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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE
EXTRATOS DE Goupia glabra AUBLET (CUPIÚBA)
PRISCILLA DE AZEVEDO OLIVEIRA
MANAUS
2010
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ii
PRISCILLA DE AZEVEDO OLIVEIRA
ESTUDO FITOQUIMICO E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE
EXTRATOS DE Goupia glabra AUBLET (CUPIÚBA)
Orientador: Valdir Florêncio da Veiga Junior
MANAUS
2010
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal do Amazonas,
como requisito parcial para a obtenção
do título de Mestre em Química, área de
concentração Química Orgânica.
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iii
PRISCILLA DE AZEVEDO OLIVEIRA
ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE
EXTRATOS DE Goupia glabra AUBLET (CUPIÚBA)
Aprovada em 02 de agosto de 2010.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Prof. Dr. Valdir Florêncio da Veiga Junior, Presidente
Universidade Federal do Amazonas
______________________________________________
Prof. Dr. Danilo Ribeiro de Oliveira, Membro
Universidade Federal do Rio de Janeiro
______________________________________________
Profª. Drª. Rita de Cássia Saraiva Nunomura, Membro
Universidade Federal do Amazonas
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal do Amazonas,
como requisito parcial para a obtenção
do título de Mestre em Química, área de
concentração Química Orgânica.
iv
Dedico esse trabalho a meu avô
Francisco Nonato Nobre
Francisco Nonato NobreFrancisco Nonato Nobre
Francisco Nonato Nobre, que
sempre me considerou uma vencedora.
Saudades eternas.
v
Gratidão Eterna
Gratidão EternaGratidão Eterna
Gratidão Eterna
Sei o que fez
Sei do que fizeste
Mesmo com tantos ais
Por tudo que me destes
Faz porque gosta de mim
Porque de ti sou parte
Quantos nãos ao invés de sim
Reprovando as minhas artes
Lembro-me quando criança
Das grandes dificuldades
Da falta de tempo que tinhas
Das grandes necessidades
Saías de casa bem cedo
Munido de dignidade
Levando a marmita enrolada
Recheada de honestidade
Fiel aos seus compromissos
Levou-nos à universidade
Sentia-se todo orgulhoso
Por ter os filhos formado
Hoje sou o que sou
Porque voce me ensinou
Outro não escolheria
Pois certamente eu não o amaria
(Autor desconhecido)
Pai e mãe amo vocês, serei eternamente grata a tudo que fizeram por mim. Obrigada.
vi
AGRADECIMENTOS
• À Deus, que me deu forças para concretizar esse sonho.
• À minha mãe Maria Benedita, meu pai Francisco Terso, minha avó Maria do Carmo e
meu irmão Rafaell pelo amor, carinho, incentivo e por sempre estarem presentes em
minha vida.
• Ao meu marido Allan Delon pelo amor e por estar comigo nos momentos bons e nas
adversidades.
• Ao meu orientador Valdir Florêncio da Veiga Junior pela confiança em mim, no meu
trabalho e pelo incentivo constante à pesquisa científica.
• Aos amigos: André, Paula, Pri Moraes, Roosevelt e Vanessa, pelos bons momentos de
convivência e ajuda nas dificuldades.
• Agradeço aos meus queridos amigos que têm um lugar especial no meu coração: Igor,
Joelma, Klenicy e Lidiam por me encorajarem sempre e confiarem em mim e no meu
trabalho.
• À todos meus colegas de laboratório pela ajuda nas horas necessárias.
• Aos colegas e amigos: Erika, Iandara, Karlinha, Milena, Neidimara, Orlando, Rafael
e Thamires, que já saíram do laboratório, mas continuam no meu coração.
• Aos colegas do laboratório B8: Júnior, Héctor e Dominique por me ajudarem quando
precisei e pelas visitas constantes.
• Aos Profs. Drs. Manoel Odorico de Moraes e Cláudia de Oliveira Pessoa, responsáveis
pelo Laboratório de Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará, pela
realização dos ensaios de atividade citotóxica em células tumorais.
• Ao Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura, responsável pelo Departamento de Análises
Clínicas da Universidade Estadual de Maringá, pela realização dos ensaios de atividade
antimicrobiana.
vii
• Às professoras Maria Lúcia Belém e Maria da Paz pelas importantes observações e
correções durante o Exame de qualificação.
• À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de mestrado.
• À todos os professores do corpo docente do Programa de Pós-graduação em Química por
não medirem esforços em repassar seus conhecimentos aos alunos, dando ferramentas
valiosas para minha formação profissional.
• À todos que de alguma forma contribuíram para minha formação pessoal e profissional.
viii
De tudo ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre a começar...
A certeza de que é preciso continuar...
A certeza que seremos interrompidos antes de terminar...
Portanto, devemos fazer da interrupção um caminho novo...
Fazer da queda um passo de dança...
Do medo uma escada...
Do sonho uma ponte...
Da procura um encontro...
E assim terá valido a pena.
(Fernando Sabino)
ix
RESUMO
A espécie Goupia glabra Aublet (Goupiaceae), denominada popularmente como cupiúba, é
utilizada na medicina popular contra diversas doenças. Suas cascas são utilizadas como
analgésico dentário, como vermífugo, no tratamento de malária, catapora e eczema. As folhas
são utilizadas contra sífilis, doenças oculares, enxaqueca, varíola e como cicatrizante. O
presente trabalho teve como objetivo quantificar compostos fenólicos e avaliar as atividades
antioxidante, inibidora de acetilcolinesterase, toxicidade em Artemia salina, antitumoral e
antimicrobiana de extratos de folhas, galhos finos e galhos grossos de cupiúba. O material
seco foi triturado e submetido à extração em aparelho de Soxhlet com solventes de polaridade
crescente (Hexano, AcOEt e MeOH). A prospecção fitoquímica foi realizada para diferentes
classes de metabólitos, sendo observados resultados positivos para esteróis em todos os
extratos, triterpenóides e algumas classes de flavonóides nos extratos obtidos em acetato de
etila e metanol. O fracionamento do extrato em hexano de folhas (EHF) resultou no
isolamento de uma mistura de β-sitosterol e estigmasterol. Do extrato em AcOEt de folhas
(EAF) foi isolado o catecol, um fenol simples de distribuição restrita na natureza. O conteúdo
de fenólicos totais dos extratos foi determinado utilizando o reagente de Folin-Ciocalteau e o
resultado foi expresso em equivalentes de ácido gálico (EAG). A atividade antioxidante foi
avaliada através da capacidade seqüestrante do radical estável 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
(DPPH
•
), utilizando quercetina como padrão externo, expressos como valores de
Concentração eficiente (CE
50
). Foi observada uma correlação positiva entre os fenólicos totais
e a CE
50
, ou seja, quanto maior a quantidade de fenólicos, menor a CE
50
. O extrato em AcOEt
das folhas (EAF) foi o que apresentou maior potencial antioxidante [CE
50
=9,76 ± 0,42 µg/mL
(cubeta) e CE
50
= 19,87 ± 0,31 µg/mL (microplaca)]. A toxicidade dos extratos foi verificada
através de bioensaios com microcrustáceo A. salina e expressa em % de mortalidade das
larvas. A análise qualitativa da atividade anticolinesterase foi realizada de acordo com o
método de Ellman (modificado), com resultados negativos para inibição da enzima
acetilcolinesterase. A atividade antitumoral foi avaliada contra quatro linhagens de células
(leucemia, mama, cólon e glioblastoma) utilizando método de análise colorimétrica baseada
na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazonium (MTT)
em azul de formazam segundo o método de Mossman. Os melhores resultados foram
observados para os extratos obtidos em AcOEt, principalmente para células HCT-8 (cólon)
que variaram de 58,35 a 77,12%. O extrato obtido em AcOEt dos galhos grossos (EAGg)
apresentou valor de CI
50
= 13,73 µg/mL para a linhagem HL-60 (leucemia). Esse extrato foi
fracionado e a fração EAGg5 apresentou percentual de inibição de crescimento celular de
85,37 e 101,37% para as linhagens SF-295 (glioblastoma) e MDAMB-435 (mama),
respectivamente. A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada pelo método da
concentração inibitória mínima (MIC) que foi determinada pela técnica da microdiluição em
caldo Müeller-Hinton para bactérias (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia
coli e Pseudomonas aeruginosa) e em meio líquido Sabouraud para fungos (Candida
albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis). Todos os extratos demonstraram algum grau de
atividade bacteriana e fungicida, com destaque para os extratos obtidos em AcOEt que
apresentaram inibição moderada de crescimento microbiano. Para avaliar o efeito dos extratos
no crescimento dos protozoários foi realizado estudo in vitro com formas promastigotas de
Leishmania amazonensis e epimastigotas de Trypanosoma cruzi. O extrato EAGg mostrou
atividade antiproliferativa, tanto contra L. amazonensis quanto para T. cruzi, com valores de
IC
50
de 86 e 40 µg/mL, respectivamente. A significativa atividade antioxidante, antitumoral e
antimicrobiana observada nos extratos de cupiúba destaca seu elevado potencial para a
obtenção de produtos biotecnológicos.
Palavras chave: G. glabra, Goupiaceae, atividades biológicas, catecol
x
ABSTRACT
The species Goupia glabra Aublet (Goupiaceae), popularly known as cupiúba is used in
popular medicine against several diseases. Their barks are used as dental analgesic, as a
vermifuge, to treat malaria, chickenpox and eczema. The leaves are used against syphilis,
ocular disorders, migraine, smallpox and as healing. This study aimed to quantify the phenolic
compounds and evaluate the antioxidant, inhibiting acetylcholinesterase, brine shrimp
toxicity, antitumor and antimicrobial activities of extracts of leaves, thin and thick branches of
cupiúba. The dry material was crushed and subjected to Soxhlet extraction using solvents in
increasing order of polarity (hexane, ethyl acetate and methanol). The phytochemical
screening was performed for different classes of metabolites, observed positive results for
sterols in all extracts and terpenoids and some classes of flavonoids in the extracts obtained in
ethyl acetate and methanol. The fractionation of the hexane extract of leaves (EHF) resulted in
the isolation of a mixture composed by β-sitosterol and stigmasterol. From ethyl acetate
extract of leaves (EAF) was isolated catechol, a simple phenol with restricted distribution in
nature. The total phenolic content of extracts was determined using the Folin-Ciocalteau and
the result was expressed as gallic acid equivalents (GAE). The antioxidant activity was
assessed by the ability of capturing the stable radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH
•
),
using quercetin as external standard, expressed as value of the effective concentration (EC
50
).
We observed a positive correlation between total phenolics and EC
50
, ie as greater the amount
of phenolics smaller is the EC
50
. The ethyl acetate extract of the leaves (EAF) presented the
highest antioxidant potential [EC
50
= 9.76 ± 0.42 µg/mL (quartz cuvette) and EC
50
= 19.87 ±
0.31 µg/mL (microplate)]. The toxicity of the extracts was verified by bioassays with
microcrustacea A. salina and expressed in percentual mortality of nauplius. Qualitative
analysis of anticholinesterase activity was performed according to the method of Ellman
(modified), presenting negative results. The antitumor activity was evaluated against four cell
lines (leukemia, breast, colon and glioblastoma) using colorimetric analysis method based on
conversion of salt 3-(4,5-dimethyl-2-thiazole)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazonium bromide (MTT)
into blue formazam by the method of Mossman. The best results were observed for the ethyl
acetate extracts, especially for cells HCT-8 (colon) that ranged from 58.35 to 77.12%. The
ethyl acetate extract obtained from thick branches (EAGg) showed values of IC
50
= 13.73
µg/mL for strain HL-60 (leukemia). This extract was fractionated and the fraction EAGg5
showed the percentage of cell growth inhibition of 85.37 and 101.37% for the lines SF-295
(glioblastoma) and MDAMB-435 (breast), respectively. The antimicrobial activity was
conducted using the minimum inhibitory concentration (MIC) that was determined by
microdilution in Mueller-Hinton broth for bacteria (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa) and in liquid Sabouraud for fungi (Candida
albicans, C. tropicalis and C. parapsilosis). All extracts showed some degree of bacterial and
fungicidal activity, especially the ethyl acetate extracts which showed moderate inhibition of
microbial growth. The effect of extracts on growth of protozoa in vitro study was evaluated
with promastigotes of Leishmania amazonensis and epimastigotes of Trypanosoma cruzi.
EAGg extract showed antiproliferative activity against both L. amazonensis and T. cruzi, with
IC
50
values of 86 and 40 µg/mL, respectively. The significant antioxidant, antitumor and
antimicrobial activities observed in the extracts of cupiuba detaches its high potential for
obtaining of biotechnological products.
Keywords: G. glabra, Goupiaceae, biological activities, catechol
xi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS xiii
LISTA DE TABELAS xv
LISTA DE ESQUEMAS xvii
LISTA DE GRÁFICOS xviii
LISTA DE ESPECTROS xix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS xx
1. INTRODUÇÃO 1
2. OBJETIVOS 5
2.1. GERAL
6
2.2. ESPECÍFICOS
6
3. REVISÃO DA LITERATURA 7
3.1. A FAMÍLIA GOUPIACEAE E O GÊNERO Goupia
8
3.2 A ESPÉCIE Goupia glabra AUBLET
8
3.2.1. Aspectos botânicos
8
3.2.2. Distribuição geográfica
11
3.2.3. Etnobotânica
11
3.2.4. Química e Atividade biológica
12
3.3. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE PLANTAS
14
3.3.1 Doenças relacionadas ao estresse oxidativo
16
3.4. SUBSTÂNCIAS FENÓLICAS
18
3.4.1. Biossíntese
19
3.5. ESTERÓIDES
22
3.5.1. Biossíntese
23
3.6. DOENÇAS INFECCIOSAS
27
3.7.DOENÇAS PARASITÁRIAS
27
3.7.1. Leishmaniose
28
3.7.2. Doença de Chagas
29
3.8. CÂNCER
30
3.8.1. PRODUTOS NATURAIS ANTINEOPLÁSICOS
31
4. MATERIAIS E MÉTODOS 33
4.1. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
34
xii
4.1.1. Reagentes e testes de identificação
34
4.2. MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS
35
4.2.1. Espectrometria de absorção no infravermelho
35
4.2.2. Ressonância Magnética Nuclear
35
4.3. PONTO DE FUSÃO
35
4.4. COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL BOTÂNICO
36
4.5. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS ORGÂNICOS
36
4.6. PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA
37
4.6.1. Fenólicos e taninos
37
4.6.2. Antocianinas, antocianidinas e flavonóides
37
4.6.3. Leucoantocianidinas, catequinas e flavanonas
38
4.6.4. Flavanóis, flavanonas, flavononóis e xantonas
38
4.6.5. Esteróides e triterpenos
39
4.6.6. Alcalóides
39
4.7. ENSAIO DE LETALIDADE SOBRE Artemia salina LEACH
40
4.7.1. Procedimento
40
4.8. DETERMINAÇÃO DE FENÓLICOS TOTAIS
41
4.8.1. Ensaio qualitativo
41
4.8.2. Quantificação de fenólicos totais
42
4.8.2.1. Procedimento
43
4.9. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
44
4.9.1. Ensaio qualitativo
44
4.9.2. Ensaio quantitativo utilizando cubeta de quartzo
45
4.9.2.1. Amostras
46
4.9.2.2. Controle e branco da amostra
46
4.9.2.3. Procedimento
46
4.9.3. Ensaio quantitativo utilizando microplaca
48
4.10. ATIVIDADE INIBIDORA DE ACETILCOLINESTERASE
49
4.11. ATIVIDADE CITOTÓXICA EM CÉLULAS TUMORAIS
50
4.11.2. Procedimento
50
4.11.2.1. Varredura inicial
50
4.11.2.2. Determinação da CI
50
52
4.12. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E ANTIFÚNGICA
53
xiii
4.12.1. Procedimento para atividade contra bactérias
54
4.12.2. Procedimento para atividade contra fungos leveduriformes
55
4.13. ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA
55
4.13.1. Metodologia para Leishmania amazonensis
56
4.13.2. Metodologia para Trypanosoma cruzi
56
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 57
5.1. EXTRATOS
58
5.2. PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA
59
5.3. ENSAIO DE TOXICIDADE SOBRE Artemia Salina LEACH
60
5.4. AVALIAÇÃO QUALITATIVA DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
61
5.5. AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
65
5.5.1. Correlação entre a quantidade de compostos fenólicos e a CE
50
66
5.6. ATIVIDADE INIBIDORA DE ACETILCOLINESTERASE
69
5.7. ATIVIDADE CITOTÓXICA EM CÉLULAS TUMORAIS
70
5.8. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E ANTIFÚNGICA
74
5.8.1. Atividade antibacteriana
74
5.8.2. Atividade antifúngica
75
5.9. ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA
77
5.10. RESUMO DAS ATIVIDADES OBSERVADAS
78
5.11. FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS E FRAÇÕES
81
5.11.1. Extrato de folhas obtido em Hexano (EHF)
81
5.11.1.1 Identificação de EHF5H7/2-4-2D
84
5.11.2. Extrato de folhas obtido em Acetato de etila (EAF)
95
5.11.2.1. Identificação de EAF4F3
98
5.11.3. Extrato de galhos grossos obtido em Acetato de etila (EAGg)
107
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 108
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 111
xiv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Tora (a) e casca (b) de Goupia glabra
9
FIGURA 2. Folhas frescas (a), folha seca (b) e flores (c) de Goupia glabra
9
FIGURA 3. Aspectos morfológicos de Goupia glabra
10
FIGURA 4. Distribuição geográfica de Goupia glabra
11
FIGURA 5. Derivados de tropolona isolados de folhas de Goupia glabra
12
FIGURA 6. Compostos isolados de folhas de Goupia glabra
13
FIGURA 7. Estruturas de: (1) Ácido elágico, (2) Ácido ascórbico, (3) Rutina e (4)
Quercetina
15
FIGURA 8. Exemplo de padrão de oxigenação típicos das vias metabólicas
20
FIGURA 9. Exemplo da biossíntese de fenólicos oriundos da via do acetato
20
FIGURA 10. Formação do ácido chiquímico
21
FIGURA 11. Estruturas do cicloartenol e lanasterol
22
FIGURA 12. Estruturas de β-sitosterol, estigmasterol e campesterol
23
FIGURA 13. Estruturas do isopreno e das duas unidades precursoras dos terpenóides
(DMPP e IPP)
23
FIGURA 14. Esquema de formação das unidades precursoras dos terpenóides.
24
FIGURA 15. Estrutura do esqualeno (precursora dos triterpenos)
25
FIGURA 16. Conformações do epóxido de esqualeno
26
FIGURA 17. Formação do cicloartenol (plantas)
26
FIGURA 18. Estruturas de vimblastina, vincristina, etoposida, teniposida e taxol
32
FIGURA 19. Separação do material vegetal de Goupia glabra em folhas, galhos finos e
galhos grossos
36
FIGURA 20. Reação do ácido gálico com molibdênio, presente no reagente de Folin
Ciocalteau
42
FIGURA 21. Perda da coloração púrpura do radical DPPH
•
44
FIGURA 22. Reação química do radical DPPH
•
formando DPPH-H
44
FIGURA 23. Redução do MTT por enzimas mitocondriais
52
FIGURA 24. Exemplo de uma leitura de experimento de MIC, após o período de
incubação
54
FIGURA 25. Avaliação preliminar da atividade antioxidante em CCD. a) antes do teste;
b) após borrifar solução de FeCl
3
; c) após borrifar solução de DPPH
61
xv
FIGURA 26. Avaliação antioxidante qualitativa dos extratos em Hexano eluídos em
Hex/AcOEt (8:2). a) antes do teste; b) após borrifar solução de FeCl
3
; c) após borrifar
solução de DPPH
63
FIGURA 27. Avaliação antioxidante qualitativa dos extratos em AcOEt eluídos em
Hex/CHCl
3
/AcOEt (5:2:5). a) antes do teste; b) após borrifar solução de FeCl
3
; c) após
borrifar solução de DPPH
63
FIGURA 28. Avaliação antioxidante qualitativa dos extratos em MeOH eluídos em
CHCl
3
/Metanol (7:3). a) após borrifar solução de FeCl
3
; b) após borrifar solução de
DPPH
64
FIGURA 29. CCD das frações EHF5H7/2-4-2D e EHF5H7/2-4-2E, eluída em:
Hex/CHCl
3
/Acetona e revelada com sulfato cérico/ácido sulfúrico
82
FIGURA 30. Estruturas de β-sitosterol, estigmasterol e campesterol
86
FIGURA 31. Estrutura do catecol
101
FIGURA 32. CCD dos extratos de média polaridade (AcOEt). Presença de catecol
evidenciada. [Eluente: Hex/CHCl
3
/AcOEt (5:2:5); Revelador: solução de FeCl
3
]
104
FIGURA 33. Provável rota biossintética de catecol
105
xvi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Nomes populares de Goupia glabra
11
TABELA 2. Descrição das possíveis características observadas no teste de fenólicos e
taninos
37
TABELA 3. Colorações indicativas da presença de antocianinas, antocianidinas, e
flavonóides
38
TABELA 4. Colorações indicativas da presença de leucoantocianidinas, catequinas e
flavanonas
38
TABELA 5. Colorações indicativas da presença de esteróides e triterpenóides
39
TABELA 6. Extratos de Goupia glabra
58
TABELA 7. Resultado da prospecção fitoquímica dos extratos de cupiúba
59
TABELA 8. Mortalidade (%) de larvas de A. salina (500 µg de extrato por mL) dos
extratos de cupiúba
60
TABELA 9. Resultado do ensaio qualitativo de compostos fenólicos e atividade
antioxidante
65
TABELA 10. Resultado da quantificação de compostos fenólicos e atividade
antioxidante
66
TABELA 11. Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em
três linhagens tumorais testadas na dose única de 50 µg/ml
70
TABELA 12. Atividade citotóxica em linhagens de células tumorais humanas,
realizado pelo Teste do MTT, após 72 horas de incubação. A tabela apresenta os
valores de CI
50
em µg/mL e o intervalo de confiança de 95% (IC 95%)
71
TABELA 13. Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das frações de
EAGg em três linhagens tumorais testadas na dose única de 25 µg/mL. Valores são
média ± DPM (Desvio padrão da média)
72
TABELA 14. Atividade antibacteriostática e antibactericida de extratos de Goupia
glabra
74
TABELA 15. Atividade antifungiostática e antifungicida de extratos de Goupia glabra
75
TABELA 16. Atividade antiparasitária de extratos de Goupia glabra
77
TABELA 17. Atividades observadas para os extratos de G. glabra
79
TABELA 18. Resultados experimentais de RMN de
1
H (δ em ppm, CDCl
3
, 500MHz)
para os esteróides β-sitosterol e estigmasterol comparados com a literatura
xvii
(FACUNDO et al., 2008).
87
TABELA 19. Resultados experimentais de RMN de
13
C (δ em ppm, CDCl
3
, 125MHz)
para os esteróides β-sitosterol e estigmasterol comparados com a literatura (KOJIMA
et al., 1990).
91
TABELA 20. Resultados experimentais de RMN de
13
C (δ em ppm, CDCl
3
, 125MHz)
para o campesterol comparados com a literatura (WRIGHT et al., 1978).
92
TABELA 21. Comparação entre os sinais observados para catecol e dados encontrados
na literatura (JEONG et al., 2009)
101
xviii
LISTA DE ESQUEMAS
ESQUEMA 1 - Procedimento para ensaio qualitativo de compostos fenólicos
41
ESQUEMA 2 - Procedimento de quantificação de compostos fenólicos
43
ESQUEMA 3 - Procedimento para ensaio qualitativo da atividade antioxidante
45
ESQUEMA 4 - Procedimento para ensaio quantitativo da atividade antioxidante em
cubeta
46
ESQUEMA 5 - Procedimento para preparo do controle, amostra (padrão ou extrato) e
branco da amostra
47
ESQUEMA 6 - Procedimento para ensaio quantitativo da atividade antioxidante em
microplaca
48
ESQUEMA 7 - Procedimento para ensaio qualitativo da atividade inibidora de
acetilcolinesterase
49
ESQUEMA 8 - Ensaio de citotoxidade pelo método MTT
51
ESQUEMA 9 – Fracionamento do extrato em hexano de folhas (EHF)
83
ESQUEMA 10 – Fracionamento do extrato em AcOEt de folhas (EAF)
96
ESQUEMA 11. Fracionamento da fração EAF4G
97
ESQUEMA 12 – Fracionamento do extrato em AcOEt dos galhos grossos (EAGg)
107
xix
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1. Mortalidade (%) de larvas de A. salina (500 µg de extrato por mL) dos
extratos de cupiúba
60
GRÁFICO 2. Correlação positiva entre a quantidade de compostos fenólicos e a
atividade antioxidante (cubeta) dos extratos de cupiúba
67
GRÁFICO 3. Correlação entre a quantidade compostos fenólicos e a atividade
antioxidante (microplaca) de todos os extratos de cupiúba
67
GRÁFICO 4. Correlação positiva entre a quantidade compostos fenólicos e a atividade
antioxidante (microplaca) dos extratos de cupiúba, com exceção do extrato EMGg
68
xx
LISTA DE ESPECTROS
ESPECTRO 1. Espectro de IV de EHF5H7/2-4-2D
85
ESPECTRO 2. RMN
1
H (δ em ppm, CDCl
3
e 500MHz) de EHF5H7/2-4-2D
88
ESPECTRO 3. RMN
13
C (δ em ppm, CDCl
3
e 125MHz) de EHF5H7/2-4-2D
89
ESPECTRO 4. RMN
13
C (DEPT, δ em ppm, CDCl
3
e 125MHz) de EHF5H7/2-4-2D
90
ESPECTRO 5. Espectro de IV de EAF4F3
98
ESPECTRO 6. Espectro de RMN de
1
H (δ em ppm, CDCl
3
e 500MHz) de EAF4F3
99
ESPECTRO 7. Espectro de RMN de
13
C (δ em ppm, CDCl
3
e 125MHz) de EAF4F3
100
ESPECTRO 8. Expansão de HSQC de EAF4F3
102
ESPECTRO 9. Expansão de HMBC de EAF4F3
103
xxi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Abs
Absorbância
AcOEt
Acetato de etila
CC
Cromatografia em coluna
CCD
Cromatografia em camada delgada
CHCl
3
Clorofórmio
CL
50
Concentração letal para o crescimento de 50%
CE
50
Concentração do extrato necessária para decrescer a concentração inicial
de DPPH em 50%.
DMSO
Dimetil-sulfóxido
DPPH
2,2-difenil-1-picrilhidrazil
EAF
Extrato em acetato de etila das folhas
EAGf
Extrato em acetato de etila dos galhos finos
EAGg
Extrato em acetato de etila dos galhos grossos
EHF
Extrato em hexano doas folhas
EHGf
Extrato em hexano dos galhos finos
EHGg
Extrato em hexano dos galhos grossos
EMF1
Extrato em metanol das folhas (1)
EMF2
Extrato em metanol das folhas (2)
EMGf
Extrato em metanol dos galhos finos
EMGg
Extrato em metanol dos galhos grossos
EtOH
Etanol
FeCl
3
Cloreto férrico
HCT-8
Linhagem tumoral de cólon-humano
Hex
Hexano
HL-60
Linhagem tumoral de leucemia-humano
CI
50
Concentração que inibe o crescimento de 50% dos parasitas
MDA-MB435
Linhagem tumoral de mama-humano
MeOH
Metanol
MH
Müller-Hinton
CIM
Concentração inibitória mínima
CBM
Concentração bactericida mínima
xxii
CFM
Concentração fungicida mínima
min
Minuto
mL
Mililitro
MTT
3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazólio
NaHCO
3
Bicarbonato de sódio
SF-295
Linhagem tumoral de glioblastoma-humano
SOD
Superóxido dismutase
UV-Vis
Ultravioleta-Visível
µg/mL
Micrograma por mililitro
µL
Microlitro
1
1. INTRODUÇÃO
2
O Brasil possui entre 15 e 20% de toda a biodiversidade mundial, sendo considerado o
maior país em número de espécies endêmicas. Abriga cerca de 60.000 espécies vegetais, o
que corresponde a cerca de 20% de toda flora mundial e não menos de 75% de todas as
espécies existentes nas grandes florestas. Toda essa biodiversidade é considerada uma fonte
de substâncias biologicamente ativas e sua preservação é fundamental tanto pelo valor
intrínseco dessa imensa riqueza biológica como pelo seu enorme potencial como fonte de
novos fármacos (GARCIA, 1995; BARREIRO, 2009).
O uso de plantas como medicamentos pela humanidade é muito antigo. A busca por
alívio e cura de doenças talvez tenha sido uma das primeiras formas de utilização de produtos
naturais (VIEGAS JR et al., 2006). Cerca de 80% da população dos países subdesenvolvidos
e em desenvolvimento continuam completamente dependentes da medicina caseira utilizando
vegetais para as necessidades primárias de saúde. Estima-se que aproximadamente 74% dos
medicamentos derivados de plantas foram desenvolvidos através de orientação baseada em
resultados revelados pela medicina popular (BRAZ-FILHO, 2010).
Apesar do aumento de estudos na área de produtos naturais, estima-se que apenas de
5-15% das cerca de 250.000 espécies de plantas existentes no planeta foram investigadas
(BRAZ-FILHO, 2010). Apenas 8% das espécies brasileiras foram estudadas em busca de
compostos bioativos, sendo que 1100 espécies vegetais foram avaliadas em suas propriedades
medicinais (SIMÕES et al., 1999).
Mais especificamente, as plantas de origem amazônica despertam grande interesse por
parte da comunidade científica com relação à sua utilização para fins medicinais, o que exige
o conhecimento das características das drogas delas originadas, incluindo sua morfologia,
composição química, propriedades farmacológicas e controle de qualidade (SIMÕES et al.,
1999).
3
Uma das estratégias mais comuns para a investigação de plantas medicinais é a
abordagem etnofarmacológica que consiste em combinar informações adquiridas junto a
comunidades locais que fazem uso da flora medicinal com estudos fitoquímicos e
farmacológicos realizados em laboratórios especializados. Esse tipo de seleção de espécies
vegetais constitui um valioso atalho para a descoberta de novos fármacos, que não pode ser
ignorado ou desprezado (KOEHN et al., 2005; BRAZ-FILHO, 2010).
A comparação de resultados obtidos através da coleta de plantas ao acaso ou
quimiotaxonomicamente orientadas, com aqueles obtidos baseados no uso em medicina
popular, demonstrou que o conhecimento tradicional é indicativo de espécies que acumulam
compostos bioativos (SIMÕES et al., 1999).
A busca por medicamentos para a cura das doenças endêmicas parasitárias, também
chamadas “doenças negligenciadas”, tais como: malária, doença de Chagas, esquitossomose e
leishmanioses, é de extrema importância (FUNARI & FERRO, 2005). Principalmente em
países em desenvolvimento como o Brasil, onde a incidência dessas doenças é elevada, o
repertório de fármacos utilizados é limitado e inadequado e a indústria farmacêutica pouco se
interessa para o desenvolvimento de novas drogas com essa finalidade, pois não há
perspectiva de retorno financeiro suficiente (DIAS et al., 2009). Das 1300 novas drogas
introduzidas no mercado entre 1975 e 1999, apenas 13 tiveram aplicação em doenças tropicais
(PINK et al., 2005).
As plantas têm sido utilizadas tradicionalmente para o tratamento de doenças
parasitárias e a fitoterapia tem recebido atenção considerável na busca de substâncias
alternativos com atividade antiparasitária (TEMPONE et al,. 2005; KVIST et al., 2006;
BRAGA, et al., 2007)
A relevância das pesquisa com produtos naturais, a fim de fornecer alternativas
terapêuticas mais eficientes e seguras, proporciona a descoberta de novos fármacos e o estudo
4
de plantas que apresentem substâncias que possam agir sobre as diferentes espécies oxidantes
geradas em nosso organismo, torna-se de grande importância para patologias nas quais as
espécies reativas do oxigênio (ERO's) são fatores determinantes. O estresse oxidativo tem
sido relacionado a um grande número de doenças degenerativas, inflamatórias, neurológicas,
oculares, pulmonares, doenças do coração, câncer e no processo de envelhecimento
(BARREIROS et al., 2006; CERQUEIRA et al., 2007; VELLOSA et al., 2007).
Algumas classes de compostos fenólicos, como flavonóides e taninos, atuam tanto
como antioxidantes (seqüestrando radicais livres) como também no combate a
microorganismos, o que tem tornado importante o estudo em conjunto das propriedades
antioxidantes e antimicrobianas de frações e extratos de plantas (CABRAL et al., 2009;
PERES et al., 2009).
5
2. OBJETIVOS
6
2.1. GERAL
• Realizar o estudo fitoquímico e avaliar as atividades biológicas de extratos de Goupia
glabra Alblet.
2.2. ESPECÍFICOS
• Descrever a composição química de extratos bioativos de Goupia glabra Aublet por
meio de métodos espectrométricos e espectroscópicos (IV, RMN
1
H e
13
C uni e
bidimensionais).
• Realizar análises pelos métodos colorimétricos de quantificação de fenólicos totais e
atividade seqüestradora do radical DPPH para verificação de atividade antioxidante
dos extratos da espécie selecionada.
• Realizar testes de inibição de acetilcolinesterase dos extratos de G. glabra.
• Realizar testes biológicos in vitro com extratos e/ou frações, visando a avaliação da
letalidade em Artemia salina.
• Realizar testes farmacológicos in vitro com extratos e/ou frações, visando a avaliação
da atividade citotóxica contra quatro linhagens de células tumorais (mama, cólon,
sistema nervoso central e leucemia).
• Realizar testes farmacológicos in vitro com extratos e/ou frações, visando a avaliação
da atividade antimicrobiana contra quatro bactérias (Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis), três fungos (Candida albicans,
C. tropicalis e C. parapsilosis) e dois protozoários (Leishmania amazonensis e
Trypanosoma cruzi).
7
3. REVISÃO DA LITERATURA
8
3.1. A FAMÍLIA GOUPIACEAE E O GÊNERO Goupia
A família Goupiaceae Miers possui apenas o gênero Goupia (MIERS, 1860). Este
gênero possui três espécies: Goupia glabra Aublet, G. cinerascens Poepp. ex Baill e G.
guatemalenses Lundel (LACOSTE & ALEXANDRE, 1991).
Anteriormente, o gênero Goupia era incluído na família Celastraceae, embora fosse
bem diferente dos demais gêneros dessa família (LACOSTE & ALEXANDRE, 1991). Após
estudos filogenéticos e morfológicos, o gênero foi excluído por ser atípico a essa família. Os
novos dados revelaram que Goupia é mais estreitamente relacionado com as famílias
Corynocarpaceae e Linaceae (SIMMONS et al., 2001). Em um estudo fitoquímico preliminar,
observou-se que os derivados isolados de Goupia glabra (ácidos vanílico e cinâmico, 4-
hidroxibenzaldeído, blumenol A e esqualeno) são diferentes dos metabólitos comumente
isolados de Celastraceae (terpenos, flavonóides e taninos), o que corrobora com a exclusão de
Goupia dessa família (MESA-SIVERIO et al., 2003; BRINKER et al., 2007; MARIOT &
BARBIERI, 2007).
3.2. A ESPÉCIE Goupia glabra AUBLET
3.2.1. Aspectos Botânicos
A espécie G. glabra foi descrita pela primeira vez em 1775, por Aublet, e possui as
sinonímias: Glossopetalum glabrum Gmel., Goupia paraensis Huber e G. tomentosa Aubl.,
sendo a última sinonímia correspondente à sua forma jovem (LACOSTE & ALEXANDRE,
1991; SMIDERLE & SCHWENGBER, 2005).
As árvores desta espécie possuem grande porte, tronco retilínio e cilíndrico, podendo
alcançar até 130 cm de diâmetro; a base é reta e a casca fina e acinzentada (FIGURA 1). A
madeira é pesada, com cerne de coloração castanho-amarelada ou bege-clara passando a
castanho-avermelhada. Sua altura varia de 10 à 40 m e possui copa piramidal. A árvore é
9
indicada para arborização e reflorestamentos, pois apresenta rápido crescimento e tolerância à
luz direta (SMIDERLE & SCHWENGBER, 2005; SILVA, 2006).
A madeira possui resistência mecânica média e boa maleabilidade, sendo fácil de
trabalhar e polir. Apresenta moderada resistência a fungos, aos cupins e ao apodrecimento,
sendo muito utilizada na indústria madeireira (FIGURA 1). O cheiro desagradável da madeira
lembra o cheiro de cupim e deu origem ao nome popular: “cupiúba” (SILVA, 2006).
FIGURA 1. Tora (a) e casca (b) de Goupia glabra
FONTE: www.inpa.gov.br/madeiras/tipos_madeira/images.php?Id=21
As folhas são simples e brilhantes, coriáceas, ovaladas com pecíolos dispostos
alternadamente (FIGURA 2a), medindo de 5 a 13 cm de comprimento e 1,5 a 4 cm de
largura, sendo facilmente reconhecíveis no chão, ao redor da árvore, por adquirirem a
coloração negra, em conseqüência de processo natural de oxidação (FIGURA 2b) (SILVA,
2006).
FIGURA 2. Folhas frescas (a), folha seca (b) e flores (c) de Goupia glabra
FONTE:
a
OLIVEIRA, P.A.;
b
SILVA, 2006;
c
RIBEIRO, 1999.
As flores são hermafroditas, muito pequenas e dispostas em inflorencências do tipo
umbrelas (FIGURA 2c). O fruto é tipo uma baga glabrosa que mede 1-7 mm de diâmetro,
10
apresenta uma coloração inicial verde, tornando-se amarela, vermelha e finalmente preta. As
sementes, em número de 1 a 5 por fruto, são amarelo escuras, albuminosas, oleaginosas,
medem cerca de 1,5 mm de comprimento e 1 mm de largura. Os ramos e folhas novas são
completamente cobertos de pêlos (FIGURA 3), tornando-se glabros somente mais tarde, o que
deu origem ao nome científico (SMIDERLE & SCHWENGBER, 2005).
FIGURA 3. Aspectos morfológicos de Goupia glabra
FONTE: www.plantsystematics.org/imgs/ws1/r/goupiaceae_goupia_glabra_21040.html
11
3.2.2. Distribuição geográfica
A espécie ocorre na região amazônica, abrangendo o Brasil, Guiana Francesa,
Suriname, Venezuela, Colômbia, Peru e Panamá. No Brasil, foi encontrada nos estados do
Amazonas, Pará, Maranhão, Mato Grosso e Rondônia (FIGURA 4) (SMIDERLE &
SCHWENGBER, 2005; SILVA, 2006).
FIGURA 4. Distribuição geográfica de Goupia glabra
FONTE: www.gbif.org
3.2.3. Etnobotânica
Essa espécie é conhecida por vários nomes populares de acordo com a região que é
encontrada (TABELA 1).
TABELA 1. Nomes populares de Goupia glabra
País* Nomes populares*
Brasil
cupiúba, cupiúba-rosa, cupiúva, cutiúba, cachaceiro, louro-bobó, peniqueiro,
peroba-do-norte
Colômbia saino, sapino
Guianas cabacalli, copie, cupi, couepi, goupi, koepi, koepie
Peru capricórnia, muena rifarillo
Suriname kopi
Venezuela pilon
*RIBEIRO, 1999; MESA-SIVERIO, 2003; SMIDERLE & SCHWENGBER, 2005; SILVA, 2006
12
A casca da árvore é popularmente utilizada como analgésico dentário (LACOSTE &
ALEXANDRE, 1991; RIBEIRO, 1999; SILVA, 2006), como vermífugo e no tratamento de
malária, catapora e eczema (DEFILIPPS et al., 2004).
As folhas são utilizadas para o tratamento de sífilis e enxaqueca (DEFILIPPS et al.,
2004). O sumo das folhas jovens é utilizado externamente para tratar cegueira, causada pela
catarata e no tratamento de varíola, também podendo ser utilizada como um cicatrizante
quando aplicada na pele (LOPEZ et al., 2001).
Na região da Amazônia Peruana, a planta também é utilizada pelos habitantes locais
no tratamento de doenças oculares (MESA-SIVERIO et al., 2003).
3.2.4. Química e Atividade biológica
Em um trabalho realizado por Mesa-Siverio e colaboradores (2003), foram isolados
dois derivados de tropolona denominados de Goupiolona A e Goupiolona B (FIGURA 5) de
um extrato em etanol de folhas de G. glabra.
FIGURA 5. Derivados de tropolona isolados de folhas de Goupia glabra
Essas duas substâncias se comportam como genotoxinas, ou seja, induzem a letalidade
de células, produzindo lesões de DNA genômico, o que sugere que essas moléculas têm
potencial para serem utilizadas como drogas anti-câncer (MESA-SIVERIO et al., 2003).
13
Tropolonas e benzotropolonas são compostos aromáticos freqüentemente isolados de
fungos e, raramente, isolados de plantas superiores. Algumas substâncias que contêm um
núcleo tropolona exibem atividade antimalárica (REN et al., 2001), antitumoral (YAMATO et
al., 1992), e existem vários relatos em artigos que descrevem a preparação de derivados de
tropolona e suas correspondentes avaliações biológicas (YAMATO et al., 1992;
TAMBURLIN-THUMIN et al., 2001).
No estudo fitoquímico realizado por Mesa-Siverio e colaboradores (2003) também
foram isoladas substâncias já conhecidos como o esqualeno, 4-hidroxibenzaldeído, ácido
cinâmico, ácido vanílico, clorofila b, e blumenol A (FIGURA 6).
FIGURA 6. Compostos isolados de folhas de Goupia glabra
Esse estudo apóia a mudança de gênero para Goupia, como relatado por Simmons e
colaboradores (2001), pois o perfil dos metabólitos de G. glabra não se relaciona com os
compostos habituais presentes na família Celastraceae que são terpenos (sesquiterpenos,
diterpenos e principalmente triterpenos), flavonóides e taninos (BRINKER et al., 2007;
MARIOT & BARBIERI, 2007).
14
3.3. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE PLANTAS
A oxidação é parte fundamental da vida anaeróbica e do nosso metabolismo e, assim,
os radicais livres são produzidos naturalmente ou por alguma disfunção biológica. Esses
radicais livres cujo elétron desemparelhado encontra-se centrado nos átomos de oxigênio ou
nitrogênio são denominados ERO (espécies reativas de oxigênio) ou ERN (espécies reativas
de nitrogênio), respectivamente. Espécies reativas incluem não só os radicais (O
2•-
,
•
OH,
NO
•
), mas também intermediários neutros ou carregados (H
2
O
2
, ONOO
-
) e outras espécies
capazes de formar radicais livres no organismo humano (
1
O
2
, O
3
, Fe, Cu). O excesso de
radicais livres no organismo é combatido em parte por macro e micromoléculas de origem
endógena ou obtidas diretamente da dieta, que são denominadas antioxidantes (BARREIROS
et al., 2006; DE OLIVEIRA et al., 2009).
De forma geral, denominam-se antioxidantes as substâncias que presentes em
concentrações baixas, comparadas ao substrato oxidável, retardam significativamente ou
inibem a oxidação do substrato. Os radicais formados a partir de antioxidantes não são
reativos para propagar a reação em cadeia, sendo neutralizados por reação com outro radical,
formando produtos estáveis ou podem ser reciclados por outro antioxidante (SOUSA et al.,
2007).
Os dois principais meios de defesa antioxidante do organismo podem ser divididos em
dois grupos: enzimáticos e não enzimáticos. A proteção antioxidante enzimática baseia-se
quase que exclusivamente na decomposição de ânion superóxido (O
2•-
) pela superóxido
dismutase (SOD) ou dismutação de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) pelas enzimas catalase e
peroxidase. A proteção antioxidante não-enzimática é feita por micromoléculas, dentre as
quais as mais utilizadas são: os tocoferóis, como a vitamina E; o ácido arcórbico (vitamina C);
polifenóis e carotenóides, como o β-caroteno (pró-vitamina A) (ROVER JÚNIOR et al.,
2001; BARREIROS et al., 2006).
15
Em artigo recente, De Oliveira e colaboradores (2009), apresentam ampla revisão
bibliográfica da capacidade antioxidante de produtos de origem vegetal, como frutas
sementes, cereais, óleos e plantas aromáticas.
Entre os principais antioxidantes derivados de plantas destacam-se o ácido ascórbico
(vitamina C), flavonóides como rutina e quercetina, derivados do ácido cinâmico e outros
compostos polifenólicos, como o ácido elágico (FIGURA 7) (GIL et al., 2005).
FIGURA 7. Estruturas de: (1) Ácido elágico, (2) Ácido ascórbico, (3) Rutina e (4) Quercetina
O ácido ascórbico (Vitamina C) é amplamente utilizado como antioxidante,
nutracêutico e cosmecêutico. Atualmente, é muito estudado no tratamento do câncer, pois
acredita-se que estimule o sistema imune, iniba a formação de nitrosaminas e bloqueie a
ativação metabólica de carcinógenos (GIL et al., 2005; CERQUEIRA et al., 2007)
A rutina é comercializada no setor farmacêutico, com função antioxidante ou anti-
radical livre, no fortalecimento de vasos capilares, contra varizes, trombose e celulite (PAYE
et al., 2001; GIL et al., 2005).
16
O ácido elágico é utilizado na indústria farmacêutica como ingrediente ativo em
preparações para clareamento de pele (PAYE et al., 2001).
A quercetina tem efeitos na prevenção e no tratamento de doenças cardiovasculares,
câncer e insuficiência renal e hepática. É o principal flavonóide presente na dieta humana e
seu consumo diário estimado varia entre 50 e 500 mg, o que representa 95% do total de
flavonóides ingeridos (BEHLING et al., 2004).
3.3.1. Doenças relacionadas ao extresse oxidativo
O estresse oxidativo é definido como a situação na qual a formação de ERO e ERN
excedem significativamente a capacidade de defesa antioxidante e de reparo do organismo,
tendo como conseqüência o aumento de danos à biomoléculas (DNA, lipídios, proteínas).
Estes danos, quando não reparados, acabam comprometendo o funcionamento da célula e
levando-a à morte por apoptose ou necrose (BARBOSA et al., 2006). O estresse oxidativo
pode ocorrer em várias situações patológicas ou ambientais que aumentem a produção de
ERO e ERN e em conseqüência do consumo inadequado de antioxidantes derivados da dieta
(CERQUEIRA et al., 2007).
O estresse oxidativo agudo, bem como estresse oxidativo crônico, têm sido
relacionados a um grande número de doenças degenerativas, como aterosclerose, diabetes,
injúria isquêmica, doenças inflamatórias (artrite reumatóide, colite ulcerativa e pancreatite),
câncer, AIDS, doenças neurológicas (doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica,
doença de Alzheimer), hipertensão, doenças oculares (degeneração macular relacionada ao
envelhecimento e catarata), doenças pulmonares (asma e doença pulmonar obstrutiva
crônica), doenças do coração e no processo de envelhecimento, podendo ser a causa ou o fator
agravante do quadro geral (BARREIROS et al., 2006; CERQUEIRA et al., 2007).
Todos os tecidos humanos sofrem lesões oxidativas, porém, por diversas razões, o
sistema nervoso central (SNC) é especialmente sensível. Primeiramente, porque possui
17
capacidade reduzida de regeneração celular, já que os neurônios de um indivíduo adulto são
células pós-mitóticas, ou seja, não se replicam mais. A morte de neurônios induzida por
toxinas ou pelo processo normal de envelhecimento pode causar sérios comprometimentos ao
sistema nervoso. Em segundo lugar, porque o consumo de oxigênio pelo cérebro é muito
elevado, o que o torna mais propenso a danos causados por espécies oxidantes. Em humanos,
o cérebro é responsável por cerca de 20% do consumo total de O
2
, demanda necessária para
sustentar o elevado consumo de ATP pelos neurônios, para manter o potencial de membrana e
o fluxo de neurotransmissores (BARBOSA et al., 2006).
18
3.4. SUBSTÂNCIAS FENÓLICAS
Os compostos fenólicos possuem várias propriedades farmacológicas como:
antialergênica, antiinflamatória, antimicrobiana, anticarcinogênica, antitrombótica,
antioxidante, cardioprotetora e efeitos vasodilatadores (BALASUNDRAM et al., 2005;
WONG et al., 2006). Os polifenóis têm capacidade comprovada de doar hidrogênios e quelar
íons metálicos como o ferro e cobre, inibindo a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade
(LDL) (SOARES, 2002).
São os principais antioxidantes encontrados nas plantas, e se enquadram em diversas
categorias como fenóis simples, ácidos fenólicos (derivados de ácido benzóico e cinâmico),
cumarinas, flavonóides, estilbenos, taninos, lignanas e ligninas. No Brasil e recentemente na
região Amazônica, o interesse em antioxidantes polifenólicos derivados de plantas tem
aumentado notavelmente na última década, devido ao seu elevado poder de remoção de
radicais livres associados com várias doenças (SILVA et al., 2005; SOUSA et al., 2007).
A atividade antioxidante relacionada aos polifenóis deve-se principalmente às suas
propriedades redutoras e estrutura química, que permite a neutralização ou seqüestro de
radicais livres e/ou quelação de metais de transição, e é influenciada pelo número e posição
dos grupos hidroxila, assim como pelas posições de glicosilação. A ressonância do anel
aromático presente nestes compostos é a principal responsável pela formação de
intermediários estáveis após processo de redução dos radicais livres, bloqueando reações em
cadeia (BARREIROS et al., 2006; CERQUEIRA et al., 2007; SOUSA et al., 2007).
Os fenólicos são as substâncias antioxidantes mais abundantes da dieta, podendo
atingir um consumo diário de 1 g, o que é muito maior que o consumo de todos os outros
fitoquímicos classificados como antioxidantes. Apesar disso, pouco se conhece sobre suas
biodisponibilidades, e sua eficácia in vivo ainda precisa ser avaliada (CERQUEIRA et al.,
2007).
19
A quantificação espectrométrica de compostos fenólicos pode ser realizada por meio
de uma variedade de técnicas, todavia, a que utiliza o reagente de Folin-Ciocalteu figura entre
as mais extensivamente utilizadas (DE OLIVEIRA et al., 2009).
Recentes estudos têm revelado uma correlação positiva entre a atividade antioxidante e
a quantidade de compostos fenólicos presentes em plantas (PIZZOLATTI et al., 2007;
ASMAWI et al., 2008; PERES et al., 2009).
3.4.2. Biossíntese
Estruturalmente, substâncias fenólicas possuem pelo menos um grupo hidroxila ligado
diretamente a um anel benzênico. São amplamente encontrados na natureza e metabolizados
tanto pela via do acetato quanto pela via do ácido chiquímico (SOLOMONS & FRYHLE,
2002; DEWICK, 2002).
Os compostos fenólicos produzidos pela via do acetato são: antraquinonas, antranóis,
tetraciclinas, fenóis simples e canabinóides. Os compostos fenólicos produzidos pela via do
ácido chiquímico são: ácidos fenólicos, cumarinas, taninos, lignanas e ligninas. Também
existem compostos fenólicos da via mista acetato/chiquimato como: flavonóides e estilbenos
(DEWICK, 2002).
Os metabólitos aromáticos da via do ácido chiquímico podem ser facilmente
reconhecidos pela distribuição em carbonos consecutivos das funções oxigenadas do anel
aromático. Esse padrão de oxigenação difere do padrão dos derivados da via do acetato, os
quais têm as funções oxigenadas em átomos de carbono alternados (FIGURA 8) (LOBO &
LOURENÇO, 2007).
20
FIGURA 8. Exemplo de padrão de oxigenação típicos das vias metabólicas.
Na formação de compostos fenólicos pela via do acetato (FIGURA 9), o bloco
constituinte fundamental é o ácido acético sob a forma de acetil-CoA (acetil coenzima A) que
é o iniciador direto de todo o processo, mas o aumento subseqüente da cadeia realiza-se
através de um derivado, o Malonil-CoA, numa reação análoga à condensação de Claisen. Em
seguida, ocorre a ciclização através de uma reação tipo aldol, uma desidratação e a
aromatização (LOBO & LOURENÇO, 2007).
FIGURA 9. Exemplo de biossíntese de fenólicos oriundos da via do acetato.
Fonte: Dewick, 2002
21
O esquema biossintético para a formação do ácido chiquímico (FIGURA 10) envolve
a adição de uma molécula de fosfoenol piruvato (PEP) a um açúcar, a eritrose-4-fosfato, para
originar um derivado ácido com 7 carbonos, o desoxi-arabino-heptulosonato-fosfato. Essa
reação é uma reação tipo aldol, seguida de uma eliminação do grupo fosfato e adição à
carbonila para originar o ácido 3-desidroquínico. Em seguida forma-se o ácido 3-
desidrochiquímico através da eliminação sin de uma molécula de água. Para garantir a
eliminação estereoespecífica de um dos prótons quirais há o envolvimento de uma enzima.
Finalmente a redução da carbonila a álcool, através de NADPH, produz o ácido chiquímico
(LOBO & LOURENÇO, 2007).
FIGURA 10. Formação do ácido chiquímico. Fonte: Dewick, 2002
22
3.5. ESTERÓIDES
Os esteróides são triterpenóides modificados contendo o sistema de anéis tetracíclico
do lanosterol (fungos) ou cicloartenol (plantas) (FIGURA 11), mas sem os grupos metílicos
em C-4 e em C-14. Estudos recentes descrevem que os fitoesteróis são capazes de reduzir as
taxas de colesterol no plasma humano (KRITCHEVSKY & CHEN, 2005).
FIGURA 11. Estruturas do cicloartenol e lanasterol
Os principais esteróis em plantas, fungos e algas são caracterizados por apresentar
substituintes extras, com um ou dois carbonos, no carbono 24. Os esteróis de plantas
campesterol e sitosterol apresentam, respectivamente, uma metila e uma etila em C-24 na
estrutura análoga ao colesterol. Já o estigmasterol contém uma insaturação adicional na cadeia
lateral, entre os carbonos C-22 e C-23 (trans) (DEWICK, 2002).
Sitosterol, estigmasterol e campesterol (FIGURA 12) encontram-se na maioria das
vezes em mistura e por apresentarem propriedades físico-químicas semelhantes são de difícil
separação. Esses três esteróides são comumente observados em óleos de sementes, frutas e
vegetais (CORTEZ et al., 1998; ABIDI, 2001).
23
FIGURA 12. Estruturas de β-sitosterol, estigmasterol e campesterol
3.5.1 Biossíntese
A unidade básica dos terpenóides é o isopreno (C
5
). No entanto ele não está envolvido
na biossíntese destes compostos. Essas unidades C
5
são formadas a partir do difosfato de 3-3’-
dimetilalila (DMAPP) e o difosfato de 3-isopentenila (IPP) (FIGURA 13). Existem duas vias
metabólicas biossintéticas possíveis para a formação do DMAPP e do IPP: a via do
mevalonato (MVA) e a via do fosfato de deoxixilulose (DXP) (DEWICK, 2002).
FIGURA 13. Estruturas do isopreno e das unidades precursoras dos terpenóides (DMAPP e IPP)
A condensação cauda-cabeça entre as unidades DMAPP e IPP, catalisada pela enzima
prenil-transferase, forma a cadeia de difosfato de geranila (GPP), precursora dos
β-sitosterol estigmasterol
campesterol
24
monoterpenos. A condensação dessa cadeia em C
10
com novas unidades de IPP origina
sucessivamente as cadeia de difosfato de farnesila (C
15
), difosfato de geranilgeranila (C
20
) e
difosfato de geranilfarnesila (C
25
), precursoras de sesquiterpenos, diterpenos e sesterterpenos,
respectivamente. Por outro lado, a condensação de duas cadeias de difosfato de farnesila, e a
de duas cadeias de difosfato de geranilgeranila, formam cadeias de 30 e 40 carbonos,
precursoras dos triterpenos e dos tetraterpenos, respectivamente (FIGURA 14) (DEWICK,
2002; LOBO & LOURENÇO, 2007).
FIGURA 14. Esquema de formação das unidades precursoras dos terpenóides.
25
A biossíntese de fitoesteróides em células de plantas demonstra que as unidades
isoprênicas são fornecidas exclusivamente da via do MVA que está localizada no citoplasma.
Por outro lado, nos monoterpenos, diterpenos e tetraterpenos são predominantemente
biossintetizados pela via do DXP, descoberta recentemente, localizado no plastídeo (LOBO &
LOURENÇO, 2007; KONGDUANG et al., 2008).
A cadeia precursora dos triterpenos é o esqualeno (FIGURA 15). Sua cadeia de 30
carbonos é formada a partir da condensação cauda-cauda de duas unidades de difosfato de
farnesila (FPP) e envolve a enzima esqualeno sintase. Um intermediário desse processo é o
difosfato de pré-esqualeno. (LOBO & LOURENÇO, 2007).
FIGURA 15. Estrutura do esqualeno (precursor dos triterpenos)
A ciclização do esqualeno ocorre a partir do intermediário 2,3-epóxido de esqualeno,
um produto de oxidação enzimática que requer uma flavoproteína e NADPH que pode
assumir diferentes conformações como por exemplo: cadeira-cadeira-cadeira-barco e cadeira-
barco-cadeira-barco (FIGURA 16) (LOBO & LOURENÇO, 2007).
A clivagem do epóxido, na conformação cadeira-barco-cadeira-barco, por protonação
dá origem a uma ciclização concertada para formar os cátions protosteril. Uma seqüência de
deslocamentos de Wagner-Meerwein de hidretos e grupos metila origina uma série de
triterpenos tetracíclicos como o cicloartenol (plantas) (FIGURA 17) e lanasterol (animais)
(DEWICK, 2002).
26
FIGURA 16. Conformações do epóxido de esqualeno
O cicloartenol é o precursor dos fitoesteróis. Apesar de existirem esteróides isolados
de plantas que contêm o anel ciclopropano, na maioria dos casos dá-se a clivagem deste anel
que gera um grupo metila, como é o caso do β-sitosterol e do estigmasterol (amplamente
encontrados no reino vegetal) (CORTEZ et al., 1998; ABIDI, 2001).
FIGURA 17. Formação do cicloartenol (plantas). Fonte: Dewick, 2002
27
3.6. DOENÇAS INFECCIOSAS
Doenças infecciosas são a segunda maior causa de mortalidade no mundo. A
descoberta de novas substâncias com atividades antibacteriana e antifúngica constitui uma
necessidade urgente devido a vários fatores tais como: o aumento da incidência de novas e
reemergentes enfermidades infecciosas; altas taxas de resistência desenvolvida pelos
microorganismos aos antibióticos usados clinicamente; o decréscimo constante observado no
número de novos agentes antimicrobianos aprovados pelo FDA (Food and Drug
Administration); a necessidade de agentes que atuem por mecanismos de ação diferentes aos
fármacos em uso (ANTUNES, 2006; GUIMARÃES et al., 2010).
Atualmente, há apenas cerca de três antibióticos em estudos pré-clínicos Fase I, sendo
que estas substâncias são de amplo espectro para microorganismos Gram positivo ou para
infecções no trato respiratório. Para bactérias Gram negativo, o cenário é ainda mais
alarmante, pois não há nenhum composto com novo mecanismo de ação em ensaios pré-
clínicos (GUIMARÃES et al., 2010).
Nos últimos 10 anos os pesquisadores têm voltado atenção especial para fontes
naturais ainda pouco exploradas. Nesse contexto, as plantas podem contribuir na descoberta
de novos fármacos, pois é possível que produtos naturais antimicrobianos possam ser
biossintetizados para prevenir e/ou combater o ataque de micro-organismos patogênicos às
plantas (GUIMARÃES et al., 2010).
3.7. DOENÇAS PARASITÁRIAS
As doenças infecciosas parasitárias afetam milhões de pessoas nas diferentes regiões
geográficas mais pobres do planeta. Elas representam uma crescente ameaça nacional e
continuam sendo um obstáculo para o desenvolvimento social e econômico. A malária,
28
doença de Chagas, leishmaniose e esquitossomose, também conhecidas como “doenças
tropicais” são responsáveis por incapacitar anualmente uma fração significativa da população
de vários países em desenvolvimento (DIAS et al., 2009).
Para essas doenças não existem vacinas disponíveis e os fármacos são o centro de
controle. Contudo, o repertório de fármacos disponíveis é limitado e inadequado, e ocorre o
surgimento de resistência, efeitos colaterais e longo período de tratamento. Nesse panorama, a
prevenção, controle e tratamento dessas doenças representam um grande desafio mundial
(CALDERON et al., 2009; DIAS et al., 2009).
A falta de uma quimioterapia eficaz para a doença de Chagas e Leishmanioses, solicita
uma investigação ampla de compostos ativos, e dentre eles, os produtos naturais estão sendo
investigados com sucesso. Substâncias derivados de plantas continuam a fornecer estruturas
fundamentais e agentes terapêuticos para o tratamento de doenças causadas por protozoários
(TEMPONE et al., 2005).
3.7.1. Leishmaniose
A Leishmaniose compreende duas formas principais: Cutânea, que causa lesões na
pele, e Visceral, que afeta os órgãos internos do corpo, principalmente o fígado, o baço e a
medula óssea. A forma visceral é a forma mais grave, podendo causar morte se não for tratada
(BRAGA et al., 2007; CALDERON et al., 2009).
Cerca 350 milhões pessoas em aproximadamente 90 países do mundo estão expostas a
essa doença e entre 1,5 e 2 milhões de pessoas são infectadas por ano. No continente
americano, a leishmaniose ocorre no norte do México até o norte da Argentina, menos no
Chile, Uruguai e Canadá (CALDERON et al., 2009). Segundo a Organização Mundial de
Saúde, apenas três países apresentam 90% dos casos da doença no globo: Bolívia, Brasil e
29
Peru. Nas regiões Norte e Nordeste do Brasil estão concentrados 73% dos casos de
leishmaniose cutânea.
Antimoniais pentavalentes têm sido recomendados para o tratamento de leishmaniose
a mais de 50 anos. São conhecidos como drogas de primeira linha. Infelizmente o tratamento
com essas drogas provoca reações adversas e resistência ao parasita. Pentamidina e
Anfotericina B são usadas como segunda escolha no tratamento da doença e são chamadas
drogas de segunda linha. Todavia, o uso dessas drogas é limitado devido a sua toxicidade,
administração com supervisão e efeitos colaterais (BRAGA et al. 2007).
3.7.2. Doença de Chagas
A doença de Chagas, descoberta em 1909 pelo médico brasileiro Carlos Chagas, é um
dos principais problemas socioeconômicos enfrentados na América Latina. Esta doença,
causada pelo protozoário parasita Trypanossoma cruzi, afeta cerca de 18 milhões de pessoas
do sul dos Estados Unidos até a Patagônia, causando aproximadamente 50.000 mortes e
300.000 novos casos por ano (DIAS et al., 2009).
A transmissão da doença ocorre, principalmente, pelo vetor (80-90%), mas a
transfusão de sangue (5-20%) e as rotas congênitas (0,5-0,8%) representam um elevado risco
para a população (TEMPONE et al., 2005). Apesar dos avanços na compreensão da biologia
do T. cruzi, os únicos medicamentos disponíveis contra este organismo são: nifurtimox e
benzonidazol, que foram desenvolvidos por volta do inicio da década de 1970. Estes
compostos demonstraram resultados promissores na fase aguda da doença de Chagas (50-70%
de eficácia), e benzonidazol recentemente também tem demonstrado ser eficaz no início de
infecções crônicas, mas de eficácia limitada contra a doença já estabelecida na fase crônica
(<20% de eficácia). Os efeitos colaterais mais comuns de nifurtimox são perda de peso,
sonolência, náuseas, vômitos e cólicas intestinais. No caso do benzonidazol, os efeitos
30
colaterais podem ser agrupados de três formas: (i) manifestações de hipersensibilidade, como
erupção cutânea, edema periorbidal ou generalizado, febre, linfadenopatia, dores musculares e
articulares; (ii) depressão da medula óssea, incluindo neutropenia, agranulocitose e púrpura
trombocitopênica; e (iii) polineuropatia periférica, representada por parestesias e polineurite
(CROFT et al., 2005; DIAS et al., 2009).
3.8. CÂNCER
Pode-se considerar o câncer como uma doença genética causada pela aquisição
seqüencial de mutações em genes implicados na proliferação e morte celular. O dano causado
ao DNA pode resultar de processos endógenos como erros na duplicação do DNA e
instabilidade química em certas bases do DNA ou de interações com agentes exógenos como
radiação ionizante e ultravioleta, agentes químicos e biológicos como os vírus (LÓPEZ-
LAZARO apud BEHLING et al., 2004).
É uma síndrome que envolve em geral, as etapas de iniciação, promoção e progressão.
Diversos trabalhos têm visado o estabelecimento da associação entre a ingestão e os níveis
séricos de certos nutrientes e o risco de câncer (BEHLING et al., 2004).
Cirurgia e radioterapia são recomendados para o tratamento de tumores localizados,
enquanto que a quimioterapia é utilizada para as células cancerígenas espalhadas pelo corpo.
Os fármacos antineoplásicos não poupam as células normais de sua ação devastadora, assim,
diversos efeitos tóxicos podem acometer os pacientes que fazem uso destes medicamentos
(LÓPEZ-LAZARO apud BEHLING et al., 2004).
Uma proposta de terapia complementar recomendada para pacientes oncológicos é o
uso de antioxidantes. Há evidências de que essas substâncias podem ser utilizadas junto à
quimioterapia por auxiliar na redução do tamanho do tumor e no aumento da longevidade dos
pacientes (DRISKO et al., apud BEHLING et al., 2004).
31
3.8.1 Produtos naturais antineoplásicos
Os fármacos usados na terapia clínica do câncer oriundos de produtos naturais são
agentes antineoplásicos importantes e eficientes (ALMEIDA et al., 2005). Dos novos
fármacos descobertos para o tratamento de câncer e doenças infecciosas, 60 e 75%
respectivamente são oriundos de fontes naturais (GULLO et al., 2006).
Dentre as classes de substâncias naturais já testadas com pronunciada atividade anti-
câncer, podemos citar os terpenos (sesquiterpenos, diterpenos e triterpenos), alcalóides,
cumarinas, lignanas, flavonóides, taninos, estilbenos, curcuminóides, polissacarídeos (CAI et
al., 2004).
Dentre alguns produtos naturais citotóxicos, usados clinicamente no tratamento de
neoplasias, têm se: i) vimblastina e vincristina, alcalóides extraídos de Catharanthus roseus;
ii) taxol (Paclitaxel®), éster alcalóide derivado do teixo ocidental (Taxus brevifolia) e do
teixo europeu (Taxus baccata), utilizado no tratamento de câncer de mama e ovário; iii)
podofilotoxinas (ou epipodofilotoxinas), tendo-se como exemplos principais a etoposida (VP-
16) e teniposida (VM-26), derivados semi-sintéticos da podofilotoxina, extraída da raiz do
podofilo (Podophyllum peltatum) (FIGURA 18) (ALMEIDA et al., 2005).
32
FIGURA 18. Estruturas de vimblastina, vincristina, etoposida, teniposida e taxol
33
4. MATERIAIS E MÉTODOS
34
4.1. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Os métodos cromatográficos utilizados foram: Cromatografia em Camada Delgada
(CCD) realizada com uso de cromatoplacas da Sorbent Technologies, com indicador de
fluorescência F
254,
200 µm de espessura e Cromatografia em coluna aberta (CC) utilizando
sílica-gel da Silicycle: gel de sílica 60 – 200 µm (70 – 230 mesh). O comprimento e o
diamêtro das colunas variaram de acordo com as quantidades de amostra a serem
cromatografadas. Os solventes orgânicos utilizados foram grau P.A. A detecção das
substâncias foi feita por irradiação com lâmpada de UV (365 e 254 nm) SOLAB Científica e
posterior revelação química.
4.1.1. Reagentes e testes de identificação
• Sulfato cérico/ácido sulfúrico. (MATOS, 2001). Solução de 1% de sulfato cérico (IV)
em ácido sulfúrico a 10 %. As cromatoplacas foram então borrifadas e aquecidas por
alguns minutos (revelador universal).
• Vanilina sulfúrica (MATOS, 2001). Solução (A): 10 % de ácido sulfúrico em etanol
(EtOH). Solução (B): 1% de vanilina em EtOH. A cromatoplaca foi então borrifada com
uma mistura da solução A e B na proporção 1:1 e aquecido por alguns minutos. Manchas
de coloração lilás são características de esteróides ou triterpenos.
• DPPH
•
(SOLER-RIVAS et al., 2000). Solução a 0,3 mM/L do radical 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH
•
) em metanol (MeOH). As cromatoplacas foram imersas por 10 s na
solução e observadas até o aparecimento de manchas amarelas sob fundo de coloração
púrpura, indicativa de possível atividade antioxidante.
• Cloreto Férrico (FeCl
3
) (SIMÕES et al., 1999). Solução a 1% de FeCl
3
em EtOH. As
cromatoplacas foram borrifadas com a solução e observadas até o aparecimento de
35
manchas azuis sob fundo de coloração amarela (laranja), indicativa de substâncias
fenólicas.
4.2. MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS
4.2.1. Espectrometria de absorção no Infravermelho:
Os espectros de absorção na região do infravermelho foram registrados em aparelho
FT-IR Spectrometer Perkin Elmer modelo Spectrum 2000 da Central Analítica da
Universidade Federal do Amazonas. As análises foram feitas utilizando-se pastilhas
comprimidas de brometo de potássio (KBr). Os máximos de freqüência (λ
máx
) das absorções
estão expressos em centímetros recíprocos (cm
-1
).
4.2.2. Ressonância Magnética Nuclear:
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN
1
H – 500 MHz)
e carbono (RMN
13
C,
1
H desacoplado – 125 MHz), DEPT, gHSQC e gHMBC foram
registrados utilizando espectrômetro Varian modelo INOVA 500 de 11,7 T, pertencente ao
Centro de Biotecnologia da Amazônia (CBA). O solvente utilizado para as análises foi
clorofórmio deuterado (CDCl
3
), os deslocamentos químicos (δ) expressos em unidades ppm
em relação ao TMS e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz). As multiplicidades dos
sinais foram indicadas segundo a convenção: s (singleto), d (dupleto), dd (dupleto duplo), e m
(multipleto).
4.3. PONTO DE FUSÃO
O ponto de fusão foi determinado em aparelho eletrônico da marca Metter Toledo FP
62.
36
4.4. COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL BOTÂNICO
Foram coletados folhas e galhos para extração dos constituintes fixos. A coleta foi
realizada na Fazenda Experimental da UFAM em julho de 2006. A exsicata encontra-se
depositada no herbário do INPA sob nº 224595.
O material botânico foi separado em folhas, galhos finos e galhos grossos. (FIGURA
19). As folhas foram limpas e secas à sombra por dois dias em sala com ar-condicionado. Em
seguida, todo o material (folhas e galhos) foi seco em estufa por dois dias em temperatura
média de 60 ºC. O material foi triturado e pulverizado em moinho de facas.
FIGURA 19. Separação do material vegetal de Goupia glabra em folhas, galhos finos e galhos grossos
4.5. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS ORGÂNICOS
As folhas, galhos finos e galhos grossos de cupiúba foram submetidos separadamente
à extração em aparelho Soxhlet (até esgotamento) com os solventes: hexano (Hex), acetato de
etila (AcOEt) e metanol (MeOH). A concentração dos extratos foi realizada sob pressão
reduzida em evaporador rotatório.
37
4.6. PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA
A prospecção fitoquímica foi realizada segundo método relatado por MATOS (2001)
para a determinação da presença das seguintes classes de substâncias: fenólicos, taninos,
antocianinas, antocianidinas, leucoantocianidinas, catequinas, flavonóides, flavanonas,
flavonas, flavonóis, flavononóis, xantonas, alcalóides, esteróides e triterpenóides.
4.6.1. Fenólicos e taninos
Foram transferidos 3 mL dos extratos dissolvidos a três tubos de ensaio e em seguida,
foram adicionadas em cada um deles 3 gotas de uma solução alcoólica de FeCl
3
. Após
agitação dos mesmos, a mudança de coloração e/ou formação de precipitado foram
comparados com o teste em branco (tubo contendo apenas água e a solução alcoólica de
FeCl
3
) e com as cores descritas na TABELA 2.
Características observadas Prováveis classes de substâncias
Coloração entre o azul e o vermelho Indicativo de substâncias fenólicas
Precipitado azul escuro
Indicativo de taninos pirogálicos
(taninos hidrolisáveis)
Precipitado verde escuro
Indicativo de taninos flobafênicos
(taninos condensados ou catéquicos)
TABELA 2. Descrição das possíveis características observadas no teste de fenólicos e taninos
4.6.2. Antocianinas, antocianidinas e flavonóides
Foram transferidos 3 mL de cada extrato dissolvido a três tubos de ensaio. Os extratos
presentes nos primeiros tubos tiveram o pH corrigido a 3, os presentes nos segundos tubos
tiveram o pH elevado a 8,5 e os presentes nos terceiros tubos elevado a pH 11. A mudança de
coloração ocorrida nos tubos citados foi comparada com a descrição da TABELA 3.
38
Cor em meio
Metabólitos
Ácido (pH 3) Alcalino (pH 8,5) Alcalino (pH 11)
antocianidinas e antocianinas
vermelho lilás azul-púrpura
flavonas, flavonóis e xantonas
_
_
amarelo
chalconas e auronas
vermelho
_
vermelho-púrpura
flavononóis
_
_
vermelho-laranja
TABELA 3. Colorações indicativas da presença de antocianinas, antocianidinas, e flavonóides
4.6.3. Leucoantocianidinas, catequinas e flavanonas
Em dois outros tubos de ensaio foram transferidos 4 mL de cada extrato dissolvido.
Nos primeiros tubos foram adicionadas gotas de HCl até pH 1 a 3 e nos segundos gotas de
NaOH até pH 11. Após aquecimento dos mesmos durante 2 a 3 minutos, as mudanças
ocorridas foram comparadas com a TABELA 4.
Cor em meio
Constituintes
Ácido Alcalino
leucoantocianidinas
vermelha
_
Catequinas (taninos catéquicos)
pardo-vermelha
_
flavanonas
_
vermelho-laranja
TABELA 4. Colorações indicativas da presença de leucoantocianidinas, catequinas e flavanonas
4.6.4. Flavonóis, flavanonas, flavanonóis e xantonas
Em tubos de ensaio contendo 4 mL de cada extrato dissolvido foram adicionados
alguns centigramas de magnésio granulado (podendo também ser utilizado magnésio em fita)
e 0,5 mL de HCl concentrado. Após término da reação, o aparecimento ou intensificação da
cor vermelha indicou a presença de flavonóis, flavanonas, flavanonóis e/ou xantonas, livres
ou em forma de heterosídios.
39
4.6.5. Esteróides e triterpenóides
Cada extrato bruto foi dissolvido em 1 a 2 mL de clorofórmio. Em seguida cada
solução foi filtrada para um tubo de ensaio seco com auxílio de um funil contendo algodão e
alguns decigramas de Na
2
SO
4
anidro. A esses novos tudos foram adicionados 1 mL de
anidrido acético e 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado tendo o cuidado de se agitar
suavemente os tubos entre as duas operações e depois da adição do ácido. Em seguida as
colorações formadas foram comparadas com a descrição da TABELA 5.
Colorações observadas Prováveis classes de substâncias
Azul evanescente seguida de verde
permanente
Indicativo de esteróides liv€res
Parda até vermelha Indicativo de triterpenos pentacíclicos livres
TABELA 5. Colorações indicativas da presença de esteróides e triterpenóides
4.6.6. Alcalóides
O pH dos extratos foi corrigido para 11 utilizando NH
4
OH. Em seguida, cada solução
obtida foi submetida a uma extração líquido-líquido utilizando três porções sucessivas de 30,
20 e 10 mL de uma mistura éter-clorofórmio 3:1. As fases éter-clorofórmio obtidas foram
tratadas com Na
2
SO
4
anidro para eliminação de água e misturadas com 3 pequenas porções
sucessivas de HCl diluído para extração das bases orgânicas existentes. As soluções aquosas
ácidas obtidas foram distribuídas em 3 tubos de ensaio, e a cada tubo foram adicionadas,
respectivamente, 3 gotas dos reagentes de precipitação de alcalóides: Hager, Mayer e
Dragendorff. A presença de alcalóides caracteriza-se pela formação de um precipitado
floculoso e pesado em pelo menos 2 tubos dos 3 utilizados.
40
4.7. ENSAIO DE LETALIDADE SOBRE Artemia Salina LEACH
O ensaio de letalidade através do uso de A. salina é um método simples, rápido e de
baixo custo para o biomonitoramento de extratos de plantas e é considerado uma ferramenta
útil para a avaliação preliminar no estudo de substâncias com potencial atividade biológica
(SIQUEIRA et al., 2001). Esse ensaio foi realizado de acordo com a metodologia proposta
por Meyer e colaboradores (1982).
Artemia salina é um microcrustáceo de água salgada que é utilizado como alimento
vivo para peixes, sendo seus ovos facilmente encontrados em lojas de aquaristas. A
simplicidade desse bioensaio favorece sua utilização rotineira, podendo ser desenvolvido no
próprio laboratório de fitoquímica (MCLAUGHLIN apud SIQUEIRA et al., 1998).
4.7.1. Procedimento
Para determinar a letalidade dos extratos de cupiúba foi realizado um bioensaio em
Artemia salina (MEYER et al., 1982). Testou-se as soluções dos extratos na concentração de
500 µg/mL diluídas em DMSO (triplicata) a fim de se verificar a percentagem de mortalidade
das larvas.
Em um aquário de vidro, os cistos de A. salina foram incubados em solução salina (37
g de sal em um litro de água do Milli-Q) em uma concentração de 10 mg de cistos/100 mL de
solução, sob iluminação artificial a 28 ºC. Após 24 horas, as larvas no primeiro estágio larval
(náuplio) foram transferidas para outro aquário que continha solução salina, e mantidas em
nova incubação por mais 24 horas sob iluminação artificial a 28 ºC. Após essa incubação,
obteve-se apenas estágios de metanáuplios do microcrustáceo (cultura pura).
Primeiramente foram adicionados 4,5 mL da solução salina nos frascos e
posteriormente adicionados cerca de 10 larvas por frasco, pescadas com auxilio de pipeta de
Pasteur, em um volume de 0,5 mL.
41
A partir dos extratos obtidos, as soluções foram testadas na concentração de 500
µg/mL diluídas em DMSO (triplicata), transferidas para os frascos com as 10 larvas cada um,
em um volume final de 5 mL de solução salina. As culturas de A. salina foram incubadas a 28
ºC, após 24 horas os microcrustáceos imóveis e/ou depositados no fundo dos frascos são
considerados como mortos.
Esse primeiro teste foi realizado a fim de se verificar a percentagem de mortalidade na
concentração de 500 µg/mL.
4.8 DETERMINAÇÃO DE FENÓLICOS TOTAIS
4.8.1. Ensaio qualitativo
Os extratos foram analisados em placas de CCD, aplicados na placa com auxílio de
um capilar que, após secagem, foram borrifadas com uma solução a 1 % de FeCl
3
em etanol.
As placas foram observadas até o aparecimento de manchas azuis sob fundo de coloração
amarela (laranja), indicativa da presença de substâncias fenólicas (ESQUEMA 1).
ESQUEMA 1. Procedimento para ensaio qualitativo de substâncias fenólicas
Para os extratos que apresentaram resultado positivo foi realizado o mesmo
procedimento, com a diferença de que antes de serem borrifadas com a solução de FeCl
3
, as
placas foram desenvolvidas em sistemas de eluição específicos: Hex/AcOEt (8:2) para os
42
extratos obtidos em hexano; em Hex/CHCl
3
/AcOEt (5:2:5) para os extratos obtidos em
AcOEt; e em CHCl
3
/MeOH (7:3) para os extratos obtidos em MeOH. Esses eluentes foram
determinados previamente para cada extrato, sendo escolhido o sistema de eluição que
apresentou a melhor separação das manchas na placa de CCD para cada extrato.
4.8.2. Quantificação de Fenólicos totais
A quantificação colorimétrica de fenólicos foi realizada por meio de uma variedade de
técnicas, todavia, a que utiliza o reagente de Folin-Ciocalteu figura entre as mais
extensivamente utilizadas (SOUSA et al., 2007).
O reagente de Folin-Ciocalteau consiste na mistura dos ácidos fosfomolibídico e
fosfotungstico, na qual o molibdênio se encontra no estado de oxidação (VI), formando um
complexo de cor amarela (NaMoO
4
.2H
2
O). Em presença de certos agentes redutores, como os
fenólicos, formam-se os complexos molibdênio-tungstênio azuis [(PMoW
11
O
4
)
4-
], com média
de estado de oxidação dos metais entre 5 (V) e 6 (VI). Dessa forma, esse reagente mede a
capacidade redutora das amostras, que não necessariamente precisam ter natureza fenólica
(FIGURA 20) (DE OLIVEIRA et al., 2009).
FIGURA 20. Reação do ácido gálico com molibdênio, presente no reagente de Folin-Ciocalteau
43
4.8.2.1. Procedimento
A determinação do teor de fenólicos totais presentes nas amostras dos extratos da
espécie estudada foi feita por meio de colorimetria na região do visível utilizando o método de
Folin–Ciocalteau (VELIOGLU et al., 1998) com modificações.
Soluções do extrato (200 µL) na concentração de 1 mg/mL foram colocadas em um
frasco âmbar e foi adicionado 1500 µL de solução 10% de reagente Folin-Ciocalteau e
misturados vigorosamente. Após 5 min, 1500 µL de solução 60g/L de NaHCO
3
foi adicionado
à mistura e ficou em repouso no escuro por 1,5 h. A absorbância foi medida a 725 nm.
(ESQUEMA 2).
ESQUEMA 2. Procedimento de quantificação de substâncias fenólicas
O mesmo procedimento foi repetido para todas as soluções do padrão ácido gálico
(0,03125 a 0,25 mg/mL) e (0,025 a 0,4 mg/mL).
O teor de fenólicos totais (FT) foi determinado por interpolação da absorbância das
amostras contra uma curva de calibração construída utilizando ácido gálico como padrão e
referência e expressos como mg de equivalentes de ácido gálico por grama de extrato (EAG).
Todas as análises foram realizadas em triplicata.
44
4.9. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Vários métodos são utilizados para determinar a atividade antioxidante de extratos e
substâncias isoladas. Um dos mais utilizados consiste em avaliar a atividade seqüestradora do
radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH
•
) (SOUSA et al., 2007). O radical DPPH
•
possui
coloração púrpura (FIGURA 21), que absorve em um comprimento de onda de 517 nm. Por
ação de um antioxidante ou espécie radicalar (R
•
), o DPPH
•
é reduzido formando 2,2-difenil-
1-picrilhidrazina (DPPH-H) (FIGURA 22) de coloração amarela, com conseqüente
desaparecimento da banda de absorção (DE OLIVEIRA et al., 2009).
FIGURA 21. Perda da coloração púrpura do radical DPPH
•
FIGURA 22. Reação química do radical DPPH
•
formando DPPH-H
4.9.1. Ensaio qualitativo
Os extratos foram analisados em placas de CCD, aplicados na placa com auxílio de
um capilar que, após secagem, foram borrifadas com uma solução a 0,3 mM/L do radical
45
DPPH
•
em MeOH (MONTENEGRO et al., 2006; SOLER-RIVAS et al., 2000). As placas
foram observadas até o aparecimento de manchas amarelas sob fundo de coloração púrpura,
indicativa de possível atividade antioxidante (ESQUEMA 3).
ESQUEMA 3. Procedimento para ensaio qualitativo da atividade antioxidante
Para os extratos que apresentaram resultado positivo foi realizado o mesmo
procedimento, com a diferença de que antes de serem borrifadas com a solução de DPPH
•
, as
placas foram desenvolvidas com os seguintes eluentes: Hex/AcOEt (8:2) para os extratos em
hexano; em Hex/CHCl
3
/AcOEt (8:1:2) para os extratos em AcOEt; e em CHCl
3
/MeOH (7:3)
para os extratos em MEOH.
4.9.2. Ensaio quantitativo utilizando cubeta de quartzo
A determinação da atividade antioxidante foi realizada segundo metodologia descrita
por Mensor e colaboradores (2001), com algumas modificações, monitorando o consumo do
radical estável 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH
•
) pelas amostras através da medida do
decréscimo da absorbância de soluções de diferentes concentrações. É um ensaio rápido e
fácil para avaliar a presença de substâncias antioxidantes na amostra.
As medidas de absorbância foram feitas em espectrofotômetro UV-Vis Spectronic
BioMate 3, tendo como controle positivo quercetina comercial.
]
46
4.9.2.1. Amostras
Soluções dos extratos (1000 µg/mL) e do controle positivo (quercetina) em MeOH
foram previamente preparadas e posteriormente diluídas nas concentrações 250, 125, 50, 25,
10 e 5 µg/mL para os extratos e 5; 2,5; 1,25; 0,625 e 0,3125 µg/mL para o padrão.
4.9.2.2. Controle e branco da amostra
O controle foi preparado com 2,5 mL de MeOH e 1mL da solução de DPPH
•
. O
branco foi preparado na maior concentração do extrato. Adiciona-se 2,5 mL de extrato e 1 mL
de MeOH. O branco do padrão também foi realizado com 2,5 mL da solução do padrão na
maior concentração e 1 mL de MeOH.
4.9.2.3. Procedimento
Um volume de 2,5 mL de solução de quercetina ou de extrato em diferentes
concentrações foi adicionado a 1,0 mL de solução de DPPH
•
na concentração de 0,3 mM/L e
misturados vigorosamente. A leitura da absorbância da mistura reacional (quercetina +
DPPH
•
) foi realizada a 517 nm após 30 minutos (ESQUEMA 4).
ESQUEMA 4. Procedimento para ensaio quantitativo da atividade antioxidante em cubeta
47
% AA = 100 - ( Abs
amostra
- Abs
branco
) x 100
Abs
controle
A partir dos valores obtidos foi construída a curva de calibração. As medidas foram
feitas em cubeta de quartzo com percurso óptico de 1 cm.
Todas as análises foram realizadas em triplicata.
Os valores das absorbâncias foram convertidos em porcentagem da atividade
antioxidante (%AA), determinada pela seguinte Equação:
onde Abs
controle
é a média da absorbância da solução metanólica de DPPH
•
e Abs
amostra
é a
absorbância de cada triplicata da mistura reacional (DPPH
•
+ amostra) e Abs
branco
é a média da
absorbância da solução da amostra em MeOH. (ESQUEMA 5).
ESQUEMA 5. Procedimento para preparo do controle, amostra (padrão ou extrato) e branco da amostra
A porcentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde à quantidade de DPPH
•
consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante necessária para
decrescer a concentração inicial de DPPH
•
em 50% é denominada concentração eficiente
Controle
2,5 mL
1 mL
* Quercetina ou Extrato
Amostra*
ou
2,5 mL
1 mL
Branco
ou
2,5 mL
1 mL
48
(CE
50
), também chamada de concentração inibitória (CI
50
). Quanto maior o consumo de
DPPH
•
por uma amostra, menor será a sua CE
50
e maior a sua atividade antioxidante (SOUSA
et al., 2007).
A CE
50
foi determinada por interpolação da curva de calibração, da atividade
antioxidante (%AA) contra a concentração da amostra.
4.9.3. Ensaio quantitativo utilizando microplaca
A determinação da atividade antioxidante utilizando microplaca de 96 poços é
semelhante a que utiliza cubeta de quartzo. As medidas de absorbância foram feitas em
espectrofotômetro Bio-Rad, modelo 3550 UV, tendo como controle positivo quercetina.
ESQUEMA 6. Procedimento para ensaio quantitativo da atividade antioxidante em microplaca
Um volume de 250 µL de solução de quercetina em diferentes concentrações foi
adicionado a 100 µL de solução de DPPH
•
na concentração de 0,3 mM/L em microplaca de 96
poços. A leitura da absorbância da mistura reacional (quercetina + DPPH
•
) foi realizada a 517
nm após 30 minutos (ESQUEMA 6).
A partir dos valores obtidos foi construída a curva de calibração. O mesmo
procedimento foi realizado para os extratos de cupiúba. Todas as análises foram realizadas em
quadruplicata. O tratamento dos dados obtidos e a determinação da CE
50
são realizados da
mesma forma que o procedimento que utiliza cubeta de quartzo.
49
4.10. ATIVIDADE INIBIDORA DE ACETILCOLINESTERASE
A avaliação qualitativa da atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase foi
efetuada de acordo com o ensaio enzimático descrito por Ellman (1961) e modificado por
Rhee e colaboradores (2001).
Foram preparadas soluções dos extratos na concentração de 5 mg/mL e aplicados (10
µL) em cromatoplacas (gel de sílica, Merck). Após eliminação do solvente, as cromatoplacas
foram borrifadas com solução aquosa 5 mM de iodeto de acetilcolina e com o reagente de
Ellman.
Após secagem, as cromatoplacas foram borrifadas com a solução contendo a enzima
acetilcolinesterase (3U/mL em solução 50 mM do tampão Tris-HCl pH=8, contendo 0,1% de
albumina sérica bovina).
Foi utilizado eserina (fisostigmina) como padrão. A inibição da atividade enzimática é
sugerida pelo surgimento de manchas esbranquiçadas sob um fundo amarelo (ESQUEMA 7).
ESQUEMA 7. Procedimento para Ensaio qualitativo da atividade inibidora de acetilcolinesterase
Solução
ATCI / DTNB
Solução
AChE
POSITIVO NEGATIVO
50
4.11. ATIVIDADE CITOTÓXICA EM CÉLULAS TUMORAIS
Esses ensaios foram realizados no Laboratório de Oncologia Experimental da
Universidade Federal do Ceará (UFC), através do convênio entre UFAM / LOE UFC, sob a
responsabilidade dos Profs. Drs. Manoel Odorico de Moraes e Cláudia de Oliveira Pessoa.
Esses testes tiveram o objetivo de verificar a citotoxidade in vitro dos extratos com
três linhagens de células tumorais, parte de uma varredura para determinação do potencial
antitumoral das amostras.
4.11.1. Procedimento
4.11.1.1. Varredura inicial
A citotoxicidade das substâncias foi avaliada pelo método do 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-
2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazólio (MTT) (MOSSMAN, 1983).
As linhagens tumorais utilizadas, MDA-MB435 (mama - humano), HCT-8 (cólon -
humano) e SF-295 (glioblastoma - humano), foram cedidas pelo Instituto Nacional do Câncer
(EUA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com 10 % de soro fetal
bovino e 1 % de antibióticos, mantidas em estufa a 37 ºC e atmosfera contendo 5% de CO
2
.
Os extratos foram dissolvidos em DMSO puro estéril e testados na concentração final
de 50 µg/mL e as frações na concentração de 25 µg/mL.
As células foram plaqueadas na concentração de 0,1 x 10
6
cél/mL para as linhagens
MDA-MB-435 e SF-295 e 0,7 x 10
5
cél/mL para a linhagem HCT-8. Em seguida foram
adicionadas as amostras dos extratos e frações na concentração final de 50ug/mL e 25 ug/mL,
respectivamente. As placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO
2
a 37 ºC. Ao
término deste, as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante, removido. Em seguida,
foram adicionados 150 µL da solução de MTT (sal de tetrazolium), e as placas foram
51
incubadas por 3h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com 150 µL de
DMSO puro em espectrofotômetro de placa a 595 nm (ESQUEMA 8).
Os experimentos foram analisados segundo a média ± desvio padrão da média (DPM)
da porcentagem de inibição do crescimento celular usando o programa GraphPad Prism. A
doxorrubicina (Dox) foi utilizada como controle positivo.
ESQUEMA 8. Ensaio de citotoxidade pelo método MTT
Análise de citotoxicidade pelo método do MTT vem sendo utilizada no programa de
triagem do Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (INC), que testa mais de 10.000
amostras a cada ano (SKEHAN et al., 1990).
É um método rápido, sensível e barato. Foi descrita primeiramente por Mossman
(1983), tendo a capacidade de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma
análise colorimétrica baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-
brometo de tetrazolium (MTT) de coloração amarela em azul de formazan (de coloração
azul/roxo), a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente
ativas (FIGURA 23).
52
O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir facilmente a citotoxicidade,
mas não o mecanismo de ação (BERRIDGE et al., 1996).
FIGURA 23. Redução do MTT por enzimas mitocondriais
4.11.1.2 Determinação da CI
50
As linhagens tumorais utilizadas, HL-60 (leucemia – humana), MDA-MB435 (mama
- humana), HCT-8 (cólon - humana) e SF-295 (glioblastoma - humana), foram cedidas pelo
Instituto Nacional do Câncer (EUA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640,
suplementados com 10 % de soro fetal bovino e 1 % de antibióticos, mantidas em estufa a 37
°C e atmosfera contendo 5% de CO
2
.
O extrato foi dissolvido e diluído com DMSO estéril na concentração estoque de 10
mg/mL.
As células foram plaqueadas na concentração de 0,1 x 10
6
cél/mL para as linhagens
MDA/MB-435 e SF-295, 0,7 x 10
5
cél/mL para a linhagem HCT-8 e 0,3 x 10
6
cél/mL para a
linhagem HL-60. As placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO
2
a 37°C. Ao
término deste, as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante, removido. Em seguida,
foram adicionados 150 µL da solução de MTT (sal de tetrazolium), e as placas foram
incubadas por 3h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com 150 µL de
DMSO puro em espectrofotômetro de placa a 595nm.
53
O cálculo da CI
50
(concentração capaz de inibir em 50% o crescimento celular) foi
realizado a partir da regressão não-linear no programa GraphPad Prism (versão 4). Os
extratos foram analisados a partir de dois experimentos realizados em triplicata. A
doxorrubicina (Dox) foi utilizada como controle positivo.
4.12. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E ANTIFÚNGICA
Esses ensaios foram realizados no Departamento de Análises Clínicas da Universidade
Estadual de Maringá – PR, através do convênio entre UFAM /UEM, sob a responsabilidade
do Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura.
Para avaliar o potencial antimicrobiano de extratos vegetais, existem diversas técnicas
de varredura, desde as mais simples até os mais sofisticados. Os dois métodos mais utilizados
são o de difusão em ágar e de diluição em caldo. O método de difusão em ágar pode ser
realizado através de disco ou de poço, e é geralmente utilizado para microorganismos de
crescimento rápido e para alguns de crescimento fastidioso. O método de diluição em caldo é
utilizado para determinar a concentração mínima de um agente necessário para inibir ou matar
um microrganismo. Os agentes antimicrobianos são geralmente testados em diluições
consecutivas, e a menor concentração capaz de inibir o crescimento de um organismo é
considerada como a Concentração Inibitória Mínima (CIM) (ALVES et al., 2008).
A técnica de microdiluição é uma adaptação da macrodiluição, e é denominada assim
porque envolve o uso de pequenos volumes de caldo e pode ser considerada a melhor opção
para determinar a atividade antimicrobiana (ALVES et al., 2008).
54
4.12.1. Procedimento para atividade contra bactérias
A determinação da atividade antibacteriana dos extratos de G. glabra foi realizada
pelo método da Concentração Inibitória Mínima (CIM), para as seguintes espécies de
bactérias: 2 Gram positivo (Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus) e 2 Gram negativo
(Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa) (CLSI, 2005a).
As bactérias foram previamente cultivadas em tubo de ensaio contendo meio de
cultura líquido Müller-Hinton (MH) por 24 h a 37°C. Após o período de incubação, a cultura
bacteriana foi diluída em solução salina 0,9% para atingir a equivalência de 1,5x10
8
células/mL, segundo a escala de McFarland, e então uma nova diluição de 1:10 foi feita em
meio de cultura. Desta última diluição bacteriana, 5 µL foram colocados em cada poço da
placa de 96 poços, já contendo 100 µL de meio de cultura MH juntamente com diferentes
concentrações do extrato (concentração máxima de 1000 µg/mL).
A placa foi então incubada por 24 h a 37°C. Os poços onde o extrato inibiu o
crescimento bacteriano (CIM) foram plaqueados em meio sólido ágar MH para determinação
de atividade bactericida ou bacteriostática após mais 24 h de incubação. A presença de
colônias indica uma concentração bacteriostática (CIM – concentração inibitória mínima) e a
ausência de colônias indica uma concentração bactericida (CBM – concentração bactericida
mínima) (FIGURA 24).
FIGURA 24. Exemplo de uma leitura de experimento de CIM, após o período de incubação
55
4.12.2 Procedimento para atividade contra fungos leveduriformes
A metodologia para análise da atividade antifúngica é semelhante à metodologia para
análise da atividade antibacteriana, com algumas diferenças e foi realizada para as seguintes
espécies: Candida albicans, Candida tropicalis e Candida parapsilosis (CLSI, 2005b).
As leveduras foram previamente cultivadas em tudo de ensaio contendo meio de
cultura líquido Sabouraud por 24 h a 37°C. Após o período de incubação, a cultura foi diluída
em solução salina 0,9% para atingir a equivalência de 1,5x10
8
células/mL, segundo a escala
de McFarland, e então uma nova diluição de 1:100 foi feita em meio de cultura. Desta última
diluição, 5 µL foram colocados em cada poço da placa de 96 poços, já contendo 100 µL de
meio de cultura juntamente com diferentes concentrações da droga a ser testada (concentração
máxima de 1000 µg/mL).
A placa foi então incubada por 48 h a 37°C. Os poços onde o extrato inibiu o
crescimento das leveduras (CIM) foram plaqueados em meio sólido ágar Sabouraud para
determinação de atividade fungicida ou fungistática após mais 48 h de incubação. A presença
de colônias indica uma concentração fungistática (CIM – concentração inibitória mínima) e a
ausência de colônias indica uma concentração fungicida (CFM – concentração fungicida
mínima).
4.13 ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA
Esses ensaios foram realizados no Departamento de Análises Clínicas da Universidade
Estadual de Maringá – PR, através do convênio entre UFAM /UEM, sob a responsabilidade
do Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura.
56
4.13.1.1. Metodologia para Leishmania amazonensis
Formas promastigotas foram previamente cultivadas em garrafas plásticas contendo
meio de cultura Warren suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) por 48 h a 25°C.
Após esse período, em uma placa de 24 poços, foi feita a inoculação de 1x10
6
parasitas/mL em cada poço, juntamente com meio de cultura e 10% de SFB, adicionado a
várias concentrações do extrato, sendo 1 mL o volume final de cada poço.
A placa foi incubada por 72 h a 25°C. Ao final do período foi realizada a contagem
dos parasitas em câmara de Neubauer, em microscópio óptico, e a concentração que inibiu o
crescimento do parasita em 50% foi determinada (CI
50
) (BUCKNER apud DIAS et al., 2009).
Ensaios de citotoxicidade com formas promastigotas são indicadores úteis para
fracionamento biomonitorado de produtos vegetais (CROFT et al., 2006)
4.13.2.1. Metodologia para Trypanosoma cruzi
Formas epimastigotas foram previamente cultivadas em tubos de ensaio contendo
meio de cultura LIT suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) por 96 h a 28°C.
Após esse período, em uma placa de 24 poços, foi feita a inoculação de 1x10
6
parasitas/mL em cada poço, juntamente com meio de cultura e 10% de SFB, adicionado a
várias concentrações do extrato, sendo 1 mL o volume final de cada poço.
A placa foi incubada por 96 h a 28°C. Ao final do período foi realizada a contagem
dos parasitas em câmara de Neubauer, em microscópio óptico, e a concentração que inibiu o
crescimento do parasita em 50% foi determinada (CI
50
) (BUCKNER apud DIAS et al., 2009).
57
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
58
5.1. EXTRATOS
O material vegetal coletado foi separado em folhas (522,0 g), galhos finos (289,0 g) e
galhos grossos (115,6 g) para obtenção dos extratos orgânicos (10 extratos), codificados
conforme a parte da planta e o solvente utilizado, de acordo com a TABELA 6.
TABELA 6. Extratos de Goupia glabra
Para obtenção dos extratos, as folhas foram divididas em duas partes e colocadas em
cartuchos de papel de filtro. Na 2ª extração com MeOH a cor do material extraído era
diferente em relação à 1ª extração e por esse motivo o material foi separado em dois extratos:
EMF1 e EMF2.
Analisando os rendimentos para os extratos obtidos em hexano, nota-se que as
substâncias apolares encontram-se em maior concentração nos galhos grossos, seguido das
folhas, e em menor concentração nos galhos finos. Em contraste com as substâncias de média
polaridade (extraídas em AcOEt) que estão em menor concentração nos galhos grossos,
seguido dos galhos finos. As folhas apresentaram maior percentual de substâncias de média
polaridade. As substâncias de alta polaridade (extraídas em MeOH) se encontram em maior
concentração em todas as três partes da planta.
O extrato que apresentou melhor rendimento foi o obtido em MeOH dos galhos finos
(EMGf), seguido do extrato obtido em AcOEt das folhas (EAF).
Parte da planta Solvente Extratos Massa (g) Rendimento (%)
Hexano EHF 6,35 g 1,22
AcOEt EAF 29,25 g 5,60
MeOH EMF1 18,40 g 3.52
FOLHAS
(522,0 g)
MeOH EMF2 23,45 g 4,49
Hexano EHGf 1,84 g 0,64
AcOEt EAGf 10,03 g 3,47
GALHOS FINOS
(289,0 g)
MeOH EMGf 20,85 g 7,21
Hexano EHGg 3,09 g 2,67
AcOEt EAGg 0,66 g 0,57
GALHOS GROSSOS
(115,6 g)
MeOH EMGg 4,52 g 3,91
59
5.2. PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA
Na TABELA 7 são apresentados os resultados da prospecção fitoquímica dos extratos
analisados de acordo com os ensaios descritos por Matos (2001). Foram observados
resultados positivos para esteróis e triterpenóides em todos os extratos e fenóis, flavonas,
flavonóis, xantonas nos extratos obtidos em AcOEt e MeOH.
Estes são ensaios preliminares e que indicam a possibilidade ou não de se encontrar
determinadas classes de metabólitos nessas espécies, sendo necessários estudos químicos
posteriores para melhor compreensão das mesmas.
TABELA 7. Resultado da prospecção fitoquímica dos extratos de cupiúba
EXTRATOS CLASSES DE
SUBSTÂNCIAS
EHF EAF EMF1 EMF2 EHGf EAGf EMGf EHGg EAGg EMGg
alcalóides
– – – – – – – – – –
antocianinas
– – – – – – – – – –
antocianidinas
– – – – – – – – – –
catequinas
– – – – – – – – – –
esteróides
+ + + + + + + + + +
fenóis
–
+ + +
–
+ +
–
+ +
flavanonas
– – – – – – – – – –
flavonas
–
+
+
+
–
+
+
–
+
+
flavonóis
–
+ + +
–
+ +
–
+ +
flavononóis
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
flavonóides
– – – – – – – – – –
leucoantocianidinas
– – – – – – – – – –
triterpenos
+ + + + + + + + + +
taninos
– – – – – – – – – –
xantonas
–
+
+
+
–
+
+
–
+
+
60
5.3. ENSAIO DE LETALIDADE SOBRE Artemia Salina LEACH
O ensaio de letalidade foi expresso em percentual de mortalidade das larvas de A.
salina e os resultados estão dispostos na TABELA 8. Os extratos são considerados tóxicos
quando apresentam percentual de mortalidade de larvas superior a 50%.
TABELA 8. Mortalidade (%) de larvas de A. salina (500 µg de extrato por mL) dos extratos de cupiúba
EXTRATOS ENSAIO
CITOTÓXICO
EHF EAF EMF1 EMF2 EHGf EAGf EMGf EHGg EAGg EMGg
Mortalidade de
larvas (%)
20,0 2,5 12,5 5,0 10,0 25,0 22,5 17,5 17,5 20,0
Conforme o resultado observado na TABELA 3, nenhum dos extratos de cupiúba
apresentou toxicidade frente às larvas de A. salina. O maior percentual de mortalidade foi
observado paro o extrato em AcOEt de galhos finos (EAGf, 25 %).
GRÁFICO 1. Mortalidade (%) de larvas de A. salina (500 µg de extrato por mL) dos extratos de cupiúba
61
5.4. AVALIAÇÃO QUALITATIVA DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
A avaliação qualitativa dos extratos por CCD em gel de sílica utilizando solução de
DPPH em MeOH sugeriu a existência de substâncias com atividade antioxidante, devido à
presença de manchas amarelas sob fundo púrpura resultantes da redução do radical DPPH.
A presença de compostos fenólicos também foi sugerida, pois na avaliação qualitativa
dos extratos, realizada por CCD em gel de sílica, utilizando solução de FeCl
3
em EtOH, foi
verificada a presença de manchas azuis sob fundo amarelo/laranja.
FIGURA 25. Avaliação preliminar da atividade antioxidante em CCD. a) antes do teste; b) após borrifar solução
de FeCl
3
; c) após borrifar solução de DPPH
Extratos em AcOEt
Extratos em MeOH
Extratos em Hexano
62
No ensaio com FeCl
3
(FIGURA 25b) os extratos obtidos em AcOEt e MeOH
apresentaram uma mancha com forte intensidade de coloração azul, com exceção dos extratos
em MeOH das folhas (EMF1 e EMF2) que apresentaram uma mancha azul bem mais fraca
em comparação com os demais extratos, o que sugere que folhas e galhos possuem
características químicas diferentes e que as substâncias fenólicas estão presente em maior
concentração nos galhos.
Para o ensaio com DPPH (FIGURA 25c), os extratos obtidos em AcOEt e MeOH
mostraram manchas com forte intensidade de coloração amarela, enquanto que os extratos
obtidos em Hexano apresentaram fraca intensidade, exceto o extrato em hexano das folhas
(EHF) que não apresentou nenhuma mancha amarela. As intensidades variadas para os
diversos extratos sugerem que eles possuem diferentes características químicas e que os
componentes mais polares presentes em extratos em obtidos em AcOEt e MeOH contribuíram
para o aumento da atividade.
Para os extratos que apresentaram resultado positivo foi realizado o mesmo
procedimento, com a diferença de que antes de serem borrifadas com a solução de DPPH ou
FeCl
3
, as placas foram desenvolvidas com os seguintes eluentes: Hex/AcOEt (8:2) para os
extratos em hexano; em Hex/CHCl
3
/AcOEt (5:2:5) para os extratos em AcOEt; e em
CHCl
3
/MeOH (7:3) para os extratos em MeOH.
Nos extratos em Hexano (FIGURA 26) não foram observadas manchas azuis para o
ensaio de fenóis (FIGURA 26b), embora os extratos tenham apresentado manchas amarelas
no ensaio com DPPH (FIGURA 26c), principalmente nos extratos de galhos finos (Gf) e
galhos grossos (Gg), sugerindo que a atividade antioxidante frente ao radical DPPH deve-se a
compostos de natureza não-fenólica.
63
FIGURA 26. Avaliação antioxidante qualitativa dos extratos em Hexano eluídos em Hex/AcOEt (8:2). a) antes
do teste; b) após borrifar solução de FeCl
3
; c) após borrifar solução de DPPH
Nos extratos em AcOEt (FIGURA 27) foram observadas manchas azuis para o ensaio
de fenóis (FIGURA 27b), principalmente no extrato de galhos finos (Gf). Para o ensaio com
DPPH (FIGURA 27c), os extratos apresentaram manchas amarelas principalmente no extrato
de galhos grossos (Gg) que mostrou mais uma mancha. A atividade antioxidante frente ao
radical DPPH deve-se à compostos de natureza fenólica e não-fenólica.
FIGURA 27. Avaliação antioxidante qualitativa dos extratos em AcOEt eluídos em Hex/CHCl
3
/AcOEt (5:2:5).
a) antes do teste; b) após borrifar solução de FeCl
3
; c) após borrifar solução de DPPH
64
FIGURA 28. Avaliação antioxidante qualitativa dos extratos em MeOH eluídos em CHCl
3
/Metanol (7:3). a)
após borrifar solução de FeCl
3
; b) após borrifar solução de DPPH
Nos extratos em MeOH (FIGURA 28) foram observadas manchas azuis para o ensaio
de fenóis (FIGURA 28a), principalmente nos extrato de galhos finos (Gf) e galhos grossos
(Gg), evidenciando uma maior concentração de compostos fenólicos nesses extratos.
Para o ensaio com DPPH (FIGURA 28b), os extratos apresentaram fortes manchas
amarelas em todos os extratos, principalmente nos extratos de galhos finos (Gf) e galhos
grossos (Gg) onde foi observado mais uma mancha. A atividade antioxidante frente ao radical
DPPH deve-se à compostos de natureza fenólica e não-fenólica.
Como observado na TABELA 9, os extratos obtidos em AcOEt e MeOH apresentaram
resultado positivo para substâncias fenólicas e atividade seqüestradora do radical DPPH.
Apenas os extratos de galhos finos e galhos grossos obtidos em hexano (EHGf e EHGg,
respectivamente) demonstraram atividade antioxidante frente ao DPPH e não foi evidenciada ,
para esses extratos, a presença de fenólicos.
65
TABELA 9. Resultado do ensaio qualitativo de compostos fenólicos e atividade antioxidante
EXTRATOS ENSAIO
QUALITATIVO
EHF EAF EMF1 EMF2 EHGf EAGf EMGf EHGg EAGg EMGg
FENÓIS –
+ +
+
–
+
+
–
+
+
Atividade antioxidante
(DPPH)
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
5.5. AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
A partir dos resultados observados na avaliação qualitativa foram realizados os ensaios
quantitativos de atividade antioxidante e quantificação de compostos fenólicos.
Os resultados obtidos na determinação dos fenóis totais pelo método de Folin-
Ciocalteau, expressos como equivalentes de ácido gálico (EAG) por grama de extrato bruto,
estão apresentados na TABELA 10.
Os resultados da avaliação quantitativa da atividade antioxidante dos extratos também
estão dispostos na TABELA 10 e foram expressos em Concentração eficiente (CE
50
), que é a
concentração do extrato necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50%.
Quanto maior o consumo de DPPH para uma amostra, menor será a CE
50
e maior a sua
atividade antioxidante.
O padrão utilizado para a determinação da atividade antioxidante foi a quercetina que
apresentou CE
50
= 3,27 ± 0,19 µg/mL no ensaio realizado em cubeta e CE
50
= 4,17 ± 0,127
µg/mL, no ensaio realizado em microplaca.
66
TABELA 10. Resultado da quantificação de compostos fenólicos e atividade antioxidante
EXTRATOS ENSAIO
QUANTITATIVO
EHF EAF EMF1 EMF2 EHGf EAGf EMGf EHGg EAGg EMGg
Fenois Totais ± DP
(mg de EAG/g)
ND
242,86
±15,60
144,36
± 3,25
98,33
± 3,78
ND
181,43
± 9,66
214,6
±3,14
ND
196,33
± 6,57
137,33
± 7,77
CE
50
± DP (µg/mL)
(em cubeta)
ND
9,76
± 0,42
69,39
± 2,26
84,68
± 0,36
ND
21,00
± 0,36
21,30
± 0,54
ND ND ND
CE
50
± DP (µg/mL)
(em microplaca)
ND
19,87
± 0,31
72,03
± 1,87
85,95
± 2,35
ND
35,08
± 0,26
29,74
±0,35
ND
27,68
±0,02
30,17
±1,20
ND (não determinado), DP (desvio padrão), EAG (equivalente de ácido gálico),
CE
50
(Concentração eficiente)
O extrato que apresentou o melhor resultado para a quantificação de fenóis e atividade
antioxidante foi o EAF (Extrato em AcOEt das folhas) com 242,86 ± 15,60 mg de EAG
(equivalente de ácido gálico) por grama de extrato seco e CE
50
= 9,76 ± 0,42 µg/mL (cubeta)
e CE
50
= 19,87 ± 0,31 µg/mL (microplaca).
Esse extrato (EAF) foi fracionado e uma das substâncias ativas foi isolada e codificada
como EAF4F3 (pp. 95-106). A atividade antioxidante de EAF4F3 foi avaliada em microplaca
e apresentou CE
50
= 1,25 ± 0,019 µg/mL, ou seja, essa substância apresenta maior atividade
antioxidante que o padrão utilizado (quercetina, CE
50
= 4,17 ± 0,127 µg/mL).
Os ensaios não foram realizados para os extratos obtidos em Hexano, pois os mesmos
não solubilizaram em MeOH que é o solvente utilizado no teste.
5.5.1. Correlação entre a quantidade de compostos fenólicos e a CE
50
Foi observada uma correlação positiva (90%) entre a quantidade de compostos
fenólicos e a atividade antioxidante, avaliada em cubeta, dos extratos de G. glabra
(GRÁFICO 2), no entanto o extrato EAGf não segue esse comportamento, o que sugere que
67
EMGf
EMF2
EMF1
EAGf
EAF
y = -0,5566x + 139,37
R
2
= 0,9011
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 50 100 150 200 250 300
Fenóis Totais (mg de EAG/g de extrato)
Atividade Antioxidante, CS50
(µg/mL)
EAGg
EMF2
EMF1
EAGf
EMGg
EMGf
EAF
y = -0,4144x + 114,89
R
2
= 0,6627
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 50 100 150 200 250 300
Fenois Totais (mg de EAG/g de extrato)
Atividade Antioxidante, CS50
(µg/mL)
exista algum constituinte que contribui particularmente e mais efetivamente para a ação
seqüestradora de radicais livres nesse extrato.
GRÁFICO 2. Correlação positiva entre a quantidade compostos fenólicos e a atividade antioxidante dos extratos
de cupiúba
Para a atividade antioxidante avaliada em microplaca não foi observada uma boa
correlação (R
2
= 0,6627) entre os fenólicos totais e a CE
50
(GRÁFICO 3).
GRÁFICO 3. Correlação entre a quantidade compostos fenólicos e a atividade antioxidante (microplaca) de
todos os extratos de cupiúba
68
EAF
EMGf
EAGf
EMF1
EMF2
EAGg
y = -0,5025x + 135,34
R
2
= 0,9191
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 50 100 150 200 250 300
Fenois Totais (mg de EAG/g de extrato)
Atividade Antioxidante, CS50
(µg/mL)
Observa-se no GRÁFICO 4, onde o extrato em MeOH dos galhos grossos (EMGg)
não foi incluído, uma boa correlação (91%) entre a atividade antioxidante avaliada em
microplaca e os fenóis totais dos demais extratos de cupiúba.
GRÁFICO 4. Correlação positiva entre a quantidade de compostos fenólicos e a atividade antioxidante
(microplaca) dos extratos de cupiúba, com exceção do extrato EMGg
Essa observação sugere que exista algum constituinte que contribui particularmente e
mais efetivamente para a ação seqüestradora de radicais livres no extrato em MeOH dos
galhos grossos (EMGg).
A partir dos resultados observados é possível sugerir que os compostos fenólicos
presentes nos extratos de G. glabra são os principais responsáveis pela atividade antioxidante
apresentada. Em estudos recentes, uma correlação positiva entre esses parâmetros também foi
verificada (PIZZOLATTI et al., 2007; ASMAWI et al., 2008; PERES et al., 2009).
Essa atividade pode ser atribuída à presença dos derivados de tropolona (Goupiolona
A e Goupiolona B), 4-hidroxibenzaldeído, ácido cinâmico e ácido vanílico, isolados de folhas
de G. glabra em estudo anterior (MESA-SIVERIO et al., 2003), já que essas substâncias
apresentam grupos fenólicos em sua estrutura (pp. 12-13).
69
5.6. ATIVIDADE INIBIDORA DE ACETILCOLINESTERASE
Na avaliação qualitativa da atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase em CCD,
na qual a inibição da atividade enzimática é sugerida pelo surgimento de manchas
esbranquiçadas sob um fundo amarelo, não foram observados resultados positivos para
nenhum dos extratos de G. glabra.
O padrão utilizado nesse ensaio é a fisostigmina, um alcalóide isolado de Physostigma
venenosum (Leguminosae/Fabaceae). Essa substância é um inibidor de colinesterases, que
previne a destruição da acetilcolina, aumentando a atividade colinérgica. Drogas com esse
potencial são utilizadas no tratamento da doença de Alzheimer (DA), que é caracterizada pela
diminuição no funcionamento do sistema colinérgico central. O uso de inibidores de
acetilcolinesterase pode resultar no aumento significativo na memória dos pacientes.
Análogos de fisostigmina são utilizados atualmente no tratamento dessa doença e apresentam
maior tempo de ação e são menos tóxicos que a fisostigmina (DEWICK, 2002).
A procura por novos inibidores de acetilcolinesterase é de grande interesse, pois
somente as substâncias tacrina, donepezil, rivastigmina e galantamina foram aprovadas pelo
FDA para o tratamento da DA (INGKANINAN et al., 2003). Galantamina é o medicamento
considerado mais efetivo no tratamento dessa doença, pois é seletivo, reversível, apresenta
maior tempo de ação, e tem menos limitações (RHEE et al., 2001).
Como observado acima, os principais inibidores de acetilcolinesterase conhecidos são
alcalóides. Sendo assim, o resultado negativo para essa atividade, observado para os extratos
G. glabra, talvez seja devido a ausência dessa classe de metabólitos nesses extratos,
evidenciada na prospecção fitoquímica (p. 59).
70
5.7. ATIVIDADE CITOTÓXICA EM CÉLULAS TUMORAIS
O resultado, em percentagem, da inibição das linhagens tumorais utilizadas MDA-
MB435 (mama - humano), HCT-8 (cólon - humano) e SF-295 (glioblastoma - humano) por
extratos de cupiúba está disposto na TABELA 11.
TABELA 11. Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três linhagens tumorais
testadas na dose única de 50 µg/mL
EXTRATOS
LINHAGENS
EHF EAF EMF1 EMF2 EHGf EAGf EMGf EHGg EAGg EMGg
SF-295
(glioblastoma)
0,59
(PA)
12,61
(PA)
5,84
(PA)
6,89
(PA)
5,38
(PA)
16,22
(PA)
2,69
(PA)
42,73
(PA)
67,31
(MO)
3,87
(PA)
HCT-8
(cólon)
SA
58,35
(MO)
SA SA SA
68,02
(MO)
SA
39,30
(PA)
77,12
(MA)
SA
MDAMB-435
(mama)
SA
23,75
(PA)
SA SA
14,26
(PA)
17,80
(PA)
SA
42,35
(PA)
30,10
(PA)
SA
0 %: SEM ATIVIDADE (SA); 1 – 50 %: POUCA ATIVIDADE (PA); 51 – 75 %: MODERADA ATIVIDADE
(MO); 76 – 100 %: MUITA ATIVIDADE (MA)
Para avaliar o potencial citotóxico dos extratos testados, uma escala de intensidade foi
utilizada. Amostras sem atividade (SA, inibição de crescimento celular igual a 0%), com
pouca atividade (PA, inibição de crescimento celular variando de 1 a 50 %), com moderada
atividade (MO, inibição de crescimento celular variando de 51 a 75 %) e com muita atividade
(MA, inibição de crescimento celular variando de 75 a 100 %).
Nos extratos obtidos em AcOEt: das folhas (EAF – 58,35%) e dos galhos finos (EAGf
– 68,02%) foram observadas inibições de crescimento para a linhagem HCT-8 (cólon). No
extrato em AcOEt dos g. grossos (EAGg) observou-se maior atividade para células de cólon
HCT-8 (77,12%) do que para as células do sistema nervoso SF-295 (67,31%). O extrato que
71
apresentou maior atividade para células de mama MDA-MB435 (42,35%) foi o extrato em
hexano dos g. grossos (EHGg).
Os melhores resultados foram observados para os extratos obtidos em AcOEt [EAF
(folhas), EAGf (g. finos) e EAGg (g. grossos)], principalmente para células de cólon (HCT-8)
que variaram de 58,35 a 77,12%.
Dos extratos avaliados, apenas o extrato em AcOEt dos galhos grossos (EAGg)
apresentou potencial citotóxico (maior que 75 %) em pelo menos uma das três linhagens
tumorais empregadas na avaliação. Para esse extrato foi determinada a CI
50
, ou seja, a
concentração capaz de inibir 50% do crescimento celular.
O potencial citotóxico do EAGg foi avaliado para as mesmas linhagens de células
tumorais MDA-MB435, HCT-8 e SF-295 (mama, cólon e sistema nervoso) e mais a linhagem
HL-60 (leucemia – humano) e o resultado está disposto na TABELA 12.
O extrato EAGg apresentou valor de CI
50
= 13,73 µg/mL, com intervalo de confiança
entre 11,66 e 16,16 µg/mL, para a linhagem HL-60 (leucemia), o que representa que este
extrato possui potencial citotóxico, visto que, segundo critérios estabelecidos pelo Nacional
Cancer Institute (NCI, USA), o valor limite de CI
50
para extratos com atividade citotóxica
promissora é de 30µg/mL (BURIOL et al., 2009).
TABELA 12. Atividade citotóxica em linhagens de células tumorais humanas, realizado pelo Teste do MTT,
após 72 horas de incubação. A tabela apresenta os valores de CI
50
em µg/mL e o intervalo de confiança de 95%
(IC 95%)
Amostra
HL-60
(leucemia)
MDAMB-435
(mama)
SF-295
(glioblastoma)
HCT-8
(cólon)
EAGg
13,73
11,66 – 16,16
> 50
32,39
25,39 – 41,34
34,35
23,34 – 50,57
Dox
0,02
0,01-0,02
0,47
0,34-0,65
0,16
0,13-0,23
0,04
0,03-0,05
72
Esse extrato (EAGg) foi fracionado em coluna de sílica gel fornecendo 13 frações. As
frações 3 e 4 foram reunidas (p.107). O potencial citotóxico das frações 3 a 13 foi avaliado
para as linhagens de células tumorais MDA-MB435, HCT-8 e SF-295 (mama, cólon e sistema
nervoso) e o resultado está disposto na TABELA 13. As frações 1 e 2 não foram incluídas,
pois não havia quantidade suficiente para análise.
TABELA 13. Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das frações de EAGg em três linhagens
tumorais testadas na dose única de 25 µg/mL. Valores são média ± DPM (Desvio padrão da média)
Frações de EAGg
LINHAGENS
3 5 6 7 8 9 10 11 12 13
SF-295
(glioblastoma)
13,86
±5,24
85,37
±14,15
40,63
±5,89
71,89
±0,85
65,17
±2,23
67,77
±1,70
64,06
±2,75
64,52
±11,53
53,92
±8,58
3,44
±4,52
HCT-8
(cólon)
17,89
±0,62
68,71
±2,54
58,97
±7,18
73,07
±3,38
81,54
±1,24
80,02
±2,03
73,63
±7,01
66,56
±0,28
59,16
±14,80
10,82
±3,50
MDAMB-435
(mama)
19,66
± 3,26
101,37
±0,60
23,29
±2,96
31,48
±8,03
32,98
±27,05
73,45
±6,76
64,91
±3,38
38,70
±1,21
19,57
±6,76
3,65
±1,15
0 %: SEM ATIVIDADE (SA); 1 – 50 %: POUCA ATIVIDADE (PA); 51 – 75 %: MODERADA ATIVIDADE
(MO); 76 – 100 %: MUITA ATIVIDADE (MA)
Os melhores resultados foram observados na fração 5 (EAGg5) que apresentou
inibições de crescimento de 85,27% e 101,37% para as linhagens SF-295 e MDAMB-435,
respectivamente, o que representa um elevado potencial citotóxico.
Para a linhagem HCT-8 as frações 8 (81,54%) e 9 (80,02%) apresentaram potencial
citotóxico elevado.
Atividades moderadas foram observadas: na linhagem SF-295 para as frações 7 até 12,
com resultados variando de 53,92 até 71,89%; na linhagem HCT-8 para as frações 5 até 12,
com resultados variando de 58,97 até 73,63%; e na linhagem MDAMB-435 apenas para as
frações 9 (73,45%) e 10 (64,91%).
73
Os extratos obtidos em AcOEt foram os que apresentaram melhor atividade citotóxica
e para esses extratos foram observadas grandes quantidades de substâncias fenólicas (p. 67),
as quais podem ser atribuídas a atividade verificada, como já observado em estudos anteriores
para essa classe de metabólitos (DEL POZO-INSFRAN et al., 2006; WONG et al., 2006).
Essa atividade pode estar relacionada com a atividade antioxidante (WONG et al., 2006).
A atividade citotóxica em células tumorais observada para os extratos de G. glabra
também pode ser atribuída a presença das substâncias fenólicas isoladas anteriormente de
folhas de G. glabra, Goupiolona A e Goupiolona B, pois essas substâncias se comportam
como genotoxinas e, dessa forma, possuem potencial como drogas anti-câncer (MESA-
SIVERIO et al., 2003).
Cerca de 60% dos fármacos utilizados no tratamento do câncer são de origem vegetal
(GULLO et al., 2006). Visto a importância de produtos naturais na busca por fármacos
antineoplásicos, o isolamento e identificação dos princípios ativos presentes no extrato EAGg
é relevante.
74
5.8. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E ANTIFÚNGICA
A atividade antimicrobiana foi classificada de acordo com os valores de CIM,
considerando como: forte inibição – CIM ≤ 100 µg/mL; inibição moderada – CIM entre 100 e
500 µg/mL, fraca inibição - CIM entre 500 e 1000 µg/mL; e inativo – CIM acima de 1000
µg/mL (SANTOS et al., 2008).
5.8.1. Atividade antibacteriana
Os resultados da avaliação da atividade antibacteriana, expressos em µg/mL, estão
disposto na TABELA 14.
TABELA 14. Atividade antibacteriostática e antibactericida de extratos de Goupia glabra
CIM (µg/mL): concentração inibitória mínima, CBM (µg/mL): concentração bactericida mínima, Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtili.
A concentração inibitória mínima (CIM) é a concentração bacteriostática, ou seja, a
menor concentração capaz de inibir o crescimento bacteriano. A concentração bactericida
mínima (CBM) é a concentração letal, ou seja, é a menor concentração capaz de inibir o
crescimento e matar todas as bactérias.
Os extratos foram testados na concentração máxima de 1000 µg/mL
Todos os extratos demonstraram algum grau de atividade bacteriana.
P. aeruginosa E. coli S. aureus B. subtilis
Extratos CIM/CBM CIM/CBM CIM/CBM CIM/CBM
EAF
>500 >500
250/500
>500
EMF1
>500 >500 >500 >500
EMF2
>500 >500 >500 >500
EAGf
>500 >500 >500 >500
EMGf
>500 >500 >500 >500
EAGg
>500 >500 >500 >500
EMGg
>500 >500 >500 >500
75
O extrato em AcOEt das folhas (EAF) foi o que apresentou a melhor atividade contra a
bactéria S. aureus, com CIM e CBM de 250 e 500 µg/mL, respectivamente, representando
uma inibição moderada.
Essa atividade pode ser atribuída às substâncias fenólicas, presentes em maior
quantidade nesse extrato (p. 67), pois já foi observado, em estudos anteriores, que substâncias
dessa classe de metabólitos apresentam atividade antimicrobiana (BALASUNDRAM et al.,
2005; KOCAÇALIŞKAN et al., 2006; ROJAS-GRAÜ et al., 2006; JEONG et al., 2009),
como, por exemplo, flavonóides e taninos (PERES et al., 2009).
Os demais extratos apresentaram atividades semelhantes contra as bactérias testadas
(CIM e CBM >500 µg/mL), o que representa uma fraca inibição.
5.8.2 Atividade antifúngica
Os resultados da avaliação da atividade antifúngica, expressos em µg/mL, estão
dispostos na TABELA 15.
TABELA 15. Atividade antifungiostática e antifungicida de extratos de Goupia glabra
C. tropicalis C. albicans C. parapsilosis
Extratos CIM/CFM CIM/CFM CIM/CFM
EAF
500 >500
250
EMF1
500 >500 500
EMF2
250/500 >500 500
EAGf
500 >500
250
EMGf
500 >500 500
EAGg 250
>500 500
EMGg
500 >500 500
CIM (µg/mL): concentração inibitória mínima, CFM (µg/mL): concentração fungicida mínima. Candida
tropicalis, Candida albicans, Candida parapsilosis
A concentração inibitória mínima (CIM) é a concentração fungiostática, ou seja, a
menor concentração capaz de inibir o crescimento microbiano. A concentração fungicida
76
mínima (CFM) é a concentração letal, ou seja, é a menor concentração capaz de inibir o
crescimento e matar todos os fungos.
Os extratos foram testados na concentração máxima de 1000 µg/mL.
Todos os extratos demonstraram algum grau de atividade antifúngica. O fungo menos
suscetível aos extratos foi a espécie C. albicans (CIM e CFM >500 µg/mL), o que representa
uma inibição fraca.
Para a espécie C. parapsilosis os extratos em AcOEt das folhas (EAF) e dos galhos
finos (EAGf) apresentaram inibição moderada, com CIM e CFM de 250 µg/mL.
Para a espécie C. tropicalis, o extrato em AcOEt dos galhos grossos (EAGg)
apresentou atividade moderada, com CIM e CFM de 250 µg/mL, seguido do extrato em
MeOH das folhas (EMF2) com CIM e CFM de 250 e 500 µg/mL, respectivamente.
De forma geral, os extratos apresentaram atividade antifúngica moderada para as
espécies C. tropicalis e C. parapsilosis, e atividade fraca para a espécie C. albicans.
Com exceção do EMF2, o extratos que apresentaram melhor atividade foram os
obtidos em AcOEt (EAF, EAGf e EAGg). Esses extratos apresentaram grandes quantidades
de substâncias fenólicas (p. 67), as quais podem ser atribuídas a atividade verificada, como já
observado em estudos anteriores para essa classe de metabólitos (BALASUNDRAM et al.,
KOCAÇALIŞKAN et al., 2006). Substâncias fenólicas presentes em óleos essenciais, como o
eugenol e o carvacrol, apresentam atividade antifúngica e bactericida (HARRIS, 2002;
HIDALGO & DE LA ROSA, 2009).
Um fracionamento monitorado por bioensaio se faz necessário a fim de isolar e
identificar os princípios ativos presentes nos extratos de G. glabra, visto que a busca por
novas alternativas para o tratamento de doenças infecciosas é uma necessidade urgente no
cenário mundial e que cerca de 75% dos fármacos utilizados no tratamento dessas doenças
são de origem vegetal (GULLO et al., 2006; GUIMARÃES et al., 2010).
77
5.9. ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA
Os resultados da avaliação da atividade antiparasitária, apresentados como CI
50
, contra
formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi e promastigotas de Leishmania amazonensis,
estão dispostos na TABELA 16.
Os extratos foram testados na concentração máxima de 100 µg/mL.
TABELA 16. Atividade antiparasitária de extratos de Goupia glabra
Tripanossoma cruzi Leishmania amazonensis
Extratos CI
50
CI
50
EAF
>100 >100
EMF1
>100 >100
EMF2
>100 >100
EAGf
>100
50
EMGf 74
>100
EAGg 40 86
EMGg
>100 >100
CI
50
: concentração (em µg/mL) que inibe o crescimento de 50% dos parasitas em relação ao controle
Os melhores resultados são observados para os extratos em AcOEt dos galhos finos
(EAGf) e galhos grossos (EAGg) e em MeOH dos galhos finos (EMGf).
O EAGg apresentou atividade forte para ambos os parasitas com melhor resultado para
T. cruzi (CI
50
= 40 µg/mL) em comparação com L. amazonensis (CI
50
= 86 µg/mL).
Os extratos EAGf e EMGf apresentaram atividade forte e seletiva para os parasitas L.
amazonensis (CI
50
= 50 µg/mL) e T. cruzi (CI
50
= 74 µg/mL), respectivamente.
Esses resultados demonstram atividade antiparasitária significativa para extratos, em
comparação com resultados observados para substâncias isoladas de plantas. Para formas
epimastigotas de T. cruzi, por exemplo: uma piranocromona apresentou CI
50
= 11 µg/mL
(atividade forte) e um protolimonóide apresentou CI
50
= 100 µg/mL (atividade moderada).
Para formas promastigotas de L. amazonensis, por exemplo: um limonóide e um alcalóide,
78
apresentaram inibição de 45,6% e 42,5%, respectivamente, na concentração 320 µg/mL,
valores considerados como moderados (MOREIRA et al., 2009).
Atualmente, diversos alcalóides e outras moléculas isoladas têm demonstrado
atividade antiparasitária contra Leishmania sp com destaque para os metabólitos isolados de
plantas da família Annonaceae, como os alcalóides: berberina, anonaina, liriodenina, dentre
outros (CALDERON et al., 2009).
De acordo com a prospeção fitoquímica, não foram observados resultados positivos
para alcalóides nos extratos de G. glabra, o que sugere que outras classes de metabólitos são
responsáveis pela atividade antiparasitária observada.
Estudos futuros com frações e substâncias isoladas são necessários para compreender e
utilizar os princípios antiprotozoários presentes nos extratos de G. glabra, pois derivados de
plantas continuam a fornecer estruturas fundamentais e agentes terapêuticos para o tratamento
de doenças causadas por protozoários (TEMPONE et al., 2005).
5.10. RESUMO DAS ATIVIDADES OBSERVADAS
Na TABELA 17, estão dispostos de forma resumida, as atividades observadas para os
extratos de G. glabra.
Pode-se notar dessa forma que os extratos que apresentaram atividades biológicas
mais promissoras foram EAF, EAGf e EAGg (obtidos em AcOEt).
As atividades foram atribuídas, de forma geral, às substâncias fenólicas presentes em
grande quantidade nesses extratos.
79
TABELA 17. Atividades observadas para os extratos de G. glabra
EXTRATOS
ENSAIOS Unidade
EHF
EAF EMF1
EMF2 EHGf
EAGf EMGf
EHGg
EAGg
EMGg
Cubeta CE
50
(µg/mL) ND
9,76
69,39 84,68 ND 21,00 21,30 ND ND ND
Antioxidante
Microplaca CE
50
(µg/mL) ND
19,87
72,03 85,95 ND 35,08 29,74 ND 27,68 30,17
Fenólicos totais
Folin-Ciocalteau mg de EAG/g ND
242,86
144,36
98,33 ND 181,43
214,60
ND 196,33
137,33
Letalidade
A. salina % 20,0 2,5 12,5 5,0 10,0 25,0 22,5 17,5 17,5 20,0
SF-295 % 0,59 12,61 5,84 6,89 5,38 16,22 2,69 42,73 67,31 3,87
HCT-8 % – 58,35 – – – 68,02 – 39,30
77,12
–
Citotoxicidade em
células tumorais
MDA-MB435 % – 23,75 – – 14,26 17,80 – 42,35 30,10 –
P. aeruginosa ND
>500 >500 >500 ND >500 >500 ND >500 >500
E. coli ND
>500 >500 >500 ND >500 >500 ND >500 >500
S. aureus ND
250/500
>500 >500 ND >500 >500 ND >500 >500
Antibacteriana
B. subtilis
CIM/CBM
(µg/mL)
ND
>500 >500 >500 ND >500 >500 ND >500 >500
C. tropicalis ND 500 500
250
/500
ND 500 500 ND
250
500
C. albicans ND >500 >500 >500 ND >500 >500 ND >500 >500
Antifúngica
C. parapsilosis
CIM/CFM
(µg/mL)
ND
250
500 500 ND
250
500 ND 500 500
T. cruzi ND >100 >100 >100 ND >100
74
ND
40
>100
Antiparasitária
L. amazonensis
CI
50
(µg/mL)
ND >100 >100 >100 ND
50
>100 ND
86
>100
80
LEGENDA:
EHF= extrato em hexano de folhas; EAF= extrato em AcOEt de folhas; EMF1= extrato em MeOH de folhas 1; EMF2= extrato em MeOH de folhas 2;
EHGf= extrato em hexano de galhos finos; EAGf= extrato em AcOEt de galhos finos; EMGf= extrato em MeOH dos galhos finos;
EHGg= extrato em hexano de galhos grossos; EAGg= extrato em AcOEt de galhos grossos; EMGg= extrato em MeOH dos galhos grossos.
(–) inativo; ND= não determinado; CE
50
= Concentração do extrato necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50%. EAG= equivalente de ácido gálico;
CIM= concentração inibitória mínima; CBM= concentração bactericida mínima; CFM= concentração fungicida mínima; CI
50
= concentração que inibe 50% do cresimento do
parasita
SF-295 (glioblastoma - humano), HCT-8 (cólon - humano), MDA-MB435 (mama - humano),
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtili,
Candida tropicalis, Candida albicans, Candida parapsilosis, Trypanosoma cruzi, Leishmania amazonensis
Antioxidante – (forte) - menor que 20 µg/mL; (moderada) - entre 20 e 50 µg/mL; (fraca) - entre 50 e 100 µg/mL
Fenólicos totais – (forte) - maior que 200 mg/g; (moderada) - entre 100 e 200 mg/g; (fraca) - entre100 e 50 mg/g
Letalidade – (moderada) - maior que 50%; (fraca) - entre 50 e 25 %; (inativo) - menor que 25%
Citotoxicidade em células tumorais – (forte) entre 100 e 75%; (moderada) entre 75 e 51%; (fraca) entre 1 e 50 %; (inativo) 0%
Antibacteriana – (forte) ≤ 100 µg/mL; (moderada) entre 100 e 500 µg/mL; (fraca) entre 500 e 1000 µg/mL;
Antifúngica – (forte) ≤ 100 µg/mL; (moderada) entre 100 e 500 µg/mL; (fraca) entre 500 e 1000 µg/mL;
Antiparasitária – (forte) ≤ 100 µg/mL; (fraca) maior que 100 µg/mL
81
5.11. FRACIONAMENTOS DE EXTRATOS E FRAÇÕES
5.11.1. Extrato de folhas obtido em Hexano (EHF)
O extrato de folhas obtido em hexano (EHF) (4,998 g) foi submetido ao fracionamento
por meio de coluna cromatográfica (4 cm) em gel de sílica (70-230 mesh) eluída em Hexano e
Acetato de etila em gradiente de eluição, sendo recolhidas 9 frações (250 mL). As frações
foram analisadas por CCD e codificadas numericamente de EHF1 a EHF9 (ESQUEMA 9).
A fração EHF5 (1,087 g) foi re-cromatografada em coluna gel de sílica (2 cm) eluída
em Hexano, Clorofórmio e Acetona em gradiente de eluição. Recolheu-se um total de 11
frações que foram analisadas por CCD e codificadas por letra de EHF5A a EHF5K.
A fração EHF5H (569,9 mg) apresentou-se na forma de um sólido cristalino e foi re-
cromatografada em coluna gel de sílica (2,0 cm) com Hexano, Clorofórmio e Acetona em
misturas de polaridade crescente, recolhendo-se 14 frações que foram analisadas por CCD e
codificadas numericamente de EHF5H1 a EHF5H14.
As frações EHF5H6, EHF5H7 e EHF5H8 apresentaram-se sob a forma cristalina e
foram reunidas, codificadas como EHF5H7 (348,8 mg) que foi re-cromatografada em coluna
gel de sílica (2,0 cm), utilizando carvão vegetal ativado para remover a clorofila presente. O
eluente utilizado foi Clorofórmio e Acetona na proporção de 1:1 recolhendo-se 3 frações que
foram analisadas por CCD e codificadas como EHF5H7/1, EHF5H7/2 e EHF5H7/3.
A fração EHF5H7/2 (270,5 mg) apresentou-se na forma de cristais e foi re-
cromatografada nas mesmas condições da coluna anterior para remoção de clorofila. Foram
recolhidas 4 frações que foram analisadas por CCD e codificadas como EHF5H7/2-1 a
EHF5H7/2-4.
A fração EHF5H7/2-4 (120,0 mg) apresentou-se na forma de cristais e foi re-
cromatografada nas mesmas condições da coluna anterior para remoção de clorofila. Foram
82
recolhidas 4 frações que foram analisadas por CCD e codificadas como EHF5H7/2-4-1 a
EHF5H7/2-4-4.
As frações EHF5H7/2-4-2 e EHF5H7/2-4-3 apresentaram-se na forma de cristais e
foram reunidas, codificadas como EHF5H7/2-4-2 e re-cromatografada em coluna gel de sílica
(2,0 cm) com Hexano, Clorofórmio e Acetona em misturas de polaridade crescente. Foram
recolhidas 21 frações que foram analisadas por CCD reunidas em 8 frações e codificadas
como EHF5H7/2-4-2A a EHF5H7/2-4-2H.
A fração EHF5H7/2-4-2D (33,8 mg) e EHF5H7/2-4-2E (21,9 mg) apresentavam-se
como um sólido branco cristalino sob a forma de agulhas. Após o processo de isolamento
através de colunas cromatográficas e análise por CCD, verificou se tratar da mesma
substância, e ambas apresentavam uma única mancha (FIGURA 29). Essa fração foi enviada
para análise de IV, RMN de H
1
, C
13
e DEPT.
FIGURA 29. CCD das frações EHF5H7/2-4-2D e EHF5H7/2-4-2E, eluída em: Hex/CHCl
3
/Acetona (5:3:2) e
revelada com sulfato cérico/ácido sulfúrico
83
ESQUEMA 9. Fracionamento do Extrato em Hexano de Folhas (EHF)
84
5.11.1.1. Identificação de EHF5H7/2-4-2D
A substância codificada como EHF5H7/2-4-2D (33,8 mg), foi isolada na forma de um
sólido branco cristalino. Para tal identificação, realizou-se experimentos de ponto de fusão
(PF), IV e RMN de
1
H e
13
C e comparou-se com dados da literatura (KOJIMA et al., 1990;
GOULART et al., 2003; FACUNDO et al., 2008).
A substância EHF5H7/2-4-2D apresentou PF igual a 136,2 ºC. A CCD eluída em
Hex/CHCl
3
/Acetona 5:3:2 mostrou, após revelação com vanilina sulfúrica, uma mancha (R
f
=
0,48) de coloração lilás característica de triterpenos ou esteróides (MATOS, 2001).
Analisando o espectro de absorção na região do IV (obtidos em pastilha de KBr)
observou-se um perfil de absorção característico da família dos fitoesteróis. As seguintes
bandas de absorção foram verificadas: uma banda larga em 3414-3330 cm
-1
atribuída à
deformação axial de O-H e sobreposição de várias bandas na região de 2840-3000 cm
-1
devido à deformação axial de C-H de sistema saturado; em 1653 cm
-1
uma banda atribuída à
deformação axial de C=C; em 1464 cm
-1
uma banda de deformação angular simétrica no
plano de grupo metileno (CH
2
); em 1382 cm
-1
observa-se uma banda de deformação angular
das ligações C-H do grupamento metila (CH
3
); as absorções entre 1350 e 1150 cm
-1
são
atribuídas à deformação angular simétrica e assimétrica fora do plano do metileno (CH
2
); em
1053 cm
-1
uma absorção de deformação axial de C-O de álcool secundário com anel alicíclico
de cinco ou seis átomos.
85
ESPECTRO 1. Espectro de IV de EHF5H7/2-4-2D
86
Os deslocamentos químicos observados nos espectros de RMN de
1
H e
13
C e DEPT
foram comparados com os dados já existentes na literatura (TABELA 13 e 14) e essa análise
inicial indicou se tratar de uma mistura complexa de compostos com características de
esteróides. (KOJIMA et al., 1990; GOULART et al., 2003; FACUNDO et al., 2008). A partir
dos dados obtidos foi possível perceber que a mistura isolada continha os esteróides: β-
sitosterol e estigmasterol, e possivelmente, campesterol (FIGURA 30).
FIGURA 30. Estruturas de β-sitosterol, estigmasterol e campesterol
Os sinais observados para o RMN de
1
H (ESPECTRO 2; TABELA 18) foram: um
singleto em δ 0,68 referente ao grupo metílico C18; vários sinais entre δ 0,7-1,0 de grupos
metílicos; vários sinais entre δ 1,0-2,3 de grupos metilênicos; multipleto em δ 3,552-3,485,
atribuído ao próton H-3 (característico de hidrogênio ligado a carbono carbinólico); dois
duplos dubletos em δ 5,017 (J=15,0 e J=8 Hz) e 5,153 (J=15,5 e J=8 Hz) atribuídos ao
prótons H-22 e H-23 do estigmasterol; dubleto largo em δ 5,349, atribuído ao próton olefínico
(H-6) do
β-sitosterol e do estigmasterol, com constante de acoplamento (J) igual a 5,0 Hz.
β-sitosterol estigmasterol
campesterol
87
TABELA 18. Resultados experimentais de RMN de
1
H (δ em ppm, CDCl
3
, 500MHz) para os esteróides β-
sitosterol e estigmasterol comparados com a literatura (FACUNDO et al., 2008).
H β-sitosterol (δ)
exp
β-sitosterol (δ)
lit
Estigmasterol (δ)
exp
Estigmasterol (δ)
lit
3 3,518 (m) 3,51 (m) 3,518 (m) 3,51 (m)
6 5,349 (d) 5,36 (d) 5,349 (d) 5,12 (d)
18 0,680 (s) 0,68 (s) 0,698 (s) 0,69 (s)
19 1,007 (s) 1,02 (s) 1,014 (s) 1,02 (s)
21 0,92 (s) 0,93 (s) 1,02 (s) 1,03 (s)
22 - - 4,993-5,041 (dd) 5,22-4,95 (m)
23 - - 5,129-5,177 (dd) 5,22-4,95 (m)
26 0,830 (s) 0,83 (s) 0,860 (s) 0,86 (s)
27 0,806 (s) 0,80 (s) 0,820 (s) 0,81 (s)
88
ESPECTRO 2. RMN
1
H (δ em ppm, CDCl
3
e 500MHz) de EHF5H7/2-4-2D
89
O espectro de RMN de
13
C (ESPECTRO 3, TABELA 19) apresentou: um sinal em δ
72,163, atribuído a um grupo carbinólico metílico; quatro sinais de carbono com valores de
deslocamento característicos de carbonos sp
2
, que são: δ 138,657 e 129,645 da ligação dupla
entre os carbonos 22 e 23 do estigmasterol (de menor intensidade) e δ 122,064 e 141,118,
referentes à ligação dupla entre os carbonos 5 e 6 (de maior intensidade) de ambos esteróides.
ESPECTRO 3. RMN
13
C (δ em ppm, CDCl
3
e 125MHz) de EHF5H7/2-4-2D
90
ESPECTRO 4. RMN
13
C (DEPT, δ em ppm, CDCl
3
e 125MHz) de EHF5H7/2-4-2D
91
TABELA 19. Resultados experimentais de RMN de
13
C (δ em ppm, CDCl
3
, 125MHz) para os esteróides β-
sitosterol e estigmasterol comparados com a literatura (KOJIMA et al., 1990).
C β-sitosterol (δ)
exp
β-sitosterol (δ)
lit
Estigmasterol (δ)
exp
Estigmasterol (δ)
lit
CH
2
-1 37,618 37,20 37,618 37,2
CH
2
-2 32,022 31,6 32,022 31,6
CH-3 72,163 71,8 72,163 71,8
CH
2
-4 42,683 42,3 42,683 42,3
C-5 141,118 140,7 141,118 140,7
CH-6 122,064 121,7 122,064 121,7
CH
2
-7 32,268 31,9 32,268 31,9
CH
2
-8 32,268 31,9 32,268 31,9
CH-9 50,502 50,1 50,502 50,1
C-10 36,864 36,6 36,864 36,6
CH
2
-11
21,435 21,1 21,435 21,1
CH
2
-12
40,138 39,9 40,042 39,7
C-13 42,661 42,3 42,661 42,2
CH-14 57,130 56,6 57,229 56,6
CH
2
-15
24,658 24,3 24,716 24,4
CH
2
-16
28,598 28,8 28,598 28,9
CH-17 56,427 56,0 56, 329 55,9
CH
3
-18
12,214 11,9 12,400 12,0
CH
3
-19
19,747 19,4 19,747 19,4
CH-20 36,501 36,1 40,830 40,5
CH
3
-21
19,135 18,8 21,559 21,2
CH
x
-22
34,311 33,9 (CH
2
) 138,657 138,3 (CH)
CH
x
-23
26,456 26,6 (CH
2
) 129,645 129,2 (CH)
CH-24 46,206 45,5 51,593 51,2
CH-25 29,528 29,1 32,268 31,9
CH
3
-26
20,164 19,9 21,559 21,1
CH
3
-27
19,395 19,0 19,395 19,0
CH
2
-28
23,434 23,0 25,753 25,4
CH
3
-29
12,334 12,0 12,591 12,2
92
Foram observados no espectro de RMN
13
C outros sinais (de menor intensidade) que
poderiam ser atribuídos à substância campesterol quando comparados com os sinais descritos
na literatura (TABELA 20) (WRIGHT et al., 1978).
O β-sitosterol e o campesterol possuem cadeias laterais muito parecidas e os
deslocamentos químicos referentes ao carbono da ligação dupla de ambos são idênticos.
Dessa forma, a presença de campesterol não pode ser evidenciada apenas por RMN
1
H e
13
C,
sendo necessário uma análise por CG-EM para confirmar sua presença.
TABELA 20. Resultados experimentais de RMN de
13
C (δ em ppm, CDCl
3
, 125MHz) para o campesterol
comparados com a literatura (WRIGHT et al., 1978).
C Campesterol (δ)
exp
Campesterol (δ)
lit
CH
2
-4 42,577 42,40
CH-9 50,527 50,24
C-13 42,577 42,40
CH-20 36,234 35,96
CH
3
-22 34,084 33,80
CH-24 39,200 38,92
CH
3
-26 20,556 20,26
CH
3
-27 18,603 18,32
CH
3
-28 15,733 15,44
A relação entre o β-sitosterol (1) e estigmasterol (2) foi obtida através dos espectros de
RMN
1
H. As percentagens aproximadas dos dois constituintes da mistura foram calculadas
com base na integração dos sinais correspondentes a H-6 (intensidade relativa: 1,92, 1 + 2) e
H-22 e H-23 (intensidade relativa: 0,84, 2) (GOULART et al., 2003). A metade de 0,84
(0,84/2=0,42) representou um próton da molécula de estigmasterol (2). Subtraindo esse valor
0,42 de 1,92 (H-6 de 1 + 2) obteve-se a intensidade 1,50 correspondente a um próton da
molécula de
β-sitosterol (1). As intensidades relativas 0,42 (1H de 2) e 1,50 (1H de 1)
93
permitiram deduzir que a mistura [1,92 (1 + 2) = 100%] contém 21,875 % de estigmasterol
(2) e 78,125 % de β-sitosterol (1).
A presença de maior quantidade de β-sitosterol na mistura pôde ser confirmada
também pelo ponto de fusão observado para EHF5H7/2-4-2D (136,2 ºC), que foi compatível
com o ponto de fusão observado na literatura para essa substância (134-136 ºC, DUTRA et
al., 1992), em detrimento do ponto de fusão de estigmasterol (170-172 ºC, ZUCHINALLI,
2009).
O β-sitosterol apresenta-se, em geral, distribuído em todas as partes das plantas e,
quando isolado em mistura com o estigmasterol, está praticamente sempre em maior
proporção. Infelizmente a maioria dos trabalhos obtidos da literatura não descrevem análises
quantitativas sobre a proporção entre as duas substâncias, nos extratos estudados (GALOTTA
& BOAVENTURA, 2005).
Os esteróis são componentes essenciais às membranas das células e podem ser
produzidos por animais e plantas. São precursores da biossíntese de diversos hormônios e da
vitamina D (DIAS et al., 2009). Os fitoesteróis possuem vários efeitos terapêuticos dentre
eles: anticarcinogênicos, antiinflamatórios, antitérmicos, antiulcerosos, liberação de insulina e
atividades estrogênicas. São importantes na indústria farmacêutica, de alimentos e de
cosméticos (DELPORT et al., 1998; ABIDI, 2001; BRINKER et al., 2007).
Uma investigação realizada com sitosterol e estigmasterol evidencia a ação destes
compostos na neutralização de veneno de cobra (GOMES et al., 2007) e, segundo TOMA e
colaboradores (2003), o β-sitosterol, estigmasterol e campesterol, podem ter contribuído para
a atividade analgésica apresentada pelo extrato hexânico de Quassia amara. Ainda em estudo
realizado com o β-sitosterol e estigmasterol, CHANDLER e colaboradores (2006),
concluíram que a presença da insaturação no carbono C-22 no estigmasterol conferiu
atividade antihipercolesterolêmica mais significante do que o
β-sitosterol. Atividade
94
antimicrobiana foi observada para a mistura dos três esteróides (50% - β-sitosterol; 21,7% -
estigmasterol e 22,8% de campesterol) contra Staphylococcus aureus (CORTEZ et al., 1998).
Esses esteróides atuam como repositores da barreira lipídica da pele, minimizando o
ressecamento e a desidratação da mesma. Possuem poder de absorver as radiações UVB e
UVC. O β-sitosterol é capaz de formar um filme não oclusivo que impede a perda de água
transepedérmica (PASTORE JR et al., 2005).
Especificamente para o β-sitosterol, há relatos de atividade antimicrobiana
(VIRTUOSO et al., 2005); atividade inibitória em várias fases do desenvolvimento de
tumores, especialmente na transformação de células pré-neoplásicas em células neoplásicas
(crescimento anormal) (GAO et al., 2003); antimutagênico (VILLASEÑOR et al., 2002);
efeitos reversíveis antifertilidade, como redução nos níveis de espermatozóides (MALINI &
VANITHAKUMARI, 1991); atividade antiinflamatória e antitérmica (DELPORT et al.,
1998).
Para o campesterol, foi observado efeito anticarcinogênico e potencial antiangiogênico
(CHOI et al., 2007).
Embora os esteróis identificados sejam comuns em plantas, é a primeira vez que estão
sendo relatados na família Goupiaceae.
95
5.11.2. Extrato de folhas obtido em acetato de etila (EAF)
O extrato de folhas obtido em acetato de etila (EAF) (5,00 g) foi submetido ao
fracionamento por meio de coluna cromatográfica (4 cm) em gel de sílica (70-230 mesh)
eluída em Hexano, Clorofórmio e Acetato de etila em gradiente de eluição, sendo recolhidas
14 frações (250 mL). As frações foram analisadas por CCD e codificadas numericamente de
EAF1 a EAF14 (ESQUEMA 10).
As frações EAF4, EAF5 e EAF6 apresentaram-se sob a forma cristalina e foram
reunidas, codificadas como EAF4 (700,0 mg) que foi re-cromatografada em coluna gel de
sílica (2,0 cm) com Hexano, Clorofórmio e Acetato de etila em misturas de polaridade
crescente, recolhendo-se 15 frações que foram analisadas por CCD e codificadas como
EAF4A a EAF5O.
As frações EAF4F (325,7 mg), EAF4G (285,9 mg) e EAF4H (33,8 mg) apresentaram-
se sob a forma cristalina. A fração EAF4F (300 mg) foi re-cromatografada em coluna gel de
sílica (2,0 cm) com Hexano, Clorofórmio e Acetona em misturas de polaridade crescente,
recolhendo-se 15 frações que foram analisadas por CCD e após reunião em 6 frações foram
codificadas como EAF4F1 a EAF4F6.
As frações EAF4F3 a EAF4F5 apresentavam-se como cristais transparentes sob a
forma de agulhas com impurezas esverdeadas. Essas frações foram reunidas e codificadas
apenas como EAF4F3 (102,8 mg) e purificadas em coluna gel de sílica (2,0 cm) com carvão
vegetal ativado e eluente Acetato de Etila. Após esse processo e análise por CCD, verificou-se
uma única mancha na fração coletada (82,9 mg). Essa fração foi enviada para análise de IV,
RMN de H
1
, C
13
, HMBC e HSQC.
96
ESQUEMA 10. Fracionamento do Extrato em AcOEt de Folhas (EAF)
97
As frações EAF4G, EAF4H e EAF4F2 foram reunidas e codificadas apenas como
EAF4G (384,4 mg) e re-cromatografada em coluna de gel de sílica (2,0 cm) com Hexano,
Clorofórmio e Acetona em misturas de polaridade crescente, recolhendo-se 18 frações que
foram analisadas por CCD e após reunião em 15 frações foram codificadas como EAF4G1 a
EAF4G15 (ESQUEMA 11).
As frações EAF4G6 (117,0 mg) e EAF4G7 (136,5 mg) apresentavam-se como cristais
transparentes sob a forma de agulhas com impurezas esverdeadas. Essas frações foram
purificadas em coluna gel de sílica (2,0 cm) com carvão vegetal ativado e eluente Acetato de
Etila. Após esse processo e análise por CCD, verificou-se uma única mancha na fração
coletada de cada uma: EAF4G6 (102,2 mg) e EAF4G7 (123,8 mg).
ESQUEMA 11. Fracionamento da fração EAF4G
As frações EAF4G6 e EAF4G7 foram analisadas em CCD e verificou-se por
comparação com EAF4F4, que se tratava da mesma substância isolada, totalizando 308,9 mg.
98
5.11.2.1. Identificação de EAF4F3
A substância codificada como EAF4F3 (82,9 mg), foi isolada na forma de um sólido
branco cristalino, com ponto de fusão igual a 98,9 ºC. A CCD desta substância
(Hex/CHCl
3
/AcOEt (5:2:5) mostrou, após revelação com solução de FeCl
3
em etanol, uma
mancha de coloração azul (R
f
= 0,44) característica de compostos fenólicos (MATOS, 2001).
O espectro de absorção na região do infravermelho (ESPECTRO 5) apresentou uma
banda larga em 3452-3329 cm
-1
atribuída à deformação axial de O-H; em 3052 cm
-1
uma
banda atribuída à deformação axial de C-H de aromáticos; harmônicas ou bandas de
combinação são observadas entre 1923-1696 cm
-1
; as bandas 1619, 1602 e 1513 cm
-1
são
características de deformação axial de C=C do anel aromático; em 1364 cm
-1
observa-se uma
banda de deformação angular fora do plano de O-H; as bandas entre 1256 e 1041 cm
-1
são
atribuídas a deformação axial de C-O; entre 849 e 741 cm
-1
bandas de deformação angular
fora do plano de =C-H.
ESPECTRO 5. Espectro de IV de EAF4F3
99
O RMN de
1
H (ESPECTRO 6) mostrou a presença de dois sinais:
• Dois multipletos em δ 6,80-6,83 e 6,85-6,88 atribuídos a hidrogênios ligados a
anel aromático, cuja integração mostrou a presença de 2 hidrogênios.
• Um sinal simples em δ 5,21 com integração para 1 hidrogênio, atribuído a um
hidrogênio de hidroxila (OH).
Os sinais observados no RMN de
1
H estão de acordo com o que foi observado no IV,
onde verificou-se a presença de: anel aromático, hidroxila, ligação C-O e ligações duplas.
ESPECTRO 6. Espectro de RMN de
1
H de EAF4F3
100
O RMN de
13
C (ESPECTRO 7) mostrou a presença de três sinais: δ 143,76; 121,49 e
115,74. O sinal em δ 143,76 foi atribuído a um carbono de anel aromático ligado a um grupo
hidroxila. Os outros sinais foram atribuídos a carbonos de anel aromático.
ESPECTRO 7. Espectro de RMN de
13
C de catecol
Conforme os deslocamentos químicos supracitados, unidas com as outras informações
de IV, e comparando esses valores com os dados da literatura (JEONG et al., 2009), pode-se
sugerir a estrutura do composto isolado como sendo catecol (FIGURA 31, TABELA 21).
101
Os sinais observados no RMN de
1
H com integração para apenas três hidrogênios
juntamente com os três sinais do RMN de
13
C deve-se a estrutura do catecol apresentar um
eixo de simetria, ou seja, os sinais se sobrepõem.
Figura 31. Estrutura do catecol (eixo de simetria)
TABELA 21. Comparação entre os sinais observados para catecol e dados encontrados na literatura (JEONG et
al., 2009)
Dados experimentais Dados da literatura
RMN
1
H (δ, ppm)
6,80-6,83 (m)
6,85-6,88 (m)
5,21 (s)
6,79-6,82 (m)
6,85-6,87 (m)
5,00-5,35 (d)
RMN
13
C (δ, ppm)
143,76
121,49
115,74
143,67
121,09
115,41
IV (cm
-1
)
3452-3329
3052
1923-1696
1619-1513
849
3450-3323
3052
1923
1620-1514
849
Espectros bidimensionais HSQC (Correlação Heteronuclear) e HMBC (Correlação
Heteronuclear de longa distância) também foram realizados.
102
No espectro de HSQC (ESPECTRO 8) foram observadas correlações entre os sinais
dos hidrogênios em δ 6,85-6,88 (H2) com o sinal do carbono em δ 115,74 (C2) e entre os
sinais dos hidrogênios em δ 6,80-6,83 (H3) com o sinal do carbono em δ 121,49 (C3).
ESPECTRO 8. Expansão de HSQC de EAF4F3
No espectro de HMBC (ESPECTRO 9) foram observadas correlações entre os sinais
dos hidrogênios em δ 6,85-6,88 (H2) com os sinais dos carbonos em δ 143,76 (C1) (J
2
) e
121,49 (C3) (J
2
).
103
ESPECTRO 9. Expansão de HMBC de EAF4F3
Esse composto apresentou atividade antioxidante maior (CE
50
= 1,25 ± 0,019 µg/mL)
do que a quercetina (CE
50
= 4,17 ± 0,127 µg/m) no ensaio com o radical DPPH· (pp. 65-66).
Foi possível identificar a presença de catecol em todos os extratos de média polaridade
(AcOEt) através de comparação por CCD (FIGURA 32). Esses extratos foram os que
apresentaram maior potencial para as atividades testadas.
A presença de catecol também foi verificada na fração EAGg5. Essa fração apresentou
maior potencial antitumoral em relação às demais frações testadas (pp. 70-72).
Embora o catecol não seja uma substância inédita, é a primeira vez que está sendo
relatado na família Goupiaceae.
104
FIGURA 32. CCD dos extratos de média polaridade (AcOEt). Presença de catecol evidenciada. [Eluente:
Hex/CHCl
3
/AcOEt (5:2:5); Revelador: solução de FeCl
3
]
O catecol é um composto fenólico simples que apresenta distribuição restrita na
natureza (SOARES, 2002). Foi isolado pela primeira vez em 1839 por H. Reinsch por
destilação do catecino (proveniente de Mimosa catechu) (ZHENG et al., 2008). Sua fórmula
molecular é C
6
H
6
O
2
, apresenta-se sob a forma de um sólido branco com PE de 245,5 ºC e PF
entre 104-105 ºC (CETESB).
Devido ao padrão de oxigenação observado para essa molécula, a rota biossintética
ocorre pela via do ácido chiquímico (FIGURA 33).
Pequenas quantidades de catecol ocorrem naturalmente em frutas e legumes,
juntamente com a enzima polifenol oxidase (ZHENG et al., 2008), e seus derivados são
encontrados especialmente na família Anacardiaceae (OLIVEIRA, 2002). Após a exposição
ao ar (como quando uma batata ou maçã é cortada), o catecol incolor oxida à benzoquinona
que possui coloração marrom-avermelhada, que é responsável pelo escurecimento de frutas e
legumes cortados (ZHENG et al., 2008).
Catecol já foi identificado em espécies como: abacate (Persea americana), baunilha
(Vanilla planifolia), cacau (Theobroma cacao), caqui (Diospyrus kaki), canela (Cinnamomum
zeylanicum), cebola-de-cabeça (Allim cepa), erva-doce (Pimpinella anisum), guaraná
105
(Paullinia cupana), orégano (Origanum vulgare), mostarda (Brassica sp.), unha-de-gato
(Uncaria guianensis), dentre outras. (DEFILIPPS et al., 2004; MOREIRA & MANCINI-
FILHO, 2004; JEONG et al., 2009; LIBER HERBARUM MINOR).
FIGURA 33. Provável rota biossintética de catecol
A estrutura do esqueleto catecol também é encontrada em compostos polifenólicos,
como a quercetina e catequinas, que exibem uma ampla gama de atividades biológicas,
incluindo efeitos antioxidante, anti-inflamatório e neuroprotetor (ZHENG et al., 2008).
Flavonóides diidroxilados que possuem o sistema catecol (3’,4’-diidroxi) no anel B possuem
forte atividade antioxidante quando comparados ao α-tocoferol, ácido ascórbico, β-caroteno,
glutationa, ácido úrico e bilirrubina (BARREIROS et al., 2006). A presença de sistema
catecol no anel B também é um fator estrutural importante para a atividade antiinflamatória
dos flavonóides (COUTINHO et al., 2009).
Catecol atua na recuperação de plantas afetadas por pragas ou doenças (BROEK, et
al., 2002) e pode promover o enraizamento em espécies vegetais (HACKETT, 1970).
106
Em estudos realizados com o catecol foram observados resultados positivos para
atividades antioxidante (MOREIRA & MANCINI-FILHO, 2004), antiinflamatória e
neuroprotetora, (ZHENG et al., 2008), antibacteriana e antifúngica (KOCAÇALIŞKAN et al.,
2006; JEONG et al., 2009).
As propriedades antimicrobianas observadas para o catecol e seus derivados contra
bactérias nocivas (Clostridium difficile, C. perfringens e Escherichia coli) combinado com
quase nenhum efeito adverso sobre bactérias benéficas (Bifidobacterium breve, B. longum e
Lactobacillus casei) indica que espécies contendo esse composto podem ter valor
farmacológico (JEONG et al., 2009).
As propriedades antiinflamatórias e neuroprotetoras do catecol (inclusive de seus
derivados como o 3-metilcatecol, 4-metilcatecol e 4-tertbutilcatecol) cultivados em micloglia
e células de neuroblastoma sugerem um potencial terapêutico destes compostos para o
tratamento de muitas doenças neurodegenerativas que são associadas com uma excessiva
ativação pró-inflamatória da micloglia (ZHENG et al., 2008).
No entanto, é necessário verificar se essa atividade é grande o suficiente para justificar
a avaliação destes compostos em aplicações clínicas para determinar se a sua utilização em
seres humanos é possível (JEONG et al., 2009). Além disso, o catecol se auto-oxida em pH
neutro, e isso o torna altamente instável e provavelmente impróprio como droga potencial.
Estudos futuros serão necessários para compreender os mecanismos moleculares precisos das
ações antiinflamatórias de catecol in vitro e in vivo para dar um novo uso terapêutico para o
catecol e seus derivados estáveis no tratamento de doenças neurodegenerativas e outras
doenças inflamatórias (ZHENG et al., 2008).
107
5.11.3. Extrato de galhos grossos obtido em acetato de etila (EAGg)
O extrato de galhos grossos obtido em acetato de etila (EAGg) (575,8 mg) foi
submetido ao fracionamento por meio de coluna cromatográfica (3 cm) em gel de sílica (70-
230 mesh) eluída em Hexano, Clorofórmio e Acetato de etila em gradiente de eluição, sendo
recolhidas 13 frações (70 mL) (ESQUEMA 12). As frações foram analisadas por CCD e
codificadas numericamente de EAGg1 a EAGg13. As frações EAGg3 e 4 foram reunidas e
codificadas apenas como EAGg3.
ESQUEMA 12. Fracionamento do Extrato em AcOEt de Galhos finos (EAGf)
Cerca de 5 mg das frações EAGg3 até EAGg13 foram enviadas para o Laboratório de
Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará (UFC) para avaliar o potencial
citotóxico em células tumorais.
Na fração EAGg5 foi identificada a presença de catecol através de comparação por
CCD.
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
109
Como resultado do estudo fitoquímico e das atividades biológicas realizadas para os
10 extratos (folhas, galhos finos e g. grossos) de Goupia glabra pode-se concluir que:
1) Foram isolados e identificados: um composto fenólico simples (catecol) do extrato
em AcOEt de folhas (EAF) e uma mistura de esteróides (β-sitosterol e estigmasterol) do
extrato em hexano de folhas (EHF).
2) Através de comparação por CCD foi possível identificar a presença de catecol em
todos os extratos de média polaridade (AcOEt). Esses extratos foram os mais ativos para as
atividades testadas nesse trabalho.
3) Em relação à atividade antioxidante, o extrato que mais se destacou foi o EAF,
apresentando CE
50
=9,76 ± 0,42 (em cubeta) e 19,87 ± 0,31 (em microplaca). Essa atividade
pode ser atribuída à maior quantidade de substâncias fenólicas (242,86 ± 15,6 mg/g)
observada para esse extrato em relação aos demais. Vale ressaltar que a substância catecol foi
isolada desse extrato e apresentou CE
50
=1,25 ± 0,019 µg/mL.
4) Para os ensaios de atividade citotóxica em células tumorais, o extrato em AcOEt
dos galhos grossos (EAGg) apresentou maior inibição de crescimento (77,12%) para células
de cólon-humano (HCT-8) e CI
50
=13,73 µg/mL para a linhagem HL-60 (leucemia-humano).
As frações obtidas desse extrato foram avaliadas e a fração EAGg5 demonstrou inibições de
crescimento de 85,27% e 101,37% para células de glioblastoma (SF-295) e mama humano
(MDAMB-435), respectivamente. Nessa fração (EAGg5) também foi evidenciada a presença
de catecol através de CCD.
5) A avaliação da atividade antimicrobiana evidenciou inibições moderadas para:
Staphylococcus aureus (EAF); Candida tropicalis (EMF2 e EAGg); C. parapsilosis (EAF,
EAGf); Tripanossoma cruzi (EMGf e EAGg) e Leishmania amazonensis (EAGf e EAGg).
110
O estudo fitoquímico biomonitorado por ensaio químico/biológico contribuiu para
descoberta da atividade de frações e/ou substância, mostrando ser uma ferramenta muito
importante para a descoberta de compostos bioativos.
As substâncias isoladas, apesar de serem conhecidas, estão sendo descritas pela
primeira vez na família Goupiaceae, bem como as atividades testadas para os extratos e/ou
frações.
A significativa atividade antioxidante, antitumoral e antimicrobiana observada nos
extratos de G. glabra destaca seu elevado potencial para a obtenção de produtos
biotecnológicos a partir desta planta.
111
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