( PDF ) Remodelamento do fígado, pâncreas e tecido adiposo em modelo experimental de 'Síndrome Metabólica' tratado com telmisartana, sitagliptina e metformina

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VANESSA DE SOUZA MELLO

Remodelamento do fígado, pâncreas e tecido adiposo em modelo

experimental de 'síndrome metabólica' tratado com telmisartana,

sitagliptina e metformina

Tese apresentada como requisito parcial

para a obtenção do título de Doutor em

Ciências do Programa de Pós-Graduação

em Biologia Humana e Experimental da

Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

Orientador: Professor Doutor Carlos Alberto Mandarim-de-Lacerda

Coorientadora: Professora Doutora Márcia Barbosa Águila

Rio de Janeiro, RJ

2010

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VANESSA DE SOUZA MELLO

Remodelamento do fígado, pâncreas e tecido adiposo em modelo

experimental de 'síndrome metabólica' tratado com telmisartana,

sitagliptina e metformina

Apresentada em: 16 de junho de 2010

Banca examinadora:

Prof. Dr. Carlos Alberto Mandarim-de-Lacerda (orientador)

Prof. Dr. Ruy Garcia Marques (UERJ)

Profª Drª Albanita Vianna de Oliveira (UERJ)

Profª Drª Lucia Marques Alves Vianna (UNIRIO)

Profª Drª Patrícia Machado Rodrigues e Silva Martins (IOC-FioCruz)

Rio de Janeiro, RJ

2010

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DEDICATÓRIA

À minha avó Luíza (“In Memoriam”),

Aos meus pais,

Aos meus irmãos de coração,

Ao meu afilhado,

Aos meus orientadores

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, pelo incentivo, apoio e dedicação constante em todas as etapas desse

projeto e pela participação ativa na realização dos meus sonhos.

A toda a minha família, em especial aos meus tios Roberto, Simone, Conceição e Rosa e

à minha avó Luíza, que me deixou neste ano, mas que continua torcendo por mim de

algum lugar.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Alberto Mandarim de Lacerda, pela confiança, pelas

orientações, pelo incentivo constante, por servir de modelo e inspiração, pelas

oportunidades que surgiram na minha vida ao longo desses 3 anos e meio e por todos os

ensinamentos que me fizeram concluir mais uma etapa da minha vida. “Todos os dias

chegam”.

À minha coorientadora, Prof. Dra. Márcia Barbosa Águila, por todos os ensinamentos

desde os meus 19 anos ainda na UNIRIO, por ter me dado a oportunidade de entrar no

LMMC, pela orientação do meu mestrado, por todas as dicas nas aulas de anatomia, por

dividir comigo a paixão pelo esporte e pela amizade.

À minha amiga Bianca pela participação ativa nesse projeto, por todas as noites

dormidas no laboratório, pela companhia nos congressos pelo mundo, pelo carinho,

respeito e admiração recíproca. Vida longa à dupla!

Aos meus ICs Bernardo e Fernando, sem os quais esse trabalho não seria possível.

Espero ter contribuído para a formação profissional de vocês na mesma proporção que

vocês contribuíram para a minha.

Ao meu amigo-irmão André, pelo apoio constante, pela amizade sólida, pela presença

em todas as etapas da minha vida e por todos os bons e maus momentos que dividimos

nesses 10 anos de jornada. Você é sempre!

Ao meu afilhado Roberto e à minha amiga-irmã Paula, que entraram na minha vida na

metade do doutorado e viraram grandes incentivadores, me dando força para continuar e

vencer a cada dia. Obrigada pelos dias perfeitos, pelos sorrisos e pela essencialidade que

vocês têm na minha vida.

Aos meus anatomistas modelo Thiago e Geraldo, pelos ensinamentos e amizade.

A toda a equipe do LMMC, em especial às companheiras de biotério Bianca, Isabele e

Alini, aos 'mestres' da imunohistoquímica Leonardo e Caroline, aos amigos Rodrigo, Júlio,

Thiago e Fernanda Amorim, pelo apoio na realização dos exames noturnos e ao amigo

Victor, pelo incentivo e pelas ajudas em todas as emergências relacionadas à informática.

À ex-IC e amiga Fernanda Ornellas e aos amigos Tamiris e Cesar, pela amizade,

incentivo e companhia.

À Thatiany Marinho, pela microtomia perfeita, pelo trabalho árduo para que eu

terminasse o artigo o mais rápido possível e pela amizade nesses 6 anos de laboratório.

Aguardo sua formatura, defesa de mestrado e doutorado.

Aos técnicos e amigos Angélica Figueiredo, Ana Lúcia e William Lannes, pela ajuda no

preparo do material ou das aulas de anatomia.

Ao melhor grupo de amigas do mundo: Aline, Carol, Paula e Raíssa. Obrigada por todos

os momentos inesquecíveis Brasil afora.

Às minhas amigas gaúchas: Cíntia, Rose e Eliete, pela amizade e apoio à distância ou no

lab.

Aos meus amigos de longa data: Erika, Luciana, Matheus e Tatiane, igualmente

importantes para a realização desse projeto.

Ao meu amigo e parceiro de dança Milton e a todos da academia sindicato da dança,

pelos momentos de descontração.

A todos que me ajudaram de alguma forma ao longo desses anos de doutorado e a

todos os professores que despertaram em mim o fascínio pela pesquisa científica e a

admiração pela docência, em especial as minhas primeiras orientadoras: Édira Andrade e

Lúcia Rodrigues.

À minha turma de doutorado, carinhosamente apelidada de “Titanic”, por dividirem

comigo todos os momentos desde a seleção do doutorado até a qualificação e defesa. A

vitória é nossa.

“Se as coisas são inatingíveis... ora! Não é motivo para não querê-las... Qu e

tristes os caminhos, se não fora a presença distante das estrelas!”

(Mário Quintana)

RESUMO

SOUZA-MELLO Vanessa. Remodelamento do fígado, pâncreas e tecido adiposo em

modelo experimental de 'síndrome metabólica' tratado com telmisartana,

sitagliptina e metformin. Tese (Doutorado em Ciências, Biologia Humana e

Experimental) – IBRAG, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,

2010.

A intervenção farmacológica pode minimizar ou até mesmo reverter o

remodelamento adverso em órgãos num modelo de síndrome metabólica. Este

trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das monoterapias e associações

medicamentosas sobre a morfologia do tecido adiposo, remodelamento hepático

e pancreático em camundongos C57bl/6 alimentados com dieta very high-fat.

Camundongos C57bl/6 machos foram alimentados com dieta very high-fat (HF,

60% de lipídios) ou dieta padrão (SC, 10% de lipídios) por 10 semanas, quando

foram iniciados os tratamentos: HF-T (HF + Telmisartana, 5.2mg/Kg/dia), HF-S (HF

+ Sitagliptina, 1.08g/Kg/dia), HF-M (HF + Metformina, 310.0mg/Kg/dia) e as

associações medicamentosas HF-TM, HF-TS e HF-SM. Os grupos tratados também

tiveram livre acesso à dieta high fat e os tratamentos duraram 6 semanas. Técnicas

morfométricas, estereológicas, imunohistoquímicas, ELISA, western blotting e

microscopia eletrônica foram utilizadas. A dieta high-fat causou sobrepeso,

intolerância oral à glucose, hiperinsulinemia, hipertrofia de ilhotas e adipócitos,

grau 2 de esteatose hepatica (<33%) redução da expressão de PPAR-alfa e de

GLUT-2, concomitante com aumento da expressão de SREBP-1 no grupo HF

(P<0.0001). Por outro lado, todos os tratamentos resultaram em perda de peso

significativa, reversão da resistência à insulina, hipertrofia de ilhotas e adipócitos e

alívio da esteatose hepática. Somente os grupos HF-T e HF-TS apresentaram

massa corporal similar ao grupo SC ao final do experimento, sendo que o ultimo

também apresentou reversão da esteatose hepática. O aumento da expressão do

PPAR-alfa paralelamente ao decréscimo da expressão do SREBP-1 explica os

achados favoráveis para o fígado. A normalização do tamanho do adipócito foi

consistente com os níveis maiores de adiponectina e com a redução dos níveis de

TNF-alfa (P<0.0001) nos grupos tratados.

Todos os tratamentos foram eficazes para controlar a síndrome metabólica. Os

melhores resultados foram alcançados com a telmisartana e sitagliptina como

monoterapias ou como associação entre essas, combinando a ativação parcial do

PPAR-alfa no fígado com a extensão do tempo de ação das incretinas.

Palavras chaves: Doença não alcoólica do fígado gorduroso, doença não alcoólica

do pâncreas gorduroso, obesidade, telmisartana, incretinas, dieta hiperlipídica.

ABSTRACT

Pharmacological intervention can minimize or even reverse adverse remodeling

due to metabolic syndrome. This work sought to evaluate the effects of

monotherapies and combinations of drugs on insulin sensitivity, adipose tissue

morphology, pancreatic and hepatic remodelling in C57BL/6 mice fed a high-fat

diet. Male C57BL/6 mice were fed a very high-fat diet (HF, 60% lipids) or standard

chow (SC, 10% lipids) over 10 weeks, after which drug treatments began: HF-T (HF

+ Telmisartan, 5.2mg/Kg/day), HF-S (HF + Sitagliptin, 1.08g/Kg/day), HF-M (HF +

Metformin, 310.0mg/Kg/day) and the drug combinations HF-TM, HF-TS and HF-

SM. Treated groups also had free access to HF diet and treatments lasted 6 weeks.

Morphometry, stereological tools, immunostaining, ELISA, Western blotting and

electron microscopy were used. The HF diet yielded an overweight phenotype, oral

glucose intolerance, hyperinsulinemia, hypertrophied islets and adipocytes, stage 2

steatosis (<33%) and reduced liver PPAR-alpha and GLUT-2, concomitant with

enhanced SREBP-1 expression, in the HF group (P<0.0001). Conversely, all drug

treatments resulted in significant weight loss, reversed insulin resistance, islet and

adipocyte hypertrophy and alleviated hepatic steatosis. Only HF-T and HF-TS

presented body weights similar to SC mice at the end of the experiment and the

latter treatment reversed hepatic steatosis. Increased PPAR-alpha immunostaining

parallel to higher GLUT-2 and reduced SREBP-1 expression explain the favourable

hepatic outcomes. Restoration of adipocyte size was consistent with higher

adiponectin levels and lower TNF-alpha levels (P<0.0001) in treated groups. In

conclusion, all treatments were effective in controlling metabolic syndrome. The

best results were achieved using Telmisartan and Sitagliptin as monotherapies or

as a dual treatment, combining partial PPAR-gamma agonism and PPAR-alpha

activation in the liver with extended incretin action.

Key words: Non alcoholic fatty liver disease, non alcoholic fatty pancreas disease,

obesity, telmisartan, incretins, high-fat diets.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura

Página

Vias de sinalização intracelular da insulina .................................................

Vias de sinalização da insulina no fígado ......................................................

Esquema da evolução da NAFLD para NASH ...............................................

Regulação do metabolismo de lipídios no fígado .......................................

Ações do GLP-1 nos tecidos periféricos .........................................................

Mecanismo de ação dos inibidores da DPP-4 ..............................................

Efeitos da combinação da ação ARB com agonista parcial PPAR-gama

sobre diversos órgãos ................................................................................

Ingestão energética durante as dez primeiras semanas de experimento

(fase de indução) ..........................................................................

Ingestão em KJ por grama de massa corporal .............................................

Evolução da massa corporal ao longo do experimento ...........................

Insulinemia dos animais aos 7 meses de idade ..........................................

Área sob a curva do teste oral de tolerância à glicose realizada aos 7

meses de idade (pós-tratamento) .................................................................

Área sob a curva do teste intraperitoneal de tolerância à insulina

realizada aos 7 meses de idade (pós-tratamento) ....................................

Homa-IR aos 7 meses de idade (pós-tratamento) .....................................

KI aos 7 meses de idade (pós-tratamento) ...................................................

HOMA-B aos 7 meses de idade (pós-tratamento) .....................................

Níveis de colesterol total aos 7 meses de idade (pós-tratamento) ....

Massa hepática corrigida pelo comprimento da tíbia aos 7 meses de

idade (pós-tratamento)....................................................................................

Densidade de volume de esteatose hepática aos 7 meses de idade

(pós-tratamento) .....................................................................................................

Distribuição da gordura corporal aos 7 meses de idade (pós-tratamento)

................................................................................................................

Razão gordura epididimária : gordura subcutânea dos animais aos 7 meses de

idade (pós-tratamento) .................................................................

Diâmetro dos adipócitos dos animais dos animais aos 7 meses de idade (pós-

tratamento) .........................................................................................

Níveis de TNF-alfa aos 7 meses de idade (pós-tratamento) .................

Níveis de adiponectina aos 7 meses de idade (pós-tratamento) ........

Massa pancreática corrigida pelo comprimento da tíbia .......................

Densidade de volume de esteatose pancreática aos 7 meses de idade

..............................................................................................................................

Diâmetro das ilhotas pancreáticas aos 7 meses de idade ......................

Imunomarcação para PPAR-alfa hepático ....................................................

Imunomarcação para insulina, glucagon e glut-2 no pâncreas dos animais aos 7

meses de idade .............................................................................

Imunofluorescência para insulina e glucagon no pâncreas dos animais aos 7

meses de idade .............................................................................

Eletromicrografia do fígado dos animais aos 7 meses de idade ..........

Densidade numérica de mitocôndrias por área aos 7 meses de idade

..............................................................................................................................

Densidade ótica integral das bandas de western blotting para SREBP-1

.......................................................................................................................

Densidade ótica integral das bandas de western blotting para GLUT-2

..........................................................................................................................

LISTA DE TABELAS

Tabela

Página

Comparação das definições para diagnóstico da SM ................................

Características químicas das dietas experimentais ..................................

Lista de Abreviaturas

Síndrome metabólica

HAS

Hipertensão arterial sistêmica

DM2

Diabetes mellitus tipo 2

NAFLD

Doença não alcoólica do fígado

gorduroso

AGL

Ácidos graxos livres

NAFPD

Doença não alcoólica do

pâncreas gorduroso

ARB

Bloqueador do receptor AT1

PPAR-gama

Receptor ativador da

proliferação peroxissomal

gama

DPP-IV

Dipeptidil peptidase tipo IV

DCV

Doenças cardiovasculares

AGS

Ácidos graxos saturados

AGT

Ácidos graxos trans

OMS

Organização mundial de saúde

EGIR

Grupo Europeu de Estudo da

resistência à insulina

NCEP/ATPIII

Programa Nacional de

Educação do Colesterol –

Terceiro Painel de Tratamento

do Adulto

PAI-1

Inibidor do ativador de

plasminogênio 1

VLDL

Lipoproteínas de densidade

muito baixa

LDL

Lipoproteína de baixa

densidade

HDL

Lipoproteína de alta densidade

DAC

Doença arterial coronariana

PI3K

Fosfatidilinositol-3-quinase

GLUT

Transportador

Receptor de insulina

IRS

Substrato do receptor de

insulina

Akt

Proteína quinase B

PTPases

Proteínas tirosina fosfatases

PTP 1B

Proteína tirosina fosfatase 1B

TNF-alfa

Fator de necrose tumoral alfa

IL-6

Interleucina 6

m-TOR

Alvo da rapamicina em

mamíferos

JNK

Quinase c-Jun-NH2-terminal

GKS-3

Glicogênio sintase quinase-3

PEPCK

Fosfoenolpiruvato

carboxiquinase

NASH

Esteatohepatite não alcoólica

Ácido graxo

PPAR-alfa

Receptor ativador de

proliferação peroxissomal alfa

MEC

Matriz extracelular

SCs

Células estreladas

SREBP-1c

Proteína de ligação ao

elemento regulador do esterol

ACC

Acetil CoA carboxilase

FAS

Ácido graxo sintetase

NASP

Esteatopancreatite não

alcoólica

Diabetes mellitus

GLP-1

Peptídeo similar ao glucagon-1

GIP

Peptídeo insulinotrópico

dependente de glicose

GLP-2

Peptídeo similar ao glucagon 2

SRAA

Sistema renina angiotensina

aldosterona

iECA

Inibidores da enzima

conversora de angiotensina

PPAR-delta

Receptor ativador de

proliferação peroxissomal delta

Massa corporal

TOTG

Teste oral de tolerância à

glicose

TITI

Teste intraperitonela de

tolerância à insulina

HOMA-IR

Modelo de avaliação da

homeostase para resistência à

insulina

Densidade de volume

PBS

Tampão fosfato salino

BSA

Albumina sérica bovina

IOD

Densidade integral ótica

MET

Microscopia eletrônica de

transmissão

Densidade numérica / área

Sumário

Página

Introdução

Objetivos

 Objetivo geral

 Objetivos específicos

Revisão da Literatura

 Síndrome metabólica

 Modelos experimentais de doenças metabólicas

 Resistência à insulina

 Alterações hepáticas na resistência à insulina

 Alterações pancreáticas na resistência à insulina

 Metabolismo da glicose e ação das incretinas

 Sitagliptina

 Metformina

 Telmisartana

Material e Métodos

 Animais e dieta

 Massa corporal e ingestão alimentar

 Análises metabólicas

 Sacrifício

 Perfil lipídico

 Radioimunoensaio para insulina

 Morfometria dos adipócitos

 TNF-alfa e adiponectina

 Estereologia do fígado

 Morfometria e estereologia do pâncreas

 Imunohistoquímica

 Imunofluorescência

 Análise de imagens

 Western Blot

 Microscopia eletrônica de transmissão

 Análise estatística

Resultados

 Ingestão alimentar e massa corporal

 Metabolismo de carboidratos

 Perfil lipídico

 Estereologia hepática

 Morfometria dos adipócitos e massa adiposa

 Adipocinas

 Morfometria do pâncreas e estereologia

 Imunohistoquímica

 Imunofluorescência

 Modificações ultraestruturais

 Western blot

Discussão

Considerações finais e Conclusões

102

Referências

105

Anexo

Apêndice

Introdução

As maiores disponibilidades de alimentos de alta densidade energética assim como

hábitos de vida sedentários introduziram uma nova ameaça à sobrevivência humana:

a obesidade e suas comorbidades. Dentre essas, destacam-se a obesidade centrípeta e

a resistência à insulina (Grundy, 2008). O armazenamento anormal de gordura na

região abdominal encontra-se diretamente relacionado ao acúmulo ectópico de gor-

dura em órgãos chave do metabolismo, tais como fígado e pâncreas. A resistência à

insulina age em sinergismo com o excesso de tecido adiposo no desencadeamento da

desregulação do eixo adipoinsular, predispondo ao desenvolvimento de outros dis-

túrbios metabólicos, caracterizando a síndrome metabólica (SM), cuja prevalência é

crescente em todo o mundo (Eckel et al., 2005; Despres e Lemieux, 2006).

A SM inclui aumento da circunferência abdominal, hipertensão arterial sistêmica

(HAS), dislipidemia e resistência à insulina ou intolerância à glicose ou diabetes melli-

tus tipo 2 (DM2) (Eckel et al., 2005). A comunidade científica vem buscando formas

de tratamento dos seus diversos componentes visando melhorar a qualidade de vida

dos seus portadores e reduzir o risco de mortalidade inerente à SM (Carpentier et al.,

2006; Pershadsingh, 2006).

A doença não alcoólica do fígado gorduroso (NAFLD) vem sendo apontada como o

componente hepático da SM. Ela engloba um aumento do ‘input’ de ácidos graxos li-

vres (AGL) concomitantemente a um decréscimo da beta-oxidação, levando a maior

suscetibilidade à fibrose hepática (Marchesini et al., 2001a). Recentemente, a doença

não alcoólica do pâncreas gorduroso (NAFPD) foi descrita e a lipotoxicidade nesse

órgão prejudica a secreção de insulina estimulada por glicose, provocando disfunção

das células beta e progressão mais rápida para o DM2 (Pitt, 2007). A NAFLD e a

NAFPD exibem a resistência à insulina como rota comum. Essa observação enfatiza a

urgência para encontrar estratégias não somente para o controle da obesidade como

também para aumentar a sensibilidade à insulina e consequentemente, me l horar a

função das células beta-pancreáticas e dos hepatócitos (Duvnjak et al., 2007).

A perda ponderal é benéfica ao tratamento da SM. Esta se fundamenta numa inges-

tão energética limitada, caracterizada pela diminuição do aporte lipídico e menor me-

tabolização de nutrientes, tendo como pilar a mudança de estilo de vida (McNeel e

Mersmann, 2005; Vasselli et al., 2005). Contudo, o auxílio de fármacos destinados ao

tratamento das doenças associadas não deve ser descartado (Wassink et al., 2007).

Nesse contexto, estudos experimentais são necessários para avaliar a viabilidade da

utilização desses fármacos, principalmente quanto ao estabelecimento de doses segu-

ras e possíveis associações benéficas entre drogas.

Entre várias classes de fármacos, alguns exibem efeitos mais marcantes. Os blo-

queadores do receptor AT1 da angiotensina 2 (ARB)/ agonista receptor ativador de

proliferação peroxissomal (PPAR)-gama e as biguanidas se direcionam ao alívio da

resistência à insulina (Marchesini et al., 2001b; Benson et al., 2004). O primeiro exer-

ce sua ação principalmente a partir da ativação parcial do PPAR-gama e da redução

significativa da produção de adipocinas pró-inflamatórias (Pershadsingh, 2006), en-

quanto o último fundamenta-se na redução da produção hepática de glicose (Home e

Pacini, 2008). Em contrapartida, os inibidores da enzima dipeptidil peptidase tipo IV

(DPP-IV) estimulam a secreção de insulina paralela à inibição da síntese de glucagon

e ação trófica sobre a massa de células beta- pancreáticas por meio da atividade en-

tendida das incretinas (Ranganath, 2008b).

Camundongos da linhagem C57BL/6 alimentados com dietas hiperlipídicas, que

mimetizam a dieta das populações ocidentais, manifestam antecipadamente e de for-

ma intensa os sintomas da SM (Black et al., 1998; Collins et al., 2004) e, por isso, re-

presentam um bom modelo para o estudo da SM em um curto período de tempo

(Fraulob et al., 2010; Nascimento et al., 2010). Considerando que o tratamento medi-

camentoso é imprescindível para impedir a progressão das anormalidades metabóli-

cas, as associações medicamentosas podem promover um controle mais rígido destas.

Ob j e t i v o s

Objetivo geral

• Comparar os efeitos das monoterapias com um duo ARB/ agonista PPAR gama

(telmisartana), um inibidor da DPP-IV (sitagliptina) e uma biguanida (metfor-

mina) sobre o metabolismo de carboidratos, remodelamento hepático, pancre-

ático e morfometria do tecido adiposo de camundongos C57BL/6 alimentados

com dieta hiperlipídica.

Objetivos específicos

• Induzir sobrepeso e suas comorbidades com dieta hiperlipídica em camun-

dongos da linhagem C57BL/6.

• Comparar os resultados entre os grupos para avaliar os efeitos do tratamento

farmacológico (telmisartana, sitagliptina, metformina e associações) sobre a

massa corporal, depósitos de gordura visceral e bioquímica do sangue (glice-

mia, lipídios plasmáticos).

• Comparar a eficácia de um tratamento clássico para o DM II (sitagliptina +

metformina) com as demais associações propostas, enfatizando os efeitos

pleiotrópicos dos fármacos envolvidos nessas.

• Avaliar os efeitos dos diversos tratamentos propostos sobre a ultraestrutura e

parâmetros moleculares hepáticos.

Revisão de Literatura

Síndrome metabólica

Pro definição, a SM compreende uma constelação de distúrbios metabólicos que

são fatores de risco para doenças cardiovasculares (DCV) e tem sua gênese atrelada

ao acúmulo de tecido adiposo visceral e ao desenvolvimento da resistência à insulina

(Eckel et al., 2005). Embora não seja consensual, há uma grande tendência em apon-

tar a resistência à insulina como cerne dessas alterações metabólicas e a SM vem sen-

do chamada de síndrome da resistência à insulina (Vague e Raccah, 1992; Hauner,

2002).

As crescentes e alarmantes prevalências de SM em países centrais e periféricos fa-

zem com que ela seja considerada atualmente como uma pandemia (Grundy, 2008;

Ginsberg e MacCallum, 2009). A associação com o fenômeno chamado transição nu-

tricional faz-se pertinente. Nas duas últimas décadas observou-se um declínio das

taxas de mortalidade por doenças infecto-contagiosas concomitante ao incremento

das taxas de mortalidade por doenças crônicas, destacando-se as DCV (Amuna e Zo-

tor, 2008).

As explicações mais plausíveis para esse perfil obesogênico das populações atuais

fundamentam-se na maior disponibilidade e consumo de alimentos de alta densidade

energética e redução da atividade física com as facilidades do mundo moderno, ou

seja, fatores de riscos modificáveis (Astrup, 2001; NCEP, 2002). Essa transição encon-

tra-se intimamente relacionada às maiores disponibilidades de alimentos e ao pre-

domínio do consumo de dietas ricas em ácidos graxos saturados (AGS), ácidos graxos

trans (AGT) e carboidratos simples, implicando diretamente no aumento drástico da

prevalência da obesidade nas populações ocidentais (Uauy et al., 2001; Uauy e Diaz,

2005). Cabe mencionar que em países mais pobres, a disponibilidade de alimentos de

alta densidade energética interage com a desnutrição materna para determinar uma

maior predisposição ao desenvolvimento de obesidade, um fenômeno conhecido co-

mo programação fetal (Vickers et al., 2000; Souza-Mello et al., 2007).

Dada a multifatoriedade e heterogeneidade da SM, o seu diagnóstico também é mo-

tivo de discussão no meio científico. Atualmente existem três critérios de diagnóstico

diferentes. Essas definições mais aceitas foram propostas pela Organização Mundial

de Saúde (OMS), pelo Grupo Europeu de Estudo da resistência à insulina (EGIR) e pe-

lo Programa Nacional de Educação do Colesterol – Terceiro Painel de Tratamento do

Adulto (NCEP-ATP III). Todos apontam como cerne para o diagnóstico da SM a obesi-

dade, a resistência à insulina, a dislipidemia e a hipertensão arterial (Alberti e Zim-

met, 1998; Balkau e Charles, 1999; NCEP, 2002). Contudo, diferentes critérios para a

avaliação de cada componente da síndrome são observados quando comparamos as

três recomendações entre si. O quadro 1 ilustra os três diferentes critérios diagnósti-

cos para a SM.

Tabela 1 – Comparação das definições para diagnóstico da SM.

WHO, 1999

EGIR, 1999

NCEP/ATP III, 2001

Diabetes ou intolerância à

glicose ou resistência à

insulina (hiperinsulinemia,

captação de glicose pelo

clamp euglicêmico <25%.

Resistência à insulina: au-

mento de 25% na insuline-

mia de jejum com relação a

população não diabética.

Mais pelo menos dois dos

seguintes componentes:

Mais pelo menos dois dos

seguintes componentes:

Três ou mais dos seguintes

componentes:

Obesidade: IMC>30 ou

razão cintura/quadril>0,90

para homens ou >0.85 para

mulheres

Obesidade centrípeta: cir-

cunferência da cintura

≥94cm (homens) ou ≥80cm

(mulheres)

Obesidade centrípeta: cir-

cunferência da cintura

>102cm (homens) ou

>88cm (mulheres)

Dislipidemia: triglicerí-

deos>150mg/dL ou

HDL<40mg/dL (mulheres)

ou <35mg/dL (homens)

Dislipidemia: triglicerí-

deos>200mg/dL ou

HDL<40mg/dL

Dislipidemia: triglicerí-

deos>150mg/dL ou

HDL<50mg/dL (mulheres)

ou <40mg/dL (homens)

Hipertensão:

>140/90mmHg

Hipertensão:

>140/90mmHg ou uso de

antihipertensivo

Hipertensão:

>135/85mmHg ou uso de

antihipertensivo

Microalbuminúria: excre-

ção de albumina

>20µg/min

Glicemia jejum >110mg/dL

As definições da OMS e do EGIR partem do diagnóstico da resistência à insulina

como componente obrigatório da SM e requerem a presença de pelo menos mais dois

fatores dentre os listados. O diagnóstico da resistência à insulina requer exames que

muitas vezes não são compatíveis com a realidade econômica da população estudada

(SBH, 2004). Devido a isso, as recomendações do NCEP-ATP III foram desenvolvidas

visando à utilização clínica e foram adotadas na I diretriz brasileira para diagnóstico e

tratamento da síndrome metabólica (NCEP, 2002; SBH, 2004).

Outros achados clínicos não fazem parte dos critérios para diagnóstico da SM, po-

rém vem sendo freqüentemente a ela associados, tais como: síndrome de ovários po-

licísticos, acanthosis nigricans, NAFLD, microalbuminúria, estados pró-trombóticos,

estados pró-inflamatórios e de disfunção endotelial e hiperuricemia (Bloomgarden,

2004).

O estudo da SM tem sido dificultado pela ausência de consenso na sua definição. No

Brasil, um estudo recente revelou a prevalência de SM em 3,6% das crianças em idade

escolar no estado de São Paulo (Seki et al., 2009). No que se refere à prevalência de

DM2, percebe-se taxas compatíveis com os países desenvolvidos: 3,2% na população

de 30-69 anos e 11% na população co mais de 70 anos (Malerbi e Franco, 1992). Até o

presente momento não existem dados que permitam descrever precisamente a pre-

valência da SM no Brasil. No entanto, estudos em diferentes populações, como a mexi-

cana, a norte-americana e a asiática, revelam prevalências elevadas da SM, dependen-

do do critério utilizado e das características da população estudada, variando as taxas

de 12,4% a 28,5% em homens e de 10,7% a 40,5% em mulheres (Ford e Giles, 2003;

Haffner e Taegtmeyer, 2003; Aguilar-Salinas et al., 2004; Hu et al., 2004).

Apesar de não ser por si só um fator utilizado para o diagnóstico da SM, a obesida-

de encontra-se diretamente ligada ao desenvolvimento da resistência à insulina

(Bjorntorp, 1993). Nos EUA cerca de 50% dos jovens obesos apresentam síndrome

metabólica (Weiss et al., 2004). O padrão de distribuição da gordura corporal parece

ser determinante para o desenvolvimento da resistência à insulina e SM, pois nem

todos os indivíduos obesos apresentam resistência à insulina (Abbasi et al., 2002).

Nesse contexto, indivíduos com excesso de gordura visceral acumulada são mais pro-

pensos à anormalidade diabetogênicas e aterogênicas. Contudo, não há um consenso

no que se refere ao fato da obesidade visceral ser um fator causal ou simplesmente

um marcador do perfil dismetabólico (Despres, 2006a, b).

A circunferência da cintura é utilizada como componente das diversas definições

para o diagnóstico da SM. Todavia, vem sendo frequentemente debatida a importân-

cia da distinção entre a gordura subcutânea e a gordura visceral propriamente dita

(Lee et al., 2004; Eckel et al., 2005). Para tal, exames mais apurados como a ressonân-

cia magnética ou tomografia computadorizada seriam necessários. A gordura subcu-

tânea libera os produtos da lipólise na circulação sistêmica, evitando efeitos mais di-

retos na função hepática, tais como o aumento da produção hepática de glicose, sínte-

se de lipídios e secreção de fatores pró-trombóticos como o fibrinogênio e o inibidor

do ativador de plasminogênio 1 (PAI-1) (Lee et al., 2004; Laclaustra et al., 2007).

Por outro lado, já está amplamente descrito que indivíduos portadores de obesida-

de visceral apresentam adipócitos intra-abdominais hipertrofiados, os quais apresen-

tam um perfil hiperlipolítico resistente à ação anti-lipolítica da insulina (Bergman et

al., 2006; Despres e Lemieux, 2006). O influxo aumentado de ácidos graxos livres (A-

GL) para o fígado prejudica o metabolismo hepático, resultando em aumento da pro-

dução hepática de glicose e resistência hepática à insulina. Nessas condições ocorre

uma menor degradação hepática da apolipoproteína B e aumento da produção de

lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL), ricas em triglicerídeos (Grundy,

1998, 2006).

A dislipidemia na SM é caracterizada por uma dislipidemia mista. A partir da hiper-

trigliceridemia que ocorre devido a uma menor metabolização hepática da apolipo-

proteína B, o indivíduo manifesta um distúrbio do metabolismo de lipoproteínas. É

frequentemente relatado um aumento dos níveis de lipoproteína da baixa densidade

(LDL) e redução dos níveis da lipoproteína de alta densidade (HDL) em portadores da

SM (Wyszynski et al., 2005; Ginsberg e MacCallum, 2009). Contudo, atualmente, deve-

se dar atenção não só à quantidade, mas também à composição da lipoproteína, com

predomínio do seu fenótipo B da LDL (caracterizado por partículas pequenas e den-

sas de LDL, depletadas de colesterol). Essa subclasse de LDL vem sendo associada a

um incremento de cerca de 3 vezes no risco de doença arterial coronariana (DAC), à

medida que atravessam mais facilmente a parede dos vasos quando comparadas a

partículas maiores, são mais susceptíveis à oxidação lipídica (passo inicial da atero-

gênese) e são mais facilmente captadas por macrófagos (células essenciais à formação

da estria gordurosa) (Grundy, 1997; Wyszynski et al., 2005; Grundy, 2006). Modifica-

ções da composição da HDL também são descritas, com predomínio da HDL3, meno-

res e menos eficientes no transporte reverso do colesterol, aumentando o risco de

DCV (de Souza et al., 2008).

A HAS encontra-se fortemente correlacionada à resistência à insulina e à obesida-

de (Ferrannini et al., 1 9 87). Quando induzida por sobrepeso, a HAS cursa com resis-

tência seletiva à insulina, ou seja, a captação tecidual de glicose é prejudicada, porém

algumas propriedades da insulina são mantidas. Mesmo na presença de hiperinsuli-

nemia, indivíduos obesos continuam sensíveis à retenção renal de sódio mediada pela

insulina, promovendo HAS. Outros autores associaram níveis suprafisiológicos de

insulina ao remodelamento arterial adverso (Osei, 1999; Ginsberg, 2000; Rocchini,

2002). Além disso, a hiperinsulinemia determina redução da atividade da enzima óxi-

do nítrico sintetase endotelial por bloqueio da via fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K),

colaborando para o estabelecimento da HAS por anormalidades na vasodilatação

(Steinberg et al., 2000).

Considerando a que a SM é multifatorial, heterogênea e multifacetada, a busca por

formas de tratamento que sejam eficazes no controle das várias comorbidades asso-

ciadas emerge como um dos maiores desafios da comunidade científica atualmente.

Os pilares do tratamento da SM são a redução da massa corporal e o conseqüente alí-

vio da resistência à insulina, os quais apresentam efeito benéfico sobre todos os de-

mais fatores de risco associados (NCEP, 2002; SBH, 2004). O diagnóstico precoce da

SM e seu tratamento adequado colaboram para a redução dos gastos com internações

decorrentes de DCV, as quais constituem a maior causa de morte mundialmente e

também previne o desenvolvimento do DM2 se a intervenção for feita quando o indi-

víduo apresenta somente um quadro resistência à insulina (Sathyaprakash e Henry,

2002; Smith, 2006).

Modelos experimentais de doenças metabólicas

Em virtude da prevalência crescente de obesidade e das suas doenças associadas

na população mundial e dos gastos públicos que o manejo dessas alterações metabó-

licas representa, a comunidade científica vem buscando modelos experimentais que

mimetizem o fenótipo humano e sejam adequados para testar terapias potenciais pa-

ra o controle da SM (Gadja et al., 2007).

Devido ao fato de que em humanos fatores ambientais são fatores cruciais para o

desenvolvimento dos caracteres da SM, a manipulação de dietas é a ferramenta mais

utilizada para antecipar a manifestação destes em modelos animais (Thigpen et al.,

2004).

No que concerne às fórmulas utilizadas atualmente, a disponibilidade de ingredi-

entes purificados permite que os estudos feitos ao redor do mundo sejam compará-

veis, uma vez que as fórmulas são disponíveis para consulta e não são mantidas em

segredo, como no caso das rações prontas que dominavam o mercado antigamente

(Ricci e Ulman, 2005).

Essa padronização dos ingredientes utilizados no que se refere à quantidade e qua-

lidade dos nutrientes foi possível pela publicação de um documento que estabeleceu

o requerimento de macronutrientes e micronutrientes para roedores nas diferentes

fases da vida. Inicialmente a AIN-76 determinou as formulações adequadas para roe-

dores mantidos em laboratório (Bieri, 1979). Contudo, alguns detalhes passaram a

ser questionados no final da década de 80 e em 1993 foi publicada a AIN-93, com al-

gumas correções e que está em voga até os dias atuais (Reeves, 1989; Reeves et al.,

1993).

Dessa forma, a AIN-93 G é uma formulação destinada a roedores na fase da gesta-

ção, lactação e nos três primeiros meses de vida (período de intenso crescimento e

desenvolvimento). Por outro lado, a AIN-93M é direcionada a roedores em fase de

manutenção, ou seja, a partir dos 3 meses de idade, período onde a taxa de crescimen-

to nesses animais reduz drasticamente (Reeves et al., 1993).

Cabe ressaltar que qualidade dos nutrientes purificados é similar em qualquer lu-

gar do mundo, o que permite ao pesquisador obter resultados diferentes manipulan-

do intencionalmente um nutriente de cada vez (Gadja et al., 2007). No que concerne

aos diferentes componentes da SM, a obesidade é mais facilmente obtida a partir da

manipulação do lipídio da dieta (Buettner et al., 2006). Alguns laboratórios utilizam a

adição de gordura a rações comerciais. Essa prática é inadequada, pois promove dilu-

ição dos demais nutrientes (proteínas, vitaminas, minerais e fibras), o que pode resul-

tar em importante viés no estudo (Ghibaudi et al., 2002).

No caso de dietas feitas a partir de ingredientes purificados, a quantidade de lipí-

dio deve ser considerada. Dietas ‘low-fat’ apresentam cerca de 10% da energia deri-

vada de lipídios na sua composição, dietas ‘high-fat’ têm 30-50% da energia advinda

de lipídios e dietas ‘very high-fat’ apresentam mais que 50% da energia derivada de

lipídios (Ghibaudi et al., 2002).

Tanto as dietas high-fat quando as very high-f at são utilizadas para induzir obesi-

dade (Buettner et al., 2006). Contudo, se algum tratamento for testado no animal obe-

so deve ser considerado o fato de que as alterações promovidas pela dieta very high-

fat são mais difíceis de reverter que as alterações impostas pela dieta high-fat, a qual

apresenta um aumento mais discreto das calorias advindas da ingestão de lipídios

(Gadja et al., 2007).

Outro fator importante para o estudo da SM em roedores é escolher a fonte de lipí-

dio predominante na dieta hiperlipídica que seja mais adequada (Buettner et al.,

2006). Nesse sentido, a utilização de AGS como fonte predominante de lipídios vem

sendo associada não somente à obesidade, mas também ao desenvolvimento de resis-

tência à insulina, intolerância à glicose e desordens no metabolismo de lipoproteínas,

sendo mais plausível para o estudo da SM (Ikemoto et al., 1996; Storlien et al., 2000).

A cepa de animal utilizada também influencia no resultado do estudo. Camundon-

gos C57BL/6 emergem como um modelo ao estudo da SM em roedores visando com-

parações com humanos. Eles apresentam vulnerabilidade genética e sofrem forte in-

fluência de fatores ambientais no desenvolvimento de obesidade, resistência à insuli-

na e DM2 (Surwit et al., 1988; Collins et al., 2004). Outros fatores importantes são o

desenvolvimento gradual das alterações metabólicas e a deposição seletiva de gordu-

ra no mesentério, consistente com o fato de que a obesidade visceral é um fator de

risco independente para o diabetes em humanos (Surwit et al., 1988; Rebuffe-Scrive

et al., 1993). Merece destaque também o fato de que as alterações metabólicas nesses

camundongos são totalmente dependentes do estímulo. Portanto, cessando a dieta

high-fat ocorre reversão total dos caracteres da SM (Parekh et al., 1998). Esse fato é

importante garante os efeitos benéficos observados em experimentos visando o tra-

tamento da SM com drogas podem ser creditados à ação da droga, desde que o estí-

mulo da dieta hiperlipídica seja mantido durante o tratamento.

A utilização do excesso lipídios em detrimento ao aumento do conteúdo de sacaro-

se na dieta também vem sendo estudada de forma substancial. A literatura documen-

ta que a ingestão de gordura é mais importante que a ingestão energética total na gê-

nese de obesidade de DM2 em camundongos C57BL/6 (Surwit et al., 1995; Petro et

al., 2004). Esses animais apresentam predisposição a estocar o excesso de gordura

dietética no tecido adiposo, causando aumento da massa corporal (Surwit et al.,

1995). A massa de gordura epididimária foi 86% maior em camundongos alimenta-

dos com dieta high-fat quando comparados com animais alimentados com dieta rica

em sacarose (Black et al., 1998).

Uma limitação da utilização do camundongo C57BL/6 para o estudo da SM é jus-

tamente a HAS. Esses animais desenvolvem aumentos muito discretos da pressão ar-

terial, os quais muitas vezes não são detectáveis por métodos simples de aferição. A

fim de obter níveis pressóricos mais elevados, deve-se adicionar sódio na dieta, o que

constituiria outro modelo com repercussões muitas vezes não desejadas de acordo

com o objetivo do estudo (Mills et al., 1993; Mattson, 2001).

Resistência à insulina

Por definição, resistência à insulina é um estado de reduzida resposta a níveis

normais de insulina. Ela aparece como um fator central e determinante da associação

da obesidade com o DM2, configurando a SM (Reaven, 1988).

A insulina é o maior hormônio anabólico, cuja ação é importante para o desenvol-

vimento e crescimento dos tecidos e homeostase da glicose. Ela é secretada pelas cé-

lulas beta-pancreáticas em resposta ao aumento dos níveis de glicose e aminoácidos

circulantes, o que ocorre principalmente no período pós-prandial (Chen et al., 1987).

A insulina normalmente controla a homeostase da glicose em diferentes sítios, redu-

zindo a produção hepática de glicose (promovendo menores taxas de glicogenólise e

gliconeogênese), estimulando a captação de glicose nos tecidos periféricos, aumen-

tando a síntese hepática de lipídios e suprimindo a liberação de ácidos graxos do teci-

do adiposo (DeFronzo, 1988; Shulman, 2000). Defeitos na secreção e ação da insulina

conduzem a múltiplas alterações metabólicas tais como hiperglicemia, aumento da

produção hepática de glicose e dislipidemia (Muoio e Newgard, 2008).

A resistência à insulina parece ser uma lesão precoce. A literatura documenta que

esse estado de resistência à insulina pode ter início anos antes do diagnóstico de DM2

(Harris e Eastman, 2000). A hipertrofia das ilhotas e hipersecreção de insulina surge

na tentativa de compensar o estado de resistência e promover valores normais de

glicemia num primeiro momento. Entretanto, esse trabalho exaustivo promove dete-

rioração progressiva das ilhotas de maneira que 50% da função das ilhotas pancreáti-

cas já estão perdidas no momento do diagnóstico de hiperglicemia, momento onde a

intolerância oral à glicose já está instalada (Taylor, 1999; Yoon et al., 2003).

Atualmente há uma tendência de uma visão lipocêntrica da resistência à insulina

(Robertson, 2009). Nesse contexto, o aumento dos depósitos de tecido adiposo e das

taxas lipólise, atrelados ao sobrepeso, fazem com que os AGL circulantes sejam desvi-

ados e armazenados em órgãos sensíveis à insulina, tais como o fígado, o pâncreas e o

músculo esquelético (Unger e Orci, 2000). Esse acúmulo ectópico de lipídios está en-

volvido na gênese da resistência à insulina e no comprometimento da função das cé-

lulas beta-pancreáticas, efeito conhecido como lipotoxicidade (Savage et al., 2005).

Já está descrito na literatura que os ácidos graxos competem com a glicose como

substrato para oxidação tanto no músculo cardíaco quando em músculo liso de roe-

dores, o que levou à especulação de que a oxidação de ácidos graxos é responsável

pela resistência à insulina nos casos de sobrepeso (Randle et al., 1963). Contudo, re-

centemente, estudos ajudaram a elucidar que níveis elevados de AGL circulantes re-

duzem os níveis intramusculares de glicose-6-fosfato. Essa observação sugere que o

aumento das concentrações plasmáticas de AGL produz resistência à insulina por

meio da inibição do transporte de glicose ou da atividade da hexoquinase II, sendo a

redução da produção de glicogênio muscular e da oxidação da glicose apenas eventos

secundários. Devido ao fato de que a glicose intracelular é um metabólito intermediá-

rio entre o transporte da glicose e a ação da hexoquinase II, a redução da glicose in-

tracelular prediz um defeito no transporte da glicose, ao passo que o acúmulo de gli-

cose intracelular sugere um defeito da enzima hexoquinase II. Estudos in vivo reve-

lam que na resistência à insulina induzida por ácidos graxos em humanos ocorre uma

redução das concentrações intracelulares de glicose na presença de níveis elevados

de AGL na circulação, confirmando um defeito no transporte da glicose (Roden et al.,

1996; Dresner et al., 1999).

Em condições fisiológicas normais, a insulina estimula a translocação do transpor-

tador de glicose (GLUT) a partir de um reservatório intracelular para a membrana

plasmática. A translocação do GLUT é um processo complexo que envolve a liberação

do GLUT do seu reservatório intracelular, trânsito pelo meio intracelular, reconheci-

mento e fusão com a membrana plasmática. Por conseguinte, existem vários passos

que podem estar comprometidos nos estados de resistência à insulina (Petersen e

Shulman, 2006b; Sesti, 2006).

A insulina desempenha suas ações nos órgãos alvos por meio da fosforilação de um

receptor transmembrana, o receptor de insulina (IR). A ligação da insulina à subuni-

dade alfa (extracelular) do IR ativa resíduos de tirosina presentes na subunidade beta

(transmembrana) do mesmo, conduzindo à auto-fosforilação do receptor. Isso resulta

na ativação da tirosino-quinase intrínseca, a qual catalisa a fosforilação de tirosinas

presentes em substratos do receptor de insulina (IRS), tais como o IRS-1 e IRS-2. Es-

tes substratos interagem com a PI3K, a qual estimula o principal efetor: a proteína

quinase B (Akt), uma quinase serina/treonina que estimula a captação de glicose por

meio da translocação do GLUT para a membrana plasmática (Saltiel e Kahn, 2001;

Sesti et al., 2001; Sesti, 2006). Diferentes tecidos expressão diferentes subtipos de

GLUT, o tecido adiposo e a musculatura esquelética expressam o GLUT4, ao passo que

o fígado e o pâncreas expressam o GLUT2 (Thorens et al., 1990).

Na vigência de resistência à insulina pode haver defeitos no IR, manifestados por

um prejuízo na interação da insulina com o seu receptor ou por uma redução do nú-

mero de receptores disponíveis. Contudo, são mais freqüentes defeitos na sinalização

da insulina a nível pós-receptor (Sesti et al., 2001; Petersen e Shulman, 2006b). Nesse

contexto, a fosforilação inadequada do IR após a ligação da insulina na sua subunida-

de extracelular foi detectada na musculatura esquelética de indivíduos obesos com ou

sem DM2 e em indivíduos não obesos e portadores de DM2 (Goodyear et al., 1995),

no tecido adiposo de indivíduos obesos portadores ou não de DM2 (Sinha et al., 1987)

e no fígado de pacientes obesos e portadores de DM2 (Caro et al., 1986). Em conjunto,

essas observações permitem inferir que defeitos na fosforilação do IR e do IRS-1 e na

ativação da PI3K desempenham papel crucial no desenvolvimento da resistência à

insulina (Sesti et al., 2001; Sesti, 2006).

Outros defeitos na sinalização da insulina descritos em indivíduos obesos portado-

res de DM2 englobam concentrações reduzidas de GLUT-4 nos adipócitos (Shepherd

e Kahn, 1999). Porém na musculatura esquelética, as concentrações de GLUT-4 são

normais, sendo relatado um prejuízo na função de distribuição desse transportador

de glicose (Zierath et al., 1996). O prejuízo na captação de glicose pode também ser

resultante do aumento de proteínas que inibem a sinalização da insulina. As proteínas

tirosina fosfatases (PTPases) agem como reguladores negativos da cascata de sinali-

zação da insulina. Estudos recentes mostram que uma das principais funções da PT-

Pase 1B (PTP 1B) é suprimir a ação da insulina. Indivíduos obesos apresentam au-

mento da expressão de PTP 1B no tecido adiposo e musculatura esquelética. Todavia,

uma perda ponderal de 10% resulta em aumento da sensibilidade à insulina concomi-

tante à redução da atividade e níveis de PTP 1B (Ahmad et al., 1997a; Ahmad et al.,

1997b).

O perfil pró-inflamatório do indivíduo obeso também apresenta correlação com a

patogenia da resistência à insulina. O tecido adiposo em excesso secreta citocinas in-

flamatórias, tais como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) e a interleucina-6

(IL-6). O aumento dessas adipocinas vem sendo relacionado à alteração na fosforila-

ção do IRS-1, caracterizado pelo aumento da fosforilação dos resíduos de serina em

proteínas chaves como Akt, alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) e quinase c-

Jun-NH2-terminal (JNK), comprometendo a sinalização adequada da insulina e trans-

locação do GLUT para a membrana (Hotamisligil et al., 1996; Kern et al., 2001). A fi-

gura 1 ilustra a cascata de sinalização da insulina na musculatura esquelética.

Figura 1 – Vias de sinalização intracelular da insulina. A ligação da insulina ao seu receptor transmembrana

leva à fosfolilação do IRS-1. Esse passo é crucial para ativar a PI3K, a qual ativa a Akt, agente efetor do estí-

mulo da translocação do GLUT4 para a membrana a fim de permitir a internalização celular da glicose. A -

breviações: IRS-1, substrato do receptor de insulina 1; PI3K, fosfatidilinositol-3-quinase; Akt, proteína quina-

se B; GLUT4, transportador de glicose 4. Adaptado de Lann e LeRoith, 2007. (Lann e LeRoith, 2007)

Alterações hepáticas na resistência à insulina

A insulina inibe a produção hepática de glicose por meio do bloqueio da gliconeo-

gênese e da glicogenólise e estimula o acúmulo do glicogênio, ativando a glicogênese.

Esta ocorre devido a um aumento da atividade da enzima glicogênio-sintetase, secun-

dário à inativação da glicogênio sintase quinase-3 (GKS-3) pela Akt (Cross et al.,

1995). A insulina também ativa a proteína fosfatase 1, via PI3K, a qual desfosforila a

glicogênio sintase (Brady et al., 1997).

A transcrição de alguns genes pode ser influenciada pela insulina. Nesse sentido, a

via de sinalização da Akt inibe a transcrição de genes que codificam a fosfoenolpiru-

vato carboxiquinase (PEPCK), enzima chave para a neoglicogênese. O aumento da

transcrição de genes codificadores de enzimas glicolíticas como a glicoquinase e a

piruvato quinase é também atribuído à ação da insulina (Pilkis e Granner, 1992; Su-

therland et al., 1996). A figura 2 ilustra a influência da insulina sobre o metabolismo

hepático.

Figura 2 – Vias de sinalização da insulina no fígado. A insulina estimula a utilização e armazenamento de

glicose como glicogênio e inibe a síntese dessa hexose e sua liberação. A insulina estimula a expressão de

genes da via glicolítica enquanto inibe a codificação daqueles que codificam enzimas da via da gliconeogê-

nese. A insulina também estimula a síntese de glicogênio através da inibição da GSK3 e proteína fosfatase 1.

Abreviações: GSK3, glicogênio sintase quinase 3. Adaptado de Cross e col. 1995 (Cross et al., 1995)

A insulina também exerce importante papel na inibição da lipólise no tecido adipo-

so. Contudo, na vigência de resistência à insulina essa propriedade é perdida. Logo, o

excesso de tecido adiposo é acompanhado por incremento das taxas de lipólise e mai-

or disponibilidade de AGL na veia porta (Despres e Lemieux, 2006). Em situações

normais, o excesso de AGL é canalizado para a mitocôndria onde ocorre a beta-

oxidação. Contudo, nos estados de resistência à insulina, a carga excessiva de AGL é

direcionada à lipogênese (esterificação), conduzindo ao acúmulo de triglicerídeos no

interior desse órgão que não é destinado a essa função, configurando a condição pato-

lógica conhecida como esteatose hepática (Holness e Sugden, 1999; Festi et al., 2004;

Duvnjak et al., 2007).

A NAFLD é a doença hepática mais comum nos países ocidentais (Erickson, 2009).

Ela vem sendo apontada como a manifestação hepática da SM e já acomete 25% da

população dos países onde a obesidade é mais prevalente (Marchesini et al., 2001a).

Embora inicialmente tenha característica benigna, ela representa o ponto de partida

de doenças mais graves como esteatohepatite não-alcoólica (NASH), cirrose hepática

e hepatocarcinoma (Brunt et al., 1999). O padrão ouro para seu diagnóstico é o aco-

metimento de mais de 5-10% do peso do tecido ou como percentual de hepatócitos

afetados em biópsia hepática. Seus principais fatores de risco incluem obesidade cen-

tral e resistência à insulina, além do DM2, dislipidemia e utilização de determinados

fármacos. A esteatose hepática ocorre sempre que o “input” de ácidos graxos (capta-

ção, síntese ou esterificação) excede o “output” (oxidação e secreção de VLDL), resul-

tando no acúmulo principalmente de triglicerídeos nos hepatócitos (Brunt et al.,

1999; Neuschwander-Tetri e Caldwell, 2003; Festi et al., 2004; Abdelmalek e Diehl,

2007).

Dentre as causas mais freqüentes do aumento do “input” figuram: o consumo de

dietas hiperlipídicas, o aumento da lipogênese “de novo” e da esterificação de ácidos

graxos (AG). Por outro lado, a redução do “output” ocorre por meio da menor secre-

ção de VLDL e/ou da beta-oxidação. As repercussões da esteatose são sistêmicas, vis-

to que a oxidação de AG nas mitocôndrias de hepatócitos provém uma gama de subs-

tratos energéticos essenciais ao metabolismo e esta via metabólica se encontra redu-

zida na esteatose (Koteish e Diehl, 2001; Diehl, 2005).

Os fatores que provocam a progressão da NAFLD, esteatose isolada, para a NASH,

caracterizada pela presença de fibrose e necrose, continuam obscuros (Kirsch et al.,

2003). Baseado na teoria dos dois passos, o primeiro passo consiste no desenvolvi-

mento da esteatose hepática, a qual uma vez estabelecida promove adaptações de

rotas sinalizadoras celulares frente aos níveis elevados de estresse oxidativo. Dessa

forma a célula sobrevive nesse meio adverso, mas fica mais propensa ao desenvolvi-

mento do segundo passo que a partir de apoptose e/ou necrose aliada à inflamação

conduz à NASH (Brunt et al., 1999; Festi et al., 2004). A figura 3 esquematiza a teoria

dos dois passos para a esteatohepatite.

Figura 3 – Esquema da evolução da NAFLD para NASH. Na presença de obesidade e hiperinsulinemia, altas

taxas de lipólise do tecido adiposo favorecem o acúmulo de triglicerídeos no interior dos hepatócitos (first

hit). A persistência dos estímulos desencadeantes desse primeiro passo interage com o aumento do estres-

se oxidativo e o perfil pró-inflamatório do indivíduo obeso, resultando em apoptose e necorse (second hit).

A ativação de células estreladas já caracteriza a NASH, levando à fibrose do tecido hepático. Abreviações:

NAFLD, doença do fígado gorduroso não alcoólica; NASH, esteatohepatite não alcoólica. Adaptado de Brunt,

1999 (Brunt et al., 1999)

O desenvolvimento da esteatose (primeiro passo) encontra-se intimamente rela-

cionado à obesidade centrípeta à medida que 76% dos portadores são obesos (Mar-

ceau et al., 1999; Akbar e Kawther, 2006). A literatura postula que o tecido adiposo

abdominal é a maior fonte de AGL. Animais com sobrepeso induzido por dieta hiper-

lipídica cursam com resistência à insulina, a qual possui efeitos distintos sobre o teci-

do adiposo e hepático. No primeiro ela estimula a lipólise, com conseqüente aumento

do transporte de AGL para o fígado pela veia porta e aumento do “input” de AG. Por

outro lado, no fígado, a hiperinsulinemia inibe a beta-oxidação, reduzindo o “output”.

Ambas as ações favorecem o acúmulo de gordura nos hepatócitos, condição que pro-

move resistência hepática à ação da insulina. A perda da capacidade da insulina em

suprimir a produção hepática de glicose agrava a resistência global à insulina e exa-

cerba a manifestação dos componentes da SM como obesidade, dislipidemia e HAS

(Festi et al., 2004; Adams e Angulo, 2005; Brunt, 2005).

Outro mecanismo proposto é o aumento da liberação de TNF-alfa pelo excesso de

tecido adiposo visceral. Esta adipocina promove redução da expressão do receptor

ativador de proliferação peroxissomal (PPAR)-alfa, receptor nuclear que ativa a

transcrição de genes implicados na formação de enzimas ligadas a oxidação lipídica. A

redução da atividade do PPAR-alfa além de reduzir a oxidação lipídica, ativa a apop-

tose e aumenta o estresse oxidativo, ambos apontados como cruciais para a progres-

são para a NASH (Koteish e Diehl, 2001; Schiffrin et al., 2003; Svegliati-Baroni et al.,

2006). Outra adipocina que sofre alteração na presença de obesidade e resistência à

insulina é a adiponectina. A literatura documenta hipoadiponectinemia em estados de

resistência à insulina, a qual se relaciona diretamente à redução da beta-oxidação

(Jarrar et al., 2008). O tratamento de camundongos ob/ob com adiponectina aumenta

a oxidação hepática de AGL, uma vez que o restabelecimento da adiponectinemia

normal promove redução das concentrações de TNF-alfa por meio da inibição da ex-

pressão e secreção desta citocina inflamatória (Xu et al., 2003; Polyzos et al., 2009).

Um fator que também deve ser considerado e que indica uma tentativa frustrada

de regeneração hepática frente aos danos causados pela NAFLD é o aumento das ta-

xas de binucleação de hepatócitos. Esta foi constatada encontrada em roedores ali-

mentados com dieta hiperlipídica (Souza-Mello et al., 2007). A alta ingestão de AGS

pode atuar como o segundo passo, acelerando a progressão da NAFLD para NASH à

medida que promove aumento da injúria hepática, ativação de células estreladas

(SCs), ativação da caspase 3 (efetora) e fibrose periportal (Moriwaki et al., 1988;

Carmiel-Haggai et al., 2005). A NASH cursa com alteração da composição da matriz

extracelular (MEC) caracterizada pelo aumento da síntese em detrimento à degrada-

ção desta. As SCs são as mais importantes no tecido hepático para a síntese de MEC e

são ativadas por dietas hiperlipídicas, espécies reativas de oxigênio, triglicerídeos,

VLDL e citocinas inflamatórias. Com o desenvolvimento da cirrose, por exemplo, há

aumento do número de células estreladas no fígado, as quais na presença de injúria

hepática apresentam ativação de mecanismos pré e pós-transcricionais que promo-

vem a deposição de colágeno tipo I e fibrose (Lu et al., 1998; Lieber et al., 2004; Tes-

sari et al., 2009).

Alterações funcionais e estruturais de mitocôndrias hepáticas, comprometendo a

beta-oxidação dos ácidos graxos nas mitocôndrias, aumento da peroxidação lipídica

em peroxissomos e microssomos e o conseqüente aumento do estresse oxidativo já

foram relatadas em animais portadores de esteatose microvesicular. A redução das

taxas de beta-oxidação favorece o acúmulo de ácidos graxos e a ocorrência de estea-

tose hepática, ao passo que o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio

favorece a progressão da NAFLD para NASH (Angulo e Lindor, 2001; Caldwell et al.,

2004; Wei et al., 2008).

Além da redução da beta-oxidação, evidenciada pelas alterações mitocondriais ine-

rentes à NAFLD, ocorre um aumento paralelo da lipogênese hepática. O aumento da

expressão da proteína de ligação ao elemento regulador do esterol (SREBP-1c) nos

estados de resistência à insulina promove incremento da transcrição de genes de en-

zimas envolvidas na síntese de ácido graxo, entre elas a acetil CoA carboxilase (ACC),

que converte a acetil CoA em malonil CoA e a ácido graxo sintetase (FAS), que conver-

te a malonil CoA em palmitato (Shimomura et al., 2000; Sakakura et al., 2001). A figu-

ra 4 detalha a ação da SREBP-1 no hepatócito.

Alguns estudos associam a esteatose hepática resultante da resistência à insulina

com o aumento dos níveis de SREBP-1 em resposta à hiperinsulinemia. Em indivíduos

sensíveis à insulina, ela estimula a produção de SREBP-1c em períodos de pós-

prandiais, quando há excesso de carboidrato circulante e níveis maiores de insuline-

mia (Brown e Goldstein, 1997; Sakakura et al., 2001). Apesar de na resistência à insu-

lina a maioria das ações desse hormônio ser comprometida, essa resistência à sua

ação é seletiva e a capacidade da insulina em aumentar a produção de SREBP-1c é

mantida. Logo, a expressão de SREBP-1c é proporcional à insulinemia, sendo maior

nos casos de resistência à insulina, os quais vêm sendo associados ao aumento da li-

pogênese hepática, além da redução da oxidação mitocondrial de ácidos graxos (Shi-

momura et al., 1999; Shimomura et al., 2000).

Figura 4 - Regulação do metabolismo de lipídios no fígado. A insulina via SREBP 1c aumenta a expressão de

genes que estimulam a síntese de ácidos graxos, tais como a acetil Coa carboxilase e a ácido graxo sinteta-

se. Adaptado de Sakakura e col., 2001 (Sakakura et al., 2001)

Alterações pancreáticas na resistência à insulina

Na presença de resistência à insulina, o excesso de AGL resultante das altas taxas

de lipólise no tecido adiposo é desviado também para o pâncreas (Mathur et al.,

2007). Embora não esteja tão bem descrita quanto à NAFLD, cada vez mais descrições

de NAFPD são encontradas na literatura (Mathur et al., 2007; Fernandes-Santos et al.,

2009a), indicando que esta é possivelmente a repercussão pancreática da SM.

A primeira correlação entre massa pancreática e massa corporal foi feita em 1926

(Schaefer, 1926). Em 1933 um estudo revelou 9% de gordura pancreática em indiví-

duos eutróficos, enquanto obesos apresentaram 17% (Ogilvie, 1933). Nos anos 60 e

70 a presença de gordura pancreática excessiva começou a ser relacionada com a o-

besidade e DM2 (Walters, 1966; Olsen, 1978) e mais recentemente estudos experi-

mentais vem confirmando essa tendência de aumento da massa pancreática em ani-

mais com sobrepeso (Fraulob et al., 2010) e presença de esteatose pancreática em

animais obesos alimentados com dieta hiperlipídica e rica em sacarose (Fernandes-

Santos et al., 2009a).

De forma semelhante ao que acontece no fígado, há uma forte associação entre o

câncer pancreático e a obesidade (Pitt, 2007). Outro achado que está fortemente cor-

relacionado com a obesidade é a pancreatite, pois indivíduos obesos apresentam for-

mas mais graves dessa doença (Segersvard et al., 2001; Papachristou et al., 2006).

Esta pode ser definida como uma condição onde ocorre autodigestão da glândula por

um mecanismo ainda não elucidado. As enzimas digestivas assumem sua forma ativa

no interior do pâncreas, o que culmina com a ruptura da membrana plasmática das

células pancreáticas, causando edema, hemorragia intersticial e ativação das demais

pró-enzimas e destruição total dos ácinos pancreáticos (Vasseur et al., 2004).

O excesso de ácidos graxos no tecido pancreático interfere na secreção de insulina,

levando à hipersecreção e hipertrofia das ilhotas pancreáticas, o que causa disfunção

e perda da célula beta-pancreática por meio de lipoapoptose. Este fenômemeno é co-

nhecido como lipotoxicidade (Lee et al.; Robertson, 2009). A persistência desse círcu-

lo vicioso conduz à exaustão pancreática (Unger, 1995). No que tange à progressão da

NAFPD, estudos recentes já localizaram células estreladas pancreáticas ativadas, su-

gerindo que a inflamação e aumento do estresse oxidativo sejam requisitos para a

evolução da NAFPD para a esteatopancreatite não alcoólica (NASP) (Pitt, 2007; Ta-

lukdar e Tandon, 2008).

Metabolismo da glicose e ação das incretinas

Após a descoberta da insulina, em 1920, o entendimento sobre o diabetes mellitus

(DM) como doença metabólica evoluiu de forma considerável. O advento do radioi-

munoensaio permitiu verificar que em certos casos os pacientes com DM apresenta-

vam níveis elevados de insulina, ao invés da ausência deste hormônio, o que resultou

no conceito de resistência à insulina (DeFronzo, 1997, 2004). A resistência à insulina

é um pilar para o entendimento do DM 2, porém estudos revelaram nos anos 50 que

outros hormônios também desempenhavam papel crucial na glicorregulação, contri-

buindo para a homeostase da glicemia. Desses hormônios destaca-se o glucagon, o

qual era o principal estímulo para a produção hepática de glicose. A partir de então o

diabetes passou a ser considerado como doença bi-hormonal (Baron et al., 1987; De-

Fronzo e Ferrannini, 1987).

Atualmente, é consensual de que a glicemia resulta do equilíbrio ou desequilíbrio

entre a velocidade de entrada e a taxa de remoção da glicose da circulação. A glicose

circulante advém da absorção intestinal, glicogenólise ou neoglicogênese (DeFronzo,

2004).

A insulina é um hormônio hipoglicemiante. Ela controla os níveis pós-prandiais de

glicose, sinalizando para que os tecidos sensíveis à insulina aumentem a captação de

glicose. Outros efeitos englobam: estímulo da glicogênese, preservando a glicose esto-

cada para períodos de jejum; inibição da síntese de glucagon pelas células alfa-

pancreáticas, resultando na interrupção da produção hepática de glicose via glicoge-

nólise e neoglicogênese (Baron et al., 1987; DeFronzo e Ferrannini, 1987).

Nas primeiras horas de jejum a glicogenólise é o mecanismo principal para manter

a glicose disponível como fonte energética. A presença do glucagon e a redução da

insulinemia são fatores cruciais para o aparecimento da glicose na circulação. Após

longos períodos de jejum, a neoglicogênese é responsável pela manutenção da glice-

mia adequada. Esta ocorre principalmente no fígado e tem como estímulos o aumento

do glucagon paralelamente à redução da insulina. Dessa forma, a insulina e o glucagon

são hormônios antagônicos e potentes reguladores do metabolismo glicídico (Butler e

Rizza, 1991; Pilar Lopez et al., 1991; Fery e Balasse, 1994). Todavia, o conceito de que

o DM é uma doença bi-hormonal está ultrapassado. Outros hormônios, secretados

pelo intestino e igualmente importantes, vêm sendo estudados exaustivamente

(Creutzfeldt, 1979).

As incretinas (GLP-1, peptídeo similar ao glucagon-1 e GIP, peptídeo insulinotrópi-

co dependente de glicose) são peptídeos derivados do intestino, intimamente relacio-

nados com o aumento da sensibilidade à insulina após a ingestão de nutrientes. O es-

tímulo oral a partir da alimentação é indispensável para a síntese desses hormônios

(Drucker, 2006; Baggio e Drucker, 2007).

As incretinas agem juntamente com insulina e glucagon na regulação da homeosta-

se da glicose pós-prandial e o DM passou a ser reconhecido como doença multi-

hormonal (Irwin et al., 2009). Células enteroendócrinas ao longo dos intestinos del-

gado e grosso contribuem para a homeostase energética, a partir da secreção de hor-

mônios importantes para a saciedade, motilidade intestinal e função das ilhotas pan-

creáticas (Lamont e Drucker, 2008). O eixo enteroinsular pode ser definido uma co-

nexão entre o trato intestinal e o pâncreas endócrino, comprovada após observações

recorrentes de que a administração oral de glicose resulta num estímulo maior para a

secreção de insulina do que a administração intravenosa (Ranganath, 2008a). Essa

diferença entre a secreção de insulina após o estímulo oral e após o mesmo estímulo

intravenoso é chamado de efeito incretina (Drucker, 2006). Atualmente, apenas duas

incretinas são conhecidas e estas são responsáveis por 50% da secreção pós-p ra ndial

de insulina, sendo o GLP-1 responsável por 70% destes (Komatsu et al., 1989; Baggio

e Drucker, 2007).

Os níveis de GLP-1 estão baixos no estado de jejum e o estímulo oral com refeições

ricas em carboidratos e lipídios deflagra sua secreção pelas células L do íleo e colo

(Mortensen et al., 2003). Quando os níveis de GLP-1 estão aumentados, ocorre su-

pressão dos níveis de glucagon e do esvaziamento gástrico. Cabe ressaltar que a redu-

ção dos níveis de glucagon no período pós-prandial, como ação da elevação dos níveis

de GLP-1, não compromete a ação do glucagon na manutenção da glicemia em perío-

dos de jejum. Além disso, a redução do esvaziamento gástrico está diretamente rela-

cionada com a diminuição da glicemia pós-prandial. O GLP-1 parece ser mais eficaz no

tratamento do DM2 quando administrado por via intravenosa, sendo mais promisso-

ra a terapia com ele. O GLP-1 apresenta outros efeitos fisiológicos importantes, tais

como redução do apetite por retardo do esvaziamento gástrico (Naslund et al., 1999)

e a preservação ou aumento da massa de células beta-pancreáticas pela indução da

neogênese de ilhotas e inibição da apoptose (Perfetti et al., 2000). O estímulo da se-

creção de insulina pelo GLP-1 ocorre num modo glicose-dependente. O GLP-1 age no

pâncreas a partir da ligação com um receptor específico, o qual se encontra acoplado

à captação de glicose e metabolismo desta. Este mecanismo evita a hipoglicemia

(Delmeire et al., 2003). O GLP-1 ainda exibe efeito lipolítico sobre os adipócitos de

ratos (Baggio e Drucker, 2007). A figura 5 resume os principais efeitos fisiológicos do

GLP-1.

Figura 5 – Ações do GLP-1 nos tecidos periféricos. Abreviação: GLP-1, Peptídeo similar ao glucagon 1. Adap-

tado de Baggio e Drucker, 2007 (Baggio e Drucker, 2007)

O GIP é secretado por meio de estímulo luminal pelas células K, situadas nas pri-

meiras porções do intestino delgado (Mortensen et al., 2003). O consumo de dietas

hiperlipídicas eleva a secreção de GIP, aumentando a absorção intestinal de glicose e

a liberação de insulina, os quais promovem acúmulo de ácidos graxos nos adipócitos,

resultando em obesidade. Esse ciclo vicioso leva ao DM2 e o antagonismo do GIP pa-

rece ser uma estratégia pertinente para evitar essa progressão (Song e Wolfe, 2007;

Irwin et al., 2009).

O aumento dos níveis de GIP e resistência a esse hormônio é uma das alterações

inerentes ao DM2. Logo, a terapia com GIP não é exitosa, já que a administração intra-

venosa deste não promove aumento da secreção de insulina e melhora da tolerância à

glicose (Ranganath, 2008b). Apesar disso, seus efeitos sobre o tecido pancreático é

muito parecido com os efeitos do GLP-1. O GIP também aumenta a transcrição de ge-

ne ligado à biossíntese da insulina assim como da expressão de componentes dos

sensores de glicose na célula beta (Drucker, 2006; Baggio e Drucker, 2007).

No DM2, a função da célula beta encontra-se alterada no estado pós-prandial. O-

corre uma perda da resposta rápida da secreção pós- prandial de insulina. Outros e-

feitos que configuram a resistência à insulina são a hipersecreção de insulina e hiper-

trofia das ilhotas (Kahn, 2001; Saltiel e Kahn, 2001). Além disso, um defeito na trans-

locação do GLUT para a membrana das células impede a utilização adequada da glico-

se pelos tecidos e esse excesso de glicose fica na circulação sanguínea, configurando

hiperglicemia pós-prandial (Kahn et al., 2001; DeFronzo, 2004).

Esse quadro de resistência à insulina caracteriza-se por uma combinação de fato-

res que incluem a resistência à insulina no fígado , músculo e tecido adiposo, declínio

progressivo da massa e função das células beta-pancreáticas e defeito na supressão

dos níveis de glucagon, causando aumento da produção hepática de glicose (Baron et

al., 1987; Petersen et al., 2005).

De todos os efeitos fisiológicos das incretinas, a supressão do glucagon emerge

como o mais significativo. Pacientes com DM2 apresentam hiperglucagonemia atrela-

da a níveis reduzidos de GLP-1, mesmo na presença de hiperglicemia (Baron et al.,

1987; Ranganath, 2008b). Contudo, antes da instalação do quadro de DM2, nos casos

de resistência à insulina, como no nosso experimento, justifica-se a utilização de es-

tratégias que aumentem os níveis circulantes das incretinas numa tentativa de evitar

a falência e/ou aumentar a massa de células beta-pancreáticas ( Mu et al., 2006).

Sitagliptina

O uso terapêutico do GLP-1 é inviável devido à sua diminuta vida média plasmáti-

ca. Antes de 3 minutos de atividade o GLP-1 é inativado pela enzima DPP-IV. Para

contornar a ação dessa enzima, algumas estratégias foram propostas: uso de agonis-

tas do receptor do GLP-1 (exenatida), análogos do GLP-1 resistentes à inativação en-

zimática (liraglutida) e inibidores da enzima DPP-IV (vidagliptina e sitagliptina) (La-

mont e Drucker, 2008). Os dois primeiros apresentam como inconveniente o fato de

serem drogas injetáveis. Os inibidores da DPP-IV são ativos por via oral, porém po-

dem potencializar a ação de outros peptídeos tais como neuropeptídeo Y, enterostati-

na, peptídeo YY, proteína quimioatratora de monócitos, GLP-2 e substância P (Nas-

lund et al., 1999; Mest e Mentlein, 2005).

A sitagliptina age por meio da inibição da DPP-IV, uma enzima chave que inativa o

GLP-1 e o GIP (3 minutos após a liberação desses, limitando suas ações (Drucker,

2006; Baggio e Drucker, 2007). Logo, sob a inibição da DPP-IV, os animais se benefici-

am da ação estendida das incretinas e de níveis aumentados. Porém, a inibição da en-

zima resulta em aumento de 2 a 3 vezes nos níveis de incretinas circulantes, ao passo

que o uso de análogos ou agonistas do GLP-1 aumentam cerca de cinco vezes os níveis

basais circulantes (Calbet e Holst, 2004; Small e Bloom, 2004). O mecanismo de ação

dos inibidores da DPP-IV está ilustrado na figura 6.

Figura 6 – Mecanismo de ação dos inibidores da DPP-IV. O GLP-1 e o GIP bioativos são liberados pelo intes-

tino delgado após a ingestão alimentar e aumenta a secreção de insulina induzida por glicose (efeito incre-

tina). A DPP-IV rapidamente converte o GLP-1 e o GIP em metabólitos inativos. A inibição da atividade da

enzima DPP-IV previne a degradação do GLP-1 e do GIP, aumentando a ação das incretinas. Abreviações:

DPP-IV, dipeptidil peptidase tipo IV; GLP-1, peptídeo similar ao glucagon 1; GIP, peptídeo insulinotrópico

dependente de glicose. Adaptado de Baggio e Drucker, 2007 (Baggio e Drucker, 2007)

No que concerne à segurança na utilização da sitagliptina, não são relatados casos

de hipoglicemia uma vez que a ação desse medicamento estimulando a secreção de

insulina ocorre apenas quando a glicemia é maior que 90 mg/dL (Charbonnel et al.,

2006). Seus efeitos são mais notórios na glicemia pós-prandial, com redução em até

50% nos níveis glicêmicos. A glicemia de jejum não reduz mais que 20%, fundamen-

tando-se no fato que a estimulação oral é crucial para a síntese das incretinas (Druc-

ker, 2003).

Considerando que a sitagliptina apenas estabiliza os níveis endógenos de GLP-1

por meio da inibição da enzima limitante da sua ação, essa droga deve ser utilizada

nas fases iniciais do DM (Deacon e Holst, 2002). Pelo fato de manter a capacidade da

célula beta-pancreática de sintetizar e liberar insulina, essa droga parece capaz de

aumentar a massa de células pancreáticas e evitar a deterioração do controle glicêmi-

co, inibindo o curso natural do DM2 (Drucker, 2003; Mest e Mentlein, 2005). Recen-

temente, foi observado um aumento da fosforilação do GLUT-2 no pâncreas como

resultado do aumento dos níveis de GLP-1 após tratamento com sitagliptina (Liu et

al., 2009). O tratamento com exenatida promoveu reversão da esteatose hepática,

sugerindo que o efeito do GLP-1 sobre e redução da produção hepática de glicose seja

mais importante que aumentar a disponibilidade de glicose (Ding et al., 2006).

Estudos clínicos têm comprovado a eficácia da sitagliptina em reduzir a glicemia de

jejum, porém seus efeitos não suplantam o da metformina (Charbonnel et al., 2006).

Sua ação é maior sobre a glicemia pós-prandial, uma vez que o estímulo oral é neces-

sário para a secreção das incretinas (Schweizer et al., 2009). Nesse sentido, associa-

ções medicamentosas sempre são favoráveis a fim de promover efeitos mais pronun-

ciados e controle mais rígido da glicemia. A combinação mais evidente da sitagliptina

seria com drogas que também atuam na resistência à insulina, como a metformina

(Green et al., 2006; Ahren, 2008).

Metformina

A metformina é uma biguanida, cuja utilização no tratamento precoce do DM2 é

muito relevante, frente ao baixo custo e a alta eficácia como sensibilizadora da insuli-

na (Ahren, 2008). Atualmente é droga de primeira escolha no tratamento do DM2 em

indivíduos obesos ou não obesos, oferecendo baixo risco de hipoglicemia e tendo co-

mo principal efeito colateral a presença de desconforto gastrointestinal (Goodarzi e

Bryer-Ash, 2005; Nathan et al., 2009).

A metformina reduz a glicemia a partir da redução da produção hepática de glico-

se, aumentando a sensibilidade à insulina no fígado (Leverve et al., 2003; Green e Fe-

inglos, 2008). Ela age por meio da proteína quinase ativada AMP 5’ (AMPK) e estimula

a oxidação de ácidos graxos no fígado (Shaw et al., 2005). Outros mecanismos de ação

atribuídos à metformina incluem a inibição da absorção intestinal de glicose e o au-

mento dos níveis plasmáticos de GLP-1, seja pela inibição da enzima DPP-IV ou pelo

maior estímulo à secreção desta incretina (Ikeda et al., 2000; Mannucci et al., 2001;

Green et al., 2006).

A monoterapia com metformina em longo prazo não é capaz de manter níveis gli-

cêmicos adequados e uma associação com outra droga é freqüentemente requerida

(Inzucchi, 2002; Nathan et al., 2009). Inicialmente, a metformina era associada a uma

sulfoniluréia em função de essas duas classes apresentarem mecanismos de ação

complementares. A metformina aumenta a sensibilidade à insulina e a sulfoniluréia

estimula a secreção de insulina. Contudo, o alto risco de hipoglicemia oferecido pela

última logo desencorajou essa associação (Hundal e Inzucchi, 2003; Setter et al.,

2003). A outra classe de escolha para associar à metformina seriam as tiazolidinedio-

nas, porém essas apresentam como incoveniente o aumento da massa corporal em

pacientes que na sua maioria objetivam perda ponderal (Charbonnel et al., 2005; De-

rosa et al., 2006).

Mais recentemente, o conhecimento acerca das incretinas e dos medicamentos que

intensificam suas ações fizeram com que os inibidores da DPP-IV fossem associados à

metformina (Ahren, 2008). Os primeiros relatos da combinação dos inibidores da

DPP-IV com a metformina confirmam um controle adequado da glicemia e redução da

hemoglobina glicosilada em indivíduos portadores de DM2 (Brazg et al., 2007; Golds-

tein et al., 2007). Embora os resultados não sejam tão díspares com relação às associ-

ações com sulfolinuréias ou tiazonilinedionas, a boa tolerabilidade e ausência de efei-

tos colaterais fazem com que essa combinação seja promissora (Bosi et al., 2007).

Entretanto, mais estudos experimentais são necessários para esclarecer as ações des-

sa combinação já utilizada na clínica sobre a secreção de glucagon, níveis pós-

prandiais de glicose e lipídios e sensibilidade à insulina (Ahren, 2008).

Telmisartana

A telmisartana é um anti-hipertensivo da classe dos bloqueadores do receptor AT1

da angiotensina 2, conhecidos como ARB. Sua ação hipotensiva é inquestionável e,

conseqüentemente, a comunidade científica tem dado mais atenção aos efeitos pleio-

trópicos dessa droga (Georgescu, 2008).

Uma associação entre o bloqueio do sistema renina angiotensina aldosterona (SR-

RA) e a prevenção do DM2 tem sido cada vez mais freqüente. Nesse sentido, vem sen-

do observada uma tendência de acúmulo de tecido adiposo subcutâneo ao invés de

tecido adiposo visceral em pacientes utilizando ARBs, o que reduziria o acúmulo ec-

tópico de gordura em tecidos como fígado e pâncreas, melhorando assim a resistência

à insulina e prevenindo o DM2 (Sharma e Engeli, 2006; Shimabukuro et al., 2007).

Outro mecanismo proposto é o aumento da microcirculação nas ilhotas pancreáticas

e um melhor balanço iônico (potássio e magnésio) resultantes do bloqueio do recep-

tor AT1. Ambas as ações atuariam influenciando positivamente a secreção de insulina

pelo pâncreas (Scheen, 2004).

Os ARBs representam uma evolução dos inibidores da enzima conversora de angi-

otensina (iECA), pelo fato de bloquearem somente as ações da angiotensina 2 media-

das pelo receptor AT1 (Sleight, 2005; Ostergren, 2007). Portanto, efeitos fisiológicos

importantes, advindos da interação da angiotensina 2 com o receptor AT2 são manti-

dos (Weber, 1997). Contudo, a telmisartana vem se diferenciando dos demais ARB e

se destacando no controle não só da hipertensão como também das comorbidades

associadas devido a sua ação de agonista parcial PPAR-gama (Benson et al., 2004).

O PPAR-gama é um receptor intranuclear que ativa a transcrição de genes que de-

sempenham um importante papel na regulação da sensibilidade à insulina, especial-

mente no tecido adiposo e na musculatura esquelética, sendo o principal alvo das tia-

zolidinedionas (Picard e Auwerx, 2002). A telmisartana é lipofílica, o que permite que

tenha um alto poder de penetrar no núcleo celular mesmo em baixas concentrações e

assim se ligar e ativar o PPAR-gama. Essa ativação é independente do bloqueio do

receptor AT1, sendo considerada uma propriedade peliotrópica dessa droga, o que

permite considerá-la como sensibilizadora da insulina (Benson et al., 2004; Kurtz,

2005).

A telmisartana vem sendo descrita como agonista parcial do PPAR-gama, pois não

ativa completamente esse receptor, levando a uma expressão seletiva dos genes ati-

vados por esse receptor. Essa característica adiciona vantagens à utilização dessa

droga, uma vez que ela não produz os efeitos colaterais resultantes da ativação total

do PPAR-gama pelas tiazolidinedionas tais como a retenção hídrica e ganho ponderal

(Kubota et al., 1999; Benson et al., 2004; Pershadsingh, 2006).

A ação conjunta de ARB e agonista parcial PPAR-gama torna a telmisartana uma

droga adequada ao manejo dos diversos componentes da SM (Bahadir et al., 2007). A

partir do bloqueio do receptor AT1 e da ativação do receptor AT2 da ansiotensina 2

são observados alguns efeitos anti-inflamatórios importantes para o manejo da obe-

sidade, já descrita como doença inflamatória. Além disso, a supressão de moléculas

ligadas ao estresse oxidativos são pertinentes ao impedimento da evolução da NAFLD

para formas mais graves como a NASH (Kurtz, 2006; Negro et al., 2006; Enjoji et al.,

2008). A ação de agonista parcial PPAR-gama também leva à supressão de moléculas

inflamatórias como o TNf-alfa e a IL-6 e ao aumento de moléculas anti-inflamatórias

como a adiponectina, com resultante aumento da sensibilidade à insulina. São ainda

observados prevenção do ganho ponderal e melhora do perfil lipídico. Todas essas

ações culminam com a prevenção de esteatose hepática e pancreática, redução do

risco de aterosclerose, proteção cardíaca e renal (Schiffrin et al., 2003; Sugimoto et al.,

2006; Grassi et al., 2008; Sasaki et al., 2008). A figura 7 ilustra os principais efeitos

metabólicos decorrentes da utilização da telmisartana.

Cabe ainda mencionar que a ação da telmisartana como agonista seletivo na ativa-

ção dos PPARs não se refere somente ao PPAR-gama. Recentemente ela foi identifica-

da como agonista PPAR-alfa especificamente no fígado, o que ajuda a entender o su-

cesso da terapia com telmisartana no tratamento da esteatose hepática (Clemenz et

al., 2008). A ativação do PPAR-alfa no fígado correlaciona-se diretamente com maio-

res taxas de beta-oxidação de AGL no interior das mitocôndrias hepáticas (Nabeshima

et al., 2009). Outra propriedade da telmisartana que está para ser completamente

entendida é sua ação na redução da massa corporal. Um estudo recente mostrou que

essa droga atua como agonista PPAR-delta, o qual está intimamente relacionado à

perda ponderal por meio da inibição da lipogênese e da ativação de proteínas desa-

copladoras e vias lipolíticas em diversos tecidos corpóreos (He et al., 2010).

Figura 7 – Efeitos da combinação da ação ARB com agonista parcial PPAR-gama sobre diversos órgãos. A-

breviações: ARB, bloqueador do receptor de angiotensina; PPAR-gama, receptor ativador de proliferação

peroxissomal gama. Adaptado de Pershadsingh, 2006. (Pershadsingh, 2006).

Materiais e Métodos

Animais e dieta

Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com os guias convencionais

para experimentação em animais (Publicação Nº. 85-23 do NIH, revisada em 1996).

Os cuidados com os animais seguiram as normas impostas pela Universidade do Es-

tado do Rio de Janeiro (UERJ), sendo aprovado pelo comitê de ética do Hospital Uni-

versitário Pedro Ernesto sob o protocolo CEA/173/2007.

Camundongos C57BL/6 machos foram mantidos em condições controladas de

temperatura, umidade e ciclo de luz (21±2ºC, umidade 60±10%, ciclo claro-escuro

12:12h) com livre acesso à comida e água. Aos três meses de idade, os animais passa-

ram a receber aleatoriamente um tipo de dieta experimental a seguir: dieta padrão

(‘standard chow’ SC, 10g lipídios/100g dieta) ou uma dieta ‘very high fat’ (HF, 60g

lipídios/100g dieta). O conteúdo de vitaminas e minerais de ambas as dietas foram

idênticos e estavam de acordo com as recomendações do Instituto Americano de Nu-

trição (AIN 93M). As dietas foram produzidas pela Rhoster (www.rhoster.com.br) e

sua composição encontra-se detalhada na tabela 2.

Tabela 2 – Características químicas das dietas experimentais

Composição das dietas

Grupos

Ingredientes

Caseína

140,0

190,0

L-cisteína

1,8

Amido de milho

620,7

250,69

Sacarose

100,0

Fibras

50,0

Óleo de soja

40,0

Banha de porco

320,0

Mix de vitaminas

10,0

Mix de minerais

35,0

Colina

2,5

Antioxidante

0,008

Energia

Kcal/g

3,57

5,40

Proteínas

14,9

14,0

Lipídios

9,4

60,0

Carboidratos

75,7

26,0

*Mistura de Vitaminas: 10,0mg, **Mistura de Minerais: 25,0mg, seguindo recomenda-

ção da AIN-93M.

Abreviações: SC, standard chow, dieta padrão; HF, dieta high-fat (Reeves et al., 1993).

Após 10 semanas de administração das dietas, objetivando induzir os caracteres da

SM, o tratamento farmacológico foi iniciado e os seguintes grupos foram formados:

grupo SC (ração padrão durante todo o experimento / n=5); grupo HF (dieta high fat

durante todo o experimento e que não fora tratado/n=5); grupo HF-T (dieta high fat

acrescida de telmisartana 0.01 mg%); grupo HF-S (dieta high fat acrescita de sitaglip-

tina 0.9%); grupo HF-M (dieta high fat acrescida de metformina 0.48mg%); grupo HF-

TM (dieta high fat acrescida de telmisartana e metformina); grupo HF-TS (dieta high

fat acrescida de telmisartana e sitagliptina) e grupo HF-SM (dieta high fat acrescida

de sitagliptina e metformina). Os tratamentos tiveram a duração de 6 semanas e as

drogas foram trituradas e misturadas à dieta nas quantidades descritas acima. Os

grupos tratados com associações medicamentosas receberam a mesma quantidade de

cada uma das drogas que os grupos em monoterapia.

Massa corporal e ingestão alimentar

A massa corporal (MC) foi avaliada semanalmente em balança de precisão (sexta

feira, 8h AM), enquanto a ingestão alimentar foi mensurada diariamente (8h AM) .

Dieta fresca era fornecida diariamente e eventual remanescente de dieta do dia ante-

rior era descartado a fim de evitar oxidação lipídica.

Considerando-se a ingestão diária de ração e a massa corporal dos animais, as do-

ses dos medicamentos corresponderam a 5,2±0,06 mg/kg/dia para a telmisartana,

1,08.0±0,05 g/kg/dia para sitagliptina, e 310,0±6,0 mg/kg/dia para a metformina.

Análises metabólicas

O teste oral de tolerância à glicose (TOTG) foi realizado ao final do experimento.

Após um período de 6 horas de jejum (1h AM - 7h AM), amostras de sangue para do-

sar a glicemia de jejum foram obtidas por ordenha da cauda após uma pequena inci-

são na ponta desta. Em seguida, uma solução de glicose (25% glicose em solução sali-

na estéril 0,9% NaCl) numa dose de 1g/kg foi administrada por gavagem orogástrica.

A concentração de glicose plasmática foi aferida antes da sobrecarga de glicose e nos

seguintes tempos subsequentes a esta: 15, 30, 60 e 120 minutos, utilizando o método

da glicose-oxidase com auxílio de um glicosímetro (Accu-chek, Roche Diagnostic,

Germany). A área sob a curva (AUC) foi calculada usando a ferramenta trapezóide do

programa GraphPad Prism versão 5.3 para Windows (GraphPad Software, San Diego,

CA, USA) com o intuito de avaliar a intolerância à glicose (Gallou-Kabani et al., 2007).

Dessa mesma forma, para o teste intraperitoneal de tolerância à insulin (TITI) os

camundongos fizeram jejum de 4 horas (1h AM-5h AM) e as amostras de sangue tam-

bém foram coletadas por ordenha da cauda. Contudo, após a determinação da glice-

mia de jejum, 0,75U de insulina/Kg MC de insulina de ação ultrarrápida (Lispro insu-

lin®) foi administrada intraperitonealmente. Na sequencia, a glicemia plasmática foi

mensurada aos 15, 30, 60 e 120 minutos após a sensibilização com a insulina. A área

sob a curva também foi calculada objetivando avaliar a resistência à insulina (Gallou-

Kabani et al., 2007).

Os dados do TITI ainda foram utilizados para calcular o índice de sensibilidade à

insulina (Ki). Este foi calculado pela seguinte formula: Glicemia basal - glicose

15 min

/15 (Schreyer et al., 1998).

Sacrifício

No dia da eutanásia, os animais foram submetidos ao jejum de 6 horas (1 AM – 7

AM). Antes do procedimento, os animais foram anestesiados profundamente com

pentobarbital sódico intraperitoneal (50 mg/kg). Em seguida, o tórax foi aberto por

incisão mediana ventral e as amostras de sangue foram obtidas rapidamente por

punção cardíaca (átrio direito). O pâncreas e os depósitos de gordura (massa de gor-

dura retroperitoneal, inguinal e genital) foram completamente removidos de ambos

os lados e foram pesados em balança de precisão digital. A gordura retroperitoneal foi

considerada como os depósitos localizados ao redor dos rins e ao longo dos músculos

lombares. A gordura inguinal foi considerada como toda a gordura subcutânea entre a

parte inferior da caixa torácica e da região média da coxa. A gordura genital (epididi-

mária) incluiu o tecido adiposo ao redor dos ureteres e bexiga, assim como dos epidí-

dimos. A tíbia esquerda também foi dissecada e o comprimento da tíbia foi aferido

com auxílio do paquímetro devido ao fato de que massas corporais discrepantes entre

os grupos podiam transformar os parâmetros absolutos em dados inconcludentes.

Dessa forma, a tíbia foi empregada para padronizar as massas do fígado e do pân-

creas, permitindo um estudo comparativo entre todos os grupos (Yin et al., 1982).

Perfil lipídico

Imediatamente após a coleta do sangue, o plasma foi separado por centrifugação

em temperatura ambiente (120 g for 15 min) e estocado a -80ºC até a realização de

análise bioquímica. Colesterol total, triglicerídeos e a HDL foram determinados por

um ensaio cinético colorimétrico (Bioclin System II, Quibasa, Bioclin, Belo Horizonte,

MG, Brazil). A fórmula de Friedwald foi utilizada para calcular a concentração de LDL.

Morfometria dos adipócitos

O tecido adiposo epididimário foi incluído em paraplast plus (Sigma-Aldrich Co., St.

Louis, MO, USA), seccionado a 5 µm e corado com hematoxilina-eosina. Após isso, a

área seccional dos adipócitos foi medida utilizando o software Image-Pro Plus versão

5.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) para a análise de imagens digitais

adquiridas de campos aleatórios (um mínimo de 10 adipócitos por animal, formato

TIFF, 36-bit, 1280x1024 pixels) com câmera Olympus LC Evolution e microscópio

Olympus BX51.

Radioimunoensaio para insulina

As concentrações de insulina de jejum foram determinadas por radioimunoensaio,

Cat. RI-13K (o coeficiente de variação intra-ensaio foi de 1,4%). O modelo de avalia-

ção da homeostase (HOMA-IR) foi calculado usando valores basais a fim de avaliar a

resistência à insulina pela seguinte fórmula: HOMA = (glicemia de jejum x insulina de

jejum)/22.5 (Matthews et al., 1985), assim como o HOMA-BETA foi obtido por meio

da fórmula: HOMA-B = 20 x insulina plasmática de jejum (uU/ml) /glicemia de jejum

(mmol/l) – 3.5 (Dagogo-Jack et al., 2009).

TNF-alfa e adiponectina

A análise dos níveis de TNF-α foi feita usando kit commercial para ELISA (Hu-

man/Mouse TNF-α ELISA Ready-SET-go, San Diego, CA, USA), assim como os níveis de

adiponectina foram obtidos pelo kit para ELISA Cat EZMADP-60K, Linco research (co-

eficiente de variação intra-ensaio foi de 3,8%).

Estereologia do fígado

O fígado foi cuidadosamente dissecado e teve seu volume aferido pelo método de

Scherle (Scherle, 1970). Este se fundamenta no deslocamento do líquido devido ao

volume do órgão submerso na solução salina de maneira que as paredes do recipiente

posicionado sobre a balança não sejam tocadas. A partir de tal procedimento, o volu-

me do órgão é obtido por meio do peso, dado que volume = massa/gravidade e que a

gravidade da solução fisiológica salina é 1,0048, pode-se considerar então que volu-

me (cm³) = massa (g) (Weibel, 1979).

Na sequência, o fígado foi cortado em fragmentos pequenos, os quais foram manti-

dos formalina de Millong durante 48h em temperatura ambiente. Fragmentos aleató-

rios foram desidratados em alcoóis de concentração crescente até alcançar o álcool

absoluto, diafanizados em xilol e incluídos em Paraplast plus (Sigma-Aldrich, St.

Louis, MO, USA). O material foi seccionado com 3μm de espessura, e então os cortes

foram corados com Hematoxilina-Eosina. Vários cortes foram obtidos de cada frag-

mento do órgão e 5 campos aleatórios foram analisados ao microscópio, configurando

um estudo completamente cego.

Para as análises estereológicas, foi utilizado um sistema de vídeo-microscopia com

microscópio Leica DMRBE, objetivas plano cromáticas (Leica, Weltzlar, Alemanha) e

um sistema teste com 36 pontos (pontos totais) acoplado ao monitor (Aguila et al.,

2003). A densidade de volume de esteatose hepática foi estimada por contagem dos

pontos que tocavam glóbulos de gordura: Vv[estrutura]:=P

[estrutura]/P

(onde P

o número de pontos que tocam as estrutura avaliada e P

é o número total de pontos

na grade teste) (Mandarim-de-Lacerda, 2003). As quantificações consideraram so-

mente estruturas preservadas e que não tocavam a linha proibida (Gundersen, 1977).

Vale a pena mencionar que a técnica de contagem de pontos foi escolhida uma vez

que esta tem uma melhor reprodutibilidade que a avaliação visual (Franzen et al.,

2005).

Morfometria e estereologia do Pâncreas

Cortes de 5μm de espessura foram corados com hematoxilina-eosina. Cinco ilhotas

pancreáticas foram analisadas randomicamente em cada lâmina. O diâmetro das ilho-

tas foi facilmente obtido considerando a média entre o maior e o menor diâmetro.

Somente as ilhotas que cortam o plano equatorial foram medidas a partir de um sis-

tema de vídeo microscopia (câmera Olymp us DP71, microscópio Olympus BX51). Um

mínimo de 100 ilhotas foi medido por grupo. A densidade de volume (Vv) de esteato-

se pancreática também foi estimada por contagem de pontos que tocavam os glóbulos

de gordura (interlobular, intralobular e perilobular) como detalhado anteriormente

para o fígado.

Imunohistoquímica

Cortes de 5 micrômetros de espessura de tecido pancreático foram desparafiniza-

dos e a recuperação antigênica foi feita com tampão citrato pH6,0 por 30 minutos a

60ºC. Após isso, a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 0,3% H

tampão fosfato salino (PBS). Ligações inespecíficas dos anticorpos policlonais foram

bloqueadas pela incubação com albumina sérica bovina (BSA) a 5% em PBS. Subse-

quentemente, os cortes foram incubados com anticorpos anti-insulina (diluição

1:100; A0564, DAKO), anti-glucagon (diluição 1:100; A0565, Dako) e anti-glut-2 (dilu-

ição 1:100; AB1342, Chemicon) e essas reações foram amplificadas usando um siste-

ma biotinha-estreptavidina (K0679; Universal DakoCytomation LSAB + kit, peroxida-

se). Imunoreações positivas foram visualizadas utilizando o reagent DAB (K3466, Da-

koCytomation) e hematoxilina. Lâminas de controle negativo foram obtidas a partir

da omissão do anticorpo primário. Similarmente, cortes de tecido hepático seguiram

o mesmo protocolo, exceto a recuperação antigênica. O anticorpo primário utilizado

para o fígado foi o anti-PPAR-α (dilution 1:100; SC-9000, Santa Cruz).

Imunofluorescência

A imunofluorescência foi realizada para localizar insulina e glucagon nas ilhotas

pancreáticas. Para tal procedimento, foi empregado o mesmo protocolo descrito aci-

ma na imunohistoquímica de rotina. Contudo, os anticorpos anti-insulina (anti-guinea

pig, A0564 DAKO) e anti-glucagon (anti-rabbit, A0565, Dako) foram utilizados na di-

luição 1:50. Pelo fato desses anticorpos terem sido obtidos em diferentes animais foi

possível realizar a dupla marcação, usando dois anticorpos secundários distintos (an-

ti-guinea pig e anti-rabbit) conjugados com o fluoróforo Alexa. As lâminas foram mon-

tadas com slow-fade (Invitrogen) a fim de manter a fluorescência. Os controles nega-

tivos foram obtidos pela omissão dos anticorpos primários. Um microscópio confocal

a laser (CLSM-510 META–Zeiss) foi utilizado na avaliação das lâminas. Fotomicrogra-

fias foram obtidas usando objetivas de 20x (EC Plan-Neofluar), com resolução de 0,5.

Análise de imagens

Imagens digitais foram capturadas e analisadas com o software Image pro plus

versão 7.0 (Media Cybernetics, Silver spring, Md). Uma ferramenta de segmentação

de densidade foi utilizada para segmentar a imagem em branco e preto, onde as áreas

brancas correspondem à marcação com insulina, glucagon ou GLUT-2 e a área em

preto representa as demais áreas remanescentes do tecido. Os limites das ilhotas fo-

ram determinados e a área colorida em branco foi quantificada utilizando uma ferra-

menta de histograma. Esse resultado foi expresso em densidade de coloração por i-

lhota (%) (Mandarim-de-Lacerda et al., 2010). Uma amostra de 10 ilhotas por animal

foi avaliada em cada grupo.

Por outro lado, a expressão do PPAR-alfa no fígado foi avaliada por uma metodolo-

gia estereológica. O número de núcleos de núcleos positivamente marcados foi divi-

dido pelo número total de núcleos de hepatócitos, considerando somente núcleos

dentro do sistema teste. O resultado foi multiplicado por 100. As medidas foram obti-

das em 10 campos por animal.

Western Blot

As proteínas hepáticas foram extraídas com tampão de lise e inibidores de protea-

se. Os homogenatos resultantes foram centrifugados a 3200x g por 20 minutos a 4°C,

e os sobrenadantes foram coletados. A expressão das proteínas SREBP-1 e GLUT-2

foram analisadas por western blot. Quantidades iguais de proteína total foram resus-

pensas em tampão de amostra contendo SDS, aquecidas por 5 minutos a 100°C e se-

paradas pelo SDS-PAGE. Após a eletroforese das proteínas houve a eletro transferên-

cia destas para uma membrana PVDF (Amersham Hybond

-P). A eficiência da trans-

ferência das proteínas foi visualizada pela coloração com o corante Ponceau. A mem-

brana foi então incubada em leite desnatado em pó (6% em T-TBS), incubada com

anticorpo policlonal anti-rabbit-SREBP-1 (68kDa, SC-367, Santa cruz Biotechnology,

CA, USA) e anti-rabbit-GLUT-2 (53-61kDa, AB1342, Chemicon), lavada e incubada

com anticorpo secundário anti-rabbit. A expressão das duas proteínas foi detectada

por meio de um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL - A-

mersham). Os sinais foram visualizados por autoradiografia e quantificados por aná-

lise de fotografias digitais dos géis por meio do Image pro plus versão 7.0 (Media Cy-

bernetics, Silver spring, Md). A densidade integral ótica (IOD) da SREBP-1 e GLUT-2

foram mensuradas.

Microscopia eletrônica de transmissão

Métodos de rotina para preparar as amostras de fígado e pâncreas para microsco-

pia eletrônica de transmissão (MET) foram empregados em pelo menos 3 animais de

cada grupo. Pequenos fragmentos de ambos os órgãos (1mm²) foram fixados com

1,5% de glutaraldeído em 0,1 mol de tampão cacodilato, pH7,4, pós-fixado com tetró-

xido de ósmio 1% em 0.1 mol de tampão cacodilato a 4ºC, desidratados em uma série

de soluções de acetona de concentração crescente e incluídas em resina epóxi. Seções

ultrafinas (68nm) foram cortadas em um ultramicrótomo (Leica Ultracut ultramicro-

tome), contrastadas com acetato de uranila e citrato de chumbo e examinadas ao mi-

croscópio eletrônico (Zeiss EM 906 ).

Eletromicrografias do fígado foram analisadas a fim de estimar a densidade numé-

rica de mitocôndrias por área (Q

), a qual pode ser definida como o número de perfis

de mitocôndrias dentro de uma área teste conhecida (expresso como mitocôndria /

µm

). Quarenta e cinco eletromicrografias por grupo foram avaliadas e todas as mito-

côndrias dentro da área teste foram contadas, exceto as que tocavam a linha proibida.

Análise estatística

Os dados são mostrados como media ± EPM. Nos casos em que podemos confirmar

a homocedasticidade das variâncias, as comparações entre os grupos foram feitas

pelo one-way ANOVA seguido pelo pós-teste de Tukey. Caso contrário as diferenças

foram testadas com Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn. Em todos os casos, um nível

de significância de 0,05 foi considerado como estatisticamente significativo. Todas as

análises e gráficos foram feitos com o GraphPad Prism versão 5.3 para Windows

(GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Resultados

Ingestão alimentar e massa corporal

Não houve diferença quanto à quantidade de ração ingerida (dado não mostrado)

até a décima semana de experimento (período de indução da resistência à insulina e

caracteres associados), porám a ingestão em energia do grupo HF foi significativa-

mente maior que a do grupo SC (+40%, P<0,0001, figura 8).

Figura 8 – Ingestão energética durante as dez primeiras semanas de experimento (fase de indução). Legen-

da: SC = standard chow; HF = high fat. [a] ≠ SC (P<0,05).

No que tange à fase de tratamento, os grupos tratados apresentaram redução da in-

gestão energética por grama de massa corporal quando comparados ao grupo HF

(P<0,05, figura 9). Esse dado indica hiperfagia no grupo HF, enquanto os grupos tra-

tados não apresentaram diferença com relação ao grupo SC.

Figura 9 – Ingestão em KJ por grama de massa corporal. Legenda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T =

high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high fat + tel-

misartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina +

metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF; [f] ≠ HF-TM (P<0,05).

A dieta ‘’very high fat’’ induziu ganho ponderal rápido e os animais exibiram sobre-

peso após a primeira semana de administração desta (P<0,05). Os animais HF conti-

nuaram ganhando peso progressivamente até o final do experimento, sendo 51%

mais pesado que os seus controles SC (P<0,0001). Em contrapartida, todos os tipos de

tratamento causaram perda ponderal significativa (P<0,0001, tabela 2). Vale ressaltar

que a telmisartana demonstrou resultados expressivos sobre a massa corporal uma

vez que os grupos HF-T e HF-TS não apresentaram diferença com relação à massa

corporal dos animais SC ao término do experimento. A evolução da massa corporal

dos animais ao longo do experimento pode ser observada na figura 10.

Figura 10 – Evolução da massa corporal ao longo do experimento. Legenda: SC = standard chow; HF = high

fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high

fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitaglipti-

na + metformina. Símbolos iguais indicam diferença estatística entre os grupos (P<0,05).

Metabolismo de carboidratos

A ingestão crônica de dieta ‘’high fat’’ induziu hiperinsulinemia nos animais HF,

com insulinemia 210% maior que os animais SC da mesma idade. Os animais tratados

apresentaram valores normais, sem diferença do grupo SC (P<0,0001, figura 11).

Figura 11 – Insulinemia dos animais aos 7 meses de idade. Legenda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T

= high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high fat +

telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina +

metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

Corroborando com os níveis de insulinemia, quando comparado ao grupo SC, os

camundongos HF apresentaram intolerância oral à glicose, com maior AUC após rea-

lização do TOTG (+38% para AUC no TOTG, P<0,001, figura 12). Embora tenha sido

aliviada por todos os tratamentos, a intolerância oral à glicose foi completamente re-

vertida pelos tratamentos com telmisartana e sitagliptina em monoterapia ou as as-

sociações telmisartana + sitagliptina e sitagliptina + metformina, já que esses grupos

não apresentaram diferenças com relação aos camundongos SC no que se refere à

AUC do TOTG.

Figura 12 – Área sob a curva do teste oral de tolerância à glicose realizada aos 7 meses de idade (pós-

tratamento). Legenda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat +

sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat +

telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF; [c] ≠ HF-T; [d] ≠

HF-S; [e] ≠ HF-M; [f] ≠ HF-TM (P<0,05).

A resistência à insulina foi detectada nesses animais HF por meio de uma maior

AUC do TITI (+59% para AUC no TITI, P<0,0001, figura 13). Os tratamentos que re-

verteram completamente a resistência à insulina avaliada pelo TITI foram a monote-

rapia com metformina e as associações telmisartana + sitagliptina e sitagliptina +

metformina, uma vez que esses grupos não apresentaram diferença com relação ao

grupo SC (figura 13).

Figura 13 – Área sob a curva do teste intraperitoneal de tolerância à insulina realizada aos 7 meses de idade

(pós-tratamento). Legenda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat

+ sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat

+ telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

Apesar de todos os tratamentos terem sido eficazes ao aliviar a intolerância à gli-

cose e resistência à insulina, as anormalidades do metabolismo de carboidratos foram

completamente revertidas somente pelos tratamentos com as associações telmisarta-

na + sitagliptina e sitagliptina + metformina, já que esses grupos não apresentaram

diferenças com relação aos camundongos SC no que se refere à AUC do TOTG e do

TITI (figuras 12 e 13). Dentre as monoterapias, o tratamento com sitagliptina de-

monstrou melhores resultados no TOTG (-30%, P<0,001), enquanto a metformina se

destacou no TITI (-26%, P<0,001).

Os animais HF não tratados apresentaram ainda aumento do HOMA-IR (+74%,

P<0,0001, figura 14) concomitante ao decréscimo do KI (-77%, P<0,0001, figura 15),

confirmando a resistência à insulina nesses animais. Adicionalmente, o aumento dos

valores de HOMA-B no grupo HF (+109%, P<0,0001, figura 16) foi indicativo de hi-

persecreção das células beta pancreáticas. O HOMA-IR, o Ki e o HOMA-B foram nor-

malizados em todos os grupos tratados.

Figura 14 – Homa-IR aos 7 meses de idade (pós-tratamento). Legenda: SC = standard chow; HF = high fat;

HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high fat

+ telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina +

metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

Figura 15 – KI aos 7 meses de idade (pós-tratamento). Legenda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T =

high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high fat + tel-

misartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina +

metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

Figura 16 – HOMA-B aos 7 meses de idade (pós-tratamento). Legenda: SC = standard chow; HF = high fat;

HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high fat

+ telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina +

metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

Perfil lipídico

A dieta ‘’high fat’’ causou hipercolesterolemia (figura 17) e aumentou os níveis de

LDL (figura 18) no grupo HF (P<0,0001). A telmisartana e a metformina reduziram

esses parâmetros, enquanto a sitagliptina não apresentou efeito sobre a colesterole-

mia e produziu níveis intermediários de LDL. As associações telmisartana + metfor-

mina e telmisartana + sitaglipitina foram eficazes em normalizar a colesterolemia e os

níveis de LDL. A associação sitagliptina + metformina não foi capaz de tratar a dislipi-

demia.

Figura 17 – Níveis de colesterol total aos 7 meses de idade (pós-tratamento). Legenda: SC = standard chow;

HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-

TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat +

sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF; [c] ≠ HF-T (P<0,05).

Figura 18 – Níveis de colesterol total aos 7 meses de idade (pós-tratamento). Legenda: SC = standard chow;

HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-

TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat +

sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF; [c] ≠ HF-T; [d] ≠ HF-S (P<0,05).

Estereologia hepática

O excesso de ingestão de gordura produziu hepatomegalia no grupo HF quando

comparado ao SC (+40%, P<0,0001, figura 19). Todos os tipos de tratamentos reduzi-

ram significativamente esse achado e, dessa forma, os animais tratados apresentaram

massa hepática similar aos animais SC, mesmo com livre acesso à dieta “high fat’’.

Figura 19 – Massa hepática corrigida pelo comprimento da tíbia aos 7 meses de idade (pós-tratamento).

Legenda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-

M = high fat + metformina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana +

sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

A esteatose hepática foi um achado recorrente no nosso estudo, principalmente no

grupo HF, o qual apresentou esteatose macrovesicular e microvesicular severa nos

hepatócitos (esteatose grau 2, 33%, figura 20). Todos os tratamentos atenuaram a

esteatose significativamente (esteatose grau 1, figura 20). No entanto, a associação da

telmisartana com a sitagliptina normalizou o grau de esteatose hepática, já que este

grupo não apresentou diferença com o grupo SC.

Figura 20 – Densidade de volume de esteatose hepática aos 7 meses de idade (pós-tratamento). Legenda:

SC = standard chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high

fat + metformina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitaglip-

tina; HF-SM = high fat + sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF; [c] ≠ HF-T; [d] ≠ HF-S; [e] ≠ HF-M; [f] ≠

HF-TM; [g] ≠ HF-TS (P<0,05).

Morfometria dos adipócitos e massa adiposa

A dieta ‘high fat’ determinou aumento das massas de gordura epididimária

(+209%), retroperitoneal (+395%) e inguinal (+254%) no grupo HF quando compa-

rado aos animais SC (P<0,001, figura 21). Por outro lado, todos os grupos tratados

apresentaram depósitos de gordura similares ao grupo SC.

Figura 21 – Distribuição da gordura corporal (inguinal, epididimária e retroperitoneal) aos 7 meses de idade

(pós-tratamento). Legenda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat

+ sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat

+ telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina + metformina.

A telmisartana alterou também o padrão de distribuição de gordura, o que pode

ser observado por um decréscimo na razão Epi:Sub (gordura epididimária: gordura

subcutânea) no grupo HF-T quando comparado ao grupo HF (-25%, P<0,001, figura

22).

Figura 22 – Razão gordura epididimária : gordura subcutânea dos animais aos 7 meses de idade (pós-

tratamento). Legenda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat +

sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat +

telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF; [c] ≠ HF-T

(P<0,05).

A hipertrofia de adipócitos foi verificada no grupo HF (+125%, P<0,001, figura

23), sendo esse achado contornado de forma eficiente por todos os tratamentos. Con-

tudo, somente os grupos HF-T e HF-TS igualaram o diâmetro dos adipócitos com o

grupo SC, enquanto os demais grupos (HF-S, HF-M, HF-TM e HF-SM) apresentaram

adipócitos de tamanho intermediário.

Figura 23 – Diâmetro dos adipócitos dos animais dos animais aos 7 meses de idade (pós-tratamento). Le-

genda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M

= high fat + metformina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana +

sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF; [c] ≠ HF-T; [d] ≠ HF-S; [e] ≠ HF-

M; [f] ≠ HF-TM; [g] ≠ HF-TS (P<0,05).

Adipocinas

Os níveis de TNF-alfa aumentaram nos animais HF quando comparados aos SC (+

405%, P<0,0001, figura 24). Todos os tratamentos produziram resultados similares

aos animais do grupo SC, aliviando não somente o sobrepeso, mas também o estado

inflamatório relacionado a este. Em contrapartida, os tratamentos aumentaram os

níveis de adiponectina para valores similares ao do grupo SC, enquanto o grupo HF

mostrou os valores mais baixos desta adipocina (-40%, P<0,0001, figura 25).

Figura 24 – Níveis de TNF-alfa aos 7 meses de idade (pós-tratamento). Legenda: SC = standard chow; HF =

high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM =

high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitag-

liptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

Figura 25 – Níveis de adiponectina aos 7 meses de idade (pós-tratamento). Legenda: SC = standard chow;

HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-

TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat +

sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF; [c] ≠ HF-T; [d] ≠ HF-S; [e] ≠ HF-M; [f] ≠ HF-TM; [g] ≠ HF-TS

(P<0,05).

Morfologia do pâncreas e estereologia

A massa pancreática foi maior no grupo HF quando comparado ao grupo SC

(P<0,001, figura 26). Todos os grupos tratados apresentaram redução da massa pan-

creática para valores similares ao grupo SC.

Figura 26 – Massa pancreática corrigida pelo comprimento da tíbia. Legenda: SC = standard chow; HF = high

fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high

fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitaglipti-

na + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

A esteatose pancreática foi significante no grupo HF (+713% em comparação ao

grupo SC de mesma idade, P<0,0001). Cabe mencionar que todos os tratamentos fo-

ram capazes de normalizar esse parâmetro e, consequentemente, todos os animais

tratados acumularam gordura no tecido pancreático num grau similar aos animais do

grupo SC (figura 27).

Figura 27 – Densidade de volume de esteatose pancreática aos 7 meses de idade. Legenda: SC = standard

chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metfor-

mina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM =

high fat + sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

No que concerne ao tamanho da ilhota, os animais HF apresentaram hipertrofia (+

94% em relação ao grupo SC, P<0,0001, figura 28), o que está de acordo com a hipe-

rinsulinemia encontrada nesses animais. Entretanto, todos os tipos de tratamentos

propostos melhoraram a função das ilhotas desde que nenhum sinal de hipertrofia

fora observado nesses grupos.

Figura 28 – Diâmetro das ilhotas pancreáticas aos 7 meses de idade. Legenda: SC = standard chow; HF =

high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM =

high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitag-

liptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

Imunohistoquímica

Imunoreações positivas para PPAR-alfa foram encontradas nos fígados de animais de

todos os grupos. A dieta HF promoveu decréscimo da expressão do PPAR-alfa (-81%,

P<0,0001, figura 29) quando comparado ao grupo SC. Por outro lado, o tratamento

com telmisartana aumentou significativamente a expressão do PPAR-alfa (+67%,

P<0,0001) quando comparados aos animais SC. Além disso, as associações que con-

têm a telmisartana (HF-TM e HF-TS) obtiveram êxito, já que ambos os grupos exibi-

ram expressão do PPAR-alfa similar aos animais SC. Apesar de não ter alcançado os

níveis dos animais SC, a monoterapia com metformina (HF-M) também impediu o

decréscimo da expressão de PPAR-alfa pelo consumo da dieta HF.

Figura 29 – Imunomarcação para PPAR-alfa hepático. Legenda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T =

high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metformina; HF-TM = high fat + tel-

misartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina +

metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF; [c] ≠ HF-T; [d] ≠ HF-S; [e] ≠ HF-M; [f] ≠ HF-TM; [g] ≠ HF-TS (P<0,05).

No que concerne à imunohistoquímica do pâncreas, as ilhotas do grupo HF apre-

sentaram aumento da imunodensidade para insulina (+92%, P<0,0001) e glucagon (+

56%, P<0,0001) concomitante à redução da imunodensidade para glut-2 (-70%,

P<0,0001) quando comparadas aos resultados do grupo SC. Todos os tratamentos

promoveram redução das imunodensidades de insulina e glucagon e aumento da i-

munodensidade de glut-2 para valores similares aos do grupo SC (Figura 30).

Figura 30 – Imunomarcação para insulina, glucagon e glut-2 no pâncreas dos animais aos 7 meses de idade.

Legenda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-

M = high fat + metformina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana +

sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

Imunofluorescência

A dupla marcação para insulina e glucagon (figura 31) ratificou os achados da i-

munohistoquímica de rotina. O grupo HF não tratado apresentou ilhotas hipertrofia-

das e com uma distribuição anormal de células alfa nas ilhotas pancreáticas. Essas

células não ficaram restritas à periferia das ilhotas, mas penetraram no cerne dessa

estrutura. Em contrapartida, o grupo SC e todos os grupos tratados apresentaram a

distribuição característica de células alfa, ou seja, estas ficaram restritas à periferia

das ilhotas.

No que tange à marcação para insulina, o grupo HF não tratado apresentou uma

área maior de marcação de insulina devido ao maior tamanho da ilhota, corroborando

com a hiperinsulinemia e hipertrofia das ilhotas descritas previamente para esses

grupos. Esses achados também não foram observados nos grupos SC tratados com

monoterapia ou associações, reforçando a eficiência dos tratamentos propostos.

Figura 31 – Imunofluorescência para insulina e glucagon no pâncreas dos animais aos 7 meses de idade.

Legenda: SC = standard chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-

M = high fat + metformina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana +

sitagliptina; HF-SM = high fat + sitagliptina + metformina.

Modificações ultraestruturais

A microscopia eletrônica (figura 32) revelou hepatócitos com abundantes vesículas

lipídicas no grupo HF, caracterizando a existência de esteatose macro e microvesicu-

lar, além de um completo desarranjo da cito arquitetura. Mitocôndrias menores e

mais escassas foram encontradas, sendo as cristas mitocondriais difíceis de serem

observadas, além de um notável desarranjo do retículo endoplasmático rugoso e

complexo de golgi. Células estreladas (SCs) ativadas foram frequentemente identifi-

cadas no grupo HF não tratado, sugerindo uma progressão para NASH (esteatohepati-

te não alcoólica). Por outro lado, os grupos tratados apresentaram gotículas de gor-

dura menores e menos frequentes, corroborando com os resultados da microscopia

de luz. Adicionalmente, foi verificado que as SCs e a arquitetura celular nos grupos

tratados lembravam muito o grupo SC, assim como as mitocôndrias que foram mais

numerosas e bem preservadas.

Figura 32 – Eletromicrografia do fígado dos animais aos 7 meses de idade. Núcleo, nucléolo e retículo endo-

plasmático rugoso bem preservado e numerosas mitocôndrias com cristas visíveis são observados em (a)

(grupo SC). Em (b), os animais HF mostram esteatose hepatica macro (estrela) e microvesicular (seta) seve-

ra, com desarranjo do retículo endoplasmático rugoso e mitocôndrias escassas. Em (c), setas abertas indi-

cam os limites entre células estreladas ativadas e citoplasma do hepatócito com esteatose macrovesicular

(estrela) no grupo HF. Em (d), arquitetura celular bem preservada, muitas mitocôndrias e gotículas lipídicas

esparsas (estrela) são obsrvadas no grupo HF-T. Em (e), núcleo, nucléolo e mitocôndrias normais, ausência

de esteatose e citoarquitetura bem preservada são observadas no grupo HF-TS. Abreviações: SC - standard

chow, HF - high-fat não tratado, HF-T - high-fat + telmisartana, HF-TS - high-fat + telmisartana + sitagliptina.

No que tange à densidade de número de mitocôndrias por área, o grupo HF não

tratado mostrou um menor número de mitocôndrias quando comparados a todos os

grupos tratados e ao grupo SC. Nos animais tratados, a densidade numérica por área

foi intermediária entre o grupo não tratado e o grupo SC (figura 33), porém a manu-

tenção do número de mitocôndrias normal foi observada somente no grupo HF-TS, o

qual foi expressivamente superior ao grupo HF (+75%, P<0.0001, figura 33) e não

apresentou diferença com relação ao grupo SC.

Figura 33 – Densidade numérica de mitocôndria por área aos 7 meses de idade. Legenda: SC = standard

chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metfor-

mina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM =

high fat + sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

Western Blot

A expressão da SREBP-1 foi maior no grupo HF que no grupo SC (+870%,

P<0,0001, figura 34). A telmisartana e a sitagliptina reduziram a expressão desta pro-

teína, enquanto a metformina e as associações normalizaram a mesma. Paralelamen-

te, a expressão do GLUT-2 foi menor no grupo HF (-40%, P<0,0001, Figura 35). Em-

bora todos os tratamentos tenham demonstrado expressão de glut-2 próxima a do

grupo SC, somente os valores dos animais dos grupos HF-T, HF-S e HF-TM diferiram

dos animais HF não tratados.

Figura 34 – Densidade ótica integral das bandas de western blotting para SREBP-1. Legenda: SC = standard

chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metfor-

mina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM =

high fat + sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

Figura 35 – Densidade ótica integral das bandas de western blotting para GLUT-2. Legenda: SC = standard

chow; HF = high fat; HF-T = high fat + telmisartana; HF-S = high fat + sitagliptina; HF-M = high fat + metfor-

mina; HF-TM = high fat + telmisartana + metformina; HF-TS = high fat + telmisartana + sitagliptina; HF-SM =

high fat + sitagliptina + metformina. [a] ≠ SC; [b] ≠ HF (P<0,05).

Discussão

A dieta ‘high fat’ causou sobrepeso e suas comorbidades, tais como dislipidemia e

resistência à insulina nos camundongos C57BL/6. Animais HF não tratados apresen-

taram aumento das massas hepáticas e pancreáticas, juntamente com NAFLD e

NAFPD. Outros achados marcantes foram hipertrofia de adipócitos, hipertrofia das

ilhotas pancreáticas concomitante com hiperinsulinemia e aumento da imunodensi-

dade para insulina e glucagon e redução da expressão de glut-2 nas ilhotas dos ani-

mais HF, indicando remodelamento morfológico adverso e função prejudicada do te-

cido pancreático. Todas essas alterações foram amenizadas ou revertidas pelas inter-

venções farmacológicas. Este é o primeiro relato na literatura de que a sitagliptina

afeta o tamanho dos adipócitos e melhora a esteatose hepática num modelo de SM em

roedores. Além disso, a normalização do tamanho e função da ilhota pancreática após

o uso da telmisartana nunca fora descrita previamente.

Cabe mencionar que a escolha das doses nos grupos tratados foi baseada em estu-

dos anteriores conduzidos em roedores (Cohen et al., 2004; Araki et al., 2006). No

entanto, para a sitagliptina, a dose adequada foi estabelecida levando em considera-

ção a quantidade de droga que provoca inibição em torno de 90% da ação da enzima

DPP-IV (Lamont e Drucker, 2008). Quando comparados com estudos epidemiológicos,

os estudos experimentais utilizam doses de fármacos acima das recomendações. To-

davia, deve-se considerar o crescimento mais rápido e a expectativa de vida menor

dos roedores quando comparados aos humanos.

A dieta HF promoveu ganho ponderal e maior acúmulo de gordura corporal. O ex-

cesso de tecido adiposo visceral é um pilar para o desenvolvimento dos caracteres da

SM, onde o tecido adiposo falha ao tentar armazenar os lipídios pós-prandiais. Sob

esta condição, o excesso de ácidos graxos livres é acumulado como gordura ectópica

no músculo, fígado e pâncreas (McGarry e Dobbins, 1999; Sharma e Engeli, 2006). A

perda de peso foi significante em todos os grupos tratados, embora com mecanismos

diversos conduzindo a esse desfecho. A telmisartana merece destaque, já que norma-

lizou a massa corporal nos grupos HF-T e HF-TS ao término do experimento. Ela age

como um agonista parcial PPAR-gama, resultando no aumento dos níveis de adipo-

nectina, a qual ativa a oxidação de ácidos graxos por meio da AMP-quinase (Benson et

al., 2004; Tuck, 2005). Devido a esses eventos, a gordura é metabolizada para alcan-

çar os requerimentos energéticos ao invés de ser desviada para depósitos excessivos

de gordura (Benson et al., 2004; Araki et al., 2006; Sugimoto et al., 2008).

A conjunção da ativação parcial do PPAR-gama com o bloqueio do receptor AT1 é

decisiva, uma vez que permite a telmisartana reter somente os efeitos benéficos da

ativação deste fator de transcrição (Sugimoto et al., 2006; Zanchi et al., 2007; Sugimo-

to et al., 2008), sem causar os efeitos indesejáveis observados pelo uso dos agonistas

total PPAR-gama. A retenção de fluidos e a adipogênese são exemp los desses efeitos

adversos. Essas provocaram ganho ponderal num modelo experimental similar trata-

do com rosiglitazona (Fernandes-Santos et al., 2009b). De forma interessante, a adi-

ção de sitagliptina ao tratamento com telmisartana no grupo HF-TS resultou em per-

da de peso mais rápida e mais pronunciada. Essa observação pode ter relação com a

redução da ingestão energética observada nos grupos tratados. Um estudo prévio

relatou que animais tratados com telmisartana apresentaram redução da ingestão

energética mesmo quando a droga foi administrada na água de beber. Essa observa-

ção exclui qualquer especulação de que a mistura da droga na ração pudesse causar

aversão alimentar (Araki et al., 2006).

No que concerne ao metabolismo de carboidratos, a administração oral de glicose

conduz a uma maior liberação de insulina que o estímulo com dose intravenosa equi-

valente (Mu et al., 2006). Como resultado, o TITI mostrou a metformina como o tra-

tamento mais exitoso para tratar a resistência à insulina, enquanto o HF-S exibiu os

melhores efeitos após o TOTG, enfatizando o efeito incretina, o qual é inquestionável

após o estímulo oral (Drucker, 2006). Efeitos similares foram relatados na literatura,

tais como uma redução significativa da AUC encontrada exclusivamente após o TOTG

e não após o TITG (teste intraperitoneal de tolerância à glicose) em camundongos

C57Bl/6 alimentados com uma dieta contendo 45% ou 60% de lipídios e tratados

com sitagliptina (Lamont e Drucker, 2008; Liu et al., 2009).

Apesar de produzir efeitos menos expressivos que as associações de fármacos, os

resultados do grupo HF-M lembram os do grupo HF-S. Até certo ponto, essa similari-

dade pode advir da inibição da enzima DPP-IV ou do estímulo à secreção de GLP-1

pela metformina (Green et al., 2006). A literatura documenta que a metformina pro-

move a secreção de GLP-1 em ratos (Yasuda et al., 2002). Todavia, mais recentemente

foi atribuída à metformina uma inibição da enzima DPP-IV mais leve que o efeito da

sitagliptina em camundongos ob/ob. Embora sejam controversas, essas duas rotas

conduzem ao mesmo desfecho: aumento dos níveis de GLP-1, o qual pode agir em

sinergismo com a redução da produção hepática de glicose, promoção de saciedade e

perda de gordura corporal para promover uma melhora pronunciada da sensibilidade

à insulina (Goodarzi e Bryer-Ash, 2005; Green et al., 2006).

As associações de fármacos resultaram em efeitos expressivos, tais como a rever-

são completa da resistência à insulina pela combinação metformina com a sitaglipti-

na. Essa observação pode ser creditada ao sinergismo entre esses medicamentos na

correção dos principais defeitos da DM2. A sitagliptina se beneficia do estímulo da

secreção insulina e da inibição da secreção de glucagon mediada pelo GLP-1, ao passo

que a metformina alivia a resistência à insulina (Cohen et al., 2004; Baggio e Drucker,

2007). Nenhum sinal de modificações farmacocinéticas é descrito na literatura após a

referida combinação (Herman et al., 2006). A telmisartana também aumentou a sen-

sibilidade à insulina, principalmente quando associada com a sitagliptina, sugerindo

um promissor sinergismo entre essas. A telmisartana depende do efeito similar às

tiazolidinedionas para restaurar a sensibilidade à insulina, o qual engloba modifica-

ções no recrutamento e diferenciação dos adipócitos e o aumento dos níveis de adi-

ponectina. Esses efeitos advêm da ativação do PPAR-gama (Kubota et al., 1999; Araki

et al., 2006).

A resistência à insulina é fator chave na associação entre a obesidade e outros

componentes da SM como NAFLD e NAFPD (Festi et al., 2004; Mathur et al., 2007).

Nossos resultados oferecem explicações relevantes para alguns mecanismos. Animais

HF não tratados apresentaram esteatose hepática grau 2 (macro e microvesicular)

concomitante à hiperinsulinemia, hipertrofia e hipersecreção das ilhotas. Eles tam-

bém apresentavam SCs ativadas. Uma célula estrelada ativa é repleta de gotículas de

vitamina A, possuem retículo endoplasmático rugoso extenso e dilatado e complexo

de golgi proeminente (Geerts, 2001). Esse achado é relevante, visto que a ativação das

células estreladas resulta no acúmulo de matriz (cicatriz), causando alargamento do

espaço de Disse e perda da fenestra endotelial. Por conseguinte, o transporte através

da parede sinusoidal fica reduzido, causando progressiva deterioração da função he-

pática (Hui e Friedman, 2003). A ativação de SCs quiescentes para um fenótipo proli-

ferativo, fibrogênico e contrátil é o evento dominante na fibrogênese (Friedman,

2008). Dessa forma, as SCs são marcadores da progressão da injúria hepática. Em

contrapartida, animais HF tratados não apresentaram SCs ativas no parênquima he-

pático, ilustrando os efeitos benéficos dos fármacos utilizados.

Um ponto significativo do nosso estudo foi que a esteatose hepática foi eficiente-

mente tratada por todas as estratégias farmacológicas testadas. Uma justificativa

plausível está relacionada ao decréscimo do ‘input’ de ácidos graxos livres (AGL) pa-

ralelo ao incremento do ‘output’ devido ao aumento da beta-oxidação. A perda ponde-

ral correlaciona-se diretamente com menores depósitos de tecido adiposo, o qual re-

duz a geração de AGL e altera o perfil de adipocinas produzidas (Svegliati-Baroni et

al., 2006). Níveis aumentados de TNF-alfa nos animais HF não tratados inibem a ex-

pressão do PPAR-alfa, reduzindo a beta-oxidação no interior dos hepatócitos, levando

a um maior grau de esteatose. Em contrapartida, os grupos tratados exibiram maior

mobilização de ácidos graxos hepáticos, secundária à redução dos níveis de TNF-alfa

e maiores taxas de beta-oxidação, aliviando a esteatose hepática. Nesse contexto, o

grupo HF-T apresentou a expressão mais alta de PPAR-alfa no fígado e a telmisartana

foi descrita recentemente como agonista parcial PPAR-alfa especificamente no fígado

devido a sua propriedade de bloqueadora do receptor AT1 (Clemenz et al., 2008; Na-

beshima et al., 2009). O PPAR-alfa modula o metabolismo lipídico intracelular, regu-

lando a transcrição de genes relacionados à captação de ácidos graxos, oxidação mito-

condrial de ácidos graxos e catabolismo de triglicerídeos (Tsuchida et al., 2005), justi-

ficando a redução drástica do grau de esteatose nos grupos tratados com a telmisar-

tana.

Dados experimentais revelam que a disfunção mitochondrial desempenha papel

crucial na gênese da NAFLD, por meio de depleção do DNA mitocondrial, reduzida

atividade da cadeia respiratória e beta-oxidação deficitária (Pessayre, 2007; Wei et

al., 2008). Nossas eletromicrografias mostram mitocôndrias grandes, escassas e de-

sestruturadas nos animais HF, como descrito anteriormente na literatura (Ibdah et

al., 2005), ao passo que os grupos tratados mostraram mitocôndrias mais numerosas

e bem preservadas no que tange à arquitetura celular. Essa observação sugere que a

beta-oxidação aumentada é essencial para reduzir o dano hepático nos animais trata-

dos. (Brunt et al., 1999).

Além do aumento da beta-oxidação, um decréscimo da lipogênese foi também ob-

servado devido a uma redução da expressão da SREBP-1 após todos os tratamentos. A

expressão da SREBP-1 é dependente do estado nutricional, sendo induzida pelo au-

mento do conteúdo de AGS na dieta, o que foi observado no grupo HF. Esta indução

apresenta relação direta com a habilidade dos AGS em promover a inflamação, au-

mentando o stress oxidativo e a probabilidade de evolução para NASH (Aragno et al.,

2009; Shimano, 2009).

Surpreendentemente, a sitagliptina também causou reversão completa da esteato-

se hepática, apesar de apresentar a menor expressão de PPAR-alfa. A sitagliptina de-

pende do efeito incretina para exercer seus efeitos benéficos. Dessa forma, o alívio da

esteatose hepática foi mais relacionado em evitar a piora do metabolismo da glicose.

A expressão hepática de glut-2 foi significativamente maior nos grupos tratados com

sitagliptina, sugerindo normalização da sinalização da insulina a nível pós-receptor e

a restauração da sensibilidade hepática e global à insulina (Petersen e Shulman,

2006a).

A resistência à insulina se desenvolve quando um defeito no receptor da insulina

ou pós-receptor alteram a sinalização para a translocação do GLUT para a membrana

a fim de permitir a internalização e utilização glicose por células da periferia (Peter-

sen e Shulman, 2006a). Como resultado, as ilhotas hipertrofiam e hipersecretam insu-

lina numa tentativa de compensar a reduzida captação de glicose e normalizar a gli-

cemia até que ocorra a exaustão pancreática (Bonora, 2008). A hipertrofia e a hiper-

secreção das ilhotas observadas no grupo HF foram eficientemente tratadas no nosso

estudo, visto que ilhotas pancreáticas de tamanho normal, níveis normais de insulina

e HOMA-B normal foram encontrados em todos os grupos tratados. Esses achados

permitem concluir que todos os tratamentos foram capazes de reverter os danos es-

truturais e funcionais produzidos pela ingestão crônica de dieta ‘high fat’.

Diferenças dramáticas foram observadas na arquitetura e na composição celular

das ilhotas após a imunohistoquímica. Nossos resultados corroboram com relatos

prévios (Mu et al., 2006), onde uma distribuição anormal de células alfa foi visualiza-

da em lâminas do grupo HF. A expressão de glucagon foi tão intensa no grupo HF que

as células alfa positivas não ficaram restritas à periferia da ilhota, mas infiltraram na

estrutura inteira, incluindo seu cerne, ao passo que no grupo SC as células alfa com -

preenderam um manto de células positivamente marcadas para glucagon ao redor

das ilhotas. A expansão da massa de células alfa faz-se necessária devido à aumentada

demanda metabólica imposta pela compensação de células beta nos estados de resis-

tência à insulina (Ellingsgaard et al., 2008).

100

Em contraste, todos os tratamentos resultaram em normalização do padrão de dis-

tribuição de células beta/ células alfa nas ilhotas pancreáticas. A hiperglucagonemia

correlaciona-se diretamente com a resistência hepática à insulina e função anormal

das ilhotas (Winzell et al., 2007) e, consequentemente, todos os grupos tratados se

beneficiaram da redução da massa de células alfa e da expressão de glucagon. Cabe

mencionar que nos animais tratados com sitagliptina o GLP-1 inibe a síntese de glu-

cagon (Liu et al., 2009). O bloqueio do receptor AT1 simultaneamente com a ativação

parcial do PPAR-alfa emerge como uma estratégia promissora para preservar a arqui-

tetura pancreática, visto que houve melhora significativa da função da ilhota nos gru-

pos tratados com telmisartana, fazendo esta ir além das suas propriedades hiperten-

sivas (Benson et al., 2004; Pershadsingh, 2006).

Embora os mecanismos pelos quais o bloqueio do SRAA exerce efeitos protetores

contra danos e disfunção das células beta não terem sido elucidados, a redução do

estresse oxidativo parece mediar esses benefícios (Scheen, 2004; Hasegawa et al.,

2009). Efeitos antiinflamatórios observados nos nossos animais tratados com telmi-

sartana, tais como a supressão dos níveis de TNF-alfa juntamente com o incremento

dos níveis de adiponectina pode ser creditada à inibição do receptor AT1 e ativação

do PPAR-gama, as quais melhoram a estrutura e função das células beta, produzindo

os efeitos pancreáticos notáveis exibidos pelos animais dos grupos HF-T, HF-TM e HF-

TS (Mathur et al., 2007; Pitt, 2007).

Concomitante com os mecanismos previamente descritos, modificações no padrão

de diferenciação dos adipócitos emerge como outro mecanismo pelo qual a telmisar-

tana reverte a resistência à insulina, melhorando significativamente a morfologia he-

pática e das ilhotas pancreática. O bloqueio do SRAA promove recrutamento de pré-

101

adipócitos, aumentando o número de adipócitos pequenos e sensíveis à insulina ao

invés dos adipócitos grandes e resistentes à insulina, os quais secretam angiotensina

2 e predominam nos estados de resistência à insulina (Iwanami et al., 2009). Esse

novo padrão de formação dos adipócitos é responsável pela redistribuição dos esto-

ques anormais de gordura ectópica no fígado e pâncreas para o tecido adiposo, me-

lhorando a resistência à insulina (Sharma et al., 2002).

Não somente a telmisartana normalizou o tamanho dos adipócitos, como também

interferiu no padrão de estocagem do tecido adiposo. Embora a sitagliptina e a met-

formina também tenham reduzido os depósitos de gordura e o tamanho dos adipóci-

tos, somente a telmisartana produziu uma razão gordura visceral: gordura subcutâ-

nea similar ao grupo SC. Este achado está relacionado à ativação do PPAR-gama, con-

duzindo a maior produção de adiponectina e controle da resistência à insulina (Araki

et al., 2006; Kudo et al., 2009). A metformina promove a supressão da lipólise media-

da por TNF-alfa, reduzindo as concentrações sistêmicas de AGL. Ademais, causa alívio

da resistência à insulina e normalização da morfologia dos adipócitos, condizentes

com o controle da massa corporal (Ren et al., 2006). A sitagliptina também diminuiu o

tamanho dos adipócitos de forma eficiente e embora tenha um consenso no que se

refere ao mecanismo preciso, a inibição da DPP-IV produz efeitos extra-pancreáticos

como o aumento da mobilização pós-prandial de lipídios e da beta-oxidação (Baggio e

Drucker, 2007; Boschmann et al., 2009).

102

Considerações finais e Conclusões

A dieta very high fat:

• Promove aumento da massa corporal;

• Causa resistência à insulina (incremento da área sob a curva do TOTG, TITI, va-

lores maiores de HOMA-IR, HOMA-BETA e KI);

• Conduz ao grau 2 de esteatose, com aumento da expressão de SREBP-1 e redu-

ção da expressão de PPAR-alfa no fígado;

• Reduz a densidade numérica de mitocôndrias hepáticas;

• Aumenta o percentual de esteatose pancreática;

• Leva ao incremento da imunodensidade de insulina e glucagon, concomitante à

redução do GLUT-2 no pâncreas;

• Promove hiperinsulinemia, hipoadiponectinemia e incremento dos níveis de

TNF-alfa;

• Causa hipertrofia dos adipócitos;

O tratamento com telmisartana:

• Reverte o sobrepeso quando administrado em monoterapia ou em associação

com a sitagliptina;

• Reverte a resistência à insulina quando em monoterapia ou em associação com

a sitagliptina, normalizando a área sob a curva do TOTG e TITI e produzindo

valores normais de HOMA-IR, HOMA-BETA e KI; A associação com a metformi-

na reduz a área sob a curva do TOTG e TITI, porém não iguala ao grupo SC.

• Alivia a esteatose hepática quando administrada em monoterapia ou combina-

da com a metformina. Associada à sitagliptina traz o percentual de esteatose

hepática para níveis iguais ao do grupo SC. Reduz a expressão de SREBP-1 e

aumenta a expressão de PPAR-alfa no fígado;

103

• Aumenta a densidade de mitocôndrias hepáticas em comparação ao grupo HF,

com destaque para a associação com sitagliptina que apresenta resultado igual

ao grupo SC;

• Reduz o percentual de esteatose pancreática;

• Leva à redução da imunodensidade de insulina e glucagon, concomitante ao in-

cremento do GLUT-2 no pâncreas;

• Trata a hiperinsulinemia, hipoadiponectinemia e reduz os níveis de TNF-alfa;

• Reduz o diâmetro dos adipócitos;

O tratamento com sitagliptina:

• Reduz a massa corporal com relação ao grupo HF não tratado. A associação

com telmisartana reverte o sobrepeso;

• Reverte a resistência à insulina, normalizando a área sob a curva do TOTG, va-

lores normais de HOMA-IR, HOMA-BETA e KI; A monoterapia com sitagliptina

apenas reduz a área sob a curva do TITI quando comparada ao grupo SC;

• Alivia a esteatose hepática (grau 1 de esteatose). A associação com a telmisar-

tana traz o percentual de esteatose hepática para níveis iguais ao do grupo SC.

Reduz a expressão de SREBP-1 e aumenta a expressão de PPAR-alfa no fígado.

Contudo, somente a associação com telmisartana exibe expressão do PPAR-alfa

similar ao grupo SC;

• Aumenta a densidade de mitocôndrias hepáticas em comparação ao grupo HF,

com destaque para a associação com telmisartana que apresenta resultado i-

gual ao grupo SC;

• Reduz o percentual de esteatose pancreática;

• Leva a redução da imunodensidade de insulina e glucagon, concomitante ao in-

cremento do GLUT-2 no pâncreas;

• Atenua a hiperinsulinemia, hipoadiponectinemia e reduz os níveis de TNF-alfa;

• Reduz o diâmetro dos adipócitos;

O tratamento com metformina:

• Reduz a massa corporal com relação ao grupo HF não tratado;

104

• A monoterapia e a associação com a sitagliptina revertem a resistência à insuli-

na, normalizando a área sob a curva do TOTG e TITI. A associação com telmi-

sartana apenas reduz a área sob a curva. Valores normais de HOMA-IR, HOMA-

BETA e KI são encontrados em todos os grupos tratados com metformina;

• Alivia a esteatose hepática (grau 1 de esteatose). A associação com a telmisar-

tana traz o percentual de esteatose hepática para níveis iguais ao do grupo SC.

Reduz a expressão de SREBP-1 e aumenta a expressão de PPAR-alfa no fígado.

Entretanto, somente a associação com telmisartana e a monoterapia exibem

expressão do SREBP-1 similar ao grupo SC;

• Aumenta a densidade de mitocôndrias hepáticas em comparação ao grupo HF;

• Reduz o percentual de esteatose pancreática;

• Leva à redução da imunodensidade de insulina e glucagon, concomitante ao in-

cremento do GLUT-2 no pâncreas;

• Trata a hiperinsulinemia, hipoadiponectinemia e reduz os níveis de TNF-alfa;

• Reduz o diâmetro dos adipócitos;

Tratamentos farmacológicos são estratégias pertinentes para reverter a resistência

à insulina e controlar o impacto econômico que as alterações hepáticas e pancreáticas

da atual pandemia de SM vêm causando. Embora a resistência à insulina seja um re-

quisito em comum para o desenvolvimento da NAFLD, NAFPD, obesidade e DM2, dro-

gas que são direcionadas ao bloqueio do receptor AT1 da angiotensina II, ao eixo en-

teroinsular ou até mesmo à ativação do PPAR produzem efeitos expressivos atenuan-

do a resistência à insulina. Observações inéditas, tais como a melhora da função hepá-

tica pela inibição da DPP-IV, assim como a melhora da função das ilhotas pancreáticas

pela combinação de bloqueador do receptor AT1 de angiotensina II/ ativação PPAR-

gama são relevantes. A combinação de telmisartana com sitagliptina pode ter grande

utilidade na clínica, visto que resultou em normalização dos parâmetros biométricos,

morfológicos e bioquímicos no atual modelo experimental de SM.

105

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