( PDF ) Desenvolvimento de um método para determinação de ácidos orgânicos em sucos de frutas utilizando eletroforese capilar de zona (ecz).

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PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA – NPGQ

MESTRADO EM QUÍMICA

DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO PARA

DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS EM

SUCOS DE FRUTAS UTILIZANDO ELETROFORESE

CAPILAR DE ZONA (ECZ)

JOSÉ MARCOS VALENTIM DE CARVALHO

Dissertação apresentada ao

Núcleo de Pós-Graduação em

Química da Universidade Federal

de Sergipe como um dos

requisitos para obtenção do título

de Mestre em Química.

Orientadora: Prof. Dra. Ana Paula Gebelein Gervasio

SÃO CRISTOVÃO/SE

2010

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DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO PARA

DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS EM

SUCOS DE FRUTAS UTILIZANDO ELETROFORESE

CAPILAR DE ZONA (ECZ)

JOSÉ MARCOS VALENTIM DE CARVALHO

Dissertação apresentada ao

Núcleo de Pós-Graduação em

Química da Universidade Federal

de Sergipe como um dos

requisitos para obtenção do título

de Mestre em Química.

Orientadora: Prof. Dra. Ana Paula Gebelein Gervasio

SÃO CRISTOVÃO/SE

2010

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

C331d

Carvalho, José Marcos Valentim de

Desenvolvimento de um método para determinação de ácidos

orgânicos em sucos de frutas utilizando eletroforese capilar de

zona (ecz) / José Marcos Valentim de Carvalho. – São Cristóvão,

2010.

107 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Química) – Programa de Pós-

Graduação em Química, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e

Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe, 2010.

Orientador: Prof. Dra. Ana Paula Gebelein Gervasio

1. Ácidos orgânicos. 2. Sucos – Produtos industrializados. 3.

Eletroforese capilar de zona. I. Título.

CDU543.2:635.077

Este trabalho é dedicado aos meus pais.

AGRADECIMENTOS

 A Deus, pelo dom da vida;

 A professora Ana Paula pela orientação, pelo aprendizado, pela

perseverança e companheirismo. Você foi essencial nessa conquista;

 Aos meus pais por estarem sempre presentes e terem me dado muita

força em todos os momentos;

 A Neneta, Lucia, Valdirene, Naiane, Junior e Edu, que mesmo sem

perceber me deram coragem para continuar em frente, buscando

sempre o melhor caminho;

 Aos professores Sandro e Péricles pelas observações pertinentes no

exame de qualificação;

 A todos os professores que contribuíram na minha formação;

 A my teacher (Evicelma Vieira), pelo companheirismo e ajuda na

tradução dos artigos;

 A Moisés Menezes e Angélica, pelo companheirismo e dedicação;

 A minha “irmã” Aparecida Fontes, e a Eli pela força e carinho;

 A todos os meus amigos do Campus de São Cristóvão, e do Campus

de Itabaiana (Roberta, Geisiane, Leidiane) que sempre estiveram

dispostos a me ajudar;

 Aos meus amigos que diretamente ou indiretamente contribuíram

muito na concretização desse trabalho (Thiago, Marcinha, Rogério, e

amigos de trabalho).

Sem vocês teria sido muito difícil a concretização dessa conquista

Muito obrigado

SUMÀRIO

LISTA DE FIGURAS i

LISTA DE TABELAS v

LISTA DE ABREVIATURAS vii

RESUMO ix

ABSTRACT x

1. INTRODUÇÃO 1

2. OBJETIVOS 4

2.1. OBJETIVO GERAL 4

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 4

3. JUSTIFICATIVA 5

4. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 8

4.1. ÁCIDOS ORGÂNICOS (OXÁLICO, TARTÁRICO, CÍTRICO,

GÁLICO e o L – aa) EM AMOSTRAS DE SUCOS DE FRUTAS

4.2. ASPECTOS GERAIS DA ELETROFORESE CAPILAR 11

4.2.1. TIPOS DE ELETROFORESE CAPILAR 11

4.2.2. INSTRUMENTAÇÃO 13

4.2.3. ELETROFORESE CAPILAR DE ZONA 14

4.2.4. INTRODUÇÃO DA AMOSTRA 15

4.2.5. SOLUÇÃO TAMPÃO 17

4.2.6. ADITIVOS 18

4.2.7. DETECTORES 18

4.2.8. CAPILARES 20

4.2.9. AGENTES MODIFICADORES DA SUPERFÍCIE CAPILAR 20

4.2.10. FLUXO ELETROOSMÓTICO (FEO) 21

4.2.11. INVERSÃO DO FLUXO ELETROOSMÓTICO 22

4.3. ASPECTOS CINÉTICOS E TERMODINÂMICOS DA CE 24

4.3.1. MOBILIDADE IÔNICA 24

4.3.2. EFEITO DOS PARÂMETROS ELETROFORÉTICOS SOBRE

OS PARÂMETROS DE SEPARAÇÃO

4.3.2.1. TEMPO DE MIGRAÇÃO 25

4.3.2.2. RESOLUÇÃO E EFICIÊNCIA 27

4.3.3. TEMPERATURA 28

4.3.4. FLUXO ELETROOSMÓTICO 29

4.3.5. VOLUME INJETADO DA AMOSTRA E COMPRIMENTO DE

ZONA

5. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 32

6. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 51

6.1. MATERIAIS E MÉTODOS 51

6.2. SOLUÇÕES E REAGENTES 52

6.3. ESTUDO DAS AMOSTRAS 53

6.3.1. AQUISIÇÃO DAS AMOSTRAS 53

6.3.2. PREPARAÇÃO, DILUIÇÃO, TEMPO, TEMPERATURA DE

ESTOCAGEM DAS AMOSTRAS E NÚMERO DE ANÁLISE

6.4. CONDIÇÕES ELETROFORÉTICAS 55

6.4.1. METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS

ORGÂNICOS POR ELETROFORESE CAPILAR DE ZONA

6.4.2. AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DO ELETRÓLITO DE

SEPARAÇÃO

6.4.3. INFLUÊNCIA DO pH DO ELETRÓLITO DE SEPARAÇÃO NO

PERFIL DO PICO

6.4.4. INFLUÊNCIA DO TEMPO DE INJEÇÃO SOBRE O PERFIL DO

PICO

6.4.5. USO DE METANOL NA SOLUÇÃO DE SEPARAÇÃO 57

6.4.6. IDENTIFICAÇÃO DOS PICOS DOS ÁCIDOS ORGÂNICOS

ESTUDADOS

6.4.7. CURVAS ANALÍTICAS DOS ÁCIDOS ESTUDADOS E

CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO PROPOSTO

6.4.8. VALIDAÇÃO 58

7. RESULTADOS E DISCUSSÃO 61

7.1. INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO ELETRÓLITO DE

SEPARAÇÃO

7.2. INFLUÊNCIA DO pH DO ELETRÓLITO DE SEPARAÇÃO NO

PERFIL DOS PICOS

7.3. INFLUÊNCIA DO TEMPO DE INJEÇÃO SOBRE O PERFIL DO

PICO

7.4. USO DE METANOL NA SOLUÇÃO DE SEPARAÇÃO 67

7.5. IDENTIFICAÇÃO DOS ÁCIDOS ORGÂNICOS 69

7.6. CURVAS ANALÍTICAS 71

7.7. APLICAÇÃO DO MÉTODO 76

7.7.1. TEMPO DE ESTUDO E CONCENTRAÇÕES OBTIDAS 76

7.8. VALIDAÇÃO DO MÉTODO 87

7.8.1. LINEARIDADE E FAIXA DE TRABALHO 87

7.8.2. SENSIBILIDADE 88

7.8.3. PRECISÃO 88

7.8.4. ENSAIOS DE RECUPERAÇÃO 89

7.8.5. LIMITES DE DETECÇÃO (LD) E QUANTIFICAÇÃO (LQ) 91

7.8.6. REPETIBILIDADE 92

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS 94

9. PERSPECTIVAS FUTURAS 96

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 97

11. ANEXOS 104

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Estrutura química dos ácidos orgânicos estudados: oxálico,

tartárico, cítrico, gálico e L – aa.

Figura 2 – Sistema eletroforético caseiro. 14

Figura 3 – Sistema CE. A e B – recipientes contendo solução

eletrolítica, onde se encontram os eletrodos de platina (PL), (F) – fonte

de potência (V) – fonte de radiação, (D) – detector acoplado a um

computador – (C), (EF) – fluxo eletroforético, (EOF) – fluxo

eletroosmótico, (E) – eletroferograma. Os círculos brancos

representam os íons, os sinais negativos e positivos indicam as

cargas.

Figura 4 – Diagrama do sistema de injeção hidrodinâmico por

gravidade: A cubo de isopor; B e C suporte de madeira; D e E frascos

contendo a solução eletrolítica.

Figura 5 – Influência do pH da solução tampão sobre a mobilidade do

fluxo eletroosmótico.

Figura 6 – Capilar de sílica após a remoção de poliimida. 19

Figura 7 – Formação do fluxo eletroosmótico. 21

Figura 8 – Esquema ilustrando as diferenças entre o perfil do fluxo

pressurizado e o eletroosmótico.

Figura 9 – Representação esquemática da adsorção de surfactantes

sobre a superfície interna de capilares de sílica fundida.

Figura 10 – Lei de Ohm. Variação da voltagem e da corrente do

sistema em função do aumento da concentração da solução.

Condições experimentais: H

pH= 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB.

Figura 11 – Eletroferogramas obtidos na avaliação da concentração

da solução de H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB. Voltagem de 8 kV,

15 s de injeção, λ = 214 nm. A- 100 mmol/L, B- 150 mmol/L e C- 200

mmol/L. Ácido cítrico 0,3 g/100mL.

Figura 12 – Eletroferogramas para os ácidos orgânicos em diferentes

valores de pH: A – ácido oxálico, B – ácido tartárico, C – ácido cítrico.

Condições experimentais: 100 mmol/L H

+ 0,5 mmol/L CTAB, 8

kV, 15 s de injeção, λ = 214 nm.

Figura 12.1 – Eletroferogramas para os ácidos orgânicos em

diferentes valores de pH: D – ácido gálico, E – L – aa. Condições

experimentais: 100 mmol/L H

+ 0,5 mmol/L CTAB, 8 kV, 15 s de

injeção, λ = 214 nm.

Figura 13 – Eletroferogramas – tempo de injeção hidrodinâmica por

gravidade na separação das 5 espécies estudadas. 100 mmol/L

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, 8 kV, λ = 214 nm. ácido oxálico

(1), ácido tartárico (2), ácido cítrico (3), ácido gálico (4), L – aa (5).

Figura 14 – Eletroferogramas obtidos no estudo da concentração de

metanol no eletrólito de separação dos ácidos orgânicos. 100 mmol/L

+ 0,5 mmol/L CTAB pH 10,0, 15 s de injeção (4,5 cm de altura),

8 kV, λ= 214 nm, 0,0150 g/100mL ácido oxálico (1) e L – aa (5),

0,0250 g/100mL ácido tartárico (2) e cítrico (3), 0,0100 g/100mL ácido

gálico (4).

Figura 15 – Eletroferogramas obtidos na identificação dos picos: (1) e

(5) 0,0150 g/100mL, (2) e (3) 0,0250 g/100mL, (4) 0,0060 g/100mL, (1)

ácido oxálico, (2) ácido tartárico, (3) ácido cítrico, (4) ácido gálico, (5)

L – aa – 100 mmol/L H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, 15 s de

injeção hidrodinâmica, 8 kV, λ=214 nm, A=mistura inicial, B=mistura 1,

C=mistura 2, D=mistura 3, E=mistura 4, F=mistura 5.

Figura 16 – Curva analítica para o ácido oxálico na presença do ácido

tartárico, 100 mmol/L H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de

8 kV, 15 s injeção, λ = 214 nm.

Figura 17 – Curva analítica para o ácido tartárico na presença do

ácido oxálico, 100 mmol/L H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB,

voltagem de 8 kV, 15 s injeção, λ = 214 nm.

Figura 18 – Curva analítica para o ácido tartárico, 100 mmol/L H

pH 10,0, 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV, 15 s injeção a 4,5 cm

por gravidade λ = 214 nm.

Figura 19 – Curva analítica para o ácido cítrico, 100 mmol/L H

10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV, 15 s injeção, λ=214nm.

Figura 20 – Curva analítica para o ácido cítrico na presença do L – aa,

100 mmol/L H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV, 15

s, λ = 214 nm.

Figura 21 – Curva analítica para o L – aa na presença de ácido cítrico,

100 mmol/L H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV, 15

s injeção, λ = 214 nm.

Figura 22 – Curva analítica para o L – aa, 100 mmol/L H

pH 10,0

+ 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV, 15 s, λ = 214 nm.

Figura 23 – Variações das concentrações obtidas no suco fresco

durante o período do estudo. (Escala: 0-1 equivale a 5,62 dias; 45

dias).

Figura 24 – Variações das concentrações obtidas nos sucos frescos

durante o período do estudo. (Escala: 0-1 equivale a 6 dias; 45 dias).

Figura 25 – Variações das concentrações obtidas nos sucos frescos

durante o período do estudo. (Escala: 0-1 equivale a 6,5 dias; 33

dias).

Figura 26 – Variações das concentrações obtidas dos ácidos oxálico

(1) e tartárico (2) avaliadas nos sucos frescos no período do estudo.

(Escala: 0-1 equivale a 5,5 dias; 28 dias).

Figura 27 – Variações das concentrações obtidas nos sucos

industrializados durante o período do estudo. A = misto de acerola,

laranja enriquecido com L – aa, B = misto de maçã, laranja, tangerina

e limão, C = misto de laranja, limão e tangerina D = goiaba, E = misto

de maçã, limão e uva, (Escala: 0-1 equivale a 16 dias, 56 dias).

iii

Figura 28 – Variações das concentrações nos sucos industrializados

durante o período do estudo. A = misto de acerola, laranja enriquecido

com L – aa, B = misto de maçã, laranja, tangerina e limão. (Escala: 0-

1 equivale a 16 dias, 56 dias).

Figura 29 – Eletroferogramas dos ácidos orgânicos na amostras dos

sucos frescos: A – de uva, B – morango, C – caju, D – acerola, E –

carambola, F – de limão, G – umbu-cajá, H – laranja; (1) ácido oxálico

(2) ácido tartárico (3) ácido cítrico (5) L – aa.

Figura 30 – Eletroferogramas dos ácidos orgânicos na amostras dos

sucos industrializados. A = Suco misto de acerola, laranja enriquecido

com L – aa, B = suco misto de maçã, laranja, tangerina e limão, C =

suco misto de laranja, limão e tangerina D = suco de goiaba, E = suco

misto de maçã, limão e uva (3) ácido cítrico (5) L – aa.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Mobilidade eletroforética e número de grupamentos ácidos

(NG) e de átomos (NA) dos ácidos estudados.

Tabela 2 – Aditivos de eletrólitos comumente empregados em

eletroforese capilar. FONTE: TAVARES M FM, 1997.

107

Tabela 3 – Estudos para a determinação dos principais ácidos

orgânicos em sucos de frutas e gêneros alimentícios utilizando

eletroforese capilar de zona BGE – Eletrólito de separação.

Tabela 4 – Estudos para a determinação dos principais ácidos

orgânicos em sucos de frutas e gêneros alimentícios utilizando

cromatografia líquida de alta eficiência.

Tabela 5 – Diluição, condições e tempo de armazenamento das

amostras de sucos de frutas frescos.

Tabela 6 – Diluição, condições e tempo de armazenamento das

amostras de sucos industrializados.

Tabela 7 – Identificação dos picos dos ácidos, oxálico, tartárico,

cítrico, gálico e L – aa.

Tabela 8 – Resultados das concentrações dos ácidos orgânicos

(g/100mL) dos sucos de frutas frescos durante o período do estudo.

Tabela 9 – Resultados das concentrações (g/100mL) dos ácidos

orgânicos nos sucos industrializados durante o período do estudo.

Tabela 10 – Médias dos resultados dos ácidos orgânicos (g/100mL)

nas amostras dos sucos frescos.

Tabela 11 – Médias dos resultados dos ácidos orgânicos (g/100mL)

nas amostras dos sucos industrializados.

Tabela 12 – Comparando os resultados dos ácidos orgânicos deste

trabalho com outros. Dados: ácidos 1-oxálico, 2-tartárico, 3-cítrico, 5-L

– aa.

Tabela 13 – Linearidade para os ácidos oxálico, tartárico, cítrico,

gálico e L – aa, na faixa de concentração de 0,0040 a 0,0450.

Tabela 14 – Faixa de trabalho dos ácidos orgânicos. 88

Tabela 15 – Coeficientes de variação (CV) para os ácidos orgânicos

nos níveis de concentração de 0,0100, 0,0150 e 0,0200 g/100mL.

Tabela 16 – Recuperação dos ácidos orgânicos (g/100mL) nos sucos

de frutas frescos.

Tabela 17 – Recuperação dos ácidos orgânicos (g/100mL) nos sucos

de frutas industrializados.

Tabela 18 – Limite de Detecção e Quantificação (g/100mL), para os

ácidos orgânicos estudados.

Tabela 19 – Concentrações obtidas para o ácido cítrico e o L – aa no

limão e na laranja no mesmo dia e entre-dias.

LISTA DE ABREVIATURAS

CE – Capillary Electrophoresis (CE – Eletroforese Capilar)

CZE – Capillary Zone Electrophoresis (ECZ – Eletroforese Capilar de Zona)

FSCE – Free-solution Capillary Electrophoresis (ECSL – Eletroforese Capilar

em Solução Livre)

MECC – Micellar Electrokinetic Capillary Cromatography (ECM –

Eletrocromatografia Micelar)

MEKC – Micellar Electrokinetic Chromatography (CECM – Cromatografia

Eletrocinética Micelar)

CGE – Capillary Gel Electrophoresis (ECG – Eletroforese Capilar em Gel)

CIEF – Capillary Isoelectric Focusing (FIC – Focalização Isoelétrica Capilar)

CITP – Capillary Isotachophoresis (IC – Isotacoforese Capilar)

HPLC – High-performance Liquid Chromatography (CLAE – Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência)

GC – Gas Chromatography (CG – Cromatografia gasosa)

DNP – 2,4-dinitrophenylhydrazine (DFH – 2,4-dinitrofenilhidrazina)

CTAB – Cetyltrimethylammonium Bromide (BCTA – Brometo de

Cetiltrimetilamônio)

TTAB – Tetradecyltrimethylammonium Bromide (BTTA – Brometo de

tetradeciltrimetilamônio)

TTAOH – Tetradecyltrimethylammonium Hidroxide (HOTTA – Hidróxido de

Tetradeciltrimetilamônio)

TMA – Trimetylic Acid (ATM – Ácido Trimetílico)

TMA – 1,2,4,5-Tetracarboxylicbenzoic Acid (ATA – Ácido 1,2,4,5-

tetracarboxílicobenzoico)

vii

BTA – 1,3,5-benzenetricarboxylic acid (Ácido 1,3,5-benzenotricarboxilico –

ABT)

TEPA – Tetraethylenepentamine (TEPA – Tetraetilenopentamino)

EDTA – Ethylenidiaminetetraacetic acid (AEDT – Ácido

Etilenodiaminotetraacético)

PDC – 2,6- Pirideinedycarboxylic Acid (APC – Ácido 2,6-piridinocarboxílico)

MTAB – Myristyltrimethylammonium Bromide (BMTA – Brometo de

Miristiltrimetilamônio)

DNB – 3,5-Dinitrebenzoic (DNB – 3,5-Dinitrobenzóico)

GARP – Associação Nacional dos Especialistas em Resíduos,

Contaminantes e Poluentes

CMC – Critical Micellar Concentration (CMC – Concentração Micelar Critica)

d.i. – Diâmetro interno

d.e. – Diâmetro externo

L – aa – L – ascorbic acid (L – aa – L – ácido ascórbico)

UV/Vis – Ultravioleta/visível

CV – Coeficiente de variação

RSD – Relative Standard Deviation (DPR – Desvio Padrão Relativo)

LD – Limite de detecção

LQ – Limite de quantificação

viii

RESUMO

Uma metodologia eletroforética com detecção no UV foi desenvolvida

para determinação dos ácidos orgânicos contidos em sucos de frutas frescos

e em sucos de frutas industrializados produzidos em Sergipe/Brasil e

comercializados nos mercados e supermercados de Lagarto, Itabaiana e

Aracaju. Os ácidos orgânicos: oxálico, tartárico, cítrico e o ácido ascórbico (L

– aa) foram separados e quantificados em amostras de sucos frescos de

uva, laranja, limão, carambola, umbu-cajá, acerola, caju, morango e em

amostras de sucos industrializados (misto de acerola, laranja fortificado com

L – aa; misto de maçã, laranja, tangerina e limão; misto de laranja, limão e

tangerina; suco de goiaba e misto de maçã, limão e uva). As análises foram

realizadas empregando uma solução tampão contendo 100 mmol/L de

tampão borato pH 10,0 e 0,5 mmol/L de brometo de cetiltrimetilamônio

(CTAB) como inversor do fluxo eletroosmótico, um capilar de sílica fundida

de 59 cm de comprimento (23,7cm efetivo, 75 µm de d.i.) e detecção a λ=

214nm. A injeção da amostra foi feita no modo hidrodinâmico (altura de 4,5

cm) por 15 s. O método mostrou-se linear numa faixa de 0,0040 a 0,0450

g/100 mL, as curvas de calibração foram preparadas com adição de padrão

externo, com coeficiente de correlação de 0,9912 a 0,9995, a precisão variou

de 1,48 a 11,46% (n = 3), o limite de detecção variou de 0,0005 - 0,0155

g/100mL e o de quantificação 0,0016 - 0,0517 g/100 mL. As recuperações

dos ácidos nas amostras de sucos frescos variaram de 83,60 a 117,5% (n =

50), e de 83,60 a 108,7% (n=11) para os ácidos nas amostras de sucos

industrializados. Os ácidos, oxálico, tartárico, cítrico e L – aa foram

separados e quantificados nas amostras de sucos frescos, enquanto que os

ácidos, cítrico e L – aa, nas amostras de sucos industrializados, sendo que

houve redução na concentração do ácido ascórbico de 18,90%, 28,20% e

36,00% nos sucos frescos de acerola, laranja e caju respectivamente, e de

100,0% no suco industrializado misto de maça, laranja, tangerina, limão e

99,40% no suco industrializado misto de acerola, laranja enriquecido com L

– aa, houve também redução na concentração do ácido cítrico em duas

amostras de sucos industrializados, 15,20% e 56,90% nos sucos, misto de

maçã, laranja, tangerina, limão, e no de goiaba. O método desenvolvido foi

rápido, sensível e adequado para análise de ácidos orgânicos em amostras

de sucos de frutas.

Palavras chaves: ácidos orgânicos, sucos de frutas frescos, sucos de frutas

industrializados, ECZ.

ABSTRACT

An electrophoretic methodology with UV detection was developed for

determinations the main organic acids contained in fresh fruit juice and

industrialized fruits juices produced in Sergipe/Brazil and sold in markets and

supermarkets of Lagarto, Itabaiana and Aracaju. Oxalic, tartaric, citric, gallic

and ascorbic (L – aa) organic acids were separate and quantified in grape,

orange, lemon, carambola, umbu-caja, acerola, cashew, strawberry samples

of fresh juices and samples of mixed juice industrialized (mixed acerola,

orange, fortified whit L – aa; mixed apple, orange, tangerine and lemon;

mixed orange, lemon and tangerine; guava juice and mixed apple, lemon and

grape). The analyses were made employing BGE containing 100 mmol/L

borate buffer pH 10.0 and 0.5 mmol/L cetyl trimethyl ammonium bromide

(CTAB) as EOF-modifier, a fused silica capillary of 59 cm of length (23.7 cm

effective, 75 mm of i.d.) λ = 214 nm. The sample injection

was made in

hydrodynamic mode (height 4.5 cm) for 15 s,

the method was linear within

0.0040 to 0.0450 g/100mL. The calibration curves were prepared with the

addition of external standard, with correlation coefficient from 0.9912 to

0.9995, the precision ranged of 1.48 to 11.46% (n= 3). The limit of detection

varied from 0.0005 to 0.0155 g/100mL and the limit of quantification varied

from 0.0016 to 0.0517 g/100mL. The recoveries in samples of fresh juices

were 83.6 to 117.5% (n = 50) and from 83.60 to 108.7% (n=11) for the acids

in fruits juices industrialized samples. The oxalic, tartaric, citric, and L – aa

were separated and quantified in samples of fresh juices while citric and L –

aa acid in samples of industrialized juices there was reduction in the

concentration of 18.90%, 28.20% and 36.00% L - aa of juices of fresh

acerola, orange and cashew respectively and of 100.0%, 99.40% in samples

of mixed juice industrialized, mixed apple, orange, tangerine and lemon,

mixed acerola, orange, fortified whit L – aa respectively, was also reduction

the concentration of citric acid in two samples juice industrialized 15,20% in

mixed apple juice, orange, tangerine, lemon and 56,9% in guava juice. The

proposed method is rapid and sensitive and can be used to analysis of

organic acids in juice fruit samples.

Key words: Organic acids, fresh fruit juice, industrialized fruit juice, CZE.

1. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento industrial no século 18, especificamente no ano de

1729, acabou destacando a necessidade das indústrias proporem métodos

analíticos que apresentassem resultados rápidos e satisfatórios. Isso

estimulou o desenvolvimento novos métodos analíticos, dentre eles, a

titulação. Em meados do século 20, diante da grande necessidade, e

precisão nas análises, surgiram técnicas eficientes e mais precisas para

análise de ânions ou cátions. Além disso, também era possível a análise de

vários compostos a partir de uma mesma corrida, diferentemente das

técnicas existentes até então. Os primeiros informes sobre estas técnicas

deram-se na década de 50 com o surgimento da cromatografia gasosa (GC),

na década de 70 pelo aperfeiçoamento da cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC). A partir da década de 80, surge a eletroforese capilar

(CE), com alto poder de resolução, e capacidade de analisar ânions de

forma individual (TAVARES et al.,1997). Paralelamente ao desenvolvimento

de novas metodologias, exigências quanto ao fornecimento de alimentos

também eram elaboradas na forma de leis, nesse caso, surgiam as

regulamentações quanto ao teor de aditivos, agrotóxicos, metais, entre

outros.

A composição química das frutas e dos sucos industrializados é uma

indicação importante para agregar valor aos seus produtos comercializados,

compor normas, e identificar a sua origem geográfica (LUYKX et al., 2008),

além disso, a produção dos sucos industrializados requer diluição com água,

adição de aditivos e conservantes, o que pode tornar difícil a determinação

dos ácidos orgânicos naturais (CASTIÑEIRA et al., 2000; ARELLANO et al.,

1997, SAAVEDRA et al., 2000; YANG et al., 2000, MATO et al., 2007).

Dependendo do tipo de análise química, várias metodologias

analíticas são utilizadas para definir a composição química de um alimento,

dentre elas podem-se citar: as espectrofotométricas, enzimáticas,

cromatográficas ou eletroforéticas (MATO et al., 2005).

A eletroforese capilar, principalmente a modalidade de zona, é

discutida com ênfase nessas duas últimas décadas devido a eficiência na

separação e quantificação de ácidos orgânicos em frutas, gêneros

alimentícios e em plantas, sobressaindo-se em relação a outros métodos

analíticos como a HPLC (HERNÁNDEZ et al., 2006; SCHERER et al., 2008;

VIGNOLI et al., 2007; SUÁREZ et al., 2008; QUIRÓS et al., 2009;

HERNÁNDEZ et al., 2009), uma vez que o volume dos reagentes e da

amostra são na ordem de nanolitros, menor tempo de análise, facilidade de

operação instrumental, e baixo impacto ambiental, com pouca geração de

resíduos (WU et al., 1995; SCHIEWE et al., 1995; TREVASKIS et al., 1995;

ARELLANO et al., 1997; CHOI et al., 1997; FUKUSHI et al., 1997; HORIE et

al., 1998; SOGA et al., 1999; SAAVEDRA et al., 2000; CASTIÑEIRA et al.,

2000; FUNG et al., 2001; CASTIÑEIRA et al., 2002; XU et al., 2002; FUNG

et al., 2003; GALLI et al., 2004; VICKERS et al., 2007; MATO. et al., 2007,

TANG. et al., 2007; PERES et al., 2009).

Considerando os inúmeros benefícios em relação ao consumo de

ácidos orgânicos, sua determinação em sucos de frutas frescos e

industrializados é importante para avaliar a relação entre consumo e saúde

humana, importante também na padronização e monitoramento dos sucos

industrializados, obtidos a partir de polpas de frutas in natura. Os ácidos

orgânicos são os responsáveis pelas propriedades organolépticas dos sucos

de frutas frescos e industrializados, dando sabor e aroma, característicos de

cada um.

A partir do que foi apresentado, quanto a importância dos ácidos

orgânicos presentes nos sucos de frutas e nos sucos industrializados, e

considerando que pouco se sabe sobre a composição química de algumas

frutas, especialmente aquelas produzidas e comercializadas no Nordeste,

assim o objetivo desse trabalho foi desenvolver um método eletroforético

para determinação de ácido oxálico, tartárico, cítrico, gálico e L – aa em

sucos de frutas frescos de uva, laranja, limão, carambola, morango, umbu

cajá, caju, e em sucos industrializados tais como, misto de acerola, laranja

enriquecido com L – aa, misto de maçã, laranja, tangerina e limão, misto de

laranja, tangerina e limão, misto de maça, limão e uva, e suco de goiaba,

todos comercializados nos mercados e supermercados das cidades de

Lagarto, Itabaiana e Aracaju/SE.

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Desenvolver um método para determinar ácido oxálico, tartárico,

cítrico, gálico e L – aa em sucos de frutas frescos e em sucos de frutas

industrializados empregando a eletroforese capilar de zona.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

2.2.1 – Estabelecer as condições adequadas para análise dos ácidos

oxálico, tartárico, cítrico, gálico e L – aa, por eletroforese capilar de zona;

2.2.2 – Desenvolver o procedimento analítico;

2.2.3 – Validar o método, com técnicas univariadas;

2.2.4 – Avaliar a estabilidade dos ácidos orgânicos nos sucos, considerando

o tempo e as condições de armazenamento;

2.2.5 – Aplicar o método desenvolvido para análise de suco de fruta fresco e

industrializado;

2.2.6 – Colaborar significativamente com informações sobre a distribuição de

ácidos orgânicos em sucos de frutas produzidos em Sergipe.

3. JUSTIFICATIVA

Como todos os sistemas vivos, os seres humanos precisam de um

fluxo contínuo de energia e provisão de nutrientes essências na sua dieta,

estes devem ser obtidos em quantidades e proporções apropriadas, pois

excesso ou deficiência de nutrientes pode provocar enfermidades

(MONTGOMER et al., 1994). Desde as grandes navegações, quando os

piratas passavam dias em navios sem uma alimentação balanceada em

vitaminas, tinham problemas freqüentes com doenças em função da má

alimentação, uma delas, por exemplo, conhecida como escorbuto, a qual

ocorria pela carência de vitamina C (LEHNINGER, 2004), a qual bloquea o

processo da oxidação, ou seja, as enzimas que removem as espécies

reativas ao oxigênio (ANGELO et al., 2007). Além do ácido ascórbico, há

outros ácidos orgânicos com inúmeros benefícios, e estes podem ser

encontrados facilmente em frutas e alimentos diversos, os quais fazem parte

da constituição das vitaminas, agindo de forma específica na formação,

crescimento e regulação hormonal. Atuam também na estabilidade

microbiana, permitindo o monitoramento de sucos industrializados além de

possibilitar sabores e aromas agradáveis característicos de cada fruta

(RIVASSEAU et al., 2006).

A indústria de frutas tem-se expandido bastante nos últimos anos,

notadamente no nordeste brasileiro. As unidades fabris se compõem, em

sua maioria, de pequenos produtores que utilizam plantios artesanais. Além

da comercialização das frutas como frutos, há também a comercialização da

polpa de frutas congeladas, a qual vem ganhando grande popularidade, não

só entre as donas de casa, mas também em restaurantes, hotéis,

lanchonetes, hospitais, etc, nos quais são utilizadas, principalmente, na

elaboração de sucos, devido a alta praticidade e facilidade de preparação e

consumo (SCHERER et al., 2008).

As frutas são consideradas fonte nutricional de vitaminas, as quais

possuem altos percentuais de ácidos orgânicos, minerais e carboidratos

solúveis, sendo que algumas possuem teor mais elevado de um ou de outro

nutriente como, por exemplo, a acerola que apresenta elevada quantidade

de vitamina C (CHOI et al., 1997)

Além do ácido L – aa, outros ácidos

orgânicos estão extensamente distribuídos nas frutas e nos vegetais, tais

como, ácido tartárico, cítrico, gálico e L – aa, onde suas concentrações

dependem de fatores como espécie, solo e circunstâncias de estresse

submetidas. Em todos os países, os levantamentos estatísticos revelam

números crescentes de consumo de frutas, tanto per capita quanto global,

esses valores são mais expressivos quando se referem às cultivadas em

meio orgânico, pelo fato do mesmo evitar o uso de agrotóxicos, os quais

prejudicam o organismo humano, trazendo doenças, e má formação

hormonal (TAPIA, 2000).

Os ácidos orgânicos são também largamente utilizados como

acidulantes na fabricação de bebidas à base de frutas e vegetais, sendo os

principais utilizados para realçar sabores como o cítrico e o tartárico. Além

disso, o cítrico é muito utilizado como acidulante em sucos de frutas, porque

o pH dos ácidos naturais não é suficiente para assegurar a estabilidade

microbiana a longo prazo. O ácido ascórbico é amplamente utilizado como

antioxidante em sucos, entretanto, por causa de sua natureza, é oxidado

durante o período de estocagem. A literatura apresenta alguns relatos sobre

a estabilidade do L – aa em sucos de frutas (RONCADA et al., 1977; CHOI

et al., 1997; TAVARES et al., 2000; SILVA et al.,2004; HERNÁNDEZ et al.,

2006; WU et al., 2007; SCHERER et al., 2008) e há pouco material sobre a

estabilidade dos ácidos oxálico, tartárico, cítrico e gálico nos sucos de frutas.

Diante da facilidade de se encontrar frutas ricas em ácidos

orgânicos na região Nordeste, mais especificamente no Estado de Sergipe,

nas cidades de Lagarto, Itabaiana e Aracaju, e com o objetivo de se avaliar a

estabilidade durante o tempo de estocagem da fruta em temperaturas

distintas, e dos sucos industrializados, neste trabalho, é utilizado um sistema

eletroforético capilar de zona (CZE) simples, de facil manuseio, preciso, de

baixo custo, com pouca geração de resíduos, para a análise de ácidos

orgânicos em sucos, sendo que a princinpal vantagem desta técnica de

separação em relação às outras é a maior eficiência e resolução obtidas em

um tempo menor de análise e com a utilização de volumes pequenos da

amostra (1 a 10 nL por injeção) e do eletrólito de trabalho (10 a 100 mL

diários) (JARGER et al., 2001). O sistema empregado neste trabalho é

considerado caseiro, pois foi montado no laboratório de pesquisa do

Campus de Itabaiana. As otimizações dos parâmetros eletroforéticos, tais

como: voltagem requerida, tempo de injeção, concentração, pH e o uso de

solvente orgânico na solução de separação, foram fundamentais para o

sucesso do método proposto. Como os analitos são ácidos orgânicos, e que

formam complexos aniônicos com ácido bórico, empregou-se a estratégia de

inverter o fluxo eletroosmótico utilizando um inversor de fluxo na solução de

separação, como descritos nos seguintes trabalhos propostos (SCHIEWE et

al., 1995; WU et al., 1995; TREVASKIS et al., 1995; FUKUSHI et al., 1997;

CHOI et al., 1997; ARELLANO et al., 1997; HORIE et al., 1998; SOGA et al.,

1999; DAVEY et al., 1999; SAAVEDRA et al., 2000; CASTIÑEIRA et al.,

2000; YANG et al., 2000; FUNG et al., 2001; CASTIÑEIRA et al., 2002; XU

et al., 2002; FUNG et al., 2003; WANG et al., 2003; Galli et al., 2004;

RIVASSEAU et al., 2006; VICKERS et al., 2007; WU et al., 2007; TANG Y. et

al., 2007; MATO et al., 2007; PERES et al., 2009).

4. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

4.1. ÁCIDOS ORGÂNICOS (OXÁLICO, TARTÁRICO, CÍTRICO, GÁLICO e

o L – aa) EM AMOSTRAS DE SUCOS DE FRUTAS

Os ácidos orgânicos são compostos orgânicos que apresentam um

ou mais grupos carboxílicos em sua estrutura, e podem ser facilmente

encontrados em frutas onde participam de suas propriedades

organolépticas, dando cor, aroma e sabor, além de possibilitar que uma

determinada fruta possa ser caracterizada como sendo de uma região. Os

ácidos em estudo são não aromáticos com exceção do ácido gálico, e com

pequena cadeia molecular. O ácido oxálico é um dicarboxílico de nome

oficial ácido etanodióico, descoberto em 1960 por J.C. Wiegleb, de fórmula

, encontrado em frutas como a carambola, o qual pode ser utilizado

em consultórios dentários (tratamento contra o tártaro). Na indústria, como

eliminador de ferrugem em mármores, metais e pedras, obtenção de

corantes e fixação em tecidos, fabricação de tintas, branqueamento de

têxteis, papeis, curtiça, palha, curtição industrial de couros, e fabricação de

oxalatos. No que se refere ao seu consumo, tóxico se ingerido puro, porém,

em frutas o percentual existente é baixo, não representando danos a saúde.

O grande consumo deste ácido pode trazer algumas patologias, como por

exemplo: geração de cisteína, doença conhecida como pedras nos rins,

além de descalcificação óssea.

Ácido tartárico é um ácido orgânico de função mista, álcool e ácido

carboxílico, descoberto em 1770 por C.W. Scheele, de nome oficial ácido

dihidroxi-butanodióico, de fórmula H

, encontrado principalmente em

frutas como: uva, tamarindo, abacaxi e amora. Pode ser utilizado como

acidulante em vinhos, ou na fabricação de tinturas, xampus anti-cálvice, uma

vez que estimula a corrente sanguínea no local da aplicação.

Ácido cítrico é um tricarboxílico com a presença de uma hidroxila,

de nome usual, ácido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxílico, de fórmula

, descoberto em 1784 por C.W. Scheele, encontrado principalmente

em frutas cítricas, dentre elas, o limão, laranja e umbu. Possui elevado poder

complexante, auxilia na formação óssea, fixando cátions como cálcio, ferro,

potássio e magnésio. Também atua como agente tamponante participando

da estabilização do pH de meios aquosos, além de ser o principal agente de

alcalinização do metabolismo humano; participa da respiração celular e

geração da energia humana iniciais do Ciclo de Krebs. Quando ingerido,

transforma-se em sal alcalino (formando citratos de cálcio, magnésio, ferro e

potássio) neutralizando a acidez do estômago. Também é conhecido como

um bactericida seguro e natural contra fermentações no estômago e

intestinos, também é utilizado nas desintoxicações em geral, inclusive nas

causadas por ingestão de soda ou potassa cáustica, serve como acidulante

e participa da defesa imunológica do organismo humano (TAPIA, 2000).

Ácido gálico é um ácido orgânico aromático de nome oficial 3,4,5-

triidroxibenzóico, de fórmula H

descoberto em 1786 por C.W. Scheele,

encontrado em frutas como goiaba e amora e considerado um antioxidante.

Ácido ascórbico (L – aa) é o enantiômero mais ativo biologicamente

da vitamina C (EVANGELISTA, 2006), de nome oficial R-3,4-dihidroxi-5-(S)-

1,2-dihidroxietilfurano-um-2(5H) de fórmula H

, isolado primeiramente

em forma cristalina pura, a partir do suco de laranja, pelos bioquímicos norte

americanos C.G. King e W.A. Waugh, em 1932 (LENHNINGER, 2004). Pode

ser encontrado em frutas como acerola, morango, mamão, laranja e kiwi. É

um ácido orgânico altamente oxidante que transforma os radicais livres de

oxigênio em formas inertes, protegendo do envelhecimento e da

degeneração de todas as células e tecidos, rege as funções da medula

óssea, participando do metabolismo de formação do sangue e desempenho

das glândulas endócrinas. Auxilia na formação dos tecidos fibrosos, dos

dentes, dos ossos, das cartilagens, da pele e até dos cabelos, favorece a

reconstituição de ossos e cartilagens como também na cicatrização dos

cortes e feridas, eficaz no tratamento e prevenção do escorbuto, anemia,

reconstituição de tecidos, fortalecimento do sistema imunológico, agindo

também de forma eficaz em problemas digestivos e circulatórios

(LENHNINGER, 2004).

A Figura 1 e a Tabela 1 mostram algumas características físico-

químicas dos ácidos orgânicos estudados neste trabalho. Os dados

mostrados na Tabela 1 foram extraídos de Cheng et al., 2006 e Olsson et al.

1998.

Figura 1 – Estrutura química dos ácidos orgânicos estudados: oxálico,

tartárico, cítrico, gálico e L – aa.

Tabela 1 – Mobilidade eletroforética e número de grupamentos ácidos (NG)

e de átomos (NA) dos ácidos estudados.

ÁCIDO NG NA Massa

molecular (g)

Mobilidade

eletroforética

(×10

−5

−1

)

Oxálico 2 8 90 74,6

Tartárico 2 16 150 60,5

Cítrico 3 21 192 70,8

Gálico 1 18 170 34,4

Ascórbico 1 20 176 2,41x10

(1)

(1) Olsson et.al. 1998.

De acordo com Cheng et al., 2006, a mobilidade eletroforética (µ

)

aumenta com o aumento do número de grupos ácidos e diminui com o

aumento do número de átomos e massa do ácido. Dentre os ácidos

estudados, a ordem de migração é: ácido oxálico, cítrico, tartárico, gálico e

ascórbico.

4.2. ASPECTOS GERAIS DA ELETROFORESE CAPILAR

4.2.1. TIPOS DE ELETROFORESE CAPILAR

Podem ser encontradas na literatura 6 técnicas eletroforéticas,

eletroforese capilar de zona (ECZ), conhecida também como eletroforese

capilar em solução livre (ECSL), eletrocromatografia micelar (EM) ou

cromatografia eletrocinética micelar (CEM), eletroforese capilar em gel

(ECG), focalização isoelétrica capilar (FIC), isotacoforese capilar (IC) e

eletroforese por fronteira móvel. Dentre elas destaca-se a ECZ por ser de

fácil operação, envolvendo somente um único eletrólito de separação, onde

os analitos presentes numa mistura são separados em função de suas

mobilidades individuais, e a mobilidade do meio em que se encontram.

Todas essas técnicas empregam um campo elétrico, que possibilita a

formação de um fluxo eletroosmótico, promovendo a migração dos analitos

até o detector. A migração é diferenciada por alguns aspectos, dentre eles, a

forma de interação dos analitos, com os constituintes das soluções tampão

dentro do capilar.

A técnica de fronteira móvel diferencia-se da ECZ devido a separação

completa de todos os componentes nunca ser atingida, apenas os

componentes de maior mobilidade são parcialmente purificados, enquanto

que as outras bandas sofrem diversos graus de sobreposição. A ECZ

também é uma técnica eletroforética por fronteira móvel, porém, quando o

potencial elétrico é estabelecido, os componentes migram em zonas com

velocidades constantes, mas diferenciadas, características de suas próprias

mobilidades, e da mobilidade das moléculas que constituem a solução

tampão.

Em ECZ, uma solução altamente básica é utilizada para preparar o

capilar. Essa solução dissocia os grupos silanóis, constituinte da parede

interna do capilar de sílica fundida, em seguida, adiciona-se uma solução

tampão, contento o eletrólito de separação e, se necessário, inversores de

fluxo para análise de ânions. Desta forma, obtêm-se dois movimentos

simultâneos, a migração eletroforética dos íons e a eletroosmose, ou seja,

fluxo de solução induzido pelo campo elétrico, o qual possibilita uma alta

eficiência da técnica (GALLI et al., 2004).

Em EM e ECG, as mobilidades eletroforéticas são semelhantes a

mobilidade eletroforética da ECZ, porém, diferenciam-se pelo modo de como

foi preparado o interior do capilar. Em EM, é adicionado dentro do capilar um

aditivo que possibilita a formação de uma fase secundária, esta pode

adsorver certa quantidade de analito, não reproduzindo no seu tempo de

migração, porém, é eficaz tanto na análise de íons como na de neutros, o

qual não se observa com a ECZ, que não é eficaz na separação de

compostos neutros. Em ECG, faz-se um pré-tratamento do capilar com o

reagente como, por exemplo, o 3-metacriloxi-propil-trimetoxi-silano, o qual

elimina o fluxo eletroosmótico através de uma ligação covalente com os

grupos silanos da superfície capilar e evita a extrusão do gel durante a

operação do sistema adicionando em seguida um gel, o qual possibilita a

dissipação do efeito joule, porém, o uso dessa modalidade eletroforética

pode reter analitos ou parte deles, não reproduzindo nos seus tempos de

migração (TAVARES, 1997).

Em IC, utiliza-se uma solução tampão, contendo dois eletrólitos de

separação, sendo que um deles é chamado de eletrólito líder e o outro

terminador, eficiente tanto na análise de ânions como na de cátions, porém,

para análise de ânions, o eletrólito líder deverá conter um ânion de maior

mobilidade em relação ao ânion do analito, e o eletrólito terminador deverá

conter um ânion de menor mobilidade em relação ao ânion do analito. Para a

análise de cátion, o eletrólito principal deverá conter um cátion de maior

mobilidade em relação ao cátion do analito, enquanto que o cátion do

eletrólito terminador deverá conter uma menor mobilidade em relação ao

cátion do analito.

A análise por FIC envolve a separação de solutos anfotéricos em um

gradiente de pH, sob a influência de um campo elétrico, um soluto

negativamente carregado migra em direção ao ânodo. Durante esse

percurso, o soluto experimenta regiões de pH progressivamente menor,

tornando assim, uma fração cada vez maior do soluto protonado, alterando a

carga efetiva durante a migração. Eventualmente, a carga total do soluto

torna-se zero, e sua migração é interrompida. Cada componente da amostra

migra para uma região de pH igual ao seu ponto isoelétrico, e permanecerá

nesta posição enquanto o campo elétrico for operante (LINDEBERG, 1996).

4.2.2. INSTRUMENTAÇÃO

Um aspecto bastante importante da eletroforese capilar é a

simplicidade da instrumentação. Na Figura 2 está uma ilustração mostrando

os componentes de um sistema caseiro para implementar a eletroforese

capilar de zona, o qual consiste de uma fonte de alta tensão, um capilar

geralmente de sílica fundida, eletrodos, geralmente de platina, e um detector

apropriado por absorção molecular na região do ultravioleta/visível. Uma

fonte regulada de alta tensão é usada para estabelecer o campo elétrico ao

longo do capilar. Tais fontes podem em geral ser operadas a voltagem

constante e/ou corrente constante, com valores típicos de voltagem no

intervalo de 0 – 30 kV e corrente, de 0 – 200 µA (TAVARES, 1997). A fonte

de alta tensão é conectada por meio de eletrodos de platina a dois

reservatórios contendo uma solução de eletrólito conveniente.

O tubo capilar de sílica fundida preenchido com a solução eletrolítica

serve como canal de migração para os analitos. Logo após a introdução da

amostra dentro do capilar, as extremidades do capilar são imersas nos

reservatórios da solução tampão para fechar o circuito elétrico.

Normalmente, a temperatura é mantida constante durante a análise química,

para manutenção da termoestabilização.

Figura 2 – Sistema eletroforético caseiro.

4.2.3. ELETROFORESE CAPILAR DE ZONA

Na eletroforese capilar de zona, o processo de separação ocorre em

uma coluna capilar de diâmetro interno entre 25 e 100 µm, e comprimento

entre 30 e 100 cm, normalmente de sílica fundida e recoberta com um

material inerte que é removido para a confecção de uma janela de

observação. O capilar é preenchido com uma solução tampão que é

eletrolítica, a qual conduz a corrente elétrica que passa pelo sistema, e

contém um eletrólito de separação, onde os analitos são separados. Aqui é

importante enfatizar que no modo eletroforético capilar de zona, a migração

dos analitos ocorrerá em blocos e a formação desses blocos dependerá da

mobilidade eletroforética dos cátions e ânions, enquanto que os neutros

migrarão todos em um único bloco, não sendo, separados e detectados

individualmente (BECKERS et al., 2001). A evolução da separação ocorre da

seguinte forma: No momento em que os íons são introduzidos no capilar, os

cátions tendem a migrar para o pólo negativo, e os ânions para o pólo

positivo, porém, sob efeito de um campo elétrico, obtido com voltagem ou

corrente constante, ocorre a formação de um fluxo eletroosmótico no sentido

do pólo negativo em direção ao pólo positivo, representado por (EF+EOF),

como mostrado na Figura 3. Isto ocorre devido a dissociação da sílica que

atrai cargas positivas para a sua superfície (BAKER, 1995).

Fatores como pH da solução tampão, inversão de fluxo

eletroosmótico, adição de agentes complexantes e voltagem afetam a

velocidade de migração dos íons (CRASTON et al., 1998).

Figura 3 – Sistema CE. A e B – recipientes contendo solução eletrolítica,

onde se encontram os eletrodos de platina (PL), (F) – fonte de potência (V) –

fonte de radiação, (D) – detector acoplado a um computador – (C), (EF) –

fluxo eletroforético, (EOF) – fluxo eletroosmótico, (E) – eletroferograma. Os

círculos brancos representam os íons, os sinais negativos e positivos

indicam as cargas.

4.2.4. INTRODUÇÃO DA AMOSTRA

A forma de introdução da amostra no capilar tem implicações

significativas na análise instrumentação, pois afeta a repetibilidade da área

ou da altura do pico, os quais refletem a precisão da técnica de injeção. Em

eletroforese capilar de zona, a amostra pode ser introduzida no capilar por

dois métodos distintos, eletrocinético ou hidrodinâmico.

Na injeção hidrodinâmica a amostra é introduzida no capilar por um

gradiente de pressão, no qual pode ser estabelecido por diferentes

mecanismos de pressurização ou vácuo em um dos reservatórios de

solução, ou por gravidade, onde um dos reservatórios é elevado em relação

ao outro. Neste trabalho, a amostra foi introduzida no capilar elevando a

extremidade catódica a 4,5 cm, tal como pode ser visto na Figura 4. Na

injeção eletrocinética, a solução é inserida no capilar com auxílio de um

gradiente de potencial, o qual é estabelecido por todo comprimento do

capilar num período de tempo conhecido.

A injeção hidrodinâmica introduz no capilar uma alíquota

representativa da composição do soluto na amostra, no qual o volume

injetado (nL) depende do tempo de injeção (t), e da altura de sua aplicação

(h), quando a injeção for feita por diferença de altura entre os dois fracos que

contém as soluções eletrolíticas. Este tipo de injeção é usualmente mais

precisa que a eletrocinética porque é baseada estritamente na transferência

de volume, (GALLI et al., 2003) diferentemente da injeção eletrocinética uma

vez que o volume aplicado é diretamente proporcional a voltagem aplicada

(V), a concentração da amostra (C), ao tempo de injeção (t), ao raio interno

do capilar (r), a mobilidade aparente (µ

) e a mobilidade eletroforética (µ

eof

e inversamente proporcional ao comprimento total da coluna (L) (ALTRIA,

1996).

Figura 4 – Diagrama do sistema de injeção hidrodinâmico por gravidade: A

cubo de isopor; B e C suporte de madeira; D e E frascos contendo a solução

eletrolítica.

4.2.5. SOLUÇÃO TAMPÃO

Para uma boa separação dos analitos em CZE, os parâmetros

eletroforéticos devem ser avaliados, principalmente em relação à solução

tampão, associado com o tipo de capilar utilizado. Para capilares de sílica

fundida, o pH da solução tampão deverá estar entre 2,0 e 11,0, uma vez que

em pH abaixo de 2,0, os grupos silanóis estarão totalmente protonados, em

pH 10,0 há o número máximo de dissociação dos grupos silanóis e, a partir

do pH 11,0, a formação do fluxo eletroosmótico será constante, Figura 5. O

tampão terá boas respostas na separação quando o seu pH for

correspondente ao pKa do eletrólito de separação, com variação de ± uma

unidade. A concentração do eletrólito deverá estar numa faixa que varie de 5

a 200 mmol/L, uma vez que, ao utilizar uma concentração eletrolítica muito

baixa, pequenas quantidades de analitos podem ser adsorvidas pela coluna,

não reproduzindo seus tempos de migração, e utilizando altas

concentrações do eletrólito, poderá ocorrer um super aquecimento no interior

da coluna, denominado efeito Joule, o qual prejudica na separação dos

analitos (LANDERS, 1997).

Figura 5 – Influência do pH da solução tampão sobre a mobilidade do fluxo

eletroosmótico.

4.2.6. ADITIVOS

O uso de eletrólitos aditivados é bastante comum em CZE, uma vez

que o aditivo altera a mobilidade eletroforética do soluto; modifica o fluxo

eletroosmótico; solubiliza soluto ou composto na matriz da amostra, e reduz

a interação de certos solutos com a parede interna do capilar, minimizando a

adsorção. Na Tabela 2, ANEXO B, estão relacionados os principais aditivos

eletrolíticos empregados em CE.

4.2.7. DETECTORES

Os detectores podem ser classificados em dois tipos: universais e

específicos. Os detectores universais medem a diferença entre alguma

propriedade do soluto em relação à solução. Assim, o sinal não depende das

propriedades dos solutos, mas das propriedades do soluto e solução. Nesta

classe, estão incluídos os detectores de índice de refração e condutividade,

entre outros que empregam métodos indiretos. Apesar de universais, esses

detectores apresentam menor sensibilidade e intervalo dinâmico. Os

detectores específicos medem uma propriedade específica do soluto, a

detecção é limitada aos solutos que possuem a referida propriedade. Nesta

classe, estão incluídos os fotodetectores baseados na absorção na região do

UV/VIS, na fluorescência ou no espalhamento Raman, os espectrômetros de

massa, os detectores amperométricos e os radiométricos. (TAVARES, 1996,

KLAMPFL,. et al., 2000).

O uso dos detectores específicos é bastante vantajoso quando a

matriz da amostra é complexa e em situações nas quais é desejável

minimizar interferências de radiação de fundo. Este tipo de detector é

geralmente mais sensível do que os detectores universais e fornecem

intervalos mais amplos de resposta linear. Além disso, a relação sinal/ruído é

melhor. Consequentemente os detectores específicos encontram maior uso

que os universais.

Os principais métodos de detecção são:

Métodos ópticos - absorção de luz na região do ultravioleta-visível ou

infravermelho, fluorescência, índice de refração, Raman, absorbância termo-

óptica e quimiluminescência. Métodos eletroquímicos - amperométricos,

voltamétricos, condutométricos e potenciométricos. Outros métodos e

métodos acoplados - ressonância magnética nuclear, radiométricos,

espectrometria de massas e de emissão óptica com plasma indutivamente

acoplado (ICP-OES) (SILVA, 2003).

Os detectores são acoplados aos capilares eletroforéticos, que

geralmente são constituídos de uma camada externa de poliimida. Para o

acoplamento do capilar com o detector faz-se uma remoção de uma

pequena parte de camada da poliimida, onde realiza o acoplamento, e este

pode ocorrer de três maneiras distintas: quando o detector se posiciona

numa parte que não seja a extremidade do capilar, este é conhecido como

on column, se o detector encontra-se na extremidade de saída da coluna,

tem-se um acoplamento off column, porém, se a separação dos analitos

ocorrer por CE, e a injeção da porção separada ocorrer em outro detector,

esta é conhecida como end column. Neste trabalho empregou-se o modo on

column, conforme Figura 6.

O desenvolvimento de novos sistemas de detecção em eletroforese

capilar tem sido uma área de intensa pesquisa desde a implementação da

técnica (MIRANDA et al., 2002). Alguns detectores, de uso geral para

cromatografia líquida, são adaptados para eletroforese capilar. Além disso, a

diversidade de moléculas que se beneficiam do uso de métodos

eletroforéticos tem contribuído para a implementação de uma variedade de

princípios de detecção.

Figura 6 – Capilar de sílica após a remoção de poliimida.

4.2.8. CAPILARES

Os capilares mais usados possuem tamanho que variam de 30 a 100

cm de comprimento, com diâmetro interno que varia de 25 a 75 µm, e

diâmetro externo até 375 µm, são de sílica fundida, uma forma pura de

dióxido de silício amorfo, o qual lhe confere muitas propriedades

importantes, como dimensões precisas, alta constante dielétrica, baixa

condutividade elétrica, alta condutividade térmica, resistência mecânica e

particularmente, alta transmissão óptica para um intervalo apreciável do

espectro (190 a 900 nm). Quimicamente, os capilares de sílica são

caracterizados pela presença de vários grupos silanos (SiOH). (BAKER,

1995).

O uso de tubos com dimensões capilares minimiza as limitações

relativas ao efeito joule, já que a geometria do capilar (elevada área

superficial interna relativa ao volume) favorece a dissipação do calor gerado

pela passagem da corrente elétrica. Com isso, obtêm-se campos elétricos

elevados, resultando em maior eficiência e redução do tempo de análise

(BONATO et al., 2005). A poliimida, na parte externa da coluna, auxilia na

movimentação do capilar e, consequentemente evita a sua ruptura.

4.2.9. AGENTES MODIFICADORES DA SUPERFÍCIE CAPILAR

Vários procedimentos são utilizados para o controle da densidade de

carga na parede do capilar, visando tanto o controle do fluxo eletroosmótico

quanto a eliminação da interação soluto-capilar. O uso de capilares

revestidos internamente é uma prática comum, nestes capilares, os grupos

silanóis são bloqueados quimicamente pela reação com ligantes polares do

tipo organosilanos (trimetilclorosilano, y-metacriloxipropiltrimetoxisilano),

entre outros. Este tipo de revestimento tem-se mostrado efetivo por um

período de tempo limitado, devido à hidrólise reversível do oxigênio ligado ao

silício, particularmente em valores altos de pH (CAMILLERI, 1993).

Uma forma de manipulação da carga superficial do capilar é a

desativação dinâmica que decorre da adsorção física de agentes tensoativos

catiônicos, tais como os alquil derivados dos sais quaternários de amônio, a

escolha adequada do tamanho da cadeia do tensoativo, como sua

concentração, permite o controle direto da magnitude do fluxo eletroosmótico

e mesmo a sua inversão (COLOMBARA et al., 1997).

4.2.10. FLUXO ELETROOSMÓTICO (FEO)

Para a formação do fluxo eletroosmótico (FEO), utiliza-se geralmente

uma solução altamente básica, normalmente de hidróxido de sódio, e uma

solução tampão contendo um eletrólito de separação, da seguinte forma: A

solução básica, ao passar pela cavidade interna do capilar, dissocia os

grupos silanos presentes na parede interna do capilar, em seguida, íons da

solução tampão são atraídos para a parede do capilar e formam uma

camada carregada positivamente, denominada de camada fixa. Como essa

camada não é suficiente para neutralizar todas as cargas da parede, uma

segunda camada carregada também positivamente é formada. Esta última é

denominada de camada móvel. Entre essas duas camadas forma-se um

potencial denominado potencial zeta (ζ), o qual possibilita a migração da

camada móvel em direção ao cátodo (-). As moléculas de água que

solvatam o analito também contribuem para o deslocamento desta camada

móvel ao longo do capilar, esta força, responsável pelo transporte das

espécies iônicas ao longo do capilar é denominada de fluxo eletroosmótico

(FEO), (Figura 7).

Figura 7 – Formação do fluxo eletroosmótico.

O FEO depende diretamente do pH do eletrólito de separação, pois a

carga do capilar (C) é governada pela ionização dos grupos silanóis. Com o

incremento de pH de dois até oito, o fluxo eletroosmótico pode ser

aumentado até 10 vezes, em valores de pH menores que dois não há fluxo

eletroosmótico, pois a maior parte dos grupos de silanóis está protonado

(TAVARES, 1996). Outro fator fundamental no controle do FEO é o tipo de

revestimento interno da parede do capilar (HSIEH et al., 1998).

A alta concentração de eletrólitos no tampão, quando a temperatura é

controlada, leva a um decréscimo do FEO, pois elimina o potencial zeta. A

adição de modificadores como solventes orgânicos têm efeito variável, pois

afetará a viscosidade, constante dielétrica e potencial zeta, a influência deste

dependerá também da quantidade adicionada; por exemplo, adicionar

metanol à água aumenta a viscosidade da solução até a concentração de

50% (v/v) diminuindo desta forma a mobilidade da solução eletrolítica.

(SARMINI et al., 1997).

O perfil do fluxo eletroosmótico é do tipo radial, o que implica dizer

que as moléculas se movimentam em velocidades muito próximas,

diferentemente do fluxo pressurizado, o qual apresenta um perfil de

velocidade parabólico, como pode ser visto na Figura 8, isto significa uma

vantagem do fluxo eletroosmótico, uma vez que permite uma maior

eficiência na separação dos picos.

Figura 8 – Esquema ilustrando as diferenças entre o perfil do fluxo

pressurizado e o eletroosmótico.

4.2.11. INVERSÃO DO FLUXO ELETROOSMÓTICO

Agentes surfactantes são utilizados em CE, para modificação do meio

interno do capilar, dentre eles, a inversão do fluxo eletroosmótico, o uso teve

início com o trabalho pioneiro de D. W. Fuerstenau, que estudou o efeito de

sais quaternários de alquilamônio na magnitude do potencial zeta de esferas

de quartzo (COLOMBARA et al.; 1997).

O modelo atualmente aceito para inversão do fluxo está baseado na

formação de uma camada de semi-micelas na superfície interna do capilar.

(Figura 9). A estrutura (A

) representa a situação para o fluxo eletroosmótico

normal, no qual a superfície está negativamente carregada e os cátions, na

proximidade da superfície, estão arranjados de acordo com uma dupla

camada elétrica. Com a adição do surfactante catiônico ao eletrólito

condutor, uma pequena quantidade de monômeros do surfactante desloca

os cátions da dupla camada e são adsorvidos na superfície, as forças que

governam a adsorção, nesta etapa, são de caráter coulômbica, e atuam

entre os sítios de carga negativa da superfície e as cabeças dos

monômeros, carregadas positivamente. Quando a concentração do

surfactante adicionado ao eletrólito condutor aumenta, a adsorção de

monômeros prossegue, e eventualmente, alcança um ponto que todos os

sítios de carga da superfície são completamente neutralizados. Este estágio

caracteriza a formação de uma monocamada, na qual a cabeça dos

monômeros está firmemente ligada à superfície e a cauda voltada para a

solução. Desde que, com este arranjo não há carga efetiva na superfície, o

fluxo eletroosmótico é suprimido (A

). Um aumento da concentração do

surfactante na solução aumenta a possibilidade de interações coesivas entre

as caudas, possibilitando a formação de uma bicamada (A

), a adsorção das

semi-micelas é tal, que uma das cabeças é firmemente ligada à superfície,

enquanto que a cabeça diametralmente oposta está voltada para a solução.

Uma dupla camada composta de ânions é então organizada na solução

interfacial e, sob ação de um campo elétrico, o fluxo eletroosmótico é

invertido, ou seja, migra em direção ao anodo (+) (COLOMBARA et al.,

1997).

A compreensão do mecanismo de reversão do fluxo e das variáveis

que o afetam é necessária, para que a importância relativa de cada um

destes fatores seja determinada e levada em consideração, quando a busca

de condições apropriadas para otimização da separação de uma

determinada mistura se fizer necessário.

Figura 9 – Representação esquemática da adsorção de surfactantes sobre a

superfície interna de capilares de sílica fundida.

4.3. ASPECTOS CINÉTICOS E TERMODINÂMICOS DA CE

4.3.1. MOBILIDADE IÔNICA

A mobilidade iônica (µ) de um determinado analito é fundamental em

ECZ, uma vez que esta indicará o tempo de migração do analito em

presença de determinada solução tampão. Cada solução tampão,

proporciona um tipo de dissociação específica do analito, possibilitando uma

maior ou menor mobilidade iônica, e esta pode ser calculada seguindo a

equação 1. Onde a mobilidade é diretamente proporcional a velocidade

limite de cada analito (ν

), o qual depende da razão entre a sua carga e o

tamanho do raio atômico, sendo que, quanto menor o tamanho do átomo e

maior a sua carga, maior a velocidade limite, e inversamente proporcional ao

campo elétrico aplicado (E). As equações descritas a seguir foram retiradas

das referências bibliográficas (CAMILLERI, 1993; BAKER, 1995; TAVARES,

M.F.M. et al., 1997; TAVARES, M.F.M. et al., 1995).

(1)

A velocidade limite de um analito (ν

) pode ser calculada,

considerando a distância percorrida por um íon, num determinado capilar

que possuirá comprimento total (L), sobre uma unidade de tempo (t

), como

descrito na equação 2.

v =

(2)

4.3.2. EFEITO DOS PARÂMETROS ELETROFORÉTICOS SOBRE OS

PARÂMETROS DE SEPARAÇÃO

Os parâmetros que influenciam de forma significativa nas separações

dos analitos em eletroforese capilar são: tempo de migração, resolução e

eficiência.

4.3.2.1. TEMPO DE MIGRAÇÃO

Em eletroforese capilar, o tempo de migração (tm) de um analito,

dependerá do comprimento efetivo da capilar (l) e da velocidade observada

(ν

obs

) como mostrado na equação 3.

obs

tm =

(3)

Para o cálculo da velocidade observada (ν

obs

), deve-se considerar a

intensidade do campo elétrico aplicado (E) e a mobilidade observada (µ

obs

como demonstrado na equação 4.

obsobs

(4)

A mobilidade observada (µ

obs

) é a soma da mobilidade aparente (µ

que representa na verdade a mobilidade do analito com a mobilidade

eletroosmótica, (µ

feo

), formada a partir do fluxo eletroosmótico, como

demonstrado na equação 5.

feoapobs

(5)

A intensidade do campo elétrico é expressa pelo valor máximo do

gradiente de potencial (V) por unidade de comprimento (L), como descrito na

equação 6.

(6)

Logo, substituindo a equação 4 na equação 3, temos a equação 7, a

qual relaciona o tempo de migração com a intensidade do campo elétrico e a

mobilidade do fluxo eletroosmótico.

feo

(7)

Por fim, ao substituir a equação 6 na equação 7, vemos que o tempo

de migração (tm) é diretamente proporcional ao comprimento efetivo (l) e ao

comprimento total (L) do capilar , e inversamente proporcional a mobilidade

observada (µ

feo

) e a voltagem aplicada (V) (equação 8), dessa forma é

vantajoso o uso de capilares que possuam pequenos comprimentos efetivos

(l) e total (L).

feo

(8)

Ainda podemos expressar o tempo de migração dos analitos em

função da mobilidade aparente (µ

) com a mobilidade efetiva (µ

feo

), ao

substituirmos a equação 5 na equação 8, como mostrado na equação 9.

( )

feoap

µµ

(9)

4.3.2.2. RESOLUÇÃO E EFICIÊNCIA

As equações tradicionais que descrevem resolução e eficiência em

CZE incorporam o fenômeno de difusão como única causa de alargamento

das zonas, e podem ser escritas, como as representadas pelas equações 10

e 11.

( )

11,













−=

feomédia

apiapiii

µµ

(10)

(

)

feoef

µµ

(11)

Onde: (µ

api

) e (µ

api+1

) são as mobilidades aparentes de dois solutos

eluindo em posições adjacentes, (µ

média

) é a mobilidade média dos solutos,

(µ

) é a mobilidade eletroforética do soluto i, (µ

feo

) é a mobilidade do fluxo

eletroosmótico, (V) é a diferença de potencial aplicada, (D) é a média dos

coeficientes de difusão dos dois solutos, (L) é o comprimento do capilar e (l)

é a distancia do ponto de injeção à posição do detector (comprimento

efetivo).

As equações 10 e 11 indicam que o uso de voltagens elevadas é

vantajoso, pois implica em um ganho de resolução e eficiência. Outra

observação pertinente é que, em separação difícil, a resolução de pares de

solutos migrando muito próximos pode ser melhorada pelo ajuste da

magnitude do fluxo eletroosmótico. Quando a mobilidade eletroosmótica for

aproximadamente igual, mas de sinal oposto à mobilidade dos solutos, um

ganho de resolução é alcançado (equação 10), com perda de eficiência

(equação 11). (TAVARES, 1997).

4.3.3. TEMPERATURA

As separações dos analitos em CZE são influenciadas pela variação

da temperatura, uma vez que esta altera a eficiência, o tempo de migração,

o volume de amostra injetado e a resposta do detector. (BAKER, 1995).

Os principais parâmetros considerados no controle da temperatura

são:

1 – Voltagem (V) aplicada nas separações, a qual pode ser calculada

com auxílio da equação 12. Em CZE existe uma relação linear de voltagem e

corrente até um ponto máximo, esse ponto é o ponto que nos permite saber

qual voltagem a ser utilizada nas analises, a partir desse ponto não temos

mais uma linearidade observada, o qual não possibilitará resultados

repetitivos.

LiRV

(12)

Onde (L) é o comprimento total da capilar, (i) é a corrente aplicada e (R)

resistência.

Ao Aumentar progressivamente a voltagem do sistema, pode-se ter

um superaquecimento interno da solução, ocasionando o efeito joule. De

acordo com a equação abaixo, quanto menor diâmetro interno do capilar

menor é o

∆

t no interior da coluna. A variação da temperatura entre a parede

interna do capilar e o seu centro pode ser calculada com auxílio da equação

13.

239,0

=∆

(13)

Onde: (∆t) é a variação de temperatura (ºC), (Q) é a densidade de potência

W/m

, (r) raio interno do capilar cm e (K) é a condutividade térmica em

W/cm.(ºC).

4.3.4. FLUXO ELETROOSMÓTICO

Para entender o desenvolvimento do fluxo eletroosmótico é preciso

examinar as forças que atuam na proximidade da superfície do capilar,

quando um campo elétrico tangencial é estabelecido. A solução dentro do

capilar é dividida em camadas concêntricas, onde cada camada possui uma

distribuição de íons do tipo Boltzmann, e espessura infinitesimal (dx). As

forças atuantes são de natureza elétrica e de atrito, no qual a força elétrica

atua em todos os íons presentes no seguimento da solução, sendo

proporcional à magnitude do campo elétrico (E) e à densidade da solução

(p). (TAVARES, 1996). Portanto pode-se calcular esta força seguindo a

equação 14.

dxpEFF

elétrica

(14)

Outro fator fundamental na formação do fluxo eletroosmótico, é o

potencial zeta (ζ), formado a partir da criação de duas camadas difusas

positivas, possibilitando que uma delas se mova em direção ao cátodo (-).

Pode ser calculado considerando a equação (15), onde: (σ) é a espessura

da dupla camada difusa, (e) carga por unidade de área, e (k) é a constante

dielétrica do tampão.

πσ

(15)

A velocidade (vfeo) e a mobilidade do fluxo eletroosmótico (µfeo) são

diretamente proporcionais ao potencial zeta (ζ), e podem ser calculados

seguindo a equação 16, e a equação 17 respectivamente.

veof

(16)

feo

(17)

Onde: (k) é a constante dielétrica do tampão, (E) é o campo elétrico

(volts/cm) e n é a viscosidade da solução tampão.

4.3.5. VOLUME INJETADO DA AMOSTRA E COMPRIMENTO DE ZONA

Para avaliar o comprimento inicial da zona, e o volume de

amostra injetada no capilar, o modo de injeção precisa ser considerado. Na

introdução hidrodinâmica, a amostra é injetada no capilar por uma pressão

criada pela diferença de gravidade ou por vácuo em uma das extremidades

do capilar, durante um pequeno intervalo de tempo. Sob condições de fluxo

laminar, o comprimento da zona, é então determinado pela equação de

Hagen-Poiseuille, representada pela equação 18, e o volume injetado, cerca

de nL, pela equação 19.

injhdinj

∆

(18)

htdx

1084,2

−

(19)

Onde: H

inj, hd

é o comprimento de zona da injeção hidrodinâmica, (t

inj

)

é o tempo de injeção, η é a viscosidade da solução e (∆P) é a diferença de

pressão estabelecida entre as extremidades do capilar, (r) raio interno do

capilar e (L) comprimento total do capilar, (

i) é o volume de amostra

injetado (nL), (h) altura da injeção, (t) tempo de injeção e (d) é o diâmetro

interno do capilar. Quando a injeção hidrodinâmica é feita por aplicação de

pressão na entrada do capilar, ou vácuo na saída do capilar, a diferença de

pressão é conhecida. Quando a injeção é feita através de sifonagem, a

diferença de pressão pode ser calculada ela equação 20.

hgP

∆

(20)

Onde: (∆h) é a diferença de altura entre o nível de solução nos dois

reservatórios, (р) é a densidade da solução e (g) é a aceleração da

gravidade.

Na introdução eletrocinética de amostra, um gradiente de

potencial (V) é estabelecido no capilar, por um breve período. O

comprimento da zona injetada (H

inj,ec

) é determinado pela mobilidade

aparente (µ

) do componente de maior mobilidade na amostra, e da

mobilidade eletroosmótica (µ

feo

) e do tempo de injeção (t

inj

), considerando o

comprimento total do capilar (L) como pode ser visto na equação 21, e o

volume de injetado (

i) nesta modalidade pode ser analisado com a equação

22.

(

)

injepfeoinj

µµ

ec ,

(21)

(

)

ctrV

feoap

µµ

+Π

(22)

Onde: (V) é a voltagem aplicada, (c) a concentração da amostra,

(t) é o tempo de injeção, (r) é o raio interno do capilar, (µ

) é a mobilidade

aparente, (µ

feo

) e a mobilidade do fluxo eletroosmótico, e (L) é o

comprimento total da coluna.

5. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Nesta etapa do trabalho, faz-se necessário discutir o emprego da

técnica da eletroforese capilar de zona, que está sendo utilizada com muita

ênfase para a determinação de ácidos orgânicos em matrizes como

amostras de sucos de frutas e gêneros alimentícios. Para isso, encontram-se

a seguir alguns trabalhos publicados que mostram a aplicabilidade da CZE

bem como a sua importância para as determinações de ácidos orgânicos em

amostras de sucos de frutas e em gêneros alimentícios (WU et al., 1995;

SCHIEWE et al., 1995; TREVASKIS et al., 1995; ARELLANO et al., 1997;

CHOI et al., 1997; FUKUSHI et al., 1997; HORIE et al., 1998; SOGA et al.,

1999; SAAVEDRA et al., 2000; CASTIÑEIRA et al., 2000; FUNG et al., 2001;

CASTIÑEIRA et al., 2002; XU et al., 2002; FUNG et al., 2003; GALLI et al.,

2004; VICKERS et al., 2007; MATO et al., 2007, TANG et al., 2007;

SANTALAD et al., 2007 PERES et al., 2009).

Em 1995, SCHIEWE et al. propuseram um sistema CZE para análise

de L – aa em menos de 8 min em amostras de sucos cítricos tal como

laranja e tangerina e em formulação de fármacos. Os autores utilizaram um

capilar de sílica fundida, com 515 mm de comprimento efetivo x 0,05 mm d.i.

e detecção UV on-column em 200 nm. As amostras foram filtradas num

papel de filtro e diluídas quando necessárias, sendo fundamental a adição

da L–cisteína, como antioxidante. O sistema proposto permitiu a avaliação

da redução do ácido ascórbico nas amostras estudadas com e sem adição

da L–cisteína, num período de 6 horas. Assim, após 6 horas, foi possível

avaliar que houve uma redução de 80% de sua concentração inicial. Foram

encontrados 508-516 µg/mL (±5 µg/mL) nas amostras dos sucos de

tangerina e 143-164 µg/mL (±2 µg/mL) nas amostras de sucos de

laranja, com limite de detecção entre 1-4 µg/mL.

WU et al., 1995 discutiram a importância da combinação de eletrólitos

de separação com inversores de fluxo eletroosmótico,. a fim de se saber

qual deles teria uma maior absorção considerando uma faixa de

comprimento de onda (200 a 350 nm). Dessa forma, os autores constataram

que a mistura do ácido trimetílico (TMA) como eletrólito de separação e

brometo de tetradeciltrimetilamônio (TTAB) como inversor de fluxo

eletroosmótico possibilitou o máximo de absorção em um comprimento de

onda de 220 nm. Outro aspecto muito importante discutido neste trabalho foi

em relação a mobilidade dos analitos em diferentes concentrações do TTAB,

para isto estudou-se a mobilidade dos analitos em concentrações de 0,5 a 5

mmol/L do TTAB. A partir desse estudo, verificou-se que o uso do inversor

acima de 2 mmol/L, ocasionava problemas de co-migração entre os ácidos

tartárico, málico e succínico, portanto os melhores resultados foram obtidos

utilizando 1 mmol/L do inversor. Outro ponto discutido foi para a escolha do

pH, o qual foi testado com duas soluções tampão, uma com pH 5,5 e a outra

com pH 9,0. A simetria no perfil do pico foi melhor quando usaram solução

tampão com pH 9,0. Outro aspecto relevante, no que se refere a oxidação

de ácidos orgânicos, é a facilidade que o L – aa tem de se oxidar, para

avaliar a oxidação do L – aa, os autores prepararam uma solução padrão de

L – aa a 0,1 mmol/L, e fizeram as seguintes observações: Após 48 horas de

estocado no escuro houve uma redução de 45% no conteúdo do L – aa

presentes na solução, após 3 horas de exposição da solução a luz a

oxidação do L – aa foi de 80%. Diante das observações realizadas com os

experimentos, a solução tampão continha 5 mmol/L de ácido trimetílico, 1

mmol/L do TTAB, pH 9,0, 20 kV, 20 µA, injeção hidrodinâmica por 3 s, 25 ºC.

Dois capilares de sílica fundida foram utilizados, um com 43 cm de

comprimento total x 75 µm d.i x 365 µm diâmetro externo (36 cm efetivo)

para a escolha da solução tampão, o outro para a separação dos analitos

continha 70 cm de comprimento total x 75 µm d.i x 365 µm d.e. (63 cm

efetivo) Os ácidos oxálico, cítrico, tartárico, acético, málico, succínico,

láctico, carbônico, aspártico, glutâmico e ascórbico, foram identificados e

quantificados em amostras de bebidas, sucos industrializados e chás em

menos de 10 min. As amostras foram preparadas a partir de uma simples

filtração (0,2 µm) com posterior diluição.

A CZE também foi empregada por TREVASKIS et al., 1995, que

separaram e quantificaram ácido oxálico, em amostras de beterraba,

brócolis, cenoura e aipo. O ácido oxálico foi extraído com uma solução

contendo 0,1 mol/L de ácido clorídrico a 60 ºC ou com uma solução

contendo 1,0 mol/L ácido clorídrico a 90 ºC por 30 min. Os resultados foram

comparados com outros dois métodos, a cromatografia líquida de alta

eficiência e um método enzimático. Para o desenvolvimento deste método,

utilizou-se um capilar de sílica fundida 75 µm diâmetro interno e 75 cm de

comprimento total, sendo 50 cm efetivo, e detecção UV em 254 nm. As

amostras foram injetadas no capilar a 20 KPa/s, com voltagem de 20 kV e 28

ºC. A solução tampão continha 10% de metanol, 10 mmol/L tetrahidrato

cromato de sódio e 4 mmol/L modificador de fluxo eletroosmótico. Os

autores relataram que o uso do metanol foi fundamental na separação do

ácido oxálico em presença do ânion nitrato. O coeficiente de variação foi de

2,7 a 4,9%, além disso, o método demonstrou boa linearidade dentro das

faixas de trabalho consideradas, com coeficiente de correlação de 0,9994.

Comparando-se os resultados obtidos, entre CZE e os outros dois métodos

propostos, todos demonstraram semelhanças nos resultados, para

realização das analises por CZE houve menor consumo de reagentes,

menor custo e tempo de análise.

ARELLANO et al., 1996, determinaram ácidos orgânicos tais como o

oxálico, tartárico e cítrico em amostras de vinhos branco, vermelho e em

sucos maçã, por meio da eletroforese capilar de zona. Após otimização, o

sistema empregou solução eletrolítica com 3 mmol/L 1,2,4,5-ácido

tetracarboxílicobenzoico (PMA), 3 mmol/L ácido etilenodiaminotetracético

(EDTA), pH= 7,5. Utilizou-se um capilar de sílica fundida de 45 cm de

comprimento, sendo 7 cm de comprimento efetivo x 75 µm de diâmetro

interno, detecção a 220 nm, voltagem de separação de 20 kV (7,4 µA). Os

autores relataram que todos os ânions tiveram um menor tempo de análise

ao utilizar 3 mmol/L de PMA, 20 kV, e temperatura constante em 30 ºC. Para

condicionamento do capilar, utilizou-se hidróxido de sódio (NaOH) a 0,1

mol/L por 1 min, água 1 min, solução tampão por 2 min, a injeção foi

hidrodinâmica por 2 s. O ácido tartárico foi encontrado somente nas

amostras de vinho branco e vermelho. Para validação do método, avaliou-se

a precisão que foi <0,54% (n=18), limite de detecção de 0,006 a 1,072 mg/L,

limite de quantificação de 0,020 a 3,574 mg/L, o método foi linear de 0,1 a

100 mg/L, para os ânions em estudo, com coeficientes de correlação maior

do que 0,99.

CHOI et al., 1997, analisaram o L – aa presente em chocolates,

doces, biscoitos, alimentos balanceados, em vegetais, e sucos de frutas,

como o suco de laranja, kiwi e maçã. Posteriormente, compararam os

resultados com os resultados obtidos por cromatográfica líquida de alta

eficiência (HPLC) e por um método enzimático empregando o reagente 2,4-

dinitrofenilhidrazina (DNP). As condições eletroforéticas utilizadas foram:

capilar de sílica fundida de 37 cm de comprimento total e 57 µm de d.i., com

tampão borato de sódio pH 8,0, comprimento de onda de 245 nm e campo

elétrico de 556 V/cm. O tempo de análise foi de 2 min, com o coeficiente de

variação que variou de 0,5 a 1,2%, e coeficiente de correlação de 0,9930 e

recuperação entre 95 a 98,6%. A partir dos resultados obtidos, constatou-se

que a CZE apresentou menor tempo de análise, cerca de 2 min enquanto

que a HPLC gastou 15 min e o método enzimático (DNP) apresentou o

maior tempo, cerca de 360 min. Concluiu-se que a CZE apresentou

vantagens significativas em relação ao tempo necessário para a análise

química, maior precisão em relação ao método enzimático DNP, e

principalmente um menor custo por análise.

FUKUSHI et al., 1997 determinaram L –aa em amostras de vegetais

tais como espinafre, nabo e salsa, utilizando eletroforese capilar de zona, em

menos de 9 min, com detecção na região do UV (λ = 270 nm), 25 °C. Um

volume de 12 nL de amostra foi injetada por 3 s, o capilar foi de sílica

fundida com 72 cm de comprimento (50 cm efetivo) e 20 kV, 50 µm d.i.x 375

d.e. Para a escolha do tamanho do capilar e da voltagem aplicada, analisou-

se a eficiência do método, medidos em pratos teóricos de duas condições.

Primeira: 15 kV, comprimento do capilar 54 cm (25 cm efetivo), segunda: 20

kV, comprimento do capilar 70 cm (50 cm efetivo). A segunda condição foi

escolhida por apresentar um maior número de pratos teóricos (96000) em

relação a primeira (83000). A solução tampão continha 20 mmol/L de

tetraborato de sódio como eletrólito de separação, pH 9,2. Para a extração

do L – aa, 2 gramas do vegetal em estudo foram homogeneizados com 4 mL

de triuréia a 2%, e em seguida adicionaram-se 14 mL de ácido hidroclórico a

10 mmol/L, ficando em repouso por 15 min, homogenizou-se a mistura e a

centrifugou (3000 rpm) por 5 min. A suspensão era filtrada (0,45 µm) e

injetada em seguida. O método proposto demonstrou ótimos valores de

recuperação (97 a 104%).

O trabalho discutido por HORIE et al., 1998, determinou e quantificou

os ácidos oxálico, cítrico, fluorídrico, málico, aspártico, glutâmico e cínico em

chá verde e em chá preto, utilizando eletroforese capilar de zona,em menos

de 6 min, com detecção no UV (λ = 254 nm) temperatura de 20 ºC. Para

preparação das amostras a serem analisadas, 3 gramas da folha foram

fervidos com água (180 mL) por 3 min, e posterior filtração. Logo após,

foram adicionados 0,25 mmol/L do ácido etilenodiaminotetraacético

dissódico, para reduzir a influência de algum metal. O capilar foi de sílica

fundida, com 57 cm de comprimento (360 µm diâmetro externo- x 75 µm d.i),

as amostras eram injetadas por pressão durante 5 s e a voltagem de 20 kV.

O pré-condicionamento do capilar era feito com a passagem constante de

ácido hidroclórico a 0,1 mol/L, hidróxido de sódio a 0,1 mol/L e a solução

tampão que continha 10 mmol/L de cromato, como eletrólito de separação,

0,5 mmol/L brometo de tetradeciltrimetilamônio como inversor do fluxo

eletroosmótico. Validou-se o método analisando o coeficiente de variação, o

qual ficou entre 0,40 a 0,83% para o tempo de migração, e de 0,93 a 3,53%

para a área do pico, o método foi linear na faixa de trabalho correspondente

(0,2-1000 mg/L). A recuperação variou de 97 a 105% para o chá verde, e de

97 a 102% para o chá preto.

SOGA et al., 1999, demonstraram a separação simultânea de ácidos

orgânicos, oxálico, fumárico, tartárico, málico, cítrico, acético e láctico, e de

metais utilizando EDTA como agente complexante. O fluxo eletroosmótico foi

invertido e empregou 2,6-ácido piridinodicarboxílico (PDC) como solução de

separação. Os ácidos e os complexos foram detectados por UV em

amostras de banho de chaparia. Neste estudo, foram utilizados dois

eletrólitos de separação, um contendo PDC com adição de EDTA, e outro

contendo ftalato. Usando a primeira solução tampão, houve separação

completa dos ácidos orgânicos em 15 min. Os melhores resultados, em

termos de tempo de análise e perfil do pico, foram obtidos quando utilizou-se

solução contendo 20 mmol/L de PDC com 0,5 mmol/L (CTAB) como inversor

do fluxo eletroosmótico. A separação dos ácidos orgânicos foi estudada

variando-se o pH da solução de separação de 3,6 a 6,4. Observou-se um

aumento de mobilidade para todos os ácidos com o aumento do pH até 5,7,

permanecendo constante até 6,5. O CV (n=6), para o tempo de migração

variou de 0,12% a 0,16% e para a área do pico a variação foi de 1,1% a

3,9%. A curva de calibração foi linear para todos os analitos numa

concentração de 10 a 100 mg/L, com valor mínimo de coeficiente de

correlação de 0,9920, e o maior valor do limite de detecção foi 1,9 mg/L.

Em 2000, SAAVEDRA et al., propuseram um sistema eletroforético

capilar de zona para determinação e quantificação de 4 ácidos orgânicos

(isocítrico, málico, tartárico e cítrico) em sucos de laranja, dentre eles, os

autores realçaram os ácidos tartárico e cítrico como sendo característicos

dos sucos de laranja. Para a preparação da amostra, foi necessário uma

filtração do líquido extraído da fruta, e filtrado em seguida com um filtro de

0,45 µm, e diluído com água destilada 1:1 (v/v). As separações foram

realizadas em um capilar de sílica fundida com 57 cm de comprimento total,

50 µm de diâmetro interno, a detecção foi feita na região ultravioleta a 200

nm, a injeção foi feita no modo hidrodinâmico, com auxílio de pressão

constante de 5 s, e a voltagem de separação foi de 14 kV. Para a escolha do

tampão, fez-se um estudo utilizando 200 mmol/L do ácido fosfórico, com

adição de hidróxido de sódio, num intervalo de pH de 3,0 a 8,0 (

∆

=0,5). As

melhores respostas em termos de simetria de pico e precisão foram obtidas

utilizando-se a solução tampão no pH 7,5. Segundo os parâmetros de

validação, o método proposto mostrou-se linear nas faixas de trabalho

consideradas, com coeficientes de correlação maior que 0,9900. Os testes

de recuperação variaram de 97 a 104% para todos os analitos, e o

coeficiente de variação ficou entre 3,3 a 4,0%. Para avaliar a precisão do

método proposto, os autores trabalharam com 24 soluções padrão, e

analisaram 44 amostras de sucos de laranja obtidas num supermercado

local. As quantidades dos ácidos orgânicos encontradas nos sucos de

laranja foram: Ácido isocítrico de 0,3920 a 0,8380 g/100mL, ácido málico de

0,0008 a 0,0210 g/100mL, ácido tartárico de 0,1100 a 1,3400 g/100mL, ácido

cítrico de 0,0650 a 0,1120 g/100mL, o limite de detecção variou de 0,002 a

0,009 g/L, para todos os ácidos.

CASTIÑEIRA et al., 2000, desenvolveu um método eletroforético de

zona para identificar e quantificar ácido tartárico, málico, succínico, acético e

láctico em amostras de vinhos, diluindo-os de 1:40 com água destilada, e

filtrando as amostras em seguida com um filtro de 0,45 µm. O sistema ficou

definido após a otimização da concentração do eletrólito de separação, pH e

concentração do inversor do fluxo. As análises foram realizadas em um

capilar de sílica fundida de 60 cm de comprimento total e 75 µm de diâmetro

interno, comprimento de onda de 185 nm, 20 kV, injeção hidrodinâmica por

30 s. Para a escolha do eletrólito, analisou-se o perfil do pico de todos os

ácidos orgânicos, nas seguintes condições: Primeira – 10 mmol/L do ácido

bórico + 0,5 mmol/L de brometo de tetracetiltrimeilamonium (MTAB) em pH

de 6,0 a 6,5, voltagem de 20 kV, injeção hidrodinâmica por 20 s (λ = 254

nm), segunda – 10 mmol/L do ácido benzóico + 0,5 mmol/L de MTAB em

pH de 6,0 a 6,5, voltagem de 20 kV, injeção hidrodinâmica por 20 s e

detecção a 185 nm; terceira – 10 mmol/L de NaH

/Na

HPO

+ 0,5

mmol/L MTAB em pH de 6,0 a 6,5, voltagem de 20 kV, injeção hidrodinâmica

por 20 s e detecção a 185 nm; quarta – 10 mmol/L de ácido fitálico + 0,5

mmol/L MTAB em pH de 6,0 a 6,5, voltagem de 20 kV, injeção hidrodinâmica

por 20 s e detecção a 254 nm; quinta – 10 mmol/L de ácido sórbico + 0,5

mmol/L MTAB em pH de 6,0 a 6,5, voltagem de 20 kV, injeção hidrodinâmica

por 20 s e detecção a 214 nm. A partir desse estudo, escolheu-se a terceira

condição (10 mmol/L de NaH

/Na

HPO

+ 0,5 mmol/L de MTAB em pH

de 6,0 a 6,5, voltagem de 20 kV, injeção hidrodinâmica por 20 s e detecção a

185 nm) por apresentar os melhores perfis de picos, eficiência na resolução

e linha de base estável. Para a escolha do pH, trabalhou-se com o eletrólito

de separação NaH

/Na

HPO

em λ = 185 nm, variando o pH de 5,5 a

7,0, sendo que o os melhores resultados, em termos de simetria de pico,

foram alcançados utilizando pH 6,5. Para a escolha da concentração do

eletrólito de separação, estudou-se a mobilidade dos analitos em soluções

eletrolíticas contendo de 3 a 10 mmol/L do NaH

/Na

HPO

. A partir dos

resultados obtidos, percebeu-se que houve uma diminuição da mobilidade

dos analitos e um aumento de tempo na análise à medida que aumentou a

concentração do eletrólito de separação, por isso escolheu-se trabalhar com

eletrólito de separação 3 mmol/L. O método proposto consumiu baixa

quantidade de reagentes, com tempo máximo de análise de 6 min. A

reprodutibilidade para área do pico foi de 0,40 a 0,96% (n=10), e para tempo

de análise foi de 0,94 a 1,06% (n=10). O limite de detecção foi de 0,015 a

0,054 mg/L, e o limite de quantificação foi de 0,050 a 0,178 mg/L, a o

método proposto mostrou-se linear para todos os analitos até 50 mg/L, com

coeficiente de variação de 0,9993 a 0,9999.

Os trabalhos que analisaram ácidos orgânicos em sucos de frutas

frescos ou em sucos industrializados, ou ainda em amostras de bebidas

fermentadas, através da CZE, demonstraram muita facilidade na preparação

das amostras a serem analisadas, eram somente filtração e diluição com

água destilada, diferentemente das análises de ácidos orgânicos por CZE,

realizadas em amostras de plantas ou em chás. O trabalho proposto por

FUNG et al., 2001, deixou bem claro essa diferença, uma vez que os ácidos

oxálico, tartárico e cítrico foram extraídos de plantas da tradicional medicina

chinesa (Flos chrysthemi, Spica prunellae e Folium mori), da seguinte forma:

As plantas foram secas a 40 ºC por 24 h em forno, e armazenadas em um

dessecador, a extração foi realizada com 0,1 mmol/L de hidróxido de sódio

por 20 min, e filtradas posteriormente (0,2 µm). Outro aspecto muito

interessante discutido em seu trabalho foi em relação a escolha da solução

tampão. Os ácidos orgânicos de cadeia curta como o oxálico, tartárico e

cítrico, é minoria em relação a outros ácidos de cadeia longa (presente em

plantas) os quais possuem grandes semelhanças nas suas mobilidades,

para diferenciar essas mobilidades estudou-se primeiro o efeito de vários

aditivos para supressão do fluxo eletroosmótico, e o melhor resultado foi

quando usou 1,5 mmol/L tetraetilenopentamino (TEPA), com essa

concentração alguns ácidos tiveram problemas de co-migração, os quais

foram resolvidos ajustando o pH até 8,4, para melhorar ainda mais a

diferença de mobilidade entre eles, utilizou-se solução tampão contendo

20% de metanol, portanto as melhores condições da solução tampão para

separação e quantificação dos analitos foram: 3 mmol/L de 1,3,5-ácido

benzenotricarboxílico (BTA), 15 mmol/L tris(hidroximetil)aminometano, 1,5

mmol/L tetraetilenopentamino pH 8,4, ajustado com hidróxido de lítio e 20%

de metanol. O capilar foi de sílica fundida 65 cm de comprimento x 75 µm

d.i., 18 kV de voltagem, corrente de 6 µA, injeção da amostra hidrodinâmica

a 8 cm por 25 s e absorção dos analitos na região do UV (254 nm). O

método apresentou bons resultados nos parâmetros de validação, sendo

que o limite de detecção variou de 90 a 190 mg/g, a repetibilidade foi de 4,47

a 6,99%, n=4.

CASTIÑEIRA et al., 2002 discutiram sobre a determinação e

quantificação de cinco ácidos orgânicos, tartárico, málico, acético, succínico,

e láctico em amostras de vinho em menos 7 min, utilizando a eletroforese

capilar de zona, com detecção na região do UV (λ = 215 nm), injeção da

amostra por 30 s. As amostras foram preparadas a partir de uma simples

filtração (0,45 µm) e posterior diluição, seguindo a proporção de 1:40

(vinho/água ultra pura). O capilar utilizado foi de sílica fundida com 60 cm de

comprimento total (75 µm d.i), detecção on-colunm, com polaridade

invertida. O condicionamento do capilar ocorreu com a passagem constante

de NaOH a 0,1 mol/L durante 5 minutos, água ultra pura durante 10 min e a

solução tampão por 10 min.

Fatores como pH, concentração do eletrólito de separação, e do

inversor do fluxo eletroosmótico, foram fundamentais para a escolha da

solução tampão. Empregaram-se duas soluções tampão, uma contendo

fosfato e a outra ácido fitálico, da seguinte forma: Para a escolha do pH,

estudaram-se as soluções numa faixa de pH de 5,5 a 7,0, sendo que os

melhores resultados foi de 6,5 para a solução tampão que continha fosfato, e

de 6,1 para a que continha ácido fitálico, para a escolha da concentração do

eletrólito de separação, trabalhou-se com fosfato em concentrações de 3 a

10 mmol/L, e com ácido fitálico em concentrações de 5 a 10 mmol/L, as

melhores respostas em termos de sensibilidade/tempo, se deu quando

utilizaram-se 3 mmol/L para a solução contendo fosfato e 7 mmol/L para a

solução contendo ácido fitálico. No que se refere a quantidade do inversor

do fluxo eletroosmótico (MTAB), estudou sua concentração em 0,5 e 2,0

mmol/L, na solução que continha fosfato, enquanto que na solução que

continha ácido fitálico, as concentrações do inversor foram de 0,5 e 3,0

mmol/L. Para o uso de metanol, estudou-se, em ambos os casos, a

mobilidade dos ácidos, na presença de metanol até 20% (v/v). Os autores

puderam perceber a diminuição da mobilidade de todos os ácidos orgânicos.

Para a solução contendo fosfato, o uso de metanol não foi eficiente, uma vez

que os analitos tiveram mobilidades muito próximas. Para a solução que

continha o ácido fitálico, o uso de 5% de metanol favoreceu uma boa

diferença de mobilidade entre todos os ácidos, logo as melhores condições

das soluções tampão foram: Primeira solução tampão – continha 3 mmol/L

fosfato como eletrólito de separação e 0,5 mmol/L (MTAB) como inversor do

fluxo eletroosmótico, pH 6,5, tempo de análise menos de 6,5 min. Segunda

solução tampão – continha 7 mmol/L de ácido fitálico como eletrólito de

separação, 2 mmol/L de (MTAB) como inversor do fluxo eletroosmótico e 5%

de metanol, para diminuir a mobilidade dos analitos, e pH 6,1 o qual

possibilitou que os ácidos fossem analisados em 7,0 min. Tanto com o uso

da primeira solução tampão, quanto da segunda, os ácidos apresentaram

boa formação e simetria no perfil dos picos, porém, escolheu-se a primeira

solução por apresentar uma maior sensibilidade. Validou-se o método

proposto com análises de recuperação que ficou entre 98 a 107%, precisão

para o tempo de migração (0,94 a 1,06%) e para a área do pico (0,40 a

0,96%), O limite de detecção foi de 0,015 e 0,054 mg/L.

XU et al., 2002, identificaram e quantificaram ácidos orgânicos como

oxálico, tartárico, málico e cítrico em amostras de extratos de plantas, em

menos de 6,5 min, utilizando um sistema eletroforético de zona, com

detecção na região do UV (λ = 190 nm), capilar de sílica fundida com 75 cm

de comprimento (70,4 cm efetivo x 50 µm d.i.), injeção hidrodinâmica por 10

s, 25 ºC, 20 kV de voltagem se separação, solução tampão contendo 30

mmol/L de fosfato de sódio como eletrólito de separação, 1 mmol/L de

tetradeciltrimetilamônio como inversor do fluxo eletroosmótico e 20% (v/v)

acetonitrila como solvente orgânico, pH 6,5. Os ácidos orgânicos foram

obtidos a partir da extração com de 0,1 g da do extrato de planta com 5 mL

de água destilada a 50 ºC por 60 min, em seguida a solução era

centrifugada e a suspensão filtrada em um filtro de membrana de 0,45 µm. O

método proposto mostrou-se linear entre 0,01 a 1,00 mmol/L, dependendo

do ácido estudado, o limite de detecção variou de 1,0 a 8,0 mmol/L, e o

coeficiente de variação para a área do pico foi de 1,9 a 3,6%.

Alguns analitos possuem mobilidades idênticas, e esta característica é

prejudicial na separação entre eles, porém, para diferenciar estas

mobilidades pode-se utilizar um solvente orgânico. Os trabalhos propostos

por WU et al., 1995 e FUNG et al., 2001, discutiram sobre a importância de

se utilizar um solvente orgânico para diferenciar a mobilidade entre alguns

analitos, para que migrassem em tempos distintos. Mais uma vez, FUNG et

al., 2003, discutiram sobre essa importância, utilizando o

tetraetilenopentamino (TEPA), como solvente orgânico, para evitar qualquer

problema de co-migração entre os ácidos orgânicos em estudo. O método

eletroforético de zona proposto, com polaridade e fluxo invertido, possibilitou

a determinação de ácidos orgânicos tais como tartárico, cítrico, acético,

láctico e ascórbico em sucos de laranja e em vinhos em menos de 14 min,

com injeção de amostra em torno de nanolitros. As amostras foram obtidas a

partir de uma simples filtração (0,45 µm) e posterior diluição de 1:50 (v/v). A

solução tampão continha 3 mmol/L de 1,3,5-ácido benzenotricarboxílico

(BTA), 15 mmol/L tris(hidroximetil)aminometano e 1,5 mmol/L

tetraetilenopentamino (TEPA) pH 8,4, ajustado com hidróxido de lítio. O

capilar foi de sílica fundida 65 cm de comprimento x 0,05 mm d.i., 25 kV de

voltagem, corrente de 0,006 mA, injeção da amostra hidrodinâmica a 8 cm

por 20 s e absorção dos analitos na região do UV (240 nm). O método

proposto apresentou ótimos resultados de repetibilidade para o tempo de

migração (0,27 a 0,67%, n=5), e boa precisão para a altura do pico (3,2 a

4,2%, n=5) e área (3,1 a 4,5%, n=5), os coeficientes de correlação foram

maiores do que 0,997, para uma faixa de trabalho de 0,005 a 2,000 mmol/L,

O limite de detecção foi de 1 a 4 mmol/L.

O trabalho de GALLI et al., 2004, demonstra como a CZE vem se

consolidando como técnica analítica para o controle de qualidade de ácidos

orgânicos em frutos. Os autores propuseram a determinação de ácidos

orgânicos em amostras de frutos do cafeeiro. Com o sistema proposto foram

separados e determinados 17 ácidos orgânicos, dentre eles, o ácido oxálico

e o cítrico, ambos extraídos do café em pó da seguinte forma: As amostras

de café foram misturadas com água por 10 min e centrifugadas numa

rotação de 2700 rpm por 5 min e filtradas num filtro de náilon com 0,22 µm.

O estudo foi feito em amostras de café verde e café torrado. As condições

eletroforéticas utilizadas foram as seguintes, 500 mmol/L de ácido bórico

como eletrólito de separação pH 6,2, 0,5 mmol/L de brometo de

cetiltrimetilamônio (CTAB), capilar de sílica fundida de 57 cm de

comprimento total e 50 µm de d.i., voltagem de separação foi de -10 kV (115

µA), injeção hidrodinâmica com pressão de 0,035 bar por 5 s, e detecção em

200 nm. A separação de todos os analitos ocorreu num tempo de 17,5 min,

sendo que o ácido oxálico foi identificado em 8,5 min e o ácido cítrico em 11

min aproximadamente. Para validação da metodologia proposta, avaliaram-

se as características analíticas tais como a linearidade, que variou de 0,050

a 8,000 mmol/L, a exatidão (recuperação), que ficou entre 92 a 101%, a

precisão (CV) no mesmo dia 1,3 a 22,8% e em dias diferentes 2,0 a 29,3%,

confirmando dessa forma bons resultados, quanto aos métodos de validação

propostos.

A CZE também foi empregada por VICKERS et al., 2007, para análise

de ácido tartárico em alimentos como: cacau, limonada, xarope de açúcar,

bolo madeira e biscoitos. As amostras foram preparadas da seguinte forma:

o cacau foi misturado a água destilada na proporção de 1:2 (m/v), até virar

uma pasta e em seguida foram adicionados 100 mg/L do ácido tartárico,

uma garrafa de limonada foi comprada e degaseificada com um banho ultra-

som e adicionado 1 g do ácido tartárico a 11 g da limonada, permanecendo

congelados até a análise, 600 g de açúcar foram misturados a 400 mL de

água e adicionando-se 3,75 g do ácido tartárico, o bolo madeira e os

biscoitos foram preparados em laboratório, e avaliaram o percentual de

ácido tartárico perdido durante o cozimento. As amostras a serem

analisadas foram obtidas com a extração a partir de 5 g de cacau, bolo

madeira, biscoitos e limonada, e 2 gramas do xarope de açúcar, as amostras

foram colocadas em balões volumétricos de 100 mL e adicionados 80 mL de

água destilada, ficando por 10 min em banho ultra-som, sendo

posteriormente filtradas e analisadas Para realização desse experimento,

utilizou-se um sistema eletroforético, nas seguintes condições: polaridade e

fluxo eletroosmótico invertidos, voltagem de 14 kV, a 22 ºC, com absorção

na região do ultravioleta (λ = 214 nm). A injeção foi feita no modo

hidrodinâmico numa pressão de 0,5 psi por 5 s. A solução tampão continha

200 mmol/L de fosfato pH 7,5 (preparada com ácido fosfórico e hidróxido de

sódio). O capilar foi de sílica fundida 66 cm de comprimento total, sendo 56

efetivos e 50 µm de diâmetro interno. O condicionamento do capilar entre as

injeções, ocorreu com injeção de água por 2 min, solução tampão por 2 min

sob pressão de 20 psi, o ácido em estudo foi identificado e quantificado em

menos de 12 min, em todas as amostras analisadas, o limite de detecção foi

de 10 µg/mL e a recuperação ficou numa faixa entre 80 a 100%. Percebeu-

se que houve perda de 20 e 14% do ácido tartárico nas amostras do bolo

madeira e nos biscoitos, respectivamente, durante o processo de cozimento.

MATO et al., 2007, identificaram e determinaram o ácido tartárico e o

cítrico em suco de uva, vinho branco, rosa e vermelho. As amostras dos

sucos de uva e vinho foram diluídas com água destilada nas seguintes

proporções: sucos de uva (0,3mL para 100mL), vinho (0,5mL para 100mL),

em seguida filtradas em papel de filtro com 0,5 µm, e analisadas. Os autores

trabalharam com duas amostras de sucos de uva, e seis amostras de vinho,

sendo que nas amostras de vinho analisou-se duas de cada espécie,

branco, rosa e vermelho. Todos os ácidos tiveram um tempo de migração

menor do que 3 min. Para realização deste trabalho, empregou-se capilar de

sílica fundida com 60 cm de comprimento total, sendo 52,5 cm de

comprimento efetivo, e 75 µm de d.i., a detecção foi feita a 185 nm. A

amostra foi introduzida no capilar de forma hidrodinâmica por gravidade,

numa altura de 10 cm durante 30 s, e voltagem de 25 kV, a 25 °C, o tampão

constituía uma mistura contendo 7,5 mmol/L NaH

, 2,5 mmol/L Na

HPO

como eletrólito de separação, junto a 2,5 mmol/L de TTAOH (hidróxido de

tetradeciltrimetilamônio) como modificador do fluxo eletroosmótico e 0,24

mmol/L de CaCl

como modificador de seletividade e pH 6,40. O método

proposto foi validado considerando o limite de detecção que variou de 0,05 a

0,38 mg/L, limite de quantificação variou de 0,29 a 1,31 mg/L, a precisão,

avaliada com os resultados obtidos no mesmo dia, foi menor do que 3,69%

(n=5), e entre dias diferentes foi <3,98% (n=3), a recuperação variou de 92,7

a 105,8%. As curvas de calibração foram montadas pelo método de

calibração de padrão externo, sendo que os coeficientes de correlação foram

maiores do que 0,9996.

O sistema proposto por TANG et al., 2007, identificou e determinou

ácido cínico, anísico, salicílico, benzóico e o L – aa, em amostras de molho

de soja e vinagre, as amostras de vinagre foram preparadas com uma

simples diluição com água destilada 1:10 (v/v), enquanto que as amostras de

molho de soja foram misturados com tetracloreto de carbono (CCl

) 1:3 (v/v)

e centrifugados por 10 min, o extrato líquido foi descartado e a fase aquosa

foi diluída com água destilada 1:10 (v/v). A solução de separação empregou

20 mmol/L de ácido bórico + 20 mmol/L de hidróxido de sódio como eletrólito

de separação, 20 mmol/L de brometo de tetradeciltrimetilamônio (TTAB)

como inversor do fluxo eletroosmótico e pH 8,8. Para a escolha da

concentração do inversor do fluxo, e para a escolha do tipo de eletrólito

utilizado nas diferentes proporções junto ao hidróxido de sódio, foram

avaliados os seguintes parâmetros: o perfil do pico, o menor tempo de

análise e a melhor resolução. Esses parâmetros foram avaliados a partir dos

seguintes estudos: Variação da concentração do inversor do fluxo em 0, 5,

10, 15, 20 e 25 mmol/L, mantendo-se constante em 20 kV a voltagem de

separação, 8 s de injeção hidrodinâmica por gravidade com 8 cm de altura, e

comprimento de onda em 240 nm. Para validação do método, avaliaram-se a

linearidade, reprodutibilidade, limites de detecção e quantificação e a

recuperação dos ácidos. Esse último variou de 98,2 a 99,2%, enquanto que

o coeficiente de variação ficou numa faixa entre 2,60 a 2,97%, os quais

demonstraram eficiência e exatidão na técnica aplicada.

SANTALAD et al., 2007, determinaram ácidos orgânicos tais como

oxálico, tartárico, cítrico, entre outros, totalizando 11 ácidos, em amostras de

sucos de frutas, vegetais e em vinhos por CZE em 12 minutos. Neste

estudo, os autores empregaram solução tampão borato contendo 30 mmol/L

pH 10,0 e 100 mmol/L de acetonitrila. Previamente as análises, as amostras

receberam 2-nitrofenilhidrazina para derivatização dos ácidos orgânicos.

Para separação, os autores empregaram 20 kV, injeção por 5 s a 0,5 psi e

detecção em 230 nm. A amostra foi filtrada em 0,45 µm e diluída com água

destilada antes das análises. A adição de acetonitrila a solução de

separação aumentou o tempo de migração dos analitos e melhoria na

resolução dos picos. Considerando as características analíticas do método

proposto, o desvio padrão relativo foi < 4% pra o tempo de migração e <5%

para a área do pico. Os coeficientes de correlação foram >0,999 e o limite de

detecção variou de 2 a 10 mg/L e o de quantificação variou de 10 a 20 mg/L.

As porcentagens de recuperação variaram entre 81,7 a 112,4%.

PERES et al., 2009, determinaram e quantificaram 6 ácidos orgânicos

em 23 amostras de vinhos, produzidos e comercializados no Brasil, dentre

eles o ácido tartárico e o ácido cítrico, os quais são fundamentais no

processo de maturação, estabilidade microbiana, e em suas propriedades

organolépticas. As análises foram realizadas com o uso de um capilar de

sílica fundida, com 57 cm de comprimento, sendo que 50 cm efetivo, 75 µm

de d.i. e 375 µm de d.e., a detecção dos analitos ocorreu na região do

ultravioleta em 254 nm, todas as amostras foram diluídas com água

destilada 1:5 (v/v), filtradas com um papel de filtro de 0,45 µm e analisadas

em seguida. Para a escolha da solução tampão, testaram-se soluções que

continham de 5 a 20 mmol/L do eletrólito de separação contendo ácido 3,5-

dinitrobenzoico (DNB), ajustando o pH para 3,6 com ácido clorídrico (HCl),

fixando a concentração do inversor do fluxo eletroosmótico (CTAB) em 0,2

mmol/L. De acordo com o perfil de pico, e boa formação de linha de base,

utilizou-se nas análises uma solução tampão que continha 10 mmol/L ácido

3,5-dinitrobenzoico (DNB) pH 3,6 e 0,2 mmol/L de CTAB. Para validação do

método proposto, estudou-se a linearidade, que ficou numa faixa de 6 a 285

mg/L com coeficiente de correlação maior 0,9901, limite de detecção de 0,64

a 1,65 mg/L, limite de quantificação de 2,12 a 5,15 mg/L, o tempo de

migração para todos os ácidos foi menor que 5,5 min, sendo que o tempo de

migração do ácido tartárico foi < 3 min e para o ácido cítrico foi <5 min. O

coeficiente de variação ficou variou de 0,1 a 3,95% (n=3) e as recuperações

variaram entre 95 a 102%, as amostras analisadas mostraram uma grande

variação entre as quantidades de ácidos orgânicos, principalmente do ácido

tartárico, 1023 a 2212 mg/L. Os autores determinaram, em apenas uma

amostra, uma quantidade superior a 1 g/L de ácido acético. Uma quantidade

tão alta evidencia adulteração do vinho.

Percebeu-se que para análise de ácidos orgânicos em sucos de frutas

frescos, ou sucos de frutas industrializados por ECZ, a matriz foi obtida a

partir de uma simples extração com posterior diluição, tem-se na Tabela 3,

resumos com essas análises. Além do método eletroforético, metodologias

de CLAE foram publicadas e podem ser encontradas na literatura para a

determinação simultânea de ácidos orgânicos nos sucos de frutas e em

gêneros alimentícios (HERNÁNDEZ et al., 2006; VIGNOLI et al., 2007;

SCHERER et al., 2008; QUIRÓS et al., 2009; HERNÁNDEZ et al., 2009).

Para essas análises, as amostras foram preparadas extraindo inicialmente

os ácidos com água, etanol ou outro solvente orgânico, com posterior

diluição e filtração. Resumo de trabalhos discutindo essas análises são

mostrados na Tabela 4.

Tabela 3 – Estudos para a determinação dos principais ácidos orgânicos em

sucos de frutas e gêneros alimentícios utilizando eletroforese capilar de zona

BGE – Eletrólito de separação.

Ácidos Matriz BGE/Tempo de análise Referências

1, 2, 3, 4,

5, 6, 8, 9,

alimentos e

bebidas

5 mmol/L trimetilato 1

mmol/L de (TTAB) pH 9,0 /

10 min

WU et al.,

1995

5 sucos de

frutas nativas,

bebidas de

frutas e

formulações

farmacêuticas

20 mmol/L tampão fosfato

pH 8,0 / 8 min

SCHIEWE et

al., 1995

1 beterraba,

brócolis,

cenoura e aipo

10 mmol/L cromato de sódio,

4 mmol/L anion-BT, 10 %

metanol pH 8,0 / 5 min

TREVASKS et

al.,1995

1, 2, 3, 4, 6

alimentos e

amostras de

bebidas

3 mmol/L PMA – 3 mmol/L

DETA pH 7,5 / 11 min

ARELLAN, et

al.,1997

5 vegetais como

espinafre,

nabo e salsa

20 mmol/L tetraborato de

sódio pH 9,2 / menos de 5

min

FUKUSHI et

al., 1997

5 vegetais,

sucos de

frutas e

drinques

Tampão borato de sódio pH

8,0 / 2 min

CHOI et al.,

1997

1, 3, 6, 9 chá 10 mmol/L de cromato, 0,5

mmol/L (TTAB) e 0,1 (EDTA)

em ajuste do pH / 5,5 min

HORIE et al.,

1998

1, 2, 3, 4,

6, 8

amostras de

banho de

chaparia

20 mmol/L de PDC com 0,5

mmol/L (CTAB) pH 6,5 / 15

min.

SOGA et al.,

1999

2, 4, 6, 8 vinho

3 mmol/L fosfato, 0,5 mmol/L

MTAB pH 6,5 / 6 min

CASTIÑEIRA,

et al., 2000

2, 3, 6 suco de

laranja

200 mmol/L fosfato pH 7,5 /

11 min

SAAVEDRA,

et al., 2000

1, 2, 3, 6 sucos de

maçã, uva,

pêra e laranja

15 mmol/L fosfato, 0,4

mmol/L brometo de

cetilpiridina (CPB) 20 mmol/L

β-ciclodextrina / 7,5 min

YANG et al.,

2000

1, 2, 3, 8 plantas

medicinais

15 mmol/L

tris(hidoximetil)aminometano,

3 mmol/L ácido 1,2,3-

benzenotricarboxilíco 1,5

mmol/L (TEPA)

tetraetilenopentamino, 20%

de metanol, pH 8,4 / ‹ 20 min

FUNG et al.,

2001

1, 2, 6 sucos de uva 180 mmol/L fosfato 1 mmol/L

de (CTAB) 15 % (v/v)

metanol pH 7,2 / 7 min

VORARAT et

al., 2002

2, 4, 6, 8 vinhos 3 mmol/L fosfato e 7 mmol/L

de ácido fitálico pH 6,1 / 6

min

CASTIÑEIRA

et al., 2002,

3, 4, 5, 6, 8

vinho branco,

vinho

vermelho e

suco de

laranja

3 mmol/L ácido 1,2,3-

benzenotricarboxilíco, 15

mmol/L

tris(hidoximetil)aminometano,

1,5 mmol/L (TEPA)

tetraetilenopentamino, pH

8,4 / menos de 14 min

FUNG et al.,

2003

2, 3, 4, 6, 7

café 500 mmol/L tampão fosfato.

0,5 mmol/L CTAB pH 6,25 /

18 min

GALLI et al.,

2004

5 suco de uva 60 mmol/L tampão borato,

pH 9,0 / 18 min

WU et al.,

2007

1, 3, 4, 6, 7

extratos de

plantas

0,01 mmol/L trimetilato,

0,0003 mol/L TTAB pH 9,0 /

2 min

RIVASSEAU

et al., 2006

2, 3, 4, 6 suco de uva e

vinho

7,5 mmol/L NaH

; 2,5

mmol/L NaH

, 2,5

mmol/L OFM-OH; 0,24

mmol/L CaCl

pH 6,4/3,5 min

MATO et al.,

2007

2 cacau,

limonada,

xarope de

açúcar, bolo

madeira e

biscoitos

200 mmol/L tampão

HPO

pH 7,5 / 12 min

VICKERS et

al., 2007

11, 12, 13,

molho de soja

e vinagre

20 mmol/L NaOH 20 mmol/L

pH 8,8 / 5 min

TANG al.,

2007

2, 3, 4, 6, 8

vinho 10 mmol/L 3,5-ácido

dinitrobenzóico (DNB) 0,2

mmol/L CTAB pH 3,6 / 5 min

PERES et al.,

2009

Dados: Ácido 1-oxálico, 2-tartárico, 3-cítrico, 4-acético, 5-L – aa, 6-málico, 7-

fórmico, 8-láctico, 9-aspártico, 10-glutâmico, 11-salicílico, 12-benzóico, 13-

anísico, 14-sórbico.

Tabela 4 – Estudos para a determinação dos principais ácidos orgânicos em

sucos de frutas e gêneros alimentícios utilizando cromatografia líquida de

alta eficiência.

Ácido

Orgânico

Matriz Preparação da

amostra

Mecanismo de

separação/

nº de Coluna

/Detecção/tempo de

análise

Referência

2, 3, 4, 6,

7, 8

vinho Diluição

filtração

Exclusão de íon/1/

eletroquímica/15min

CASELA et

al.,2002

2, 3, 8 suco de uva Precipitação

filtração

Exclusão de íon/1/

espectrofotometria

UV/Vis/11min

SOYER et

al., 2003

1, 2, 3, 8, 6 vinho Diluição

filtração

Fase-reversa/

1/indução fotoquímica

e quiluminescência

/30 min

PEREZ-

RUÍZ et al.,

2004

9, 10 gêneros

alimentícios

Extração

filtração

Fase reversa/1/

espectrofotometria

UV/Vis/23 min

SAAD et al.,

2005

5 banana,

mamão,

manga e

abacaxi

Extração

Centrifugação

filtração

Isocrática/1/

espectrofotometria

UV/Vis/ 9 min

HERNÁNDE

Z et al.,

2006

2, 3, 4, 6 café solúvel Dissolução

filtração

Fase reversa

/1/espectrofotometria

UV/Vis/70 min

VIGNOLI et

al.,2007

2, 3, 6, 5 acerola, açaí,

polpas de caju

Diluição

filtração

Isocrática/1/

espectrofotometria

UV/Vis/7 min

SCHERE et

al.,2008

2, 3 tomates Extração

centrifugação

diluição/filtração

Gradiente

/1/espectrofotometria

UV/Vis/ 12 min

SUÁREZ et

al.,2008

1, 2, 3, 6 mamão,

abacaxi

Extração

centrifugação

filtração

Isocrática/1/

espectrofotometria

UV/Vis/ mais de 60

min

HERNÁNDE

Z, et al.,

2009

5 laranja, maçã,

abacaxi,

refrigerantes

de laranja,

limão, chá,

isotônicos e de

cola

Filtração

diluição

Fase reversa

/2/espectrofotometria

UV/Vis/6 min

QUIRÓS et

al.,2009

3, 6, 5 sucos e vinhos

de laranja

Diluição

filtração

Fase isocrática e por

gradiente/1/

espectrofotometria

UV/Vis/20 min

KELEBEKet

al.,2009

Dados: Ácido 1-oxálico, 2-tartárico, 3-cítrico, 4-acético, 5-L – aa, 6-málico, 7-

fórmico, 8-láctico, 9-benzoico, 10-sórbico.

6. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

6.1. MATERIAIS E MÉTODOS

O sistema eletroforético usado nas análises foi um sistema caseiro

constituído de:

•

CE Linear Instruments model 200 detector user manual (San Jose,

CA) (equipado com detector UV-Vis, fonte de alta voltagem CZE 100R

(Spellman modelo CZE 30PN1000); Estação eletroforética (Data Apex

Ltda, USA) acoplada a um microcomputador; Bomba peristáltica com

13 canais Ismatec modelo mp 13GJ-4; Capilar de sílica fundida

(Polymicro) com diâmetro interno 75 µm e externo de 375 µm,

comprimento total 59 cm sendo 23,4 de comprimento efetivo sem

recobrimento interno; frascos com solução de eletrólito, eletrodos de

platina do pólo positivo e negativo, suportes de madeira.

Outros aparelhos e equipamentos também foram utilizados, tais

como:

•

Balança analítica BEL engeneering mark 210ª classe I;

•

Medidor de pH Marconi PA 200;

•

Destilador CIENTEC;

•

Balão volumétrico (100 mL), vidro de relógio, béquer espátula, proveta

graduada (5, 10, 15, 20 mL) bastão de vidro, garra, suporte, papel de

filtro qualy 0,45 µm, funil de vidro.

6.2. SOLUÇÕES E REAGENTES

A limpeza das vidrarias do laboratório foi feita com solução de ácido

clorídrico (HCl) 1 mol/L e água destilada. Para limpeza do capilar foram

empregadas soluções 1 mol/L HCl e 0,1 mol/L NaOH. Outros reagentes

foram: ácido bórico (H

) PA (Baker, Brasil), brometo de

cetiltrimetilamônio (CTAB) (Vetec, Alemanha), ácido oxálico PA (Vetec,

Alemanha), ácido tartárico PA (Vetec, Alemanha) ácido cítrico anidro PA

(Labsynth, Brasil), ácido gálico (Vetec, Alemanha), ácido ascórbico (F. Maia

Indústria e Comércio LTDA, Brasil), hidróxido de sódio (Merck, Alemanha),

ácido clorídrico PA (ISOTAR, Brasil), metanol (JJ Baker, Brasil) e água

destilada.

A solução tampão, e as soluções padrão dos ácidos, eram preparadas

diariamente antes do seu uso, em alíquotas de 100 mL, e descartadas ao

final do dia.

As soluções de trabalho foram preparadas nas seguintes concentrações:

•

Ácido bórico (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200

mmol/L);

•

Brometo de cetiltrimetilamônio 0,5 mmol/L (CTAB);

•

Soluções padrão de ácido oxálico, tartárico, cítrico e L – aa 0,4000

g/100mL, ácido gálico 0,2000 g/100mL;

•

As soluções dos ácidos orgânicos utilizadas no preparo das curvas

analíticas foram preparadas a partir da diluição das soluções padrão

nas respectivas proporções: ácido oxálico e L – aa 0,0150 g/100 mL,

tartárico e cítrico 0,0250 g/100 mL e o gálico 0,0060 g/100mL;

•

Solução do branco (100 mmol/L de ácido bórico + 0,5 mmol/L

brometo de cetiltrimetilamônio, pH 10,0 ajustado com hidróxido de

sódio a 0,1 mol/L e ácido clorídrico a 1 mol/L;

•

Solução de hidróxido de sódio a 0,1 mol/L;

•

Solução de ácido clorídrico a 1 mol/L.

6.3. ESTUDO DAS AMOSTRAS

6.3.1. AQUISIÇÃO DAS AMOSTRAS

O limão e a laranja foram adquiridos em um sítio no povoado

Taperinha dos Gatos Lagarto/SE. A acerola, caju, umbu-cajá e a carambola

foram comprados no mesmo local e dia no supermercado de Aracaju/SE, o

morango e a uva no mercado de Itabaiana. Os sucos industrializados foram

adquiridos em dois supermercados de Aracaju/SE, com o prazo de validade

vigente.

6.3.2. PREPARAÇÃO, DILUIÇÃO, TEMPO, TEMPERATURA DE

ESTOCAGEM DAS AMOSTRAS E NÚMERO DE ANÁLISE

As amostras dos sucos frescos foram preparadas extraindo o suco

espremendo a fruta diretamente sobre o papel de filtro de 0,45 µm (Qualy),

diluídos posteriormente com água destilada nas proporções que variaram de

1:5 no suco de Caju (Anacardium Occidentale ) a 1:50 no suco de limão

(Citrus Limonum), permitindo que os resultados ficassem nas faixas de

trabalho estudadas. A temperatura de estocagem das frutas variou de 0 ºC a

23 ºC, com o intuito de se avaliar o comportamento dos ácidos em

temperaturas distintas, e o seu tempo de estudo correspondia ao tempo que

começava a sua degradação. Durante o estudo, o ácido cítrico foi analisado

20 vezes na laranja (Citrus Sinensis), 9 no umbu cajá (Spondias Cytherea), 3

no morango (Fragaria Vesca) e 17 no limão (Citrus Limonum), o L – aa foi

analisado 18 vezes no caju (Anacardium Occidentale ), 20 na laranja (Citrus

Sinensis), 3 no morango (Fragaria Vesca) e 9 na acerola (Malpighia Globra),

o ácido oxálico foi analisado 9 vezes na carambola (Averrhoa Carambola) e

o ácido tartárico 12 vezes na uva (Vitis Vinefera) e 9 na carambola (Averrhoa

Carambola), Tabela 5.

As amostras de sucos industrializados eram obtidas filtrando o suco

diretamente no papel de filtro de 0,45 µm (Qualy), diluídos posteriormente

com água destilada na proporção 1:5. Essas diluições permitiram que os

resultados ficassem dentro das faixas de trabalho estudadas. Os sucos

industrializados foram armazenados a 23 ºC, e o tempo de análise variou de

42 dias no suco misto de laranja limão e tangerina a 56 dias no suco de

goiaba como mostrado, onde o ácido cítrico foi analisado 9 vezes no suco

misto de maçã, limão, uva e no suco de goiaba, 6 vezes no suco misto de

laranja limão e tangerina, o L – aa foi analisado 12 vezes nos suco misto de

maça, tangerina, laranja, limão e no suco misto de acerola , laranja

enriquecido com L – aa, Tabela 6.

Tabela 5 – Diluição, condições e tempo de armazenamento das amostras de

sucos de frutas frescos.

Fruta Diluição

(v/v)

Temperatura

(

ºC

)

estocagem

Dias

estocados

(Ácido orgânico)

Número de

analises

Caju 1:5 0 28 (5) 18

Laranja 1:10 23 34 (3 e 5) 20

Uva 1:10 0 28 (2) 12

carambola 1:15 0 15 (1 e 2) 9

Umbu cajá 1:15 0 15 (3) 9

Morango 1:20 23 - (3 e 5) 3

Acerola 1:25 0 45 (5) 9

Limão 1:50 23 30 (3) 17

Ácidos: 1 – oxálico, 2 – tartárico, 3 – cítrico, 4 – gálico, 5 – L – aa.

Tabela 6 – Diluição, condições e tempo de armazenamento das amostras de

sucos industrializados.

Suco Diluição

(v/v)

Temperatura (ºC)

estocagem

Dias

estocados

(Ácido orgânico)

Número de

analises

A 1:5 23 54 (5) 12

B 1:5 23 54 (5) 12

C 1:5 23 42 (3) 6

D 1:5 23 56 (3) 9

E 1:5 23 44 (3) 9

Ácidos: 3 – cítrico, 5 – L – a, A – misto de acerola, laranja, enriquecido com

L – aa; B – misto de maçã, tangerina, laranja e limão; C – misto de laranja,

limão e tangerina; D – goiaba; E – misto de maçã, limão e uva.

6.4. CONDIÇÕES ELETROFORÉTICAS

6.4.1. METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS

POR ELETROFORESE CAPILAR DE ZONA

Neste trabalho, utilizou-se a eletroforese capilar de zona, com

inversão do fluxo eletroosmótico e da polaridade. Assim, o fluxo

eletroosmótico ocorre do cátodo (-) ao ânodo (+), diferentemente de como

ocorre no fluxo eletroosmótico normal. A injeção foi feita no pólo negativo

(cátodo), inversamente a polaridade normal. Deste modo, foi possível

otimizar a separação dos ânions. A solução de ácido bórico pH 10,0 foi

empregada como eletrólito de separação, possibilitando a formação dos

complexos aniônicos, conforme reação 1.

(1)

Ácido carboxílico ácido bórico complexo formado

Antes das análises, o capilar foi condicionado bombeando-se HCl a 1

mol/L por 5 min, H

O por 5 min, NaOH 0,1 mol/L por 10 min e 30 min da

solução tampão contendo 100 mmol/L H

+ 0,5 mmol/L do CTAB pH

10,0. Para fechar o circuito elétrico, as extremidades do capilar foram

mergulhadas em dois frascos (2mL) contendo a mesma solução tampão de

100 mmol/L H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L do CTAB. A voltagem a 8 kV foi

ligada durante cinco minutos para a eletroestabilização, em seguida foi feita

uma corrida empregando apenas a solução tampão (branco), e posterior

introdução da amostra no capilar por gravidade numa altura de 4,5 cm. Os

analitos foram detectados on column (Figura 6) utilizando um detector UV. O

comprimento de onda utilizado foi de 214 nm, devido a absorção dos ácidos

orgânicos na faixa de 200-240 nm (KLAMPFL, C.W., 2007). Os sinais foram

monitorados empregando a estação eletroforética Data Apex Ltda, USA. A

temperatura para a realização das análises foi mantida em 23 °C. As

injeções foram feitas elevando a extremidade do capilar em contato com a

solução tampão, onde encontrava o eletrodo de platina (pólo negativo) a

uma altura de 4,5 cm por 30 s. Os suportes de madeira foram usados para

acomodar os frascos que continham a solução eletrolítica. A montagem

desse sistema permitiu avaliar os principais parâmetros envolvidos na

separação dos ácidos orgânicos.

6.4.2. AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DO ELETRÓLITO DE

SEPARAÇÃO

A concentração do eletrólito foi avaliada mantendo-se constantes, o

capilar de sílica fundida com diâmetro interno de 75 µm e externo de 375

µm, comprimento total de 59 cm (23,4 cm efetivo), a temperatura ambiente

foi de 23 ºC, e a solução de separação continha 0,5 mmol/L do CTAB.

Para cada solução preparada, variou-se a voltagem de 2 em 2 kV,

anotando-se o sinal da corrente correspondente (em µA). Posteriormente,

foram obtidos os gráficos I x V para cada solução.

A partir dos resultados obtidos no estudo anterior, a voltagem foi

mantida em 8 kV, neste modo, a corrente foi de 36 µA. A detecção dos

ácidos foi feita em 214 nm, inversão do fluxo eletroosmótico com 0,5 mmol/L

CTAB, inversão da polaridade, tempo de injeção hidrodinâmica por

gravidade de 15 s a 4,5 cm de altura, a concentração do eletrólito de

separação foi avaliada em 100, 150 e 200 mmol/L.

6.4.3. INFLUÊNCIA DO pH DO ELETRÓLITO DE SEPARAÇÃO NO

PERFIL DO PICO

O estudo do pH foi realizado mantendo-se constantes: voltagem de

separação em 8 kV, corrente de 36 µA, detector em 214 nm, e a solução de

ácido bórico 100 mmol/L + 0,5 mmol/L CTAB, polaridade invertida, tempo de

injeção hidrodinâmica por gravidade de 15 s, a temperatura de 23 ºC, o pH

da solução foi variado em 9,0, 10,0, 11,0 e 12,0.

6.4.4. INFLUÊNCIA DO TEMPO DE INJEÇÃO SOBRE O PERFIL DO PICO

O estudo do tempo de injeção foi realizado mantendo-se constantes:

voltagem de separação em 8 kV, corrente de 36 µA, detector em 214 nm, e

a solução de ácido bórico 100 mmol/L + 0,5 mmol/L CTAB pH = 10,0 ,

polaridade invertida, injeção hidrodinâmica por gravidade, temperatura de 23

ºC, o tempo de injeção foi variado em 3, 15, 30 e 45 s.

6.4.5. USO DE METANOL NA SOLUÇÃO DE SEPARAÇÃO

O estudo do uso de metanol como solvente orgânico, foi realizado

mantendo-se constantes: voltagem de separação em 8 kV, corrente de 36

µA, detector em 214 nm, e a solução de ácido bórico 100 mmol/L + 0,5

mmol/L CTAB pH= 10,0, polaridade invertida, tempo de injeção

hidrodinâmica por gravidade 15 s (4,5 cm de altura), a temperatura de 23 ºC.

A influência do metanol na solução de separação foi avaliada preparando-se

soluções contendo 5% e 20% (v/v) de metanol.

6.4.6. IDENTIFICAÇÃO DOS PICOS DOS ÁCIDOS ORGÂNICOS

ESTUDADOS

A identificação dos picos foi obtida a partir das soluções preparadas

em soluções mistas. As condições foram mantidas em: voltagem de

separação em 8 kV, corrente de 36 µA, detector em 214 nm, e a solução de

ácido bórico 100 mmol/L + 0,5 mmol/L CTAB pH = 10,0, polaridade invertida,

tempo de injeção hidrodinâmica por gravidade 15 s (4,5 cm de altura),

temperatura de 23 ºC, a solução mista continha: ácido oxálico e L – aa

0,0150 g/100mL, ácido tartárico e cítrico 0,0250 g/100mL, ácido gálico

0,0060 g/100mL.

6.4.7. CURVAS ANALÍTICAS DOS ÁCIDOS ESTUDADOS E

CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO PROPOSTO

Uma vez identificados os picos referentes aos ácidos orgânicos

estudados, obtiveram-se 7 curvas analíticas a partir da concentração x altura

do pico da seguinte forma:

1- ácido oxálico na presença do ácido tartárico;

2- ácido tartárico na presença do ácido oxálico;

3- ácido tartárico na ausência dos outros;

4- ácido cítrico na ausência dos outros;

5- ácido cítrico na presença do L – aa;

6- L – aa na presença do ácido cítrico;

7- L – aa na ausência dos outros.

As condições foram mantidas em: voltagem de separação em 8 kV,

corrente de 36 µA, detector em 214 nm, solução de ácido bórico 100 mmol/L

+ 0,5 mmol/L CTAB pH=10,0, polaridade invertida, tempo de injeção

hidrodinâmica por gravidade 15 s (4,5 cm de altura) e temperatura de 23 ºC.

6.4.8. VALIDAÇÃO

As sete curvas analíticas foram obtidas a partir das seguintes

misturas: curva do ácido oxálico, na presença do ácido tartárico (0,0120,

0,0160, 0,0120, 0,0240 e 0,0280 g/100 mL do oxálico, fixando o tartárico em

0,0160 g/100 mL); Curva do ácido tartárico, na presença do ácido oxálico

(0,0120, 0,0160, 0,0200, 0,0240 e 0,0280 g/100mL do tartárico, fixando o

oxálico em 0,0160 g/100mL); Curva do ácido tartárico na ausência dos

outros (0,0100, 0,0150, 0,0200, 0,0250 e 0,0300 g/100mL); Curva do ácido

cítrico na ausência dos outros (0,020, 0,025, 0,0300, 0,0350 e 0,0400 g/100

mL); Curva do ácido cítrico na presença do L – aa (0,020, 0,0250, 0,0300,

0,0350 e 0,0400 g/100mL do cítrico, fixando a concentração do L – aa em

0,0200 g/100 mL); Curva do L – aa,na presença do ácido cítrico (0,0150,

0,0200, 0,0250, 0,0300 e 0,0350 g/100mL do L – aa, fixando o cítrico em

0,0350 g/100 mL); Curva do L – aa na ausência dos outros (0,0100, 0,0200,

0,0300, 0,0400, 0,0500 g/100mL).

A linearidade e faixa de trabalho foram obtidos a partir da análise das

curvas analíticas, sendo que cada ponto da curva foi gerado com análise em

triplicata.

A sensibilidade foi avaliada por meio dos coeficientes angulares,

obtidos nas curvas de calibração.

A precisão de um método está relacionada com a concordância das

medidas entre si, ou seja, quanto maior a dispersão dos valores, menor a

precisão. Esta variável pode ser expressa de várias maneiras, mas diz-se

que quanto maior a grandeza dos desvios, menor a sua precisão (BACCAN

et al., 1998). Para determinar a precisão de um conjunto de dados, pode-se

calcular o desvio dos valores em relação a sua média aritmética, ou seja, a

estimativa do desvio-padrão relativo (RSD) ou coeficiente de variação (CV)

dado pela equação 23 (HARRIS, 2008). Onde X

é a média aritmética das

medidas e s a estimativa do desvio padrão, dado pela equação 24, onde X

representa cada valor unitário, e n corresponde ao número de valores

(HARRIS, 2008). A precisão foi calculada usando o coeficiente de variação,

em três níveis de concentração, 0,0100, 0,0150 e 0,0200 g/100mL,

empregando a equação 23.

%100.

(23)

)(

−

∑

(24)

Os limites de detecção e quantificação foram calculados a partir da

medida de 10 pontos na linha base do branco, conforme equações, 25 e 26.

(25)

(26)

A repetibilidade foi testada (n=5) injetando-se a amostra de suco de

laranja e limão, no mesmo dia e dias diferentes.

O estudo de recuperação foi efetuado a partir da análise das

amostras, com adição de padrão nas mesmas, calculadas com a equação

27.

( )

100

∆

(27)

Onde: R é a recuperação, ∆C é a diferença de concentração

(concentração final menos a concentração inicial, Cf-Ci). .

7. RESULTADOS E DISCUSSÃO

7.1. INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO ELETRÓLITO DE

SEPARAÇÃO

Visto que a voltagem é um importante parâmetro na separação em

análises eletroforéticas, os trabalhos iniciais enfocaram o estudo da

voltagem a ser utilizada nas análises. Para isto, estudou-se o aumento do

sinal de corrente em relação ao aumento da voltagem aplicada, lei de Ohm,

em 12 soluções com concentrações entre 10 e 200 mmol/L, fixando o pH em

10,0. Pode-se observar que o aumento da voltagem do sistema promoveu

aumento do sinal de corrente, e que este aumento, dependendo da

concentração de eletrólito de separação, manteve a linearidade até um valor

máximo de voltagem, Figura 10.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

CORRENTE (mA)

VOLTAGEM (kV)

10 mmol/L

20 mmol/L

30 mmol/L

40 mmol/L

50 mmol/L

60 mmol/L

70 mmol/L

80 mmol/L

90 mmol/L

100 mmol/L

150 mmol/L

200 mmol/L

Figura 10 – Lei de Ohm. Variação da voltagem e da corrente do sistema em

função do aumento da concentração da solução. Condições experimentais:

pH= 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB.

O valor máximo foi mantido em todas as separações, visando a

otimização do método. Ao utilizar um tampão com 10 mmol/L de eletrólito de

separação em pH 10,0, a linearidade se estendeu até 12 kV e a corrente de

A, quando se usou uma solução tampão com 200 mmol/L em pH 10,0, a

linearidade se estendeu até 6 kV e 26 µA. Dessa forma, tanto para soluções

tampão com baixas ou altas concentrações de eletrólito de separação, é

necessário investigar o máximo de voltagem que pode ser aplicada.

Portanto, escolheu-se uma solução tampão que continha 100 mmol/L do

eletrólito de separação, uma vez que baixas concentrações, menor que 5

mmol/L, podem reter analitos ou parte deles na parede interna do capilar,

prejudicando a precisão do tempo migração, e ainda, altas concentrações de

eletrólito de separação, acima de 200 mmol/L, poderia produzir um

superaquecimento interno no capilar (efeito Joule), prejudicando, a

separação dos analitos.(LANDERS, 1997).

Verificou-se a influência da concentração do eletrólito de separação,

utilizando uma solução de ácido cítrico a 0,3 g/100mL. A partir desse estudo,

verificou-se que a concentração do eletrólito de separação influencia

diretamente o perfil do pico e o tempo de migração do analito. Pode-se

observar que quanto maior a concentração do eletrólito de separação, maior

a área e/ou altura do pico para um analito de mesma concentração (Figura

11). O tempo de migração do analito aumentou quando a concentração do

eletrólito passou de 100 para 150 mmol/L. Este aumento de tempo ocorreu

devido à alteração do potencial zeta (ζ) formado a partir da interação de

duas camadas carregadas positivamente na parede interna do capilar, sendo

que uma delas é denominada camada fixa e a outra camada móvel, e entre

elas forma-se o potencial, que é o responsável pela criação do fluxo

eletroosmótico (FEO), que transporta os analitos do pólo positivo ao pólo

negativo. No modo normal de eletroforese, a velocidade de migração

depende do número de cargas positivas que se formam nessas camadas.

Portanto, quanto maior o número de cargas na parede interna do capilar

maior é o potencial zeta (ζ), e maior será a mobilidade do fluxo

eletroosmótico. Por outro lado, aumentando-se significativamente a

concentração ou força iônica da solução, a diferença de potencial diminui,

diminuindo a mobilidade do fluxo eletroosmótico, aumentando o tempo de

análise (ALTRIA, 1996).

2 4 6 8 10

-12

-6

2 4 6 8 10

-18

-12

-6

TEMPO (min)

área do pico: 133,611 mV.s

altura do pico: 12,613 mV

VOLTAGEM (mV)

área do pico: 78,820 mV.s

altura do pico: 9,697 mV

área do pico: 127,456 mV.s

altura do pico: 11,135 mV

Figura 11 – Eletroferogramas obtidos na avaliação da concentração da

solução de H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB. Voltagem de 8 kV, 15 s de

injeção,

= 214 nm. A- 100 mmol/L, B- 150 mmol/L e C- 200 mmol/L. Ácido

cítrico 0,3 g/100mL.

7.2. INFLUÊNCIA DO pH DO ELETRÓLITO DE SEPARAÇÃO NO PERFIL

DOS PICOS

O controle do pH foi fundamental na otimização da separação dos

ácidos. A mobilidade eletroforética desses ácidos depende do pH do

eletrólito, uma vez que são ácidos orgânicos fracos, cuja dissociação

aumentará com o aumento do pH (LINDEBERG, 1996).

Sabendo que o sistema tampão é eficiente em um intervalo de pH

correspondente ao pKa do eletrólito de separação em ± uma unidade, e que

o pKa do ácido bórico (eletrólito de separação) é de 9,24, analisou-se o perfil

dos picos em pH 9,0, 10,0, 11,0 e 12,0, mantendo-se constante a

concentração dos ácidos oxálico, tartárico, cítrico, gálico e o L – aa em

0,0150, 0,0250, 0,0250, 0,0060 e 0,0150 g/100mL respectivamente. Os

resultados são mostrados nas Figuras 12A, 12B, 12C, 12.1D e 12.1E.

Para a escolha do pH da solução tampão, avaliou-se o perfil e a

resolução dos picos formados. Concluiu-se que para análise do ácido oxálico

poderiam ser utilizados pH 10,0, 11,0 e 12,0 (Figura 12A), para o ácido

tartárico, os valores de pH poderiam ser 9,0, 10,0, 11,0 ou 12,0 (Figura 12B),

porém, ao usar eletrólito com pH 11,0 ou 12,0 houve flutuações na linha de

base, para o ácido cítrico, os melhores resultados foram obtidos em pH 10,0,

11,0 e 12,0 (Figura 12C), para o ácido gálico, os melhores resultados foram

obtidos utilizando pH 9,0 e 10,0 (Figura 12.1D) enquanto que para o ácido L

– aa, os melhores resultados foram obtidos utilizando pH 9,0, 10,0 e 11,0

(Figura 12.1E). Diante desses resultados, escolheu-se pH 10,0 para

realização das análises, uma vez que foram obtidos picos com boa simetria,

área e/ou altura.

2 4 6 8

-8

-4

2 4 6 8

-3

2 4 6 8

VOLTAGEM (mV)

A - pH 9,0

A - pH 10,0

TEMPO (min)

A - pH 11,0 A - pH 12,0

2 4 6 8

-21

-18

-15

2 4 6 8

-3

2 4 6 8

-12

-9

-6

2 4 6 8

-3

VOLTAGEM (mV)

B - pH 9,0

B - pH 10,0

TEMPO (min)

B - pH 11,0

B - pH 12,0

2 4 6 8

-14

-7

2 4 6 8

-14

-7

2 4 6 8

-14

-7

2 4 6 8

-14

-7

VOLTAGEM (mV)

C - pH 9,0

C - pH 10,0

TEMPO (min)

C - pH 11,0

C - pH 12,0

Figura 12 – Eletroferogramas para os ácidos orgânicos em diferentes valores

de pH: A – ácido oxálico, B – ácido tartárico, C – ácido cítrico. Condições

experimentais: 100 mmol/L H

+ 0,5 mmol/L CTAB, 8 kV, 15 s de

injeção,

= 214 nm.

2 4 6 8

D - pH 9,0

D - pH 10,0

VOLTAGEM (mV)

TEMPO (min)

D - pH 11,0

D - pH 12,0

2 4 6 8

-11

2 4 6 8

E - pH 9,0

E - pH 10,0

VOLTAGEM (mV)

TEMPO (min)

E - pH 11,0 E - pH 12,0

Figura 12.1 – Eletroferogramas para os ácidos orgânicos em diferentes

valores de pH: D – ácido gálico, E – L – aa. Condições experimentais: 100

mmol/L H

+ 0,5 mmol/L CTAB, 8 kV, 15 s de injeção,

= 214 nm.

7.3. INFLUÊNCIA DO TEMPO DE INJEÇÃO SOBRE O PERFIL DO PICO

Para verificar a influência do tempo de injeção sobre o perfil do pico,

analisou-se uma amostra padrão, contendo as respectivas concentrações

dos ácidos em estudo: 0,0150 g/100mL oxálico e L – aa, 0,0250g/100mL

tartárico e cítrico, 0,0060 g/100mL para o gálico. A partir da análise da

Figura 13A e 13B, verificou-se que o tempo de injeção influencia de forma

direta na formação do eletroferograma, uma vez que o volume de amostra

injetada é diretamente proporcional ao tempo de injeção (WEINBERGER,

2000). Injeções por 15 s (1 nL) puderam ser observados 5 picos com um

bom perfil. Contudo, não foram observados os 5 picos quando foram

empregados 3 s de injeção hidrodinâmica (0,2 nL) (Figura 13A). Entretanto,

com 30 s (2 nL) e 45 s (3 nL) de injeção, observaram-se todos os picos com

sobreposição de picos dos ácidos tartárico e cítrico (Figura 13B). A partir

desse estudo definiu-se trabalhar com 15 s de injeção.

2 4 6 8

-12

-6

VOLTAGEM (mV)

TEMPO (min)

3 s

15 s

1 2

2 4 6 8

-12

-6

VOLTAGEM (mV)

TEMPO (min)

30 S

45 S

Figura 13 – Eletroferogramas – tempo de injeção hidrodinâmica por

gravidade na separação das 5 espécies estudadas. 100 mmol/L H

10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, 8 kV,

= 214 nm. ácido oxálico (1), ácido tartárico

(2), ácido cítrico (3), ácido gálico (4), L – aa (5).

7.4. USO DE METANOL NA SOLUÇÃO DE SEPARAÇÃO

Em CZE é bastante comum o uso de eletrólitos aditivados, o qual é

indicado em quatro situações: 1) para alterar a mobilidade do soluto, 2)

modificar o fluxo eletroosmótico, 3) solubilizar solutos ou compostos na

matriz da amostra, 4) reduzir a interação de certos solutos com a parede do

capilar. Alguns autores relataram que o metanol é um dos solventes

orgânicos mais utilizados como aditivo em soluções eletrolíticas, uma vez

que este possui uma menor influência na mobilidade do fluxo eletroosmótico,

e que quanto maior o percentual de aditivo usado na solução eletrolítica,

menor a mobilidade eletroosmótica, aumentando o tempo de análise

(SARMINI et al, 1997).

Neste trabalho, utilizou-se metanol como aditivo para alterar a

mobilidade dos ânions, permitindo uma maior separação entre eles,

principalmente a separação dos ácidos tartárico e cítrico. Para tal estudo

prepararam-se soluções com 100 mmol/L de ácido bórico pH 10,0 com

diferentes proporções de metanol. O efeito da concentração de metanol foi

observado injetando-se solução trabalho mista de ácidos orgânicos. O

eletroferograma obtido neste estudo é mostrado na Figura 14. A adição de

um solvente orgânico influenciou no perfil dos picos e no tempo de migração

dos analitos, uma vez que, adicionando 5% de metanol houve pico não

simétrico (ácido oxálico) e aumento do tempo de migração, porém, houve

uma melhor separação entre os ácidos tartárico, cítrico, gálico e L - aa.

Adicionando 20% de metanol, a simetria do pico do ácido oxálico ficou ainda

mais comprometida, e a análise foi realizada num tempo ainda maior (11

min), apesar de ter melhorado significativamente a separação dos ácidos. O

aumento no tempo de migração dos compostos deu-se em virtude da

diminuição do fluxo eletroosmótico, provocado pela diminuição da

mobilidade dos constituintes da solução tampão (SARMINI et al, 1997).

2 4 6 8 10 12

VOLTAGEM (mV)

TEMPO (min)

20 % DE METANOL

5 % DE METANOL

SEM ADIÇÃO DE METANOL

Figura 14 – Eletroferogramas obtidos no estudo da concentração de metanol

no eletrólito de separação dos ácidos orgânicos. 100 mmol/L H

+ 0,5

mmol/L CTAB pH 10,0, 15 s de injeção (4,5 cm de altura), 8 kV,

= 214 nm,

0,0150 g/100mL ácido oxálico (1) e L – aa (5), 0,0250 g/100mL ácido

tartárico (2) e cítrico (3), 0,0100 g/100mL ácido gálico (4).

A partir desses resultados, optou-se por não usar metanol no eletrólito

de separação, uma vez que todos os ácidos orgânicos em soluções de

referência foram separados de forma satisfatória com um menor tempo de

análise.

7.5. IDENTIFICAÇÃO DOS ÁCIDOS ORGÂNICOS

Por se tratar de uma metodologia analítica para determinação

simultânea de ácidos orgânicos, foi necessário identificar o tempo de

migração de cada analito e, posteriormente avaliar as características

analíticas para cada ácido. A solução tampão borato, contendo 100 mmol/L,

em pH 10,0, foi mantida. Preparam-se soluções mistas dos ácidos para

facilitar a avaliação dos eletroferogramas. A solução mista dos ácidos

orgânicos foi preparada nas concentrações: 0,0150 g/100mL de ácido

oxálico e L – aa, 0,0250 g/100mL de ácido tartárico e cítrico, 0,0060

g/100mL de ácido gálico. A partir das injeções dessas soluções, efetuou-se a

identificação de cada pico correspondente a cada ácido orgânico em estudo,

Figura 15A. Posteriormente, para definir a ordem de migração de cada ácido

orgânico, empregou-se a injeção de cinco soluções mistas, sendo que cada

solução foi preparada sem a adição de um dos analitos, Tabela 7. Como

resultado, o ácido que não foi adicionado na mistura não apresentou pico no

eletroferograma correspondente, como evidenciado nas Figuras 15B, 15C,

15D 15E e 15F. Portanto, em ordem crescente de migração, identificaram-se

os picos desses analitos como sendo: o ácido oxálico (4,60 ± 0,13 min),

ácido tartárico (5,10 ± 0,18 min), ácido cítrico (5,20 ± 0,10 min), ácido gálico

(5,50 ± 0,17 min) e o L – aa ( 6,00 ± 0,17 min).

Tabela 7 – Identificação dos picos dos ácidos, oxálico, tartárico, cítrico,

gálico e L – aa.

Mistura (Ácido orgânico)

Concentração (g/100mL)

Mistura (Ácido orgânico)

Concentração (g/100mL)

inicial

(1) 0,0150 g/100mL

(2) 0,0250 g/100mL

(3) 0,0250 g/100mL

(4) 0,0060 g/100mL

(5) 0,0150 g/100mL

(1) 0,0150 g/100mL

(2) 0,0250 g/100mL

(4) 0,0060 g/100mL

(5) 0,0150 g/100m

(2) 0,0250 g/100mL

(3) 0,0250 g/100mL

(4) 0,0060 g/100mL

(5) 0,0150 g/100mL

(1) 0,0150 g/100mL

(2) 0,0250 g/100mL

(3) 0,0250 g/100mL

(5) 0,0150 g/100mL

(1) 0,0150 g/100mL

(3) 0,0250 g/100mL

(4) 0,0060 g/100mL

(5) 0,0150 g/100mL

(1) 0,0150 g/100mL

(2) 0,0250 g/100mL

(3) 0,0250 g/100mL

(4) 0,0060 g/100mL

(1) Ácido oxálico, (2) ácido tartárico, (3) ácido cítrico, (4) ácido gálico e (5) L

– aa.

2 4 6 8

-12

-10

-8

-6

-4

-2

2 4 6 8

-4

2 4 6 8

-2

2 4 6 8

1 2

VOLTAGEM (mV)

TEMPO (min)

Figura 15 – Eletroferogramas obtidos na identificação dos picos: (1) e (5)

0,0150 g/100mL, (2) e (3) 0,0250 g/100mL, (4) 0,0060 g/100mL, (1) ácido

oxálico, (2) ácido tartárico, (3) ácido cítrico, (4) ácido gálico, (5) L – aa – 100

mmol/L H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, 15 s de injeção hidrodinâmica, 8

kV,

=214 nm, A=mistura inicial, B=mistura 1, C=mistura 2, D=mistura 3,

E=mistura 4, F=mistura 5.

7.6. CURVAS ANALÍTICAS

Para a maioria das análises químicas, a resposta de um determinado

método deve ser inicialmente avaliada em relação a quantidade conhecida

de analito (os padrões). Só então pôde-se interpretar qual seria a resposta

correspondente a amostra com quantidade desconhecida. Para esse

propósito, normalmente prepara-se uma curva de calibração, que mostra a

resposta de um método analítico para quantidades conhecidas de analito

(HARRIS, 2008). Portanto, com as condições otimizadas, pH e concentração

do eletrólito de separação da solução tampão, tempo de injeção, foi

necessário definir as condições de quantificação e aplicar o método proposto

na determinação simultânea dos ácidos orgânicos em sucos de frutas

frescos e industrializados. Optou-se pelo método de padronização externo

empregando curvas analíticas preparadas com soluções dos ácidos

orgânicos, o qual possibilita os cálculos das concentrações em todas as

amostras analisadas. Os resultados podem ser observados nas figuras 16 a

22.

0,012 0,016 0,020 0,024 0,028

2,8

3,0

3,2

3,4

3,6

3,8

4,0

VOLTAGEM (mV)

ÁCIDO OXÁLICO (g/100mL)

y = 74,85 x + 1,9130

r = 0,9995

Figura 16 – Curva analítica para o ácido oxálico na presença do ácido

tartárico, 100 mmol/L H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV,

15 s injeção,

= 214 nm.

0,012 0,016 0,020 0,024 0,028

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

VOLTAGEM (mV)

ÁCIDO TARTÁRICO (g/100mL)

y = 111,71x + 0,5713

r = 0,9923

Figura 17 – Curva analítica para o ácido tartárico na presença do ácido

oxálico, 100 mmol/L H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV,

15 s injeção,

= 214 nm.

0,010 0,015 0,020 0,025 0,030

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

VOLTAGEM (mV)

ÁCIDO TARTÁRICO (g/100mL)

y = 107,66x + 0,4534

r = 0,9912

Figura 18 – Curva analítica para o ácido tartárico, 100 mmol/L H

, pH

10,0, 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV, 15 s injeção a 4,5 cm por

gravidade

= 214 nm.

0,020 0,025 0,030 0,035 0,040

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

VOLTAGEM (mV)

ÁCIDO CÍTRICO (g/100mL)

y = 59,22 x - 0,5722

r = 0,9988

Figura 19 – Curva analítica para o ácido cítrico, 100 mmol/L H

pH 10,0

+ 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV, 15 s injeção,

=214nm.

0,020 0,025 0,030 0,035 0,040

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

VOLTAGEM (mV)

ÁCIDO CÍTRICO (g/100mL)

y = 64,50 x - 0,5330

r = 0,9983

Figura 20 – Curva analítica para o ácido cítrico na presença do L – aa, 100

mmol/L H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV, 15 s,

= 214

nm.

0,015 0,020 0,025 0,030 0,035

VOLTAGEM (mV)

L - aa (g/100mL)

y = 224,38 x - 0,0255

r = 0,9984

Figura 21 – Curva analítica para o L – aa na presença de ácido cítrico, 100

mmol/L H

pH 10,0 + 0,5 mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV, 15 s injeção,

= 214 nm.

0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

VOLTAGEM (mV)

L - aa (g/100mL)

y = 261,85x + 0,3406

r = 0,9987

Figura 22 – Curva analítica para o L – aa, 100 mmol/L H

pH 10,0 + 0,5

mmol/L CTAB, voltagem de 8 kV, 15 s,

= 214 nm.

7.7. APLICAÇÃO DO MÉTODO

7.7.1. TEMPO DE ESTUDO E CONCENTRAÇÕES OBTIDAS

O estudo dos ácidos orgânicos nos sucos de frutas frescos foi feito no

período compreendido entre 06/07 a 01/09/09, em dias alternados como

mostrado na Tabela 8. A partir das suas análises, conforme mostrado nas

Figuras 23 e 24, verificou-se que houve redução de 36,0% do L – aa no suco

fresco de caju, armazenado a 0 ºC durante 28 dias, 18,9% no suco fresco de

acerola, armazenado a 0

C durante 45 dias e 28,2% no suco fresco de

laranja, armazenado a 23 ºC durante 32 dias. Porém, não houve variação na

concentração do ácido cítrico em nenhum suco fresco que o continha,

apesar de o limão e a laranja serem armazenados a 23 ºC, e o umbu-cajá a

0 ºC, como mostrado na Figura 25. Não houve redução também nas

concentrações dos ácidos oxálico e tartárico presentes nas amostras dos

sucos frescos de carambola e de uva armazenados a 0 ºC, durante o

período do estudo, porém, apresentaram pequenas oscilações durante o

tempo de estudo, Figura 26.

Tabela 8 – Resultados das concentrações dos ácidos orgânicos (g/100mL)

dos sucos de frutas frescos durante o período do estudo.

Amostra / data da análise Ácido Orgânico

Cítrico L – aa

Limão / 28.07.09 5,3607 -

Limão / 04.08.09 5,3607 -

Limão / 10.08.09 5,5000 -

Limão / 21.08.09 5,4333 -

Limão / 28.08.09 5,8579 -

Laranja / 28.07.09 0,7701 0,0351

Laranja / 04.08.09 0,7798 0,0353

Laranja / 10.08.09 0,8960 0,0251

Laranja / 21.08.09 0,8167 0,0273

Laranja / 01.09.09 0,8307 0,0252

Caju / 14.07.09 - 0,1013

Caju / 15.07.09 - 0,0998

Caju / 20.07.09 - 0,0928

Caju / 21.07.09 - 0,0855

Caju / 11.08.09 - 0,0645

Caju / 12.08.09 - 0,0648

Umbu cajá / 28.07.09 1,2374 -

Umbu cajá / 04.08.09 1,2891 -

Umbu cajá / 08.08.09 1,2901 -

Umbu cajá / 11.08.09 1,2643 -

Acerola / 06.07.09 - 1,0854

Acerola / 18.08.09 - 1,0560

Acerola / 21.08.09 - 0,9129

Oxálico Tartárico

Carambola / 28.07.09 0,0333 0,1787

Carambola / 04.08.09 0,0258 0,1874

Carambola / 11.08.09 0,0457 0,1458

Uva / 14.07.09 - 0,3887

Uva / 20.07.09 - 0,3579

Uva / 28.07.09 - 0,3317

Uva / 12.08.09 - 0,3300

As análises foram feitas em triplicatas.

0 1 2 3 4 5 6 7

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

L - aa (g/100mL)

PERÍODO DO ESTUDO (dias)

SUCO FRESCO DE ACEROLA

Figura 23 – Variações das concentrações obtidas no suco fresco durante o

período do estudo. (Escala: 0-1 equivale a 5,62 dias; 45 dias).

0 1 2 3 4 5 6 7

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

L - aa (g/100mL)

PERÍODO DO ESTUDO (dias)

SUCO FRESCO DE LARANJA

SUCO FRESCO DE CAJU

Figura 24 – Variações das concentrações obtidas nos sucos frescos durante

o período do estudo. (Escala: 0-1 equivale a 6 dias; 45 dias).

1 2 3 4 5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

ÁCIDO CÍTRICO (g/100mL)

PERÍODO DO ESTUDO (dias)

SUCO FRESCO DE LIMÃO

SUCO FRESCO DE LARANJA

SUCO FRESCO DE UMBU-CAJÁ

Figura 25 – Variações das concentrações obtidas nos sucos frescos durante

o período do estudo. (Escala: 0-1 equivale a 6,5 dias; 33 dias).

1 2 3 4 5

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

ÁCIDO ORGÂNICO (g/100mL)

PERÍODO DO ESTUDO (dias)

SUCO FRESCO DE CARAMBOLA (1)

SUCO FRESCO DE

CARAMBOLA (2)

SUCO FRESCO DE

UVA (2)

Figura 26 – Variações das concentrações obtidas dos ácidos oxálico (1) e

tartárico (2) avaliadas nos sucos frescos no período do estudo. (Escala: 0-1

equivale a 5,5 dias; 28 dias).

Para os sucos industrializados o estudo ocorreu do dia 21/09 a

17/11/09, Tabela 9.

A partir da análise dos sucos industrializados, conforme mostrado na

Figura 27, percebeu-se que houve redução de 15,2% de ácido cítrico no

suco misto B, armazenado a 23 ºC após 56 dias e de 59,5% no suco D

armazenado a 23 ºC após 56 dias. Os resultados demonstraram ainda

redução de 99,4% do L – aa no suco misto A, armazenado a 23 ºC após 54

dias de aberto e redução de 100% do L – aa no suco misto B armazenado a

23 ºC após 56 dias de aberto, Figura 28.

Esses resultados demonstraram que o L – aa foi oxidado durante o

tempo de armazenagem das amostras, independentemente da temperatura

de estocagem, considerando tanto os sucos frescos como os

industrializados, enquanto que para o ácido cítrico só houve redução em

duas amostras de sucos industrializados. Os eletroferogramas obtidos a

partir das análises dos sucos frescos e dos industrializados são mostrados

nas Figuras 29 e 30.

Tabela 9 – Resultados das concentrações (g/100mL) dos ácidos orgânicos

nos sucos industrializados durante o período do estudo.

Amostra / data da análise Ácido orgânico

Cítrico L – aa

A / 23.09.09 0,4238 0,0247

A / 03.10.09 0,4008 0,0129

A / 17.11.09 0,4351 0,0016

B / 21.09.09 0,4042 0,0172

B / 23.09.09 0,4315 0,0114

B / 03.10.09 0,4443 0,0079

B / 17.11.09 0,3661 0,0000

C / 05.10.09 0,4296 -

C / 17.11.09 0,4350 -

D / 21.09.09 0,4514 -

D / 23.10.09 0,2725

D / 17.11.09 0,1828

E / 03.10.09 0,2306 -

E / 23.10.09 0,2725 -

A = suco misto de acerola, laranja enriquecido com L – aa, B = suco misto

de maçã, laranja, tangerina e limão, C = suco misto de laranja, limão e

tangerina D = suco de goiaba, E = suco misto de maçã, limão e uva. Todas

as análises foram feitas em triplicatas.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

ÁCIDO CÍTRICO (g/100mL)

PERÍODO DO ESTUDO (dias)

SUCO A

SUCO B

SUCO C

SUCO D

SUCO E

Figura 27 – Variações das concentrações obtidas nos sucos industrializados

durante o período do estudo. A = misto de acerola, laranja enriquecido com

L – aa, B = misto de maçã, laranja, tangerina e limão, C = misto de laranja,

limão e tangerina D = goiaba, E = misto de maçã, limão e uva, (Escala: 0-1

equivale a 16 dias, 56 dias).

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

L - aa (g/100mL)

PERÍODO DO ESTUDO (dias)

SUCO A

SUCO B

Figura 28 – Variações das concentrações nos sucos industrializados durante

o período do estudo. A = misto de acerola, laranja enriquecido com L – aa, B

= misto de maçã, laranja, tangerina e limão. (Escala: 0-1 equivale a 16 dias,

56 dias).

2 4 6 8

-2

2 4 6 8

-4

-2

2 4 6 8

-2

2 4 6 8

-2

2 4 6 8

-2

2 4 6 8

-2

2 4 6 8

-2

2 4 6 8

-2

VOLTAGEM (mV)

TEMPO (min)

Figura 29 – Eletroferogramas dos ácidos orgânicos na amostras dos sucos

frescos: A – de uva, B – morango, C – caju, D – acerola, E – carambola, F –

de limão, G – umbu-cajá, H – laranja; (1) ácido oxálico (2) ácido tartárico (3)

ácido cítrico (5) L – aa.

2 4 6 8 10

-2

2 4 6 8

-2

2 4 6 8

-2

2 4 6 8

-2

2 4 6 8

-10

-8

-6

-4

-2

VOLTAGEM (mV)

TEMPO (min)

Figura 30 – Eletroferogramas dos ácidos orgânicos na amostras dos sucos

industrializados. A = Suco misto de acerola, laranja enriquecido com L – aa,

B = suco misto de maçã, laranja, tangerina e limão, C = suco misto de

laranja, limão e tangerina D = suco de goiaba, E = suco misto de maçã,

limão e uva (3) ácido cítrico (5) L – aa.

Avaliação da redução de ácido ascórbico é, na verdade, um dos

principais objetivos de pesquisadores na área de alimentos. Pode-se

destacar o estudo feito por SILVA et al 2004 que encontraram redução de 84

a 92% no conteúdo de L–aa em amostras do pseudo fruto do caju,

armazenados por 1 mês, a 4 ºC; CAMPOS et al 2002, encontraram redução

de 12% do L –aa em amostras de suco de caju clarificado estocado a 4 °C,

durante um mês; JUSTI et al. 2000, encontraram redução de 23% no

conteúdo de L – aa no camu-camu armazenado a -18 °C durante 28 dias.

Os trabalhos propostos por CORTE et al., 1997 também mostraram redução

de 3,5% do L – aa em amostras de suco de acerola congelado a -18 ºC após

1 mês de armazenamento.

Nas Tabelas 10 e 11, têm-se as médias das concentrações em

g/100mL dos ácidos orgânicos encontrados nas amostras dos sucos frescos

e das amostras dos sucos industrializados. A maior quantidade de ácido

orgânico encontrado nos sucos de frutas frescos foi a do cítrico no limão,

com 5,6440 g/100mL ± 0,2200 e a menor foi a do L – aa na laranja, com

0,0286 g/100mL ± 0,0050, enquanto que nas amostras dos sucos

industrializados a maior quantidade foi a do ácido cítrico no suco de goiaba

com 0,4514 g/100mL ± 0,0116, e a menor foi a do L – aa no suco misto de

maçã, laranja, tangerina e limão com 0,0132 g/100mL ± 0,0046.

Tabela 10 – Médias dos resultados dos ácidos orgânicos (g/100mL) nas

amostras dos sucos frescos.

Amostra(n) Ácido Orgânico

Oxálico Tartárico Cítrico L – aa

Limão (27) - - 5,6440 ± 0,2230 -

Laranja (30) - - 0,8012 ± 0,0480 0,0286 ± 0,0050

Carambola (18) 0,0346 ± 0,0090 0,1695 ± 0,0180 - -

Caju (21) - - - 0,0859 ± 0,0150

Umbu caja (12) - - 1,2699 ± 0,0250 -

Uva (12) - 0,3527 ± 0,0270 - -

Acerola (12) - - - 1,0181 ± 0,0920

Morango (3) - - 0,5038 ± 0,0020 0,0753 ± 0,0070

n = número de análises.

Tabela 11 – Médias dos resultados dos ácidos orgânicos (g/100mL) nas

amostras dos sucos industrializados.

Amostra (n) Ácido orgânico

Cítrico L – aa

A (6) 0,4115 ± 0,0116 0,0168 ± 0,0068

B (9) 0,4243 ± 0,2995 0,0132 ± 0,0046

C (3) 0,4296 ± 0,0083 -

D (3) 0,4514 ± 0,0116 -

E (3) 0,2306 ± 0,0217 -

n = número de análises, A = Suco misto de acerola, laranja enriquecido com

L – aa, B = suco misto de maçã, laranja, tangerina e limão, C = suco misto

de laranja, limão e tangerina D = suco de goiaba, E = suco misto de maçã,

limão e uva.

A partir da análise dos resultados mostrados na Tabela 12, pode-se

comparar os resultados de alguns ácidos orgânicos obtidos através da ECZ

discutidos em outros trabalhos, com os resultados obtidos neste trabalho.

Tabela 12 – Comparando os resultados dos ácidos orgânicos deste trabalho

com outros. Dados: ácidos 1-oxálico, 2-tartárico, 3-cítrico, 5-L – aa.

Referência

Método

1 (g/100mL)

fruta

2 (g/100mL)

fruta

3 (g/100mL)

fruta

5 (g/100mL)

fruta

CARVALHO

et al., 2010

0,0346

Carambola

0,1695

Carambola

0,3527

Uva

5,6440

Limão

0,8012

Laranja

0,0286

Laranja

1,0181

Morango

CHOI et

al.,1997

- - - 0,0069

Laranja

0,0071

Morango

YANG et al.,

2000

- 0,7980

Uva

0,3200

Laranja

SAAVEDRA

et al., 2000

- - 1,1200

Laranja

MATO et al.

2007

- 0,2302

Uva

O ácido gálico não foi identificado em nenhum trabalho.

7.8. VALIDAÇÃO DO MÉTODO

A validação de um conjunto de ensaios propõe verificar se um

determinado método analítico é apto a produzir resultados confiáveis e

adequados aos objetivos a que se propõe. A validação permite ter

conhecimento das limitações e da confiabilidade das medidas obtidas na

análise por meio da metodologia desenvolvida (BRITO et al., 2003) Neste

trabalho, foram avaliadas a linearidade, faixa de trabalho, sensibilidade,

precisão, exatidão, limites de detecção, quantificação e repetibilidade.

7.8.1. LINEARIDADE E FAIXA DE TRABALHO

Os coeficientes de correlação (r) das curvas dos analitos foram

superiores a 0,9912 (Tabela 13), demonstrando uma boa relação de

linearidade entre a concentração e o sinal analítico, uma vez que sua

eficiência máxima consiste em ter valores de coeficiente de correlação maior

que 0,9990 (ANVISA). Para valores aceitáveis, a ANVISA recomenda um

coeficiente de correlação igual a 0,9900 no mínimo, e o INMETRO um valor

acima de 0,9000 no mínimo. O método desenvolvido mostrou ótimos

resultados dentro das faixas de trabalho para cada ácido orgânico (Tabela

14).

Tabela 13 – Linearidade para os ácidos oxálico, tartárico, cítrico, gálico e L –

aa, na faixa de concentração de 0,0040 a 0,0450.

Ácido orgânico Curva de calibração Coeficiente de

correlaçãor (r)

(1) na presença do (2) y = 74,8500x + 1,9130 0,9995

(2) na presença do (1) y = 111,7100x + 0,5713 0,9923

(2) y = 107,6575x + 0,4534 0,9912

(3) y = 59,2200x – 0,5722 0,9988

(3) na presença do (5) y = 64,5000x – 0,5330 0,9983

(5) na presença do (3) y = 224,3800x – 0,0255 0,9984

(5) Y = 261,8460 + 0,3406 0,9987

Ácidos: (1) oxálico (2) tartárico (3) cítrico (4) gálico (5) L – aa.

Tabela 14 – Faixa de trabalho dos ácidos orgânicos.

Ácidos Orgânicos

Oxálico Tartárico Cítrico Gálico L–aa

FT 0,0050 a

0,0250

0,0100 a

0,0300

0,0200 a

0,0400

0,0040 a

0,0120

0,0150 a

0,0450

FT = faixa de trabalho.

7.8.2. SENSIBILIDADE

A sensibilidade é um parâmetro que demonstra a variação da

resposta em função da concentração do analito, o qual pode ser expresso

em função da curva analítica de calibração, quanto maior for o valor do

coeficiente angular, mais sensível será o método. Considerando a análise

dos ácidos orgânicos com curvas de calibração em função da concentração

x altura do pico, o método apresentou maior sensibilidade para o L – aa,

uma vez que demonstrou o maior valor de coeficiente angular, como pode

ser visto na Tabela 13.

7.8.3. PRECISÃO

Neste trabalho, a precisão do método foi avaliado em três níveis de

concentração para cada analito, sendo que as médias foram obtidas a partir

de análise em triplicata. Os coeficientes de variação foram inferiores a 11,5%

em todos os níveis (Tabela 15), denotando uma boa precisão da técnica.

Tabela 15 – Coeficientes de variação (CV) para os ácidos orgânicos nos

níveis de concentração de 0,0100, 0,0150 e 0,0200 g/100mL.

g/100mL Precisão (%)

(1) (2) (3) (4) (5)

0,0100 3,44 3,24 7,29 3,72 6,20

0,0150 5,74 4,10 3,05 5,06 10,38

0,0200 1,76 1,48 11,46 5,29 2,74

(1) ácido oxálico (2) ácido tartárico (3) ácido cítrico (4) ácido gálico (5) L –

aa.

7.8.4. ENSAIOS DE RECUPERAÇÃO

O processo mais utilizado para avaliar a exatidão de um método é o

uso de materiais de referência certificado. Além disso, outras estratégias são

usadas para avaliar a confiabilidade de um método, tais como, ensaios de

recuperação ou comparação com um outro método. A recuperação (R) é

definida como a proporção da quantidade da substância de interesse,

presente ou adicionada na porção analítica do material teste, que é extraída

e passível de ser quantificada. O teste de recuperação mostra o efeito de

matriz sobre os resultados.

A eficiência do método varia em função da concentração da

substância, na maioria dos casos, a dispersão dos resultados aumenta com

a diminuição da concentração e a recuperação pode diferir substancialmente

a altas e baixas concentrações, por isso para a análise em nível de resíduos

recomenda-se que se trabalhe em níveis de adição de 1, 2 e 10 vezes o

valor de limite de quantificação, entretanto para componentes em maiores

concentrações, os níveis de adição podem ser 50, 75, 100, 125 e 150% do

nível esperado para a substância.

Foram feitas 61 adições padrão, sendo que 50 foram para os sucos

de frutas frescos e 11 para os sucos de frutas industrializados. As

recuperações obtidas variaram de 83,6 a 117,5% nos sucos frescos, e de

83,6 a 116,7% nos sucos de frutas industrializados (Tabelas 16 e 17). Esses

resultados mostraram ótimos valores de ensaios de recuperação, uma vez

que ficaram dentro da faixa especificada pelo RIBANI (70 a 120% para esse

nível de concentração), demonstrando que o método proposto é livre de

interferência de matriz.

Tabela 16 – Recuperação dos ácidos orgânicos (g/100mL) nos sucos de

frutas frescos.

Amostra Massa dos ácidos orgânicos (g)

Adicionada Recuperada Recuperação (%)

Limão (3) 0,0075 (3) 0,0071 (3) 95,24

Limão (3) 0,0150 (3) 0,0132 (3) 88,00

Limão (3) 0,0120 (3) 0,0138 (3) 114,8

Limão (3) 0,0060 (3) 0,0054 (3) 90,90

Limão (3) 0,0040 (3) 0,0040 (3) 101,0

Limão (3) 0,0800 (3) 0,0894 (3) 111,8

Limão (3) 0,0160 (3) 0,0179 (3) 112,3

Limão (3) 0,0640 (3) 0,0610 (3) 95,30

Laranja (3) 0,0010 (5)0,0030 (3) 0,0009 (5) 0,0039

(3) 95,40 (5) 108,7

Laranja (3) 0,0010 (5) 0,0030

(3) 0,0008 (5) 0,0033

(3) 90,20 (5) 108,6

Laranja (3) 0,0120 (5) 0,0140

(3) 0,0126 (5) 0,0149

(3) 105,25 (5) 93,30

Laranja (3) 0,0008 (5) 0,0020

(3) 0,0008 (5) 0,0023

(3) 103,20 (5) 115,0

Laranja (3) 0,0060 (5) 0,0050

(3) 0,0051 (5) 0,0005

(3) 85,12 (5) 90,16

Laranja (3) 0,0160 (5) 0,0080

(3) 0,0163 (5) 0,0085

(3) 102,00 (5) 106,0

Laranja (3) 0,0060 (5) 0,0016

(3) 0,0068 (5) 0,0017

(3) 114,00 (5) 83,60

Laranja (3) 0,0180 (5) 0,0120

(3) 0,1586 (5) 0,0124

(3) 88,10 (5) 103,3

Laranja (3) 0,0130 (5) 0,0090

(3) 0,0137 (5) 0,0097

(3) 91,30 (5) 97,30

Morango (3) 0,0120 (5) 0,0160

(3) 0,0109 (5) 0,0177

(3) 91,2 (5) 110,8

Caju (5) 0,0042 (5) 0,0037 (5) 89,50

Caju (5) 0,0030 (5) 0,0033 (5) 109,0

Caju (5) 0,0036 (5) 0,0038 (5) 105,5

Umbu cajá (3) 0,0030 (3) 0,0031 (3) 103,0

Umbu cajá (3) 0,0020 (3) 0,0023 (3) 114,40

Umbu cajá (3) 0,0020 (3) 0,0019 (3) 97,98

Acerola (5) 0,0120 (5) 0,0103 (5) 85,70

Acerola (5) 0,0008 (5) 0,0009 (5) 85,90

Carambola (1) 0,0200 (5) 0,0060

(1) 0,0235 (2) 0,0057

(1) 117,5 (2) 95,00

Carambola (1) 0,0080 (5) 0,0080

(1) 0,0081 (2) 0,0070

(1) 100,0 (2) 87,60

Carambola (1) 0,0150 (2) 0,0060

(1) 0,0147 (2) 0,0062

(1) 98,00 (2) 96,00

Carambola (1) 0,0040 (2) 0,0160

(1) 0,0047 (2) 0,0141

(1) 117,3 (2) 93,50

Carambola (1) 0,0080 (2) 0,0080

(1) 0,0081 (2) 0,0070

(1) 100,8 (2) 88,17

Uva (2) 0,0020 (2) 0,0025 (2) 105,8

Uva (2) 0,0016 (2) 0,0013 (2) 87,43

Uva (2) 0,0060 (2) 0,0051 (2) 102,5

Uva (2) 0,0006 (2) 0,0007 (2) 116,0

(1) ácido oxálico (2) ácido tartárico (3) ácido cítrico (5) L – aa.

Tabela 17 – Recuperação dos ácidos orgânicos (g/100mL) nos sucos de

frutas industrializados.

Amostra Ácido

Orgânico

Massa

adicionada

(g)

Massa

recuperada

(g)

Recuperação

A (3) 0,4238

(5) 0,0247

(3) 0,0020

(5) 0,0070

(3) 0,0016

(5) 0,0069

(3) 83,60

(5) 98,63

A (3) 0,4008

(5) 0,0129

(3) 0,0006

(5) 0,0014

(3) 0,0006

(5) 0,0014

(3) 108,7

(5) 100,0

B (3) 0,4042

(5) 0,0172

(3) 0,0008

(5) 0,0040

(3) 0,0009

(5) 0,0039

(3) 106,7

(5) 98,55

B (3) 0,4315

(5) 0,0114

(3) 0,0014

(5) 0,0040

(3) 0,0012

(5) 0,0045

(3) 88,70

(5) 83,60

C (3) 0,4341 (3) 0,0016 (3) 0,0017 (3) 105,9

D (3) 0,4509 (3) 0,0025 (3) 0,0024 (3) 95,76

E (3) 0,2284 (3) 0,0060 (3) 0,0052 (3) 86,16

A = Suco industrializado misto de acerola, laranja enriquecido com L – aa; B

= Suco industrializado misto de maçã, laranja, tangerina e limão; C = Suco

industrializado misto de laranja, limão e tangerina; D = Suco industrializado

de goiaba e E = Suco industrializado misto maçã, limão e uva. (3) ácido

cítrico (5) L – aa.

7.8.5. LIMITES DE DETECÇÃO (LD) E QUANTIFICAÇÃO (LQ)

Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) são parâmetros

analíticos que auxiliam na determinação e escolha de um método analítico,

os quais estão associados a sinais analíticos instrumentais, dentre eles a

magnitude de sinal analítico, que indica a concentração de um elemento

possível a ser medido e a linha de base. O limite de detecção (LD) é a

concentração do analito a um dado sinal analítico correspondente ao valor

de 2 ou 3 vezes a magnitude da linha de base com ruído (IUPAC). A linha de

base com ruído pode ser analisada, estatisticamente, fazendo-se pelo

menos dez medidas de um branco para obter o sinal observado e

determinando a estimativa do desvio padrão destas medidas.

O limite de quantificação (LQ) pode ser calculado considerando 10

vezes a magnitude da linha de base com ruído (IUPAC).

Neste trabalho, o LD e o LQ foram calculados considerando a linha de

base formada com o sinal-ruído obtido a partir das análises, sendo que para

o cálculo do LD e LQ, consideraram-se 11 medidas do branco, em um

intervalo de tempo de 4 a 6 min, uma vez que todos os ácidos em estudo

migraram neste intervalo de tempo (Tabela 18).

Tabela 18 – Limite de Detecção e Quantificação (g/100mL), para os ácidos

orgânicos estudados.

Ácidos Orgânicos

Oxálico Tartárico Cítrico Gálico L–aa

LD 0,0005 0,0056 0,0155 0,0009 0,0045

LQ 0,0016 0,0187 0,0517 0,0031 0,0151

LD = limite de detecção LQ = limite de quantificação (g/100 mL).

7.8.6. REPETIBILIDADE

A repetibilidade de um método representa a concordância entre os

resultados de análise de um determinado método realizado, considerando o

mesmo laboratório, analista e instrumento. Para o cálculo, podem ser

realizadas 9 determinações, sendo 3 em concentrações diferentes, no qual

cada concentração é feita em triplicata, ou com no mínimo de 5

determinações para uma única concentração (BRITO et al., 2003). Neste

trabalho, a repetibilidade do método foi estimada analisando-se amostras

consecutivas das frutas de sucos frescos de limão e sucos frescos de laranja

num mesmo dia (n=5), e em dias distintos (n=5), como pode ser visto na

Tabela 19. O teor de ácido cítrico no suco fresco de limão analisado no

mesmo dia e em dias distintos foi de 5,8282 g/100mL ± 0,0170 e 5,5025

g/100mL ± 0,2069, respectivamente, demonstrando que a variação dos

resultados do ácido cítrico foi maior nas análises feitas em dias distintos. O

teor de ácido cítrico no suco fresco da laranja analisado no mesmo dia e em

dias distintos foi de 0,8012 g/100mL ± 0,0500 e 0,8187g/100mL ± 0,0500,

respectivamente, apresentando uma mesma variação. O teor de L – aa para

o suco fresco da laranja apresentou uma maior variação em dias alternados,

passando de 0,0287 g/100mL ± 0,0050 e 0,0296 g/100mL ± 0,0052,

respectivamente. Os resultados mostraram uma maior variação das

concentrações das análises feitas em dias distintos.

Tabela 19 – Concentrações obtidas para o ácido cítrico e o L – aa no limão e

na laranja no mesmo dia e entre-dias.

Amostras - data Ácidos orgânicos (g/100mL)

Cítrico L – aa

Limão - 28/08/09 5,8579 -

Limão - 28/08/09 5,8217 -

Limão - 28/08/09 5,8166 -

Limão - 28/08/09 5,8140 -

Limão - 28/08/09 5,8309 -

Média ± SD 5,8282 ± 0,0170 -

Limão - 28/07/09 5,3607 -

Limão - 04/08/09 5,3607 -

Limão - 10/08/09 5,5000 -

Limão - 21/08/09 5,4333 -

Limão - 28/08/09 5,8579 -

Média ± SD 5,5025 ± 0,2069 -

Laranja - 01/09/09 0,8307 0,0252

Laranja - 01/09/09 0,7326 0,0253

Laranja - 01/09/09 0,7899 0,0275

Laranja - 01/09/09 0,8107 0,0244

Laranja - 01/09/09 0,8062 0,0244

Média ± SD 0,8012 ± 0,0500 0,0286 ± 0,0050

Laranja - 28/07/09 0,7701 0,0351

Laranja - 04/08/09 0,7798 0,0353

Laranja - 10/08/09 0,8960 0,0251

Laranja - 21/08/09 0,8167 0,0273

Laranja - 01/09/09 0,8307 0,0252

Média ± SD 0,8187 ± 0,0500 0,0296 ± 0,0052

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O método desenvolvido foi adequado para a determinação dos ácidos

orgânicos oxálico, tartárico, cítrico, gálico e o L – aa, em sucos de frutas

frescas e em sucos de frutas industrializados. O método mostrou-se simples,

eficiente, rápido (< 6 min) de baixo custo e de fácil operação.

Alguns parâmetros na montagem do sistema eletroforético de zona

foram fundamentais para a separação e quantificação dos ácidos, tais como:

a concentração do eletrólito de separação e o uso de um inversor do fluxo

eletroosmótico (CTAB), o pH da solução tampão, a inversão da polaridade, o

comprimento de onda de absorção molecular, a voltagem, o tempo e a altura

de injeção hidrodinâmica, e o não uso de um solvente orgânico.

Segundo os parâmetros de validação, o método apresentou boa

linearidade para as faixas de trabalho consideradas, boa sensibilidade, e

ótimos coeficientes de correlação (r). O coeficiente de variação variou de

1,48 a 11,46%, os limites de detecção variaram de 0,0005 a 0,0155

g/100mL, e os limites de quantificação variaram de 0,0016 a 0,0517

g/100mL, respectivamente. Os ensaios de recuperação nas amostras dos

sucos de frutas frescos variaram de 83,6 a 117,5%, e nos sucos

industrializados a variação foi de 83,6 a 108,7%, demonstrando ótimos

resultados de recuperação.

Foram detectados e quantificados os ácidos oxálico, tartárico, cítrico,

e o L – aa nas amostras dos sucos de frutas frescos e nos sucos de frutas

industrializados, sendo que o ácido oxálico foi quantificado no suco fresco de

carambola, o ácido tartárico nos sucos frescos de carambola e uva, o ácido

cítrico nos sucos frescos de limão, laranja, umbu cajá e morango, e nos

sucos industrializados A, B, C, D e E (A = suco industrializado misto de

acerola, laranja enriquecido com L – aa; B = suco industrializado misto de

maçã, laranja, tangerina e limão; C = suco industrializado misto de laranja,

limão e tangerina; D = suco industrializado de goiaba e E = suco

industrializado misto maçã, limão e uva), o L – aa foi encontrado nos sucos

frescos de laranja, caju, acerola e morango, e nos sucos industrializados A e

B (A = suco industrializado misto de acerola, laranja enriquecido com L – aa;

B = suco industrializado misto de maçã, laranja, tangerina e limão).

Não houve redução, tanto na concentração do ácido oxálico quanto

na concentração do ácido tartárico, nas amostras de sucos que os

continham, porém, houve redução do ácido cítrico em duas amostras de

sucos industrializados (suco misto de maçã, laranja, tangerina e limão e no

suco de goiaba). Em relação a concentração do L – aa, houve redução em

todas as amostras de sucos que o continham, sendo que essa redução foi

ainda mais expressiva nos sucos industrializados.

9. PERSPECTIVAS FUTURAS

Devido a grande facilidade de implementação da eletroforese capilar

de zona, e a facilidade de se trabalhar com frutas e sucos industrializados,

uma vez que as amostras são preparadas a partir do suco obtido com

posterior diluição com água destilada, pretende-se trabalhar com outras

frutas, com frutas de diferentes regiões do país, e abranger um número

maior de ácidos orgânicos;

Pretende-se monitorar o teor de ácidos orgânicos nas frutas num

período de inter-safra;

Colaborar com outros trabalhos na determinação dos ácidos

orgânicos em amostras de sucos de frutas.

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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103

11. ANEXOS

104

ANEXO A

CURRICULUM VITAE

Nome: José Marcos Valentim de Carvalho

Nascimento: 11 de novembro de 1981 em Lagarto/SE

Filiação: João Valentim de Carvalho e Josefa Jovelina Nascimento de

Carvalho

FORMAÇÃO

 Graduação: Licenciado em Química pela Universidade Federal de

Sergipe.

EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL

 De 2005 a 2007, atuou como analista químico no controle de

qualidade da empresa de alimentos e fermentados acéticos Maratá

Aguardentes, exercendo atividades espectrofotométrica,

turbidimétrica, titulométrica, e cromatografia gasosa (GC).

 Desde 2007 exerce atividades ligadas à educação em Química, em

diversos estabelecimentos particulares e público de ensino.

 Desde 2007 atua como professor efetivo de Química na Escola prof.

Abelardo Romero Dantas Lagarto/SE.

ATIVIDADES DESENVOLVIDAS DURANTE O MESTRADO

 2008 – Universidade Federal de Sergipe (São Cristóvão) 4º encontro

da Pós-Graduação em Química. Apresentação do trabalho “Análise

de Ácidos Orgânicos em Frutas Utilizando Eletroforese Capilar”.

 2009 – Universidade Federal de Sergipe (Campus Prof. Alberto

Carvalho) I ENESQUIM. Apresentação do trabalho “Desenvolvimento

de um Sistema Eletroforético para Determinação de Ácidos Orgânicos

em Sucos de Frutas Utilizando Eletroforese Capilar de Zona”.

 2009 – Bahia Othon Palace Hotel (Salvador – BA) – 15° Encontro

Nacional de Química Analítica e 3° Congresso Iberoamericano de

Química Analítica.

105

 2009 – Bahia Othon Palace Hotel (Salvador – BA) – 15° Encontro

Nacional de Química Analítica e 3° Congresso Iberoamericano de

Química Analítica. Curso: Análise Multivariada.

 2009 – Bahia Othon Palace Hotel (Salvador – BA) – 15° Encontro

Nacional de Química Analítica e 3° Congresso Iberoamericano de

Química Analítica. Apresentação do trabalho “Desenvolvimento de um

Sistema Eletroforético para Determinação de Ácidos Orgânicos em

Sucos de Frutas”.

 2010 – Submissão do artigo intitulado “Developing of a System for the

Determination of Organic Acids in Fruit Juices Using Capillary Zone

Electrophoresis”. no Journal Food of Composition Analysis, em 28 de

janeiro de 2010.

106

ANEXO B

Tabela 2 – Aditivos de eletrólitos comumente empregados em eletroforese

capilar. FONTE: TAVARES M FM, 1997.

ADITIVO FUNÇÃO E/OU EFEITO

Ácidos sulfônicos Agente de pareamento iônico e

modificador da carga superficial

Aminas Bloqueia sítio ativo na superfície

capilar. Reduz a adsorção e a

simetria de pico

Linfólitos Reduz a interação soluto capilar,

melhora a resolução e simetria de

pico

Ciclodextrinas Usado na separação quiral e como

complexante auxiliar na separação

de compostos nêutros

Éter coroa Usados nas separações quirais e

como complexantes auxiliares na

separação de metais

Glicóis Reduz a adsorção soluto-capilar,

auxilia na solubilidade de solutos

orgânicos e reduz o fluxo

eletroosmótico.

Metais de transição Modificam a mobilidade de certos

solutos, afetam a resolução

Polímeros de celulose Agentes modificadores do fluxo-

eletroosmótico

Sais inorgânicos Reduz o fluxo eletroosmótico, altera

a conformação de proteínas e

previne a adsorção soluto capilar

Solventes orgânicos Aumenta a solubilidade de solutos

orgânicos. Reduz a interação

soluto/capilar. Agentes modificadores

do fluxo eletroosmótico

Tensoativos catiônicos Reverte o fluxo eletroosmótico

Uréia Aumenta a solubilidade das

proteínas

107

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