuron, utilizando a técnica MSPD das matrizes de açaí e cupuaçu.

• Validar o método desenvolvido por MSPD e HPLC-UV/DAD.

3. JUSTIFICATIVA

Com o uso de pesticidas nas culturas agrícolas e os problemas causados

por eles, faz-se necessário o monitoramento da quantidade destes produtos

nessas culturas, para avaliar a qualidade do produto que chega ao consumidor

(GRISOLIA 2005). Sendo assim torna-se necessário o desenvolvimento de

métodos analíticos capazes de determinar esses pesticidas de maneira simples,

confiável, econômica e com curto tempo de análise (ANVISA (b), 2009).

A dispersão da matriz em fase sólida tem sido utilizada frente a outras

técnicas de extração, como a extração líquido-líquido e a extração em fase

sólida, para a extração de multirresíduos de pesticidas em frutas e vegetais. Isso

se deve principalmente pelo fato de que em uma única etapa realiza-se a

homogeneização, extração e limpeza (clean-up) da amostra, reduzindo

significativamente a quantidade de amostra utilizada, o consumo de solventes

orgânicos, os riscos de formação de emulsões, além de ser aplicada a matrizes

sólidas e semi-sólidas (BARKER, 2000; SOLER & PICO, 2007).

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) tem se mostrado uma

importante técnica de análise para separação e identificação de grande

quantidade de compostos presentes em matrizes complexas, como o caso do

açaí e do cupuaçu, devido a seu alto poder de resolução, eficiência e

detectabilidade (COLLINS et al, 2006; WANG et al., 2007).

A partir de 2000 surgiu um maior interesse internacional pelo açaí e pelo

cupuaçu, de tal forma que essas frutas deixaram de ser culturas regionais,

agregando maior valor econômico e uma necessidade de expansão de áreas

cultivadas (QUEIROZ et al., 2001; NOGUEIRA et al., 2006; PITA, 2008).

As culturas de açaí e cupuaçu podem ser atacadas principalmente por

insetos e fungos, que podem inviabilizar sua comercialização, recorrendo ao uso

de pesticidas para o controle destas pragas (SOUZA, 2002; BENCHIMOL, 2004;

PORTES, 2008). Sendo necessário dispor de um método analítico simples,

rápido e eficiente para determinar resíduos de pesticidas nestas culturas.

4. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

4.1 - Pesticidas

O crescimento populacional intensificou a demanda por alimentos. As

áreas agricultáveis disputam espaço com a expansão das áreas urbanas e

industriais. Neste contexto a agricultura se desenvolve na busca por maior

produtividade agrícola por hectare, produzindo alimentos de boa qualidade e em

grandes proporções, chamada de agroindústria, para tanto grande parte das

culturas são tratadas com pesticidas para evitar a perda da colheita pela ação

das pragas (GRISOLIA, 2005; MENEZES FILHO et al., 2006).

Os pesticidas são agentes utilizados para controlar ou matar um

organismo indesejável, esses organismos indesejáveis podem ser insetos,

roedores, aves, plantas daninhas, fungos, bactérias, vírus. Os pesticidas podem

ser classificados de acordo com vários critérios (BAIRD, 2002).

Assim sendo, de acordo com o tipo de praga que eles combatem podem

ser classificados como inseticidas (controlam os insetos), fungicidas (agem

sobre os fungos), herbicidas (combatem as plantas invasoras), bactericidas

(controlam as bactérias), acaricidas (eliminam os ácaros), nematicidas (agem

sobre os nematóides do solo), moluscidas (combatem as lesmas) e raticidas

(agem sobre os ratos) (NOGUEIRA et al., 2006; CARVALHO, 2009).

Do ponto de vista da composição química, os pesticidas possuem uma

grande diversidade estrutural, mas muitos deles apresentam algumas

características em comum, sendo classificados dentro de um mesmo grupo. Os

grupos químicos dos pesticidas deste estudo são azol, benzoiluréia,

organofosforado e estrobilurina.

Os azóis compreendem os compostos fungicidas, alguns dos quais são

cancerígenos (PAN PESTICIDES DATABASE, 2009). Eles são inibidores da

biossíntese do ergosterol

, matando os fungos pela inibição da formação da

parede celular (BRENT, 1995).

A benzoiluréia é uma classe de compostos que atuam como herbicidas e

inseticidas (SOUZA E SILVA, 1996), com um grupo funcional da uréia

substituível por grupo benzoil (PAN PESTICIDES DATABASE, 2009), que atua

nos insetos por contato ou ingestão, inibindo a síntese da quitina, um dos

constituintes da parede celular, determinando a morte do fungo (BRENT, 1995).

Os organofosforados são compostos que atuam como inseticidas. A

maioria dos compostos desta classe são inibidores da colinesterase, que é

responsável pelo funcionamento do sistema nervoso, permitindo a transmissão

de impulsos nervosos. Os pesticidas desativam esta enzima, causando

neurotoxicidade (tremores, náuseas, fraqueza em doses baixas e paralisia e

morte em doses mais elevadas). Esse mecanismo é semelhante nos insetos e

em seres humanos (GRISOLIA, 2005).

As estrobilurinas são compostos químicos extraídos do fungo Strobilurus

tenacellus, que apresentam ação fungicida. Estes compostos agem inibindo a

cadeia respiratória ao nível do complexo III do fungo, impedindo a cadeia

bioquímica de transferência de elétrons na mitocôndria

(PARREIRA et al.,

2009).

Os pesticidas também podem ser classificados de acordo com sua

toxicologia (DL

), sendo agrupados em classes que variam de I a IV, sendo I

(extremamente tóxico), II (altamente tóxico), III (medianamente tóxico) e IV

(pouco tóxico), conforme dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA, 2009).

Quanto à forma de atuação eles podem ser sistêmicos ou não-sistêmicos

(CARVALHO, 2009). Os sistêmicos fixam-se na superfície da planta,

dispersando-se, subsequentemente, através de toda a planta, transportando-se

em quantidade letal para o inseto, sem prejudicar a planta. Os não-sistêmicos

Substância fundamental para a manutenção da integridade da membrana celular.

Organela celular responsável pelo processo respiratório.

necessitam atingir diretamente os organismos nocivos para serem eficazes,

portanto, tem ação de contato, penetração, ingestão e fumegante (BOLAND,

2005). Na Tabela 1 destacam-se algumas características dos pesticidas

estudados.

Tabela 1: Características dos pesticidas selecionados para estudo.

(BARCELÓ, 1997; ANVISA, 2009; TOMLIN, 1994; PESTICIDES, 2004)

Pesticida

Classe química

(fórmula)

Massa molar

(g mol

-1

)

Modo de ação Classe toxicológica

Forma de

atuação

Aplicação

Bromuconazol

triazol

BrCl

377,1 fungicida III- medianamente tóxico sistêmico foliar

Cresoxim-metílico

estrobilurina

)

313 fungicida III- medianamente tóxico ---- foliar

Fenbucobazol

azol

)

336,8 fungicida ---- sistêmico ---

Parationa-metílica

organofosforado

PS)

263

acaricida

inseticida

I - extremamente tóxico não-sistêmico foliar

Teflubenzuron

benzoiluréia

)

381,1 inseticida IV - pouco tóxico não-sistêmico foliar

O comportamento de um pesticida pode ser estimado pela suas

características físico-químicas e pelos seus metabólitos ou produtos de

degradação formados (CARVALHO, 2009). Nas Tabelas 2 e 3 e na Figura 1

evidenciam-se algumas propriedades físico-químicas, solubilidade e estrutura

química dos pesticidas selecionados para o estudo.

Alguns dos valores de solubilidade dos pesticidas estudados não foram

encontrados nos solventes indicados, mas de forma geral, eles apresentam uma

moderada solubilidade nos solventes orgânicos mais comuns.

Tabela 2: Características físicas dos pesticidas selecionados para estudo

Pesticida

log k

(20-25 °C)

Ponto de ebulição

(°C)

Tempo de meia vida

1/2

), em dias

Bromuconazol 3,24 84 18

Cresoxim-metílico --- 97-102 --

Fenbuconazol 3,22 124-126 --

Parationa - metílica 3,0 154 15

Teflubenzuron 4,3 222,5 --

* Coeficiente de partição octanol:água

(TOMLIN, 1994; BARCELÓ, 1997; PESTICIDES, 2004; ANVISA, 2009)

Tabela 3: Solubilidade dos pesticidas estudados.

Pesticida

Água

(g L

-1

20-25 °C)

Diclorometano

(g L

-1

, 20 °C)

Ciclohexano

(g L

-1

, 20 °C)

Acetonitrila

(g L

-1

, 20 °C)

Metanol

(g L

-1

, 20 °C)

Bromuconazol 5.10

-2

solúvel solúvel solúvel solúvel

Cresoxim-

metílico

2.10

-3

--- --- solúvel solúvel

Fenbuconazol 2.10

-4

--- --- solúvel solúvel

Parationa-

metílica

1,1.10

-2

> 200 50-100 solúvel solúvel

Teflubenzuron 1,9.10

-5

1,8 20 solúvel solúvel

(TOMLIN, 1994; PESTICIDES, 2004)

Cresoxim-

metílico

Parationa-

metílica

Figura 1:

Estrutura química dos pesticidas selecionados para estudo

_____________

_______________________

1-[(2RS,4RS:2RS,4SR)-4-

bromo

methyl( E)-2-

methoxyimino[2

4-(4-chlorophenyl)-2-

phenyl

O,O-dimethyl O-4-

nitrophenyl phosphorothioate

dimethyl 2,2,2-trichloro-1-

hydroxyethylphosphonate

Bromuconazol

metílico

Fenbuconazol

metílica

Teflubenzuron

Estrutura química dos pesticidas selecionados para estudo

(

PESTICIDES, 2004

_______________________

_________________

bromo

-2-(2,4-dichlorophenyl) tetrahydrofurfuryl]-

methoxyimino[2

-(o-tolyloxymethyl)phenyl]acetate

phenyl

-2-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)butyronitrile

nitrophenyl phosphorothioate

hydroxyethylphosphonate

Fenbuconazol

Teflubenzuron

PESTICIDES, 2004

; ANVISA, 2009)

_________________

___________

-1,2,4-triazole

4.2 – Frutas exóticas

4.2.1 – Açaí

Chama-se açaí o fruto da palmeira de nome açaizeiro (Euterpe oleracea

Mart) que ocorre de forma espontânea na Região Amazônica, de cuja polpa é

extraída um suco muito consumido pela população da região (QUEIROZ et al.,

2001; SOUZA, 2002). O açaí é um fruto de drupa globosa ou levemente

depressa, que apresenta resíduos florais aderidos de coloração violácea ou

verde, quando maduros (OLIVEIRA et al., 2002). Com o açaí são fabricados

sorvetes, licores, doces, néctares e geléias, podendo ser aproveitado, também,

para a extração de corantes e antocianina (QUEIROZ et al, 2001).

Figura 2: Açaizeiro (NOGUEIRA et al., 2006)

O interesse pela implementação da produção de frutos tem se dado pelo

fato do açaí, antes destinado totalmente ao consumo local (Região Amazônica),

ter conquistado novos mercados e se tornado em importante fonte de renda e de

emprego. A venda de polpa congelada, para outros estados brasileiros, vem

aumentando significativamente com taxas anuais superiores a 30 %, podendo

chegar a cerca de 12 mil toneladas. O açaí é considerado alimento de alto valor

calórico, com elevado percentual de lipídeos (48g/100g), e nutricional, pois é

ricos em proteínas e minerais (NOGUEIRA et al., 2006).

Em 2000, foi iniciada a exportação de polpa congelada de açaí para os

Estados Unidos e para a Itália. Esse mercado externo vem crescendo nos

últimos. Em 2005, a região do estado do Pará produziu 416 mil toneladas de

polpa de açaí, sendo 60 % para o mercado nacional, 30 % para o local e 10 %

para as exportações, devido a comercialização do açaí concentrado e a

popularização da mistura com diversas outras frutas, feitas em academias de

ginástica (NOGUEIRA et al., 2006; PEREIRA, 2006).

4.2.1.1 – Pragas do açaizeiro

Dentre os fatores que podem comprometer a produção racional do cultivo

do açaizeiro destaca-se a ocorrência de insetos. Diversos insetos são capazes

de atacar o açaizeiro, desde a fase de sementeira até o plantio adulto, contudo

essas pragas são pouco conhecidas (SOUZA, 2002; NOGUEIRA et al., 2006).

Com a expansão comercial do cultivo do açaí, os problemas causados

pelos insetos têm sido evidenciados, tornando-se preocupantes (SOUZA, 2002).

Na Tabela 4 encontra-se o resumo com as principais pragas do açaizeiro

e as indicações de métodos para controlá-las.

Tabela 4: Principais pragas do açaizeiro e as indicações de métodos de controle.

Pragas Indicação de método de controle

Pulgão-preto-do-coqueiro (Cerataphis latanie

Boisuval) (Hemiptera: Aphididae); Cochonilha

Escama vírgula ou Escama Vírgula

[Mytilococcus bechii (Newman) (Hemiptera:

Diaspididae)]

Pulverização de óleo mineral na concentração

de 1%, misturado com inseticidas fosforados de

controle e alto poder residual na concentração

de 0,1 % do produto comercial.

Mosca Branca [Aleurodicus cocois (Curtis)

(Hemiptera: Aleyrodidal)]; Mosca Branca ou

Piolhos Farinhentos [ Alleurothrixus floccsus

(Maskell) (Hemiptera: Aleyrodiae)]

Catação manual, com auxílio de pano

umedecido em água

Saúvas, Tanajuras ou Formigas Saúvas [Atta

ssp. (Hymenoptera: Formicidae)]

Gases liquefeitos; líquidos termonebulizáveis,

como fenitrotion e deltametrina; e iscas

granuladas à base de diflubenzuron.

Gafanhoto do coqueiro, gafanhotos ou

tucurão [Eutropidacris cristata L. (Orthoptera:

Acrididae)]

Uso de inseticidas: carbaril (40g/ 20 L de água);

lindano (15g/ 20 L de água); e parationa-etílica

ou parationa-metílica (15g/ 20 L de água).

Fungos

Fungicidas: oxicloreto de cobre

(25g/20 L de água); benomil (10g/20L de água);

captan

(20g/20L de água).

(Adaptado de QUEIROZ et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002; SOUZA,

2002; SOUZA et al., 2004; NOGUEIRA et al., 2006 ).

É importante ressaltar que não existe registro no Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento de pesticidas para o controle de pragas em cultura de

açaí. As formulações indicadas para controle de pragas são as recomendadas

para culturas, como a do coqueiro e do dendezeiro.

4.2.2 – Cupuaçu

O cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum Schum), Figura 3, é uma árvore

nativa do leste da Amazônia, sendo uma das plantas frutíferas de maior

importância econômica, principalmente devido a sua participação na composição

dos sistemas de produção, cultivados ou extrativos, além da grande aceitação e

consumo da polpa de seus frutos. Os frutos, que podem pesar até 1,5 Kg, têm

uma polpa branca-amarelada com um agradável sabor ácido e forte fragrância, e

são amplamente consumidos na forma de sucos, sorvetes e doces (OLIVEIRA et

al., 2004(a); LOPES et al., 2008).

Figura 3: Cupuaçuzeiro (EMBRAPA, 2009)

4.2.2.1 – Pragas do cupuaçuzeiro

Na região amazônica, essa cultura é atacada por diversos patógenos.

Entre as doenças observadas, a vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo

Crinipelis perniciosa, é a doença mais prejudicial (BENCHIMOL, 2004). A Tabela

5 mostra as principais doenças e as recomendações de controle.

Tabela 5: Principais pragas do cupuaçuzeiro e as recomendações de controle.

PRAGAS RECOMENDAÇÕES DE CONTROLE

Broca-do-fruto

(Inseto Conotrachelus sp.)

Controle com boas práticas agrícolas

Vassoura-de bruxa

(fungo Crinipellis perniciosa)

Podar as vassouras, remover os frutos

afetados, proteger as partes podados com

pasta bordaleza (5L de água + 1 Kg cal virgem

+ 0,5 Kg sulfato de cobre) oxicloreto de cobre

(4g/L) + tebuconazole (0,5 mL/L)

Antracnose e Manchas de Phomopsis (Fungo

Colletotrichum gloeosporioides)

Pulverizações com fungicidas cúpricos

Podridão negra dos frutos e Morte progressiva

(Lasiodiplodia theobromae)

Aplicação de endosulfan 35%

Raspar as lesões e pincelar com 30 g de

tiofanato metílico + 20 mL de óleo vegetal +

400 g de cal hidratada + 600 mL de água

Podridão branca das raízes (Rigidoporus

lignosus)

Abrir uma trincheira, eliminar as raízes

afetadas e pincelar as partes sadias com

fungicidas à base de PCNB ou quintozene (10

g/L) e fechar as trincheiras

Podridão do pé

(Phytophthora palmivora)

Eliminar as plantas doentes, aplicar metalaxil +

mancozeb (2 g/L) nas plantas circunvizinhas.

(Adaptado de BENCHIMOLl, 2004)

É importante ressaltar que não existe pesticida registrado no Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento para controle de doenças em

cupuaçuzeiro.

4.3 – Dispersão da matriz em fase sólida

A dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) é um método empregado

no isolamento de diversos compostos como fármacos, pesticidas e outros a

partir de amostras de características sólidas, semi-sólidas e viscosas de

matrizes ambientais e biológicas (KRISTENSON et al., 2006; BARKER, 2007;

GARCIA-LÓPEZ et al., 2008).

Os princípios de operação da MSPD foram introduzidos por Barker e seus

colaboradores em 1989. A MSPD evidencia-se pelo baixo custo por extração; a

não necessidade de instrumentos elaborados; e moderado consumo de

solventes orgânicos (BOGIALLI, 2007; GARCIA-LÓPEZ et al., 2008). A primeira

etapa consiste na maceração da amostra com um suporte sólido num almofariz

e pistilo, a fim de:

1. quebrar a estrutura da amostra, e

2. homogeneizar a mistura amostra/suporte sólido.

Essa mistura é transferida para uma coluna ou cartucho e os analitos são

eluídos com um solvente orgânico adequado, como observado na Figura 4

(PICÒ et al., 2007; CHEN et al., 2008; GARCIA-LÓPEZ et al., 2008).

Figura 4: Esquema da dispersão da matriz em fase sólida, adaptado de BARKER, 2007

(BEZERRA, 2009).

Na eluição, existem duas possibilidades: (i) os analitos são retidos na

coluna, sendo os interferentes eluídos e, em seguida, elui-se os analitos com

outro solvente ou (ii) os interferentes são retidos na coluna e os analitos eluídos

diretamente (KRISTENSON et al., 2006; CAPRIOTTI et al., 2010).

A seletividade e eficiência de um procedimento de extração por MSPD

são condicionadas por uma série de fatores, tais como: origem e estado físico da

amostra, concentração e as propriedades (polaridade, estabilidade química, etc.)

dos analitos e interferentes, como também a combinação adequada ao

adsorvente e o solvente de eluição (GRACIA-LÓPEZ et al., 2008).

Geralmente, a combinação do adsorvente/solvente é determinada pela

polaridade dos analitos e da natureza da amostra/matriz. Com isso, a otimização

dos parâmetros da técnica de MSPD é alcançada por meio de combinações

entre adsorventes e solventes (LANÇAS, 2004(a); KRISTENSON et al., 2006).

A determinação de resíduos de pesticidas utilizando a MSPD como

técnica de extração e métodos cromatográficos para análise vem sendo aplicado

a diversos tipos de frutas/ verduras (vegetais), como se observa na Tabela 6.

Tabela 6: Utilização de MSPD para a extração de resíduos de pesticidas de frutas/verduras (vegetais).

Referência Matriz Analito Suporte sólido

Adsorvente

auxiliar

Eluente

Análise

instrumental

SILVA et al., 2010 Alface

malationa, parationa-metílica,

pirimicarbe, procimidona,

α-endossulfam e β-

endossulfam

sílica/alumina ---- acetonitrila GC-MS

ABHILASH et al.,

2009

diversas

frutas

lindano e isômeros do

hexaclorociclohexano

Florisil alumina neutra

n-hexano / acetato

de etila (70:30)

GC-ECD

RADISIC et al.,

2009

maçã, laranja

e pêssego

organofosforados, triazol,

carbamatos, dinitrofenol,

fenilureía

terra de

diatomáceas

---- diclorometano LC-MS/MS

PINHO et al., 2009 Tomate

inseticidas (piretróides e

organofosforados)

Florisil ---- acetato de etila CG-ECD

MALDANER et al.,

2008

Soja

imazethapyr, imazaquin,

metsulfuron-Me, carboxin,

chlorimuron-Et, e

tebuconazol

sílica C

20 mL de acetato

de etila + 5 mL de

metanol

HPLC-DAD

SILVA et al., 2008 polpa de coco

dimetoato, malationa,

lufenuron, triclorfon,

carbofuran, 3-

hidroxicarbofurano,

difenoconazol e tiabendazol

Florisil

40 mL de

acetonitrila saturado

com n-hexano

GC-MS

WANG et al., 2007

maçã, laranja,

banana,

alface, uva e

tomate

tiabendazol, imazalil,

tiofanato-metilico, pirimetanil,

procimidona, triadimefon,

miclobutanil, triadimenol,

diclofluanida, fenarimol,

epoxiconazol, iprodiona,

cresoxim-metílico, procloraz,

diniconazol

---

10 mL de acetato

de etila

HPLC/ESI-

MS/MS

Continuação da Tabela 6

Referência Matriz Analito Suporte sólido

Adsorvente

auxiliar

Eluente

Análise

instrumental

MENEZES FILHO

et al., 2006

Tomate

dimetoato, parationa-metílica,

malationa, tebuconazol e

cipermetrina(cis)

alumina neutra Florisil diclorometano GC-MS

SOLER et al.,

2005

fruta cítrica inseticidas sílica ----

diclorometano

/metanol

LC-MS/MS

4.4 – Cromatografia líquida de alta eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma importante

técnica de separação, uma vez que consegue separar misturas que contém um

grande número de compostos. Ela tem a capacidade de realizar separações e

análises quantitativas de uma grande variedade de compostos presentes em

diversos tipos de amostra, em escala de tempo de poucos minutos, com alta

resolução, eficiência e detectabilidade (SADEK, 2002).

A técnica de cromatografia líquida é complementar à cromatografia a gás,

pelo fato de permitir a separação e análise de compostos termicamente

instáveis, não-voláteis ou de elevada polaridade (BARCELÓ, 1997).

O equipamento básico de HPLC é constituído de reservatório de fase

móvel, bombas de alta pressão, válvula de injeção, coluna, detector e sistema

de aquisição de dados (Figura 5).

Figura 5: Esquema básico do equipamento HPLC, adaptado de CASS et al., 2001.

O detector mais utilizado em HPLC é o espectrofotométrico, cujo principio

é a absorção de luz ultravioleta ou visível, por parte da amostra, quando nela

passa radiação eletromagnética. (CASS et al., 2001)

Existem três tipos de equipamentos operando de acordo com esse

principio: os fotômetros de comprimento de onda fixo, os espectrofotômetros e

os detectores por arranjo de fotodiodos.

Os detectores fotométricos são sensíveis, econômicos e simples,

funcionam com um ou dois comprimentos de onda fixos (LANÇAS, 2009). Os

espectrofotômetros são mais versáteis, permitindo a escolha do comprimento de

onda mais adequado a cada análise. Já o detector de arranjo de fotodiodos,

detecta vários comprimentos de onda simultaneamente, onde cada diodo

monitora uma faixa estreita de comprimentos de onda e, no final da análise, toda

a região de interesse foi varrida e os dados, acumulados no computador

permitindo, com software adequado, a obtenção de espectro de substância..

(COLLINS et al., 2006; SADEK, 2002)

Esse detector apresenta inúmeras vantagens em relação aos outros,

principalmente por possibilitarem uma “varredura” da região UV-Vis em única

corrida cromatográfica, constituindo um dado adicional que, juntamente com o

tempo de retenção, permite análises qualitativas, nas quais a identificação pode

ser feita através de comparação com um padrão ou uma biblioteca on-line,

sendo especialmente útil para o desenvolvimento de métodos (SNYDER et al.,

1997; LANÇAS, 2009).

Ao utilizar um detector de absorvência no UV, a fase móvel não deve

absorver no comprimento de onda selecionado para a análise. Recomenda-se a

utilização do comprimento de onda máximo do analito, desde que este seja

superior a 220 nm, pois abaixo deste valor geralmente observa-se interferência

da fase móvel, com algumas exceções como a fase móvel acetonitrila:água

(SNYDER et al., 1997). A Tabela 8 mostra os comprimentos de onda mínimos

para que não se observe interferência de fase móvel.

Tabela 7: Comprimento de onda mínimo dos solventes mais utilizados nesse trabalho.

Solvente UV

mínimo

(nm)

Acetato de etila 255

Acetronitrila 200

Água

190

Ciclohexano 210

Hexano 200

Metanol 210

Adaptado de CASS et al., 2001

4.5 - Validação do método analítico

A validação

do método analítico é o processo pelo qual torna confiável o

método desenvolvido, comprovando que o método oferece resultados esperados

com credibilidade, precisão e exatidão adequados (INMETRO, 2007).

Apesar de não existir um consenso sobre quais parâmetros devem ser

incluídos no processo de validação, na literatura os principais parâmetros

descritos para a validação de método para análise de traços são: linearidade,

seletividade, precisão, exatidão (recuperação), limite de detecção e limite de

quantificação (CASSIANO et al., 2009).

4.5.1 - Linearidade

Linearidade é a resposta obtida em função da concentração do analito, a

qual deve ser estudada em um intervalo de concentração apropriado, sendo na

prática determinada por gráficos de calibração

, seguido de um tratamento

estatístico, que deve envolver a equação da reta, a análise da regressão e os

dados de correlação e determinação (CASSIANO et al., 2009).

A equação da reta, neste caso, terá a forma (LANÇAS, 2009):

Ato ou efeito de validar, dar validade, tornar legítimo ou legal. Visa diminuir ou controlar os

fatores que levam à imprecisão ou inexatidão de um dado apresentado (LANÇAS, 2009).

O número de pontos geralmente, aceito, nos gráficos de calibração, varia entre 5 e 6 pontos.

(LANÇAS, 2009)

ݕ = ܽݔ + ܾ Eq. 1

onde:

y = variável dependente

x = variável independente

a = coeficiente angular

b = coeficiente linear

O coeficiente angular (a) expressa a inclinação do gráfico em relação aos

eixos, enquanto o coeficiente linear (b) expressa a interseção do gráfico com os

eixos. A regressão geralmente utilizada para a análise é a dos mínimos

quadrados, sendo a equação da reta obtida registrada. Também é possível

calcular os coeficientes de correlação (r) e determinação (r

) (RIBEIRO et al,

2008).

O coeficiente de correlação permite uma estimativa da qualidade da curva

obtida, quanto mais próximo de 1,0 menor é a dispersão do conjunto de pontos

experimentais e menor a incerteza de regressão estimados. Sendo que um

coeficiente de correlação maior que 0,999 é considerado como evidência de um

ajuste ideal dos dados para a linha de regressão. A ANVISA recomenda um

coeficiente de correlação igual ou superior a 0,99 e o INMETRO um valor acima

de 0,90. Por sua vez, os valores de determinação (r

) são aceitáveis a partir de

0,98. (ANVISA (b), 2009; RIBANI et al., 2004)

4.5.2 - Seletividade

A seletividade corresponde à capacidade de um método em determinar o

analito de maneira inequívoca na presença de outras substâncias susceptíveis

de interferirem na determinação (US-FDA, 2001; PETERS et al., 2007).

De modo geral, a forma mais simples de verificar a seletividade é

observar a presença de picos na região do tempo de retenção do analito de

interesse por meio da injeção de um branco obtido com a matriz de interesse

(LANÇAS, 2004(b); RIBANI et al., 2004).

4.5.3 - Precisão

A precisão é um importante parâmetro que possibilita decidir se o método

analítico é confiável ou não para o objetivo da análise (CASSIANO et al., 2009).

A precisão é a expressão da concordância entre vários resultados

analíticos obtidos para uma mesma amostra (TAVERNIERS et al., 2004). Na

prática, a precisão é expressa pelo desvio padrão relativo (RSD) ou coeficiente

de variação (CV), que é dado por,

ܴܵܦ

ሺ

ሻ

݋ݑ ܥܸ

ሺ

ሻ

ௌ

௑

ത

× 100 Eq.2

Onde:

S = estimativa do desvio padrão da recuperação

ത

= média aritmética dos valores de recuperação

Em métodos de análise de traços ou impurezas, são aceitos RSD de até

20% para amostras complexas, como a matriz fruta (RIBANI et al., 2004).

4.5.4 - Exatidão

A exatidão expressa à concordância entre os resultados encontrados pelo

método e os valores nominais aceitos como referência (PETERS et al, 2007).

A exatidão aparece associada a valores de precisão, dentro de certos

limites, a um dado limite de confiança. O número de ensaios depende da

legislação ou das diretrizes adotadas. A ANVISA recomenda que um mínimo de

nove determinações envolvendo um mínimo de três níveis diferentes de

concentração deve ser feito (RIBANI et al., 2004).

Existem alguns processos para avaliar a exatidão, o mais utilizado é

ensaios de recuperação.

Este parâmetro reflete a medida de eficiência do processo de isolamento

do analito de interesse da matriz no qual ela se encontra, sendo calculado pela

comparação da resposta obtida para o analito adicionado na matriz e extraído

com a resposta obtida para o analito em amostras preparadas em solvente e

consequentemente, não extraídas, as quais representam 100 % (BEZERRA,

2009; SILVA, 2010), segundo relação:

ܴ݁ܿݑ݌݁ݎܽçã݋

ሺ

ሻ

௏௔௟௢௥ ௢௕௧௜ௗ௢

௏௔௟௢௥ ௔ௗ௜௖௜௢௡௔ௗ௢

× 100 Eq. 3

Os valores de recuperação são aceitos dentro da faixa de 50-120 %, para

matrizes complexas, como frutas (RIBANI et al., 2004; LANÇAS, 2004).

4.5.5 - Limite de detecção (LD)

O limite de detecção (LD) corresponde ao menor valor de concentração

do analito que pode ser detectado pelo método ou equipamento (INMETRO,

2007).

Para o calculo do LD utiliza-se o método baseado nos parâmetros da

curva de calibração, sendo expresso por:

ܮܦ = ݐ

ଽଽ%

× ݏ Eq. 4

Onde: t

99%

é o fator t de Student para um nível de confiança de 99% e s é

a estimativa do desvio padrão amostral da concentração (µg mL

-1

) (SILVA,

2010).

4.5.6 - Limite de quantificação (LQ)

O limite de quantificação é definido como a menor concentração do

analito de interesse em uma amostra, que pode ser quantitativamente

determinada com valores aceitáveis de precisão e exatidão (CASSIANO et al.,

2009).

Para a quantificação do LQ utiliza-se a equação 5, onde para o LD do

método os desvios padrões são medidos do processo de extração (sete

replicatas da amostra fortificada de açaí e cupuaçu) (BRITO et al., 2003; RIBANI

et al., 2004; INMETRO, 2007).

ܮܳ = 10 × ݏ Eq. 5

Onde: s = desvio padrão amostral da concentração (µg mL

-1

5. EXPERIMENTAL

5.1 – Materiais

Béquer (50 e 250 mL), balão volumétrico (1;5;10 e 25 mL), proveta (10 a

25 mL), pinça, lã de vidro, bastão de vidro, espátula, seringa de polietileno (20

mL), balão de fundo redondo (50 mL), pipeta Pasteur, micropipetas (Jencons) de

0,5-10 µL, 10-100µL e 100-1000 µL), vidro de relógio, almofariz e pistilo, vial

(1;5;10 e 50 mL), membrana para filtração (RC 0,45 µm – Nylon) (Sartorius,

Alemanha).

5.2 – Reagentes e adsorventes

Diclorometano, acetato de etila, n-hexano, metanol, ciclohexano (Tedia

company, EUA) e acetonitrila ((Mallinckrodt Chemicals, EUA), todos grau HPLC;

sílica gel 60 – 200 mesh (Mallinckrodt Chemicals, EUA), alumina neutra 70 – 290

mesh (Macherey – Nagel, Alemanha), Florisil 60 – 100 mesh (Sigma EUA), C

50 µm – 65 A° (Waters, EUA), sulfato de sódio anidr o (Merck, Alemanha), grau

p.a. e sulfato de magnésio anidro (Reagen, Brasil).

5.3 – Padrões e soluções de pesticidas

- bromuconazol (AccuStandard,EUA)

- cresoxim-metílico (Riedel-de-Haën, pureza de 96,6 %)

- fenbuconazol (Riedel-de-Haën, pureza de 99,9 %)

- parationa-metílica (Fluka Analytical, pureza de 99,8 %)

- teflubenzuron (Fluka Analytical, pureza de 98,8 %)

As soluções estoques dos padrões certificados de bromuconazol (400 µg

-1

) e cresoxim-metílico (400 µg mL

-1

) foram preparadas em metanol, enquanto

que fenbuconazol (1000 µg mL

-1

), parationa-metílica (1000 µg mL

-1

) e

teflubenzuron (1000 µg mL

-1

) foram preparadas em acetronitrila. A partir destas

foi preparada 10 mL da solução intermediária dos analitos com concentração 32

µg mL

-1

, da qual foram preparadas soluções de trabalho para a curva analítica e

ensaios de recuperação com concentrações entre 0,08 – 10 µg mL

-1

5.4 – Equipamentos

Balança analítica (Sartorius TE214S) (Figura 6), liofilizador L101 da marca

LIOTOP) (Figura 7), sistema para SPE Vacuum Manifold (Varian, Walnut Creck,

CA, EUA) (Figura 8), evaporador rotatório (Fisatom 802D) (Figura 9), lavadora

ultra-sonica (Unique) (Figura 10), cromatógrafo líquido de alta eficiência com

detector espectrofotométrico com arranjo de fotodiodos Shimadzu (Quioto,

Japão) modelo Prominence (Figura11) e sistema de ultrapurificação de água

Milli-Q (Figura 12).

Figura 6: Balança analítica (Sartorius TE214S).

Figura 7: Liofilizador L101 da marca LIOTOP.

Figura 8: Sistema para SPE Vacuum Manifold (Varian, Walnut Creck, CA, EUA).

Figura 9: Evaporador rotatório (Fisatom 802D).

Figura 10: Lavadora ultra-sonica (Unique).

Figura 11: Cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector espectrofotométrico com arranjo

de fotodiodos Shimadzu (Quioto, Japão) modelo Prominence.

Figura 12: Sistema de ultrapurificação de água Milli-Q.

5.5 – Preparação da amostra de fruta

5.5.1 – Preparação da amostra de açaí

5.5.1.1 - Fruto

A amostra de açaí foi adquirida em uma fazenda na região do sul do

estado da Bahia, em fevereiro de 2009. Os frutos foram colocados em um

recipiente tipo bandeja e adicionou-se 200 mL de água destilada, deixando em

repouso por 5 horas, como se observa na Figura 13.

Figura 13: Preparação da amostra do fruto açaí.

A amostra foi processada com o auxílio de liquidificador. Após o

processamento, a polpa e casca foram separadas manualmente das sementes,

como se observa na Figura 14. Após a separação, a polpa e a casca foram

processadas com auxílio de um mixer para completa homogeneização.

Figura 14: Procedimento manual para separação da polpa e casca das sementes de açaí.

A amostra de polpa de açaí foi transferida para um frasco com tampa

rosqueável, etiquetado e armazenado sob refrigeração.

5.5.1.2 - Polpa de açaí

A amostra comercial de polpa de açaí foi obtida em supermercado da

cidade de Estância-SE na forma de polpa integral congelada. Foi retirada da

embalagem original e transferida para um frasco com tampa rosqueável,

rotulado e armazenado sob refrigeração a -18 °C.

5.5.1.3 - Polpa de açaí liofilizada

A polpa comercial de açaí foi liofilizada e transferida para um frasco com

tampa rosqueável, rotulado e armazenado sob refrigeração.

5.5.2 – Preparação da amostra de cupuaçu

5.5.2.1 - Fruto

A amostra de cupuaçu foi adquirida na região do estado da Bahia em

2009 (Figura 15).

Figura 15: Amostra de cupuaçu da região da Bahia.

O fruto foi aberto, manualmente retirou-se a polpa das sementes com o

auxílio de uma colher de aço inoxidável. A polpa foi processada com o mixer

para a completa homogeneização. A amostra foi acondicionada em um frasco

com tampa rosqueável, rotulado e armazenado sob refrigeração (Figura 16).

Figura 16: Etapas da preparação da amostra de cupuaçu.

5.6 – Condições cromatográficas de análise

As condições de análise foram otimizadas em um cromatógrafo líquido

modelo Prominence da marca Shimadzu composto por um desgaseificador

DGU-20A

, duas bombas LC-6AD, um módulo de comunicação CBM-20A, um

auto injetor SIL-20A e um detector espectrofotométrico com arranjo de diodos

SPD-M20A com coluna Sinergi 4u polar - RP 80A (250mm X 4,6 mm X 4µm) da

marca Phenomenex.

A fase móvel foi composta por gradiente binário acetonitrila:água,

programação do gradiente de eluição na Tabela 8 e vazão de 0,8 mL min

-1

. O

tempo de corrida de 60 min e injeção de 20 µL (extrato). Os dados foram

tratados com o Software LCSolution e o comprimento de onda selecionado para

o estudo foi de 210 nm.

Tabela 8: Programação do gradiente binário de eluição em HPLC-UV/DAD.

Tempo (min)

Porcentagem

de ACN

na fase móvel (%)

0,01

,00

5.7 – Métodos de extração

5.7.1 – Método de extração de pesticidas de açaí e cupuaçu por MSPD

ma amostra de açaí

Em seguida,

a amostra

adicionado (3,0

g de alumina

o homogeneizado foi tran

silanizada

(base de sustentação)

pesticidas foi feita com 20 mL de uma mistura dos solventes

de etila (1:1, v/v)

com fluxo de 1 mL

evaporador rotatório (80 rpm; 4

resíduo foi retomado

filtrado

em membrana, antes da anális

foi analisada por HPLC

de pesticidas de açaí e cupuaçu.

Figura 17

: Fluxograma do método de extração

ma amostra de açaí

ou cupuaçu foi pesada (1

,0 g) em vidro de relógio.

a amostra

foi transferida para o almofariz.

g de alumina

neutra) e homogeneizou-se por 2

min.

o homogeneizado foi tran

ferido para uma coluna contend

(base de sustentação)

e sul

fato de sódio anidro (1,0 g).

pesticidas foi feita com 20 mL de uma mistura dos solventes

ciclohexano

com fluxo de 1 mL

min

-1

. O

extrato foi concentrado em

evaporador rotatório (80 rpm; 4

0°C) até 1 mL e seco

em fluxo suave de N

acetonitrila, levando para banho ultras

sônico por 1 min,

em membrana, antes da anális

e cromatográfica

. Uma alíquota de 20 µL

foi analisada por HPLC

-UV/DAD.

A Figura 17 apresenta as etapas de extração

de pesticidas de açaí e cupuaçu.

: Fluxograma do método de extração

de pesticidas de

açaí e cupuaçu

,0 g) em vidro de relógio.

adsorvente foi

min.

Em seguida,

ferido para uma coluna contend

o lã de vidro

fato de sódio anidro (1,0 g).

A eluição dos

ciclohexano

:acetato

extrato foi concentrado em

em fluxo suave de N

. O

sônico por 1 min,

. Uma alíquota de 20 µL

A Figura 17 apresenta as etapas de extração

açaí e cupuaçu

por MSPD.

5.8 - Limpeza da vidraria

A vidraria foi enxaguada em água corrente por três vezes, deixando em

solução de Extran 2% por 24 horas, novo enxágüe em água corrente por três

vezes, lavado com água destilada e, em seguida, com acetona, secando em

estufa ou a temperatura ambiente, sendo guardado com as extremidades

cobertas com papel filme ou laminado.

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 - Seleção dos pesticidas para o estudo

Apesar de não existir pesticida registrado no Ministério da Agricultura para

uso nas culturas de açaí e cupuaçu, faz-se o uso destes nestas culturas. Os

critérios para seleção dos pesticidas para o estudo foram: 1) pesquisa de campo

(informação de uso por serem indicados para culturas semelhantes) e 2)

indicação de que estes pesticidas são promissores para uso nestas culturas.

6.2 – Otimização das condições cromatográficas

Uma solução padrão de concentração 8 µg mL

-1

com os pesticidas

bromuconazol, cresoxim-metílico, fenbuconazol, parationa-metílica e

teflubenzuron em acetonitrila foi utilizada para obtenção do gradiente de eluição

inicial (proporção dos solventes da fase móvel)

. Inicialmente foi testado como

fase móvel metanol:água (modo gradiente binário), utilizando uma coluna de

fase C

Microsorb-MV 100 (250 mm X 4,6 mm X 5 µm) da Varian e outra de

fase Sinergi 4u polar - RP 80A (250mm X 4,6 mm X 4 µm) da Phenomenex. Foi

observado, para ambas as colunas, linha de base não estável no comprimento

de onda de maior absorção dos pesticidas, pois o solvente metanol absorve no

UV nessa faixa (210 nm).

Em seguida, foi testado a fase móvel acetonitrila:água com a coluna de

fase C

Microsorb-MV 100 (250 mm X 4,6 mm X 5 µm) da Varian e com a

Sinergi 4u polar - RP 80A (250mm X 4,6 mm X 4 µm) da Phenomenex, obtendo-

se uma linha de base estável, com picos definidos para os pesticidas. Com a

Informações obtidas em diálogos telefônicos com pesquisadores da EMBRAPA.

Realiza-se uma corrida cromatográfica variando a porcentagem do solvente B (metanol ou

acetonitrila) de 5 a 100 % em 60 min, com vazão de 1 mL min

-1

, aplicando-se um calculo de

regra de três simples, estima-se o tempo de retenção dos analitos presentes.

coluna Sinergi 4u polar - RP 80A (250mm X 4,6 mm X 4 µm) da Phenomenex

obtiveram-se cromatogramas melhor definidos e valores de áreas dos picos

mais significativos do que a fase C

Microsorb-MV 100 (250 mm X 4,6 mm X 5

µm) da Varian. Após a seleção da fase móvel e coluna, foram realizados alguns

ajustes no gradiente de eluição para uma melhor separação dos picos que

estavam próximos como o par fenbuconazol e a parationa-metílica, e o par

cresoxim-metílico e o teflubenzuron. Na Figura 18, observa-se o cromatograma

da solução padrão dos pesticidas bromuconazol, cresoxim-metílico,

fenbuconazol, parationa-metílica e teflubenzuron em solvente acetonitrila (8 µg

-1

) nas condições otimizadas de análise.

Figura 18: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão dos pesticidas em

solvente acetonitrila (8 µg mL

-1

) nas condições otimizadas, sendo: 1) bromuconazol; 2)

fenbuconazol; 3) parationa-metílica; 4) cresoxim-metílico e 5) teflubenzuron. Para condições

cromatográficas de análise, ver item 5.6.

Foram efetuadas injeções individuais das soluções padrões dos analitos

para identificação dos seus tempos de retenção (t

) (Tabela 9) e obtenção dos

seus respectivos espectros nas condições otimizadas de análise (Figuras 19 a

23).

Tabela 9: Tempos de retenção dos pesticidas estudados nas condições cromatográficas

otimizadas.

Pesticidas

Tempo de retenção (

)

(min)

Bromuconazol

19,7

Fenbuconazol

21,9

Parationa

metílica

22,0

Cresoxim

metílico

27,1

Teflubenzuron

30,5

Figura 19: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão de bromuconazol em

solvente acetonitrila (8 µg mL

-1

) com seu espectro de UV.

Figura 20: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão de fenbuconazol em

solvente acetonitrila (8µg mL

-1

) com seu espectro de UV.

Figura 21: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão de parationa-metílica em

solvente acetonitrila (8 µg mL

-1

) com seu espectro de UV.

Figura 22: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão de cresoxim-metílico em

solvente acetonitrila (8 µg mL

-1

) com seu espectro de UV.

Figura 23: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da solução padrão de teflubenzuron em

solvente acetonitrila (8 µg mL

-1

) com seu espectro de UV.

Os picos cromatográficos referentes aos pesticidas foram identificados

por meio do tempo de retenção e do espectro de UV. O pesticida bromuconazol

é uma mistura de dois isômeros, apresentando em seu cromatograma dois

picos, sendo escolhido para a análise aquele que apresentou a maior área.

6.3 – Ensaios para otimização da extração por MSPD

A eficiência da extração dos pesticidas foi analisada em termos de

recuperação, calculada comparando-se as áreas dos picos de cada composto

com aquela obtida da solução padrão preparada no extrato da matriz, de forma a

minimizar os erros gerados pelo efeito matriz, bastante acentuado em matrizes

complexas tais como as frutas (BEZERRA, 2009). Esse efeito é devido a uma

transferência dos componentes da matriz para o extrato durante o processo de

extração dos analitos de interesse, os quais podem co-eluir junto ou muito

próximo ao tempo de retenção dos pesticidas diminuindo ou aumentando a área

do mesmo (MENKISSOGLU-SPIROUDI et al., 2004).

6.3.1 – Ensaios para otimização da extração de pesticidas da matriz açaí por

MSPD

Os ensaios iniciais foram realizados utilizando a amostra do fruto de açaí.

Inicialmente foram realizados ensaios para a escolha da proporção

adequada da amostra:suporte sólido, sendo realizados com sílica, alumina

neutra, C

e Florisil

em diversas proporções (1:1; 1:2; 1:3; e 2:5 (m/m)), e

eluindo com 20 mL dos seguintes solventes: acetato de etila, diclorometano e

ciclohexano. Os extratos obtidos foram analisados nas condições

cromatográficas otimizadas, ver item 5.6.

De maneira qualitativa, baseando-se no aspecto de homogeneização da

amostra:suporte sólido e nos cromatogramas branco dos extrato, os melhores

resultados indicaram a alumina neutra e o Florisil na proporção 2:5 (m/m) da

amostra:suporte sólido.

O Florisil é um sorbente com características polares, que é utilizado na

limpeza de matrizes lipofílicas devido a sua facilidade em reter lipídios

(DOPICO-GARCIA et al., 2007; SILVA et al., 2008; CAPRIOTTI et al., 2010). A

alumina neutra é um sorvente anfótero, ou seja, pode interagir com pesticidas de

diversas classes químicas facilitando a extração (LANÇAS, 2004).

Os ensaios que seguem foram realizados em duplicata (n=2). As

amostras foram fortificadas no nível de concentração de 2 µg g

-1

Foram realizados ensaios com amostra fortificada de açaí, utilizando os

adsorventes alumina neutra e Florisil, variando-se o uso de MgSO

(0,5 g) na

homogeneização da amostra:suporte sólido, além de um adsorvente auxiliar na

coluna, 1,0 g de Florisil, objetivando a limpeza do extrato de açaí. Os valores

das recuperações estão apresentados nas Figuras 24 e 25.

Os suportes sólidos sílica, Florisil, alumina neutra e C

não sofreram tratamento para a

utilização nos ensaios de otimização por MSPD.

Figura 24

: Eficiência na recuperação

suporte sólido, variando

o uso de MgSO

adsorvente auxiliar

na coluna

Figura 25:

Eficiência na recuperação

sólido, variando

o uso de MgSO

auxilia

r na coluna e eluição com 2

Bromuconazol

Fenbuconazol

alumina neutra

alumina neutra/adsorvente auxiliar: Florisil

alumina neutra:MgSO4

alumina neutra:MgSO4/Adsorvente auxiliar: Florisil

140

Bromuconazol

Fenbuconazol

: Eficiência na recuperação

(%) dos pesticidas de acaí utilizando

o uso de MgSO

na homogeneização amostra:

na coluna

e eluição com 20 mL de acetato de etila.

Eficiência na recuperação

(%) dos pesticidas de acaí utilizando

Florisil

o uso de MgSO

na homogeneização amostra:s

uporte sólido e a

r na coluna e eluição com 2

0 mL de acetato de etila.

150

Fenbuconazol

Parationa

metílica

Cresoxim

metílico

alumina neutra

alumina neutra/adsorvente auxiliar: Florisil

alumina neutra:MgSO4

alumina neutra:MgSO4/Adsorvente auxiliar: Florisil

248

303

558

138

Fenbuconazol

Parationa

metílica

Cresoxim

metílico

Florisil

Florisil/adsorvente auxiliar: Florisil

Florisil:MgSO4

Florisil:MgSO4/Adsorvente auxiliar: Florisil

lumina neutra como

na homogeneização amostra:

suporte sólido e

Florisil

como suporte

uporte sólido e a

dsorvente

340

420

Teflubenzuron

303

Teflubenzuron

Observou-se

que alumina

adequados do que F

lorisil. O

proporção 2:5, m/m.

Após a seleção do

para

a escolha do solvente de eluição.

Observou-

se que

aceitáveis. Partindo-

se desta observação testou

solvente, acetato de etila:DCM, na proporção 1:1, v/v

etila:ciclohexano,

na proporção 1:1, v/v.

Figura 26

: Eficiência na recuperação

suporte sólido, variando a utilização de adsorvente

etila:diclorometano

na proporção 1:1, v/v.

Bromuconazol

Fenbuconazol

alumina neutra

alumina neutra/adsorvente auxiliar: Florisil

alumina neutra:MgSO4/adsorvente auxiliar: Florisil

alumina neutra:MgSO4

que alumina

neutra apresentou

valores de recuperação

lorisil. O

suporte sólido escolhido foi

alumina

Após a seleção do

suporte sólido,

foram

a escolha do solvente de eluição.

se que

com o solvente acetato de etila, a

s recuperações foram

se desta observação testou

se inicialmente

solvente, acetato de etila:DCM, na proporção 1:1, v/v

na proporção 1:1, v/v.

: Eficiência na recuperação

(%) dos pesticidas de açaí,

utilizando alumina

suporte sólido, variando a utilização de adsorvente

auxiliar

e eluição com 20 mL de

na proporção 1:1, v/v.

254

Fenbuconazol

Parationa

metílica

Cresoxim

metílico

alumina neutra

alumina neutra/adsorvente auxiliar: Florisil

alumina neutra:MgSO4/adsorvente auxiliar: Florisil

alumina neutra:MgSO4

valores de recuperação

mais

alumina

neutra na

foram

realizados testes

s recuperações foram

se inicialmente

a mistura de

e acetato de

utilizando alumina

neutra como

e eluição com 20 mL de

acetato de

254

Teflubenzuron

Figura 27

: Eficiência na recuperação

suporte sólido, variando a utilização de adsorvente auxiliar e eluição com 20 mL de

etila:ciclohexano

na proporção 1:1, v/v.

Nos resultados apresentados nas

utilizaçã

o de um adsorvente auxiliar

homogeneização

, não melhorou

testados. Para o

pesticida teflubenzuron o uso do adsorvente auxiliar na coluna

(Florisil)

reduz o efeito matriz, mas não significativamente,

os valores de recuperação dos outros pesticidas.

De maneira g

eral,

pesticidas estudados, com exceção do teflubenzuron (efeito matriz),

sistema alumina

neutra

(DCM)

ou acetato de etila:ciclohexano

Faz-

se necessário a utilização de uma etapa de limpeza

o efeito matriz no

teflubenzuron. Foi

28 apresenta

os valores de recuperação destes ensaios.

Bromuconazol

Fenbuconazol

alumina neutra

alumina neutra/adsorvente auxiliar: Florisil

alumina neutra:MgSO4

alumina neutra:MgSO4/adsorvente auxiliar: Florisil

: Eficiência na recuperação

(%) dos pesticidas de

açaí utilizando alumina

suporte sólido, variando a utilização de adsorvente auxiliar e eluição com 20 mL de

na proporção 1:1, v/v.

Nos resultados apresentados nas

Figuras 26 e 27,

percebe

o de um adsorvente auxiliar

(Florisil)

, e o uso do MgSO

, não melhorou

os resultados de recuperação

para

pesticida teflubenzuron o uso do adsorvente auxiliar na coluna

reduz o efeito matriz, mas não significativamente,

e ainda

os valores de recuperação dos outros pesticidas.

eral,

uma recuperação adequada foi

verificada

pesticidas estudados, com exceção do teflubenzuron (efeito matriz),

neutra

e eluição com 20 mL de acetato de etila:

ou acetato de etila:ciclohexano

se necessário a utilização de uma etapa de limpeza

teflubenzuron. Foi

testado o uso de

carvão ativado

os valores de recuperação destes ensaios.

301

Fenbuconazol

Parationa

metílica

Cresoxim

metílico

alumina neutra

alumina neutra/adsorvente auxiliar: Florisil

alumina neutra:MgSO4

alumina neutra:MgSO4/adsorvente auxiliar: Florisil

açaí utilizando alumina

neutra como

suporte sólido, variando a utilização de adsorvente auxiliar e eluição com 20 mL de

acetato de

percebe

u-se que a

, e o uso do MgSO

no processo de

para

os solventes

pesticida teflubenzuron o uso do adsorvente auxiliar na coluna

e ainda

compromete

verificada

para os

pesticidas estudados, com exceção do teflubenzuron (efeito matriz),

utilizando o

e eluição com 20 mL de acetato de etila:

diclorometano

a fim de reduzir

carvão ativado

. A Figura

301

200

130

140

Teflubenzuron

Figura 28: Eficiênci

a na recuperação

suporte sólido, variando o uso ou não de carvão ativado e o tipo de solvente de eluição.

Os ensaios evidencia

eliminou

o efeito matriz

Considerando que a

a etapa de validação do método,

da polpa de açaí

e da polpa de açaí liofilizada.

para comparar o fruto,

mostrados nas Figuras

100

123

Bromuconazol

Fenbuconazol

20 mL de acetonitrila

20 mL de acetonitrila/0,05g de carvão ativado

20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v

20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção 1:1, v/v

20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção de 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

a na recuperação

(%) dos pesticidas de açaí,

utilizando alumina

suporte sólido, variando o uso ou não de carvão ativado e o tipo de solvente de eluição.

Os ensaios evidencia

ram que o carvão ativado minimizou

o efeito matriz

sobre o teflubenzuron.

Considerando que a

amostra do fruto de açaí

terminou antes de executar

a etapa de validação do método,

para dar continuidade aos trabalhos,

e da polpa de açaí liofilizada.

Desta forma, fo

ram feitos ensaios

a polpa e a polpa liofilizada. O

s cromatogramas

29 a 31.

121

126

119

144

130

Fenbuconazol

Parationa

metílica

Cresoxim

metílico

20 mL de acetonitrila

20 mL de acetonitrila/0,05g de carvão ativado

20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v

20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção 1:1, v/v

20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção de 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

utilizando alumina

neutra como

suporte sólido, variando o uso ou não de carvão ativado e o tipo de solvente de eluição.

ram que o carvão ativado minimizou

(15%), mas não

terminou antes de executar

para dar continuidade aos trabalhos,

fez-se uso

ram feitos ensaios

s cromatogramas

estão

258

254

180

301

255

Teflubenzuron

20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção de 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

Figura 29: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da amostra controle do fruto de açaí. Para

as condições otimizadas, ver itens 5.6 e 5.7.1.

Figura 30: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da amostra controle da polpa comercial de

açaí. Para condições otimizadas, ver itens 5.6 e 5.7.1.

Figura 31: Cromatograma obtido por HPLC-UV/DAD da polpa comercial de açaí liofilizada. Para

condições otimizadas, ver itens 5.6 e 5.7.1.

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min

100

110

120

130

mAU

210nm,4nm (1.00)

98943

252752

126129

Comparativamente, o cromatograma da polpa comercial de açaí

apresenta mais compostos do que o fruto in natura.

adição de

conservantes,

de análise, com exceção dos

teflubenzuron

(tr = 30,5 min)

natura, e estão intensifi

cado

Nos testes com a polpa comercial de açaí, foi necessário aumentar a

proporção amostra:suporte sólido

para possibilitar uma

melhor homogeneização da amostra (polpa) com o suporte

sólido, pois a polpa

é menos

de água.

Comparado-se

os resultados obtidos da polpa

comercial

liofilizada de açaí, observou

Figuras 32 e 33.

Optou

etapa no processo.

Figura 32

: Eficiência na recuperação

como suporte sólido na p

acetato de etila:diclorometano

Bromuconazol

Fenbuconazol

Fruto/20 mL de acetato de etila:diclorometano, na proporção 1:1, v/v

Polpa comercial/20 mL de Acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v

Polpa comercial liofilizada/20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v

Comparativamente, o cromatograma da polpa comercial de açaí

apresenta mais compostos do que o fruto in natura.

Provavelmente,

conservantes,

mas esses compostos

não estão na região de inte

de análise, com exceção dos

componentes presentes na região do

(tr = 30,5 min)

, os quais foram previamente

observado

cado

s na polpa comercial.

Nos testes com a polpa comercial de açaí, foi necessário aumentar a

proporção amostra:suporte sólido

, que foi

de 2:5 (m/m) para 1:3

melhor homogeneização da amostra (polpa) com o suporte

é menos

consistente do que o fruto devido

os resultados obtidos da polpa

comercial

liofilizada de açaí, observou

-se

semelhança entre os resultados

Optou

-se pelo uso da polpa comercial

, pois s

: Eficiência na recuperação

(%) dos pesticidas de açaí,

utilizando a alumina

porção 1:3 (m/m), amostra:suporte sólido

e eluição

acetato de etila:diclorometano

na proporção 1:1, v/v.

Fenbuconazol

Parationa-metílica Cresoxim-metílico

Fruto/20 mL de acetato de etila:diclorometano, na proporção 1:1, v/v

Polpa comercial/20 mL de Acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v

Polpa comercial liofilizada/20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v

Comparativamente, o cromatograma da polpa comercial de açaí

Provavelmente,

devido a

não estão na região de inte

resse

componentes presentes na região do

observado

s no fruto in

Nos testes com a polpa comercial de açaí, foi necessário aumentar a

de 2:5 (m/m) para 1:3

(2:6) (m/m),

melhor homogeneização da amostra (polpa) com o suporte

maior presença

comercial

e da polpa

semelhança entre os resultados

, pois s

e diminui uma

utilizando a alumina

neutra

e eluição

com 20 mL de

254

790

324

Teflubenzuron

Polpa comercial/20 mL de Acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v

Polpa comercial liofilizada/20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v

Figura 33

: Eficiência na recuperação

como suporte sólido na

proporção

acetato de etila:ciclohexano

Ensaios para a escolha da quantida

houve alteração significativa quando se utilizou 15, 20 ou 25 mL de acetato de

etila:ciclohexano na

proporção de 1:1, v/v, ocorrendo apenas uma perda de

recuperação (20-30%)

com 15 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção

1:1, v/v.

Desta forma, após a otimização dos parâmetros de extração por MSPD,

processo de validação

(m/m) amostra:

suporte sólido,

eluição foi feita

com 20 mL de acetato de etila:ciclohexano

Bromuconazol

Fenbuconazol

Fruto/20 mL de acetato de etila:ciclohexano na porporção 1:1, v/v

Polpa comercial/20 mL de acetato de etila:cilcohexano na proporção 1:1, v/v

Polpa comercial liofilizada/20 mL de acetato de etila:cilcohexano na proporção de 1:1, v/v

: Eficiência na recuperação

(%) dos pesticidas de açaí,

utilizando a alumina

proporção

1:3 (m/m), amostra:suporte sólido

e eluição com 20 mL de

na proporção 1:1, v/v.

Ensaios para a escolha da quantida

de de solvente foram realizados.

houve alteração significativa quando se utilizou 15, 20 ou 25 mL de acetato de

proporção de 1:1, v/v, ocorrendo apenas uma perda de

com 15 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção

Desta forma, após a otimização dos parâmetros de extração por MSPD,

processo de validação

foi realizado com a polpa comercial na

proporção de 1:3

suporte sólido,

com 1,0

g de sulfato de sódio

com 20 mL de acetato de etila:ciclohexano

1:1, v/v.

Fenbuconazol

Parationa

metílica

Cresoxim

metílico

Fruto/20 mL de acetato de etila:ciclohexano na porporção 1:1, v/v

Polpa comercial/20 mL de acetato de etila:cilcohexano na proporção 1:1, v/v

Polpa comercial liofilizada/20 mL de acetato de etila:cilcohexano na proporção de 1:1, v/v

utilizando a alumina

neutra

e eluição com 20 mL de

de de solvente foram realizados.

Não

houve alteração significativa quando se utilizou 15, 20 ou 25 mL de acetato de

proporção de 1:1, v/v, ocorrendo apenas uma perda de

com 15 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção

Desta forma, após a otimização dos parâmetros de extração por MSPD,

proporção de 1:3

g de sulfato de sódio

na coluna e a

1:1, v/v.

301

547

468

Teflubenzuron

Polpa comercial/20 mL de acetato de etila:cilcohexano na proporção 1:1, v/v

Polpa comercial liofilizada/20 mL de acetato de etila:cilcohexano na proporção de 1:1, v/v

6.3.2 – Ensaios

para otimização da extração de pesticidas da matriz

por MSPD

Da mesma maneira que foi feita a escolha da proporção amostra:suporte

sólido para o amostra de açaí

cupuaçu

, sendo os melhores resultados qualitativos obtidos com a alumina

neutra e sílica,

na proporção 2:5 e 1:2,

Foram realizados

de concentração

de 2 µg g

variando-se

o uso de MgSO

sólido, além de um adsorvente auxiliar na coluna, 1,0

20 mL de acetato de etila

34 e 35.

Figura 34:

Eficiência na recuperação

como suporte sólido, variando

adsorvente auxilia

r na coluna e eluição com 20 mL de acetato

Bromuconazol

Fenbuconazol

alumina neutra

alumina neutra/adsorvente auxiliar: Florisil

alumina neutra:MgSO4

alumina neutra:MgSO4/adsorvente auxiliar: Florisil

para otimização da extração de pesticidas da matriz

Da mesma maneira que foi feita a escolha da proporção amostra:suporte

sólido para o amostra de açaí

, este processo também foi executado

, sendo os melhores resultados qualitativos obtidos com a alumina

na proporção 2:5 e 1:2,

m/m, respectivamente.

Foram realizados

ensaios com

a amostra de cupuaçu fortificada

de 2 µg g

-1

utilizando adsorvente alumina

o uso de MgSO

(0,5

g) na homogeneização da amostr

sólido, além de um adsorvente auxiliar na coluna, 1,0

g de Florisil

20 mL de acetato de etila

. Os valores de recuperação

se encontram nas

Eficiência na recuperação

(%) dos pesticidas de cupuaçu,

utilizando

como suporte sólido, variando

o uso de MgSO

na homogeneização amostra:suporte sólido e

r na coluna e eluição com 20 mL de acetato

de etila.

Fenbuconazol

Parationa

metílica

Cresoxim

metílico

alumina neutra

alumina neutra/adsorvente auxiliar: Florisil

alumina neutra:MgSO4

alumina neutra:MgSO4/adsorvente auxiliar: Florisil

para otimização da extração de pesticidas da matriz

cupuaçu

Da mesma maneira que foi feita a escolha da proporção amostra:suporte

, este processo também foi executado

para a de

, sendo os melhores resultados qualitativos obtidos com a alumina

a amostra de cupuaçu fortificada

no nível

utilizando adsorvente alumina

neutra e sílica,

g) na homogeneização da amostr

a:suporte

g de Florisil

, e eluição com

se encontram nas

Figuras

utilizando

alumina neutra

na homogeneização amostra:suporte sólido e

117

145

Teflubenzuron

Figura 35: Efi

ciência na recuperação

suporte sólido, variando

o uso de MgSO

adsorvente auxilia

r na coluna e eluição com 20 mL de acetato

Percebe-

se que

são obtidos em comparação a sílica.

desenvolver um úni

co método para as duas matrizes, açaí e cupuaçu, foram

realizados ensaios com os solventes acetato de etila:

etila:ciclohexano, nas porporções de 1:1, v/v, ambos

amostra:suporte sólido,

119

111

115

Bromuconazol

Fenbuconazol

ciência na recuperação

(%) dos pesticidas de cupuaçu,

utilizando

o uso de MgSO

na homogeneização amostra:suporte sólido e

r na coluna e eluição com 20 mL de acetato

de etila.

se que

com alumina

neutra melhores valores de recuperação

são obtidos em comparação a sílica.

Considerando a intenção de se

co método para as duas matrizes, açaí e cupuaçu, foram

realizados ensaios com os solventes acetato de etila:

diclorometano

etila:ciclohexano, nas porporções de 1:1, v/v, ambos

, utilizando a proporção 1:3

amostra:suporte sólido,

Figura 36.

Fenbuconazol

Parationa-metílica Cresoxim-metílico

sílica

sílica/adsorvente auxiliar: Florisil

sílica:MgSO4

sílica:MgSO4/adsorvente auxiliar: Florisil

utilizando

sílica como

na homogeneização amostra:suporte sólido e

neutra melhores valores de recuperação

Considerando a intenção de se

co método para as duas matrizes, açaí e cupuaçu, foram

diclorometano

e acetato de

, utilizando a proporção 1:3

120

Teflubenzuron

Figura 36

: Eficiência na recuperação

como suporte sólido na

proporção

carvão ativado.

Assim, ao comparamos os resultados obtidos nas duas matrizes

melhores resultados

amostra:suporte sólido

acetato de etila:ciclohexano na proporção

6.4 -

Validação do método analítico

6.4.1 - Linearidade

faixa linear de cada analito foi determinada usando o método de

regressão linear, o

btendo

determinação (r

183

Bromuconazol

Fenbuconazol

20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v

20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção 1:1, v/v

20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção de 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

: Eficiência na recuperação

(%) dos pesticidas de

cupuaçu utilizando a alumina

proporção

1:3 (m/m), amostra:suporte sólido

, com o uso ou não de

Assim, ao comparamos os resultados obtidos nas duas matrizes

melhores resultados

foram com a utilização da

proporção

amostra:suporte sólido

do adsorvente alumina neutra e eluiçã

o com 20 mL de

acetato de etila:ciclohexano na proporção

, 1:1, v/v.

Validação do método analítico

faixa linear de cada analito foi determinada usando o método de

btendo

-se os respectivos

coeficientes de correlação (r) e

Fenbuconazol

Parationa

metílica

Cresoxim

metílico

20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v

20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção 1:1, v/v

20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção de 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

cupuaçu utilizando a alumina

neutra

, com o uso ou não de

Assim, ao comparamos os resultados obtidos nas duas matrizes

, os

proporção

1:3 (m/m)

o com 20 mL de

faixa linear de cada analito foi determinada usando o método de

coeficientes de correlação (r) e

285

260

320

335

Teflubenzuron

20 mL de acetato de etila:diclorometano na proporção 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção de 1:1, v/v /0,05 g de carvão ativado

Para a matriz de açaí, as faixas de trabalho estiveram compreendidas

entre 0,08 a 10 µg mL

-1

por HPLC-UV/DAD e preparados tanto em solvente

acetonitrila como na matriz açaí. As Tabelas 10 e 11 apresentam os valores dos

coeficientes de correlação e as equações de regressão linear dos pesticidas por

HPLC-UV/DAD em solvente acetonitrila e na matriz, respectivamente. As

Figuras 37 a 39 demonstram as curvas analíticas para cada pesticida estudado

em solvente acetonitrila, e as figuras 40 a 42, na matriz açaí.

Tabela 10: Valores dos coeficientes de correlação e equação da reta para os pesticidas em

solvente acetonitrila e analisados por HPLC-UV/DAD.

Pesticidas

Linearidade

(µg mL

-1

)

Coeficiente de

correlação (r)

Equação da reta

Bromuconazol 0,08-10 0,999 y = 107465x + 9182,7

Fenbuconazol 0,08-10 0,999 y = 140312x - 1444,7

Parationa-metílica 0,08-10 0,999 y = 43161x + 4230,5

Cresoxim-metílico 0,08-10 0,999 y = 53675x + 3658,2

Teflubenzuron 0,08-10 0,997 y = 89427x + 8803,4

Tabela 11: Valores dos coeficientes de correlação e equação da reta para os pesticidas

preparados no extrato da matriz açaí e analisados por HPLC-UV/DAD.

Pesticidas

Linearidade (µg

-1

)

Coeficiente de

correlação (r)

Equação da reta

Bromuconazol 0,08-10 0,998 y = 103903x + 13965

Fenbuconazol 0,08-10 0,999 y = 135508x + 4453,7

Parationa-metílica 0,08-10 0,999 y = 41969x + 4277

Cresoxim

metílico

0,08

0,999

y = 52127x + 4010,7

Teflubenzuron 0,1-10 0,999 y = 79736x + 1956,8

(a)

(b)

Figura 37: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analizados por HPLC-UV/DAD: (a)

bromuconazol e (b) fenbuconazol.

y = 107465x + 9182, 7

R² = 0,998

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade bromuconazol

y = 140312x - 1444,7

R² = 0,999

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade fenbuconazol

(a)

(b)

Figura 38: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-UV/DAD: (a)

parationa-metílica e (b) cresoxim-metílico.

y = 43161x + 4230,5

R² = 0,998

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade parationa metílica

y = 53675x + 3658,2

R² = 0,999

100000

200000

300000

400000

500000

600000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade cresoxim-metílico

(a)

Figura 39: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-UV/DAD: (a)

teflubenzuron

(a)

Figura 40: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato da

matriz açaí e analisados por HPLC-UV/DAD: (a) bromuconazol.

y = 89427x + 8803,4

R² = 0,994

200000

400000

600000

800000

1000000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade teflubenzuron

y = 103903x + 13965

R² = 0,998

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade bromuconazol

(a)

(b)

Figura 41: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato da

matriz açaí e analisados por HPLC-UV/DAD: (a) fenbuconazol e (b) parationa-metílica.

y = 135508x + 4453,7

R² = 0,999

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade fenbuconazol

y = 41969x + 4277

R² = 0,997

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade parationa metílica

(a)

(b)

Figura 42: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato da

matriz açaí e analisados por HPLC-UV-DAD: (a) cresoxim-metílico e (b) teflubenzuron.

y = 52127x + 4010,7

R² = 0,999

100000

200000

300000

400000

500000

600000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade cresoxim-metílico

y = 79736x + 1956,8

R² = 0,998

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade teflubenzuron

Para a matriz cupuaçu, as faixas de trabalho tiveram valores entre 0,2 a 6

µg mL

-1

por HPLC-UV/DAD e preparados tanto em solvente como na matriz

cupuaçu. As Tabelas 12 e 13 apresentam os valores dos coeficientes de

correlação e as equações de regressão linear dos pesticida por HPLC-UV/DAD

em solvente acetonitrila e no extrato da matriz cupuaçu, respectivamente. As

Figuras 43 a 45 demonstram as curvas analíticas para cada pesticida estudado

em solvente acetonitrila, e as Figuras 46 a 48, no extrato da matriz cupuaçu.

Tabela 12: Valores dos coeficientes de correlação e equação da reta para os pesticidas em

solvente acetonitrila e analisados por HPLC-UV/DAD.

Pesticidas

Linearidade

(µg mL

-1

)

Coeficiente de

correlação (r)

Equação da reta

Bromuconazol 0,2-6 0,998 y = 110764x + 7787,9

Fenbuconazol 0,2-6 0,998 y = 139782x - 188,6

Parationa-metílica 0,2-6 0,999 y = 44703x - 3571,3

Cresoxim-metílico 0,2-6 0,999 y = 54886x + 3108,0

Teflubenzuron 0,2-6 0,999 y = 89594x + 3451,9

Tabela 13: Valores dos coeficientes de correlação e equação da reta para os pesticidas

preparados no extrato da matriz cupuaçu e analisados por HPLC-UV/DAD.

Pesticidas

Linearidade

(µg mL

-1

)

Coeficiente de

correlação (r)

Equação da reta

Bromuconazol 0,2-6 0,999 y = 99708x + 1104,7

Fenbuconazol 0,2-6 0,999 y = 118932x - 3875,7

Parationa-metílica 0,2-6 0,999 y = 40433x + 177,2

Cresoxim

metílico

0,2

0,999

y = 48546x + 1023,

Teflubenzuron 0,2-6 0,999 y = 69501x + 1640,8

(a)

(b)

Figura 43: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-UV/DAD: (a)

bromuconazol e (b) fenbuconazol.

y = 110764x + 7787,9

R² = 0,997

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade bromuconazol

y = 139782x - 188,64

R² = 0,999

-100000

100000

300000

500000

700000

900000

1100000

1300000

1500000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade fenbuconazol

(a)

(b)

Figura 44: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-UV/DAD: (a)

parationa-metílica e (b) cresoxim-metílico.

y = 44703x + 3571,3

R² = 0,996

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade parationa metílica

y = 54886x + 3108

R² = 0,998

100000

200000

300000

400000

500000

600000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade cresoxim-metílico

(a)

Figura 45: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-UV/DAD: (a)

teflubenzuron

(a)

Figura 46: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato da

matriz cupuaçu: (a) bromuconazol.

y = 89594x + 3451,9

R² = 0,999

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade teflubenzuron

y = 99708x + 1104,7

R² = 1

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade bromuconazol

(a)

(b)

Figura 47: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato da

matriz cupuaçu: (a) fenbuconazol e (b) parationa-metílica.

y = 118932x - 3875,7

R² = 0,999

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade fenbuconazol

y = 40433x + 177,2

R² = 0,999

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade parationa metílica

(a)

(b)

Figura 48: Curvas analíticas por regressão linear para os pesticidas preparados no extrato da

matriz cupuaçu: (a) cresoxim-metílico e (b) teflubenzuron.

y = 48546x + 1023,5

R² = 0,999

100000

200000

300000

400000

500000

600000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade cresoxim-metílico

y = 69501x - 1640,8

R² = 0,998

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 2 4 6 8 10 12

Área

C(µg mL

-1

)

Linearidade teflubenzuron

6.4.2 - Seletividade

Para a matriz açaí, o método foi seletivo para os pesticidas

bromuconazol, fenbuconazol, parationa-metílica e cresoxim-metílico, pois não há

picos interferentes nessa região, porém para o pesticida teflubenzuron houve co-

eluição de componentes da matriz como observado na Figura 49.

(a)

(b)

(c)

Figura 49: Cromatogramas por obtidos no HPLC-UV/DAD da amostra testemunha de açaí (a), da

solução padrão dos pesticidas 2 µg mL

-1

no extrato da matriz (b), do processo de extração no

nível de fortificação de 2 µg mL

-1

(c), sendo: 1) bromuconazol, 2) fenbuconazol, 3) parationa-

metílica, 4) cresoxim-metílico, 5) teflubenzuron e I) interferentes da matriz. Para condições

cromatográficas ver item 5.6.

Para a matriz cupuaçu, o método foi seletivo para os pesticidas

fenbuconazol, parationa-metílica e cresoxim-metílico, pois não há picos

interferentes nessa região, porém para os pesticidas bromuconazol e

teflubenzuron houve co-eluição de componentes da matriz como mostra a Figura

50.

(a)

(b)

(c)

Figura 50: Cromatogramas obtidos por HPLC-UV/DAD da amostra testemunha de cupuaçu(a),

da solução padrão dos pesticidas 2 µg mL

-1

no extrato da matriz cupuaçu (b), do processo de

extração no nível de fortificação de 2 µg mL

-1

(c), sendo: 1) bromuconazol, 2) fenbuconazol, 3)

parationa-metílica, 4) cresoxim-metílico, 5) teflubenzuron e I) interferentes da matriz de cupuaçu.

Para condições cromatográficas ver item 5.6.

6.4.3 - Precisão

No presente estudo, na matriz de açaí, o coeficiente de variação dos

pesticidas para os cálculos de recuperação variaram de 1,4 a 20,0 %, valores

aceitáveis para matriz complexa, exceção para o pesticida teflubenzuron que

tiveram valores acima dos aceitáveis para as análises realizadas em HPLC-

UV/DAD (Tabela 14).

6.4.4 - Exatidão

Para essa figura de mérito a avaliação do método desenvolvido foi

realizada por meio de ensaios de fortificação de amostras testemunhas de açaí

em três níveis de concentração (1,0; 2,0 e 6,0 µg mL

-1

), em triplicata, para cada

nível.

Para a matriz açaí, os valores de recuperação foram satisfatórios para os

níveis de fortificação estudados, com exceção do pesticida teflubenzuron que

para os níveis 1 e 2 µg mL

-1

, obteve valores altos de recuperação, 324 e 547 %,

respectivamente, evidenciando o efeito matriz. Esse efeito foi minimizado com o

aumento da concentração, observando-se que no nível de 6 µg mL

-1

o valor de

recuperação foi de 108 %. O efeito matriz pode variar de acordo com a

concentração do analito na matriz (HAJSLOVÁ et al., 1998; LEHOTAY, 2000),

percebe-se no caso do teflubenzuron, que com o aumento na concentração do

analito o efeito matriz não foi significativo.

Tabela 14: Valores de recuperação média e coeficiente de variação dos pesticidas em matriz

açaí por MSPD e HPLC-UV/DAD.

Pesticida

Nível de fortificação

(µg mL

-1

)

Recuperação

média (%)

RSD (%)

Bromuconazol

1 119 17,3

2 70 14,4

6 68 6,4

Fenbuconazol

1 66 20,0

2 69 1,4

6 70 2,6

Parationa-metílica

1 95 8,4

2 68 4,9

6 70 4,3

Cresoxim-metílico

1 57 7,5

2 70 15,1

6 65 3,8

Teflubenzuron

1 324 25,3

2 547 23,7

6 108 7,1

6.3.5 - Limite de Detecção

O limite de detecção pode ser calculado através do desvio padrão

amostral do menor nível de concentração obtido na curva analítica (7 replicatas).

Neste caso, não foi possível calcular pelo menor nível, sendo calculado pelo

nível intermediário, o mesmo para o limite de quantificação. Os valores dos

limites de detecção do método para a matriz açaí se encontram na Tabela 15.

Tabela 15: Limite de detecção dos pesticidas utilizando MSPD e HPLC-UV/DAD para a matriz

açaí.

Pesticidas

LD (µg

) do método para a matriz açaí

Bromuconazol

0,9

Fenbuconazol

0,6

Parationa

metílica

0,1

Cresoxim

metílico

0,1

6.4.6 - Limite de quantificação

A literatura registra alguns trabalhos, como o método desenvolvido por

MALDANER et al., 2008 para a determinação de 6 pesticidas (imazethapyr,

imazaquin, metsulfuron-Me, carboxin, chlorimuron-Et, e tebuconazol) em soja

utilizando MSPD e HPLC-DAD com limite de quantificação na faixa de 0,04 a

0,08 µg g

-1

, também, WANG et al.,2007, desenvolveram um método para

determinação de resíduos de fungicidas (um dos fungicidas o cresoxim-metílico

em maçã, laranja, banana, alface, uva e tomate utilizando MSPD e HPLC/ESI-

MS-MS com um limite de quantificação de 0,004 a 0,1

µg g

-1

, (CAPRIOTTI et

al., 2010). Percebe-se que ao limites de quantificação obtidos pelo método, 0,4-

2,1 µg g

-1

para a matriz açaí se encontram acima dos valores encontrados na

literatura, mas evidencia-se que essa comparação é superficial pelo fato de

serem matrizes diferentes, apesar de complexas, e utilizando diferentes

proporções amostra:suporte sólido e solvente de eluição. Além disso, o método

de análise no trabalho desenvolvido por WANG et al., 2007 foi a cromatografia

líquida acoplada a espectometria de massas, que é mais seletivo do que o UV-

DAD. Na Tabela 16 estão apresentados os valores dos limites de quantificação

(LQ) dos pesticidas utilizando MSPD e HPLC-UV/DAD para a matriz açaí.

Tabela 16: Limite de quantificação dos pesticidas utilizando MSPD e HPLC-UV/DAD para a

matriz açaí.

Pesticidas

LQ (µg

) do método para a matriz

açaí

Bromuconazol

2,1

Fenbuconazol

1,7

Parationa

metílica

0,4

Cresoxim

metílico

0,6

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O procedimento analítico por MSPD envolvendo a homogeneização da

amostra (1,0 g) em suporte sólido alumina (3,0 g), sem etapa de limpeza (clean-

up) e eluição com 20 mL de acetato de etila:ciclohexano na proporção 1:1, v/v foi

desenvolvido para extração dos pesticidas bromuconazol, fenbuconazol,

parationa-metílica e cresoxim-metílico para as matrizes açaí e cupuaçu,

obtendo-se valores aceitáveis de recuperação pela utilização da técnica de

HPLC-UV/DAD.

Na validação do método desenvolvido foram avaliadas as figuras de

mérito: linearidade, exatidão e precisão, limites de quantificação e detecção. O

método teve uma faixa maior de linearidade na matriz açaí em relação a matriz

cupuaçu, com coeficientes de correlação variando entre 0,998-0,999 na faixa de

concentração 0,08-10 µg mL

-1

para a matriz açaí; e coeficientes de correlação

0,999 na faixa de concentração 0,2-6 µg mL

-1

, para a matriz cupuaçu.

Na matriz açaí, para os pesticidas bromuconazol, fenbuconazol,

parationa-metílico e cresoxim-metílico os valores estão na faixa 57-119 %,

dentro da faixa aceitável descrita na literatura para a análise de resíduos de

pesticidas em amostras complexas (50-120 %) e em concordância com os

valores de coeficientes de variação, na faixa de 1,4-20 % (menores que 20 %).

Os limites de detecção e quantificação do método foram entre 0,1-0,9 µg g

-1

0,4-2,1 µg g

-1

, respectivamente. Para a matriz cupuaçu, valores de recuperação

entre 57 - 69 %, ao nível de concentração de 2 µg g

-1

O efeito matriz comprometeu a extração e análise do pesticida

teflubenzuron.

8. REFERÊNCIAS

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