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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA
“PROF. DELBY FERNANDES DE MEDEIROS”
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS
E SINTÉTICOS BIOATIVOS
KARINE FORMIGA QUEIROGA
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO
BIOANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DA RIPARINA I
EM SANGUE DE RATOS
João Pessoa – PB
2010
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KARINE FORMIGA QUEIROGA
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO
BIOANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DA RIPARINA I
EM SANGUE DE RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos do Laboratório de
Tecnologia Farmacêutica “Prof. Delby
Fernandes de Medeiros” do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade
Federal da Paraíba, em cumprimento às
exigências para obtenção do título de
Mestre em Farmacoquímica de Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Marcelo Sobral da Silva
COORIENTADORA: Profa. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz
João Pessoa – PB
2010
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Q3d Queiroga, Karine Formiga.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para
quantificação da riparina I em sangue de ratos / Karine Formiga
Queiroga. - João Pessoa: [s.n.], 2010.
161 f. : il.
Orientador: Marcelo Sobral da Silva.
Coorientadora: Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz.
Dissertação (Mestrado) – UFPB/CCS.
1. Produtos naturais. 2. Aniba riparia (Nees) Mez. 3. Riparina I. 4.
Extração líquido-líquido. 5. Bionálise. 6. CLAE-UV
UFPB/BC CDU: 547.9(043)
KARINE FORMIGA QUEIROGA
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO
BIOANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DA RIPARINA I
EM SANGUE DE RATOS
Dissertação aprovada em 10 de março de 2010.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________
Prof. Dr. Marcelo Sobral da Silva
Universidade Federal da Paraíba
Orientador
__________________________________________
Profa. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz
Universidade Federal da Paraíba
Coorientadora
__________________________________________
Prof. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira
Universidade Federal da Paraíba
Examinador Interno
__________________________________________
Prof. Dr. Ticiano Gomes do Nascimento
Universidade Federal de Alagoas
Examinador Externo
Dedico este trabalho aos meus pais,
Vicente e Alba, pelo amor, dedicação,
compreensão pela ausência e por sempre
investirem na minha educação; as minhas
irmãs gêmeas, Karolinne e Katherine,
por todo amor, amizade e felicidade que
me proporcionam e a toda a minha família,
em especial, a minha avó Maria das
Neves, pelo apoio e carinho de sempre.
AGRADECIMENTOS
A Deus, que me dá forças para não desistir dos meus sonhos e que nas
dificuldades me faz perceber que “mesmo quando eu chorar as minhas lágrimas
serão para regar a minha fé e consolar meu coração”.
Ao Prof. Dr. Marcelo Sobral da Silva, pela orientação, pela oportunidade
de ingressar na pesquisa científica e por ter confiado e acreditado em mim durante
esses seis anos no LTF.
A Prof. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz, a quem eu tanto
admiro e respeito, pelo apoio e exemplo de pessoa e profissional.
A Socrates Golzio, pelos ensinamentos, incentivo e dedicação à pesquisa,
pelo apoio em todos os momentos, pela paciência, amizade, confiança, pelas idéias
sempre brilhantes e sua alegria constante que tornavam os experimentos tão
divertidos. Minha eterna gratidão, admiração e carinho.
Ao Dr. Stanley Juan Chávez Gutierrez que nos cedeu as riparinas para
estudo, pela disponibilidade e pelo apoio de sempre.
A Prof. Dra. Creuzioni Figueredo dos Santos, pela acolhida e
oportunidade concedida para a utilização da centrífuga.
A José Crispim Duarte pelo apoio e disponibilidade com os animais sempre
que precisei.
Ao Prof. Dr. Josean Fechine Tavares, pela orientação e ensinamentos
durante minha iniciação científica, pelo incentivo e por ter sempre acreditado em
mim.
As minhas adoráveis e inseparáveis amigas: Maria do Carmo de Alustau,
Camila Figueiredo, Priscilla Néris e Catarina Rangel, que são essenciais na
minha vida e sempre me apoiam em todos os momentos.
A Hellane Fabricia, minha grande amiga, pela confiança, preocupação,
dedicação, apoio constante, pelas loucuras, mesóclises e muitas risadas nos fins de
semana e madrugadas no laboratório e por ser sempre tão presente na minha vida,
tornando tudo mais fácil de ser superado.
A Fabio Tenório-Souza, por ser esse amigo tão admirável e altruísta, pelo
carinho, incentivo, ajuda com os espectros, pela alegria de sempre, por tornar os fins
de semana e madrugadas no laboratório inesquecíveis e por saber que posso contar
com ele em todos os momentos.
Ao meu amigo “awesome” Wemerson Matias, por toda a alegria que me
proporciona, sempre me incentivando e me fazendo sorrir, pela preocupação, apoio,
pela companhia tão agradável e por acreditar em mim.
A equipe Sobral, meus queridos: Vivianne Marcelino, Steno Lacerda, Isis
Fernandes, Heloísa Mara, Marcelo Duarte e Meri Emili pela força, amizade e
companheirismo no dia a dia.
Aos meus grandes amigos da melhor turma de todos os tempos: Thiago
Gomes, Felipe Queiroga, Rodrigo Molina, Aline Lira, Mariana Nóbrega, Thaísa
Rolim, Edison Vieira e Tiago Bezerra, pelos momentos inesquecíveis, pela força,
carinho e certeza de amizade para a vida toda.
A Thyago Queiroz pela amizade, força e estímulo em todos os momentos.
Aos amigos do LEBIM-DBM que me acolheram tão bem, em especial a
Thiago Onofre pelo carinho, pela alegria e disponibilidade de sempre.
Aos amigos da Fitoquímica: Narlize Lira, Daysianne Pereira, Gabriela
Lemos, Analúcia Guedes, Ana Silvia Suassuna, Roosevelt Albuquerque,
Marianne Guedes, Rafael Rodrigo, Roberto Jefferson, Antônio Cláudio, Sandro
Leal e Cinthia Queiroga pela força, companheirismo e agradável convívio.
A turma do mestrado: Ana Carolina Correia, Antônia Rosângela, Bruna
Priscilla, Camila Figueiredo, Carlos Alberto, Charlane Souto, Daysianne
Pereira, Fábio Tenório, Fillipe Oliveira, João Carlos Pita, John Albuquerque,
Geraldo Gonçalves, Maria do Carmo de Alustau, Marcelo Duarte, Renata Kelly,
Rubens Benedito, Tiago Bezerra, Thaísa Rolim, Vinícius Trajano, Vitor Lorenzo,
Vivyanne Falcão e Wemerson Matias, pela ótima convivência, pelos momentos de
descontração e pelas amizades que construímos.
Aos professores da Pós-Graduação, em especial: Bagnólia Araújo,
Demétrius Machado, Eduardo de Jesus Oliveira, Josean Fechine e Maria de
Fátima Vanderlei de Souza por todos os ensinamentos.
A Raimundo Nonato, Vicente Carlos, Glória e Ataíde Matias por serem
sempre tão atenciosos e pelas ajudas no laboratório sempre que precisei.
A UFPB e CNPq pelo suporte técnico e apoio financeiro.
“É preciso que eu suporte duas ou três larvas se quiser conhecer as borboletas”
Antoine de Saint-Exupéry
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da
riparina I em sangue de ratos.
QUEIROGA, K. F.
Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,
Dissertação de Mestrado, LTF/CCS/UFPB (2010)
RESUMO
A riparina I, uma alcamida isolada dos frutos verdes de Aniba riparia (Neez) Mez,
apresenta várias atividades farmacológicas, entre as quais ação antinociceptiva,
ansiolítica e antimicrobiana. Não há metodologias de análise da riparina I em
matrizes biológicas descritas na literatura. Sendo assim, o presente trabalho
descreve o desenvolvimento, a extração e a validação de método bioanalítico para
sua quantificação em sangue de ratos Wistar, utilizando a CLAE-UV/Vis. O estudo
foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA/UFPB).
A pureza da riparina I foi avaliada por meio de métodos cromatográficos e
espectroscópicos. O método cromatográfico desenvolvido utilizou uma coluna de
fase reversa C-18 (250 x 4,6 mm x 5 μm) e como fase móvel uma mistura de água e
metanol (35:65 | H
2
O:MeOH) a um fluxo de 1 mL/min. O estudo de estabilidade em
solução demonstrou que a riparina I se manteve estável após armazenamento a
-20 ºC e ciclos de congelamento e descongelamento de 24 horas durante 30 dias. O
método de extração líquido-líquido avaliou a recuperação da riparina I em sangue de
ratos e ratas, utilizando diferentes solventes orgânicos e condições de centrifugação.
Apenas as variáveis “tipo de sangue” em relação ao sexo e “solvente orgânico”
apresentaram diferenças significativas quando comparadas dentro de seus grupos.
A riparina I apresentou uma maior recuperação em sangue de ratos (94,50%)
utilizando a acetonitrila a 12.000 x g durante 20 minutos. O efeito de matriz é
definido como o conjunto de alguns efeitos indesejáveis que se originam de uma
matriz biológica, que podem resultar em supressão ou aumento do sinal. Pode ser
calculado pela relação entre a área das amostras em solução/ área das amostras
extraídas da matriz. Um valor de 100% indica que não há nenhum efeito de matriz e
pode-se observar que não houve efeito de matriz em sangue (100,64%). A avaliação
da eficiência do processo de extração foi determinada pela relação entre o efeito de
matriz e a recuperação em relação ao método de extração, e foi observado um valor
de 106,89%, demonstrando a eficácia do processo de extração. O método de
quantificação por detecção no ultravioleta foi desenvolvido e validado de acordo com
a Resolução RE nº 899/2003 da ANVISA e mostrou-se: seletivo nos diferentes tipos
de sangue, linear na faixa de concentração utilizada (0,2-7,0 μg/mL), preciso
(CV ≤ 15%), exato (100-110%), com recuperação elevada (94,69 ± 4,81) e robusto,
dentro das condições especificadas, podendo ser empregado para determinação
quantitativa da riparina I no sangue em estudos de farmacocinética.
Palavras-chave: Aniba riparia (Nees) Mez. Riparina I. Extração líquido-líquido.
Bioanálise. Sangue. Validação. CLAE-UV.
Development and validation of bioanalytical method to quantify riparin I in
blood of rats.
QUEIROGA, K. F.
Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,
Master’s Thesis, LTF/CCS/UFPB (2010)
ABSTRACT
Riparin I, an alcamid isolated from the green fruits of Aniba riparia (Nees) Mez, has
several pharmacological activities, including antinociceptive, anxiolytic and
antimicrobial action. There are no methods for the analysis of riparin I in biological
matrices described in the literature. Therefore, the present work describes the
development, extraction and validation of a bioanalytical method for its quantification
in blood of Wistar rats, using HPLC with UV detection. The study was approved by
the Ethics Committee for Animal Research (CEPA / UFPB). The purity of riparin I was
evaluated by chromatographic and spectroscopic methods. The chromatographic
method developed used a reversed phase column C-18 (250 x 4.6 mm x 5 µm) and
as mobile phase a mixture of water and methanol (35:65 | H
2
O: MeOH) at a flow rate
of 1 mL/min. The study of stability in solution showed that riparin I was stable after
storage at -20 ºC and cycles of freezing and thawing of 24 hours for 30 days. The
method of liquid-liquid extraction evaluated the recovery of riparin I in blood of male
and females rats, using different solvents and centrifugation conditions. Only the
variables “type of blood” in relation to sex and “solvent” significantly different when
compared within their groups. The riparin I had a greater recovery in blood of male
rats (94.50%) using acetonitrile at 12.000 x g for 20 minutes. The matrix effect is
defined as the set of some undesirable effects that originate from a biological matrix.
Coeluting compounds originating from the matrix can cause signal enhancement or
suppression. Absolute matrix effect was assessed by comparing the mean area
response of standard solutions with mean area of samples spiked after extraction
from the matrix. A value of 100% indicates that there is no absolute matrix effect and
can be observed that there was no matrix effect in blood (100.64%). The evaluation
of the efficiency of the extraction process was determined by the ratio of the matrix
effect and recovery over the extraction method, and observed a value of 106.89%,
demonstrating the effectiveness of the extraction process. The method using
detection in the UV was developed and validated as directed by the Brazilian
regulatory authority (RE 899/2003/ANVISA) and proved to be selective in the
different types of blood, linear in the concentration range used (0.2-7.0 µg/mL),
precise (CV ≤ 15%), accurate (100-110%), with high recovery (94.69 ± 4.81) and
rugged and can be used for quantitative determination of riparin I in blood in
pharmacokinetic studies.
Keywords: Aniba riparia (Nees) Mez. Riparin I. Liquid-liquid extraction. Bioanalysis.
Blood. Validation. HPLC-UV.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Distribuição geográfica da família Lauraceae no mundo...................
29
Figura 2.
Distribuição geográfica do gênero Aniba no mundo..........................
30
Figura 3.
Distribuição geográfica da espécie Aniba riparina (Nees) Mez no
mundo................................................................................................
30
Figura 4.
Alguns constituintes químicos isolados de Aniba riparina (Nees)
Mez.....................................................................................................
32
Figura 5.
Riparinas isoladas de Aniba riparina (Nees) Mez..............................
34
Figura 6.
Cromatograma em 225 nm por sistema gradiente de solventes (5 a
95% de MeCN em 30 minutos) da riparina I em CLAE-DAD na
concentração de 20 μg/mL em (50:50 | H
2
O:MeCN)..........................
44
Figura 7.
Cromatograma “Contour” da riparina I por sistema gradiente de
solventes (5 a 95% de MeCN em 30 minutos) em CLAE-DAD na
concentração de 20 μg/mL em (50:50 | H
2
O:MeCN)..........................
44
Figura 8.
Perfil de pureza do pico cromatográfico da riparina I na
concentração de 20 μg/mL mostrando uma pureza de 99,19%.........
45
Figura 9.
Espectro na região de UV/Vis (detector de arranjo de diodos) de
190 a 800 nm da riparina I na concentração de 20 μg/mL.................
45
Figura 10.
Estrutura química da riparina I mostrando o núcleo N-benzoilamida
(em verde) e o radical 4’-metoxifeniletil (em azul)..............................
46
Figura 11.
Espectro de Infravermelho (KBr, cm
-1
) da riparina I...........................
47
Figura 12.
Espectro de RMN
1
H (CDCl
3
, 500 MHz) da riparina I.........................
48
Figura 13.
Expansão do espectro de RMN
1
H (CDCl
3
, 500 MHz) da riparina I
na região de 6,0 – 7,7 ppm.................................................................
48
Figura 14.
Expansão do espectro de RMN
1
H (CDCl
3
, 500 MHz) da riparina I
na região de 2,7 – 3,8 ppm................................................................
49
Figura 15.
Espectro de RMN
13
C-APT (CDCl
3
, 125 MHz) da riparina I...............
49
Figura 16.
Espectro de massas de alta resolução da riparina I...........................
52
Figura 17.
Espectros de fragmentação do íon m/z 256 com diferentes
energias de colisão.............................................................................
53
Figura 18.
Proposta de fragmentação da riparina I baseada nos espectros de
massas de alta resolução no modo de ionização positivo.................
54
Figura 19.
Processo de separação cromatográfica.............................................
56
Figura 20.
Esquema de um cromatógrafo líquido de alta eficiência....................
58
Figura 21.
N-(3,4-dimetoxifeniletil) benzamida....................................................
60
Figura 22.
Cromatogramas da riparina I (A), PI (B) e da riparina I + PI (C) em
sistema de eluição gradiente (5 a 95% de MeOH durante 30 min) a
225 nm................................................................................................
64
Figura 23.
Cromatogramas da riparina I (A), PI (B) e da riparina I + PI (C) em
sistema de eluição isocrática (10:90 | H
2
O:MeOH) a 225 nm............
65
Figura 24.
Cromatogramas da riparina I (A), PI (B) e da riparina I + PI (C) em
sistema de eluição isocrática (30:70 | H
2
O:MeOH) a 225 nm............
66
Figura 25.
Cromatogramas da riparina I (A), PI (B) e da riparina I + PI (C) em
sistema de eluição isocrática (50:50 | H
2
O:MeOH) a 225 nm............
67
Figura 26.
Cromatogramas da riparina I (A), PI (B) e da riparina I + PI (C) em
sistema de eluição isocrática (35:65 | H
2
O:MeOH) a 225 nm............
68
Figura 27.
Curva de calibração da riparina I no intervalo de concentração de
20 a 160 μg/mL para o estudo de estabilidade no 1º e 30º dia..........
76
Figura 28.
Cromatogramas do estudo de estabilidade da riparina I a
100 μg/mL em solução: (A) amostra no 1º dia de estudo antes de
ser armazenada a -20 ºC, (B) amostra que permaneceu a -20 ºC
durante 30 dias, (C) amostra no 1º dia antes de ser submetida ao
ciclo de congelamento/descongelamento de 24 horas e (D)
amostra que passou pelo ciclo congelamento/descongelamento de
24 horas durante 30 dias....................................................................
77
Figura 29.
Monitoramento da temperatura ambiente (A) e da temperatura do
freezer (B) durante o período de 30 dias do estudo de
estabilidade.........................................................................................
78
Figura 30.
Monitoramento da umidade relativa durante o período de 30 dias
do estudo de estabilidade...................................................................
79
Figura 31.
Procedimento de extração por precipitação.......................................
84
Figura 32.
Procedimento de extração líquido-líquido..........................................
85
Figura 33.
Procedimento de “clean-up” e extração em fase sólida.....................
86
Figura 34.
Processo de extração líquido-líquido das riparinas I e III em
solução e em sangue de ratos e ratas...............................................
93
Figura 35.
Cromatogramas da riparina I (A), riparina III (B) e riparinas I e III (C)
em sistema de eluição isocrática (10:90 | H
2
O:MeCN) a 225 nm......
96
Figura 36.
Cromatogramas da riparina I (A), riparina III (B) e riparinas I e III (C)
em sistema de eluição isocrática (30:70 | H
2
O:MeCN) a 225 nm......
97
Figura 37.
Cromatogramas da riparina I (A), riparina III (B) e riparinas I e III (C)
em sistema de eluição isocrática (50:50 | H
2
O:MeCN) a 225 nm......
98
Figura 38.
Cromatogramas a 225 nm da amostra de sangue de ratos isenta
de riparinas (amostra-branco) (A) e da amostra de sangue de ratos
a 100 µg/mL das riparinas I e III centrifugada a 12.000 x g durante
20 minutos..........................................................................................
111
Figura 39.
Cromatogramas a 225 nm da amostra em solução a 100 µg/mL das
riparinas I e III centrifugada a 12.000 x g durante 20 minutos (C) e
da amostra em solução a 100 μg/mL das riparinas I e III que não
passou pelo processo de extração (D)...............................................
112
Figura 40.
Cromatogramas a 225 nm das amostras de sangue-branco:
sangue normal (A), sangue lipêmico (B) e sangue hemolisado (C)...
129
Figura 41.
Cromatogramas da amostra de riparina I (2 µg/mL) + PI (15 µg/mL)
em sangue normal (A e B) e perfil de pureza do pico
cromatográfico da riparina I mostrando uma pureza de 99,99% (C)..
130
Figura 42.
Cromatogramas da amostra de riparina I (2 µg/mL) + PI (15 µg/mL)
em sangue lipêmico (A e B) e perfil de pureza do pico
cromatográfico da riparina I mostrando uma pureza de 100% (C).....
131
Figura 43.
Cromatogramas da amostra de riparina I (2 µg/mL) + PI (15 µg/mL)
em sangue hemolisado (A e B) e perfil de pureza do pico
cromatográfico da riparina I mostrando uma pureza de 100% (C).....
132
Figura 44.
Regressão linear da curva de calibração em sangue da riparina I
no intervalo de concentração de 0,2 – 7 μg/mL para os três dias de
análise na linearidade.........................................................................
134
Figura 45.
Cromatogramas da riparina I a 225 nm em sangue: amostra-branco
(A), amostra-zero (padrão interno a 15 μg/mL) (B) e amostra
contendo a riparina I (4 μg/mL) e o padrão interno (15 μg/mL) (C)....
135
Figura 46.
Cromatogramas do estudo de precisão/exatidão da riparina I a
225 nm em sangue nas concentrações: baixa (0,5 μg/mL) (A),
média (2 μg/mL) (B) e alta (7 μg/mL) (C)...........................................
138
Figura 47.
Regressão linear da curva de calibração em solução da riparina I
no intervalo de concentração de 0,2 – 7 μg/mL para os três dias de
análise na recuperação......................................................................
141
Figura 48.
Cromatogramas do estudo de robustez da riparina I (2 μg/mL) a
225 nm em sangue para a variável % MeOH: 60% MeOH (A), 65%
MeOH (B) e 70% MeOH (C)...............................................................
144
Figura 49.
Cromatogramas do estudo de robustez da riparina I (2 μg/mL) a
225 nm em sangue para a variável fluxo: 0,8 mL/min (A), 1 mL/min
(B) e 1,2 mL/min (C)...........................................................................
145
Figura 50.
Cromatogramas do estudo de robustez da riparina I (2 μg/mL) a
225 nm em sangue para a variável temperatura: 24 ºC (A), 27 ºC
(B) e 30 ºC (C)....................................................................................
146
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1.
Recuperação média da riparina I em amostras de solução e
sangue de ratos (SRO e SGRO, barras em azul) e ratas (SRA e
SGRA, barras em vermelho) que passaram pelo processo de
extração. ANOVA “one-way” seguido de Bonferroni, ** p < 0,01;
*** p < 0,001....................................................................................
101
Gráfico 2.
Recuperação média da riparina I em amostras de solução (SOH
e SCN) e sangue (SGOH e SGCN) de ratos (A) e ratas (B), em
relação tipo de solvente orgânico precipitante (metanol/
acetonitrila). ANOVA “one-way” seguido de Bonferroni,
** p < 0,01; *** p < 0,001 ................................................................
103
Gráfico 3.
Recuperação média da riparina I em amostras de solução (S10K,
S12K e S14K) e sangue (SG10K, SG12K e SG14K) de ratos (A)
e ratas (B) em relação à aceleração centrífuga. ANOVA “one-
way” seguido de Bonferroni, *
p < 0,05; ***
p < 0,001.....................
105
Gráfico 4.
Recuperação média da riparina I em amostras de solução
(S10M, S15M e S20M) e sangue (SG10M, SG15M e SG20M) de
ratos (A) e ratas (B) em relação ao tempo de centrifugação.
ANOVA “one-way” seguido de Bonferroni, *
p < 0,05; ** p < 0,01;
***
p < 0,001....................................................................................
107
Gráfico 5.
Recuperação média da riparina I em amostras de sangue de
ratos utilizando acetonitrila como solvente orgânico para
precipitação de proteínas e centrifugadas a diferentes
acelerações de rotação (10.000 x g em barras azuis, 12.000 x g
em barras vermelhas e 14.000 x g em barras verdes) em
diferentes tempos (10, 15 e 20 minutos). ANOVA “one-way”
seguido de Bonferroni.....................................................................
108
Gráfico 6.
Recuperação média da riparina I em amostras de sangue de
ratos (SGCN-12K-20min) e em solução (SCN-12K-20min) que
passaram pelo processo de extração a 12.000 x g durante 20
minutos e solução-controle (CQ, barra em branco), para
observação do efeito de matriz e da eficiência do método de
extração. ANOVA “one-way” seguido de Bonferroni......................
109
LISTA DE QUADROS
Quadro 1.
Programação da eluição por sistema gradiente de solventes........
61
Quadro 2.
Condições cromatográficas desenvolvidas para quantificação da
riparina I com detecção por ultravioleta..........................................
69
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Valores do ponto de fusão da riparina I..........................................
43
Tabela 2.
Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e
13
C (125 MHz) da riparina I
em CDCl
3
e comparação com os dados de RMN de
1
H (400
MHz) e
13
C (100 MHz) da literatura.................................................
50
Tabela 3.
Amostras da riparina I a 100 μg/mL que foram submetidas ao
estudo de estabilidade em solução durante 30 dias.......................
75
Tabela 4.
Valores de recuperação média, desvio padrão e coeficiente de
variação da riparina I em amostras de solução e sangue de ratos
e ratas que passaram pelo processo de extração e solução-
controle...........................................................................................
101
Tabela 5.
Valores de recuperação média, desvio padrão e coeficiente de
variação da riparina I em amostras de solução e sangue de ratos
e ratas, utilizando metanol/acetonitrila como solvente orgânico
para precipitação de proteínas, e solução-controle........................
103
Tabela 6.
Comparação dos valores de recuperação média, desvio padrão e
coeficiente de variação da riparina I entre as amostras de sangue
de ratos centrifugadas a 10.000 x g durante 15 minutos e
12.000 x g durante 20 minutos, ambas utilizando acetonitrila
como solvente orgânico para precipitação de
proteínas.........................................................................................
109
Tabela 7.
Parâmetros de linearidade obtidos durante a validação do
método bioanalítico.........................................................................
133
Tabela 8.
Valores de precisão e exatidão intra-ensaio no 1º dia de análise
para as concentrações 0,5, 2 e 7 µg/mL da riparina I em sangue
(n = 5)*............................................................................................
136
Tabela 9.
Valores de precisão e exatidão intra-ensaio no 2º dia de análise
para as concentrações 0,5, 2 e 7 µg/mL da riparina I em sangue
(n = 5)*............................................................................................
136
Tabela 10.
Valores de precisão e exatidão intra-ensaio no 3º dia de análise
para as concentrações 0,5, 2 e 7 µg/mL da riparina I em sangue
(n = 5)*............................................................................................
137
Tabela 11.
Valores de precisão e exatidão inter-ensaio nos três dias de
análise para as concentrações 0,5, 2 e 7 μg/mL da riparina I em
sangue (n = 3)*................................................................................
137
Tabela 12.
Valores de recuperação durante o 1º dia de análise para as
concentrações 0,5, 2 e 7 μg/mL da riparina I em amostras de
sangue e solução que passaram pelo processo de extração e
solução-controle (n = 3)..................................................................
139
Tabela 13.
Valores de recuperação durante o 2º dia de análise para as
concentrações 0,5, 2 e 7 μg/mL da riparina I em amostras de
sangue e solução que passaram pelo processo de extração e
solução-controle (n = 3)..................................................................
140
Tabela 14.
Valores de recuperação durante o 3º dia de análise para as
concentrações 0,5, 2 e 7 μg/mL da riparina I em amostras de
sangue e solução que passaram pelo processo de extração e
solução-controle (n = 3)..................................................................
140
Tabela 15.
Valores do tempo de retenção da riparina I para as variáveis
analisadas (% MeOH, fluxo e temperatura) no estudo de
robustez do método bioanalítico.....................................................
143
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AREAP
Área do pico
ASSM
Assimetria
CEPA
Comitê de Ética em Pesquisa Animal
CG-EM
Cromatografia gasosa acoplada ao detector de espectrometria de
massas
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE-DAD
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de arranjo de
diodos
CLAE-FLU
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de
fluorescência
CLAE-UV/Vis
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de ultravioleta
na faixa do visível
CLAE-EM-EM
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao detector de
espectrometria de massas
CMD
Concentração média determinada
CQ
Solução-controle da riparina I que não passou pelo processo de
extração
CV
Coeficiente de variação
d
Dupleto
dd
Duplo dupleto
DP
Desvio padrão
DP
a
Desvio padrão do intercepto com o eixo dos Y
DPR
Desvio padrão relativo
EDTA
Ácido etileno-diaminotetracético
EFS
Extração em fase sólida
ELL
Extração líquido-líquido
EM
Efeito de Matriz
EM
Espectrometria de massas
EPP
Extração por precipitação
EP
Eficiência do Processo
e.p.m.
Erro padrão da média
ESI
Ionização por electrospray
FDA
Food and Drug Administration
g
Aceleração centrífuga
HPLC
High performance liquid chromatography
IC
Inclinação da curva de calibração
IV
Infravermelho
J
Constante de acoplamento
LD
Limite de detecção
LQ
Limite de quantificação
m
Multipleto
MHz
Megahertz
m/z
Razão massa/carga
n
Número de experimentos realizados
NA-TFA
Ácido trifluoroacético com sódio
nm
Nanômetro
OMS
Organização Mundial de Saúde
PI
Padrão interno
ppm
Partes por milhão
q
Quadrupleto
r
2
Coeficiente de correlação linear
R
Recuperação
RE
Recuperação em relação ao processo de extração
Rip-I
Riparina I
Rip-III
Riparina III
RMN
13
C
Ressonância Magnética Nuclear de Carbono treze
RMN
1
H
Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
R
s
Resolução
s
Simpleto
SCN
Solução de riparina I que passou pelo processo de extração
utilizando acetonitrila como solvente orgânico
sl
Simpleto largo
SCN-12K-
20min
Solução de riparina I que passou pelo processo de extração
utilizando a acetonitrila como solvente e centrifugada a 12.000 x g
durante 20 minutos
SOH
Solução de riparina I que passou pelo processo de extração
utilizando metanol como solvente orgânico
SRO/ SRA
Solução de riparina I que passou pelo processo de extração
S10K
Solução de riparina I centrifugada a 10.000 x g que passou pelo
processo de extração
S12K
Solução de riparina I centrifugada a 12.000 x g que passou pelo
processo de extração
S14K
Solução de riparina I centrifugada a 14.000 x g que passou pelo
processo de extração
S10M
Solução de riparina I centrifugada durante 10 minutos e que passou
pelo processo de extração
S15M
Solução de riparina I centrifugada durante 15 minutos e que passou
pelo processo de extração
S20M
Solução de riparina I centrifugada durante 20 minutos e que passou
pelo processo de extração
SGCN
Sangue de ratos/ratas contaminado com a riparina I que passou
pelo processo de extração utilizando acetonitrila como solvente
orgânico
SGCN-10K-
15min
Sangue de ratos contaminado com a riparina I que passou pelo
processo de extração utilizando a acetonitrila como solvente
precipitante e centrifugado a 10.000 x g durante 15 minutos
SGCN-12K-
20min
Sangue de ratos contaminado com a riparina I que passou pelo
processo de extração utilizando a acetonitrila como solvente
precipitante e centrifugado a 12.000 x g durante 20 minutos
SGOH
Sangue de ratos/ratas contaminado com a riparina I que passou
pelo processo de extração utilizando metanol como solvente
orgânico
SGRA
Sangue de ratas contaminado com a riparina I que passou pelo
processo de extração
SGRO
Sangue de ratos contaminado com a riparina I que passou pelo
processo de extração
SG10K
Sangue de ratos/ratas contaminado com a riparina I centrifugado a
10.000 x g que passou pelo processo de extração
SG12K
Sangue de ratos/ratas contaminado com a riparina I centrifugado a
12.000 x g que passou pelo processo de extração
SG14K
Sangue de ratos/ratas contaminado com a riparina I centrifugado a
14.000 x g que passou pelo processo de extração
SG10M
Sangue de ratos/ratas contaminado com a riparina I centrifugado
durante 10 minutos e que passou pelo processo de extração
SG15M
Sangue de ratos/ratas contaminado com a riparina I centrifugado
durante 15 minutos e que passou pelo processo de extração
SG20M
Sangue de ratos/ratas contaminado com a riparina I centrifugado
durante 20 minutos e que passou pelo processo de extração
T
Temperatura
t
Tripleto
TOF
Analisador de massas por tempo de vôo
T
r
Tempo de retenção
USP
United States Pharmacopeia
UV
Ultravioleta
δ
Deslocamento químico em ppm
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO................................................................................
23
2
OBJETIVOS ...................................................................................
25
2.1
OBJETIVO GERAL..........................................................................
25
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS...........................................................
25
CAPÍTULO I – Riparina I
I.1
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA......................................................
27
I.1.1
A FAMÍLIA LAURACEAE................................................................
28
I.1.2
ANIBA RIPARIA (NEES) MEZ.........................................................
30
I.1.3
ALCAMIDAS....................................................................................
32
I.1.4
RIPARINA I......................................................................................
34
CAPÍTULO II – Determinação da pureza da riparina I
II.1
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA......................................................
37
II.2
MATERIAL E MÉTODOS...............................................................
39
II.2.1
MATERIAL.......................................................................................
39
II.2.1.1
Padrões e reagentes.....................................................................
39
II.2.1.2
Equipamentos................................................................................
39
II.2.1.2.1
Ponto de fusão................................................................................
39
II.2.1.2.2
Cromatografia líquida de alta eficiência..........................................
39
II.2.1.2.3
Infravermelho...................................................................................
40
II.2.1.2.4
Ressonância magnética nuclear de
1
H e
13
C..................................
40
II.2.1.2.5
Espectrometria de massas .............................................................
40
II.2.2
MÉTODOS......................................................................................
40
II.2.2.1
Ponto de fusão...............................................................................
40
II.2.2.2
Cromatografia líquida de alta eficiência......................................
41
II.2.2.3
Ressonância magnética nuclear de
1
H e
13
C..............................
41
II.2.2.4
Espectrometria de massas...........................................................
42
II.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................
43
II.3.1
PONTO DE FUSÃO........................................................................
43
II.3.2
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA....................
43
II.3.3
CONFIRMAÇÃO ESTRUTURAL DA RIPARINA I...........................
46
II.3.4
ESPECTROMETRIA DE MASSAS.................................................
51
CAPÍTULO III – Desenvolvimento do método cromatográfico
III.1
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA......................................................
56
III.1.1
PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA.............................................
56
III.1.2
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA....................
57
III.1.3
DESENVOLVIMENTO CROMATOGRÁFICO EM CLAE................
58
III.2
MATERIAL E MÉTODOS...............................................................
60
III.2.1
MATERIAL.......................................................................................
60
III.2.1.1
Padrões e reagentes.....................................................................
60
III.2.1.2
Parâmetros cromatográficos........................................................
60
III.2.2
MÉTODOS......................................................................................
61
III.2.2.1
Preparação das soluções-estoque e de trabalho da riparina I
e do padrão interno.......................................................................
61
III.2.2.2
Desenvolvimento do método cromatográfico............................
61
III.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................
63
CAPÍTULO IV – Estudo de estabilidade em solução da
riparina I
IV.1
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA......................................................
71
IV.2
MATERIAL E MÉTODOS...............................................................
73
IV.2.1
MATERIAL.......................................................................................
73
IV.2.1.1
Padrões e reagentes.....................................................................
73
IV.2.1.2
Equipamentos................................................................................
73
IV.2.2
MÉTODOS......................................................................................
73
IV.2.2.1
Preparação da solução da riparina I a 100 µg/mL......................
73
IV.2.2.2
Parâmetros cromatográficos........................................................
74
IV.2.2.3
Procedimento do estudo de estabilidade...................................
74
IV.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................
75
CAPÍTULO V – Desenvolvimento do método de extração em
sangue de ratos e ratas Wistar
V.1
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA......................................................
81
V.1.1
MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS EM
FLUIDOS BIOLÓGICOS.................................................................
81
V.1.2
MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E “CLEAN-UP” DE AMOSTRAS.......
82
V.1.2.1
Extração por precipitação (EPP)..................................................
82
V.1.2.2
Extração líquido-líquido (ELL).....................................................
84
V.1.2.3
Extração em fase sólida (EFS).....................................................
86
V.1.3
EFEITO DE MATRIZ.......................................................................
87
V.1.4
RECUPERAÇÃO.............................................................................
87
V.2
MATERIAL E MÉTODOS...............................................................
89
V.2.1
MATERIAL.......................................................................................
89
V.2.1.1
Padrões e reagentes.....................................................................
89
V.2.1.2
Equipamentos................................................................................
89
V.2.2
MÉTODOS......................................................................................
89
V.2.2.1
Preparação das soluções-estoque e de trabalho das
riparinas I e III................................................................................
89
V.2.2.2
Desenvolvimento de método cromatográfico para as
riparinas I e III................................................................................
90
V.2.2.3
Extração em sangue de ratos e ratas Wistar..............................
90
V.2.2.3.1
Obtenção do sangue.......................................................................
90
V.2.2.3.2
Curva de calibração padrão............................................................
91
V.2.2.3.3
Metodologia de extração líquido-líquido das riparinas I e III em
sangue.............................................................................................
91
V.2.2.3.4
Avaliação do efeito de matriz (EM)..................................................
94
V.2.2.3.5
Recuperação em relação ao processo de extração (RE)................
94
V.2.2.3.6
Eficiência do processo (EP)............................................................
94
V.2.2.3.7
Análise estatística............................................................................
94
V.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................
95
V.3.1
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO CROMATOGRÁFICO
PARA AS RIPARINAS I E III...........................................................
95
V.3.2
EXTRAÇÃO E RECUPERAÇÃO DA RIPARINA I EM
SANGUE.........................................................................................
99
V.3.2.1
Efeito do sexo do animal na extração e recuperação da
riparina I.........................................................................................
100
V.3.2.2
Efeito do solvente orgânico na extração e recuperação da
riparina I.........................................................................................
101
V.3.2.3
Efeito da aceleração de rotação na extração e recuperação
da riparina I....................................................................................
104
V.3.2.4
Efeito do tempo de centrifugação na extração e recuperação
da riparina I....................................................................................
105
V.3.3
EFEITO DE MATRIZ.......................................................................
107
CAPÍTULO VI – Validação do método bioanalítico
VI.1
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA......................................................
114
VI.1.1
SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE................................................
114
VI.1.2
LINEARIDADE.................................................................................
115
VI.1.2.1
Padronização externa...................................................................
116
VI.1.2.2
Padronização interna....................................................................
117
VI.1.2.3
Padronização por adição de padrão............................................
117
VI.1.3
PRECISÃO E EXATIDÃO...............................................................
118
VI.1.3.1
Precisão..........................................................................................
118
VI.1.3.2
Exatidão..........................................................................................
119
VI.1.4
LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO..............................
120
VI.1.5
RECUPERAÇÃO.............................................................................
120
VI.1.6
ROBUSTEZ.....................................................................................
121
VI.2
MATERIAL E MÉTODOS...............................................................
122
VI.2.1
MATERIAL.......................................................................................
122
VI.2.1.1
Padrões e reagentes.....................................................................
122
VI.2.1.2
Parâmetros cromatográficos........................................................
122
VI.2.2
MÉTODOS......................................................................................
123
VI.2.2.1
Preparação das soluções-estoque e soluções de trabalho......
123
VI.2.2.2
Procedimento de extração em sangue........................................
123
VI.2.2.3
Validação do método bioanalítico...............................................
124
VI.2.2.3.1
Seletividade.....................................................................................
124
VI.2.2.3.2
Linearidade......................................................................................
124
VI.2.2.3.3
Precisão/Exatidão............................................................................
125
VI.2.2.3.4
Recuperação...................................................................................
125
VI.2.2.3.5
Limites de detecção e quantificação...............................................
126
VI.2.2.3.6
Robustez.........................................................................................
127
VI.2.2.3.7
Análise estatística............................................................................
127
VI.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................
128
VI.3.1
SELETIVIDADE...............................................................................
128
VI.3.2
LINEARIDADE.................................................................................
133
VI.3.3
PRECISÃO/EXATIDÃO...................................................................
136
VI.3.4
RECUPERAÇÃO.............................................................................
139
VI.3.5
LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO..............................
142
VI.3.6
ROBUSTEZ.....................................................................................
142
CAPÍTULO VII – Conclusão
VII.1
CONCLUSÃO.................................................................................
148
CAPÍTULO VIII – Referências
REFERÊNCIAS...............................................................................
150
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
23
1 INTRODUÇÃO
Amenizar o sofrimento e tentar curar doenças pela ingestão de ervas e
folhas, possivelmente foi uma das primeiras formas de utilização dos produtos
naturais (VIEGAS-JUNIOR; BOLZANI, 2006). As plantas medicinais têm sido
utilizadas sob os critérios dos conhecimentos populares e científicos em diferentes
contextos terapêuticos (CECHINEL-FILHO; YUNES, 1998). Porém, a humanidade se
aproveita de uma fração muito pequena das plantas e o reino vegetal ainda
permanece como uma grande incógnita.
No início da década de 1990, a Organização Mundial de Saúde (OMS)
divulgou que 65-80% da população dos países em desenvolvimento dependiam das
plantas medicinais como única forma de acesso aos cuidados básicos de saúde
(CALIXTO, 2000).
No Brasil, as pesquisas de descoberta de protótipos de fármacos e/ou
fitofármacos, além de propiciarem o avanço da pesquisa básica multidisciplinar,
podem contribuir também para o desenvolvimento tecnológico nacional, levando em
conta que a diversidade dos inúmeros biomas brasileiros é ainda muito pouco
explorada como uma fonte de substâncias de interesse farmacológico (BARREIRO;
BOLZANI, 2009).
Embora existam, nos dias atuais, diversas estratégias e metodologias
disponíveis para que se possa sintetizar e descobrir novos fármacos, a química de
produtos naturais continua exercendo seu fascínio na produção de fármacos
inovadores, sendo uma alternativa de sucesso historicamente privilegiada
(BARREIRO; MANSSOUR, 2008; MANN, 1992).
Atualmente, há grande interesse no desenvolvimento de métodos analíticos
rápidos que forneçam parâmetros apropriados para análises quantitativas de
fármacos em produtos farmacêuticos, estudos de dissolução e matriz biológica
(RUELA; ARAÚJO; PEREIRA, 2009).
O desenvolvimento de métodos bioanalíticos envolve a avaliação e a
otimização de condições, incluindo etapas de preparação da amostra, separação
cromatográfica, detecção e a medição quantitativa dos analitos em uma matriz
biológica, como sangue, plasma, soro e urina.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
24
Desde o início de sua aplicação, há várias décadas, as técnicas
cromatográficas têm desempenhado um importante papel na determinação
quantitativa de fármacos e seus metabólitos em amostras biológicas (VAN DE
MERBEL, 2008).
A cromatografia líquida com detecção no ultravioleta tem sido empregada
devido à resolução, precisão e exatidão significativas, constituindo-se uma técnica
de identificação e caracterização de componentes em misturas complexas de
amostras (KORFMACHER, 2005; NIESSEN, 2003).
Para garantir que um método analítico seja confiável e reprodutível para a
finalidade pretendida, este deve ser submetido a uma avaliação denominada
validação. A validação de métodos para quantificação de fármacos é normatizada
pela Resolução RE nº 899 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA),
publicada no Diário Oficial da União em 29 de maio de 2003, que determina a
publicação do “Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos” (BRASIL,
2003).
A validação de métodos bioanalíticos, empregada para a determinação de
drogas e seus metabólitos em fluidos biológicos, desempenha um importante papel
na avaliação da biodisponibilidade, bioequivalência, farmacocinética e estudos
toxicocinéticos (SHAH, 2007).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
25
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver e validar um método bioanalítico de extração e determinação
do éster metílico de N-benzoil-tiramina (Riparina I) em sangue de ratos Wistar
utilizando a extração líquido-líquido e a cromatografia líquida de alta eficiência
acoplada a um detector de UV/Vis.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Verificar a pureza da riparina I por meio de métodos espectroscópicos e
análise do perfil cromatográfico em detector de arranjo de diodos;
b) Desenvolver um método analítico para análise da riparina I em solução;
c) Realizar estudo de estabilidade da riparina I em solução;
d) Desenvolver um método de extração líquido-líquido da riparina I em
sangue de ratos e ratas Wistar;
e) Desenvolver e validar um método para quantificação da riparina I em
sangue de ratos aplicando a CLAE-UV/Vis.
CAPÍTULO I
Riparina I
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
27
I.1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Pouco mais de 200 anos atrás, o farmacêutico alemão Friedrich Sertürner,
isolou o primeiro composto puro farmacologicamente ativo de uma planta: a morfina
do ópio produzido pelos frutos da papoula, Papaver somniferum (HAMILTON;
BASKETT, 2000). Isto iniciou uma era em que as drogas a partir de plantas podiam
ser purificadas, estudadas e administradas em doses precisas que não variavam
com a fonte ou idade do material (HARVEY, 2008; LI; VEDERAS, 2009).
A investigação farmacêutica se expandiu após a Segunda Guerra Mundial
com uma maciça seleção de microrganismos para novos antibióticos, devido à
descoberta da penicilina. Em 1990, cerca de 80% dos medicamentos eram produtos
naturais ou análogos inspirados neles. Antibióticos (penicilina, tetraciclina,
eritromicina), antiparasitários (avermectinas), antimaláricos (quinina, artemisina),
agentes de controle de lipídios (lovastatina e análogos), imunossupressores para
transplante de órgãos (ciclosporinas) e drogas anticâncer (taxol, doxorubicina)
revolucionaram a medicina (HARVEY, 2008; LI; VEDERAS, 2009).
A expectativa de vida em grande parte do mundo aumentou em cerca de 40
anos no século XX para mais de 77 anos atualmente. Embora a expansão da
química medicinal sintética na década de 1990 tenha causado um aumento nos
estudos de novos medicamentos à base de produtos naturais para
aproximadamente 50% do que se tinha em décadas anteriores, apenas 13
medicamentos derivados de produtos naturais foram aprovados nos Estados Unidos
entre 2005 e 2007 (HARVEY, 2008; LI; VEDERAS, 2009).
Os produtos naturais têm inspirado um grande desenvolvimento na química
orgânica (NEWMAN, 2008; WILSON; DANISHEFSKY, 2006), levando a avanços nas
metodologias sintéticas e possibilidades de análogos do composto original com
melhoria nas propriedades farmacológicas (SUNAZUKA; HIROSE; OMURA, 2008).
A síntese química de produtos naturais é possível e comercialmente viável,
especialmente para aqueles com estruturas químicas relativamente simples, tais
como a aspirina e a efedrina (KOLEWE; GAURAV; ROBERTS, 2008). A metodologia
utilizada na síntese de fármacos precisa ser capaz de viabilizar o acesso, com maior
rendimento químico possível e na escala adequada de menor custo, a compostos
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
28
farmacoterapeuticamente ativos, de elevado grau de pureza, passíveis de serem
empregados, com segurança, na posologia prescrita, como medicamentos
(BARREIRO, 1991).
Muitos metabólitos secundários se notabilizaram como matérias-primas
valiosas para a produção de inúmeros medicamentos contemporâneos,
comprovando que a parceria entre químicos medicinais e químicos de produtos
naturais é estratégica para a descoberta de fármacos inovadores (BARREIRO;
BOLZANI, 2009). Nesse contexto, pode-se inserir a riparina I, uma alcamida isolada
da espécie Aniba riparina (Nees) Mez (Lauraceae) típica da região Amazônica, e
que foi posteriormente sintetizada no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica.
I.1.1 A FAMÍLIA LAURACEAE
A família Lauraceae foi estabelecida por Jussieu em 1789 e o conhecimento
de suas espécies vem desde os primórdios da civilização, quando as folhas de louro
(Laurus nobilis) eram usadas como grinaldas pelos antigos gregos e romanos que
coroavam os guerreiros e atletas (GOTTLIEB, 1972).
As plantas da família Lauraceae têm distribuição pantropical (Figura 1, p.
29), sendo bem representadas na América, Ásia tropical, Austrália, Madagascar, e
pouco expressivas no sul da África, possuindo cerca de 50 gêneros e 2.500
espécies (ROHWER, 1986). No Brasil ocorrem 22 gêneros e cerca de 390 espécies,
que habitam, em sua maior parte, as florestas pluviais, bem como as restingas e os
cerrados, estando presentes, ainda, em outros ecossistemas (BARROSO et al.,
2002).
A família Lauraceae destaca-se entre as demais famílias pela sua
importância econômica mundial, devido ao fornecimento de madeira valiosa, óleos
essenciais e importantes substâncias que são amplamente empregadas nas
indústrias farmacêuticas de cosméticos, na culinária, na fabricação de papel, na
marcenaria e construção civil e na medicina popular (MARQUES, 2001).
As espécies produtoras de óleos essenciais estão compreendidas
principalmente entre os gêneros Aniba, Nectandra, Ocotea, Licaria e Dicypellium. Na
região Amazônica, esses gêneros são conhecidos popularmente como “pau-rosa” e
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
29
“louros” e o elevado potencial da flora odorífera da Amazônia apresenta-se como a
fonte renovável mais apropriada para a produção de essências aromáticas (SILVA et
al., 2009).
Figura 1. Distribuição geográfica da família Lauraceae no mundo
Fonte: http://www.mobot.org/MOBOT/research/APW
Somando-se à importância econômica de muitas de suas espécies, as
Lauráceas neotropicais, incluindo as brasileiras, são também ecologicamente
importantes, funcional e estruturalmente (MORAES, 2005). Várias espécies são
utilizadas na medicina popular para lesões cutâneas, distúrbios gástricos (COSMO
et al., 2007), problemas circulatórios e como anti-inflamatório em países do ocidente
e oriente (YU; LEE; JANG, 2007), com atividades ansiolítica (SOUSA et al., 2008),
antifúngica (FENNER et al., 2006) e hipoglicemiante (BARBOSA-FILHO et al., 2005).
Dentre as espécies medicinais, merecem destaque as pertencentes ao
gênero Aniba, as quais se destacam pelo alto valor econômico, devido à constituição
do óleo essencial, encontrado em grande quantidade principalmente no lenho e na
casca (MARQUES, 2001).
O gênero Aniba é composto por aproximadamente 41 espécies que se
distribuem na América Central, Antilhas e, principalmente, na América do Sul (Figura
2, p. 30). A maior concentração de espécies encontra-se na região das Guianas e na
Amazônia Central. No Brasil, o gênero é representado por cerca de 25 espécies,
dentre elas a Aniba riparia (Ness) Mez (QUINET; ANDREATA, 2002).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
30
Figura 2. Distribuição geográfica do gênero Aniba no mundo
Fonte: http://www.tropicos.org/SpecimenDistribution.aspx?nameid=42000016
I.1.2 ANIBA RIPARIA (NEES) MEZ
A espécie Aniba riparia (Nees) Mez é conhecida popularmente como “louro”,
“louro-faia” ou “pau-rosa” e tem como centro da sua diversidade a região Amazônica
e as Guianas, podendo estender-se para os Andes, as montanhas do norte da
Venezuela e leste e sul do Brasil (Figura 3, p. 30) (CASTELO-BRANCO et al., 2000).
Figura 3. Distribuição geográfica da espécie Aniba riparia (Nees) Mez no mundo
Fonte: http://www.tropicos.org/SpecimenDistribution.aspx?name420082
O óleo essencial de algumas partes de Aniba riparia foi obtido por
hidrodestilação e analisado por CG-EM, tendo como principais componentes
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
31
identificados no óleo das folhas, o β-cariofileno (16,9%), α-humuleno (14,9%) e
biciclogermacreno (14,1%) e nas cascas das raízes, benzoato de benzila (30,9%)
(LUZ et al., 2002).
Estudos fitoquímicos com as cascas do caule de Aniba riparia levaram ao
isolamento de alguns flavonoides, benzilbenzoatos e benzaldeidos (FERNANDES;
GOTTLIEB; XAVIER, 1978; FRANÇA et al., 1976).
Além disso, estudos realizados com os frutos verdes dessa planta levaram
ao isolamento de uma grande variedade de constituintes químicos, como
benzilbenzoatos, flavonoides, neolignanas, estirilpironas e alcaloides, do tipo
alcamidas (Figura 4, p. 32) (BARBOSA-FILHO et al., 1987). Esta última classe de
substâncias tem sido fonte de interesse de pesquisadores na busca de novas fontes
vegetais de princípios farmacologicamente ativos.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
32
benzilbenzoato
feniletilaminas do ácido benzoico
estiril-α-pirona
neolignanas
neolignanas
flavonoides
Figura 4. Alguns constituintes químicos isolados de Aniba riparia (Ness) Mez
Fonte: Barbosa-Filho et al., 1987
I.1.3 ALCAMIDAS
As alcamidas naturais constituem uma classe especial de alcaloides
contendo uma função amida restrita a poucos representantes na natureza
(BARBOSA-FILHO et al., 1987).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
33
As amidas como produtos naturais não são tão abundantes, compreendendo
um grupo de aproximadamente 70 estruturas conhecidas e distribuídas em todo o
reino vegetal (TORRES; CHAVEZ, 2001). Estes metabólitos têm sido relatados
presentes em pelo menos dez famílias de plantas, principalmente em Asteraceae,
Piperaceae e Rutaceae (MOLINA-TORRES et al., 2008).
Do ponto de vista biogênico, as alcamidas representam uma classe distinta
de produtos naturais que se formam ao serem conjugadas nas duas diferentes rotas
metabólicas, sendo, portanto, metabólitos secundários, cuja estrutura geral se
origina da união de um ácido graxo de cadeia mediana ou longa que pode ser de
oito a dezoito, geralmente de cadeia alifática ou linear, unida a uma amina
proveniente de alguns aminoácidos por descarboxilação no momento da
condensação (TORRES; CHAVEZ, 2001).
Dependendo do número de ligações duplas que apresentam, as alcamidas
foram divididas em dois grupos principais: alcamidas olefínicas, que possuem
somente ligações duplas, e alcamidas acetilênicas, com pelo menos uma ligação
tripla, e aquelas que apresentam anéis homo ou heterocíclicos que são observados
principalmente na família Piperaceae (TORRES; CHAVEZ, 2001).
As alcamidas alifáticas são as mais importantes para o metabolismo
secundário e as mais utilizadas pelo homem (TORRES; CHAVEZ, 2001). São
consideradas como constituintes bioativos em espécies utilizadas na medicina
tradicional de várias culturas ancestrais e têm demonstrado eficácia como
compostos medicinais e para o controle biológico, como anestésico local, inseticida,
vermífuga, fungicida e bactericida, sendo, portanto, um grupo de metabólitos de
grande interesse atualmente (MOLINA-TORRES et al., 2008).
Dos frutos verdes de Aniba riparia foram isoladas três alcamidas
denominadas riparinas em homenagem à planta (Figura 5, p. 34), sendo elas a
riparina I (éter metílico de N-benzoil tiramina), a riparina II (éter metílico de N-2-
hidroxibenzoil tiramina) e a riparina III (éter metílico de N-2,6-dihidroxibenzoil
tiramina) (BARBOSA-FILHO et al., 1987; BARBOSA-FILHO; YOSHIDA; GOTTLIEB,
1990; THOMAS et al., 1994). Posteriormente, essas alcamidas naturais foram
sintetizadas no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da
Paraíba (BARBOSA-FILHO; SILVA; BHATTACHARYYA, 1990).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
34
Riparina I
Riparina II
Riparina III
Figura 5. Riparinas isoladas de Aniba riparia (Ness) Mez
Fonte: Barbosa-Filho et al., 1987
I.1.4 RIPARINA I
Isolada do fruto verde de Aniba riparia, a riparina I é uma alcamida
caracterizada como uma feniletilamina do ácido benzoico, sendo formada pela união
da tiramina (uma feniletilamina) com o ácido benzoico. Apresenta uma metoxila no
anel da tiramina e ausência de substituições no anel do ácido benzoico.
O uso popular de Aniba riparia não é relatado na literatura, no entanto,
estudos farmacológicos recentes têm sido realizados com suas alcamidas naturais.
Foi demonstrado que a riparina I apresentou atividade antimicrobiana de
amplo espectro contra linhagens resistentes aos antibióticos de Staphylococcus
aureus e Escherichia coli (CATÃO et al., 2005).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
35
A riparina I foi capaz de induzir, de forma não específica e reversível, o
relaxamento das contrações produzidas por acetilcolina e histamina em íleo de
cobaia e por ocitonina e bradicinina em útero de rata virgem (CASTELO-BRANCO et
al., 2000).
A riparina I apresentou efeito hipotensor e bradicárdico, devido a uma ação
que parece envolver, principalmente, um componente de origem parassimpática em
nível cardíaco (SEIXAS, 1996).
Efeitos ansiolítico e antinociceptivo foram observados em camundongos,
quando a riparina I foi administrada nas doses de 25 e 50 mg/kg por via oral e
intraperitoneal (ARAÚJO et al., 2009; SOUSA et al., 2005).
Uma atividade anti-inflamatória foi observada pela administração
intraperitoneal da riparina I nas doses de 25 e 50 mg/kg (ARAÚJO et al., 2006). Uma
ação analgésica dessa alcamida também foi apresentada em camundongos nas
mesmas doses por via oral (ARAÚJO et al., 2006).
Em relação à citotoxicidade, a riparina I foi avaliada em fibroblastos L929 e
em macrófagos J774. A riparina I não promoveu perda da integridade da membrana
celular e da fragmentação do DNA, bem como não causou parada em nenhuma das
fases do ciclo celular, demonstrando, assim, que possui uma baixa toxicidade in vitro
(SILVEIRA, 2007).
Devido à ausência na literatura de estudos em matrizes biológicas da
riparina I, e de suas atividades farmacológicas bastante promissoras, procurou-se
avaliá-la em sangue de ratos, desenvolvendo as melhores condições
cromatográficas para sua extração e quantificação e, com isso, realizar estudos
farmacocinéticos posteriores.
CAPÍTULO II
Determinação da pureza da riparina I
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
37
II.1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A análise de fármacos e seus metabólitos em matrizes biológicas é realizada
utilizando amostras fortificadas com padrões de referência. O FDA (Food and Drug
Administration) recomenda que os padrões sejam de referência analítica, com
identificação e pureza conhecidas (CASSIANO et al., 2009; US-FDA, 2001).
Três tipos de padrões de referência são normalmente utilizados: padrões de
referência certificados (como por exemplo, padrão USP), padrões de referência
obtidos comercialmente e, outros materiais de pureza conhecida, como os obtidos
sinteticamente por laboratórios analíticos, desde que os materiais tenham sido
previamente caracterizados e identificados (CASSIANO et al., 2009; US-FDA, 2001).
O ponto de fusão é um valor constante, característico de uma substância
pura, sendo bastante influenciado pela presença de outras substâncias, e por isso a
sua determinação constitui um método indicativo do grau de pureza. É um parâmetro
físico-químico que quando bem definido com intervalo entre 1 - 2 ºC é considerado
indicativo de pureza de um composto.
Na cromatografia líquida de alta eficiência, o uso do detector de arranjo de
diodos é utilizado frequentemente para determinação da pureza do pico, pois
permite o registro do cromatograma com detecção em diferentes comprimentos de
onda simultaneamente durante a análise cromatográfica, fornecendo mais
informação sobre a composição da amostra do que é fornecido pelo comprimento de
onda fixo, além disso, adquire o espectro de ultravioleta de cada pico ao longo do
seu comprimento e, consequentemente, a sua pureza pode ser avaliada (SNYDER;
KIRKLAND; GLAJEH, 1997).
Deve-se ressaltar que o uso do detector de arranjo de diodos sozinho não
pode ser utilizado de forma conclusiva no estabelecimento de pureza de pico. A
análise do pico, seguida de outras técnicas analíticas qualitativas, como o
infravermellho, ressonância magnética nuclear e a espectrometria de massas são
geralmente utilizadas para aumentar a garantia da pureza do pico (SNYDER;
KIRKLAND; GLAJEH, 1997).
A espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IV) é uma técnica
analítica qualitativa que pode dar evidências para a presença de grupos funcionais
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
38
presentes na molécula. Essa técnica é empregada em laboratórios industriais de
controle de qualidade e laboratórios de pesquisa acadêmica, sendo bastante
empregada na identificação de um composto ou na investigação da composição de
uma amostra.
O IV, como todas as técnicas de espectroscopia, depende da interação das
moléculas ou átomos com a radiação eletromagnética. A radiação no IV faz com que
os átomos e grupos de átomos orgânicos vibrem com amplitude aumentada ao redor
das ligações covalentes que os ligam. Essa radiação não é suficiente para excitar os
elétrons, e a absorção da energia no IV para uma molécula ocorrerá de maneira
característica dos tipos de ligações e átomos presentes nos grupos funcionais
específicos da molécula (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007; PAVIA;
LAMPMAN; KRIZ, 2001).
Diferentemente do espectro de IV (que pode ser interpretado pela presença
ou ausência de grupos funcionais), na espectroscopia de ressonância magnética
nuclear (RMN) de
1
H e
13
C pode-se determinar o número, a natureza e o ambiente
dos hidrogênios e carbonos em uma molécula. A RMN encontra aplicação em várias
áreas da ciência, sendo uma das mais importantes, o estudo da estrutura química de
compostos orgânicos naturais, a partir do uso de técnicas uni ou bidimensionais.
A RMN depende das variações de energia quantificáveis que podem ser
induzidas nas moléculas através de irradiação eletromagnética, estando
relacionadas com as transições de radiofrequência entre estados quantizados de
energia dos núcleos orientados num campo magnético. A partir da radiofrequência e
intensidade de absorção, é possível detectar um núcleo e em cada caso o seu
ambiente químico (PAVIA; LAMPMAN; KRIZ, 2001).
A espectrometria de massas (EM) é uma técnica analítica utilizada para
obtenção do peso molecular e das características estruturais da amostra,
fornecendo informações necessárias para identificar compostos desconhecidos,
quantificar e elucidar misturas complexas. Na área da Farmácia encontra grande
aplicabilidade na elucidação da estrutura de novos fármacos, em estudos de
farmacocinética e metabolismo de drogas (KAZAKEVICH; LoBRUTTO, 2007).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
39
II.2 MATERIAL E MÉTODOS
II.2.1 MATERIAL
II.2.1.1 Padrões e reagentes
A riparina I foi sintetizada a partir do éter metílico da tiramina com o cloreto
de benzoíla e cedida pelo Dr. Stanley Juan Chávez da equipe do Prof. Dr. José
Maria Barbosa Filho do LTF-UFPB. Foram utilizadas água ultrapura tipo I (Elga
Labwater Purelab Option-Q), acetonitrila grau HPLC (TEDIA-USA) e clorofórmio
deuterado (CDCl
3
, Cambridge Isotope Laboratories).
II.2.1.2 Equipamentos
II.2.1.2.1 Ponto de fusão
O ponto de fusão da riparina I foi verificado em um medidor de ponto de
fusão (GEHAKA, modelo PF 1500).
II.2.1.2.2 Cromatografia líquida de alta eficiência
O espectro de UV/Vis da riparina I foi obtido utilizando um cromatógrafo
líquido marca SHIMADZU da série 10A vp, constituído de duas bombas LC-6AD,
detector de arranjo de diodos SPD-M10A vp, módulo controlador SCL-10A vp e
injetor manual provido com um loop de amostra de 20 µL (Rheodyne).
A análise cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna analítica C18
(ACE) com 250 mm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e 5 µm de
tamanho de partícula, e pré-coluna C18 (ACE) com 4,6 mm de diâmetro interno e
5 µm de tamanho de partícula.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
40
II.2.1.2.3 Infravermelho
O espectro na região do IV (4000 a 400 cm
-1
) foi obtido em aparelho de
BOMEM FT-IR (modelo MB 100), utilizando uma pequena quantidade de amostra
em pastilha de brometo de potássio (KBr), com frequência medida em cm
-1
.
II.2.1.2.4 Ressonância Magnética Nuclear de
1
H e
13
C
Os espectros de RMN de
1
H e
13
C foram obtidos em espectrômetro VARIAN-
NMR-SYSTEM 500 MHz do laboratório multiusuário de caracterização e análise da
UFPB.
II.2.1.2.5 Espectrometria de massas
O espectro de massas foi obtido em Espectrômetro de Massas (modelo
ultrOTOFQ-ESI-TOF Mass Spectrometer, Bruker Daltonics, Billerica, MA, EUA)
acoplado a um cromatógrafo líquido de alta eficiência (Prominence SHIMADZU com
bombas de alta pressão, modelo LC-20AD com faixa de fluxo: 0.0001 a 10.0000
mL/min, detector espectrofotométrico de arranjo de diodos SPD-M20A, módulo de
comunicação CBM-20A, desgaseificador DGU-20A-5 e bomba de infusão modelo
COLE PARMER).
II.2.2 MÉTODOS
II.2.2.1 Ponto de fusão
Para determinação do ponto de fusão, tubos capilares de vidro com diâmetro
interno de aproximadamente 1 mm e espessura das parede de 0.1 a 0.2 mm foram
usados para suportar a amostra, as quais foram compactadas com uma altura de 3 a
4 mm. Os capilares com as amostras foram colocados em uma câmara de
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
41
aquecimento a 100 ºC. A temperatura da câmara aumentou a uma taxa de 3 ºC/min
até a fusão das amostras. Os valores dos pontos de fusão obtidos para cada
amostra foram calculados para obtenção da média, desvio padrão, erro padrão
médio e coeficiente de variação.
II.2.2.2 Cromatografia líquida de alta eficiência
A solução-estoque da riparina I foi preparada em (50:50 | H
2
O:MeCN) na
concentração de 1 mg/mL. A partir dessa solução, foi preparada uma solução de
trabalho na concentração de 20 µg/mL em (50:50 | H
2
O:MeCN), a qual foi submetida
a uma análise em modo gradiente de eluição, utilizando como fase móvel uma
mistura binária de H
2
O e MeCN. O sistema gradiente variou a proporção de MeCN
de 5 a 95% no tempo de 0 a 30 minutos. O fluxo foi mantido em 1 mL/min durante a
análise.
A determinação da pureza de pico é uma ferramenta importante para
identificação de interferentes que possam coeluir ou diminuir a resolução dos
analitos presentes em amostras biológicas. A pureza do pico cromatográfico
referente à riparina I foi determinada em cromatógrafo líquido acoplado ao detector
de arranjo de diodos (DAD) na faixa de 190 a 800 nm e foi avaliada utilizando-se a
rotina do software ClassVp conhecida como “Peak Purity”. A ferramenta “Peak
Purity” compara os espectros de ultravioleta ao longo do pico cromatográfico com o
espectro no ápice do pico. Um índice de pureza de 1,0 indica um grau de pureza de
100%, e valores que se desviam de 1,0 mostram picos que coeluem com impurezas.
II.2.2.3 Ressonância magnética nuclear de
1
H e
13
C
Os deslocamentos químicos (δ) em partes por milhão (ppm) e as constantes
de acoplamento (J) em Hz foram referenciados para RMN de
1
H pelos sinais
característicos dos hidrogênios pertencentes à fração não deuterada do CHCl
3
(7,24 ppm). Para o espectro de RMN de
13
C, os deslocamentos químicos foram
referenciados pelos sinais dos carbonos do solvente deuterado CDCl
3
(77,0 ppm).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
42
As multiplicidades dos deslocamentos químicos de RMN de
1
H foram
indicadas segundo as convenções: s (simpleto), sl (simpleto largo), d (dupleto),
dd (duplo dupleto), t (tripleto), q (quadrupleto) e m (multipleto).
Os espectros de RMN de
13
C foram obtidos pela técnica APT com a seguinte
convenção: sinais de carbonos não-hidrogenados (C) e metilênicos (CH
2
) acima da
linha base e sinais de carbonos metínicos (CH) e metílicos (CH
3
) abaixo da linha
base.
II.2.2.4 Espectrometria de massas
A riparina I foi utilizada na concentração de 20 µg/mL em
(50:50 | H
2
O:MeCN) e as condições experimentais foram: bomba de infusão, fluxo
300 µL/h e modo de detecção positivo e negativo. Por ser de alta resolução, o
aparelho necessita de uma calibração interna antes das análises. Para isso, utilizou-
se para calibração interna uma solução de ácido trifluoroacético com sódio (NA-TFA)
a 10 mg/mL (TOF). Os parâmetros utilizados foram: end plate: 4 KV; voltagem do
capilar de 4,5 KV; capillary exit: 300 Volts; skimmer 1: 55 Volts; skimmer 2: 25 Volts;
transfer: 90 µs; collision exit gate: 80 µs; temperatura do gás de dessolvatação de
150 ºC; fluxo do gás de dessolvatação de 4 L/min; pressão do gás de nebulização de
2 Bar e gás nitrogênio.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
43
II.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A qualidade do padrão de referência pode afetar a confiabilidade do estudo,
por esta razão, sua identidade e pureza devem ser conhecidas.
As análises da riparina I por espectroscopia de infravermelho (IV), de
ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN
1
H) e de carbono 13 (RMN
13
C),
espectrometria de massa (ESI-EM), ultravioleta, bem como o ponto de fusão,
confirmaram a sua pureza e estrutura através de seus picos, absorções e
fragmentações características.
II.3.1 PONTO DE FUSÃO
Os resultados do estudo do ponto de fusão da riparina I estão representados
na Tabela 1 (p. 43). Foi obtido um coeficiente de variação de 0,25%, o que
demonstrou homogeneidade nos dados obtidos, sugerindo que a amostra possui um
grau de pureza elevado.
Tabela 1. Valores do ponto de fusão da riparina I
Replicata 1 Replicata 2 Replicata 3
Ponto de Fusão (ºC)
121,20
121,40
121,80
Md
DP
EPM
CV (%)
121,47 ºC
0,31
0,18
0,25
* Md (média), DP (desvio padrão), EPM (erro padrão médio), CV (coeficiente de variação)
II.3.2 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
O cromatograma ( = 225 nm) (Figura 6, p. 44) em sistema de eluição
gradiente, mostrou o aparecimento do pico da riparina I em 22,4 minutos, confirmado
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
44
pelo seu cromatograma “contour” (Figura 7, p. 44). O teste de pureza do pico (Figura
8, p. 45) apresentou índice de pureza espectroscópica de 0,9919 (99,19%).
Figura 6. Cromatograma em 225 nm por sistema gradiente de solventes (5 a 95% de MeCN em
30 minutos) da riparina I em CLAE-DAD na concentração de 20 µg/mL em (50:50 | H
2
O:MeCN)
Figura 7. Cromatograma “Contour” da riparina I por sistema gradiente de solventes (5 a 95%
de MeCN em 30 minutos) em CLAE-DAD na concentração de 20 µg/mL em (50:50 | H
2
O:MeCN)
T
r
= 22,408 min
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
45
Figura 8. Perfil de pureza do pico cromatográfico da riparina I na concentração de 20 µg/mL
mostrando uma pureza de 99,19%
O espectro de UV/Vis pelo cromatograma indicou que a riparina I possui
absorções na faixa do UV/Vis, com dois picos de absorções máximas em 205 e
225 nm (Figura 9, p. 45).
Figura 9. Espectro na região de UV/Vis (detector de arranjo de diodos) de 190 a 800 nm da
riparina I na concentração de 20 µg/mL
205 nm
225 nm
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
46
II.3.3 CONFIRMAÇÃO ESTRUTURAL DA RIPARINA I
A estrutura química da riparina I é caracterizada por apresentar um núcleo
N-benzoilamida ligado ao radical 4’-metoxifeniletil pelo nitrogênio da amida
secundária (Figura 10, p. 46) e foi confirmada pela análise dos espectros de
infravermelho, ressonância magnética nuclear de
1
H e
13
C e massas.
Figura 10. Estrutura química da riparina I mostrando o núcleo N-benzoilamida (em verde) e o
radical 4’-metoxifeniletil (em azul)
No espectro de IV (Figura 11, p. 47) desta substância, absorções em
1639 cm
-1
, característica de estiramento de C=O, e em 1535 e 1512 cm
-1
,
estiramento de C=C aromático, permitiram sugerir a presença de carbonila de amida
aril conjugada, tal como é observada na estrutura química da riparina I. Única
absorção forte em 3321 cm
-1
atribuída a estiramento de N-H confirmou que a mesma
tratava-se de uma amida secundária.
No espectro de RMN
1
H (500 MHz, CDCl
3
), bem como nas suas expansões
(Figuras 12, 13 e 14, p. 48 e 49), um duplo dupleto com integral para dois
hidrogênios em δ
H
7,67 (J = 1,5 e 8,0 Hz), um tripleto integrando para dois
hidrogênios em δ
H
7,37 (J = 8,0 Hz) e um tripleto de tripletos para um hidrogênio em
δ
H
7,45 (J = 1,5 e 7,0 Hz) atribuídos aos prótons H-2/6, H-3/5 e H-4,
respectivamente, sugeriram um sistema aromático monossubstituído. Estes dados
foram corroborados pelos sinais, no espectro de RMN
13
C (125 MHz, CDCl
3
) (Figura
15, p. 49), em δ
C
134,8 (C-1), 131,3 (C-4), 128,5 (C-2/6) e 126,8 (C-3/5).
O simpleto largo em δ
H
6,18 atribuído ao hidrogênio ligado a heteroátomo,
no espectro de RMN
1
H (Figura 13, p. 48), o sinal, no espectro de RMN
13
C (Figura
15, p. 49), em δ
C
167,4 para carbonila em C-7 e as absorções no espectro de IV
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
47
para carbonila de amida aril conjugada confirmaram a presença deste grupo
funcional e, juntamente com os dados para um sistema aromático monossubstituído,
ratificaram o núcleo N-benzoilamida da riparina I.
Figura 11. Espectro de Infravermelho (KBr, cm
-1
) da riparina I
O sistema AA’BB’ evidenciado no espectro de RMN
1
H (Figura 13, p. 48)
pelos dupletos com integral para dois hidrogênios cada em δ
H
6,84 (J = 8,0 Hz) e
7,13 (J = 8,0 Hz) atribuídos aos hidrogênios H-3’/5’ e H-2’/6’, respectivamente, e os
sinais no espectro de RMN
13
C (Figura 15, p. 49) em δ
C
114,2 (C-3’/5’) e 129,7 (C-
2’/6’) confirmaram a presença de um anel aromático p-substituído.
O tripleto em δ
H
2,85 (J = 7,0 Hz) e o quarteto em δ
H
3,66 (J = 6,0 e
12,5 Hz), ambos com integral para dois hidrogênios, e seus respectivos sinais para
carbonos em δ
C
34,8 e 41,3, atribuídos aos átomos da posição 7’ e 8’ do grupo etil
substituído, respectivamente, bem como, o simpleto para três hidrogênios em δ
H
3,77 e o sinal em δ
C
55,2 para metoxila não impedida estericamente confirmaram a
presença do radical 4’-metoxifeniletil. Estes dados juntamente com aqueles para o
núcleo N-benzoilamida permitiram confirmar a estrutura química N-[8’-(4’-
metoxifeniletil)]-benzoilamida da riparina I (Tabela 2, p. 50).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
48
ppm (f1)
5.0
10.0
7.680
7.666
7.461
7.447
7.431
7.387
7.371
7.356
7.240
7.135
7.118
6.851
6.834
6.184
3.772
3.678
3.666
3.652
3.638
2.867
2.853
2.839
-0.011
2.00
1.04
2.13
2.08
2.03
0.98
3.30
2.28
2.22
Figura 12. Espectro de RMN
1
H (CDCl
3
, 500 MHz) da riparina I
ppm (f1)
6.50
7.00
7.50
7.680
7.666
7.461
7.447
7.431
7.387
7.371
7.356
7.240
7.135
7.118
6.851
6.834
6.184
2.00
1.04
2.13
2.08
2.03
0.98
Figura 13. Expansão do espectro de RMN
1
H (CDCl
3
, 500 MHz) da riparina I na região de
6,0 – 7,7 ppm
H
N
H
3
CO
O
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
7
4
3
2
1
6
5
H
N
H
3
CO
O
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
7
4
3
2
1
6
5
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
49
ppm (f1)
3.00
3.50
3.772
3.678
3.666
3.652
3.638
2.867
2.853
2.839
3.30
2.28
2.22
Figura 14. Expansão do espectro de RMN
1
H (CDCl
3
, 500 MHz) da riparina I na região de
2,7 – 3,8 ppm
ppm (f1)
50
100
150
200
167.41
158.40
134.78
131.29
130.89
129.70
128.49
126.79
114.18
77.25
77.00
76.75
55.23
41.28
34.79
Figura 15. Espectro de RMN
13
C-APT (CDCl
3
, 125 MHz) da riparina I
H
N
H
3
CO
O
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
7
4
3
2
1
6
5
H
N
H
3
CO
O
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
7
4
3
2
1
6
5
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
50
Tabela 2. Dados de RMN de
1
H (500 MHz) e
13
C (125 MHz) da riparina I em CDCl
3
e comparação
com os dados de RMN de
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) da literatura
Fonte: Seixas, 1996
C
δ
C
δ
H
δ
C
δ
H
1
134,8
-
134,86
-
2
128,5
7,67 (dd, J = 1,5 e 8,0 Hz)
128,68
7,71 (dd, J = 1,5 e 7,2 Hz)
3
126,8
7,37 (t, J = 8,0 Hz)
126,92
7,40 (t, J = 7,2 Hz)
4
131,3
7,45 (tt, J = 1,5 e 7,0 Hz)
131,50
7,48 (tt, J = 1,5 e 7,2 Hz)
5
126,8
7,37 (t, J = 8,0 Hz)
126,92
7,40 (t, J = 7,2 Hz)
6
128,5
7,67 (dd, J = 1,5 e 8,0 Hz)
128,68
7,71 (dd, J = 1,5 e 7,2 Hz)
7
167,4
-
167,64
-
1’
130,9
-
131,06
-
2’
129,7
7,13 (d, J = 8,0 Hz)
129,90
7,15 (d, J = 8,6 Hz)
3’
114,2
6,84 (d, J = 8,0 Hz)
114,28
6,86 (d, J = 8,6 Hz)
4’
158,4
-
158,48
-
5’
114,2
6,84 (d, J = 8,0 Hz)
114,28
6,86 (d, J = 8,6 Hz)
6’
129,7
7,13 (d, J = 8,0 Hz)
129,90
7,15 (d, J = 8,6 Hz)
7’
34,8
2,85 (t, J = 7,0 Hz)
34,94
2,87 (t, J = 7,0 Hz)
8’
41,3
3,66 (q, J = 6,0 e 12,5 Hz)
41,50
3,67 (q, J = 7,0 Hz)
N-H
-
6,18 (sl)
-
6,35 (sl)
CH
3
O-4’
55,2
3,77 (s)
55,40
3,79 (s)
H
N
H
3
CO
O
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
7
4
3
2
1
6
5
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
51
II.3.4 ESPECTROMETRIA DE MASSAS
O espectro de massas de alta resolução ESI-EM da riparina I no modo de
ionização positivo (Figura 16, p. 52) corroborou com os espectros anteriores ao
mostrar o pico de íon molecular em m/z 256,1340 condizente com a fórmula
molecular C
16
H
17
NO
2
(calc. 255,1259) adicionada à massa de hidrogênio (calc.
1,0078) na formação do íon [M + H]
+
ocorrido por reação de protonação
característico da técnica ESI. Os picos em m/z 278,1161 e 294,0900 também
confirmaram a massa molecular da substância, uma vez que correspondem à
formação dos adutos de sódio [M + Na]
+
e potássio [M + K]
+
, respectivamente.
O pico em m/z 135,0781 [M – C
7
H
7
NO]
+
corresponde à fragmentação da
riparina I em decorrência da cisão heterolítica da ligação N-alquila com formação do
íon 4’-metoxifeniletil. Essa quebra foi confirmada no experimento de fragmentação
do íon em m/z 256,1340, como observado nos espectros da Figura 17 (p. 53) em
que houve o aparecimento do íon em m/z 135,0837.
Com o aumento da energia de colisão foi observado o aparecimento de
outros dois picos: em m/z 120,0598 correspondente à cisão homolítica da ligação C-
C do grudo etila do íon 4’-metoxifeniletil com liberação do radical metila; e em m/z
105,0401 atribuído a outra cisão heterolítica da ligação C-N da carbonila com
formação do cátion benzoíla estabilizado por ressonância (Figuras 17 e 18, p. 53 e
54).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
52
Figura 16. Espectro de massas de alta resolução da riparina I
135.0781
256.1340
278.1161
294.0900
+MS, 4.0min #75
0
1
2
3
5
x10
Intens.
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
256.1340
278.1161
294.0900
135.0781
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
53
Figura 17. Espectros de fragmentação do íon m/z 256 com diferentes energias de colisão
135.0837
256.1375
+MS2(256.0991), 0eV, 5.4min #100
135.0839
256.1368
+MS2(256.0991), 5eV, 5.6min #103
105.0401
135.0840
256.1370
+MS2(256.0991), 10eV, 5.7min #106
105.0425
120.0598
135.0837
+MS2(256.0991), 15eV, 5.8min #108
105.0499
120.0604
135.0836
+MS2(256.0991), 20eV, 6.0min #111
0
1
2
3
4
5
x10
Intens.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
5
x10
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5
x10
0.0
0.5
1.0
1.5
5
x10
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
5
x10
100 120 140 160 180 200 220 240 260 m/z
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
54
Figura 18. Proposta de fragmentação da riparina I baseada nos espectros de massas de alta
resolução no modo de ionização positivo
CAPÍTULO III
Desenvolvimento do método cromatográfico
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
56
III.1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
III.1.1 PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA
A cromatografia como um método físico-químico de separação de misturas
complexas foi descoberta no início do século XX pelo botânico italiano-russo M. S.
Tswet (KAZAKEVICH; LoBRUTTO, 2007).
A cromatografia é definida como um processo de migração diferencial dos
componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas
fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária (Figura 19, p. 56). A grande
variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica
extremamente versátil e de grande aplicação (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
Figura 19. Processo de separação cromatográfica
Dentre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de
destaque devido à facilidade com que efetua a separação, identificação e
quantificação das espécies químicas (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
57
III.1.2 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é uma técnica de
separação que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos analíticos
mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos (TONHI et al., 2002) e
atualmente se destaca na química analítica pela capacidade de realizar análises
qualitativas e quantitativas em amostras ambientais, farmacêuticas, biológicas e em
alimentos (RIBANI et al., 2004).
A CLAE é um sistema de separação automatizado que funciona com uma
fase móvel passando por uma fase estacionária sob alta pressão, o que
originalmente levou à denominação de cromatografia líquida de alta pressão. Esta
terminologia foi substituída quando se constatou que o grande aporte da técnica era
a melhor capacidade de separação cromatográfica e não a maior pressão. Com o
desenvolvimento de partículas de sílica peliculares porosas, permitiu-se operar em
fluxos e pressões menores, com maior grau de eficiência no processo de separação
(NETO; NUNES, 2003).
O sistema típico da CLAE se caracteriza por ter, em sua configuração
básica, os seguintes componentes: reservatório de solventes, bomba, injetor, coluna,
detector, sistema de aquisição de dados e sistema controlador (KAZAKEVICH;
LoBRUTTO, 2007) (Figura 20, p. 58).
A separação em CLAE se dá pela distribuição de moléculas de soluto entre
dois líquidos imiscíveis (fases estacionária e móvel) de acordo com seu coeficiente
de partição. A fase móvel carreia o analito pela fase estacionária e durante essa
passagem, os analitos da mistura interagem ora com a fase móvel, ora com a fase
estacionária, o que retém seletivamente cada analito. Ao sair da fase estacionária, o
analito passa por um sistema de detecção com alta sensibilidade que registra sua
passagem em função do tempo, representado pelo cromatograma (COLLINS,
BRAGA, BONATO, 2006).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
58
Figura 20. Esquema de um cromatógrafo líquido de alta eficiência
Fonte: Golzio, 2008
III.1.3 DESENVOLVIMENTO CROMATOGRÁFICO EM CLAE
O desenvolvimento de métodos cromatográficos é baseado no
conhecimento do processo cromatográfico, além do conhecimento da natureza da
amostra a ser analisada (SNYDER; KIRKLAND; GLAJEH, 1997).
A composição química da amostra pode fornecer uma valiosa pista para a
melhor escolha das condições iniciais para uma separação em CLAE. Algumas
amostras requerem um pré-tratamento antes de serem analisadas em CLAE, devido
à necessidade de remover os interferentes, concentrar os analitos na amostra e/ou
proteger a coluna ou o equipamento de possíveis danos (SNYDER; KIRKLAND;
GLAJEH, 1997).
A injeção direta da amostra é preferível pela sua conveniência e uma melhor
precisão. Entretanto, a maioria das amostras para serem analisadas, necessita
serem pesadas e diluídas antes da injeção. Os melhores resultados são geralmente
obtidos quando o solvente utilizado para solubilizar a amostra é a própria fase
móvel, uma vez que diminui os ruídos na linha de base e outros problemas, como a
assimetria da banda cromatográfica (SNYDER; KIRKLAND; GLAJEH, 1997).
Porém, antes da injeção da amostra no cromatógrafo líquido, deve-se ter a
certeza de que o detector selecionado irá ser sensível a todos os componentes da
Detector
Fase Móvel
(Reservatório)
Bomba
Injetor
Coluna
Descarte
Resultado
(Cromatograma)
Sistema de Aquisição
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
59
amostra. O detector de ultravioleta de comprimento de onda variável, normalmente,
é a primeira escolha devido a sua conveniência e aplicabilidade para a maioria das
amostras. O espectro de UV pode ser encontrado na literatura, estimado pela
estrutura química dos componentes da amostra de interesse, medido diretamente
(se a substância pura estiver disponível), ou obtido durante a separação em CLAE
por meio do detector de arranjo de diodos (SNYDER; KIRKLAND; GLAJEH, 1997).
Geralmente, para o desenvolvimento do método cromatográfico com CLAE,
utiliza-se uma fase móvel de força eluotrópica elevada. Em seguida, a porcentagem
do solvente orgânico é reduzida de acordo como necessário. Uma alternativa para
iniciar a separação isocrática é o uso da eluição em modo gradiente (SNYDER;
KIRKLAND; GLAJEH, 1997).
Uma eluição gradiente inicial fornece uma estimativa da faixa aproximada de
retenção do analito, o que permite uma escolha entre a eluição isocrática ou
gradiente para experimentos subsequentes. Se a eluição isocrática é a melhor
escolha, uma eluição gradiente inicial permite uma estimativa da melhor força do
solvente para a separação isocrática. Uma separação inicial por gradiente é também
vantajosa para o desenvolvimento do método desde que forneça a melhor resolução
da amostra do que quando obtida por separação isocrática com um solvente forte
(SNYDER; KIRKLAND; GLAJEH, 1997).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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60
III.2 MATERIAL E MÉTODOS
III.2.1 MATERIAL
III.2.1.1 Padrões e reagentes
A riparina I e o padrão interno foram cedidos pelo Dr. Stanley Juan Chávez
Gutierrez do LTF-UFPB. Foram utilizadas água ultrapura tipo I (Elga Labwater
Purelab Option-Q), metanol grau HPLC (TEDIA-USA) e acetonitrila grau HPLC
(TEDIA-USA).
O padrão interno (PI) utilizado neste estudo foi o N-(3,4-dimetoxifeniletil)
benzamida demonstrado na Figura 21 abaixo.
Figura 21. N-(3,4-dimetoxifeniletil) benzamida
III.2.1.2 Parâmetros cromatográficos
As análises foram realizadas utilizando um sistema de cromatografia líquida
de alta eficiência SHIMADZU série 10A vp, constituído de duas bombas LC-6AD,
detector de arranjo de diodos SPD-M10A vp, módulo controlador SCL-10A vp e
injetor manual provido com um loop de amostra de 20 µL (Rheodyne).
As separações cromatográficas foram realizadas utilizando uma coluna
analítica C18 (ACE) com 250 mm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e
5 µm de tamanho de partícula, e pré-coluna C18 (ACE) com 4,6 mm de diâmetro
interno e 5 µm de tamanho de partícula. O comprimento de onda utilizado para
análise das variáveis cromatográficas foi 225 nm. As variáveis cromatográficas
analisadas foram: tempo de retenção (T
r
), área do pico da amostra (AREAP) e
assimetria (ASSM).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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61
III.2.2 MÉTODOS
III.2.2.1 Preparação das soluções-estoque e de trabalho da riparina I e do
padrão interno
As soluções-estoque da riparina I e do padrão interno foram preparadas
separadamente em (50:50 | H
2
O:MeCN) na concentração de 1 mg/mL e
armazenadas a -20 ºC. A partir dessas soluções, foram preparadas as soluções de
trabalho na concentração de 20 µg/mL em (50:50 | H
2
O:MeCN), as quais foram
submetidas à análise em CLAE-DAD.
III.2.2.2 Desenvolvimento do método cromatográfico
Para o desenvolvimento cromatográfico da mistura da riparina I com o
padrão interno foram avaliadas as duas formas de eluição: gradiente e isocrática.
A mistura das substâncias e as mesmas separadamente foram submetidas a
uma análise cromatográfica em modo gradiente, utilizando como fase móvel uma
mistura binária de H
2
O e MeOH. O sistema gradiente variou a proporção de MeOH
de 5 a 95% no tempo de 0 a 30 min, permanecendo em eluição isocrática a 95 % de
MeOH durante 10 min (de 30 a 40 min) e de 40 a 40,1 min variou de 95 % para 5%,
permanecendo em eluição isocrática a 5% de MeOH (Quadro 1, p. 61). O fluxo foi
mantido em 1 mL/min durante a análise.
Quadro 1. Programação da eluição por sistema gradiente de solventes
Tempo (min)
Proporção de MeOH (%)
0
5
30
95
40
95
40,1
5
60
5
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
62
Na eluição isocrática, foram analisadas quatro proporções de fase móvel:
(10:90 | H
2
O:MeOH), (30:70 | H
2
O:MeOH), (50:50 | H
2
O:MeOH) e
(35:65 | H
2
O:MeOH). Os tempos de análises foram de 30 minutos a um fluxo de
1 mL/min.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
63
III.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
No desenvolvimento cromatográfico com eluição por gradiente de solventes
(Figura 22, p. 64), o cromatograma da mistura do padrão interno e da riparina I
mostrou uma boa separação entre os picos com tempos de retenção de 26,22 e
28,01 minutos, respectivamente, fornecendo uma estimativa da faixa de retenção
aproximada dos analitos, bem como, a melhor proporção do solvente orgânico para
dar início à eluição isocrática.
Para as análises cromatográficas por eluição isocrática utilizando
(10:90 | H
2
O:MeOH), a identificação individual e a mistura da riparina I e padrão
interno não se mostraram satisfatórias, já que os tempos de retenção foram muito
baixos para a riparina I e padrão interno (3,59 e 3,25 minutos, respectivamente) e
próximos do tempo morto da coluna, devido à alta força eluotrópica da mistura
(Figura 23, p. 65). Este efeito levou à sobreposição dos picos da riparina I e do
padrão interno, bem como pode levar a sobreposição dos picos dos mesmos com
outros componentes, como produtos de degradação ou impurezas.
O cromatograma obtido com (50:50 | H
2
O:MeOH) exibiu um tempo de
retenção relativamente alto para a riparina I (21,78 minutos) e a resolução entre o
pico da riparina I e o pico do padrão interno (13,27 minutos) ainda permite uma
alteração no sistema eluente para uma concentração intermediaria com 70% de
metanol (Figura 25, p. 67).
O desenvolvimento com (30:70 | H
2
O:MeOH) mostrou uma boa separação
entre a riparina I e o padrão interno (Figura 24, p. 66), com tempos de retenção
baixos (6,03 e 4,52 minutos, respectivamente), porém o método foi otimizado
utilizando como fase móvel (35:65 | H
2
O:MeOH) para obtenção de uma melhor
resolução entre os picos (Figura 26, p. 68).
A otimização do método revelou-se ideal, apresentando uma resolução
elevada (R
s
= 1,5) entre o padrão interno e a riparina I, além de fornecer tempos de
análises curtos (5,36 e 7,09 minutos, respectivamente), que é um fator essencial
para quantificação rápida de amostras (Figura 26, p. 68).
O quadro 2 (p. 69) apresenta as condições cromatográficas desenvolvidas
para identificação e quantificação da riparina I com detecção por ultravioleta.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
64
Figura 22. Cromatogramas da riparina I (A), PI (B) e da riparina I + PI (C) em sistema de eluição
gradiente (5 a 95% de MeOH durante 30 min) a 225 nm
(A)
(B)
(C)
T
r
= 28,072 min
T
r
= 26,289 min
T
r
= 26,215 min
T
r
= 28,007 min
1
2
ASSM = 1,14
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
AREAP = 1312394
AREAP = 1666398
AREAP = 1091896
AREAP = 1612140
ASSM = 1,23
ASSM = 1,21
ASSM = 1,19
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
65
Figura 23. Cromatogramas da riparina I (A), PI (B) e da riparina I + PI (C) em sistema de eluição
isocrática (10:90 | H
2
O:MeOH) a 225 nm
(A)
(B)
(C)
T
r
= 3,585 min
T
r
= 3,250 min
T
r
= 3,238 min
T
r
= 3,424 min
1
2
ASSM = 1,14
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
AREAP = 1411323
AREAP = 5634616
AREAP = 1918129
AREAP = 2431296
ASSM = 1,00
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66
Figura 24. Cromatogramas da riparina I (A), PI (B) e da riparina I + PI (C) em sistema de eluição
isocrática (30:70 | H
2
O:MeOH) a 225 nm
(A)
(B)
(C)
1
2
T
r
= 6,028 min
T
r
= 4,524 min
T
r
= 4,605 min
T
r
= 5,734 min
AREAP = 2277905
AREAP = 1653490
AREAP = 1681790
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
AREAP = 1794261
ASSM = 1,4
ASSM = 1,38
ASSM = 1,14
ASSM = 0,86
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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67
Figura 25. Cromatogramas da riparina I (A), PI (B) e da riparina I + PI (C) em sistema de eluição
isocrática (50:50 | H
2
O:MeOH) a 225 nm
(A)
(B)
(C)
1
2
T
r
= 21,778 min
T
r
= 13,265 min
T
r
= 4,605 min
T
r
= 5,734 min
AREAP = 1607399
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
AREAP = 1635013
ASSM = 1,15
ASSM = 1,17
AREAP = 1651224
ASSM = 0,99
AREAP = 1318382
ASSM = 1,19
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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68
Figura 26. Cromatogramas da riparina I (A), PI (B) e da riparina I + PI (C) em sistema de eluição
isocrática (35:65 | H
2
O:MeOH) a 225 nm
(A)
(B)
(C)
1
2
T
r
= 7,007 min
T
r
= 5,446 min
T
r
= 5,364 min
Pico 1 (PI)
AREAP = 1260280
ASSM = 1,31
Pico 2 (Riparina I)
T
r
= 7,090min
AREAP = 1876767
ASSM = 1,23
AREAP = 2284651
ASSM = 0,88
AREAP = 1306551
ASSM = 1,32
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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69
Sistema
Descrição
Cromatógrafo
SHIMADZU série 10A vp configurado com os
seguintes módulos:
duas bombas (LC–6AD vp), módulo
controlador SCL-10A vp e injetor manual
provido com um loop de 20 µL (Rheodyne)
Detector
Detector de arranjo de diodos SPD-M10A vp
Coluna
ACE, 5 μm - C18 (250 x 4,6 mm) com pré-
coluna C18
Comprimento de onda
225 nm
Volume de injeção
20 μL
Fase móvel
(35:65 | H
2
O: MeOH)
Tipo de eluição
Isocrática
Vazão de fluxo
1 mL/min
Temperatura
27 ºC
Quadro 2. Condições cromatográficas desenvolvidas para quantificação da riparina I com
detecção por ultravioleta
CAPÍTULO IV
Estudo de estabilidade em solução da riparina I
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
71
IV.1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A estabilidade é definida como o tempo (em dias, meses, anos) durante o
qual a especialidade farmacêutica ou mesmo a matéria-prima, dentro dos limites
especificados e durante todo o período de estocagem e uso, possuem as mesmas
condições e características quando da época de sua fabricação (JÚNIOR, 2009;
VADAS, 2000).
Todas as substâncias estão sujeitas a alguma forma de decomposição
química ou física. Os principais processos de degradação química são: hidrólise,
oxidação, reações fotoquímicas, isomerização e polimerização. A maior ou menor
vulnerabilidade de uma espécie sofrer uma reação química é definida como fator
intrínseco de estabilidade, tais como ponto de fusão e coeficiente de solubilidade. Já
as condições externas envolvidas na deterioração de fármacos, fatores extrínsecos
como a luz, a temperatura, o ar e a umidade, podem afetar a estabilidade física de
medicamentos e acelerar processos de decomposição química do fármaco (BRASIL,
2005; MURAKAMI et al., 2009).
O estudo de estabilidade, portanto, é necessário para que se possa garantir
a pureza, a inocuidade, a potência e a eficácia do produto, e estabelecer por quanto
tempo, desde o momento de sua produção, estas características podem ser
mantidas (CARSTENSEN; RHODES, 2000; MURAKAMI et al., 2009).
Para gerar resultados confiáveis e reprodutíveis, a estabilidade das
soluções-estoque deve ser investigada no início da validação do método, para que
seja estabelecido o tempo de validade de tais soluções (SHABIR, 2003). Os
experimentos devem contemplar a temperatura adequada para o armazenamento
(ambiente, sob refrigeração ou congelamento) e o período de estocagem das
soluções. As análises devem ser realizadas em intervalos de tempo apropriados, por
exemplo, no mínimo 6 horas após o preparo e depois de 15 e 30 dias (CAUSON,
1997).
Os resultados obtidos com as soluções-estoque recém-preparadas devem
ser comparados com aqueles obtidos utilizando as soluções-estoque armazenadas.
Caso seja confirmada a estabilidade das soluções-estoque, os padrões de
calibração e as amostras controle de qualidade durante a validação e na aplicação
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
72
do método analítico podem ser preparados a partir da mesma solução-estoque, sem
a necessidade de preparar novas soluções (BRODIE; HILL, 2002).
Recomenda-se avaliar a estabilidade das soluções-estoque em uma única
concentração e, no mínimo, em duplicata (BANSAL; DeSTEFANO, 2007).
Em relação aos critérios de aceitação dos estudos de estabilidade, algumas
considerações são encontradas na literatura. Não há uma concordância sobre o
critério de aceitação que define a estabilidade aceitável para as soluções-estoque.
Entretanto, o consenso é que a degradação deve ser pequena, uma vez que estas
soluções são utilizadas no preparo dos padrões de calibração e amostras controle
de qualidade (VISWANATHAN et al., 2007).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
73
IV.2 MATERIAL E MÉTODOS
IV.2.1 MATERIAL
IV.2.1.1 Padrões e reagentes
A riparina I foi cedida pelo Dr. Stanley Juan Chávez Gutierrez do LTF-UFPB.
Foram utilizadas água ultrapura tipo I (Elga Labwater Purelab Option-Q) e
acetonitrila grau HPLC (TEDIA-USA).
IV.2.1.2 Equipamentos
Termo-higrômetro digital Max. Min int/ext (Incoterm) para medição das
temperaturas interna (do freezer) e externa e da umidade externa;
Cromatógrafo líquido SHIMADZU da série 10A vp, constituído de duas
bombas LC-6AD, detector de arranjo de diodos SPD-M10A vp, módulo controlador
SCL-10A vp e injetor manual provido com um loop de amostra de 20 µL (Rheodyne).
IV.2.2 MÉTODOS
IV.2.2.1 Preparação da solução da riparina I a 100 µg/mL
A partir da solução-estoque da riparina I (1 mg/mL) foi preparada a solução
em estudo na concentração de 100 µg/mL em (50:50 | H
2
O:MeCN) para um volume
de 1.000 µL.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
74
IV.2.2.2 Parâmetros cromatográficos
A análise no CLAE-DAD foi realizada utilizando uma coluna analítica C18
(ACE) de 250 mm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e 5 µm de tamanho
de partícula e pré-coluna C18 (ACE) com 4,6 mm de diâmetro interno e 5 µm de
tamanho de partícula.
A fase móvel consistiu em (50:50 | H
2
O:MeCN) no modo de eluição
isocrática com fluxo de 1 mL/min. O volume de injeção das amostras no sistema
cromatográfico foi de 20 µL. O tempo de retenção da riparina I foi de 8 minutos,
sendo as análises realizadas em 12 minutos e em duplicata. O comprimento de onda
para análise no detector de UV foi em 225 nm. As variáveis cromatográficas
analisadas foram: tempo de retenção (T
r
), área do pico da amostra (AREAP) e
assimetria (ASSM).
IV.2.2.3 Procedimento do estudo de estabilidade
Para o estudo de estabilidade em solução da riparina I, seis amostras foram
preparadas na concentração de 100 µg/mL, injetadas no cromatógrafo líquido e, em
seguida, divididas em dois grupos: três amostras que permaneceram armazenadas
em freezer a -20 ºC durante 30 dias (amostras-freezer) e três amostras que foram
submetidas ao ciclo de congelamento e descongelamento de 24 horas (amostras-
ciclo). No 30º dia do estudo foram preparadas novas soluções (amostras-frescas)
para fins de comparação com as demais. Além disso, foram preparadas soluções
nas concentrações de 20, 50, 80, 130 e 160 µg/mL de riparina I em
(50:50 | H
2
O:MeCN) para construção da curva de calibração no início e no término
do estudo.
Durante os 30 dias de experimento, a temperatura e a umidade relativa do ar
foram monitoradas.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
75
IV.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
As áreas dos picos nos cromatogramas analisados no 1° dia (Figura 28,
p. 77) foram submetidas a cálculos de regressão linear obtidos por meio da curva de
calibração (Figura 27, p. 76) feita com amostras frescas para conhecimento das
concentrações, assim como as áreas dos picos nos cromatogramas no 30° dia de
estudo (Figura 28, p. 77).
A concentração média das amostras de riparina I que permaneceram
armazenadas à temperatura de -20 ºC (amostras-freezer), como também das
amostras que foram submetidas ao ciclo de congelamento e descongelamento de 24
horas (amostras-ciclo) demonstrou que não houve variação maior do de 5% ao
comparar a concentração entre o 1º e o 30º dia (Tabela 3, p. 75).
Tabela 3. Amostras da riparina I a 100 µg/mL que foram submetidas ao estudo de estabilidade
em solução durante 30 dias
*Cada valor é expresso como média desvio padrão de três determinações
Os resultados sugerem que a riparina I em solução (50:50 | H
2
O:MeCN) é
estável no período de 30 dias mesmo que haja variação da temperatura ambiente e
variação da umidade nos intervalos verificados, ou se a solução for mantida à
temperatura de -20 ºC (Figuras 29 e 30, p. 78 e 79). Com isso, os padrões de
calibração e as amostras-controle poderão ser preparados a partir da mesma
solução-estoque, sem a necessidade de preparar sempre novas soluções a cada
experimento.
Amostras
Início do estudo (μg/mL)
Após 30 dias (μg/mL)
Freezer
100,64 ± 2,53
103,15 ± 2,95
Ciclo
99,83 ± 1,69
102,23 ± 2,56
Amostras recém-preparadas
-
103,60 ± 0,40
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
76
Figura 27. Curva de calibração da riparina I no intervalo de concentração de 20 a 160 µg/mL
para o estudo de estabilidade no 1º e 30º dia
y = 88880x - 356899
r
2
= 0,9968
y = 88708x + 158671
r
2
= 0,9979
30º dia
1º dia
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
77
Figura 28. Cromatogramas do estudo de estabilidade da riparina I a 100 μg/mL em solução: (A) amostra no 1º dia de estudo antes de ser
armazenada a -20 ºC, (B) amostra que permaneceu a -20 ºC durante 30 dias, (C) amostra no 1º dia antes de ser submetida ao ciclo de
congelamento/descongelamento de 24 horas e (D) amostra que passou pelo ciclo congelamento/descongelamento de 24 horas durante 30 dias
(A)
(B)
(C)
(D)
AREAP = 9245614
T
r
= 8,053 min
ASSM = 1,18
T
r
= 7,969 min
AREAP = 9264741
ASSM = 1,09
AREAP = 9357994
T
r
= 8,083 min
ASSM = 1,33
AREAP = 9310825
T
r
= 8,136 min
ASSM = 1,21
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78
Figura 29. Monitoramento da temperatura ambiente (A) e da temperatura do freezer (B) durante
o período de 30 dias do estudo de estabilidade
(A)
(B)
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79
Figura 30. Monitoramento da umidade relativa durante o período de 30 dias do estudo de
estabilidade
CAPÍTULO V
Desenvolvimento do método de extração em sangue
de ratos e ratas Wistar
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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81
V.1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
V.1.1 MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS EM FLUIDOS
BIOLÓGICOS
A extração e “clean-up” de fármacos em fluidos biológicos são geralmente o
primeiro e mais difícil passo na bioanálise devido à necessidade de remover
seletivamente os interferentes, como as proteínas, sem uma perda significante do
analito (FEDENIUK; SHAND, 1998; NASCIMENTO; OLIVEIRA; MACÊDO, 2005).
A elevada concentração de proteínas e o grande número de compostos
endógenos presentes nas matrizes biológicas dificultam a análise e podem levar à
precipitação ou desnaturação e adsorção na coluna, com consequente aumento da
pressão do sistema, mudanças no tempo de retenção e decréscimo na capacidade e
eficiência da coluna (ANOVÁ; HUTTA, 2003).
Para contornar tais problemas, são empregados procedimentos de preparo
da amostra, com os quais se procura eliminar os interferentes (Clean-up) (BEDOR et
al., 2004), extrair os analitos com altas recuperações e, em determinadas ocasiões,
pré-concentrar, quando se faz necessário um aumento da sensibilidade do método
(QUEIROZ; LANÇAS, 2005). Portanto, o preparo da amostra torna-se necessário
para que se possa obter uma amostra biológica adequada para o método
selecionado e posterior quantificação de fármacos, biomarcadores ou metabólitos.
Para realizar essa tarefa, a química da substância deve ser entendida, bem
como a matriz e a tecnologia de detecção (CHANG et al., 2007).
Em bioanálises, a CLAE é o método analítico mais utilizado para
determinação de substâncias em matrizes biológicas. O sistema cromatográfico
separa os analitos de todos os outros compostos que possam interferir com a sua
detecção (HENDRIKS, 2009).
A sensibilidade de detecção, seleção de solventes para extração,
simplicidade do processo de extração para preparação de amostras, bem como, o
uso de padrão interno disponível comercialmente, são todos critérios importantes na
determinação de concentrações de fármacos em amostras de plasma
(DANESHTALAB; LEWANCZUK; JAMALI, 2002; ERK, 2003; GONZÁLEZ et al.,
2002; MACEK; KLIMA; PTÁÈEK, 2006).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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82
V.1.2 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E “CLEAN-UP” DE AMOSTRAS
Em geral, mais de um tipo de técnica de extração e/ou pré-concentração
pode ser empregada para uma determinada amostra. A escolha da técnica deve
levar em conta as seguintes características: ser simples, ser rápida, ter baixo custo,
fornecer amostras relativamente livres de interferentes, ter alta recuperação, com
boa exatidão e precisão para os analitos de interesse. A eficiência da extração
(recuperação) é avaliada a partir das características de cada analito em questão,
como o seu pKa, coeficiente de partição e estabilidade no meio de extração
(QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001).
As técnicas mais comumente utilizadas para extração e concentração de
fármacos presentes em fluidos biológicos têm sido a extração por precipitação de
proteínas, extração líquido-líquido e extração em fase sólida (MA et al., 2008).
V.1.2.1 Extração por precipitação (EPP)
A precipitação é uma técnica antiga e ainda é um dos métodos mais
populares para a preparação da amostra bioanalítica. A base teórica da precipitação
de proteínas é a interação entre o reagente e moléculas de proteína. Proteínas
solúveis geralmente têm um núcleo hidrofóbico rodeado por uma superfície
hidrofílica incluindo os grupos iônicos, que não estão envolvidos nas ligações
intramoleculares com outra molécula iônica da carga oposta (CHANG et al., 2007).
As proteínas são precipitadas pela adição de solventes orgânicos
adequados, ácido forte ou alguns sais de metais pesados na amostra (HENDRIKS,
2009). Mudanças no pH e na força iônica alteram a ionização dos grupos funcionais
das proteínas e a espessura da dupla camada lipídica, afetando as interações
proteína-proteína (BOULET; BRITTEN; LAMARCHE, 2001; WALSTRA; JENNESS,
1984). Sais concentrados afetam seus estados de hidratação, sendo as proteínas
menos hidratadas as menos solúveis. Solventes orgânicos e detergentes neutros
diluídos também interferem com as interações hidrofóbicas intramoleculares de
proteínas, reduzindo a sua hidratação (CHANG et al., 2007).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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83
Os álcoois modificam a estrutura primária e as propriedades de interação
através de ligação específica, ligação esta sendo acompanhada por desidratação.
Como regra, a desnaturação protéica aumenta com o aumento do comprimento da
cadeia do álcool e a diminuição do conteúdo de hidroxila (BOULET; BRITTEN;
LAMARCHE, 2001; BULL; BRESE, 1978).
A eficiência da remoção de proteínas por solventes orgânicos depende do
tipo e da quantidade utilizada (CHANG et al., 2007). Apesar da larga escolha de
agentes desnaturantes, a acetonitrila e o metanol são amplamente utilizados devido
a sua compatibilidade com a maioria das fases móveis para CLAE e por
coprecipitarem uma quantidade menor de fármaco quando comparados aos agentes
precipitantes mais eficientes, como o ácido tricloroacético e o ácido perclórico, além
do baixo custo e dos requisitos mínimos para o desenvolvimento de métodos
(BLANCHARD, 1981; MA et al., 2008; ROUAN et al., 2001).
O método de precipitação é preferivelmente utilizado quando é necessária a
extração de vários fármacos de uma mesma classe de compostos, como potenciais
candidatos ao uso terapêutico e rapidez na obtenção de um método bioanalítico
(NASCIMENTO, 2004; PÉHOURCQ; JARRY, 1998).
A extração por precipitação é o tipo de extração mais simples por apresentar
apenas um passo principal (Figura 31, p. 84). O procedimento geralmente começa
com a adição de um padrão interno e do agente precipitante. A mistura é então
homogeneizada para aumentar a velocidade de agregação protéica, devendo ser
refrigerada para aumentar a eficiência de remoção das proteínas. O sobrenadante, o
qual contém o analito, é então separado das proteínas por meio da centrifugação e
uma alíquota é injetada no sistema cromatográfico (CHANG et al., 2007).
Embora seja uma técnica de fácil execução, não apresenta eficiência de
limpeza da matriz, o que pode conduzir a perdas na recuperação devido ao
processo de oclusão do fármaco por precipitação das proteínas. Outros problemas
são diluição, precipitação incompleta de proteínas, coprecipitação de fármacos e
degradação ácida catalisada por fármacos lábeis (FEDENIUK; SHEND, 1998;
NASCIMENTO, 2004).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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84
Figura 31. Procedimento de extração por precipitação
V.1.2.2 Extração líquido-líquido (ELL)
Embora cada vez mais substituída pela extração em fase sólida, a extração
líquido-líquido (ELL) é ainda um método amplamente utilizado para “clean-up” de
amostras em bioanálises (HENDRIKS, 2009).
A ELL é baseada na distribuição de solutos entre uma fase aquosa, a
amostra a ser extraída e o solvente orgânico imiscível em água. O parâmetro de
resposta de interesse é a recuperação do analito. Em segundo lugar, o objetivo é
extrair a menor quantidade possível de substâncias potencialmente interferentes
(HENDRIKS, 2009).
A distribuição do analito depende principalmente do pH da fase aquosa e da
afinidade de espécies não carregadas do analito para o solvente de extração
(HENDRIKS, 2009).
A extração de fármacos, os quais são geralmente bases ou ácidos fracos, é,
normalmente, realizada com o ajuste do pH, sendo esta uma das condições
necessárias para assegurar uma boa recuperação do analito, além da escolha
adequada do solvente orgânico. Vários tipos de solventes orgânicos têm sido
empregados na extração de fármacos ácidos e básicos presentes em amostras de
fluidos biológicos, tais como o éter dietílico, acetato de etila, hexano, tolueno,
diclorometano, acetato de butila, dentre outros. Quanto maior a afinidade do analito
Agitação
Centrifugação
Plasma + padrão interno + agente precipitante
Retirada uma alíquota
Injeção no
cromatógrafo
Sobrenadante
Precipitado de proteínas
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85
pelo solvente orgânico, maior a sua recuperação (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM,
2001).
A ELL apresenta as vantagens de ser simples e poder utilizar um grande
número de solventes puros e disponíveis comercialmente, os quais fornecem uma
ampla faixa de solubilidade e seletividade (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001).
Por outro lado, esta técnica possui uma série de desvantagens, tais como:
as amostras com alta afinidade pela água são parcialmente extraídas pelo solvente
orgânico, resultando em perda do analito; impurezas do solvente são concentradas
juntamente com a amostra, implicando no uso de solventes ultrapuros; pode ocorrer
a formação de emulsões, o que resulta em grande consumo de tempo; alguns
solventes orgânicos são tóxicos e pode haver decomposição de compostos instáveis
termicamente na etapa de pré-concentração (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001).
Apesar destas desvantagens, a ELL ainda é muito utilizada em análises de
diversos tipos de substâncias presentes em fluidos biológicos, pois extratos bastante
limpos podem ser obtidos com alta seletividade para alguns analitos (QUEIROZ;
COLLINS; JARDIM, 2001).
A Figura 32 (p. 85) mostra as etapas de um procedimento de extração
líquido-líquido.
Figura 32. Procedimento de extração líquido-líquido
Agitação
Centrifugação
Evaporação do solvente
Plasma + padrão interno + solvente
Injeção no
cromatógrafo
Fase orgânica
Fase aquosa
Reconstituição do resíduo com fase móvel
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86
V.1.2.3 Extração em fase sólida (EFS)
Atualmente, a extração em fase sólida (EFS) é uma das ferramentas mais
poderosas e mais empregadas para a extração e/ou pré-concentração de analitos
presentes em matrizes complexas (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001).
A EFS utiliza o mesmo princípio da separação cromatográfica, sendo o mais
comumente utilizado, o princípio de fase reversa (CHANG, 2007). A EFS emprega
adsorventes recheados em cartuchos, nas formas de barril ou seringa. Um cartucho
típico é formado por um tubo de polipropileno contendo cerca de 50 a 500 mg de
adsorvente, com 40-60 mm de tamanho de partícula, fixado no tubo através de dois
filtros (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001).
Em geral, os procedimentos de EFS (Figura 33, p. 86) contêm cinco etapas:
i) ativação do sorvente para deixar os sítios ativos disponíveis; ii) condicionamento
do sorvente com solvente adequado para ajustar as forças do solvente de eluição
com o solvente da amostra; iii) introdução da amostra, quando ocorre a retenção do
analito e, às vezes, de alguns interferentes; iv) limpeza da coluna para retirar os
interferentes menos retidos que o analito; v) eluição e coleta do analito (LINGEMAN;
HOEKSTRA-OUSSOREN, 1997; QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001).
Os recentes desenvolvimentos em EFS têm sido direcionados para a síntese
de sorventes mais seletivos e para novas configurações cromatográficas (QUEIROZ;
COLLINS; JARDIM, 2001).
Figura 33. Procedimento de “clean-up” e extração em fase sólida
interferentes eluídos
Eluição do analito
Condicionamento
Aplicação
da amostra
“Clean-up”
da amostra
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87
V.1.3 EFEITO DE MATRIZ
A investigação do efeito de matriz na quantificação de compostos
endógenos ou exógenos e/ou seus metabólitos é um importante parâmetro a ser
avaliado durante o desenvolvimento de um método bioanalítico. Esse efeito ocorre
quando substâncias inerentes à matriz biológica coeluem com os compostos de
interesse, sendo alvo de especulação em métodos bioanalíticos convencionais, tais
como: CLAE-FLU, CLAE-UV e mais recentemente em CLAE-EM/EM (CASSIANO et
al., 2009; MATUSZEWSKI; CONSTANZER; CHAVEZ-ENG, 2003).
O efeito de matriz pode ser definido como o conjunto de alguns efeitos
indesejáveis que se originam de uma matriz biológica. Esses componentes podem
resultar em supressão ou aumento do sinal, diminuição ou aumento na sensibilidade
dos analitos durante um período de tempo, aumento da linha base, imprecisão de
dados, alteração no tempo de retenção e distorção na forma do pico ou
aparecimento de cauda cromatográfica (MALLET; JU; MAZZEO, 2004; PATEL et al.,
2009).
A ligação a compostos endógenos dos fluidos biológicos ou metabolização
do analito é um dos efeitos que levam à diminuição do sinal detectado na
recuperação em matriz (AHUJA; RASMUSSEN, 2007).
A extensão da supressão ou aumento do sinal depende do procedimento de
extração da amostra e também é dependente das características do analito (PATEL
et al., 2009). A precipitação de proteínas utilizando solvente orgânico apresenta um
efeito de matriz maior, quando comparada à extração em fase sólida e à extração
líquido-líquido (CASSIANO et al., 2009).
V.1.4 RECUPERAÇÃO
A recuperação avalia a eficiência do método de tratamento das amostras
biológicas. Este parâmetro é calculado comparando-se a resposta obtida para o
analito adicionado na matriz biológica e extraído com a resposta obtida para o
analito em amostras preparadas em solvente e, consequentemente, não extraídas,
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
88
as quais representam 100% (BRASIL, 2003; CASSIANO et al., 2009; SHAH et al.,
1992).
Embora altos valores de recuperação sejam desejáveis para maximizar a
sensibilidade do método, não é necessário que este valor seja de 100% e, sim, que
a recuperação seja consistente, precisa e reprodutiva (BRASIL, 2003; CASSIANO et
al., 2009; SHAH et al., 2000).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
89
V.2 MATERIAL E MÉTODOS
V.2.1 MATERIAL
V.2.1.1 Padrões e reagentes
As riparinas I e III foram cedidas pelo Dr. Stanley Juan Chávez Gutierrez do
LTF-UFPB. Foram utilizadas água ultrapura tipo I (Elga Labwater Purelab Option-Q),
acetonitrila grau HPLC (TEDIA-USA), metanol grau HPLC (TEDIA-USA) e como
anticoagulante, o EDTA do Labtest HEMSTAB Ref 30-400.
V.2.1.2 Equipamentos
Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência SHIMADZU da série 10A
vp, constituído de duas bombas LC-6AD, detector de arranjo de diodos SPD-M10A
vp, módulo controlador SCL-10A vp e injetor manual provido com um loop de
amostra de 20 µL (Rheodyne).
Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência SHIMADZU da série 10A
vp, consistindo de uma bomba LC-10 AD vp com válvula solenóide FCV-10AL vp,
autoinjetor SIL-10AD vp, forno CTO-10AS vp, degaseificador DGU-14h e detector
SPD-10AV vp.
Vortex (AP-56 – TECNAL/PHOENIX).
Centrífuga Sigma Laborventrisugen 2K15.
V.2.2 MÉTODOS
V.2.2.1 Preparação das soluções-estoque e de trabalho das riparinas I e III
As soluções-estoque das riparinas I e III foram preparadas separadamente
em (50:50 | H
2
O:MeCN) na concentração de 1 mg/mL e armazenadas a -20 ºC.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
90
A partir dessas soluções, foram preparadas as soluções de trabalho
isoladamente e em mistura na concentração de 20 µg/mL em (50:50 | H
2
O:MeCN),
as quais foram submetidas à análise em CLAE-DAD para o desenvolvimento
cromatográfico para quantificação das riparinas I e III.
V.2.2.2 Desenvolvimento de método cromatográfico para as riparinas I e III
Como a recuperação da riparina I não tem influência e independe da
recuperação da riparina III, o método de extração em sangue de ratos e ratas foi
desenvolvido para as riparinas I e III simultaneamente. Diante disso, foi necessário
desenvolver inicialmente um método cromatográfico para as mesmas, e para isso
escolheu-se o modo isocrático de eluição, sendo a acetonitrila utilizada como
solvente orgânico para fase móvel.
Na eluição isocrática, as proporções de fase móvel escolhidas foram:
(10:90 | H
2
O:MeCN), (30:70 | H
2
O:MeCN) e (50:50 | H
2
O:MeCN). As análises foram
realizadas em 30 minutos e em duplicata com fluxo de 1 mL/min.
A coluna analítica utilizada foi uma C18 (ACE) de 250 mm de comprimento,
4,6 mm de diâmetro interno e 5 µm de tamanho de partícula e pré-coluna C18 com
4,6 mm de diâmetro interno e 5 µm de tamanho de partícula. O volume de amostra
injetado no sistema cromatográfico foi de 20 µL e o comprimento de onda para
análise no detector de ultravioleta foi em 225 nm. As variáveis cromatográficas
analisadas foram: tempo de retenção (T
r
), área do pico da amostra (AREAP) e
assimetria (ASSM).
V.2.2.3 Extração em sangue de ratos e ratas Wistar
V.2.2.3.1 Obtenção do sangue
O sangue utilizado neste estudo foi obtido de ratos e ratas Wistar (Rattus
norvegicus) pesando entre 250-300 g, provenientes do biotério “Prof. George
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
91
Thomas” do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica “Prof. Delby Fernandes de
Medeiros” da Universidade Federal da Paraíba (LTF/UFPB).
Os animais foram mantidos sob uma condição controlada de temperatura
(21 ± 1 °C), em um ciclo claro-escuro de 12 horas e com livre acesso à alimentação
e água.
Todos os experimentos desenvolvidos neste estudo foram aprovados pelo
Comitê de Ética em Pesquisa Animal do LTF (CEPA), certidão número 0107/08.
Para a obtenção do “pool” de sangue, os animais foram eutanaziados por
deslocamento cervical. O sangue foi coletado em tubos contendo o anticoagulante
sal sódico do ácido etileno-diaminotetracético (EDTA, 1 gota / 5 mL de sangue) para
prevenir a coagulação e foi posteriormente armazenado à -20 ºC até a análise.
V.2.2.3.2 Curva de calibração padrão
A partir das soluções-estoque de 1 mg/mL das riparinas I e III, foram
preparadas diluições seriais para obtenção das concentrações de 20, 50, 80, 130 e
160 µg/mL em (50:50 | H
2
O:MeCN) na mesma solução com um volume final de
1.000 µL para construção da curva de calibração.
V.2.2.3.3 Metodologia de extração líquido-líquido das riparinas I e III em sangue
Para análise das riparinas I e III em sangue de ratos, inicialmente, o “pool”
de sangue previamente estocado a -20 ºC foi submetido ao descongelamento à
temperatura ambiente.
Uma alíquota de 240 μL de sangue foi transferida para tubos eppendorfs, em
triplicata. Em seguida, adicionou-se 30 μL das soluções-estoque de riparinas I e III
(1 mg/mL) para obtenção da concentração final de 100 μg/mL de cada riparina e
para um volume final de 300 μL. As amostras foram homogeneizadas em agitador
do tipo vortex durante 30 segundos, submetidas à extração com 600 μL de solvente
orgânico (metanol ou acetonitrila) e homogeneizadas em vortex durante 60
segundos. A acetonitrila e o metanol foram escolhidos como solventes orgânicos e
suas eficiências na recuperação da riparina I foram comparadas (PIAO e al., 2008).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
92
As amostras foram centrifugadas a 4 ºC a três diferentes rotações (10.000,
12.000 e 14.000 x g) e para cada rotação foram analisados três tempos (10, 15 e 20
minutos). Após a centrifugação, 600 μL do sobrenadante foram transferidos para
outro tubo e submetidos ao processo de secagem sob pressão reduzida e a uma
temperatura controlada de 40 ºC durante 12 horas. O resíduo foi reconstituído com
300 μL de fase móvel (50:50 | H
2
O:MeCN) e homogeneizado durante 30 segundos.
As amostras foram transferidas para microvials e volumes de 20 µL foram injetados,
em duplicata, no sistema CLAE-UV/Vis e analisadas no comprimento de onda de
225 nm (Figura 34, p. 93).
O mesmo procedimento foi realizado para as amostras de sangue isentas
das riparinas I e III (amostra-branco) e amostras em solução (50:50 | H
2
O:MeCN) de
riparinas I e III (100 µg/mL) para avaliação do Efeito de Matriz (EM). Além disso, foi
preparada uma solução (50:50 | H
2
O:MeCN) das riparinas I e III na concentração de
100 µg/mL que não passou pelo processo de extração e secagem (amostra-controle)
para avaliação da recuperação em relação ao método de extração (RE) (Figura 34,
p. 93).
Todos esses procedimentos foram repetidos para as amostras de sangue de
ratas.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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93
Figura 34. Processo de extração líquido-líquido das riparinas I e III em solução e em sangue de
ratos e ratas
“pool” de sangue (EDTA)
Mantido a – 20 ºC
(50:50 ι H
2
O:MeCN)
800 µL de solução (50:50 | H
2
O:MeCN)
100 µL de rip-III
100 µL de rip-I
Solução-estoque: Rip-I e Rip-III
1 mg/mL (50:50 | H
2
O:MeCN)
Rip-I + Rip-III (100 µg/mL)
Amostra-controle
30 µL de rip-III (1 mg/mL)
30 µL de rip-I (1 mg/mL)
240 µL de solução
Vortex (t = 30s)
Adição de 600 µL
(MeCN ou MeOH)
Vortex (t = 60s)
t = 10/ 15/ 20 min
10.000/ 12.000/ 14.000 x g
Retirada de 600 µL ssb
(T = 40 ºC – 12 horas)
Secagem à vácuo
CLAE-UV/Vis
Resuspenso com 300 µL
(50:50 | H
2
O:MeCN)
30 µL de rip-III (1 mg/mL)
30 µL de rip-I (1 mg/mL)
240 µL de sangue
300 µL de sangue
Amostra-branco
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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94
V.2.2.3.4 Avaliação do efeito de matriz (EM)
Para avaliação do efeito de matriz, as áreas das amostras contendo o
padrão após extração em sangue (A) foram comparadas com as áreas das amostras
em solução que também passaram pelo processo de extração (B). A razão (B/A x
100) é definida como absoluto efeito de matriz (EM %). Um valor de 100% indica que
não há nenhum efeito de matriz (MATUSZEWSKI; CONSTANZER; CHAVEZ-ENG,
2003; VAN DE STEENE; LAMBERT, 2008).
V.2.2.3.5 Recuperação em relação ao processo de extração (RE)
A recuperação em relação ao processo de extração em solução pode ser
calculada comparando-se a área do pico da amostra que passou pelo processo de
extração (B) em relação à área do pico da amostra que não passou pelo processo
de extração (C) (MATAR, 2008; MATUSZEWSKI; CONSTANZER; CHAVEZ-ENG,
2003).
V.2.2.3.6 Eficiência do processo (EP)
A avaliação da eficiência do processo de extração foi determinada pela
equação EP = (EM x RE)/ 100 (MATAR, 2008; MATUSZEWSKI; CONSTANZER;
CHAVEZ-ENG, 2003).
V.2.2.3.7 Análise estatística
Os resultados deste estudo foram expressos como média ± erro padrão da
média (e.p.m.) da porcentagem de recuperação. As diferenças entre as médias
foram consideradas significantes quando p < 0,05. As análises estatísticas foram
realizadas utilizando ANOVA “one-way” com pós-teste de Bonferroni.
B
C
x 100
RE (%) =
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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95
V.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
V.3.1 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO CROMATOGRÁFICO PARA AS
RIPARINAS I E III
As análises cromatográficas das riparinas I e III separadamente e em
mistura utilizando (10:90 | H
2
O:MeCN) não se mostraram satisfatórias, havendo
coeluição dos picos das riparinas I e III com tempos de retenção muito baixos (3,38
e 3,35 minutos, respectivamente), devido à alta força eluotrópica da mistura (Figura
35, p. 96).
O desenvolvimento cromatográfico com (30:70 | H
2
O:MeCN) ainda exibiu
tempos de retenção muito próximos entre si (4,36 e 4,63 minutos), com uma baixa
resolução entre os picos (R
s
= 0,7) das riparinas I e III, permitindo uma alteração no
sistema eluente para uma concentração menor de solvente orgânico (Figura 36, p.
97).
A análise com (50:50 | H
2
O:MeCN) mostrou-se satisfatória, com boa
resolução (R
s
= 2,5) entre os picos das riparinas I e III, e tempos de retenção
relativamente baixos (8,30 e 10,51 minutos, respectivamente), permitindo realizar as
análises em um curto período de tempo de 12 minutos, sendo então o método de
escolha para as análises subsequentes (Figura 37, p. 98).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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96
Figura 35. Cromatogramas da riparina I (A), riparina III (B) e das riparinas I e III (C) em sistema
de eluição isocrática (10:90 | H
2
O:MeCN) a 225 nm
(A)
(B)
(C)
T
r
= 3,378 min
T
r
= 3,353 min
T
r
= 3,492 min
AREAP = 7389199
ASSM = 1,17
AREAP = 1811254
ASSM = 1,11
AREAP = 3529556
ASSM = 1,41
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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97
Figura 36. Cromatogramas da riparina I (A), riparina III (B) e das riparinas I e III (C) em sistema
de eluição isocrática (30:70 | H
2
O:MeCN) a 225 nm
(A)
(B)
(C)
T
r
= 4,364 min
T
r
= 4,625 min
T
r
= 4,431 min
T
r
= 4,752 min
1
2
AREAP = 7275618
ASSM = 1,37
AREAP = 1753419
ASSM = 1,38
AREAP = 1618888
ASSM = 1,31
AREAP = 1660228
ASSM = 1,37
Pico 1 (Riparina I)
Pico 2 (Riparina III)
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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98
Figura 37. Cromatogramas da riparina I (A), riparina III (B) e das riparinas I e III (C) em sistema
de eluição isocrática a (50:50 | H
2
O:MeCN) a 225 nm
1
(A)
(B)
(C)
T
r
= 8,304 min
T
r
= 10,512 min
T
r
= 8,190 min
T
r
= 10,791 min
2
AREAP = 7787309
ASSM = 1,13
AREAP = 1712524
ASSM = 1,09
AREAP= 1844720
ASSM = 1,18
Pico 1 (Riparina I)
AREAP = 1801311
ASSM = 1,20
Pico 2 (Riparina III)
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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99
V.3.2 EXTRAÇÃO E RECUPERAÇÃO DA RIPARINA I EM SANGUE
As estratégias de extração de fármacos dependem da natureza da matriz
biológica e das propriedades físico-químicas do analito em particular.
Quando se extrai analitos de amostras de sangue, é assumido que a matriz
requer algum grau de pré-tratamento devido à ligação das drogas com proteínas
plasmáticas, como a albumina, α-glicoproteína ácida, lipoproteínas e γ-globulinas
(AERTS; HOGENBOOM; BRINKMAN, 1995; NASCIMENTO et al., 2009).
Na extração líquido-líquido (ELL), o uso de procedimentos de múltiplas
etapas envolvendo extração e re-extração em fase orgânica e aquosa com o
controle apropriado do pH e da concentração iônica, podem extrair um analito
seletivamente da matriz biológica, bem como reduzir a quantidade de interferentes e
contaminantes no extrato final (SNYDER; KIRKLAND; GLAJEH, 1997).
Por ser considerada uma técnica de extração relativamente simples, versátil
e de baixo custo, quando comparada à extração em fase sólida, a ELL foi escolhida
para a análise da riparina I em amostras complexas de sangue de ratos e ratas.
O parâmetro de recuperação é fundamental para avaliar a eficiência do
método de extração. Os procedimentos de preparação das amostras levam a perdas
do analito devido à extração incompleta, adsorção, perda de volume ou
coprecipitação. Raramente o fármaco pode ser completamente recuperado da matriz
biológica, porém essa perda pode ser minimizada pela otimização do processo de
extração (PENG; CHIOU, 1990).
Como um dos fatores que influenciam a ELL é o tipo de solvente orgânico
extrator, optou-se por avaliar dois solventes, o metanol e a acetonitrila, para
comparação dos valores de recuperação da riparina I em sangue.
Além disso, devido à influência da aceleração e do tempo de centrifugação
em relação à precipitação de proteínas, decidiu-se avaliar três acelerações de
rotação (10.000, 12.000 e 14.000 x g) e para cada rotação verificou-se três tempos
de centrifugação (10, 15 e 20 minutos).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
100
V.3.2.1 Efeito do sexo do animal na extração e recuperação da riparina I
Os dados obtidos em relação à porcentagem de recuperação média da
riparina I foram agrupados de acordo com o tipo de sangue utilizado (quanto ao
sexo) e os resultados foram expressos no Gráfico 1 (p. 101).
Foi observado que o grupo SGRO (sangue de ratos contaminado com
riparina I que passou pelo processo de extração) obteve uma média de recuperação
de 65,44% e que o mesmo apresentou diferença significativa (p < 0,0001) em
relação ao grupo SRO (solução de riparina I que passou pelo processo de extração)
que apresentou uma média de recuperação de 83,66% (Gráfico 1, p. 101).
O grupo SGRA (sangue de ratas contaminado com riparina I que passou
pelo processo de extração) apresentou uma média de recuperação de 74,26%, valor
este significativo (p < 0,001), quando comparado à recuperação média de 93,96% do
grupo SRA (solução de riparina I que passou pelo processo de extração) (Gráfico 1,
p. 101).
A recuperação da riparina I em sangue de ratas foi significativamente maior
(74,26%), quando comparada à recuperação em sangue de ratos (65,44%). Apesar
de uma porcentagem de recuperação maior, os valores obtidos apresentaram uma
maior dispersão (CV = 0,34) em relação aos valores obtidos em sangue de ratos
(CV = 0,33) (Tabela 4, p. 101).
O grupo controle CQ (solução que não passou pelo processo de extração e
secagem) apresentou uma recuperação média de 98,88% (Tabela 4, p. 101), valor
este significativo apenas quando comparado ao grupo SRO.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
101
0
25
50
75
100
125
***
***
SGRO
SRO
SGRA
SRA
**
sexo do animal
Recuperação (%)
Gráfico 1. Recuperação média da riparina I em amostras de solução e sangue de ratos (SRO e
SGRO, barras em azul) e ratas (SRA e SGRA, barras em vermelho) que passaram pelo
processo de extração. ANOVA “one-way” seguido de Bonferroni,
**
p < 0,01;
***
p < 0,001
Tabela 4. Valores de recuperação média, desvio padrão e coeficiente de variação da riparina I
em amostras de solução e sangue de ratos e ratas que passaram pelo processo de extração e
solução-controle
SGRO
SRO
SGRA
SRA
CQ
Média (%)
65,44
83,66
74,26
93,97
98,88
Desvio padrão
21,28
15,78
25,02
10,70
11,68
CV (%)
0,33
0,19
0,34
0,11
0,12
V.3.2.2 Efeito do solvente orgânico na extração e recuperação da riparina I
Os dados obtidos em relação à porcentagem de recuperação média da
riparina I foram agrupados segundo o tipo de solvente utilizado para precipitação das
macromoléculas e células do sangue e separados pelo tipo de sangue em relação
ao sexo do animal. Os resultados foram expressos no Gráfico 2 (A – ratos e B –
ratas, p. 103).
Em relação aos resultados utilizando sangue de ratos, foi observado que o
grupo SGOH (sangue contaminado com riparina I que passou pelo processo de
extração utilizando metanol como solvente precipitante) obteve uma recuperação
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
102
média de 53,89%, e que o mesmo apresentou diferença significativa (p < 0,001) em
relação ao grupo SOH (solução de riparina I que passou pelo processo de extração
utilizando metanol como solvente) que apresentou uma recuperação média de
81,26% (Gráfico 2A, p. 103).
Para o grupo SGCN (sangue contaminado com riparina I que passou pelo
processo de extração utilizando acetonitrila como solvente precipitante), a
recuperação média foi de 77,04%, valor este não significativamente diferente
quando comparado ao grupo SCN (solução de riparina I que passou pelo processo
de extração utilizando acetonitrila como solvente) que apresentou uma recuperação
de 84,46% (Gráfico 2A, p. 103).
A recuperação da riparina I em sangue de ratos foi significativamente maior
(p < 0,001) quando se utilizou a acetonitrila como solvente precipitante (77,04%),
além de apresentarem valores mais homogêneos (CV = 0,26), quando comparados
aos valores de recuperação utilizando o metanol (CV = 0,33) (Tabela 5, p. 103).
Em relação aos resultados utilizando sangue de ratas, foi observado que o
grupo SGOH obteve uma recuperação média de 51,89%, e que o mesmo
apresentou diferença significativa (p < 0,001) quando comparado ao grupo SOH, que
obteve uma recuperação média de 92,75%. Para o grupo SGCN, a recuperação foi
de 98,00%, valor este não significativamente diferente quando comparado ao grupo
SCN (Gráfico 2B, p. 103).
A recuperação da riparina I em sangue de ratas foi significativamente maior
(p < 0,001) quando se utilizou a a acetonitrila como solvente precipitante (98,00%),
além de apresentarem valores mais homogêneos (CV = 0,06), quando comparados
aos valores de recuperação de 51,89% utilizando o metanol (CV = 0,24) (Tabela 5,
p. 103).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
103
0
25
50
75
100
125
***
SGOH
SOH
SGCN
SCN
**
solvente orgânico
Recuperação (%)
0
25
50
75
100
125
***
SGOH
SOH
SGCN
SCN
***
solvente orgânico
Recuperação (%)
Gráfico 2. Recuperação média da riparina I em amostras de solução (SOH e SCN) e sangue
(SGOH e SGCN) de ratos (A) e ratas (B), em relação ao tipo de solvente orgânico precipitante
(metanol/ acetonitrila). ANOVA “one-way” seguido de Bonferroni,
**
p < 0,01;
***
p < 0,001
Tabela 5. Valores de recuperação média, desvio padrão e coeficiente de variação da riparina I
em amostras de solução e sangue de ratos e ratas, utilizando metanol/ acetonitrila como
solvente orgânico para precipitação de proteínas, e solução-controle
RATOS
SGOH
SOH
SGCN
SCN
CQ
Média (%)
53,89
81,28
77,04
84,46
96,11
Desvio padrão
17,73
17,28
19,95
13,51
14,86
CV (%)
0,33
0,21
0,26
0,16
0,15
RATAS
SGOH
SOH
SGCN
SCN
CQ
Média (%)
51,89
92,75
98,00
94,37
101,65
Desvio padrão
12,48
10,37
6,24
10,91
6,94
CV (%)
0,24
0,11
0,06
0,12
0,07
(A)
(B)
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
104
V.3.2.3 Efeito da aceleração da rotação na extração e recuperação da riparina I
Os dados obtidos em relação à porcentagem de recuperação média da
riparina I foram agrupados de acordo com o grau de aceleração da rotação utilizado
para precipitação das proteínas e separados pelo tipo de sangue em relação ao
sexo do animal. Os resultados foram expressos no Gráfico 3 (A – ratos e B – ratas,
p. 105).
Em relação aos resultados utilizando sangue de ratos, foi observado que o
grupo SG10K (sangue contaminado com riparina I centrifugado a 10.000 x g que
passou pelo processo de extração) apresentou recuperação média de 70,99%,
significativamente diferente (p < 0,05) do grupo S10K (solução de riparina I
centrifugada a 10.000 x g que passou pelo processo de extração) que obteve valor
de 85,14% (Gráfico 3A, p. 105).
Para o grupo SG12K (sangue contaminado com riparina I centrifugado a
12.000 x g que passou pelo processo de extração) o valor foi médio de recuperação
foi de 58,93%, significativamente diferente (p < 0,05) do valor de recuperação de
73,00% do grupo S12K (solução de riparina I centrifugada a 12.000 x g que passou
pelo processo de extração) (Grafico 3A, p. 105).
Para o grupo SG14K (sangue contaminado com riparina I centrifugado a
14.000 x g que passou pelo processo de extração), a recuperação média foi de
66,39%, significativamente diferente (p < 0,001) do grupo S14K (solução de riparina I
centrifugada a 14.000 x g que passou pelo processo de extração) que obteve um
valor médio de recuperação de 92,84% (Grafico 3A, p. 105).
Em relação ao estudo realizado com sangue de ratas, o grupo SG10K
obteve um valor de recuperação médio de 80,37%, valor este significativamente
diferente (p < 0,01) do grupo S10K, o qual obteve valor de 95,48%. Para o grupo
SG12K, a recuperação média da riparina I foi de 70,67%, significativamente
diferente (p < 0,001) do valor de 89,60% do grupo S12K. Para o grupo SG14K, o
valor observado foi de 71,73%, significativamente diferente (p < 0,001) do grupo
S14K que obteve um valor de recuperação médio de 96,82% (Gráfico 3B, p. 105).
A recuperação da riparina I, tanto em sangue de ratos, como de ratas, não
teve influência da aceleração da rotação, uma vez que não houve diferença
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
105
significativa ao comparar as amostras em sangue centrifugadas a diferentes
acelerações de rotação.
0
25
50
75
100
125
*
*
***
SG10K
S10K
SG12K
S12K
SG14K
S14K
aceleração centrífuga
Recuperação (%)
0
25
50
75
100
125
**
***
***
SG10K
S10K
SG12K
S12K
SG14K
S14K
aceleração centrífuga
Recuperação (%)
Gráfico 3. Recuperação média da riparina I em amostras de solução (S10K, S12K e S14K) e
sangue (SG10K, SG12K e SG14K) de ratos (A) e ratas (B) em relação à aceleração centrífuga.
ANOVA “one-way” seguido de Bonferroni,
*
p < 0,05;
***
p < 0,001
V.3.2.4 Efeito do tempo de centrifugação na extração e recuperação da
riparina I
Os dados obtidos em relação à porcentagem de recuperação média da
riparina I foram agrupados de acordo com o tempo de centrifugação utilizado para
(A)
(B)
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
106
precipitação das proteínas plasmáticas e separados pelo tipo de sangue em relação
ao sexo do animal. Os resultados foram expressos no Gráfico 4 (A – ratos e B –
ratas, p. 107).
Em relação ao estudo utilizando sangue de ratos, foi observado que o grupo
SG10M (sangue contaminado com riparina I centrifugado durante 10 minutos e que
passou pelo processo de extração) obteve valor médio de recuperação de 65,22%,
significativamente diferente (p < 0,001) do grupo S10M (solução de riparina I
centrifugada durante 10 minutos e que passou pelo processo de extração), o qual
obteve uma recuperação média de 85,97% (Gráfico 4A, p. 107).
Para o grupo SG15M (sangue contaminado com riparina I centrifugado
durante 15 minutos e que passou pelo processo de extração), a recuperação média
obtida foi de 64,66%, significativamente diferente (p < 0,05) quando comparada à
recuperação de 78,37% do grupo S15M (solução de riparina I centrifugada durante
15 minutos e que passou pelo processo de extração) (Gráfico 4A, p. 107).
Para o grupo SG20M (sangue contaminado com riparina I centrifugado
durante 20 minutos e que passou pelo processo de extração), a recuperação média
foi de 66,43%, com diferença significativa (p < 0,001) quando comparada à
recuperação de 86,65% do grupo S20M (solução de riparina I centrifugada durante
20 minutos e que passou pelo processo de extração) (Gráfico 4A, p. 107).
Em relação aos resultados obtidos utilizando sangue de ratas, verificou-se
que o grupo SG10M obteve um valor médio de recuperação de 77,18%,
significativamente diferente (p < 0,001) do valor de 95,42% do grupo S10M (Gráfico
4B, p. 107).
O grupo SG15M apresentou valor médio de recuperação de 73,20%,
significativamente diferente (p < 0,001) quando comparado ao valor de 97,61% do
grupo S15M. Para o grupo SG20M, foi obtido um valor médio de recuperação de
72,39%, o qual teve diferença significativa (p < 0,01) com o grupo S20M que obteve
valor de 88,87% (Gráfico 4B, p. 107).
A recuperação da riparina I, tanto em sangue de ratos, como de ratas, não
teve influência do tempo de centrifugação, uma vez que não houve diferença
significativa ao comparar as amostras em sangue centrifugadas em diferentes
tempos.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
107
0
25
50
75
100
125
***
*
***
SG10M
S10M
SG15M
S15M
SG20M
S20M
Tempo de centrifugação
Recuperação (%)
0
25
50
75
100
125
***
***
**
SG10M
S10M
SG15M
S15M
SG20M
S20M
Tempo de centrifugação
Recuperação (%)
Gráfico 4. Recuperação média da riparina I em amostras de solução (S10M, S15M e S20M) e
sangue (SG10M, SG15M e SG20M) de ratos (A) e ratas (B) em relação ao tempo de
centrifugação. ANOVA “one-way” seguido de Bonferroni, *
p < 0,05; **
p < 0,01; *** p < 0,001
V.3.3 EFEITO DE MATRIZ
A riparina I, apesar de ter apresentado uma recuperação média menor em
sangue de ratos, quando comparada à recuperação em sangue de ratas, apresentou
um coeficiente de variação menor, indicando uma maior homogeneidade nos
valores. Além disso, foi verificado durante os experimentos, que o volume de sangue
de ratos coletado é maior do que o de ratas, sendo assim, escolheu-se dar
continuidade ao estudo com sangue de ratos.
Nos resultados anteriores, foi observado que as variáveis “sexo do animal” e
“solvente orgânico” apresentaram diferenças significativas quando comparadas
(A)
(B)
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
108
dentro de seus grupos, diferentemente das variáveis aceleração e tempo de rotação.
Dessa forma, foram agrupados os valores de recuperação da riparina I em sangue
de ratos em que se utilizou a acetonitrila como solvente orgânico em relação à
aceleração e ao tempo de centrifugação, e com isso foi possível definir o melhor
método para a recuperação da riparina I (Gráfico 5, p. 108).
0
25
50
75
100
125
SGCN-10k-10min
SGCN-10k-15min
SGCN-10k-20min
SGCN-12k-10min
SGCN-12k-15min
SGCN-12k-20min
SGCN-14k-10min
SGCN-14k-15min
SGCN-14k-20min
grupos de análise
Recuperação (%)
Gráfico 5. Recuperação média da riparina I em amostras de sangue de ratos utilizando
acetonitrila como solvente para precipitação de proteínas e centrifugadas a diferentes
acelerações de rotação (10.000 x g em barras azuis, 12.000 x g em barras vermelhas e
14.000 x g em barras verdes) em diferentes tempos (10, 15 e 20 minutos). ANOVA “one-way”
seguido de Bonferroni
Foi observado que os dois grupos: SGCN-10K-15min (sangue de ratos que
passou pelo processo de extração utilizando a acetonitrila como solvente
precipitante e centrifugado a 10.000 x g durante 15 minutos) e SGCN-12K-20min
(sangue de ratos que passou pelo processo de extração utilizando a acetonitrila
como solvente precipitante e centrifugado a 12.000 x g durante 20 minutos) não
apresentaram diferença significativa entre eles, mas por apresentar o maior valor de
recuperação de 94,50% (Tabela 6, p. 109), o grupo SGCN-12K-20min foi escolhido
como sendo o melhor método para recuperação da riparina I (Figuras 38 e 39, p.
111 e 112).
O efeito de matriz em sangue foi calculado utilizando a equação
100
sangue em área
solução em área
EM%
, a partir dos valores do Gráfico 6 (p. 109), que
mostrou que não houve diferença significativa entre os grupos SGCN-12K-20min,
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
109
SCN-12K-20min (solução de riparina I que passou pelo processo de extração
utilizando a acetonitrila como solvente e centrifugada a 12.000 x g durante 20
minutos) e o grupo-controle (CQ).
Tabela 6. Comparação dos valores de recuperação média, desvio padrão e coeficiente de
variação da riparina I entre as amostras de sangue de ratos centrifugadas a 10.000 x g durante
15 minutos e 12.000 x g durante 20 minutos, ambas utilizando acetonitrila como solvente
orgânico para precipitação de proteínas
Ratos
SGCN-10K-15min
SGCN-12K-20min
Média (%)
92,70
94,50
Desvio padrão
3,41
3,49
CV (%)
0,04
0,04
0
25
50
75
100
125
Branco
SGCN-12K-20min
SCN-12K-20min
CQ
método de extração
Recuperação (%)
Gráfico 6. Recuperação média da riparina I em amostra de sangue de ratos (SGCN-12K-20min)
e em solução (SCN-12K-20min) que passaram pelo processo de extração a 12.000 x g durante
20 minutos e solução-controle (CQ, barra em branco), para observação do efeito de matriz e da
eficiência do método de extração. ANOVA “one-way” seguido de Bonferroni
No cálculo do efeito de matriz, foi observada uma recuperação média de
100,64%, sugerindo que não há efeito de matriz da riparina I em sangue. Esta
observação foi importante para dar prosseguimento à validação do método
bioanalítico.
A recuperação em relação ao processo de extração apresentou uma
recuperação média da riparina I de 106,22%, comprovando que o processo é
adequado para recuperação. A eficiência do processo de extração desenvolvido foi
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
110
de 106,89%, sugerindo, então, que o processo de extração é eficiente na obtenção
de 100% da riparina I.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
111
Figura 38. Cromatogramas a 225 nm da amostra de sangue de ratos isenta de riparinas
(amostra-branco) (A) e da amostra de sangue de ratos a 100 μg/mL das riparinas I e III
centrifugada a 12.000 x g durante 20 minutos (B)
(A)
(B)
1
2
Pico 1 (Riparina I)
Pico 2 (Riparina III)
T
r
= 7,886 min
AREAP = 7298683
ASSM = 1,13
T
r
= 9,998 min
AREAP = 5727860
ASSM = 0,99
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
112
Figura 39. Cromatogramas a 225 nm da amostra em solução a 100 μg/mL das riparinas I e III
centrifugada a 12.000 x g durante 20 minutos (C) e da amostra em solução a 100 μg/mL das
riparinas I e III que não passou pelo processo de extração (D)
(C)
(D)
1
2
1
2
Pico 1 (Riparina I)
Pico 2 (Riparina III)
T
r
= 7,898min
AREAP = 5384111
ASSM = 1,18
T
r
= 10,032 min
ASSM = 1,11
AREAP = 5734182
Pico 1 (Riparina I)
Pico 2 (Riparina III)
T
r
= 7,943 min
ÁREAP = 6496638
ASSM = 1,22
T
r
= 10,094 min
ÁREAP = 8475942
ASSM = 1,17
CAPÍTULO VI
Validação do método bioanalítico
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
114
VI.1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A necessidade de se mostrar a qualidade das análises químicas está sendo
cada vez mais reconhecida e exigida, pois dados analíticos não confiáveis podem
conduzir a decisões desastrosas e a prejuízos financeiros irrecuperáveis (RIBANI et
al., 2004). Para garantir que um método analítico gere informações confiáveis e
interpretáveis sobre a amostra testada, ele deve ser submetido a uma avaliação
denominada validação (LIMA et al., 2006).
O objetivo de uma validação é demonstrar que o método é apropriado para a
finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou
quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos (RANDAU
et al., 2005).
A validação de métodos é um aspecto vital da garantia da qualidade
analítica. Os métodos de ensaios utilizados para avaliar a conformidade de produtos
farmacêuticos com especificações estabelecidas devem atingir padrões adequados
de exatidão, precisão e confiabilidade (SILVA et al., 2006; ALENCAR et al.,2004).
A validação de métodos para quantificação de fármacos é normatizada pela
Resolução RE nº 899 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA),
publicada no Diário Oficial da União em 29 de maio de 2003, que determina a
publicação do “Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos” (BRASIL,
2003).
De acordo com esta resolução, a validação deve garantir, por meio de
estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações
analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar
precisão, exatidão, linearidade, limites de detecção e quantificação, especificidade,
reprodutibilidade, estabilidade e recuperação adequados à análise (BRASIL, 2003).
VI.1.1 SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE
A seletividade de um método bioanalítico é um importante parâmetro a ser
avaliado para garantir que a quantificação do analito de interesse não seja afetada
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
115
pela presença de metabólitos, produtos de degradação, fármacos co-administrados
ou compostos endógenos (BANSAL; DeSTEFANO, 2007; HARTMANN et al., 1998).
A habilidade que o método analítico possui de diferenciar e quantificar o
analito na presença de outros componentes da amostra é definida como
seletividade, enquanto que a especificidade se baseia na habilidade que um
determinado método apresenta em responder a uma única substância de interesse
dentre outras presentes na amostra (CASSIANO et al., 2009).
A ANVISA recomenda que sejam realizados testes em amostra de matriz
biológica obtidas de seis indivíduos, sendo quatro amostras normais, uma lipêmica e
uma hemolisada, sob condições controladas referentes ao tempo, alimentação e
outros fatores importantes para o estudo em relação a humanos. Cada amostra-
branco deve ser testada utilizando o procedimento e as condições cromatográficas
propostas (BRASIL, 2003).
Em métodos cromatográficos, deve-se tomar precauções necessárias para
garantir a pureza dos picos cromatográficos. A utilização de testes de pureza de pico
(por exemplo, com auxílio do detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de
massas) é interessante para demonstrar que o pico cromatográfico é atribuído a um
só componente (BRASIL, 2003).
Uma vez definidos e minimizados os interferentes provenientes de
metabólitos e produtos de degradação durante o desenvolvimento do método
bioanalítico, a etapa seguinte consiste em avaliar a presença de substâncias não
monitoradas e que são provenientes da matriz biológica, afetando a detecção do
analito de interesse, o qual é conhecido como efeito de matriz (BANSAL;
DeSTEFANO, 2007; DADGAR; BURNETT, 1995).
VI.1.2 LINEARIDADE
A linearidade corresponde à capacidade de uma metodologia analítica de
demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração
do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado (BRASIL, 2003).
De acordo com Resolução RE nº 899/2003, para métodos bioanalíticos,
recomenda-se que a linearidade seja determinada pela análise de, no mínimo, seis
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
116
concentrações diferentes. Os resultados dos testes deverão ser tratados por
métodos estatísticos apropriados como o cálculo de regressão linear pelo método
dos mínimos quadrados (BRASIL, 2003).
As concentrações estabelecidas devem contemplar o intervalo de variação
esperado, desde o limite de quantificação (LQ) até 120% da máxima concentração
que se pretende analisar. Além disso, deve-se realizar análise da amostra-branco
(matriz biológica isenta do analito e do padrão interno) e da amostra-zero (matriz
biológica adicionada do padrão interno) (BRASIL, 2003).
Os critérios para aceitação da curva de calibração seguem normas
estabelecidas por guias de validação publicados por agências reguladoras oficiais.
De acordo com as normas atualmente em vigor, se aceita um coeficiente de
variação menor ou igual a 20% em relação à concentração nominal para o LQ e
menor ou igual a 15% para as demais concentrações. Além disso, o coeficiente de
correlação linear (r
2
) deve ser igual ou superior a 0,98 (BRASIL, 2003).
Pode-se optar por três diferentes tipos de padronização para a construção
da curva de calibração. Isto é feito de acordo com o tipo de análise e do tratamento
utilizado para a amostra. O método de padronização escolhido deve fornecer a
melhor exatidão possível, além de um alto nível de precisão (RIBANI et al., 2004).
A quantificação do composto de interesse em validação pode ser obtida por
meio dos seguintes métodos: padronização externa, padronização interna e
padronização por adição de padrão (CASSIANO et al., 2009).
VI.1.2.1 Padronização externa
A padronização externa é utilizada para amostras que não precisam de um
extenso pré-tratamento. Os padrões de calibração são obtidos pela adição de
concentrações conhecidas do analito na matriz. Ao ser aplicado para análises de
amostras desconhecidas, esse método compara a área do pico do analito a ser
quantificado com as áreas obtidas a partir dos padrões de calibração (através do
gráfico de concentração versus resposta ou pela equação da curva resultante)
(CASS et al., 2003; CASS; GALATTI, 2008; CASSIANO et al., 2009; CUADROS-
RODRÍGUEZ et al., 2001).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
117
Este método é sensível a erros de preparo das amostras e dos padrões de
injeção das soluções-padrão e por isso deve ser feito a cada análise (RIBANI et al.,
2004).
VI.1.2.2 Padronização interna
A padronização interna consiste na preparação dos padrões de calibração
contendo diferentes concentrações do analito, nos quais se adiciona uma
concentração fixa do padrão interno. Este método permite avaliar a variação da
resposta em função de manipulações da amostra (por exemplo, concentração,
extração e preparo da amostra), sendo o método de escolha para análises em
matrizes biológicas, quando não se trabalha com injeção direta de amostras
(CASSIANO et al., 2009; CUADROS-RODRÍGUEZ et al., 2001).
O modelo de regressão e o gráfico são elaborados pela relação entre a
razão das áreas (área do analito/ área do padrão interno) com as concentrações do
analito. Na aplicação do método, as amostras desconhecidas são analisadas após a
adição da mesma quantidade do padrão interno (CASSIANO et al., 2009;
CUADROS-RODRÍGUEZ et al., 2001).
Idealmente, a substância utilizada como padrão interno deve ser similar ao
analito a ser quantificado, terem tempos de retenção próximos e não reagir com o
analito ou outro componente da matriz, não fazer parte da amostra e, quando
cromatografada, ter uma boa resolução entre as demais substâncias presentes na
amostra. O método de padronização interna é extremamente útil, especialmente
pelo fato de que independe de pequenas mudanças em variáveis experimentais,
como temperatura da coluna e tamanho da amostra (CUADROS-RODRÍGUEZ et al.,
2001; RIBANI et al., 2004).
VI.1.2.3 Padronização por adição de padrão
A padronização por adição de padrão é o método utilizado nas seguintes
situações: quando não é possível obter a matriz isenta do analito; em matrizes muito
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
118
complexas; quando há fortes interações entre o analito e a matriz e quando é difícil
encontrar um padrão interno adequado (RIBANI et al., 2004).
Este método consiste na adição de diferentes concentrações do analito à
matriz, que já contém uma quantidade desconhecida do mesmo, sendo a adição
feita antes do processo de tratamento da amostra. A concentração do analito na
matriz biológica é determinada pela extrapolação da reta, definida pelas demais
concentrações analisadas (RIBANI et al., 2004; ELLISON; THOMPSON, 2008).
Entre os métodos de quantificação, a padronização interna é a que possui
maior capacidade de eliminar erros técnicos, melhorando a precisão e a exatidão do
método aplicado na quantificação, e considerando que, em geral, os métodos
bioanalíticos utilizam etapas de tratamento com significativa manipulação da
amostra (extração, diluição, centrifugação, concentração, dentre outros), utiliza-se
na maioria das vezes a padronização interna para quantificação dos fármacos em
fluidos biológicos.
VI.1.3 PRECISÃO E EXATIDÃO
A precisão e a exatidão determinam os erros de uma medida analítica e são
os principais critérios utilizados para julgar a qualidade de um método bioanalítico
(CASSIANO et al., 2009).
VI.1.3.1 Precisão
A precisão de um método bioanalítico é a medida dos erros aleatórios e
representa a proximidade dos resultados obtidos a partir de medidas independentes
de amostragens múltiplas de uma amostra homogênea. É considerada em três
níveis: repetibilidade (precisão intra-corrida), precisão intermediária (precisão inter-
corridas) e reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial) (BRASIL, 2003).
A repetibilidade define a precisão do método em repetir, em um curto
intervalo de tempo, os resultados obtidos nas mesmas condições de análise, ou
seja, com o mesmo analista e a mesma instrumentação. A precisão intermediária
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
119
define a habilidade do método em fornecer os mesmos resultados quando as
análises são conduzidas no mesmo laboratório, mas em diferentes dias, por
analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes (BRASIL, 2003; CASSIANO et al.,
2009).
A repetibilidade do método deve ser verificada utilizando-se, no mínimo, três
concentrações (baixa, média e alta), contemplando o intervalo linear do método,
realizando-se, no mínimo, cinco determinações por concentração. A precisão deve
ser determinada em uma mesma corrida (precisão intra-corrida) e em corridas
diferentes (precisão inter-corridas), e pode ser expressa como desvio padrão relativo
(DPR), ou coeficiente de variação (CV), não se admitindo valores superiores a 15%
(BRASIL, 2003).
Em que, DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada.
VI.1.3.2 Exatidão
A exatidão representa o grau de concordância entre os resultados individuais
encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como
verdadeiro. Deve ser determinada em uma mesma corrida (exatidão intra-corrida) e
em corridas diferentes (exatidão inter-corridas), utilizando-se, no mínimo, três
concentrações (baixa, média e alta), contemplando o intervalo linear do método,
realizando-se, no mínimo, cinco determinações por concentração (BRASIL, 2003).
Pode ser expressa pela relação entre a concentração média determinada
experimentalmente e a concentração teórica correspondente, não devendo o desvio
exceder 15% (BRASIL, 2003).
concentração média experimental
concentração teórica
Exatidão =
x 100
DP
CMD
x 100
DPR =
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
120
VI.1.4 LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO
O limite de detecção (LD) representa a menor quantidade do analito que
pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, nas condições
experimentais estabelecidas. Recomenda-se que o LD seja com base na relação de
duas a três vezes superior ao ruído da linha de base (BRASIL, 2003).
O limite de quantificação (LQ) representa a menor quantidade do analito em
uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as
condições experimentais estabelecidas. O limite de quantificação é determinado por
meio da análise de matriz biológica contendo concentrações decrescentes do
fármaco até o menor nível determinável com precisão e exatidão aceitáveis, como
também, utilizando-se a razão de 5:1 entre o sinal e o ruído da linha de base. O pico
de resposta do fármaco no LQ deve ser identificável e reproduzível com precisão de
20% e exatidão de 80-120%, através da análise de, no mínimo, cinco amostras de
padrões (BRASIL, 2003).
VI.1.5 RECUPERAÇÃO
A recuperação mede a eficiência do procedimento de extração de um
método analítico dentro de um limite de variação. Porcentagens de recuperação do
analito e do padrão interno próximos a 100% são desejáveis, porém, admitem-se
valores menores, desde que a recuperação seja precisa e exata (BRASIL, 2003).
Para a avaliação da recuperação, comparam-se os resultados analíticos de
amostras extraídas a partir de três concentrações (baixa, média e alta),
contemplando a faixa de linearidade do método, com os resultados obtidos com
soluções-padrão não extraídas, que representam 100% de recuperação. É aceito
uma variação de até 15% do valor de recuperação determinado para os analitos de
interesse (BRASIL, 2003; CASSIANO et al., 2009).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
121
VI.1.6 ROBUSTEZ
A robustez de um método analítico mede sua susceptibilidade frente a
pequenas variações que podem ocorrer durante as análises de rotina. Os testes de
robustez são de fundamental importância para que os analistas conheçam quais
fatores devem ser estritamente controlados durante a execução de um método
(CASSIANO et al., 2009).
Para examinar as causas de variabilidade dos resultados, vários fatores
devem ser avaliados, tais como: pH, força iônica e quantidade do solvente orgânico
da fase móvel, temperatura da coluna, vazão da fase móvel, diferentes colunas
(diferentes lotes e/ou fabricantes) e procedimentos envolvidos no preparo das
amostras. Se as alterações das condições de análise produzirem resultados dentro
dos limites aceitáveis de seletividade, exatidão e precisão, o método pode ser
considerado robusto e tais variações podem ser incorporadas ao procedimento
(RIBANI et al., 2004).
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Karine Formiga Queiroga
122
VI.2 MATERIAL E MÉTODOS
VI.2.1 MATERIAL
VI.2.1.1 Padrões e reagentes
A riparina I e o padrão interno (N-(3,4-dimetoxifeniletil) benzamida), foram
cedidos pelo Dr. Stanley Juan Chávez Gutierrez do LTF-UFPB. Foi utilizada água
ultrapura tipo I (Elga Labwater Purelab Option-Q), metanol grau HPLC (TEDIA-USA)
e acetonitrila grau HPLC (TEDIA-USA).
VI.2.1.2 Parâmetros cromatográficos
As análises foram realizadas utilizando um sistema de cromatografia líquida
de alta eficiência SHIMADZU da série 10A vp, consistindo de uma bomba LC-10 AD
vp com válvula solenóide FCV-10AL vp, autoinjetor SIL-10AD vp, forno CTO-10AS
vp, degaseificador DGU-14h e detector SPD-10AV vp.
A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna analítica C18
(ACE) de 250 mm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e 5 µm de tamanho
de partícula e pré-coluna C18 com 4,6 mm de diâmetro interno e 5 µm de tamanho
de partícula. A fase móvel foi constituída de (35:65 | H
2
O:MeOH) com fluxo de
1 mL/min. A temperatura da coluna foi ajustada em 27 ºC e a temperatura no
autoinjetor foi controlada em 4 ºC. O volume de amostra injetado no sistema
cromatográfico foi de 40 µL e o comprimento de onda para análise no detector de
ultravioleta foi em 225 nm. As análises foram realizadas em 8 minutos e em
duplicata.
Para avaliação da seletividade do método foi utilizado o sistema de
cromatografia líquida de alta eficiência SHIMADZU da série 10A vp, constituído de
duas bombas LC-6AD, detector de arranjo de diodos SPD-M10A vp, módulo
controlador SCL-10A e injetor manual provido com um loop de amostra de 20 µL
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
123
(Rheodyne). Foram utilizadas as mesmas condições cromatográficas citadas
anteriormente, com exceção do volume de amostra que foi de 20 µL.
VI.2.2 MÉTODOS
VI.2.2.1 Preparação das soluções-estoque e soluções de trabalho
As soluções-estoque da riparina I e do padrão interno foram preparadas em
(50:50 | H
2
O:MeCN) nas concentrações de 1 mg/mL e armazenadas à temperatura
de -20 ºC.
A partir das soluções-estoque de 1 mg/mL, foram preparadas as soluções de
trabalho da riparina I nas concentrações de 20, 50, 100 e 200 µg/mL em
(50:50 | H
2
O:MeCN). Para o padrão interno, foi preparada uma solução de trabalho
na concentração de 300 µg/mL.
VI.2.2.2 Procedimento de extração em sangue
O procedimento empregado baseou-se no método de extração líquido-
líquido previamente desenvolvido no capítulo anterior. Às alíquotas de sangue foram
adicionadas 15 µL do padrão interno (a partir de uma solução de trabalho de
300 µg/mL para obtenção de uma concentração de 15 µg/mL) e diferentes
concentrações nominais de riparina I, totalizando um volume final de 300 µL. Após
agitação durante 30 segundos em vortex, adicionou-se 600 µL de acetonitrila e as
amostras foram novamente homogeneizadas durante 60 segundos. Em seguida, as
amostras foram centrifugadas sob refrigeração (4 ºC) a 12.000 x g durante
20 minutos e 600 µL do sobrenadante foram transferidos para tubos e evaporados
sob pressão reduzida a uma temperatura controlada de 40 ºC durante 12 horas.
Após secagem, as amostras foram reconstituídas com 200 µL de solução
(50:50 | H
2
O:MeCN) e 40 µL foram injetados no CLAE-UV/Vis em duplicata.
Além disso, foram preparadas amostras-branco (sangue isento de riparina I
e padrão interno) e amostras-zero (sangue adicionado do padrão interno).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
124
VI.2.2.3 Validação do método bioanalítico
Os ensaios para determinação dos parâmetros de validação foram
realizados de acordo com recomendações da legislação vigente na resolução RE
nº 899/2003 da ANVISA.
VI.2.2.3.1 Seletividade
A seletividade do método foi avaliada pela análise de seis amostras de
sangue, sendo quatro amostras de sangue normais, um lipêmico e um hemolisado.
Para obtenção do sangue hemolisado, este foi mantido em banho de
ultrassom durante 10 minutos.
Para obtenção do sangue lipêmico, quatro ratos foram submetidos a uma
dieta hiper calórica com chocolate branco (FACHIN et al., 2008) durante o período
de sete dias, com alimentação controlada e livre acesso à água.
Para todos os tipos de sangue, foram preparadas amostras na concentração
de 2 µg/mL da riparina I e 15 µg/mL do padrão interno.
VI.2.2.3.2 Linearidade
A linearidade do método foi avaliada por meio da análise de seis
concentrações da riparina I, sendo estas concentrações preparadas em triplicata e o
processo repetido durante três dias não consecutivos. Além disso, foram preparadas
amostras-zero e amostras-branco. O ensaio foi realizado de acordo com as
condições experimentais previamente estabelecidas. As razões das áreas da
riparina I pela área do PI (área riparina I/ área PI) foram plotadas em função das
concentrações da riparina I para o cálculo das equações de regressão linear e dos
coeficientes de correlação. A linearidade foi validada pelo valor do critério mínimo
aceitável do coeficiente de correlação devendo ser igual ou superior a 0,98.
As soluções de trabalho da riparina I e do PI foram adicionadas a alíquotas
de sangue para obtenção das concentrações determinadas na curva de calibração,
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
Karine Formiga Queiroga
125
com um volume final de 300 μL. As concentrações utilizadas foram de 0,2; 0,3; 0,5;
2; 4 e 7 µg/mL para a riparina I e o padrão interno foi utilizado sempre na
concentração de 15 µg/mL.
VI.2.2.3.3 Precisão/Exatidão
Para análise dos estudos de precisão e exatidão, as amostras foram
preparadas em três níveis de concentração: baixa (0,5 μg/mL), média (2 μg/mL) e
alta (7 μg/mL), em quintuplicata, sendo analisadas no mesmo dia (precisão e
exatidão intra-dia) e preparadas e analisadas em três dias não consecutivos
(precisão e exatidão inter-dias).
Foram preparadas também amostras nas concentrações de 0,2; 0,3; 0,5; 2;
4 e 7 µg/mL de riparina I para obtenção da curva de calibração.
As áreas dos picos nos cromatogramas foram relacionadas com as
concentrações nominais na curva de calibração, sendo assim, estabelecidas por
regressão linear as concentrações experimentais das amostras.
A precisão foi expressa pelo coeficiente de variação (CV) e a exatidão em
percentual (%) de desvio das concentrações médias observadas experimentalmente
em relação ao valor nominal.
VI.2.2.3.4 Recuperação
A recuperação (R) é o valor, expresso em porcentagem, da relação entre a
área obtida da análise cromatográfica de amostras submetidas ao procedimento de
extração, e a área obtida da análise cromatográfica de soluções não extraídas.
Para determinação da recuperação do método, as amostras foram
preparadas em triplicata em três níveis de concentração: baixa (0,5 μg/mL), média
área da amostra/ área do PI extraída
área da amostra/ área do PI não extraída
=
x 100
R
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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126
(2 μg/mL) e alta (7 μg/mL) de riparina I em sangue e em solução, durante três dias
não consecutivos.
A recuperação em relação ao método de extração foi avaliada quando as
áreas dos cromatogramas das amostras de sangue foram submetidas ao cálculo de
regressão linear proveniente da curva de calibração em sangue, obtendo-se as
concentrações experimentais, assim como as amostras de solução que passaram e
não passaram pelo processo de extração foram submetidas ao mesmo cálculo
proveniente da curva de calibração em solução. As concentrações das amostras
foram comparadas entre si para a obtenção da percentagem de recuperação do
método utilizado.
Para obtenção da curva de calibração em solução, foram preparadas
soluções nas concentrações de 0,2; 0,3; 0,5; 2; 4 e 7 µg/mL de riparina I e 15 µg/mL
do PI em (50:50 | H
2
O:MeCN) para um volume final de 1.000 µL.
VI.2.2.3.5 Limites de detecção e quantificação
Os limites de detecção e quantificação da riparina I foram estimados
utilizando a razão entre o sinal do pico e o ruído da linha de base de 3:1 e 5:1,
respectivamente, e segundo equações presentes na RE nº 899/2003 da ANVISA.
em que: DP
a
é o desvio padrão do intercepto com o eixo dos Y de, no
mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo concentrações do fármaco
próximas ao suposto limite de quantificação e, IC é a inclinação da curva de
calibração.
DP
a
x 3
IC
LD =
DP
a
x 10
IC
LQ =
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127
VI.2.2.3.6 Robustez
A robustez do método foi analisada para se determinar possíveis alterações
que podem ocorrer quando o método é transferido para outros laboratórios, quando
há variações nas proporções de fase móvel, variações na temperatura, variações no
fluxo da fase móvel e variações devido a analistas e equipamentos diferentes.
Foram avaliadas as alterações na concentração do metanol (± 5%), variação da
temperatura (± 3 ºC) e alteração no fluxo da fase móvel (± 0,2 mL/min) para as
amostras na concentração de 2 µg/mL de riparina I e 15 µg/mL do padrão interno.
VI.2.2.3.7 Análise estatística
Os resultados deste estudo foram expressos como média ± erro padrão da
média (e.p.m.). As diferenças entre as médias foram consideradas significantes
quando p < 0,05. As análises estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA “one-
way” com pós-teste de Bonferroni.
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128
VI.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
VI.3.1 SELETIVIDADE
O uso de detector de arranjo de diodos permitiu observar a pureza dos picos
cromatográficos para substâncias que absorvem radiação no intervalo de 190 a
800 nm e, portanto, detectar a presença de interferência em cada amostra de
sangue em diferentes comprimentos de onda.
A seletividade do método foi avaliada nos cromatogramas das amostras-
branco dos diferentes tipos de sangue, que mostraram a ausência de interferentes
endógenos nos tempos de retenção da riparina I e do padrão interno (Figura 40, p.
129).
A ausência de outros picos no cromatograma foi observada no comprimento
de onda de 225 nm, assim como no intervalo de 190 a 800 nm, no mesmo tempo de
retenção ou muito próximo, dos tempos de retenção da riparina I e do PI, quando os
analitos foram adicionados às amostras de sangue normal (Figura 41, p. 130),
sangue lipêmico (Figura 42, p. 131) e sangue hemolisado (Figura 43, p. 132).
A pureza do pico da riparina I foi avaliada e apresentou índices de pureza de
pico de 99,99% para o sangue normal, 100% para o sangue lipêmico e 100% para o
sangue hemolisado (Figuras 41, 42 e 43C, p. 130, 131 e 132).
Dessa forma, os experimentos demonstraram que o método foi seletivo
nessas condições, uma vez que os cromatogramas da amostra-branco e fortificados
com a riparina I e PI foram livres de picos interferentes na faixa de detecção dos
analitos, não sendo encontrada nenhuma coeluição significativa frente a compostos
endógenos.
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129
Figura 40. Cromatogramas a 225 nm das amostras de sangue-branco: sangue normal (A),
sangue lipêmico (B) e sangue hemolisado (C)
(A)
(B)
(C)
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130
Figura 41. Cromatogramas da amostra de riparina I (2 µg/mL) + PI (15 µg/mL) em sangue
normal (A e B) e perfil de pureza do pico cromatográfico da riparina I mostrando uma pureza
de 99,99% (C)
(C)
(A)
(B)
1
2
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
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131
Figura 42. Cromatogramas da amostra de riparina I (2 µg/mL) + PI (15 µg/mL) em sangue
lipêmico (A e B) e perfil de pureza do pico cromatográfico da riparina I mostrando uma pureza
de 100% (C)
(A)
(B)
(C)
1
2
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
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132
Figura 43. Cromatogramas da amostra de riparina I (2 µg/mL) + PI (15 µg/mL) em sangue
hemolisado (A e B) e perfil de pureza do pico cromatográfico da riparina I mostrando uma
pureza de 100% (C)
(A)
(B)
(C)
1
2
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
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133
VI.3.2 LINEARIDADE
A linearidade do método bioanalítico foi avaliada pela razão entre a área do
pico da riparina I pela área do pico do padrão interno, utilizando o modelo de
regressão linear para o intervalo de concentração entre 0,2 e 7 μg/mL de riparina I.
Foi obtido um coeficiente de correlação linear médio de 0,9898 com os resultados
dos três dias de análise (Figura 44, p. 134). Este parâmetro permite uma estimativa
da qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1, menor a dispersão do
conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão
estimados.
A Tabela 7 (p. 133) mostra os valores de equação da reta para os três dias
da análise de linearidade com seus coeficientes de correlação. Tais valores estão de
acordo com o proposto para a validação de método bioanalítico, segundo a
resolução RE nº 899/2003/ANVISA, que estabelece valor mínimo aceitável de 0,98.
Tabela 7. Parâmetros de linearidade obtidos durante a validação do método bioanalítico
Riparina I (0,2 – 7,0 μg/mL)
Equação da reta
Coeficiente de correlação (r
2
)
1º dia
y = 0,0770x – 0,0073
0,9922
2º dia
y = 0,0819x – 0,0139
0,9828
3º dia
y = 0,0783x + 0,0075
0,9944
Alguns cromatogramas obtidos durante o estudo da linearidade estão
demonstrados na Figura 45 (p. 135).
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134
Figura 44. Regressão linear da curva de calibração em sangue da riparina I no intervalo de
concentração de 0,2 – 7 µg/mL para os três dias de análise na linearidade
y = 0,0783x + 0,0075
r
2
= 0,9944
y = 0,0819x – 0,0139
r
2
= 0,9828
y = 0,0770x – 0,0073
r
2
= 0,9922
2º dia
1º dia
3º dia
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135
Figura 45. Cromatogramas da riparina I a 225 nm em sangue: amostra-branco (A), amostra-zero
(padrão interno a 15 μg/mL) (B) e amostra contendo a riparina I (4 μg/mL) e o padrão interno
(15 μg/mL) (C)
(B)
(A)
(C)
1
2
T
r
= 5,418 min
Pico 1 (PI)
T
r
= 5,250 min
Pico 1 (PI)
AREAP = 2208211
ASSM = 1,34
1
Pico 2 (Riparina I)
AREAP = 649421
ASSM = 1,26
T
r
= 7,166 min
AREAP = 2264209
ASSM = 1,31
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136
VI.3.3 PRECISÃO/EXATIDÃO
Os estudos de precisão e exatidão intra-ensaio para o 1° dia de análise
apresentaram valores de variação menores que 6% (Tabela 8, p. 136). Para o 2º dia
de análise, os resultados para precisão não apresentaram valores de variação
maiores que 3% e para exatidão não houve valores maiores que 10% (Tabela 9, p.
136). Nos resultados do 3º dia, apenas a concentração de 2 μg/mL apresentou
variação de 12%, mas permaneceu dentro dos limites especificados para o método
bioanalítico. As demais concentrações não ultrapassaram variações de 3% e os
resultados para exatidão não apresentaram valores de variações maiores que 11%
(Tabela 10, p. 137).
Tabela 8. Valores de precisão e exatidão intra-ensaio no 1º dia de análise para as
concentrações 0,5, 2 e 7 μg/mL da riparina I em sangue (n = 5)*
* As amostras foram analisadas em cinco replicatas para cada concentração por dia.
a
C.V. (%) = (DP/média) x 100%.
b
Calculada como (média determinada da concentração nominal/ concentração nominal) x 100%.
Tabela 9. Valores de precisão e exatidão intra-ensaio no 2º dia de análise para as
concentrações 0,5, 2 e 7 μg/mL da riparina I em sangue (n = 5)*
* As amostras foram analisadas em cinco replicatas para cada concentração por dia.
a
C.V. (%) = (DP/média) x 100%.
b
Calculada como (média determinada da concentração nominal/ concentração nominal) x 100%.
Valor nominal
(μg/mL)
Concentração calculada
(μg/mL, média ± DP, n=5)
Precisão
CV (%)
a
Exatidão (%)
b
0,5
0,5023 ± 0,01
2,0911
100,4492
2
2,1103 ± 0,12
5,8723
105,5157
7
7,3309 ± 0,17
2,2766
104,7278
Valor nominal
(μg/mL)
Concentração calculada
(μg/mL, média ± DP, n=5)
Precisão
CV (%)
a
Exatidão (%)
b
0,5
0,5435 ± 0,02
2,9018
108,7087
2
2,1898 ± 0,05
2,3618
109,4935
7
7,4515 ± 0,13
1,7868
106,4499
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137
Tabela 10. Valores de precisão e exatidão intra-ensaio no 3º dia de análise para as
concentrações 0,5, 2 e 7 μg/mL da riparina I em sangue (n = 5)*
* As amostras foram analisadas em cinco replicatas para cada concentração por dia.
a
C.V. (%) = (DP/média) x 100%.
b
Calculada como (média determinada da concentração nominal/ concentração nominal) x 100%.
Os estudos de precisão e exatidão para o método bioanalítico estão dentro
dos limites especificados e preconizados pela resolução RE nº 899/2003/ANVISA,
em que os valores para precisão e exatidão não devem ultrapassar o intervalo de
15% para mais ou menos do valor nominal.
Os resultados inter-ensaios para as concentrações de 0,5 e 2 μg/mL
apresentaram médias ± desvio padrão de 0,49 ± 0,05 e 2,10 ± 0,01,
respectivamente. Apenas a concentração de 7 μg/mL apresentou um desvio padrão
acima de 1, mas abaixo de 2 (Tabela 11, p. 137). Os valores de exatidões das
concentrações não ultrapassaram 9%. Alguns cromatogramas obtidos durante o
estudo estão demonstrados na Figura 46 (p. 138).
Tabela 11. Valores de precisão e exatidão inter-ensaio nos três dias de análise para as
concentrações 0,5, 2 e 7 μg/mL da riparina I em sangue (n = 3)*
Valor nominal
(μg/mL)
Concentração calculada
(μg/mL, média ± DP, n=3)
Precisão
CV (% ± DP)
a
Exatidão (% ± DP)
b
0,5
0,4989 ± 0,05
2,3979 ± 0,44
105,9550 ± 4,77
2
2,1009 ± 0,09
6,8153 ± 4,99
108,1673 ± 2,30
7
7,5159 ± 1,80
2,2607 ± 0,47
105,8757 ± 0,99
* As amostras foram analisadas em triplicata para cada concentração.
a
C.V. (%) = (DP/média) x 100%.
b
Calculada como (média determinada da concentração nominal/ concentração nominal) x 100%.
Valor nominal
(μg/mL)
Concentração calculada
(μg/mL, média ± DP, n=5)
Precisão
CV (%)
a
Exatidão (%)
b
0,5
0,4502 ± 0,01
2,2008
90,0363
2
2,0015 ± 0,24
12,2119
100,0763
7
7,7637 ± 0,21
2,7192
110,9104
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138
Figura 46. Cromatogramas do estudo de precisão/exatidão da riparina I a 225 nm em sangue
nas concentrações: baixa (0,5 μg/mL) (A), média (2 μg/mL) (B) e alta (7 μg/mL) (C)
(A)
(B)
(C)
1
2
1
2
1
2
T
r
= 5,402 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
AREAP = 2402363
ASSM = 1,35
T
r
= 7,083 min
AREAP= 94254
ASSM = 1,23
T
r
= 5,317 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
AREAP = 2821342
ASSM = 1,45
T
r
= 7,025 min
AREAP = 378239
ASSM = 1,33
T
r
= 5,428 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
T
r
= 7,186 min
AREAP = 1379039
ASSM = 1,29
AREAP = 2386146
ASSM = 1,34
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139
VI.3.4 RECUPERAÇÃO
Após os cálculos de regressão linear da curva de calibração em sangue
(Figura 44, p. 134) e em solução (Figura 47, p. 141), foi possível a obtenção das
concentrações das amostras testadas em sangue e em solução, respectivamente.
As concentrações foram transformadas em porcentagem após comparação com o
valor nominal equivalente a 100%.
Os resultados do estudo de recuperação para os três dias de análise
demonstraram que não houve diferença significativa ao se comparar as diferentes
concentrações separadamente (0,5, 2 e 7 μg/mL) das amostras de sangue com as
amostras em solução que passaram (solução-rec) e não passaram (solução-
controle) pelo processo de extração/recuperação.
A porcentagem média de recuperação das diferentes concentrações
testadas da riparina I em sangue para o 1º dia do estudo foi 94,95% com desvio
padrão de 1,77 (Tabela 12, p. 139).
Tabela 12. Valores de recuperação durante o 1º dia de análise para as concentrações 0,5, 2 e 7
μg/mL da riparina I em amostras de sangue e solução que passaram pelo processo de
extração e solução-controle (n = 3)
Valor nominal (μg/mL)
Sangue
[Média (%) ± DP]
Solução-rec
[Média (%) ± DP]
Solução-controle
[Média (%) ± DP]
0,5
92,9970 ± 1,7659
100,5646 ± 3,1595
96,9991 ± 4,1351
2
96,4386 ± 7,2286
102,7172 ± 4,0224
99,1393 ± 3,5645
7
95,4084 ± 5,3564
98,0049 ± 6,8211
102,5662 ± 2,5962
[Média (%) ± DP, n=3]
94,9483 ± 1,7659
100,4289 ± 2,3591
99,5674 ± 2,8069
Para o 2º dia do estudo, a porcentagem média de recuperação das
diferentes concentrações testadas da riparina I em sangue foi 94,33% com desvio
padrão de 0,39 (Tabela 13, p. 140).
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140
Tabela 13. Valores de recuperação durante o 2º dia de análise para as concentrações 0,5, 2 e 7
μg/mL da riparina I em amostras de sangue e solução que passaram pelo processo de
extração e solução-controle (n = 3)
Valor nominal (μg/mL)
Sangue
[Média (%) ± DP]
Solução-rec
[Média (%) ± DP]
Solução-controle
[Média (%) ± DP]
0,5
94,7279 ± 5,4199
101,0974 ± 4,8792
100,4684 ± 4,4753
2
93,9561 ± 3,7461
107,6761 ± 9,2740
97,7380 ± 3,4759
7
94,2941 ± 1,1178
97,8827 ± 5,7236
102,9693 ± 2,7886
[Média (%) ± DP, n=3]
94,3260 ± 0,3869
102,2188 ± 4,9921
100,3919 ± 2,6165
Para o 3º dia do estudo, a porcentagem média de recuperação das
diferentes concentrações testadas da riparina I em sangue foi 94,33% com desvio
padrão de 1,57 (Tabela 14, p. 140).
Tabela 14. Valores de recuperação durante o 3º dia de análise para as concentrações 0,5, 2 e 7
μg/mL da riparina I em amostras de sangue e solução que passaram pelo processo de
extração e solução-controle (n = 3)
Valor nominal (μg/mL)
Sangue
[Média (%) ± DP]
Solução-rec
[Média (%) ± DP]
Solução-controle
[Média (%) ± DP]
0,5
93,1160 ± 2,7633
102,7650 ± 2,7452
100,5452 ± 4,3024
2
95,0366 ± 8,5519
101,9620 ± 3,2571
97,2858 ± 3,5372
7
96,2390 ± 2,9665
100,4709 ± 3,1514
103,1907 ± 2,5635
[Média (%) ± DP, n=3]
94,3260 ± 1,5752
101,7326 ± 1,1641
100,3406 ± 2,9578
A porcentagem média dos três dias dos resultados das concentrações (0,5,
2 e 7 μg/mL) para o método de recuperação em sangue de ratos foi 94,69% com
desvio padrão de 4,81.
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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141
Figura 47. Regressão linear da curva de calibração em solução da riparina I no intervalo de
concentração de 0,2 – 7 µg/mL para os três dias de análise na recuperação
y = 0,0707x - 0,0001
r
2
= 0,9990
y = 0,0709x – 0,0002
r
2
= 0,9990
y = 0,0740x – 0,0002
r
2
= 0,9994
2º dia
1º dia
3º dia
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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142
VI.3.5 LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO
Os valores dos limites de detecção e quantificação foram estimados
segundo equações presentes na resolução RE nº 899/2003/ANVISA, em 0,14 µg/mL
e 0,23 µg/mL, respectivamente. Porém, experimentalmente, por meio de cálculos
entre a razão sinal:ruído nos cromatogramas, esse valores foram ainda menores,
sendo de 0,05 ug/mL e 0,10 ug/mL para o LD e o LQ, respectivamente.
VI.3.6 ROBUSTEZ
A retenção do analito em CLAE é explicada como o resultado das interações
competitivas do analito e moléculas do eluente com a fase estacionária. Quanto
mais forte as interações do eluente com a superfície da fase estacionária, menor é a
retenção do analito, o que leva ao termo de força do eluente (KAZAKEVICH;
LoBRUTTO, 2007).
O estudo de robustez mostrou que das três variáveis estudadas, apenas
duas demonstraram potencial de variação no tempo de retenção da riparina I
(Tabela 15, p. 143). A variação de metanol em 5% a menos na proporção da fase
móvel variou o tempo de retenção da riparina I em 2,20 minutos, enquanto que a
variação em 5% a mais levou à variação de 1,29 minutos (Figura 48, p. 144).
O tempo de retenção do analito é dependente também da razão do fluxo da
fase móvel. Quanto mais rápido a taxa do fluxo, menor é o tempo de retenção do
analito (KAZAKEVICH; LoBRUTTO, 2007).
Em relação à variação do fluxo da fase móvel (Figura 49, p. 145), as
variações foram menores quando comparadas àquelas ocasionadas pelas
mudanças na proporção de metanol na fase móvel. Um aumento do fluxo para
1,2 mL/min levou a uma diminuição do tempo de retenção da riparina I com uma
variação de 1,03 minutos e uma diminuição do fluxo para 0,8 mL/min levou a um
aumento do tempo de retenção com variação de 1,56 minutos (Tabela 15, p. 143).
As variações em ±3 ºC em relação à temperatura de 27 ºC não
demonstraram variações relevantes em relação aos tempos de retenção (Figura 50,
p. 146).
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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143
As variações no tempo de retenção da riparina I ocasionadas pelas
variações na proporção de solvente mostraram-se maiores do que as variações
ocasionadas pelas outras duas variáveis testadas (fluxo e temperatura), o que
sugere que a riparina I tenha mais afinidade pela fase estacionária quando se utiliza
uma fase móvel com água/metanol, por apresentar variações maiores ao diminuir os
valores das variáveis testadas, ficando a riparina I mais retida na coluna
cromatográfica.
Tabela 15. Valores do tempo de retenção da riparina I para as variáveis analisadas (% MeOH,
fluxo e temperatura) no estudo de robustez do método bioanalítico
* DP: desvio padrão; CV(%): coeficiente de variação
Tempo de retenção
∆ Tempo de retenção
MeOH (%)
60
65
70
65-60
65-70
Média (min)
8,56
6,53
5,24
2,02
1,29
DP
0,06
0,03
0,03
CV (%)
0,67
0,44
0,51
Fluxo (mL/min)
0,8
1
1,2
1-0,8
1-1,2
Média (min)
8,10
6,53
5,51
1,56
1,03
DP
0,06
0,03
0,03
CV (%)
0,75
0,44
0,46
Temperatura (ºC)
24
27
30
27-24
27-30
Média (min)
6,64
6,53
6,53
0,10
0,00
DP
0,06
0,03
0,05
CV (%)
0,94
0,44
0,78
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144
Figura 48. Cromatogramas do estudo de robustez da riparina I (2 μg/mL) a 225 nm em sangue
para a variável % MeOH: 60% MeOH (A), 65% MeOH (B) e 70% MeOH (C)
(A)
(B)
(C)
1
2
T
r
= 6,202 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
T
r
= 8,605 min
1
2
2
1
T
r
= 5,064 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
T
r
= 6,554 min
T
r
= 4,310 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
T
r
= 5,233 min
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145
Figura 49. Cromatogramas do estudo de robustez da riparina I (2 μg/mL) a 225 nm em sangue
para a variável fluxo: 0,8 mL/min (A), 1 mL/min (B) e 1,2 mL/min (C)
(A)
(B)
(C)
1
2
1
2
1
2
T
r
= 6,252 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
T
r
= 8,104 min
T
r
= 5,064 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
T
r
= 6,554 min
T
r
= 5,522 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
T
r
= 4,271 min
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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146
Figura 50. Cromatogramas do estudo de robustez da riparina I (2 μg/mL) a 225 nm em sangue
para a variável temperatura: 24 ºC (A), 27 ºC (B) e 30 ºC (C)
(A)
(B)
(C)
T
r
= 5,064 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
T
r
= 6,554 min
T
r
= 5,132 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
T
r
= 6,678 min
T
r
= 5,086 min
Pico 1 (PI)
Pico 2 (Riparina I)
T
r
= 6,59 min
2
1
1
2
2
1
CAPÍTULO VII
Conclusão
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148
VII.1 CONCLUSÃO
Em conclusão, os resultados obtidos demonstraram que:
A riparina I mostrou-se com elevado grau de pureza quando submetida a
técnicas espectroscópicas e cromatográficas.
O método cromatográfico desenvolvido em CLAE-DAD mais adequado para
análise da riparina I e do padrão interno, simultaneamente, foi a eluição por sistema
isocrático de solventes (35:65 | H
2
O:MeOH) com fluxo de 1 mL/min, utilizando uma
coluna em fase reversa (C18, 250 x 4,6 x 5µm) e analisados em comprimento de
onda de 225 nm.
A riparina I em solução (50:50 | H
2
O:MeCN) na concentração de 100 µg/mL
se mostrou estável após armazenamento à temperatura de -20ºC e ciclos de
congelamento/ descongelamento de 24 horas durante o período de 30 dias.
A extração líquido-líquido da riparina I em sangue de ratos e ratas mostrou-
se uma técnica com um bom poder de “clean-up” e de recuperação, além de ser
precisa, exata e simples. Entre os parâmetros avaliados, apenas o tipo de sangue
em relação ao sexo dos animais e o solvente orgânico tiveram influência na
recuperação da riparina I.
A riparina I apresentou uma maior recuperação em sangue de ratos
(94,50%) utilizando a acetonitrila a 12.000 x g durante 20 minutos. Não foi
observado efeito de matriz em sangue (100,64%) e a eficiência do processo foi de
106,89%, demonstrando a eficácia do processo de extração.
O método bioanalítico desenvolvido para quantificação da riparina I em
amostras de sangue por meio da CLAE-UV/Vis apresentou seletividade,
sensibilidade, linearidade, precisão, exatidão e recuperação adequadas, além de
rapidez nas mensurações, tornando-se uma poderosa técnica para aplicação em
bioanálises, o que permite a sua utilização em ensaios farmacocinéticos que são de
fundamental importância na pesquisa e desenvolvimento farmacêutico.
CAPÍTULO VIII
Referências
Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação da riparina I em sangue de ratos
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150
REFERÊNCIAS
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