ads:
TÂNIA MARIA LEITE DA SILVEIRA
AMINAS BIOATIVAS LIVRES E CONJUGADAS NO CAFÉ
SOLÚVEL: METODOLOGIA DE ANÁLISE E INFLUÊNCIA DO
PROCESSAMENTO
Faculdade de Farmácia da UFMG
Belo Horizonte, MG
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
TÂNIA MARIA LEITE DA SILVEIRA
AMINAS BIOATIVAS LIVRES E CONJUGADAS NO CAFÉ
SOLÚVEL: METODOLOGIA DE ANÁLISE E INFLUÊNCIA DO
PROCESSAMENTO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciência de Alimentos da Faculdade de Farmácia
da Universidade Federal de Minas Gerais, como
requisito parcial para obtenção do grau de Doutor
em Ciência de Alimentos.
Orientadora: Profa. Maria Beatriz Abreu Glória
Faculdade de Farmácia da UFMG
Belo Horizonte, MG
2008
ads:
3
Silveira, Tânia Maria Leite da
S587a
Aminas bioativas livres e conjugadas no café solúvel: metodologia
de análise e influência do processamento / Tânia Maria Leite da
Silveira. – 2008.
179f. : il.
Orientador: Prof. Maria Beatriz Abreu Glória
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Minas Gerais.
Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciência
de Alimentos.
1. Café – Qualidade - Teses. 2. Café – Processamento - Teses.
3. Café – Pesquisa – Teses. I. Glória, Maria Beatriz Abreu. II.
Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia.
CDD 663.93
4
DEDICATÓRIA
Ao Álisson, pelo amor que me incentiva sempre, pelo carinho, confiança e pelos
sonhos e valores compartilhados. Obrigada pelo seu companheirismo.
A minha querida filhinha Catarina, razão da minha vida, pela alegria de viver e
serenidade em todos os momentos.
Aos meus pais, Eduil e Maria Lúcia, que me ensinaram os caminhos da perseverança e
da valorização do conhecimento.
Aos meus sogros Antônio e Mércia (In Memória), exemplos de dedicação profissional,
pelo constante incentivo.
Às minhas irmãs, pelo apoio e carinho em todos os momentos.
À minha cunhada, meus cunhados e sobrinhos pela alegria e demonstrações de afeto
sempre.
Aos tios Marco Antônio e Carmélia, pela disponibilidade, incentivo e cuidados com
minha filhinha nas horas de minha ausência.
5
AGRADECIMENTOS
À Deus que sempre me guiou e norteou toda a minha trajetória na idealização deste
sonho.
À minha orientadora, Maria Beatriz Abreu Glória, exemplo de caráter e dedicação
profissional, pela confiança em meu trabalho, pela orientação e pelos preciosos
ensinamentos durante todo percurso deste doutorado.
À FAPEMIG, pelo suporte financeiro para execução deste trabalho.
Ao professor Juan Cañelllas Bosch Neto, do curso de Engenharia de Alimentos do
Centro Universitário de Belo Horizonte – Unibh, pela ajuda e ensinamentos na
execução dos ensaios de granulometria.
Aos professores do programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos da
Faculdade de Farmácia e da Escola de Engenharia da Universidade Federal de Minas
Gerais, pelo aprendizado.
Às funcionárias da secretaria do Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos
pela atenção, esclarecimentos e auxílio.
À professora Adriana Farah do Laboratório de Bioquímica Nutricional e de Alimentos do
Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pela colaboração no
fornecimento de amostras de café.
À Companhia Iguaçú de Café Solúvel, ao Denisley G. Bassoli e Josiane Alessandra
Vignoli pelo apoio e fornecimento de amostras de café.
Ao SINDICAFÉ-MG, na pessoa do biólogo Flávio Ricardo Campos da Silveira, pela
contribuição no fornecimento de amostras de café.
Aos professores da minha banca de qualificação, Rosemary Gualberto F. A. Pereira,
Fernão Castro Braga e David Lee Nelson, pelas sugestões e direcionamento do
trabalho.
Ao aluno de iniciação científica Igor F. R. Ribeiro, pela dedicação e apoio em uma
etapa deste trabalho.
Às alunas de iniciação científica Vivian Proença Lara e Rita Carolina Figueiredo Duarte
pela disposição e valiosa contribuição com o desenvolvimento deste trabalho.
À Ana Amélia Paolucci Almeida pela incentivo, amizade, compartilhamento de
conhecimentos e, acima de tudo, boas energias.
6
Às colegas Silvia Mendonça Vieira, Lúcia Peret de Almeida, Flávia Beatriz Custódio,
Renata Adriana Labanca, pelas valiosas contribuições e boas risadas nos momentos
de descontração.
Aos colegas do Laboratório de Bioquímica de Alimentos Giuliana, Cristina, Paula
Santiago, Cyntia Karine, Flávia Vitorino, Tássia, Tarliane, Juliana, Ana Carolina,
Warlley, Bruno, Bruno da La Paula, Adriana, Aline, Priscila, pelos bons momentos de
convívio no LBqA.
Aos colegas de trabalho do Centro Universitário de Belo Horizonte – Unibh, pelo
incentivo.
Muito obrigada a todos que de alguma forma contribuíram para a idealização deste
trabalho.
7
“De tudo, ficaram três coisas: a certeza de estar sempre começando, a certeza de que
é preciso continuar e a certeza de ser interrompido antes de terminar”.
(Fernando Sabino)
8
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS 11
LISTA DE FIGURAS 13
LISTA DE ABREVIATURAS 15
RESUMO 16
ABSTRACT 17
INTRODUÇÃO 18
REVISÃO DA LITERATURA 21
1 CAFÉ SOLÚVEL ................................................................................. 21
1.1 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA ............................................................................. 21
1.2 CLASSIFICAÇÃO ................................................................................................ 23
1.3 PROCESSAMENTO ............................................................................................ 24
1.4 COMPOSIÇÃO .................................................................................................... 27
2 AMINAS BIOATIVAS LIVRES ............................................................. 28
2.1 ASPECTOS GERAIS ........................................................................................... 28
2.2 BIOSSÍNTESE ..................................................................................................... 30
2.3 FUNÇÕES ............................................................................................................ 34
2.4 CATABOLISMO .................................................................................................. 36
2.5 ASPECTOS TOXICOLÓGICOS .......................................................................... 37
2.6 AMINAS LIVRES EM CAFÉ ................................................................................ 39
3 AMINAS BIOATIVAS CONJUGADAS ................................................ 44
3.1 ASPECTOS GERAIS ........................................................................................... 44
3.2 FORMAÇÃO ........................................................................................................ 45
3.3 RELEVÂNCIA FISIOLÓGICA .............................................................................. 47
3.4 AMINAS CONJUGADAS EM CAFÉ.................................................................... 49
4 MÉTODOS PARA ANÁLISE DE AMINAS EM CAFÉ ........................... 50
5 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS ......................................... 52
OBJETIVOS 55
9
CAPÍTULO I – PERFIL E TEORES DE AMINAS BIOATIVAS EM
AMOSTRAS DE CAFÉ SOLÚVEL COMERCIALIZADAS EM
BELO HORIZONTE, MG 56
RESUMO ................................................................................................. 56
I.1 INTRODUÇÃO .................................................................................... 57
I.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 59
I.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................... 62
I.4 CONCLUSÕES ................................................................................... 70
CAPÍTULO II. OTIMIZAÇÃO DA ETAPA DE EXTRAÇÃO DAS
AMINAS BIOATIVAS LIVRES DE CAFÉ CRÚ 71
RESUMO ................................................................................................. 71
II.1 INTRODUÇÃO ................................................................................... 72
II.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. 74
II.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................ 78
iI.4 CONCLUSÕES ................................................................................. 88
CAPÍTULO III. OTIMIZAÇÃO DA HIDRÓLISE ÁCIDA NA
DETERMINAÇÃO DAS AMINAS CONJUGADAS EM CAFÉ 90
RESUMO ................................................................................................. 90
III.1 INTRODUÇÃO .................................................................................. 91
III.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. 92
III.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................ 97
III.4 CONCLUSÕES ................................................................................112
CAPÍTULO IV. VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA POR CLAE -
PAR IÔNICO PARA A DETERMINAÇÃO DE AMINAS
BIOATIVAS LIVRES EM AMOSTRAS DE CAFÉ 113
RESUMO ................................................................................................113
IV.1 INTRODUÇÃO ................................................................................114
10
IV.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................115
IV.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................120
IV.4 CONCLUSÕES ...............................................................................134
CAPÍTULO V. INFLUÊNCIA DO PROCESSAMENTO DO CAFÉ
SOLÚVEL NOS TEORES DE AMINAS BIOATIVAS LIVRES E
CONJUGADAS 135
RESUMO ................................................................................................135
V.1 INTRODUÇÃO .................................................................................136
V.2 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................138
V.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................142
V.5 CONCLUSÕES ................................................................................153
CONCLUSÕES INTEGRADAS 155
SUGESTÕES 157
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 158
ANEXO 172
11
LISTA DE TABELAS
[REVISÃO BIBLIOGRÁFICA]
1. Parâmetros físico-químicos de qualidade do café solúvel............................... 27
2. Composição química aproximada do café solúvel........................................... 28
3. Teores de aminas bioativas livres em grãos de café arábica (cru e torrado)... 39
4. Teores de aminas bioativas livres em grãos de café robusta (cru e torrado)... 40
5.
Teores de aminas bioativas livres em grãos de café arábica (cru e torrado)
classificados como bebida mole e rio................................................................
42
6.
Teores de aminas bioativas livres em grãos de café arábica (cru e torrado)
classificados como preto, verde, ardido e mistura pva .....................................
43
7.
Teores de aminas bioativas conjugadas ácido solúveis (AS) e ácido
insolúveis (AI) em grãos crus de café arábica e robusta ..................................
49
8. Variáveis utilizadas na hidrólise ácida em diferentes matrizes ........................ 51
[CAPÍTULO I]
I.1. Teores de aminas bioativas livres no café solúvel.................………………….. 64
I.2.
Teores de serotonina, tiramina, cadaverina e total de aminas bioativas livres
em 50 mL de bebida nas diferentes marcas dos café analisados..........………
68
I.3.
Valores de pH e características de cor CIE L*a*b* das amostras de café
solúvel regular, descafeinado e orgânico .........................................................
70
[CAPÍTULO II]
II.1 Influência do ácido extrator na recuperação das aminas livres em amostras
de café adicionadas de 1 e 10 mg de padrão por 100 g de amostra ...............
79
II.2 Eficiência dos extratores ácidos avaliados segundo os critérios do CODEX
(1993) ...............................................................................................................
80
II.3
Porcentagem de retenção das partículas dos grãos de café após moagem
nos moinhos de rolos e martelos .....................................................................
83
II.4
Volume de extrato recuperado na extração das aminas ..................................
8
4
II.5
Teores de aminas bioativas extraídos de grãos de café cru de diferentes
tamanhos de partículas ....................................................................................
85
II.6 Teores de aminas bioativas em café cru extraídas por meio de uma ou três
extrações sucessivas na presença ou não de repouso ....................................
87
[CAPÍTULO III]
III.1 Teores médios de aminas livres detectadas na amostra de café cru .............. 97
III.2
Aminas ácido solúveis detectadas após hidrólise por 24 h com HCl em
diferentes concentrações .................................................................................
98
III.3
Aminas ácido insolúveis detectadas após hidrólise com diferentes
concentrações de HCl ......................................................................................
99
III.4
Influência da temperatura na hidrólise das aminas conjugadas ácido solúveis
10
0
III.5 Influência da temperatura na hidrólise das aminas conjugadas ácido
insolúveis .........................................................................................................
101
III.6 Recuperação das aminas do padrão (10 µg/mL) durante hidrólises ácidas
com HCl 9 mol/L e 12 mol/L .............................................................................
109
12
[CAPÍTULO IV]
IV.1
Equações de regressão linear, coeficientes de determinação e de correlação
das curvas analíticas para cada amina determinada em três dias ...................
122
IV.2
Limites de detecção e de quantificação do método para matriz café .............
13
1
IV.3
Percentuais de recuperação de aminas bioativas nas matrizes café cru,
torrado e solúvel fortificadas com 0,1, 1 e 10 mg/100 g de padrão ..................
132
[CAPÍTULO V]
V.1 Teores médios de aminas bioativas livres em amostras coletadas em
diferentes pontos do processamento do café solúvel ......................................
142
V.2
Perfil e teores de aminas conjugadas ácido solúveis em amostras coletados
durante o processamento do café solúvel .......................................................
147
V.3
Teores de aminas ácido insolúveis em amostras coletadas durante o
processamento do café solúvel .......................................................................
149
V.4 Características físico-químicas de amostras coletadas durante o
processamento do café solúvel ........................................................................
151
V.5 Características de cor (CIE L*a*b*) de amostras coletadas durante o
processamento do café solúvel .......................................................................
153
13
LISTA DE FIGURAS
[REVISÃO BIBLIOGRÁFICA]
1. Exportações brasileiras de café solúvel em toneladas no período de 1994 a
2007 ..................................................................................................................
22
2. Fluxograma da produção de café solúvel .......................................................... 25
3. Estruturas químicas de algumas aminas ........................................................... 29
4. Vias metabólicas para a formação de aminas biogênicas ................................ 31
5. Vias para a síntese de poliaminas ..................................................................... 33
6. Estruturas químicas de algumas poliaminas conjugadas (amidas de ácidos
hidroxicinâmicos (HCAAs) ................................................................................
44
7. Esquema da biossíntese da tiramina e serotonina conjugadas ........................ 46
[CAPÍTULO I]
I.1. Ocorrências das aminas bioativas livres nas amostras analisadas ................... 62
I.
2
.
Contribuição de cada amina em relação ao teor total nos diferentes tipos de
café solúvel ........................................................................................................
65
I.3. Teores de aminas bioativas nos diferentes tipos de café solúvel ..…………… 66
I.4. Teores totais de aminas bioativas livres nas diferentes marcas de café
solúvel: A) regular; B) descafeinado; C) orgânico. …………………………….
67
[CAPÍTULO II]
II.1 Moinhos utilizados na moagem dos grãos de café crus ................................... 76
II.2 Medida do diâmetro dos grãos de café inteiros (Size Meter 1.1) ..................... 82
II.3 Grãos de café inteiros e após uma moagem no moinho de rolos .................... 82
II.
4
Grãos de café após duas moagem em moinho de rolos seguidas de moagem
no moinho de martelos .......................................................................................
83
II.5 Influência dos procedimentos de extração sobre cada amina ........................... 88
[CAPÍTULO III]
III.1 Esquema geral da análise de aminas conjugadas ........................................... 94
III.2 Influência do tempo de hidrólise ácida a temperatura ambiente nas aminas
ácido solúveis putrescina, espermidina e espermina de grãos crus de café......
103
III.3 Influência do tempo de hidrólise ácida a 110 ºC nas aminas ácido solúveis
putrescina, espermidina e espermina de grãos crus de café..............................
104
III.4 Influência do tempo de hidrólise ácida a temperatura ambiente nas aminas
ácido insolúveis putrescina, espermidina e espermina de grãos crus de café...
106
III.5
Influência do tempo de hidrólise ácida a 110 ºC nas aminas ácido insolúveis
putrescina, espermidina e espermina de grãos crus de café .............................
107
III.6
Comportamento das aminas durante a reação de hidrólise................................
11
1
[CAPÍTULO IV]
IV.1
Cromatogramas de uma solução padrão de 3 µg/mL das dez aminas (preto) e
de amostras de cafés cru (vermelho), torrado (verde) e solúvel (azul) ..............
121
IV.2
Curvas de linearidade das aminas no solvente e na matriz café cru .................
12
6
IV.3
Curvas de linearidade das aminas no solvente e na matriz café torrado .........
12
8
IV.4
Curvas de linearidade das aminas no solvente e na matriz café solúvel .........
129
14
[CAPÍTULO V]
V.1
Fluxograma da produção de café solúvel com indicação dos pontos de coleta
das amostras .....................................................................................................
138
V.
2
Contribuição de cada amina ao teor total nas amostras de café analisadas
coletadas em diferentes pontos do processamento do café solúvel ..................
143
V.
3
Aminas bioativas livres detectadas nas amostras de café coletadas em
diferentes pontos do processamento do café solúvel .......................................
144
V.4 Contribuição de cada amina ácido solúvel ao teor total destas aminas ........... 147
V.
5
Comportamento das aminas ácido solúveis frente as diferentes etapas do
processamento do café solúvel ........................................................................
148
V.
6
Contribuição de cada amina ácido insolúvel ao teor total destas aminas .........
15
0
V.7 Comportamento das aminas ácido insolúveis frente as diferentes etapas do
processamento do café solúvel ..........................................................................
150
15
LISTA DE ABREVIATURAS
AGM Agmatina
AI Aminas ácido insolúveis
AS Aminas ácido solúveis
BEHPA Bis-2-etilhexilfosfato
CAD Cadaverina
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
DAO Diaminoxidase
EPD Espermidina
EPM Espermina
FEN Feniletilamina
HCAA Amida de ácido hidroxicinâmico
HIM Histamina
MAO Monoaminoxidase
ODC Ornitina descarboxilase
PAO Poliaminoxidase
PUT Putrescina
SAMDC S-Adenosil-L-metionina descarboxilase
SRT Serotonina
TCA Ácido tricloroacético
TIM Tiramina
TRM Triptamina
16
RESUMO
O perfil e os teores de aminas bioativas livres em café solúvel, bem como a
influência das etapas do processamento nos teores das aminas livres e conjugadas
foram investigados. A metodologia para análise de aminas livres e conjugadas em café
foi otimizada e o método CLAE-par iônico com derivação pós-coluna com OPA e
detecção fluorimétrica para análise de aminas bioativas livres foi validado. Amostras
de café solúvel regular, descafeinado e orgânico comercializadas em Belo Horizonte,
MG foram analisadas em relação ao perfil e aos teores de aminas bioativas livres, pH e
características de cor. Amostras de café foram coletadas em quatro etapas durante a
produção do café solúvel. Foram pesquisadas dez aminas (putrescina, cadaverina,
tiramina, histamina, serotonina, agmatina, espermidina, espermina, feniletilamina e
triptamina). Dentre as dez aminas pesquisadas foram encontradas a putrescina,
cadaverina, histamina, tiramina, serotonina, agmatina, espermidina, espermina e
feniletilamina. O teor total de aminas presente no café solúvel coletado no mercado
variou de 0,28 a 2,76 mg/100 g. Os teores de tiramina e cadaverina foram
significativamente diferentes (p < 0,05) entre os três tipos de café solúvel analisados.
Para um melhor rendimento na extração de aminas livres do grão cru, o procedimento
deve ser conduzido com ácido tricloroacético (TCA) 5% (m/v) em três extrações
sucessivas. A hidrólise das aminas conjugadas para liberação da sua forma livre deve
ser executada com HCl 9 mol/L a 110 ºC por 18 horas. Foi observado influência das
etapas do processamento do café solúvel no perfil e teores das aminas livres e
conjugadas. A torrefação diminuiu os teores das aminas, sendo que a putrescina,
tiramina, espermidina, espermina e triptamina não foram detectadas no café torrado e a
serotonina teve seus teores reduzidos. Observou-se a formação da agmatina durante a
torrefação. Os teores totais das aminas aumentaram com a concentração do extrato do
café. As aminas conjugadas ácido solúveis foram detectadas no café cru e em
pequenas concentrações no café torrado. As aminas conjugadas ácido insolúveis foram
detectadas apenas no café cru.
Palavras-chave: café, café solúvel; café descafeinado; café orgânico; aminas bioativas
livres; aminas conjugadas, processamento.
17
ABSTRACT
Free and conjugated bioactive amines in instant coffee: the methodology of
analysis and the influence of processing - The profile and levels of free bioactive
amines in instant coffee, as well as the influence of the processing on the levels of free
and conjugated amines, were investigates. The method for analysis of free and
conjugated amines in coffee beans was optimized, and the post-column derivatization
and fluorimetric detection for the analysis of free bioactive amines by ion pair HPLC was
validated. The profile and levels of the free bioactive amines, pH and color
characteristics of regular, decaffeinated and regular organic coffee samples
commercialized in Belo Horizonte, MG, were analyzed. Ten amines (putrescine,
cadaverine, tyramine, histamine, serotonin, agmatine, spermidine, spermine,
phenylethylamine and tryptamine) were determined. The total levels of amines in
instant coffee ranged from 0.28 to 2.76 mg/100 g. Of the ten amines, putrescine,
cadaverine, tyramine, histamine, serotonin, agmatine, spermidine, spermine and
phenilethilamine were detected. The tyramine and cadaverine levels were significantly
different (p < 0.05) among the three types of instant coffee analyzed. The use of 5%
(m/v) trichloroacetic acid with three successive extractions was the best procedure for
extraction of free bioactive amines. The hydrolysis of the conjugated amines for the
liberation of the free form should be executed with 9 mol/L HCl at 110 ºC for 18 hours.
The processing method influenced the profile and the levels of free and conjugated
bioactive amines in instant coffee. Roasting decreased the levels of amines so that
putrescine, tyramine, spermidine, spermine and tryptamine were not detected in roasted
coffee. The serotonin levels were reduced during the roasting of the coffee. Agmatine
formation was observed in the roasted coffee. The total levels of amines increased in
the process of concentrating the coffee extract. The acid-soluble conjugated amines
were detected in green coffee, and low levels were found in roasted coffee. The acid-
insoluble conjugated amines were only detected in green coffee.
Key Words: instant coffee, decaffeinated coffee, organic coffee, free bioactive amines,
conjugated bioactive amines.
18
INTRODUÇÃO
O mercado de café solúvel no Brasil tem se desenvolvido muito nos últimos
anos. Em 2002 o Brasil produziu cerca de 70 mil toneladas de café solúvel, das quais
86% foram destinadas ao mercado externo, sendo o maior exportador mundial de café
solúvel, com uma participação de 48% no mercado internacional, seguido pela
Colômbia (11%); Equador (8%) e Malásia (7,5%). O Brasil é também o segundo maior
produtor mundial de café solúvel, responsável por 20% da produção total, precedido
pelos Estados Unidos, com 30% (BNDES, 2003). Segundo a Associação Brasileira das
Indústrias de Café Solúvel (ABICS) em 2007 a indústria brasileira de café solúvel
exportou um volume de 75,4 mil toneladas, com uma receita de US$ 434, 460 milhões.
Em comparação com o ano anterior houve um aumento de 4,3% no volume e um
incremento de 17,7 % no valor, efeito da forte elevação dos preços unitários do
produto, em face da demanda aquecida no exterior e no consumo interno, que
passaram de US$ 5.634/ton em 2006 para US$ 6.360/ton em 2007, um aumento de
12,9% (ABICS, 2008).
No processo de produção do café solúvel os grãos são torrados, moídos e
submetidos à extração sob pressão em altas temperaturas (180 ºC). O extrato é então
desidratado em vaporizadores ou liofilizadores originando o café solúvel em pó ou
granulado. A composição final do café solúvel dependerá, além das condições do
processamento, das espécies e variedades de café utilizadas nos blends (NOGUEIRA
& TRUGO, 2003).
Dentre os diversos tipos de substâncias biologicamente ativas presentes no café
estão as aminas bioativas. As aminas são compostos orgânicos que podem estar
naturalmente presentes nos alimentos ou ser formadas pela atividade enzimática da
microbiota acompanhante, sendo classificadas como poliaminas e aminas biogênicas.
As poliaminas espermidina e espermina estão amplamente distribuídas na natureza,
em elevadas concentrações nas células e tem seu conteúdo aumentado em tecidos
com altas taxas de crescimento (GLÓRIA, 2005).
As aminas bioativas participam de importantes processos fisiológicos no homem,
animais e plantas: aceleram o processo metabólico ou a conversão enzimática; atuam
como reserva de nitrogênio, como hormônios ou fatores de crescimento e são
biomoduladoras (GLÓRIA, 2005). Algumas aminas desempenham papel de
19
neurotransmissores e de precursores de hormônios (NAGATSU, 1991). As poliaminas
vêm sendo reportadas como importantes agentes antioxidantes presentes nos
alimentos (SILLA-SANTOS, 1996). Nos vegetais, além das funções acima citadas, as
poliaminas participam da floração e desenvolvimento do fruto, da resposta ao estresse
e inibem a produção de etileno e a senescência (FLORES et al., 1989; GLÓRIA, 2003).
A presença das aminas biogênicas histamina e serotonina em vegetais confere
proteção ao tecido vegetal contra insetos e predadores (GLÓRIA, 2003).
O perfil e os teores de aminas bioativas em um determinado produto alimentício
irão depender da espécie vegetal, das condições de cultivo, do processamento e ainda
das condições higiênico-sanitárias durante o processamento e armazenamento.
Alguns autores têm sugerido a utilização das aminas como parâmetro de qualidade,
refletindo a má qualidade das matérias-primas utilizadas ou as condições higiênicas
durante o processo de fabricação (DONHAUSER, 1993; LIMA & GLÓRIA, 1999).
As aminas podem estar presentes nas plantas na forma livre ou conjugada. A
conjugação consiste em uma ligação covalente entre o grupo amina e o grupo
carboxílico dos ácidos hidroxicinâmicos, sendo o derivado desta reação denominado
amidas de ácido hidroxicinâmicos (HACCs) (FONTANIELLA et al., 2001; 2003). As
aminas conjugadas têm sido associadas a processos de crescimento e
desenvolvimento das plantas e a mecanismo de defesa contra patógenos (WALTERS,
2003). Alguns estudos têm reportado as HACCs como importante classe de
compostos antioxidantes, agentes quimioterápicos e agentes anticolesterolêmicos
(SON & LEWIS, 2002; CHOI et al, 2007).
Os relatos sobre a presença de aminas bioativas em café são poucos. AMORIM
et al. (1977) e CIRILO et al. (2003) detectaram as aminas putrescina, espermidina e
espermina em amostras de café verde, sendo que CIRILO et al. (2003) também
detectaram serotonina (0,60 mg/100 g). CASAL et al. (2004) detectaram além das
aminas já citadas a cadaverina e a tiramina. OLIVEIRA et al. (2005) encontraram a
histamina e triptamina em amostras de café classificados como Rio que são
considerados de baixa qualidade. Alguns autores também avaliaram aminas em café
torrado e verificaram que a torrefação alterou o perfil e os teores de algumas aminas
(AMORIM et al., 1977; CIRILO et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2005).
Apesar da grande importância do produto café para o Brasil e do vasto
conhecimento científico sobre o mesmo, até o presente momento os relatos na
literatura sobre o perfil e teores de aminas bioativas no café solúvel limitam-se aos
20
estudos realizados durante a execução deste trabalho. Os estudos realizados até
então, concentraram-se no café em grãos, cru e torrado. Diante da importância que o
café solúvel vem assumindo na economia brasileira, a execução de trabalhos sobre
presença de aminas bioativas livres e conjugadas em café solúvel apresentará uma
contribuição valiosa para a elaboração de um produto diferenciado, melhorando a sua
competitividade no mercado mundial.
No presente trabalho, foram determinados o perfil e os teores de aminas livres e
conjugadas no café solúvel. Considerando que as aminas bioativas podem estar
presentes nos alimentos sob a forma livre ou conjugada e que as aminas conjugadas
são analisadas em sua forma livre, a etapa de extração das aminas do café foi
otimizada e a metodologia de análise de aminas bioativas por CLAE - par iônico foi
validada. Foi otimizada também a etapa de hidrólise das aminas conjugadas para que
as mesmas fossem posteriormente analisadas sob a forma livre. A influência das
etapas do processamento no perfil e teores das aminas livres e conjugadas no café
solúvel foi investigada em quatro diferentes pontos da linha de produção, sendo as
amostras analisadas quanto às características físico-químicas e de cor e perfil e teores
de aminas bioativas livres e conjugadas.
21
REVISÃO DA LITERATURA
1 CAFÉ SOLÚVEL
Café solúvel é o produto resultante da desidratação do extrato aquoso obtido
exclusivamente do café torrado, através de métodos físicos, utilizando água como
único agente extrator (BRASIL, 2005). O café solúvel foi desenvolvido em 1901 pela
empresa Japanese American Chemist de Chicago. Em 1906 o químico americano
George Constant Washington, que morava na Guatemala, observou um pó fino no bico
de sua chaleira de café, que parecia a condensação do vapor do café. Após alguns
experimentos produziu a primeira massa de café solúvel, que foi denominada de “Red
Coffee” (JAVACAFÉ, 2005).
A crise econômico-financeira dos últimos anos da década de 20 refletiu-se no
Brasil na produção e comercialização de seu principal produto: o café. Para dar
aproveitamento à produção excedente, o governo brasileiro encomendou à Nestlé em
1930 uma pesquisa que acabou conduzindo à tecnologia do café solúvel. O Nescafé
foi lançado na Europa, nos EUA e na Argentina, em 1938. No Brasil, devido à forte
pressão contrária dos produtores de café torrado e moído, só foi fabricado a partir de
1953 (RIC, 2005).
1.1 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA
De acordo com a Associação Brasileira da Indústria de Café Solúvel (ABICS), o
Brasil produziu em 2002 cerca de 70 mil toneladas/ano de café solúvel, das quais 86%
são destinadas ao mercado externo. As exportações brasileiras totalizaram 56.431
toneladas, gerando uma receita de US$ 167 milhões (Figura 1). Os principais destinos
foram os países da União Européia, com 18% do total exportado; Rússia, com 15%;
Ucrânia, com 15%; Estados Unidos, com 15%; e Japão, com 10%. O Brasil é o maior
exportador de café solúvel do mundo, com uma participação de 48% no mercado
internacional, seguido pela Colômbia (11%); Equador (8%) e Malásia (7,5%). É o
segundo maior produtor mundial de café solúvel, responsável por 20% da produção
total, precedido pelos Estados Unidos, com 30% (BNDES, 2003).
22
Figura 1 – Exportações brasileiras de café solúvel em toneladas no período de 1994 a
2007.
A exportação de café solúvel em 2004 alcançou recorde de 73,5 mil toneladas
(cerca de 3,2 milhões de sacas) (Figura 1), com crescimento de 11,8% sobre o ano
anterior (65,7 mil toneladas). Em termos de receita, houve aumento de 27,7%, de US$
225,5 milhões para US$ 287,9 milhões. Segundo a ABICS, este fato ocorreu devido ao
bom desempenho das exportações para a Rússia, com aumento de cerca de 74%
sobre 2003, passando de 8,3 mil para 14,4 mil toneladas. Do total exportado em 2004,
1,6 milhões de sacas foram embarcadas sob a forma de produto com maior valor
agregado. De acordo com dados fornecidos pelo CECAFÉ (2006), o volume das
exportações de café solúvel em 2005 cresceu 4%, totalizando 77 mil toneladas (cerca
de 3,3 milhões de sacas) de café solúvel. A receita cambial alcançou US$ 331,1
milhões (alta de 15%) e o preço médio de exportação subiu 10,6%, de US$ 3.918 em
2004 para US$ 4.334 em 2005.
Já em 2006 houve uma queda na exportação brasileira de café solúvel. O
volume estimado em toneladas para o referido ano era de 85.811 sendo o realizado de
72.300 toneladas (ABICS, 2007). Uma das causas para a diminuição do volume das
exportações em 2006 foi a discriminação tarifária exercida pela União Européia sobre o
café solúvel proveniente do Brasil, taxado em 9% enquanto se isentava o produto
originário da América Latina (Colômbia) e África (MALTA, 2007).
23
Em 2007 a indústria brasileira de café solúvel exportou um volume de 75,4 mil
toneladas, com uma receita de US$ 434.460 milhões. Em comparação com o ano
anterior houve um aumento de 4,3% no volume e um incremento de 17,7 %. Isso se
deve à forte elevação dos preços unitários do produto, em face da demanda aquecida
no exterior e no consumo interno, que passaram de US$ 5.634/ton em 2006 para US$
6.360/ton em 2007, um aumento de 12,9% (ABICS, 2008). De acordo com MALTA
(2008) a forte procura pelo café solúvel no mundo demonstra maior inclinação pelo
consumo de um produto natural, de fácil e rápido preparo, que atenda melhor ao
usuário de terceira idade e a mulher que trabalha fora, segmentos populacionais que
estão em crescimento. Adicionado a essa tendência, nota-se o aumento de consumo
da mistura do café solúvel com leite na população jovem, o que tem contribuído para o
espantoso crescimento do consumo em países que ainda não são consumidores
tradicionais de café. Estimou-se um aumento no consumo de café solúvel no mundo,
em 2007, da ordem de 5%, índice bem maior do que o de consumo do café torrado e
moído, forma tradicional de consumo de café, que cresce em média cerca de 1,5% ao
ano no mundo.
As estimativas para 2008 apontam uma redução no volume exportado pelo
Brasil de 5,2%, passando-se de 75.704 toneladas para 71.500. Porém os preços de
venda deverão sofrer uma elevação pelo efeito de uma oferta apertada em relação à
demanda, passando de US$ 6.345/ton, verificado em 2007, para US$ 6 800/ton. em
2008, um incremento de 7,2%. Em decorrência desse aumento dos preços a receita de
2008 experimentará um ligeiro aumento em relação a 2007, passando de US$ 480.311
mil em 2007 para US$ 486.200 mil em 2008 (ABICS, 2008). Mas, de acordo com
MALTA (2008) este incremento nos preços, confrontado com um volume exportado
inferior ao ano anterior, não será suficiente para permitir um aumento significativo na
receita.
1.2 CLASSIFICAÇÃO
O café solúvel é assim designado podendo ser seguido da classificação e/ou
espécie que lhe deu origem. Segundo o Ministério da Saúde (BRASIL, 1999), o café
solúvel poderia ser classificado de acordo com o processo de desidratação e forma de
24
apresentação como café solúvel em pó, café solúvel granulado ou aglomerado e café
solúvel liofilizado ou freeze-dried.
O café solúvel em pó ou spray dried é o produto obtido por processo no qual o
extrato de café, no estado líquido, é pulverizado em atmosfera aquecida, para através
da evaporação da água, formar partículas secas. O café solúvel granulado ou
aglomerado é o produto obtido por processamento, no qual as partículas de café
solúvel spray dried são fundidas para formar partículas maiores (grânulos). E o café
solúvel liofilizado ou freeze-dried é o produto obtido por processamento no qual o café,
no estado líquido, é congelado e a água é removida por sublimação, formando
partículas secas de formas irregulares (VARNAM & SUTHERLAND, 1994).
Em 2005 a ANVISA publicou a Resolução Nº 277, de 22 de setembro que
revogou a Portaria nº 130, de 19 de fevereiro de 1999 (BRASIL, 2005). Na RDC nº 277
de 2005, não consta a classificação do café solúvel, apenas define que a designação
do café solúvel pode vir acompanhada das expressões relativas ao processo de
obtenção do mesmo.
1.3 PROCESSAMENTO
O processamento do café solúvel envolve as etapas de seleção dos grãos,
mistura, torração, moagem, extração, concentração, secagem por aspersão ou
liofilização, aglomeração e envasamento (Figura 2) (SMITH, 1989; CLARKE, 2001).
As etapas do processamento do café solúvel estão descritas a seguir:
i. seleção e mistura – etapa na qual os grãos de café são selecionados e combinados
adequadamente, para a elaboração da bebida na qualidade exigida para cada padrão.
A composição dos blends pode variar em função da espécie do café utilizado
nesta etapa de seleção. No Brasil são cultivados o Coffea arabica e o Coffea
canephora Pierre (conhecida como Robusta), assim as duas espécies podem fazer
parte da composição dos blends. De acordo com MORGANO et al. (2002), na
fabricação do café solúvel utiliza-se um maior percentual de café robusta, visto que a
taxa de extração de sólidos no processo de fabricação deste tipo de bebida, e portanto
o teor de sólidos solúveis é superior àquela obtida com utilização do café arábica.
25
Figura 2 – Fluxograma da produção de café solúvel. Fonte: SMITH (1989).
ii. torração – etapa na qual se iniciam importantes transformações químicas. Ocorre
perda de matéria seca do grão de café na forma de CO
2
gasoso e outros produtos
voláteis da pirólise. Muitos dos compostos formados durante a pirólise são importantes
para determinar o aroma do café (VARNAM & SUTHERLAND, 1994). A cor dos grãos
varia de acordo com o grau de torrefação do café. A primeira etapa do processo
Mistura
Torração
Moagem
Extração
Concentração
Aglomeração
Envase
Secagem por spray-dryer
Secagem por freeze dryer
Aromatização
26
consiste na eliminação da umidade, sendo que a torração começa quando a
temperatura do grão de café alcança 180 a 230º C (CLARKE, 1989). O tempo de
duração da torração pode variar de 5 a 30 minutos, o que vai depender do nível de
torração desejado, das características físicas da matéria-prima, tipo e controle dos
torrefadores (VARNAM & SUTHERLAND, 1994);
iii. moagem – etapa necessária para permitir uma rápida extração dos sólidos solúveis
na etapa de extração. Para moer os grãos de café torrados empregam-se moinhos,
sendo o mais utilizado o de rodas múltiplos. Este equipamento consiste de um grupo
de 2 ou 4 pares de rolos por onde os grãos de café vão passando e reduzindo de
tamanho progressivamente (VARNAM & SUTHERLAND, 1994);
iv. extração – constitui em um processo físico que consiste na transferência de massa
dos compostos que podem difundir-se da fase sólida para a líquida. No processo de
extração industrial utiliza-se uma bateria de percoladores em coluna nos quais os
sólidos solúveis são extraídos do café moído com água à temperatura de 180 ºC
(CLARKE, 2001);
v. concentração – durante a concentração o extrato de café é desidratado mediante
evaporação térmica, mas também pode ser usada a concentração por congelamento.
Um problema importante que afeta todos os sistemas de evaporação térmica é a perda
de substâncias voláteis que pode afetar o aroma e o sabor do café solúvel. Este
problema pode ser solucionado extraindo-se e recuperando-se os compostos voláteis
mediante condensação (VARNAM & SUTHERLAND, 1994);
vi. secagem por aspersão (spray-dryer) – o extrato concentrado é atomizado em
forma de gotículas no topo de uma torre de secagem ao mesmo tempo em que é
submetido a uma corrente de ar quente de aproximadamente 205 ºC, provocando a
evaporação da água (SMITH, 1989). O produto coletado na base dessa torre é o café
solúvel em pó, que pode ser transformado em café aglomerado se submetido a uma
etapa adicional de processamento;
vii. secagem por liofilização (freeze-dryer) – na secagem por liofilização o extrato é
congelado a temperaturas inferiores a 30 ºC negativos, sendo então triturado em
moinhos especiais e conduzido à câmara de vácuo dentro de bandejas, sendo a água
removida por sublimação (SMITH, 1989). O produto final é o café liofilizado;
viii. aglomeração – consiste na fusão das partículas do café para formar grânulos.
Na aglomeração, as partículas do pó são umedecidas permitindo uma melhor
aglomeração dos grãos que em seguida serão novamente secos (SMITH, 1989);
27
ix. aromatização – etapa onde são incorporados ao café aromas que possam ter sido
perdidos durante o processamento.
x. envase – etapa na qual o café solúvel em pó, granulado ou liofilizado é
acondicionado em embalagens próprias para preservar suas características durante a
sua vida de prateleira.
1.4 COMPOSIÇÃO
Como relatado anteriormente, o café solúvel deverá ser produzido pela
desidratação do extrato aquoso obtido exclusivamente do café torrado, utilizando
apenas água como agente extrator. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) por meio da RDC nº 277, de 22 de setembro de 2005, fixou a identidade e as
características mínimas de qualidade do café solúvel. De acordo com a ANVISA
(BRASIL, 2005), o café solúvel deverá atender aos requisitos específicos apresentados
na Tabela 1.
Tabela 1 – Parâmetros físico-químicos de qualidade do café solúvel
Parâmetro Limite Permitido (g/100 g)
Umidade Máximo 5,0
Cafeína: produtos descafeinados Máximo 0,3
Fonte: Brasil (2005).
Dados sobre a composição do café solúvel são escassos. De acordo com
NOGUEIRA & TRUGO (2003), a composição final do café solúvel depende das
espécies e variedades do café utilizadas na formulação dos blends. As espécies
arábica e robusta apresentam diferenças em sua composição, deste modo, a
participação de cada uma dessas nos blends e as condições de processamento são
determinantes da qualidade final do café solúvel.
Alguns dados sobre a composição do café solúvel estão demonstrados na
Tabela 2.
28
Tabela 2 – Composição química aproximada do café solúvel
Componentes Café solúvel em pó (g/100 g bs)
Minerais 8,8 - 10,0
Cafeína 2,5 - 5,1
Lipídios 0,2 - 1,6
Ácidos clorogênicos totais 5,2 - 7,4
Oligossacarídeos 0,7- 5,2
Polissacarídeos totais 50,0 - 65,0
Proteínas 12,6 - 21,0
Fonte: SMITH (1989); USDA (2008); bs = base seca.
Em relação aos teores de umidade foram relatados valores médios de 3,43%
(ALVES & BORDIN, 1998) e 3,45% (ALVES et al., 2000) para amostras de café solúvel
aglomerado e de 2,74 % (ALVES et al., 2000) para café solúvel em pó.
2 AMINAS BIOATIVAS LIVRES
2.1 ASPECTOS GERAIS
Aminas bioativas são compostos orgânicos nitrogenados, em que um, dois ou
três átomos de hidrogênio da amônia foram substituídos por grupos alquila ou arila.
São bases orgânicas alifáticas, alicíclicas ou heterocíclicas de baixo peso molecular
que participam de processos metabólicos normais de animais, plantas e
microrganismos (HALÁSZ et al., 1994; BARDÓCZ, 1995; SOUSADIAS & SMITH, 1995;
SILLA-SANTOS, 1996).
A denominação das aminas bioativas é função dos aminoácidos precursores. A
histamina origina-se da histidina, a tiramina da tirosina e a triptamina do triptofano. A
cadaverina e a putrescina foram encontradas em produtos em fase de decomposição
ou putrefação. Já a espermina e espermidina foram isoladas pela primeira vez no fluido
seminal (LIMA & GLÓRIA, 1999).
As aminas bioativas podem ser classificadas em função do número de
grupamentos amina, da estrutura química, da via biossintética e da função que
exercem (SMITH, 1980-81; BARDÓCZ, 1995). Quanto ao número de grupamentos
29
amina na molécula, têm-se as monoaminas (tiramina e feniletilamina), as diaminas
(histamina, triptamina, serotonina, putrescina e agmatina) e as poliaminas
(espermidina, espermina e agmatina). Com relação à estrutura química as aminas
podem ser classificadas em alifáticas (putrescina, cadaverina, espermidina, espermina
e agmatina), aromáticas (tiramina e feniletilamina) e heterocíclicas (histamina e
triptamina e serotonina) e em função do grupo químico como catecolaminas (dopamina,
noradrenalina e adrenalina), indolaminas (serotonina) e como imidazolaminas
(histamina) (Figura 3).
Figura 3 – Estruturas químicas de algumas aminas bioativas.
N
H
HO
CH
2
CH
2
NH
2
Serotonina
N NH
CH
2
CH
2
NH
2
Histamina
CH
2
CH
2
NH
2
CH
2
CH
2
NH
2
HO
N
CH
2
CH
2
NH
2
H
H
2
N
NH
2
H
2
N NH
2
NH
2
(CH
2
)
3
NH
(CH
2
)
4
H
2
N
2-Feniletilamina
Tiramina
Triptamina
Putrescina Cadaverina Espermidina
H
2
N
NH
N
(CH
2
)
4
NH
2
H
2
N
(CH
2
)
3
NH
(CH
2
)
4
NH
(CH
2
)
3
NH
2
Espermina
Agmatina
30
Levando-se em consideração a via biossintética, as aminas podem ser
classificadas em biogênicas, quando são formadas pela descarboxilação de
aminoácidos por enzimas microbianas (histamina, serotonina, tiramina, feniletilamina,
triptamina, putrescina, cadaverina e agmatina), e em naturais, cuja formação ocorre in
situ nas células à medida que são requeridas (putrescina, agmatina, espermina,
espermidina e histamina) (BARDÓCZ, 1995).
Com relação às funções que exercem as aminas bioativas são classificadas em
moduladoras e promotoras do crescimento (espermidina e espermina), por atuarem no
crescimento e manutenção do metabolismo celular, e em vasoativas e neuroativas
(tiramina, histamina e serotonina) devido ao seu efeito nos sistemas vascular e neural
(BARDÓCZ, 1995).
2.2 BIOSSÍNTESE
A formação das aminas bioativas ocorre durante o metabolismo normal em todos
os seres vivos. A principal via de formação é por meio da descarboxilação de
aminoácidos, seja por hidrólise ou decomposição térmica de compostos nitrogenados
(HALÁSZ et al.,1994; BARDÓCZ, 1995). Nos alimentos as aminas podem também ser
produzidas pela quebra de aminoácidos, devido à ação de descarboxilases de origem
microbiana, sendo que em algumas reações o cofator piridoxal fosfato é requerido
(MAGA, 1978; CHANDER et al., 1989; EDMUNDS & EITENMILLER, 1992; HALÁSZ et
al., 1994; SHALABY, 1996).
As aminas tiramina, histamina, triptamina, feniletilamina e cadaverina são
formadas via descarboxilação dos aminoácidos tirosina, triptofano, histidina,
fenilalanina e lisina (Figura 4) (HALÁSZ et al., 1994). Já na síntese da serotonina ou 5-
hidroxitriptamina, o triptofano é convertido pela triptofano hidrolase em 5-
hidroxitriptofano, que é descarboxilado pela aminoácido aromático descarboxilase
(AADC) (NAGATSU, 1991).
A produção de aminas biogênicas resulta da presença de bactérias que são
capazes de descarboxilar aminoácidos (SHALABY, 1996). Inúmeras espécies
bacterianas são produtoras de aminas, principalmente representantes da família
Enterobacteriaceae, particularmente os gêneros Escherichia, Enterobacter, Salmonella,
Shigella e Proteus ao lado de espécies dos gêneros Achromobacter, Lactobacillus,
31
Leuconostoc, Pseudomonas, Pediococcus, Streptococcus, Propionobacterium,
Clostridium (SHALABY, 1996; LIMA & GLÓRIA, 1999). Enterococcus e alguns
lactobacilos apresentam grande capacidade de formação de tiramina (BOVER-CID &
HOLZAPFEL, 1999).
Histamina Serotonina
5-Hidroxitriptofano
Tiramina
Histidina
Triptofano
Triptamina
Tirosina Proteína
Fenilalanina
Lisina
Feniletilamina
Cadaverina
Figura 4 – Vias metabólicas para a formação de aminas biogênicas. Fonte: LIMA &
GLÓRIA (1999).
Vários fatores podem influenciar a produção de aminas pelas bactérias. O pH
do meio, a temperatura, a tensão de oxigênio, a presença de coenzimas e vitaminas, a
concentração de aminoácidos livres e de carboidratos fermentáveis interferem na
formação das aminas. Em meio ácido, pH 2,5 a 6,5, a produção de aminas é
estimulada como um mecanismo de proteção da bactéria (LIMA & GLÓRIA, 1999),
devido ao fato de que altas concentrações do íon H
+
são prejudiciais ao microrganismo,
fazendo com que este sintetize as enzimas descarboxilases (VOIG & EITENMILLER,
1977; HALÁSZ et al., 1994; SILLA-SANTOS, 1996). Como a formação das aminas
32
depende da ação de enzimas descarboxilantes, a temperatura interfere de forma
significativa no processo. Em temperaturas inferiores a 30 ºC as descarboxilases são
mais ativas, a 40 ºC são inativadas e na faixa de 0 a 10 ºC a atividade dependerá da
microbiota presente (HALÁSZ et al., 1994).
Os aminoácidos ornitina e arginina são os precursores das poliaminas, sendo a
putrescina um composto intermediário obrigatório (Figura 5). Para formar a putrescina,
a arginina é transformada em ornitina pela ação da enzima arginase e, em seguida, a
ornitina sofre a ação da ornitina descarboxilase (ODC) formando a putrescina
(HILLARY & PEGG, 2003). A via de formação da putrescina pode ser diferente entre
os organismos vivos. Em animais e fungos é formada via descarboxilação da ornitina e
em bactérias pode ser pela descarboxilação da arginina formando agmatina. Já em
vegetais a formação pode ocorrer tanto via agmatina quanto via ornitina. Existe uma
via adicional para a formação da putrescina a partir da citrulina (SMITH, 1985; FLORES
et al., 1989; BARDOCZ, 1995; WALTERS, 2003).
Espermidina e espermina são formadas pela adição de um grupo aminopropil à
putrescina e à espermidina, respectivamente. Estas reações são catalisadas pelas
aminopropiltransferases espermidina-sintetase (EpdS, EC 2.5.1.16) e espermina-
sintetase (EpmS, EC 2.5.1.22). O grupo aminopropil é derivado da metionina via S-
adenosil-L-metionina (SAM) numa reação catalisada pela enzima SAMDC (EC
4.1.1.50). A 5’-metiltioadenosina, resultante da liberação do grupo aminopropil pela
SAM é convertido em metilribose e em metionina, reciclando o grupo –SCH
3
que
garante a síntese de poliaminas (SMITH, 1985; FLORES et al., 1989; WALTERS,
2003).
A biossíntese de poliaminas é muito bem controlada por mecanismos complexos
que previnem sua superprodução ou sua deficiência (OKAMOTO et al., 1997). As
concentrações intracelulares de poliaminas são reguladas pela síntese de novo,
conversão, degradação e também pela captação de poliaminas extracelulares. Os
mecanismos reguladores preliminares são a síntese de novo pela via ODC,
reconversão das poliaminas via rota de interconversão (espermina/espermidina N1-
acetiltransferase e poliamina oxidase) e degradação oxidativa das poliaminas
(DORHOUT et al., 1996; LÖSER, 2000).
Apesar de sua formação intracelular, a alimentação e as bactérias do trato
intestinal também são uma importante fonte de poliaminas (LÖSER, 2000).
33
Glutamina Citrulina
CDC
Uréia
Prolina Ornitina Arginina
ODC N-Carbamoil ADC
putrescina
CO
2
CO
2
NH
3
NCPAH AIH
Putrescina Agmatina
SpdS Propilamina
Espermidina S-adenosil-metionina
descarboxilase
SpmS Propilamina
ATP SAMDC
Espermina Metionina
Figura 5 – Vias para a síntese de poliaminas. Fonte (GLÓRIA, 2003).
ODC= ornitina descarboxilase; ADC= arginina descarboxilase; CDC= citrulina descarboxilase; AIH= agmatina imino-
hidrolase; SpmS= Espermina sintase; SpdS= Espermidina sintase; SAMDC= S-adenosilmetionina descarboxilase.
34
2.3 FUNÇÕES
Aminas bioativas participam de importantes processos fisiológicos no homem,
animais e plantas: aceleram o processo metabólico ou a conversão enzimática; atuam
como hormônios ou fatores de crescimento e são biomoduladoras (SMITH, 1980-81;
NAGATSU, 1991; STRATTON et al., 1991). As aminas atuam como reserva de
nitrogênio, substâncias naturais de crescimento dos microrganismos e vegetais e
desenvolvem papel de neurotransmissores e de precursores de hormônios nas formas
de vida mais evoluídas (NAGATSU, 1991). As poliaminas (putrescina, espermidina e
espermina) são indispensáveis às células vivas. De acordo com BARDÓCZ et al.
(1993) e SILLAS-SANTOS (1996), as poliaminas são essenciais ao crescimento e
metabolismo celular, sendo rapidamente requeridas em tecidos em crescimento.
Interagem eletrostaticamente com várias macromoléculas, especialmente DNA, RNA e
proteínas, estando envolvidas no estímulo e regulação de suas sínteses (LÖSER,
2000).
SOUSADIAS & SMITH (1995) e JEEVANANDAM et al. (1997), considerando o
envolvimento das poliaminas nas etapas de síntese de DNA, RNA e proteínas,
proliferação e crescimento celular, atuação hormonal e estabilização das funções dos
cromossomos e membranas, constataram que as poliaminas agiam como promotoras
de crescimento em concentrações não tóxicas.
De acordo com SILLA-SANTOS (1996) as poliaminas espermina, espermidina e
a diamna putrescina inibem a oxidação dos ácidos graxos poliinsaturados e este efeito
antioxidante é correlacionado com o grupo NH
3
+
presente na estrutura química das
poliaminas. Segundo DROLET et al. (1986) e BARDOCZ (1995), a espermina e a
espermidina são eficientes estabilizadores de radicais livres in vitro. Desta forma,
podem inibir a peroxidação lipídica e prevenir a senescência em vegetais. O radical
hidroxil produzido pela reação de Fenton foi eficientemente inibido por espermina e
espermidina.
As poliaminas interagem com componentes da membrana celular carregados
negativamente, tais como fosfolípides, sendo importantes na permeabilidade e
estabilidade da membrana (DROLET et al., 1986; BARDOCZ, 1995; SILLA-SANTOS,
1996; LÖSER, 2000).
Diversos efeitos das poliaminas têm sido identificados na replicação celular,
dentre eles, iniciação e controle da translação, estímulo da associação da subunidade
35
ribossomal, aumento da síntese de ácidos nucléicos e redução na taxa de degradação
do RNA (BARDOCZ et al., 1993; 1995). Estimulam também a diferenciação celular e
modulam vários sistemas de mensagem intracelular (LÖSER, 2000). A função mais
importante das poliaminas, tanto em vegetais quanto em animais, que não pode ser
feita por nenhuma outra molécula carregada positivamente, é atuar como segundo
mensageiro, mediando a ação de todos os hormônios e fatores de crescimento
conhecidos (BARDOCZ, 1995).
Pesquisas com plantas superiores sugerem que as poliaminas putrescina,
espermidina e espermina estão naturalmente presentes em frutas e hortaliças.
Desempenham um papel crítico em vários processos, dentre eles, formação das raízes,
embriogênese somática, controle do pH intracelular, desenvolvimento de flores e frutos,
resposta à condições de estresse como deficiência de potássio, choque osmótico, seca
e infecções. Elas são também importantes na síntese de metabólitos secundários de
interesse biológico como alcalóides (SMITH, 1985; FLORES et al., 1989; OHTA et al.,
1993; WALTERS, 2003; MORET et al., 2005).
As poliaminas vêm sendo reportadas como agentes anti-senescência em frutas,
tendo efeitos no aumento da firmeza, no retardamento das alterações na cor da fruta,
na inibição da peroxidação lipídica e na diminuição nas taxas de emissão de etileno e
respiração (PANDEY et al., 2000; VALERO et al., 2002). Estão associadas com a
parede e com a membrana celular. Elas modulam a pectinesterase e se ligam à
pectina, retardando o amolecimento do fruto e sua senescência (KRAMER et al., 1991).
O efeito de enrijecimento promovido pelas poliaminas é similar ao efeito do cloreto de
cálcio, e pode ser devido à habilidade das poliaminas de ligarem-se à parede celular e
membranas celulares estabilizando-as ou tornando a parede celular menos acessível a
enzimas que amolecem membranas (KRAMER et al.,1991; PONAPPA et al., 1993).
Existe também a hipótese de que as poliaminas inibem as próprias enzimas que
atacam a parede celular. KRAMER et al. (1991) demonstraram efeitos inibitórios das
poliaminas sobre as poligalacturonases de maçãs. As propriedades anti-radicais livres
das poliaminas têm sido sugeridas como protetoras das membranas contra a
peroxidação lipídica e estresse oxidativo (GONZALEZ-AGUIAR et al., 1998).
Em frutas, mudanças notáveis na biossíntese das poliaminas têm sido
observadas em resposta a uma variedade de estresses, incluindo injúria pelo frio,
danos mecânicos, deficiência de minerais, tensão de CO
2
e variações de temperatura e
altitude (VALERO et al., 2002).
36
Estudos têm demonstrado que a putrescina pode acumular em plantas com
deficiência de minerais durante o crescimento (SMITH, 1985). A deficiência de
potássio e magnésio causou o acúmulo de putrescina em rabanete, ervilha, feijão e
espinafre (BASSO & SMITH, 1974).
Em vegetais, a feniletilamina atua como substância protetora, repelente de
insetos predadores e animais forrageiros e, por esta razão, pode ter significância na
agricultura (SMITH, 1977). As aminas serotonina, triptamina, histamina, agmatina e
cadaverina estão presentes em frutas. Estas aminas também tem um papel protetor
contra predadores (BOUCHEREAU et al., 2000). Algumas aminas são importantes na
síntese de metabólicos secundários, como nicotina e outros alcalóides. Triptamina e
feniletilamina são precursores de substâncias de crescimento. Triptamina é precursora
do ácido indolacético e dos alcalóides -carbonila, hormônios de crescimento da planta
(COUTTS et al., 1986).
2.4 CATABOLISMO
As aminas ingeridas são rapidamente metabolizadas no organismo por
conjugação ou mediante reações de oxidação, por enzimas como a MAO
(monoaminoxidase), DAO (diaminoxidase) e PAO (poliaminoxidase) (BARDOCZ,
1995). A degradação das poliaminas consiste em uma deaminação oxidativa do grupo
amino primário da poliamina e seus derivados N-acetil. Esta reação é catalisada por
enzimas aminoxidases (diaminoxidase e poliaminoxidase) em presença de íons cobre.
Os aldeídos formados são oxidados pela aldeído-desidrogenase formando um
composto ácido. A putrescina é convertida em ácido -aminobutírico (GABA), a
espermidina em ácido 2-espermídico e a espermina em ácido 1-espermico. Em
mamíferos a degradação das poliaminas também envolve a produção de 1,3-
diaminopropano (DAP), N-acetil-1,3-DAP, -alanina, 2-hidroxiputrescina e álcoois (TETI
et al., 2002). A ação da DAO sobre a putrescina produz 1-pirrolina, peróxido de
hidrogênio e amônia. A degradação da espermidina e espermina pela PAO produz
pirrolina, diaminopropano (DAP) e peróxido de hidrogênio. A histamina é convertida
em metilhistamina pela ação da histamina N-metil-transferase (HMT) que, em seguida,
é oxidada pela MAO. A histamina também pode ser desaminada pela DAO. A tiramina
é oxidada pela MAO (LIMA & GLÓRIA, 1999).
37
2.5 ASPECTOS TOXICOLÓGICOS
Conforme relatado anteriormente as aminas presentes nos alimentos são
metabolizadas no organismo por enzimas aminoxidases, como as monoaminoxidases
(MAO), as diaminoxidases (DAO) e poliaminoxidases (PAO). Entretanto, a ingestão de
grandes quantidades de aminas pode representar um perigo à saúde, podendo causar
intoxicações em situações em que as aminoxidases forem inibidas, ocorrerem efeitos
sinérgicos ou potencializadores ou se houver deficiência genética (HALÁSZ et al.,
1994).
A intoxicação alimentar mais freqüente causada por aminas envolve a histamina.
Nestes casos tem sido observada diminuição da pressão sanguínea devido a
vasodilatação, rubor da face e pescoço, cefaléia intensa e contínua, palpitação
cardíaca, tontura, sensação de ardor na boca e garganta e dificuldade de engolir
(SILVA & GLÓRIA, 2002). A ocorrência de um ou mais sintomas resulta da ingestão de
alimentos que contêm elevados teores de histamina. Os surtos de intoxicação por
histamina são relatados em maior freqüência após ingestão de peixes e queijos tendo
sido também relatados casos de intoxicação após consumo de fígado e moela de
frangos. De acordo com TAYLOR (1986), vários surtos de intoxicação têm sido
registrados nos Estados Unidos, Japão, Inglaterra, França, Dinamarca, Canadá, Nova
Zelândia, sendo mais implicados os peixes das famílias Scombridae (atum, bonito,
cavala, listrado), Scomberesocidae (tiravira), Clupeidae (arenque, sardinha), dentre
outros. Entretanto, os dados disponíveis são escassos e possivelmente não retratam a
prevalência real.
Os efeitos toxicológicos da histamina dependem da concentração de histamina
ingerida, atividade da aminoxidase e fisiologia intestinal individual. De acordo com
STRATTON et al. (1991) e LIMA & GLÓRIA (1999), o efeito de algumas aminas no
organismo pode ainda ser potencializado pela presença concomitante de outras aminas
como putrescina, cadaverina, tiramina, triptamina, feniletilamina, espermidina e
espermina. Segundo CHU & BJELDANES (1983), a putrescina e a cadaverina podem
potencializar a toxicidade da histamina por inibir as enzimas DAO e histaminametil-
transferase (HMT), aumentando assim seu transporte através da parede gastrintestinal.
A presença destas substâncias potencializadoras pode explicar porque, em alguns
casos, peixes deteriorados são mais tóxicos que a mesma quantidade de histamina
38
quando ingerida sozinha (TAYLOR, 1986; SOARES & GLÓRIA, 1994; LIMA & GLÓRIA,
1999).
A tiramina é o segundo tipo de amina envolvida em intoxicações alimentares. Em
concentrações elevadas pode causar dor de cabeça, enxaqueca, hemorragia
intracraniana, febre, vômito, transpiração e aumento da pressão sangüínea (LIMA &
GLÓRIA, 1999; SILVA & GLÓRIA, 2002). Farmacologicamente a tiramina atua através
da liberação da noradrenalina estocada causando um aumento da pressão sanguínea.
Os medicamentos inibidores da MAO aumentam a concentração da noradrenalina nas
terminações nervosas potencializando a ação da tiramina.
Tem sido atribuído ao elevado teor de serotonina nos alimentos o aparecimento
de transtornos intestinais, fibrose do miocárdio e enxaqueca (LIMA & GLÓRIA, 1999).
A espermina possui toxicidade renal, e influi na coagulação e pressão sangüínea, na
pulsação e na respiração (FUZIKAWA et al., 1999; LIMA & GLÓRIA, 1999).
A diamina putrescina e as poliaminas espermina e espermidina podem acelerar o
crescimento de tumores. Assim sendo, recomenda-se uma dieta com teores reduzidos
destas substâncias para pacientes em tratamento contra o câncer de forma a diminuir o
crescimento e progresso do tumor (BARDÓCZ, 1995; LIMA & GLÓRIA, 1999). A
putrescina, cadaverina, agmatina, espermidina e espermina podem também reagir com
nitrito sob condições ácidas formando nitrosaminas heterocíclicas, nitrosopirrolidina e
nitrosopiperidina (SILLAS-SANTOS,1996). Sabe-se que as nitrosaminas são
compostos cancerígenos, assim é importante prevenir o acúmulo de aminas capazes
de formar nitrosaminas em alimentos (HALÁSZ et al., 1994; GLORIA & IZQUIERDO-
PULIDO, 1999; LIMA & GLÓRIA, 1999).
A determinação da dose tóxica das aminas é difícil de ser estabelecida, pois
depende das características individuais e da presença de outras aminas. Foi sugerido
um limite para histamina de 10 mg/100 g de alimento em geral e de 2 mg/L de bebida
alcoólica. Valores 3 mg/100 g para feniletilamina tem sido sugerido como tóxicos por
HALÁSZ et al. (1994).
A dose tóxica da tiramina é de 10 a 80 mg/100 g de alimento. Entretanto, a
ingestão de alimentos contendo 6 mg de tiramina pode causar enxaqueca e de 10 a 25
mg pode provocar crise hipertensiva e hemorragia intracraniano em indivíduos em
tratamento com inibidores da MAO (HALÁSZ et al., 1994; LIMA & GLÓRIA, 1999).
39
2.6 AMINAS LIVRES EM CAFÉ
Existem poucos estudos sobre a presença de aminas bioativas em grãos de café
verde e torrado, sendo que os dados disponíveis referem-se em sua maioria ao café da
espécie Coffea arabica. Apenas dois trabalhos disponibilizaram dados sobre o perfil e
teores de aminas bioativas em amostras de cafés da espécie Coffea canephora var.
Robusta. CASAL et al. (2004) determinaram os teores de aminas bioativas livres em
amostras de café robusta, cru e torrado, oriundas da África (Costa do Marfin, Uganda,
Angola e Camerron) e Ásia (Vietnam e Índia). Já CASAL et al. (2005) avaliaram o efeito
da torração nas poliaminas livres em amostras de café robusta oriundos apenas da
Costa do Marfin. Não foram encontrados dados na literatura sobre o perfil e teores de
aminas bioativas livres em amostras de café da espécie Coffea canephora (Robusta)
de origem brasileira.
De acordo com as Tabelas 3 e 4, o perfil e os teores de aminas no café variou
entre as diferentes amostras analisadas, ficando também evidente a influência do
processo de torração na concentração das aminas no café.
Tabela 3 - Teores de aminas bioativas livres em grãos de café arábica (cru e torrado)
Referência Amostra
Teores de aminas bioativas (mg/100 g)
SPD SPM PUT AGM SRT CAD TIM
AMORIM et al. (1977) Cru 1,56 0,81 4,26 __ __ __ __
Torrado nd nd 0,2 __ __ __ __
CIRILO et al. (2003) Cru 0,60 0,44 1,03 nd 1,13 nd nd
Torrado 0,12 nd nd 0,12 0,16 nd nd
CASAL et al. (2004) Cru 0,9 0,55 4,79 nd 0,25 0,02 0,02
Torrado 0,01 0,12 0,1 nd 0,23 nd nd
OLIVEIRA (2004) Cru 1,35 1,32 8,23 nd nd nd nd
Torrado 0,08 0,03 0,03 nd nd nd nd
CASAL et al. (2005) Cru 0,79 0,43 4,38 –– –– –– ––
Torrado nd nd nd –– –– –– ––
VASCONCELOS et
al. (2007)
Cru 2,01 2,29 7,65 nd 0,52 nd nd
Torrado nd nd nd nd
<0,37
nd nd
nd - não detectado; –– - não pesquisado; SPD: espermidina; SPM: espermina; PUT : putrescina; CAD:
cadaverina; TIM: tiramina; SRT: serotonina; AGM: agmatina.
40
De acordo com CIRILO et al. (2003), o perfil e os teores de aminas em diferentes
amostras de café verde podem variar com o tipo do café e condições de cultivo (tipo de
solo, deficiência mineral, estresse e estágio de desenvolvimento da planta). A
deficiência de potássio durante o desenvolvimento da planta causa acúmulo de
putrescina nos grãos de café (CIRILO, 2001).
AMORIM et al. (1977) pesquisaram as aminas putrescina, espermidina e
espermina em grãos de café arábica, bebidas mole e rio, antes e após o processo de
torração a 240 ºC por 10 (clara) e 12 minutos (escura). Nos grãos crus todas as três
aminas pesquisadas foram detectadas, porém, após a torração por 10 minutos
somente a putrescina foi detectada, sendo que nenhuma amina foi encontrada após 12
minutos de torração.
CIRILO et al. (2003) investigaram o perfil e teores de dez aminas bioativas em
café verde e torrado da espécie arábica. Os grãos foram submetidos a dois graus de
torração 300 ºC por 6 minutos (americana) e 300 ºC por 12 minutos (francesa). Nos
grãos de café verde os autores encontraram as aminas putrescina, espermidina,
espermina e serotonina, sendo esta última encontrada em maior concentração (1,13
mg/100 g). Após a torração, os teores de serotonina e espermidina diminuíram, sendo
que a putrescina e a espermina não foram detectadas no café torrado. Um fato
interessante observado neste trabalho foi a detecção de agmatina após 12 minutos de
torração.
Tabela 4 - Teores de aminas bioativas livres em grãos de café robusta (cru e torrado)
Referência Amostra
Teores de aminas bioativas (mg/100 g)
SPD SPM PUT SRT CAD TIM
CASAL et al. (2004)
Cru 0,83 0,60 1,11 0,21 0,04 0,31
Torrado 0,01 0,18 0,13 0,33 nd nd
CASAL et al. (2005)
Cru 0,74 0,43 1,43 –– –– ––
Torrado nd nd nd –– –– ––
nd - não detectado; –– não pesquisado; SPD: espermidina; SPM: espermina; PUT : putrescina; CAD:
cadaverina; TIM: tiramina; SRT: serotonina; AGM: agmatina.
CASAL et al. (2004) avaliaram grãos de café arábica e robusta cru e torrado com
relação aos teores de seis aminas bioativas livres (putrescina, cadaverina, serotonina,
tiramina, espermidina e espermina). A putrescina foi a amina mais abundante em
ambas as espécies, seguida da espermidina, espermina e serotonina. As aminas
41
cadaverina e tiramina foram detectadas em pequenas quantidades. Os teores de
putrescina e tiramina foram significativamente diferentes entre as amostras de café
arábica e robusta, sendo que a putrescina foi detectada em maior concentração no café
arábica e a tiramina no café robusta. Os grãos de café foram submetidos ao processo
de torração a 160-220 ºC por 14 minutos. A torração alterou os teores das aminas,
sendo que putrescina, cadaverina, tiramina, espermidina e espermina tiveram seus
teores diminuídos. A serotonina manteve-se inalterada no café arábica, porém no café
robusta os seus teores aumentaram com a torração.
CASAL et al. (2005) pesquisaram a presença de poliaminas (putrescina,
espermidina e espermina) livres em amostras de café arábica e robusta. As amostras
foram submetidas a diferentes graus de torração (140, 160, 180, 200, 220 e 240 ºC)
durante 15 minutos. A putrescina foi a amina mais abundante, seguida da espermidina
e espermina, tanto no café arabica quanto no robusta crus. Durante a torração o
comportamento das aminas foi semelhante com significativa redução em seus teores
entre 180 e 240 ºC. Entretanto, no café robusta a perda de putrescina iniciou-se a
temperatura de 140 ºC, enquanto que no arabica esta diferença nos teores foi
observada somente a partir de 160 ºC. A espermina apresentou um pequeno aumento
em sua concentração na temperatura de 140 ºC em relação ao teor no grão cru. Este
fato sugere que esta amina foi liberada de sua forma conjugada, porém mais estudos
são necessários para confirmar esta hipótese.
A presença de aminas livres também foi avaliada em amostras de grãos de café
classificados como bebidas de alta qualidade (bebida mole) e de baixa qualidade
(bebida rio) (Tabela 5). AMORIM et al. (1977) pesquisaram apenas as poliaminas,
espermidina e espermina e a diamina putrescina, tendo encontrado teores semelhantes
destas aminas para os dois tipos de grãos avaliados. OLIVEIRA et al. (2005)
detectaram cinco das dez aminas pesquisadas: espermidina, espermina, putrescina,
histamina e triptamina. Os teores totais das aminas variaram entre as amostras de
bebida mole e rio. A putrescina foi encontrada em teores significativamente maiores
nos grãos de bebida rio. Histamina e triptamina foram detectadas em maiores
quantidades nas amostras de café verde de baixa qualidade (bebida rio). Assim como
ocorreram nos demais estudos, após a torração, houve diminuição significativa nos
teores de aminas.
42
Tabela 5 - Teores de aminas bioativas livres em grãos de café arabica (cru e torrado)
classificados como bebida mole e rio
Referência Amostra Teores de aminas bioativas (mg/100 g)
SPD SPM PUT HIM TRM
AMORIM et al. (1977)
Mole
Cru 1,63 0,83 4,35 –– ––
Torrado
nd nd 0,18 __ __
Rio Cru 1,50 0,80 4,18 __ __
Torrado
nd nd 0,23 __ __
OLIVEIRA (2004) Mole
Cru 1,13 1,16 6,62 0,04 nd
Torrado
0,11 nd nd nd nd
Rio Cru 1,36 1,37 9,85 0,15 0,30
Torrado
0,05 nd nd nd nd
nd - não detectado; --- não pesquisado; SPD: espermidina; SPM: espermina; PUT : putrescina; HIM:
histamina; TRM: triptamina.
VASCONCELOS et al. (2007) submeteram grãos de café, defeituosos e sadios,
a diferentes graus de torração e os avaliou quanto aos teores de aminas livres. Os
tipos de grãos analisados foram preto, verde, ardido, pva (mistura: preto, verde e
ardido) e sadio, sendo utilizados os estágios de torração claro (200 ºC/30 min), médio
(200 ºC/1 h) e escuro (200 ºC/2 h). O perfil e teores das aminas encontradas nos grãos
de café sadios (cru e torrado) estão apresentados na Tabela 3. Nos grãos defeituosos,
além das aminas encontradas nos grãos sadios (espermidina, espermina, serotonina e
putrescina), foram encontradas cadaverina, histamina e triptamina, porém com algumas
variações entres os mesmos (Tabela 6).
A amina predominante em todos os tipos de grãos foi a putrescina. Dentre as
três aminas encontradas apenas nos grãos defeituosos, a histamina e triptamina foram
predominantes nos grãos defeituosos verdes. A cadaverina só foi encontrada nos
grãos pretos, porém em baixas quantidades. A triptamina não foi encontrada nas
amostras de grãos pretos. Nos grãos torrados, apenas a serotonina estava presente
em baixas concentrações nas amostras submetidas a torração clara. As demais
aminas foram degradadas durante os diferentes processos de torração.
Até o presente momento não foram encontrados dados na literatura sobre o
perfil e teores de aminas bioativas em café solúvel. Em estudos preliminares
realizados no laboratório de Bioquímica de Alimentos, FAFAR, UFMG, foram
encontradas as aminas espermidina, espermina, putrescina, serotonina, cadaverina,
43
tiramina, histamina, agmatina e feniletilamina. Os teores totais variaram de 0,04 a 3,65
mg/100 g, sendo a serotonina predominante (46 %) seguida da cadaverina (17 %),
espermidina (10 %), tiramina (8 %), putrescina (5 %), histamina e espermina (4 %) e
agmatina e feniletilamina (3 %) (SILVEIRA & GLÓRIA, 2004).
Tabela 6 - Teores de aminas bioativas livres em grãos de café arabica (cru e torrado)
classificados como preto, verde, ardido e mistura pva
Amostra Teores de aminas bioativas (mg/100 g)
SPD SPM PUT SRT CAD HIM TRM
Preto Cru 0,42 <0,37 0,88 0,39 <0,37 0,44 nd
Torrado nd nd nd <0,37 nd nd nd
Verde Cru 1,59 1,89 5,39 0,42 nd 0,69 0,57
Torrado nd nd nd <0,37 nd nd nd
Ardido
Cru 1,24 1,74 4,21 nd nd 1,02 <0,37
Torrado nd nd nd 0,52 nd nd nd
PVA Cru 1,80 1,77 6,52 <0,37 nd 0,64 0,46
Torrado nd nd nd <0,37 nd nd nd
Fonte: VASCONCELOS (2005); nd - não detectado; SPD: espermidina; SPM: espermina; PUT:
putrescina; SRT: serotonina; CAD: cadaverina; HIM: histamina; TRM: triptamina.
No processo de produção do café solúvel, os grãos de café são submetidos à
torração. Desta forma o perfil e teores de aminas no café solúvel deveria ser
semelhante ao do café torrado. Os resultados obtidos nos estudos preliminares
demonstraram a presença de algumas aminas que não haviam sido detectadas nos
estudos com café torrado, como tiramina e histamina. Estas aminas têm sido descritas
na literatura como possíveis causadoras de efeitos tóxicos no homem. Além disto,
outras podem afetar a qualidade sensorial da bebida café. Assim sendo, mais estudos
são necessários para traçar o perfil das aminas em café solúvel verificando a
possibilidade de minimizar os seus teores no produto final a fim de garantir uma melhor
qualidade e maior segurança ao consumidor.
44
3 AMINAS BIOATIVAS CONJUGADAS
3.1 ASPECTOS GERAIS
As aminas estão presentes nas plantas na forma livre ou conjugada a moléculas
de baixo peso molecular (ácidos fenólicos) ou a macromoléculas (proteínas)
(RODRIGUEZ et al., 2000; FONTANIELLA et al., 2001; FONTANIELLA et al., 2003). A
conjugação aos ácidos fenólicos consiste em uma ligação covalente entre o grupo
amina e o grupo carboxílico dos ácidos hidroxicinâmicos como os ácidos p-cumárico,
ferúlico e caféico (FONTANIELLA et al., 2001). O resultado desta conjugação é
conhecido como amidas de ácidos hidroxicinâmicos (HCAAs) (Figura 6) (WALTERS,
2003).
Figura 6 – Estruturas químicas de algumas poliaminas conjugadas (amidas de ácidos
hidroxicinâmicos (HCAAs)).
45
As poliaminas são normalmente conjugadas com ácidos hidroxicinâmicos como
p-cumárico, ferúlico e caféico (MARTIN-TANGUY, 1997). As HCAAs básicas
constituídas por aminas alifáticas como a putrescina, espermidina e espermina são
hidrossolúveis enquanto que as HCAAs neutras, aquelas constituídas por aminas
aromáticas como a tiramina, octopamina e triptamina, são insolúveis em água
(FACCHINI et al., 2002).
Além das poliaminas outras aminas têm sido encontradas conjugadas aos
ácidos fenólicos como a tiramina, cadaverina, serotonina, octopamina, triptamina,
dopamina e noradrenalina (CASAL et al., 2004; KING & CALHOUN, 2005; KANG &
BACK, 2006; LY et al., 2008).
3.2 FORMAÇÃO
Em plantas, as poliaminas são comumente conjugadas com ácidos
hidroxicinâmicos, sendo que a proporção entre as formas livre e conjugada varia muito
entre as diferentes espécies de plantas (TIBURCIO et al., 1997; BAGNI & TASSONI,
2001). A conjugação se dá por meio da formação de uma ligação amida, na qual
ésteres de coenzima A (COA) fornecem o grupo carboxil ativado. A putrescina e a
espermidina são conjugadas por transferases, que diferem em sua especificidade para
os derivados hidroxicinamoil-CoA. Desta forma, a enzima putrescina hidroxicinamoil
transferase (PHT; EC 2.3.1. -) catalisa a transferência de ácidos hidroxicinâmicos entre
a CoA e a putrescina. Assim, a reação entre cafeoil-COA e a putrescina produz uma
amida do ácido hidroxicinâmico denominada cafeoilputrescina (WALTERS, 2003). A
putrescina pode formar monômeros ácido solúveis ou dímeros ácido insolúveis com os
ácidos cumárico, caféico e ferúlico. Segundo BAGNI & TASSONI (2001) as poliaminas
também podem se ligar a alguns componentes da parede celular, como a hemicelulose
e a lignina.
De acordo com MARTIN-TANGUY et al. (1978), as poliaminas conjugadas com
ácidos fenólicos estão presentes em um grande número de famílias de plantas, sendo
o principal constituinte fenólico de órgãos reprodutivos e sementes de
aproximadamente 20 espécies de plantas. A conjugação entre poliaminas e ácidos
fenólicos tem sido observada em muitas plantas com flores (HENNION & TANGUY,
46
1999; FONTANIELLA et al., 2001). Estes compostos são acumulados após a indução
floral, no ápice da floração (FONTANIELLA et al., 2001).
As aminas aromáticas como a tiramina, triptamina, serotonina e dopamina são
conjugadas aos ácidos hidróxicinamicos por meio da reação de condensação com
hidroxicinamoil-CoA tioester, que podem ser a cinamoil-CoA, p-cumaroil-CoA, cafeoil-
CoA, feruloil-CoA e sinapoil-CoA. A biossíntese da tiramina conjugada é catalizada
pela enzima tiramina-N-hidroxicinamoiltransferase (THT; EC 2.3.1.110) e a conjugação
da serotonina é catalizada pela enzima serotonina-N-hidroxicinamoiltransferase (SHT)
(Figura 7) (KANG et al., 2006).
Figura 7 – Esquema da biossintese da tiramina e serotonina conjugadas. (Fonte: KANG
et al., 2006). THT = tiramina-N-hidroxicinamoiltransferase; SHT = serotonina-N-
hidroxicinamoiltransferase.
47
3.3 RELEVÂNCIA FISIOLÓGICA
Muitos estudos têm sido conduzidos com o objetivo de demonstrar o
envolvimento direto das poliaminas conjugadas em diferentes funções biológicas em
plantas, animais e seres humanos. As HCAAs têm sido associadas a processos de
crescimento e desenvolvimento de plantas e iniciação da floração. Antes da floração
as aminas conjugadas estão presentes em elevadas concentrações nas folhas das
plantas. Durante a floração estas aminas desaparecem das folhas e migram para as
flores se acumulando nesses órgãos (MARTIN-TANGUY, 1997). Após a fertilização
ocorre uma elevação da concentração de aminas conjugadas nas sementes, que
decresce com a germinação (FACCHINI et al., 2002).
Alguns estudos têm sugerido que as amidas de ácidos hidroxicinâmicos
desempenham importante papel no mecanismo de defesa das plantas contra
patógenos (SEN et al., 1994; WALTERS, 2003). De acordo com HENNION & TANGUY
(1999), o aumento na concentração de aminas conjugadas em folhas de plantas é
devido à presença de infecções virais e fúngicas, bem como, às mudanças ambientais
severas como deficiência de minerais, hipóxia e poluentes ambientais.
LEGAZ et al. (1998) estudaram a relação entre a presença das poliaminas
conjugadas e a sensibilidade da cana de açúcar a um tipo de infecção por fungo e
observaram um aumento na concentração das poliaminas conjugadas ácido solúveis
na cana de açúcar contaminada. As amidas conjugadas entre ácidos fenólicos e
poliaminas têm sido descritas como fitoalexinas, que são sintetizadas por plantas
superiores em resposta a infecções por vírus e fungos (FONTANIELLA et al., 2003).
Segundo SEN et al. (1994) as poliaminas conjugadas aos ácidos fenólicos fortalecem a
parede celular de alguns cereais contribuindo com o mecanismo de resistência ao
ataque de insetos.
Um outro papel relevante das aminas conjugadas se refere à sua atividade
antimicrobiana. YINGYONGNARONGKUL et al. (2006) sintetizaram amidas de ácidos
hidroxicinâmicos e testaram sua atividade antimicrobiana frente a uma cepa de
Staphylococcus aureus meticilina e vancomicina resistentes. Os autores demonstraram
que a dihidrocafeoilputrescina e seus análogos apresentaram atividade antimicrobiana
maior que os antibióticos vancina e a oxacilina frente a cepas de estafilococcus
testadas.
48
A capacidade das HCAAs em inibir a produção de aflatoxina pelo Aspergillus
flavus também foi testada por MELLON & MOREAU (2004). Os autores testaram uma
mistura de diferuloilputrescina e p-cumaroilferuloilputrescina (85:15) e evidenciaram um
nível de inibição de 93% da produção de aflatoxina, porém estes compostos não
inibiram o crescimento do fungo.
Alguns estudos têm reportado as HCAAs como importante classe de compostos
antioxidantes e agentes quimioterápicos (NAGATSU et al., 2000; PARK & SCHOENE,
2002). SON & LEWIS (2002) avaliaram a capacidade das amidas do ácido caféico em
seqüestrar radicais livres e sua atividade antioxidante e concluíram que a atividade
antioxidante destes compostos está relacionada à sua estrutura. As formas
conjugadas do ácido caféico, como cafeoilfeniletilamina, cafeoiltiramina e
cafeoildopamina, apresentaram maior atividade antioxidante. A atividade antioxidante
das poliaminas também foi estudada por CHOI et al. (2007), que evidenciaram elevada
atividade antioxidante dos compostos N-dicumaroilputrescina, N,N-diferuloilputrescina,
p-cumaroil-N-feruloilputrescina. Estes autores também evidenciaram uma forte
atividade antimelanogênica destes compostos, sugerindo que os mesmos poderiam ser
utilizados como agentes antioxidantes naturais e agentes protetores da pele.
A capacidade das aminas conjugadas em inibir a síntese de melanina foi
estudada por OKOMBI et al. (2006). Os autores avaliaram a atividade biológica de
algumas HCAAs sobre os melanócitos humanos e evidenciaram que a trans-N-
cafeoiltiramina, N-dihidrocafeoiltiramina e trans-N-dihidro-p-hidroxicinamoiltiramina
apresentaram maior capacidade de inibição da formação de melanina.
O efeito anticolesterolêmico das aminas conjugadas também tem sido
demonstrado. LEE et al. (2004) sintetizaram amidas do ácido hidroxicinâmico e
testaram seu efeito inibidor na oxidação do colesterol LDL, sobre a atividade da acyl-
CoA:colesterol acyltransferase-1 e -2 e sobre a diminuição do tamanho das partículas
de HDL. Os autores concluíram que as aminas conjugadas possuem atividade
antiaterosclerótica com forte inibição da oxidação do LDL, inibição do acúmulo de
colesterol celular e rearranjo das partículas de HDL. KOYAMA et al. (2006) reportaram
o efeito atenuante da p-cumaroilserotonina e da feruloilserotonina no desenvolvimento
de lesões ateroscleróticas em ratos .
49
3.4 AMINAS CONJUGADAS EM CAFÉ
As aminas podem estar presentes nas plantas na forma livre ou conjugada. A
maioria dos trabalhos descritos na literatura se refere às aminas livres (AMORIM et al.,
1977; CIRILO et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2005, VASCONCELOS et al., 2007).
Entretanto, recentemente, CASAL et al. (2004; 2005) relataram também a presença
das aminas conjugadas no café.
Na tabela 7 estão apresentados o perfil e os teores de aminas bioativas
conjugadas ácido solúveis (AS) e ácido insolúveis (AI) detectadas em amostras de café
arábica e robusta. De acordo com os dados apresentados por CASAL et al. (2004), a
putrescina foi a amina conjugada predominante em ambas as espécies de cafés
analisadas, seguida da espermidina, espermina e serotonina. O café robusta
apresentou maiores teores de tiramina conjugada em relação ao café arábica.
Tabela 7 - Teores de aminas bioativas conjugadas ácido solúveis (AS) e ácido
insolúveis (AI) em grãos crus de café arábica e robusta
Referência
CASAL et
al.
Amostra
Teores de aminas bioativas (mg/100 g)
SPD SPM PUT SRT CAD TIM
AS
AI
AS
AI
AS
AI
AS
AI
AS
AI
AS
AI
2004 Arabica 0,35
0,05
0,20
0,58
0,37
0,29
0,08
nd
0,03
0,01
0,02
0,04
Robusta 0,26
0,04
0,36
0,52
0,32
0,06
0,12
nd
0,04
0,01
0,24
0,09
2005 Arabica 0,10
0,04
0,34
0,14
0,39
0,17
__ __
__ __ __ __
Robusta 0,12
0,04
0,30
0,31
0,26
0,13
__ __
__ __ __ __
nd - não detectado; --- não pesquisado; PUT : putrescina; CAD: cadaverina; TIM: tiramina; SRT:
serotonina; AGM: agmatina; SPD: espermidina; SPM: espermina; AS: ácido solúveis; AI: ácido
insolúveis.
Nos dados apresentados por CASAL et al. (2005), os teores de putrescina na
forma conjugada (AS + AI) foram predominantes no café arábica, porém no café
robusta foi a espermina. Os autores sugeriram que esta seja a forma predominante da
espermina nos vegetais. Porém, mais estudos são necessários para confirmar esta
hipótese. O efeito da torração nos teores das poliaminas conjugadas também foi
avaliado por estes autores, que submeteram amostras de café arábica e robusta a
diferentes graus de torração. Assim como as aminas livres, as conjugadas também
tiveram seus teores diminuídos durante a torração. Apesar dos dados indicarem uma
50
diminuição nos teores das aminas durante a torração, o aumento da concentração de
algumas aminas livres durante o processamento do café pode estar relacionado com a
liberação de sua forma conjugada. Assim, faz-se necessário mais estudos sobre a
influência da torração e do processamento no comportamento das aminas conjugadas.
4 MÉTODOS PARA ANÁLISE DE AMINAS EM CAFÉ
Vários métodos têm sido desenvolvidos e propostos para isolar e quantificar
aminas em alimentos, entre eles, a cromatografia de camada delgada (LAPA-
GUIMARÃES & PICKOVA, 2004), cromatografia a gás (BAKER et al., 1987; ANTOINE
et al., 2002), cromatografia líquida de troca iônica (ZEE et al., 1981; STANDARA et al.,
2000; REY & POHL, 2003), cromatografia líquida de alta eficiência - CLAE
(IZQUIERDO-PULIDO et al., 1993; VALE & GLÓRIA, 1997; NOVELLA-RODRÍGUEZ et
al., 2000; TAMIN et al., 2002). A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é o
método mais utilizado para a determinação de aminas bioativas livres e conjugadas em
amostras de café (CASAL et al., 2002; CIRILO et al., 2003).
A metodologia para a análise de aminas envolve as seguintes etapas: extração,
purificação, separação e quantificação. Dependendo da matriz, ou seja, o tipo do
alimento a ser analisado, as etapas de extração e purificação podem sofrer alterações.
Em alguns casos, é necessário ainda fazer uma derivação da amostra antes da etapa
de separação ou de detecção (MORET & CONTE, 1996).
A extração consiste na retirada das aminas da matriz, sendo considerada crítica,
pois sua eficiência depende do tipo e da natureza das aminas presentes e do alimento
analisado (TAMIN et al., 2002). A extração de aminas pode ser realizada em meio
aquoso, com água a temperatura ambiente ou aquecida, desta forma são extraídas
apenas as aminas livres, ou em meio ácido, podendo ser utilizados os ácidos clorídrico
(HCl), perclórico (HClO
4
) ou tricloroacéico (TCA). Na extração ácida, algumas aminas
ligadas a outros componentes da matriz também são extraídas, juntamente com as
aminas livres (MORET & CONTE, 1996).
A extração de aminas livres em amostras de café é feita em meio ácido, sendo o
ácido mais utilizado o TCA a 5% (m/v). CASAL et al. (2002) avaliaram a performance
dos ácidos HCl (0,1 M), PCA (0,4 e 0,6 M) e TCA (5 e 10%) na etapa de extração de
aminas em amostras de café. Os autores concluíram que o extrator mais eficiente foi o
51
TCA a 5%, visto que o HCl produziu um extrato muito turvo e com baixa resolução dos
picos cromatográficos. Com ácido perclórico, os picos da histamina e tiramina se
apresentaram de forma anormal e com muitas impurezas. Assim os autores
concluíram que o melhor extrator seria o TCA 5% (m/v).
Para a determinação das aminas conjugadas, após a extração ácida, o extrato
obtido é submetido a uma hidrólise ácida. Na análise de aminas conjugadas em
amostras de café, CASAL et al. (2004, 2005) efetuaram a hidrólise com HCl 12 M a
110 ºC por 18 h, porém outros autores utilizaram procedimentos diferentes (Tabela 8)
em matrizes variadas.
Diante de diferentes condições de hidrólise disponíveis na literatura, estudos são
necessários para otimização das condições de análises para determinação de aminas
conjugadas em amostras de café.
Tabela 8 – Variáveis utilizadas na hidrólise ácida em diferentes matrizes
Matriz Hidrólise ácida Referência
Ácido Tempo Temp ºC
Café HCl 12 M 18 h 110 Casal et al. (2004)
Laranja HCl 6 N 20 h 110 Tassoni et al. (2004)
Alga HCl 11 N 16 h 110 Lu & Hwang (2002)
Liquem Evernia
prunastri
HCl 12 M 18 h Amb Fontaniella et al. (2001)
HCl 12 M 18 h 110
Acético 1M 18 h Amb
Acético 1M 18 h 110
Fórmico 90% 8 h Amb
Fórmico 90% 8 h 110
Planta Lyallia
kerguelensis
HCl 6 N 10-16 h 110 Hennion & Martin-
Tanguy (1999)
Caldo de cana HCl 12 M 18 h Amb Rodriguez et al. (2000)
HCl 12 N 18 h Amb Armas et al. (1999)
Após a etapa de extração, e posterior hidrólise para obtenção das aminas
conjugadas, as substâncias interferentes podem ser removidas pela purificação do
extrato com resinas de troca iônica ou catiônica ou partição líquido-liquido (COUTTS et
52
al., 1986; CASAL et al., 2002). O café é uma matriz complexa, e o extrato pode
apresentar muitos interferentes. CASAL et al. (2002) testaram o método de partição
líquido-líquido para a purificação dos extratos de café. Foram testados os solventes
orgânicos: dietileter, butanol, butanol/clorofórmio e um par iônico BEHPA (bis-2-
etilhexilfosfato). De acordo com os autores, para o extrato de café, o método de
purificação mais eficiente foi a partição líquido-liquido com utilização do par iônico
BEHPA, visto que o dietileter apresentou picos interferentes com a histamina e
cadaverina. O procedimento realizado com o butanol e butanol/clorofórmio também
apresentaram picos interferentes coincidindo com a histamina e a cadaverina. Alguns
ajustes no gradiente foram testados, mas sem sucesso. O cromatograma dos extratos
de café, após a purificação com par iônico BEHPA, apresentou picos com elevada
pureza, um melhor resultado no teste de recuperação das aminas e nenhum pico
interferente.
As aminas bioativas em café são separadas por cromatografia líquida de alta
eficiência - CLAE (TAMIN et al., 2002) ou CLAE com par iônico (IZQUIERDO-PULIDO
et al., 1993; VALE & GLÓRIA, 1997; NOVELLA-RODRÍGUEZ et al., 2000; CIRILO et
al., 2003) com detecção espectrofotométrica ou espectrofluorimétrica após
derivatização com cloreto de dansila (CASAL et al., 2002) ou o-ftalaldeído (CIRILO et
al., 2003).
5 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Validação de método analítico é o processo de demonstrar que o método é
adequado ao uso pretendido, sendo considerado um aspecto vital da garantia da
qualidade analítica (BARROS, 2002). De acordo com a ANVISA (2003), a validação
deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências
das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados.
O objetivo da validação é demonstrar que um método analítico é adequado para
o seu propósito. Desta forma a validação deve ser considerada quando se desenvolve
ou efetua adaptações em metodologias já validadas, inclusão de novas técnicas de
análise ou mesmo com o uso de equipamentos diferentes (BRITO et al., 2003). Os
métodos normalizados, já são validados e não é necessário proceder ao processo
completo de validação desde que não ocorram alterações significativas dos mesmos
(BARROS, 2002). Porém, independente de quão adequado seja o desempenho de um
53
método em um estudo de validação já estabelecido, é necessário uma confirmação de
que o método é válido quando aplicado em diferentes laboratórios, efetuando uma
validação intralaboratorial (SOUZA et al., 2007).
O processo de validação consiste na determinação de parâmetros analíticos,
também conhecidos como, parâmetros de desempenho analítico, características de
desempenho ou figuras analíticas de mérito (RIBANI et al., 2004). Os parâmetros
analíticos normalmente utilizados para a validação de métodos são: seletividade,
linearidade e faixa de aplicação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de
quantificação e robustez (JENKE, 1996; BRITO et al., 2003; RIBANI et al, 2004; LIMA &
FROTA, 2007).
As definições das figuras de mérito mais utilizadas em validação de métodos
analíticos estão apresentadas a seguir:
Especificidade - é a habilidade de determinar com exatidão e especificamente a
substância de interesse na presença de outros componentes tais como: impurezas,
produtos de degradação e excipientes (BARROS, 2003). Um método pode ser
considerado seletivo quando produz resposta para vários compostos químicos de uma
matriz com características em comum (RIBANI et al., 2004).
Linearidade e faixa de trabalho - é a capacidade do método de gerar resultados
diretamente proporcionais à concentração da substância de interesse, enquadrados em
uma faixa analítica especificada (BRITO et al., 2003). A linearidade pode ser
demonstrada pelo coeficiente de correlação da curva analítica, que não deve ser
estatisticamente diferente de um, com a inclinação da reta diferente de zero.
A faixa de trabalho ou de aplicação corresponde ao intervalo de concentrações
dos padrões (maior e menor nível) que possam ser determinadas com precisão e
exatidão dentro da linearidade do método (BRITO et al., 2003).
Exatidão - é a proximidade entre a média de um conjunto de resultados obtidos
experimentalmente, em relação ao valor verdadeiro ou de referência. A exatidão
expressa a diferença entre o valor obtido e o valor real de um analito na matriz. É
geralmente expressa na forma de tendência (bias), ou seja, o desvio (positivo ou
negativo) da média de um resultado obtido em relação ao valor real (EURACHEM,
1998).
54
Precisão - é o grau de concordância de uma série de resultados obtidos de múltiplas
análises, de uma mesma amostra homogênea. Usualmente é expressa como o desvio
padrão, variância ou coeficiente de variação (CV) de diversas medidas. A precisão
pode ser considerada no nível de repetibilidade, de precisão intermediária e de
reprodutibilidade (CHASIN et al., 1998; BRITO et al., 2002).
A repetibilidade é o grau de concordância entre os resultados obtidos pela
aplicação de um mesmo procedimento analítico sob as mesmas condições de medida,
em intervalos curtos de tempo (EURACHEM, 1998).
Limite de detecção - é a menor concentração do analito na amostra que pode ser
detectada, mas não necessariamente quantificada (INMETRO, 2003).
Limite de quantificação - é a menor quantidade da substância de interesse que pode
ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis (INMETRO, 2003).
Robustez – é a medida da capacidade de permanecer inalterado sob pequenas, mas
estudadas variações nos parâmetros do método e prover indicação da sua
dependência durante o uso normal (BRITO et al., 2003). É a capacidade de
permanência dos resultados diante de pequenas variações em parâmetros
operacionais e ambientais (EURACHEM, 1998).
55
OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo geral determinar o perfil e teores das aminas
bioativas livres e conjugadas no café solúvel e verificar a influência do processamento
no perfil e teores destas aminas.
Os objetivos específicos são:
(i) determinar o perfil e teores de aminas bioativas livres no café solúvel disponível
no mercado consumidor.
(ii) otimizar e padronizar a etapa de extração das aminas livres do café cru;
(iii) otimizar e padronizar a etapa de hidrólise das aminas conjugadas no café;
(iv) acompanhar todo o processamento do café solúvel, desde a seleção dos grãos
até o produto final, determinando o perfil e teores das aminas bioativas, livres e
conjugadas, assim como outras características físico-químicas relevantes
(umidade, pH, características de cor, atividade de água, cafeína);
(v) avaliar a influência das etapas de processamento do café solúvel no perfil e
teores das aminas livres e conjugadas e
56
CAPÍTULO I – PERFIL E TEORES DE AMINAS BIOATIVAS EM
AMOSTRAS DE CAFÉ SOLÚVEL COMERCIALIZADAS EM
BELO HORIZONTE, MG
RESUMO
O perfil e os teores de dez aminas bioativas livres, bem como o pH as
características de cor foram determinados em amostras de café solúvel regular,
descafeinado e orgânico, comercializadas em Belo Horizonte, MG, Brasil. As aminas
putrescina, cadaverina, tiramina, histamina, serotonina, agmatina, espermidina,
espermina, feniletilamina e triptamina foram extraídas com ácido tricloroacético e
quantificadas por CLAE-par iônico, derivação pós-coluna com o-ftalaldeído e detecção
fluorimétrica. Nove aminas foram detectadas: serotonina, cadaverina, tiramina,
espermidina, putrescina, histamina, agmatina, feniletilamina e espermina. A triptamina
não foi detectada em nenhuma amostra. Os teores totais de aminas variaram de 0,28
a 2,76 mg/100 g, sendo a serotonina predominante (36 %) seguida da cadaverina (24
%), tiramina (12 %), espermidina (10 %), putrescina (7 %), histamina e feniletilamina (4
%), agmatina (3%) e espermina (2 %). Os teores de tiramina foram significativamente
maiores no café descafeinado. A cadaverina foi detectada em maiores concentrações
nos café descafeinados e orgânico. Os teores de aminas variaram entre os lotes e
entre as diferentes marcas analisadas. O pH variou de 4,86 a 5,15, com maiores
valores para o café descafeinado. As características de cor variaram entre os tipos de
cafés analisados. Foi observado correlação positiva entre o pH das amostras e os
teores de tiramina e agmatina.
Palavras-chave: café solúvel, aminas bioativas, café descafeinado, café orgânico, pH,
cor
57
I.1 INTRODUÇÃO
O café é uma das bebidas mais consumidas em todo mundo devido seu sabor e
aroma agradáveis e seus efeitos estimulantes. Além disso, recentemente, inúmeros
benefícios à saúde humana têm sido atribuídos ao café (YEN et al., 2005; FARAH et
al., 2006b) O café solúvel foi inventado em 1901, mas foi comercializado somente em
1938. O consumo de café solúvel vem aumentando significativamente por causa da
facilidade com que é preparado e pela vida de prateleira prolongada (TRUGO &
MACRAE, 1984; NOGUEIRA & TRUGO, 2003).
Nos últimos anos estudos sobre a composição do café aumentaram
significativamente, com determinações principalmente de ácidos fenólicos e compostos
nitrogenados como cafeína e trigonelina. Todavia, poucos estudos foram conduzidos
sobre as aminas bioativas, que desempenham um importante papel no
desenvolvimento das plantas e também na saúde humana. Nas plantas as aminas são
requeridas no crescimento, no controle do pH intracelular, na resposta ao estresse e
nos mecanismos de defesa contra patógenos, insetos e predadores (ELIASSEN et al.,
2002; GLÓRIA, 2005; KALAC & KRAUSOVA, 2005). Com relação à saúde humana,
estudos têm demonstrado que algumas aminas participam nos processos de
desenvolvimento e crescimento celular, na resposta ao estresse, na inibição da
peroxidação lipídica, na estabilização de membranas, na maturação do trato
gastrointestinal, sendo que algumas aminas também são vasoativas e psicoativas
(GLÓRIA, 2005; KALAC & KRAUSOVA, 2005).
Alguns estudos têm relatado a presença de aminas bioativas em café (AMORIM
et al., 1977; CASAL et al., 2002; CIRILO et al., 2003; CASAL et al., 2004; OLIVEIRA et
al., 2005; VASCONCELOS et al., 2007). De acordo com esses estudos, no café verde
foram encontradas as aminas putrescina, espermidina e espermina. A putrescina foi a
amina predominante, seguida da espermidina e da espermina. Outras aminas também
foram relatadas no café verde, como a serotonina (CIRILO et al., 2003; CASAL et al.,
2005; VASCONCELOS et al., 2007), tiramina, histamina e cadaverina (CASAL et al.,
2002; CASAL et al., 2004). Foram evidenciadas diferenças no perfil e nos teores de
aminas em amostras de café de diferentes espécies (CASAL et al., 2004), origens
(CASAL et al., 2002), práticas de cultivo (CIRILO et al., 2003), qualidade da bebida
(AMORIM et al., 1977; OLIVEIRA et al., 2005) e dos grãos (VASCONCELOS et al.,
58
2007), bem como em diferentes métodos de extração das aminas da matriz (CASAL et
al., 2004; 2005).
Estudos realizados por OLIVEIRA et al. (2005) indicaram que grãos de café que
originavam bebidas de baixa qualidade (Rio) continham elevados teores de putrescina
quando comparados com grãos classificados como de alta qualidade (Mole). Além
disso, histamina e triptamina foram detectadas em grãos de café classificados como
bebida de baixa qualidade. De acordo com VASCONCELOS et al. (2007), algumas
aminas que não foram detectadas em grãos de café sadios foram encontradas em
grãos de café defeituosos. A histamina foi detectada nos grãos preto, verde e ardido, a
triptamina nos grãos verde e ardido e a cadaverina nos grãos pretos. Desta forma a
presença de algumas aminas que não são comuns aos grãos verdes em amostras de
café poderia indicar a presença de grãos defeituosos e, conseqüentemente, uma
bebida de baixa qualidade.
Durante o processo de torração do café ocorre uma significante diminuição nos
teores de aminas. Elevadas temperaturas e o tempo utilizados na torração podem
diminuir os teores das aminas ao ponto de algumas não serem detectadas (AMORIM et
al., 1977; CIRILO et al., 2003; CASAL et al., 2004; 2005). Porém grão de café
submetido à torração clara pode conter baixos teores de aminas (CIRILO et al., 2003;
CASAL et al., 2004; 2005; VASCONCELOS et al., 2007). Além disso, durante a
torração de grãos de café por 12 min a 300 ºC, CIRILO et al. (2003) detectou a
formação da agmatina. A formação da agmatina pode ter ocorrido pela descarboxilação
da arginina ou pela liberação desta amina de sua forma conjugada (CIRILO et al, 2003;
CASAL et al., 2005).
No processo de produção do café solúvel os grãos são torrados, moídos e
submetidos à extração sob pressão em altas temperaturas (180ºC). O extrato é então
desidratado em vaporizadores ou liofilizadores originando o café solúvel em pó ou
granulado. Desta forma a composição do café solúvel dependerá, além das condições
do processamento, das espécies e variedades de café utilizadas nos blends
(NOGUEIRA & TRUGO, 2003).
Devido à escassez de dados sobre o perfil e teores de aminas bioativas em café
solúvel e a relevância destes compostos para a saúde humana, o presente trabalho
teve como objetivo determinar o perfil e teores de aminas bioativas no café solúvel
disponível no mercado consumidor de Belo Horizonte, MG.
59
I.2 MATERIAL E MÉTODOS
I.2.1 MATERIAL
I.2.1.1 Amostra
Foram coletadas no mercado consumidor de Belo Horizonte, MG, no período de
julho de 2002 a dezembro de 2003, sessenta e oito amostras de café solúvel, sendo 39
regulares, 24 descafeinados e 5 orgânicos.
I.2.1.2 Reagentes
Os reagentes utilizados possuíam grau analítico, exceto o solvente usado no
CLAE (acetonitrila), que era de grau cromatográfico. Todas as soluções foram
preparadas com água ultrapura obtida do Sistema Milli-Q Plus (Millipore Corp., Milford,
MA, EUA). Os padrões de aminas bioativas (diidrocloreto de putrescina - PUT,
diidrocloreto de cadaverina - CAD, diidrocloreto de histamina - HIM, hidrocloreto de
tiramina - TIM, tetraidrocloreto de espermina - EPM, triidrocloreto de espermidina –
EPD, complexo sulfato creatinina agmatina - AGM, hidrocloreto de 2-feniletilamina -
FEM, hidrocloreto de 5-hidroxitriptamina ou serotonina – SRT), foram adquiridos da
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). As fases móveis foram filtradas em
membrana (47 mm de diâmetro e 0,45 m de poro, Millipore Corp., Milford, MA, EUA)
dos tipos HAWP e HVWP para reagentes aquosos e solventes orgânicos,
respectivamente.
I.2.2. MÉTODOS
As amostras coletadas foram analisadas quanto ao perfil e teores das aminas
bioativas, pH e características de cor L* a* b*. As aminas pesquisadas foram
putrescina, cadaverina, tiramina, histamina, serotonina, agmatina, espermidina,
espermina, feniletilamina e triptamina.
60
I.2.2.1 Determinação de aminas bioativas
Para a determinação das aminas, o café solúvel (5 g) foi adicionado de 7 mL de
ácido tricloroacético (TCA) 5%. Em seguida foi agitado em mesa agitadora por 10
minutos, centrifugado a 11.180 g a 4 °C por 21 minutos e filtrado em papel de filtro
qualitativo. A extração foi repetida mais duas vezes, com adição de 7 e 6 mL de TCA
5%; os extratos foram combinados e o volume final anotado.
Os extratos foram filtrados em membrana HAWP de 13 mm de diâmetro e 0,45
µm de tamanho do poro (Millipore Corp. Milford, MA, EUA). As aminas foram
determinadas por CLAE-par iônico, derivação pós-coluna com OPA, conforme
metodologia descrita por CIRILO et al. (2003).
A análise cromatográfica foi efetuada em um cromatógrafo líquido de alta
eficiência Shimadzu, modelo LC-10 AD, com a mistura à baixa pressão; conjunto de
lavagem automática de pistão; injetor automático Shimadzu modelo SIL – 10 ADVP
conectado a um detector espectrofluorimétrico modelo RF-551 a 340 nm de excitação e
445 nm de emissão e um controlador CBM-20 A (Shimadzu, Kyoto, Japão) conectada a
um computador. O sistema de derivação pós-coluna foi montado com uma câmara de
mistura (volume morto igual a zero), instalada entre a saída da coluna e o detector; um
tubo de teflon, protegido da luz, de 2 m de comprimento e 0,25 cm de diâmetro
conectado entre a câmara de mistura e o detector e a bomba LC-10 AD (Shimadzu,
Kyoto, Japão).
Foi utilizada uma coluna µBondapak C18 em fase reversa 3,9 x 300 mm, 10 µm
e pré-coluna µBondapak C18 (Waters, Milford, MA) e sistema gradiente de eluição em
ambiente com temperatura controlada (20 ± 1 ºC). As fases móveis foram: A - solução
0,2 M de acetato de sódio e 15 mM de octanosulfonato de sódio, pH 4,9 ajustado com
ácido acético e B - acetonitrila. O fluxo de análise foi de 0,8 mL/min.
O reagente de derivação consistiu de 0,2 g de OPA dissolvido em 3 mL de
metanol e 500 mL de uma solução de 25 g de ácido bórico e 22 g de KOH (pH 10,5),
1,5 mL de Brij-35 e 1,5 mL de mercaptanol. A solução derivante foi preparada
diariamente, mantida ao abrigo da luz e bombeada à câmara de mistura a um fluxo de
0,4 mL/min.
A identificação das aminas foi feita por comparação do tempo de retenção das
aminas na amostra em relação ao padrão e também pela adição de solução da amina
61
suspeita à amostra. O cálculo da concentração das aminas foi feito por interpolação
nas respectivas curvas analíticas.
I.2.2.1 Determinação do pH
O pH das amostras de café foi determinado por medida direta em pHmetro digital
(DM20 Digimed, Santo Amaro, SP, Brasil) previamente calibrado com soluções tampão
de pH 4,0 e 7,0 à temperatura ambiente. O café solúvel (2 g) foi reconstituído em 100
ml de água (IAL, 2004).
I.2.2.2 Determinação das características de cor
As características de cor foram determinadas usando o colorimetro ColorTec
PCM (Accuracy Microsensor, Pittsford, EUA). Foram efetuadas medidas dos
parâmetros L*, a*, b* e cálculo dos valores de croma [c = (a
2
+ b
2
)
1/2
] e tonalidade [h =
arctg a/b] em triplicata. Os valores c e h foram confirmados empregando-se o software
Colorpro (COLORPRO, 2004).
I.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos durante a execução do experimento foram submetidos à
análise de variância (média, desvio padrão e coeficiente de variação) - ANOVA, e as
médias foram comparadas pelo teste de Duncan a 5% de significância utilizando-se o
programa estatístico SIGMA STAT versão 2.0.
62
I.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
I.3.1 Perfil de aminas bioativas livres no café solúvel
Nove das dez aminas investigadas foram detectadas nas amostras analisadas. A
triptamina não foi detectada em nenhuma das amostras. A tiramina foi a amina
prevalente, sendo detectada em todas as 68 amostras analisadas, seguida da
cadaverina (88%), serotonina (72%), espermidina (65%), feniletilamina (57%),
putrescina e histamina (54%) (Figura I.1). A Agmatina e espermina foram detectadas
apenas e 29 e 18% das amostras, respectivamente.
Figura I.1. Ocorrências das aminas bioativas livres nas amostras analisadas.
SPD=espermidina; SPM=espermina; PUT=putrescina; AGM=agmatina; SRT=serotonina; CAD=cadaverina; TIM=tiramina;
HIM=histamina; PHE=feniletilamina.
A presença da espermidina no café era esperada visto que esta amina esta
amplamente distribuída em plantas e desempenham um importante papel no processo
de divisão e crescimento celular (FLORES et al., 1989; BARDOCZ, 1995; CIRILO et al.,
2003). A putrescina por ser um precursor das aminas espermidina e espermina
também era esperada (LIMA & GLÓRIA, 1999; WALTERS, 2003). A prevalência de
63
espermidina em relação à espermina está em acordo com VALERO et al. (2002) e
KALAC et al. (2002) para diferentes vegetais. Algumas aminas identificadas no café
solúvel já haviam sido previamente detectadas em amostras de café verde e torrado,
com exceção da feniletilamina, que foi detectada em amostras de café pela primeira
vez. A presença de muitas destas aminas foi relatada em grãos de café verde, dentre
elas , a prutrescina, a espermidina, a espermina e a serotonina (AMORIM et al., 1977;
CIRILO et al., 2003; CASAL et al., 2004; VASCONCELOS et al., 2007). Tiramina e
cadaverina foram encontradas em baixas concentrações (0,31 e 0,04 mg/100 g,
respectivamente) em grãos de café verde da espécie Coffea canephora var. Robusta
(CASAL et al., 2004). A agmatina foi detectada em amostras de café submetidas a
elevadas temperaturas de torração (CIRILO et al., 2003). Além disso, histamina,
triptamina e cadaverina foram detectadas em cafés classificados como bebida de baixa
qualidade e em grãos de café defeituosos como preto, verde e ardido (OLIVEIRA et al.,
2005; VASCONCELOS et al., 2007).
Não foram encontrados dados na literatura sobre o perfil e teores de aminas
bioativas em café solúvel. Todavia, como o extrato do café é obtido a partir do café
torrado, o perfil de aminas presente no café solúvel deveria ser semelhante ao café
torrado. Durante a torração muitas aminas livres são degradadas, assim o café torrado
apresenta normalmente a serotonina que parece ser a amina mais resistente à
torração. As aminas putrescina, espermidina e espermina podem ser detectadas em
torrações mais brandas (clara), sendo que a agmatina pode ser formada durante
processos de torração escura (AMORIM et al., 1977; CIRILO et al., 2003; CASAL et al.,
2004). A presença de diferentes tipos de aminas no café solúvel poderia indicar que
estas foram introduzidas durante o processamento, nas etapas de extração,
concentração ou desidratação. Além disso, as aminas poderiam estar presentes no
café torrado em sua forma conjugada e que foram hidrolisadas durante o
processamento. Mais estudos são necessários para identificar a fonte destas aminas
presentes no café solúvel.
I.3.2 Teores de aminas bioativas livres no café solúvel
Os teores de aminas detectados nas amostras analisadas estão indicados na
Tabela I.1. Os teores totais de aminas variaram de 0,28 a 2,76 mg/100 g. Teores
médios elevados foram observados para as aminas serotonina, seguida da cadaverina,
64
tiramina e espermidina. Foi observada uma grande variação nos teores das aminas
entre as amostras analisadas, como evidenciado pelo coeficiente de variação.
Elevadas variações foram observadas para a espermina, a agmatina e a feniletilamina.
Todavia pequenas variações foram encontradas para a tiramina, a cadaverina e a
serotonina, que foram as aminas presentes em maiores quantidades.
As aminas serotonina, espermidina e putrescina foram detectadas em teores
similares aos encontrados no café torrado como reportado por AMORIM et al. (1977),
CIRILO et al. (2003), CASAL et al. (2004), VASCONCELOS et al. (2007). Porém
cadaverina, tiramina, histamina e feniletilamina, que não tinham sido encontradas no
café torrado, foram detectadas no café solúvel em teores significativos.
Tabela I.1. Teores de aminas bioativas em café solúvel
Aminas Teores de aminas (mg/100 g)
SPD SPM PUT AGM
SRT CAD TIM HIM PHE Total
n + 44 12 37 20 49 60 68 37 39 68
Mínimo 0,04 0,05 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,28
Máximo 0,77 0,41 0,53 0,53 1,80 0,81 0,55 0,14 0,75 2,76
Mediana 0,06 0,00 0,04 0,00 0,36 0,27 0,11 0,04 0,04 1,01
Média 0,11 0,03 0,08 0,04 0,39 0,7 0,14 0,04 0,05 1,15
CV (%) 169 293 142 216 98 79 74 110 197 56
n+= número de amostras positivas; CV= coeficiente de variação; SPD=espermidina; SPM=espermina; PUT=putrescina;
AGM=agmatina; SRT=serotonina; CAD=cadaverina; TIM=tiramina; HIM=histamina; PHE=feniletilamina.
I.3.3 Perfil e teores de aminas livres em diferentes tipos de café solúvel
A contribuição de cada amina ao teor total para cada tipo de café solúvel variou
significativamente (Figura I.2). Em média a amina que mais contribuiu com o teor total
foi a tiramina, mas avaliando cada tipo de café separadamente foram observadas
variações. No café solúvel regular a serotonina contribuiu mais com o teor total,
seguida da cadaverina, espermidina e tiramina. No café descafeinado as aminas que
mais contribuíram foram a cadaverina, a serotonina e a tiramina. No café orgânico a
cadaverina também foi a amina que apresentou Mao ir contribuição ao teor total,
seguida da espermidina e serotonina.
65
Figura I.2. Contribuição de cada amina em relação ao teor total nos diferentes tipos de
café solúvel. SPD=espermidina; SPM=espermina; PUT=putrescina; AGM=agmatina; SRT=serotonina; CAD=cadaverina;
TIM=tiramina; HIM=histamina; PHE=feniletilamina.
Os teores médios de cada amina detectada nos diferentes tipos de café solúvel
analisadas estão indicados na Figura I.3. As aminas encontradas em maiores teores
foram a serotonina, a cadaverina, a tiramina e a espermidina. Foi observada diferença
significativa nos teores de cadaverina e tiramina entre os três tipos de café solúvel.
Elevados teores de cadaverina foram detectados nos cafés descafeinado e orgânico,
enquanto que a quantidade de tiramina foi maior no café descafeinado.
De acordo com NOGUEIRA & TRUGO (2003), a composição do café solúvel
pode variar durante o processamento e também com as espécies e variedades de café
usadas nos blends. Nos grãos de café robusta foram observados elevados teores de
tiramina (CASAL et al., 2004), assim o uso desta variedade de café em altas
proporções nos blends poderia fornecer elevados teores de tiramina ao café solúvel.
Os teores de cadaverina foram significativamente diferentes no café solúvel orgânico
em relação ao café solúvel regular. Estes resultados sugerem que as práticas de cultivo
orgânicas podem favorecer a formação e o acúmulo de cadaverina neste tipo de café.
66
Figura I.3. Teores de aminas bioativas nos diferentes tipos de café solúvel. Letras
diferentes (a, b) para uma mesma amina são significativamente diferentes. Teste de Duncan (p< 0,05).
I.3.4 Teores de aminas bioativas livres em diferentes marcas de café solúvel
Os teores totais de aminas nas diferentes marcas dos cafés regular,
descafeinado e orgânico estão demonstrados na Figura I.4. Do total de 12 marcas
incluídas neste estudo, dez produziam café solúvel regular, seis descafeinado e apenas
uma marca produzia café orgânico. O teor total de aminas variou de 0,30 a 2,86
mg/100 g (média 1,07 mg/100 g) para o café solúvel regular; 0,38 a 2,51 mg/100 g
(média 1,29 mg/100 g) para o descafeinado e 0,41 a 2,53 mg/100 g (média 1,41
mg/100 g) para o orgânico. Foi observada uma variação nos teores de aminas entre as
marcas, mas esta diferença não foi estaticamente significativa (p> 0,05), provavelmente
devido a grande variação nos teores entre as amostras dos diferentes lotes de cada
marca.
I.3.5 Perfil e teores de aminas livres nos diferentes tipos de bebida café solúvel
A concentração das aminas serotonina, tiramina e cadaverina presentes em
50 mL de bebida para cada marca dos cafés analisados solúvel regular, descafeinado e
orgânico está indicada na Tabela I.2. As bebidas foram preparadas de acordo com as
instruções dos fabricantes, e não diferiram em relação à proporção de café utilizada no
67
preparo (2 g para 50 mL de bebida). Os teores destas aminas na bebida variaram
amplamente.
Figura I.4. Teores totais de aminas bioativas livres nas diferentes marcas de café
solúvel: A) regular; B) descafeinado; C) orgânico.
68
A serotonina apresentou teores que variaram de não detectados até 7,8 µg, a
tiramina de 0,0 a 4,9 µg e a cadaverina de 0,2 a 6,0 µg. A implicação dos níveis destas
aminas na bebida café ainda não está bem estabelecida. Dados sobre a influência das
aminas nas características sensoriais da bebida café são escassos. WANG et al.
(1975) reportou que as poliaminas livres apresentam um odor desagradável,
amoniacal, quase pútrido. Porém, o ph bem como outros componentes presentes no
café pode desempenhar um papel na percepção das aminas.
Tabela I.2. Teores de serotonina, tiramina, cadaverina e total de aminas bioativas livres
em 50 mL de bebida nas diferentes marcas dos café analisados.
Tipos Marca
s
Serotonina
(µg/50 mL)
Tiramina
(µg/50 mL)
Cadaverina
(µg/50 mL)
Total
(µg/50 mL)
Regular A 4,3 1,2 2,0 11,2
B 3,7 0,6 2,6 10,6
C 7,8 0,9 3,8 18,3
D 6,5 1,0 0,6 9,9
E 3,4 2,0 5,0 28,6
F 1,7 1,7 1,7 6,9
G nd 2,2 2,2 5,5
H 3,0 0,3 0,1 5,1
I 4,0 0,9 1,3 5,6
J 2,7 1,0 0,9 6,4
Descafeinado
A 5,5 1,9 6,0 16,9
D 3,9 1,4 3,7 12,2
E 2,6 2,0 3,3 23,0
G 1,2 4,9 0,4 18,0
H 0,5 3,7 2,4 5,5
K nd 1,3 4,4 7,2
Orgânico H 1,7 0,3 0,9 4,0
L 2,2 0,6 4,8 15,8
Os teores foram calculados pela média dos valores (n= 5) das aminas nos respectivos pós para preparo
da bebida. nd = não detectado; Limite de determinação = 0,2 µg/50 mL para tiramina e cadaverina e
0,4 µg/50 mL para serotonina).
69
De acordo com ABIC (2008) o consumo de café em 2007 foi de
aproximadamente 74 litros da bebida por habitante o que representa um consumo de
200 mL da bebida por dia. Considerando os dados apresentados na Tabela I.2 e a
estimativa de consumo apresentada pela ABIC os teores de tiramina e serotonina
consumidos diariamente por meio do consumo de café seria de 19,6 e 31,2 mg,
respectivamente. Segundo HALÁSZ et al. (1994) e GLÓRIA (2005) somente elevadas
concentrações de tiramina (10 mg/100 g de alimento) podem causar alterações na
pressão arterial. Desta forma a concentração de tiramina no café solúvel não
representa risco para o consumidor. Não foram encontrados dados na literatura sobre o
os efeitos da serotonina presente na bebida café. Porém, segundo CASAL et al. (2004)
devido ao seu papel psicoativo nos seres humanos, como mediador neuronal, sua
presença no café esta poderia ser interessante.
I.3.6 pH e características de cor do café solúvel
O pH e as características de cor CIE L*a*b* das amostras de café solúvel
analisadas estão indicados na Tabela I.3. O pH variou entre os diferentes tipos de café
analisados, com valores significativamente mais baixos para o café orgânico em
relação ao café regular e descafeinado. As características de cor também variaram
significativamente entre os diferentes tipos de cafés. O café orgânico apresentou
valores para as características de cor mais elevados, seguido do café descafeinado e
do café solúvel regular. De acordo com BORGES et al. (2002) e FARAH et al. (2006a)
a luminosidade (L) dos grãos de café apresenta correlação inversa com o grau de
torração. Desta forma, os resultados sugerem que o café orgânico foi submetido a uma
torração mais branda. Porém para o café solúvel esta correlação ainda não foi
estabelecida e fatores como a utilização de CO
2
, para clareamento do café, durante o
processamento podem interferir na coloração final do café solúvel.
Estudos de correlação entre os teores de aminas bioativas detectadas nas
amostras analisadas com o pH e as características de cor, indicaram uma correlação
positiva entre a tiramina e a agmatina com o pH (R = 0,432, P = 0,003 e R = 0,293, P =
0,048, respectivamente). Não foram observadas correlações entre as características de
cor e os teores de aminas.
70
Tabela I.3. Valores de pH e características de cor CIE L*a*b* das amostras de café
solúvel regular, descafeinado e orgânico
Característica
Valores médios ± dp / Tipos de caf
é solúvel
Regular Descafeinado Orgânico
pH* 5,05 ± 0,07 b 5,15 ± 0,14 a 4,86 ± 0,04 c
Características de cor **
L 14,61 ± 2,20 c 20,61 ± 4,69 b 33,48 ± 3,02 a
a 6,61 ± 2,03 b 7,91 ± 3,63 b 11,53 ± 4,01 a
b 3,73 ± 2,33 c 12,56 ± 8,03 b 33,51 ± 6,73 a
c 9,01 ± 5,15 c 15,35 ± 8,00 b 36,24 ± 3,99 a
Hº 32,89 ± 17,47 b 54,03 ± 15,02 a 67,15 ± 9,28 a
* Determinado na bebida. ** Determinado no café solúvel em pó. Valores médios com letras diferentes
na mesma linha são estatisticamente diferentes (Teste de Duncan, p ≤ 0,05).
I.4 CONCLUSÕES
O café solúvel coletado no mercado consumidor foi caracterizado pela presença
das aminas serotonina, cadaverina, tiramina, espermidina, putrescina, histamina,
agmatina, feniletilamina e espermina. A amina predominante foi a serotonina. Os teores
de tiramina e cadaverina foram significativamente diferentes nos três tipos de cafés
analisados. A tiramina foi detectada em maiores concentrações no café descafeinado
e a cadaverina nos cafés descafeinado e orgânico. Os teores de aminas variaram entre
as marcas e os diferentes lotes analisados.
O pH apresentou correlação significativa com as aminas tiramina e agmatina. As
características de cor não apresentaram correlação com as aminas bioativas
detectadas no café solúvel.
71
CAPÍTULO II. OTIMIZAÇÃO DA ETAPA DE EXTRAÇÃO DAS
AMINAS BIOATIVAS LIVRES DE CAFÉ CRÚ
RESUMO
A extração é uma etapa muito importante na determinação de aminas bioativas
em alimentos, pois dela depende a qualidade do resultado da análise. O objetivo do
presente trabalho foi otimizar a etapa de extração das aminas bioativas livres de café
cru, avaliando a influência dos parâmetros granulometria da amostra, ácido extrator e
extrações consecutivas na recuperação das aminas da matriz café cru. Grãos de café
robusta foram submetidos à moagem, classificação por tamanho de partícula e, em
seguida, avaliados quanto aos teores de aminas. Foram testados os extratores ácido
tricloroacético (TCA) a 5% m/v, HCl 1 mol/L e ácido perclórico (HClO
4
) 0,4 mol/L e os
procedimentos com uma e três extrações consecutivas, seguidas ou não da etapa de
repouso a 4 ºC por 12 h. As aminas foram quantificadas por CLAE-par iônico,
derivação pós-coluna com o-ftalaldeído e detecção fluorimetrica. A granulometria
influenciou significativamente o volume recuperado do extrato, sendo que na extração
de amostras com partículas de diâmetro médio (< 0,85 mm), o volume do extrato
recuperado foi menor. A recuperação da maioria das aminas detectadas nos grãos de
café cru não foi significativamente diferente para as partículas obtidas após moagem e
separação nas peneiras 9, 20, 28 mesh (2,00; 0,85 e 0,60 mm de diâmetro,
respectivamente). O extrator que proporcionou melhor recuperação das aminas foi o
TCA 5%. A extração das aminas utilizando três extrações consecutivas foi
significativamente mais eficiente na recuperação das aminas bioativas de café cru, não
havendo necessidade de repouso sob refrigeração.
Palavras-chave: aminas bioativas, café cru, extração, granulometria.
72
II.1 INTRODUÇÃO
A separação e quantificação de aminas bioativas em alimentos pode ser feita por
vários métodos, dentre eles, a cromatografia em camada delgada (LAPA-GUIMARÃES
& PICKOVA, 2004), a cromatografia gasosa (BAKER et al., 1987; ANTOINE et al.,
2002), a cromatografia em coluna de troca iônica (ZEE et al., 1981; STANDARA et al.,
2000; REY & POHL, 2003), ou a cromatografia líquida de alta eficiência - CLAE
(IZQUIERDO-PULIDO et al., 1993; VALE & GLÓRIA, 1997; NOVELLA-RODRÍGUEZ et
al., 2000; TAMIN et al., 2002), sendo esta última a mais eficiente.
Antes da separação e da quantificação, entretanto, as aminas devem ser
extraídas da matriz e, algumas vezes, o extrato deve ser purificado para eliminar
interferentes. Dependendo da matriz, ou seja, do tipo de alimento a ser analisado, as
etapas de extração e purificação podem sofrer alterações. Em alguns casos, é
necessário ainda fazer uma derivatização da amostra antes da etapa de separação ou
de detecção (MORET & CONTE, 1996).
A extração das aminas consiste na retirada destas da matriz. Esta etapa é
crítica, pois sua eficiência depende do tipo e da natureza das aminas presentes e do
alimento analisado (TAMIN et al., 2002). De acordo com a literatura, diferentes
agentes extratores têm sido utilizados para extrair aminas bioativas dos alimentos:
água (INGLES et al., 1985), solventes orgânicos como etanol e metanol (SATO et al.,
1970; AOAC, 1995) e ácidos como tricloroacético (TCA) (PATTONO et al., 2000;
CASAL et al., 2004), clorídrico (HCl) (FONTANIELLA et al., 2001; CINQUINA et al.,
2004) perclórico (HClO
4
) (CHIACCHIERINI, RESTUCCIA & VINCI, 2006; LAVIZZARI et
al., 2006) e sulfosalicílico (POLLACK et al., 1992; BUTS et al., 1995). Em meio
aquoso, com água a temperatura ambiente ou aquecida, são extraídas apenas as
aminas livres. Porém, na extração ácida, dependendo da concentração do ácido,
algumas aminas ligadas a outros componentes da matriz também são extraídas,
juntamente com as aminas livres (MORET & CONTE, 1996).
Durante a execução da etapa de extração dois parâmetros são importantes,
dentre eles, o solvente usado para a extração, que está relacionado com a matriz a ser
analisada, e a forma de preparo da amostra e o procedimento de extração (MORET &
CONTE, 1996). O café possui uma grande variedade de compostos, constituindo,
portanto, uma matriz complexa. Desta forma, uma etapa de extração apropriada é
fundamental para obtenção de um bom resultado da análise.
73
Na determinação de aminas bioativas em amostras de café, a metodologia mais
utilizada é a CLAE (CASAL et al., 2002). A etapa de extração assume importante papel
na qualidade do resultado final. Os métodos descritos na literatura para a
determinação de aminas em grãos de café utilizam diferentes procedimentos de
extração, bem como uma diversidade de agentes extratores. De acordo com CASAL et
al. (2002), na análise de aminas em amostras de café, a etapa de extração foi
conduzida com uma única adição do agente extrator seguida de repouso a 4 ºC por
aproximadamente 12 h. Porém, na metodologia descrita por CIRILO et al. (2003), as
aminas foram retiradas da matriz por meio de três extrações consecutivas sem a etapa
de repouso sob refrigeração. Desta forma uma melhor avaliação dos procedimentos de
extração para verificar a influência de extrações consecutivas e do repouso sob
refrigeração na recuperação das aminas deve ser realizada.
Com relação ao agente extrator, o meio mais eficiente para a extração das
aminas do café é o ácido, sendo o mais utilizado o TCA (CASAL et al., 2002; CIRILO et
al., 2003). Um outro parâmetro importante que pode influenciar na etapa de extração
das aminas em grãos de café e, conseqüentemente, em sua quantificação é a
preparação da amostra. Esta etapa envolve os procedimentos de moagem dos grãos,
que consiste na trituração dos mesmos para que sejam reduzidos a uma granulometria
adequada para a extração das aminas. A redução do tamanho dos grãos de café pode
facilitar a extração de solutos, devido ao aumento da área de contato disposta entre os
grãos e o agente extrator (BRENNAN et al., 1998).
Diante da importância da etapa de extração na determinação das aminas
bioativas, o presente estudo avaliou a eficiência de diferentes procedimentos de
extração, dentre eles, o tipo de acido extrator, o número de extrações sucessivas, e a
granulometria do grão de café na recuperação das aminas bioativas em amostras de
café cru.
74
II.2 MATERIAL E MÉTODOS
II.2.1 MATERIAL
II.2.1.1 Amostra
Para realização deste experimento foram utilizadas amostras de café cru em
grãos da espécie robusta (Coffea canephora var. Robusta). Todos os experimentos
foram realizados em triplicata.
II.2.1.2 Reagentes
Os reagentes utilizados possuíam grau analítico, exceto os solventes usados no
CLAE (acetonitrila), que eram de grau cromatográfico. As soluções foram preparadas
com água ultrapura obtida do Sistema Milli-Q Plus (Millipore Corp., Milford, MA, EUA).
Os padrões de aminas bioativas (diidrocloreto de putrescina (PUT), diidrocloreto de
cadaverina (CAD), diidrocloreto de histamina (HIM), hidrocloreto de tiramina (TIM),
tetraidrocloreto de espermina (EPM), triidrocloreto de espermidina (EPD), complexo
sulfato creatinina agmatina (AGM), hidrocloreto de 2-feniletilamina (FEA), hidrocloreto
de 5-hidroxitriptamina (serotonina – SRT), foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MO, EUA). As fases móveis foram filtradas em membrana de 47 mm de
diâmetro e com tamanho do poro de 0,45 m (Millipore Corp., Milford, MA, EUA), tipos
HAWP e HVWP para solventes aquosos e orgânicos, respectivamente.
II.2.2 MÉTODOS
II.2.2.1 Estudo da influência do ácido extrator na recuperação das aminas
bioativas de café cru
Diferentes tipos de ácidos extratores, dentre eles o TCA, o ácido clorídrico e o
ácido perclórico foram avaliados quanto à eficiência em recuperar aminas durante a
etapa de extração de 10 aminas bioativas da matriz café cru. Todas as extrações
foram conduzidas em triplicata, utilizando-se a matriz (café cru) sem e com adição de
solução contendo 10 aminas de forma a se obter adição de 1 e 10 mg/100 g da
amostra.
75
A eficiência da extração de aminas bioativas de café cru por cada solução ácida
foi investigada adicionando-se 7 mL das soluções de TCA 5 g/100 mL (CIRILO et al.,
2003), HCl 1,0 mol/L e ácido perclórico 0,4 mol/L (CASAL et al., 2002) a 5 g da amostra
de café cru sem e com adição de solução de concentração conhecida de aminas. As
amostras foram agitadas em mesa agitadora por 10 min e centrifugadas a 11.180 g a 4
ºC por 21 min. Em seguida, foram filtradas em papel de filtro qualitativo. A extração foi
repetida por mais duas vezes, com 7 e 6 mL e os filtrados foram combinados (CIRILO
et al., 2003).
II.2.2.1 Estudo da influência da granulometria na extração de aminas bioativas de
café cru
Os grãos de café cru (250 g) foram submetidos a duas triturações em moinho de
rolos (modelo C 60, CAMARGO, São Paulo, SP, Brasil) (Figura II.1A) a 283 rpm e, em
seguida, foram triturados uma vez no moinho de martelos (Figura II.1B) a rotação de
3500 a 4000 rpm. Após a moagem pesou-se 100 gramas do material o qual foi
submetido à peneiramento nos tamises de número 4, 8, 9, 20, 28, 32 e 60 mesh com
abertura das malhas de 4,75; 2,36; 2,00; 0,85; 0,60; 0,50 e 0,25 mm, respectivamente.
Para o peneiramento foi utilizado um agitador de peneiras (Bertel Indústria e
Comércio Ltda, São Paulo, SP, Brasil) com reostato na posição 5 por um tempo de 30
minutos. Cada fração da amostra retida nas diferentes peneiras foi recolhida, pesada
para verificar a granulometria média do café após a moagem e, em seguida, submetida
a extração de aminas bioativas.
Os grãos de café foram fotografados na entrada e saída de cada moinho. Por
meio da imagem dos grãos de café determinou-se o diâmetro médio dos mesmos, com
o Size Meter 1.1 (Luis Henrique Castelan Carlson, LCP, UFSC, SC, Brasil).
Após cada etapa de moagem, as partículas foram peneiradas e o diâmetro
médio das partículas após o peneiramento foi calculado pela média geométrica das
massas retidas e as aberturas das peneiras através da equação:
Diâmetro médio = (d1 x d2)
½
sendo:
d1: diâmetro em mm da peneira com a maior massa retida, e
d2: diâmetro em mm da peneira com a segunda maior massa retida.
76
A) B)
Figura II.1 – Moinhos utilizados na moagem dos grãos de café crus.
A) Moinho de rolos; B) Moinho de martelos.
As partículas separadas por diferentes tamanhos foram subtidas à análise de
aminas bioativas. As aminas foram extraídas com 7 mL de TCA 5%, agitadas em mesa
agitadora por 10 min e centrifugadas a 11.180 g a 4 ºC por 21 min. A extração foi
repetida por mais duas vezes, com 7 e 6 mL e os filtrados foram combinados.
II.2.2.2 Estudo da influência de extrações sucessivas e repouso sob refrigeração
na recuperação de aminas bioativas de café cru
As condições de extração otimizadas nas etapas anteriores foram adotadas para
verificar a influência de extrações sucessivas e repouso sob refrigeração na
recuperação de dez aminas bioativas em amostras de café cru. Foram testadas uma
única extração e três extrações consecutivas, com e sem repouso a 4 ºC por 12 h.
A amostra de café foi triturada e peneirada em tamises de 9 e 20 mesh e as
partículas retidas na peneira de 20 mesh foram recolhidas. Em seguida 5 g da amostra
foi adicionada de 30 mL de TCA 5%, agitada em mesa agitadora (Tecnal TE – 140,
Piracicaba, SP) por 10 min, centrifugada a 11.180 g a 4 ºC por 21 min e filtrada em
papel de filtro qualitativo. O mesmo procedimento foi repetido porém, após a adição do
77
TCA 5%, a amostra foi mantida em repouso sob refrigeração a 4 ºC por 12 h. O
procedimento também foi conduzido por meio de três extrações consecutivas com e
sem repouso a 4 ºC por 12 h. Foram adicionados 10 mL de TCA 5% a 5 g de amostra
de café cru. Em seguida foram agitadas, centrifugadas e filtradas em papel de filtro
qualitativo como descrito acima. A extração foi repetida por mais duas vezes (com 10
mL cada) e os extratos foram combinados. As extrações foram realizadas em triplicata.
II.2.2.4 Determinação de aminas bioativas por CLAE-par iônico
Todos os extratos obtidos foram filtrados em membrana HAWP de 13 mm de
diâmetro e 0,45 µm de tamanho do poro (Millipore Corp. Milford, MA, EUA). As aminas
foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência por par iônico,
derivação pós-coluna com o-ftalaldeído (OPA) e detecção fluorimétrica, conforme
metodologia descrita por CIRILO et al. (2003).
A análise cromatográfica foi efetuada em um cromatógrafo líquido de alta
eficiência Shimadzu, modelo LC-10 AD, com a mistura à baixa pressão; conjunto de
lavagem automática de pistão; injetor automático Shimadzu modelo SIL – 10 ADVP
conectado a um detector espectrofluorimétrico modelo RF-10 AXL a 340 nm de
excitação e 445 nm de emissão e um controlador CBM-20 A (Shimadzu, Kyoto, Japão)
conectada a um computador. O sistema de derivação pós-coluna foi montado com
uma câmara de mistura (volume morto igual a zero), instalada entre a saída da coluna
e o detector; um tubo de teflon, protegido da luz, de 2 m de comprimento e 0,25 cm de
diâmetro conectado entre a câmara de mistura e o detector e a bomba LC-10 AD
(Shimadzu, Kyoto, Japão).
Foi utilizada uma coluna µBondapak C18 em fase reversa 3,9 x 300 mm, 10 µm
e pré-coluna µBondapak C18 (Waters, Milford, MA) e sistema gradiente de eluição em
ambiente com temperatura controlada (20 ± 1 ºC). As fases móveis foram: A - solução
0,2 M de acetato de sódio e 15 mM de octanosulfonato de sódio, pH 4,9 ajustado com
ácido acético e B - acetonitrila. O fluxo de análise foi de 0,8 mL/min.
O reagente de derivação consistiu de 0,2 g de OPA dissolvido em 3 mL de
metanol e 500 mL de uma solução de 25 g de ácido bórico e 22 g de KOH (pH 10,5),
1,5 mL de Brij-35 e 1,5 mL de mercaptanol. A solução derivante foi preparada
diariamente, mantida ao abrigo da luz e bombeada à câmara de mistura a um fluxo de
0,4 mL/min.
78
A identificação das aminas foi feita por comparação do tempo de retenção das
aminas na amostra em relação ao padrão e também pela adição de solução da amina
suspeita à amostra. O cálculo da concentração das aminas foi feito por interpolação
nas respectivas curvas analíticas.
II.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram submetidas a análise de variância (ANOVA) e as
médias foram comparadas pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade SIGMA STAT
2.0 (Systat Software Inc, Richmond, CA, USA).
II.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
II.3.1 Influência do ácido extrator na recuperação das aminas bioativas de café
cru
Na tabela II.1 estão apresentados os percentuais de recuperação das dez amina
bioativas livres extraídas com diferentes ácidos extratores do café cru, após adição de
1 e 10 mg de cada uma das aminas em 100 g da amostra.
Observou-se que o TCA foi o extrator mais eficiente para a extração de aminas
livres em grãos de café. A recuperação média da agmatina (110 %) foi a maior,
seguida da putrescina (96 %), espermina (93 %), espermidina (88 %) e tiramina (85 %).
Estes resultados confirmam os dados obtidos por CASAL et al. (2002) que, após
avaliarem a eficiência de diferentes extratores, indicaram o TCA como a melhor
escolha para análise de aminas em café.
Avaliando-se a recuperação de cada amina separadamente, observa-se que a
triptamina foi a amina que apresentou menor índice de recuperação, abaixo de 50%
para os três extratores avaliados. Na extração com TCA, triptamina (25%), histamina
(49%) e feniletilamina (53%) apresentaram os menores percentuais de recuperação.
Já o ácido perclórico recuperou percentuais menores ainda, triptamina (11%),
histamina (30%) e agmatina (31%). A agmatina apresentou 48% de recuperação na
extração com HCl, enquanto que a triptamina não foi recuperada. Resultados
semelhantes foram relatados por CASAL et al. (2002) para histamina com
recuperações de 4% a 35%.
79
Tabela II.1. Influência do ácido extrator na recuperação das aminas livres em amostras
de café adicionadas de 1 e 10 mg de padrão por 100 g de amostra
Aminas % de Recuperação (% CV)
TCA 5% m/v HCl 1 mol/L HClO
4
0,4 mol/L
Putrescina
1 mg/100 g 100 (3) c, x 107 (3) b, x 116 (2) a
10 mg/100 g 91 (2) b, y 93 (5) b, y 125 (6) a
Cadaverina
1 mg/100 g 115(2) a 48 (34) c, y 73 (4) b
10 mg/100 g 114 (5) a 80 (7) b, x 81 (8) b
Histamina
1 mg/100 g 47 (7) b 96 (13) a, y 24 (9) c, y
10 mg/100 g 50 (8) b 149 (11) a, x 36 (2) c, x
Tiramina
1 mg/ 100 g 80 (11) a 69 (5) b, y 75 (10) a, b
10 mg/100 g 90 (5) a 83 (5) b, x 78 (5) b
Serotonina
1 mg/100 g 57(14) y 66 (24) 59 (18)
10 mg/100 g 92 (11) a, x 68 (8) b 84 (21) a
Agmatina
1 mg/100 g 101 (10) a, y 50 (2) b 30 (4) c
10 mg/100 g 118 (2) a, x 47 (5) b 32 (8) c
Espermidina
1 mg/100 g 84 (7) 86 (11) 81 (12)
10 mg/100 g 93 (14) a 76 (5) b 86 (15) a, b
Espermina
1 mg/100 g 99 (6) a 76 (10) b, y 123 (18) a
10 mg/100 g 88 (11) c 158 (8) a, x 133 (5) b
Feniletilamina
1 mg/100 g 46 (23) c 68 (7) b 83 (7) a
10 mg/100 g 61 (8)
b
79 (17)
a
74 (19)
b
Triptamina
1 mg/100 g 25 (7)
a
0 0
y
10 mg/100 g 24 (5) a 0 11 (21) b, x
CV: coeficiente de variação; TCA: ácido tricloroacético; HCl: ácido clorídrico; HClO
4
: ácido perclórico.
Valores com letras diferentes para cada linha (a-c) ou coluna (x-y) são significativamente diferentes (p
0,05, teste de Duncan).
80
Para um método analítico quantitativo ser adequado, os percentuais de
recuperação devem estar entre 80% e 110% e os coeficientes de variação não podem
ser maiores do que 15% (CODEX, 1993). Levando-se em consideração esses
critérios, nenhum dos extratores testados apresentou eficiência na extração das dez
aminas simultaneamente. De acordo com os dados apresentados na Tabela II.2 o TCA
recuperou um maior número de aminas, seguido do HClO4 e HCl, confirmando a sua
maior eficiência na extração das aminas do café.
Tabela II.2. Eficiência dos extratores ácidos avaliados segundo os critérios do CODEX
(1993)
Concentração
adicionada
Extratores
TCA 5% m/v HCl 1 mol/L HClO
4
0,4 mol/L
1 mg/100 g PUT, TIM, AGM,
SPD, SPM
PUT, HIM, SPD PUT, TIM, SRT, SPD,
SPM, PHE
10 mg/100 g PUT, TIM, SRT,
AGM, SPD, SPM
PUT, CAD,TIM CAD, SRT, SPD
PUT = putrescina; CAD = cadaverina; TIM = tiramina; HIM = histamina; SRT = serotonina; AGM =
agmatina; SPD = espermidina; SPM = espermina; PHE = feniletilamina.
O ácido clorídrico tem sido citado na literatura como um bom extrator para
diferentes matrizes, principalmente para queijo (INNOCENT et al., 2006; CUSTÓDIO et
al., 2007). Porém alguns autores relataram que esse ácido originava um extrato muito
turvo (ANTOLINI et al., 1999; CASAL et al. 2002). Esse fato também foi observado
durante a execução deste experimento, sendo que o extrato obtido na extração com
HCl apresentou elevada turbidez. CASAL et al. (2002), ao observarem a turbidez do
extrato, descartaram o uso de HCl como um possível extrator de aminas em café. A
eficiência do HCl na recuperação das aminas do café foi significativamente menor
quando comparado com os ácidos tricloroacético e perclórico.
A eficiência do ácido perclórico na extração das aminas do café foi menor em
relação ao ácido tricloroacético. As porcentagens de recuperação variaram de 81% a
86% para as aminas cadaverina, espermidina e feniletilamina. Esses resultados foram
inferiores aos obtidos por CASAL et al. (2002) que relataram uma recuperação de
100% para a espermidina. O uso do ácido perclórico na extração de aminas já foi
relatado em matrizes de origem vegetal (LAVIZZARI et al., 2006) com porcentagens de
81
recuperação que variaram de 87 a 110% (espinafre), 86 a 97% (banana) e 82 a 94%
(batata). Porém seu uso é limitado por ser explosivo.
Avaliando-se a eficiência de extração dos ácidos testados em relação à
concentração do padrão adicionado (Tabela II.1) observa-se que a concentração de
padrão adicionada influenciou significativamente na recuperação de algumas aminas
durante a extração. Essa influência foi maior na extração com HCl, seguido do TCA e
HClO
4
. Para a maioria das aminas pesquisadas, as recuperações foram maiores nas
amostras adicionadas de 10 mg de padrão por 100 g de amostra.
Nas amostras adicionadas de 1 mg/100 g de padrão de aminas, o HCl foi o
extrator menos eficiente, exceto para a histamina (96%) e putrescina (107%). O ácido
perclórico extraiu eficientemente a feniletilamina e espermidina (81 - 83%) e o TCA foi
eficiente na extração da putrescina, tiramina, agmatina, espermidina e espermina (80 -
101%), a cadaverina foi recuperada em 116% e as demais abaixo de 80%.
Nas amostras adicionadas de 10 mg de padrão por 100 g de café, o ácido
clorídrico foi eficiente apenas para putrescina, cadaverina e histamina com
porcentagens de recuperação de 80% a 93%. O ácido perclórico recuperou
eficientemente cadaverina (81%) e espermidina (86%), a serotonina também foi
recuperada (84%), porém, o coeficiente de variação foi inadequado (21%). A eficiência
na recuperação das aminas pelo ácido tricloroacético foi adequada para putrescina,
tiramina, serotonina, espermidina e espermina (88 - 93%). As aminas cadaverina e
agmatina foram recuperadas com porcentagens de 114 e 118%, respectivamente.
CUSTÓDIO et al. (2007) observaram comportamento semelhante ao extraírem aminas
de queijo ralado com TCA 5%.
II.3.2 Influência da granulometria na extração das aminas bioativas do café cru
Durante a execução deste experimento, os grãos de café foram fotografados
antes e após a moagem para inferir sobre o grau de redução do tamanho dos grãos de
café. Desta forma, os grãos do café, ao entrarem na primeira moagem no moinho de
rolos, apresentaram um diâmetro médio de 7,0 mm (Figura II.2). Os grãos de café
foram moídos no moinho de rolos e no moinho de martelos. O moinho de martelos é
muito utilizado para a redução do tamanho de partículas e produz um material mais fino
que o moinho de rolos (BRENNAN, 1998). Nas Figuras I.3 e I.4, estão apresentadas as
82
imagens do grão do café verde e as partículas trituradas após as três moagens feitas
nos moinhos de rolos e de martelos.
Figura II.2. Medida do diâmetro dos grãos de café inteiros (Size Meter 1.1).
Figura II.3. Grãos de café inteiros e após uma moagem no moinho de rolos.
83
Figura II.4. Grãos de café após duas moagem em moinho de rolos seguida de
uma moagem no moinho de martelos.
Na tabela II.3 estão apresentados os dados da análise granulométrica com as
porcentagens de retenção das partículas dos grãos de café após duas moagens no
moinho de rolos e uma no moinho de martelos.
Tabela II.3. Porcentagem de retenção das partículas dos grãos de café após moagem
nos moinhos de rolos e martelos
Tamis
(mesh)
Abertura
(mm)
% de Retenção das partículas / Moinhos
Rolos Martelos
Uma vez Duas vezes
4 4,75 38,1 2,5 0,5
8 2,36 58,9 47,7 3,1
9 2,00 2,0 23,9 4,4
20 0,85 0,7 12,9 51,9
28 0,60 0,2 11,0 19,4
32 0,50 0,0 1,0 14,9
60 0,25 0,0 0,6 4,4
Fundo
0 0,0 0,5 1,4
84
Conforme relatado anteriormente, os grãos de café, ao entrarem na primeira
trituração apresentaram um diâmetro médio de 7,0 mm. Após a análise
granulométrica, os sistemas particulados apresentaram diâmetro médio de 3,3 mm e
2,1 mm para a primeira e segunda moagem no moinho de rolos, respectivamente, e de
0,7 mm após a moagem no moinho de martelos. Desta forma foi evidenciada uma
redução de 2,1; 3,3 e 10 para os moinhos de rolos e martelos. Os dados obtidos estão
semelhantes aos encontrados por CABRAL (2007) que, após submeter grãos de café
com diâmetro médio de 7,5 mm a moagem no moinho de rolos, evidenciou uma
redução de 3,4 vezes no tamanho de grãos do café.
O volume de extrato recuperado após a extração das aminas no café separado
nas diferentes peneiras estão apresentados na Tabela II.4. A trituração dos grãos em
tamanhos diferentes influenciou o volume do extrato recuperado. Para os grãos retidos
nas peneiras de 28, 32 e 60 mesh, os quais apresentaram diâmetro das partículas
menores que 0,85 mm, o volume recuperado foi significativamente menor em relação
ao volume recuperado na extração das aminas do café moído cujo diâmetro das
partículas está compreendido entre 4,75 a 0,85 mm. Para partículas retidas nas
peneiras 9 e 20 mesh, com diâmetro compreendido entre 2,0 e 0,85 mm, o volume de
extração recuperado foi significativamente menor em relação aos grãos retidos nas
peneiras 4 e 8 mesh.
Tabela II.4 – Volume de extrato recuperado na extração das aminas
Peneira Extrato
Tyler
(mesh)
ABNT
(mesh)
Abertura da
malha (mm)
Volume médio recuperado (mL)
4 4 4,75 13,6 ± 0,3 a
8 8 2,36 13,0 ± 0,1 a
9 10 2,00 11,2 ± 0,3 b
20 20 0,85 11,1 ± 0,5 b
28 30 0,60 7,3 ± 0,1 c
32 35 0,50 7,5 ± 0,2 c
60 60 0,25 7,4 ± 0,1 c
Valores com letras diferentes na mesma coluna a, b e c são diferentes (Teste de Duncan, p≤0,05).
85
Baseado nestes resultados, quanto maior o grau de trituração dos grãos e,
conseqüentemente, menor o tamanho das partículas, a recuperação do extrato não era
eficiente. Na extração efetuada no café moído e retido nas peneiras 28, 32 e 60 mesh,
ao adicionar a primeira porção do ácido no café, esta era totalmente incorporada nos
grãos, desta forma não se conseguiu uma separação do ácido durante a centrifugação.
Somente após a segunda adição do ácido e subseqüente extração, o extrato foi
separado e recuperado. Desta forma, para não prejudicar a eficiência da extração, um
volume adicional do acido extrator teve de ser adicionado.
Na tabela II.5 observa-se os teores das dez aminas pesquisadas nos grãos de
café submetidos a moagem e separados por diferença de tamanho. Deve-se lembrar
que quanto maior o mesh (quantidade de aberturas da malha do tamis por polegadas)
menor é o tamanho das partículas.
Tabela II.5 – Teores de aminas bioativas extraídos de grãos de café cru de diferentes
tamanhos de partículas
Aminas
Teores de aminas (mg/100 g) (% CV) / Granulometria (mesh)
4 8 9 20 28 32 60
Putrescina
0,28 (9) c
0,53 (6) a 0,57 (9) a 0,57 (12) a
0,62 (5) a 0,63 (13) a
0,47 (2) b
Tiramina
0,28 (1) b 0,42 (6) a 0,53 (4) a 0,55 (12) a
0,55 (14) a
0,52 (12) a
0,54 (6) a
Serotonina
0,21 (8) c 0,24 (6) c 0,43 (8) b 0,41 (14) b
0,41 (15) b
0,66 (10) a
0,44 (7) b
Espermidina
0,13 (8) c 0,23 (9) c 0,31 (6) b 0,32 (14) b
0,31(15) b
0,50 (6) a 0,27 (13) b
Espermina
0,09 (12) b
0,15 (19) a
0,14 (18) a
0,15 (16) a
0,19 (32) a
0,11 (36) a
0,19 (29) a
Feniletilamina
0,09 (9) c 0,04 (27) c
0,06 (54) c
0,11(33) b 0,12 (56) b
0,22 (7) a 0,14 (55) b
CV: coeficiente de variação; nd: não detectado. Valores com letras diferentes em uma mesma linha são
significativamente diferentes (Teste de Duncan, p0,05).
Dentre as dez aminas pesquisadas no café foram detectadas seis. Estes
resultados são similares aos reportados por CASAL et al. (2004), ou seja, a presença
destas aminas já havia sido relatada em grãos de café cru. Nas partículas dos grãos
retidos na peneira de 4 mesh (4,75 mm), cujo tamanho é maior em relação às demais
peneiras, os teores recuperados foram significativamente menores para a maioria das
aminas detectadas no café. Para as partículas retidas na peneira de 60 mesh (0,25
mm), esperava-se uma maior recuperação devido ao menor tamanho das mesmas e,
consequente maior superfície de contato do solvente com as partículas. Entretanto,
observou-se uma diferença significativa nos teores recuperados. Para duas das seis
86
aminas detectadas, os teores de aminas recuperados foram significativamente
menores em relação aos encontrados na peneira de 32 mesh. Estes resultados
sugerem que uma trituração excessiva, pode trazer efeitos deletérios na extração de
aminas da matriz. O que pode ter sido ocasionado pela elevação da temperatura do
grão durante a moagem no moinho de rolos e martelos.
De acordo com BRENNAN (1998), a redução de tamanho de uma matriz serve
para auxiliar a extração do constituinte desejado, sendo que a velocidade de extração
de um soluto cresce proporcionalmente com a área de contato disposta entre o sólido e
o solvente. Entretanto, com os resultados apresentados na tabela II.4, verifica-se que
para a extração das aminas do grão do café cru, o mesmo não deve ser reduzido em
partículas de tamanhos inferiores a 0,50 mm, o que pode comprometer o rendimento
da extração.
Nas partículas retidas nas peneiras 9, 20 e 32, os teores recuperados não
sofreram interferência do tamanho das mesmas para a maioria das aminas detectadas
no café. Os teores das aminas detectadas nas diferentes granulometrias avaliadas
apresentaram coeficientes de variação adequados para a maioria das peneiras, de
acordo com CODEX (1993), que estabelece um coeficiente de variação de no máximo
15 % para analitos de concentração acima de 0,01 mg/100 g da amostra. Exceto para
a espermina e feniletilamina cuja % CV foi adequado somente para a peneira 4.
Baseado nestes resultados e levando em consideração o volume de extrato
recuperado, a extração das aminas dos grãos de café cru deve ser conduzida com
amostras submetidas a trituração e separação, com partículas apresentando diâmetro
compreendido entre 2,00 a 0,85 mm, o que equivale a peneirar a amostra em peneiras
de 9 a 20 mesh.
II.3.3 Influência de extrações sucessivas e repouso sob refrigeração na
recuperação de aminas bioativas de café cru
Os tipos e teores das aminas detectadas nas amostras de café submetidas a
diferentes números de extração estão apresentados na Tabela II.6. Das nove aminas
pesquisadas foram detectadas espermidina, espermina, putrescina, tiramina e
serotonina, com teores totais que variaram de 0,39 a 1,23 mg/100 g de café. As
aminas cadaverina, histamina, agmatina, feniletilamina e triptamina não foram
87
detectadas nas amostras analisadas. Estes resultados estão de acordo com estudos
anteriores em que estas aminas não haviam sido detectadas em amostras de café
robusta cru, ou foram detectadas em baixos teores (CASAL et al., 2004).
De acordo com os dados apresentados na Tabela II.6, apenas para os teores
totais de aminas foi observada diferença significativa (p<0,05) entre os procedimentos
avaliados, sendo que três extrações sucessivas, após repouso a 4 ºC por 12 h
apresentou maior recuperação.
Tabela II.6 – Teores de aminas bioativas em café cru extraídas por meio de uma ou
três extrações sucessivas na presença ou não de repouso
Aminas Teores de aminas em mg/100 g (% CV)
três extrações uma extração
s/ repouso 4 ºC/ 12 h s/ repouso 4 ºC/ 12 h
Putrescina 0,35 (3) ab 0,38 (13) a 0,17 (9) c 0,27 (20) b
Tiramina 0,23 (7) a 0,26 (2) a 0,09 (8) c 0,15 (13) b
Serotonina 0,09 (15) b 0,21 (7) a nd 0,06 (18) c
Espermidina 0,17 (6) ab 0,22 (8) a 0,07 (26) c 0,15 (25) b
Espermina 0,13 (10) ab 0,16 (15) a 0,06 (14) bc 0,09 (24) c
Total 0,96 (6) b 1,23 (9) a 0,39 (10) d 0,68 (19) c
CV: coeficiente de variação. Valores com letras diferentes na mesma linha são significativamente
diferentes (Teste de Duncan, p≤0,05).
Avaliando cada amina separadamente, as três extrações sucessivas forneceram
valores significativamente maiores para putrescina, tiramina, espermidina e espermina.
Entretanto, a etapa de repouso sob refrigeração não influenciou na recuperação destas
aminas. Apenas para a serotonina os procedimentos avaliados apresentaram
diferenças significativas, sendo que com uma única extração esta amina não foi
detectada. A influência dos procedimentos avaliados sobre cada amina estão
demonstrados na Figura II.5.
Os resultados obtidos estão em acordo com CUSTÓDIO et al. (2007), que
avaliaram a influência de extrações consecutivas na determinação de aminas bioativas
em amostras de queijo ralado. Os autores concluíram que, para uma melhor
recuperação das aminas, a etapa de extração deve ser conduzida com três extrações
consecutivas.
88
Figura II.5. Influência dos procedimentos de extração sobre a extração de cada
amina. Proced 1 = 03 extrações; Proced 2 = 01 extração. PUT: putrescina; TIM: tiramina; ESD: espermidina; ESM:
espermina
De acordo com o CODEX (1993), para métodos quantitativos com
concentrações do analito acima de 0,01 mg/100 g, o coeficiente de variação deve ter
valor máximo de 15%, desta forma os resultados obtidos estão de acordo com esta
recomendação para o procedimento conduzido com três extrações sucessivas. O
procedimento realizado com apenas uma extração, sem a etapa de repouso,
apresentou coeficiente de variação acima de 15% para a espermidina. Para as aminas
extraídas por meio de uma única extração, seguida de repouso sob refrigeração, este
procedimento apresentou CV acima do estabelecido pelo CODEX (1993) para a
maioria das aminas detectadas.
II.4 CONCLUSÕES
Maiores percentuais de recuperação de aminas bioativas foram obtidos após
moagem e separação dos grãos de café nas peneiras de 9, 20, 28 mesh, não havendo
diferença significativa entre elas. Desta forma, sugere-se que a extração das aminas
bioativas do café seja conduzida com amostras submetidas à moagem e peneiramento
em partículas de diâmetro entre 0,85 mm e 2,0 mm, o que corresponde a passar por
peneiras de 9 e 20 mesh.
89
Uma quantidade maior de reagente extrator deve ser utilizada na extração para
minimizar o efeito da absorção do extrator pelas partículas do grão.
Para uma recuperação mais eficiente das aminas na etapa de extração, a
mesma deve ser conduzida com o ácido tricloroacético na concentração de 5% m/v,
por meio de três extrações consecutivas, não havendo necessidade de repouso sob
refrigeração antes da extração.
90
CAPÍTULO III. OTIMIZAÇÃO DA HIDRÓLISE ÁCIDA NA
DETERMINAÇÃO DAS AMINAS CONJUGADAS EM CAFÉ
RESUMO
Assim como a etapa de extração das aminas da matriz é importante na pesquisa
de aminas bioativas livres a etapa de hidrólise também influência de forma significativa
os resultados, na determinação de aminas conjugadas do café. Com o objetivo de
obter melhores condições de hidrólise das aminas conjugadas em amostras de café, os
parâmetros concentração do ácido clorídrico, temperatura e tempo de reação foram
testados. O ácido clorídrico foi avaliado nas concentrações de 1, 3, 6, 9 e 12 mol/L. As
temperaturas e tempos das reações testadas foram ambiente e 110 ºC e 16, 18, 20 e
24 h. A eficiência da etapa de hidrólise foi afetada pelos parâmetros avaliados. A
hidrólise das aminas conjugadas foi significativamente mais eficiente quando conduzida
com o ácido clorídrico nas concentrações de 9 e 12 mol/L. Porém a temperatura de 110
ºC foi mais eficiente apenas para a putrescina. A duração da reação influenciou
significativamente na etapa de hidrólise, sendo os melhores resultados obtidos com 18,
20 e 24 h de reação. A estabilidade de dez aminas livres frente a reação de hidrólise
foi testada evidenciando instabilidade das aminas livres tiramina, histamina, serotonina
e triptamina durante a reação de hidrólise.
Palavras-chave: café, aminas conjugadas, hidrólise ácida.
91
III.1 INTRODUÇÃO
As aminas estão presentes nas plantas na forma livre ou conjugada a moléculas
de baixo peso molecular (ácidos fenólicos) ou a macromoléculas (proteínas)
(FONTANIELLA et al., 2001; FONTANIELLA et al., 2003). A conjugação das aminas
com os ácidos fenólicos (p-cumárico, ferúlico e caféico) consiste em uma ligação
covalente entre o grupo amina das aminas bioativas e o grupo carboxílico dos ácidos
hidroxicinâmicos (HCAs). O resultado desta conjugação é conhecido como amidas de
ácidos hidroxicinâmicos – HCAAs (WALTERS, 2003). As HCAAs básicas constituídas
por aminas alifáticas como a putrescina, espermidina e espermina são hidrossolúveis
enquanto que as HCAAs neutras, aquelas constituídos por aminas aromáticas como a
tiramina, octopamina e triptamina, são insolúveis em água (FACCHINI et al., 2002).
Em plantas, as poliaminas são comumente conjugadas com ácidos
hidroxicinâmicos como o ácido cumárico, ferúlico e caféico. A proporção entre as
formas livre e conjugada varia muito entre as diferentes espécies de plantas
(TIBURCIO et al., 1997; BAGNI & TASSONI, 2001). A conjugação se dá por meio da
formação de uma ligação amida, na qual ésteres de coenzima A (COA) fornecem o
grupo carboxil ativado. A putrescina e a espermidina são conjugadas por transferases,
que diferem em sua especificidade para os derivados hidroxicinamoil-CoA. Desta
forma, a enzima putrescina hidroxicinamoil transferase (PHT; EC 2.3.1.) catalisa a
transferência de ácidos hidroxicinâmicos entre a CoA e a putrescina. Assim, a reação
entre cafeoil-COA e putrescina produz uma amida do ácido hidroxicinâmico
denominada cafeoilputrescina (WALTERS, 2003). A putrescina normalmente forma
monômeros com o ácido cumárico, caféico e ferúlico (BAGNI & TASSONI, 2001).
De acordo com MARTIN-TANGUY et al. (1978), as poliaminas conjugadas estão
presentes em um grande número de famílias de plantas, sendo o principal constituinte
fenólico de órgãos reprodutivos e sementes de aproximadamente 20 espécies de
plantas. A conjugação entre poliaminas e ácidos fenólicos tem sido observada em
muitas plantas com flores (HENNION & TANGUY, 1999; FONTANIELLA et al., 2001).
Estes compostos são acumulados depois da indução floral, no ápice da floração
(FONTANIELLA et al., 2001). De acordo com HENNION & TANGUY (1999), o
aumento na concentração de aminas conjugadas em folhas de plantas é devido à
presença de infecções virais e fúngicas, bem como, à mudanças ambientais severas
como deficiência de minerais, hipóxia e poluentes ambientais.
92
De acordo com a literatura as aminas conjugadas são quantificadas em sua
forma livre, após uma etapa de extração, pelo procedimento de hidrólise ácida (ARMAS
et al., 1999; RODRIGUEZ et al., 2000; FONTANIELLA et al., 2003). Diferentes
procedimentos de hidrólise têm sido empregados na determinação das aminas
conjugadas, porém o mais utilizado é a hidrólise ácida, sendo o ácido clorídrico o
reagente mais empregado. O ácido clorídrico tem sido utilizado em concentrações que
variam de 6 a 12 mol/L, com aquecimento a 110 ºC ou à temperatura ambiente por um
tempo de 10 a 24 horas. Na análise de aminas conjugadas em amostras de café,
CASAL et al. (2004, 2005) efetuaram a hidrólise com HCl 12 M a 110 ºC por 18 h.
Diante de diferentes condições de hidrólise disponíveis na literatura, mais
estudos são necessários para otimizar as condições de análises para determinação de
aminas conjugadas em amostras de café. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi
estabelecer os parâmetros de hidrólise (concentração do ácido, tempo e temperatura)
que promovam uma recuperação eficiente das aminas livres na determinação de
aminas conjugadas.
III.2 MATERIAL E MÉTODOS
III.2.1 MATERIAL
III.2.1.1 Amostra
Para realização deste experimento foram utilizadas amostras de café cru em
grão da espécie robusta (Coffea canephora var. Robusta). Todos os experimentos
foram realizados com três repetições e as amostras analisadas em triplicata.
III.2.1.2 Reagentes
Os reagentes utilizados possuíam grau analítico, exceto os solventes usados no
CLAE (acetonitrila), que eram de grau cromatográfico. Todas as soluções foram
preparadas com água ultrapura obtida do Sistema Milli-Q Plus (Millipore Corp., Milford,
MA, EUA). Os padrões de aminas bioativas (diidrocloreto de putrescina (PUT),
diidrocloreto de cadaverina (CAD), diidrocloreto de histamina (HIM), hidrocloreto de
93
tiramina (TIM), tetraidrocloreto de espermina (EPM), triidrocloreto de espermidina
(EPD) complexo sulfato creatinina agmatina (AGM), hidrocloreto de 2-feniletilamina
(FEA), hidrocloreto de 5-hidroxitriptamina (serotonina – SRT), foram adquiridos da
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). As fases móveis foram filtradas em
membrana (47 mm de diâmetro e 0,45 m de tamanho de poro, Millipore Corp., Milford,
MA, EUA) HAWP e HVWP para reagentes aquosos e solventes orgânicos,
respectivamente.
III.2.2 MÉTODOS
III.2.2.1 Extração das aminas
As aminas foram extraídas da matriz café conforme metodologia otimizada
descrita no capítulo I. Os grãos de café foram triturados e separados em peneiras de 9
e 20 mesh, sendo as partículas retidas na peneira 20 mesh selecionada para análise.
Foram adicionados 10 mL de TCA 5% a 5 g de amostra de café cru. Em seguida
foram agitados em mesa agitadora por 10 minutos, centrifugadas a 11.180 g a 4 °C por
21 minutos e filtradas em papel de filtro qualitativo. A extração foi repetida mais duas
vezes, com adição de 10 e 10 mL de TCA 5%, os extratos foram combinados e o
volume final anotado. O extrato foi filtrado em membrana HAWP de 13 mm de diâmetro
e 0,45 µm de tamanho do poro.
No extrato foram pesquisadas as aminas livres e as aminas conjugadas ácido
solúveis. No resíduo obtido durante a extração foram pesquisadas as aminas
conjugadas ácido insolúveis (Figura III.1).
94
Figura III.1 – Esquema geral da análise de aminas conjugadas.
III.2.2.2 Estudo da influência da concentração do ácido clorídrico na hidrólise das
aminas conjugadas
Foram testadas cinco concentrações do ácido clorídrico: 1, 3, 6, 9 e 12 mol/L. O
extrato e o resíduo sólido obtidos durante a extração das aminas dos grãos de café
foram submetidos a hidrólise para liberação das aminas de sua forma conjugada.
Uma alíquota do sobrenadante obtido na etapa de extração das aminas do café
(2 mL) foi adicionada de 2 mL de HCl nas concentrações descritas acima e submetido
a hidrólise por 24 horas à temperatura ambiente. Ao término do tempo de hidrólise, o
hidrolisado foi filtrado, concentrado a 40 ºC sob corrente de ar e, em seguida,
ressuspendido com 1 mL de TCA 5%. A amostra foi filtrada em membrana HAWP de
0,45 µm de tamanho de poro.
O resíduo obtido na etapa de extração foi adicionado de 20 mL de NaOH 0,1
mol/L. A uma alíquota do resíduo ressuspendido (2 mL) foi adicionado 2 mL de HCl nas
concentrações de 1, 3, 6, 9 e 12 mol/L e hidrolisados a temperatura ambiente por 24
horas. O hidrolisado foi filtrado, concentrado a 40 ºC sob corrente de ar e, em seguida,
95
ressuspendido com 1 mL de TCA 5%. A amostra foi filtrada em membrana HAWP de
0,45 µm de tamanho de poro.
III.2.2.3 Estudo da influência da temperatura na hidrólise das aminas conjugadas
O procedimento descrito na etapa anterior foi modificado para verificar a
influência da temperatura na hidrólise das aminas. O extrato e o resíduo obtidos na
etapa de extração da matriz foram adicionados de HCl nas concentrações de 1, 3, 6, 9
e 12 mol/L e hidrolisados a temperatura de 110 ºC por 24 horas em bloco de
aquecimento (Dry Block TE-21, Tecnal, SP). O hidrolisado foi filtrado, concentrado a 40
ºC sob corrente de ar e, em seguida, ressuspendido com 1 mL de TCA 5%. A amostra
foi filtrada em membrana HAWP de 0,45 µm de tamanho do poro.
III.2.2.4 Estudo da influência do tempo na hidrólise das aminas conjugadas
O extrato e o resíduo (2 mL) obtidos na etapa de extração das aminas da matriz
foram adicionados de 2 mL de HCl nas concentrações de 6, 9 e 12 mol/L e foram
hidrolisados à temperatura ambiente e a 110 ºC por 16, 18, 20 e 24 horas para verificar
a influência do tempo na hidrólise das aminas conjugadas ácido solúveis e ácido
insolúveis de café.
III.2.2.5 Avaliação do comportamento das aminas livres frente a hidrólise ácida
Uma solução padrão contendo dez aminas (putrescina, cadaverina, histamina,
tiramina, serotonina, agmatina, espermidina, espermina, feniletilamina e triptamina) na
concentração de 10 µg/mL foi submetida à hidrólise ácida para verificar o
comportamento de cada amina frente a reação de hidrólise.
A solução padrão de aminas (2 mL) foi adicionada de 2 mL de HCl nas
concentrações de 9 e 12 mol/L e submetidas a hidrólise a temperatura de 110 ºC por
um período de 18, 20 e 24 horas. Os hidrolisados foram filtrados, concentrados a 40
ºC sob corrente de ar e, em seguida, ressuspendido com 1 mL de TCA 5%. As
amostras foram filtradas em membrana HAWP 0,45 µm e injetadas no cromatógrafo
líquido.
96
III.2.2.5 Determinação de aminas bioativas por CLAE-par iônico
Todos os extratos obtidos foram filtrados em membrana HAWP de 13 mm de
diâmetro e 0,45 µm de tamanho do poro (Millipore Corp. Milford, MA, EUA). As aminas
foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência por par iônico,
derivação pós-coluna com o-ftalaldeído (OPA) e detecção fluorimétrica, conforme
metodologia descrita por CIRILO et al. (2003).
A análise cromatográfica foi efetuada em um cromatógrafo líquido de alta
eficiência Shimadzu, modelo LC-10 AD, com câmera de mistura à baixa pressão;
conjunto de lavagem automática de pistão; injetor automático Shimadzu modelo SIL –
10 ADVP conectado a um detector espectrofluorimétrico modelo RF-10 AXL a 340 nm
de excitação e 445 nm de emissão e um controlador CBM-20 A (Shimadzu, Kyoto,
Japan) conectados a um computador. O sistema de derivação pós-coluna foi montado
com uma câmara de mistura (volume morto igual a zero), instalada entre a saída da
coluna e o detector; um tubo de teflon, protegido da luz, de 2 m de comprimento e 0,25
cm de diâmetro conectado entre a câmara de mistura e o detector e a bomba LC-10 AD
(Shimadzu, Kyoto, Japão).
Foi utilizada uma coluna µBondapak C18 em fase reversa 3,9 x 300 mm, 10 µm
e pré-coluna µBondapak C18 (Waters, Milford, MA) e sistema gradiente de eluição em
ambiente com temperatura controlada (20 ± 1 ºC). As fases móveis foram: A - solução
0,2 M de acetato de sódio e 15 mM de octanosulfonato de sódio, pH 4,9 ajustado com
ácido acético, B - acetonitrila. O fluxo de análise foi de 0,8 mL/min.
O regente de derivação consistiu de 0,2 g de OPA dissolvido em 3 mL de
metanol e 500 mL de uma solução de 25 g de ácido bórico e 22 g de KOH (pH 10,5),
1,5 mL de Brij-35 e 1,5 mL de mercaptanol. A solução derivante foi preparada
diariamente, mantida ao abrigo da luz e bombeada à câmara de mistura a um fluxo de
0,4 mL/min.
A identificação das aminas foi feita por comparação do tempo de retenção das
aminas na amostra em relação ao padrão e também pela adição de solução da amina
suspeita à amostra. O cálculo da concentração das aminas foi feito por interpolação na
curva analítica.
97
III.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram submetidas a análise de variância (ANOVA) e as
médias foram comparadas pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade SIGMA STAT
2.0 (Systat Software Inc, Richmond, CA, USA).
III.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
III.3.1 Influência da concentração do ácido clorídrico na hidrólise das aminas
conjugadas
Os tipos e teores das aminas livres detectadas no café cru antes do
procedimento de hidrólise estão apresentados na Tabela III.1. As aminas livres
detectadas na amostra de café foram putrescina, serotonina, espermidina e espermina,
com teores que variaram de 0,12 mg/100 g para a serotonina a 6,61 mg/100 g para a
putrescina. A putrescina foi a amina predominante, contribuindo com 88% do teor total
de aminas, seguida da espermidina e espermina, que contribuíram com 5%, e da
serotonina (2%).
Tabela III.1. Teores médios de aminas livres detectados nas amostras de café cru
Aminas Teores mg/100 g (% CV)
Putrescina 6,61 (10)
Serotonina 0,12 (23)
Espermidina 0,39 (13)
Espermina 0,35 (15)
TOTAL 7,47 (12)
CV = coeficiente de variação.
98
III.3.1.1 Aminas ácido solúveis
Os resultados obtidos no estudo da influência da concentração do ácido
clorídrico na hidrólise das aminas conjugadas ácido solúveis (AS) estão indicados na
Tabela III.2. Somente as poliaminas putrescina, espermidina e espermina foram
detectadas nas amostras de café analisadas, após a hidrólise ácida. As demais
aminas pesquisadas não foram detectadas.
Tabela III.2. Aminas ácido solúveis detectadas após hidrólise por 24 h com HCl em
diferentes concentrações
Aminas (AS) Teores em mg/100 g (% CV)/HCl (mol/L)
1 3 6 9 12
Putrescina nd nd nd 2,79 (12) a
1,25 (3) b
Espermidina 0,24 (6) b 0,26 (21) b
0,26 (18) b 0,36 (13) a
0,26 (4) b
Espermina 0,24 (6) 0,25 (19) 0,25 (17) 0,22 (12) 0,24 (4)
AS: ácido solúveis. Valores com letras diferentes na mesma linha são significativamente diferentes.
(Teste de Duncan, p 0,05).
Para a espermina, as diferentes concentrações do ácido clorídrico utilizadas na
hidrólise não influenciaram na capacidade de liberação das mesmas de sua forma
conjugada. Entretanto, a putrescina só foi liberada de sua forma conjugada ao ser
submetida à hidrólise com HCl em concentrações mais elevadas de 9 mol/L e 12 mol/L.
A hidrólise com HCl 9 mol/L foi significativamente mais eficiente para a putrescina e
espermidina em comparação com a hidrólise conduzida com HCl 12 mol/L. Resultados
similares foram encontrados por FONTANIELLA et al. (2001) ao avaliarem a eficiência
de diferentes ácidos na hidrólise das aminas conjugadas em plantas (liquens). Os
autores concluíram que a hidrólise da putrescina é mais eficiente quando conduzida
com HCl em concentrações mais elevadas (12 mol/L).
A utilização do ácido clorídrico na hidrólise das aminas conjugadas tem sido
relatada na literatura para a análise de diferentes matrizes de origem vegetal
(RODRIGUEZ et al., 2000; FONTANIELLA et al., 2001; CASAL et al., 2004; TASSONI
et al., 2004). Na maioria dos estudos a hidrólise foi conduzida com HCl na
concentração de 12 mol/L, com a detecção das poliaminas putrescina, espermidina e
espermina. Resultados discordantes com os encontrados nesses estudos foram
99
obtidos por TASSONI et al. (2004) que detectaram putrescina em amostras de laranja
após hidrólise com HCl 6 mol/L.
III.3.1.2 Aminas ácido insolúveis
Na Tabela III.3 estão indicadas as aminas ácido insolúveis (AI) detectadas nas
amostras de café analisadas, após hidrólise com HCl em diferentes concentrações por
24 horas.
Tabela III.3 – Aminas ácido insolúveis detectadas após hidrólise com HCl em diferentes
concentrações
Aminas (AI)
Teores em mg/100 g (% CV)/hidrólise com HCl (mol/L)
1 3 6 9 12
Putrescina nd nd nd 0,22 (12) a
0,08 (5) b
Espermidina
nd nd 0,06 (15) b
0,16 (11) a
0,05 (8) b
Espermina nd nd 0,25 (13) c
0,58 (12) a
0,45 (10) b
AI: ácido insolúveis. Valores com letras diferentes na mesma linha são significativamente diferentes.
(Teste de Duncan p 0,05).
Em relação às aminas conjugadas AI observa-se comportamento semelhante às
aminas ácido solúveis, em relação à eficiência de extração das mesmas de sua forma
conjugada. O ácido clorídrico em concentrações mais elevadas (9 e 12 mol/L) foi mais
eficiente na hidrólise das aminas ácido insolúveis. As aminas espermidina e espermina
foram detectadas após a hidrólise com HCl em concentrações a partir de 6 mol/L. Estes
resultados condizem com TASSONI et al. (2004) que relataram a presença de
espermidina ácido insolúvel após hidrólise com HCl 6 mol/L. CASAL et al. (2005)
também relataram a presença das aminas ácido insolúveis putrescina, espermidina e
espermina em amostras de café. O HCl 9 mol/L foi significativamente mais eficiente na
hidrólise das aminas conjugadas ácido insolúveis, seguido do HCl 12 mol/L e do HCl 6
mol/L.
100
III.3.2 Influência da temperatura na hidrólise das aminas conjugadas
III.3.2.1 Aminas ácido solúveis
Na Tabela III.4, pode-se observar a influência da temperatura na liberação das
aminas ácido solúveis de suas formas conjugadas durante o procedimento de hidrólise.
A temperatura de 110 ºC foi significativamente mais eficiente na hidrólise para a
putrescina. Na concentração do ácido de 6 mol/L, a putrescina só foi detectada na
hidrólise a 110 ºC. A temperatura não influenciou os teores de espermidina e
espermina recuperados após a hidrólise, somente com a reação conduzida com HCl 6
mol/L. Dados semelhantes foram descritos por TASSONI et al. (2004), que também
detectaram a presença de putrescina (ácido solúvel) em amostras de laranja
submetidas à hidrólise ácida (HCl 6 mol/L) à temperatura de 110 ºC por 20 horas.
Tabela III.4 - Influência da temperatura na hidrólise das aminas conjugadas ácido
solúveis
Aminas/
Temperatura
Aminas conjugadas ácido solúveis (mg/100 g) (% CV)/hidrólise HCl (mol/L)
1 3 6 9 12
Putrescina
Ambiente/24 h
nd nd nd y 2,79 (12) ay 1,25 (3) by
110 ºC/ 24 h nd nd 0,65 (31) x 3,33 (5) ax 1,98 (4) bx
Espermidina
Ambiente/24 h
0,24 (6) b 0,26 (21) b 0,26 (18) by 0,36 (13) a 0,26 (4) b
110 ºC/ 24 h 0,19 (15)
c
0,30 (18)
b
0,62 (12)
a
x
0,38 (6)
b
0,22 (7)
c
Espermina
Ambiente/24 h
0,24 (6) 0,25 (19) 0,25 (17) y 0,22 (12) 0,24 (4)
110 ºC/ 24 h 0,31(14) b 0,27 (25) b 0,44 (15) ax 0, 20 (3) b 0,26 (13) b
Valores com letras diferentes para cada linha (a-c) ou coluna (x-y) para a mesma amina são
significativamente diferentes. (Teste de Duncan p 0,05).
FONTANIELLA et al. (2001) encontraram resultados semelhantes para a
putrescina. Na hidrólise ácida com HCl 12 mol/L, os teores de putrescina foram
significativamente maiores a 110 ºC do que à temperatura ambiente. Já para a
espermidina e espermina, os autores relataram uma menor eficiência na hidrólise
conduzida à temperatura de 110 ºC.
101
Comportamento semelhante pode ser observado para as aminas ácido
insolúveis (Tabela III.5), para as quais a liberação da putrescina conjugada ácido
insolúvel foi mais eficiente quando o procedimento de hidrólise foi conduzido a
temperatura de 110 ºC para as concentrações de 6, 9 e 12 mol/L de HCl.
III.3.2.2 Aminas ácido insolúveis
A temperatura de hidrólise não influenciou a eficiência de recuperação das
aminas ácido insolúveis espermidina e espermina. Os teores destas aminas foram
semelhantes na hidrólise conduzida à temperatura ambiente quanto à 110 ºC com HCl
nas concentrações de 6, 9 e 12 mol/L. A espermidina já havia sido encontrada após
hidrólise ácida com HCl 6 mol/L a 110 ºC em amostras de laranjas (TASSONI et al.,
2004). Diferentemente dos resultados anteriores, a espermina ácido insolúvel foi
detectada durante a hidrólise com HCl 3 mol/L a 110 ºC.
Tabela III.5 - Influência da temperatura na hidrólise das aminas conjugadas ácido
insolúveis
Aminas/
Temperatura
Aminas conjugadas ácido insolúveis (mg/100 g) (% CV)/hidrólise HCl
(mol/L)
1 3 6 9 12
Putrescina
Ambiente/24 h
nd nd nd y 0,22 (7) ay 0,08 (3) by
110 ºC/24 h nd nd 0,15 (9) c x 0,44 (5) ax 0,28 (4) bx
Espermidina
Ambiente/24 h
nd nd 0,06 (15) b 0,16 (11) a 0,05 (8) b
110 ºC/24 h nd nd 0,05 (18) a 0,18 (6) a 0,09 (7) b
Espermina
Ambiente/24 h
nd nd y 0,25 (13)
c
0,58 (12)
a
0,45 (10)
b
110 ºC/24 h nd 0,27 (25) bx
0,30 (15) b 0, 51 (3) a 0,41 (13) b
Valores com letras diferentes para cada linha (a-c) ou coluna (x-y) são significativamente diferentes.
(Teste de Duncan p 0,05).
102
III.3.3 Influência do tempo de reação na hidrólise das aminas conjugadas
III.3.3.1 Aminas ácido solúveis
De acordo com os resultados obtidos nos estudos da influência da temperatura e
da concentração do ácido clorídrico ideais para a hidrólise de uma maior quantidade de
aminas conjugadas, o tempo de reação foi testado. Na Figura III.2 observa-se a
influência do tempo da reação de hidrólise com HCl nas concentrações de 6, 9 e 12, a
temperatura ambiente, na liberação das aminas ácido solúveis de sua forma
conjugada.
Avaliando os dados apresentados, verifica-se que na hidrólise efetuada com HCl
6 mol/L, o período de 16 horas não foi suficiente para liberação das aminas de sua
forma conjugada. A putrescina foi detectada apenas quando o tempo de reação
alcançou 18 horas. Já a espermina foi detectada com 16 horas de reação com HCl na
concentração de 12 mol/L. Os teores das aminas detectadas não foram
significativamente diferentes (p 0,05) entre os tempos avaliados.
Na Figura III.3 são apresentados os dados obtidos na hidrólise das aminas
conjugadas ácido solúveis com HCl nas concentrações de 6, 9 e 12 mol/L conduzida a
temperatura de 110 ºC em diferentes tempos de reação.
Observa-se que na hidrólise a 110 ºC o tempo de reação exerceu influência
sobre a eficiência da hidrólise. Para o procedimento realizado com HCl 6 mol/L a
detecção das aminas ocorreu a partir de 20 h de reação. Este fato foi observado para
as aminas putrescina, espermidina e espermina. Já na hidrólise executada com HCl 9
mol/L e 12 mol/L as aminas putrescina e espermina passaram a ser detectadas a partir
de 16 horas de reação e a espermidina com 18 h.
Analisando os resultados para cada amina separadamente, a putrescina foi
detectada a partir de 16 horas de hidrólise com HCl 12 mol/L e a partir de 18 h com HCl
9 mol/L. Porém o teor encontrado desta amina foi significativamente menor (p 0,05),
com 16 h de reação em relação a 18, 20 e 24 h na hidrólise com HCl 12 mol/L. Nas
demais concentrações de ácido, não foi observada diferença significativa entre os
tempos de reação.
103
Figura III.2 – Influência do tempo de hidrólise ácida à temperatura ambiente nas
aminas ácido solúveis putrescina, espermidina e espermina de grãos crus de café.
104
Figura III.3 – Influência do tempo de hidrólise ácida a 110 ºC na extração das aminas
ácido solúveis putrescina, espermidina e espermina de grãos crus de café.
105
Para a espermidina foi observada diferença significativa (p 0,05) entre os
tempos de reação apenas na hidrólise com HCl 6 mol/L, sendo que o teor desta amina
na reação com 24 h de duração foi significativamente maior. A espermidina foi
detectada com 16 horas de reação de hidrólise ácida com HCl 9 e 12 mol/L.
Semelhante ao que foi observado para a putrescina, os teores de espermina foram
significativamente menores (p0,05) apenas para o tempo de reação de 16 horas.
IIII.3.3.2 Aminas ácido insolúveis
A eficiência da hidrólise ácida executada com HCl nas concentrações de 6, 9 e
12 mol/L à temperatura ambiente e a 110 ºC, em relação ao tempo de reação também
foram testadas para a liberação das aminas ácido insolúveis de sua forma conjugada.
A influência do tempo na reação de hidrólise ácida à temperatura ambiente está
demonstrada na Figura III.4. Observa-se que a hidrólise efetuada em 16 horas não foi
suficiente para liberação das aminas da forma conjugada, mesmo em concentrações
de HCl mais elevadas.
Avaliando a influência do tempo de reação nas diferentes concentrações de HCl
para cada uma das aminas, observou-se que a putrescina só foi detectada a partir de
18 horas de reação para todas as concentrações testadas. Na concentração de HCl 6
mol/L foi detectada a putrescina após 20 h de reação, em baixos teores (0,04 mg/100
g), porém em 24 h esta amina não foi detectada.
A espermidina foi detectada a partir de 18 horas de reação para as
concentrações do ácido de 9 e 12 mol/L. Na hidrólise feita com HCl 6 mol/L à
temperatura ambiente esta amina só foi detectada a partir de 24 horas de reação. Não
foi observada diferença significativa (p 0,05) nos teores desta amina nos diferentes
tempos de reação avaliados.
106
Figura III.4 – Influência do tempo de hidrólise ácida à temperatura ambiente na
extração das aminas ácido insolúveis putrescina, espermidina e espermina de grãos
crus de café.
107
Figura III.5 – Influência do tempo de hidrólise ácida a 110 ºC na extração das aminas
conjugadas ácido insolúveis putrescina, espermidina e espermina de grãos crus de
café.
108
O comportamento da espermina foi semelhante em todos os tempos avaliados,
tendo sido detectada a partir de 18 horas de reação nas concentrações de 6, 9 e 12
mol/L. Assim como para as aminas putrescina e espermidina não foi observada
diferença significativa nos teores de espermina nos diferentes tempos avaliados.
A influência do tempo na hidrólise a 110 ºC das aminas conjugadas ácido
insolúveis também foi avaliada e está indicada na Figura III.5. Semelhante ao que
ocorreu na hidrólise à temperatura ambiente o tempo de reação de 16 horas não foi
eficiente na hidrólise das aminas à temperatura de 110 ºC.
Para concentrações de HCl de 6 mol/L, a hidrólise à temperatura de 110 ºC só
foi eficiente com 24 horas de reação. Porém, nas demais concentrações de HCl, as
aminas putrescina, espermidina e espermina foram detectadas nas reações com
duração de 18, 20 e 24 horas. Para todas as três aminas ácido insolúveis detectadas
na amostra de café não foram observadas diferenças significativas (p 0,05) em seus
teores nos diferentes tempos de reação avaliados.
Considerando os resultados relatados acima, tanto para as aminas ácido
solúveis quanto para as ácido insolúveis, o tempo de hidrólise influenciou na liberação
das aminas de sua forma conjugada no café. Recuperações mais eficientes foram
obtidas com reações conduzidas por no mínimo 18 horas. Não foram encontrados
dados na literatura sobre a influência do tempo da reação de hidrólise ácida com HCl
na eficiência da liberação das aminas de sua forma conjugada, porém relatos na
literatura apontam para a execução deste procedimento com tempos que variam de 18
a 20 horas em diferentes matrizes (RODRIGUEZ et al., 2000; FONTANIELLA et al.,
2001; TASSONI et al., 2004). As aminas conjugadas têm sido determinadas em
amostras de café por meio da reação de hidrólise com HCl 12 mol/L a 110 ºC por 18
horas (CASAL et al., 2004; CASAL et al., 2005).
III.3.4 Influência da hidrólise ácida no perfil e teores das aminas livres
Para inferir sobre a influência da hidrólise na determinação das aminas
conjugadas, os teores de aminas livres antes e após a reação de hidrólise foram
avaliados. Os percentuais de recuperação das aminas do padrão de 10 µg/mL, após
serem submetidas à hidrólise com HCl nas concentrações de 9 e12 mol/L por 18, 20 e
24 h estão demonstrados na Tabela III.6.
109
Tabela III.6. Recuperação das aminas livres de solução padrão (10 µg/mL) durante
hidrólise ácida com HCL 9 e 12 mol/L
Aminas/hidrólise
% Recuperação (% CV)/tempo de reação (h)
18 20 24
Putrescina
HCl 9 mol/L 89 (13) 93 (15) 92 (8)
HCl 12 mol/L 93 (11) 91(8) 92 (3)
Cadaverina
HCl 9 mol/L 99 (13) 101 (12) 105 (13)
HCl 12 mol/L 95 (13) 98 (7) 105 (5)
Histamina
HCl 9 mol/L 88 (2) x 88 (5) x 82 (7) x
HCl 12 mol/L 74 (4) a y 70 (5) a y 61 (5) b y
Tiramina
HCl 9 mol/L 77 (16) 72 (15) 75 (15)
HCl 12 mol/L 81 (9) 82 (14) 73 (8)
Serotonina
HCl 9 mol/L 33 (23) x 35 (15) x 12 (52) x
HCl 12 mol/L 12 (12) a y 2 (11) b y 1 (14) b y
Agmatina
HCl 9 mol/L 95 (3) 96 (7) 80 (24)
HCl 12 mol/L 88 (13) 96 (12) 81 (3)
Espermidina
HCl 9 mol/L 99 (16) 102 (11) 91 (22)
HCl 12 mol/L 103 (14) 96 (23) 95 (3)
Espermina
HCl 9 mol/L 84 (3) 93 (9) 85 (25)
HCl 12 mol/L 81 (9) 83 (8) 88 (5)
Feniletilamina
HCl 9 mol/L 87 (6) 80 (20) 82 (23)
HCl 12 mol/L
80 (13) 81 (12) 83 (5)
Triptamina
HCl 9 mol/L 58 (16) 59 (4) x 49 (27)
HCl 12 mol/L 49 (5) 36 (21) y 37(40)
CV: coeficiente de variação. Valores com letras diferentes para cada linha (a-b) ou coluna para cada
amina (x-y) são significativamente diferentes. (Teste de Duncan p 0,05).
110
Sete das dez aminas contidas na solução padrão apresentaram porcentagem de
recuperação satisfatória (acima de 80%), após a hidrólise. A concentração do ácido
influenciou na recuperação das aminas livres. Os teores de histamina, serotonina e
triptamina foram significativamente (p 0,05) menores após a hidrólise com HCl 12
mol/L.
Para o procedimento realizado com HCl 9 mol/L as aminas tiramina, serotonina e
triptamina demonstraram uma redução em suas concentrações com coeficientes de
recuperação variarando de 12 a 77%. Comportamento semelhante foi observado
durante a hidrólise com HCl 12 mol/L, sendo que as aminas histamina, serotonina e
triptamina apresentaram recuperações médias de 68%, 5% e 41%, respectivamente. A
serotonina foi a amina que apresentou menores coeficientes de recuperação, com
percentuais variando de 1 a 72%.
O tempo da reação não influenciou a recuperação da maioria das aminas. Para
a histamina, os índices de recuperação foram significativamente maiores (p 0,05)
após 18 e 20 h de reação em comparação a 24 h. Este fato também foi observado para
a serotonina que apresentou porcentagens de recuperação significativamente maiores
(p 0,05) na reação com 18 h de duração em relação a 20 e 24 h. Estes resultados
foram observados apenas na reação de hidrólise conduzida com HCl 12 mol/L.
Na Figura III.6 pode-se observar o comportamento das dez aminas contidas na
solução padrão de 10 µg/mL submetida a hidrólise com HCl 9 e 12 mol/L à 110 ºC por
18, 20 e 24 horas. A maioria das aminas se comportaram de maneira semelhante, não
apresentando perdas durante a hidrólise. As aminas que demonstraram maior
instabilidade após as 24 horas de reação de hidrólise foram a tiramina, serotonina e
triptamina para o procedimento com HCl 9 mol/L e histamina, serotonina e triptamina
ao serem submetidas a hidrólise com HCl 12 mol/L.
Considerando que a maioria dos relatos na literatura sobre a presença de
aminas conjugadas em matrizes de origem vegetal evidenciam a presença das
poliaminas putrescina, espermidina e espermina conjugadas e, analisando os
resultados acima relatados, o procedimento de hidrólise ácida para a determinação de
aminas conjugadas deve ser aplicado apenas para as aminas putrescina, cadaverina,
agmatina, espermidina, espermina e feniletilamina. Desta forma sugere-se mais
estudos para determinação das aminas tiramina, histamina e serotonina.
111
Figura III.6. Comportamento das aminas durante a reação de hidrólise. A) HCl 9 mol/L ;
B) HCl 12 mol/L. PUT= putrescina; CAD= cadaverina; HIM= histamina; TIM= tiramina; SRT=
serotonina; AGM= agmatina; ESD=espermidina; ESM= espermina; FEN= feniletilamina; TRM=
triptamina.
112
III.4 CONCLUSÕES
As aminas conjugadas encontradas no café foram as poliaminas putrescina,
espermidina e espermina. A hidrólise para a determinação das aminas conjugadas em
café foi otimizada.
A concentração do ácido clorídrico afetou de forma significativa a hidrólise das
poliaminas conjugadas. Melhor eficiência foi observada com o ácido clorídrico na
concentração de 9 mol/L. A temperatura de reação influenciou de forma significativa a
reação de hidrólise apenas para a putrescina, sendo 110 ºC significativamente mais
eficiente. Enquanto que o tempo de reação foi mais eficiente em reações conduzidas
por 18, 20 e 24 horas, tanto para as aminas ácido solúveis quanto para as aminas
ácido insolúveis.
Desta forma a condição de hidrólise selecionada para a determinação de aminas
conjugadas em amostras de café foi hidrólise com HCl 9 mol/L a 110 ºC por 18 horas.
113
CAPÍTULO IV. VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA POR CLAE -
PAR IÔNICO PARA A DETERMINAÇÃO DE AMINAS
BIOATIVAS LIVRES EM AMOSTRAS DE CAFÉ
RESUMO
Para garantir maior confiabilidade nos resultados da análise de aminas bioativas
em amostras de café, a metodologia CLAE-par iônico, derivação pós-coluna com OPA
e detecção fluorimétrica foi validada para a determinação das aminas putrescina,
cadaverina, histamina, tiramina, serotonina, agmatina, espermidina, espermina,
feniletilamina e triptamina. Os parâmetros de desempenho do método avaliados foram:
seletividade, linearidade, efeitos da matriz, exatidão e precisão e limites de detecção e
quantificação. O método apresentou seletividade com boa resolução dos picos e
tempos de retenção das aminas na amostra concordando com os das aminas da
solução padrão. A curva analítica apresentou linearidade satisfatória na faixa de 0,5 a
15 µg/mL, com coeficientes de correlação maiores que 0,99 para todas as aminas. A
matriz exerceu influência na linearidade da curva para a tiramina e triptamina no café
torrado e para a tiramina, serotonina e triptamina no café solúvel. Os limites de
detecção e quantificação do método foram de 0,04 µg/mL e de 0,1 mg/100 g,
respectivamente, para todas as matrizes avaliadas. O método foi preciso na faixa de
0,1 a 10 mg/100 g. Os coeficientes de variação variaram de 2 a 15% para o café cru, 2
a 13% para o torrado e 2 a 15% para o café solúvel. A exatidão foi satisfatória para as
aminas putrescina, cadaverina, histamina, tiramina, agmatina, espermidina e espermina
na faixa de 0,1 a 10 mg/100 g com recuperações médias entre 80 a 110%.
Palavras-chave: validação, café, cromatografia líquida de alta eficiência, aminas
bioativas
114
IV.1 - INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de um método analítico e a adaptação ou implementação de
um método conhecido envolvem um processo de avaliação que estime a sua eficiência
na rotina do laboratório. Esse processo é denominado de validação (BRITO et al.,
2003).
Validação de método analítico é o processo de demonstrar que o método é
adequado ao uso pretendido, sendo considerado um aspecto vital da garantia da
qualidade analítica (BARROS, 2002). De acordo com a ANVISA (2003), a validação
deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências
das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados.
O objetivo da validação consiste em demonstrar que um método analítico é
adequado para o seu propósito. Desta forma, a validação deve ser considerada quando
se desenvolve ou efetua adaptações em metodologias já validadas, inclusão de novas
técnicas de análise ou mesmo com o uso de equipamentos diferentes (BRITO et al.,
2003). Os métodos normalizados já são métodos validados e não é necessário
proceder ao processo completo de validação desde que não ocorram alterações
significativas dos mesmos (BARROS, 2002). Porém, independente de quão adequado
for o desempenho de um método em um estudo de validação já estabelecido, é
necessário uma confirmação de que o método é válido quando aplicado em diferentes
laboratórios, efetuando uma validação intralaboratorial (SOUZA et al., 2007).
Sob uma visão geral, a validação de métodos analíticos pode ser dividida em
dois tipos (RIBANI et al., 2005). O primeiro consiste das etapas de validação dentro de
um único laboratório usado para validar um método novo ou verificar a adequação de
um método já validado, denominado “in house validation”. O segundo tipo, denominado
de validação completa (“full validation”), envolve o estabelecimento de todas as
características de desempenho de um método analítico e um estudo interlaboratorial
que é utilizado para verificar como a metodologia se comporta quando executada em
diferentes laboratórios.
O processo de validação consiste na determinação de parâmetros analíticos,
também conhecidos como parâmetros de desempenho analítico, características de
desempenho ou figuras analíticas de mérito (RIBANI et al., 2004). Os parâmetros
analíticos normalmente utilizados para a validação de métodos são: seletividade,
115
linearidade e faixa de aplicação; precisão; exatidão; limite de detecção, limite de
quantificação e robustez (BRITO et al., 2003; LIMA & FROTA, 2007; RIBANI et al.,
2007).
A metodologia de determinação de aminas bioativas por cromatografia líquida
por par-iônico, derivação pós-coluna com OPA e detecção fluorimétrica tem sido
empregada na análise de diversos tipos de alimentos como bebidas alcoólicas, cafés,
produtos cárneos, leite e derivados, vegetais e frutas (BUSTO et al., 1997; VALE &
GLÓRIA, 1997; NOVELLA-RODRIGUEZ, et al., 2000; VIDAL-CAROU et al., 2003;
ADÃO & GLÓRIA, 2005; LAVIZZARI et al., 2006; CIRILO et al., 2003; SILVEIRA et al.,
2007 a). Relatos sobre os procedimentos de validação desta metodologia foram
encontrados para as matrizes: queijo (VALE & GLÓRIA, 1997); espinafre, batata,
banana, avelã e achocolatado (LAVIZZARI et al., 2006) e vinhos (PRESTE et al.,
2007).
Neste contexto, considerando a importância do procedimento de validação do
método analítico para a garantia da confiabilidade dos resultados, e a complexidade da
matriz café, o objetivo deste trabalho foi validar (validação “in house”) a metodologia
para a determinação de aminas bioativas livres por CLAE par-iônico, derivação pós-
coluna com OPA e detecção fluorimétrica para análise de café verde, café torrado e
café solúvel.
IV.2 MATERIAL E MÉTODOS
IV.2.1 MATERIAL
IV.2.1.1 Amostra
Para realização da validação foram utilizadas amostras de café cru, café torrado
e café solúvel.
116
IV.2.1.2 Reagentes
Os reagentes utilizados possuíam grau analítico, exceto os solventes usados no
CLAE (acetonitrila), que eram de grau cromatográfico. Todas as soluções foram
preparadas com água ultrapura obtida do Sistema Milli-Q Plus (Millipore Corp., Milford,
MA, EUA). Os padrões de aminas bioativas (diidrocloreto de putrescina - PUT,
diidrocloreto de cadaverina - CAD, diidrocloreto de histamina - HIM, hidrocloreto de
tiramina - TIM, tetraidrocloreto de espermina - EPM, triidrocloreto de espermidina –
EPD, complexo sulfato creatinina agmatina - AGM, hidrocloreto de 2-feniletilamina -
FEA, hidrocloreto de 5-hidroxitriptamina ou serotonina – SRT), foram adquiridos da
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). As fases móveis foram filtradas em
membrana (47 mm de diâmetro e 0,45 m de poro, Millipore Corp., Milford, MA, EUA)
HAWP e HVWP para reagentes aquosos e solventes orgânicos, respectivamente.
IV.2.2 MÉTODOS
O procedimento utilizado para a validação do método consistiu na determinação
de dez aminas bioativas livres por CLAE par iônico, derivação pós-coluna com o-
ftalaldeído e detecção fluorimétrica a 340 nm de excitação e 445 nm de emissão. As
aminas determinadas por esta metodologia foram putrescina, cadaverina, histamina,
tiramina, serotonina, agmatina, espermidina, espermina, feniletilamina e triptamina, de
acordo com CIRILO et al. (2003).
A validação consistiu no estabelecimento dos parâmetros seletividade,
linearidade, efeitos da matriz, exatidão, precisão, limite de detecção e limite de
quantificação.
IV.2.2.1 Procedimentos de validação
Seletividade
Extratos do café verde, torrado e solúvel foram fortificados com solução padrão
contendo dez aminas bioativas nas concentrações de 0,5 , 3 e 6 µg/mL em três
replicatas independentes para inferir sobre a interferência dos componentes da matriz
na detecção das aminas bioativas.
117
Linearidade
Para a verificação da linearidade três curvas de calibração foram preparadas
com a solução padrão contendo as dez aminas em seis concentrações diferentes (0,5;
3; 6; 9; 12 e 15 µg/mL). Cada ponto da curva foi analisado em triplicata em ordem
aleatória. Em seguida foram construídos os gráficos da área do pico e a concentração
das aminas por regressão linear, as equações das curvas analíticas e seus coeficientes
de correlação, foram determinados.
Efeitos da matriz
O método de adição foi empregado para avaliação dos efeitos da matriz.
Semelhante ao procedimento realizado para avaliar a linearidade, uma curva de
calibração com seis concentrações diferentes (0,5; 3; 6; 9; 12 e 15 µg/mL) contendo as
dez aminas, foi preparada com os extratos de café verde, torrado e solúvel. Cada
ponto da curva foi analisado em triplicata em ordem aleatória. Em seguida foram
construídos os gráficos relacionando as áreas dos picos e as respectivas
concentrações e, por regressão linear, as equações das curvas analíticas e seus
coeficientes de correlação, foram determinados.
Limite de detecção
Extratos dos cafés foram fortificados com padrão das dez aminas para obtenção
de concentração correspondente a 0,5 µg/mL e analisados em dez replicatas. O limite
de detecção foi calculado pelo desvio padrão das respostas multiplicado por 3
(INMETRO).
Limite de quantificação
O limite de quantificação foi determinado conforme descrito anteriormente para o
limite de quantificação. Após a análise dos extratos dos cafés fortificados com padrão,
o desvio padrão foi calculado e multiplicado por 10 para obtenção do limite de
quantificação (INMETRO).
118
Exatidão e precisão
A exatidão e precisão do método avaliado foram calculadas por meio da
recuperação média (exatidão) e coeficientes de variação (precisão) dos resultados
obtidos após análise de amostras de café verde, torrado e solúvel enriquecidas com
três concentrações do padrão contendo as dez aminas. O enriquecimento foi feito para
se obter amostras com concentrações correspondentes a 0,1; 1,0 e 10 mg/100 g da
amostra, em triplicata.
IV.2.2.2 Preparo das soluções padrão
As soluções padrão utilizadas durante o processo de validação foram
preparadas de acordo com a instrução de trabalho (IT - 2) estabelecida pelo LBqA.
Foram preparadas soluções estoques na concentração de 1 mg/mL de cada amina
(putrescina, cadaverina, histamina, tiramina, serotonina, agmatina, espermidina,
espermina, feniletilamina e triptamina). A partir destas soluções foi preparada uma
solução padrão de 100 µg/mL, contendo as dez aminas que, por meio de diluições
subseqüentes, deram origem às soluções padrão de trabalho.
IV.2.2.3 Separação e determinação de aminas bioativas por CLAE-par iônico
As aminas foram extraídas da matriz café conforme metodologia otimizada
descrita no capítulo II. Os grãos de café verde e torrado foram triturados e separados
por peneiras, sendo as partículas retidas em peneira de 20 mesh selecionada para
análise.
Foram adicionados 10 mL de TCA 5% a 5 g dos cafés verde torrado e solúvel.
Em seguida, foram agitados em mesa agitadora por 10 minutos, centrifugadas a 11.180
g a 4 °C por 21 minutos e filtradas em papel de filtro qualitativo. A extração foi repetida
mais duas vezes, com adição de 10 mL de TCA 5% cada. Os extratos foram
combinados e o volume final anotado.
Os extratos investigados foram filtrados em membrana HAWP de 13 mm de
diâmetro e 0,45 µm de tamanho do poro (Millipore Corp. Milford, MA, EUA). As aminas
foram determinadas por CLAE-par iônico, derivação pós-coluna com OPA, conforme
metodologia descrita por CIRILO et al. (2003).
119
A análise cromatográfica foi efetuada em um cromatógrafo líquido de alta
eficiência Shimadzu, modelo LC-10 AD, com câmara de mistura à baixa pressão;
conjunto de lavagem automática de pistão; injetor automático Shimadzu modelo SIL –
10 ADVP conectado a um detector espectrofluorimétrico modelo RF-10 AXL a 340 nm
de excitação e 445 nm de emissão e um controlador CBM-20 A (Shimadzu, Kyoto,
Japan) conectado a um computador. O sistema de derivação pós-coluna foi montado
com uma câmara de mistura (volume morto igual a zero), instalada entre a saída da
coluna e o detector; um tubo de teflon, protegido da luz, de 2 m de comprimento e 0,25
de diâmetro conectado entre a câmara de mistura, o detector e a bomba LC-10 AD
(Shimadzu, Kyoto, Japão).
Foi utilizada uma coluna µBondapak C18 em fase reversa 3,9 x 300 mm, 10 µm
e pré-coluna µBondapak C18 (Waters, Milford, MA) e sistema gradiente de eluição em
ambiente com temperatura controlada (20 ± 1 ºC). As fases móveis foram: A - solução
0,2 M de acetato de sódio e 15 mM de octanosulfonato de sódio, pH 4,9 ajustado com
ácido acético, B - acetonitrila. O fluxo de análise foi de 0,8 mL/min.
O reagente de derivação consistiu de 0,2 g de OPA dissolvido em 3 mL de
metanol e 500 mL de uma solução de 25 g de ácido bórico e 22 g de KOH (pH 10,5),
1,5 mL de Brij-35 e 1,5 mL de mercaptanol. A solução derivante foi preparada
diariamente, mantida ao abrigo da luz e bombeada à câmara de mistura a um fluxo de
0,3 mL/min.
A identificação das aminas foi feita por comparação do tempo de retenção das
aminas na amostra em relação ao padrão e também pela adição de solução da amina
suspeita à amostra. O cálculo da concentração das aminas foi feito por interpolação na
curva analítica.
120
IV.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
IV.3.1 Parâmetros de validação para o café cru, torrado e solúvel
Seletividade
Na Figura IV.1 estão apresentados os cromatogramas obtidos na análise da
solução padrão de 3 µg/mL das dez aminas e de cada amostra dos cafés cru, torrado e
solúvel fortificados com soluções padrão nas concentrações de 0,5; 3 e 6 µg/mL. Os
tempos de retenção médios foram 14,38 ± 0,07 min para putrescina; 15,63 ± 0,12 min
para cadaverina; 18,79 ± 0,28 min para histamina; 23,12 ± 0,29 min para tiramina;
28,55 ± 0,07 min para serotonina; 33,48 ± 0,08 min para agmatina; 36,27 ± 0,07 min
para espermidina; 39,90 ± 0,03 min para espermina; 42,57 ± 0,04 min para
feniletilamina; e 44,33 ± 0,14 min para triptamina.
A avaliação dos cromatogramas mostrou que o método produz respostas para
diferentes analitos presentes no café. Porém os picos relativos às dez aminas de
interesse puderam ser distinguidos dos outros compostos detectados, mostrando boa
resolução. Mostrou também que os tempos de retenção das aminas na amostra
concordaram com os das aminas da solução padrão.
No café solúvel foi detectada uma maior quantidade de interferentes em relação
aos cafés torrado e cru. Esse fato se deve, provavelmente, à concentração destas
substâncias interferentes durante o processamento do café solúvel, que envolve a
etapa de concentração do extrato do café.
Linearidade
Na Tabela IV.1 estão relacionadas as equações de regressão linear, e os
coeficientes de determinação e de correlação para cada amina, obtidos a partir da
construção das curvas analíticas. Para todas as aminas, o coeficiente de correlação (r)
foi maior que 0,99 em todas as três curvas analíticas.
121
A)
B)
C)
Figura IV.1 - Cromatogramas de uma solução padrão de 3 µg/mL das dez aminas
(preto) e de amostras dos cafés cru (vermelho), torrado (verde) e solúvel (azul). Amostras
adicionadas de solução padrão de 0,5 µg/mL (A); solução padrão de 3,0 µg/mL (B); solução padrão de 6,0 µg/mL
(C); PUT = putrescina; CAD = cadaverina; HIM = histamina; TIM = tiramina; SRT = serotonina; AGM = agmatina;
SPD = espermidina; SPM = espermina; PHE = feniletilamina; TRM = triptamina.
122
Tabela IV.1 – Equações de regressão linear e coeficientes de determinação e de
correlação das curvas analíticas para cada amina determinada em três dias
Aminas
Equação
r
2
r
Putrescina
1º dia y = 1879202x – 14600 0,996 0,997
2º dia y = 1020627x + 76145 0,986 0,993
3º dia y = 1013600x – 76145 0,986 0,993
Cadaverina
1º dia y = 2098511x – 110278 0,998 0,999
2º dia y = 1406496x + 267418 0,985 0,992
3º dia y = 1332176x – 81952 0,986 0,993
Histamina
1º dia y = 1363327x – 178010 0,998 0,999
2º dia y = 746185x + 119391 0,986 0,993
3º dia y = 76086x – 86349 0,984 0,992
Tiramina
1º dia y = 1139937x – 168512 0,997 0,998
2º dia y = 580787x + 72911 0,988 0,994
3º dia y = 65092x - 65694 0,980 0,990
Serotonina
1º dia y = 629116x – 149355 0,998 0,999
2º dia y = 359170x + 16502 0,989 0,994
3º dia y = 33410x - 70530 0,991 0,995
Agmatina
1º dia y = 1002268x – 104173 0,998 0,999
2º dia y = 571693x + 89411 0,988 0,994
3º dia y = 56921x - 71546 0,981 0,990
Espermidina
1º dia y = 1179338x – 114497 0,996 0,997
2º dia y = 740197x + 213838 0,981 0,990
3º dia y = 72252x + 26741 0,980 0,990
Espermina
1º dia y = 1669277x – 153680 0,998 0,999
2º dia y = 349050x + 19799 0,987 0,993
3º dia y = 34164x - 79999 0,986 0,993
Feniletilamina
1º dia y = 530825x + 284779 0,989 0,994
2º dia y = 915120x +150186 0,983 0,991
3º dia y = 93157x - 10586 0,986 0,993
Triptamina
1º dia y = 1010164x – 103711 0,998 0,999
2º dia y = 513315x + 35102 0,987 0,993
3º dia y = 47019x - 66413 0,985 0,992
r
2
= Coeficiente de determinação; r = coeficiente de correlação.
123
Avaliando-se os resultados, observa-se que para a curva obtida no primeiro dia
os coeficientes de determinação (r
2
) para a maioria das aminas foi maior que 0,99,
exceto para a feniletilamina (r
2
= 0,989). Já para as demais curvas, os coeficientes de
determinação apresentados estão abaixo de 0,99 e acima de 0,90, entre 0,981 a 0,989
para o segundo dia e 0,980 a 0,986 para o terceiro dia. Baseado nesses resultados foi
selecionada a primeira curva analítica para determinação dos demais parâmetros de
validação como efeito da matriz, exatidão e precisão.
Os dados obtidos na curva analítica demonstraram que há correlação linear
significativa entre as concentrações das aminas na faixa de 0,5 a 15 µg/mL e as
respectivas áreas. Os coeficientes de correlação (r) estão em conformidade com os
critérios do INMETRO (2003) que recomendam valores maiores que 0,90 para os
testes de linearidade.
A linearidade do método para determinação de dez aminas bioativas por CLAE
par-iônico com detecção por fluorescência também foi estabelecida na faixa de 0,5 a 6
µg/mL por VALE & GLÓRIA (1997). Porém a matriz utilizada foi queijo parmesão.
PRESTES et al. (2007) obtiveram linearidade deste método para ensaio de
histamina em vinhos na faixa de 0,01 a 0,2 µg/mL. LAVIZZARI et al. (2006)
estabeleceram linearidade para doze aminas bioativas por CLAE com detecção
fluorimétrica na faixa de 0,1 a 100 µg/mL em diferentes matrizes (espinafre, nozes,
banana, batata e achocolatado).
Efeitos da matriz
O método de adição do padrão utilizado para verificar a interferência da matriz
na linearidade da curva analítica consiste na adição de padrão à amostra na mesma
faixa de concentração utilizada para construir a curva analítica.
Os efeitos de cada uma das matrizes de café (cru, torrado e solúvel) na
linearidade da curva analítica na faixa de 0,5 a 15 µg/mL foram avaliados. Na
Figura IV.2 estão demonstradas as curvas analíticas no solvente e na matriz café cru
para todas as dez aminas.
Os resultados dos estudos do efeito da matriz café cru para avaliar se esta
exerce influência na análise, mostraram que, ao se comparar as curvas de linearidade
para os padrões no solvente e na matriz, os gráficos obtidos para todas as aminas a
124
matriz não apresentaram influência em relação à curva dos padrões no solvente, sendo
possível visualizar que as curvas se sobrepuseram ou se apresentaram paralelas.
125
Figura IV.2 – Curvas de linearidade das aminas no solvente e na matriz café cru.
Equação acima da curva refere-se ao padrão; Equação abaixo da curva refere-se ao padrão na matriz.
De acordo com RIBANI et al. (2003), um método é seletivo e a matriz não exerce
influência na linearidade da curva analítica quando na comparação entre as curvas
analíticas no solvente e na matriz, observa-se que ocorre uma sobreposição entre as
retas ou as mesmas se posicionam paralelas. Ainda, segundo o mesmo autor, na
determinação de analitos em que a matriz interfere na linearidade da curva analítica,
esta deve ser construida na matriz.
O efeito da matriz café torrado na linearidade da curva analítica está
demonstrado na Figura IV.3. Observa-se que, para a tiramina e triptamina as curvas
analíticas no solvente e na matriz apresentaram um ângulo, o que demonstra que a
matriz influenciou significativamente a curva analítica. Observa-se para estas aminas
que a resposta do detector apresentou alterações em concentrações acima de 3 µg/mL
126
e, com o aumento da concentração do analito, as retas se distanciaram. Estes
resultados demonstram que o café torrado apresenta substâncias capazes de modificar
a resposta do detector no momento de detecção das aminas tiramina e triptamina e,
pelo perfil do gráfico, a resposta foi menor em relação ao padrão. Este fato pode estar
relacionado com a mudança na composição química do café verde quando este é
submetido ao processo de torração.
De acordo com MORAES & TRUGO (2001), a temperatura elevada durante a
torração desencadeia reações complexas de desidratação, hidrólise, fracionamento e
catálise, que liberam gases e formam princípios aromáticos, resultantes da
transformação dos glicosídeos e outros compostos, que formarão as características
específicas de bebida. Os produtos da torração são os açúcares caramelizados, ácido
acético, aldeídos, cetonas, furfural, ésteres, ácidos graxos, aminas, etc.
127
Figura IV.3 – Curvas de linearidade das aminas no solvente e na matriz café torrado.
Equação acima da curva refere-se ao padrão; Equação abaixo da curva refere-se ao padrão na matriz.
128
Na Figura IV.4 estão apresentados os gráficos das curvas de linearidade das
dez aminas no solvente e na matriz café solúvel. Assim como observado no café
torrado, a matriz café solúvel exerceu influência na resposta do detector para as
aminas tiramina e triptamina. Porém, nesta matriz além destas aminas, a serotonina
também apresentou divergência entre as curvas no solvente a na matriz. Semelhante
ao café torrado, as alterações foram evidenciadas acima da concentração de 3 µg/mL
sendo que, com o aumento da concentração do analito, houve um aumento no ângulo
entre as retas.
A mudança na resposta do detector para a serotonina na matriz café solúvel
pode estar relacionada com a concetração desta amina durante a produção do café
solúvel. De acordo com CLARKE (2001), no processamento do café solúvel, o extrato
do café é submetido à concentração para retirada de parte da água (40%), para facilitar
a secagem para obtenção do café solúvel. Desta forma, provavelmente, as
substâncias interferentes na detecção da serotonina estavam presentes no café torrado
em baixas quantidades e, com a concentração durante o processamento do café
solúvel, estas foram capazes de alterar a resposta do detector para a serotonina.
129
Figura IV.4 – Curvas de linearidade das aminas no solvente e na matriz café solúvel.
Equação acima da curva refere-se ao padrão; Equação abaixo da curva refere-se ao padrão na matriz.
130
Baseado nos resultados acima relatados, sugere-se que, para a determinação
das aminas tiramina e triptamina em café torrado e tiramina, serotonina e triptamina em
café solúvel as curvas analíticas sejam preparadas com padrões inseridos na matriz.
Limite de detecção e de quantificação
Os limites de detecção e quantificação do método para as matrizes de café cru,
torrado e solúvel estão apresentados nas tabelas IV.2. Os limites de detecção do
método variaram de 0,1 a 0,3 µg/mL para o café cru e 0,1 a 0,4 µg/mL para os cafés
torrado e solúvel. Já os limites de quantificação do método variaram de 0,05 a 0,10
mg/100 g para as três matrizes de café avaliadas.
Resultados semelhantes para a detecção de histamina em vinhos foram
reportados por PRESTES et al. (2007), que obtiveram limites de detecção e
quantificação de 0,25 µg/mL e 0,5 µg/mL de vinho. Limites de quantificação próximos
(0,07 a 0,14 mg/100 g) aos estabelecidos por este trabalho foram também publicados
por VALE & GLÓRIA (1997) para as dez aminas pesquisadas. Limites inferiores aos
alcançados neste processo de validação foram reportados por autores que adotaram
como critério de avaliação deste parâmetro os dados de desvio-padrão da resposta e
coeficiente angular. LAVIZZARI et al. (2006) estabeleceram limites de detecção de
0,05 µg/mL para a histamina, tiramina, serotonina, triptamina, octopamina, putrescina,
cadaverina e espermidina; 0,07 µg/mL para feniletilamina e dopamina; e 0,14 µg/mL
para espermina, utilizando amostras brancas de espinafre, nozes, banana, batata e
leite achocolatado. Em relação aos limites de quantificação, esses autores
apresentaram valores de 0,02 mg/100 mL para as aminas pesquisadas exceto para
espermina que foi de 0,04 mg/100 mL.
Os limites de detecção experimentais do método para as dez aminas foram
estabelecidos como 0,3 µg/mL para o café cru e 0,4 µg/mL para café torrado e solúvel.
Para o limite de quantificação foi estabelecido o valor de 0,1 mg/100 g para as aminas
determinadas nas três matrizes avaliadas.
131
Tabela IV.2 – Limites de detecção e de quantificação do método para matriz café
Aminas
Limites de quantificação (µg/mL) e detecção (mg/100 g)
LOD LOQ
Café cru
Putrescina 0,2 0,05
Cadaverina 0,1 0,05
Histamina 0,1 0,05
Tiramina 0,3 0,10
Serotonina 0,1 0,05
Agmatina 0,1 0,05
Espermidina 0,3 0,10
Espermina 0,1 0,05
Feniletilamina 0,1 0,05
Triptamina 0,1 0,05
Café torrado
Putrescina 0,3 0,08
Cadaverina 0,2 0,07
Histamina 0,2 0,06
Tiramina 0,2 0,06
Serotonina 0,1 0,05
Agmatina 0,2 0,08
Espermidina 0,3 0,09
Espermina 0,1 0,05
Feniletilamina 0,4 0,10
Triptamina 0,2 0,07
Café soluvel
Putrescina 0,3 0,10
Cadaverina 0,1 0,05
Histamina 0,3 0,08
Tiramina 0,4 0,10
Serotonina 0,1 0,05
Agmatina 0,1 0,05
Espermidina 0,1 0,05
Espermina
0,1
0,05
Feniletilamina 0,2 0,08
Triptamina 0,1 0,05
LOD = limite de detecção; LOQ = limite de quantificação.
Exatidão e precisão
Na Tabela IV.3 estão indicados os percentuais médios de recuperação e os
respectivos coeficientes de variação obtidos na pesquisa de dez aminas bioativas nas
matrizes café cru, torrado e solúvel. Estão indicados, em negrito e itálico, as
recuperações que não atenderam estas recomendações do CODEX (1993).
132
Tabela IV.3 – Percentuais de recuperação durante a extração de aminas bioativas das
matrizes café cru, torrado e solúvel fortificadas com 0,1; 1 e 10 mg/100 g de padrão
Aminas
% de Recuperação (% CV)
/Café
C
ru
T
orrado
S
olúvel
Putrescina
0,1 mg/100 g 81 (13) 88 (9) 86 (11)
1 mg/100 g 104 (4) 110 (9) 98 (15)
10 mg/100 g 103 (6) 81 (11) 81 (14)
Cadaverina
0,1 mg/100 g 80 (4) 80 (4) 81 (11)
1 mg/100 g 95 (5) 95 (5) 97 (5)
10 mg/100 g 109 (10) 105 (3) 87 (2)
Histamina
0,1 mg/100 g 80 (2) 81 (5) 82 (4)
1 mg/100 g 80 (14) 89 (2) 80 (5)
10 mg/100 g 82 (2) 80 (3) 88 (1)
Tiramina
0,1 mg/100 g 81 (2) 80 (9) 80 (9)
1 mg/100 g 87 (4) 81 (2) 110 (4)
10 mg/100 g 106 (15) 89 (4) 84 (4)
Serotonina
0,1 mg/100 g 78 (3) 80 (6) 85 (10)
1 mg/100 g 80 (10) 88 (13) 86 (2)
10 mg/100 g 91 (2) 84 (5) 93 (4)
Agmatina
0,1 mg/100 g 80 (5) 93 (7) 97 (14)
1 mg/100 g 105 (2) 110 (3) 103 (2)
10 mg/100 g 102 (8) 105 (13) 94 (2)
Espermidina
0,1 mg/100 g 89 (4) 102 (9) 100 (8)
1 mg/100 g 91 (2) 80 (5) 93 (2)
10 mg/100 g 98 (15) 110 (13) 80 (13)
Espermina
0,1 mg/100 g 86 (6) 80 (7) 84 (15)
1 mg/100 g 80 (8) 81 (6) 93 (2)
10 mg/100 g 84 (4) 83 (5) 80 (13)
Feniletilamina
0,1 mg/100 g 77 (7) 83 (12) 66 (7)
1mg/100 g 75 (2) 80 (12) 88 (13)
10 mg/100 g 84 (4) 81 (12) 82 (11)
Triptamina
0,1 mg/100 g 61 (13) 59 (2) 52 (14)
1 mg/100 g 79 (13) 74 (2) 80 (12)
10 mg/100 g 78 (7) 80 (3) 87 (7)
Média Geral
0,1 mg/100 g
79
83 81
1 mg/100 g 88 89 93
10 mg/100 g 94 90 85
133
De acordo com o CODEX (1993), para métodos quantitativos e concentrações
do analito maiores que 0,01 mg/100 g, a faixa de recuperação deve estar entre 80 a
110% com coeficiente de variação de no máximo 15%. Considerando estas
recomendações verifica-se que as aminas serotonina, feniletilamina e triptamina, para
algumas concentrações e tipos de matriz café, não atenderam esta especificação.
As médias de recuperação durante a extração alcançadas para as amostras
adicionadas de 0,1 mg/100 g variaram de 61 a 89% para o café cru, de 59 a 102% para
o café torrado e de 52 a 100% para o café solúvel. Para amostras fortificadas com 1
mg/100 g, as porcentagens de recuperação foram 75 a 105% (café cru), 74 a 110%
(café torrado) e 77 a 103% (café solúvel). Amostras fortificadas com 10 mg/100 g
apresentaram recuperações de 78 a 109%, 80 a 110% e 80 a 94%, para as matrizes de
café cru, torrado e solúvel, respectivamente.
Avaliando as recuperações médias de cada amina nas diferentes matrizes, com
base nas recomendações do CODEX (1994) observa-se que no café cru, seis das dez
aminas determinadas apresentaram percentual de recuperação entre 80 e 115%, nos
três níveis de adição. Para a serotonina, feniletilamina e triptamina recuperações
médias inferiores a 80% foram observadas na faixa de 0,1 mg/100 g. A triptamina
apresentou médias de recuperação abaixo de 80% em todos os níveis de fortificação
estudados.
Médias de recuperação aceitáveis foram atingidas na faixa de 0,1 a 10 mg/110 g
para a putrescina, cadaverina, histamina, tiramina, serotonina, agmatina, espermidina,
espermina e feniletilamina na matriz café torrado. Somente a triptamina apresentou
médias de recuperação abaixo do recomendado pelo CODEX (1993) na faixa de 0,1
mg/100 g (59%) e 1 mg/100 g (74%).
No café solúvel, as médias de recuperação foram satisfatórias para todas as
aminas na faixa de 1 a 10 mg/100 g. Porém, na faixa de 0,1 mg/100 g, baixas
porcentagens de recuperação foram alcançadas para feniletilamina (66%) e triptamina
(52%).
A precisão do método alcançou resultados satisfatórios para todas as dez
aminas na faixa de 0,1 a 10 mg/100 g. Os coeficientes de variação dos resultados
obtidos nos estudos de recuperação variaram de 2 a 15% para o café cru, 2 a 13%
para o torrado e 2 a 15% para o café solúvel.
Considerando os resultados acima relatados, o método avaliado pode ser
considerado preciso na faixa de 0,1 a 10 mg/100 g para a determinação das dez
134
aminas pesquisadas (putrescina, cadaverina, histamina, tiramina, serotonina, agmatina,
espermidina, espermina, feniletilamina e triptamina) em amostras de café. Porém,
nesta mesma faixa o método avaliado apresentou exatidão satisfatória apenas para
putrescina, cadaverina, histamina, tiramina, agmatina, espermidina e espermina.
Entretanto, o método foi considerado validado pois, de acordo com BRITO et al. (2003),
um método pode ser considerado validado mesmo que alguns parâmetros não se
enquadrem nos limites estabelecidos pela literatura. Porém os mesmos devem ser
conhecidos e adequados aos objetivos do estudo a ser realizado.
IV.4 CONCLUSÕES
O método CLAE-par iônico, derivação pós-coluna com OPA e detecção
fluorimétrica foi validado e apresentou boa seletividade e precisão para determinação
das aminas putrescina, cadaverina, histamina, tiramina, serotonina, agmatina,
espermidina, espermina, feniletilamina e triptamina em amostras de café. A exatidão
do método foi satisfatória apenas para putrescina, cadaverina, histamina, tiramina,
agmatina, espermidina e espermina.
O tipo da matriz café afetou a linearidade da curva analítica. Desta forma, para a
pesquisa das dez aminas nas diferentes matrizes de café, a curva analítica usada para
cálculo dos teores de aminas livres deve ser construída em solvente para análise de
café cru e na própria matriz para análise de café torrado e solúvel.
135
CAPÍTULO V. INFLUÊNCIA DO PROCESSAMENTO DO CAFÉ
SOLÚVEL NOS TEORES DE AMINAS BIOATIVAS LIVRES E
CONJUGADAS
RESUMO
Amostras de café foram coletas em quatro pontos diferentes da linha de
produção do café solúvel em uma indústria em três dias diferentes, não consecutivos, e
analisadas quanto ao pH, teor de umidade e de cafeína, atividade de água,
características de cor (CIE L*a*b*) e dez aminas bioativas livres e conjugadas. Dentre
as dez aminas livres pesquisadas, foram detectadas a tiramina, agmatina, espermidina
e espermina. Os teores totais de aminas variaram de 0,23 a 2,42 mg/100 g. O
processamento influenciou significativamente os teores das aminas bioativas livres e
conjugadas no café. As aminas conjugadas ácido solúveis e insolúveis foram
detectadas apenas no café cru. A putrescina conjugada ácido solúvel foi detectada no
café torrado, porém em baixos teores. No café solúvel não foram encontradas aminas
conjugadas. Os teores de umidade variaram com valores de 11,20 g/100 g para o café
cru, de 2,61 para o café torrado, 60,15 no extrato concentrado e 4,12 g/100 g para o
café solúvel. O teor de cafeína variou de 2,2 a 4,0 g/100 g. A atividade de água variou
de 0,69 no início do processamento a 0,20 no final. Os parâmetros de luminosidade
(L*) alteraram durante o processamento, evidenciando a influência do mesmo na cor do
café solúvel. Não foram observadas diferenças significativas nas características físico-
químicas entre os três lotes avaliados indicando padronização do processo tecnológico.
Palavras-chave: aminas bioativas livres, aminas conjugadas, processamento, café
solúvel.
136
V.1 INTRODUÇÃO
O café é uma das bebidas mais consumidas em todo mundo e é apreciada tanto
pelo sabor e aroma, como também por seu efeito estimulante. O café solúvel é o
produto resultante da desidratação do extrato aquoso obtido exclusivamente do café
torrado, utilizando água como único extrator (BRASIL, 2005). O consumo do café
solúvel vem aumentando nos últimos anos devido às vantagens desta bebida como
facilidade de preparo e conveniência por apresentar vida de prateleira longa (ICO,
2006).
O processo de produção do café solúvel envolve as etapas de seleção dos
grãos, torração, extração e concentração do extrato, finalizando com a desidratação
para obtenção do produto solúvel (SMITH, 1989). Durante o processamento, os grãos
são torrados, moídos e submetidos à extração sob pressão em altas temperaturas (180
ºC). O extrato é então desidratado em vaporizadores ou liofilizadores originando o café
solúvel em pó ou granulado. A composição do café solúvel dependerá, além das
condições do processamento, das espécies e variedades de café utilizadas nos blends
(NOGUEIRA & TRUGO, 2003).
Dentre os muitos compostos biologicamente ativos presentes no café estão as
aminas bioativas. As aminas são compostos orgânicos que podem estar naturalmente
presentes nos alimentos ou serem formadas pela atividade enzimática da microbiota
acompanhante, sendo classificadas como poliaminas e aminas biogênicas. As
poliaminas espermidina e espermina estão amplamente distribuídas na natureza, estão
presentes em elevadas concentrações nas células e têm seu conteúdo aumentado em
tecidos com altas taxas de crescimento. Desempenham importantes funções nos
processos de crescimento, renovação e metabolismo das células vivas (BARDÓCZ,
1995; SILLA SANTOS, 1996, LIMA & GLÓRIA, 1999, KALAC & KRAUSOVÁ, 2005).
Nos vegetais, além das funções acima citadas, as poliaminas participam da floração e
desenvolvimento do fruto, da resposta ao estresse e inibem a produção de etileno e a
senescência (FLORES et al., 1989; SIMON-SARKADI et al., 1994, GLÓRIA, 2003).
As aminas biogênicas cadaverina, tiramina, histamina, serotonina, agmatina,
feniletilamina e triptamina também podem estar naturalmente presentes nos alimentos
ou serem formadas pela descarboxilação de aminoácidos por enzimas microbianas ou
por decomposição térmica (HALÁSZ et al., 1994; GLÓRIA, 2005; ÖNAL, 2007). A
137
presença de histamina e serotonina em vegetais confere proteção ao tecido vegetal
contra insetos e predadores (GLÓRIA, 2003).
Os relatos sobre a presença de aminas bioativas em café citam a predominância
das poliaminas. AMORIM et al. (1977) e CIRILO et al. (2003) detectaram as aminas
putrescina, espermidina e espermina em amostras de café verde, sendo que CIRILO et
al. (2003) também detectaram serotonina. CASAL et al. (2004) detectaram além das
aminas já citadas, cadaverina e tiramina. Porém OLIVEIRA et al. (2005) ao
investigarem a presença de aminas em cafés de alta e baixa qualidade encontraram a
histamina e triptamina em amostras de café classificados como rio, que são
considerados de baixa qualidade.
Alguns autores avaliaram aminas em café torrado e verificaram que a torração
alterou o perfil e teores de algumas aminas (AMORIM et al., 1977; CIRILO et al., 2003;
OLIVEIRA et al., 2005). Estudos realizados por SILVEIRA et al. (2007 a) evidenciaram
a presença das poliaminas putrescina, espermidina e espermina em amostras de café
solúvel. Mas, além destas aminas, foram encontradas também a serotonina, tiramina,
cadaverina, histamina e feniletilamina.
O perfil e os teores de aminas bioativas em um determinado produto alimentício
irão depender da espécie vegetal, das condições de cultivo, do processamento e ainda
das condições higiênico-sanitárias durante o processamento e armazenamento. Assim
sendo, as aminas poderiam ser utilizadas como parâmetro de qualidade, refletindo a
má qualidade das matérias-primas utilizadas ou as condições higiênicas durante o
processo de fabricação (DONHAUSER, 1993; LIMA & GLÓRIA, 1999, MARTINEZ-
VILLALUENGA, 2008). A presença de histamina e triptamina no café tem sido
associada a baixa qualidade do mesmo (OLIVEIRA et al., 2005; VASCONCELOS et al.,
2007).
Diante da importância que o café solúvel vem assumindo na economia brasileira,
e dos poucos relatos na literatura sobre a composição química do mesmo, o presente
trabalho teve como objetivo investigar os tipos e teores de aminas bioativas no café
solúvel, avaliar a influência das etapas do processamento no perfil e teores das
aminas, bem como determinar as características físico-químicas como pH, umidade,
atividade de água, teor de cafeína e características de cor do café solúvel.
138
V.2 MATERIAL E MÉTODOS
V.2.1 MATERIAL
V.2.1.1 Amostra
Para a execução deste trabalho, amostras de café foram coletadas durante o
processamento do café solúvel em quatro pontos da linha de produção, em três dias
distintos de coleta. De acordo com a Figura V.1, foram analisadas as amostras de café
cru, café torrado, extrato concentrado de café e café solúvel. As amostras foram
coletadas na Companhia Iguaçu de café solúvel, localizada no município de Cornélio
Procópio, PR.
Figura V.1 – Fluxograma da produção de café solúvel com indicação dos pontos de
coleta das amostras.
Mistura
“Blend”
Torrefação
Moagem
Extração
Concentração
Aglomeração
Envase
Secagem por spray-dryer
Café crú
Café torrado
Extrato concentrado
Café solúvel
139
V.2.1.2 Reagentes
Os reagentes utilizados possuíam grau analítico, exceto o solvente usado no
CLAE (acetonitrila), que era de grau cromatográfico. Todas as soluções foram
preparadas com água ultrapura obtida do Sistema Milli-Q Plus (Millipore Corp., Milford,
MA, EUA). Os padrões de aminas bioativas (diidrocloreto de putrescina - PUT,
diidrocloreto de cadaverina - CAD, diidrocloreto de histamina - HIM, hidrocloreto de
tiramina - TIM, tetraidrocloreto de espermina - EPM, triidrocloreto de espermidina –
EPD, complexo sulfato creatinina agmatina - AGM, hidrocloreto de 2-feniletilamina -
FEM, hidrocloreto de 5-hidroxitriptamina ou serotonina – SRT), foram adquiridos da
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). As fases móveis foram filtradas em
membrana (47 mm de diâmetro e 0,45 m de poro, Millipore Corp., Milford, MA, EUA)
dos tipos HAWP e HVWP para reagentes aquosos e solventes orgânicos,
respectivamente.
V.2.2 MÉTODOS DE ANALISE
As amostras de café coletadas na indústria foram submetidas às análises de pH,
cor, umidade, atividade de água e determinação dos teores de aminas bioativas livres e
conjugadas. Todas as análises foram executadas em triplicata.
V.2.2.1 Determinação do pH
O pH das amostras de café foi determinado por medida direta em pHmetro digital
(DM20 Digimed, Santo Amaro, SP, Brasil) previamente calibrado com soluções tampão
de pH 4,0 e 7,0 à temperatura ambiente. O café solúvel (2 g) foi reconstituído em 100
ml de água (IAL, 2004).
V.2.2.2 Determinação das características de cor
As características de cor foram determinadas usando o colorimetro ColorTec
PCM (Accuracy Microsensor, Pittsford, EUA). Foram efetuadas medidas dos
parâmetros L*, a*, b* e cálculo dos valores de croma [c = (a
2
+ b
2
)
1/2
] e tonalidade [h =
arctg a/b] em triplicata. Os valores c e h foram confirmados empregando-se o software
Colorpro (COLORPRO, 2004).
140
V.2.2.3 Determinação do teor de umidade
O teor de água do café torrado e solúvel foi determinado pelo método de Karl
Fisher segundo metodologia descrita pelo Instituto Adolfo Lutz (IAL, 2004), utilizando
titulador de Karl Fisher, marca Analyser, modelo KF-1000, Analyser Comércio e
Indústria Ltda, São Paulo, SP, Brasil.
O teor de umidade do café crú foi determinado pelo método de secagem em
estufa a 105 ± 2 ºC até peso constante (IAL, 2004).
V.2.2.4 Determinação da atividade de água
A atividade de água foi determinada por leitura direta no equipamento da marca
Testo, modelo 400, Testo do Brasil Instrumentos de Medição Ltda, Campinas, SP,
Brasil.
V.2.2.5 Determinação do teor de cafeína
O teor de cafeína das amostras de café foi determinado pelo método
espectrofotométrico segundo metodologia descrita por IAL (2004).
V.2.2.6 SEPARAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE AMINAS BIOATIVAS POR CLAE-
PAR IÔNICO
As aminas foram extraídas da matriz café conforme a metodologia otimizada
descrita no capítulo I. Os grãos de café verde e torrado foram triturados e separados
por peneiras, sendo as partículas retidas na peneira de 20 mesh.
Foram adicionados 10 mL de TCA 5% a 5 g da amostra (café cru, torrado,
extrato e solúvel). Em seguida foram agitados em mesa agitadora por 10 minutos,
centrifugadas a 11.180 g a 4 °C por 21 minutos e filtradas em papel de filtro qualitativo.
A extração foi repetida mais duas vezes, com adição de 2 X 10 mL de TCA 5%; os
extratos foram combinados e o volume final anotado.
Os extratos foram filtrados em membrana HAWP de 13 mm de diâmetro e 0,45
µm de tamanho do poro (Millipore Corp. Milford, MA, EUA). As aminas foram
determinadas por CLAE-par iônico, derivação pós-coluna com OPA, conforme
metodologia descrita por CIRILO et al. (2003).
A análise cromatográfica foi efetuada em um cromatógrafo líquido de alta
eficiência Shimadzu, modelo LC-10 AD, com câmara de mistura a baixa pressão;
141
conjunto de lavagem automática de pistão; injetor automático Shimadzu modelo SIL –
10 ADVP conectado a um detector espectrofluorimétrico modelo RF-10 AXL a 340 nm
de excitação e 445 nm de emissão e um controlador CBM-20 A (Shimadzu, Kyoto,
Japão) conectada a um computador. O sistema de derivação pós-coluna foi montado
com uma câmara de mistura (volume morto igual a zero) instalada entre a saída da
coluna e o detector; um tubo de teflon, protegido da luz, de 2 m de comprimento e 0,25
de diâmetro conectado entre a câmara de mistura e o detector e a bomba LC-10 AD
(Shimadzu, Kyoto, Japão).
Foi utilizada uma coluna µBondapak C18 em fase reversa 3,9 x 300 mm, 10 µm
e pré-coluna µBondapak C18 (Waters, Milford, MA, EUA) e sistema gradiente de
eluição em ambiente com temperatura controlada (20 ± 1 ºC). As fases móveis foram:
A - solução 0,2 M de acetato de sódio e 15 mM de octanosulfonato de sódio, pH 4,9
ajustado com ácido acético, B - acetonitrila. O fluxo de análise foi de 0,8 mL/min.
O reagente de derivação consistiu de 0,2 g de OPA dissolvido em 3 mL de
metanol e 500 mL de uma solução de 25 g de ácido bórico e 22 g de KOH (pH 10,5),
1,5 mL de Brij-35 e 1,5 mL de mercaptanol. A solução derivante foi preparada
diariamente, mantida ao abrigo da luz e bombeada à câmara de mistura a um fluxo de
0,4 mL/min.
A identificação das aminas foi feita por comparação do tempo de retenção das
aminas na amostra em relação ao padrão e também pela adição de solução da amina
suspeita à amostra. O cálculo da concentração das aminas foi feito por interpolação
nas respectivas curvas analíticas.
V.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos durante a execução do experimento foram submetidos à
análise de variância (média, desvio padrão e coeficiente de variação) - ANOVA, e as
médias foram comparadas pelo teste de Duncan a 5% de significância utilizando-se o
programa estatístico SIGMA STAT versão 2.0.
142
V.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
V.3.1 Influência do processamento no perfil e teores de aminas bioativas livres
Das dez aminas pesquisadas, sete foram encontradas nas amostras de café cru,
torrado e solúvel analisadas, dentre elas, putrescina, tiramina, serotonina, agmatina,
espermidina, espermina e triptamina. Nenhuma das aminas estava presente em todas
as amostras analisadas. A putrescina e a triptamina foram encontradas apenas no café
cru correspondendo a 25% das amostras analisadas, já as demais aminas apareceram
em 75% das amostras.
A presença de aminas bioativas livres em café já havia sido relatada na
literatura. Algumas aminas encontradas neste estudo foram relatadas por diferentes
autores em amostras de café verde (AMORIM et al. 1977; CIRILO et al, 2003; CASAL
et al., 2004), torrado (CIRILO et al, 2003; CASAL et al., 2005) e solúvel (SILVEIRA et
al., 2007a).
Os teores médios encontrados nos três lotes avaliados de cada amostra de café
coletada em diferentes etapas do processamento do café solúvel estão indicados na
Tabela V.1.
Tabela V.I – Teores médios de aminas bioativas livres em amostras coletadas em
diferentes pontos do processamento do café solúvel
Café
Teores de aminas bioativas livres
em
mg/100 g * (% CV)
PUT TIM SRT AGM SPD SPM TRM TOTAIS
Crú 1,00 (31) 0,34 (18) a
0,49 (17) a
nd 0,37 (18) a
0,15 (17) b
0,07 (18) 2,42 (16) a
Torrado nd nd 0,11 (8) b 0,13 (26) nd nd nd 0,23 (15) c
Extrato nd 0,30 (28) a
0,11 (16) b
0,17 (10) 0,12 (35) b
0,19 (16) b
nd 0,88 (21) b
Solúvel nd 0,19 (20) b
nd 0,18 (25) 0,17 (18) b
0,31 (27) a
nd 0,85 (23) b
nd = não detectado (limite de detecção 0,04 mg/100 g). PUT = putrescina; TIM = tiramina; SRT = serotonina; AGM =
agmatina; SPD = espermidina; SPM = espermina; TRM = triptamina
* Valores expressos em base seca
Valores médios com letras diferentes (a-b) na mesma coluna para cada tipo de café são estatisticamente diferentes.
Teste de Duncan (p<0,05).
Observa-se que uma maior quantidade de aminas livres foi detectada no café
cru, seguido do extrato, café solúvel e torrado. Os teores totais médios de aminas
143
variaram de 2,42 mg/100 g no café cru, 0,23 mg/100 g no café torrado, 0,88 mg/100 g
no extrato concentrado de café e 0,85 mg/100 g no café solúvel.
A contribuição percentual de cada uma das aminas ao teor total encontrado para
as amostras das diferentes etapas do processamento está indicada na Figura V.2. No
café cru a putrescina foi predominante contribuindo com 41%, seguida da serotonina
(20%), espermidina (15%), tiramina (14%), espermina (6%) e triptamina (3%). Uma
maior contribuição da putrescina ao teor total de aminas foi relatada na maioria dos
estudos sobre café cru (AMORIM et al., 1977; CIRILO et al., 2003; CASAL et al., 2004;
CASAL et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2005; VASCONCELOS et al., 2006; SILVEIRA et
al. (2007b). Outros estudos com amostras de origem vegetal como banana (ADÃO &
GLÓRIA, 2005), molho de tomate (CHIACCHIERINI et al., 2006) e suco de laranja
(VIEIRA et al., 2006), também apontaram a putrescina contribuindo em maiores
percentuais. Acredita-se que pelo fato da putrescina ser um intermediário obrigatório
na síntese das poliaminas, espermidina e espermina, esta se apresente em maiores
proporções.
Figura V.2 – Contribuição de cada amina ao teor total nas amostras de café coletadas
em diferentes pontos do processamento do café solúvel. PUT = putrescina; TIM = tiramina;
SRT = serotonina; AGM = agmatina; SPD = espermidina; SPM = espermina; TRM = triptamina
Nas amostras de café torrado foram encontradas apenas a agmatina e a
serotonina com contribuições de 54 e 46%, respectivamente. No extrato de café e no
café solúvel a maior contribuição foi da tiramina (34 – 22%), seguida da espermina (13
144
– 20%), agmatina (19 – 21%), e espermina (21 – 37%). A serotonina contribuiu com
13% no extrato de café e não foi detectada nas amostras de café solúvel.
A influência do processamento no perfil e teores das aminas bioativas nas
amostras de café cru, café torrado, extrato concentrado do café e no café solúvel está
demonstrado na Figura V.3. Observou-se que a etapa de torração alterou
significativamente os teores de algumas aminas. As aminas putrescina, tiramina,
espermidina, espermina e triptamina tiveram seus teores reduzidos ao ponto de não
serem detectadas após a torração. Diminuições nos teores de aminas durante a
torração do café também foram relatados por AMORIM et al. (1977), CIRILO et al.
(2003), OLIVEIRA et al. (2005), CASAL et al. (2005), VASCONCELOS et al. (2006) e
SILVEIRA et al. (2007 b). De acordo com estes autores, a taxa de redução nos teores
das aminas está diretamente relacionada com o binômio tempo e temperatura de
torração. CASAL et al. (2005) relataram 100% de redução nos teores de putrescina,
espermidina e espermina em café submetido à torração a 240 ºC por 15 minutos.
Figura V.3 – Aminas bioativas livres detectadas nas amostras de café coletadas em
diferentes pontos do processamento do café solúvel. PUT = putrescina; TIM = tiramina; SRT =
serotonina; AGM = agmatina; SPD = espermidina; SPM = espermina; TRM = triptamina
O teor de serotonina foi reduzido em 80% após a torração. Dados similares
foram encontrados por VASCONCELOS et al. (2006) que evidenciaram uma
diminuição de 100% em amostras de grãos café defeituosos quando estes foram
145
submetidos a torração a 200 ºC por 30 minutos. Por outro lado, CIRILO et al. (2003)
observaram uma diminuição nos teores de serotonina após 6 minutos de torração à
300 ºC e subseqüente aumento após 12 minutos. Alguns autores reportaram que pode
haver um aumento dos teores de serotonina durante processos térmicos devido à
descarboxilação do 5-hidroxitriptofano (NAGATSU, 1991).
A agmatina foi detectada nas amostras de café somente após a torração,
sugerindo que esta amina tenha sido formada durante a torração. Estes resultados
estão de acordo com CIRILO et al. (2003) que evidenciaram a formação da agmatina
durante a torração do café a 300 ºC por 12 minutos. Segundo GLÓRIA (2005), a
agmatina pode ser formada pela descarboxilação do aminoácido arginina ou ainda por
decomposição térmica deste aminoácido. FELDMAN et al. (1969), ao avaliarem a
influência de compostos não voláteis no flavor do café evidenciaram a presença de
arginina em café verde (2,28 a 4,72 g/100 g) e que seus teores diminuíram durante a
torração. Este fato reforça a hipótese da formação da agmatina durante a torração do
café.
Após a torração, o café é moído e submetido á extração e concentração
consecutiva. O teor total de aminas no extrato de café foi significativamente maior (p
0,05) em relação ao café torrado. No extrato concentrado do café foi encontrado um
maior número de aminas em relação ao café torrado. Este fato pode ser explicado pela
concentração do extrato, o que fez com que algumas aminas que estavam presentes
no café torrado em níveis não detectáveis pelo método de análise empregado,
puderam ser detectadas no extrato após a sua concentração. Para as aminas
serotonina e agmatina, que já haviam sido detectadas no café torrado, não foi
observado um aumento significativo em seus teores após a concentração do extrato.
No café solúvel foram detectadas as aminas tiramina, agmatina, espermidina e
espermina (Tabela V.I). Os teores encontrados foram de 0,19 mg/100 g para tiramina,
0,18 mg/100 g para agmatina, 0,17 mg/100 g para espermidina e 0,31 mg/100 g para
espermina. Embora o teor total de aminas no café solúvel não tenha sido
significativamente diferente, observou-se uma redução nos teores da tiramina e
serotonina em relação aos teores encontrados no extrato concentrado, sendo que a
serotonina não foi detectada. Este fato pode estar relacionado a uma perda destas
aminas durante o processo de secagem do extrato concentrado que pode ser
conduzido a elevadas temperaturas (± 100 ºC) na secagem por asperção.
146
Avaliando o perfil e teores de aminas bioativas livres presentes no café solúvel
produzido a partir de blends elaborados utilizando-se 100% de café da espécie Coffea
canephora var. robusta, observa-se que o café solúvel foi caracterizado pela presença
das aminas espermidina, espermina, tiramina e agmatina. Comparando estes
resultados com os dados relatados no capítulo I deste trabalho, observa-se que as
amostras de café solúvel coletadas no mercado apresentaram perfil de aminas
bioativas livres diferentes. Além das aminas acima citadas foram encontradas nas
amostras de café solúvel coletadas no mercado consumidor a putrescina, serotonina,
cadaverina, histamina e feniletilamina.
De acordo com NOGUEIRA & TRUGO (2003) um dos fatores que inflenciam na
composição final do café solúvel é o café utilizado na elaboração dos blends. Desta
forma, a diferença no perfil de aminas bioativas encontrada nas amostras de café
solúvel analisadas, pode estar relacionada com a utilização de diferentes espécies de
café na formação dos blends, bem como a presença de grãos de café defeituosos e de
baixa qualidade, visto que alguns autores têm relatado a presença da histamina em
grãos defeituosos de café (OLIVEIRA et al., 2005; VASCONCELOS et al., 2007).
Considerando que o perfil de aminas foi diferente para o café solúvel elaborado
com 100% de café robusta, mais estudos são necessários para verificar a origem das
aminas detectadas nas amostras de café solúvel analisadas no capítulo I. Assim a
análise de aminas poderia ser utilizada como parâmetro de verificação da qualidade do
café solúvel.
V.3.2 Influência do processamento no perfil e teores de aminas bioativas
conjugadas
V.3.2.1 Perfil e teores de aminas ácido solúveis
O perfil e teores das aminas conjugadas ácido solúveis detectadas nos cafés
(cru, torrado, extrato e solúvel) (n = 3) coletados em diferentes etapas do
processamento do café solúvel estão indicados na Tabela V.2. Foram encontradas nas
amostras de café cru as aminas conjugadas ácido solúveis putrescina, espermidina e
espermina. Os teores totais variaram de 0,10 a 1,00 mg/100 g. A presença destas
aminas em amostras de café já havia sido reportada por CASAL et al. (2004). Além
147
destas aminas estes autores encontraram a cadaverina, serotonina e tiramina ácido
solúveis em concentrações que variaram de 0,02 a 0,37 mg/100 g de café.
Tabela V.2 – Perfil e teores de aminas conjugadas ácido solúveis em amostras
coletados durante o processamento do café solúvel
Tipos de
café
Teores de aminas conjugadas ácido solúveis mg/100 g * (% CV)
PUT SPD SPM TOTAIS
Crú 0,56 (43) a 0,19 (38) a 0,25 (18) a 1,00 (30) a
Torrado 0,10 (10) b nd b Nd b 0,10 (10) b
* Valores expressos em base seca. CV = coeficiente de variação; PUT = putrescina; SPD = espermidina;
SPM = espermina.
No café torrado, apenas a putrescina ácido solúvel foi detectada em teor médio
de 0,10 mg/100 g de café. A amina ácido solúvel predominante no café cru foi a
putrescina, contribuindo com 56% em relação ao teor total de aminas ácido solúveis. A
espermina, segunda amina que mais contribuiu (25%), foi seguida da espermidina
(19%) (Figura V.4).
Figura V.4 – Contribuição de cada amina ácido solúvel ao teor total destas aminas.
148
Estes resultados são semelhantes aos reportados por CASAL et al. (2005) que
evidenciaram uma predominância da putrescina ácido solúvel em amostras de café cru.
Porém discordam de CASAL et al. (2004) que observaram uma maior predominância
da espermina ácido solúvel em café cru. Relatos sobre a presença de aminas
conjugadas ácido solúveis em amostras de origem vegetal tem sido encontrados na
literatura, com predominância das poliaminas putrescina, espermidina e espermina
(ARMAS et al., 1999; RODRIGUEZ et al., 2000; FONTANIELLA et al., 2001; TASSOMI
et al., 2004).
O processamento influenciou de forma significativa os teores de aminas
conjugadas ácido solúveis presentes nas amostras de café cru coletadas no início do
processamento. Na Figura V.5, observa-se que no café cru foram encontradas as
aminas ácido solúveis putrescina, espermidina e espermina. Porém, após a torração, a
espermidina e a espermina não foram detectadas, indicando uma degradação das
mesmas. Nas amostras de café após a torração apenas a putrescina foi encontrada
mas em teores menores aos quantificados no café antes da torração. Foi observada
uma redução de 82% nos teores da putrescina ácido solúvel após a torração.
Figura V.5 – Comportamento das aminas ácido solúveis frente as diferentes etapas do
processamento do café solúvel.
Resultados semelhantes foram relatados por CASAL et al. (2005) que, ao
estudarem o efeito da torração no perfil e teores de aminas conjugadas no café,
evidenciaram uma diminuição significativa nos teores das aminas putrescina,
149
espermidina e espermina no café torrado. Estes autores ainda concluíram que a
degradação era maior quanto maior o tempo e a temperatura de torração.
V.3.2.1 Perfil e teores de aminas ácido insolúveis
Na Tabela V.3 estão demonstrados os teores médios das aminas
conjugadas ácido insolúveis encontrados nas amostras de café obtidas de diferentes
pontos do processamento do café solúvel. Semelhante às aminas ácido solúveis,
apenas as poliaminas putrescina, espermidina e espermina ácido insolúveis foram
detectadas e somente nas amostras de café cru coletadas no início do processamento.
O teor total foi de 1,20 mg/100 g.
Diferente ao observado para as aminas ácido solúveis, a amina predominante
entre as ácido insolúveis detectadas foi a espermina. A contribuição de cada amina ao
teor total das aminas ácido insolúveis está indicada na Figura V.6. Como dito
anteriormente, a espermina foi a amina predominante com 65%, seguida da putrescina
com 19%, e da espermidina 16%. Estes resultados estão de acordo com CASAL et al.
(2004) e (2005) que reportaram a predominância da espermina ácido insolúvel em
amostras de café cru.
Tabela V.3 - Teores de aminas ácido insolúveis em amostras coletadas durante o
processamento do café solúvel
Aminas
Teores em mg/100 g * (% CV)/ Café
CRU
PUT 0,23 (16)
SPD 0,19 (12)
SPM 0,78 (7)
TOTAIS
1,20 (11)
* Valores expressos em base seca. CV = coeficiente de variação. PUT = putrescina; SPD = espermidina;
SPM = espermina. DP = desvio padrão.
Da mesma forma que o processamento alterou os teores de aminas ácido
solúveis presentes no café, este alterou também as aminas ácido insolúveis (Figura
V.7). As aminas ácido insolúveis só foram detectadas nas amostras de café cru
coletadas na etapa de mistura. Após a torração, as aminas ácido insolúveis não foram
150
detectadas, reforçando desta forma, as evidências da instabilidade destas aminas
frente ao processamento térmico.
Figura V.6 – Contriuição de cada amina ácido insolúvel ao teor total destas aminas.
Figura V.7 - Comportamento das aminas ácido insolúveis frente as diferentes etapas
do processamento do café solúvel.
Considerando os dados acima relatados sobre o perfil e teores das aminas
bioativas livres e conjugadas no café cru, observa-se que as aminas putrescina,
espermidina e espermina estavam presentes tanto na forma livre quanto na conjugada.
151
A espermidina estava presente em maior concentração na sua forma livre, enquanto
que a espermina foi predominante na forma conjugada. Alguns estudos sobre o perfil
de aminas livres no café demonstraram a predominância da espermidina em relação à
espermina (CIRILO et al. 2003; CASAL et al., 2005; VASCONCELOS et al., 2007).
Desta forma os resultados acima reforçam a hipótese levantada por CASAL et al.
(2005) que sugeriram que a forma predominante da espermina no café seja a
conjugada.
V.3.3 Características físico-químicas
V.3.3.1 pH, umidade, atividade de água e teores de cafeína
Os resultados obtidos com relação aos parâmetros físico-químicos determinados
nas amostras de café coletadas durante o processamento do café solúvel estão
apresentados na Tabela V.4. Os coeficientes de variação dos resultados obtidos nas
análises dos três lotes coletados foram baixos ( 20%), evidenciando uma
padronização e controle efetivo do processo tecnológico.
Tabela V.4 – Características físico-químicas de amostras de café coletadas durante o
processamento do café solúvel
Café Parâmetros/ Valores médios (% CV)
pH
Umidade %
m/m
Atividade de
água
Cafeína %
m/m*
Cru nd 11,20 (5) b 0,68 (2) a 2,20 (20) b
Torrado
nd 2,61 (20) d 0,60 (2) a 2,67(11) b
Extrato
4,83 (1) 60,15 (1) a nd 2,60 (8) b
Solúvel
4,83 (1) 4,12 (1) c 0,22 (4) b 4,00 (7) a
nd = não determinado.
* Valores referentes a apenas uma determinação.
O café solúvel avaliado apresentou % de água média de 4,12 g/100 g. Estes
valores estão de acordo com a legislação vigente a RDC Nº 277 de 22 de setembro de
2005 (BRASIL, 2005), que estabelece a umidade do café solúvel em no máximo 5%.
152
A umidade média do café cru foi de 11,20 g/100 g, do café torrado de 2,61 g/100
g, 60,15 g/100 g para o extrato concentrado e 4,12 g/100 g para o café solúvel. O
percentual de umidade encontrado nas amostras de café cru coincide com os
comumente reportados na literatura (CLARKE, 1989; FRANÇA et al., 2005;
VASCONCELOS et al., 2007) que variaram de 8,5 a 13 g/100 g. Após a torração, o
café apresentou uma redução no teor de umidade, o que era esperado devido à perda
de massa dos grãos do café durante a torração. Os resultados de umidade do café
torrado encontrados neste trabalho concordam com BELETZ & GROSH (1997).
Segundo estes autores, a umidade dos grãos de café pode variar de 1,5 a 3,5 g/100 g.
Em relação à atividade de água das amostras de café observou-se que houve
uma redução na atividade de água durante o processamento do café solúvel, sendo
que, ao final do processamento, o café apresentou os menores teores de atividade de
água, entre 0,20 a 0,23. Valores de atividade de água baixos são requeridos para o
café solúvel, devido a influência da atividade de água nas características sensoriais do
produto. Segundo ALVES & BORDIN (1998), alterações visuais no café solúvel, como
aglomeração leve, foram evidenciadas com atividade de água de 0,43, aglomeração
forte com Aw entre 0,51 a 0,63 e princípio de dissolvição com Aw a partir de 0,67.
Não foi observado diferença significativa nos valores de pH entre as amostras
analisadas. O valor médio do pH foi de 4,83 para o café coletado após a extração e
concentração e para o café solúvel.
Os teores médios de cafeína nas amostras de café avaliadas foram de 2,20
g/100 g no café cru, 2,67 g/100 g no torrado, 2,60 g/100 g no extrato e 4,0 g/100 g no
café solúvel. Dados similares sobre o teor de cafeína no café cru foram reportados por
MACRAE (1989) com valores que variaram de 0,9 a 2,4 g/100 g. Os teores de cafeína
encontrados neste trabalho para as amostras de café após a etapa de torração
discordam de BRENELLI (2003) que observou teores médios de cafeína de 1,4 g/100 g
de café torrado. FUJIOKA & SHIBAMOTO (2008) também reportaram valores de
cafeína em café torrado entre 1,09 a 1,65 mg/100 g.
V.3.3.2 Características de cor
As características de cor das amostras de café coletadas durante o
processamento do café solúvel, investigadas neste estudo, estão indicadas na Tabela
V.5. Das quatro amostras de café coletadas durante o processamento foram
153
submetidas a análise de cor o café torrado e o café solúvel. Nas amostras de café
torrado foram observadas diferenças significativas para os valores de a*, b* e croma.
Para as amostras de café solúvel não foram observadas diferenças significativas entre
os parâmetros avaliados.
Tabela V.5 – Características de cor (CIE L*a*b*) de amostras coletadas durante o
processamento do café solúvel
Cafés Valores/Parâmetros de cor CIE L*a*b* (%CV)
L* a* b* croma hue*
Torrado 20,6 (10) b
5,7 (75) b 13,1(32) b
15,1(15) b 92,9 (3) a
Solúvel 32,2 (6) a 12,2 (8) a 31,5 (10) a
33,9 (9) a 68,6 (4) b
L* = luminosidade; h* = tonalidade
Médias de triplicatas com letras diferentes na mesma coluna (a-b) são significativamente diferentes
(Teste de Duncan, p0,05).
Os valores de luminosidade (L*) encontrados para o café solúvel foram maiores
que os obtidos para as amostras de café torrado. De acordo com BORGES et al.
(2002), o parâmetro luminosidade relaciona-se ao grau de escurecimento do café,
podendo variar de 0 (preto) a 100 (branco). Ainda, segundo estes autores, existe uma
correlação significativa inversa entre a luminosidade e o grau de torração do café.
Desta forma, os dados encontrados sugerem que as etapas do processamento após a
torração alteraram a cor do café solúvel.
V.5 CONCLUSÕES
As aminas bioativas livres presentes no café solúvel foram a tiramina, agmatina,
espermidina e espermina. As etapas do processamento influenciaram
significativamente os teores das aminas. A torração reduziu os teores de algumas
aminas, mas também propiciou a formação da agmatina. A etapa de concentração do
extrato de café contribuiu para um aumento nos teores das aminas. Já na etapa final
do processamento do café solúvel, algumas aminas tiveram seus teores reduzidos
novamente.
154
No café solúvel não foram encontradas aminas conjugadas. Durante o
processamento do café solúvel, houve alteração nos teores destas aminas, que foram
detectadas apenas no café cru coletado no início do processamento e em teores bem
reduzidos no café torrado.
As características físico-químicas das amostras coletadas durante a produção do
café solúvel foram afetadas de forma significativa pelas diferentes etapas do
processamento, porém as alterações observadas são requeridas para padronização do
processo tecnológico. Alterações nos parâmetros de cor durante o processamento do
café solúvel evidenciaram uma interferência das etapas de extração e secagem na
coloração final do café solúvel.
155
CONCLUSÕES INTEGRADAS
As amostras de café solúvel coletadas no mercado consumidor caracterizaram-
se pela presença das aminas bioativas livres putrescina, cadaverina, tiramina,
serotonina, espermidina, espermina, sendo a putrescina a amina predominante. Os
teores das aminas calculados em 50 mL da bebida não representam riscos para a
saúde do consumidor mesmo considerando um consumo de 200 mL por dia, que é a
quantidade estimativa de consumo diário da população brasileira.
Na determinação das aminas bioativas livres do café, para uma melhor extração
das aminas da matriz, os grãos de café devem ser moídos e separados em peneiras de
tamanhos de 9 a 20 mesh que corresponde a 2,0 a 0,85 mm de diâmetro. A extração
deve ser conduzida com ácido tricloroacético a 5% (m/v) em três extrações
consecutivas.
Para a quantificação das aminas conjugadas é necessário fazer uma hidrólise
para posterior análise das aminas livres. A condição de hidrólise que apresentou
melhor eficiência na liberação de um maior número de aminas conjugadas ácido,
solúveis e ácido insolúveis do café foi conduzida com ácido clorídrico 9 mol/L a 110 ºC
por 18 horas.
A metodologia de determinação de aminas conjugadas baseada na hidrólise das
mesmas e liberação de sua forma livre não é recomendada para a pesquisa de
serotonina, pois esta amina apresentou grande instabilidade frente à reação de
hidrólise.
A metodologia analítica para a determinação de aminas bioativas livres por
CLAE-par iônico, derivação pós-coluna com OPA e detecção fluorimétrica foi validada
para análise de amostras de cafés cru, torrado e solúvel. O método apresentou
precisão, linearidade, limites de detecção e quantificação adequados para a análise
dos diferentes tipos de cafés. Foi observado que a matriz café torrado influenciou na
linearidade da curva analítica das aminas tiramina e triptamina. Interferências na curva
analítica para as aminas serotonina, tiramina e triptamina também foram evidenciadas
para a matriz café solúvel. Sugere-se que na determinação destas aminas nestas
matrizes, a curva analítica seja preparada com padrões na matriz.
O café solúvel coletado durante o processamento foi caracterizado pela
presença das aminas tiramina agmatina, espermidina e espermina. As etapas do
156
processamento do café solúvel influenciaram o perfil e os teores das aminas bioativas
livres e conjugadas. Os teores das aminas livres reduziram de forma significativa após
a torração dos grãos de café, sendo que o teor da serotonina foi reduzido em 80% e as
demais aminas, putrescina, tiramina, espermidina, espermina e triptamina, que
estavam presentes nos grãos crus não foram detectadas no café torrado. Foi
observada a formação da agmatina durante a torração do café. A etapa de
concentração do extrato do café contribuiu para um aumento nos teores de algumas
aminas. A tiramina, a espermidina e a espermina que não foram detectadas após a
torração tiveram seus teores aumentados na etapa de concentração do extrato de café.
No café solúvel não foram detectadas aminas conjugadas. O processamento
afetou significativamente os teores das aminas conjugadas. As aminas conjugadas
ácido solúveis putrescina, espermidina e espermina foram detectadas nos grãos de
café cru. Após a torração houve uma diminuição significativa da putrescina e as
demais aminas não foram detectadas. As aminas conjugadas ácido insolúveis
putrescina, espermidina e espermina estavam presentes apenas nos grãos de café cru.
A umidade e a atividade de água sofreram alterações durante o processamento.
Porém, estas são requeridas para a manutenção da qualidade do café solúvel. As
características de cor também sofreram alterações durante o processamento,
evidenciando uma diminuição da tonalidade escura do café solúvel. Pequenas
variações nos resultados dos parâmetros físico-químicos analisados nos três lotes de
produção do café solúvel sugerem controle efetivo e padronização no processo
tecnológico da indústria produtora de café solúvel.
157
SUGESTÕES
Considerando os resultados encontrados durante a execução deste trabalho e a
importância do café no mercado mundial e também como alimento que pode contribuir
para a saúde do consumidor, sugere-se como trabalhos futuros:
Avaliar o perfil e teores de aminas bioativas no café Coffea canephora variedade
robusta brasileiro;
Estudar a influência grãos defeituosos de café e casca de café no perfil e teores
de aminas bioativas no café solúvel para avaliar a utilização das aminas como
parâmetro de identificação de possíveis fraudes no café solúvel;
Verificar a influência das aminas bioativas no sabor e aroma da bebida café;
Determinar os tipos e teores de ácidos hidroxinâmicos presentes no café e
verificar quais ácidos fazem conjugação com as aminas presentes no café;
Estudar a influência da conjugação das aminas com os compostos fenólicos na
atividade antioxidante do café;
Avaliar a biodisponibilidade das aminas presentes no café após a ingestão da
bebida.
158
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABICS. Associação Brasileira das Indústrias de Café Solúvel. Análises econômicas.
Dodirex 1-2007: desempenho 2006 e perspectivas 2007. Disponível em:
http\\www.abics.org.br. Acesso em: 19/outubro/2007.
ABICS. Associação Brasileira das Indústrias de Café Solúvel. Análises econômicas.
Dodirex 1-2008: desempenho 2007 e perspectivas 2008. Disponível em:
http\\www.abics.org.br. Acesso em: 30/junho /2008.
ADÃO, R.C.; GLÓRIA, M.B.A. Bioactive amines and carbohydrate changes during
ripening of ‘Prata’ banana (Musa acuminata X M. Balbisiana). Food Chem., v. 90,
n. 4, p. 705-711, 2005.
ALVES, R.M.V.; BORDIN, R.M. Estimativa da vida útil de café solúvel por modelo
matemático. Ciênc. Tecnol. Aliment. v.18, n.1, p. 19-24 ,1998.
ALVES, R.M.V.; MILANEZ, C.R.; PADULA, M. Embalagens alternativas para café
solúvel. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 20, n. 2, p. 204-211, 2000.
AMORIM, H.V.; BASSO, L.C.; CROCOMO, O.J.; TEIXEIRA, A.A. Polyamines in green
and roasted coffee. J. Agric. Food Chem., v. 25, n. 4, p. 957–958, 1977.
ANTOINE, F.R.; WEI, C.; OTWELL, W.S.; SIMS, C.A.; LITTELL, R.C.; HOGLE, A.D.;
MARSHALL, M.R. Gas chromatographic analysis of histamine in mahi-mahi
(Coryphaena hippurus). J. Agric. Food Chem., v. 50, n. 17, p. 4754 – 4759, 2002.
ANTOLINI, F.; FRANCIOSINI, S.; FLORIDI, A.L.; FLORIDI, A. An íon-pair HPLC
method for the determination of histamne, tyramine, tryptamine, -phenylethylamine
and their amino acid precursors in cheeses for industrial purposes. Ital. J. Food Sci.,
v. 11, p. 335-345, 1999.
ANVISA (Agência Nacional de Vigilancia Sanitária). Guia para validação de métodos
analíticos e bioanalíticos. Resolução nº 899, de 29 de maio de 2003.
AOAC (Association of Official Analytical Chemists). Official methods of analysis. 16 ed.
Washington: AOAC, 1995. Método 35.1.32.
ARMAS, R.; MARTINEZ, M.; VICENTE, C.; LEGZ, M.E. Free and conjugated
polyamines and phenols in raw and alkaline-clarified sugarcane juices. J. Agric.
Food Chem., v. 47, p. 3086-3092, 1999.
159
BAGGIO, S.R.; BRAGAGNOLO, N. Validação da metodologia para determinação
simultânea, por CLAE, de colesterol e óxidos de colesterol em produtos cárneos
processados. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 24, n. 1, p. 64-70, 2004.
BAGNI, N.; TASSONI, A. Biosynthesis, oxidation and conjugation of aliphatic
polyamines in higher plants. Amino Acids, v. 20, p. 301-317, 2001.
BAKER, G.B.; WONG, J.T.F.; COUTTS, R.T.; PASUTTO, F.M. Simultaneous
extraction and quantitation of several bioactive amines in cheese and chocolate.
Chromatographia, v. 19, p. 317-331, 1987.BARDÓCZ, S.; GRANT, G.; BROWN,
D.S.; RALPH, A.; PUSZTAI, A. Polyamines in food: implications for growth and
health. J. Nutr. Biochem., v. 4, n. 2, p. 66-71, 1993.
BARDÓCZ, S. Polyamines in food and their consequences for food quality and human
health. Trends Food Sci. Technol., v. 6, p. 341-346, 1995.
BARROS, C.B. Validação de métodos analíticos. Biológico, v. 64, n. 2, p. 175-177,
2002.
BASSO, L.C.; SMITH, T.A. Effect of mineral deficiency on amine formation in higher
plants. Phytochem., v. 13, p. 875-883, 1974.
BELETZ, H.D.; GROSH, W. Química de los alimentos. 2 ed. Zaragoza: Acribia, 1997.
1087 p.
BNDES. Nestlé constrói, com apoio do BNDES, fábrica de café solúvel para
exportação. Disponível em: http://www.bndes.gov.br/noticias/not683.asp. Acesso
em 02/ março/ 2005.
BORGES, M.L.A.; FRANÇA, A.S.; OLIVEIRA, L.S.; CORREA, P.C.; GLORIA, M.B.A.
Estudo da variação da coloração de café arábica durante a torrefação em
diferentes condições de aquecimento. Rev. Bras. Armaz. v. especial, n. 5, p. 3-8,
2002.
BOUCHEREAU, A.; GUÉNOT, P.; LARHER, F. Analysis of amines in plant materials.
J. Chromatogr. B, v. 747, p. 49-67, 2000.
BOVER-CID, S.; HOLZAPFEL, W.H. Improved screening for biogenic amine production
by lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol. v. 53, p. 33-41, 1999.
BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria nº 130 de 19 de fevereiro de 1999. Aprova
Regulamento técnico para fixação de identidade e qualidade de café solúvel. Diário
Oficial, Brasília, 25 fev. 1999.
160
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Resolução n°
277, de 22 de setembro de 2005. Aprova Regulamento técnico para café, cevada,
chá erva-mate e produtos solúveis. Diário Oficial, Brasília, 23 set. 2005.
BRENELLI, E.C.S. A extração de cafeína em bebidas estimulantes – uma nova
abordagem para um experimento clássico em química orgânica. Quim. Nova, v. 26,
n. 1, p. 136-138, 2003.
BRENNAN, J.G.; BUTTERS, J.R.; COWELL, N.D.; LILLEY, A.E.V. Las Operaciones de
la Ingeniería de los Alimentos. 3ª ed. Zaragoza: Acribia, 1998, 716 p.
BRITO, N.M.; AMARANTE JUNIOR, O.P.; POLESE, L.; SANTOS, T.C.R.; RIBEIRO,
M.L. Avaliação da exatidão e da precisão de métodos de análise de resíduos de
pesticidas mediante ensaios de recuperação. Pesticidas: R. Ecotoxicol. Meio Amb.,
v. 12, p. 155-168, 2002.
BRITO, N.M.; AMARANTE JUNIOR, O.P.; POLESE, L.; RIBEIRO, M.L. Validação de
métodos analíticos: estratégia e discussão. Pesticidas: R. Ecotoxicol. Meio Amb., v.
13, p. 129-146, 2003.
BUSTO, O.; MIRACLE, M.; GUASH, J.; BORRULL, F. Determination of biogenic
amines in wines by high-performance liquid chromatography with on-column
fluorescence derivatization. J. Chromatogr. A, v. 757, p. 311-318, 1997.
CABRAL, V.L. Tecnologia de moagem do café. Belo Horizonte: Uni-bh. 2007.
(Monografia, Graduação em Engenharia de Alimentos).
CASAL, S.; OLIVEIRA, M.B.P.P.; FERREIRA, M.A. Determination of biogenic amines
in coffee by an optimized liquid chromatographic method. J. Liq. Chromatogr.
Relat. Technol., v. 25, n. 16, p. 2535-2549, 2002.
CASAL, S.; MENDES, E.; ALVES, R.M.; ALVES, R.C.; OLIVEIRA, M.B.P.P.;
FERREIRA, M.A. Free and conjugated biogenic amines in green and roasted
coffee beans. J. Agric. Food Chem. v. 52, p. 6188-6192, 2004.
CASAL, S.; MENDES, E.; OLIVEIRA, M.B.P.P.; FERREIRA, M.A. Roast effects on
coffee free and conjugated polyamines. E. J. Environ. Agric. Food Chem., v. 4, n.
5, p. 1063-1068, 2005.
CECAFÉ. Conselho dos Exportadores de Café Verde. Disponível em:
http//www.cecafe.com.br. Acesso em: 02/março/2006.
CHANDER, H.; BATISH, V.K.; BABU, S.; SINGH, R.S. Factors affecting amine
production by a selected strain of Lactobacillus bulgaricus. J. Food Sci., v. 54, n. 4,
p. 940-942, 1989.
161
CHASIN, A.A.M.; NASCIMENTO, E.S.; RIBEIRO-NETO, L.M.; SIQUEIRA, M.E.P.B.;
ANDRAUS, M.H.; SALVADOR, M.C.; FERNÍCOLA, N.A.G.; GORNI, R.; SALCEDO,
S. Validação de métodos em análises toxicológicas: uma abordagem geral. Rev.
Brasil. Toxicol., v. 11, n. 1, p. 1-6, 1998.
CHIACCHIERINI, E.; RESTUCCIA, D.; VINCI, G. Evaluation of two different extraction
methods for chromatographic determination of bioactive amines in tomato products.
Talanta, v. 69, p. 548-555, 2006.
CHOI, S.W.; LEE, S.K.; KIM, E.O.; OH, H.; YOON, K.S.; PARRIS, N.; HICKS, K.B.;
MOREAU, R.A. Antioxidant and antimelanogenic activities of polyamine conjugated
from corn bran and related hydroxycinnamic acids. J. Agric. Food Chem., v. 55, p.
3920-3925, 2007.
CHU, C.H.; BJELDANES, F.L. Effect of diamines, polyamines and tuna fish extracts on
the binding of histamine to mucin in vitro. J. Food. Sci. v. 47, p. 79-88, 1981.
CINQUINA, A.L.; CALÌ, A.; LONGO, F.; DE SANTIS, L.; SEVERONI, A.; ABBALLE, F.
Determination of biogenic amines in fish tissues by ion-exchange chromatography
with conductivity detection. J. Chromatog. A, v. 1032, p. 73-77, 2004.
CIRILO, M.P.G. Influência da adubação potássica e da torra nos teores de aminas
bioativas em café. Belo Horizonte: UFMG. 2001. (Dissertação, Mestrado em
Ciência de Alimentos).
CIRILO, M.P.G.; COELHO, A.F.S.; ARAÚJO, C.M.; GONÇALVES, F.R.B.; NOGUEIRA,
F.D.; GLÓRIA, M.B.A. Profile and levels of bioactive amines in green and roasted
coffee. Food Chem., v. 82, p. 397-402, 2003.
CLARKE, R.J. Roasting and grinding. In: CLARKE, R.J.; MACRAE, R. Coffee:
technology. London: Elsevier Applied Science, 1989 a. v. 2, p. 73-106.
CLARKE, R.J. Water and mineral contents. In: CLARKE, R.J.; MACRAE, R. Coffee:
Chemistry. London: Elsevier Applied Science, 1989 b, v. 1, p. 42-82.
CLARKE, R.J. Technology III: Instant coffee. In: CLARKE, R.J.; VITZTHUM, O.G.
Coffee recent developments. Oxford: Blackwell Science Ltd, 2001, p. 125-139.
CODEX ALIMENTARIUS. Residuos de medicamentos veterinários em los alimentos. 1ª
ed. Roma, 1993, v. 3.
COUTTS, R.T.; GLEN, B.B.; PASUTTO, F.M. Foodstuffs as source of psychoactive
amines and their precursors: content, significance and identification. Adv. Drug
Res., v.15, p. 169-233, 1986.
162
CUSTÓDIO, F.B.; TAVARES, E.; GLÓRIA, M.B.A. Extraction of bioactive amines from
grated parmesan cheese using acid, alkaline and organic solvents. J. Food. Comp.
Anal., v. 20, p. 280-288, 2007.
DENOBILE, M.; NASCIMENTO, E.S. Validação de método para determinação de
resíduos de antibióticos oxitetraciclina, tetraciclina, clortetraciclina e doxiciclina, em
leite, por cromatografia líquida de alta eficiência. Rev. Brasil. Ciênc. Farmac., v. 40,
n. 2, p. 209-218, 2004.
DONHAUSER, S.; WAGNER, D.; GEIGER, E. Biogenic amines: significance,
occurrence and assessment. Brauwelt. Int. v. 11, p. 100-107, 1993.
DORHOUT, B.; Van BEUSEKOM, M.; HUISMAN, M.; KINGMA, A.W.; De HOOG, E.;
BOERSMA, E.R.; MUSKIET, F.A.J. Estimation of twenty-four hour polyamine
intake from mature human milk. J. Pediat. Gastroenterol. Nutrit. v. 23, p. 298-302,
1996.
DROLET, G.; DUMBROFF, B.E.; LEGGE, L.R.; THOMPSON, E.J. Radical scavenging
properties of polyamines. Phytochem., v. 25, n. 2, p. 367-371, 1986.
EDMUNDS, W.J.; EITENMILLER, R.R. Effect of storage time and temperature on
histamine content and histidine decarboxylase activity of aquatic species. J. Food
Sci., v. 57, n. 2, p. 355-365, 1992.
ELIASSEN, K.A.; REISTAD, R.; RISOEN, U.; RONNING, H.F. Dietary polyamines.
Food Chem., v. 78, p. 273-280, 2002.
EURACHEM. The fitness for purpose of analytical methods: a laboratory guide to
method validation and related topics, 1
a
ed. Teddington: UK, 1998, 61 p.
FACCHINI, P.J.; HAGEL, J.; ZULAK, K.G. Hydroxycinnamic acid amide metabolism:
physiology and biochemistry. Canadian J. Bot., v. 80, p. 577-589, 2002.
FARAH, A., MONTEIRO, M.C., CALADO, V., FRANCA, A.S., TRUGO, L.C. Correlation
between cup quality and chemical attributes of Brazilian coffee. Food Chem., v. 98,
p. 373-380, 2006a.
FARAH, A., PAULIS, T., MOREIRA, D.P., TRUGO, L.C., MARTIN, P.R. Chlorogenic
acids and lactones in regular and water-decaffeinated arabica coffees. J. Agric.
Food Chem., v. 54, p. 374-381, 2006b.
FELDMAN, J.R.; RYDER, W.S.; KUNG, J.T. Importance of nonvolatile compounds to
the flavor of coffee. J. Agric. Food Chem., v. 17, n. 4, p. 733-739, 1969.
FLORES, H.E.; PROTACIO, C.M.; SIGNS, M. Primary and secondary metabolism of
polyamines in plants. Rec. Adv. Phytochem., v. 23, p. 329-393, 1989.
163
FONTANIELLA, B.; MATEOS, J.L.; VICENTE, C.; LEGAZ, M.E. Improvement of the
analysis of dansylated derivatives of polyamines and their conjugates by high-
performance liquid chromatography. J. Chromatogr., v. 919, p. 283-288, 2001.
FONTANIELLA, B.; VICENTE, C.; LEGAZ, M.E.; ARMAS, R.; RODRIGUEZ, C.W.;
MARTINEZ, M.; PINON, D.; ACEVEDO, R.; SOLAS, M.T. Yellow leaf syndrome
modifies the composition of sugarcane juices in polysaccharides, phenols and
polyamines. Plant Physiol. Biochem., v. 41, p. 1027-1036, 2003.
FRANÇA, A.S.; MENDONÇA, J.C.F.; OLIVEIRA, S.D. Composition of green and
roasted coffees of different cup qualities. LWT, v. 38, p. 709-715, 2005.
FUJIOKA, K.; SHIBAMOTO, T. Chlorogenic acid and caffeine contents in various
commercial brewed coffees. Food Chem., v. 106, p. 217-221, 2008.
FUZIKAWA, C.S.; HARA, C.; GLÓRIA, M.B.A.; ROCHA, F.L. IMAO e dieta –
atualização e orientações práticas para o uso clínico. J. Bras. Psiq., v. 48, n. 10, p.
453-460, 1999.
GLÓRIA, M.B.A. Amines. In: CABALLERO, B.; TRUGO, L.; FINGLAS, P.M. (Eds).
Encyclopedia of food science and nutrition. London: Academic Press.; 2003, p. 173-
181.
GLÓRIA, M.B.A. Bioactive amines. In: HUI, H., SHERKAT, F. (Eds). Handbook of
food science, technology and engineering. London: CRC Press.; 2005, 3632 p.
GLÓRIA, M.B.A.; IZQUIERDO-PULIDO, M. Levels and significance of biogenic amines
in Brazilian beers. J. Food Comp. Anal., v. 22, n. 4, 1999.
GONZALEZ-AGUILAR, G.A.; ZACARIAS, L.; LAFUENTE, M.T. Ripening affects high-
temperature-induced polyamines and their changes during cold storage of hibrid
Fortune mandarins. J. Agric. Food Chem., v. 46, n. 9, p. 3503-3508, 1998.
HALÁSZ, A.; BARÁTH, A.; SIMON-SARKADI, L.; HOLZAPFEL, W. Biogenic amines
and their production by microorganisms in food. Trends Food Sci. Technol., v. 5, p.
42-49, 1994.
HENNION, F.; MARTIN-TANGUY, J.M. Amine distribution and content in several parts
of the subantarctic endemic species Lyallia Kerguelensis (Hestorellaceae).
Phytochem., v. 52, p. 247-251, 1999.
HILLARY, A.R.; PEGG, A.E. Decarboxylases involved in polyamines biosynthesis and
their inactivation by nitric oxide. Biochem. Biophys. Acta, v. 1647, p. 161-166, 2003.
164
IAL (Instituto Adolfo Lutz). Métodos químicos e físicos para análises de alimentos. 3
ed. v. 1. São Paulo: IAL, 1985. 533p.
IAL (Instituto Adolfo Lutz). Métodos químicos e físicos para análises de alimentos. 4
ed. v. 1. São Paulo: IAL, 2004. 533p.
ICO (International Coffee Organization). Roasting/making coffee. Disponível em:
http//www.ico.org. Acesso em: 02/março/2007.
INMETRO (Intituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial).
Orientações sobre validação de métodos de ensaios químicos. DOQ-CGCRE-008,
Rio de Janeiro, 2003.
INNOCENT, N.; BIASSUTTI, M.; PADOVESE, M.; MORET, S. Determination of
biogenic amines in cheese using HPLC technique and direct derivation of acid
extract. Food Chem., v. 101, p. 1285-1289, 2007.
IZQUIERDO-PULIDO, M.L.; VIDAL-CAROU, M.C.; MARINÉ-FONT, A. Determination
of biogenic amines in beers and their raw materials by ion-pair liquid
chromatography with post column derivatization. J.O.A.C. Int., v. 76, p. 1027-1032,
1993.
JAVACAFÉ. Coffee history. Disponível em: http://www.javacafe.com.br. Acesso em:
02/março/2005.
JEEVANANDAM, M.; HOLADAY, B.S.; BEGAY, C.K.; PETERSEN, S.R. Nutrition
efficacy of a spermidine supplemented diet. Nutrition, v.13, n. 9, p. 788-794, 1997.
JENKEN, D.R. Chromatographic method validation: a review of current practices and
procedures. General concepts and guidelines. J. Liq. Chomatogr. Relat. Technol., v.
19, n. 5, p. 719-736, 1996.
KALAC, P.; SVECOVA, S.; PELIKANOVA, T. Level of biogenic amines in typical
vegetables products. Food Chem., v. 77, p. 349-351, 2002.
KALAC, P.; KRAUSOVÁ, P. A review of dietary polyamines: formation, implications for
growth and health and occurrence in foods. Food Chem., v. 90, n. 1-2, p. 219-230,
2005.
KANG, S.; BACK, K. Enriched production of N-hydroxycinnamic acid amides and
biogenic amines in pepper (Capsicum annuum) flowers. Sci. Horticult., v. 108, p.
337-341, 2006.
165
KANG, S.; KANG, K.; CHUNG, G.C.; CHOI, D.; ISHIHARA, A.; LEE, D.S.; BACK, K.
Functional analysis of the amine substrate specificity domain of pepper tyramine
and serotonin N-hydroxycinnamoyltransferases. Plant Physiol., v. 140, p. 704-715,
2006.
KING, R.R.; CALHOUN, L.A. Characterization of cross-linked hydroxycinnamic acid
amides isolated from potato common scab lesions. Phytochem., v. 66, p. 2468-
2473, 2005.
KOYAMA, N.; KURIBAYASHI, K.; SEKI, T. Serotonin derivatives, major safflower
(Carthamus tinctorius L.) seed antioxidants, inhibit low-density lipoprotein (LDL)
oxidation and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. J. Agric. Food
Chem., v. 54, p.4970-4976, 2006.
KRAMER, G.F.; WANG, C.Y.; CONWAY, W.S. Inhibition of softening by polyamine
application in ‘Golden Delicious’ and ‘McIntosh’ apples. J. Amer. Soc. Hort. Sci., v.
116, p. 813-817, 1991.
LANÇAS, F.M. Validação de métodos cromatográficos de análise. São Carlos: RIMA,
2004, 62p.
LAPA-GUIMARÃES, J.; PICKOVA, J. New solvent systems for thin-layer
chromatographic determination of nine biogenic amines in fish and squid. J.
Chromatogr. A, v. 1045, p. 223-232, 2004.
LAVIZZARI, T.; VECIANA-NOGUÉS, M.T.; BOVER-CID, S.; MARINÉ-FONT, A.; VIDAL-
CAROU, M.C. Improved method for the determination of biogenic amines and
polyamines in vegetable products by ion-pair high-performance liquid
chromatography. J. Chromatogr. A, v. 1129, p. 67-72, 2006.
LEE, S.; HAN, J.M.; KIM, H.; KIM, E.; JEONG, T.S.; LEE, W.S.; CHO, K.H. Synthesis of
cinnamic acid derivatives and their inhibitory effects on LDL-oxidation, acyl-
CoA:cholesterol acyltransferase-1 and -2 activity, and decrease of HDL-particle size.
Bioorg. Med. Chem. Letters, v. 14, p. 4677-4681, 2004.
LEGAZ, M.E.; ARMAS, R.; PINÓN, D.; VICENTE, C. Relationships between phenolics-
conjugated polyamines and sensitivity of sugarcane to smut (Ustilago scitaminea). J.
Experim. Bot., v. 49, n. 327, p. 1723-1728, 1998.
LIMA, A.S.; GLÓRIA, M.B.A. Aminas bioativas em alimentos. Bol. SBCTA, v. 33, n. 1,
p. 70-79, 1999.
166
LIMA, I.M.H.; FROTA, M.N. O enfoque da metrologia química em análises toicológicas
na atividade turfística: validação de método analítico para determinação de cafeína
em matrizes biológicas. Quim. Nova, v. 30, n. 8, p. 1820-1829, 2007.
LÖSER, C. Polyamines in human and animal milk. British J. Nutr., v. 84, Suppl. 1,
S55-S58, 2000.
LU, H.Y.; HWANG, D.F. Polyamine profile in the paralytic shellfish poison-producing
alga Alexandrium minutum. J. Plant. Re., v. 24, n. 3, p. 275-279, 2002.
LY, D.; KANG, K.; CHOI, J.; ISHIRAHA, A.; BACK, K.; LEE, S. HPLC analysis of
serotonin, tryptamine, tyramine, and the hidroxycinnamic acid amides of serotonin
and tyramine in food vegetables. J. Med. Foods, v.11, p. 385-389, 2008.
MACRAE, R. Nitrogenous components. In: CLARKE, R.J.; MACRAE, R. Coffee
Chemistry. London: Elsevier Applied Science, 1989, p. 115-149.
MALTA, M. Dodirex 2-2007: reflexões sobre a economia cafeeira. Disponível em:
http\\www.abics.org.br. Acesso em: 19/outubro /2007.
MALTA, M. Dodirex 1-2008: reflexões sobre a economia cafeeira. Disponível em:
http\\www.abics.org.br. Acesso em: 30/junho/2008.
MARTIN-TANGUY, J. Conjugated polyamines and reproductive development:
biochemical, molecular and physiological approaches. Physiol. Plant., v. 100, p.
675-688, 1997.
MARTIN-TANGUY, J.; CANNABE, F.; PERDRIZET, E.; MARTIN, C. The distribution of
hydroxycinnamic acid amides in flowering plants. Phytochem., v. 17, p. 1927-1928,
1978.
MARTINEZ-VILLALUENGA, C.; FRIAS, J.; GULEWICZ, P.; GULEWICZ, K.; VIDAL-
VALVERDE, C. Food safety evaluacion of broccoli and radish sprouts. Food Chem.
Toxicol., v. 46, p. 1635-1644, 2008.
MELLON, J.E.; MOREAU, R.A. Inhibition of aflatoxin biosynthesis in Aspergillus flavus
by diferuloylputrescine and p-coumaroylferuloylputrescine. J. Agric. Food Chem., v.
52, p. 6660-6663, 2004.
MORAES, R.C.P.; TRUGO, L.C. Efeito da torração e da granulometria na composição
química do café. In: Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil, 2, 2001, Vitória.
p.1511-1517.
MORET, S.; CONTE, L.S. High performance liquid chromatographic evaluation of
biogenic amines in foods: an analysis of different methods of sample preparation in
relation to food characteristics. J. Chromatogr. A, v. 729, p. 363-369, 1996.
167
MORET, S.; SMELA, D.; POPULIN, T.; CONTE, L.S. A survey on free biogenic amines
content of fresh and preserved vegetables. Food Chem., v. 89, p. 355-361, 2005.
MORGANO, M.A.; PAULUCI, L.F.; MANTOVANI, D.M.B.; MORY, E.E.M.
Determinação de minerais em café cru. Cienc. Tecnol. Aliment., v. 22, n. 1, p. 19-
23, 2002.
NAGATSU, A.; ZHANG, H.L.; MIZUKAMI, H.; OKUYAMA H.; SAKAKIBARA, J.;
TOKUDA, H.; NISHINO, H. Tyrosinase inhibitory and anti-tumor promoting activities
of compounds isolated from safflower (Carthamus tinctorius L.) and cotton
(Gossypium hirsutum L.) oil cakes. Nat. Prod. Lett., v. 14, p. 153-158, 2000.
NAGATSU, T. Application of high-performance liquid chromatography to the study of
biogenic amine – related enzymes. J. Chromatogr., v. 566, p. 287-307, 1991.
NOGUEIRA, M.; TRUGO, L.C. Distribuição de isômeros de ácido clorogênico e teores
de cafeína e trigonelina em cafés solúveis brasileiros. Ciênc. Tecnol. Aliment., v.
23, n. 2, p. 296-299, 2003.
NOVELLA-RODRÍGUEZ, S.; VECIANA-NOGUÉS, M.T.; VIDAL-CAROU, M.C. Biogenic
amines and polyamines in milks and cheeses by ion-pair high performance liquid
chromatography. J. Agric. Food Chem., v. 48, p. 5117-5123, 2000.
OHTA, H.; YOZA, K.I.; TAKEDA, Y.; NOGATA, Y. Influence of storage temperature on
the polyamine levels and ethylene production in broccoli (Brassica oleracea, Itálica
Group). Biosci. Biotechnol. Biochem., v. 57, n. 5, p. 831-832, 1993.
OKAMOTO, A.; SUGI, E.; KOIZUMI, Y.; YANAGIDA, F.; UKADA, S. Polyamine content
of ordinary foodstuffs and various fermented foods. Biosci. Biotechnol. Biochem.,
v. 61, n. 9, p. 1582-1584, 1997.
OKOMBI, S.; RIVAL, D.; BONNET, S.; MARIOTTE, A.M. PERRIER, E.; BOUMENDJEL,
A. Analogues of N-hydroxycinnamoylphenalkylamides as inhibitors of human
melanocyte-tyrosinase. Bioorg. Med. Chem. Letters, v. 16, p. 2252-2255, 2006.
OLIVEIRA, S.D. Caracterização fisico-química e teores de aminas bioativas em café
cru e torrado. Belo Horizonte: UFMG. 2004. 109 f. (Dissertação, Mestrado em
Ciência de Alimentos).
OLIVEIRA, S.D.; FRANCA, A.S.; GLÓRIA, M.B.A.; BORGES, M.L.A. The effect of
roasting on the presence of bioactive amines in coffees of different qualities. Food
Chem., v. 90, p. 287-291, 2005.
ÖNAL, A. A review: current analytical methods for the determination of biogenic amines
in foods. Food Chem., v. 103, p. 1475-1486, 2007.
168
PANDEY, S.; RANADE, S.A.; NAGAR, P.K.; KUMAR, N. Role of polyamines and
ethylene as modulators of plant senescence. J. Biosc., v. 25, n. 3, p. 291-299,
2000.
PARK, J.B.; SCHOENE, N. Synthesis and characterization of N-coumaroyltyramine as
a potent phytochemical which arrests humam transformed cells via inhibiting protein
tyrosine kinases. Biochem. Biophys. Res. Commum., v. 292, p. 1104-1110, 2002.
PONAPPA, T.; SCHEERENS, J.C.; MILLER, A.R. Vacuum infiltration of polyamines
increases firmness of strawberry slices under various storage conditions. J. Food
Sci., v. 58, p. 361-364, 1993.
PRESTES, O.D.; PRESTA, M.A.; KOLBERG, D.I.S.; ZANRLLA, R. Desenvolvimento e
validação de um método analítico para a determinação de histamina em vinhos
utilizando cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência.
Quim. Nova, v. 30, n. 1, p. 18-21, 2007.
REY, M.; POHL, C. Novel cation-exchange column for the separation of hydrophobic
and/or polyvalent amines. J. Chromatogr. A, v. 997, p. 199-206, 2003.
RIBANI, M.; COLLINS, C.H.; BOTTOLI, C.B.G.; JARDIM, I.C.S.F.; MELO, L.F.C.
Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Quim. Nova, v. 27, n. 5, p.
771-780, 2004.
RIBANI, M.; COLLINS, C.H.; BOTTOLI, C.B.G. Validation of chomatrographic methods:
evaluation of detection and quantification limits in the determination of impurities in
omeprazole. J. Chomatogr., v. 1156, p. 201-205, 2007.
RIC (Rede Independência de Comunicação). História da Nestlé. Disponível em:
http//www.ric.com.br/ historia_da_propaganda_nestle.asp. Acesso em: 02/março/
2005.
RODRIGUEZ, C.W.; ARMAS, R.; VICENTE, C.; LEGAZ, M.E. Changes in free and
conjugated polyamines during starvation of sugarcane juices as analyzed by high-
performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A, v. 881, p. 531-541, 2000.
SAMPAIO, I.B.M. Estatística aplicada à experimentação animal. Belo Horizonte:
Fundação de Ensino e Pesquisa em Medicina Veterinária e Zootecnia. 1998. 221p.
SEN, A.; BERGVINSON, D.; MILLER, S.S.; ATKINSON, J.; FULCHER, R.G.;
ARNASON, J.T. Distribution and microchemical detection of phenolic acids,
flavonoids, and phenolic acid amides in maize kernels. J. Agric. Food Chem., v. 42,
p. 1879-1883, 1994.
169
SHALABY, A.R. Significance of biogenic amines to food safety and human health.
Food Res. Int., v. 29, n. 7, p. 675-690, 1996.
SILLA SANTOS, M.H. Biogenic amines: their importance in foods. Int. J. Food
Microbiol., v. 29, n. 2/3, p. 213-231, 1996.
SILVA, C.M.G.; GLÓRIA, M.B.A. Bioactive amines in chicken breast and thigh after and
during storage at 4 ± 1 ºC and in chicken-based meat products. Food Chem., v. 78,
p. 241-248, 2002.
SILVEIRA, T.M.L.; GLÓRIA, M.B.A. Perfil e teores de aminas bioativas em café
solúvel. In: XIX Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2004,
Recife. Anais. Recife: SBCTA, 2004. v. 1, p. 1-4.
SILVEIRA, T.M.L.; TAVARES, E.; GLÓRIA, M.B.A. Profile and levels of bioactive
amines in instant coffee. J. Food. Comp. Anal., v. 20, p.451-457, 2007a.
SILVEIRA, T.M.L.; SILVA, T.M.; FARAH, A.; GLÓRIA, M.B.A. Aminas bioativas em café
robusta submetidos a diferentes graus de torração – estudos preliminares. In:
Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil. Anais. v.1, p.1-4, 2007b.
SIMON-SARKADI, L.; HOLZAPFEL, W.H.; HALASZ, A. Biogenic amines content and
microbial contamination of leafy vegetables during storage at 5 ºC. J. Food
Biochem., v. 17, p. 407-417, 1994.
SMITH, A.W. Introduction. In CLARKE, R.J.; MACRAE, R. Coffee Chemistry. London:
Elsevier Applied Science, 1989, p. 1-41.
SMITH, T.A. Tryptamine and related compounds in plants. Phytochem., v. 16, p. 171-
175, 1977.
SMITH, T.A. Amines in food. Food Chem., v. 6, p. 169-200, 1980-81.
SMITH, T.A. Polyamines. Ann. Rev. Plant Physiol., v. 36, p. 117-143, 1985.
SOARES, V.F.M.; GLÓRIA, M.B.A. Histamine level in canned fish available in the retail
market of Belo Horizonte, MG, Brazil. J. Food Comp. Anal., v. 7, p. 102-107, 1994.
SON, S.; LEWIS, B.A. Free radical scavenging and antioxidative activity of caffeic acid
amide and ester analogues: structure-activity relationship. J. Agric. Food Chem., v.
50, p. 468-472, 2002.
SOUSADIAS, M.G.; SMITH, T.K. Toxicity and growth-promoting potential of spermine
when fed to chicks. J. Animal Sci., v. 73, p. 2375-2381, 1995.
170
SOUZA, S.V.C.; LIMA, J.A.; TEODORO, J.C.; JUNQUEIRA, R.G. Validação
intralaboratorial de método quantitativo para determinação múltipla de resíduos de
avermectinas em leite bovino por cromatografia líquida de alta eficiência com
detecção de fluorescência. Cienc. Tecnol. Aliment., v. 27, n. 4, p. 823-836, 2007.
STANDARA, S.; VESELÁ, M.; DRDÁK, M. Determination of biogenic amines in cheese
by ion exchange chromatography. Nahrung, v. 44, n.1, p. 28-31, 2000.
STRATTON, J.E.; HUTKINS, R.W.; TAYLOR, S.L. Biogenic amines in cheese and
other fermented foods: a review. J. Food Protec., v. 54, n. 6, p. 460-470, 1991.
TANIM, N.M.; BENNETT, L.W.; SHELLEM, T.A.; DOERR, J.A. High-performance liquid
chromatographic determination of biogenic amines in poultry carcasses. J. Agric.
Food Chem., v. 50, p. 5012-5015, 2002.
TASSONI, A.; GERMANA, M.A.; BAGNI, N. Free and conjugated polyamines content
in Citrus sinesis Osbeck, cultivar brasiliano N.L. 92, a navel orange, at different
maturation stages. Food Chem., v. 87, p. 537-541, 2004.
TAYLOR, S.L. Histamine food poisoning: toxicology and clinical aspects. Crit. Rev.
Toxicol., v. 17, n. 2, p. 91-128, 1986.
TETI, D.; VISALLI, M.; McNAIR, H. Analysis of polyamines as markers of
(patho)physiological conditions. J. Chromatogr. B, v. 781, p. 107-149, 2002.
TIBURCIO, A.F.; ALTABELLA, T.; BORRELL, A.; MASGRAU, C. Polyamine
metabolism and its regulation. Physiol. Plant., v. 100, p. 664-674, 1997.
TRUGO, L.C.; MACRAE, R.; DICK, J. Determination of purine alkaloids and trigonelline
in instant coffee and other beverages using high performance liquid
chromatograph. J. Sci. Food Agric., v. 34, p. 300-306, 1983.
TRUGO, L.C., MACRAE, R. Chlorogenic acid composition of instant coffee. Analyst, v.
109, p. 263-270, 1984.
USDA. UNITED STATE DEPARTMENT OF AGRICULTURE. National nutrient
database for standar reference. Release 21. Disponível em:
http://www.ars.usda.gov/ba/bhnrc/ndl. Acesso em: 02/dezembro/2008.
VALE, S.R.; GLÓRIA, M.B.A. Methodology for the determination of biogenic amines in
cheese. J. AOAC Int., v. 80, n. 5, p. 1006-1012, 1997.
VALERO, D.; MARTÍNEZ-ROMERO, D.; SERRANO, M. The role of polyamines in the
improvement of shelf life of fruit. Trends Food Sci. Technol., v. 13, p. 228-234,
2002.
171
VARNAM, A.H.; SUTHERLAND, J.P. Bebidas: tecnologia, química y microbiologia.
Zaragoza: Editora Acribia S.A., 1994, 487 p.
VASCONCELOS, A.L.S. Caracterização de grãos defeituosos de café quanto a
aspectos físico-químicos e teores de aminas, para diversos graus de torração. Belo
Horizonte: UFMG. 2005. 90 f. (Dissertação, Mestrado em Ciência de Alimentos).
VASCONCELOS, A.L.S.; FRANCA, A.S.; GLÓRIA, M.B.A.; MENDONÇA, J.C.F. A
comparative study of chemical attributes and levels of amines in defective green
and roasted coffee beans. Food Chem., v. 101, p. 26-32, 2007.
VIEIRA, S.M.; THEODORO, K.H.; GLÓRIA, M.B.A. Profile and levels of bioactive
amines in orange juice and orange soft drink. Food Chem., v. 100, p. 895-903,
2007.
VOIG, M.N.; EITENMILLER, R.R. Production of tyrosine and histidine decarboxylase
by dairy-related bacteria. J. Food Protect., v. 40, n. 4, p. 241-245, 1977.
WALTERS, D.R. Polyamines and plant disease. Phytochem., v. 64, p. 97-107, 2003.
WANG, L.C.; THOMAS, B.W.; WARNER, K.; WOLF, W.J.; KWOLEK, W.F. Apparent
odor thresholds of polyamines in water and 2% soybean flour dispersions. J. Food
Sci., v. 40, p. 274-279, 1975.
YEN, W.J., WANG, B.S., CHANG, L.W., DUH, P.D. Antioxidant properties of roasted
coffee residues. J. Agric. Food Chem., v. 53, p. 2658-2663, 2005.
YINGYONGNARONGKUL, B.; APIRATIKUL, N. AROONRERK, N.; SUKSAMRARN, A.
Solid-phase synthesis and antibacterial activity of hydroxycinnamic acid amides and
analogues against methicillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-
resistant S. aureus. Bioorg. Med. Chem. Lett., v. 16, p. 5870-5873, 2006.
ZEE, J.A.; SIMARD, R.E.; L’HEUREUX, L. An automated method for the composite
analysis of biogenic amines in cheese. Leb. Wissens. Technol., v. 18, p. 245-248,
1985.
172
ANEXO
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
