( PDF ) Estudo da possível atividade psicofaramacológica do D-limoneno em modelo comportamental em camundongos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA

PROF. DELBY FERNANDES DE MEDEIROS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SINTÉTICOS BIOATIVOS

NAIANA GONDIM PEREIRA BARROS LIMA

ESTUDO DA POSSÍVEL ATIVIDADE PSICOFARMACOLÓGICA DO D-

LIMONENO EM MODELO COMPORTAMENTAL EM CAMUNDONGOS

JOÃO PESSOA - PB

2009

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NAIANA GONDIM PEREIRA BARROS LIMA

ESTUDO DA POSSÍVEL ATIVIDADE PSICOFARMACOLÓGICA DO D-

LIMONENO EM MODELO COMPORTAMENTAL EM CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Laboratório de

Tecnologia Farmacêutica Prof. Delby Fernandes de Medeiros da

Universidade Federal da Paraíba, para obtenção do grau de

MESTRE EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS.

Área de Concentração: FARMACOLOGIA.

Orientador:

Prof. Dr. REINALDO NÓBREGA DE ALMEIDA

Co-orientador

Prof. Dr. DAMIÃO PERGENTINO DE SOUSA

JOÃO PESSOA - PB

2009

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L732e Lima, Naiana Gondim Pereira Barros.

Estudo da possível atividade

psicofaramacológica do D-limoneno em modelo

comportamental em camundongos / Naiana

Gondim Pereira Barros Lima.- João Pessoa, 2009.

129f.

Orientador: Reinaldo Nóbrega de Almeida

Co-orientador: Damião Pergentino de Sousa

Dissertação (Mestrado) – UFPB/CCS/LTF

1. Produtos Naturais. 2. Óleos essenciais. 3.

D-limoneno (DLO). 4. Plantas aromáticas. 5. DLO –

atividade ansiolítica.

FOLHA DE APROVAÇÃO

NAIANA GONDIM PEREIRA BARROS LIMA

ESTUDO DA POSSÍVEL ATIVIDADE PSICOFARMACOLÓGICA DO D-

LIMONENO EM MODELO COMPORTAMENTAL EM CAMUNDONGOS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos

Bioativos do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica

Prof. Delby Fernandes de Medeiros da Universidade

Federal da Paraíba, para obtenção do grau de MESTRE

EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS.

Área de Concentração: FARMACOLOGIA

Aprovada em: 27/03/2009

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. REINALDO NÓBREGA DE ALMEIDA (Orientador - UFPB)

Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa (Co-orientador - UFS)

Profa. Dra. Leônia Maria Batista (Examinadora - UFPB)

Prof. Dr. Fladmir de Sousa Claudino (Examinador - UFCG)

“Talvez não tenhamos conseguido fazer o melhor, mas lutamos para que o melhor

fosse feito... Não somos o que deveríamos ser, não somos o que iremos ser. Mas,

graças a Deus, nãos somo o que éramos.”

Martin Luther King

Dedicatórias

Ao meu esposo, meu grande amor, Ígor Prado, pelo

compartilhamento de todos os momentos da minha vida, mais

fáceis e mais difíceis, além do seu total apoio, amor e carinho a

mim dedicados.

Aos meus pais, Sinedei de Moura e Vânia Gondim, pela dedicação

e esforços incondicionais aos meus estudos e que sempre me deram

muito amor e carinho.

Ao meu irmão, André Gondim, pelo exemplo de vida, coragem e

determinação.

Agradecimentos

"Quando se diz obrigado, se dizem muitas coisas mais,

que vêm de muito longe com a origem do indivíduo, e de

tão perto como o pulsar do coração".

(Pablo Neruda)

A DEUS, que me carregou no colo em muitos momentos desta caminhada para que o desânimo,

cansaço, angústias fossem embora e que sempre me protegeu na BR- 230.

Aos meus pais e irmão pelo carinho, apoio e por acreditar sempre que este trabalho seria

concluído.

Ao meu esposo pelo total apoio nesta etapa da minha vida.

Aos meus sogros, Dr. Paulo e Dona Margaret, pelo apoio durante este momento tão importante

da minha vida.

Ao Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida, meu orientador, que acreditou em mim, exemplo de

sabedoria, serenidade, competência e dedicação.

Ao Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa pela co-orientação, pelos ensinamentos químicos e

pelo fornecimento do monoterpeno D-limoneno

À Prof. Drª. Liana Clébia Soares Lima de Moraes pela amizade e incentivo.

Ao professor Dr. Eduardo de Jesus Oliveira, meu orientador da iniciação científica, que me

apresentou ao mundo da pesquisa e me proporcionou momentos de muito aprendizado.

Aos professores do curso de pós-graduação, pelos conhecimentos transmitidos e dedicação

permanente aos alunos e ao programa de pós-graduação.

Ao Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,

Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho pelo tratamento sempre cordial e apoio.

Aos professores Fladmir Claudino e Leônia Batista por terem gentilmente aceito o convite para

participar da banca examinadora desta dissertação.

Ao doutorando Fernando de Oliveira, pelos comentários pertinentes que contribuíram para o

enriquecimento deste trabalho.

Às doutorandas, Leandra Eugênia, Vanine Gomes, Camila Carolina, Flávia Negromonte pelos

ensinamentos e pelo carinho que me demonstraram nesta fase da minha vida.

Aos amigos de pós-graduação: Fabíola, Kelly, Solange, Mariane, Angélica, Analúcia, pela

amizade e apoio recebido.

Aos estudantes de iniciação científica: Guilherme e Lucas pela dedicação e seriedade na

execução dos experimentos.

A todos que fazem parte do Laboratório de Psicofarmacologia, pelos préstimos e convívio

amigável, que tornaram mais agradável minha passagem por este laboratório.

Ao Laboratório de Tecnologia Farmacêutica pelo espaço para realização do trabalho.

A Luis Cordeiro, Adriano Silva e José Crispim Duarte pela disponibilidade e apoio técnico

imprescindível na execução deste trabalho.

Ao CNPq pelo apoio científico e financeiro durante o primeiro ano de mestrado.

Ao Departamento de Farmácia da Universidade Estadual da Paraíba por ter me incentivado

para a realização da minha parte experimental.

Aos professores Departamento de Farmácia da Universidade Estadual da Paraíba, em especial

aos Professores: Rossana Miranda, Thúlio Antunes, Alessandra Teixeira, Raíssa Catão e Nícia

Stellita

Á minha amiga e colega de trabalho, Michelle de Oliveira, que muito me incentivou e apoiou.

A todos os funcionários do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica e à secretária da Pós-

graduação Tânia Araújo, pelos serviços prestados.

Ao Biotério Prof. Dr. Thomas George do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica pelo

fornecimento dos animais.

Aos grandes amigos, Jorge e Juliana, pelo carinho e apoio, momentos de alegria, palavras amigas

e incentivadoras.

Aos amigos Thaís, Suênia, Ionaldo, Nilson, Kellyane pela amizade e apoio.

Enfim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente na realização deste trabalho, o meu

MUITO OBRIGADA!

RESUMO

LIMA, N.G.P.B. Estudo da possível atividade psicofarmacológica do d-

limoneno em modelo comportamental em camundongos. 2009. Dissertação

Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa.

D-limoneno (DLO) é um monoterpeno prevalente em óleos essências de várias

espécies de plantas aromáticas. Estudos prévios demonstraram que esse composto

apresentava atividade no SNC. O presente estudo objetivou investigar a atividade

ansiolítica do DLO. Na triagem farmacológica comportamental, para avaliar o efeito no

SNC do DLO, observou-se que os camundongos tratados por via intraperitoneal (i.p.)

apresentaram alterações comportamentais indicativas de analgesia e hiperatividade.

Por outro lado, os camundongos tratados por via inalatória (v.i.) apresentaram

defecação diminuída e analgesia. Os animais tratados com DLO (50 mg/kg, i.p.) não

apresentaram alteração na coordenação motora no teste de rota Rod quando

comparados com grupo controle, até 120 minutos após a administração. A dose de 50

mg/kg, i.p., potencializou o tempo de sono induzido pelo pentobarbital (40 mg/kg, i.p.) e

diminuiu sua latência. Desde que o aumento do tempo de sono induzido por

pentobarbital indica uma ação sedativa ou hipnótica, o envolvimento do sistema

GABAérgico pode ser considerado. No teste do campo aberto, DLO nas doses de 25,

50 e 100 mg/kg (i.p.) reduziram significativamente o tempo de auto-limpeza. Quando

avaliada a metodologia no labirinto em cruz elevado (LCE), via i.p., na dose de 50

mg/kg, foi observado um efeito ansiolítico pelo aumento no tempo total de permanência

nos braços abertos. Efeito similar foi mostrado quando os camundongos foram tratados

com DLO (0,5 e 1,0 %, v.i.) representado pelo aumento no número de entradas e no

tempo de permanência nos braços abertos do LCE. No entanto, DLO 2,5 % v.i.,

apresentou um efeito ansiogênico evidenciado pelo aumento do tempo de permanência

nos braços fechados. A segunda etapa desse estudo consistiu em determinar dados

sobre o mecanismo de ação do DLO. A presença do flumazenil, um antagonista seletivo

do sítio benzodiazepínico dos receptores GABA

, não foi efetivo em reverter o efeito

ansiolítico do DLO (50 mg/kg, i.p. e 1% v.i).

Portanto, de acordo com os resultados

obtidos desse estudo, DLO apresenta atividade ansiolítica por via intraperitoneal e

inalatória, sendo esse efeito desprovido de interferência na coordenação motora e sem

relação direta com os receptores GABA

. Entretanto, o exato mecanismo de ação

permanece a ser elucidado.

Palavras-chave: D-limoneno, monoterpeno, atividade ansiolítica, labirinto em cruz

elevado.

ABSTRACT

LIMA, N.G.P.B. Study of the possible psychopharmacology activity of the D-

limonene in behavioral animal models in mice. 2009. Dissertação Universidade

Federal da Paraíba, João Pessoa.

D-Limonene (DLO) is a monoterpene prevalente in essential oils of various aromatic

plants species. Previous studies have shown that this compound exerts some activity on

the central nervous system. The present study aimed to investigate the putative

anxiolytic-like activity of DLO. In the behavioral screening that evaluate possible effects

in CNS of DLO was observed that treated mice (i.p.) showed any behavioral alterations

indicatives of analgesia and CNS excitation. The other hand, inhalation treated mice

presented analgesia and reduction of the defecation. Animals treated with DLO (50

mg/kg, i.p.) did not present reduction of the motor activity when was compared to

control group at 120 minutes after administration. The dose of 50 mg/kg i.p. increased

the sleeping time induced by pentobarbital (40 mg/kg) and decreased the latency to

induce sleep. Since that significant increase of the time of sleep induced by

pentobarbital indicate a sedative or hypnotic action, an involvement of the GABAergic

system may be considered. In the open field test, DLO at the doses of 25, 50 and 100

mg/kg (i.p) significantly reduced of the time spent in grooming behavior. When evaluated

in elevated plus maze methodology (EPM), i.p. route, at dose of 50 mg/kg, an anxiolyt-

like effect was observed by the increased of the time spent into open arms. Similar effect

was showed when mice were treated with DLO (0,5 e 1,0 %, v.i.) represented by the

increased frequency of entries and the time spent into open arms of EPM. However,

DLO 2.5% v.i., presented a anxiogenic-like effect evidenced by the increase of the time

of permanence in the closed arms. The second part of this study involved the

investigation of a possible mechanism of action of DLO. The presence of flumazenil, a

selective antagonist of benzodiazepine site of GABA

receptor was not effective to revert

the anxiolytic effect of DLO (50 mg/kg, i.p. e 1% v.i). Therefore, according the results

obtained in this study, DLO presents anxiolytic-like activity by intraperitoneal and

inhalation routes, being this effect unprovided of interference in the motor coordination

and without direct relation with receptors GABA

. However, the exact underlying

mechanism of action remains to be elucidated.

KEY WORDS: D-limonene, monoterpene, anxiolytic-like activity, elevated plus-maze

test

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Estruturas químicas do Ácido gama-aminobutírico (A); Diazepam (B)

e Flumazenil (C)...................................................................................

Figura 2

Estrutura do Receptor GABA

..............................................................

Figura 3

Biossíntese da serotonina....................................................................

Figura 4

Estrutura do glutamato.........................................................................

Figura 5

Sinapse glutamatérgica........................................................................

Figura 6

Receptor N-metil-D-aspartato, estado fechado e estado

aberto...............................

Figura 7

Estrutura química dos compostos: isopreno, monoterpeno e

sesquiterpeno

Figura 8

Formação do limoneno a partir do geranil pirofostato......

Figura 9

Estruturas químicas do limoneno (A), e de outros monoterpenos com

atividade no SNC: α,β-epóxi-carvona (B), isopulegol (C), linalol

(D).......................................................................................................

Figura 10

Camundongo Swiss macho e albino.................................................... 46

Figura 11

Aparelho de rota rod.............................................................................

Figura 12

Aparelho do labirinto em cruz elevado................................................. 49

Figura 13

Aparelho do campo aberto................................................................... 50

Figura 14

Caixa de inalação................................................................................. 50

Figura 15

Resumo esquemático do estudo psicofarmacológico do D-limoneno

pela via intraperiotenal.........................................................................

Figura 16 Resumo esquemático do estudo psicofarmacológico do D-limoneno

por via inalatória...................................................................................

Figura 17

Efeitos do DLO e diazepam sobre a latência do sono em segundos

no teste do tempo de sono induzido pelo

pentobarbital.................................................................................

Figura 18

Efeitos do DLO e diazepam sobre o tempo de sono induzido pelo

pentobarbital..........................................

Figura 19

Efeitos do DLO e diazepam sobre a coordenação motora dos

animais nos tempos 30 min, 60 min e 120

min........................................................................................................

Figura 20

Efeitos do DLO e diazepam sobre a auto-limpeza dos animais no

teste do campo aberto..............

Figura 21

Efeitos do DLO e diazepam sobre a ambulação dos animais no teste

do campo aberto.................

Figura 22

Efeitos do DLO e diazepam sobre a elevação dos animais no teste

do campo aberto....................

Figura 23

Efeitos do DLO e diazepam sobre o número de bolos fecais dos

animais no teste do campo

aberto...................................................................................................

Figura 24

Efeitos do DLO e diazepam sobre o tempo de permanência nos

braços abertos e fechados do labirinto em cruz

elevado......................................................................

Figura 25

Efeitos do DLO e diazepam sobre o número de entrada nos braços

abertos e fechados do labirinto em cruz

elevado......................................................................

Figura 26

Efeitos do Controle, DLO, diazepam e flumazenil sobre o tempo de

permanência nos braços abertos e fechados do labirinto em cruz

elevado.....................

Figura 27

Efeitos do Controle, DLO, diazepam e flumazenil sobre o número de

entrada nos braços abertos e fechados do labirinto em cruz

elevado.................................

Figura 28

Efeitos do DLO v.i. e diazepam i.p. sobre a auto-limpeza dos

camundongos no teste do campo aberto..............

Figura 29

Efeitos do DLO v.i. e diazepam i.p. sobre a ambulação dos animais

no teste do campo aberto...........................

Figura 30

Efeitos do DLO v.i. e diazepam i.p. sobre a quantidade de levantar

no teste do campo aberto em

camundongos.......................................................................................

Figura 31

Efeitos do DLO v.i. e diazepam i.p. sobre a quantidade de bolos

fecais no teste do campo aberto em

camundongos.......................................................................................

Figura 32

Efeitos do DLO v.i. e diazepam i.p. sobre o tempo de permanência

nos braços do labirinto em cruz elevado.....

Figura 33

Efeitos do DLO v.i. e diazepam i.p. sobre o número de entrada nos

braços do labirinto em cruz elevado............

Figura 34

Efeitos do DLO v.i., diazepam i.p. e do flumazenil i.p. sobre o tempo

de permanência nos braços abertos e fechados do labirinto em cruz

elevado.....................

Figura 35

Efeitos do DLO v.i., diazepam i.p. e do flumazenil i.p. sobre o

número de entradas nos braços abertos e fechados do labirinto em

cruz elevado.................................

LISTA DE QUADROS

Quadro 1

Classificação dos modelos animais de ansiedade............................... 31

Quadro 2

Protocolo utilizado na triagem farmacológica.......................................

Quadro 3

Principais alterações comportamentais registradas em

camundongos decorrentes da administração do D-limoneno via

intraperitoneal.......................................................................................

Quadro 4 Principais alterações comportamentais registradas em

camundongos decorrentes da administração do D-limoneno via

inalatória...............................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

5-HT

Receptor serotoninérgico – subtipo 1A

5-HT

Receptor serotoninérgico – subtipo 1B

5-HT

Receptor serotoninérgico – subtipo 3

5-HT Serotonina

AMPc Monofosfato de adenosina cíclica

ANOVA Análise de variância

BZD Benzodiazepínicos

C Carbono

Cálcio

CG-EM Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa

DLO D-limoneno

DZP Diazepam

e. p. m. Erro padrão da média

et AL E colaboradores

GABA Ácido gama amino butírico

GABA

Receptor de ácido gama amino butírico tipo A

GABA

Receptor de ácido gama amino butírico tipo B

iGlu Receptores glutamato ionotrópicos

i.p. Intraperitoneal

Íon potássio

LCE Labirinto em cruz elevado

LTF Laboratório de Tecnologia Farmacêutica

mGlu Receptores glutamato metabotrópicos

Íon sódio

NMDA N-metil-D-aspartato

OEs Óleos essenciais

PTZ Pentilenotetrazol

RMN

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

r. p. m. Rotações por minuto

Seg Segundo

SNC Sistema Nervoso Central

Tween 80 Polioxetileno Sorbitano Monoleato

v.i. via inalatória

OBS: As abreviaturas e os símbolos utilizados neste trabalho e que não constam nesta

relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas universalmente.

SUMÁRIO

I INTRODUÇÃO......................................................................................................

1CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS DISTÚRBIOS DA ANSIEDADE..........

2 DROGAS ANSIOLÍTICAS.................................................................................... 22

2.1 BENZODIAZEPÍNICOS.....................................................................................

2.2 AGONISTAS DOS RECEPTORES DE SEROTONINA 5-HT

........................ 25

2.3 ANTAGONISTAS GLUTAMATÉRGICOS......................................................... 27

2.4 ANSIOLÍTICOS QUE ATUAM POR OUTRAS VIAS DE

NEUROTRANSMISSÃO........................................................................................

3 MODELOS ANIMAIS PARA AVALIAR DROGAS ANSIOLÍTICAS...................... 30

4 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE PLANTAS MEDICINAIS.......................... 33

5 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS ÓLEOS ESSÊNCIAS E SEUS

PRINCIPAIS COMPONENTES...............................................................................

6 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O D-LIMONENO...................................... 39

II OBJETIVOS.........................................................................................................

2.1 GERAL.............................................................................................................. 44

2.2 ESPECÍFICOS.................................................................................................. 44

III MATERIAL..........................................................................................................

3.1 ANIMAIS............................................................................................................

3.1.1 Condições experimentais............................................................................

3.2 DROGAS E REAGENTES................................................................................ 47

3.2.1 Preparo das substâncias............................................................................. 47

3.2.1.1 Via intraperitoneal........................................................................................

3.2.1.2 Via inalatória................................................................................................

3.3 APARELHAGEM............................................................................................... 48

3.3.1 Aparelho do rota rod....................................................................................

3.3.2 Aparelho do labirinto em cruz elevado......................................................

3.3.3 Aparelho do campo aberto..........................................................................

3.3.4 Caixas de inalação.......................................................................................

IV MÉTODOS..........................................................................................................

4.1 TESTE PRELIMINAR DA ATIVIDADE NO SNC............................................... 53

4.1.1 Triagem farmacológica comportamental...................................................

4.2 AVALIAÇÃO GERAL DA ATIVIDADE NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL... 55

4.2.1 Teste da potencialização do sono induzido pelo pentobarbital..............

4.2.2 Avaliação da coordenação motora (teste do rota rod).............................

4.2.3 Teste do campo aberto................................................................................

4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANSIOLÍTICA.....................................................

4.3.1 Teste do Labirinto em cruz elevado...........................................................

4.4 AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA GABAÉRGICO NO

EFEITO ANSIOLÍTICO DO D-LIMONENO.................................................

4.4.1 Bloqueio do efeito ansiolítico pelo tratamento prévio com flumazenil

no teste do labirinto em cruz elevado................................................................

4.4.1.1 Via intraperitoneal........................................................................................

4.4.1.2 Via inalatória................................................................................................

4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................. 59

V RESULTADOS....................................................................................................

5.1 TESTE PRELIMINAR DA ATIVIDADE NO SNC............................................... 62

5.1.1 Efeito do D-Limoneno na triagem farmacológica comportamental por

via intraperitoneal..................................................................................................

5.2 AVALIAÇÃO GERAL DA ATIVIDADE NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL... 63

5.2.1 Teste da potencialização do tempo de sono induzido pelo

pentobarbital por via intraperitoneal...................................................................

5.2.2 Avaliação da coordenação motora (teste de rota rod).............................

5.2.3 Teste do campo aberto................................................................................

5.3 AVALIAÇÃO ESPECÍFICA DA ATIVIDADE NO SISTEMA NERVOSO

CENTRAL................................................................................................................

5.3.1 Avaliação da atividade ansiolítica (via intraperitoneal)............................

5.3.1.1 Teste do labirinto em cruz elevado..............................................................

5.4 AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DO SÍTIO BENZODIAZEPÍNICO DOS

RECEPTORES GABA

...........

5.5 TESTE PRELIMINAR DA ATIVIDADE NO SNC............................................... 74

5.5.1 Efeito do DLO na triagem farmacológica comportamental via

inalatória.................................................................................................................

5.6 AVALIAÇÃO GERAL DA ATIVIDADE NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL... 75

5.6.1 Teste do campo aberto................................................................................

5.7 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANSIOLÍTICA POR VIA INALATÓRIA...............

5.7.1 Teste do labirinto em cruz elevado.............................................................

5.8 AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DO SÍTIO BENZODIAZEPÍNICO DOS

RECEPTORES GABA

.................................................................................

VI DISCUSSÃO.......................................................................................................

VII CONCLUSÕES..................................................................................................

REFERÊNCIAS.......................................................................................................

I INTRODUÇÃO

1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS DISTÚRBIOS DA ANSIEDADE

De acordo com Associação Psiquiátrica Americana (1994) e estudos recentes

realizados por Mora et al. (2005a), ALMEIDA et al. (2004) as desordens da ansiedade

são as doenças psiquiátricas das mais predominantes na população geral.

Em países desenvolvidos, as doenças mentais representam 25% do perfil de

morbidade. Na União Européia compreendendo 28 países com a população de cerca

de 466 milhões de habitantes, o custo financeiro de desordens do cérebro foi estimado

em 386 bilhões de euros em 2004. A respeito das desordens da ansiedade, cerca de 41

milhões de cidadãos da União Européia sofrem destas doenças; sendo a mais

prevalente o distúrbio psiquiátrico (ANDLIN-SOBOCKI et al., 2005). Tal realidade

também se expressa nos Estados Unidos da América. O número estimado de pacientes

com ansiedade é em torno de 20 a 26 milhões e o custo anual com tratamentos

equivale a cerca de 42 bilhões de dólares (DUPONT et al., 1996; GREENBERG et al.,

1999). No Brasil, Almeida Filho et al., (1992) fizeram um estudo de morbidade

psiquiátrica em adultos, realizado nas cidades de Brasília, São Paulo e Porto Alegre, o

que demonstrou que os transtornos ansiosos afetam 12%, 6,9% e 5,4% da população

respectivamente, encontrando-se em primeiro lugar entre os mais prevalentes

diagnósticos psiquiátricos.

A ansiedade representa um problema de saúde pública substantivo nos países

desenvolvidos (RICE; MILLER, 1998) com o cálculo de gastos de 5 bilhões de euros

por ano no Reino Unido pelo tratamento farmacológico padrão (MALIZIA, 2002). Devido

aos efeitos colaterais do tratamento tradicional com os ansiolíticos, têm aumentado o

interesse no uso de terapias alternativas, incluindo aromaterapia. (BRADLEY et al.,

2007).

A ansiedade é uma emoção semelhante ao medo, porém, enquanto no medo há

uma ameaça definida, na ansiedade, a fonte do perigo é incerta ou desconhecida. A

ansiedade manifesta-se em diferentes planos: psicológico, fisiológico e comportamental

(GRAEFF, 1997; PEREIRA, 2004). A sensação caracteriza-se por um sentimento

difuso, desagradável e vago de apreensão, freqüentemente, acompanhado por

sintomas autonômicos, como cefaléia, perspiração, palpitações, aperto no peito e leve

desconforto abdominal. Os sintomas presentes durante a ansiedade tende a variar

entre as pessoas. A ansiedade é uma resposta a uma ameaça desconhecida, interna,

vaga ou de origem conflituosa. Quando considerada simplesmente como um sinal de

alerta, tal doença pode ser encarada como uma emoção semelhante ao medo, podendo

preparar o indivíduo para tomar medidas necessárias, para evitar a ameaça ou, pelo

menos, atenuar suas conseqüências (KAPLAN; SADOCK; GREBB, 1997).

Schmitt e Kapczinski (2004) descrevem que é um consenso na psiquiatria que

todo ser humano tem um quantum de ansiedade considerada normal e de valor

adaptativo, visto que esta ansiedade é um fenômeno conhecido pelo homem há

milhares de anos e não seria um exagero dizer que esse sentimento foi um dos

responsáveis pela sobrevivência humana na terra. O medo do ataque de predadores e

a antecipação mental desta possibilidade, característica típica da ansiedade, levaram o

homem a adotar estratégias eficazes de fuga ou enfrentamento, resultando na

manutenção da espécie.

A distinção entre o estado ansioso patológico e o normal não tem uma definição

nítida, mas representa o ponto no qual, os sintomas interferem com as atividades

produtivas normais. Sabe-se que um pouco de ansiedade é necessário para um melhor

desempenho nas tarefas cognitivas, porém quando em exagero pode ser inadequada,

perturbando acentuadamente o desempenho. Nesse caso pode-se falar em ansiedade

patológica, que pode ser considerada uma resposta inapropriada a um estímulo, em

virtude de sua intensidade ou duração, e será alvo de intervenção médica quando for

desproporcional às possíveis causas aparentes, muito persistentes e interferir no

funcionamento global do indivíduo de maneira significativa (PAPROCKI, 1990).

De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatística de Transtornos Mentais da

Associação Norte-Americana de Psiquiatria (1994) classifica os transtornos de

ansiedade nos seguintes tipos: Transtorno de pânico sem agorafobia, transtorno de

pânico com agorafobia, fobia específica, fobia social, transtorno obsessivo-compulsivo,

transtorno de estresse pós-traumático, transtorno de estresse agudo, transtorno de

ansiedade generalizada, transtorno de ansiedade devido a uma condição médica geral,

transtorno de ansiedade devido a uma substância e transtorno de ansiedade sem outra

especificação.

Andreatini, Boerngen-Lacerda e Zorzetto Filho (2001), relataram que na década

de 90 houve os maiores avanços em compreender as bases neuroanatômicas e

neurohumorais da ansiedade, assim como a farmacologia e a psicoterapia do

tratamento dos transtornos da ansiedade. Embora na gênese da ansiedade estejam

envolvidos diversos sistemas de neurotransmissores integrados, os medicamentos mais

comumente empregados no tratamento das desordens ansiosas envolvem os sistemas

GABAérgico e serotonérgico (NUTT; RICKELS; STEIN, 2002).

De acordo com Bloom (2005) o sistema límbico é uma designação para regiões

cerebrais (formação do hipocampo, complexo amigdalóide, septo, núcleos olfatórios,

gânglios da base e núcleos selecionados do diencéfalo) agrupados ao redor das bordas

subcorticais do núcleo cerebral subjacente, ao qual é atribuída uma variedade de

funções emocionais e motivacionais complexas. Acredita-se que os circuitos neurais

que envolvem a amígdala e o hipocampo são a base da ansiedade (ROSEN;

SCHULKIN, 1998).

Estudos com animais sugerem que algumas formas de ansiedade são mediadas

através do sistema noradrenérgicos (McQUADE; STANFORD, 2000), mas estudos

recentes confirmam esta hipótese somente parcialmente. Outras pesquisas implicam o

sistema serotoninérgico em alguns tipos de ansiedade (CAMPBELL; MERCHANT,

2003).

De acordo com Lépine (2001) e Brown et al. (1996), os sintomas de ansiedade

podem trazer muito sofrimento e em alguns casos incapacidade para seus portadores.

A ansiedade é uma emoção normal e também uma desordem psiquiátrica. Muitas vezes

é difícil separar a condição normal da patológica, no entanto, quando os sintomas são

freqüentes e mal adaptados, interferindo com o funcionamento normal do indivíduo, a

ansiedade é considerada patológica e requer terapia farmacológica.

2 DROGAS ANSIOLÍTICAS

As primeiras drogas para tratar a ansiedade foram os barbitúricos, compostos

tóxicos que produzem uma variedade de efeitos colaterais, e posteriormente

substituídos pelos benzodiazepínicos, em grande parte, muito mais seguros. Durante as

três décadas passadas os benzodiazepínicos (BZD) foram as drogas de primeira linha

para tratar as desordens da ansiedade (DINAN, 2006).

É importante uma melhor compreensão dos processos moleculares e

neuroanatômicos envolvidos nos distúrbios da ansiedade para facilitar o

desenvolvimento de tratamentos mais eficazes. Os principais grupos de substâncias

utilizados no tratamento dos transtornos da ansiedade são os benzodiazepínicos e

agonistas parciais dos receptores de serotonina 5-HT

. Mais recentemente novos

estudos destacam os grupos de antagonistas glutamatérgicos e ansiolíticos que atuam

em outras vias de neurotransmissão.

2.1 BENZODIAZEPÍNICOS

Os benzodiazepínicos constituem um grupo de drogas que exercem, em graus

variados, cinco grandes ações: ansiolítica, anticonvulsivante, relaxante muscular,

hipnótica e amnésia anterógrada. Devido a este último efeito, os BZD são usados

rotineiramente em procedimentos cirúrgicos para assegurar que os pacientes esqueçam

a experiência desagradável na cirurgia (JENKINS et al, 2007; KING, 1992; VON

DELIUS; HOLLWECK; SCHMID, 2007). Desde sua descoberta, em parte devido a sua

segurança e eficácia no tratamento de insônia e desordens da ansiedade, este grupo

de drogas tornou-se um dos mais prescritos em todo o mundo (WIKINSKI et al, 2001).

O ácido γ-aminobutírico (GABA), representado na Figura 1A, é o principal

neurotransmissor inibitório no cérebro dos mamíferos e seus efeitos são mediados

através de dois tipos de receptores, do ionotrópico GABA

e do metabotrópico GABA

(WHITING, 2006). Receptor GABA

são proteínas transmembranas hetero-oligoméricas

expressas no Sistema Nervoso Central (SNC) e periférico, os quais são os canais do

íon cloreto regulado por ligante. (MOHLER et al., 1995; GALLAGHER; PRIMUS, 1992;

BARNARD et al., 1998). A ligação do neurotransmissor GABA ocorre na interface entre

as subunidades α e β o que causa a abertura do canal, permitindo o rápido influxo de

cloreto ([Cl

]

) dentro da célula (JACOB; MOSS; JURD, 2008).

(A) (B) (C)

Figura 1 Estruturas químicas do Ácido gama-aminobutírico (A); Diazepam (B) e Flumazenil (C).

(COZAR et al, 1996; MANDEMA; GUBBENS-STIBBE; DANHOF, 1991; SHAFAATI; LUCY,

2005)

Os benzodiazepínicos exercem seu efeito através da ligação a um sítio

específico, subunidades α e β, no complexo macromolecular do receptor ácido γ-

aminobutírico (GABA

), distinto do sítio ligante do GABA (Figura 2). O BZD age de

modo alostérico potencializando a atividade de concentrações subsaturadas do GABA e

acentua a entrada de cloreto dentro do neurônio, com a consecutiva hiperpolarização e

ação inibitória (WIKINSKI et al, 2001; MARDER et al., 2003; KAHNBERG et al., 2002).

Figura 2 Estrutura do Receptor GABA

5 subunidades reúnem-se para formar o

heteropentamérico canal permeável ao Cl

(JACOB;

MOSS; JURD

, 2008).

Citosol

Alguns exemplos de BDZ são: flurazepam, clonazepam, bromazepam,

lorazepam, sendo o mais utilizado; diazepam. A figura 1B mostra a estrutura química do

diazepam. Esse fármaco tem sido relatado em demonstrar efeitos ansiolíticos em vários

modelos animais, como labirinto em cruz elevado, caixa claro-escura e campo aberto

(CHAOULOFF; DURAND; MORMEDE, 1997; COSTALL et al., 1989; CRAWLEY;

GOODWIN, 1980, CRAWLEY, 1985, CRAWLEY; DAVIS, 1982; GRAEFF; FERREIRA

NETTO; ZANGROSSI, 1998; HASCOET; BOURIN, 1998; LEPICARD et al., 2000.

MECHAN et al., 2002; PELLOW et al., 1985).

A descoberta dos benzodiazepínicos contribuiu para uma melhor compreensão

das bases da ansiedade. Essas drogas foram introduzidas na prática médica há mais

de quatro décadas e são os agentes ansiolíticos de escolha devido a sua efetividade e

relativa segurança. Entretanto, os BDZ podem induzir tolerância e dependência física

(WALKER, 1990), esse é um dos fortes motivos da atual busca de novas alternativas de

medicamentos mais eficazes, com reduzidos efeitos tóxicos e baixo custo,

principalmente envolvendo produtos de origem sintética, semi-sintética e natural.

Os transtornos da ansiedade são doenças crônicas que necessitam de

tratamentos de longo prazo e o uso prolongado dos BDZ pode causar declínio de todos

os domínios cognitivos (BARKER et al., 2004). Um aumento da sensibilidade de doses

hipnóticas de BZD foi evidenciado em humanos e animais idosos juntos com alta

incidência de um estado confusional e ataxia, o qual foi associado com quedas e

fraturas (ASHTON, 1994).

Os BDZs são uma das classes de drogas psicoativas mais prescritas, apesar dos

efeitos colaterais que produzem como sedação, miorelaxamento, ataxia, amnésia,

pontencialização e tolerância ao álcool etílico e ao barbitúrico (PALADINI et al., 1999;

WOODS; KATS; WINGER, 1992; HAMON, 1997).

Reações paradoxicais de agressividade com o uso de BZD têm sido discutidas

na literatura científica desde a década de 60. Este termo foi introduzido para descrever

reações de agitação e de desinibição que ocorrem durante o tratamento ansiolítico ou

hipnótico do BZD. A agressão física, estupro, a tomada de decisão impulsiva e a

violência foram relatadas assim como, a auto-agressividade e o suicídio (SAIAS;

GALLARDA, 2008).

O uso dos BZDs por longo tempo leva a dependência e tolerância (ENNACEUR

et al, 2008). Um grande investimento tem sido feito em estudos com animais,

principalmente ratos e camundongos, no desenvolvimento de novos compostos com

estruturas relacionadas ao GABA

porém, sem os efeitos colaterais conhecidos dos

BDZs.

O flumazenil (Fig. 1C), imidazobenzodiazepínico, liga-se com alta afinidade a

locais específicos sobre o receptor GABA

, onde antagoniza competitivamente a

ligação e os efeitos alostéricos dos benzodiazepínicos e de outros ligantes, portanto, é

indicado para reverter o efeito sedativo dos BZD quando este é usado durante cirurgia

ou outro procedimento médico, e também para tratar overdose dos BDZ (WEINBROUM

et al., 1997; MULLINS, 1999; SHANNON et al., 1997; PETERS et al., 1999; HOFFMAN;

WARREN, 1993).

2.2 AGONISTAS DOS RECEPTORES DE SEROTONINA 5-HT

O aminoácido precursor da serotonina endógena é o triptofano, conforme

visualizado na figura 3. A serotonina (5-hidrotriptamina ou 5-HT) influencia uma

variedade de comportamentos e processos fisiológicos que incluem o despertar, ciclo

dormir-acordar, ingestão de alimentos e comportamentos relacionados à ansiedade

(GRAEFF et al., 1996; HALFORD; BLUNDELL, 1996; JACOBS; FORNAL, 1999;

LEONARD, 1996).

Triptofano Triptofano

hidroxilase

5-hidroxitriptofano

Ácido-L-

aromático

Descarboxilase

Serotonina

Figura 3 Biossíntese da serotonina. (WONG; PERRY; BYMASTER, 2005)

Os corpos celulares dos neurônios que contêm serotonina agrupam-se na ponte

e na porção superior da medula oblonga próximo à linha mediana (rafe), sendo

freqüentemente denominada núcleos da rafe. Os núcleos de localização rostral

projetam-se, através do feixe prosencefálico medial, para muitas partes do córtex,

hipocampo, gânglios da base, sistema límbico e hipotálamo. As células de localização

caudal projetam-se para o cerebelo, a medula oblonga e a medula espinal

(BOUWKNECHT et al, 2007). Lowry et al., (2005) exploram a possibilidade da

regulação do estágio da ansiedade e comportamentos relacionados à ansiedade pelo

sistema serotoninérgico mesolímbico que se origina em partes do núcleo da rafe dorsal.

De acordo com Barnes e Sharp (1999) a serotonina exerce inúmeras ações

complexas, as quais são reflexos da profusão de subtipos de receptores de 5-HT. Os

principais locais de ação são os seguintes: trato gastrintestinal, músculo liso, vasos

sanguíneos, plaquetas, terminações nervosas e no sistema nervoso central.

Na atualidade são reconhecidos sete tipos principais de receptores 5-HT

1-7

todos

estes receptores são acoplados a proteína G, à exceção do receptor 5-HT

, que é um

canal de cátion operado por ligante. Segundo Hoyer et al (1994) todos os membros da

subfamília do receptor 5-HT

estão acoplados negativamente à adenilciclase e pelo

menos um subtipo de receptor 5-HT

, receptor 5-HT

, também ativa um canal de K

inibe um canal de Ca

regulado por voltagem.

Os receptores 5-HT

são abundantemente expressos nos neurônios 5-HT do

núcleo da rafe dorsal, estão envolvidos na regulação da temperatura, também são

encontrados em regiões do SNC como o hipocampo e a amígdala associadas ao humor

e à ansiedade (MORAES et al, 2008). A ativação dos receptores 5-HT

leva à aumenta

da condutância de K

que leva a hiperpolarização e inibição neuronal. Esses receptores

podem ser ativados por azaspironas como a buspirona e a ipsapirona, usadas para

tratar a ansiedade (TOTH, 2003). A buspirona mostrou ser ativa em vários modelos

animais de ansiedade (POLTRONIERI et al., 2003 ; HASCOET et al., 1994) e em

estudo clínico (DEAKIN, 1993).Clément et al, (1996) relatam que modificações na

neurotransmissão da serotonina tem sido associada a fisiopatologia da ansiedade e

depressão.

A buspirona é igualmente eficaz aos benzodiazepinicos e está livre dos efeitos

adversos relatados dos mesmos, mas podem induzir vertigem, náusea, insônia e um

aumento dos níveis de prolactina. A principal falha deste ansiolítico é ter um início de

ação mais lento quando comparado aos BZD (PECKNOLD et al., 1989; BOURIN;

MALINGE, 1995; DELLE CHIAIE et al., 1995).

Os receptores 5-HT

são principalmente encontrados na substância negra e

globo pálido (PAZOS; PALÁCIOS, 1985) e são auto-receptores pré-sinápticos terminais

(HOYER; MIDDLEMISS, 1989). A ativação destes receptores pode levar ao aumento da

ansiedade e locomoção e a diminuição da atividade sexual e comportamentos

agressivos (CHOPIN; MORET; BRILEY, 1994; SANCHEZ et al., 1993; SAUDOU et al.,

1994). Segundo Rodgers et al. (1992) em estudos envolvendo vários agonistas 5-HT

mostraram atividade ansiogênica em modelos animais de ansiedade.

2.3 ANTAGONISTAS GLUTAMATÉRGICOS

O sistema glutamatérgico constitui o principal sistema neurotransmissor

excitatório no cérebro, e representam cerca de 50% dos neurônios cerébrais. O

glutamato (Fig. 4) age pela estimulação de dois maiores grupos de receptores

glutamato ionotrópicos (iGlu) e receptores glutamato metabotrópicos (mGlu). Os

ligantes do receptor iGlu tem uma influência direta nos fluxos dos íons no SNC,

enquanto os ligantes do receptor mGlu exercem um papel modulatório no SNC

(PALUCHA; PILC, 2007).

Figura 4. Estrutura do glutamato. (JERICÓ et al, 1998)

O receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) é um dos principais receptores glutamato

ionotrópico no cérebro (MONAGHAN et al, 1989), a estimulação dos quais são

responsáveis por vários dos efeitos excitatórios no SNC (Figura 5).

O receptor NMDA consiste de vários ligantes e sítios moduladores (DANYSZ;

PARSONS, 1998). A ativação dos receptores NMDA requer tanto a glicina quanto o

glutamato (Fig. 6). O sítio de ligação da glicina é distinto do sítio de ligação do

glutamato, e ambos precisam estar ocupados para abertura do canal (KRISTENSEN et

al, 2006).

Figura 6 Receptor N-metil-D-aspartato, estado fechado e estado aberto (KRISTENSEN et al,

2006).

Estudos indicam que efeitos ansiolíticos podem ser encontrados pelo bloqueio da

neurotransmissão glutamatérgica, por um antagonista competitivo dos receptores

NMDA e que na ansiedade pode ocorrer uma hiperfunção da transmissão

glutamatérgica (DUNN; CORBETT; FIELDING, 1989; WINSLOW et al., 1990;

Glutamato

Axônio terminal

Dendrito

Figura 5 Sinapse glutamatérgica (Figura modificada de GHOSH, 2002).

Glicina

Glutamato

Fechado

Membrana

Aberto

CORBETT; DUNN, 1991; KARCZ-KUBICHA et al., 1997; CHOJNACKA-WOJCIK;

KLODZINSKA; PILC, 2001).

Receptores metabotrópicos glutamatérgicos são da família de receptores

acoplados a proteínas G, nos quais são classificados em 3 grupos. Grupo I receptores

mGlu (mGlu1 e mGlu5) que são positivamente acoplados a fosfolipase C, Grupo II

receptores mGlu (mGlu2 e mGlu3) e Grupo III receptores mGlu (mGlu4, mGlu6, mGlu7

e mGlu8) são negativamente acoplados a adenil cliclase (CONN; PIN, 1997).

Receptores do grupo I mGlu, particularmente o receptor mGlu5, pode ter um papel na

ansiedade (PALUCHA; PILC, 2007). Klodzinska et al, (2004), Varty et al. (2005),

Steckler et al, (2005) estudaram os efeitos ansiolíticos através dos antagonistas dos

receptores mGlu 1 e mGlu 5.

2.4 ANSIOLÍTICOS QUE ATUAM POR OUTRAS VIAS DE NEUROTRANSMISSÃO

A taurina é um aminoácido abundante no cérebro (JACOBSEN; SMITH, 1968). E

seu papel como um neurotransmissor foi revisado por Kuriyama (1980). De acordo com

McBride e Frederickson (1979) este aminoácido é um possível transmissor inibitório no

cerebelo, cujos níveis estão aumentados durante o estresse (MILAKOFSKY et al.,

1984). Estudos mostram que foram avaliados a atividade ansiolítica de taurina em

modelos animais para ansiedade (KONG et al, 2006; CHEN et al, 2004).

Os sistemas opióides endógenos regulam respostas neurobiológicas aos

estímulos de ameaça (RIBEIRO et al., 2005). Vários tipos de receptores opióides foram

identificados no sistema nervoso e em outros tecidos. Os receptores para opióides são

classificados em cinco tipos µ(mu), κ(capa), δ(delta), σ(sigma) e ε(epsílon)

(KRAYCHETE, 2002) . Os receptores opióides pertencem a família dos receptores

acoplados a proteína G e inibem a adenilato ciclase (DHAWAN et al., 1996), conforme

mostrado na figura 6. Portanto, promovem a abertura de canais de potássio o que reduz

a excitabilidade neuronal e inibem a abertura de canais de cálcio dependentes de

voltagem o que diminui a liberação de transmissores. Dessa forma, o efeito é inibitório

ao nível celular.

Microinjeções do agonista de receptores κ-opióides dentro da amígdala

basolateral apresentou efeitos ansiogênicos em ratos (NARITA et al, 2006). Segundo

Knoll et al., (2007) observaram efeitos ansiolíticos dos antagonistas dos receptores κ-

opióides em ratos. Outros estudos realizados por Wilson e Junor (2008) avaliaram o

papel do µ-receptor em dois modelos experimentais para estudo da ansiedade em

ratos.

Os β-bloqueadores são indicados para o tratamento de angina pectoris crônica,

hipertensão e arritmias cardíacas (NODARI; METRA; DEI CAS, 2003), mas também

são usados para tratar alguns distúrbios da ansiedade, como o transtorno do pânico e

fobia social (LIEBOWITZ et al., 1992).

Em muitos estados emocionais o sistema nervoso autônomo é ativado,

especificamente o sistema simpático que faz com que aumente a freqüência cardíaca,

tremores, sudorese e pupila dilatada. Esta classe de fármacos, a exemplo do

propranolol, é utilizada por alguns atores e músicos para reduzir os sintomas do medo

ao palco (FONTANELLA, 2003; GLEITER; DECKERT, 1996).

Os pesquisadores Kawachi et al. (1995), Cohen et al. (2000), Piccirillo et al.

(1997) e Virtanen et al. (2003) estudaram a ansiedade relacionada com a desregulação

do sistema nervoso autonômico. O Metoprolol é um β-bloqueador seletivo, atua

primariamente sobre os receptores β

, os resultados de Chaturvedi (1985) indicaram

que este fármaco é efetivo no tratamento dos sintomas da ansiedade. Bailly (1996)

pesquisou o papel do bloqueio dos β-adrenoreceptores no tratamento de desordens

psiquiátricas.

3 MODELOS ANIMAIS PARA AVALIAR DROGAS ANSIOLÍTICAS

Os modelos animais podem ser utilizados basicamente para o estudo de

fármacos ou da neurobiologia dos transtornos mentais. Em relação aos fármacos,

podem ser empregados na pesquisa de novas drogas ou na elucidação do mecanismo

de ação dos psicofármacos (ANDREATINI, BOERNGEN-LACERDA, ZORZETTO

FILHO, 2001b).

De acordo com Zangrossi e Graeff (2004) existem diversos modelos

experimentais que utilizam roedores para avaliar a atividade ansiolítica e ainda não há

um consenso na literatura a respeito daquele mais específico ou com maior poder

preditivo, ou seja, prever se a substância que está sendo testada tem ou não potencial

para ser usada no tratamento dos transtornos da ansiedade.

Os modelos animais de ansiedade utilizados obedecem a classificação proposta

por Bourin et al. (2007) que podem ser divididos em duas principais subclasses (Quadro

1); o qual envolve respostas condicionadas do animal ao estresse e geralmente a

eventos dolorosos e o segundo inclui paradigmas baseadas etologicamente e envolve

reações naturais e espontânea dos animais ao estímulo de estresse que não envolve

explicitamente dor ou desconforto.

Modelos - Respostas condicionadas Modelos - Respostas não

condicionadas

Conflito de Geller-Seifter Exploração claro-escuro

Conflito de Vogel Interação social

Esconder esfera Placa perfurada

Esquiva ativa/passiva Vocalização ultra-sônica

Resposta emocional condicionada Campo aberto

Aversão condicionada ao sabor Labirinto em cruz elevado

Quadro 1 Classificação dos modelos animais de ansiedade (BOURIN et al., 2007).

Nesta pesquisa foram os utilizados os modelos não condicionados (espontâneos)

que são menos suscetíveis a fatores de interferência como aprendizado/memória,

fome/sede ou mecanismos nociceptivos (RODGERS et al., 1997)

O teste da caixa claro/escuro é um procedimento experimental descrito por

Crawley e Goodwin (1980) e ligeiramente modificado por Costall et al. (1989). O teste é

baseado na aversão inata dos roedores às áreas iluminadas e no comportamento

exploratório espontâneo em resposta ao ambiente novo e à luz. As drogas ansiolíticas

induzem um aumento nos comportamentos executados na parte clara (BOURIN;

HASCOET, 2003).

O teste da interação social foi relatado por File e Hyde em 1978, onde dois ratos

são colocados em uma arena e neste teste observa-se que as drogas ansiolíticas

aumentam o tempo gasto em interação social ativa, entendida como comportamento

mútuo de cheirar, limpar ou apresentar algum indício de comportamento sexual em

relação ao outro animal, enquanto que as drogas ansiogênicas reduzem tais efeitos

(FILE, 1980).

O método da placa perfurada foi proposto por Clark, Koster e Person (1971),

onde o animal é colocado individualmente no centro da placa, por um período de cinco

minutos e registra-se o tempo entre a colocação do animal na placa e o primeiro

mergulho da cabeça em qualquer das cavidades (latência) e o número de total de

mergulhos (MONNIER; LALONDE, 1995).

O teste do campo aberto é um modelo animal que avalia a atividade locomotora

e exploratória (ARCHER, 1973, BOURIN et al., 2007), podendo ser utilizado para

pesquisar drogas com atividade ansiolítica, entretanto esta última é questionável em

virtude de também pesquisar drogas com atividades estimulantes (PRUT; BELZUNG,

2003).

O modelo do labirinto em cruz elevado (LCE) é o mais aceito e utilizado pela

comunidade científica para pesquisar agentes ansiolíticos e ansiogênicos em roedores

(TREIT, 1985; RODGERS; DALVI, 1997, PELLOW et al., 1985; LISTER, 1987;

GRUNDMANN et al., 2007; POLESZAK et al., 2008). O aparelho é elevado do assoalho

com dois braços abertos e dois fechados, entre eles está uma plataforma central. O

tempo passado nos braços abertos e a porcentagem das entradas nos braços abertos

são usados como índices experimentais da ansiedade (RODGERS; DALVI, 1997;

ROSA et al., 2000; CAROBREZ; BERTOGLIO, 2005). Entretanto, outros parâmetros

como: o número de comportamentos de levantar, o número de comportamentos de

autolimpeza, o número de mergulhos (quando o animal coloca a cabeça fora do

aparelho) e a latência para entrar nos braços abertos, também podem ser avaliados

pelo LCE (LEPICARD et al., 2000; HO et al., 2002).

4 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE PLANTAS MEDICINAIS

O Brasil é um país que tem uma diversidade genética vegetal que representa

uma das maiores do mundo. Tem mais de 55.000 espécies conhecidas em um total

estimado entre 350.000 e 550.000, e destas espécies muitas apresentam atividade

biológica (RODRIGUES et al., 2008).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) plantas medicinais são todas

aquelas, silvestres ou cultivadas, que são utilizadas como recurso para prevenir, aliviar,

curar e modificar um processo fisiológico normal ou patológico, e ainda como fonte de

fármacos e de seus precursores (ARIAS, 1999).

A qualidade das plantas medicinais e aromáticas é obtida durante todo o

processo produtivo, desde a identificação botânica, escolha do material vegetal, época

e local de plantio, tratos culturais, determinação da época de colheita e cuidados na

colheita (MARCHESE; FIGUEIRA, 2005).

As plantas têm múltiplas ações farmacológicas e contêm vários constituintes

químicos e tem sido uma importante fonte de novos fármacos (SONAVANE et al., 2002;

ANTHONY; FYFE; SMITH, 2005). As atividades biológicas das plantas são

correlacionadas à presença de compostos químicos, particularmente os metabólitos

secundários. A presença destes compostos pode justificar alguns dos usos tradicionais

das plantas medicinais.

O valor medicinal e a atividade biológica das plantas são geralmente devido a

seus perfis fitoquímico, cuja composição é totalmente dependente dos fatores

geográficos e ambientais (KIRAN; DEVI; REDDY, 2008), por exemplo, o número de

horas que as plantas recebem de luz solar podem influenciar na fitoquímica da planta.

Segundo Poser e Mentz (2003) os constituintes químicos produzidos pelas

plantas podem ser divididos em dois grandes grupos. O primeiro grupo, essencial a

todos os vegetais, que são os metabólitos primários, tais como lipídeos, protídeos e

glicídeos, com funções vitais bem definidas. E o segundo grupo de compostos químicos

são os metabólitos secundários, que normalmente apresentam estrutura complexa,

pronunciadas atividades biológicas e são encontradas em determinados grupos de

plantas. Exemplos deste último grupo destacam-se saponinas, cumarinas, flavonóides,

alcalóides, taninos, óleos essenciais, entre outros.

A espécie Lippia alba (Mill.) N. E. Br. é uma planta nativa da América do Sul,

popularmente conhecida por erva cidreira (SILVA et al, 2006). Várias pesquisas foram

realizadas para estudar as atividades antifúngicas (DUARTE et al., 2005),

antibacterianas (SENA FILHO et al. 2006), antivirais (RUFFA et al., 2004),

antiprotozoárias (CALZADA et al., 2006, 2007) dos óleos essenciais e extratos da L.

Alba.

As drogas obtidas de fontes naturais de plantas estão surgindo como terapias

adjuvantes no tratamento de desordens psiquiátricas (KIENZLE-HORN 2002; CARLINI,

2003). A Valeriana officinallis é uma planta usada para tratar ansiedade e insônia

(KENNEDY et al., 2006; MORAZZONI; BOMBARDELLI, 1995). Os extratos do Kava-

kava (Piper methysticum) e da Erva de São João (Hypericum perforatum) são

conhecidos por terem uma eficácia clínica no tratamento da ansiedade e na depressão,

respectivamente (ERNST, 2002). Há relatos do aparecimento ou agravamento de

sintomas extrapiramidais (parkinsonianos) com o uso do kava-kava (PITTLER; ERNST,

2000). Testes clínicos foram realizados para avaliar a hepatoxicidade do P.

methysticum (TESCHKE; SCHWARZENBOECK; HENNERMANN, 2008).

Algumas plantas são usadas tradicionalmente na China e Índia, para melhorar a

função cognitiva e para aliviar outros sintomas associados com a doença de Alzheimer

(HOWES; HOUGHTON, 2003). A decocção de folhas e sementes da Casimiroa edulis

tem sido amplamente usada para tratar ansiedade e insônia na medicina tradicional no

México (HERNÁNDEZ, 1993; MORA et al, 2005b).

Os efeitos anticonvulsivantes dos extratos das folhas e sementes do Panax

quinquefolium L., uma planta nativa do Norte da América, foram observados em

modelos animais por Lian, Zhang e Stringer (2005). Já o grupo de Xiu-Yan et al. (2007)

isolou e extraiu saponinas da raiz do P. quinquefolium para avaliar o efeito ansíolitico

em camundongos. O extrato do Apocynum venetum mostrou significativa atividade

antidepressiva no teste do nado forçado em ratos (BUTTERWECK et al., 2001).

Grundmann et al. (2007) avaliaram o efeito ansiolítico do extrato etanólico das

folhas do A. venetum no teste do LCE com camundongos. Ensaios pré-clínicos

(ELHABAZI et al., 2006) mostraram que o Thymus broussonetti Boiss apresentou

atividade ansiolítica no teste da caixa claro e escura. Vasconcelos et al. (2007)

estudaram a atividade anticonvulsivante dos extratos hidroalcoólicos das cascas do

caule de Erythrina velutina e Erythrina mulungu. Os efeitos do extrato aquoso das

folhas da Hyptis pectinata sobre o SNC de roedores foram avaliados por Bueno et al.

(2006). Dhawan, Kumar e Sharma (2001), avaliaram a atividade ansiolítica de extratos

da Passiflora incarnata nas doses de 100, 125, 200 e 300 mg/kg em camundongos.

Audi et al. (2001) pesquisaram os efeitos no SNC do extrato hidroalcoólico das folhas

de Kielmeyera coriacea por meio dos modelos comportamentais que incluíram natação

forçada, campo aberto e o teste do LCE.

A busca por novas farmacoterapias de plantas medicinais para doenças

psiquiátricas progrediu significativamente na década passada (ZHANG, 2004). Isto é

refletido no grande número de medicamentos a base de ervas cujo potencial

psicoterapêutico foi avaliado em uma variedade de modelos animais (MORA et al.,

2005a).

5 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS ÓLEOS ESSÊNCIAS E SEUS PRINCIPAIS

COMPONENTES

De acordo com a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 02, de 15 de

janeiro de 2007 (BRASIL, 2007), os óleos essenciais (OEs) são produtos voláteis de

origem vegetal obtidos por processo físico, tais como destilação por arraste com vapor

de água, destilação a pressão reduzida ou outro método adequado. Esses óleos podem

ser extraídos de flores, caules, frutos e raízes de diversas espécies de vegetais

aromáticas e possuem diferentes aplicações (BUSATTA, 2006).

Os OEs e seus constituintes são utilizados em diversos setores industriais, por

exemplo, agentes flavorizantes na indústria alimentícia, como fragrâncias para a

indústria de perfume e cosméticos, em formulações de medicamentos pela indústria

farmacêutica e como essências em produtos de higiene e limpeza (LEVISON et al.,

1994; De VINCENZI; MANCINI; DESSI, 1996).

As plantas possuem substâncias odoríferas que tem como várias funções, tais

como: inibidores da germinação, na proteção contra predadores, na atração de

polinizadores, na proteção contra a perda de água e aumento de temperatura (ENAN,

2001; MCGARVEY; CROTEAU, 1995; BAKKALI et al., 2008).

Os óleos essenciais podem também ser chamados de óleos etéreos ou

essências. A designação de “óleo” é devida a algumas características físico-químicas

como a de serem geralmente líquidos de aparência oleosa à temperatura ambiente.

Sua principal característica é a volatilidade, o que os difere dos óleos fixos, que são

misturas de substâncias lipídicas obtidas normalmente de sementes (SIMÕES;

SPITZER, 2004).

Dependendo da família, os OEs podem ocorrer em estruturas secretoras

especializadas, tais como em pêlos glandulares (Lamiaceae), células parenquimáticas

diferenciadas (Lauraceae, Piperaceae, Poaceae), canais oleíferos (Apiaceae) ou em

bolsas lisígenas ou esquizolisígenas (Pinaceae, Rutaceae). Os OEs podem estar

estocados em certos órgãos, tais como nas flores (laranjeira, bergamoteira), folhas

(capim-limão, eucalipto, louro) ou ainda nas cascas dos caules (canela), madeira

(sândalo, pau-rosa), raízes (vetiver), rizomas (cúrcuma, gengibre), frutos (anis-

estrelado, funcho, erva-doce) ou sementes (noz-moscada) (SIMÕES; SPITZER, 2004).

Os componentes dos óleos essenciais das plantas são divididos em duas

classes químicas inteiramente distintas, terpenóides e fenilpropanóides, que se

originam de metabolismos precursores diferentes e são gerados por rotas biossintéticas

completamente distintas. Os terpenóides são preponderantes nos óleos voláteis e são

originados a partir do ácido mevalônico e os fenilpropanóides, provenientes do ácido

chiquímico (SANGWAN et al., 2001).

É bem estabelecido que os terpenóides são derivados a partir de cinco unidades

de carbono, chamadas de isopreno, conforme figura 7. Os principais terpenos são os

monoterpenos (C

) e sesquiterpenos (C

) (BAKKALI et al., 2008).

Isopreno Monoterpeno Sesquiterpenos

Figura 7 Estrutura química dos compostos: isopreno, monoterpeno e sesquiterpeno (MELO,

2005)

As atividades biológicas são atribuídas aos monoterpenos, que são os principais

componentes químicos dos óleos essenciais (DO AMARAL et al., 2007). Os

monoterpenos podem ainda ser divididos em três subgrupos: acíclicos (mirceno, linalol

e geraniol), monocíclicos (α-terpineol e terpinoleno) e bicíclicos (α-pineno e cânfora).

Em cada um desses subgrupos, há ainda outras classificações: hidrocarbonetos

insaturados (limoneno), álcoois (mentol), aldeídos ou cetonas (mentona e carvona),

lactonas (nepelactona) e tropolonas (γ-tujaplicina) (SIMÕES; SPITZER, 2004).

No século XVI, na Alemanha surgiu a aromaterapia com o objetivo de usar OEs

com finalidades terapêuticas (PERRY; PERRY, 2006). De acordo com Delgado (2005),

as substâncias usadas na aromaterapia não são fragrâncias ou misturas aromáticas

usadas na indústria de perfume, mas óleos essenciais puros, substâncias voláteis

extraídas de diversas partes de plantas as quais tem propriedades curativas.

Os óleos essenciais contidos em várias espécies de plantas aromáticas têm sido

utilizados para o tratamento de diferentes doenças, incluindo a epilepsia e a ansiedade

(ALMEIDA et al., 2004; BAKKALI et al., 2008).

Os OEs derivados de plantas exibem várias atividades biológicas tais como

antiinflamatória (ALMEIDA et al, 2001), antinociceptiva (ALMEIDA; NAVARRO;

BARBOSA-FILHO, 2001a), anticonvulsivante (De SOUSA et al., 2006), antidepressiva

(KOMORI et al, 1995), sedativa (BUCHBAUER et al., 1993) e ansiolítica (ALMEIDA et

al., 2004; KOMIYA; TAKEUCHI; HARADA, 2006, UMEZU, 1999).

Os óleos essenciais da Artemísia dracunculus possuem atividade

anticonvulsivante nos testes das convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol (PTZ) e

por eletrochoque auricular (SAYYAH; NADJAFNIA; KAMALINEJAD, 2004). Os três

principais monoterpenos identificados neste trabalho foram trans-Anethole, trans-

Ocimene e limoneno. Santos et al. (2005) avaliaram o efeito antinociceptivo das folhas

do OE do Croton sonderianus em camundongos, os resultados das análises deste óleo

por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM) mostrou o

predomínio de mono e sequiterpenos.

De Sousa et al. (2007) avaliaram o efeito psicofarmacológico do monoterpeno

α,β-epóxi-carvona no SNC nas doses de 200, 300 e 400 mg/kg administrado por via

intraperitoneal (i.p.) em camundongos. Silva et al. (2007) investigaram a atividade no

SNC com a administração via i.p. do isopulegol e os resultados deste monoterpeno

mostraram efeitos ansíoliticos e antidepressivos.

Estudos recentes mostram que OEs exibem efeitos ansiolíticos em diversos

modelos comportamentais de ansiedade. Pultrini, Galindo e Costa (2006)

demonstraram efeito ansiolítico do óleo essencial de Citrus aurantium nos testes de

esconder esfera e na caixa claro e escuro. Carvalho-Freitas e Costa (2002) avaliaram o

efeito do OE de C. aurantium através do labirinto em cruz elavado. Rajkumar et al.

(2007) avaliaram o potencial ansiolítico do OE de Celastrus paniculatus em ratos. O

óleo de lavanda mostrou efeitos semelhantes aos observados com o diazepam em um

modelo condicionado, o teste conflito de Geller (UMEZU, 2000).

Pesquisas em humanos demonstraram que pacientes do sexo feminino expostas

ao ambiente com o odor de laranja produziram uma diminuição dos níveis de

ansiedade, melhora no humor e altos níveis de tranqüilidade (LEHRNER et al, 2000).

Estudos controlados com pacientes submetendo-se a hemodiálise de modo crônico

reduziram a depressão e ansiedade com os aromas dos óleos de hiba e lavanda (ITAI

et al, 2000).

Ensaios clínicos foram realizados para avaliar o efeito comportamental dos OEs

interferindo na atenção humana (ILMBERGER; HEUBERGER; MAHRHOFER, 2001).

Graham et al. (2003) pesquisaram se inalação da aromaterapia durante a radioterapia

reduzia a ansiedade. Outro estudo (Wilkinson et al., 2007) avaliou a eficácia da

massagem com aromaterapia no controle da ansiedade e da depressão nos pacientes

com câncer. Os resultados de Haze et aL. (2002) mostraram que a inalação de OEs

podem modular a atividade simpática em adultos normais.

6 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O D-LIMONENO

O limoneno é um hidrocarboneto, classificado como um terpeno cíclico. É

denominado pela IUPAC como: 1-Metil-4-prop-1-en-2-yl-ciclohexene. Apresenta a

fórmula molecular: C

. Seu nome provém do limão, porque a casca do limão, como

outras frutas cítricas, contém quantidades consideráveis deste composto químico, o

qual é responsável pelo cheiro característico (DE MAYO, 1959). É encontrado em

ambas as formas isoméricas R-(+) e S-(−), e também como misturas racêmicas. R-(+)

limoneno é o isômero mais abundante e pode ser isolado da casca da laranja, enquanto

o isômero do S(−) pode ser obtido da casca de limão (DE CASTILHO et al., 2007).

O limoneno é formado a partir do geranil pirofosfato, via ciclização do neril

carbocátion ou seu equivalente como mostrado na figura 8 (MANN et al, 1994). O final

da etapa envolve a perda do próton do cátion para formar o alceno.

Figura 8 Formação do limoneno a partir do geranil pirofostato (MANN et al., 1994).

Limoneno serve como precursor para outros monoterpenos monociclícos

oxigenados, tais como carveol, carvona, geraniol, mentol, álcool perílico e peril aldeído

(MCGARVEY; CROTEAU, 1995; KARP et al., 1990).

O limoneno teve amplas aplicações industriais e seu uso teve um crescimento

rápido (GELLING; LOADMAN; SIDEK, 1979). A demanda do mercado para o limoneno

flutua consideravelmente. Seu preço era 1 US$/kg durante o período de 1986-1988 e

aumentou para 9 US$/kg em 1995–1996. O preço de venda de 1 kg em novembro de

1999 foi de 10 US$ (PAKDEL; PANTEA; ROY, 2001). Este monoterpeno é usado em

muitos produtos alimentícios, sabões e perfumes devido a seu sabor e odor parecido

com limão, é um ingrediente ativo registrado em quinze produtos pesticidas usados

como inseticidas, repelentes de inseto, e repelentes de cão e do gato (EPA, 1994).

geranil

pirofosfato

limoneno

D-Limoneno é um monoterpeno prevalente em óleos essenciais de várias

espécies vegetais tais como Artemísia dracunculus L. (Asteraceae) (SAYYAH;

NADJAFNIA; KAMALINEJAD, 2004), Lippia alba (Mill.) N.E. Brown (Verbanaceae)

(VALE et al., 2002) e Citrus aurantium L. (Rutaceae) (PULTRINI et al., 2006).

O Limoneno apresenta grupos funcionais e estrutura química semelhante a

vários outros monoterpenos (Figura 9) que possuem atividade farmacológica no SNC

(Do AMARAL et al., 2007; SILVA et al., 2007; DE SOUSA et al., 2007, SANTOS, 2007).

(A) Limoneno

(B) α,β-epóxi-Carvona

Figura 9 Estruturas químicas do limoneno (A), e de outros monoterpenos com atividade no

SNC: α,β-epóxi-carvona (B), isopulegol (C), linalol (D).

O metabolismo do monoterpeno D-limoneno pelos mamíferos foram investigados

por Kodama et al. (1974; 1976). O limoneno e/ou seus metabólitos são detectados no

fígado, pulmão e em muitos outros tecidos, (IGIMI et al., 1974) em alta concentração

nos tecidos adiposos e glândulas mamárias do que em tecidos menos adiposos

(CROWELL et al. 1992). A meia-vida deste monoterpeno em ratos e humanos foi

estimado em 12-24 horas e a excreção ocorre principalmente através da urina. O

limoneno é metabolizado em metabólitos oxigenados tanto em ratos quanto em

humanos (CROWELL et al, 1992, 1994).

O uso de fitoconstituintes de forma preventiva pode ser um dos caminhos para o

controle do câncer. Estudos mostram (RABI; GUPTA, 2008) que as substâncias

fitoquímicas obtidas de vegetais, frutas, ervas e plantas medicinais, tais como os

terpenóides e outros compostos fenólicos, tem sido eficaz em suprimir a carcinogênese

experimental em vários órgãos nos modelos pré-clínicos. Tsuda et al. (2004) relata que

os constituintes de plantas incluindo os derivados de vitaminas, agentes fenólicos,

flavonóides, compostos orgânicos sulfúricos, isotiocianatos, ácidos graxos e o d-

limoneno são úteis na quimio-prevenção do câncer. Diversas pesquisas foram

realizadas no século XX com o limoneno para avaliar a atividade antitumoral

(DIETRICH; SWENBERG, 1991; ELEGBEDE et al., 1984; ELSON et al., 1988; ELSON;

YU, 1994; GOULD et al., 1994; HURSTING et al., 1995; KAWAMORI et al., 1996;

MALTZMAN et al., 1991).

Vale et al. (1999) avaliaram o efeito comportamental de três quiomiotipos de óleo

essenciais de Lippia alba (Mill.) N.E. As análises de cromatografia gasosa deste estudo

revelaram predominantemente monoterpenos. O quimiotipo I era constituído por citral,

β-mirceno e limoneno. Quimiotipo II: citral e limoneno e o Quimiotipo III: carvona e

limoneno.

De acordo com Henson et al. (2005) mais de cem componentes diferentes foram

isolados da alfazema (Lavandula angustifolia) incluindo limoneno, linalol, taninos,

cumarinas e flavonóides. Chalchat e Ozcan (2008) identificaram o limoneno como um

dos maiores constituintes das folhas de Ocimum basilicum L. através da CG-EM.

Cymbopogon schoenanthus L. Spreng é uma erva aromática consumida em

saladas e usada para preparar receitas tradicionais de carne na Tunísia. Khadri et al.

(2008) avaliaram a atividade anticolinesterásica e antioxidante do óleo essencial do C.

schoenanthus e analisaram a composição química do OE por CG-EM e através de

ressonância magnética nuclear de carbono 13 (RMN

C), onde os principais

componentes identificados foram limoneno (10.5–27.3%), β-phellandrene (8.2–16.3%),

δ-terpineno (4.3–21.2%) e α-terpineol (6.8–11.0%).

Lin et al. (2008) avaliaram a atividade antiinflamatória do OE obtido da fruta do

Cinnamomum insularimontanum, e os componentes mais abundantes encontrados

neste óleo foram citral, seguido pelo citronelal, citronelol, α-pineno, β-pineno, e

limoneno. O grupo de Kiran (2008) avaliou a atividade antimicrobiana in vitro de folhas e

sementes do OE de Chloroxylon swietenia DC. O limoneno e geijerene foram os

constituintes mais abundantes nas folhas e sementes.

As plantas aromáticas contêm frações voláteis e não-voláteis e a composição

química dessas duas frações podem ser influenciadas por mudanças sazonais.

Kamatou et al. (2008) pesquisaram a variação sazonal da composição de óleos

essenciais de três espécies de Salvia do Sul da África, e um dos principais

componentes encontrados da S. africana-caerulea foi o limoneno. Este monoterpeno

apresentou-se em concentrações variadas em diferentes épocas do ano.

É relatada no trabalho de Tanida et al. (2005) que o odor do óleo do grapefruit e

do seu componente ativo, limoneno, afetou a neurotransmissão autonômica e pressão

sanguínea em ratos.

Considerando que vários monoterpenos apresentam atividade no SNC e o

limoneno apresenta estrutura semelhante a tais monoterpenos (Figura 9), o presente

trabalho tem por objetivo avaliar e caracterizar a atividade ansiolítica do D-Limoneno

utilizando modelos animais.

Diante do exposto onde se relata a importância de produtos naturais na

descoberta de novos compostos com atividade biológica, especificando-se os

monoterpenos, aliado ao fato da ansiedade ser um grave problema de saúde pública

em quase todos os países, há a necessidade da realização de estudos

psicofarmacológicos do D-limoneno utilizando modelos animais com o propósito de

contribuir para a pesquisa de novas drogas ansiolíticas com menores efeitos colaterais.

II OBJETIVOS:

2.1 GERAL

 Investigar os efeitos do D-limoneno sobre SNC, utilizando metodologias

específicas em animais de laboratório a fim de contribuir com a pesquisa de

novas drogas ansiolíticas.

2.2 ESPECÍFICOS

 Contribuir para o conhecimento sobre os efeitos psicofarmacológicos dos óleos

essenciais;

 Identificar e caracterizar o efeito do D-limoneno sobre o SNC;

 Avaliar a interferência do D-limoneno sobre o sistema motor;

 Avaliar o possível efeito ansiolítico do monoterpeno D-Limoneno empregando

modelos animais com tratamentos pelas vias intraperitoneal e inalatória;

 Investigar os possíveis mecanismos de ação da substância em estudo.

III – MATERIAL

3.1 ANIMAIS

Em todos os experimentos foram utilizados camundongos (Mus musculus)

machos albinos da linhagem Swiss, com 3 meses de idade, pesando entre 28-40 g

(Figura 11), provenientes do Biotério Prof. Dr. Thomas George do Laboratório de

Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba (LTF/UFPB).

Os animais foram colocados em gaiolas de polietileno, sob condições

monitoradas de temperatura (21 ± 1ºC), com livre acesso a ração do tipo pellets

(Purina

) e água. Os animais foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12 horas, sendo

a fase clara de 6h00 as 18h00.

Figura 10 Camundongo Swiss macho e albino.

3.1.1 Condições experimentais

Os experimentos foram realizados no laboratório de psicofarmacologia do

LTF/UFPB. Os animais foram previamente selecionados e alojados em gaiolas de

polietileno, contendo 4 animais cada, com pelo menos 60 minutos de antecedência à

execução dos testes, visando minimizar as possíveis alterações comportamentais dos

animais, bem como permitir uma adaptação dos mesmos ao novo ambiente. Os

camundongos foram privados de água e ração 60 minutos antes dos procedimentos

experimentais.

Os experimentos foram executados no período compreendido entre 11h00 e

16h00, sendo os animais utilizados uma única vez e, em seguida, eutanasiados por

deslocamento cervical.

Todos os procedimentos experimentais foram analisados e previamente

aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) do LTF/UFPB, mediante a

certidão nº 0605/07.

3.2 DROGAS E REAGENTES

As substâncias utilizadas nesta pesquisa foram:

 Cloreto de sódio (Merck – E. U. A.);

 Diazepam (Merck – Brasil);

 Etanol (Labsynth – Brasil);

 Flumazenil (Cristália – Brasil);

 Pentobarbital sódico (Sigma- E. U. A.);

 (R)-(+)-limoneno (DIERBERGER Óleos Essenciais S.A. - Brasil);

 Tween 80 (Vetec Química Fina LTDA – Brasil).

3.2.1 Preparo das substâncias

A preparação das doses foi feita minutos antes dos testes.

3.2.1.1 Via intraperitoneal

O D-Limoneno (DLO) foi dissolvido em Tween 80 a 1,5% e diluído em água

destilada, para ser a administrado nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg. Os grupos

controles receberam veículo (água destilada com Tween 80 a 1,5%). O diazepam (1 e 2

mg/kg) e pentobarbital sódico (40mg/kg) foram dissolvidos e diluídos em solução salina

(0.9%). O volume de solução administrada nos camundongos foi de 0,1 mL/10g.

3.2.1.2 Via inalatória

As concentrações 0,5%, 1,0 % e 2,5% do DLO foram preparadas em forma de

emulsão, o tween 80 a 1,5% foi utilizado como agente emulsificante, e a água destilada

o agente dispersante, enquanto que para os animais do grupo controle receberam uma

solução salina 0,9 % + tween 80 a 1,5%.

3.3 APARELHAGEM

3.3.1 Aparelho de rota rod

O aparelho do rota rod utilizado foi da marca Insight, modelo EFF 412 (Figura

12). Constitui-se de uma barra giratória não escorregadia, com 5,5 cm de diâmetro e 40

cm de comprimento, dividida em quatro compartimentos iguais, separados por cinco

discos plásticos de 48 cm de diâmetro cada. Equipamento confeccionado em acrílico,

com velocidade regulável de 5 a 37 rotações por minuto (r.p.m.). Este aparelho ainda

dispõe de um mecanismo automático capaz de contabilizar o tempo de permanência do

animal na barra giratória e a contagem do número de vezes em que este caiu.

Figura 11 Aparelho do rota rod.

3.3.2 Aparelho de labirinto em cruz elevado

O labirinto em cruz elevado utilizado foi da marca Insight, modelo EP 150, feito

em acrílico, cor cinza e consiste em quatro braços, sendo dois braços com paredes

laterais e sem cobertura (braços fechados), medindo 30 cm de comprimento e 30 cm de

altura, colocados perpendicularmente a dois braços desprovidos de paredes laterais

(braços abertos) com o mesmo comprimento e largura (Figura 13). Cada braço é

posicionado a 90º do braço adjacente e cruzam-se numa área central onde o animal é

posicionado. O labirinto é apoiado sob um suporte com 38,5 cm elevado em relação ao

solo.

Figura 12 Aparelho do labirinto em cruz elevado.

3.3.3 Aparelho do campo aberto

O aparelho usado foi da marca Insight, modelo EP 154C mostrado na figura 14,

confeccionado em acrílico transparente 5 mm, consiste de uma base medindo 50 x 50

cm, com desenho do campo com 30 cm de diâmetro circundada por uma parede com

30 cm de altura. O piso da arena é dividido em 12 campos (com linhas pintadas de

preto), sendo dois círculos concêntricos: um interno e outro externo com 4 divisões e 8

divisões, respectivamente.

Figura 13 Aparelho do campo aberto.

3.3.4 Caixas de Inalação

As paredes da caixa de inalação (36 x 30 x 29 cm) são feitas de acrílico. As duas

paredes de maior largura contêm quatro furos (2 cm no diâmetro cada um) onde foi

colocado o algodão embebido com a droga em análise ou salina. Depois de quatro

exposições, o algodão com o D-limoneno foi renovado para manter a concentração do

óleo dentro do aparato. O assoalho da caixa de inalação tem uma grade de aço

inoxidável onde os animais foram colocados individualmente. Foram utilizadas duas

caixas de inalação específicas (Figura 15), uma para o grupo controle e outra para o

grupo experimental (DA SILVA, 2008). Os animais permaneciam nesta caixa por 7

minutos.

Figura 14 Caixa de inalação.

IV MÉTODOS

Todos os métodos utilizados para o estudo psicofarmacológico do D-Limoneno

por via intraperitoneal em camundongos estão esquematizados na Figura 16.

Figura 15 Resumo esquemático do estudo psicofarmacológico do D-limoneno pela via

intraperiotenal.

TESTE PRELIMI

NAR DA ATIVIDADE NO SNC

TRIAGEM FARMACOLÓGICA COMPORTAMTENTAL

AVALIAÇÃO GERAL DA ATIVIDADE NO SNC

TESTE DE

ROTA ROD

TESTE POTENCIALIZAÇÃO

DO SONO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

PSICODEPRESSORA

ATIVIDADE ANSIOLÍTICA

TESTE DO

LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO

TESTE DO CAMPO

ABERTO

AVALIAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO

ANTAGONISTA BENZODIAZEPÍNICO

Todos os métodos utilizados para o estudo psicofarmacológico do D-Limoneno

por via inalatória em camundongos estão esquematizados na Figura 17.

Figura 16 Resumo esquemático do estudo psicofarmacológico do D-limoneno por via

inalatória.

TESTE PRELIMINAR DA ATIVIDADE NO SNC

TRIAGEM FARMACOLÓGICA COMPORTAMTENTAL

AVALIAÇÃO GERAL DA ATIVIDADE NO SNC

ALIAÇÃO DA ATIVIDADE

PSICODEPRESSORA

ATIVIDADE ANSIOLÍTICA

TESTE DO

LABIRINTO EM CRUZ

ELEVADO

TESTE DO CAMPO

ABERTO

AVALIAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO

ANTAGONISTA BENZODIAZEPÍNICO

4.1 TESTE PRELIMINAR DA ATIVIDADE NO SNC

4.1.1 Triagem Farmacológica Comportamental

A triagem farmacológica comportamental dos camundongos foi realizada

seguindo os parâmetros descritos por Almeida et al. (1999), Almeida e Oliveira, (2006).

A partir da triagem pode-se avaliar o possível efeito de uma droga no SNC, na qual são

observados alguns parâmetros comportamentais nos animais que possibilitam

caracterizar o efeito central da droga (SANTOS, 2008).

Os animais foram tratados com D-limoneno nas doses 25, 50 ou 100 mg/kg

através da via intraperitoneal e 0,5; 1,0 e 2,5% por via inalatória. Todos os grupos eram

constituídos por 8 camundongos machos.

Após as respectivas administrações, os camundongos foram colocados em

gaiolas de polipropileno (em grupos de quatro animais cada) e observados a cada trinta

minutos, durante quatro horas, seguindo-se um protocolo experimental padrão de

avaliação comportamental (ALMEIDA et al., 1999).

ATIVIDADE FARMACOLÓGICA

Quantificação dos efeitos

(0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente, (++) efeito intenso

até 30` 1h 2h 3h 4h

1 – SNC

a – Estimulante

Hiperatividade

Irritabilidade

Agressividade

Tremores

Convulsões

Piloereção

Movimento intenso das vibrissas

Outras_____________________

b – Depressora

Hipnose

Ptose

Sedação

Anestesia

Ataxia

Reflexo do endireitamento

Catatonia

Analgesia

Resposta ao toque diminuído

Perda do reflexo corneal

Perda do reflexo auricular

c – Outros comportamentos

Ambulação

Bocejo excessivo

Limpeza

Levantar

Escalar

Vocalizar

Sacudir a cabeça

Contorções abdominais

Abdução das patas do trem posterior

Pedalar

Estereotipia

2 – SN AUTÔNOMO

Diarréia

Constipação

Defecação aumentada

Respiração forçada

Lacrimejamento

Micção

Salivação

Cianose

Tono muscular

Força para agarrar

3 – MORTE

Observaçõescomplementares.:_______________________________________________________

Responsável Técnico

Quadro 2 Protocolo utilizado na Triagem Farmacológica (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006).

4.2 AVALIAÇÃO GERAL DA ATIVIDADE NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

4.2.1 Teste da potencialização do sono induzido pelo pentobarbital

Nesse protocolo experimental é possível verificar se a substância em estudo tem

ação depressora no sistema nervoso central, pelo fato de que, em geral, as drogas

depressoras do SNC atuam sinergicamente aumentando o tempo de sono induzido por

barbitúricos (RILEY; SPINKS, 1958).

Trinta minutos após a administração do DLO 50 mg/kg i.p., veículo i.p. ou

diazepam 2 mg/kg, i.p., todos os grupos receberam pentobarbital sódico 40 mg/kg, por

via intraperitoneal. Os parâmetros avaliados neste teste foram a latência do sono (o

intervalo entre a administração de pentobarbital sódico e a perda do reflexo de

endireitamento) e a duração do sono (o intervalo entre a perda e a recuperação do

reflexo de endireitamento) cujo tempo máximo de observação do teste foi de 240

minutos (CARLINI et al. 1986; ELISABETSKY et al., 1995; MATTEI et al., 1998;

MATTEI; FRANCA, 2006; DE SOUSA et al, 2007).

4.2.2 Avaliação da coordenação motora (teste do rota rod)

O procedimento foi descrito por Dunham e Miya (1957) que avalia a coordenação

motora dos animais pelo tempo de permanência dos camundongos na barra giratória do

aparelho rota rod (CAPASSO, 1996).

Foi realizada uma pré-seleção dos animais, sem administração de substâncias,

cujo critério era a permanência na barra giratória (2,5 cm diâmetro, 7 r.p.m., 45 cm

acima do solo) do rota rod por pelo menos três minutos (MENDES; MATTEI; CARLINI,

2002). Vinte e quatro horas após a pré-seleção, os camundongos foram divididos em

três grupos de oito animais. O primeiro grupo, considerado como controle, recebeu

solução tween 80 a 1.5% (veículo); o segundo grupo recebeu DLO na dose de 50

mg/kg e o último grupo recebeu diazepam 2mg/kg.

Após 30, 60 e 120 minutos da administração da droga por via intraperitoneal, os

animais foram colocados com as quatro patas sobre uma barra de 2,5 cm de diâmetro,

elevado a 45 cm do piso, em uma velocidade de 7 rpm. Para cada animal foi registrado

o tempo de permanência total na barra, em um período de até 3 minutos sendo o limite

máximo de três quedas para cada animal (DUNHAM; MIYA, 1957).

4.2.3 Teste do campo aberto

O teste do campo aberto é um método para avaliar a atividade exploratória do

animal, como também o comportamento de ansiedade e sedação da substância

pesquisada (ARCHER, 1973; PRUT; BELZUNG, 2003).

Neste teste foram utilizados grupos de 8 camundongos tratados com D-

Limoneno, nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg i.p. ou 0,5; 1,0 e 2,5% por via inalatória,

enquanto que o grupo controle foi tratado com o veículo e o grupo padrão com o

diazepam, na dose de 1 mg/kg (i.p.).

Trinta minutos após administração i.p. ou sete minutos após os tratamentos

inalatórios, os animais foram colocados individualmente no centro da arena para

explorar livremente o ambiente novo durante um período de 5 minutos. Os seguintes

parâmetros foram observados: ambulação (número de cruzamentos dos segmentos

pelo animal com as quatro patas), número de levantamentos (rearing), tempo de

comportamento de auto-limpeza (grooming) e defecação (número de bolos fecais)

(MONTGOMERY, 1955; LEITE; SIQUEIRA, 2006).

4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANSIOLÍTICA

4.3.1 Teste do labirinto em cruz elevado

Este teste tem como finalidade verificar os possíveis efeitos ansiolíticos ou

ansiogênicos das substâncias, uma vez que drogas ansiolíticas levam o animal ao

aumento do número de entradas e o tempo de permanência nos braços abertos,

enquanto que drogas ansiogênicas induzem ao aumento dos mesmos parâmetros nos

braços fechados (LISTER, 1987).

Foram utilizados grupos de 8 camundongos tratados com D-Limoneno nas doses

de 25, 50 e 100 mg/kg i.p. ou 0,5; 1,0 e 2,5% por v. i., enquanto que o grupo controle foi

tratado com o veículo e o grupo padrão com o diazepam, na dose de 1 mg/kg. Trinta

minutos após administração i.p. ou sete minutos após os tratamentos inalatório da

droga ou veículo, os animais foram colocados, individualmente, na plataforma central

de frente para um dos braços fechados do labirinto e o número de entradas nos braços

abertos e fechados e o tempo de permanência nos braços abertos e fechados foram

registrados por um período de 5 minutos. Considerou-se entrada nos braços quando o

animal encontrava-se com as quatro patas dentro dos limites dos mesmos (PELLOW et

al., 1985; SONAVANE et al., 2002; MORA et al, 2005a; GRUNDMANN et al., 2007).

4.4 AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA GABAÉRGICO NO EFEITO

ANSIOLÍTICO DO D-LIMONENO

4.4.1 Bloqueio do efeito ansiolítico pelo tratamento prévio com flumazenil no teste

do labirinto em cruz elevado

Neste experimento foi avaliado se o Flumazenil (Ro15 - 1788), antagonista do

sistema gabaérgico, era capaz de bloquear os efeitos do DLO no teste de labirinto em

cruz elevado, analisando seu envolvimento com o mecanismo de ação desta via no

controle da ansiedade (ARAGÃO et al., 2006).

4.4.1.1 Via intraperitoneal

Os camundongos machos foram divididos em seis grupos, três grupos: controle,

DLO (0,5; 1,0 e 2,5%) e diazepam (1 mg/kg) formados por oito animais cada, que não

foram tratados com o flumazenil a fim de comprovar seus efeitos no teste em análise,

trinta minutos após a administração de cada grupo foi colocado no aparelho do labirinto

em cruz elevado para o teste. Aos três grupos restantes foram pré-tratados com o

flumazenil na dose de 10 mg/kg por via intraperitoneal (DE MELO, 2006) e após 15

minutos foram tratados com veículo, DLO na dose de 50 mg/kg, ou diazepam na dose

de 1 mg/kg. Transcorridos 30 minutos dos tratamentos procedeu-se a observação dos

seguintes parâmetros: número de entrada e tempo de permanência nos braços abertos

e fechados. Os animais foram observados durante um período de 5 minutos no labirinto

em cruz elevado.

4.4.1.2 Via inalatória

Camundongos machos foram divididos em seis grupos, três grupos (controle,

ODL e diazepam) formados por oito animais cada, não foram tratados com o flumazenil

a fim de comprovar seus efeitos no teste em análise. O controle e o grupo do DLO (1%)

foram tratados por via inalatória, e cada grupo permaneceu na caixa inalatória por 7

minutos para serem submetidos ao teste e o grupo diazepam (1mg/kg) recebeu

tratamento pela via intraperitoneal e somente após 30 minutos da administração foi

colocado no aparelho do labirinto em cruz elevado para o teste.

Os outros três grupos formados por oito animais cada foram pré-tratados com o

flumazenil na dose de 10 mg/kg por via intraperitoneal (DA SILVA, 2008) e após 15

minutos foram tratados com diazepam (DZP) na dose de 1 mg/kg, sendo que o controle

v.i. e o grupo do DLO (1%, v.i.) foram tratados após 23 minutos da administração do

flumazenil i.p, e cada grupo permaneceu na caixa inalatória por 7 minutos para então

serem submetidos ao teste e o grupo diazepam (1mg/kg) que recebeu tratamento pela

via i.p. somente após 30 minutos da administração foi colocado no aparelho do labirinto

em cruz elevado para o teste. Transcorridos o período dos tratamentos, procedeu-se a

observação dos seguintes parâmetros: número de entrada e tempo de permanência

nos braços abertos e fechados. Os animais foram observados durante um período de 5

minutos no labirinto em cruz elevado.

4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística dos dados foi realizada através do programa GraphPad

Prism, versão 4.0 (GraphPad Sotware Incorporated, San Diego, USA).

Os resultados que obedeciam a uma distribuição paramétrica foram analisados

por Análise de Variância (ANOVA) seguido pelo teste de Dunnett (post hoc) ou teste “t”

de Student não pareado. Os dados não paramétricos foram analisados pelo mesmo

programa utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn's.

Em todas as análises estatísticas, os valores obtidos foram expressos em média

± erro padrão da média (e.p.m.), e os resultados foram considerados significativos

quando apresentaram p < 0,05. Os símbolos (*) e jogo da velha (#) caracterizam o grau

de significância, sendo que *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 é em relação ao

respectivo grupo controle e #< 0,05; ### p < 0,001 em relação ao controle positivo,

diazepam.

V RESULTADOS

5.1 TESTE PRELIMINAR DA ATIVIDADE NO SNC

5.1.1 Efeito do D-Limoneno na triagem farmacológica comportamental por via

intraperitoneal

Os animais tratados com D-limoneno (DLO) nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg

apresentaram analgesia com até 30 minutos após a administração. Na dose de 100

mg/kg foi observada hiperatividade nos 10 primeiros minutos após a administração.

O quadro 3 mostra uma síntese das principais alterações comportamentais

observadas nos animais após tratamento com o DLO em relação ao respectivo grupo

controle.

DOSE

(mg/kg, i.p.)

SUBSTÂNCIAS

TEMPO

(min)

EFEITOS OBSERVADOS

Até 30 Analgesia (+)

60 Sem alterações comportamentais

120 Sem alterações comportamentais

180 Sem alterações comportamentais

(D)-Limoneno

240 Sem alterações comportamentais

Até 30 Analgesia (+)

60 Sem alterações comportamentais

120 Sem alterações comportamentais

180 Sem alterações comportamentais

(D)-Limoneno

240 Sem alterações comportamentais

Até 30 Analgesia (+), Hiperatividade (+)

60 Sem alterações comportamentais

120 Sem alterações comportamentais

180 Sem alterações comportamentais

100

(D)-Limoneno

240 Sem alterações comportamentais

Quadro 3 Principais alterações comportamentais registradas em camundongos decorrentes da

administração do D-limoneno via intraperitoneal. (-) efeito diminuído, (--) efeito bem diminuído,

(+) efeito presente, (++) efeito presente intenso (n=8).

5.2 AVALIAÇÃO GERAL DA ATIVIDADE NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

5.2.1 Teste da potencialização do tempo de sono induzido pelo pentobarbital por

via intraperitoneal

Nesse teste foram analisados dois parâmetros: a latência do sono em segundos

e a duração do sono em minutos. O D-Limoneno diminuiu a latência por via i.p. (150,6 ±

10,2) comparado com o controle (184,3 ± 8,3) (Figura 17).

DLO na dose de 50 mg/kg (i.p.) aumentou o tempo de sono (122,7 ± 22,4)

quando comparado com o controle (65,55 ± 3,8) (Figura 18).

Como esperado, o diazepam 2 mg/kg i.p., reduziu o tempo de latência do sono

(145,4 ± 6,4) e aumentou a duração do sono (213,7 ± 16,8), conforme as figuras 17 e

18.

100

200

Controle

DLO 50mg/kg

DZP 2 mg/kg

Tratamentos (i.p.)

Latência (seg)

Figura 17 Efeitos do DLO (50 mg/kg, i.p.) e diazepam (2mg/kg, i.p.) sobre a latência do sono

em segundos no teste do tempo de sono induzido pelo pentobarbital. Os valores estão

expressos em média ± e.p.m. (n=8), ANOVA seguido pelo teste de Dunnett’s, * p< 0,05 ** p<

0,01 vs Controle.

100

150

200

250

Controle

DLO 50 mg/kg

DZP 2 mg/kg

Tratamentos (i.p.)

Tempo de sono (min)

Figura 18 Efeitos do DLO (50 mg/kg, i.p.) e diazepam (2mg/kg, i.p.) sobre o tempo de sono

induzido pelo pentobarbital. Os valores estão expressos em média ± e.p.m. (n=8), ANOVA

seguido pelo teste de Dunnett’s, * p< 0,05 ** p< 0,01 vs controle.

5.2.2 Avaliação da coordenação motora (teste de rota rod)

Nesse teste, após 30, 60 e 120 minutos, não houve alterações significativas no

tempo de permanência da barra giratória com os animais tratados com o D-Limoneno

na dose de 50 mg/kg (i.p.). Entretanto, com o padrão positivo, diazepam, foi diminuído o

tempo de permanência na barra, que foi observado em 30 min (28,13 ± 15,15 vs 177,5

± 2,5) e 60 min. (112,3 ± 27,8 vs 166,8 ± 13,25) do tratamento (Figura 19).

30 60 120

100

200

Controle

DLO 50 mg/kg

DZP 2 mg/kg

***

Tempo de observação (min)

Tempo de permanência

na barra giratória (seg)

Figura 19 Efeitos do DLO (50 mg/kg, i.p) e diazepam (2mg/kg, i.p.) sobre a coordenação

motora dos animais nos tempos 30 min, 60 min e 120 min. Os valores estão expressos em

média ± e.p.m. (n=8), Teste Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn's, * p < 0.05 ; *** p <

0.001 vs respectivo grupo controle

5.2.3 Teste do campo aberto

A ambulação (número de travessias), o rearing (levantar), o grooming (auto-

limpeza) e o número de bolos fecais foram os parâmetros analisados, conforme

mostrados nas figuras 20, 21, 22 e 23.

Após o tratamento intraperitoneal, DLO nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg

demonstraram uma redução do tempo de auto-limpeza (16,7± 4,4; 9,6± 4,6; 9,9 ± 3,3 vs

62,7 ± 22,8) em relação ao controle (Figura 20). Os outros parâmetros analisados não

apresentaram diferença significativa (Figuras 21, 22 e 23).

Os animais tratados com o DZP 1 mg/kg i.p. diminuíram o tempo de auto-limpeza

(16,3 ± 7,8 vs 62,7 ± 22,8) em relação ao respectivo controle (Figura 20).

Controle

DLO 50 mg/kg

DLO 25 mg/kg

DLO 100 mg/kg

DZP 1 mg/kg

Tratamentos (i.p.)

Tempo de

auto-limpeza (seg)

Figura 20 Efeitos do DLO (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) e diazepam (1mg/kg, i.p.) sobre a auto-

limpeza dos animais no teste do campo aberto. Os valores estão expressos em média ± e.p.m.

(n=7-8), ANOVA seguido do teste de Dunnetts, * p < 0,05; ** p < 0,01 vs respectivo grupo

controle.

100

125

Controle

DLO 25 mg/kg

DLO 50 mg/kg

DLO 100 mg/kg

DZP 1 mg/kg

Tratamentos (i.p.)

Ambulação

Figura 21 Efeitos do DLO (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) e diazepam (1mg/kg, i.p.) sobre a

ambulação dos animais no teste do campo aberto. Os valores estão expressos em média ±

e.p.m. (n=8) ANOVA seguido do teste de Dunnetts.

Controle

DLO 50 mg/kg

DLO 25 mg/kg

DZP 1 mg/kg

DLO 100 mg/kg

Tratamentos (i.p.)

Quantidade

de elevação

Figura 22 Efeitos do DLO (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) e diazepam (1mg/kg, i.p.) sobre a elevação

dos animais no teste do campo aberto. Os valores estão expressos em média ± e.p.m. (n=8).

ANOVA seguido do teste de Dunnetts.

0.0

0.5

1.0

DLO 50 mg/kg

DLO 25 mg/kg

Controle

DLO 100 mg/kg

DZP 1 mg/kg

Tratamentos

Quantidade de

bolos fecais

Figura 23 Efeitos do DLO (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) e diazepam (1mg/kg, i.p.) sobre o número

de bolos fecais dos animais no teste do campo aberto. Os valores estão expressos em média ±

e.p.m. (n=8). ANOVA seguido do teste de Dunnetts.

5.3 AVALIAÇÃO ESPECÍFICA DA ATIVIDADE NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

5.3.1 Avaliação da atividade ansiolítica (via intraperitoneal)

5.3.1.1 Teste do labirinto em cruz elevado

Nesse modelo, o D-Limoneno, nos animais tratados na dose de 50 mg/kg,

aumentou de maneira significativa o tempo de permanência (140,3 ± 21,2) nos braços

abertos quando comparados com o grupo controle (57,1 ± 12,9) (Figura 24). Contudo,

nenhuma alteração significativa foi observada no número de entrada nos braços

abertos (Fig. 25).

O diazepam (1 mg/kg) interferiu em todos os parâmetros: aumentou o número de

entradas (9,5 ± 1,9) e o tempo de permanência (157,5 ± 22,1 seg) nos braços abertos

em relação ao controle (4,1 ± 0,7; 57,13 ± 12,9 seg, respectivamente) e reduziu o

número de entradas (3,3 ± 1,2 vs 7,8± 0,8) e tempo de permanência (69,4± 22,3 vs

185,5 ± 17,4) nos braços fechados quando comparado com o grupo controle tratado

com o veículo (Figuras 24 e 25).

100

150

200

250

Controle

DLO 25 mg/kg

DLO 50 mg/kg

DLO 100 mg/kg

DZP 1 mg/kg

braços abertos

braços fechados

Tratamentos

Tempo de

permanência (seg)

Figura 24 Efeitos do DLO (25, 50 e 100 mg/kg, i.p) e diazepam (1 mg/kg, i.p.) sobre o tempo de

permanência nos braços abertos e fechados do labirinto em cruz elevado. Os valores estão

expressos em média ± e.p.m. (n= 8), ANOVA seguido pelo teste de Dunnett’s, * p< 0,05 ** p<

0,01 vs Controle.

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

Controle

DLO 25 mg/kg

DLO 50 mg/kg

DLO 100 mg/kg

DZP 1 mg/kg

braços abertos

braços fechados

Tratamentos

Número de entrada

Figura 25 Efeitos do DLO (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) e diazepam (1mg/kg, i.p.) sobre o número

de entrada nos braços abertos e fechados do labirinto em cruz elevado. Os valores estão

expressos em média ± e.p.m. (n= 8), ANOVA seguido pelo teste de Dunnett’s, grupo

experimental vs grupo controle, * p< 0,05 vs Controle.

5.4 AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DO SÍTIO BENZODIAZEPÍNICO DOS

RECEPTORES GABA

O D-limoneno na dose de 50 mg/kg aumentou o tempo de permanência nos

braços abertos (84,9± 10,5 vs 44,7± 8,4). Para investigar se o mecanismo de ação do

DLO (50 mg/kg i.p.) poderia ser mediado por receptores benzodiazepínicos, o

flumazenil (10 mg/kg i.p.) um antagonista específico para o reconhecimento deste

receptor foi pré-administrado com os seguintes resultados: o grupo (FLU 10 + controle)

não alterou o parâmetro analisado, tempo de permanência nos braços abertos (47,5 ±

9,7), quando comparado com o respectivo grupo controle (44,75 ± 8,4) (Figura 26),

também não foi observada diferença significativa para o grupo FLU 10 + DLO 50 (67,25

± 9,8).

O diazepam aumentou o tempo de permanência (152,5 ± 15,11 vs 44,75 ± 8,4) e

o número de entradas (11,8 ± 1,2 vs 4,0 ± 0,5) nos braços abertos em relação ao

controle. O flumazenil (FLU 10 + DZP 1) reverteu o efeito ansiolítico do diazepam nos

parâmetros analisados: número de entradas (5,3 ± 0,3 vs 11,8 ± 1,2) e o tempo de

permanência (65,0± 6,3 vs 152,5 ± 15,11) nos braços abertos quando comparado com

os respectivos grupos de DZP 1 (Figuras 26 e 27).

100

150

200

250

Controle

FLU 10 + Controle

DLO 50 mg/kg

FLU 10 + DLO 50

DZP 1 mg/kg

FLU 10 + DZP 1

braços abertos

braços fechados

Tratamentos

###

Tempo de

permanência (seg)

Figura 26 Efeitos do controle, DLO (50 mg/kg, i.p.) diazepam (1 mg/kg, i.p.) e flumazenil (10

mg/kg, i.p.) sobre o tempo de permanência nos braços abertos e fechados do labirinto em cruz

elevado. Os valores estão expressos em média ± e.p.m. (n= 8), ANOVA “one-way” seguido pelo

teste de Dunnett’s e o Teste “t” de Student, * p< 0,05; ** p< 0,01 vs Controle; # p< 0,05; ### p<

0,001 vs padrão positivo diazepam.

Controle

FLU 10 + Controle

DLO 50 mg/kg

FLU 10 + DLO 50

DZP 1 mg/kg

FLU 10 + DZP 1

braços abertos

braços fechados

Tratamentos

###

Número de entrada

Figura 27 Efeitos do Controle, DLO (50 mg/kg, i.p.) diazepam (1 mg/kg, i.p.) e flumazenil (10

mg/kg, i.p.) sobre o número de entrada nos braços abertos e fechados do labirinto em cruz

elevado. Os valores estão expressos em média ± e.p.m. (n= 8), ANOVA “one-way” seguido pelo

teste de Dunnett’s e Teste “t” de Student, * p< 0,05; ** p< 0,01 vs Controle; # p< 0,05; ### p<

0,001 vs padrão positivo diazepam.

5.5 TESTE PRELIMINAR DA ATIVIDADE NO SNC

5.5.1 Efeito do DLO na triagem farmacológica comportamental via inalatória

Os animais tratados com D-limoneno (DLO) na concentração de 1,0%

apresentaram os seguintes efeitos: analgesia e diminuição da defecação.

O quadro 4 mostra uma síntese das principais alterações comportamentais

observadas nos animais após tratamento com DLO por via inalatória em relação ao

respectivo grupo controle.

DOSE

(%,

inalatória)

SUBSTÂNCIAS

TEMPO

(min)

EFEITOS OBSERVADOS

Até 30 Sem alterações comportamentais

60 Sem alterações comportamentais

120 Sem alterações comportamentais

180 Sem alterações comportamentais

0,5

(D)-Limoneno

240 Sem alterações comportamentais

Até 30 Defecação (-)

60 Analgesia (+)

120 Sem alterações comportamentais

180 Analgesia (+)

1,0

(D)-Limoneno

240 Sem alterações comportamentais

Até 30 Sem alterações comportamentais

60 Sem alterações comportamentais

120 Sem alterações comportamentais

180 Sem alterações comportamentais

2,5

(D)-Limoneno

240 Sem alterações comportamentais

Quadro 4 Principais alterações comportamentais registradas em camundongos decorrentes da

administração do D-limoneno por via inalatória. (-) efeito diminuído, (--) efeito bem diminuído,

(+) efeito presente, (++) efeito presente intenso (n=8).

5.6 AVALIAÇÃO GERAL DA ATIVIDADE NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

5.6.1 Teste do campo aberto

O D-limoneno não alterou de maneira significativa os parâmetros observados

neste modelo animal (Figura 28, 29,30 e 31), mas a droga padrão diazepam diminuiu o

tempo de auto-limpeza (13,4 ± 2,1 vs 44,1 ± 8,1) (Figura 28).

Controle v.i

DLO 0,5% v.i

DLO 1,0% v.i

DLO 2,5% v.i

Controle i.p.

DZP 1 mg/kg i.p.

Tratamentos

Tempo de

auto-limpeza

(seg)

Figura 28 Efeitos do DLO v.i. (0,5; 1,0 e 2,5 %) e diazepam i.p. (1mg/kg) sobre a auto-limpeza

dos camundongos no teste do campo aberto. Os valores estão expressos em média ± e.p.m.

(n=8), Teste “t” de Student não pareado, ** p < 0,01 vs respectivo grupo controle.

100

200

Controle

DLO 0,5%

DLO 1,0 %

DLO 2,5 %

DZP 1 mg/kg i.p.

Controle i.p.

Tratamentos

Ambulação

Figura 29 Efeitos do DLO v.i. (0,5; 1,0 e 2,5 %) e diazepam i.p. (1mg/kg) sobre a ambulação

dos animais no teste do campo aberto. Os valores estão expressos em média ± e.p.m. (n=8).

Teste “t” de Student não pareado.

Controle v.i

DLO 0,5 % v.i

DLO 1,0% v.i

DLO 2,5% v.i

Controle i.p.

DZP 1mg/kg i.p.

Tratamentos

Quantidade

de levantar

Figura 30 Efeitos do DLO v.i. (0,5; 1,0 e 2,5 %) e diazepam i.p. (1mg/kg) sobre a quantidade de

levantar no teste do campo aberto em camundongos. Os valores estão expressos em média ±

e.p.m. (n=8). Teste “t” de Student não pareado.

0.5

1.5

2.5

3.5

Controle v.i.

DLO 0,5% v.i.

DLO 1,0% v.i.

DLO 2.5% v.i.

Controle i.p.

DZP 1 mg/kg i.p.

Tratamentos

Quantidade de

bolos fecais

Figura 31 Efeitos do DLO v.i. (0,5; 1,0 e 2,5 %) e diazepam i.p. (1mg/kg) sobre a quantidade de

bolos fecais no teste do campo aberto em camundongos. Os valores estão expressos em média

± e.p.m. (n=8). Teste “t” de Student não pareado.

5.7 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANSIOLÍTICA POR VIA INALATÓRIA

5.7.1. Teste do labirinto em cruz elevado

Os animais tratados com o D-Limoneno nas concentrações 0,5 e 1,0 % por via

inalatória apresentaram aumento no número de entradas (10,3 ± 1,0 vs 7,2 ± 0,7; 9,3 ±

1,0 vs 5,8 ± 1,0) e no tempo de permanência (123,2 ± 6,2 vs 90,7± 11,8; 135,1 ± 20,8 vs

74,0 ± 15,5) nos braços abertos quando comparados com o grupo controle (Figuras 32

e 33).

Além disso, observou-se uma redução no tempo de permanência nos braços

fechados (104,6 ± 6,3 vs 149,3 ± 13,1) quando comparado com o grupo controle tratado

com o veículo na concentração de 0,5 %. Entretanto, na concentração de 2,5 %

aumentou o tempo total de permanência nos braços fechados (146,9 ± 6,6 vs 114,4 ±

8,3) quando comparado com o grupo controle (Figura 32).

O Diazepam (1mg/kg) interferiu em todos os parâmetros: aumentou o número de

entradas (8,6 ± 1,6) e tempo total de permanência (157,5 ± 22,1 seg) nos braços

abertos em relação ao controle (4,1 ± 0,5; 57,13 ± 12,9 seg, respectivamente) (Figuras

32 e 33), e reduziu o número de entradas (3,3 ± 1,2 vs 7,8± 0,8) e tempo de

permanência (69,4± 22,3 vs 185,5 ± 17,4) nos braços fechados quando comparado com

o grupo controle que foi tratado com o veículo.

100

150

200

250

DZP 1 mg/kg i.p.

Controle v.i.

DLO 0,5 % v.i.

DLO 1,0 % v.i.

DLO 2,5 % v.i.

Controle i.p.

braços abertos

braços fechados

Tratamentos

Tempo de

permanência (seg)

Figura 32 Efeitos do DLO v.i. (0,5; 1,0 e 2,5 %) e diazepam i.p. (1mg/kg) sobre o tempo de

permanência nos braços do labirinto em cruz elevado. Os valores estão expressos em média ±

e.p.m. (n=8), Teste “t” de Student não pareado, * p< 0,05; ** p< 0,01 vs respectivo grupo

controle

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

Controle v.i.

DLO 0,5 % v.i.

DLO 1,0 % v.i.

DLO 2,5% v.i.

Controle i.p.

DZP 1 mg/kg i.p.

braços abertos

braços fechados

Tratamentos

Número de entrada

Figura 33 Efeitos do DLO v.i. (0,5; 1,0 e 2,5 %) e diazepam i.p. (1mg/kg) sobre o número de

entrada nos braços do labirinto em cruz elevado. Os valores estão expressos em média ±

e.p.m. (n=8), Teste “t” de Student não pareado, * p< 0,05; ** p< 0,01 vs respectivo grupo

controle.

5.8 AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DO SÍTIO BENZODIAZEPÍNICO DOS

RECEPTORES GABA

O D-limoneno 1,0% v.i. aumentou o número de entradas (8,8 ± 0,6 vs 4,7 ± 0,4) e

o tempo de permanência (83,8 ± 4,0 vs 50,8 ± 6,2) nos braços abertos. Para investigar

se o mecanismo de ação do DLO (1,0%, v.i.) poderia ser mediado por receptores

benzodiazepínicos, o flumazenil (10 mg/kg i.p.), um antagonista específico para o

reconhecimento deste receptor, foi pré-administrado com os seguintes resultados: o

grupo (FLU 10 + controle) não alterou os parâmetros analisados: número de entradas

(4,5± 0,3 vs 4,7 ± 0,4) e tempo de permanência nos braços abertos (41,1 ± 4,6 vs 50,8

± 6,2) quando comparado com o respectivo grupo controle (Figuras 34 e 35), também

não foi observada diferença significativa para o grupo FLU 10 + DLO 50 (8,9 ± 0,7; 84,1

± 8,7).

O diazepam aumentou o tempo de permanência (152,5 ± 15,1 vs 44,7 ± 8,4) e o

número de entradas (11,8 ± 1,2 vs 4,0 ± 0,5) nos braços abertos em relação ao

controle. A associação (FLU 10 + DZP 1) reverteu o efeito ansiolítico do diazepam nos

parâmetros analisados: número de entradas (5,3 ± 0,3) e o tempo de permanência (65,0

± 6,3) nos braços abertos quando comparado com os respectivos grupos de DZP 1

mg/kg, conforme mostrado nas figuras 34 e 35.

100

150

200

250

Controle

FLU + Controle

DLO 1%

FLU + DLO 1%

Controle i.p.

FLU 10 + Controle i.p.

DZP 1 mg/kg

FLU 10 + DZP 1

braços abertos

braços fechados

Tratamentos

***

###

Tempo de

permanência (seg)

Figura 34 Efeitos do DLO v.i. (0,5; 1,0 e 2,5 %), diazepam i.p. (1mg/kg) e flumazenil i.p. (10

mg/kg) sobre o tempo de permanência nos braços abertos e fechados do labirinto em cruz

elevado. Os valores estão expressos em média ± e.p.m. (n=8), Teste “t” de Student não

pareado, ** p< 0,01, *** p< 0,001 ; vs respectivo grupo controle. # p< 0,05, ### p< 0,001 em

relação ao controle positivo (DZP).

FLU + Controle v.i.

DLO 1% v.i.

FLU + DLO 1%

Controle i.p.

FLU 10 + Controle i.p.

DZP 1 mg/kg i.p.

Controle v.i.

FLU 10 + DZP 1

braços abertos

braços fechados

Tratamentos

***

###

Número de entrada

Figura 35 Efeitos do DLO v.i. (0,5; 1,0 e 2,5 %), diazepam i.p. (1mg/kg) e do flumazenil i.p. (10

mg/kg) sobre o número de entradas nos braços abertos e fechados do labirinto em cruz

elevado. Os valores estão expressos em média ± e.p.m. (n=8), * p< 0,05 *** p< 0,001; vs

respectivo grupo controle # p< 0,05, ### p< 0,001 em relação ao controle positivo (DZP) (Teste

“t” de Student não pareado).

VI DISCUSSÃO

A Psicofarmacologia é a parte da farmacologia voltada para o estudo dos efeitos

das drogas que atuam no sistema nervoso central, gerando alterações das funções

mentais, principalmente quanto ao humor, emoções e atividade psicomotora (ALMEIDA;

BARBOSA-FILHO, 2006).

O interesse do laboratório de psicofarmacologia em estudar compostos

biologicamente ativos, aliados aos dados anteriores de possíveis efeitos centrais do D-

limoneno (DLO), levou-nos a investigar esta substância. Neste trabalho, os efeitos do

DLO foram estudados em vários modelos de comportamento animal, tais como triagem

farmacológica, campo aberto, rota rod, tempo de sono induzido por pentobarbital e o

labirinto em cruz elevado. Esta pesquisa utilizou duas vias: intraperitoneal e inalatória,

entretanto, com esta última via foram realizadas apenas os testes de triagem

farmacológica, campo aberto e labirinto em cruz elevado. O flumazenil, um antagonista

benzodiazepínico, foi usado para investigar o possível envolvimento do DLO no sistema

gabaérgico.

O D-limoneno é um monoterpeno prevalente em vários óleos essenciais, como

exemplo no óleo da casca da laranja (HARDCASTLE et al., 1999). Alguns autores

pesquisaram este monoterpeno buscando atividade no SNC (VALE et al., 1999, 2002),

atividade antinociceptiva (DO AMARAL et al., 2007) e anticonvulsivante (VIANA et al.,

2000).

Com um método inovador, investigou-se a propriedade ansiolítica do DLO

através da via inalatória em modelos animais. A via inalatória é aquela através da qual

os medicamentos e outras substâncias são administrados pelas vias aéreas superiores.

De acordo com Newhouse (1993), Huchon (1997) e Almeida et al. (2001b) as

vantagens da via inalatória são muitas, incluindo menor quantidade de droga para

obtenção do efeito significativo, menor incidência de efeitos colaterais, pode-se

administrar em pacientes inconscientes e início rápido de ação. Além disso, segundo

Cardoso et al. (2006) a via de administração oral dos óleos essenciais apresenta

maiores riscos de apresentar efeitos tóxicos do que a via inalatória, que possui como

principal vantagem o fato de reduzir o estresse decorrente das manipulações por

injeção por outras vias, além de reduzir a toxicidade.

De acordo com Guyton e Hall (2006) as células receptoras para a sensação da

olfação são as células olfatórias que são neurônios bipolares derivados originalmente

do sistema nervoso central. A porção das células olfatórias que responde ao estímulo

químico olfatório é o cílio olfatório. As substâncias odorantes, ao entrarem em contato

com a superfície da membrana olfatória, inicialmente difundem-se no muco que recobre

o cílio ligando-se a proteína receptora de cada cílio, ativando o complexo da proteína G

(REISERT; YAU; MARGOLIS, 2007). Esta, ativa muitas moléculas de adenilil ciclase

que se encontram do lado intracelular da membrana olfatória. Em conseqüência muitas

moléculas de monofosfato de adenosina cíclica (AMPc) são formadas. O AMPc ativa

outra proteína de membrana próxima, um canal iônico de sódio, o qual se “abre”. Os

íons sódio aumentam o potencial intracelular, tornando-os positivo, e excitando, assim,

o neurônio olfatório e transmitindo os potencias de ação através do nervo olfatório para

o SNC.

Os neurônios sensoriais olfatórios detectam uma variedade de pequenas

moléculas voláteis com sensibilidade e especificidade elevadas (STROTMANN, 2001).

Lavabre (2001) descreve que o sentido do olfato age principalmente no nível

subconsciente uma vez que os nervos olfatórios são ligados ao sistema límbico ao qual

está relacionada à regulação da atividade sensório-motora e os impulsos primitivos de

sexo, fome e sede.

Segundo Eichenbaum (1998) a informação do odor inicialmente é processada

pelo bulbo olfatório e enviada diretamente às áreas corticais que fornecem então a

fonte primária da informação sensorial olfatória ao sistema límbico.

Diversos estudos pré-clínicos foram realizados utilizando a via inalatória. Shaw et

al. (2007) investigaram a quantidade, o tempo de exposição da inalação do óleo de

lavanda (

Lavandula angustifolia

) no teste do campo aberto em ratos. Bradley et al.

(2007a) pesquisou o efeito ansiolítico da inalação do óleo de

Rosa damascena

Mill. de

gerbils nos testes do LCE e da caixa claro/escuro. Em outro estudo, o grupo de Bradley

et al. (2007b) investigou o efeito do odor da

Lavandula angustifolia

Mill no LCE. Os

resultados obtidos foram similares aos do diazepam (1 mg/kg, i.p.). Ito et al. (2008)

avaliaram o efeito antidepressivo em camundongos através da inalação do l-

perilaldeido. Chen et al. (2008) avaliaram o efeito ansiolítico da inalação do óleo

essencial de nerol (

Citrus aurantium

). Komiya et al (2006) pesquisaram em

camundongos a atividade antidepressiva e ansiolítica do vapor do óleo de limão.

Komori et al. (1995) estudaram o efeito antidepressivo do odor de limão em ratos. O

grupo de Linck (2008) estudou o efeito sedativo da inalação em um câmara durante 60

minutos de uma atmosfera saturada com 1% ou 3% de linalol em camundongos.

Barocelli et al (2004) investigou o efeito antinociceptivo da inalação do óleo essencial

Lavandula hybrida

, e seus principais constituintes linalol e linalil acetato. Estudo com

camundongos (LIM et al, 2005) mostra que a inalação de óleos essenciais podem

induzir efeitos estimulantes ou sedativos em camundongos.

Ensaios clínicos foram realizados para avaliar se a inalação de óleos essenciais,

lavanda (GOEL; KIM; LAO, 2005) e hortelã-pimenta (GOEL; LAO, 2006) alteravam o

sono.

Nesta pesquisa, além da via inalatória foi utilizada também a via intraperitoneal.

Entretanto, essa é uma via já bem descrita na literatura. (VALE et al. 2002)

No presente trabalho, os estudos com DLO compreenderam inicialmente a

triagem farmacológica preliminar para traçar o perfil da ação da substância em nível do

SNC (ALMEIDA et al., 1999). Observou-se analgesia nos animais tratados com DLO

nas doses 25, 50 e 100 mg/kg (i.p.). O pH da emulsão foi verificado em 4,8 e drogas de

caráter ácido provocam contorções abdominais por estimularem os nociceptores

localizados em áreas adjacentes à região do peritônio o que pode ser correlacionado

com a hiperatividade observada nos primeiros dez minutos na dose de 100 mg/kg (i.p.),

conforme observado no quadro 3 (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006). DLO 1% por via

inalatória apresentou nos animais tratados uma defecação diminuída e analgesia

(Quadro 4).

Em nossos estudos, o DLO em ambas as vias não induziu tremores, convulsões,

catalepsia e ataxia o que muitas vezes são considerados indícios para drogas tóxicas.

Em humanos, o DLO demonstrou baixa toxicidade depois de doses únicas e repetidas

por até um ano. A DL

oral relatada para o D-limoneno em camundongos machos e

fêmeas foi de 5.6 e 6.6 g/kg de peso de corpo, respectivamente, e a DL

em ratos

machos e fêmeas foram 4.4 e 5.1 g/kg peso de corpo, respectivamente. (SUN, 2007).

Mora et al. (2005b) avaliaram os efeitos produzidos pelo extrato hidroalcoólico

das folhas de

Casimiroa edulis

no SNC, utilizando diferentes modelos animais

comportamentais. E no teste farmacológico geral não mostrou nenhuma diferença em

seus comportamentos durante os períodos de observação, quando comparado ao

grupo controle em nenhuma dose ou hora. Claudino (2007) realizou um teste de

triagem comportamental com monoterpeno epóxi-carvona e observou diminuição da

ambulação, ptose palpebral, resposta ao toque diminuída, sedação e analgesia.

O teste do tempo de sono induzido por pentobarbital foi realizado de acordo com

Ferrini, Miragoli, e Taccardi (1974). Neste modelo a redução da latência para o sono e o

prolongamento no tempo do sono são relacionados às drogas que deprimem o SNC

(WILLIANSON; OKPAKO; EVANS, 1996). A ação hipnótica do pentobarbital foi

demonstrada por Petty (1995) com indicações de ser mediada pelo complexo receptor

GABA

, portanto, é um teste para avaliar o efeito hipnótico/sedativo de uma substância.

O DLO (50 mg/kg, i.p.) diminuiu a latência e aumentou o tempo de sono (Figuras 17 e

18). Estes dados são sugestivos de um efeito sedativo por potencialização do

barbitúrico no teste do tempo de sono. Resultados semelhantes foram obtidos com o

diazepam (2 mg/kg, i.p.).

No trabalho do grupo de Vale et al., (2002) houve um aumento significativo no

tempo de sono observado com altas doses (200 mg/kg, i.p.) do D-limoneno. Porém, na

pesquisa desenvolvida por Amaral et al. (2007) este monoterpeno não aumentou o

tempo de sono induzido pelo pentobarbital (40 mg/kg, i.p.). Carvalho-Freitas e Costa

(2002) trataram oralmente os camundongos com o óleo obtido da casca do

Citrus

aurantium

L. que contém como principal componente o limoneno (PULTRINI;

GALINDO; COSTA, 2006) e observaram aumento no tempo de sono. Entretanto, este

teste não é específico porque substâncias que interagem com a biotransformação do

pentobarbital no complexo do citocromo P450 podem apresentar as mesmas ações de

drogas depressoras do SNC (GOLOUBKOVA et al., 1998).

O teste do rota rod foi usado para verificar um possível efeito do DLO (50 mg/kg,

i.p.) na coordenação motora ou relaxamento muscular (SEDELIS; SCHWARTING;

HUSTON, 2001; SANTOS et al., 2005). Para evitar qualquer influência devido à

incapacidade dos animais não relacionada ao tratamento, foi feita uma pré-seleção com

vinte e quatro horas antes do experimento, onde os animais foram avaliados sob as

mesmas condições usadas no teste (PULTRINI; GALINDO; COSTA, 2006).

Neste trabalho, o D-limoneno não alterou a coordenação motora no teste do rota

rod, diferenciando do diazepam, droga ansiolítica que apresenta efeito relaxante

muscular (ARGYROPOULOS; SANDFORD; NUTT, 2000), que diminuiu o tempo de

permanência na barra (Figura 19). Portanto, os resultados indicam que o tratamento

com o DLO (50 mg/kg) não interfere na coordenação motora, descartando assim um

efeito relaxante muscular ou mesmo uma neurotoxicidade do monoterpeno, que é

comum a algumas drogas com perfil depressor do SNC (ALMEIDA, 2006). Estes

resultados corroboram com o trabalho de Do Amaral et al. (2007), no qual o D-

limoneno (25 e 50 mg/kg, i.p.) não apresentou alterações significativas no tempo de

permanência na barra giratória. Entretanto, Vale et al., (2002) observou o relaxamento

muscular causado pelo DLO medido através do rota rod nas doses de 100 e 200 mg/kg

por via intraperitoneal.

Um dos fatores negativos dos benzodiazapínicos, que são os fármacos mais

prescritos para ansiedade, é que esses interferem na coordenação motora, o que foi

observado com o diazepam (figura 19), fármaco ansiolítico, que apresentou um efeito

sedativo e provocou um prejuízo motor até os 60 minutos de observação. Entretanto, o

resultado do DLO (i.p.), do presente trabalho, encontrado no teste do rota rod

apresentou um efeito bastante positivo, desejado e buscado para uma droga ansiolítica,

não causar uma incoordenação motora.

O teste do rota rod é um método não-específico, utilizado para descartar a

possibilidade de resultados falso-positivos, uma vez que avalia a integridade do sistema

motor, permitindo detectar enfraquecimento neurológico, incluindo ataxia, sedação ou

relaxamento muscular, efeitos característicos da neurotoxicidade (DUNHAM; MIYA,

1957; DALLMEIER; CARLINI, 1981).

O teste do campo aberto é empregado para avaliar a atividade exploratória dos

animais (ARCHER, 1973). A tendência natural do animal em um ambiente novo é a de

explorá-lo, apesar do estresse e do conflito provocado por este ambiente

(MONTGOMERY, 1958). A locomoção, quantidade de levantar (

rearing

), tempo de

auto-limpeza (

grooming

) e o número de bolos fecais foram os parâmetros

comportamentais observados no campo aberto.

Apesar de ser um modelo animal também utilizado para pesquisar a atividade

ansiolítica (SHAW et al., 2007), o método do campo aberto foi usado neste estudo

como teste geral, justificado pelo fato de ser um teste em que também se estuda

atividade estimulante de drogas (PRUT; BELZUNG, 2003).

Nossos resultados apresentaram uma redução significativa do comportamento

de auto-limpeza no teste do campo aberto com todas as doses por via intraperitoneal

(Figura 20). Não foram observados resultados significativos para este parâmetro por via

inalatória (Figura 28).

A auto-limpeza normalmente consiste em o animal lamber as patas, a cabeça, as

costas e a genitália com movimentos repetitivos usando as patas (KRUK et al., 1998;

VAN ERP et al., 1994). MacFarland e Reeder (1974) relatam que quase todos os

animais gastam uma significativa parte do tempo no comportamento de auto-limpeza.

Estudos mostraram que o aumento do

grooming

é observado em roedores apreensivos

(ARCHER, 1973) e que alguns pesquisadores observaram que drogas ansiolíticas e/ou

depressoras reduzem este parâmetro no teste do campo aberto (BARROS et al., 1994;

DUNN et al., 1981). Vale salientar, que uma redução neste parâmetro, também foi

observada em animais tratados com o diazepam, que foi usado como droga de

referência em nosso protocolo experimental (Figura 20).

A ambulação em um novo ambiente representa a atividade locomotora do

animal. Johansson e Ahlenius (1989) relacionam a quantidade de levantar (

rearing

) com

um aspecto de comportamento exploratório e que geralmente diminui quando um

animal é colocado em um ambiente novo ou estressante, e pode aumentar quando o

animal está sob efeito de drogas ansiolíticas. O número de bolos fecais é relacionado

como parâmetro de emocionalidade (ARCHER, 1973).

Nesta pesquisa, a ambulação, o número de bolos fecais e a quantidade de

levantar não foram significativas para ambas as vias de administração (Figuras 21, 22,

23, 29, 30 e 31). Vale et al. (2002) mostraram que os camundongos tratados com

limoneno diminuíram de forma significativa a atividade espontânea, quantidade de

levantar e comportamento de auto-limpeza. As diferenças encontradas nos nossos

resultados com o D-limoneno em relação a outros grupos pode ser devido a vários

fatores: o tempo de privação à comida e água, temperatura do ambiente, ao próprio

pesquisador (cheiro e manuseio), alterações na metodologia, a origem sintética do

monoterpeno, o pH da emulsão, entre outras. Em trabalhos anteriores (ANGRINI;

LESLIE; SHEPHARD, 1998), foram observados que os fármacos, clordiazepóxido,

propranolol e a buspirona, usados amplamente no tratamento para ansiedade humana

reduziram o comportamento locomotor no campo aberto (COSTAIN; GREEN, 1978;

SIMEON et al., 1994).

A partir de todos os resultados apresentados até esta etapa (triagem

farmacológica preliminar e testes psicofarmacológicos gerais) há uma forte indicação

que o D-limoneno apresente efeitos farmacológicos no SNC. Desta forma, houve um

direcionamento para uma avaliação específica da atividade ansiolítica do DLO.

A ansiedade é um estado emocional relacionado ao estresse ou dificuldade

psicológica associada a uma condição patológica. Embora muitas formas de tratamento

sejam aplicadas, a ansiedade é tratada na clínica com drogas ansiolíticas

(BHATTACHARYA; SATTYAN, 1997). Os distúrbios da ansiedade são altamente

prevalentes, com uma incidência crescente no mundo inteiro (POLLACK, 2002). O

excesso de ansiedade pode debilitar e prejudicar a qualidade de vida (RICKELS;

SCHWEIZER, 1997).

Os distúrbios da ansiedade são geralmente doenças crônicas que necessitam de

tratamento em longo prazo, e já foram relatados os efeitos colaterais dos ansiolíticos

disponíveis no mercado, portanto são necessárias pesquisas de novos compostos. A

pesquisa com plantas medicinais é uma fonte promissora na obtenção de novas

moléculas com potencial atividade farmacológica, inclusive sobre o SNC. Vários óleos

essenciais derivados de plantas têm sido usados no tratamento de uma variedade de

doenças mentais como a ansiedade (CHEN et al., 2004), convulsão (ALMEIDA;

MOTTA; LEITE, 2003; SAYYAH; NADJAFNIA; KAMALINEJAD, 2004) e depressão

(KOMORI et al., 1995, MARTIJENA et al., 1998). Os óleos essenciais possuem efeitos

farmacológicos em funções do cérebro (UMEZU; SAKATA; ITO, 2001). Esta afirmação

é apresentada em estudos de atividade ansiolítica em modelos animais (ALMEIDA et

al., 2004; PULTRINI; GALINDO; COSTA, 2006; MIN et al., 2005).

A maioria dos modelos experimentais que utilizam animais de laboratório para

avaliar a ansiedade baseia-se, principalmente, em situações conflitantes, como por

exemplo, colocar o animal num ambiente estranho (“estressante”) ou frente a um

predador, gerando assim, algumas alterações comportamentais, acompanhadas de

desvios fisiológicos. Assim o que se reproduz nos animais é um estado semelhante à

ansiedade no homem, medida através de sinais exteriores, como a atividade

exploratória, locomotora e social, que podem ser avaliados por meio de alguns testes

(LEITE; SIQUEIRA, 2006).

Para avaliar o efeito ansiolítico foi usado o modelo do labirinto em cruz elevado

(LCE), o mais utilizado para avaliação da ansiedade (PELLOW et al., 1985; CRUZ;

FREI; GRAEFF, 1994; PELLOW; FILE, 1986; COLE, 1995). Esse teste baseia-se no

fato que roedores tem aversão a lugares abertos e elevados (MONTGOMERY, 1958;

RODGERS et al., 1997). LCE é utilizado para investigar os efeitos ansiolíticos ou

ansiogênicos das substâncias, uma vez que ansiolíticos aumentam o número de

entradas e o tempo de permanência nos braços abertos, e as substâncias ansiogênicas

fazem o oposto (GRUNDMANN et al., 2007; YU et al., 2007).

No presente estudo, o DLO por via intraperitoneal na dose de 50 mg/kg

aumentou significativamente apenas um parâmetro observado (Figura 24), o tempo de

permanência nos braços abertos, indicativo de efeito ansiolítico (ROCHA, LAPA; LIMA,

2002). O diazepam, droga padrão de efeito ansiolítico, na dose de 1 mg/kg, aumentou

significativamente o número de entradas e o tempo de permanência nos braços

abertos, enquanto que nos braços fechados diminuiu o tempo de permanência e o

número de entradas (Figuras 24 e 25). Segundo Nogueira et al. (1998), a redução da

aversão aos braços abertos ou a menor afinidade aos braços fechados sugerem um

efeito ansiolítico e de acordo com Pellow et al. (1985) e Dawson et al. (1995) os ratos e

camundongoss, sob condições comportamentais normais têm maior preferência para

braços fechados que são considerados mais seguros e menos iluminados.

No mesmo modelo, a administração inalatória do DLO, apresentou efeito

ansiolítico em duas concentrações estudadas 0,5 e 1,0%, nas quais foram observadas

um aumento significativo no número de entradas e no tempo de permanência nos

braços abertos (Figuras 32 e 33), embora a concentração de 2,5% aumentou

significativamente o tempo de permanência nos braços fechados. Desta forma, nossos

resultados mostraram que o DLO apresentou efeito ansiolítico com as duas menores

concentrações (0,5 e 1,0%) por via inalatória resultados semelhante ao produzido pela

droga de referência o diazepam (1 mg/kg, i.p.), embora com a concentração 2,5 % v.i.

as alterações comportamentais induzidas pelo DLO foram sugestivas para efeito

ansiogênico.

Lima (2005) também apresentou resultados semelhantes onde a Iangambina,

uma lignana isolada a partir do caule de

Ocotea duckei

Vattimo, apresentou efeito

ansiogênico com duas doses (25 e 50 mg/kg, i.p.) e com a dose de 75mg/kg i.p. e com

estas mesmas doses administradas por via oral observaram a atividade ansiolítica no

teste do labirinto em cruz elevado. No trabalho de Carvalho-Freitas e Costa (2002) a

administração oral de 1 g/kg do óleo de

C. aurantium

aumentou o tempo de

permanência nos braços abertos. No estudo do grupo de Vale et al. (2002) o limoneno

(5mg/kg, i.p.) diminuiu o número de entradas nos braços abertos do LCE.

Várias vias neurais estão envolvidas na fisiopatologia da ansiedade,

conseqüentemente, um grande número de neurotransmissores participa dos

mecanismos subjacentes de drogas ansiolíticas (PALUCHA; PILE, 2002).

Clinicamente, os benzodiazepínicos são amplamente utilizados como drogas

sedativas e ansiolíticas, corroborando com os estudos em modelos animais tais como o

teste do labirinto em cruz elevado, onde os efeitos do diazepam são altamente

reprodutíveis (ARAGÃO et al., 2006). O diazepam tem sido freqüentemente usado

como um composto de referência, um padrão ansiolítico em testes farmacológicos

comportamentais (TAUKULIS; GOGGIN, 1990; GUIMARACES et al., 1990; WRIGHT;

UPTON; MARSDEN, 1992, SEO et al., 2007).

É amplamente aceito que drogas ansiolíticas, como os benzodiazepínicos (BDZ)

agem clinicamente por acentuar o efeito do GABA, no receptor GABA

, que é o

principal receptor inibitório no SNC (OLSEN; WERNER, 2008). Esse receptor

associado a um canal para cloreto operado por ligante, composto por subunidades alfa

(

3 ou

5) em combinação com subunidades beta (

2) e subunidade gama

(BENSON et al., 1998).

Os benzodiazepínicos, alprazolam, clonazepam, diazepam, lorazepam

mostraram ser eficazes nos distúrbios da ansiedade tais como: transtorno de pânico

(BALLENGER et al., 1988; ANDERSCH; ROSENBERG; KULLINGSJO, 1991), fobia

social (DAVIDSON; TUPLER; POTTS, 1994), transtorno obsessivo-compulsivo

(HEWLETT; VINOGRADOV; AGRAS, 1992), transtorno de estresse pós-traumático

(O'BRIEN; NUTT, 1998), transtorno de ansiedade generalizada (KAHN et al., 1986;

MITTE et al., 2005). Embora os BDZ clássicos realcem a função do receptor GABA

sejam ansiolíticos eficazes, eles apresentam efeitos colaterais indesejados, incluindo

sedação, tolerância, prejuízo cognitivo e dependência (SCHWEIZER; RICKELS, 1998;

BARKER et al., 2004; WHITING, 2006). Muitos estudos farmacológicos mostram

mudanças na expressão da ansiedade em modelos animais comportamentais assim

como nos estudos humanos devido a perturbação do influxo de cloreto estimulado pelo

GABA (YOUNG et al., 1996; SEO et al., 2007).

O agonista parcial do receptor 5-HT

, buspirona, é uma droga que reduz a

atividade serotoninérgica central, usado no tratamento da ansiedade (KUNOVAC;

STAHL, 1995). Sonavane et al (2002) e Grundmann et al. (2007) utilizaram a

buspirona, além do diazepam, como ferramenta farmacológica ansiolítica. No entanto,

este agonista parcial do receptor 5-HT

tem como desvantagem um início de ação

mais demorado, precisando de cerca de duas semanas de administração para que

surjam os primeiros efeitos benéficos. Como sua meia-vida de excreção varia de duas a

oito horas, deve ser administrada três vezes ao dia (JANICAK et al., 1997).

Pesquisadores têm reportado diferentes efeitos da buspirona no teste do LCE,

ansiolíticos (DUNN; CORBETT; FIELDING, 1989; LEE; RODGERS, 1991), ineficazes

(WADA; FUKUDA, 1991) e ansiogênicos (KLINT, 1991; MOSER, 1989). Em virtude de o

LCE ser uma excelente ferramenta para detectar compostos que tenham relação com

complexo receptor GABA

e da buspirona apresentar resultados muito variáveis em

relação a esse teste, foi escolhido para o nosso estudo apenas o padrão positivo

diazepam (RODGERS et al., 1997).

Os benzodiazepínicos, como o diazepam, agem como ansiolíticos em doses

baixas, produzem também sedação e efeito relaxante muscular em doses mais altas

(ONAIVI et al., 1992; WOLFFGRAMM; MIKOLAICZY; COPER, 1994). Por esta razão,

no presente trabalho, foram utilizadas diferentes doses de diazepam nos testes

realizados. Por exemplo, nos testes do

rota rod

e do tempo de sono foi utilizada uma

dose mais elevada (2mg/kg) para causar relaxamento muscular e sedação. No entanto,

no teste do labirinto em cruz elevado, a dose usada foi de 1 mg/kg para evidenciar o

seu efeito ansiolítico. Nesse sentido, foi possível verificar o efeito sedativo/hipnótico do

DLO no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital e o efeito ansiolítico no teste

do LCE.

O flumazenil, um antagonista benzodiazepínico, foi utilizado para investigar o

possível envolvimento do monoterpeno D-limoneno no sistema gabaérgico. Nossos

resultados mostraram que o efeito ansiolítico do diazepam foi antagonizado totalmente

pelo pré-tratamento com o flumazenil, que reverteu tanto o número de entradas quanto

o tempo de permanência nos braços abertos no teste do labirinto em cruz elevado.

Entretanto, o tratamento com flumazenil associado ao DLO tanto por via inalatória como

intraperitoneal em camundongos não reverteu os parâmetros comportamentais

observados no teste do LCE (número de entradas e tempo de permanência nos braços

abertos) (Figuras 26, 27, 34, 35), indicando que o mecanismo de ação do DLO

provavelmente não está relacionado à ligação direta com o receptor GABA

, não

descartando a participação de outros sítios moduladores existentes nesse receptor.

O presente trabalho demonstrou a atividade ansiolítica em modelos animais por

via intraperitoneal e por via inalatória do monoterpeno D-limoneno. Outros modelos pré-

clínicos de ansiedade devem ser realizados para confirmação desta atividade, assim

como estudos neuroquímicos para avaliar o nível de neurotransmissores em animais

tratados com DLO e pesquisas da interação droga-receptor para avaliar os possíveis

mecanismos de ação deste monoterpeno (LIMA, 2005).

VII CONCLUSÕES

Baseado nos resultados obtidos na caracterização da atividade

psicofarmacológica de D-limoneno (DLO)



O DLO induziu alterações comportamentais sugestivas de droga psicoléptica, ou

seja, que reduz a atividade do SNC;



O DLO possui efeito sedativo observado no teste do tempo de sono induzido por

pentobarbital;



O DLO não interferiu com a coordenação motora dos animais no teste do rota

rod;



O DLO apresentou características de droga ansiolítica quando administrado

pelas vias inalatória e intraperitoneal baseados nos resultados dos testes do

labirinto em cruz elevado;



O mecanismo de ação ansiolítico do DLO parece não ser mediado pela

interferência com o sistema GABAérgico, não descartando outros sítios não

avaliados neste receptor;

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