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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E
BIOLOGIA EVOLUTIVA
DEYLA PAULA DE OLIVEIRA
Manaus - Amazonas
Abril de 2010
ANÁLISE DA PATERNIDADE DE Caiman crocodilus crocodilus (L.) DA RESERVA
DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL PIAGAÇU-PURUS, USANDO
MARCADORES MICROSSATÉLITES
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DEYLA PAULA DE OLIVEIRA
ORIENTADOR: Dr. Tomas Hrbek
CO-ORIENTADORA: Dra. Izeni Pires Farias
Dissertação apresentada ao Programa de Pós -
graduação do Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia, como parte dos requisitos para a obtenção
do título de mestre em Genética, Conservação e
Biologia Evolutiva.
Manaus – Amazonas
Abril de 2010
ANÁLISE DE PATERNIDADE DE Caiman crocodilus crocodilus (L.) DA RESERVA
DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL PIAGAÇU-PURUS, USANDO
MARCADORES MICROSSATÉLITES
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FICHA CATALOGRÁFICA
(Catalogação realizada pela Biblioteca do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia –
INPA
O48 Oliveira, Deyla Paula de
Análise da paternidade de Caiman crocodilus crocodilus (L.) da
Reseva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu-Purus, utilizando
marcadores microssatélites / Deyla Paula de Oliveira. --- Manaus : [s.n.],
2010 xii, 97 f. : il. color.
Dissertação (mestrado)-- INPA, Manaus, 2010
Orientador : Tomas Hrbek
Co-orientador : Izeni Pires Farias
Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
1. Caiman crocodilus crocodilus – Amazonas. 2. Microssatélites. 3.
Marcadores genéticos. 4. Testes de Paternidade. I. Título.
CDD 19. ed. 597.980415
SINOPSE
Realizou-se o isolamento e caracterização de 12 locos microssatélites específicos
para Caiman. crocodilus (jacaré – tinga) através da biblioteca enriquecida em
microssatélites dinucleotídeos e teste de amplificação cruzada em uma outra
espécie relacionada. Os seis locos mais polimórficos foram utilizados para analisar
o sistema de acasalamento em 13 ninhos da espécie coletados na Reserva de
Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus. Foi constatada a paternidade
múltipla em 100% dos ninhos.
Palavras-chave:
Jacaré – tinga, microssatélite, sistema de acasalamento.
Ao meu pai, Raimundo Mendes de Oliveira e minha mãe Leila Maria Oliveira Mendes.
Essa dissertação não seria possível sem toda a educação, caráter e persistência
proporcionada por eles!
Aos jacarezinhos e aos comunitários do grande coração do Purus (RDS Piagaçu - Purus).
E a todos aqueles que estão longe de seus familiares em prol de um sonho e que sabem o
significado da palavra saudade.
OFEREÇO
Ao grande mestre John Thorbjarnarson (in memorian),
que amava os crocodilianos mais que tudo!
DEDICO
AGRADEÇO...
Agradeço a todos que, direta e indiretamente contribuíram para a realização desse
trabalho. Em especial:
Aos meus pais Raimundo e Leila, irmãos Ana Paula e Douglas e minha querida
sobrinha Raíssa que no auge dos seus 4 anos nos disse "A vida é apenas um ventinho!".
Mesmo longe fisicamente, eles estavam comigo sempre no coração;
Ao Dr. Tomas Hrbek, pela orientação, pelos ensinamentos, pelas sugestões e
constante preocupação com o trabalho;
Á Dra. Izeni Pires Farias, pela co-orientação, pelo direcionamento e dedicação.
Posso dizer que ela foi a minha mãe de pesquisa aqui em Manaus;
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia e aos professores do Programa de
Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, pela oportunidade desse
aperfeiçoamento,
A Dra. Vera Scarpassa, coordenadora do GCBEv e a Alessandra, secretária do
GCBEv, sempre solicitas,
Aos colegas do mestrado, em especial ao grande amigo Edson pela amizade, por
me aturar nesses dois anos de mestrado, por me ouvir, aconselhar, por sempre me
acompanhar e esperar nas madrugadas e feriados em que tive que ir a UFAM e pelas
sextas-feiras nada culturais da vida;
Aos colegas do laboratório de Evolução e Genética Animal – LEGAL, pela ajuda e
pelos momentos de convivência no dia-a-dia do laboratório: Áureo, Adam, Carla (Carlota),
Edvaldo (Ed), Fábio (Fabinho), Fabíola (FCR), Jaqueline (Jaq), Mauro, Maria da
Conceição (Concy), Maria Doris, Mário, Marina, Natasha (Jovem), Olavo, Patrícia (Pat),
Pedro, Kelmer, Rafaela (Rafa), Roberta, Valéria, Waleska (Wal). Em especial á Nat e Olavo
pela companhia nas noites e madrugadas no laboratório e pelas constantes caronas, á
Concy, Fabíola e Rafa pela ajuda no laboratório, principalmente com os microssatélites, ao
Pedro pela ajuda nas análises;
Ao técnico do LEGAL Adriano por nos proporcionar momentos de descontração
com suas brincadeiras e pela imensa ajuda no laboratório;
Ao amigo e companheiro de coleta Boris Marioni, pela ajuda em campo na RDS
Piagaçu – Purus e por sempre ser solicito em responder as imensas dúvidas que tive com a
biologia dos tingas no decorrer desses dois anos de trabalho;
Aos comunitários da RDS Piagaçu – Purus pela ajuda em campo e pelos
ensinamentos durante um mês que permaneci na reserva;
A todos os integrantes da expedição de coleta em 2008: comandante, ajudantes e
tripulantes do barco "Jesus me deu", pela imensa ajuda nas coletas;
Ao Instituto Piagaçu e á Wildlife Conservation Socity (WCS) que viabilizaram os
equipamentos e a logística na RDS Piagaçu – Purus;
A Zilca Campos pela oportunidade na expedição de coleta em 2008, pelas
referências bibliográficas e por sempre ser solicita em responder aos meus e-mails;
Aos avaliadores do projeto de dissertação e membros da banca da aula de
qualificação, Cleiton Fantin, Doriane Picanço Rodrigues, Maristerra Lemos, Rodrigo
Barban Zucoloto, pelas valiosas sugestões, as quais aprimoraram consideravelmente este
trabalho;
Aos colegas de república Cadú (a mãe da casa), Pedro e Renato pela campanha
"Deyla vai dormir" nos últimos dias em que estive escrevendo a dissertação e pelo carinho
disponiblizado a mim, a única mulher da casa;
Ao Sisbio pela emissão da licença de pesquisa e coleta de material biológico na
RDS Piagaçu – Purus;
Á secretaria de Estado do Meio Ambiente e Desenvolvimento Sustentável, órgão
gestor e responsável pela RDS – Piagaçu - Purus,
Ao Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão
da bolsa de mestrado;
Á PROCAD-CAPES, pelo financiamento do Banco enriquecido em marcadores
moleculares microssatélites para C. crocodilus;
Aos monitores Adna Sousa, Fernanda Cidade, Marcos Prado, Tatiana Campos e
professores Anete Pereira, Michel Vincentz, Miriam Rafael, Maria Imaculara Zuchi e
Marcelo Cavallari responsáveis pelo curso "Construção de bancos enriquecidos em
microssatélites de eucariotos: um curso prático e teórico";
Ao John Thorbjarnarson (in memorian) e ao Robinson Botero-Arias coordenadores
do IV Workshop de Treinamento em Pesquisa sobre Jacarés na Reserva de
Desenvolvimento Sustentável Mamirauá pela oportunidade da participação no Workshop;
Aos colegas Dani Rivera, Diego Forrisi, Johnny Severiche, Lucía Fernandez, Luiza
Passos, Mauro Hoffman, Rafael Barboza, Virginia Parachú pela convivência durante os 15
dias do Worshop na RDS Mamirauá;
Aos vários amigos que fiz em Manaus pelas alegrias e tristezas compartilhadas;
Aos amigos que carinhosamente dispuseram um tempinho e fizeram as correções
do meu plano de dissertação, resumos, manuscritos dos artigos e a dissertação final;
Ao CNPq/PPG-7 (Processo nº 55326012005-7) e National Geographic
Society/Waitt Grants Program pelo financiamento do projeto.
Meus mais sinceros agradecimentos!
Filho da floresta, água e madeira vão na luz dos meus
olhos, e explicam este jeito meu de amar as estrelas e
de carregar nos ombros a esperança.
Thiago de Melo, poeta amazonense
Os Estatutos do Homem (Ato Institucional Permanente)
Artigo I
Fica decretado que agora vale a verdade.
agora vale a vida,
e de mãos dadas,
marcharemos todos pela vida verdadeira.
Artigo II
Fica decretado que todos os dias da semana,
inclusive as terças-feiras mais cinzentas,
têm direito a converter-se em manhãs de domingo.
Artigo III
Fica decretado que, a partir deste instante,
haverá girassóis em todas as janelas,
que os girassóis terão direito
a abrir-se dentro da sombra;
e que as janelas devem permanecer, o dia inteiro,
abertas para o verde onde cresce a esperança.
Artigo IV
Fica decretado que o homem
não precisará nunca mais
duvidar do homem.
Que o homem confiará no homem
como a palmeira confia no vento,
como o vento confia no ar,
como o ar confia no campo azul do céu.
Parágrafo único:
O homem confiará no homem
como um menino confia em outro menino.
Artigo V
Fica decretado que os homens
estão livres do jugo da mentira.
Nunca mais será preciso usar
a couraça do silêncio
nem a armadura de palavras.
O homem se sentará à mesa
com seu olhar limpo
porque a verdade passará a ser servida
antes da sobremesa.
Artigo VI
Fica estabelecida, durante dez séculos,
a prática sonhada pelo profeta Isaías,
e o lobo e o cordeiro pastarão juntos
e a comida de ambos terá o mesmo gosto de aurora.
Artigo VII
Por decreto irrevogável fica estabelecido
o reinado permanente da justiça e da claridade,
e a alegria será uma bandeira generosa
para sempre desfraldada na alma do povo.
Artigo VIII
Fica decretado que a maior dor
sempre foi e será sempre
não poder dar-se amor a quem se ama
e saber que é a água
que dá à planta o milagre da flor.
Artigo IX
Fica permitido que o pão de cada dia
tenha no homem o sinal de seu suor.
Mas que sobretudo tenha
sempre o quente sabor da ternura.
Artigo X
Fica permitido a qualquer pessoa,
qualquer hora da vida,
uso do traje branco.
Artigo XI
Fica decretado, por definição,
que o homem é um animal que ama
e que por isso é belo,
muito mais belo que a estrela da manhã.
Artigo XII
Decreta-se que nada será obrigado
nem proibido,
tudo será permitido,
inclusive brincar com os rinocerontes
e caminhar pelas tardes
com uma imensa begônia na lapela.
Parágrafo único:
Só uma coisa fica proibida:
amar sem amor.
Artigo XIII
Fica decretado que o dinheiro
não poderá nunca mais comprar
o sol das manhãs vindouras.
Expulso do grande baú do medo,
o dinheiro se transformará em uma espada fraternal
para defender o direito de cantar
e a festa do dia que chegou.
Artigo Final.
Fica proibido o uso da palavra liberdade,
a qual será suprimida dos dicionários
e do pântano enganoso das bocas.
A partir deste instante
a liberdade será algo vivo e transparente
como um fogo ou um rio,
e a sua morada será sempre
o coração do homem.
Thiago de Melo, poeta amazonense
RESUMO
Nos últimos anos, estudos genéticos têm sido utilizados para investigar os sistemas de
acasalamento em crocodilianos, mas até a presente data nenhuma pesquisa tinha sido
realizada para investigar a paternidade de Caiman crocodilus crocodilus. Para investigar a
paternidade é necessária a utilização de locos microssatélites altamente polimórficos, que
apresentem uma alta probabilidade de exclusão de paternidade e permita diferenciar
indivíduos. Neste sentido, foram isolados e caracterizados 12 locos microssatélites
dinucleotídeos a partir de uma biblioteca genômica enriquecida com repetições de
dinucleotídeos (CT) e 8 (GT) 8. Os 12 locos foram caracterizados em C. c. crocodilus da
Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus, Amazonas e também testado
em Caiman c. yacare de Cáceres, Mato Grosso. Os resultados da caracterização indicaram
que estes locos são adequados para o estudo do sistema de acasalamento e também para
estudos populacionais com o complexo C. crocodilus. Seis locos mais polimórficos com
alto poder de exclusão de paternidade e com alto poder de diferenciar indivíduos foram
usados em sistema do PCR multiplex para a análise do sistema de acasalamento da espécie
C. c. crocodilus da Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus. Foram
genotipados 198 filhotes de 13 ninhos (representando um esforço de amostragem que
variaram de 30% a 100% de filhotes por ninho) de duas temporadas reprodutivas (2007 e
2008), além de 11 fêmeas que estavam ao lado dos respectivos ninhos e 21 machos,
potencias pais. Em 100% dos ninhos houve uma contribuição de 2-4 pais, sendo que todos
os machos contribuíram igualmente para a ninhada, e nenhum dos machos genotipados
foram os pais reais dos filhotes. Nenhum macho acasalou com mais de uma fêmea e as
fêmeas não mostraram fidelidade a um único macho. Todas as fêmeas encontradas nas
proximidades dos ninhos eram as mães dos filhotes dos ninhos. Nosso estudo destaca que a
poliandria é comum nesta espécie não há um único macho reprodutivo dominante e que as
fêmeas copularam com machos geograficamente distantes. Nossos resultados têm
implicações importantes para os esforços de conservação e manejo de espécies na área de
estudo e outras áreas do entorno.
PALAVRAS-CHAVES: Amazonas, Caiman crocodilus crocodilus, microssatélites,
sistema de acasalamento, Piagaçu – Purus
ABSTRACT
Recently genetic studies have been utilized to study breeding systems of several
crocodilian, however, no paternity studies involved Caiman crocodilus crocodilus. To
investigate paternity, it is necessary to use highly polymorphic microsatellite loci that have
high probability of exclusion of paternity and differentiating individuals. For this purpose
12 dinucleotide microsatellite loci were isolated and characterized from a genomic library
enriched for the dinucleotide repetitions (CT)
8
and (GT)
8
. The 12 loci were characterized
in C. c. crocodilus from the Piagaçu-Purus Sustainable Development Reserve, Amazonas,
and their utility also tested in Caiman c. yacare from Cacéres, Mato Grosso. The results of
the characterization indicated that these loci are adequate for the study of the breeding
system and also for population studies with the Caiman crocodilus complex. Six loci with
highest polymorphism, high power of paternity exclusion and with high probability of
differentiating among individuals were used in a PCR multiplex system for breeding
system analysis of the C. c crocodilus from the Piagaçu-Purus Sustainable Development
Reserve. We genotyped 198 hatchlings from 13 nests (representing a sampling effort that
varied from 30% to 100% of the hatchlings per nest) sampled in the two reproductive
seasons (2007 and 2008), as well as 11 females that were beside their respective nests and
21 males, potential fathers. In 100% of the nests there was a contribution of two to four
fathers, all males contributed approximately equally per clutch, and none of the genotyped
males were the actual fathers of the hatchlings. No male mated with more than one female,
and no female showed across-year male fidelity. All females found in proximity of nests
were mothers of the hatchlings of those nests. Our study highlights that polyandry is
common in this species, that no single male reproductively dominates, and that females
mate with geographically distant males. Our results have important implications for
conservation efforts and species management in the study area and beyond.
KEY WORDS: Amazon, Caiman crocodilus, microsatellites, mating systems, Piagaçu –
Purus
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL...............................................................................................16
1.1. Aspectos gerais da ordem Crocodylia (Gmelin 1789)..................................................16
1.11. Ocorrência dos crocodilianos......................................................................................18
1.2. Taxonomia, relações filogenéticas e suas controvérsias................................................19
1.2.1. Complexo Caiman crocodilus....................................................................................20
1.2.11. Caracteristicas do complexo Caiman crocodilus.....................................................21
1.3. Ameaças aos crocodilianos...........................................................................................23
1.3.1. Manejo dos crocodilianos...........................................................................................24
1.4. Aspectos do sistema reprodutivo dos crocodilianos......................................................25
1.5. Técnicas moleculares para o estudo do sistema de acasalamento em animais.............29
CAPÍTULO I
ARTIGO I. Marcadores microssatélites para o sistema de acasalamento e análise de
populações de jacaré-tinga Caiman crocodilus (Linnaeus 1758).........................................32
CAPÍTULO II
ARTIGO II. Análise do sistema de acasalamento de Caiman crocodilus da Reserva de
Desenvolvimento Sustentável Piagaçu-Purus, Amazonas, Brasil........................................41
2. CONCLUSÃO GERAL.................................................................................................71
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................72
APÊNDICE I......................................................................................................................87
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela 1. Caracterização dos 12 locos microssatélites para Caiman c. crocodilus e teste de
amplificação cruzada em Caiman c. yacare.........................................................................40
CAPÍTULO II
Tabela 1. Código dos ninhos e informações dos corpos de água, setores, quantidade de
filhotes genotipados e porcentagens e ano de coleta dos 13 ninhos amostrados em 2007 e
2008 na RDS Piagaçu-Purus................................................................................................64
Tabela 2. Amostras dos machos de jacaré-tinga coletados em corpos de água nas
proximidades dos ninhos amostrados na RDS – Piagaçu – Purus.......................................65
Tabela 3. Combinações dos seis locos para genotipagem tipo multiplex............................65
Tabela 4. Número de alelos por loco dentro dos ninhos e em todos os 13 ninhos de Caiman
crocodilus.............................................................................................................................66
Tabela 5. Potencial dos locos microssatélites para a análise de parentesco em C. crocodilus
da RDS Piagaçu – Purus.......................................................................................................66
Tabela 6. Potencial dos locos microssatélites combinados para análise de parentesco em C.
crocodilus da RDS Piagaçu – Purus.....................................................................................67
Tabela 7. Evidências de paternidade múltipla em 13 ninhos de Caiman crocodilus através
de seis locos microssatélites espécie – específicos..............................................................68
Tabela 8. Genótipos dos parentais reconstruídos com o auxílio do programa Gerud 2.0 e
estimativa da contribuição relativa de cada um dos pais nos 13 ninhos de Caiman
crocodilus.............................................................................................................................69
LISTA DE FIGURAS
Fig. 01. Representação do rostro de animais da família Alligatoridae.................................16
Fig. 02. Representação do rostro de animais da família Crocodylidae................................17
Fig.03. Representação do rostro de animais da família Gavialidae.....................................17
Fig. 04. Distribuição das espécies de crocodilianos em oito regiões zoogeográficas. PA:
Paeloártico, NA: Neoártico, NT: Neotropical, AT: Afrotropical, OL: Oriental, AU:
Autralásia, PAC: Ilhas do Oceano Pacífico, ANT: Antártico...............................................18
Fig 05. Distribuição de C .c.chiapasius (1), C.c. fuscus (2), C.c.crocodilus (3), C.c.yacare
(4), C.c.aporiensis (5) e C. c.crocodilus e C.c.yacare (6)....................................................20
Fig. 06. Fêmea de Caiman crocodilus (A). Filhote de Caiman crocodilus
(B).........................................................................................................................................22
Fig. 07. Fêmea de Melanosuchus niger aproximando-se do ninho devido à presença
humana na RDS Mamirauá, Amazonas................................................................................27
Fig. 08. Fêmea de Caiman latirostris em defesa do ninho no
Uruguai.................................................................................................................................27
16
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1. ASPECTOS GERAIS DA ORDEM Crocodylia (Gmelin 1789)
Os membros da classe reptilia evoluíram a partir dos antracosauros a cerca de 60
milhões de anos após o aparecimento destes últimos. Desde o Permiano e ao longo do
Cretáceo, eram os vertebrados mais abundantes (Hildebrand e Goslow, 2006).
Os crocodilianos atuais são os únicos sobreviventes da subclasse Archousaria que
incluia dois clados extintos: os pterossauros e os dinossauros (Hickam et al., 2006). A história
evolutiva do grupo tem sido estudada por Buffetaud (1982), Taplin (1984), Taplin e Grigg
(1989) e Brochu (2003).
Os primeiros crocodilianos chamados Protosuchia apareceram no início do Jurássico,
enquanto que os modernos crocodilianos (Eusuchia) apareceram no Triássico Superior a cerca
de 220 milhões de anos atrás sob a forma de carnívoros terrestres (Martin, 2008). Estes
animais diferem pouco entre si ou das formas da era Mesozóica. A maior variação
interespecífica observada nos crocodilianos atuais refere-se à morfologia da cabeça. Estas
variações se devem basicamente as preferências e estratégias alimentares. Os representantes
da família Alligatoridae apresentam um rostro mais largo (Fig.01), os representantes da
família Crocodylidae possuem uma variedade de larguras dos rostros (Fig.02), e os
representantes da família Gavialidae possuem um rostro bem estreito (Fig.03).
Fig. 01. Representação do rostro de animais da família Alligatoridae.
Fonte: http://iucncsg.org/ph1/modules/Crocodilians/crocfacts.html
17
Fig. 02. Representação do rostro de animais da família Crocodylidae
Fonte: http://iucncsg.org/ph1/modules/Crocodilians/crocfacts.html
Fig.03. Representação do rostro de animais da família Gavialidae.
Fonte: http://iucncsg.org/ph1/modules/Crocodilians/crocfacts.html
Os crocodilianos apresentam o crânio bastante resistente, com uma forte musculatura
que movimenta a mandíbula disposta de maneira a permitir uma grande abertura e um
fechamento rápido e poderoso (Hickam et al., 2006). Os dentes são inseridos em cavidades ou
tecas (tecodonte) e apresenta um palato secundário completo, o que permite que a respiração
aconteça mesmo enquanto a boca contém água, alimentos ou ambos (Hickam et al., 2006).
São animais que vivem em áreas tropicais e subtropicais em vários habitats aquáticos
(rios, pântanos, lagos, córregos, etc) (Ross, 1989). Ocasionalmente podem adaptar-se as águas
salgadas e salobras como mangues ou estuários, pois apresentam glândulas na língua que
podem ser usadas para excretar o excesso de sal.
São ectotérmicos e o controle da temperatura corpórea ocorre através de trocas de
energia com o meio ambiente. A termorregulação ocorre quando o animal se posiciona na
superfície da água expondo todo o corpo ou parte dele. Estes animais também saem da água
para a terra firme e recebem radiação solar de forma direta e indireta, e conforme o aumento
da temperatura retorna para a água. A atividade de termorregulação está diretamente
relacionada às atividades de reprodução, captura de alimento, digestão e crescimento (Pough
et al., 2003).
Os crocodilianos são predadoras oportunistas e a dieta depende do seu estágio de
desenvolvimento e diversidade de presas potenciais, que varia com o hábitat, estação e região
geográfica (Webb et al., 1982; Magnusson et al., 1987). Os indivíduos adultos apresentam
uma dieta mais variada do que a dieta dos mais jovens (Webb et al., 1982). A dieta dos jovens
18
durante o primeiro ano de vida é composta principalmente por invertebrados, desde insetos
(principalmente Odonata, Hemíptera e Coleóptera), crustáceos (principalmente caranguejos),
moluscos (principalmente Pomacea e Bivalvia), e a mudança ontogenética realiza-se no início
do segundo ano de vida, fase em que pequenos peixes já são incorporados á dieta (Coutinho e
Campos, 2007).
1.1.1. OCORRÊNCIA DOS CROCODILIANOS
A maioria dos crocodilianos são endêmicos de uma única região zoogeográfica.
Apenas as espécies C. niloticus, C. porosus, C. siamensis e Gavialis gangeticus são
encontrados em duas regiões adjacentes (Martin, 2008). (Fig.04).
Fig. 04. Distribuição das espécies de crocodilianos em oito regiões zoogeográficas. PA:
Paeloártico, NA: Neoártico, NT: Neotropical, AT: Afrotropical, OL: Oriental, AU: Autralásia,
PAC: Ilhas do Oceano Pacífico, ANT: Antártico. Fonte: Martin, 2008.
No Brasil são encontradas apenas espécies da família Alligatoridae: Paleosuchus
palpebrosus (jacaré - paguá) (Cuvier 1807), Paleosuchus trigonatus (jacaré – coroa)
19
(Schneider 1801), Melanosuchus niger (jacaré – açu) (Spix 1825), Caiman latirostris (jacaré-
do-papo-amarelo) (Daudin 1802) e Caiman crocodilus (jacaré-tinga) (Linnaeus 1758).
Alguns autores consideram que no Brasil são encontradas seis espécies, pois elevam o
status de Caiman crocodilus yacare ao nível específico de Caiman yacare. Esta convenção é
atualmente adotada pela autoridade ambiental brasileira (IBAMA) (Coutinho e Campos,
2007).
1.2. TAXONOMIA, RELAÇÕES FILOGENÉTICAS E SUAS CONTROVÉRSIAS
Conforme Coutinho e Campos (2007), a taxonomia, biogeografia e filogenia dos
crocodilianos são assuntos de longos e consideráveis debates.
A ordem Crocodylia divide-se em três famílias, sendo elas: Crocodylidae, Gavialidae e
Alligatoridae. Com base em dados moleculares, Janke et al. (2005) dividiram a ordem em
duas famílias: Alligatoridae e Crocodylidae, incluindo Gavialis único gênero da família
Gavialidae, agora na família Crocodylidae.
O número de espécies aceitas atualmente varia de vinte e três (Brochu, 2003), vinte e
quatro (Martin, 2008) a vinte e cinco (elevando as subespécies ao nível de espécies)
(McAliley et al., 2006). Estas espécies estão distribuídas em nove gêneros Caiman,
Melanosuchus, Paleosuchus, Alligator, Crocodylus, Mecistops, Osteolaemus, Tomistoma,
Gavialis (McAliley et al., 2006). O maior nível de diversidade das espécies encontra-se no
gênero Crocodylus, que reúne 13-14 espécies, conforme Martin (2008).
A posição da espécie Tomistoma schlegelii (falso gavial) flutua entre Crocodylidae a
partir de estudos morfológicos a Gavialidae a partir de estudos bioquímicos ou moleculares
(Salisbury et al., 2006). Dados genéticos suportam a hipótese de que a espécie Crocodilus
catapharactus representa o único membro sobrevivente de uma linhagem antiga endêmica do
continente Africano, o gênero histórico Mecistops (Gray, 1844) (McAliley et al., 2006). Esta
idéia também é apoiada por evidências morfológicas feitas por Brochu (2003).
Estudos da distribuição e as relações entre as populações de Caiman c. crocodilus e
Caiman c. yacare foram investigados no Brasil por Brazaitis et al. (1998). Busack e Pandya
(2001) usando dados morfológicos, relataram que C. c. yacare é suficientemente diferenciado
das outras subespécies, o que rejeita a sua validade como uma subespécie. Hrbek et al. (2008)
utilizando dados moleculares, mostraram que as relações filogenéticas entre C. c. crocodilus e
C. c. yacare não são claras. Os dados não apóiam que as duas subespécies sejam
20
evolutivamente distintas pelo menos ao nível molecular.
Venega-Anaya et al. (2008), utilizando dados moleculares, inferiram a história
evolutiva de C. c. crocodilus, C. c. fuscus e C. c. chiapasius obtendo resultados coerentes com
a taxonomia. C. c. fuscus são geneticamente estruturadas no sul da Mesoamérica, C. c
chiapasius pode ser considerada uma linhagem com evolução distinta e pode estar havendo
uma hibridização entre C. c. fuscus e C. c. chiapasius no norte da Mesoamérica.
1.2.1. COMPLEXO Caiman crocodilus
Caiman crocodilus é um táxon bastante complexo que inclui atualmente quatro ou
cinco subespécies com base na morfologia: C. c. fuscus (Cope 1868), C. c. apaporiensis
(Medem 1955), C. c. chiapasius (Bocourt 1976), C. c. crocodilus (Linnaeus 1758), C. c.
yacare (King e Burke 1989) (Ross, 1998). Baseado em evidências fósseis, filogenéticas e
geográficas, C. crocodilus parece ter uma origem sul-americana (Venegas-Anaya et al., 2008).
Esse complexo é amplamente distribuído no continente americano, habitando desde o sul do
México até o norte da Argentina (Fig. 05) (Ross, 1998).
A IUCN indica para C. crocodilus no Brasil projetos com moderada prioridade como a
implantação de programas de manejo sustentável, a diminuição do comércio ilegal de peles e
estudos taxonômicos aprofundados que definam mais precisamente as espécies/subespécies e
suas respectivas distribuições geográficas.
21
Fig 05. Distribuição de C. c .chiapasius (1), C. c. fuscus (2), C. c. crocodilus (3), C. c.
yacare (4), C. c. aporiensis (5) e C. c. crocodilus e C. c. yacare (6). Fonte: Busack e
Padya, 2001.
1.2.1.1. CARACTERISTICAS DO COMPLEXO Caiman crocodilus
Caiman crocodilus (Caiman sclerops aparece em algumas publicações como um
importante sinônimo para esta espécie) é conhecido popularmente no Brasil como jacaré –
tinga, termo indígena que significa jacaré-branco, devido a sua coloração verde amarelada
(Fig. 06).
Segundo Ross (1998), os machos desta espécie podem alcançar 2,5 metros de
comprimento total, apesar de alguns autores relatarem que os indivíduos deste tamanho sejam
raros na Amazônia Brasileira (Marioni et al., 2008), e as fêmeas atingem um tamanho
corporal menor. A espécie pode atingir a maturação sexual rapidamente, entre 4,5 e 6 anos de
idade na Amazônia (Da – Silveira, 2001), bem menos tempo que os outros crocodilianos, que
22
requerem mais de 9 anos para as fêmeas alcançarem a maturidade sexual. Por atingir o
comprimento reprodutivo em um intervalo de tempo bem mais curto do que as demais
espécies de crocodilianos existentes, Rebêlo e Magnusson (1983) relatam que a espécie possa
suportar maior pressão de exploração, pela facilidade no recrutamento de indivíduos para a
população reprodutiva.
Distribui-se na Colômbia, Bolívia, Brasil e Peru (Ross, 1998). Encontra-se em
simpatria com C. c. yacare em algumas regiões do Brasil (Mato Grosso e Rondônia) e no Rio
Madre de Dios (Peru). No Brasil a espécie habita as águas de drenagem do Rio Solimões, Rio
Amazonas, Araguaia, Araguari, Itapicuru, Paranaíba, Negro, Tapajós, Tocantins, Xingú e os
rios que drenam para o Oceano Atlântico sobre a costa norte do Brasil (Brazaitis et al, 1998).
Atualmente a espécie está listada no Apêndice II da CITES e considerada na categoria
de baixo risco pela IUCN (Ross, 1998).
Fig. 06. Fêmea de Caiman crocodilus (A). Filhote de Caiman crocodilus (B) Foto: Boris
Marioni.
C. c. yacare distribui-se pelo norte da Argentina, parte do território paraguaio,
boliviano e centro – oeste brasileiro (Coutinho e Campos, 2007). No Brasil, a principal área
de ocorrência da espécie é a região do Pantanal, nos estados de Mato Grosso e Mato Grosso
do Sul (Brazaitis, 1998). Apresenta corpo esverdeado, com manchas amarelas e cinzas e pode
atingir até 2,5 metros de comprimento. Está listada no Apêndice II da CITES e na categoria
baixo risco pela IUCN (Coutinho e Campos, 2007).
C. c. fuscus distribui-se na Colômbia e Venezuela (Rueda – Almonacid et al., 2007).
Encontra-se associada à área com cobertura vegetal flutuante (Balaguera – Reina e Gonzáles –
Maya, 2009). Apresentam o dorso marrom claro, verde oliva ou marrom amarelado com
23
listras visíveis apenas na cauda e podem chegar até 2 m de comprimento (Rueda – Almonacid
et al., 2007). Está listado no Apêndice II da CITES.
C. c. apaporiesis é endêmica da Colômbia, ocorrendo em um trecho de 200 Km
(Rueda – Almonacid et al., 2007). Apresenta um rostro muito longo e relativamente largo, a
cor do dorso é marrom - amarelo brilhante com manchas pretas na cabeça, listras escuras no
corpo e na cauda, perna cinza escuro ou preta e abdômen amarelo (Rueda – Almonacid et al.,
2007). É sobre-explorado e por apresentar uma distribuição restrita é muito sensível a caça.
Está incluída no apêndice I da CITES (Rueda – Almonacid et al., 2007).
C. c. chiapasius distribui-se do sul do México, Guatemala, El Salvador, Honduras,
Nicarágua, Costa Rica, Panamá até a Colômbia e Equador. A morfologia cranial, como a
cabeça e o rostro menos largo que em C. c. fuscus, tem sido um argumento para a separação
como entidades subespecíficas diferentes (Rueda – Almonacid et al., 2007).
1.3. AMEAÇA AOS CROCODILIANOS
Dentre as principais ameaças aos crocodilianos encontram-se a superexploração dos
seus estoques, como a grande pressão de caça comercial para produção de couro e carne, a
modificação da vegetação ciliar, a alteração de habitats e de sítios de reprodução, a
contaminação das águas e perturbações antrópicas, tais como a circulação de embarcações
motorizadas (Thorbjarnarson, 1992).
Segundo Miles et al. (2009a), apesar dos esforços dos programas de recuperação das
espécies de crocodilianos com a diminuição das pressões da caça ilegal e fragmentação de
habitat, 17 espécies de crocodilianos ainda estão listadas no apêndice I da CITES, sendo elas:
Alligator sinensis, Caiman crocodilus apaporiensis, Caiman latirostris (exceto as populações
da Argentina, que estão incluídas no apêndice II), Melanosuchus niger (exceto as populações
do Brasil e do Equador, que estão incluídas no apêndice II), Crocodylus acutus (exceto as
populações de Cuba, que estão incluídas no apêndice II), Crocodylus cataphractus,
Crocodylus intermedius, Crocodylus mindorensis, Crocodylus moreletii, Crocodylus niloticus
(exceto as populações de Botswana, Etiópia, Quénia, Madagáscar, Malawi, Moçambique,
Namíbia, África do Sul, Uganda, República Unida da Tanzânia, Zâmbia e Zimbabwe, que
estão incluídas no apêndice II), Crocodylus palustris, Crocodylus porosus (exceto as
populações da Austrália, Indonésia, Papúa Nova Guiné que estão incluídas no apêndice II),
24
Crocodylus rhombifer, Crocodylus siamensis, Osteolaemus tetraspis, Tomistoma schlegelii,
Gavialis gangeticus.
Segundo critérios da União Internacional para a Conservação da Natureza e dos
Recursos Naturais (IUCN), cinco espécies de crocodilianos estão criticamente em perigo de
extinção (Alligator sinensis, Crocodylus mindorensis, Crocodylus intermedius, Crocodylus
siamensis, Gavialis gangeticus), duas espécies estão em perigo (Crocodylus rhombifer e
Tomistoma schlegelii), três espécies são consideradas vulneráveis (Crocodylus acutus,
Crocodylus palustris, Osteolaemus tetraspis), doze espécies são consideradas em baixo risco
de extinção (Crocodylus moreletii, Melanosuchus niger, Alligator mississippiensis,
Crocodylus johnstoni, Crocodylus niloticus, Crocodylus novaeguineae, Crocodylus porosus,
Caiman crocodilus crocodilus, Caiman latirostris, Caiman crocodilus yacare, Paleosuchus
palpebrosus, Paleosuchus trigonatus) e a espécie Crocodylus cataphractus devido a dados
insuficientes como distribuição e / ou status das suas populações, não está classificada em
nenhuma das categorias acima.
No Brasil, antes da criação da Lei de Proteção a Fauna (Lei 5.197/67, 1967), a caça
comercial de crocodilianos era uma prática legal (Smith, 1980). Apesar da exploração
comercial atualmente ser uma atividade proibida, permanece até os dias de hoje em várias
localidades. Há estimativas de que 50 toneladas de carne salgada de jacarés, principalmente
C. c. crocodilus, são comercializadas por ano na Reserva de Desenvolvimento Sustentável
Piagaçu-Purus, que fica localizada no baixo rio Purus (Marioni et al., 2006) e, segundo Da –
Silveira (2003), esta região é considerada a maior produtora ilegal de carne de jacaré do
mundo. Em virtude da sobreexploração que C. c. crocodilus vem sofrendo na área, há
necessidades de estudos que gerem informações sobre vários aspectos da biologia, visando à
composição do plano de manejo e conservação para a população da área.
1.3.1. MANEJO DOS CROCODILIANOS
O manejo dos crocodilianos objetivando o aproveitamento econômico da carne e
couro pode ser dividido em três modalidades: manejo extensivo ou caça controlada de
populações selvagens, conhecido por harvesting ou cropping, retirada de ovos de ninhos
provenientes da natureza e posterior criação dos filhotes em cativeiro, conhecido por
ranching, e, por último, o ciclo completo em cativeiro, incluindo reprodução, conhecido por
farming (Ashley, 1996).
25
No Brasil, o modelo vigente de uso do jacaré (extração de ovos e criação de jovens em
cativeiro), a partir da Portaria 126 de 1990 do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos
Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), é a opção legal disponível para explorar as
populações naturais de jacarés (Coutinho e Campos, 2006). No entanto, uma das deficiências
técnicas da Portaria é que as cotas anuais de extração de ovos são baseadas em estimativas de
anos anteriores, e isso pode resultar em erros graves com autorizações de cotas super ou
subestimadas (Coutinho e Campos, 2006). Para as Unidades de Conservação (UCs) a
legislação vingente tem sido atualizada e revisada (Instituto Piagaçu, 2010).
As estratégias de manejo em UCs devem ser baseadas em informações sobre aspectos
relacionados à demografia, capacidade de regeneração, na estrutura genética e biologia
reprodutiva das espécies a serem manejadas. Deve haver uma participação efetiva das
comunidades locais, tanto no planejamento, como na implementação e nas decisões
(Arunachalan, 2000), quanto no direito ao beneficiamento e conservação dos recursos (Brasil,
1999). O manejo para ser sustentável, deve ser economicamente viável, ecologicamente
defensável e socialmente justo.
1.4. ASPECTOS DO SISTEMA REPRODUTIVO DOS CROCODILIANOS
O comportamento reprodutivo dos crocodilianos é dividido em corte e cópula,
nidificação, incubação, eclosão e pós-eclosão. O ciclo reprodutivo tem-se mostrado mais
complexo e evoluído do que o dos demais répteis (Magnusson et al., 1989).
A maturidade sexual é dependente do tamanho e idade dos animais, sendo que
normalmente os machos crescem mais rápido e apresentam um porte maior que as fêmeas
quando adulto. De um modo geral, os jacarés, aligátores e os pequenos crocodilos alcançam a
maturidade sexual com um porte relativamente pequeno, enquanto que os maiores crocodilos
e o gaviais tornam-se sexualmente maduros apenas quando relativamente grandes
(Magnusson et al., 1989).
Ainda permanece desconhecido como é feita a escolha de um determinado sítio de
nidificação pelos jacarés (Reagan, 2000). Há relatos de que a disponiblidade de certos tipos de
vegetação utilizados na composição do ninho possa ser importante para a escolha do local de
nidificação (Carbonneau, 1987).
O ninho dos crocodilianos varia de um simples buraco escavado na areia, como os
feitos pelas espécies Gavialis gangeticus, Tomistoma schlegeli, C. acutus, C. intermedius, C.
26
johnsoni, C. niloticus, C. palustris, C. rhombifer e C. siamensis, a montes de restos orgânicos
próximos a corpos de água, como os feitos pelas espécies C. novaeguineae, C. porosus,
Osteolaemus tetraspis, Alligator mississipiensis, Melanosuchus niger, Paleosuchus spp. e
Caiman spp (Coutinho e Campos, 2007). O tamanho e a composição dos ninhos dependem
mais do habitat e da disponibilidade de material (restos de folhagens e gravetos) do que das
espécies envolvidas (Coutinho e Campos, 2007).
Embora algumas fêmeas de crocodilianos desovem em anos consecutivos em
cativeiro, existem dados limitados do intervalo de nidificação em crocodilianos na natureza
(Reagan, 2000). Elsey et al. (2008) relatam que certamente muitos fêmeas de Alligator
mississipiensis não reproduzem a cada ano, visto que o esforço de nidificação é afetado pelo
nível das águas e pelas condições de habitat, fato observado em Louisiana nos Estados Unidos
onde a taxa de nidificação variou de 20.000 ninhos em 2006 para 43.000 ninhos em 2007.
De acordo com Campos e Magnusson (1995) e Campos (2003), o período de
nidificação dos jacarés na Amazônia ocorre predominantemente no final da estação seca, com
o nível da água ainda baixo. Da postura dos ovos até a eclosão dos jovens pode decorrer até
70 dias, isso dependendo das condições de incubação dos ovos e do cuidado das fêmeas.
Pouco se sabe sobre a fidelidade ao sítio de desova em crocodilianos e os dados de
vários estudos mostraram uma baixa porcentagem de reutilização imediata dos sítios de
desova em Alligator mississippiensis (Elsey et al., 2008). A partir da captura e marcação de
fêmeas de Alligator mississippiensis que estavam em defesa dos ninhos ao longo dos anos de
1997 a 2007 (exceto os anos de 1998 e 1999) no Rockefeller Wildlife Refuge (sudoeste de
Lousiana, USA) para o estudo do sistema de acasalamento iniciado por Davis et al. (2001),
Elsey et al. (2008) documentaram a reutilização ocasional de ninhos pelas fêmeas e vários
casos de fidelidade ao sítio de desova, incluindo dois casos de fidelidade ao sítio de desova
durante 7 anos.
As fêmeas dos crocodilianos investem tempo para a construção e cuidado contra
ataque de predadores aos seus ninhos, apresentando cuidado parental elaborado (Coutinho e
Campos, 2007) (Fig. 07 e 08). Apesar da alegação de que os filhotes dispersam-se
imediatamente após emergir do ovo (Hunt e Watanabe, 1982), sabe-se que alguns filhotes
permanecem perto da mãe no primeiro ano de vida e às vezes no segundo ou mesmo terceiro
ano (Hunt e Watanabe, 1982).
27
Fig. 07. Fêmea de Melanosuchus niger aproximando-se do ninho devido à presença humana
na RDS Mamirauá, Amazonas. Foto: Luiza Passos.
Fig. 08. Fêmea de Caiman latirostris em defesa do ninho no Uruguai. Foto: Diego Forrisi.
A comunicação vocal entre os filhotes e os adultos começa antes do ovo eclodir e
continua após a eclosão dos recém – nascidos. Os sons produzidos pelos recém-nascidos
28
estimulam a fêmea a escavar o ninho, utilizando seus membros e maxilas para afastar a
vegetação ou a terra e quebrar delicadamente a casca dos ovos com seus dentes para ajudá-los
a eclodir. Em seguida, a fêmea coloca os filhotes na boca e leva-os, um ou dois de cada vez,
para serem liberados na água (Pough et al., 2003). Os filhotes quando amedrontados, emitem
um grito de angústia que estimula os machos e fêmeas adultos a virem em sua defesa (Pough
et al., 2003). Golpes na água, com a cabeça e a cauda, e uma variedade de vocalizações
também são utilizados pelos machos durante a corte e exibições de territorialidade (Pough et
al., 2003).
O sexo dos crocodilianos não é um fator genético (não apresentam cromossomos
sexuais heteromórficos) e sim fenotípico, dependente da temperatura de incubação dos ovos.
Os ninhos incubados a temperaturas baixas (
≤ 31,5 °C) originam fêmeas e os ninhos
incubados em temperaturas altas (≥ 31°C) originam principalmente machos (Coutinho e
Campos, 2005). Mudanças nas condições térmicas próximas aos ninhos podem resultar em
desvios da razão sexual (Rodrigues, 2005).
O tamanho corporal no nascimento, tamanho da ninhada, freqüência da reprodução,
época da maturidade sexual e modo de reprodução são componentes de história de vida de
uma espécie e compõe parte do seu esforço reprodutivo (Pough et al., 2003). Dessa forma, o
estudo da reprodução é essencial para a compreensão da dinâmica populacional de qualquer
espécie.
De acordo com Coutinho et al. (2005), a reprodução dos crocodilianos, tanto em
condições naturais como em cativeiro, tem recebido considerável atenção, particularmente
devido a sua aplicação no manejo e conservação das espécies. Muito das informações
disponíveis são relacionadas à produção de ninhos, duração do período de postura, tamanho
de ovos e filhotes e sua relação com tamanho das fêmeas.
Em C. c. crocodilus, parte da variação no número de ovos por ninho pode ser
explicada pelo tamanho das fêmeas, mas provavelmente existem outros fatores que interferem
na produção de ovos como idade, estado nutricional e a genética (Campos, 2003).
A estrutura social é caracterizada por hierarquias de dominância e territorialidade
(Lang, 1989), sendo que há lutas pelo domínio de territórios entre os machos (Garrick e Lang,
1977). Os machos maiores, mais agressivos ganham o combate e a prioridade de acesso às
fêmeas (Garrick e Lang, 1977). Neste sentido, os sistemas de acasalamento dos crocodilianos
têm sido geralmente classificados como políginicos em que grandes machos garantem a
maioria das cópulas (Lang, 1989). Porém, as fêmeas de jacarés podem circular livremente
29
entre os territórios dos machos rivais e acasalar com vários machos, inclusive com os machos
subordinados (Garrick e Lang, 1977), fato coroborado recentemente com dados genéticos
(Davis et al. 2001; McVay et al., 2008; Amavet et al., 2008; Lance et al., 2009).
1.5. TÉCNICAS MOLECULARES PARA O ESTUDO DO SISTEMA DE
ACASALAMENTO EM ANIMAIS
Dentre os vários marcadores moleculares utilizados para a análise de paternidade e
parentesco encontram-se: DNA polimórfico amplificado ao acaso - RAPD, polimorfismo do
comprimento de fragmento de restrição - RFLPs, minissatélites e os microssatélites que
também podem ser conhecidos por alguns sinônimos como: sequências simples repetidas
(SSR's), pequenas sequências repetidas (STR's), sequências simples repetidas lado a lado
(SSTR), simples polimorfismos de comprimento de seqüência (SSLP), sequências
microssatélites seguidas (STMS).
Os RAPDs não diferenciam os locos em heterozigose dos locos em homozigose e
apresenta uma baixa reprodutibilidade. Os RFLP possuem baixa heterozigosidade e baixo
conteúdo de informação de polimorfismo. Os minissatélites são de difícil interpretação devido
à extrema variabilidade genética que apresentam. Já os microssatélites apresentam vantagem
em relação aos outros marcadores para estudo de paternidade e parentesco por fornecer
informações sobre locos individuais, cálculo das freqüências alélicas e por exibir altos níveis
de diversidade genética e de polimorfismo (Parker et al., 1980).
Microssatélites são repetições em tandem de pequenos motivos de seqüência com 1 a
6 pb (Goldstein e Pollock, 1997), 1 a 5 pb (Schotterer, 1999) ou 2 a 8 pb (Armour et al.,
1999), sendo encontrados amplamente distribuídos pelo genoma da maior parte dos
eucariotos, embora também presente em procariotos (Litt e Luty, 1989), sendo flanqueadas
por seqüências conservadas (Avise, 1994).
Esses marcadores podem ser classificados quanto à presença ou a ausência de
interrupção na unidade repetitiva e ainda, quanto à presença de mais de um tipo de unidade
repetitiva (Goldstein e Schlotterer, 1999). De acordo com a presença ou ausência de
interrupção na unidade repetitiva, os microssatélites podem ser classificados como: a)
microssatélites perfeitos: consistem de um único motivo de repetição, não sendo
interrompidos ao longo da seqüência por nenhuma outra base (Ex: TATATATATATATATA); b)
microssatélites imperfeitos: quando uma única base altera o padrão do motivo repetitivo (Ex:
30
TATATATACTATATATA); c) microssatélites interrompidos: apresentam a inserção de um
pequeno número de bases ao longo da sequência de repetição (Ex:
TATATATAGGGTATATATA); d) microssatélites compostos: consistem de dois ou mais
microssatélites diferentes na mesma sequência (Ex: TATATATAGAGAGAGA) (Weber,
1990). Quanto à presença de mais de um tipo de unidade repetitiva, os microssatélites são
classificados como mono-, di-, tri-, tetra-, penta- ou hexa- nucleotídeos (Queller e Goodnight,
1989).
Os microssatélites mais comuns são os dinucleotídeos, seguidos pelos
mononucleotídeos e tetranucleotídeos, sendo menos abundantes os trinucleotídeos (Ellegren,
2004). A raridade dos microssatélites trinucleotídeos em crocodilianos da família
Alligatoridae foi observada por Glen et al. (1998). Segundo Morgante et al. (2002),
seqüências microssatélites compostas por motivos trinucleotídicos são mais abundantes em
regiões codificantes e isso resulta de uma seleção negativa contra mutações que alteram a fase
de leitura em regiões codificantes.
Os microssatélites apresentam uma elevada taxa de mutação, que pode variar entre
espécies, sendo considerada entre 10
-3
a 10
-10
por loco em cada geração (Goldstein e
Schlotterer, 1999). Essa elevada taxa de mutação resulta em uma ampla variação no número
de unidades repetidas, o que faz com que sejam altamente informativos e amplamente
utilizados na identificação de indivíduos (Goldstein e Schlotterer, 1999).
A explicação precisa para a variação encontrada no número de repetições em tandem
de um microssatélite é desconhecida, mas acredita-se que esteja associado à ocorrência de
crossing-over desigual ou por erros durante a replicação do DNA, processo descrito como
slippage, e seguido por falha no sistema de reparo que restaura a seqüência original
(Chalesworth et al., 1994). Alguns modelos de mutação são adotados quando se analisam
locos microssatéliters em estudos populacionais: modelo de alelos infinitos (IAM), modelo de
mutações escalonadas ou passo-a-passo (SMM) e o modelo de duas fases (TPM). O modelo
SMM é o mais utilizado para explicar as características evolutivas dos microssatélites, pois
sugere que o ganho e a perda de unidades de repetição se dão em igual probabilidade (taxa
fixa) e admite uma simetria no processo, independentemente do tamanho da repetição. No
modelo IAM, cada mutação cria um novo alelo a uma dada taxa (u), não permitindo
homoplasia e cada alelo idêntico compartilha o mesmo ancestral e são idênticos por
descedência. O modelo TPM surgiu como uma extensão do SMM e postula que diversos
eventos mutacionais resultam em um aumento ou diminuição de uma unidade de repetição,
31
embora também ocorram alterações de um grande número de repetições, ainda que menos
freqüentemente (Oliveira et al., 2006).
Dentre as principais aplicações dos marcadores microssatélites estão os estudos em
genética de populações, genética da conservação, estudos epidemiológicos e de patologia
molecular, mapeamento de QTLs (Locos de características quantitativas), mapeamento
genético, história evolutiva e análise do sistema de acasalamento (Chistiakov et al., 2006).
Os microssatélites possuem características que os tornam excelentes marcadores para a
análise do sistema de acasalamento como: alto polimorfismo, são abundantes e
uniformemente distribuídos por todo o genoma, são marcadores codominantes, apresentam
herança mendeliana, são automatizáveis em sistemas multiplex, o que permite avaliar
rapidamente um grande número de indivíduos para um grande número de locos em pouco
tempo, possuem alto poder de exclusão de paternidade (PE) o que permite indicar o
verdadeiro pai e também baixa probabilidade de identidade genética (PI), o que permite
diferenciar indivíduos.
As inferências do sistema de acasalamento baseados em marcadores microssatélites
têm demonstrado que a paternidade múltipla é freqüente em várias espécies de invertebrados e
vertebrados, incluindo Littorina obtusata (lula) (Buresch et al., 2001), Palaemonetes pugio
(camarão) (Baragona et al., 2001), Schmidtea polychroa (platelminto) (Pongratz e Michiels,
2003), Microtus arvalis (rato) (Borkowska e Ratkiewicz, 2010),
Thamnophis sirtalis (cobra)
(McCraken et al., 99), várias espécies de tartarugas (Galbraith, 93, Peare e Parker, 94; Hoekert
et al., 99; Valenzuela, 2000; Fantin et al., 2008, Fantin et al., 2010), peixes (Avise e DeWoody,
2001), Ambystoma t. tigrinum (anfibio) (Gopurenko et al., 2006) e tem sido extensivamente
estudado em aves (Westneat et al. 90; Birkhead e Møller 92; Westneat e Sherman, 97;
Møller e Cuervo, 2000; Griffith et al. 2002). Em contraste com as aves, poucos estudos têm
investigado os padrões de acasalamentos múltiplos em crocodilianos (Uller e Olsson, 2008).
O conhecimento do sistema de acasalamento de uma dada espécie é particularmente
importante, pois influencia em uma série de fatores que vão desde a sustentabilidade da
população variando ao relativo sucesso reprodutivo dos indivíduos para a manutenção da
diversidade genética populacional e, conseqüentemente, o potencial evolutivo futuro de toda a
espécie (Frankham et al., 2002). Neste sentido, o presente trabalho visou gerar conhecimentos
sobre o sistema de acasalamento da espécie C. c. crocodilus da RDS Piagaçu – Purus usando
locos microssatélites isolados e caracterizados para a espécie. Os dados serão utilizados para
compor o plano de manejo da espécie na área coletada.
32
CAPÍTULO I
ARTIGO PUBLICADO NA REVISTA CONSERVATION GENETICS RESOURCES
(APÊNDICE I).
MARCADORES MICROSSATÉLITES PARA SISTEMA DE ACASALAMENTO
E ANÁLISES DE POPULAÇÃO DE JACARÉ - TINGA Caiman crocodilus
(LINNAEUS 1758)
33
MARCADORES MICROSSATÉLITES PARA SISTEMA DE ACASALAMENTO E
ANÁLISES DE POPULAÇÃO DE JACARÉ - TINGA Caiman crocodilus (LINNAEUS
1758)
Deyla Paula de Oliveira
1
, Izeni Pires Farias
1
, Boris Marioni
2
, Zilca Campos
3
, Tomas Hrbek
1,4*
Laboratório de Evolução e Genética Animal, Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas, Av.
Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000, 69077-000, Manaus, AM, Brazil
1
Instituto Piagaçu, Rua UZ, Quadra Z, Numero 8, Conjunto Morada do Sol, Aleixo, 69060-000, Manaus/AM,
Brazil
2
EMBRAPA-Pantanal, Corumbá, MS, Brazil
3
Biology Department, University of Puerto Rico, Rio Piedras, San Juan, PR 00931, Puerto Rico
4
*Correspondência para:
Tomas Hrbek
Fone: + 1 787 764 000 ext. (1) 2909; e-mail: [email protected]
RESUMO: Nós usamos a biblioteca enriquecida em microssatélites para isolar e caracterizar
12 locos microssatélites dinucleotídeos para Caiman crocodilus. Os microssatélites foram
caracterizados em populações de C. c. crocodilus da Reserva de Desenvolvimento Sustentável
Piagaçu Purus, Amazonas. Brasil e C. c. yacare de Cáceres. Mato Grosso, Brasil. Os
resultados da caracterização foram comparados entre as duas subespécies, com o número de
alelos variando de 3 a 20 e 1 a 14 por loco, em C. c. crocodilus e C. c. yacare,
respectivamente. A heterozigosidade observada variou de 0,088 – 0,816 e 0,115 – 0,833,
respectivamente. A exclusão de paternidade (QC) foi superior a 0,999 em ambas as
subespécies, e a probabilidade de identidade genética variou de 4,631 x 10
-13
em C. c.
crocodilus a 2,233 x 10
-6
em C. c. yacare. Todos os locos estão em equilíbrio de ligação e
com exceção de três locos em C. c. crocodilus todos os locos estão em equilíbrio de Hardy –
Weinberg. As características destes locos indicam que eles são uma excelente ferramenta para
o estudo do sistema de acasalamento e estrutura populacional no complexo de espécie
Caiman crocodilus.
PALAVRAS - CHAVE: Caiman crocodilus, sistema de acasalamento, análise de população,
34
loco microssatélite, jacaré – tinga.
INTRODUÇÃO
Caiman crocodilus (Linnaeus 1758) é amplamente distribuído no novo mundo. A sua
distribuição estende-se do Sul do México ao norte da Argentina, incluindo bacias
hidrográficas importantes, tais como Magdalena, Orinoco, Amazonas e Paraguai (Ross 1998).
É considerado um táxon bastante complexo dependendo do autor (Brazaitis et al. 1996; Ross
1998), até quatro subespécies são reconhecidas: C. crocodilus fuscus (Cope 1868), C.
crocodilus apaporinses (Medem 1955), C. crocodilus chiapasius (Bocourt 1976), C.
crocodilus yacare (King e Burke 1989), alternativamente C. c. yacare é considerado uma
espécie distinta (Busack & Pandya, 2001). Recentes análises moleculares identificaram várias
linhagens filogeneticamente divergentes que correspondem basicamente às subespécies
(Hrbek et al. 2008; Venegas-Anaya et al. 2008).
Busack e Padya (2001) relataram que os jacarés sul – americano, desempenham um
papel importante na economia local da bacia amazônica e tem sido uma importante fonte de
proteína animal, desde pelo menos 1200 a C. A exploração comercial dos crocodilianos para
comercialização de couro resultou na exportação de mais de 1,5 milhões de couro de jacarés
entre 1960 e 1969 da Amazônia Brasileira (Smith 1980), levando a um declínio populacional
(Ross 1998). Atualmente C. crocodilus está listada no Apêndice II pela Convenção
Internacional do Comércio de Espécies Exóticas da Flora e da Fauna (CITES), enquanto na
União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (IUCN) está na
lista vermelha considerada na categoria baixo risco. Por causa do grave declínio populacional
de várias espécies de crocodilianos no século 20 e sua importância para a economia local, a
IUCN e o Crocodile Specialist Group (CSG) enfatizam a necessidade do desenvolvimento de
ferramentas moleculares e estudos genéticos. Os estudos genéticos são fundamentais para a
obtenção de informações sobre: estrutura populacional, padrões de dispersão e fluxo gênico,
hibridização, sistemas de acasalamento, entre outros parâmetros importantes para o manejo e
conservação. Inferências a cerca dos padrões e seus processos subjacentes podem ser obtidos
a partir da análise de marcadores polimórficos, como os microssatélites.
Marcadores microssatélites foram isolados para uma variedade de espécie de
crocodilianos incluindo Alligator mississipiensis (Glenn et al. 1998), Crocodylus moreletii
(Dever e Densmore 2001), Crocodylus johnstoni (FitzSimmons et al. 2001), Caiman
35
latirostris (Zucoloto et al. 2002), Crocodylus porosus (Miles et al. 2009 b), Paleosuchus
trigonatus (Villela, 2008), Alligator sinensis (Jing et al., 2009) e (Zhu et al. 2009). Alguns
desses marcadores foram amplificados com sucesso em Caiman c. crocodilus, no entanto, os
níveis de polimorfismo foram geralmente baixos e os padrões dos microssatélites foram
difíceis de interpetrar em Caiman crocodilus (dados não publicados), tornando os marcadores
heterólogos ineficientes para análise do sistema de acasalamento e para estudo da estruturação
populacional. Portanto, foram isolados e caracterizados 12 locos microssatélites altamente
polimórficos para Caiman c. crocodilus.
Os marcadores microssatélites foram isolados de acordo com o protocolo de Billotte et
al. (1999), com modificações. O DNA genômico total foi extraído de uma amostra de tecido
de um indivíduo proveniente da Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus
(Amazonas, Brasil), através do protocolo CTAB 2% (Doyle e Doyle, 1987), com
modificações. O DNA foi digerido com a enzima Rsa I (10 U/mL), ligados a um adaptador
construído a partir do primer Rsa 21 (5´ - CTC TTG CTT ACG CGT GGA CTA - 3´) e Rsa 25
(5 - TAG TCC ACG CGT AAG CAA GAG CAC A - 3) e amplificados com o primer RSA
21 de acordo com protocolo padrão de PCR (Billote et al. 1999). Os produtos de PCR
purificados foram hibridizados com oligonucleotídeos ligados a biotina III (CT)
8
e (GT)
8
e os
produtos hibridizados foram recuperados através do kit Streptavidine-Magnesphere (Promega,
Madison, WI). Os produtos hibridizados foram re-amplificados usando o primer RSA 21.Os
fragmentos de PCR purificados foram cloanados em um vetor pGEM-T (Promega, Madison,
WI), transformado em Escherichia coli XlL1 Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA) e a seleção das
células azul/brancas foram realizadas. As PCRs foram realizadas diretamente das colônias
positivas utilizando os primers universais M13 (-21) e primer reverse M13 (-48). Os produtos
de PCR foram purificados usando Exo - Sap (Invitrogen, Carlsbad, CA) e as reações de
seqüenciamento foram feitas usando o Kit BigDye Terminator versão 3.1 (Applied
Biosystems, Inc), com os primers internos T7 e Sp6 de acordo com o protocolo do fabricante.
As reações de sequência foram feitas em sequenciador automático ABI 3130 xl (Applied
Biosystems, Inc).
Um total de 96 clones foram seqüenciados e destes, 28 foram selecionados para o
desenho dos pares de primers através do software Primer 3 (Rozen e Skaletsky 2000). Em 13
pares de primers, um dos iniciadores tinha uma cauda M13 (- 21) adicionado à sua
extremidade 5 (Schuelke 2000), enquanto nos 15 pares restantes, um dos iniciadores tinha
uma cauda M13 (- 48) adicionado à sua extremidade 5. A adição de duas diferentes caudas
36
permite o anelamento simultâneo de primer universal M13 marcado com a fluorescência
FAM- 6 e HEX, respectivamente.
A temperatura ideal de anelamento foi inferida através do gradiente de PCR na faixa
de 48 a 63°C. A temperatura ideal para cada marcador variou de 50 a 60 °C e foram utilizados
para a caracterização de 12 primer altamente polimórficos a partir do conjunto original de 28
primer. As reações de genotipagem foram realizadas em um termociclador Veriti™ Thermal
Cycler (Applied Biosytems, Inc.) em um volume final de 10
µL. Cada reação continha 2,6 µL
de água ultrapura, 0,8 µL de 50 mM MgCl
2
, 0,8 µL de 10 mM dNTPs, 1,0 µL de tampão de
PCR (100 mM Tris-HCl, pH 8,5, 500 mM KCl); 1,0 µL de 5c de BSA, 0,3 µL de 2 µM do
primer forward; 0,7 µL de 2 µM do primer M13 marcado com fluorescência, 1,0 µL de 2 µM
do primer reverse; 0,8 µL de 2,5 U da enzima Taq DNA polimerase e 1,0 µL de DNA (50 –
100 ng/µL). As reações foram submetidas a duas ciclagens: desnaturação a 94ºC por 30 seg,
seguida de 20 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 seg, anelamento dos primers (temperatura
específica para cada par de primer) por 30 seg, extensão a 68ºC por 40 sec e a etapa de adição
da fluorescência consistiu em 25 ciclos de desnaturação a 94ºC por 20 seg, anelamento a 53ºC
por 30 seg, extensão a 72ºC por 40 seg, um passo final de extensão a 72ºC por 30 min. Um µL
do produto de PCR foi combinado com 1 µL de ROX de tamanho padrão (DeWoody, 2004) e
8,0 µL de formamida Hi - Di (Applied Biosystems, Inc) e genotipados em sequenciador
automático ABI 3130 xl (Applied Biosystems). Os genótipos foram visualizados com o
auxílio do programa GeneMapper v 4.0 (Applied Biosystems, Inc). Os locos microssatélites
foram caracterizados em 38 indivíduos de Caiman c. crocodilus da RDS Piagaçu – Purus
(Amazonas, Brasil) e 21 indivíduos de Caiman. c. yacare de Cáceres (Mato Grosso, Brasil),
nos programas GenAIEx v6.3 (Peakall & Smouse 2006), Fstat v2.9.3 (Goudet 1995) e Micro-
Checker v2.2.3 (Van Oosterhout et al. 2004).
Na população de Caiman c. crocodilus da RDS Piagaçu – Purus, a heterozigosidade
observada variou de 0,088 a 0,816 e a heterozigosidade esperada variou de 0,242 a 0,929. O
número de alelo por loco variou de 3 (loco Cc_B10) a 20 (loco Cc_D09), com média de 9,667
alelo/loco. A probabilidade de identidade genética para os locos individuais variaram de 0,012
a 0,531 por loco, enquanto que a probabilidade conjunta de identidade genética foi 4,631 x 10
-
13
. A probabilidade de exclusão de paternidade variou de 0,156 a 0,841 entre os locos,
enquanto que a probabilidade conjunta de exclusão de paternidade foi maior que 0,999
(Tabela 1). Três locos encontravam-se em significativo desvio do equilíbrio de Hardy-
Weinberg, e dois desses locos (Cc_B09 e Cc_D09) evidenciaram alelos nulos. Não houve
37
evidência de desequilíbrio de ligação entre os locos.
Os 12 locos polimórficos foram similarmente caracterizados na população de Caiman.
c. yacare de Cáceres, no entanto, apenas 10 locos foram polimórficos (Tabela 1). A
heterozigosidade observada variou de 0,115 a 0,833, a heterozigosidade esperada variou de
0,160 a 0,924, e o número de alelos por loco variou de três nos locos Cc_B10, Cc_D02 e
Cc_F03, a 14 nos locos Cc_E06 e Cc_E08. Os locos não mostraram desvio significativo de
Hardy-Weinberg, no entanto, os locos Cc_D02, Cc_D07, Cc_D09 e Cc_E06 evidenciaram
potencialmente a presença de alelos nulos. A probabilidade de identidade genética para os
locos individuais variaram de 0,017 a 0,714 por loco, enquanto que a probabilidade conjunta
de identidade genética foi de 2,233 x 10
-8
. A probabilidade de exclusão de paternidade variou
de 0,082 a 0,804 entre os locos, enquanto que a probabilidade conjunta de exclusão de
paternidade foi maior que 0,999 (Tabela 1). Todos os locos estão em equilíbrio de ligação.
Os 12 locos caracterizados parecem ser adequados para análises evolutivas do
complexo de espécies Caiman crocodilus que exige um conjunto de marcadores altamente
polimórficos, tais como estudos de sistema de acasalamento, estrutura populacional e variação
clinal em toda a Amazônia/Cerrado/Ecótono do Pantanal, parte superior do sistema do rio
Madeira.
AGRADECIMENTOS:
Este trabalho teve o suporte financeiro do CNPq/PPG7 5570090/2005-9 e CNPq/CT-
Amazônia 575603/2008-9 para I.P.F., e PROCAD-Amazônia-
INPA/UNICAMP/UFRGS/CAPES (023/2006). Permissão para a coleta das amostras de
tecido foi concedida pelo RAN/IBAMA n º. 18187-1 e SDS/CEUC. Este estudo faz parte da
dissertação de Mestrado de D.P.O em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva do
programa de pós-graduação do INPA/UFAM. D.P.O foi apoiada com uma bolsa do CNPq, e
para o trabalho de campo foi apoiado pelo WCS e Instituto Piagaçu.
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40
Tabela 1. Caracterização dos 12 locos microssatélites para Caiman c. crocodilus e teste de amplificação cruzada em Caiman c. yacare
GenBank
Primer
Tamanho
Caiman c. crocodilus Caiman c. yacare
Locos Acesso. (5’-3’) Repeat motif
Ta
(ºC)
(bp) n N
A
Ho He Q I
n N
A
Ho He Q I
Cc_B09 GU807530 (GT)
9
F - GTGAGGAACAGCTGGGAGAG
R - AAAAACACACACATGCATACATACT
50 °C
317 - 483 35 5 0.088 0.242* 0.156 0.53 19 4 0.208 0.231 0.116 0.610
Cc_B10 GU807531 (CA)
9
F - CCTGGGTGTCCATGGGTAG
R - TGCTTTCAACTTCCCAGAGG
56 °C
240 - 248 36 3 0.571 0.568 0.326 0.255 21 3 0.154 0.275 0.133 0.555
Cc_C05 GU807532 (GT)
20
F - TGTGATCTCTCTGATCTCCATGA
R - TCTGCCACAAGACAGGAGTG 60 °C
261 - 323 38 19 0.763 0.929* 0.841 0.012 19 4 0.125 0.160 0.082 0.714
Cc_D02 GU807533 (GT)
12
F - GTGGAAAGTTCTGGGGTCAG
R - TTAATCCCTCCGCCCACA 60 °C
250 - 276 38 7 0.711 0.740 0.543 0.103 21 3 0.269 0.523 0.273 0.290
Cc_D03 GU807534 (CA)
8
F - CTCTAACAGAGTAACCACCTTGC
R - GGTCATTTTGTAAATGCCAAAC
60 °C
279 - 289 38 4 0.526 0.532 0.310 0.275 21 1
Cc_D07 GU807535 (CA)
12
F - TGGCATAGGACTGTTTTCCA
R - CAACAGCGGGAGTTTGGTT
58 °C
197 - 225 38 13 0.816 0.848 0.688 0.047 21 10 0.615 0.849 0.678 0.045
Cc_D09 GU807536 (GT)
26
F - GGGTTCTGGGTTTGAGGAGT
R - GACAGAACCTGGCACACAAA 53 °C
267 - 337 35 20 0.559 0.888* 0.765 0.026 19 9 0.500 0.746 0.514 0.109
Cc_E06 GU807537 (CA)
25
F - AGAGCTGGCATTTTCTGAGG
R - TGGACTATCAGGGGACAGGA 60 °C
205 - 317 37 10 0.622 0.800 0.628 0.067 18 14 0.652 0.924 0.804 0.017
Cc_E08 GU807538 (GT)
16
F - ATTAAGCATATACAAACACACCAGA
R - TGGGTTTCCAAAATGACTTG
60 °C
206 - 242 36 14 0.778 0.835 0.680 0.048 19 14 0.833 0.876 0.719 0.035
Cc_F03 GU807539 (GT)
9
F - GTGGTAATCCATTCTTTGTTCG
R - GGCAGTATCACACATTCCAGAG
50 °C
212 - 240 37 5 0.595 0.639 0.388 0.202 21 3 0.115 0.302 0.145 0.521
Cc_G08 GU807540 (CA)
10
F - AACACCCCCTTGTAATGTGC
R - AGGGAGAATCAATGCACAGC 56 °C
260 - 272 37 5 0.541 0.559 0.336 0.25 21 1
Cc_H04 GU807541
(GT)
16
F - AATGGGCTTTCCAGAAACTG
R - CCAGTGACCTAAATTCCAACC
53 °C
247 - 390 36
11 0.806 0.843 0.686 0.047 20
8 0.231 0.587 0.39 0.198
QC = IC = QC = IC =
0.999 4.631 x 10
-13
0.999 2.233 x 10
-8
Ta, temperature de anelamento; n. número de indivíduos, A. número de alelos; Ho Heterozigosidade observada; He Heterozigosidade esperada; I. Probabilidade de identidade
genética por loco individual; IC. Probabilidade de identidade genética para todos os locos; Q. probabilidade de exclusão de paternidade para cada locos; QC. Probabilidade de
exclusão para todos os locos
41
CAPÍTULO II
ARTIGO A SER SUBMETIDO AO JOURNAL OF EXPERIMENTAL ZOOLOGY
PART A: ECOLOGICAL GENETICS AND PHYSIOLOGY
ANÁLISE DO SISTEMA DE ACASALAMENTO DE Caiman crocodilus da RESERVA
DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL PIAGAÇU – PURUS, AMAZONAS,
BRASIL
42
ANÁLISE DO SISTEMA DE ACASALAMENTO DE Caiman crocodilus da RESERVA
DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL PIAGAÇU – PURUS, AMAZONAS,
BRASIL
Deyla Paula de Oliveira
1
, Boris Marioni
2
, Izeni Pires Farias
1
, Tomas Hrbek
1,3*
Laboratório de Evolução e Genética Animal, Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas, Av.
Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000, 69077-000, Manaus, AM, Brazil
1
Instituto Piagaçu, Rua UZ, Quadra Z, Numero 8, Conjunto Morada do Sol, Aleixo, 69060-000, Manaus/AM,
Brazil
2
Biology Department, University of Puerto Rico, Rio Piedras, San Juan, PR 00931, Puerto Rico
3
*Correspondência para:
Tomas Hrbek
Fone: + 1 787 764 000 ext. (1) 2909; e-mail: [email protected]
RESUMO: Nós investigamos o sistema de acasalamento de Caiman crocodilus crocodilus da
Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus, Amazonas, Brasil. Através do uso
de seis locos microssatélites específicos para C. c. crocodilus foram genotipados 229
indivíduos, incluindo 198 filhotes de 13 ninhos (n= 4 a 28), 10 fêmeas e 21 machos. Para a
determinação da paternidade foram realizadas duas abordagens comparativas que incluíram a
contagem simples dos alelos e a reconstrução dos genótipos parentais para inferir a
contribuição relativa dos pais para cada ninho. Os resultados foram similares entre as duas
abordagens e a hipótese nula de paternidade única foi rejeitada em todos os 13 ninhos,
demostrando que dois a quatro pais poderiam estar contribuindo para a prole e que as fêmeas
de C. c. crocodilus são poliândricas. Esta é a primeira evidência do sistema de acasalamento
em C. c. crocodilus, e mostra que a paternidade múltipla é comum na espécie e que a
freqüência está entre os maiores valores já relatada para outros crocodilianos. Os dados serão
utilizados para compor o plano de manejo da espécie na RDS – PP.
PALAVRAS – CHAVE: Caiman crocodilus crocodilus, microssatélites, sistema de
acasalamento
43
INTRODUÇÃO
O conjunto de estratégias e interações sociais que ocorrem entre os indivíduos de uma
população e formam um contexto dentro do qual tem lugar à união de gametas é denominado
sistema de acasalamento (Carranza, 1994). Dinamicamente, o acasalamento é a acepção de
duas fases sucessivas na reprodução, o pareamento e a cópula. Pode haver ainda uma terceira
fase: a corte nupcial que se situa cronologicamente entre as duas já mencionadas (Davis,
1955).
Os vertebrados apresentam três formas gerais de sistema de acasalamento: a
monogamia, a poligamia e a promiscuidade (Karl, 2008). A monogamia é caracterizada pelo
acasalamento de um macho com uma única fêmea, formando um par unido durante a estação
reprodutiva ou por toda a vida. Com poucas exceções, a monogamia é rara em animais (Karl,
2008). Existem três formas de poligamia: a poliginia, poliandria e a poliginandria. A poliginia
é caracterizada pelo acasalamento de um macho com muitas fêmeas (poliginia de defesa de
recurso e poliginia de dominância dos machos). A poliandria é o inverso da poliginia: uma
fêmea acasala com vários machos ao mesmo tempo (poliandria simultânea) ou
sucessivamente (poliandria sucessiva). A poliginandria é caracterizada como o acasalamento
com dois ou mais machos com duas ou mais fêmeas (Karl, 2008). A promiscuidade é a
mistura de poliginia, poliandria e poliginandria, onde tanto os machos quanto as fêmeas
acasalam-se com vários indivíduos diferentes. Essas três formas de sistema de acasalamento
ocorrem em répteis, sendo que os mesmos apresentam as maiores taxas de sistema de
acasalamento poligâmico comparado a qualquer outro grupo de vertebrado (Uller e Olsson,
2008).
É amplamente aceito que a estrutura do sistema de acasalamento dos vertebrados é
influenciada por uma série de variáveis ecológicas, como a disponibilidade e distribuição de
recursos alimentares e locais de reprodução, condições climáticas, pressão de predadores,
competição intra e interespecífica, densidade populacional e distribuição espacial e temporal
de parceiros sexuais (Kwiatkowski e Sullivan, 2002). Assim, o conhecimento do sistema de
acasalamento é particularmente importante, pois influencia em uma série de fatores que vão
desde a sustentabilidade da população ao relativo sucesso reprodutivo dos indivíduos (ou seja,
seu fitness individual) (Chapman et al., 2004).
O uso de marcadores moleculares para tais atribuições pode trazer informações que
seriam difíceis ou impossíveis de obter a partir de observações comportamentais, por
44
exemplo, nos casos em que os mecanismos pós-copulatórios afetam a paternidade
(Fitzsimmons, 98) ou onde o acasalamento em si é difícil ou impossível de observar (Coltman
et al., 1998). O marcador molecular de microssatélites é considerado o marcador ideal para a
análise do sistema de acasalamento por ser altamente polimórfico, co–dominante, ser
amplificado via reação em cadeia da polimerase (PCR) (Jones et al., 2010), ter herança
mendeliana (Paeker et al., 1980) e por permitir examinar o sistema de acasalamento sem a
observações de comportamento na natureza. Os marcadores microssatélites permitem ainda
responder as seguintes questões sobre o sistema de acasalamento: se as fêmeas estão
acasalando com mais de um macho na mesma temporada de reprodução, quantos e quais
machos são pais de uma determinada prole, e se há domínio de certos machos durante a
reprodução (Davis et al., 2001).
Nos últimos anos, estudos genéticos têm sido realizados para investigar o sistema de
acasalamento em algumas espécies de répteis, confirmando que a paternidade múltipla é
generalizada na classe (Uller e Olsson, 2008). São reportados a evidência da paternidade
múltipla e padrões de acasalamento em Alligator mississippiensis (Davis et al. 2001),
evidência da poliandria em Crocodylus moreletti (McVay et al., 2008), Caiman latirostris
(Amavet et al., 2008), teste de maternidade em Caiman latirostris (Zucoloto et al., 2009) e
paternidade múltipla plurianual e fidelidade ao companheiro de longa data em Alligator
mississippiensis (Lance et al., 2009).
A paternidade múltipla é devido ao acasalamento múltiplo numa estação reprodutiva
sem o armazenamento de espermatozóides; ao acasalamento múltiplo numa estação
reprodutiva com o armazenamento de espermatozóides entre as estações ou ao acasalamento
com um único macho nas estações reprodutivas com o armazenamento de espermatozóides
entre as estações.
Os grupos de vertebrados que armazenam espermatozóides incluem as aves e os
répteis, grupos que possuem ovos telolécitos completos ou megalécitos (Gist et al., 2008). Em
répteis o armazenamento de espermatozóides é generalizado em todos os grandes táxons
(Uller e Olsson, 2008). Evidências indiretas do armazenamento de espermatozóides em
crocodilianos foram relatadas por Davenport et al. (1995). Porém, a estratégia de
armazenamento e o local potencial de armazenamento dos espermatozóides pelas fêmeas de
crocodilianos só foram confirmadas recentemente em Alligator mississippiensis por Gist et al.
(2008).
A descoberta da múltipla paternidade em vários táxons e conseqüentemente a
45
poliandria têm ampliado o papel na compreensão dos benefícios para as fêmeas que realizam
acasalamentos múltiplos (Moore et al., 2008). Embora Karl (2008) ressalte que a poliandria
não acarreta o aumento do tamanho efetivo populacional, acredita-se geralmente que o
sistema de acasalamento poligâmico tenha efeitos profundos sobre a diversidade genética de
uma população e que a poliandria possa aumentar o tamanho efetivo populacional devido à
diversidade genética proporcionado pela cópula com mais de um macho com a conseqüente
competição dos espermatozóides desses machos no oviduto das fêmeas (Yue et al., 2010). São
relatados também que o acasalamento de poucos machos com várias fêmeas pode levar ao
declínio populacional (Fantin et al., 2008).
Como o sistema de acasalamento determina quais genes serão representados nas
gerações futuras e, portanto, afeta a trajetória evolutiva de uma população, o conhecimento
sobre o sistema de acasalamento é um fator decisivo para o sucesso em longo prazo em
qualquer sistema de manejo e conservação a ser estabelecido para uma determinada
população selvagem.
O presente trabalho faz parte de um estudo amplo do Programa de Conservação de
Crocodilianos na Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus (RDS-PP), que
visa gerar informações sobre vários aspectos da ecologia geral da espécie Caiman croodilus
crocodilus. O conhecimento dos aspectos da ecologia da espécie junto com o conhecimento
do sistema de acasalamento dará embasamento para avaliar a susceptibilidade dessa espécie
quanto á exploração a qual a espécie vem sofrendo atualmente, visando à manutenção da
capacidade reprodutiva dessas populações a serem manejadas legalmente no futuro. Neste
sentido, o presente trabalho teve como objetivo analisar o sistema de acasalamento da espécie
C. c. crocodilus utilizando marcadores moleculares microssatélites espécie – específicos. O
estudo pretendia responder as seguintes questões: as fêmeas de C. c. crocodilus são
poliândricas? Qual a freqüência da poliandria (generalizada em todos os setores da RDS-PP)?
Os machos contribuem de maneira igualmente em cada ninho? Há machos dominantes? Há
evidência de fidelidade da fêmea a algum macho? Os machos da área de entorno contribuem
para a paternidade dos ninhos?
46
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta das amostras
As coletadas foram realizadas na Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu -
Purus (RDS - PP), localizada no baixo rio Purus, região central do Estado do Amazonas,
Brasil, entre as coordenadas geográficas 4º05´e 5º35´S e 61º73
΄e 63º35´O.
As coletas dos ninhos de C. c. crocodilus foram concentradas nos anos de 2007 e
2008, principalmente no período de vazante – seca entre os meses de setembro e dezembro
em três setores Cauá – Cuiuanã, Itapuru e Jari – Arumã, localizados na região norte da RDS –
PP. Os ninhos foram localizados durante caminhadas de varreduras nas margens de 15 lagos,
contando com a participação ativa dos moradores locais que atuaram como assistentes de
campo. Foram coletados de 30 a 100% de ovos de cada ninho (n= 4 a 28 ovos por ninho) em
13 ninhos, totalizando 198 filhotes (Tabela 1), sendo quatro ninhos da temporada reprodutiva
de 2007 e nove ninhos da temporada reprodutiva de 2008. Em alguns casos os ninhos estavam
parcialmente predados, o que inviabilizou a coleta de mais de 30% dos ovos.
As fêmeas encontradas guardando os ninhos foram consideradas como as possíveis
mães dos ninhos mais próximos e capturadas através de um laço especial de aço e cambão. Os
indivíduos capturados foram medidos, pesados e marcados individualmente, mediante a
remoção combinada de no máximo quatro das mais de 40 escamas caudais. Foram amostradas
11 fêmeas, sendo que uma destas fêmeas foi capturada em 2007 e recapturada em 2008 na
mesma localidade e com isso foi possível amostrar ninhos de duas temporadas reprodutivas
distintas. Uma fêmea de um ninho não foi capturada.
Adicionalmente, 21 amostras dos machos foram coletadas para ver a contribuição
relativa deles na prole de cada ninho (Tabela 2). Os machos foram capturados nos corpos de
água adjacentes aos locais onde os ninhos foram amostrados. Os procedimentos de captura,
medição, marcação individual e soltura foram os mesmos que os utilizados para as fêmeas no
ninho.
Todas as amostras de tecidos foram armazenadas em microtubos devidamente
identificados contendo álcool 95%, estocados em caixas de armazenamento e depositados na
Coleção de Tecidos de Genética Animal / CTGA – ICB / UFAM (CGEN, deliberação n. 75 de
26/08/04) do Laboratório de Evolução e Genética Animal, Universidade Federal do Amazonas
(LEGAL/UFAM).
47
Protocolos de laboratório
O DNA genômico foi isolado das amostras de tecido pelo método CTAB 2% (p/v)
(Doyle e Doyle, 87), com algumas modificações.
Para as reações de PCR foram utilizados seis locos microssatélites mais polimórficos,
que em conjunto mostraram PEC > 0.95 e PI < 0.001 e que permitiam formar multiplex dos
desenvolvidos por Oliveira et al. (2010) para C. c. crocodilus.
As amplificações foram realizadas em um termociclador Veriti™ Thermal Cycler
(Applied Biosytems, Inc.) em um volume final de 10
µL. Cada reação continha 2,6 µL de
água ultrapura, 0,8 µL de 50 mM MgCl
2
, 0,8 µL de 10 mM dNTPs, 1,0 µL de tampão de PCR
(100 mM Tris-HCl, pH 8,5, 500 mM KCl); 1,0 µL de 5c de BSA, 0,3 µL de 2 µM do primer
forward; 0,7 µL de 2 µM do primer M13 marcado com a fluorescência FAM ou HEX, 1,0 µL
de 2 µM do primer reverse; 0,8 µL de 2,5 U da enzima Taq DNA polimerase e 1,0 µL de
DNA (50 – 100 ng/µL). As amplificações foram realizadas em dois diferentes programas de
ciclagem: desnaturação a 94ºC por 30 seg, seguida de 20 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30
seg, anelamento dos primers (temperatura específica para cada par de primer) por 30 seg,
extensão a 68ºC por 40 seg e a etapa de adição da fluorescência consistiu em 25 ciclos de
desnaturação a 94ºC por 20 seg, anelamento a 53ºC por 30 seg, extensão a 72ºC por 40 seg,
um passo final de extensão a 72ºC por 30 min.
Um µL do produto de PCR foi combinado com 1 µL de
6-carboxi-X-rodamina (ROX)
de
tamanho padrão (DeWoody, 2004) e 8,0 µL de formamida Hi - Di (Applied Biosystems, Inc)
e genotipados em sequenciador automático ABI 3130 xl (Applied Biosystems, Inc). As
genotipagens foram feitas em sistema multiplex onde as combinações dos pares de locos
foram escolhidas por possuírem alelos em faixas de tamanho diferentes ou estarem marcados
por diferentes tipos de fluorescências (Tabela 3). Os genótipos foram visualizados com o
auxílio do programa GeneMapper
TM
software versão 4.0 (Applied Biosystems Inc.) para
inferir os tamanhos dos alelos de cada loco.
Ao todo foram genotipados 229 indivíduos, totalizando 198 filhotes de 13 ninhos (n=
4 a 28), 10 fêmeas e 21 machos. A amostra da fêmea do ninho 1 não foi amplificada devido a
má conservação do tecido em campo.
48
Análise dos dados
Foram calculadas a probabilidade de identidade genética, por loco (I) e combinada
(PI), probabilidade de exclusão de paternidade (PE) e de exclusão de paternidade combinada
(PEC) através do programa GenAIEx 6.3 (Peakall e Smouse, 2006). A probabilidade de
exclusão (PE) foi calculada para três casos: PE1 quando o genótipo de ambos os parentais são
conhecidos, calculada por meio da fórmula 1a de Jamieson e Taylor (1997), PE2, quando não
está disponível um ou outro genótipo parental, calculada segundo a fórmula simplificada 2a
de Jamieson e Taylor (1997), com base em Garber e Morris (1983) e PE3 quando não está
disponível nenhum genótipo parental, calculada segundo a fórmula 3a de Jamieson e Taylor
(1997), com base em Grundel e Reetz (1981). A probabilidade de exclusão combinada para
todos os locos é dada por: PEC = 1 – (1-P
1
) (1-P
2
) (1-P
3
)...(1-P
k
), sendo n o número de locos
avaliados e k é a probabilidade de exclusão de cada loco.
Determinou-se a probabilidade de identidade (I), segundo estabelecido por Paetkau et
al. (1995) para cada um dos locos escolhidos e a probabilidade de identidade combinada (PI),
calculada segundo a fórmula: PI = Σ
i
p4
i
+ Σ
i
Σ
j>i
(2pipj)2
, onde pi e pj são as freqüências de
dois alelos de uma determinada população.
A contagem dos alelos e dos genótipos foi utilizada para testar a presença ou a
ausência de mais de um pai em cada ninho. O método mínimo de contagem de alelos
pressupõe uma distribuição mendeliana dos alelos na progênie (Myers e Zamudio, 2004). Este
método atribui à paternidade múltipla dentro de uma ninhada supondo que todos os alelos não
contabilizados pelo genótipo materno foram contribuídos pelo genótipo do pai (Myers e
Zamudio, 2004).
Como a análise usando o método mínimo de contagem dos alelos é feita
individualmente para cada loco foi utilizado o programa Gerud 2.0 (Jones, 2005), que faz as
análises de reconstrução dos genótipos utilizando todos os locos microssatélites em conjunto.
Este programa reconstrói os possíveis genótipos maternos e paternos, dado que todos os
filhotes de um ninho são irmãos ou meio irmãos e faz uma busca exaustiva de todos os
possíveis genótipos dos pais contra a matriz da progênie para encontrar o número mínimo de
pais para explicar a matriz.
O programa não aceita dados faltantes, assim a prole com dados perdidos não pode ser
analisada e foi eliminada. Também não faz concessão a erros de genotipagem ou mesmo
mutações, mas ele detecta as incompatibilidades entre os parentais e os filhotes conhecidos, o
49
que pode dar uma indicação sobre a taxa de erros das genotipagens no conjunto dos dados,
permitindo que estes dados sejam retirados das análises.
RESULTADOS
Todos os seis locos foram altamente polimórficos e o número de alelos por loco dentro
dos ninhos, variou de 2 a 9, e em todos os ninhos o número de alelos observados variou de 11
para o loco Cc_H4 A 21 para o loco Cc_D9 (Tabela 4).
A probabilidade de exclusão obtida por loco variou de 0,794 a 0,872 quando ambos os
pais são conhecidos, de 0,657 a 0,772 quando apenas um dos pais é conhecido, e de 0,931 a
0,971 quando nenhum dos pais é conhecido (Tabela 5). A probabilidade de exclusão
combinada variou de 0, 816 a 0,999 quando ambos os pais são conhecidos, de 0,689 a 0,988
quando apenas um dos pais é conhecido, e quando não há a possibilidade de indicar nenhum
dos parentais, a probabilidade variou de 0,945 a 0,999 (Tabela 6).
A probabilidade de identidade genética por loco variou de 0,299 a 0,371 (Tabela 5) e a
probabilidade combinada de identidade genética (PI) variou de 0, 299 a 0,001 (Tabela 6),
indicando um valor baixo de identidade genética.
Os genótipos maternos foram determinados diretamente a partir das genotipagem das
amostras das fêmeas que estavam ao lado dos ninhos e estes puderam ser observados nos
genótipos dos descendentes. Foram genotipados todos os alelos maternos através dos seis
locos microssatélites nos ninhos N2, N3, N4, N7, N9, N11, N12, N13. No ninho 5 os alelos
maternos só puderam ser genotipados através dos locos Cc_D7, Cc_D9, Cc_E6, Cc_E8 e
Cc_H04, no ninho 6 os alelos maternos só foram genotipados através dos locos Cc_C5,
Cc_E6 e Cc_E8 e no ninho 8 os alelos maternos só foram genotipados através dos locos
Cc_C5, Cc_D7, Cc_E6 e Cc_E8 e Cc_H4. A fêmea do ninho N1 foi capturada, porém pela má
conservação do tecido em campo, os alelos correspondentes a cada loco não puderam ser
genotipados. A fêmea do ninho N14 não foi capturada, portanto os genótipos dessa fêmea
foram deduzidos a partir dos filhotes homozigotos quando presentes no ninho para cada loco.
Para as contagens simples dos alelos foram considerados os genótipos maternos dos ninhos
N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N11, N12 e N13, com base nos padrões de herança
mendeliana e com isso, foi possível averiguar a contribuição relativa de mais de um pai para a
prole em cada ninho.
A presença de filhotes homozigotos para um alelo permitiu a dedução de um alelo
50
paterno no ninho N1 através do loco Cc_H4, ninho N2 através dos locos Cc_C05 e Cc_D9,
ninho N3 através dos locos Cc_E6, Cc_E8 e Cc_H4, ninho N4 através dos locos Cc_C05,
Cc_E08 e Cc_H04, ninho N5 através dos locos Cc_D7, Cc_D9, Cc_E8 e Cc_H4, ninho N6
através dos locos Cc_E6 e Cc_E8, ninho N7 através dos locos Cc_C5, Cc_D7, Cc_E6 e
Cc_H4, ninho N8 através dos locos Cc_C5, Cc_D7, Cc_E6, Cc_E8 e Cc_H4, ninho N9
através dos locos Cc_C5, Cc_D09, ninho N11 através dos locos Cc_C5, Cc_E6 e Cc_H4,
ninho N12 através dos locos Cc_C5, Cc_D7, Cc_D9, Cc_E6 e Cc_H4 e ninho N13 através
dos locos Cc_C5, Cc_D9, Cc_E6, Cc_E8, Cc_H4. Já a presença de filhotes homozigotos para
dois alelos permitiu a dedução de dois alelos parternos nos ninhos N2 (loco Cc_E06), ninho
N5 (loco Cc_E6), ninho N7 (loco Cc_D09), ninho N9 (loco Cc_H04), N11 (loco Cc_E8),
ninho N13 (loco Cc_D7). A presença de filhotes homozigotos para um alelo permitiu deduzir
tanto o alelo materno nos casos em que alguns dos locos não puderam ser genotipados para as
fêmeas e também permitiram deduzir os alelos dos pais nos ninhos N1 através dos locos
Cc_D7, Cc_E8 e Cc_H4, ninho N6 através dos locos Cc_D7, Cc_D9 e Cc_H4), ninho N8
através do loco Cc_D9 e ninho N14 através do loco Cc_H4. A presença de filhotes
homozigotos para dois alelos permitiu deduzir tanto o alelo materno quanto os alelos dos pais
no ninho N1 através do loco Cc_E6, ninho N5 através do loco Cc_C5 e ninho N14 através dos
locos Cc_D9 e Cc_E6. Assim, a presença de filhotes homozigotos diferentes para um ou dois
alelos facilitou a reconstrução dos genótipos parentais e permitiu a verificação da presença de
mais de um pai em cada um dos ninhos.
Através da contagem simples dos alelos foi detectada a paternidade múltipla através de
dois locos microssatélites nos ninhos N4, por três locos nos ninhos N3, N9 e N14, por quatro
locos nos ninhos N1, N5 e N8, por cinco locos nos ninhos N1, N2, N11 e N12 e por todos os
locos nos ninhos N6, N7 e N13 (Tabela 7).
Através do programa Gerud 2.0 foi possível reconstruir os genótipos dos parentais das
progênies. Foi realizada a determinação dos genótipos das mães compatíveis e em seguida
foram feitos os testes dos possíveis genótipos paternos para ver qual combinação mínima dos
pais poderia explicar o conjunto dos dados.
Verificou-se que todos os genótipos das mães reconstruídos com o programa Gerud
2.0 foram compatíveis com os genótipos das fêmeas que estavam em defesa dos ninhos e que
haviam sido genotipadas. Como a fêmea do ninho 14 não foi capturada, os genótipos desta
fêmea foram reconstruídos pelo programa. Esse genótipo reconstruído também foi compatível
com o genótipo deduzido a partir dos filhotes homozigotos quando presentes no ninho para
51
cada loco através do método da contagem simples dos alelos. Também foi possível confirmar
que a fêmea do ninho N3 capturada em 2007 e recapturada em 2008 na mesma localidade era
realmente a mãe do ninho N3 e do ninho N4.
Através da reconstrução de todos os possíveis genótipos paternos para ver qual
combinação mínima dos pais poderia explicar o conjunto dos dados, verificou-se a
contribuição relativa de dois pais para os ninhos N3, N4, N5, N8, N9 e N11, de três pais para
os ninhos N1, N7, N12 e N14 e de quatro pais para os ninhos N2, N6 e N13, sendo que cada
um dos pais contribuiram diferentemente para cada prole (Tabela 8). Portanto, os dados
gerados pelo programa Gerud 2.0 confirmam que há paternidade múltipla em 100% dos
ninhos de C. c. crocodilus da RDS – PP.
Os genótipos dos 21 prováveis pais amostrados nos mesmos corpos de águas dos 13
ninhos, não corresponderam a nenhum dos genótipos dos pais reconstruídos por Gerud 2.0.
Assim, nenhum destes machos genotipados poderia ser o pai de algum dos ninhos.
DISCUSSÃO
Poder de discriminação dos locos microssatélites para a análise de parternidade em
C. c. crocodilus
Todos os seis locos utilizados para a análise da paternidade na espécie foram altamente
polimórficos. Tal constatação é importante, pois o conteúdo de informação do loco, que por
sua vez, depende do número de alelos e da distribuição das freqüências alélicas, melhora a
possibilidade de avaliação da paternidade (Wenk et al., 2005). O poder informativo de um
microssatélite para a determinação da paternidade é determinado pelo valor da probabilidade
da identidade genética e pela probabilidade de exclusão da paternidade, que são dependentes
do número de alelos e da distribuição de freqüências desses alelos na população. Constatou-se
que os seis locos também apresentaram bons índices de probabilidade de identidade genética
por loco e combinada e de probabilidade de exclusão de paternidade e de exclusão de
paternidade conjunta. O índice de identidade genética que é definida como a probabilidade
que dois indivíduos ao acaso da população apresentaram um perfil genético idêntico com os
locos testados, mostrou valores baixos, sendo que quanto menor os valores de identidade
genética, maior será o potencial de discriminação dos locos utilizados. Os seis locos
combinados indicaram uma alta probabilidade de um pretenso pai ser o verdadeiro pai,
52
quando comparado, ao acaso, com a probabilidade de que outro macho da população seja o
verdadeiro pai. A probabilidade de exclusão de paternidade variou de 98 % (quando apenas
um dos parentais é conhecido) a 99% (quando ambos os parentais são conhecidos e quando
não há a possibilidade de indicar nenhum dos parentais). Isberg et al. (2004) também
encontraram valores altos de probabilidade de exclusão de paternidade (99,8%), porém com
14 locos desenvolvidos por FitzSimmons et al. (2001) para Crocodylus porosus. Segundo
Curi e Lopes (2001), a eficácia do teste de paternidade não depende do número de locos
utilizados, mas sim do poder informativo que esses locos proporcionam.
Os resultados destes índices demonstraram o alto poder de discriminação dos seis
locos combinados, evidenciando que apenas os seis locos foram marcadores robustos para
inferir o sistema de acasalamento na espécie.
Análise de paternidade em C. c. crocodilus
O método mínimo de contagem dos alelos pressupõe uma distribuição mendeliana dos
alelos na progênie, onde cada filhote da ninhada deve herdar um dos dois alelos maternos e
um alelo paterno. Este método assume que todos os alelos dos filhotes não herdados pelas
fêmeas foram necessariamente contribuídos pelo genótipo dos pais (Myers e Zamudio, 2004).
Os filhotes homozigotos presentes nos 13 ninhos analisados também foram extremamente
importantes para inferir os prováveis alelos paternos e também para inferir se havia a
possibilidade de mais de um pai para cada um dos ninhos. Esse método, apesar de ser
informativo, é conservador na medida em que não é contabilizada a paternidade múltipla por
machos com alelos similares (Myers e Zamudio, 2004). O método também não permite
estimar quantos prováveis pais poderiam estar contribuindo para cada um dos ninhos e nem
permite reconstruir os verdadeiros genótipos dos parentais. Estas informações foram obtidas
através do programa Gerud 2.0 (Jones, 2005), que permitiu a reconstrução dos genótipos dos
parentais e também verificou a combinação mínima dos pais que poderiam estar contribuindo
para cada um dos 13 ninhos.
Os dados dos segundo método de análise confirmam que há paternidade múltipla em
100% dos ninhos. Os dados revelam ainda que a freqüência da paternidade múltipla obtida
esteja entre os maiores valores já registrados para as demais espécies de crocodilianos.
Para Alligator mississippiensis, Davis et al. (2001) relataram que a paternidade
múltipla foi detectada em 31,8% (7/22) dos ninhos analisados através de cinco locos
53
microssatélites. Para a realização do trabalho foram amostrados três ninhos na temporada
reprodutiva de 1995 e dezenove na temporada reprodutiva de 1997, sendo que os três ninhos
coletados em 1995 também foram genotipados utilizando um loco isoenzimático.
McVay et al. (2008) testaram a evidência da paternidade múltipla em Crocodylus
moreletii de duas localidades de Belize (América Central) através de cinco locos
microssatélites. Os autores relataram que 50% (5/10) dos ninhos analisados apresentaram a
contribuição de mais de um macho. Os dados sugerem que a paternidade múltipla é uma
estratégia de acasalamento nos crocodilos verdadeiros.
Amavet et al. (2008) detectaram a paternidade múltipla em 50% (2/4) dos ninhos de
Caiman latirostris de Santa Fé (Argentina) através de quatro locos microssatélites
desenvolvidos por Zucoloto et al. (2002) para a espécie.
Lance et al. (2009) obtiveram resultados da variação da paternidade múltipla em
Alligator mississippiensis durante oito estações reprodutivas no período de 10 anos (1995 a
2005). Foram analisados 92 ninhos, juntamente com os 22 ninhos do estudo de Davis et al.
(2001), através de cinco locos microssatélites. Foram detectados 51% de paternidade múltipla
em todos os ninhos, com variação de 40 a 67% entre os anos, ilustrando a complexa natureza
do comportamento de acasalamento dos crocodilianos. Os autores detectaram pela primeira
vez em crocodilianos a fidelidade parcial ao macho. Através da análise dos ninhos de dez
fêmeas recapturadas, foi possível detectar que sete destas fêmeas exibiram fidelidade ao
macho, sendo que uma fêmea copulou com o mesmo macho em três anos (1997, 2002 e
2005). Cinco destas fêmeas exibiram fidelidade parcial ao macho e tiveram pelo menos um
ninho com paternidade múltipla, ou seja, essa fêmea acasalou com o mesmo macho, mas não
exclusivamente.
No presente estudo foram amostrados dois ninhos (N3 e N4) de uma mesma fêmea em
duas temporadas reprodutivas e foi possível detectar que esta fêmea acasalou com quatro
diferentes machos em 2007 e 2008 (dois em cada estação reprodutiva), não sendo detectada
fidelidade a um único macho entre as duas temporadas reprodutivas. Seria necessária a
inclusão de outros ninhos de fêmeas recapturadas para averiguar se o comportamento de
fidelidade ao macho também seria comum em fêmeas de C. c. crocodilus. Porém, este único
caso reforça o fato de que as fêmeas da espécie apresentam fidelidade ao local de desova na
RDS Piagaçu – Purus. Este comportamento também já foi observado para A. mississippiensis
por Elsey et al., (2008) que relataram que a espécie apresenta graus variados de fidelidade ao
local do ninho, em geral na mesma área do ano anterior e alguns ninhos no mesmo local
54
durante anos.
A contribuição relativa dos machos para cada prole variou de 2 a 4 pais, sendo que em
46 % (6/13) dos ninhos, dois machos possivelmente contribuíram para a paternidade da prole,
em 31 % (4/13) dos ninhos três machos contribuíram para a paternidade da prole e em 23 %
(3/13) foram necessários quatro pais para explicar a contribuição extra para a prole. Ao total,
37 machos contribuíram para a paternidade dos 13 ninhos em conjunto em freqüências
aproximadamente iguais. Nenhum dos 21 machos capturados contribuiu para a paternidade
das proles dos 13 ninhos. Torna-se necessário fazer uma maior amostragem dos machos de
várias localidades da RDS Piagaçu – Purus para verificar os possíveis pais que estejam
contribuindo para a prole nas respectivas áreas amostradas.
Foi constatado que cada genótipo paterno foi único (não há compartilhamento na
fertilização de fêmeas de outros ninhos). Este tipo de contribuição diferencial de cada um dos
machos nos ninhos pode surgir através de vários fatores como a freqüência da cópula,
procedência do esperma e / ou momento da cópula e a competição dos espermatozóides
(Lance et al., 2009; Yue et al., 2010). Lance et al. (2009) constataram que em mais de 87 %
dos ninhos de A. mississipiensis analisados havia a contribuição de um macho primário
responsável pela paternidade de aproximadamente 50 % dos filhotes. Os autores concluíram
que o sistema de acasalamento desta espécie não é caracterizado por alguns machos
dominantes monopolizando o acasalamento.
Fisher e Hoekstra (2010) mostraram a partir de um experimento com camundongos do
gênero Peromyscus, cujas fêmeas são poliândricas, que os espermatozóides dos machos
podem formar agrupamentos com os outros espermatozóides gerados pelo mesmo indivíduo.
Os espermatozóides agregados têm a vantagem em serem mais rápidos do que os
espermatozóides individuais, o que os ajudam a atravessar o inóspito ambiente do aparelho
reprodutor feminino e permitem ainda a competição com os espermatozóides dos outros
indivíduos que a fêmea venha a copular. Do ponto de vista evolutivo, o agrupamento garante
que um determinado espermatozóide tenha seu material genético representado na prole, visto
que os demais espermatozóides que não fertilizaram o óvulo têm em média 50% de seu
material genético semelhante ao espermatozóide - irmão que fertilizou o óvulo.
É desconhecido se a existência da paternidade múltipla em C. c. crocodilus se deve ao
acasalamento com mais de um macho na mesma temporada reprodutiva com a conseqüente
competição dos espermatozóides desses machos no oviduto da fêmea apenas nesse ciclo
reprodutivo ou se a fêmea possa armazenar espermatozóides dos machos copulados em várias
55
temporadas reprodutivas como já relatado para algumas espécies de répteis como lagartos,
serpentes e tartarugas.
Davis et al. (2001) ressaltam que muitos dos argumentos de adaptação do
armazenamento dos espermatozóides em muitas espécies de répteis não se aplicam aos
crocodilianos. Além disso, os crocodilianos desovam apenas uma vez por temporada
reprodutiva e com isso não precisariam armazenar espermatozóides para desovas
subseqüentes (Magnusson et al., 89; Davis et al., 2001). Dados do trabalho de Gist et al.
(2008) com a espécie A. mississippiensis reforçam estes argumentos, sendo que os autores
demonstraram que está espécie pode armazenar o espermatozóide dos machos em seu oviduto
dentro da mesma época reprodutiva, mas não encontraram provas de que os espermatozóides
possam ser armazenados de uma estação reprodutiva para a próxima.
Implicações do sistema de acasalamento para a conservação e manejo
A Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus (RDS – PP), por ser uma
Unidade de Conservação Estadual de Uso Sustentável, é regido pelo Sistema Nacional de
Unidades de Conservação da Natureza (SNUC) e, em virtude disso, as espécies da fauna
silvestres tradicionalmente sujeitas à exploração econômica, como os C. c. crocodilus, são
passíveis de manejo legalizado, desde que previsto no plano de manejo da área. Esta espécie
merece uma atenção especial, pois está sujeita a uma alta pressão de caça na RDS - PP, de
forma que o baixo rio Purus é atualmente considerada uma das áreas de maior produção ilegal
de carne de jacarés (Da - Silveira, 2003)
Para a implantação do projeto de manejo há necessidade de estudos que gerem
informações sobre vários aspectos da biologia da espécie a ser manejada. Baseado nisso, o
Instituto Piagaçu (co - gestor da RDS – PP), através do Programa de Conservação de
Crocodilianos, realiza vários estudos na área da reserva, visando levantar informações básicas
que irão complementar o plano de manejo e conservação da espécie (Instituto Piagaçu, 2010).
Foram realizados mapeamentos dos locais de nidificação de jacarés e levantamentos noturnos
a fim de determinar a abundância, densidade e razão sexual das populações.
Os dados ecológicos indicam alguns possíveis efeitos da caça ilegal na estrutura
populacional de C. crocodilus, por exemplo, a estrutura de tamanho das populações indica que
81% dos indivíduos estão abaixo do tamanho mínimo reprodutivo (comprimento rostro –
cloacal
≤ 60 cm), sugerindo inclusive o manejo específico e monitoramento em longo prazo
(Instituto Piagaçu, 2010).
56
É relato que fêmeas de Alligator mississippiensis têm uma ampla oportunidade de
avaliar e escolher os machos preferidos, sendo que em cativeiro as fêmeas preferem machos
dominantes, mas que ocasionalmente podem acasalar com os machos subordinados (Garrick e
Lang, 77). Também o padrão de fidelidade ao macho encontrado por Lance et al. (2009) para
a mesma espécie sugere uma potencial escolha dos machos pelas fêmeas. Assim, a exploração
ou caça ilegal pode estar afetando diretamente o sistema de acasalamento da espécie C. c.
crocodilus na RDS – PP, porque ela tende a alterar a dinâmica de corte e a seleção de
parceiros, pois elimina indivíduos com características particulares, reduz o sucesso global de
acasalamento, a qualidade genética dos descendentes resultantes da baixa seleção sexual e
conseqüentemente a produtividade e tem forte efeito sobre o recrutamento posterior
(Allendorf e Hard, 2009).
A dinâmica de acasalamento encontrada para C. c. crocodilus, nos permite afirmar que
deve ser protegidas áreas maiores do que as áreas de ocorrência dos ninhos, pois as fêmeas
estão copulando com machos de outras áreas.
No presente trabalho, constatou-se que C. c. crocodilus apresenta um sistema de
acasalamento poligâmico, fato já observado para outras espécies de crocodilianos. Não
descartando o fato da poligamia ser o sistema de acasalamento preferencial da espécie
também em outras áreas, o alto índice de poliandria observado nas fêmeas da RDS – PP,
também pode ser a conseqüência de uma mudança no comportamento feminino, devido à
sobre-exploração que a espécie vem sofrendo.
Gosselin et al. (2005) demonstraram a mudança de comportamento no sistema de
acasalamento na lagosta americana (Homarus americanus) em decorrência da exploração
humana. Os autores observaram que as fêmeas amostradas em locais explorados são
principalmente poliândricas. Essa mudança decorre do fato de que machos maiores são o
principal alvo da caça predatória. Nesse caso as fêmeas buscam acasalar com outros machos
para garantir que todos os seus ovúlos sejam fertilizados.
Chevolot et al. (2007) demonstraram que as fêmeas da raia Raja clavata uma das
espécies mais pescadas comercialmente no Atlântico e no Mediterrâneo são poliândricas. Os
autores não descartam a possibilidade de que a poliandria na espécie seja uma resposta
compensatória ao enfrentamento análogo ao efeito Allee, uma situação em que a escassez dos
machos leva a uma diminuição da aptidão média da população.
A cópula com diferentes machos pode ser vantajosa para a fêmea por trazer benefícios
diretos, como o aumento da fertilização dos seus óvulos por machos com qualidade genética
57
superior ou indiretos proporcionando um maior potencial para a sua prole (Klemmer et al.,
2008), através de mecanismos pré - copulatórios ou pós - copulatórios. No mecanismo pré -
copulatório a fêmea pode copular com o primeiro macho disponível, o que asseguraria a
fecundação de seus óvulos e posteriormente copular com outro macho que apresente uma
melhor qualidade genética, averiguado através das características sexuais secundárias,
proporcionando a maximização da qualidade genética de seus descendentes (Pircher et al;
2003; Lee e Hays; 2004). No mecanismo pós - copulatório, haverá uma competição dos
espermatozóides no interior do trato reprodutivo da fêmea (Klemmer et al., 2008). Essa
competição funcionará como um mecanismo de reforço para o sucesso reprodutivo, pois
haverá a seleção dos espermatozóides com elevada qualidade genética o que culminará com a
seleção dos melhores e, portanto com o aumento da aptidão dos filhotes devido a herança dos
"bons genes" (Klemmer et al., 2008). A competição de espermatozóides também pode reduzir
a probabilidade de fecundação por espermatozóides geneticamente incompatíveis (Zeh e Zeh,
97), evitar a depressão endogâmica que pode surgir a partir do acasalamento com machos
aparentados, assegurar a fertilização através da presença de um número suficiente de
espermatozóides, caso a fêmea copule com um macho estéril ou que transfira um número
insuficiente de espermatozóides (Avise et al., 2002).
Embora Karl (2008) não discorde dos benefícios advindos da cópula com mais de um
macho, ele argumenta que a paternidade múltipla não aumenta o tamanho efetivo
populacional como relatado em vários trabalhos (Murray, 64; Moran e Garcia-Vazquez, 98).
Segundo o autor, na maioria dos casos, a paternidade múltipla diminuirá o tamanho efetivo
populacional por causa do aumento da variância global no sucesso reprodutivo masculino.
Apenas quando a contribuição dos machos para a prole for igualada, o tamanho efetivo será
inalterado. O autor enfatiza que há necessidade de um teste empírico em todos os estudos que
argumentam que a paternidade múltipla esteja aumentando o tamanho efetivo populacional.
Para ele, apenas Sugg e Chesser (94), fizeram um tratamento teórico que especificasse os
efeitos da paternidade multipla sobre o tamanho efetivo populacional, demonstrando que
poderia haver um aumento do tamanho efetivo com a paternidade múltipla.
Como a exploração ou caça ilegal reduz substancialmente a variabilidade genética de
uma população, limitando a expansão futura, a alta freqüência de paternidade múltipla
detectada em C. crocodilus na RDS – PP pode ser um fator importante, pois pode estar
assegurando a qualidade genética dos descendentes. Porém, sugere-se a avaliação futura dos
níveis de variabilidade genética da espécie na RDS - PP, pois as informações geradas poderão
58
fornecer um indicador do número de indivíduos que contribuem com genes para a próxima
geração e, portanto, é uma valiosa estimativa do tamanho efetivo populacional (Ne). Estas
informações também poderão auxiliar no plano de manejo e conservação da espécie na
reserva.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho teve o suporte financeiro do CNPq/PPG7 5570090/2005-9 e CNPq/CT-
Amazônia 575603/2008-9 para I.P.F. Permissão para a coleta das amostras de tecido foi
concedida pelo RAN/IBAMA n º. 18187-1 e SDS/CEUC. Este estudo faz parte da dissertação
de Mestrado de D.P.O em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva do programa de pós-
graduação do INPA/UFAM. D.P.O foi apoiada com uma bolsa do CNPq, e para o trabalho de
campo foi apoiado pelo WCS e Instituto Piagaçu.
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64
Tabela 1. Código dos ninhos e informações dos corpos de água, setores, quantidade de
filhotes genotipados e porcentagens e ano de coleta dos 13 ninhos amostrados em
2007 e 2008 na RDS Piagaçu-Purus.
*Mais do que 30% dos ovos não puderam ser coletados
*
* Ninhos da mesma fêmea.
Amostras Amostras Ano
Código Ninho Corpo de água Setor genotipadas
% fêmeas Coleta
IT07CC011 N01 Lago Patinho Itapuru 9
*
Sim 2007
CA07CC069
N02 Lago Craveirinha Cauá 21 100 Sim 2007
IT07CC95 N03 Paranã Capitarizinho Itapuru 5
*
** 2007
IT08CC003 N04 Paranã Capitarizinho Itapuru 4
*
**
2008
IT08CC005 N05 Paranã Capitarizinho Itapuru 24 100 Sim 2008
AR08CC003
N06 Lago Miauzinho Jari - Arumã 22 100 Sim 2008
IT08CC032 N07 Paranã Tapagem Itapuru 11 100 Sim 2008
CA08CC009
N08 Lago Viola Cauá 11 50 Sim 2008
CA08CC027
N09 Lago Bololão Cauá 13 50 Sim 2008
CA08CC039
N11 Paranã do Carro Cauá 18 50 Sim 2008
CA08CC002
N12 Lago Bijogó Cauá 25 100 Sim 2008
CA08CC003
N13 Lago Bijogó Cauá 28 100 Sim 2008
IT07CC94 N14 Paranã Capitarizinho Itapuru 7
*
Não 2007
65
Tabela 2. Amostras dos machos de jacaré-tinga coletados em corpos de água nas
proximidades dos ninhos amostrados na RDS – Piagaçu – Purus.
Machos Corpo de água Setor
Cc_D1S2S7 Lago Cunhã Atravessado Paricatuba
Cc_D1S2S11 Lago Cunhã Atravessado Paricatuba
Cc_D1S2S9 Lago Cunhã Atravessado Paricatuba
Cc_E1S3 Lago Esfolinha Itapuru
Cc_E1S5 Lago Esfolinha Itapuru
Cc_E1S7 Lago Esfolinha Itapuru
Cc_E1S8 Lago Esfolinha Itapuru
Cc_E1S4 Lago Esfolinha Itapuru
Cc_E1S6 Lago Esfolinha Itapuru
Cc_E1S2 Lago Esfolinha Itapuru
Cc_D1S10 Lago. C. Peua Grande Caua-Cuiuanã
Cc_D2S3 Lago. C. Peua Grande Caua-Cuiuanã
Cc_D1S5 Lago. C. Peua Grande Caua-Cuiuanã
Cc_D3S5 Lago. C. Peua Grande Caua-Cuiuanã
Cc_D1S3 Lago Bololão Caua-Cuiuanã
Cc_D1S2S6 Lago Araçatuba Paricatuba
Cc_D1S2S5 Lago Araçatuba Paricatuba
Cc_D1S3S9 Paranã Paricatuba Paricatuba
Cc_D1S3S8 Paranã Paricatuba Paricatuba
Baja22 Lago Bijogó Caua-Cuiuanã
Baja26 Lago Araça da Prainha Caua-Cuiuanã
Tabela 3. Combinações dos seis locos para genotipagem tipo multiplex
Locos combinados Fluorescência
Tamanho (pb)
C5 + D7 FAM/HEX 261- 323/197 - 225
D9 + E8 HEX/HEX 267 - 337/206 - 242
E6 + H4 HEX/HEX 205 - 317/247 - 390
66
Tabela 4. Número de alelos por loco dentro dos ninhos e em todos os 13 ninhos de Caiman
crocodilus
Locos
Ninhos
Cc_C5 Cc_D7 Cc_D9 Cc_E6 Cc_E8 Cc_H4
N1 4 3 5 3 3 5
N2 5 5 8 5 3 4
N3 4 4 4 5 3 2
N4 5 4 5 3 2 2
N5 4 4 5 4 2 6
N6 6 3 3 4 4 3
N7 6 4 9 4 4 4
N8 5 3 4 3 3 4
N9 6 4 5 5 4 3
N11 5 4 5 3 3 3
N12 7 6 3 4 5 4
N13 8 3 4 4 5 5
N14 5 5 2 3 3 3
Todos os ninhos 18 12 21 15 13 11
Tabela 5. Potencial dos locos microssatélites para a análise de parentesco em C. crocodilus da
RDS Piagaçu – Purus.
Locos PE 1 PE 2 PE 3 PI
C5 0,872 0,772 0,971 0,299
D7 0,813 0,683 0,942 0,351
D9 0,863 0,759 0,967 0,346
E6 0,794 0,657 0,931 0,371
E8 0,813 0,683 0,942 0,364
H4 0,813 0,683 0,942 0,340
PE1 = probabilidade de exclusão por loco quando o genótipo de ambos os parentais são
conhecidos.
PE2 = probabilidade de exclusão por loco quando não está disponível um ou outro
genótipo parental.
PE3 = probabilidade de exclusão por loco quando não está disponível nenhum genótipo
parental.
PI = probabilidade de identidade genética por loco.
67
Tabela 6. Potencial dos locos microssatélites combinados para análise de parentesco em C.
crocodilus da RDS Piagaçu - Purus
Locos combinados PEC 1 PEC 2 PEC 3 PI
1 0,816 0,689 0,945
0,299
1+2 0,936 0,839 0,99
0,105
1+2+3 0,98 0,922 0,998
0,036
1+2+3+4 0,992 0,955 0,999
0,013
1+2+3+4+5 0,997 0,975 0,999
0,004
1+2+3+4+5+6 0,999 0,988 0,999 0,001
Nota: 1= Loco Cc_C05; 2= Cc_D07; 3= Cc_D09; 4= Cc_E06; 5= Cc_E08; 6= Cc_H04
PEC1 = probabilidade de exclusão combinada quando o genótipo de ambos os parentais
são conhecidos,
PEC2 = probabilidade de exclusão combinada quando não está disponível um ou outro
genótipo parental,
PEC3 = probabilidade de exclusão combinada quando não está disponível nenhum
genótipo parental,
PI = probabilidade combinadda de identidade genética
68
Tabela 7. Evidências de paternidade múltipla em 13 ninhos de Caiman crocodilus crocodilus com base em informações de seis locos
microssatélites espécie – específicos
C05 D07 D09 E06 E08 H04
Ninhos
N H AP/AE
N H AP/AE N H AP/AE
N H AP/AE
N H AP/AE
N H AP/AE
N1
9 0
0/4
9 2
2/3
9 0
0/5
9 6
4/3
9 2 2/3 9 1
2/5
N2
21
1
3/5
21 3
3/5
19 1
3/8
19 5
4/5
21 0 2/3 15 2
3/4
N3
5 0 2/4 5 0 2/4 5 0
2/4
5 3
3/5
5 0
3/3
3 1 3/2
N4
4 1
3/5
4 0 2/4 4 0
2/5
4 0 2/3 4 2 3/2 4 2 3/2
N5
24
7
4/4
24 2
3/4
24 21
3/5
24 13 4/4 24 9 3/2 23 2
3/5
N6
22
8
2/6
22 3
4/3
20 19
4/3
21 9
3/4
20 3
3/4
16 8
4/3
N7
11
0
2/6
11 0
2/4
11 3
4/9
11 3
3/4
11 0 2/4 11 4
3/4
N8
11
2
3/5
11 3 3/3 11 1
2/4
11 4
3/3
11 4 3/3 11 1
3/4
N9
13
1
3/6
13 0 2/4 13 6
3/5
13 0
2/5
13 0 2/4 13 5 4/3
N11
18
2
3/5
18
0 2/4
18
0
2/5
18
7
3/3
18
8
4/3
17
11
3/3
N12
25
2
3/7
25
4
3/6
24
3
3/3
25
7
3/4
25
0
2/5
24
4
3/4
N13
28
8
3/8
28
7
4/3
25
4
3/4
28
1
3/4
28
4
3/5
28
0
3/5
N14
7 0
0/6
7 0
0/5
7 7 4/2 7 3
4/3
7 0 0/3 7 3 2/3
Nota: N = número de indivíduos genotipados por cada loco/ninho; H = filhotes homozigotos presentes em cada loco/ninho; AP/AE = alelos
parentais inferidos/número de alelos encontrados para cada loco/ninho. Os resultados em negrito indicam a presença de paternidade múltipla.
69
Tabela 8. Genótipos dos parentais reconstruídos com o auxílio do programa Gerud 2.0 e
estimativa da contribuição relativa de cada um dos pais nos 13 ninhos de C. c. crocodilus
Locos
Ninhos
Família
Cc_C05
Cc_D7 Cc_D9 Cc_E6 Cc_E8 Cc_H4
% da contribuição dos pais
N1 Mãe 303/305
213/217
303/315
299/303
219/231
365/375
Pai 1 301/301
213/201
305/311
299/303
219/219
375/377
25%
Pai 2 301/303
213/201
307/311
299/299
209/209
369/369
25%
Pai 3 307/303
213/201
305/311
303/301
209/219
369/367
50%
N2 Mãe 291/297
199/201
291/305
299/309
219/225
365/369
Pai 1 305/299
201/205
279/307
299/299
213/213
369/369
27,27%
Pai 2 305/299
201/205
279/311
299/315
213/213
373/363
45,45%
Pai 3 309/299
199/199
307/311
317/279
213/213
369/369
18,18%
Pai 4 299/299
201/201
277/277
317/317
213/213
373/373
9,09%
N3 Mãe 303/307
203/213
271/275
299/299
213/213
369/369
Pai 1 295/295
221/199
277/277
319/299
233/231
363/363
66.66 %
Pai 2 305/305
199/199
271/271
299/299
213/213
369/369
33,33%
N4 Mãe 303/307
203/213
271/275
299/299
213/213
369/369
Pai 1 307/279
199/199
305/307
309/309
213/213
369/369
50%
Pai 2 279/309
199/215
311/311
309/305
219/219
361/361
50%
N5 Mãe 303/307
201/221
275/275
303/307
223/223
367/371
Pai 1 303/301
205/205
275/275
307/307
223/223
367/377
25%
Pai 2 307/305
199/205
275/329
303/307
223/213
367/369
75%
N6 Mãe 301/303
201/205
277/275
305/307
213/213
363/369
Pai 1 299/307
201/201
275/275
299/305
233/233
369/361
27,27%
Pai 2 299/301
201/201
277/277
299/299
235/215
363/369
27,27%
Pai 3 305/307
201/201
277/277
299/299
213/215
369/369
18,18%
Pai 4 261/303
205/205
277/277
305/297
233/215
369/369
27,27%
N7 Mãe 301/301
207/213
299/313
307/317
209/213
363/369
Pai 1 303/305
199/199
271/271
299/299
215/215
361/369
25%
Pai 2 303/313
197/199
271/277
307/299
231/231
365/365
50%
Pai 3 313/307
199/199
279/309
307/299
231/231
365/363
25%
N8 Mãe 293/293
199/213
275/271
303/303
219/231
365/367
Pai 1 305/293
199/203
297/275
299/303
231/213
361/367
50%
Pai 2 307/301
199/203
297/275
299/303
231/213
367/375
50%
N9 Mãe 299/317
205/205
277/279
309/311
223/229
363/367
Pai 1 305/305
213/199
277/277
299/303
227/213
367/367
33,33%
Pai 2 305/301
213/199
307/311
299/303
227/213
363/369
66,66%
N11 Mãe 295/305
203/205
279/299
303/303
223/225
367/369
Pai 1 303/287
199/209
275/287
299/303
213/223
367/361
70%
Pai 2 303/287
199/209
287/277
299/283
223/225
367/367
30%
70
Cont. Tabela 8. Genótipos dos parentais reconstruídos com o auxílio do programa Gerud 2.0
e estimativa da contribuição relativa de cada um dos pais nos 13 ninhos de Caiman crocodilus
Locos
Ninhos
Família
Cc_C05
Cc_D7 Cc_D9 Cc_E6 Cc_E8 Cc_H4
% da contribuição dos pais
N12 Mãe 303/307
199/205
277/305
299/305
209/221
369/371
Pai 1 309/301
199/199
301/301
299/301
231/223
367/371
36,36%
Pai 2 305/303
205/197
279/277
305/301
231/223
367/371
45,45%
Pai 3 305/311
199/197
301/275
301/301
231/231
367/367
18,18%
N13 Mãe 303/321
201/203
275/299
299/299
213/225
369/369
Pai 1 315/305
201/205
307/307
305/279
213/213
361/361
27,27%
Pai 2 305/307
203/203
307/309
305/307
219/227
361/365
27,27%
Pai 3 311/319
203/203
275/305
305/305
219/219
365/365
18,18%
Pai 4 301/303
201/205
307/309
307/307
213/219
361/365
27,27%
N14 Mãe 303/307
199/213
277/279
303/309
215/223
367/371
Pai 1 313/309
221/215
277/277
311/303
231/231
371/369
42,85%
Pai 2 303/303
203/203
279/279
303/303
223/223
369/369
14,28%
Pai 3 311/311
215/213
277/277
311/309
231/231
371/369
42,85%
71
2.
CONCLUSÃO GERAL
Os 12 locos isolados e caracterizados para C. c. crocodilus:
• São polimórficos
• Apresentam alto poder de exclusão de paternidade
• Baixa probabilidade de identidade genética
• São ideais para estudos de paternidade
• Poderão ser utilizados em estudos populacionais com outras espécies e subespécies
relacionadas
Sistema de acasalamento:
• Primeira evidência do sistema de acasalamento de C.c. crocodilus
• Fêmeas de C. c. crocodilus são poliândricas
• Foi encontrada uma alta freqüência de paternidade múltipla (100% dos ninhos)
• Não houve evidência de fidelidade a um único macho
• Foi relatado caso de fidelidade ao sítio de desova em duas temporadas reprodutivas
• Houve contribuição diferencial dos machos na fertilização
• Não há machos dominantes
• Dados importantes para a conservação e manejo da espécie na RDS Piagaçu – Purus
72
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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APÊNDICE I
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