( PDF ) Respostas bioquímicas e fisiológicas de Cucumis sativus e Avena sativa ao estresse causado por alumínio

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

TOXICOLÓGICA

RESPOSTAS BIOQUÍMICAS E FISIOLÓGICAS DE Cucumis sativus e

Avena sativa AO ESTRESSE CAUSADO POR ALUMÍNIO

TESE DE DOUTORADO

Luciane Belmonte Pereira

Santa Maria, RS, Brasil

2010

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RESPOSTAS BIOQUÍMICAS DE Cucumis sativus e Avena sativa AO

ESTRESSE CAUSADO POR ALUMÍNIO

Por

Luciane Belmonte Pereira

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas - Bioquímica Toxicológica, da Universidade Federal de Santa

Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de

Doutor em Bioquímica Toxicológica

Orientador: Maria Rosa Chitolina Schetinger

Co-orientadora: Vera Maria Morsch

Santa Maria, RS, Brasil

2010

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“Pense no poder que há no Universo, que move a

Terra e faz as árvores crescerem. Esse

mesmo poder existe em você,

basta que tenha coragem

e o desejo de usá-lo!”

Charles Chaplin

LISTA DE ABREVIATURAS

Al – Alumínio

APX – Ascorbato peroxidase

ASA- Ácido ascórbico

CAT – Catalase

ELP – Porcentagem de vazamento de eletrólitos

EROs - Espécies reativas de oxigênio

MDA – Malondialdeído

NPSH – Grupos tióis não proteicos

PBG – Porfobilinogênio

SOD – Superóxido dismutase

δ ALA-D – Delta aminolevulinato desidratase

AGRADECIMENTOS

Sou grata a todos que, mesmo indiretamente, contribuíram para o meu crescimento

profissional e pessoal, através da realização desse trabalho. Agradeço em especial:

A professora Maria Rosa, pela orientação, amizade, confiança e compreensão, e

acima de tudo pelo exemplo de profissional, que contribuiu para o meu crescimento

pessoal e profissional. Obrigada pela paciência, apoio e incentivo em todos os

momentos.

Da mesma forma agradeço a professora Vera Maria Morsch pela orientação,

amizade e auxílio em todos os momentos.

Ao professor Fernando T. Nicoloso pela orientação, amizade, acompanhamento e

participação constante na realização deste trabalho.

Um agradecimento especial as amigas Liana Verônica Rossato, Jamile F.

Gonçalves, Denise Cargnelutti, Luciane A. Tabaldi, Nicéia Calgaroto, pelo

comprometimento e seriedade com que me ajudaram a realizar este trabalho.

Á minha querida irmã de coração Cinthia M. de A. Mazzanti, pelo forte incentivo de

vida em todos os momentos difíceis ao longo destes quatro anos.

Aos demais colegas do Laboratório de Bioquímica e Enzimologia Toxicológica e do

Laboratório de Biotecnologia Vegetal pela amizade e carinho.

A todo corpo docente do programa de Pós Graduação em Bioquímica Toxicológica

que proporcionaram a minha formação.

A toda minha família, em especial à meus pais Luiz Carlos e Francina, irmão Luiz

Carlos Júnior pelo carinho, compreensão, ajuda, paciência e essencialmente pelo

incentivo para que eu vencesse mais essa etapa; ao meu marido Fabrício pelo amor,

apoio e colaboração.

Agradeço a CAPES, pelo apoio financeiro à realização deste trabalho.

A todas as pessoas que colaboraram, de forma direta ou indireta, para a realização

deste trabalho, os meus sinceros agradecimentos.

RESUMO

Tese de Doutorado

Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica

Universidade Federal de Santa Maria

RESPOSTAS BIOQUÍMICAS E FISIOLÓGICAS DE Cucumis sativus E Avena

sativa AO ESTRESSE CAUSADO POR ALUMÍNIO

Autora: Luciane Belmonte Pereira

Orientadora: Maria Rosa Chitolina Schetinger

Co-orientadora: Vera Maria Morsch

Data e Local de Defesa: Santa Maria, 21 de maio de 2010.

O alumínio (Al) é o metal mais abundante na crosta terrestre, afetando o

crescimento e desenvolvimento das plantas. Neste estudo, foram investigados

através da análise de parâmetros bioquímicos e fisiológicos, os efeitos do alumínio

(Al) em plântulas de pepino (Cucumis sativus L.) e em plântulas de aveia (Avena

sativa L). As plântulas de aveia estudadas pertencem a três diferentes genótipos:

UFRGS 930598-sensível ao alumínio, UFRGS 17-tolerante ao alumínio e UFRGS

280-intermediário ao alumínio (resultante do cruzamento entre UFRGS 930598 e

UFRGS 17), expostos a 0, 5, 10, 20 e 30 mg/L de Al. Os parâmetros bioquímicos

analisados para C. sativus foram: a atividade das enzimas antioxidantes (catalse

(CAT), ascorbato peroxidase (APX) e superóxido dismutase (SOD)), os níveis de

peroxidação lipídica, vazamento de eletrólitos, oxidação de proteínas e conteúdo de

clorofila. O aumento na porcentagem de vazamento de eletrólitos e na produção de

peróxido de hidrogênio observado está relacionado com a diminuição da eficiência

do sistema antioxidante nas concentrações mais altas de alumínio. O sistema

antioxidante foi incapaz de impedir a toxicidade, resultando em efeitos negativos,

tais como peroxidação lipídica, oxidação de proteínas e diminuição do crescimento

das plantas. Plântulas dos três genótipos de aveia foram expostas ao Al em

diferentes meios de crescimento. Primeiro a exposição foi em meio de crescimento

semi-sólido com agar por 5 dias, com plântulas com 5 dias de desenvolvimento,

depois em solução hidropônica por 7 dias com plântulas com 10 dias de

desenvolvimento. Foram avaliados o conteúdo de peróxido de hidrogênio,

peroxidação de lipídeos, conteúdo de ácido ascórbico e tióis não protéicos (NPSH),

a atividade das enzimas CAT, APX e SOD e o conteúdo de Al acumulado nas

plântulas. As enzimas do sistema antioxidante SOD e CAT tiveram suas atividades

aumentadas nos genótipos UFRGS 17 e UFRGS 280. Mesmo acumulando altas

concentrações de alumínio estes dois genótipos não apresentaram altos níveis de

peroxidação lipídica e conteúdo de peróxido de hidrogênio quando comparados com

o genótipo 930598. Para esse genótipo houve ativação da enzima APX, entretanto

os altos níveis de alumínio acumulados na planta causaram um aumento na

peroxidação de lipídeos e no conteúdo de peróxido de hidrogênio. O genótipo

UFRGS 930598 mostrou ser mais sensível ao alumínio que os genótipos UFRGS 17

e UFRGS 280, o que confirma as análises morfológicas prévias obtidas por

FEDERIZZI et al., 2000. Embora tenha ocorrido um aumento da atividade da APX

neste genótipo, o sistema antioxidante não foi eficiente na remoção das espécies

reativas de oxigênio (EROS). Com a finalidade de melhor entender esses resultados

foi utilizado o meio de crescimento com solução hidropônica onde a mobilidade do

metal é maior por um período de exposição de 7 dias com plântulas de aveia com 10

dias de desenvolvimento. Neste experimento além dos parâmetros bioquímicos

citados acima, foi feita a análise do crescimento da raiz e parte aérea, matéria seca

e fresca, conteúdo de clorofila, atividade da enzima δ –aminolevulinato desidratase

(δ-ALA-D) e o monitoramento do pH da solução hidropônica de cada genótipo. O pH

da solução hidropônica do genótipo tolerante (UFRGS 17) apresentou um aumento

significativo nos valores de pH, enquanto os genótipos sensíveis (UFRGS 930598) e

intermediário (UFRGS 280) não apresentaram mudanças significativas nos valores

de pH. O genótipo sensível teve inibição do crescimento da raiz e parte aérea nas

concentrações mais altas de alumínio enquanto que para o genótipo tolerante e

intermediário, não houve modificações significativas do crescimento da raiz e parte

aérea. A atividade das enzimas antioxidantes foi aumentada após 7 dias de

exposição ao alumínio no genótipo sensível, enquanto que no genótipo tolerante não

houve aumento na atividade das enzimas antioxidantes. Nas plântulas do genótipo

intermediário houve o aumento na atividade das enzimas CAT, APX e SOD apenas

nas maiores concentrações de alumínio (20 e 30 mg/L). Os resultados mostram que

os genótipos intermediário e tolerante apresentaram semelhanças quanto ao efeito

do alumínio na atividade das enzimas do sistema antioxidante e também nos

parâmetros fisiológicos como o crescimento das raízes e parte aérea. Mesmo

acumulando altas concentrações de alumínio, o genótipo intermediário não

apresentou diminuição do crescimento, o que mostra que ele apresenta mecanismos

de resistência, relacionado com a imobilização interna deste metal nos vacúolos. O

genótipo tolerante também apresenta mecanismos de resistência ao alumínio,

porém estes mecanismos podem ser de exclusão do alumínio pela raiz através da

ligação deste metal a ácidos orgânicos. Com a finalidade de investigar quando o

sistema antioxidante é ativado nos diferentes genótipos de aveia, as plântulas foram

colocadas no meio de crescimento com solução hidropônica e retiradas do meio

após 12, 24 e 36 horas de exposição a 20 mg/L de Al. Os genótipos tolerante e

intermediário apresentaram aumento na atividade das enzimas do sistema

antioxidante após 12 h de exposição ao alumínio, enquanto o genótipo sensível

somente após 24 ou 36 horas de exposição. Esta diferença na velocidade de

ativação do sistema antioxidante pode ser crucial na manutenção da homeostase

celular redox deste genótipo. Nessa fase do desenvolvimento, o genótipo tolerante e

o intermediário apresentaram um estímulo do crescimento da raiz enquanto o

sensível um atraso do crescimento. Com a finalidade de estabelecer comparações

entre as espécies vegetais, o pepino (Cucumis sativus) foi colocado em meio de

crescimento hidropônico, juntamente com as plântulas de aveia (genótipo sensível e

tolerante). O pepino (Cucumis sativus) quando colocado em solução hidropônica

exposto a 20 mg/L de alumínio juntamente com o genótipo tolerante (UFRGS 17) e o

genótipo sensível (UFRGS 930598), apresentou semelhanças com o genótipo

sensível tais como o aumento da atividade da enzima catalase após 36 h de

exposição ao alumínio. Os níveis de peroxidação lipídica foram elevados após 12,

24 e 36h de exposição ao alumínio e como conseqüência a raiz teve uma diminuição

do crescimento. Através da avaliação conjunta, com os genótipos de aveia tolerante,

UFRGS 17, e sensível, UFRGS 930598, o pepino (Cucumis sativus) pode ser

considerado uma espécie sensível ao alumínio.

ABSTRACT

Doctoral Thesis

Graduate Program in Toxicology Biochemistry

Federal University of Santa Maria

BIOCHEMICAL AND PHYSIOLOGICAL RESPONSES OF Cucumis sativus AND

Avena sativa TO EXCESS ALUMINUM STRESS.

Author: Luciane Belmonte Pereira

Adviser: Maria Rosa Chitolina Schetinger

Co-adviser: Vera Maria Morsch

Place and date of the defense: Santa Maria, May 21, 2010.

Aluminum (Al) is the most abundant metal in the Earth's crust, affecting growth and

development of plants. The aim of this study was to investigate the effects of Al on

seedlings of cucumber (Cucumis sativus L.) and oat (Avena sativa L) through the

analysis of biochemical and physiological parameters. Three different genotypes of

oat seedlings were studied, namely UFRGS 930598 Al-sensitive, UFRGS 17 Al-

tolerant, and 280 Al-intermediate (resulting from the crossing UFRGS 930598 and

UFRGS 17), exposed to 0, 5, 10, 20, and 30 mg/L Al. The biochemical parameters

analyzed for cucumber were: the activity of antioxidant enzymes (catalase (CAT),

ascorbate peroxidase (APX) and superoxide dismutase (SOD)), the levels of lipid

peroxidation, leakage electrolytes, protein oxidation, and chlorophyll content. The

increase of electrolyte leakage and the production of hydrogen peroxide observed

are related to the decreased efficiency of the antioxidant system at the highest

concentrations of Al. The antioxidant system was unable to prevent the toxicity

resulting in negative effects such as lipid peroxidation, protein oxidation, and

decreased plant growth. Oat seedlings were exposed to Al in different growth media.

The first exposure was in the midst of semi-solid growth agar for 5 days, seedlings

with five days of development and then to a hydroponic solution for 7 days with 10

days of seedling development. The content of hydrogen peroxide, lipid peroxidation,

ascorbic acid and non-protein thiols (NPSH), as well as the activity of the enzymes

CAT, APX and SOD, and the content of Al accumulated in the seedlings were

evaluated. Enzymes activities of the antioxidant SOD and CAT were increased in

UFRGS 17 and UFRGS 280 genotypes. Even when these two genotypes

accumulated high concentrations of Al, they did not show high levels of lipid

peroxidation and contents of hydrogen peroxide when compared with the 930598

genotype. For this genotype, an activation of the enzyme APX was observed,

however, high levels of Al accumulated in the plant caused an increase in the lipid

peroxidation and hydrogen peroxide content. The UFRGS 930598 genotype was

more sensitive to Al than the UFRGS 17 and UFRGS 280 genotypes, which confirms

the previous morphological analysis obtained by FEDERIZZI et al., 2000. Although

there was increased activity of APX in this genotype, the antioxidant system was not

efficient in the removal of reactive oxygen species (ROS). In order to better

understand these results, a growth medium with a hydroponic solution was used in

which the mobility of the metal was greater for an exposure period of 7 days with oat

seedlings with 10 days of development. Besides the biochemical parameters

mentioned above, the analysis of the growth of roots and shoots, fresh and dry

matter, chlorophyll content, activity of the enzyme δ-aminolevulinic acid dehydratase

(δ-ALA -D), and the monitoring of the pH of the hydroponic solution of each genotype

were performed. The pH of the hydroponic solution of salt-tolerant genotype (UFRGS

17) showed a significant increase in pH, while the sensitive (UFRGS 930598) and

intermediate (UFRGS 280) genotypes showed no significant changes. The sensitive

genotype presented inhibition of root and shoot growth at the highest concentrations

of Al while the tolerant and intermediate genotype showed no significant changes.

The activity of antioxidant enzymes was increased after 7 days of exposure to Al in

the sensitive genotype, whereas in the tolerant genotype there was no increase in

this activity. In seedlings of the intermediate genotype there was an increase in the

activity of CAT, APX and SOD enzymes only at higher Al concentrations (20 and 30

mg/L). Results showed that the intermediate and tolerant genotypes showed similar

effects not only on the activity of enzymes of the antioxidant system, but also on the

physiological parameters such as growth of roots and shoots. Even when

accumulating high concentrations of Al, the intermediate genotype did not show a

decrease in growth, which shows that it has resistance mechanisms related to the

internal immobilization of this metal in the vacuoles. The tolerant genotype also

introduces mechanisms of resistance to Al, but these mechanisms may be the

exclusion of Al by binding this metal to organic acids. In order to investigate if the

antioxidant system is activated in different genotypes of oat, seedlings were placed in

growth medium with a hydroponic solution and withdrawn from the medium after 12,

24, and 36 h of exposure to 20 mg/L. Tolerant and intermediate genotypes showed

an increase of the enzyme activity of the antioxidant system after 12 h of exposure to

Al, while the sensitive genotype presented this increase only after 24 or 36 h. This

difference in the rate of activation of the antioxidant system may be crucial in

maintaining cellular redox homeostasis of this genotype. At this stage of

development, the tolerant and the intermediate genotypes showed a stimulation of

root growth while the sensitive type showed significant growth retardation. In order to

compare plant species, cucumber was placed in hydroponic growth medium with the

oat seedlings (sensitive and tolerant genotypes.) When cucumber was placed in

hydroponic solution exposed to 20 mg/L Al along with the tolerant (UFRGS 17) and

the sensitive (UFRGS 930 598) genotypes, it showed similarities with the sensitive

genotype (increased catalase activity after 36 h of exposure to Al). The levels of lipid

peroxidation were high after 12, 24, and 36h of exposure to Al and as a consequence

there was a reduction in root growth. Considering the evaluation with tolerant

(UFRGS 17) and sensitive (UFRGS 930 598) oat genotypes, the cucumber may be

considered an Al-sensitive species.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Desenho esquemático dos mecanismos de tolerância ao alumínio.........29

Figura 2 - A acumulação do alumínio em angiospermas...........................................32

Figura 3 - Cultivo em meio hidropônico de genótipos de aveia (Avena sativa) em

câmara climatizada...................................................................................................180

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............. ................................................................................15

1.1OBJETIVOS .....................................................................................................17

2. REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................18

2.1 Solos ácidos.........................................................................................................18

2.1.1 Alumínio.............................................................................................................19

2.2 Estresse oxidativo ..............................................................................................21

2.2.1 Enzimas antioxidantes.......................................................................................23

2.3 A enzima delta-aminolevulinato desidratase........................................................24

2.4 Desenvolvimento Vegetal e estratégias de resistência ao alumínio....................25

2.5 Mecanismos externos de resistência...................................................................27

2.6 Mecanismos internos de resistência ao alumino..................................................30

2.7 Pepino..................................................................................................................33

2.8 Aveia....................................................................................................................34

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................36

Artigo I – Aluminum-induced oxidative stress in cucumber…………………………...37

Manuscrito I – Differential responses of oat genotypes: oxidative stress provoked by

aluminum…………………………………………………………………………………....65

Manuscrito II – Physiological and oxidative stress responses of three oat genotypes

to aluminum grown hydropony...................................................................................91

Manuscrito III – Differential speed of activation in antioxidant system in three

genotypes of oat…………………………………………………………………………..124

Manuscrito IV – Physiological and oxidative stress responses of two Avena sativa

genotypes and Cucumis sativus seedlings to aluminum in nutrient solution……….150

4. DISCUSSÃO…………………………………………………………………..……….170

5. CONCLUSÔES....................................................................................................173

6. BIBLIOGRAFIA....................................................................................................174

1. INTRODUÇÃO

A toxidez do alumínio é um fator limitante para a obtenção de altos rendimentos

em muitos solos do mundo. Na América do Sul, aproximadamente 500 milhões de

hectares apresentam uma extrema acidez e baixa fertilidade. No Brasil, mais de 50 %

dos solos são ácidos e apresentam o alumínio tóxico que pode provocar perdas

significativas no rendimento das culturas (DELHAIZE et al., 2001; MA et al., 2001).

O alumínio é o terceiro elemento mais abundante na litosfera, após o oxigênio

e o silício, participando em 8% na composição da crosta terrestre. O excesso de

alumínio, além de inibir a formação normal da raiz, interfere nas reações enzimáticas,

na absorção, transporte e uso dos nutrientes pelas plantas. Além disso, o alumínio

causa estresse oxidativo, oxidando biomoléculas como lipídeos, proteínas, pigmentos e

ácidos nucléicos (YOKEL, 2001, SILVA et al., 2006).

Uma alternativa para contornar este problema é a aplicação de calcário no

solo, tornando o alumínio menos disponível pela modificação do pH. Entretanto, nas

áreas distantes das fontes de calcário, os gastos de correção da toxidez tornam-se

elevados (ZHANG et al., 2007).

A opção mais promissora, neste caso, é a exploração do potencial genético das

culturas porque as espécies diferem amplamente na tolerância ao excesso de alumínio

tóxico no solo. As plantas respondem diferentemente ao alumínio, e estas respostas

são caracterizadas por alterações fisiológicas oriundas de diferentes comportamentos

bioquímicos (VITORELLO et al., 2005). O estudo das respostas à toxicidade do

alumínio em espécies sensíveis e tolerantes vem sendo realizado em algumas espécies

como o trigo desde 1925, sendo que para a cultura de aveia poucos trabalhos foram

desenvolvidos (FEDERIZZI et al., 2000).

Estudos desenvolvidos no Departamento de Plantas e Lavoura da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), e em outras instituições,

mostraram que os genótipos de aveia dos programas de melhoramento apresentam

grande variabilidade quanto à tolerância ao alumínio tóxico. No estudo da herança

genética estes trabalhos revelaram que a tolerância em aveia é um caráter oligogênico

(BENIN et al., 2004). Com o aumento da utilização da aveia para o consumo humano, o

estudo do efeito do alumínio no crescimento e desenvolvimento dos diferentes

genótipos dessa cultura é de grande interesse para os programas de melhoramento e

também para os impactos ambientais causados por este metal para as mais diversas

espécies vegetais (DAVID et al., 2008).

Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo analisar o

comportamento dos diferentes genótipos de aveia (Avena sativa) em relação ao

alumínio; analisar o comportamento dos diferentes espécies vegetais como o pepino

(Cucumis sativus) que é um bioindicador de ambientes contaminados com metais

(PEREIRA et al., 2006; CARGNELUTTI et al., 2006; GONÇALVES et al., 2009); os

efeitos deste metal no crescimento das plantas, na ativação das enzimas do sistema

antioxidante, e também de enzimas envolvidas no metabolismo de nutrientes como a

δ–Aminolevulinato desidratase (δ–ALA-D) propondo assim possíveis relações

bioquímicas e fisiológicas entre as plantas e a toxicidade causada pelo alumínio.

1.1 OBJETIVOS

1.1.1 Objetivo geral

Avaliar as respostas bioquímicas e fisiológicas de pepino e de aveia na

toxicidade causada pelo alumínio.

1.1.2 Objetivos específicos

1) Avaliar os efeitos do alumínio no crescimento de plântulas de pepino e de

plântulas dos três genótipos de aveia UFRGS 17, UFRGS 280 e UFRGS 930598 e

avaliar se o estresse oxidativo causado pelo alumínio é um sinal inicial que pode

desencadear inibição do crescimento da raiz nos diferentes genótipos de aveia.

2) Quantificar o conteúdo de clorofila e analisar a atividade da enzima δ–

Aminolevulinato desidratase (ALA-D) de plântulas de pepino e dos três genótipos de

aveia expostos ao alumínio.

3) Avaliar os níveis de peroxidação lipídica e o conteúdo de peróxido de

hidrogênio induzidos por alumínio em plântulas de pepino e dos três genótipos de

aveia.

4) Analisar a atividade das enzimas superóxido dismutase, ascorbato

peroxidase e catalase de plântulas de pepino e aveia expostos ao alumínio e identificar

e caracterizar os possíveis mecanismos de tolerância presentes nos diferentes

genótipos de aveia.

5) Comparar as respostas encontradas nos genótipos de aveia com os

resultados encontrados para o pepino (Cucumis sativus), com a finalidade de identificar

se o pepino é uma espécie sensível ou tolerante ao alumínio.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Os solos ácidos

Os solos ácidos ocorrem em aproximadamente 50% da terra em todo o

planeta. A acidificação do solo devido ao uso de fertilizantes ou chuvas ácidas,

causadas pela poluição industrial, são uma ameaça crescente para a agricultura e para

os ecossistemas naturais (YOKEL, 2001).

Os solos ácidos apresentam pH menor ou igual a 5,5 e promovem a inibição do

crescimento das plantas, especialmente devido à deficiência de nutrientes e ao

estresse causado pelo alumínio (Al). O Al é um metal que compõe cerca de 8% da

crosta terrestre e é o terceiro elemento mais abundante depois do oxigênio e do silício.

Grande parte deste Al ocorre como óxidos inofensivos e aluminossilicatos. Entretanto,

quando os solos tornam-se ácidos como um resultado de processos naturais ou

atividades humanas o Al é solubilizado na forma do cátion trivalente tóxico,

(DELHAIZE et al., 2001; MORITA et al., 2007).

Este metal afeta aproximadamente 40% das terras aráveis do planeta que são

potencialmente usadas para a produção de biomassa e alimentos (Ma et al., 2001). O

Al trivalente, a espécie fitotóxica, inibe o crescimento da raiz e a captação de água e de

nutrientes, resultando em um atraso no desenvolvimento da planta (KOCHIAN,1995;

DELHAIZE et al., 2001). Considera-se a toxidez do Al um dos principais fatores

limitantes da produtividade agrícola em solos ácidos (FOY et al., 1992; JEMO et al.,

2005; ZHANG et al., 2007).

Ainda mais relevante é o fato de que muitas dessas áreas estão localizadas em

países em desenvolvimento da América do Sul, África Central e Sudoeste da Ásia. A

acidez dos solos é uma ocorrência natural em solos tropicais e subtropicais e pode

resultar do desequilíbrio nos ciclos de nitrogênio, enxofre e carbono (BOLAN &

HEDLEY 2003); maior captação de cátions em comparação com ânions e menor

fixação de nitrogênio por leguminosas (BOLAN et al., 1991).

Os níveis de acidez do solo aumentam em decorrência das atividades

humanas tais como, a liberação atmosférica de poluentes industriais associadas com a

lixiviação de solos com chuvas ácidas, atividades de mineração e, no setor agrícola, a

nitrificação subseqüente à aplicação de altas doses de fertilizantes amoniacais

(ZHANG, 2007; SILVA et al., 2006).

A maioria dos solos do Rio Grande do Sul e do Brasil são solos ácidos. No

Brasil aproximadamente 500 milhões de hectares apresentam solos ácidos,

compreendendo dois terços de seu território total – a maior área de solos ácidos dentro

de um único país (VITORELLO et al., 2005). Um estudo abrangendo 26 solos de

regiões brasileiras mostrou que os valores de pH da camada superficial variaram entre

3,78 e 5,52 e que o Al

foi o cátion trocável predominante em mais de um terço dos

solos com pH inferior a 5,6 (ABREU et al., 2003).

Desta forma as raízes das plantas estão quase sempre expostas ao Al

(DELHAIZE et al., 2001). A produção de alimentos, principalmente de grãos é afetada

negativamente por estar em solos ácidos; 20% da produção de milho e 13% da

produção de arroz do planeta estão em solos ácidos (DELHAIZE et al., 2001). Portanto,

os solos ácidos limitam a produtividade de culturas em muitos países em

desenvolvimento (KOCHIAN et al., 2004).

2.1.1 Alumínio (Al)

O Al é o metal mais abundante e o terceiro elemento mais comum na crosta da

terra. A mais rica fonte é o triidrato de alumínio ou bauxita, o minério do qual o Al é

derivado. O Al também combina-se com o silício para formar o aluminossilicato, o maior

constituinte das rochas, argilas e solos. Apesar de sua disponibilidade difundida, parece

que este metal não é requerido para os processos biológicos. Ao mesmo tempo, várias

formas químicas de Al são tóxicas para as plantas, peixes e humanos. A toxicidade do

Al é o fator limitante primário das plantações em solos ácidos, que compõe

aproximadamente 50% da crosta terrestre (KOCHIAN et al., 2004; VITORELLO et al.,

2005).

As formas de alumínio que ocorrem na natureza são usualmente não tóxicas e

estáveis. Sob certas condições, entretanto, o Al pode tornar-se solúvel, como por

exemplo quando um ambiente torna-se ácido ou quando os níveis de matéria orgânica

no solo são altos. Tais processos produzem uma ampla variedade de formas solúveis

de Al inorgânico (monômeros tais como, Al

, Al(OH)

) e formas orgânicas de Al

(KOCHIAN, 1995).

Portanto, a medida que os solos se acidificam, íons Al passam a ocupar as

posições de troca catiônica, em superfícies eletronegativas dos colóides, em

substituição aos cátions removidos pela lixiviação, onde concentrações de espécies de

Al podem alcançar níveis tóxicos para os organismos (ZHANG, 2003).

O interesse em estudar o Al tem aumentado a cada ano devido aos efeitos

prejudiciais do Al sobre o ambiente e a saúde humana (KOCHIAN, 1995). O Al entra em

contato com o corpo humano através da comida, ar, água, e drogas (YOKEL, 2001).

Embora somente uma pequena porção de alumínio seja absorvida pelo trato

gastrintestinal, a ingestão oral representa a via de entrada no organismo com maiores

implicações toxicológicas (TESTOLIN et al., 1996).

Em plantas, o Al é absorvido pela raiz e o principal sintoma de toxidez é a

inibição do crescimento, que parece ser causada por vários mecanismos, incluindo

lesões apoplásticas, interações na parede celular, membrana plasmática ou no

simplasma da raiz (DIPIERRO, 2005). A inibição do crescimento da raiz resulta em um

sistema radicular reduzido que pode levar a deficiência mineral e ao estresse hídrico

(KOCHIAN, 1995).

A toxidez causada pelo Al aumenta o rompimento dos dictiossomos e sua

função secretória, a vacuolização e o turnover de grãos de amido na ponta e nas

células meristemáticas da raiz (TAMÁS et al., 2006). A extensão da inibição do

crescimento da raiz é comumente usada como uma medida de toxicidade do Al

(KOCHIAN, 1995). Entretanto, o crescimento da raiz é um processo complexo e

dinâmico. Provavelmente, vários processos bioquímicos e fisiológicos podem já ter sido

alterados antes da inibição do crescimento da raiz induzida por Al (ZHANG, 2003). A

literatura é rica em relatos mostrando que numerosos processos bioquímicos e

fisiológicos são afetados em várias espécies dentro de minutos ou horas após a

exposição ao Al, entre eles o estresse oxidativo (YAMAMOTO et al., 2002). Uma

característica comum a vários tipos de estresse é a produção de muitas moléculas do

radical superóxido, (O

°-

), radical hidroxil (

OH), e peróxido de hidrogênio (H

)

(CHAFFAI, 2005). Essas espécies reativas de oxigênio (EROs) altamente citotóxicas

podem causar dano oxidativo a biomoléculas tais como os lipídeos, as proteínas, os

pigmentos e os ácidos nucléicos, levando à peroxidação de lipídeos de membrana,

perda de íons, hidrólise de proteínas e até mesmo dano ao DNA (ZHANG et al., 2007).

Estudos de toxicidade com o Al em raízes sugerem que a produção de EROs podem

contribuir para a inibição induzida por Al do alongamento da raiz (YAMAMOTO et al.,

2003).

2.2 Estresse oxidativo

O estresse oxidativo corresponde a um estado em que há uma elevada

produção de EROs, onde os mecanismos celulares pró-oxidantes superam os

antioxidantes. A terminologia espécies reativas de oxigênio (EROs ou ROS: “reactive

oxygen species”) inclui as espécies chamadas de radicais livres e outras que, embora

não possuam elétrons desemparelhados, são muito reativas em decorrência de sua

instabilidade (MARRONI, 2002).

O oxigênio molecular (O

) é relativamente não reativo e não tóxico, devido a

estrutura estável de elétrons na sua camada externa. Ele é necessário para a

sobrevivência de todos os organismos aeróbicos. Assim, a obtenção de energia por

estes organismos é feita na mitocôndria através da fosforilação oxidativa onde o O

reduzido por quatro elétrons à H

Entretanto, alterações na distribuição dos elétrons

podem provocar a sua ativação e influenciar os sistemas biológicos. As EROs podem

ser geradas dentro das plantas como resultado da excitação do elétron externo,

formando oxigênio singlet (

) ou de uma sucessiva adição de elétrons ao oxigênio

molecular produzindo O

°-

OH, e H

.. Essas moléculas são ditas reativas porque não

necessitam da entrada de energia para reagir com outras moléculas (RESENDE et al.,

2003). Abaixo serão descritas espécies reativas de oxigênio que podem ser formadas

como resultado da toxicidade causada pelo alumínio:

Radical Superóxido (O

°-

): pode ser produzido na planta por meio de vários

mecanismos, inclusive pela ativação de NADPH-oxidases/sintases ligadas à membrana,

peroxidases da parede celular, lipoxigenases e como resultado da transferência de

elétrons da mitocôndria ou do cloroplasto. Normalmente, oxida várias moléculas

orgânicas, como o ascorbato, ou como redutor de metais como Fe

, nas reações de

Haber-Weiss ou Fenton (BREUSEGEM et al., 2001).

Peróxido de hidrogênio (H

): a maioria do H

celular surge da dismutação do O

°-

catalisada pela enzima superoxido dismutase. Peróxido de hidrogênio é um oxidante

relativamente estável e ausente de carga, o que pode facilitar a passagem através da

camada lipídica da membrana celular. Essa capacidade de difundir-se rapidamente

através da membrana celular favorece a rápida elicitação da resposta vegetal

(MITTLER, 2002; CHAFFAI et al., 2005).

Radical hidroxila (

OH): embora os radicais hidroxila tenham meia-vida curta, são

radicais potencialmente fortes e com alta afinidade à biomoléculas no seu sítio de

produção (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989; POSCHENRIEDER et al., 2008), o que

dificulta o estudo desses radicais.

Oxigênio singlet (

): semelhante aos radicais hidroxila, os

tem meia-vida curta e

são altamente destrutivos, reagindo com a maioria das moléculas biológicas (MITTLER,

2002; GIANNAKOULA et al., 2007), porém a maioria dos danos são próximos aos sítios

onde são produzidos. São predominantemente gerados nos cloroplastos, através da

transferência de energia de uma clorofila foto-excitada para o elétron do oxigênio

molecular. O

reage facilmente com ligações duplas e têm alta afinidade com

“dienos” na membrana e aminoácidos específicos como histidina, metionina, triptofano e

cisteína. Sob condições fisiológicas normais, a produção de EROs nas células é baixa e

se mantém constante nos cloroplastos. Quando produzidas em excesso elas tornam-se

danosas à célula vegetal (MITTLER, 2002).

As EROs também tem a função de sinalizadoras nas células vegetais, e

requerem no mínimo dois mecanismos diferentes para regular as concentrações

intracelulares destas espécies reativas. Um mecanismo permite a fina modulação de

baixos níveis de EROs com o propósito de sinalização e o outro mecanismo permite a

remoção do excesso de EROs, especialmente durante o estresse. Os processos

oxidativos normais da célula são responsáveis pela geração destas espécies reativas.

Durante o transporte de elétrons nos cloroplastos e mitocôndrias, muitos desses

elétrons são perdidos, e então captados pelo O

formando as EROs (DELHAIZE et al.,

2009). Fatores abióticos tais como extremos de temperatura, poluentes, estresse

osmótico e mecânico, podem aumentar a produção de EROs. Contudo, os elicitores

mais efetivos são macromoléculas derivadas de patógenos e a toxicidade causada por

metais (POSCHENRIEDER et al., 2008).

Estudos de toxicidade de Al em raízes sugerem que a produção de EROs pode

contribuir para a inibição induzida por Al do alongamento da raiz (YAMAMOTO et al.,

2003; MORITA et al., 2007; DELHAIZE et al., 2009).

2.2.1 Enzimas antioxidantes

Como o acúmulo das EROs pode resultar em prejuízos consideráveis, a célula

dispõe de vários mecanismos para detoxificar eficientemente essas EROs. Esses

mecanismos de proteção foram desenvolvidos pelas plantas durante o processo de

evolução, para controlar os níveis dessas moléculas e anular essa toxicidade.

Moléculas antioxidantes, enzimas simples e um sistema mais complexo de

destoxificação podem estar envolvidos na proteção celular contra as EROs. Conhecida

como “scavengers”, várias enzimas reguladoras impedem a ação tóxica das EROs à

célula vegetal (BOWLER, 1992; MITLER, 2002). Abaixo serão descritas algumas

enzimas antioxidantes presentes nas células:

Catalase: são enzimas que convertem o H

em H

O e O

e estão presentes nos

peroxissomos e glioxissomas. As catalases são as principais enzimas de detoxificação

do H

em plantas e podem ser divididas em três classes: catalases da classe I que

removem o H

produzido durante a fotorrespiração em tecidos fotossintéticos;

catalases da classe II que são produzidas em tecidos vasculares e podem exercer uma

função de lignificação, mas sua exata função biológica permanece desconhecida e na

classe III estão as catalases presentes abundantemente em sementes e plantas jovens,

cuja atividade está relacionada à remoção do H

produzido durante a degradação dos

ácidos graxos no glioxissoma (BREUSEGEM et al. 2001, RESENDE et al., 2003).

Ciclo do ascorbato/glutationa: principal sistema de remoção de EROs nos

cloroplastos. Nesse ciclo são empregadas quatro enzimas: ascorbato peroxidase (APX),

deidroascorbato redutase (DHA), monodeidroascorbato redutase (MDA) e glutationa

redutase. O H

pode ser reduzido e removido pela APX através do ascorbato como

redutor, formando o radical monodeidroascorbato (MDA°) (YOSHIMURA et al., 2000).

Esse por sua vez irá dismutar para deidroascorbato (DHA) e ascorbato (MILTTLER

2002; RESENDE et al., 2003).

Superóxido dismutase: A SOD participa ativamente na remoção do O

°-

gerado

através de diferentes processos do metabolismo celular, tais como o transporte de

elétrons na mitocôndria e cloroplasto (MITTLER, 2002). O Zn se encontra associado

com o cobre (Cu) na isoenzima superóxido dismutase dependente de Cu e Zn (Cu/Zn

SOD). A Cu/Zn SOD está localizada nos cloroplastos, citosol e possivelmente no

espaço extracelular. Muito provavelmente o átomo de Cu é o componente catalítico e o

Zn é o componente estrutural da Cu/Zn SOD. Contudo, na deficiência do Zn, a atividade

da Cu/Zn SOD é drasticamente reduzida, mas pode ser restabelecida in vitro pelo

suprimento de Zn (INZÉ & MONTAGU, 1995). Portanto, o átomo de Zn é um

componente estrutural essencial para o funcionamento normal da Cu/Zn SOD. A

redução na atividade da SOD ocorre com um aumento simultâneo do acúmulo de O

°-

O radical superóxido é um dos principais oxidantes responsáveis pela peroxidação de

lipídeos e conseqüente aumento na permeabilidade das membranas (INZÉ &

MONTAGU , 1995).

2.3 A enzima delta - aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D)

A enzima citoplasmática delta-aminolevulinato desidratase (E.C. 4.2.1.24),

também conhecida como porfobilinogênio sintetase (PBGS) foi isolada na década de 50

a partir de fígado bovino (GIBSON et al., 1955). Esta enzima catalisa a condensação

assimétrica de duas moléculas de ácido delta-aminolevulínico (ácido 5-aminolevulínico-

ALA), com perda de duas moléculas de água, formando o composto monopirrólico

porfobilinogênio - PBG (JAFFE, 1995).

As seqüências do gene da δ-ALA-D isolada de diversas fontes tais como

humanos, bactérias, camundongos e vegetais apresentam grande similaridade

(WETMUR et al., 1986; ECHELARD et al., 1988; BISHOP et al., 1989; BOESE et al.,

1991), sugerindo que a enzima possui estrutura e mecanismo de ação semelhante em

diferentes organismos.

No mecanismo proposto para a síntese do porfobilinogênio, um resíduo de lisina

do sítio ativo da enzima forma uma base de Schiff com a primeira molécula do substrato

(ALA), originando a cadeia lateral P (cadeia propiônica), enquanto uma segunda

molécula de ALA origina a cadeia lateral A (acética) do porfobilinogênio

(CASTELFRANCO & BATLE, 1983). As duas moléculas de substrato interagem no sítio

ativo da enzima, aparentemente, através da formação de uma segunda base de Schiff

(ligação carbono-nitrogênio) (JAFFE et al., 1995). As reações enzimáticas do ácido

aminolevulínico (ALA) até a protoporfirina IX são comuns para a biossíntese de

tetrapirróis em todos os organismos e este caminho leva a biossíntese de cofatores

biologicamente importantes, tais como, heme, clorofilas e vitamina B12 (SHOOLINGIN-

JORDAN, 1998).

NAITO et al., (1980) sugeriram que a biossíntese de clorofila pode ser regulada

pela atividade da ALA-D. Diminuída atividade da ALA-D concomitante com reduzido

conteúdo de clorofila tem sido relatado em muitas plantas terrestres expostas a várias

concentrações de chumbo, cádmio e mercúrio (STOBART et al., 1985). Tendo em vista

a importância da enzima delta-aminolevulinato desidratase em plantas e com a

finalidade de melhor entender os mecanismos de toxicidade do alumínio denota-se a

importância dos estudos do efeito do alumínio na atividade da enzima ALA-D.

2.4 Desenvolvimento Vegetal e Estratégias de Resistência ao Alumínio

Nas plantas, o crescimento consiste na conversão de substâncias inorgânicas

relativamente simples (água, CO

e elementos minerais) em quantidades cada vez

maiores de proteínas e carboidratos (e também gorduras). A embriogênese inicia o

desenvolvimento da planta, mas diferentemente dos animais, é um processo contínuo,

estabelecendo o plano básico do corpo vegetal e formando os meristemas que geram

os órgãos adicionais no adulto. A maior parte do desenvolvimento vegetal é pós-

embrionária e ocorre a partir dos meristemas, os quais podem ser considerados

fábricas celulares onde os processos de divisão celular, expansão e diferenciação

geram o corpo vegetal. Os meristemas vegetativos são altamente repetitivos produzindo

a mesma ou similar estrutura reiteradas vezes, podendo sua atividade continuar

indefinidamente, fenômeno conhecido como crescimento indefinido (TAIZ & ZEIGER,

2004).

O crescimento primário ocorre relativamente próximo às extremidades das

raízes e caules. Ele é iniciado pelos meristemas apicais e está primariamente envolvido

com a extensão do corpo da planta – o crescimento vertical. Além do crescimento

primário, muitas plantas passam por um crescimento adicional que aumenta em

espessura o caule e a raiz, tal crescimento é denominado crescimento secundário

(RAVEN et al., 2001).

Os estímulos do meio ambiente causam mudanças drásticas no

desenvolvimento das plantas. Em contraste, as flutuações ambientais pouco afetam o

curso e a maneira do desenvolvimento em animais superiores, a não ser seus ciclos

sexuais e seus hábitos de dormência. A razão plausível dessa diferença é que os

animais superiores passam apenas uma vez pelo crescimento formativo, não

apresentando crescimento progressivo e indefinido; eles não formam uma multiplicidade

de centros de crescimento (que são responsáveis pelo crescimento progressivo em

vegetais), que a qualquer momento podem reproduzir o comportamento do organismo

todo. O crescimento de uma planta pode ser medido de várias maneiras: comprimento

total do sistema radicular, comprimento da parte aérea, peso fresco e peso seco total. O

fundamento da análise do crescimento é a medida seqüencial do acúmulo de matéria

orgânica e a sua determinação é feita considerando o peso seco da planta. A fim de

que o crescimento total da planta possa ser estimado, as raízes devem ser

consideradas como importantes componentes do vegetal, já que o desenvolvimento da

raiz refletirá no desenvolvimento de toda planta (FERRI, 1985; TAIZ & ZEIGER., 2004).

As plantas podem ser classificadas conforme sua sensibilidade ou resistência a

toxidez do alumínio. As plantas com baixa resistência ao alumínio são capazes de

crescer somente em solos com baixos níveis deste elemento, entretanto plantas com

moderada ou alta resistência podem sobreviver em altas concentrações de alumínio

(OSAKI et al., 1997). Algumas plantas apresentam mecanismos para tolerar o estresse

ao alumínio permitindo que elas cresçam em solos ácidos. Muitas secretam ácidos

orgânicos pelas raízes em resposta ao tratamento com alumínio. O citrato, o oxalato e o

malato são alguns dos ácidos orgânicos que podem formar fortes complexos com o

. Ao ser absorvido o Al

é quelado internamente pelo oxalato, formando um

complexo (Al-oxalato) que é levado até o xilema, onde o alumínio passa a se ligar ao

citrato. Ao chegar na folha, o alumínio é armazenado no vacúolo e o oxalato voltará a

se complexar ao Al

impedindo que este elememto fique livre para se ligar a moléculas

biológicas (DELHAIZE et al., 2001). As espécies sensíveis ao alumínio apresentam de

forma mais evidente os efeitos da toxicidade do alumínio, tais como a inibição do

desenvolvimento e do crescimento do sistema radicular (PUTHOTA et al., 1991).

2.5 Mecanismos externos de resistência

2.5.1 Ligação ou fixação do alumínio na parede celular

Muitas plantas que crescem em ambientes ácidos não acumulam alumínio em

suas folhas e a maioria desse alumínio permanece na parede celular da raiz. Sugere-se

que este seja o maior sítio de acúmulo do alumínio e que esta ligação limita o

movimento do alumínio no simplasma (YAMAMOTO et al., 2003). O alumínio liga-se

principalmente à celulose que é um componente da parede celular, mas as interações

precisas do alumínio com os constituintes da parede celular permanecem pouco

exploradas (JANSEN et al., 2002). A maioria do alumínio está localizada na epiderme e

nas células do córtex periférico da raiz e a penetração do alumínio no cilindro central

parece ser prevenida. YAMAMOTO et al. (2003) sugeriram que plantas com uma alta

capacidade de troca de cátions na raiz são geralmente mais sensíveis ao alumínio que

as plantas que apresentam uma baixa capacidade de troca de cátions. O transporte de

alumínio para a parte aérea é feito via xilema, e as paredes do xilema tem uma alta

capacidade de troca de cátions o que causa um retardo no movimento dos cátions de

alumínio (DELHAIZE et al., 2009).

2.5.2 Exudação de ligantes que quelam o alumínio

MA et al. (2001) sugeriram que ácidos orgânicos com alta capacidade de se

ligar ao alumínio desempenham uma importante função na detoxificação do alumínio.

Estudos tem demonstrado que formas queladas de alumínio são menos tóxicas para o

crescimento da planta do que as formas iônicas. DELHAIZE et al. (1993) sugeriram que

o malato liberado protege o ápice da raiz (o sítio de maior toxicidade do alumínio).

Vários outros estudos mostram que a resistência ao alumínio está relacionada à

excreção de ligantes que quelam o alumínio (ácidos orgânicos) no ápice da raiz como

citrato em Cassia tora e soja (Glycine Max) (YANG et al., 2000), citrato e malato em

mutantes de Arabdopsis thaliana (LARSEN at al., 1998) e oxalato em Fagopyrum

esculentum (MARSCHNER, 1995). A análise do xilema em plantas acumuladoras

mostra o envolvimento de ácidos orgânicos no transporte do alumínio (DELHAIZE et al.,

2001) (Fig. 1).

Figura 1. Desenho esquemático dos mecanismos de tolerância ao alumínio. Adaptado de

Delhaize et al. (2003).

2.5.3 Permeabilidade seletiva da membrana plasmática ao Al

As plantas que acumulam alumínio mostram uma alta concentração deste

metal na parte aérea sem efeitos prejudiciais, o que sugere que o alumínio seja

transportado através da membrana plasmática pelo simplasma (SILVA et al., 2006).

A principal diferença entre plantas que acumulam alumínio e as que excluem

pode ser a permeabilidade das células da endoderme. A endoderme de plantas não

acumuladoras limita a entrada do alumínio para o cilindro central, entretanto a

endoderme de plantas acumuladoras não limita a entrada do metal. Testes

histoquímicos realizados em plantas não acumuladoras mostraram a ausência do

alumínio nas células endodérmicas (JANSEN et al., 2002).

2.6 Mecanismos Internos de Resistência ao Al

A seguinte hipótese é sugerida para a detoxificação interna de alumínio após

sua entrada no citoplasma: formação de agregados de alumínio com ácido orgânico,

proteínas ou outros ligantes e compartimentalização do alumínio no vacúolo (KOCHIAN,

1995; MA et al., 2001).

Os ácidos orgânicos são importantes para a detoxificação interna do alumínio

porque eles se ligam ao alumínio e impedem que este metal se ligue a outras

biomoléculas (MA et al., 2001; DELHAIZE et al., 2001). O alumínio tem uma forte

afinidade por compostos doadores de oxigêno como o fosfato inorgânico, ATP, RNA,

DNA, proteínas, ácidos carboxílicos e fosfolipídeos. Os mecanismos de detoxificação

interna são pré-requisitos para a tolerância ao alumínio em plantas que acumulam este

metal. Em Camellia sinensis a maioria do alumínio está ligado nas catequinas,

compostos fenólicos e ácidos orgânicos. Em folhas de Hydrangea, ele está ligado ao

ácido cítrico (MORITA et al., 2007). Em Fagopyrum esculentum e Melastoma

malabathricum o alumínio está ligado ao ácido oxálico. Todas estas espécies crescem

normalmente e apresentam altas concentrações de alumínio em suas folhas (JANSEN

et al., 2002).

2.6.1 Mecanismos genéticos de tolerância ao alumínio

A genética da resistência ao alumínio tem sido estudada em várias espécies

agrícolas importantes. A tolerância ao alumínio é controlada por um gene em Hordeum

vulgare e Triticum (DELHAIZE et al., 2009) enquanto parece ser controlada por vários

genes em Secale cereale e outras espécies como Glycine max (LARSEN et al., 1998).

Outros pesquisadores mostraram que a resistência ao alumínio é um traço que pode

ser controlado por um ou mais genes e vários genes menores (POSCHENRIEDER et

al., 2008). Em Arabidopsis thaliana a resistência ao alumínio é controlada por dois

diferentes genes (LARSEN, 1998; EZAKI et al., 2000). Além disso, verificou-se que

esses dois genes controlam dois mecanismos distintos: liberação de ácidos orgânicos

que se ligam ao alumínio e previnem sua captação pela raiz e o aumento do pH ao

redor do ápice da raiz que diminui a concentração de alumínio tóxico. Portanto, é

improvável que a resistência ao alumínio seja o resultado de um único mecanismo em

todas as espécies vegetais (KOCHIAN, 1995; POSCHENRIEDER et al., 2008;

DELHAIZE et al., 2009).

2.6.2 Acúmulo do alumínio em angiospermas

Plantas acumuladoras de alumínio ou “aluminum hyperaccumulators” é o nome

dado as plantas que acumulam concentrações acima ou iguais a 1000 mg Kg

-1

(JANSEN et al., 2004). Existem aproximadamente 55 famílias de angiospermas que

apresentam espécies acumuladoras de alumínio, sendo que 93% de todos os

acumuladores de alumínio que estão descritos pertencem às subclasses Rosidae e

Asteridae. Dentro destes grupos os acumuladores de alumínio estão principalmente

entre as ordens Myrtales e Gentianales que contam com aproximadamente 42,5% e

35% respectivamente do total de acumuladores conhecidos (Fig. 2). Exemplo de

famílias que incluem espécies acumuladoras de alumínio: família Hydrangeaceae,

Melatomataceae, Rubiaceae, Theaceae, Symplocaceae e Vochysiaceae. A espécie

Camellia sinensis da família Theaceae tem grande importância comercial, sendo muito

utilizada como chá (chá da Índia). Outra espécie frequentemente citada é a Hydrangea

macrophylla (conhecida popularmente como hortênsia). A coloração azul ou cor de rosa

das pétalas nas inflorescências da hortência depende da concentração de alumínio na

parte aérea das plantas (JANSEN et al., 2002). Nas monocotiledôneas existem

espécies que acumulam alumínio principalmente nas famílias Liliaceae e Poaceae

(Gramíneas).

A ocorrência do acúmulo do alumínio nestas famílias pode ilustrar a conexão

próxima desta característica com a taxonomia. Estudos filogenéticos recentes baseados

na sequência molecular procuram desvendar de maneira mais minunciosa a tendência

evolucionária de caracteres fitoquímicos (SOLTIS et al., 2000).

G ymnosperm s

AMB O R ELLACEA E (1)

Nymphaeaceae

Austrobaileyaceae

Schisandraceae

ILLIC IA C EA E (4)

MO N O C O TS (41)

WINTE R A LES (2)

LA U RA LES (92)

Magnoliales

Chloranthales

Piperales

Ceratophyllales

RA N U NCU LA LES (9)

Sabiaceae

PRO TEALES (67)

Trochodendraceae

Buxaceae/Didymelaceae

Caryophyllales

SANTALA LES (9)

Berberidopsidales

G unnerales

ERIC A LES (299)

CO RNA LE S (36)

AQ UIFO LIA LES (47)

Apiales

Dipsacales

Asterales

G arryales

G E N TIA N A LES (1158)

Solanales

LA MIALES (6)

SAXIFR A G A LE S (7)

G eraniales

MYRTA LE S (1408)

Crossosomatales

Brassicales

Malvales

SAPIN D A LES (1)

MA LP IG H IA LES (99)

O X A LID A LES (14)

Celastrales

Zygophyllales

FAB A LE S (36)

Rosales

CU C U RBITALES (23)

FAG A LES (16)

Figure 2. Acúmulo do alumínio em Angiospermas. Dentro do parêntese está o número de

espécies conhecidas que acumulam alumínio. (Fonte: Jansen et al., 2004).

Entre as dicotiledôneas que apresentam sensibilidade à ambientes

contaminados com metais, podemos citar o pepino (Cucumis sativus) pertencente a

ordem Cucurbitales, que apresenta 23 espécies que acumulam alumínio. A aveia

(Avena sativa) está entre as monocotiledôneas, que apresentam 41 espécies

acumuladoras de alumínio (JANSEN et al., 2004).

2.7 Pepino (Cucumis sativus)

O pepino é originário das regiões montanhosas da Índia e apropriado para o

plantio em regiões tropicais e temperadas. Tem sido cultivado desde a Antiguidade na

Ásia, África e Europa. Foi trazido para a América por Cristovão Colombo. A espécie

apresenta grande variação, entre os inúmeros cultivares, quanto ao tamanho, forma,

cor dos frutos, sabor e características vegetativas. Os pepineiros são plantas

trepadeiras, anuais, com folhas lobadas e flor amarela. Os frutos são longos, com casca

verde clara com estrias e manchas escuras, a polpa é de cor clara, com sementes

achatadas semelhantes as do melão, que é outro membro da família Cucurbitaceae.

Embora não tenha grande importância econômica, é utilizado normalmente para

alimentação em forma de saladas. A utilização desta espécie em estudos científicos

tem aumentado nas últimas décadas devido a rápida germinação das sementes em

laboratório (KANG et al., 2002; ZHU et al., 2004) e também por ser um indicador de

ambientes contaminados por metais como cádmio, mercúrio e alumínio

(CARGNELUTTI et al., 2006; PEREIRA et al., 2006; GONÇALVEZ et al., 2009).

2.8 Aveia (Avena sativa)

A aveia é um cereal do gênero Avena, da família Poaceae (Gramíneas). Foi

primeiramente cultivada no norte da Europa. A produção mundial de aveia se mantém

em torno de 50 toneladas por ano, o que representa 5 a 7% da produção mundial de

grãos. A maior parte da produção, aproximadamente 75% é representada por Avena

sativa (aveia branca). No Brasil a aveia é cultivada em oito estados: Rio Grande do Sul,

Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Rio de Janeiro

e Espírito Santo, locais onde a temperatura (20 a 25º C) favorece o seu

desenvolvimento vegetativo (WAGNER et al., 2001).

Existem múltiplas possibilidades de utilização da aveia, tais como produção de

grãos (alimentação humana e animal), forragem, cobertura de solo, adubação verde e

para inibir as infestações de plantas invasoras. Na alimentação humana, a aveia

representa um alimento multifuncional, superior em muitos aspectos em comparação

com outros tipos de grãos de cereais. Atualmente, mais aveia está sendo moída para

consumo humano, tornado-se necessário desenvolver cultivares que contenham

nutrientes nas proporções que são consistentes com baixo teor de gordura e alto teor

de fibra (FLOSS et al., 1997).

A variabilidade da tolerância ao Al é controlada geneticamente e os

mecanismos da herança são diferentes entre espécies e cultivares. Embora a base

genética ainda não esteja determinada em aveia, a variabilidade fenotípica observada

entre espécies e entre genótipos indica a possibilidade de progresso no melhoramento

de aveia para tolerância ao Al tóxico (FLOSS et al., 1997). Trabalhos desenvolvidos no

Departamento de Plantas e Lavoura da Universidade Federal do Rio Grande do Sul

(UFRGS), e em outras instituições mostraram que os genótipos de aveia apresentaram

grande variabilidade quanto à tolerância ao alumínio tóxico. FEDERIZZI et al. (2000)

concluíram que o caráter tolerância à toxidez de alumínio é uma característica herdável,

controlada por um gene e a ação gênica observada foi a dominância. Avaliando um

número maior de cruzamentos WAGNER e colaboradores (2001) obtiveram resultados

indicando a presença de um a dois genes dominantes envolvidos na tolerância ao

alumínio. A presença dos alelos A

e A

levou um maior grau de tolerância nos

genótipos estudados. UFRGS 17 foi identificado como um genótipo tolerante, UFRGS

930598 como sensível e UFRGS 280 originário do cruzamento de UFRGS 17 e UFRGS

930598, identificado como intermediário ao alumínio (FEDERIZZI et al., 2000).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 MANUSCRITOS

Os resultados que fazem parte desta Tese estão apresentados sob a forma de

um artigo e de quatro manuscritos. Os itens Materiais e Métodos, Resultados,

Discussão e Referências Bibliográficas, encontram-se nos próprios manuscritos.

Artigo I: Aluminum-induced oxidative stress in cucumber – aceito para

publicação na revista Plant Physiology and Biochemistry.

Manuscrito I: Differential responses of oat genotypes: oxidative stress induced

by aluminum.

Manuscrito II: Physiological and oxidative stress responses of three oat

genotypes to aluminum grown in hydropony.

Manuscrito III: Differential speed of activation in antioxidant system in three

genotypes of oat.

Manuscrito IV: Physiological and oxidative stress responses of two Avena

sativa genotypes and Cucumis sativus seedlings to aluminum in nutrient solution.

Artigo I - ALUMINUM-INDUCED OXIDATIVE STRESS IN CUCUMBER

Plant Physiology and Biochemistry

Running Title: CUCUMBER SEEDLINGS AND Al EXPOSURE

Full title: ALUMINUM-INDUCED OXIDATIVE STRESS IN CUCUMBER

Luciane Belmonte Pereira

1,3

Cinthia Melazzo de A. Mazzanti

1,3

, Jamile F. Gonçalves

1,3

Denise Cargnelutti

1,3

Luciane A. Tabaldi

, Alexssandro Geferson Becker

, Júlia Gomes

Farias

1,3

, Vanessa Battisti

1,3

, Denise Bohrer

, Fernando T. Nicoloso

, Vera M. Morsch

1,3

Maria R. C. Schetinger

1,3

Departamento de Química e

Biologia,

Programa de Pós-Graduação em Bioquímica

Toxicológica, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de Santa Maria,

97105-900, Santa Maria, RS, Brasil.

Corresponding author:

Dr. Maria Rosa Chitolina Schetinger

Departamento de Química

Centro de Ciências Naturais e Exatas

Universidade Federal de Santa Maria

Santa Maria RS Brasil - 97105-900

Fax: 0+555532208978

e-mail: [email protected]

ABSTRACT

Aluminum (Al) is one of the most abundant elements of the planet and exposure to this

metal can cause oxidative stress and lead to various signs of toxicity in plants. Plants are essential

organisms for the environment as well as food for humans and animals. The toxic effect of

aluminum is the major cause of decreased crop productivity in soils. Thus, the objective of the

present study was to analyze the effects of aluminum on the activity of antioxidant enzymes such

as catalase (CAT - E.C. 1.11.1.6), superoxide dismutase (SOD - E.C.1.15.1.1) and ascorbate

peroxidase (APX - E.C. 1.11.1.11), and on lipid peroxidation, electrolyte leakage percentage

(ELP) and chlorophyll and protein oxidation levels in Cucumis sativus L (cv. Aodai). Seedlings

were grown at different concentrations of aluminum ranging from 1 to 2000 µM for 10 days. The

increase in ELP and H

production observed in the seedlings may be related to the decreased

efficiency of the antioxidant system at higher aluminum concentrations. The antioxidant system

was unable to overcome toxicity resulting in negative effects such as lipid peroxidation, protein

oxidation and a decrease in the growth of Cucumis seedlings. Aluminum toxicity triggered

alterations in the antioxidant and physiological status of growing cucumber seedlings.

Keywords: Aluminum, Ascorbate peroxidase, Catalase, Cucumis sativus, Hydrogen peroxide,

Superoxide dismutase

Abbreviations

APX, ascorbate peroxidase; CAT, catalase; DMSO, dimethylsulphoxide; DNPH, 2,4-

dinitrophenylhydrazine; EDTA, ethylenediaminetetracetic acid; ELP, electrolyte leakage

percentage; MDA, malondialdehyde; NPSH, non-protein thiol groups; PBG, porphobilinogen;

PVP, polyvinylpyrrolidone; ROS, reactive oxygen species; SOD, superoxide dismutase; δ-ALA,

aminolevulinic acid; δ-ALA-D, δ-aminolevulinate dehydratase; TCA, trichloroacetic acid; TBA,

thiobarbituric acid; WC, water content.

1. Introduction

Various kinds of environmental stress induce the formation of reactive oxygen species

(ROS) in plant cells [1]. Sources of environmental stress include changes in temperature,

mechanical shock, UV light, exposure to the ozone, water deficiency, and an excess of metallic

ions. Under normal physiological conditions, cells produce ROS by reducing molecular oxygen

[2]. However, under environmental stress conditions this production is increased.

Although Al itself is not a transition metal and cannot catalyze redox reactions, the

involvement of oxidative stress in Al toxicity has been suggested [2]. Al is a major constituent of

soil and, consequently, plants grow in soil environments in which the roots are potentially

exposed to high concentrations of aluminum [3]. Al toxicity is one of the major factors limiting

crop production on acid soils and, since a large part of the world’s total land area consists of acid

soil, much attention has been given to Al toxicity [4, 5 and 6].

The first evident symptom of Al toxicity is the inhibition of root growth, which occurs

after very brief exposure of roots to Al [1, 3]. Exposure to Al was found to enhance oxidative

stress and was a decisive event in the inhibition of cell growth [1]. Cakmak and Horst [7] first

reported the relation between ROS and the enhancement of lipid peroxidation and small increases

in activities of enzymes such as superoxide dismutase (SOD) and peroxidases caused by Al in

root tips of soybean (Glycine max), suggesting a generation of ROS. Although many studies have

focused on this aspect of toxicity and various mechanisms of action have been proposed, the

causes of Al toxicity are still poorly understood.

All cells possess a defense system, consisting of various enzymes such as catalase (CAT -

E.C. 1.11.1.6), ascorbate peroxidase (APX - E.C. 1.11.1.11), and superoxide dismutase (SOD -

E.C.1.15.1.1). These enzymes reduce ROS under normal conditions, but if complete reduction

does not occur, the result may be a state of oxidative stress leading to the oxidation of

biomolecules (lipids, proteins and DNA) [2, 9] or even cell death [10]. Cucumis sativus is an

environmental bioindicator of ecosystems polluted with metals such as mercury [10], Al [11].

Studies realized in our laboratory have shown that the root system growth is reduced in the

presence of Al [11].

The present study describes mainly physiological aspects of Al toxicity focusing on

oxidative stress in Cucumis sativus seedlings and examines whether Al toxicology affects their

growth and development.

2. Material and methods

2.1 Plant material and growth conditions

Cucumis sativus L. seeds (cv. Aodai), commonly known as cucumber, provided by Feltrin Ltd.

(Santa Maria, RS) were germinated in glass recipients (100 mL) containing 15 mL of medium

with Al

(SO

)

diluted in a 0.5 % agar solution. No nutritive solution was added to the agar. The

seedlings made use of the seed nutrition in the initial stage of development, and in a previous

experiment, it was verified that up to the tenth day the plants did not suffer any nutrient

deficiency (data not shown). Seven different Al

(SO

)

treatments (0, 1, 10, 100, 500, 1000 and

2000 µM) were applied randomly. The medium pH was adjusted to 4.0 by tritation with HCL

solutions of 0.1 M and monitored daily. This pH maintained constant throughout the experiment.

Each experimental unit consisted of 6 seeds, totalizing 15 replicates per treatment. After

germination, the seedlings were maintained in a growth chamber with controlled temperature

(25±1

C) and photoperiod (16 h light; light intensity of 35 µmol m

-2

-1

at plant level).

2.2 Metal determination

Al content was determined in the roots and shoot of 10-day-old cucumber seedlings.

Approximately 50 mg of roots and shoots were digested with 4 mL HNO

utilizing the following

stages of heating: a) 50

C for 1 h; b) 80

C for 1 h; and 120

C for 1 h in a digester block (Velp,

Italy). The samples were then diluted to 50 mL with high-purity water. Al concentrations were

determined using a Model AAS 5 EA atomic absorption spectrometer (Analytic Jena, Germany)

equipped with a transversely heated graphite furnace and an autosampler (MPE 5). The content

absorbed was expressed in µg/g dry weight.

2.3 Ascorbate peroxidase (APX - E.C. 1.11.1.11)

For determination of APX activity, cucumber seedlings were homogenized in a 50 mM

HPO

(pH 7.0) containing 1 mM EDTA and 2% PVP, pH 7.8, at a ratio of 1:3 (w/v).

The homogenate was centrifuged at 13 000 x g for 20 min at 4°C, and the supernatant was used

for enzyme activity, which was assayed according to the modified method of Zhu [12]. The

reaction mixture, at a total volume of 2 mL, consisted of 25 mM sodium phosphate buffer (pH

7.0), 0.1 mM EDTA, 0.25 mM ascorbate, 1.0 mM H

and 100 µL extract. H

–dependent

oxidation of ascorbate was followed by a decrease in absorbance at 290 nm (E = 2.8 mM

-1

Ascorbate peroxidase activity was expressed as µmol oxidized ascorbate/min/mg protein.

2.4 Catalase (CAT - E.C. 1.11.1.6)

For the CAT assay, the cucumber seedlings were prepared by the homogenization of fresh tissue

material in a solution containing 50 mM KH

HPO

(pH 7.0), 10 g L

-1

PVP, 0.2 mM

EDTA and 10 mL L

-1

Triton X-100, at a ratio of 1:5 (w/v). After the homogenate was centrifuged

at 12 000 x g at 4ºC for 20 min, the supernatant was used for determination of CAT activity,

which was assayed according to the modified method of Aebi [13] by monitoring the

disappearance of H

by measuring the decrease in absorbance at 240 nm in a reaction mixture

with a final volume of 2 mL containing 15 mM H

in 50 mM KPO

buffer (pH 7.0) and 30 µL

extract. Catalase activity was expressed as ∆E/min/mg protein.

2.5 Superoxide dismutase (SOD - E.C.1.15.1.1)

The activity of superoxide dismutase was assayed according to McCord and Fridovich [14].

About 200 mg fresh tissues were homogenized in 5 mL of 100 mM KH

HPO

(pH 7.8)

containing 0.1 mM EDTA, 0.1% (v/v) Triton X-100 and 2% (w/v) polyvinyl pyrrolidone (PVP).

The extract was filtered and centrifuged at 22 000 x g for 10 min at 4ºC, and the supernatant was

utilized for the assay. The assay mixture consisted of a total volume of 1 ml, containing glycine

buffer (pH 10.5), 60 mM epinephrine and enzyme material. Epinephrine was the last component

to be added. The adrenochrome formation over the next 4 min was recorded at 480 nm in a UV-

Vis spectrophotometer. One unit of SOD activity is expressed as the amount of enzyme required

to cause 50% inhibition of epinephrine oxidation under the experimental conditions. SOD activity

was expressed as U SOD/mg protein. This method is based on the ability of SOD to inhibit the

autoxidation of epinephrine at an alkaline pH. Since the oxidation of epinephrine leads to the

production of a pink adrenochrome, the rate of increase of absorbance at 480 nm, which

represents the rate of autoxidation of epinephrine, can be conveniently followed. SOD has been

found to inhibit this radical-mediated process.

2.6 Determination of hydrogen peroxide

The H

contents of both control and treated seedlings were determined according to Loreto and

Velikova [15]. Approximately 100 mg of seedlings were homogenized at 4ºC in 2 mL of 0.1%

(w/v) trichloroacetic acid (TCA). The homogenate was centrifuged at 12 000g for 15 min and 0.5

mL of 10 mM KH

HPO

(pH 7.0) and 1 mL of 1M KI. The H

content of the

supernatant was evaluated by comparing its absorbance at 390 nm with a standard calibration

curve. The H

content was expressed as µmol/g fresh weight.

2.7 Protein oxidation

The reaction of carbonyls with dinitrophenyl hydrazine (DNPH) was used to determine the

amount of protein oxidation, as described by Levine [16]. Cucumber seedlings were

homogenized in a 25 mM KH

HPO

containing 10 ml L

-1

Triton X-100, pH 7.0, at a

ration of 1:5 (w/v). The homogenate was centrifuged at 13 000 x g for 30 min at 4°C. After the

DNPH-reaction, the carbonyl content was calculated by absorbance at 370 nm, using the molar

extinction coefficient (21 X 10

l/mol cm) and results were expressed as nmol carbonyl/mg

protein.

2.8 Estimation of lipid peroxidation and electrolyte leakage percentage (ELP)

The levels of lipid peroxides in the seedlings were determined by measuring malondialdehyde

(MDA) content from the thiobarbituric acid (TBA) reaction as described by El-Moshaty [17].

The plants were homogenized in 0.2 M citrate-phosphate buffer, pH 6.5, at a ratio of 1:20 (w/v).

The homogenate was filtered through two layers of paper filter and then centrifuged at 20 000 x g

at 4°C for 15 min. One milliliter of the supernatant fraction was added to an equal volume of

20% TCA containing 0.5% TBA. Tubes were placed in a 95°C water bath for 40 min, and then

immediately cooled on ice for 15 min. Samples were centrifuged at 10 000 x g for 15 min. The

absorbance of the supernatant at 532 nm was read and corrected for unspecific turbidity by

subtracting the value at 600 nm. MDA values were expressed in nmol MDA/mg protein.

The ELP was measured using an electrical conductivity meter and its determination was

based on the method of Lutts [18], with some modifications. Seedling samples were divided into

5 g segments and placed in individual stopped vials containing 50 mL of distilled water after

washes with distilled water to remove surface contamination. These samples were incubated at

room temperature (25ºC) on a shaker (100 rpm) for 24 h. Electrical conductivity of bathing

solution (EC1) was read after incubation. Samples were then placed in a thermostatic water bath

at 95ºC for 15 min and the second reading (EC2) was determined after cooling the bathing

solutions to room temperature. ELP was calculated as EC1/EC2 and expressed as %.

2.9 Chlorophyll determination

0.1 g cotyledons were weighed and used for chlorophyll determination. Chlorophyll was

extracted following the method of Hiscox and Israelstam [19] and estimated with the help of

Arnon’s formulae [20]. Fresh chopped cotyledon samples were incubated at 65ºC in

dimethylsulfoxide (DMSO) until the pigments were completely bleached. Absorbance of the

solution was then measured at 663 and 645 nm in a Spectrophotometer (Celm E-205D).

Chlorophyll content was expressed as µg g

-1

fresh weight.

2.10 Magnesium concentration

The cucumber seedlings were separated into shoot and roots and then were oven-dried at 65°C

until reaching a constant weight. The plant material was ground with a stainless steel grinder and

then digested in a mixture of HNO

- HClO

at a ratio of 4:1 (v/v). Magnesium (Mg

)

concentrations were measured with a GBC 932AAS atomic absorption spectrophotometer (GBC

Scientific Equipment Pty Ltd, Victoria, Australia). The macronutrient (Mg

) is expressed as g/kg

dry weight.

2.11 Protein determination

In all the enzyme preparations, protein was measured by the Coomassie blue method according to

Bradford [21] using bovine serum albumin as standard.

2.12 Statistical analysis

The experiments were carried out through a randomized design. The analyses of variance were

computed for statistically significant differences determined based on the appropriate F-tests. The

results are the means ± S.D. of at least three independent replicates. The mean differences were

compared utilizing the Tukey test. Three pools of 5 replicates each (n=3) were taken for all

analyses from each set of experiments.

3. Results

3.1 Metal determination

The Al content was determined in the roots and shoots of 10-day-old cucumber seedlings (Table

I). The roots and shoots showed an increase of Al at 10, 100, 500, 1000 and 2000 µM when

compared with the control. More aluminum was accumulated in the roots than in the shoot. The

maximum accumulation of Al was 34.16 µg/g dry weight in roots treated with 2000 µM (Table I).

Table I

Concentration of aluminum in root and shoots of cucumber.

Values are the mean ± SD of three independent experiments. Letters indicate statistical

differences at p<0.05.

Al concentration Root (µg / g dry weight) Shoot (µg / g dry weight)

0 µM 7.48 ± 0.19

5.17 ± 0.04

1 µM 9.67 ± 0.33

6.36 ± 0.05

10 µM 11.75 ± 1.39

8.85 ± 0.13

100 µM 18.64 ± 0.32

10.54 ± 0.14

500 µM 28.22 ± 1.65

12.69 ± 1.45

1000 µM 32.46 ± 0.98

17.69 ± 0.59

2000 µM 34.16 ± 1.89

18.33 ± 0.59

3.2 Activities of antioxidant enzymes

The presence of Al in the substrate caused an increase in CAT activity of about 18%, 18% and

20% at concentrations of 10, 100 and 500 µM, respectively (p<0.05). On the other hand, CAT

activity was reduced to basal levels at 2000 µM when compared with the control (figure 1A).

APX activity was increased by about 10%, 68% and 12% at 10, 100 and 500 µM

(SO

)

, respectively (p<0.05). Nonetheless, APX activity was inhibited at 1000 and 2000 µM

(figure 1B). The maximum APX activity was 0.70 µmol ascorbate oxidate/min/mg of protein at

100 µM Al

(SO

)

Figure 1C shows the SOD activity of cucumber seedlings. At the lower concentrations (1

– 500 µM Al

(SO

)

), a significant increase in SOD activity was observed. However, at the

highest aluminum concentration (2000 µM) there was a decrease in SOD levels.

Fig. 1 Effect of Al

(SO

)

on CAT activity (A), APX activity (B) and SOD activity (C) in 10 day

old cucumber seedlings. Data represent the mean ± SD of three different experiments. Letters

indicate statistical differences at p<0.05.

3.3 Lipid peroxidation, protein oxidation, electrolyte leakage and hydrogen peroxide levels

MDA content in the whole plant increased by 90% at levels of up to 500 µM in comparison with

the control, while it significantly decreased, at 1000 and 2000 µM, to levels near to the control

(figure 2A). Electrolyte leakage percentage (ELP) was significantly enhanced (figure 2B) at all

concentrations tested, except at 1 µM Al

(SO

)

. A significant increase of more than 50% was

observed for protein oxidation at all concentrations, whereas at 2000 µM there was an increase of

84% (figure 2D).

The effect of Al

(SO

)

on H

content is shown in figure 2C. The levels of endogenous

increased by about 70% in comparison to control plants at 100 µM Al

(SO

)

. At the

higher concentrations (1000 and 2000 µM), there was an increase in H

content of about of

34% and 55%, respectively.

Fig. 2 Effect of Al

(SO

)

on lipid peroxides (A), electrolyte leakage (B) H

content (C) and

Protein oxidation (D) in 10 day old cucumber seedlings. Data represent the mean ± SD of three

different experiments. The control specific activity (without aluminum) that represents 100% was

0.23 ± 0.79 nmol of MDA/mg of protein, 0.128 ± 0.08 µs/cm, 2 ± 3.96 µmol/L g fresh weight

and 11.39 ± 1.74 nmol of carbonyl/mg of protein. Letters indicate statistical differences at

p<0.05.

3.4 Determination of Chlorophyll and Magnesium contents

Chlorophyll and magnesium contents were determined in cucumber cotyledons (figure 3A and

B). The chlorophyll content decreased with increasing concentrations of aluminum (figure 3A).

An inhibition of the chlorophyll content of 60% was observed at 2000 µM Al

(SO

)

. At the

lower concentrations of aluminum (1 and 10 µM Al

(SO

)

), the magnesium content was

increased. Conversely, a decrease in the magnesium level was detected at 100, 500, 1000 and

2000 µM Al

(SO

)

(figure 3B).

Fig. 3 Effect of Al

(SO

)

on chlorophyll content (A) and magnesium concentration in shoot of

cucumber seedlings (B). Data represent the mean ± SD of three different experiments. Letters

indicate statistical differences at p<0.05.

4. Discussion

A common feature of several stresses including Al toxicity is perturbation of the cell

redox homeostasis and, as a consequence, the enhanced production of reactive oxygen species

(ROS) [8, 22 and 23]. Studies of Al toxicity in roots suggest that production of ROS may

significantly contribute to Al-induced inhibition of root elongation [23].

Previous studies from our laboratory have shown that the growth, dry weight and fresh

weight of roots and shoots of Cucumis sativus were decreased at 100, 500, 1000 and 2000 µM

(SO

)

[11]. Probably, the growth of root cells was affected by aluminum, causing a decrease

in cell wall synthesis because aluminum inhibits the secretory function of the Golgi apparatus [2,

4, 11 and 24].

It is generally accepted that Al accumulates in root apices including the root cap and in the

meristematic and elongation zones. Many researchers have reported that the major portion of

absorbed Al, ranging from 30% to 90% of total Al, is localized in the apoplast [25, 26]. As Al is a

polyvalent cation, under acidic conditions it binds strongly to negative charges in the Donnan free

space of root cell apoplasm. The negative charges are mostly free carboxyl groups of pectic

material in cell walls [41]. The pectin matrix is the main target of Al accumulation and thus Al

toxicity. The pectin matrix with its different degree of pectin esterification (DE) seem to play a

fundamental role in the expression of Al toxicity and resistance. High degrees of esterification of

pectins would thus be an indicator of Al-resistance as the high DE decreases the binding strength

of Al to the pectin matrix and favours it release/desorption by organic acids [41, 42, 43]. The

aluminum sorption affects the conformation of the Ca- pectates complex, both aluminum and

calcium seem to interact with the carboxylate groups as well as to the anomeric oxygens of

pectins [42].

Soluble Al can exist in many different ionic forms in aqueous solution depending on the

pH. In acidic solutions (pH<5.0), Al

exists as the octahedral hexahydrate, Al(H

, which by

convention is usually called Al

[4, 34] Al species that are relevant to phytotoxicity can be

categorized into several different classes. With regard to the solution bathing the root, these

classes include free or mononuclear forms as Al

, polynuclear Al, and Al as low molecular

weight complexes. At low pH values the main species is Al(H

, however, as the pH

increase, Al(OH)

and Al(OH)

are gradually formed and the neutral pH amorphous Al(OH)

precipitates: at basic pH this precipitate dissolves to form Al(OH)

. In the cellular cytoplasm, Al

in either reversible or irreversible macromolecular complexes should also considered.

Polynuclear Al is defined as any species, complex, or aggregation (including solid-phase

Al(OH)

) that contains more than one Al atom. Al

13,

or other polynuclear species, can arise if the

[Al] increases or if the pH rises in acid solution or falls in basic solutions [40]. It has been

suggested that Al toxicity was better correlated with either the sum of all of the monomeric

hydroxyl-Al species or a combination of Al

and certain other monomeric hydroxyl-Al species,

instead of Al

alone [4]. It also has been suggested that for dicotyledonous, either Al(OH)

Al(OH)

were phytotoxic species, and Al

was hypothesized to be much less toxic [34]. This

difference in aluminum response between monocots (which are most sensitive to Al

) and

dicotyledonous is puzzling but more studies were necessary and this can depends on the plant

species [40]. In our experiments the pH was monitored daily and maintained to 4.0 in all

experiment time and there is consensus that trivalent cationic Al

in acid environments is the

most relevant toxic form to plants [40]. Some studies have demonstrated that Al in solutions

remain mononuclear for many days when {Al

}/{H

}

≤ 10

8.8

, where braces denote ion activities

[4, 34 and 40].

In this study, Al content in the tissues of cucumber seedlings was higher in the roots than

in the shoots (Table I). This result shows that the cucumber root system serves as a partial barrier

to the transport of aluminum to the shoots. The transport to the shoots probably only played a

minor role. A major role may be played by the export of Al from the roots into the substrate, as

well as the exclusion of Al from uptake into the roots. It has been reported that one specific

response to Al stress in tolerant plants is the secretion of malate or citrate. Malate and citrate

might be released by plants either to prevent Al sorption by the roots or to desorption Al already

present in the root apoplast [26, 28]. However, cucumber has proved not to be an Al tolerant

plant [11].

One of the important targets of Al at the cellular level might be the plasma membrane.

This is supported by the interference of Al in membrane lipids which is caused by the increased

production of highly ROS. Cakmak and Horst [7] found the highest lipid peroxidation in the root

tips (<2cm) of soybean at a longer duration of Al exposure. A close relationship exists between

lipid peroxidation and inhibition of the rate of root elongation induced by Al. These observations,

and others showing an increase in MDA and accumulated Al, indicate that cucumber seedlings

experience substantial oxidative damage when exposed to high concentrations of Al

(SO

)

for

ten days (figure 2A). Al also affects the membrane electrophysiological properties of plant

species that differ in their tolerance to Al [27, 29]. Changes of the membrane lipid architecture

induced by Al can lead to modification of membrane permeability [30, 31 and 32].

The results of the present study indicate that in cucumber seedlings, electrolyte leakage

percentage (ELP) levels were significantly enhanced, and this enhancement was concentration-

dependent (figure 2B). Another study showed that in cucumber plants exposed to HgCl

, ELP

content also increased [10]. Stab and Horst [27] proposed that binding of Al induces a stronger

association of membrane phospholipids and a higher packing density of phospholipids, reducing

membrane permeability.

Major ROS-scavenging enzymes in seedlings include SOD, APX and CAT [29, 30 and

33]. The balance between SOD and APX or CAT activities in cells is crucial for determining the

steady-state level of superoxide radicals and hydrogen peroxide [30]. The different affinities of

APX (µM) and CAT (mM) for H

suggest that they belong to two different classes of H

–

scavenging enzymes: APX might be responsible for the fine modulation of ROS for signaling,

whereas CAT might be responsible for the removal of excess ROS during stress.

Hydrogen peroxide also appears to play an important role in signal transduction during

plant abiotic stress. H

produced from oxidative burst functions, such as a local trigger of

programmed cell death of challenged cells, causes a rapid cross-linking of cell wall proteins [31].

Results of the present study clearly indicate that Al induced an increase in H

content in

cucumber seedlings (figure 2C), which coincided with the increase in CAT activity (figure 1A).

CAT is only present in peroxisomes, but it is indispensable for ROS detoxification during stress,

during which time high levels are produced [29, 31].

APX is thought to be the most important H

scavenger operating both in the cytosol and

chloroplasts. APX uses ascorbic acid as a reducing substrate and forms part of a cycle, known as

the ascorbate-glutathione or Halliwell-Asada cycle [32]. Because CAT does not require a supply

of reducing equivalents for its functioning, it might not be affected during stress, unlike other

mechanisms, such as APX [33]. The present investigation indicated that higher concentrations of

Al (1000 and 2000 µM Al

(SO

) decreased APX activity (figure 1B). Thus, seedlings with

suppressed APX production induce increased SOD and CAT to compensate for loss of this

enzyme [33].

An increase in SOD and APX activities was observed in response to low levels of Al (1

µM and 10 µM) in substrate (figure 1B and 1C). However, a decline in APX activity at 2000 µM

suggests a possible delay in the removal of H

and hence an enhancement of lipid

peroxidation. Low SOD levels at 2000 µM may be related to the increase of H

levels, because

may inactivate enzymes by oxidizing their thiol groups [30]. Al

has great affinity for SH

groups of endogenous biomolecules such as SOD and acid delta aminolevulinic (ALA-D)

enzyme.

One important finding observed in this study is related to the fact that aluminum has been

associated with biphasic or hormetic responses of different physiological parameters, where the

low dose is stimulatory and high dose is inhibitory. Hormesis is a dose-response phenomenon

reported for various chemical-physical stressors [34]. Aluminum-induced growth stimulation of

-sensitive varieties may be brought about by Al

which, as a trivalent cation, would reduce the

cell surface negativity and, in consequence, the H

activity at the cell membrane surface [34, 35].

The hormetic effect and the Al-induced alleviation of H

toxicity is considered an important

starting point for the investigations into the mechanisms of Al- and proton-induced inhibition of

root elongation in relation to Al species and their toxic effects on the plasma membrane and can

be identified as an adaptative response of cells following an initial disruption in homeostasis [35].

The decrease in chlorophyll content (figure 3A) observed in the present study may be due to

the inhibition of ALA-D activity shown in previous studies [11]. The enzyme δ-aminolevulinic

acid dehydratase (ALA-D) is sensitive to metals due to its sulfhydrylic nature [36] and catalyzes

the asymmetric condensation of two molecules of δ-aminolevulinic acid (ALA) to

porphobilinogen [37]. The synthesis of porphobilinogen promotes the formation of porphyrins,

hemes and clorophylls, which are essential for adequate chlorophyll aerobic metabolism and for

photosynthesis [37, 38]. In line with this, it has been reported that ALA-D activity in plants

increases during chloroplast development, which is a period of rapid chlorophyll accumulation

[37, 39] and a role of ALA-D in the regulation of chlorophyll has been proposed by Naito et al.

[39]. Mg

is not essential for plant ALA-D activity but causes a significant increase in the Vmax

of the enzyme [37]. The binding data for Mg(II) indicate that plant ALA-D can bind up to 3

Mg(II)/subunit. The kinetic data support the existence of a required Mg(II), an allosteric Mg(II)

and an inhibitory Mg(II), but data are insufficient to address the individual stoichiometries of

these three types of Mg(II) [38]. In addition, aluminum may reduce the amount of almost all

organic nutrients of plants [4] and may interfere with the absorption, transport and use of several

cations such as calcium and magnesium [7]. The results of the present study indicate a continuous

decrease in the content of magnesium in the cucumber shoots (figure 3B). This suggests that the

reduction in chlorophyll content in the presence of aluminum is caused by a decrease of

chlorophyll biosynthesis, ALA-D activity and magnesium content.

Lipids and proteins are common targets of oxidative damage in tissue under environmental

stress [14]. Carbonyl content is a sensitive indicator of oxidative damage to proteins [16], and

levels of carbonylated proteins in plants demonstrate oxidative stress associated with heavy

metals [2], drought [32] and low temperatures [17]. The data from the present study indicate that

the differences in protein oxidation at the higher concentrations of Al in cucumber seedlings are

related to low levels of antioxidant defenses (figure 2D). The accumulation of carbonyls in

cucumber seedlings, thus, indicates that the quantity of free radicals exceeds the capacity of the

antioxidant defense system. Therefore, aluminum indeed induced the production of ROS, such as

the hydroxyl radical, since neither H

nor O

•-

were reactive enough to provoke oxidation.

In a previous study, Pereira et al. [11] reported that Al rapidly induced drought stress in

cucumber seedlings, which probably contributes to the induction of oxidative stress [22]. This Al-

induced ROS production can activate signal transduction pathways and lead to cell death [11] as

a general symptom of Al-treated plants [2].

In conclusion, the increase in H

production in cucumber seedlings may be related to

the fact that the antioxidant system was not be able to overcome the toxicity caused by higher

levels of Al. This resulted in negative effects such as lipid peroxidation and ELP which affected

membrane protein oxidation and brought about a decrease in the growth of cucumber seedlings.

These results demonstrate that the toxic effects of Al are harmful for plant development and

affect the quality of crop productivity.

Acknowledgements The authors wish to thank the Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação e Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS).

References

[1] Vierstra R.D., Ubiquitin, a key component in the degradation of plant proteins, Physiol. Plant.

70 (1987) 103-106.

[2] Boscolo P.R.S., Menossi M., Jorge R.A., Aluminum-induced oxidative stress in maize.

Phytochemistry 62 (2003) 181-189.

[3] Dipierro N., Mondelli D., Paciolla C., Brunetti G., Dipierro S., Changes in the ascorbate

system in the response of pumpkin (Cucurbita pepo L.) roots to aluminum stress. J. Plant

Physiol. 162 (2005) 529-536.

[4] Matustumoto H., Cell biology of aluminum toxicity and tolerance in higher plants. Int. Rev.

Cytol. 200 (2000) 1-46.

[5] Delhaize E., Ryan R.P., Ma F.J., Aluminum tolerance in plants and the complexing role of

organic acids. Trends Plant Sci. 6 (2001) 273-278.

[6] Yamamoto Y., Koayashi Y., Matsumoto H., Lipid peroxidation is an early sympton triggered

by aluminum, but no the primary cause of elongation inhibition in pea roots. Plant Physiol. 125

(2001) 199-208.

[7] Cakmak I., Horst W. J., Effect of aluminum on lipid peroxidation, superoxide dismutase,

catalase and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycine max). Physiol. Plant 83 (1991)

463-468.

[8] Richter C., Schweizer M., Oxidative stress in mitochondria. In: Scandalios, J.G. (Ed.),

Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant defenses, Monograph Series, Cold

Spring Harbor 34 (1997) 169-200.

[9] Whalsgrove R.M., Keys A.J., Lea P.L., Miflin B.J., Photosynthesis, photorespiration and

nitrogen metabolism, Plant Cell Environ. 6 (1990) 301-309.

[10] Cargnelutti D., Tabaldi L.A., Spanevello R.M., Jucoski G.O., Battisti V, Redin M., Linares

C.E.B., Flores E.M.M., Nicoloso F.T., Morsch V.M., Schetinger M.R.C., Mercury toxicity

induces oxidative stress in growing cucumber seedlings. Chemosphere 65 (2006) 999-1006.

[11] Pereira L.B., Tabaldi L.A., Gonçalves J.F., Jucoski G.O., Pauletto M.M., Weis S.N.,

Nicoloso F.T, Borher D, Rocha J.B.T, Schetinger M.R.C., Effect of aluminum on δ-

aminolevulinic acid dehydratase (ALA-D) and the development of cucumber (Cucumis sativus

L). Environ. Exp. Bot. 57 (2006) 106-115.

[12] Zhu Z., Wei G., Li J., Qian Q., Yu J., Silicon alleviates salt stress and increases antioxidant

enzymes activity in leaves of salt-stressed cucumber (Cucumis sativus L.). Plant Science 167

(2004) 527 – 533.

[13] Aebi H., Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105 (1984) 121-126.

[14] Mc Cord, J.M., Fridovich I., Superoxide dismutase: an enzymic function for erythrocuprein

(hemocuprein). J. Biol. Chem. 244 (1969) 6049 – 6055.

[15] Loreto F., Velikova V., Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus

against ozone damage, quences ozone products, and reduces lipid peroxidation of cellular

membranes. Plant Physiol. 127 (2001) 781-1787.

[16] Levine R.L., Garland D., Oliver C.N., Amici A., Climent I., Lenz A.G., Ahn B.W., Shaltiel

S., Stadtman E.R., Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods

in Enzymol. 233 (1990) 346-357.

[17] El-Moshaty F.I.B, Pike S.M, Novacky A.J, Sehgal O.P., Lipid peroxidation and superoxide

production in cowpea (Vigna unguiculata) leaves infected with tobacco ringspot virus or southern

bean mosaic virus. Physiol. Mol. and Plant Pathol. 43 (1993) 109-119.

[18] Lutts S., Kinet J.M., Bouharmont J., NaCl-induced senescence in leaves of rice (Oriza sativa

L.) cultivar differing in salinity resistance. Ann. Bot. 78 (1996) 389 – 398.

[19] Hiscox J.D., Israelstam G.F., A method for the extraction of chlorophyll from leaf tissue

without maceration. Can. J. Bot. 57 (1979) 1132-1334.

[20] Arnon D.I., Copper enzymes in isolated chloroplasts: polyphenoloxidase in Beta vulgaris.

Plant Physiol. 24 (1949) 1-15.

[21] Bradford M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantity of

protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254.

[22] Tamás L., Huttová J., Mistrík I., Simonovicová M., Siroká B., Aluminum-induced drought

and oxidative stress in barley roots. J. Plant Physiol. 163 (2006) 781-784.

[23] Horst W.J., and Klotz F., Screening soybean for aluminum tolerance and adaptation to acid

soil. In “Genetic aspects of Plant Mineral Nutrition” (N. Bassam, M. Dambroth, and B.C.

Loughman, Eds). Kluwer Academic Publication, The Netherlands (1990) 353-360.

[24] Lazof D.B., Goldsmith J.B., Linton R.W., The in situ analysis of intracellular aluminum in

plants. J. Cell Biol. 58 (1997) 112-149.

[25] Yang M.Z., Sivaguru M., Horst W.J., Matsumoto H., Aluminum tolerance is achieved by

exudation of citric acid from roots of soybean (Glycine max). Physiol. Plant 110 (2000) 72-77.

[26] Ryan P.R., Delhaize E., Jones D. L., Function and mechanism of organic anion exudation

from plant roots. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52 (2001) 527-560.

[27] Stab A., Horst W., Effect of aluminum on membrane properties of soybean (Glycine max)

cells in suspension culture. In: Date RA, editor. Plant soil interactions at low pH. Dordrecht:

Kluwer Academic Publishers (1995) 279 – 284.

[28] Ishikawa S., Wagatsuma T., Plasma membrane permeability of root – tip cells following

temporary exposure to Al ions is a rapid measure of Al tolerance among plant species. Plant Cell

Physiol. 39 (1998) 516-525.

[29] Willekens H., Catalase is a sink for H

and is indispensable for stress defense in C-3

plants. Embo. Journal 16 (1997) 4806-4816.

[30] Bowler C., Camp V.W., Montagu V., Inzé D., Superoxide dismutase and stress tolerance.

Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43 (1992) 83-116.

[31] Levine A., Tenhaken R., Dixon R., Lamb C., H

from the oxidative burst orchestrates the

plant hypersensitive disease resistance response. Cell 79 (1994) 583-593.

[32] Foyer C. H., Mullineaux PM (Eds): Causes of photooxidative stress and amelioration of

defense systems in plants. (1994) Boca Raton: CRC Press.

[33] Mittler R., Oxidative Stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. 7 (2002)

405-410.

[34] Yokel R.A., McNamara P., Aluminium toxicokinetics: an updated

minireview. Pharmacol. Toxicol. 88 (2001) 159–167.

[35] Barceló J., Poschenrieder C., Fast root growth responses, root exudates, and internal

detoxification as clues to the mechanisms of aluminium toxicity and resistance: a review.

Environ. Exp. Bot. 48 (2002) 75–92.

[36] Rocha J.B.T., Pereira M.E., Emanuelli T., Christofari R.S., Souza D., Effects of

methylmercury exposure during the second stage of rapid postnatal brain growth on delta-

aminolevulinic acid dehydratase (ALA-D) activity in brain, liver, kidney and blood of suckling

rats. Toxicology 100 (1995) 27–37.

[37] Jaffe E.K., Kervinen J., Dunbrack Jr., Litwin S., Martins J., Scarrow R.C., Volin M., Yeung

A.T., Yonn E., Porphobilinogen synthase from pea: expression from an artificial gene, kinetic

characterization, and novel implications for subunit interactions. Biochemistry 39 (2000) 9018–

9029.

[38] Shibata H., Ochiai H., Purification and properties of δ aminolevulinic acid dehydratase from

radish cotyledons. Plant Cell Physiol. 18 (1976) 421–429.

[39] Naito K., Ebato T., Endo Y., Shimizu S., Effect of benzyladenine on δ aminolevulinic acid

synthetic ability and δ aminolevulinic acid dehydratase: differential responses to benzyladenine

according to leaf age. Pflanzenphysiologie 96 (1980) 95–102.

[40] Poschenrieder C., Gunsé B., Corrales I., Barceló J., A glance into aluminum toxicity and

resistance in plants. Sci. of the Total Environ. 400 (2008) 356-368.

[41] Mimmo T., Marzadori C., Montecchio D., Gessa D., Characterisation of Ca- Al – pectate

gels by thermal analysis and FT – IR spectroscopy. Carbohydrate Research 340 (2005) 2510 –

2519.

[42] Mimmo T., Marzadori C., Francioso O., Deiana S., Gessa C.E., Effects of aluminum

Sorption on Calcium – Polygalacturonate Network Used as Soil – Root Interface Model.

Biopolymers 70 (2003) 655 – 661.

[43] Mimmo T., Marzadori C., Gessa C. E., Does the degree of pectin esterification influence

aluminium sorption by the root apoplast? Plant and Soil 314 (2009) 159 – 168.

Manuscrito I - DIFFERENTIAL RESPONSES OF OAT GENOTYPES:

OXIDATIVE STRESS INDUCED BY ALUMINUM

DIFFERENTIAL RESPONSES OF OAT GENOTYPES: OXIDATIVE STRESS

INDUCED BY ALUMINUM

Luciane Belmonte Pereira

1,3

Cinthia Melazzo de A. Mazzanti

1,3

Denise Cargnelutti

1,3

Liana Verônica Rossato

1,3

, Jamile F. Gonçalves

1,3

Nicéia Calgaroto

Valderi Dressler

Fernando T. Nicoloso

, Luiz Carlos Federizzi

4,5

Vera M. Morsch

1,3

,Maria R. C.

Schetinger

1,3

Departamento de Química e

Biologia,

Programa de Pós-Graduação em Bioquímica

Toxicológica, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de Santa Maria,

97105-900, Santa Maria, RS, Brasil.

Departamento de Plantas de Lavoura,

Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves 7712, Porto Alegre, RS, Brasil.

Corresponding author: [email protected]

ABSTRACT

The phytotoxic effects of aluminum and the mechanisms of genetically-based Al tolerance have

been widely investigated, as reported in many papers and reviews. However, investigations on

many Al-sensitive and Al-resistant species demonstrate that Al phytotoxicity and Al-resistance

mechanisms are extremely complex phenomena. The objective of the present study was to

analyze the effects of aluminum on the activity of antioxidant enzymes such as catalase (CAT -

E.C. 1.11.1.6), superoxide dismutase (SOD - E.C.1.15.1.1) and ascorbate peroxidase (APX - E.C.

1.11.1.11). Also was evaluated the lipid peroxidation, H

content, levels of ascorbic acid

(ASA), non-protein thiols (NPSH) and Al content in three genotypes of oat, Avena sativa L

(UFRGS 930598, UFRGS 17 and UFRGS 280). The genotypes were grown in different

concentrations of Al ranging from 5 to 30 mg L

-1

for 5 days. The antioxidant system was unable

to overcome toxicity resulting in negative effects such as lipid peroxidation and H

content in

UFRGS 930598. The results showed that UFRGS 930598 was the most sensitive genotype.

UFRGS 17 and UFRGS 280 were more resistant to Al toxicity. These results suggest that

UFRGS 17 has mechanisms of external detoxification and UFRGS 280 has mechanisms of

internal detoxification. The different behavior of enzymatic and non-enzymatic antioxidants of

the genotypes showed that aluminum resistance in UFGRS 17 and UFRGS 280 may be related to

oxidative stress.

Keywords: Avena sativa, Superoxide dismutase, hydrogen peroxide, ascorbate peroxidase,

catalase, aluminum content, oxidative stress.

Introduction

All aerobic organisms including plants require molecular oxygen for survival, which

can be easily reduced to reactive oxygen species (ROS) through various biochemical reactions

(Morita et al., 1999). ROS include the superoxide anion radical (O

•-), hydrogen peroxide

), the hydroxyl radical (•OH) and singlet oxygen (

) which are reactive species and can

oxidize and damage cellular components (De Biasi et al., 2003). The cells possess a defensive

system, consisting of various enzymes such as catalase (CAT - E.C. 1.11.1.6), ascorbate

peroxidase (APX - E.C. 1.11.1.11), and superoxide dismutase (SOD - E.C.1.15.1.1), that reduce

ROS under normal conditions, but if complete reduction does not occur, the result may be a state

of oxidative stress leading to the oxidation of biomolecules as lipids, proteins and DNA (Mittler,

2002). The antioxidative system falls into two general classes: (1) low molecular weight

antioxidants, which consist of lipid-soluble membrane associated antioxidants such as a-

tocopherol and b-carotene, and water-soluble reductants such as glutathione and ascorbate and (2)

antioxidant enzymes: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX)

and glutathione reductase (GR) (Gratão et al. 2005).

The toxicity caused by aluminum in plants in acid soils is a well-known example of

environmental stress (for a review, see Ma, 2000; Matsumoto, 2000; Ma et al., 2001; Ryan and

Delhaize, 2001). Although Al itself is not a transition metal and cannot catalyze redox reactions,

the involvement of oxidative stress in Al toxicity has been suggested. Al

, the most toxic of the

soluble forms of Al (Yamamoto et al., 2001) induces oxidative stress, and a number of studies

have reported its participation in various processes, including an increase in enzyme activity

(SOD) related to ROS and lipid peroxidation in soybeans (Glycine max) (Cakmak and Horst,

1991) peas (Pisum sativum) (Yamamoto et al., 2001), changes in the expression of various genes

induced by Al in Arabidopsis (Sugimoto and Sakamoto, 1997; Richards et al., 1998), tobacco

(Ezaki et al., 2000) and wheat (Triticum aestivum L.) (Snowden and Gardner, 1995; Cruz-Ortega

et al., 1997; Hamel et al., 1998). Comparative studies of Al tolerance in 22 species from seven

families have established that plants can resist the toxic effects of Al. There are many proposed

mechanisms of Al tolerance in plants involving external avoidance or internal tolerance

(Kochian, 1995). The phytotoxic effects of aluminum and the mechanisms of genetically-based

Al tolerance have been widely investigated, as reported in many papers and reviews (Kochian,

1995; Delhaize & Ryan, 1995; Ciamporová, 2002; Gonçalves et al., 2009). Evidence

corroborating the relation between aluminum stress and oxidative stress in plants has been

obtained with transgenic Arabidopsis plants (Ezaki et al., 2000). However, investigations on

many Al-sensitive and Al-resistant species demonstrate that Al phytotoxicity and the mechanisms

of Al-resistance are extremely complex phenomena. When comparing the physiology and

biochemistry of genotypes that differ in Al tolerance, it is preferable that the genetic backgrounds

be similar so as to eliminate differences that are unrelated to Al tolerance (Ezaki et al., 2000).

In this study, we have used three genotypes of oat (Avena sativa L) that differ in Al

tolerance .These genotypes, UFRGS 17, UFRGS 930598 and UFRGS 280, were previously

classified as tolerant, sensitive and intermediate to aluminum respectively in accordance with

morphological characteristics suck as root length (Federizzi et al., 2000). Measurements of the

effects of Al were carried out after 5 days of exposure, and allowed us to reveal whether there are

any biochemical differences between UFRGS 17, UFRGS 930598 and UFRGS 280 and their

classification as tolerant, sensitive and intermediate respectively in accordance with previous

morphological analysis was confirmed. It was also shown that aluminum resistance may be

related the oxidative stress.

Material and Methods

Plant material and growth conditions

Avena sativa L. seeds of three genotypes (UFRGS 17 Al-tolerant; UFRGS 930598 Al-

sensitive, UFRGS 280 Al-intermediate), commonly known as oat, provided by Programa de

Melhoramento Genético de Aveia from the Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)

were germinated in plastic recipients (1000 mL) containing 250 mL of medium with Al

(SO

)

diluted in a 0.5% agar solution. No nutritive solution was added to the agar. The seedlings made

use of the seed nutrition in the initial stage of development, and in a previous experiment, it was

verified that up to the tenth day the plants did not suffer any nutrient deficiency (data not shown).

Five different Al

(SO

)

treatments (0, 5, 10, 20 and 30 mg L

-1

) were applied randomly. The

medium pH was adjusted to 4.0. Each experimental unit consisted of 30 seeds, totalizing 15

replicates per treatment. After germination, the seedlings were maintained in a growth chamber

with controlled temperature (25 ± 1

C) and photoperiod (16 h light; light intensity of 35 µmol m

-2

-1

at plant level). On the fifth day the seedlings were separated into root and shoot and prepared

for homogenization.

Metal determination

Al content was determined in the roots and shoot of 5-day-old oat seedlings.

Approximately 50 mg of roots and shoot were digested with 4 mL HNO

utilizing the following

stages of heating: a) 50

C for 1 h; b) 80

C for 1 h; and 120

C for 1 h in a digester block (Velp,

Italy). The samples were then diluted to 50 mL with high-purity water. Al concentrations were

determined using a Model AAS 5 EA atomic absorption spectrometer (Analytic Jena, Germany)

equipped with a transversely heated graphite furnace and an autosampler (MPE 5). The content

absorbed was expressed in mg/Kg dry weight.

Antioxidant enzyme activities

Catalase (CAT)

For the CAT assay, the oat root and shoot seedlings were prepared by the

homogenization of fresh tissue material in a solution containing 50mM KH

HPO

(pH

7.0), 10g L

-1

PVP, 0.2mM EDTA and 10 mL L

-1

Triton X-100, at a ratio of 1:5 (w/v). After the

homogenate was centrifuged at 12 000 x g at 4ºC for 20 min, the supernatant was used to

determine CAT activity, which was assayed according to the modified method of Aebi (1984) by

monitoring the disappearance of H

by measuring the decrease in absorbance at 240 nm in a

reaction mixture with a final volume of 2 mL containing 15 mM H

in 50 mM KPO

buffer

(pH 7.0) and 30 µL extract. CAT activity was expressed as ∆E/min/mg protein.

Ascorbate peroxidase (APX)

For determination of APX activity, oat root and shoot were homogenized in a 50 mM

potassium phosphate buffer containing 1mM EDTA and 2% PVP, pH 7.8, at a ratio of 1:3 (w/v).

The homogenate was centrifuged at 13 000 x g for 20 min at 4°C, and the supernatant was used

for enzyme activity, which was assayed according to the modified method of Zhu (2004). The

reaction mixture, at a total volume of 2 mL, consisted of 25 mM sodium phosphate buffer (pH

7.0), 0.1 mM EDTA, 0.25 mM ascorbate, 1.0 mM H

and 100 µL extract. H

–dependent

oxidation of ascorbate was followed by a decrease in absorbance at 290 nm (E = 2.8 mM

-1

APX activity was expressed as µmol oxidized ascorbate /min/mg protein.

Superoxide dismutase (SOD)

The activity of SOD was assayed according to McCord and Fridovich (1969). About

200 mg fresh tissues were homogenized in 5 mL of 100 mM K-phosphate buffer (pH 7.8)