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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE FARMÁCIA
STELA RAMIREZ DE OLIVEIRA
DESENVOLVIMENTO ANALÍTICO E FARMACOTÉCNICO DE
FORMAS FARMACÊUTICAS SÓLIDAS DE ISOFLAVONA DE
SOJA
GOIÂNIA
2010
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STELA RAMIREZ DE OLIVEIRA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DESENVOLVIMENTO ANALÍTICO E FARMACOTÉCNICO DE
FORMAS FARMACÊUTICAS SÓLIDAS DE ISOFLAVONA DE
SOJA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Federal de Goiás, como
parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Ciências Farmacêuticas
Área de concentração: Fármacos e
medicamentos
Orientadora: Profa. Dra. Eliana Martins Lima
GOIÂNIA
2010
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
GPT/BC/UFG
O482d
Oliveira, Stela Ramirez.
Desenvolvimento analítico e farmacotécnico de formas
farmacêuticas sólidas de isoflavona de soja [manuscrito] /
Stela Ramirez de Oliveira. - 2010.
95 f. : il., figs, tabs.
Orientadora: Profª. Drª. Eliana Martins Lima.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
Faculdade de Farmácia, 2010.
Bibliografia.
Inclui lista de tabelas, figuras, abreviaturas e siglas.
1. Tecnologia Farmacêutica 2. Fitoterápico 3.
Comprimidos 4. Controle de Qualidade 5. Isoflavona
I. Título.
CDU: 615.012
Ao Sr Urbano Gregório Perdomo Naranjo
pela maravilhosa pessoa que é
e por tudo que me ensinou.
AGRADECIMENTOS
A minha família, que sempre esteve ao meu lado me apoiando.
Ao Allys Vilela de Oliveira, por todo carinho, auxílio e compreensão.
A professora Dra Eliana, por acreditar no meu potencial, pela oportunidade e
orientação.
A professora Dra Danielle Diniz, por todos os conselhos, ajuda, apoio e
dedicação.
Ao professor Dr Ricardo Neves Marreto, pela ajuda e sugestões.
A Fernanda Bellato, pela atenção, conselhos, por me defender e salvar tantas
vezes.
Ao Marco Júnio Peres Filho, pelo companheirismo, por toda ajuda ao longo
deste trabalho, pelas alegrias e sorrisos proporcionados.
A Mariana de Oliveira Berretta, pelos grandes ensinamentos, ajuda,
contribuição, atenção e principalmente pela amizade.
A Stephania pelas contribuições e ensinamentos.
A Emmanuele e a Flávia Neri, pelos ensinamentos de estatística.
A Erika Crispim, pelo companheirismo e paciência.
Aos meus companheiros de laboratório Fernanda Steger, César, Marilisa
Gaeti, Thais Leite, Luciano, Leonardo, Ana Lúcia, Fabrícia, Lívia, Luciana, por todas
as contribuições e pelo convívio.
A TKS Farmacêutica e todos os meus colegas que contribuíram para este
projeto se tornar realidade.
E a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para a realização desse
sonho.
RESUMO
Isoflavonas são flavonóides encontrados em abundância nos grãos de soja (Glycine max L.).
Essas substâncias têm estrutura semelhante ao estrógeno e possuem uma ação fracamente
estrogênica. São utilizadas no tratamento dos sintomas da menopausa como alternativa às
terapias de reposição hormonal convencionais, por provocarem menor número de efeitos
colaterais. As isoflavonas de soja estão entre as matérias-primas vegetais com ações de
interesse para obtenção de formas farmacêuticas sólidas. A alta variabilidade de teores de
isoflavonas em cápsulas e comprimidos disponíveis comercialmente demonstra a
necessidade de desenvolvimento farmacotécnico e controle de qualidade adequados para
este fitoterápico. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento analítico e farmacotécnico
de formas farmacêuticas sólidas de isoflavona de soja, utilizando como matéria-prima
extrato seco de soja padronizado. Para verificar a qualidade do extrato foi realizada análise
microbiológica e análise do teor dos marcadores. Os resultados obtidos através do ensaio
microbiológico não demonstrou contaminação microbiológica do extrato, não tendo
crescimento de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans e Aspergillus
niger. Para avaliação do teor e da porcentagem dissolvida de ambos os marcadores foram
desenvolvidas e validadas tanto metodologia analítica de quantificação de daidzeína e
genisteína por cromatografia líquida de alta eficiência quanto metodologia para avaliar o
perfil de dissolução dos comprimidos obtidos. Para análise cromatográfica dos marcadores
foi utilizado método isocrático, com fase móvel constituída por metanol com 0,1% de ácido
acético, água com 0,1% de ácido acético e acetonitrila na proporção 64:32:4 , fluxo de 0,7
mL/min e temperatura de 30ºC. Nesta condição os picos foram simétricos, tiveram resolução
maior que 2, com tempos de retenção de 3,13 e 3,72 da daidzeína e genisteína,
respectivamente. A avaliação do teor dos marcadores daidzeína e genisteína, demonstrou
que as concentrações no extrato foram 27,8% e 11,1%, respectivamente. Em relação ao
estudo de pré-formulação foi feita análise térmica e a avaliação das propriedades dos pós e
grânulos. Foram desenvolvidas seis formulações de comprimidos de isoflavona, sendo uma
por compressão direta e cinco por granulação úmida. Nos resultados da análise térmica não
foram observadas possíveis interações dos excipientes com o extrato. O melhor método de
obtenção dos comprimidos foi por granulação úmida, pois apresentou melhores
propriedades compressionais com velocidade de escoamento variando entre 4,5 e 6,7
s/100g e compressibilidade entre 16,85% e 26,06%. A formulação por granulação úmida 3
foi a que apresentou melhor desempenho segundo os parâmetros analisados, apresentando
teor de 92,66% e 92,76% de daidzeína e genisteína, respectivamente, desintegração de 15
minutos, e seu fluxo foi caracterizado como excelente. No desenvolvimento do método
analítico para dissolução dos comprimidos de isoflavona foi feito o teste de solubilidade para
definir o melhor meio, sendo o meio água com 3% de lauril sulfato de sódio o que dissolveu
maior quantidade de daidzeína e genisteína na temperatura de 37ºC em comparação com
os outros meios. Os demais parâmetros definidos através do desenvolvimento do método
foram aparato pá, velocidade de rotação de 100 rpm e 900 mL de volume de meio. Os
resultados mostraram a possibilidade de obtenção de formas farmacêuticas sólidas
promissoras para veiculação de isoflavona, além de metodologias otimizadas para controle
de qualidade para análise da matéria-prima e do produto acabado.
Palavras-chave: Pré-formulação, comprimidos, dissolução, fitoterápico, isoflavona,
daidzeína, genisteína.
ABSTRACT
Isoflavones are flavonoids found in abundance in grains of soy (Glycine max L.) and
its derivatives. These substances have estrogen like structure and weakly estrogenic
action. They are used for treatment of menopause symptoms as an alternative to
conventional hormone replacement therapies, because they cause fewer side effects.
Soy isoflavones are amongst herbal products of great interest to obtain solid dosage
forms. High assay variability of isoflavones in commercially available capsules and
tablets shows the need of appropriate drug development and quality control for this
herbal product. The aim of this work was drug development and quality control of soy
isoflavone solid dosage forms, using standardized dry extract of soy. To evaluate the
quality of the extract microbiologic and assay analysis of this drug’s markers were
performed. Results obtained from microbiological test did not show microbiologic
contamination of the extract, as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida
albicans and Aspergillus niger did not grow. To evaluate assay and dissolution
percentage of both markers analytical methodology for quantification of daidzein and
genistein by high performance liquid chromatography was developed, and also a
method to analyze dissolution profile of the obtained tablets. Isocratic method was
used for chromatographic analysis of the markers, with mobil phase of methanol with
0.1% of acetic acid, water with 0.1% of acetic acid and acetonitrile in proportion
64:32:4, flow of 0.7 mL/min and temperature of 30°C. At this condition, peaks were
symmetric, had resolution lower than 2, with retention times of 3,13 and 3,72 for
daidzein and genistein, respectively. Assay evaluation of the markers daidzein and
genistein showed that concentrations in the extract were 27,8% and 11,1%,
respectively. To accomplish preformulation study, thermal analysis and powder and
granules flow evaluation were made. Six formulations of isoflavone tablets were
developed, one by direct compression and five by wet granulation. Results of thermal
analysis showed no possible extract interactions between tested excipients and
extract. Wet granulation was the best method to obatain tablets, because it
presented the best compressional properties with flow velocity between 4,5 and 6,7
s/100g and compressibility between 16,85% and 26,06%. GU3 formulation, which
presented the best performance according to evaluated parameters, made by wet
granulation, showed 92,66% and 92,76% of daidzein and genistein, respectively,
disintegration of 15 minutes, and its flow was categorized as excellent. In analytical
dissolution method development of isoflavone tablets solubility test was performed to
define the best medium, and water with 3% of sodium lauryl sulfate dissolved the
greatest amount of daidzein and genistein at tested temperature, 37°C, in
comparison with the other medium. Other parameters defined through method
development were paddle apparatus, stirring speed of 100 rpm and 900 mL of
medium volume. Results showed the possibility to obtain promising solid dosage
forms to deliver isoflavone, and optimized quality control methodologies to analyze
raw material and finished product.
Key words: Preformulation, tablets, dissolution, herbal product, isoflavone, daidzein,
genistein.
LISTA DE TABELAS
Condições cromatográficas utilizadas para o desenvolvimento do
método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência.
17
Componentes das formulações GU1 a GU5 e CD1.
24
Meios utilizados no ensaio de solubilidade.
27
Fatores do método de dissolução.
28
Planejamento fatorial fracionário 2
4-1
.
28
Condições avaliadas no planejamento fatorial
28
Resultados da contagem de bactérias, fungos e leveduras.
30
Precisão e Exatidão obtidas para a daidzeína obtidas utilizando
método cromatográfico descrito no item 5.2.
36
Precisão Intermediaria e Exatidão obtidas para a daidzeína
utilizando método cromatográfico descrito no item 5.2.
36
Precisão e exatidão obtidas para a genisteína utilizando método
cromatográfico descrito no item 5.2.
37
Precisão intermediaria e exatidão obtidas para a genisteína
utilizando método cromatográfico descrito no item 5.2.
37
Limite de quantificação e detecção obtidos para daidzeína
utilizando método cromatográfico descrito no item 5.2.
38
Limite de quantificação e detecção obtidos para genisteína utilizando
método cromatográfico descrito no item 5.2.
39
Teor de daidzeína e genisteína no extrato seco de soja.
47
Resultados das análises dos pós e granulados.
49
Granulometria dos pós e granulados.
50
Resultados de peso médio, dureza, espessura, desintegração e
friabilidade.
53
Teor de daidzeína e genisteína nas formulações GU1 a GU5 e
CD1.
54
Porcentagens de daidzeína dissolvida em diferentes meios de
dissolução.
56
Porcentagens de genisteína dissolvida em diferentes meios de
dissolução
57
Análise de variância Daidzeína 60 minutos.
59
Análise de variância Daidzeína 90 minutos.
61
Análise de variância Genisteína 60 minutos.
63
Análise de variância Genisteína 90 minutos.
66
Comparação da porcentagem de daidzeína dissolvida entre as
formulações por tempo.
70
Comparação da porcentagem de genisteína dissolvida entre as
formulações por tempo.
70
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Fases do processo de compressão.
6
Figura 2
Estruturas químicas das agliconas e glicosídeos de isoflavonas.
11
Figura 3
GTB usado na análise de fluxo (A) e na análise de ângulo de
repouso (B).
21
Figura 4
Esquema das etapas de granulação úmida e compressão direta.
23
Figura 5
Cromatograma do placebo.
33
Figura 6
Cromatograma padrão de daidzeína e genisteína.
33
Figura 7
Curva de calibração da daidzeína (média de 3 determinações).
34
Figura 8
Curva de calibração da genisteína (média de 3 determinações).
35
Figura 9
Curvas de DSC do extrato seco de soja, padrões daidzeína e
genisteína.
39
Figura 10
Curvas de DSC e TG do extrato seco de soja.
41
Figura 11
Curvas DSC do extrato, amido de milho e mistura binária.
42
Figura 12
Curvas DSC do extrato, dióxido de silício sozinho e mistura
binária.
43
Figura 13
Curvas DSC do extrato, estearato de magnésio e mistura binária.
44
Figura 14
Curvas DSC do extrato, fosfato dicálcico dihidratado e mistura
binária.
45
Figura 15
Curvas DSC do extrato, lauril sulfato de sódio e mistura binária.
45
Figura 16
Curva DSC da mistura binária extrato e lauril sulfato de sódio e
curva TG do lauril sulfato de sódio.
46
Figura 17
Distribuição de tamanho das partículas das formulações
estudadas.
51
Figura 18
Fotomicrografias de pós e granulados estudados: (A) extrato seco
de soja, (B) granulado da formulação GU5, (C) mistura de pós da
formulação CD1.
52
Figura 19
Comprimidos de isoflavona obtidos pela formulação GU3.
55
Figura 20
Comparação de cor entre os meios água com 0,5% de LSS (lado
esquerdo) e HCl 0,1 mol/L (lado direito) ao final de 24h.
58
Figura 21
Superfície de resposta referente à influência das variáveis
―concentração de lauril sulfato de sódio‖ e ―volume do meio‖ sobre
a concentração de daidzeína dissolvidas em 60 minutos do ensaio
de dissolução.
60
Figura 22
Superfície de resposta referente à influência das variáveis
―aparato‖ e ―rotaçoes‖ sobre a concentração de daidzeína
dissolvidas em 60 minutos do ensaio de dissolução.
61
Figura 23
Superfície de resposta referente à influência das variáveis
―concentração de lauril sulfato de sódio‖ e ―volume do meio‖ sobre
a concentração de daidzeína dissolvidas em 90 minutos do ensaio
de dissolução.
62
Figura 24
Superfície de resposta referente à influência das variáveis
―aparato‖ e ―rotações‖ sobre a concentração de daidzeína
dissolvidas em 90 minutos do ensaio de dissolução.
63
Figura 25
Superfície de resposta referente à influência das variáveis
―concentração de lauril sulfato de sódio‖ e ―volume do meio‖ sobre
a concentração de genisteína dissolvidas em 60 minutos do
ensaio de dissolução.
65
Figura 26
Superfície de resposta referente à influência das variáveis
―aparato‖ e ―rotações‖ sobre a concentração de genisteína
dissolvidas em 60 minutos do ensaio de dissolução.
65
Figura 27
Superfície de resposta referente à influência das variáveis
―concentração de lauril sulfato de sódio‖ e ―volume do meio‖ sobre
a concentração de genisteína dissolvidas em 90 minutos do
ensaio de dissolução.
67
Figura 28
Superfície de resposta referente à influência das variáveis
―aparato‖ e ―rotações‖ sobre a concentração de genisteína
dissolvidas em 90 minutos do ensaio de dissolução.
67
Figura 29
Superfície de resposta referente à influência das variáveis
―concentração de lauril sulfato de sódio‖ e ―rotações‖ sobre a
concentração de genisteína dissolvidas em 90 minutos do ensaio
de dissolução.
68
Figura 30
Curvas dos perfis de dissolução de daidzeína das formulações.
71
Figura 31
Curvas dos perfis de dissolução de genisteína das formulações.
71
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µg
Micrograma
µL
Microlitro
µm
Micrômetro
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CD
Compressão Direta
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
DP
Desvio Padrão
DPR
Desvio Padrão Relativo
DSC
Calorimetria Exploratória Diferencial
F
Teste de Hipóteses
GL
Grau de Liberdade
GU
Granulação Úmida
HCl
Ácido Clorídrico
LD
Limite de Detecção
LQ
Limite de Quantificação
LSS
Lauril Sulfato de Sódio
mg
Miligrama
min
Minuto
mL
Mililitro
Mm
Milímetro
MQ
Média dos Quadrados
nm
Nanômetro
ºC
Graus Celsius
P
Significância Estatística
R
2
Coeficiente de Correlação
rpm
Rotações por Minuto
SQ
Soma dos Quadrados
TG
Termogravimetria
UFC
Unidade Formadora de Colônia
USP
United States Pharmacopeia
UV
Ultravioleta
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
1
2
REVISÃO DA LITERATURA
3
2.1
FORMAS FARMACÊUTICAS SÓLIDAS ORAIS
3
2.1.1
Estudo de pré-formulação
3
2.1.2
Comprimidos
5
2.1.2.1
Formas de obtenção de comprimidos
6
2.1.2.1.1
Compressão direta
6
2.1.2. 1.2
Granulação úmida
7
2.1.2.2
Vantagens dos comprimidos
7
2.1.2.3
Excipientes
8
2.2
CONTROLE DE QUALIDADE
8
2.2.1
Controle da qualidade microbiológica
8
2.2.2
Controle de qualidade físico-químico
9
2.3
ISOFLAVONAS DA SOJA
9
3
OBJETIVOS
12
3.1
OBJETIVO GERAL
12
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
12
4
MATERIAL E MÉTODOS
13
4.1
MATERIAS
13
4.1.1
Equipamentos e Acessórios
13
4.1.2
Reagentes e Produtos
14
4.1.3
Matérias-primas
14
4.2
MÉTODOS
15
4.2.1
Análise microbiológica
15
4.2.2
Desenvolvimento e validação do método analítico por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para
determinação de genisteína e daidzeína.
16
4.2.2.1
Curva de calibração
18
4.2.2.2
Precisão, Repetibilidade, Exatidão
18
4.2.2.3
Robustez
18
4.2.2.4
Limites de quantificação e detecção
19
4.2.3
Estudo de pré-formulação
19
4.2.3.1
Análise térmica
19
4.2.3.1.1
Mistura binária
19
4.2.3.1.2
Termogravimetria (TG)
19
4.2.3.1.3
Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
19
4.2.3.2
Determinação do teor do extrato seco de soja
20
4.2.3.3
Propriedades dos pós e granulados
20
4.2.3.4
Métodos de obtenção dos comprimidos
22
4.2.3.5
Testes físicos dos comprimidos
25
4.2.3.5.1
Determinação do Peso Médio
25
4.2.3.5.2
Determinação da Dureza
25
4.2.3.5.3
Espessura
25
4.2.3.5.4
Determinação da Friabilidade
26
4.2.3.5.5
Determinação do Tempo de Desintegração
26
4.2.3.6
Determinação do teor dos comprimidos
26
4.2.4
Desenvolvimento da metodologia analítica para o método de
dissolução
26
4.2.4.1
Ensaio de solubilidade
26
4.2.4.2
Ensaio de dissolução
27
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
30
5.1
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
30
5.2
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
PARA DETERMINAÇÃO DE GENISTEÍNA E DAIDZEÍNA
32
5.2.1
Verificação da precisão e exatidão
35
5.2.1.1
Daidzeína
35
5.2.1.2
Genisteína
36
5.2.3
Verificação dos limites de quantificação e detecção para
daidzeína e genisteína
38
5.2.3.1
Limites de Quantificação e Detecção para a daidzeína e genisteína
38
5.3
ESTUDO DE PRÉ-FORMULAÇÃO
39
5.3.1
Análise térmica
39
5.3.2
Teor de daidzeína e genisteína no extrato seco de soja
47
5.3.3
Formulações de comprimidos
48
5.3.3.1
Análise dos pós e granulados
48
5.3.3.2
Análise dos parâmetros físicos dos comprimidos
53
5.4
DESENVOLVIMENTO DA METODOLOGIA ANALÍTICA PARA
MÉTODO DE DISSOLUÇÃO
55
5.4.1
Ensaio de solubilidade
55
5.4.2
Planejamento fatorial
59
5.4.2.1
Daidzeína
59
5.4.2.1.1
Coleta no tempo 60 minutos
59
5.4.2.1.2
Coleta no tempo 90 minutos
61
5.4.2.2
Genisteína
63
5.4.2.2.1
Coleta no tempo 60 minutos
63
5.4.2.2.2
Coleta no tempo 90 minutos
66
5.4.3
Perfil de dissolução das formulações desenvolvidas
68
6
CONCLUSÃO
73
7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
75
1
1 INTRODUÇÃO
A partir dos usos em medicina popular e as inúmeras comprovações
científicas de propriedades farmacológicas, o interesse na utilização de
medicamentos fitoterápicos tem aumentado. Com esse aumento, foram criadas
normas e exigências legais de controle de qualidade deste tipo de medicamento,
como a RDC n. 48 de 16 de março de 2004. Para a adequação às exigências cada
vez maiores, e mais rigorosas, tornou-se imprescindível o desenvolvimento
farmacotécnico de medicamentos fitoterápicos, além de métodos de controle de
qualidade (PALMA et al., 2002; BRASIL, 2004).
O desenvolvimento de formas farmacêuticas sólidas utilizando matéria-prima
vegetal é complexo, pois geralmente possuem propriedades desfavoráveis, como
fluxo pobre e baixa compressibilidade (PALMA et al., 2002). A via oral é a mais
utilizada para administração de medicamentos principalmente na forma farmacêutica
de comprimido, os quais representam dois terços do mercado mundial de
medicamentos (ALDERBORN, 2005; WU; SEVILLE, 2009). A produção de
comprimidos é um processo complexo que envolve um grande número de variáveis,
como propriedades do produto, composição da formulação, escolha do processo
(VENKATARAM et al., 1996). Portanto, o estudo das propriedades do fármaco e
planejamento de formulações são etapas essenciais para o desenvolvimento de uma
forma farmacêutica de qualidade (WELLS, 2005).
Dentre as matérias-primas vegetais com ações farmacológicas de interesse
para obtenção de formas farmacêuticas sólidas estão as isoflavonas de soja. As
isoflavonas são flavonóides encontrados em abundância nos grãos de soja (Glycine
max L.). São denominadas fitoestrógenos devido à sua estrutura química
semelhante ao estrógeno (hormônio feminino) e ação fracamente estrogênica.
Devido a essa ação estrogênica elas têm sido bastante utilizadas como alternativa
às terapias de reposição hormonais convencionais, pois reduzem os sintomas da
menopausa e provocam menos efeitos colaterais (APERS et al., 2004; LEE et al.,
2007). As isoflavonas também possuem ação em várias outras patologias, como no
combate a cânceres hormônio-dependentes, doenças cardiovasculares e
osteosporose. Essas substâncias ainda possuem atividade antioxidante e anti-
fúngica (PARK et al., 2001; LEE et al., 2007; CÉSAR et al., 2007).
2
Campos e colaboradores (2006) e César e colaboradores (2007) relatam a
alta variabilidade de teores de isoflavonas em cápsulas e comprimidos de isoflavona
comercializadas, demonstrando a deficiência de desenvolvimento farmacotécnico e
controle de qualidade adequados.
Diante das considerações acima este trabalho propõe o desenvolvimento
farmacotécnico e analítico apropriado de formas farmacêuticas sólidas de isoflavona
de soja, utilizando como matéria-prima extrato seco de soja padronizado.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 FORMAS FARMACÊUTICAS SÓLIDAS ORAIS
2.1.1 Estudo de pré-formulação
A pré-formulação é a primeira etapa no desenvolvimento racional de formas
farmacêuticas. No desenvolvimento de formulações é essencial conhecer as
características físicas e químicas do fármaco e dos excipientes. É importante que a
forma farmacêutica tenha estabilidade e biodisponibilidade adequadas, sendo que
tanto o fármaco como os excipientes podem influenciar estas características.
(ALDERBORN, 2005; WELLS, 2005; VIANA et al, 2006).
Para obtenção de formas farmacêuticas sólidas adequadas é essencial que
se cumpram algumas etapas ao longo do desenvolvimento, como análise do
tamanho das partículas, compatibilidade entre os componentes, estabilidade, fluxo
de pós, compressibilidade, avaliação das características físico-químicas,
polimorfismo, aparência visual (WELLS, 2005; CURY; SILVA JÚNIOR; CASTRO,
2008).
Os tamanhos de partículas do fármaco e excipientes terão influência tanto nas
características físicas do medicamento como na sua eficácia farmacológica. O
tamanho de partícula influi também na produção das formas farmacêuticas sólidas.
Existem etapas na produção de comprimidos e cápsulas que controlam a massa de
fármaco e adjuvantes farmacotécnicos mediante preenchimento de um determinado
volume. Qualquer fator que interfira na uniformidade do preenchimento pode alterar
a massa de fármaco contida no comprimido ou na cápsula, comprometendo a
uniformidade de conteúdo do produto final. Pós com diferentes tamanhos de
partícula apresentam diferentes propriedades de fluxo e empacotamento,
conseqüentemente gerando volumes de pó encapsulados ou comprimidos
irregulares. Para evitar esse tipo de problema durante a produção do medicamento,
os tamanhos de partícula do fármaco e excipientes devem ser avaliados durante a
fase de pré-formulação do produto (STANIFORTH, 2005; EMSHANOVA, 2008).
O fluxo de pós é um parâmetro importante a ser avaliado na pré-formulação,
pois influencia nas etapas de mistura, granulação, secagem, calibração dos
grânulos, compressão e enchimento de cápsulas. Fluxo livre é fundamental para
alimentação de equipamentos, uniformidade na dose, evitar excesso de ar retido
4
entre as partículas (impedindo laminação), evitar excesso de partículas finas que
podem gerar contaminação cruzada e do manipulador (STANIFORTH, 2005;
SCHNEIDER; SINKA; COCKS, 2007).
Velocidade de fluxo é uma medida direta do fluxo de pós. Ela é medida
verificando o tempo que uma determinada massa, geralmente 100g, leva para
passar por um funil com um diâmetro de orifício previamente definido. O diâmetro do
orifício do funil pode variar, sendo este um parâmetro fundamental na análise da
velocidade de fluxo (USP 30, 2007).
O ângulo de repouso é o ângulo formado pelo pó quando ele escoe
livremente por um funil com um diâmetro de orifício previamente definido e cai por
uma superfície plana e lisa (ANSEL; POPOVICH; ALLEN Jr, 2007; USP 30, 2007).
Compressibilidade é a capacidade da matéria-prima de sofrer redução de
volume quanto submetida à pressão. Os dois mecanismos principais de redução de
volume durante a compressão são a fragmentação e a deformação plástica. Os
materiais se comportam em graus diferentes de fragmentação e deformação plástica
durante a compressão. Geralmente o parâmetro de compressibilidade de pós
farmacêuticos é determinado pela relação entre a pressão aplicada e o volume
compactado (ZHAO; BURT; MILLER, 2006; SINKA et al., 2009). Um índice similar a
compressibilidade foi determinado por Hausner, no qual o fluxo também é avaliado
indiretamente utilizando a densidade aparente e a densidade de compactação do pó
(WELLS, 2005; USP 30, 2007).
O estudo das propriedades físicas e químicas do fármaco é importante para
obtenção de um medicamento estável e eficaz. Essas propriedades, como
solubilidade, dissolução, tamanho da partícula, formas polimórficas, interações entre
fármaco e excipientes, coeficiente de partição, constante de ionização,
higroscopicidade e propriedades organolépticas, podem ter efeitos sobre a
disponibilidade fisiológica e estabilidade física e química do fármaco (YORK, 2005).
O estudo de compatibilidade são testes fundamentais a serem avaliados no
desenvolvimento de formulações. As técnicas termoanalíticas são de grande auxílio
nesses testes, pois possibilitam a triagem de formulações mais estáveis em menor
tempo que os estudos de estabilidade convencionais (BAZZO; SILVA, 2005).
Nesse sentido, a análise térmica é um conjunto de métodos pelos quais as
propriedades de uma amostra é medida em função da temperatura e / ou do tempo,
enquanto a amostra está submetida a um programa de temperatura controlado, sob
5
uma atmosfera especificada. Possibilita estudar interações entre o princípio ativo e
os excipientes, a cinética de degradação e a estabilidade entre os componentes da
formulação. Dentre os métodos conhecidos, os mais empregados são a calorimetria
exploratória diferencial e a termogravimetria (RODRIGUES et al., 2008).
2.1.2 Comprimidos
Comprimidos são formas farmacêuticas sólidas constituídas por um ou mais
princípios ativos e excipientes (substâncias que auxiliam na sua formação e não
possuem atividade farmacológica) agrupados em uma formulação, sendo obtidos
pela compressão da formulação completa (ALDERBORN, 2005; SHAO, ROWE,
YORK, 2007).
O processo de compressão envolve três fases principais (Figura 1):
alimentação, compactação e ejeção. Na alimentação, o pó/granulado flui do funil
alimentador preenchendo a matriz pela força da gravidade, e o punção inferior veda
a parte inferior da matriz, não deixando o conteúdo sair. O preenchimento da matriz
deve ser uniforme para que os comprimidos sejam uniformes. A compactação é a
etapa em que os punções, inferior e superior, movimentam-se na matriz até
exercerem uma força máxima no material particulado dentro da matriz, formando o
comprimido. Após a compactação vem a fase de ejeção na qual o punção inferior
sobe, ejetando o comprimido da matriz. As propriedades do fármaco e dos
adjuvantes influenciam diretamente nas fases do processo de compressão, afetando
a qualidade do produto final (BONACUCINA et al., 2007; WU et al.,2008; SINKA et
al., 2009).
6
Figura 1. Fases do processo de compressão.
2.1.2.1 Formas de obtenção de comprimidos
2.1.2.1.1 Compressão direta
A compressão direta é um processo contemporâneo que tem crescido nos
últimos anos devido ao aparecimento de mais e melhores excipientes para uso na
compressão direta de medicamentos. Este processo oferece vantagens, como o
tempo reduzido, por ter menos operações unitárias, podendo levar à obtenção de
comprimidos muitas vezes com melhor estabilidade, visto que a mistura de pós não
passa por etapas de umectação, secagem em temperaturas elevas ou granulação
seca. Porém, para que esse processo possa ser utilizado, o fármaco deve ter
características adequadas como boa fluidez, compressibilidade e representar uma
pequena porcentagem do comprimido. Isto torna a seleção de excipientes
extremamente importante, visto que eles devam ser apropriados para fornecer
7
fluidez, homogeneidade da mistura, compressibilidade, estabilidade física e química,
compatibilidade com o ativo da formulação e promover dissolução adequada.
(ZHANG, LAW, CHAKRABARTI, 2003; ALDERBORN, 2005; EMSHANOVA, 2008)
2.1.2.1.2 Granulação úmida
A granulação úmida é um processo tradicional, no qual se faz com que as
partículas primárias se aglomerem formando grânulos. Na forma mais convencional
desse processo é feita a tamisação dos componentes (fármaco e adjuvantes) na
forma de pós, tentando delimitar o tamanho máximo das partículas, posteriormente é
feita a mistura desses componentes, então é adicionado um líquido aglutinante, e
em seguida a massa formada é homogeneizada e granulada. Os grânulos úmidos
são colocados em estufa para secagem (SUMMERS, AULTON, 2005; LAMOLHA,
SERRA, COCKS, 2007; BACHER et al., 2008).
Apesar de envolver mais etapas, a granulação úmida confere melhor
propriedades de fluxo e compactação da formulação, previne a segregação dos
constituintes durante as etapas posteriores do processo, minimiza as variações de
granulometria de diferentes lotes de matérias-primas, reduz os possíveis riscos à
saúde causados pelo manuseio e inalação de pós finos. Por serem mais densos, os
grânulos ocupam menor volume por unidade de peso, sendo mais convenientes
para estocagem. Outra vantagem é econômica, visto que geralmente são utilizadas
matérias-primas mais baratas que para compressão direta e o fármaco pode
representar uma porcentagem mais alta do comprimido (SUMMERS, AULTON,
2005; LAMOLHA, SERRA, COCKS, 2007; BACHER et al., 2008).
2.1.2.2 Vantagens dos comprimidos
Dentre as vantagens apresentadas por essa forma farmacêutica, podem ser
citadas a alta aceitação, via conveniente (não invasiva) e segura para administração
de medicamentos. Comprimidos geralmente possuem melhor estabilidade química e
física em relação às formas líquidas, os processos de preparo permitem maior
precisão da dose e menor variabilidade do conteúdo, são de fácil manuseio e podem
ser obtidos de modo versátil levando em consideração os modos de uso. Podem ser
produzidos em grande escala por processos de produção robustos e com sistema
eficaz de controle de qualidade, com custo relativamente baixo. Pode ainda ser
8
levada em conta a questão estética do comprimido, que pode ser preparado com
várias cores e formatos (ALDERBORN, 2005; ANDO et al., 2007).
2.1.2.3 Excipientes
Excipientes ou adjuvantes farmacotécnicos, são, de forma simplificada,
matérias-primas que auxiliam na formação dos medicamentos e não possuem
atividade farmacológica. Apesar de serem considerados inertes, alguns excipientes
podem tem ação, como o manitol, que é utilizado como diluente em formas sólidas, e
em grandes quantidades tem efeito laxativo (VILLANOVA; SÁ, 2009).
Os excipientes são fundamentais no desenvolvimento de formas
farmacêuticas sólidas, por serem responsáveis pela formação da forma
farmacêutica. Excipientes influenciam e muitas vezes garantem a estabilidade física
e química, a biodisponibilidade adequada e uma boa aparência visual. Eles possuem
várias funções como diluentes, tensoativos, aglutinantes, lubrificantes, deslizantes,
desintegrantes, antioxidantes, agentes modificadores de liberação, agentes de
revestimento, plastificantes, edulcorantes, corantes, flavorizantes (ALDERBORN,
2005; VIANA et al, 2006; VILLANOVA; SÁ, 2009).
2.2 CONTROLE DE QUALIDADE
O controle de qualidade visa a fabricação de produtos com qualidade, de
forma sistemática e uniforme. Para garantir que todo lote de medicamento tenha
eficácia semelhante, é essencial estabelecer especificações adequadas para o
medicamento em questão. Como a qualidade é requisito indispensável em todas as
fases do processo de fabricação, o controle das matérias-primas e da produção
(processo) é o melhor método para manter um alto nível de qualidade na totalidade
dos produtos semi-elaborados e acabados (KOROLKOVAS, 1984).
2.2.1 Controle da qualidade microbiológico
Grande parte das matérias-primas de uso farmacêutico apresenta-se
contaminada por algum microorganismo. Os produtos de origem natural geralmente
são mais contaminados que os de origem sintética, já que nas matérias-primas
sintéticas a carga microbiana pode ter sido reduzida durante o processo de obtenção
por efeito do calor, de valores extremos do pH ou pelo uso de solventes orgânicos. A
determinação da carga microbiana nessas matérias-primas, em que a análise
9
microbiológica se faz necessária, é realizada, muitas vezes, de forma direta,
utilizando os procedimentos de contagem de microorganismos viáveis (HODGES,
2005).
2.2.2 Controle de qualidade físico-químico
Para garantir que uma forma farmacêutica tenha a eficácia desejada é preciso
que ela cumpra parâmetros físico-químicos relacionados ao produto final. O controle
de qualidade físico-químico dos comprimidos visa garantir que eles possuam as
características adequadas para disponibilizar o fármaco para absorção. A dissolução
é um método muito utilizado para avaliar a forma como o comprimido libera o
princípio ativo no meio, garantindo a biodisponibilidade do medicamento
(RODRIGUES et al., 2008).
Entre os métodos utilizados para avaliar a qualidade físico-química dos
comprimidos estão: análise do teor de princípio(s) ativo(s), peso médio, dureza,
espessura, desintegração, friabilidade, dissolução e aparência física (STULZER;
SILVA, 2007).
Grande parte dos métodos utilizados na avaliação de comprimidos está
descritos em compêndios oficiais (Farmacopéias). No entanto, há casos em que não
há a descrição, sendo necessário que os mesmos sejam desenvolvidos e validados,
segundo a Resolução – RE nº 899 (2003), da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (BRASIL, 2003).
2.3 ISOFLAVONAS DA SOJA
Isoflavonas são flavonóides encontrados em abundância nos grãos de soja
(Glycine max L.). As isoflavonas são os fitoestrógenos mais comuns, possuindo uma
estrutura semelhante ao estrógeno (APERS et al., 2004; LEE et al., 2007). As
isoflavonas exercem funções biológicas semelhantes ao estrógeno, com ação
fracamente estrogênica, sendo utilizadas no tratamento dos sintomas da menopausa
como alternativa às terapias de reposição hormonais convencionais que provocam
diversos efeitos colaterais. Estudos têm demonstrado que as isoflavonas reduzem os
sintomas indesejáveis decorrentes da menopausa sem provocar a alta incidência de
efeitos colaterais provocados pela terapia de reposição hormonal convencional. Há
também um aumento no interesse de outros benefícios potenciais das isoflavonas,
como em vários tipos de cânceres hormônio-dependentes, doenças
10
cardiovasculares, e osteosporose. Essas substâncias ainda possuem atividade
antioxidante e anti-fúngica (PARK et al., 2001; LEE et al., 2007; CÉSAR et al., 2007).
As isoflavonas podem agir de diferentes formas dependendo do tecido,
apresentando afinidade por receptores específicos. Suas principais ações são como
estrógenos e anti-estrógenos, reguladora de atividade de proteína (principalmente
de tirosina quinases, ligada ao desenvolvimento de câncer), reguladora do ciclo
celular e antioxidante (ESTEVES; MONTEIRO, 2001). Na presença de estrógenos
as isoflavonas atuam como antiestrógenos, competindo pelos sítios de ligação nos
receptores de estrógenos presentes na célula. Na ausência do estrógeno, como na
menopausa, as isoflavonas possuem efeito estrogênico e substituem o hormônio
que se apresenta em baixo nível, aliviando os sintomas da menopausa
(DESPAIGNE, 2001).
As principais isoflavonas (Figura 2) da soja são as formas agliconas
daidzeína, genisteína e gliciteína, que ocorrem também na forma de glicosídeos,
daidzina, genistina e glicitina, respectivamente. A genisteína e a daidzeína são as
formas mais abundantes, representando de 50 a 90% dos flavonóides encontrados e
possuem maior atividade biológica (PARK et al., 2001; PRABHAKARAN; HUI;
PERERA, 2006; CÉSAR et al., 2007).
11
Figura 2. Estruturas químicas das agliconas e glicosídeos de isoflavonas.
As isoflavonas quando ingeridas podem ser hidrolisadas em parte pelo suco
gástrico liberando as agliconas, como daidzeína e genisteína, e a grande parte é
absorvida diretamente no intestino. A eliminação geralmente ocorre via renal,
semelhante aos estrógenos endógenos (KNIGHT; EDEN, 1995; TAPIERO; BA;
TEW, 2002).
Outro fator importante é que os teores de isoflavonas em suas diferentes
formas variam com o cultivo e as condições climáticas, sendo de fundamental
importância o monitoramento dos teores de cada matéria-prima. Tal variação diminui
com o uso de extrato padronizado. (PARK et al., 2001; PRABHAKARAN; HUI;
PERERA, 2006; CÉSAR et al., 2007).
Em dezembro de 2009 a isoflavona de soja foi um dos fitoterápicos aprovados
pelo ministério da saúde para ser distribuída pelo Sistema Único de Saúde, para
reduzir os sintomas da menopausa (BRASIL, 2009).
12
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver formas farmacêuticas sólidas de uso oral de isoflavona de soja e
métodos de análise da matéria-prima, do granulado e do produto acabado
(comprimidos).
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estudo de pré-formulação e desenvolvimento de formulações de comprimidos
de isoflavona de soja.
Desenvolver metodologia analítica para a determinação quantitativa e
qualitativa das isoflavonas daidzeína e genisteína por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE). Aplicar a metodologia desenvolvida no controle de qualidade
matéria-prima e dos produtos acabados desenvolvidos.
Desenvolver metodologia de dissolução para analisar os comprimidos
desenvolvidos, avaliando o perfil de cada formulação.
Comparar as formulações desenvolvidas, quanto a parâmetros físicos, teor e
dissolução.
13
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAS
4.1.1 Equipamentos e Acessórios
Balança Analítica – Gehaka (Modelo AG 200);
Balança Semi-Analítica – Tecnal (Modelo B TEC 1300);
Balança de infravermelho – GEHAKA (Modelo IV 2000);
Banho-Maria – Fisatom (Mod. 552);
Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência – Varian;
Centrífuga – Sigma (Modelo 3-18K);
Deionizador – Quimis ;
Dissolutor – Varian (Modelo Vankel 7000, nº série 1-6353-0802, R.S. 001800);
Estufa – Nova ética
Lavadora Ultra-sônica – Unique (Modelo USC 1400, nº série 238210);
Milli Q Gradiente – Millipore (nº série B2EN 38775ª);
Mini incubadora – Marconi (Modelo MA 410);
Paquímetro Fischer Scientific;
Aparelho para determinação do ângulo de repouso – Erweka, modelo GTB;
Desintegrador – Nova Ética, modelo 301AC;
Calorímetro diferencial exploratório por fluxo de calor, Shimadzu DSC-60A,
dotado de controlador de fluxo para gás de purga (N
2
) FC-60A, integrador TA-
60WS e software de controle e avaliação TA-60WS;
Termobalança Shimadzu DTG-60, dotado de controlador de fluxo para gás de
purga (N
2
) FC-60A, integrador TA-60WS e software de controle e avaliação
TA-60WS;
Friabilômetro – Nova Ética (modelo 300);
Misturador em V – Lawes, modelo 6-10 L;
Compressora – Lawes 2000 08-PSC MANU;
Estufa de secagem de pós – Lawes;
Granulador cônico – Lawes (modelo GS Lab);
Durômetro – Nova ética (modelo 298 – DGP);
Drageadora – Lawes;
Densímetro de pós – Erweka ( modelo SVM 203).
14
4.1.2 Reagentes e Produtos
Ácido Clorídrico;
Ácido Acético Glacial;
Acetato de Sódio Monohidratado;
Acetonitrila;
Lauril Sulfato de Sódio;
Metanol (Grau CLAE);
Tween® 20;
Tween® 80;
Meio ágar caseína-soja;
Meio ágar sabouraud;
Escherichia coli cepa ATCC 25922;
Staphylococcus aureus cepa ATCC 25923;
Candida albicans cepa ATCC 10231;
Aspergillus niger cepa ATCC 16404.
4.1.3 Matérias-primas
Extrato seco de soja padronizado em 40% de isoflavona;
Daidzeína substância química de referência – Sigma-Aldrich (Lote 048K4032);
Genisteína substância química de referência – LC Laboratories (Lote G-6055);
Celulose microcristalina PH-102;
Croscarmelose sódica;
Amido de milho;
Dióxido de titânio;
Dióxido de silício;
Estearato de magnésio;
Fosfato dicálcico anidro;
Hidroxipropilmetilcelulose (Opadry YS-1-7006
®
);
Lactose M-200;
Polietilenoglicol 6000;
Lauril sulfato de sódio;
Polyplasdone XL-10
®
;
Polyplasdone XL
®
;
15
Metabissulfito de sódio;
Butilhidroxitolueno;
Povidona;
Talco;
Corante óxido de ferro amarelo;
Corante vermelho ponceau;
Corante amarelo tartrazina.
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Análise microbiológica
A análise microbiológica do extrato seco de soja foi realizada junto com um
teste de recuperação com cepas de bactérias e fungos disponíveis, para verificar se
o extrato não impede o crescimento microbiológico (USP 30, 2007).
Na análise microbiológica e teste de recuperação do extrato seco de soja as
bactérias Escherichia coli cepa ATCC 25922 e Staphylococcus aureus cepa ATCC
25923 foram repicadas em meio ágar caseína-soja inclinado e incubadas a 35ºC por
48 horas. Os fungos Candida albicans cepa ATCC 10231 e Aspergillus niger cepa
ATCC 16404 foram repicados em ágar sabouraud e incubados a 24ºC por 96 horas.
Os microorganismos do meio ágar caseína-soja inclinado foram transferidos para um
tubo contendo caldo caseína-soja com auxílio de uma alça estéril.
Foi retirada uma alíquota de 1 mL das suspensões, transferida para uma
placa de petri e acrescentados 20 mL de ágar caseína-soja fundido e resfriado a
45ºC nas placas contendo inóculo bacteriano. As placas contendo fungos receberam
ágar sabouraud fundido e resfriado a 45ºC. O plaqueamento foi realizado em
duplicata para cada diluição.
O extrato foi diluído em caldo de soja triptona com polissorbato e lecitina de
soja na proporção 1:10, respectivamente.
As bactérias foram incubadas a 35ºC por 48 horas e os fungos a 24ºC por 96
horas. Após a incubação foi verificada a contagem células por placa, através da
média aritmética para cada diluição em teste.
No primeiro grupo (grupo teste) foi adicionado 1 mL do extrato diluído no
método de análise na placa de petri, em seguida um 1 mL de inóculo, 20 mL de
16
ágar fundido e resfriado a 45ºC. Homogeneizou-se com movimento em 8 e
colocadas em repouso até solidificar. As placas foram incubadas invertidas.
No segundo grupo (grupo teste do diluente) foi adicionado 1 mL do diluente
na placa de petri, em seguida um 1 mL de inoculo, 20 mL de ágar fundido e resfriado
a 45ºC. Homogeneizou-se com movimento em 8 e colocadas em repouso até
solidificar. As placas foram incubadas invertidas.
No terceiro grupo (controle positivo) foi adicionado 1 mL de inoculo na placa
de petri, 20 mL de ágar fundido e resfriado a 45ºC. Homogeneizou-se com
movimento em 8 e colocadas em repouso até solidificar. As placas foram incubadas
invertidas.
No quarto grupo (controle negativo) foi adicionado 1 mL do diluente na placa
de petri, 20 mL de ágar fundido e resfriado a 45ºC. Homogeneizou-se com
movimento em 8 e colocadas em repouso até solidificar. As placas foram incubadas
invertidas.
No quinto grupo (controle do produto) foi adicionado 1 mL do extrato diluído
na placa de petri, 20 mL de ágar fundido e resfriado a 45ºC. Homogeneizou-se com
movimento em 8 e colocadas em repouso até solidificar. As placas foram incubadas
invertidas.
Após o tempo de incubação as unidades formadoras de colônias (UFC) foram
contadas manualmente nas placas.
Cada grupo deve cumprir os critérios específicos, sendo que o 1º grupo deve
apresentar crescimento igual ou superior a 70% em relação ao observado no
controle positivo (grupo 3); o 2º grupo deve apresentar crescimento igual ou superior
a 70% em relação ao observado no controle positivo (grupo 3); o 3º grupo deve
apresentar crescimento conforme a padronização feita anteriormente; o 4º grupo
(controle negativo) não deve apresentar crescimento; o 5º grupo por ser o controle
do produto não deve apresentar crescimento (USP 30, 2007).
4.2.2 Desenvolvimento e validação do método analítico por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) para determinação de genisteína e daidzeína.
No desenvolvimento do método para análise de genisteína e daidzeína por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram avaliadas diferentes condições
cromatográficas conforme a Tabela 1, com o intuito de determinar as condições de
17
melhor desempenho do método que garantisse a quantificação e separação desses
dois marcadores.
Em todas as condições demonstradas na Tabela 1 a fase estacionária
utilizada foi uma coluna de fase reversa C18 150 mm x 4,6 mm x 5 µm, e o
comprimento de onda foi 254 nm. Amostras de padrões primários de genisteína e
daidzeína foram dissolvidas separadamente em metanol.
Tabela 1. Condições cromatográficas utilizadas para o desenvolvimento do método
analítico por cromatografia líquida de alta eficiência.
Método
Fase móvel
Proporção
(v/v)
Fluxo
(mL/min)
Modo
Detector
Temperatura
Volume
de
injeção
1
metanol com 1%
de ácido acético:
água com 1% de
ácido acético
30:70
0,7
Isocrático
UV -VIS
40ºC
10 µL
2
metanol com 1%
de ácido acético:
água com 1% de
ácido acético
65:35
0,7
Isocrático
UV -VIS
40ºC
10 µL
3
metanol com 1%
de ácido acético:
água com 1% de
ácido
acético:acetonitrila
64:34:2
0,7
Isocrático
UV -VIS
40ºC
10 µL
4
metanol com 0,1%
de ácido acético:
água com 0,1%
de ácido
acético:acetonitrila
64:34:2
0,7
Isocrático
UV -VIS
40ºC
10 µL
5
metanol com 0,1%
de ácido acético:
água com 0,1%
de ácido
acético:acetonitrila
64:34:2
0,7
Isocrático
UV -VIS
30ºC
10 µL
6
metanol com 0,1%
de ácido acético:
água com 0,1%
de ácido
acético:acetonitrila
64:32:4
0,7
Isocrático
UV -VIS
30ºC
10 µL
Após todos os métodos serem testados e avaliados quanto à simetria e
resolução dos picos, tempos de retenção e largura das bases dos picos, o método
escolhido foi submetido ao procedimento de validação seguindo os critérios de
aceitação da Resolução – RE nº 899 (2003), da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária e ICH (2005).
18
4.2.2.1 Curva de calibração
Para a construção das três curvas de calibração foram preparadas soluções
estoque de daidzeína e genisteína pesando 10mg de cada padrão, posteriormente
colocados em balões volumétricos separados de 10mL e completados os volumes
com metanol. Partindo das soluções estoques foi preparada uma solução mãe
utilizando balão volumétrico de 10mL, sendo pipetado 1mL de cada solução estoque
e completando com metanol grau CLAE.
As diluições volumétricas para as curvas de calibração foram feitas, em
duplicata, em vial a partir da solução mãe. As curvas de calibração foram realizadas
em diferentes dias, sendo todas nas seguintes concentrações de ambos os padrões:
36,0 µg/mL; 32,5 µg/mL; 30,0 µg/mL; 24,0 µg/mL; 19,5 µg/mL; 15,0 µg/mL; 7,5
µg/mL; 3,0 µg/mL e 1,5 µg/mL.
A linearidade foi avaliada pelo coeficiente de correlação das três curvas de
calibração.
4.2.2.2 Precisão, Repetibilidade, Exatidão
A precisão foi avaliada quanto à repetibilidade (precisão intra-corrida) e
precisão intermediária (inter-corrida).
Para avaliar a repetibilidade, foram realizadas em CLAE nove determinações
em três concentrações, baixa (1,5µg/mL), média (15,0µg/mL) e alta (30,0µg/mL),
sendo cada concentração feita em triplicata para posterior cálculo estatístico. A
precisão intermediaria foi realizada por outro analista em dia diferente, sendo as
análises feitas como na repetibilidade.
A exatidão foi avaliada pelo grau de concordância entre os resultados obtidos
na repetibilidade e os valores estabelecidos como referência (Ribani et al, 2004).
4.2.2.3 Robustez
Para avaliar a robustez do método, foram realizadas pequenas variações nos
parâmetros analíticos do método cromatográfico para avaliar a susceptibilidade do
método às variações analíticas.
Os parâmetros avaliados foram: temperatura, fluxo e pH da fase móvel. A
temperatura utilizada no ensaio de robustez foi alterada de 30ºC para 35ºC. O fluxo
da fase móvel foi modificado de 0,7mL/min para 0,6mL/min. E o pH da fase móvel foi
alterado de 4,0 para 3,8.
19
4.2.2.4 Limites de quantificação e detecção
Os limites de quantificação e detecção foram determinados pela análise em
CLAE de soluções contendo concentrações decrescentes de daidzeína e genisteína
até o menor nível determinável e detectável (ICH, 2005).
4.2.3 Estudo de pré-formulação
4.2.3.1 Análise térmica
4.2.3.1.1 Mistura binária
Para verificar possíveis interações do extrato seco de soja e vários
excipientes, foram preparadas misturas binárias para serem submetidas à
calorimetria exploratória diferencial (MURA et al., 1995).
As misturas binárias foram preparadas por meio de mistura física na
proporção de 1:1 do extrato e de cada excipiente demonstrado na Tabela 2. Cada
componente da mistura foi pesado separadamente e transferido para frasco de vidro
âmbar. Todos os frascos contendo mistura binária foram agitados igualmente.
4.2.3.1.2 Termogravimetria (TG)
Antes da análise por calorimetria exploratória diferencial o extrato seco de
soja foi analisado por termogravimetria para avaliar o seu comportamento térmico.
As condições desse teste foram velocidade de aquecimento de 10ºC/min, faixa de
aquecimento entre 25ºC e 650ºC, a composição e fluxo do gás de purga utilizado foi
nitrogênio sob fluxo de 50mL/min.
4.2.3.1.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
O equipamento foi previamente calibrado com índio e zinco, em termos de
temperatura e valores de entalpia.
Foram submetidas à calorimetria exploratória diferencial as amostras de
extrato seco de soja, excipientes, misturas binárias e as substâncias químicas de
referência daidzeína e genisteína. Em cada cadinho foram pesadas as amostras
com massa entre 1 e 3mg, os quais foram tampados e selados com selador próprio.
20
Dois cadinhos vazios foram tampados e selados para serem utilizados um como
referência e outro como branco.
Os ensaios foram realizados utilizando velocidade de aquecimento de
10ºC/min, faixa de aquecimento entre 25ºC e 500ºC, a composição e fluxo do gás de
purga utilizado foi nitrogênio sob fluxo de 50mL/min.
4.2.3.2 Determinação do teor do extrato seco de soja
O teor de daidzeína e genisteína do extrato seco de soja foi determinado de
duas formas, sem hidrolisar e hidrolisando o extrato.
Na forma sem hidrolisar o extrato foi pesado, transferido para balão
volumétrico, adicionado metanol e colocado em ultrassom por 20 minutos. A solução
foi diluída para a concentração de 100 µg/mL de extrato, filtrada e analisada por
CLAE, conforme item 4.2.2.
Na outra forma, o extrato foi submetido previamente a hidrólise ácida. Para a
hidrólise ácida o extrato foi pesado, colocado em balão volumétrico, adicionado
ácido clorídrico etanólico 3 mol/L e colocado sob agitação em banho-maria a 60ºC
com refluxo por 40 minutos. Após resfriar, o volume foi completado com ácido
clorídrico etanólico 3 mol/L (CÉSAR et al., 2006; CÉSAR et al., 2007; YUAN et al.,
2008). A solução foi filtrada e diluída com metanol para a concentração de 100
µg/mL de extrato e analisada por CLAE, conforme item 4.2.2.
4.2.3.3 Propriedades dos pós e granulados
O fluxo da mistura de pós e dos granulados foi avaliado diretamente pela
velocidade de escoamento e indiretamente pelo ângulo de repouso, no analisador de
fluxo de pós e granulados GTB (Erweka) - Figura 3. Aproximadamente 40 g da
amostra foram colocadas no funil com orifício de 15 mm de diâmetro, com agitação
mecânica e leitura automática. Os experimentos foram feitos em triplicatas.
21
A
B
Figura 3. GTB usado na análise de fluxo (A) e na análise de ângulo de repouso (B).
A densidade da mistura de pós e dos granulados foi determinada em um
densímetro de pós SVM 203 (Erweka). Para a determinação, 40 g da mistura de pós
ou granulado foram pesadas e transferidas para a proveta calibrada do densímetro,
onde o volume foi medido e a densidade aparente avaliada. A proveta foi submetida
a uma seqüência de batidas e o volume final (densidade compactada) foi aferido. As
densidades aparente e de compactação foram calculadas dividindo a massa
colocada na proveta pelo volume medido.
Utilizando as densidades calculadas, aparente (bruta) e de compactação, a
compressibilidade foi calculada pela seguinte equação:
100
0
x
dac
ddac
C
(Equação 1)
Onde, C é a compressibilidade, dac é a densidade de compactação e d0 é a
densidade aparente. Sendo o resultado obtido expresso em porcentagem (USP 30,
2007).
O índice de Hausner foi calculado pela equação abaixo:
0d
dac
IH
(Equação 2)
Onde, IH é o índice de Hausner, dac é a densidade de compactação e d0 é a
densidade aparente (USP 30, 2007).
A umidade residual dos pós e granulados foi avaliada em triplicata utilizando
balança de infravermelho GEHAKA. O extrato, granulado ou mistura de pós foi
22
acondiciona em prato metalizado 10 cm de diâmetro, de forma a preencher todo o
fundo do recipiente. Foi utilizado o modo automático de secagem até que se
atingisse peso constante à temperatura de 105ºC (BORGES et al., 2005).
A granulometria foi avaliada colocando 50 g do extrato, mistura de pós ou
granulado numa seqüência de tamises, com malhas de 1,4 mm, 1,0 mm, 0,5 mm,
0,25 mm e 0,125mm, que foram submetidos à agitação manual. A quantidade retida
em cada tamis foi pesada e expressa em porcentagem.
4.2.3.4 Métodos de obtenção dos comprimidos
Foram propostas cinco formulações de comprimidos revestidos de isoflavona
150 mg por granulação úmida (formulações GU1, GU2, GU3, GU4 e GU5) e uma
formulação por compressão direta (formulação CD1) com o objetivo de avaliar o
comportamento dos excipientes e do extrato seco de soja. Para cada formulação foi
feito um piloto de aproximadamente 300 g.
As formulações por granulação úmida e compressão direta foram preparadas
conforme esquema demonstrado na Figura 4. A Tabela 2 mostra os excipientes
utilizados para cada formulação.
23
Figura 4. Esquema das etapas de granulação úmida e compressão direta.
24
Tabela 2. Componentes das formulações GU1 a GU5 e CD1.
Função
Matéria-prima
Formulações
GU1
GU2
GU3
GU4
GU5
CD1
Ativo
Extrato seco de soja
X
X
X
X
X
X
Diluente
Lactose m-200
X
X
X
X
X
Fosfato dicálcio
X
Amido de milho
X
X
Celulose microcristalina PH-102
X
X
X
X
X
X
Desintegrante
Croscarmelose sódica
X
X
X
X
Polyplasdone XL-10
X
Polyplasdone XL
X
Tensoativo
Lauril sulfato de sódio
X
X
X
Aglutinante
Povidona
X
X
X
X
X
Deslizante
Dióxido de silício
X
X
X
X
X
X
Lubrificante
Estearato de magnésio
X
X
X
X
X
X
Antioxidante
Metabissulfito de sódio
X
Butilhidroxitolueno
X
X
X
X
X
Filme de
revestimento
Opadry
®
YS-1-7006
X
X
X
X
X
X
Plastificante
Polietilenoglicol 6.000
X
X
X
X
X
X
Opacificante
Dióxido de titânio
X
X
X
X
X
X
Deslizante
Talco
X
X
X
X
X
X
Corante
Corante óxido de ferro amarelo
X
Corante vermelho ponceau
X
X
X
X
X
Corante amarelo tartrazina
X
Na granulação úmida todas as matérias-primas foram tamisadas em malha
1,0 mm. A isoflavona, diluentes e metade da quantidade dos desintegrantes foram
misturados. A solução de umectação, preparada com o aglutinante em 90 mL de
álcool, foi adicionada à mistura. A massa úmida formada foi passada pelo granulador
cônico, utilizando malha 2,0mm, formando os grânulos. O granulado obtido foi
recolhido em bandejas e colocado em estufa a 40ºC, até que atingisse umidade
abaixo de 5,0%. O granulado seco foi passado novamente pelo granulador cônico,
25
utilizando malha 1,4 mm. Após calibração o granulado foi colocado no misturador em
V junto com o lubrificante (1,5%) e o deslizante (0,5%), e misturado por cinco
minutos. Após a mistura final, o granulado foi colocado no funil da compressora e os
comprimidos foram obtidos utilizando punção redondo de 9 mm bicôncavo, com
peso médio teórico de 300 mg.
Na compressão direta todas as matérias-primas foram tamisadas em malha
1,4 mm, e colocadas no misturador em V por 10 minutos. A mistura foi colocada no
funil da compressora e os comprimidos foram obtidos utilizando punção redondo de
9 mm bicôncavo.
Após a compressão as formulações foram revestidas em drageadora
convencional para proteger da umidade, melhorar a aparência e mascarar o sabor
do comprimido (HOGAN, 2005). A suspensão de revestimento foi preparada em
álcool com o filme de revestimento, o plastificante, o opacificante, o deslizante e o(s)
corante(s). Os comprimidos foram colocados na drageadora e submetidos a ar
quente. Quando os comprimidos atingiram aproximadamente 40ºC iniciou-se a
aplicação dos 500 mL da suspensão.
4.2.3.5 Testes físicos dos comprimidos
4.2.3.5.1 Determinação do Peso Médio
Foram pesados individualmente 20 comprimidos em balança analítica. Em
seguida, a média aritmética, desvio padrão e coeficiente porcentual de variação do
peso foram determinados (BRASIL, 1988).
4.2.3.5.2 Determinação da Dureza
A dureza de 20 comprimidos foi determinada em durômetro digital pela
medida da resistência ao esmagamento radial. Foram calculados os coeficientes de
variação, média e desvio padrão (BRASIL, 1988).
4.2.3.5.3 Espessura
A espessura de 20 comprimidos foi determinada com o auxílio de paquímetro
digital. Foram calculados os coeficientes de variação, média e desvio padrão
(BRASIL, 1988).
26
4.2.3.5.4 Determinação da Friabilidade
A friabilidade foi determinada com a pesagem de 20 comprimidos revestidos
em balança analítica (peso inicial) de acordo com a Farmacopéia Brasileira 4ª.
Edição. O teste foi feito em friabilômetro regulado a 20 rpm, durante 5 minutos. Após
esse tempo, os 20 comprimidos foram pesados novamente (peso final) e foi
determinada a friabilidade de acordo com a equação seguir (BRASIL, 1988).
Pi
PfPi
deFriabilida
100*)(
(Equação 3)
Na qual:
Pi = peso inicial
Pf = peso final
4.2.3.5.5 Determinação do Tempo de Desintegração
O tempo de desintegração foi realizado de acordo com o método descrito na
USP 30 (2007), que prevê a avaliação de seis comprimidos. Os comprimidos foram,
então, colocados no aparelho de desintegração, empregando água como solvente, e
o tempo necessário para desintegração dos comprimidos foi determinado em
minutos com o auxílio de um cronômetro (USP 30, 2007).
4.2.3.6 Determinação do teor dos comprimidos
Para a determinação do teor de daidzeína e genisteína, 20 comprimidos
foram pesados e triturados. Em seguida o equivalente a um peso médio foi pesado e
transferido para um balão volumétrico de 100 mL, adicionado metanol e colocado em
ultrassom por 20 minutos. Após o tempo no ultrassom o volume foi completado com
metanol, a solução foi filtrada e uma alíquota de 100 µL foi colocada em vial com
900 µL de metanol. A quantificação foi feita por CLAE, conforme item 4.2.2.
4.2.4 Desenvolvimento da metodologia analítica para o método de dissolução
4.2.4.1 Ensaio de solubilidade
A solubilidade dos marcadores daidzeína e genisteína foi determinada em
diferentes meios com o intuito de avaliar o melhor meio para desenvolvimento da
27
dissolução. Os ensaios foram realizados em duplicata e os meios utilizados
apresentados na Tabela 3.
Tabela 3. Meios utilizados no ensaio de solubilidade.
Meios
Tensoativos
LSS
Tween
®
80
Tween
®
20
Água
-
-
-
0,5%
-
-
1,0%
-
-
1,5%
-
-
2,0%
-
-
3,0%
-
-
-
3,0%
-
-
-
3,0%
Tampão Acetato de Sódio pH 4,5
-
-
-
0,5%
-
-
HCl 0,1mol/L
-
-
-
0,5%
-
-
Foram pesados 50mg do extrato e transferidos para um frasco de vidro
âmbar. Em seguida, foram medidos 50mL de cada meio utilizado, aquecidos até
atingir a temperatura de 37°C e adicionados nos respectivos frascos. Os frascos
foram mantidos sob agitação orbital na temperatura de 37°C e agitação de
aproximadamente 150 rpm.
Na 1ª e na 24ª hora os frascos foram retirados da incubadora e coletadas
alíquotas de 2mL de cada frasco. Após a coleta da 1ª hora o volume retirado não foi
reposto, e os frascos foram recolocados na incubadora rapidamente. As alíquotas
coletadas foram colocadas em tubos falcon e centrifugadas a 3.000 rpm por 5
minutos. Os sobrenadantes foram filtrados em membrana de PVDF com 0,45 μm de
porosidade, diluídos em metanol, diretamente em vials, utilizando-se os volumes
100µL de amostra e 900 µL de metanol. A quantificação das amostras foi realizada
por CLAE.
4.2.4.2 Ensaio de dissolução
Para determinar as condições ideais de dissolução utilizou-se planejamento
fatorial fracionário 2
4-1
conforme Tabelas 4, 5 e 6, utilizando o melhor meio definido
no ensaio de solubilidade.
28
Tabela 4 – Fatores do método de dissolução.
Fatores
Níveis
Nível (+)
Nível (-)
1
Meio de Dissolução
Água + 3,0% LSS
Água + 1,5% LSS
2
Aparato
Pá
Cesta
3
Velocidade de Rotação
100rpm
75rpm
4
Volume de meio
1000mL
900mL
Tabela 5 – Planejamento fatorial fracionário 2
4-1
.
Planejamento Fatorial para Ensaio de Dissolução
Níveis
1
2
3
4
a
-
-
-
-
b
+
-
-
+
c
-
+
-
+
d
+
+
-
-
e
-
-
+
+
f
+
-
+
-
g
-
+
+
-
h
+
+
+
+
Tabela 6 – Condições avaliadas no planejamento fatorial
Ensaios
Condições
a
Água + 1,5% LSS/ Cesta/ 75rpm/ 900mL
b
Água + 3,0% LSS/ Cesta/ 75rpm/ 1000mL
c
Água + 1,5% LSS/ Pá/ 75rpm/ 1000mL
d
Água + 3,0% LSS/ Pá/ 75rpm/ 900mL
e
Água + 1,5% LSS/ Cesta/ 100rpm/ 1000mL
f
Água + 3,0% LSS/ Cesta/ 100rpm/ 900mL
g
Água + 1,5% LSS/ Pá/ 100rpm/ 900mL
h
Água + 3,0% LSS/ Pá/ 100rpm/ 1000mL
Todas as condições foram realizadas em triplicata na temperatura de 37°C.
Foram coletadas amostras de 3 mL nos tempos de 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120 e
150 minutos. Sendo que após 120 minutos a rotação foi aumentada para 150rpm,
para obter o ponto infinito, que pode fornecer dados de conteúdo uniformidade e
informações úteis sobre a formulação e características durante o desenvolvimento
inicial ou sobre o viés do método (USP 30, 2007). Garantindo manutenção da
condição sink do ensaio, optou-se pela não reposição do meio de dissolução após
as coletas.
29
As amostras coletadas foram filtradas em membrana de PVDF com 0,45 μm
de porosidade, diluídas em metanol, diretamente em vials, utilizando-se os volumes
800µL de amostra e 200 µL de metanol. A quantificação das amostras foi realizada
por CLAE conforme descrito no item 4.2.2.
Para a caracterização de formulações, testes de dissolução devem ser
executados em diferentes condições de teste até que a dissolução exceda 80% da
quantidade declarada (FIP, 1996).
30
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
Os resultados das contagens das unidades formadoras de colônia foram
apresentados na Tabela 7.
Tabela 7. Resultados da contagem de bactérias, fungos e leveduras.
Grupos
Contagem de Bactérias
Contagem de Fungos e
Leveduras
Placa 1
Placa 2
Média
Placa 1
Placa 2
Média
1º Grupo
(Extrato +
Inóculo)
E. coli
23
27
25
-
-
-
S. aureus
36
55
45,5
-
-
-
C. albicans
-
-
-
300
300
300
A. Niger
-
-
-
35
37
36
2º Grupo
(Diluente +
Inóculo)
E. coli
16
17
16,5
-
-
-
S. aureus
41
47
44
-
-
-
C. albicans
-
-
-
298
300
299
A. niger
-
-
-
33
26
29,5
3º Grupo
(Controle
Positivo)
E. coli
20
22
21
-
-
-
S. aureus
30
40
35
-
-
-
C. albicans
-
-
-
249
300
274,5
A. niger
-
-
-
32
37
34,5
Padronização
do inóculo
E. coli
22
24
23
-
-
-
S. aureus
30
28
29
-
-
-
C. albicans
-
-
-
242
260
251
A. niger
-
-
-
38
44
41
4º Grupo (Controle
Negativo)
0 UFC
0 UFC
5º Grupo (Extrato)
0 UFC
0 UFC
No 1º grupo, E. coli apresentou crescimento de 119,0% em relação ao
observado no controle positivo (grupo 3). S. aureus apresentou crescimento de
130,0% em relação ao observado no controle positivo (grupo 3). C. albicans
apresentou crescimento de 109,3% em relação ao observado no controle positivo
(grupo 3). A. niger apresentou crescimento de 104,3% em relação ao observado no
controle positivo (grupo 3). Demonstrando que o extrato não inativa os inóculos
31
utilizados, pois permite que eles cresçam na sua presença. Esse parâmetro é
importante pois se o extrato inativar o crescimento das bactérias e fungos o
resultado da análise microbiológica será alterado.
No 2º grupo, E. coli apresentou crescimento de 78,6% em relação ao
observado no controle positivo (grupo 3). S. aureus apresentou crescimento de
125,7% em relação ao observado no controle positivo (grupo 3). C. albicans
apresentou crescimento de 108,9% em relação ao observado no controle positivo
(grupo 3). A. niger apresentou crescimento de 85,5% em relação ao observado no
controle positivo (grupo 3). Demonstrando que o diluente utilizado não impede o
crescimento das bactérias e fungos.
No 3º grupo, E. coli apresentou crescimento de 91,3% em relação ao
observado no controle positivo (grupo 3). S. aureus apresentou crescimento de
120,7% em relação ao observado no controle positivo (grupo 3). C. albicans
apresentou crescimento de 109,4% em relação ao observado no controle positivo
(grupo 3). A. niger apresentou crescimento de 84,1% em relação ao observado no
controle positivo (grupo 3). Por ser o grupo de controle positivo as bactérias e fungos
cresceram adequadamente, não mostrando nenhuma alteração em relação aos
inóculos.
Os grupos 4 e 5 não apresentaram crescimento. O grupo 4 mostrou que os
meios e materiais utilizados não estavam contaminados, sendo o controle negativo.
E os resultados observados com o grupo 5 evidenciaram que o extrato não estava
contaminado, portanto adequado para ser utilizado no desenvolvimento das
formulações objeto deste estudo.
A análise microbiológica em matéria-prima vegetal é primordial, sendo
preconizada pela resolução RDC 48 (2004), pois a contaminação por
microorganismos pode trazer diversos prejuízos à saúde do consumidor. Portanto
apenas matérias-primas que não contenham contaminação microbiológica devem
ser utilizadas na produção de medicamentos.
32
5.2 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO POR
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) PARA
DETERMINAÇÃO DE GENISTEÍNA E DAIDZEÍNA.
Para padronizar o método cromatográfico diferentes condições analíticas
foram utilizadas conforme demonstrado no item 4.2.2.1. As diferentes condições
foram avaliadas quanto ao pH, tempo de retenção, resolução e simetria dos picos
para os analitos. Obteve-se como resultado número de pratos teóricos acima de
8000 para todas as análises, fator de simetria, segundo USP 30 (2007) de 1,15 e
1,12 para a genisteína e daidzeína respectivamente. Segundo Ribani e
colaboradores (2004) o numero mínimo de pratos teóricos para validação de
métodos por CLAE dever ser de 2000.
A especificidade e seletividade do método foram determinadas através de
análise comparativa entre os cromatogramas obtidos a partir da solução padrão dos
analitos, analisados separadamente e quando combinados na mesma solução. A
análise dos cromatogramas demonstrou a inexistência de qualquer interferente,
inclusive dos solventes e excipientes conforme demonstrado pela Figura 5 além de
demonstrar boa resolução do cromatograma, com completa separação dos picos
(Figura 6). Os tempos de retenção para a genisteína e daidzeína foram de 3,72 e
3,13 respectivamente.
33
Figura 5. Cromatograma do placebo. Coluna de fase reversa C18 150 x 4,6 mm x 5
µm, UV 254 nm, fase móvel: metanol com 0,1% de ácido acético, água com 0,1% de
ácido acético e acetonitrila na proporção 64:32:4, fluxo de 0,7 mL/min, temperatura
de 30ºC, e volume de injeção de 10 µL.
Figura 6. Cromatograma padrão de daidzeína e genisteína. Coluna de fase reversa
C18 150 x 4,6 mm x 5 µm, UV 254 nm, fase móvel: metanol com 0,1% de ácido
acético, água com 0,1% de ácido acético e acetonitrila na proporção 64:32:4, fluxo
de 0,7 mL/min, temperatura de 30ºC, e volume de injeção de 10 µL.
34
Das condições cromatográficas avaliadas a que apresentou melhor simetria
dos picos, menor tempo de retenção foi a que utilizou método isocrático, com fase
móvel constituída por metanol e água ambos acidificados com 0,1% de ácido
acético, e acetonitrila na proporção 64:32:4, fluxo de 0,7 mL/min, temperatura de
30ºC, e volume de injeção de 10 µL.
A linearidade foi determinada pelo coeficiente de correlação (R
2
), obtido a
partir da média das 3 curvas de calibração, conforme ilustrado nas Figuras 7 e 8. A
linearidade do método demonstrou proporcionalidade entre as diferentes
concentrações de padrão, as absorbâncias e as áreas dos picos. O coeficiente de
correlação com valores acima de 0,99 demonstra que as soluções apresentaram boa
correlação linear entre a absorbância e as concentrações, indicando que os
coeficientes de linearidade são adequados. Esta correlação foi verificada na faixa de
concentração de 1,5 µg/mL a 36,0 µg/mL, tendo sido utilizados nove valores para a
construção da curva conforme descrito na Tabela 9 para daidzeína e genisteína.
Figura 7. Curva de calibração da daidzeína (média de 3 determinações).
y = 0,0145x - 0,0481
R² = 0,9982
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Concentração teórica (µg/mL)
Área (mAU.s)
35
Figura 8. Curva de calibração da genisteína (média de 3 determinações).
Segundo a Resolução – RE nº 899 (2003), coeficientes de correlação da
curva próximos a 1 significam que o método apresenta linearidade. Assim, a
metodologia analítica desenvolvida demonstrou linearidade uma vez que apresentou
resultados diretamente proporcionais às concentrações de daidzeína e genisteína
presentes nas soluções com coeficiente de correlação igual a 0,9982 e 0,998
respectivamente. As equações da reta obtidas foram iguais a y = 2060,8x + 5,5963 e
y = 2026,9x + 4,9076 para a daidzeína e genisteína respectivamente.
5.2.1 Verificação da precisão e exatidão.
Os valores obtidos dos ensaios de precisão, precisão intermediaria,
repetibilidade e exatidão durante período de validação foram demonstrados nas
Tabelas 8, 9, 10 e 11. Todos os valores estão de acordo com os limites
recomendados pela Resolução – RE nº 899 (2003), que prevê que a precisão pode
ser expressa como desvio padrão ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação)
de uma serie de medidas não se admitindo valores superiores a 5% e que a
exatidão esteja entre 95 a 105%.
5.2.1.1 Daidzeína
O método cromatográfico também demonstrou precisão e exatidão para a
daidzeína dentro dos limites aceitáveis para os níveis analisados conforme
demonstrado nas Tabelas 8 e 9.
y = 0,0148x - 0,0341
R² = 0,998
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
0,0 1000,0 2000,0 3000,0
Concentração teórica (µg/mL)
Área (mAU.S)
36
Tabela 8. Precisão e Exatidão obtidas para a daidzeína obtidas utilizando método cromatográfico descrito no item 5.2.
Tabela 9. Precisão Intermediaria e Exatidão obtidas para a daidzeína utilizando método cromatográfico descrito no item 5.2.
5.2.1.2 Genisteína
O método cromatográfico demonstrou precisão e exatidão para a genisteína dentro dos limites aceitáveis para os níveis
analisados conforme demonstrado nas Tabelas 10 e 11.
Concentração
Teórica
(µg/mL)
Área do pico
(mAU.min)
Média
DP
DPR
Concentração
calculada
(µg/mL)
Média
DP
DPR
Exatidão
(%)
1,5
1,20
1,20
1,30
1,23
0,06
4,68
1,54
1,50
1,57
1,54
0,03
1,87
102,44
15
17,2
17,2
17,2
17,20
0,00
0,00
14,59
14,65
14,57
14,603
0,034
0,233
97,4
30
36,2
35,8
35,9
35,97
0,21
0,58
30,12
29,81
29,93
29,953
0,128
0,426
99,8
Concentração
Teórica
(µg/mL)
Área do pico
(mAU.min)
Média
DP
DPR
Concentração
calculada
(µg/mL)
Média
DP
DPR
Exatidão
(%)
1,5
1,6
1,6
1,6
1,60
0,00
0,00
1,49
1,53
1,50
1,51
0,02
1,13
100,44
15
16,3
16,5
16,9
16,57
0,31
1,84
14,37
14,51
14,88
14,59
0,22
1,47
97,24
30
33,5
33,4
33
33,30
0,26
0,79
29,38
29,33
28,95
29,22
0,19
0,66
97,40
37
Tabela 10. Precisão e exatidão obtidas para a genisteína utilizando método cromatográfico descrito no item 5.2.
Tabela 11. Precisão intermediaria e exatidão obtidas para a genisteína utilizando método cromatográfico descrito no item 5.2.
Concentração
Teórica
(µg/mL)
Área do pico
(mAU.min)
Média
DP
DPR
Concentração
calculada
(µg/mL)
Média
DP
DPR
Exatidão
(%)
1,5
1,1
1,1
1,1
1,1
0
0
1,49
1,47
1,49
1,48
0,01
0,64
98,89
15
16,4
16,40
16,40
16,40
0,00
0,00
14,44
14,48
14,46
14,46
0,02
0,11
96,40
30
34,3
34,10
34,10
34,17
0,12
0,34
29,71
29,51
29,51
29,58
0,09
0,32
98,59
Concentração
Teórica
(µg/mL)
Área do pico
(mAU.min)
Média
DP
DPR
Concentração
calculada
(µg/mL)
Média
DP
DPR
Exatidão
(%)
1,5
1,60
1,60
1,60
1,60
0,00
0,00
1,46
1,52
1,50
1,49
0,02
1,67
99,56
15
16,10
16,20
16,50
16,27
0,21
1,28
14,36
14,51
14,81
14,56
0,19
1,28
97,07
30
33,00
32,70
32,30
32,67
0,35
1,08
29,47
29,16
28,89
29,17
0,24
0,81
97,24
38
5.2.3 Verificação dos limites de quantificação e detecção para daidzeína e
genisteína
O limite de quantificação foi estabelecido por meio da análise de
concentrações decrescentes dos marcadores até o menor nível quantificável e
detectável com precisão e exatidão aceitáveis. O limite de quantificação deve ser no
mínimo cinco vezes superior a qualquer interferente da amostra branco no tempo de
retenção do fármaco e o pico de resposta do fármaco deve ser identificável e
reprodutível com desvio de precisão ate 5% e exatidão de 95 a 105% (BRASIL,
2003).
O limite de detecção também foi estabelecido por meio da análise de
concentrações decrescentes do fármaco, até menor nível detectável correspondente
a 3 vezes o ruído da linha de base.
5.2.3.1 Limites de Quantificação e Detecção para a daidzeína e genisteína
A menor concentração dos analitos, determinadas quantitativamente, cujo
pico de resposta foi reprodutível e identificável com precisão demonstrado por DPR
menor ou igual 5% e exatidão entre 95 - 105%, para daidzeína e genisteína foi de
80ng/mL (Tabelas 12 e 13).
Tabela 12. Limite de quantificação e detecção obtidos para daidzeína utilizando
método cromatográfico descrito no item 5.2.
Concentração Teórica
(g/mL)
Média (g/mL)
n=6
DP
DPR
EXATIDÃO
(%)
0,07
0,07
0,02
20,00
107,14
0,08 (LQ e LD)
0,08
0,00
4,92
104,9
39
Tabela 13. Limite de quantificação e detecção obtidos para genisteína utilizando método
cromatográfico descrito no item 5.2.
5.3 ESTUDO DE PRÉ-FORMULAÇÃO
5.3.1 Análise térmica
A Figura 9 apresenta as curvas obtidas no DSC do extrato utilizado na
manipulação dos comprimidos, sobreposta com as curvas dos padrões daidzeína e
genisteína. Observa-se que o ponto de fusão da daidzeína ocorre em 335,5ºC e que
o ponto de fusão da genisteína ocorre em 303ºC (Figura 9).
Figura 9. Curvas de DSC do extrato seco de soja, padrões daidzeína e genisteína.
Velocidade de aquecimento de 10ºC/min, faixa de aquecimento entre 25ºC e 500ºC,
fluxo do gás de purga, nitrogênio, sob fluxo de 50mL/min.
Concentração Teórica
(g/mL)
Média (g/mL)
n=6
DP
DPR
EXATIDÃO
(%)
0,07
0,06
0,00
7,69
92,86
0,08 (LQ e LD)
0,08
0,00
4,63
104,8
40
A sobreposição das curvas dos padrões de daidzeína e genisteína à curva da
matéria-prima demonstra que os referidos picos de fusão dos padrões não se
repetem na curva DSC do extrato, pelo menos não de forma evidente.
Possivelmente pela baixa proporção desses marcadores no extrato em comparação
com os padrões analisados. Além disso, a presença de impurezas no extrato
favorece o aparecimento de picos irregulares na curva de DSC, visto que extrato
vegetal possui vários constituintes (Figura 9).
A Figura 10 mostra as curvas obtidas no DSC e no TG do extrato utilizadao
na manipulação dos comprimidos. Nas curvas não foi possível observar eventos
bem definidos, característicos de fusão, provavelmente por se tratar de análise do
extrato seco, que contém mistura de diferentes componentes e devido à proporção
em massa, já discutido anteriormente. Na curva DSC próximo à temperatura de
100ºC é possível observar uma endoterma, que coincide com a perda de massa de
3,3% na mesma região na curva TG. Sendo essa perda referente à água (umidade
do extrato), visto que quando realizada a análise de umidade residual por balança de
infravermelho (item 5.3.3.1) foi verificado uma umidade de 4,4%. Acredita-se que
esta diferença encontrada nas duas análises se dê devido ao fato de que a análise
de perda de água através das curvas de TG seja mais precisa do que aquela
realizada por umidade residual em balança. Entretanto, foi possível verificar a perda
de água existente na amostra. A degradação do extrato inicia em 200ºC, sendo que,
entre 200 e 300ºC a massa do extrato diminui quase 17% (Figura 10).
41
Figura 10. Curvas de DSC e TG do extrato seco de soja. Velocidade de
aquecimento de 10ºC/min, faixa de aquecimento entre 25ºC e 500ºC, fluxo do gás de
purga, nitrogênio, sob fluxo de 50mL/min.
Através de análises em DSC da mistura física na proporção de 1:1 entre o
fármaco e os excipientes de interesse, é possível estimar a compatibilidade entre os
componentes da formulação para que as possíveis interações fiquem mais
evidenciadas (MURA et al., 1998). Assim, para analisar a compatibilidade entre os
excipientes utilizados nas formulações (Tabela 1) e a isoflavona foram avaliadas as
sobreposições das curvas extrato, excipiente isolado e mistura binária. Isso foi
possível através da sobreposição das curvas DSC do excipiente isolado e em
mistura com o extrato.
Dessa forma, estão relacionadas a seguir algumas das curvas das misturas
do extrato com excipientes de interesse. Conforme indicado na legenda de cada
figura, o tracejado pequeno corresponde à curva do excipiente, o tracejado maior
corresponde ao extrato seco de soja (isoflavona), e a linha contínua se refere à
mistura física de ambos. Como nas curvas DSC das misturas à proporção de
excipiente equivale a 50%, espera-se que a intensidade do seu pico de fusão seja
reduzida pela metade.
42
A Figura 11 apresenta a curva DSC da mistura da isoflavona com o amido de
milho. Como é possível perceber, existe uma endoterma de fusão próxima dos
100°C nas curvas do excipiente e da mistura física, indicando perda de água. Não
havendo indício de interação entre o extrato e o amido de milho.
Figura 11. Curvas DSC do extrato, amido de milho e mistura binária. Velocidade de
aquecimento de 10ºC/min, faixa de aquecimento entre 25ºC e 500ºC, fluxo do gás de
purga, nitrogênio, sob fluxo de 50mL/min.
Através da análise da Figura 12 pode-se sugerir ausência de interação entre a
isoflavona e o dióxido de silício, uma vez que a curva DSC da mistura física, em
linha contínua, não apresenta nenhum evento térmico detectado nas curvas do
fármaco ou do excipiente sozinhos.
43
Figura 12. Curvas DSC do extrato, dióxido de silício sozinho e mistura binária.
Velocidade de aquecimento de 10ºC/min, faixa de aquecimento entre 25ºC e 500ºC,
fluxo do gás de purga, nitrogênio, sob fluxo de 50mL/min.
O estearato de magnésio apresenta duas moléculas de água de hidratação
(aproximadamente 5.5% do seu peso). O processo de desidratação ocorre a partir
dos 70°C. Além disso, há um pico de fusão em torno de 120°C, que às vezes
aparece em temperaturas menores ou mesmo se sobrepõe aos eventos de
desidratação (CUNHA-FILHO et al., 2007). Eventos endotérmicos discretos mostram
essa característica de desidratação do estearato de magnésio na Figura 13.
44
Figura 13. Curvas DSC do extrato, estearato de magnésio e mistura binária.
Velocidade de aquecimento de 10ºC/min, faixa de aquecimento entre 25ºC e 500ºC,
fluxo do gás de purga, nitrogênio, sob fluxo de 50mL/min.
O perfil DSC do fosfato dicálcico dihidratado (Figura 14) é associado à perda
de água de hidratação desse material e à formação de fosfato dicálcico anidro. O
processo de desidratação ocorre em duas etapas em 150,8°C e 191,1°C segundo
Cunha-Filho e colaboradores (2007). Observando a curva DSC do excipiente fosfato
dicálcico dihidratado e da sua mistura física com a isoflavona, esse comportamento
se repete. Ou seja, não existe evidência de interação da isoflavona com esse
excipiente.
45
Figura 14. Curvas DSC do extrato, fosfato dicálcico dihidratado e mistura binária.
Velocidade de aquecimento de 10ºC/min, faixa de aquecimento entre 25ºC e 500ºC,
fluxo do gás de purga, nitrogênio, sob fluxo de 50mL/min.
Figura 15. Curvas DSC do extrato, lauril sulfato de sódio e mistura binária.
Velocidade de aquecimento de 10ºC/min, faixa de aquecimento entre 25ºC e 500ºC,
fluxo do gás de purga, nitrogênio, sob fluxo de 50mL/min.
46
O lauril sulfato de sódio (Figura 15) apresenta um pico endotérmico,
possivelmente de fusão, um pouco antes de 190°C. Esse pico também aparece na
curva DSC da mistura física, apesar de estar um pouco deslocado e diminuído. O
pico exotérmico detectado em 218°C não foi observado tanto na curva DSC desse
excipiente quanto na curva DSC do extrato, e pode ser indicativo de interação entre
o lauril e o extrato.
Por isso foi feita a análise em TG do excipiente lauril sulfato de sódio (Figura
16) para verificar o seu perfil de degradação de massa, e a possível interação com o
extrato.
Figura 16. Curva DSC da mistura binária extrato e lauril sulfato de sódio e curva TG
do lauril sulfato de sódio. Velocidade de aquecimento de 10ºC/min, faixa de
aquecimento entre 25ºC e 500ºC, fluxo do gás de purga, nitrogênio, sob fluxo de
50mL/min.
A Figura 16 mostra que antes desse evento exotérmico verificado na curva
DSC da mistura binária o lauril sulfato de sódio já havia perdido 22,9% de sua massa
inicial. Ou seja, a partir desse ponto o excipiente já iniciou sua degradação, não
sendo possível avaliar uma possível interação visto que a característica do
excipiente já está alterada.
47
5.3.2 Teor de daidzeína e genisteína no extrato seco de soja
O teor de daidzeína e genisteína encontrado no extrato pelas duas formas
analisadas foi apresentado na Tabela 14 em porcentagem de cada marcador.
Tabela 14. Teor de daidzeína e genisteína no extrato seco de soja.
Não hidrolisada
(n=3)
Hidrolisada
(n=3)
Daidzeína
27,8% ± 1,2
27,5% ± 0,2
Genisteína
11,1% ± 0,7
11,0% ± 0,1
A hidrólise ácida das isoflavonas promove a conversão de glicosídeos em
agliconas através da retirada do açúcar por meio de aquecimento da amostra em
meio ácido (CÉSAR et al., 2006; CAMPOS et al., 2007; ROSTAGNO et al., 2009).
Segundo Rostagno e colaboradores (2009) a vantagem da hidrólise ácida é
simplificar a análise, reduzindo o número de derivados, o tempo de corrida, e a
possibilidade do uso de método isocrático quando analisado por CLAE. Campos e
colaboradores (2007) relatam que a análise das formas agliconas totais,
principalmente daidzeína e genisteína, é fundamental por serem as principais formas
relacionadas à terapêutica, e pelo fato dos glicosídeos sofrerem hidrólise no
organismo para depois serem absorvidos na forma de aglicona. Portanto a
quantificação de agliconas é muito importante, visto que a quantidade de isoflavonas
é muito variável nos extratos e comprimidos.
César e colaboradores (2006) avaliaram a eficiência da hidrólise pelo
aumento nas concentrações de aglicona, com conseqüente redução da área dos
picos referentes aos glicosídeos. E relataram que a melhor condição de hidrólise
testada foi a que utilizou ácido clorídrico etanólico 3 mol/L, em banho-maria fervente,
por 40 minutos (César et al., 2006).
Segundo Genovese e Lajolo (2001), para que haja hidrólise total das
isoflavonas é necessário um refluxo de pelo menos 2 horas com HCl 2 mol/L em
banho de água fervente, porém em tais condições as isoflavonas sofrem
48
degradação, concluindo-se que a determinação de isoflavonas na forma
originalmente presente, sem hidrólise, é mais adequada. Rostagno, Palma e Barroso
(2005) relatam que acima de 40ºC as isoflavonas começam a sofrer degradação,
principalmente a daidzeína.
A hidrólise foi realizada conforme descrito por César e colaboradores (2006)
como a melhor condição para a hidrólise. Porém, como demonstrado na Tabela 14,
o teor dos marcadores não teve alteração significativa entre os dois métodos
analisados. Este fato pode ser explicado pela possível degradação de isoflavonas,
ou por conter uma quantidade muito pequena de glicosídeos. Segundo laudo do
fabricante do extrato utilizado, os glicosídeos representam cerca de 1%.
Como houve pequena diferença entre os métodos avaliados, o método direto
(sem hidrólise) foi escolhido como forma de análise, por apresentar menores custos
e menor tempo de análise.
Levando-se em consideração a análise do teor do extrato pelo método direto
foram encontrados 27,8% e 11,1% de daidzeína e genisteína, respectivamente.
Portanto estas foram as porcentagens utilizadas em todos os cálculos que
envolveram a utilização do extrato ao longo do desenvolvimento do trabalho para
caracterizar a quantidade de cada marcador.
5.3.3 Formulações de comprimidos
5.3.3.1 Análise dos pós e granulados
O extrato seco de soja, a mistura de pós da formulação CD1 (compressão
direta) e os granulados das formulações GU1, GU2, GU3, GU4 e GU5 foram
analisados quanto à velocidade de escoamento, ao ângulo de repouso, à
compressibilidade, ao índice de Hausner e à umidade residual conforme
demonstrado na Tabela 15.
49
Tabela 15. Resultados das análises dos pós e granulados.
Velocidade de
escoamento
(100g)
Ângulo de
repouso
Compressibilidade
Índice de
Hausner
Umidade
residual
(%)
Extrato seco de
soja
Não apresentou
fluxo
-
42,86
1,75
4,4 ± 0,2
Formulação
GU1
6,0 s ± 1,0s
30,0º ±
1,3º
25,37
1,34
3,7 ± 0,1
Formulação
GU2
6,7 s ± 0,9s
34,1º±
1,8º
26,06
1,35
2,7 ± 0,2
Formulação
GU3
4,8 s ± 0,8s
28,4º±
0,5º
18,68
1,23
4,6 ± 0,1
Formulação
GU4
4,8 s ± 1,1s
28,3º±
1,2º
22,45
1,29
5,0 ± 0,1
Formulação
GU5
4,5 s ± 0,5s
27,6º±
0,9º
16,85
1,20
4,9 ± 0,2
Formulação
CD1
50,6 s ± 2,8s
39,2º ±
1,1º
40,00
1,66
2,3 ± 0,3
Valores de referência: Ângulo de repouso 25 a 30º – fluxo excelente, 31 a 35º – fluxo
bom, 36 a 40º – fluxo razoável, 41 a 45º – fluxo tolerável, 46 a 55º – fluxo pobre, 56
a 65º – fluxo muito pobre, > 66º – fluxo muito, muito pobre (USP 30, 2007).
Compressibilidade de 5 a 15 – fluxo excelente, 12 a 16 – fluxo bom, 18 a 21 – fluxo
favorável, 23 a 35 – fluxo fraco, 33 a 38 – fluxo muito fraco, > 40 – fluxo
extremamente fraco (USP 30, 2007). Índice de Hausner 1,00 a 1,11 – fluxo
excelente, 1,12 a 1,18 – fluxo bom, 1,19 a 1,25 – fluxo razoável, 1,26 a 1,34 – fluxo
tolerável, 1,45 a 1,45 – fluxo pobre, 1,46 a 1,59 – fluxo muito pobre, > 1,60 – fluxo
muito, muito pobre (USP 30, 2007).
Segundo Emshanova (2008), para que o método de compressão direta possa
ser utilizado, o fármaco deve apresentar boas propriedades de fluxo. Portanto, de
acordo com os resultados observados na Tabela 15 foi possível verificar que o
método de compressão direta não foi adequado para a isoflavona, visto que ela não
50
apresentou fluxo contínuo. O resultado foi confirmado através da análise da
formulação CD1, pois apresentou um tempo de escoamento muito superior ao
apresentado pelas formulações obtidas por via úmida, além de um maior ângulo de
repouso, altos índices de compressibilidade e de Hausner (WELLS, 2005).
As formulações obtidas por via úmida apresentaram melhor fluxo. O resultado
já era esperado, visto que tal processo promove a melhora do fluxo (EMSHANOVA,
2008). A formulação GU2 proporcionou a formação de um ângulo de 34,1º, que
segundo a USP 30 (2007), corresponde a uma boa capacidade de fluxo. Enquanto
as formulações GU1, GU3, GU4 e GU5 proporcionaram a formação de ângulos
situados entre 25 e 30º, correspondendo a um fluxo excelente. Após a análise de
todas as formulações foi verificado que a formulação GU5 apresentou as melhores
propriedades de fluxo, pois resultou na melhor velocidade de escoamento, ângulo de
repouso, compressibilidade e índice de Hausner.
De acordo com Wu e colaboradores (2007), a granulometria pode ser
avaliada através da utilização de jogos de tamises colocados em seqüência,
contendo tamanhos de malhas variados e em ordem decrescente de tamanho.
Sendo assim, a distribuição do tamanho das partículas (perfil granulométrico) do
extrato seco de soja e das formulações de GU1 a GU5 e CD1 foi analisada através
da porcentagem de partículas retidas em cada malha utilizada, como ilustrado na
Tabela 16 e na Figura 17.
Tabela 16. Granulometria dos pós e granulados.
Material avaliado
Malhas (% de partículas retidas em cada malha)
1,4 mm
1,0 mm
0,5 mm
0,250 mm
0,125 mm
Coletor
Extrato seco de
soja
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
3,38%
96,62%
Formulação GU1
0,0%
10,67%
17,98%
25,87%
23,44%
22,04%
Formulação GU2
0,0%
4,90%
11,05%
15,40%
45,70%
22,95%
Formulação GU3
0,0%
16,80%
35,18%
28,60%
14,28%
5,15%
Formulação GU4
0,0%
2,63%
22,85%
31,53%
32,58%
10,43%
Formulação GU5
0,0%
18,05%
36,15%
31,13%
10,15%
4,53%
Formulação CD1
0,0%
0,0%
0,0%
2,90%
59,50%
37,60%
51
Figura 17. Distribuição de tamanho das partículas das formulações estudadas.
Foi observado que o extrato seco de soja possui grande quantidade de
partículas finas, pois 96,62% das partículas passaram por todos os tamises. Essa
quantidade de pó fino prejudica muito o fluxo, pois são mais coesivas
(STANIFORTH, 2005). A formulação CD1, que foi levada à compressão direta sem
granulação prévia, conseqüentemente também demonstrou ter grande quantidade
de partículas finas com 59,5% retidas na malha 0,125 mm. Enquanto que a
formulação GU5, preparada por granulação úmida, apresentou distribuição do
tamanho das partículas mais dispersa, com apenas 4,53% de pó fino, o que contribui
para um bom fluxo (EMSHANOVA, 2008).
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
1,0 mm
0,5 mm
0,250 mm
0,125 mm
<
0,125mm
Malhas
Formulação CD1
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
1,0 mm
0,5 mm
0,250 mm
0,125 mm
<
0,125mm
Malhas
Formulação GU1
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
1,0 mm
0,5 mm
0,250 mm
0,125 mm
<
0,125mm
Malhas
Formulação GU2
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
40,00%
1,0 mm
0,5 mm
0,250 mm
0,125 mm
<
0,125mm
Malhas
Formulação GU3
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
1,0 mm
0,5 mm
0,250 mm
0,125 mm
<
0,125mm
Malhas
Formulação GU4
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
40,00%
1,0 mm
0,5 mm
0,250 mm
0,125 mm
<
0,125mm
Malhas
Formulação GU5
52
Essa diferença no tamanho das partículas pode ser observada na Figura 18.
Observa-se que o extrato e a mistura seca são constituídos por pós muito finos, e o
granulado é um aglomerado de partículas maiores com superfície porosa. Segundo
Wu e colaboradores (2007) a porosidade do grânulo pode auxiliar na dissolução.
Figura 18: Fotomicrografias de pós e granulados estudados: (A) extrato seco de
soja, (B) granulado da formulação GU5, (C) mistura de pós da formulação CD1.
53
5.3.3.2 Análise dos parâmetros físicos dos comprimidos
Os parâmetros físicos dos comprimidos obtidos nas formulações GU1, GU2,
GU3, GU4, GU5 e CD1 foram avaliados quanto peso médio, dureza, espessura,
desintegração e friabilidade (Tabela 17).
Tabela 17. Resultados de peso médio, dureza, espessura, desintegração e
friabilidade.
Formulação
Peso médio
(n=20)
Dureza
(n=20)
Espessura
(n=20)
Desintegração
(n=06)
Friabilidade
(n=20)
GU1
288,5 mg ± 3,6
9,3 kgf ± 1,2
4,70 mm ± 0,03
20 min
0,0%
GU2
306,8 mg ± 2,3
8,2 kgf ± 2,1
5,10 mm ± 0,06
23 min
0,0%
GU3
301,5 mg ± 3,7
9,4 kgf ± 1,5
4,65 mm ± 0,02
15min
0,0%
GU4
298,7 mg ± 4,6
10,1 kgf ± 1,6
4,59 mm ± 0,02
23 min
0,0%
GU5
301,4 mg ± 3,3
9,2 kgf ± 0,8
4,67 mm ± 0,07
24 min
0,0%
CD1
314,9 mg ± 15,7
9,1 kgf ± 5,2
5,02 mm ± 0,23
16 min
0,5%
Durante a compressão da formulação CD1 houve grande variação de peso e
dureza devido ao fluxo pobre desta formulação. O fluxo é fundamental para garantir
parâmetros ideais e uniformes durante o processo de compressão (STANIFORTH,
2005; SCHNEIDER; SINKA; COCKS, 2007). Segundo Emshanova (2008)
formulações por compressão direta possuem partículas menores, tendo maior
superfície de contato e favorecendo assim a desintegração.
As formulações GU1, GU2, GU4 e GU5 proporcionaram bons resultados em
relação a peso médio, dureza, espessura e friabilidade. No entanto, os tempos de
desintegração não foram satisfatórios (maiores que 20 minutos), pois a USP 30
(2007) descreve que o tempo de desintegração para comprimidos fitoterápicos deve
ser de até 20 minutos. Já a formulação GU3 proporcionou bons resultados em todos
os parâmetros avaliados. A desintegração mais rápida foi obtida pelo uso do
desintegrante croscarmelose sódica e do tensoativo lauril sulfato de sódio. Villanova
e Sá (2009) relatam que o uso de tensoativo na formulação reduz a tensão
superficial, melhorando a molhabilidade do fármaco e aumentando a sua
solubilidade, ou seja, auxiliam na redução do tempo de desintegração dos
54
comprimidos. E relatam, também, que o uso de desintegrantes facilita a
desagregação dos grânulos em partículas menores, quando em contato com a água,
aumentando a superfície exposta ao meio e acelerando a dissolução (VILLANOVA e
SÁ, 2009). O uso de dois por cento do LSS na formulação foi fundamental para
melhorar a desintegração e dissolução do comprimido.
A Tabela 18 mostra o teor de daidzeína e genisteína encontrado nos
comprimidos das formulações GU1 a GU5 e CD1, sendo representado em
porcentagem em relação ao valor encontrado no extrato.
Tabela 18. Teor de daidzeína e genisteína nas formulações GU1 a GU5 e CD1.
Formulação
Daidzeína (%)
Genisteína (%)
GU1
88,92 ± 1,37
74,62 ± 1,06
GU2
88,92 ± 0,88
95,36 ± 0,47
GU3
92,66 ± 3,21
92,76 ± 3,16
GU4
91,52 ± 0,38
91,33 ± 0,46
GU5
97,55 ± 2,44
97,01 ± 2,28
CD1
91,53 ± 3,43
95,36 ± 0,69
Segundo a USP 30 (2007) o teor de comprimidos deve estar entre 90 e 110%,
portanto apenas as formulações CD1, GU3, GU4 e GU5 cumprem este parâmetro.
As formulações GU1 e GU2 apresentaram teores abaixo dos valores especificados.
Foi observado que a troca do metabissulfito de sódio por butilhidroxitolueno,
aparentemente, contribuiu para aumentar o teor de genisteína, pois foi a única
alteração entre as fórmulas GU1 e GU2, sendo que não foram alterados os demais
excipientes e suas concentrações. Huang e colaboradores (2008) relatam que a
genisteína é mais sensível à oxidação, e provavelmente por isso ela tenha sofrido
alteração de teor quando alterado o antioxidante. Devido a esse aumento do teor de
genisteína, em todas as formulações posteriores foi utilizado o butilhidroxitolueno
como antioxidante. Nas formulações GU3, GU4 e GU5 o amido foi retirado e a
concentração de celulose microcristalina PH-102 foi aumentada, para obter a dureza
necessária sem que houvesse a necessidade da máquina compressora trabalhar de
forma forçada para obter a dureza necessária. Com a troca de excipientes a
55
máquina passou a trabalhar de forma mais suave, sendo este um parâmetro
importante a ser a avaliado para aumentar a vida útil do equipamento.
O revestimento de todas as formulações foi semelhante, a única diferença foi
o corante utilizado, visando mascarar o aspecto original do comprimido. A aparência
do comprimido é um fator que influencia na adesão ao tratamento, pois a aparência
agradável da forma farmacêutica promove melhor aceitação pelo paciente
(ALDERBORN, 2005). Como os comprimidos de isoflavona desenvolvidos neste
trabalho são para mulheres que se encontram no período da menopausa foi
escolhido o corante vermelho ponceau para o revestimento, que na concentração de
0,05% na suspensão de revestimento, proporcionou comprimidos na cor rosa (Figura
19).
Figura 19. Comprimidos de isoflavona obtidos pela formulação GU3.
5.4 DESENVOLVIMENTO DA METODOLOGIA ANALÍTICA PARA MÉTODO DE
DISSOLUÇÃO
5.4.1 Ensaio de solubilidade
As Tabelas 19 e 20 mostram as porcentagens de daidzeína e genisteína
dissolvidas, respectivamente, em diferentes meios de dissolução. Observa-se que os
meios água com lauril sulfato de sódio dissolvem maior porcentagem de daidzeína e
genisteína. Os tensoativos são bastante empregados para modificar o meio de
dissolução permitindo solubilizar fármacos de baixa solubilidade, como observado no
caso da daidzeína e da genisteína (MANIASSO, 2001). Observa-se que a genisteína
possui maior quantidade dissolvida nos meios aquosos, quando comparada com a
56
daidzeína. Tal fenômeno pode ser explicado devido a genisteína apresentar em sua
estrutura molecular uma hidroxila a mais do que a daidzeína, tornando-a mais polar
(Figura 2).
Durante a realização dos ensaios de solubilidade observou-se que no tempo
de 24 horas o meio HCl 0,1 mol/L com 0,5% de lauril sulfato de sódio ocorreu
alteração de cor, passando de amarelo, como os demais, para rosa (Figura 20).
Segundo Genovese e Lajolo (2001), as isoflavonas, principalmente a genisteína,
sofrem degradação quando colocadas em refluxo por 2 horas com HCl 2 mol/L em
banho de água fervente. Como o extrato ficou em HCl por 24 horas, provavelmente a
alteração de cor se deu pela degradação das isoflavonas.
Tabela 19. Porcentagens de daidzeína dissolvida em diferentes meios de
dissolução.
Meios de dissolução
1 hora
24 horas
% dissolvida
% dissolvida
Água deionizada
2,30 ± 0,05
3,22 ± 0,05
HCl 0,1 mol/L
2,28 ± 0,13
2,49 ± 0,03
Tampão acetato de sódio pH 4,5
2,25 ± 0,03
2,49 ± 0,03
Água + 0,5% de LSS
5,81 ± 0,03
6,97 ± 0,21
HCL 0,1 mol/L + 0,5% de LSS
3,90 ± 0,08
4,53 ± 0,11
Tampão acetato de sódio pH 4,5
+ 0,5% de LSS
5,22 ± 0,20
6,05 ± 0,03
Água + 3,0% de LSS
17,30 ± 2,65
25,03 ± 0,64
Água + 3,0% de Tween 80
14,17 ± 0,76
20,63 ± 0,24
Água + 3,0% de Tween 20
12,27 ± 1,93
16,04 ± 0,58
Água + 1,0% de LSS
8,47 ± 0,08
11,99 ± 0,53
Água + 1,5% de LSS
11,44 ± 0,00
15,53 ± 0,45
57
Tabela 20. Porcentagens de genisteína dissolvida em diferentes meios de
dissolução
Meios de dissolução
1 hora
24 horas
% dissolvida
% dissolvida
Água deionizada
6,31 ± 0,13
9,53 ± 0,20
HCl 0,1mol/L
6,22 ± 0,00
7,46 ± 0,07
Tampão acetato de sódio pH 4,5
6,22 ± 0,00
7,65 ± 0,46
Água + 0,5% de LSS
24,73 ± 0,83
44,11 ± 1,19
HCL 0,1 mol/L + 0,5% de LSS
11,67 ± 0,96
19,66 ± 1,00
Tampão acetato de sódio pH 4,5
+ 0,5% de LSS
15,81 ± 2,87
34,21 ± 0,33
Água + 3,0% de LSS
38,15 ± 7,20
82,54 ± 2,72
Água + 3,0% de Tween 80
30,99 ± 4,84
76,06 ± 7,37
Água + 3,0% de Tween 20
30,05 ± 10,77
65,93 ± 2,59
Água + 1,0% de LSS
30,68 ± 4,40
75,97 ± 4,98
Água + 1,5% de LSS
31,44 ± 0,13
78,69 ± 0,86
58
Figura 20. Comparação de cor entre os meios água com 0,5% de LSS (lado
esquerdo) e HCl 0,1 mol/L (lado direito) ao final de 24h.
Daruházi e colaboradores (2008) relatam que as isoflavonas possuem baixa
solubilidade em água, sendo necessário o uso de adjuvantes para melhorar a
solubilidade delas em meio aquoso. Dwiecki e colaboradores (2009) relatam que,
além da baixa solubilidade da daidzeína em água, ela é degradada em meio aquoso
com o passar do tempo. Portanto, a pequena porcentagem de daidzeína dissolvida
após o período de 24 horas pode ter sido influenciada pela sua instabilidade em
meio aquoso com conseqüente processo de degradação, fato este que deverá ser
confirmado, posteriormente, por ensaio de estabilidade do ativo em solução.
Após a análise dos resultados foi possível verificar que houve uma baixa
porcentagem de daidzeína dissolvida em todos os meios utilizados, visto que todos
os meios são compostos por veículos aquosos. No entanto, pode-se perceber que
mesmo tendo dissolvido uma pequena porcentagem ao final do ensaio, o meio
contendo água e 3,0% de lauril sulfato de sódio apresentou um maior percentual de
dissolução quando comparado com os demais.
Levando em consideração todas essas variações, foram escolhidos para o
desenvolvimento do método de dissolução os meios água com 3% de LSS e com
1,5% de LSS, para verificar a influência da quantidade de LSS durante o ensaio de
59
dissolução, pois os meios água com LSS foram os que apresentaram maior
porcentagem de daidzeína e genisteína dissolvidas.
5.4.2 Planejamento fatorial
Os dados gerados pelo planejamento fatorial foram analisados com o auxílio
do programa GNU Octave versão 3.2.2 (2009). Foram analisados os dados obtidos
das coletas nos tempos 60 e 90 minutos.
5.4.2.1 Daidzeína
5.4.2.1.1 Coleta no tempo 60 minutos.
A análise de variância resultou os dados demonstrados na Tabela 21, onde
SQ representa a soma dos quadrados, GL o grau de liberdade, MQ a média dos
quadrados, F o teste de hipóteses e P a significância estatística.
Tabela 21. Análise de variância Daidzeína 60 minutos.
Fonte de
Variação
SQ
GL
MQ
F
P
R²=
98,59%
Regressão
Entre
5201,5844
7
743,0835
159,5262
1,36397E-13
V=
4,66
Resíduo
Dentro
74,5291
16
4,6581
0,0000
DP=
2,16
Total
Total
5276,1134
23
A significância estatística revelou um p<0,001, demonstrando que os dados
apresentam um alto grau de confiabilidade. O coeficiente de determinação (R
2
) foi
próximo de 1 revelando um boa correlação entre as variáveis, e o desvio padrão foi
± 2,16.
A regressão linear resultou a seguinte equação:
y = 58,5 + 7,5*%LSS + 3,59*Ap. + 2,62*rpm + 1,49*%LSS*Ap. - 1,73*%LSS*vol
(Equação 4)
A equação 4 demonstra que os fatores LSS, aparato e velocidade de rotação
apresentam efeito primário positivo, tendo os níveis (+) uma maior resposta em
concentração de daidzeína no tempo de 60 minutos. Logo, as condições ideais
devem respectivamente ser: água + 3%LSS, pá 100 rpm . O fator volume não
apresentou efeito primário estatisticamente significativo, no entanto o seu efeito
sinérgico com o fator meio de dissolução foi menor que zero, revelando um melhor
60
desempenho quando utilizado o volume de 900 mL. Na Figura 21 pode-se observar
tanto o efeito primário positivo do meio de dissolução, como o efeito sinérgico do
volume com o meio de dissolução. Na Figura 22 pode-se observar os efeitos
primários positivos do aparato e da velocidade de rotação.
Figura 21. Superfície de resposta referente à influência das variáveis ―concentração
de lauril sulfato de sódio‖ e ―volume do meio‖ sobre a concentração de daidzeína
dissolvidas em 60 minutos do ensaio de dissolução.
61
Figura 22. Superfície de resposta referente à influência das variáveis ―aparato‖ e
―rotaçoes‖ sobre a concentração de daidzeína dissolvidas em 60 minutos do ensaio
de dissolução.
5.4.2.1.2 Coleta no tempo 90 minutos.
A análise de variância resultou os dados conforme Tabela 22.
Tabela 22. Análise de variância Daidzeína 90 minutos.
Fonte de
Variação
SQ
GL
MQ
F
P
R²=
98,84%
Regressão
Entre
4513,9652
7
644,8522
194,8562
2,82570E-14
V=
3,31
Resíduo
Dentro
52,9500
16
3,3094
0,0000
DP=
1,82
Total
Total
4566,9152
23
A significância estatística revelou um p<0,001, demonstrando que os dados
apresentam um alto grau de confiabilidade. O coeficiente de determinação (R
2
) foi
próximo de 1 revelando um boa correlação entre as variáveis, e o desvio padrão foi
± 1,82.
A regressão linear resultou a seguinte equação:
y = 67,21 + 6,87*%LSS + 4,24*Ap. + 1,94*rpm + 0,93*%LSS*Ap. - 0,85*%LSS*vol
(Equação 5)
62
A equação 5 permite inferir que os resultados obtidos com as coletas em 90
minutos são semelhantes aos obtidos nas coletas com 60 minutos, onde os fatores
LSS, aparato e velocidade de rotação apresentam efeito primário positivo, tendo os
níveis (+) uma maior resposta em concentração de daidzeína no tempo de 90
minutos. Ou seja, as condições ideais devem respectivamente ser: água + 3%LSS,
pá 100 rpm . O fator volume não apresentou efeito primário estatisticamente
significativo, no entanto o seu efeito sinérgico com o fator meio de dissolução foi
menor que zero, revelando um melhor desempenho quando utilizado o volume de
900 mL. Na Figura 23 pode-se observar tanto o efeito primário positivo do meio de
dissolução, como o efeito sinérgico do volume com o meio de dissolução. Na Figura
24 pode-se observar os efeitos primários positivos do aparato e da velocidade de
rotação.
Figura 23. Superfície de resposta referente à influência das variáveis ―concentração
de lauril sulfato de sódio‖ e ―volume do meio‖ sobre a concentração de daidzeína
dissolvidas em 90 minutos do ensaio de dissolução.
63
Figura 24. Superfície de resposta referente à influência das variáveis ―aparato‖ e
―rotações‖ sobre a concentração de daidzeína dissolvidas em 90 minutos do ensaio
de dissolução.
5.4.2.2 Genisteína
5.4.2.2.1 Coleta no tempo 60 minutos.
A análise de variância resultou os dados conforme Tabela 23.
Tabela 23. Análise de variância Genisteína 60 minutos.
Fonte de
Variação
SQ
GL
MQ
F
P
R²=
97,37%
Regressão
Entre
3145,3945
7
449,3421
84,6005
1,92006E-11
V=
5,31
Resíduo
Dentro
84,9815
16
5,3113
0,0000
DP=
2,30
Total
Total
3230,3759
23
A significância estatística revelou um p<0,001, demonstrando que os dados
apresentam um alto grau de confiabilidade. O coeficiente de determinação (R
2
) foi
próximo de 1 revelando um boa correlação entre as variáveis, e o desvio padrão foi
± 2,30.
64
A regressão linear resultou a seguinte equação:
y = 71,59 + 3,88*%LSS + 3,26*Ap. + 3,9*rpm - 1,27*%LSS*rpm - 2,37*%LSS*vol.
(Equação 6)
A equação 6 demonstra que os fatores LSS, aparato e velocidade de rotação,
assim como para a daidzeína, apresentam efeito primário positivo, tendo os níveis
(+) uma maior resposta em concentração de genisteína no tempo de 60 minutos. As
condições ideais continuam sendo respectivamente: água + 3%LSS, pá 100 rpm . O
fator volume não apresentou, novamente, efeito primário estatisticamente
significativo, no entanto o seu efeito sinérgico com o fator meio de dissolução foi
menor que zero, revelando um melhor desempenho quando utilizado o volume de
900 mL. Foi observado que o efeito secundário entre fatores meio de dissolução e
aparato não foi estatisticamente significativo segundo essa equação. Na Figura 25
pode-se observar tanto o efeito primário positivo do meio de dissolução, como o
efeito sinérgico do volume com o meio de dissolução. Na Figura 26 pode-se
observar os efeitos primários positivos do aparato e da velocidade de rotação.
65
Figura 25. Superfície de resposta referente à influência das variáveis ―concentração
de lauril sulfato de sódio‖ e ―volume do meio‖ sobre a concentração de genisteína
dissolvidas em 60 minutos do ensaio de dissolução.
Figura 26. Superfície de resposta referente à influência das variáveis ―aparato‖ e
―rotações‖ sobre a concentração de genisteína dissolvidas em 60 minutos do ensaio
de dissolução.
66
5.4.2.2.2 Coleta no tempo 90 minutos.
A análise de variância resultou os dados conforme Tabela 24.
Tabela 24. Análise de variância Genisteína 90 minutos.
Fonte de Variação
SQ
GL
MQ
F
P
R²=
99,16%
Regressão
Entre
1835,7161
7
262,2452
270,3988
2,12423E-
15
V=
0,97
Resíduo
Dentro
15,5175
16
0,9698
0,0000
DP=
0,98
Total
Total
1851,2336
23
A significância estatística revelou um p<0,001, demonstrando que os dados
apresentam um alto grau de confiabilidade. O coeficiente de determinação (R
2
) foi
próximo de 1 revelando um boa correlação entre as variáveis, e o desvio padrão foi
± 0,98.
A regressão linear resultou a seguinte equação:
y = 80,21 + 1,17*%LSS + 4,19*Ap. + 1,88*rpm - 0,83*Vol. - 0,46*%LSS*Ap. -
1,41*%LSS*rpm - 1,83*%LSS*Vol. (Equação 7)
A equação 7 demonstra que os fatores LSS, aparato e velocidade de rotação
apresentam efeito primário positivo, tendo os níveis (+) uma maior resposta em
concentração de genisteína no tempo de 90 minutos, concordando com os
resultados obtidos no item 5.3.1.1. Ou seja, as condições ideais continuam sendo
respectivamente: água + 3% LSS, pá 100 rpm. Porém, diferente dos resultados
anteriores, o fator volume apresentou efeito primário estatisticamente significativo
negativo, concordando que o melhor desempenho se deu quando utilizado o volume
de 900 mL. Os efeitos sinérgicos, secundários, LSS x aparato, LSS x rotações, LSS
x volume, foram todos negativos, sendo o maior valor em módulo LSS x Volume. Na
Figura 27 pode-se observar tanto o efeito primário positivo do meio de dissolução,
como o efeito sinérgico do volume com o meio de dissolução. Na Figura 28 pode-se
observar os efeitos primários positivos do aparato e da velocidade de rotação. Na
Figura 29 pode-se observar a o efeito sinérgico negativo entre meio de dissolução e
velocidade de rotação.
67
Figura 27. Superfície de resposta referente à influência das variáveis ―concentração
de lauril sulfato de sódio‖ e ―volume do meio‖ sobre a concentração de genisteína
dissolvidas em 90 minutos do ensaio de dissolução.
Figura 28. Superfície de resposta referente à influência das variáveis ―aparato‖ e
―rotações‖ sobre a concentração de genisteína dissolvidas em 90 minutos do ensaio
de dissolução.
68
Figura 29. Superfície de resposta referente à influência das variáveis ―concentração
de lauril sulfato de sódio‖ e ―rotações‖ sobre a concentração de genisteína
dissolvidas em 90 minutos do ensaio de dissolução.
De acordo com os resultados citados acima foi definido os seguintes
parâmetros para o método de dissolução:
Meio de dissolução: Água + LSS 3%
Aparato: Pá
Velocidade de rotação: 100 rpm
Volume de meio: 900 mL
5.4.3 Perfil de dissolução das formulações desenvolvidas
Após a definição das condições utilizadas durante o desenvolvimento do
método de dissolução para comprimidos de isoflavona da soja pode-se analisar as
seis formulações desenvolvidas ao longo do trabalho.
Segundo a USP 30 (2007) o uso de tensoativo, como LSS, no meio de
dissolução pode auxiliar na dissolução de fármacos pouco solúveis em água. Como
no caso dos marcadores daidzeína e genisteína que são pouco solúveis em água. O
volume de 900 mL de meio definido no método, segundo a USP 30 (2007) é o mais
utilizado. A velocidade de rotação de 100 rpm, também, está dentro dos critérios
aceitos pela USP 30 (2007). Sendo o aparato pá o mais comumente utilizado para
comprimidos (USP 30, 2007). Tanto na USP 30 (2007), como na Farmacopéia
69
Brasileira (1988) ainda não há descrição de ensaio de dissolução de fitoterápicos.
Atualmente a ANVISA (2010) ainda não exige ensaio de dissolução para registro de
fitoterápicos. Porém por se tratar de um ensaio in vitro que tem uma predição
relevante do desempenho do medicamento in vivo, é de fundamental importância
desenvolve-lo (TZANAVARAS et. al., 2008), mesmo que seja complexo, como no
caso de fitoterápicos.
A análise foi feita através do perfil de dissolução obtido com o ensaio de
dissolução realizado em sextuplicata e, a melhor formulação foi escolhida levando-se
em consideração a maior porcentagem dissolvida para os dois marcadores avaliados
(daidzeína e genisteína). Foi determinado que 80% de cada marcador deveriam ser
dissolvidos no tempo de 90 minutos.
As Tabelas 25 e 26 e as Figuras 30 e 31 demonstram que das formulações
avaliadas, a GU3 foi a que proporcionou melhor desempenho, pois promoveu a
dissolução da maior quantidade de daidzeína e genisteína ao longo de todo o
ensaio, permitindo que mais de 80% dos dois marcadores se dissolvessem em 90
minutos.
70
Tabela 25. Comparação da porcentagem de daidzeína dissolvida entre as formulações por tempo.
Tabela comparativa entre as formulações - Daidzeína (Média)
Formulações/Tempo
5 min
10 min
15 min
30 min
45 min
60 min
90 min
120 min
150 min
GU1
6,34 ± 2,2
16,45 ± 4,89
26,87 ± 6,60
50,40 ± 7,39
64,34 ± 6,20
70,78 ± 2,22
76,01 ± 1,60
76,69 ± 0,58
78,94 ± 0,76
GU2
3,73 ± 0,41
10,22 ±1,33
18,14 ± 1,96
40,59 ± 4,04
57,55 ± 5,47
68,18 ± 3,16
77,68 ± 1,76
82,11 ± 2,00
84,68 ± 2,12
GU3
12,56 ± 0,59
23,15 ± 0,88
34,57 ± 2,51
55,73 ± 2,92
68,66 ± 1,54
74,94 ± 1,54
80,74 ± 0,94
82,38 ± 1,12
84,83 ± 1,00
GU4
4,90 ± 0,59
10,16 ± 1,23
17,21 ± 1,71
31,95 ± 3,22
46,11 ± 4,54
59,32 ± 3,45
73,68 ± 2,45
79,01 ± 2,03
81,44 ± 1,20
GU5
4,30 ± 1,18
9,92 ± 1,14
18,08 ± 0,56
36,53 ± 1,07
52,44 ± 1,70
64,37 ± 2,90
69,06 ± 31,88
81,29 ± 1,36
84,94 ± 1,49
CD1
4,15 ± 0,83
9,10 ± 2,39
14,29 ± 4,34
30,49 ± 9,30
46,39 ± 14,15
55,99 ± 13,49
69,39 ± 8,27
78,97 ± 5,25
84,16 ± 2,39
Tabela 26. Comparação da porcentagem de genisteína dissolvida entre as formulações por tempo.
Tabela comparativa entre as formulações - Genisteína (Média)
Formulações/Tempo
5 min
10 min
15 min
30 min
45 min
60 min
90 min
120 min
150 min
GU1
7,14 ± 1,72
14,78 ± 4,05
23,33 ± 5,72
43,82 ± 7,45
55,26 ± 6,17
60,17 ± 2,19
63,36 ± 1,76
62,63 ± 1,12
63,52 ± 1,12
GU2
6,31 ± 0,50
13,78 ± 1,56
22,72 ± 2,29
47,82 ± 5,03
66,91 ± 6,61
77,21 ± 3,41
83,36 ± 2,52
84,68 ± 2,49
85,23 ± 1,94
GU3
21,89 ± 0,94
33,90 ± 0,72
46,89 ± 3,25
71,25 ± 3,15
85,28 ± 1,67
88,87 ± 2,37
92,20 ± 0,64
92,30 ± 0,89
92,57 ± 1,55
GU4
7,66 ± 0,68
13,42 ± 1,33
21,22 ± 1,97
37,95 ± 3,78
53,37 ± 5,19
67,48 ± 4,14
80,92 ± 1,82
83,43 ± 2,40
83,51 ± 0,57
GU5
7,61 ± 0,27
13,20 ± 1,28
22,11 ± 0,67
42,79 ± 1,18
59,87 ± 2,02
72,93 ± 3,46
79,34 ± 10,80
84,82 ± 1,66
86,80 ± 1,63
CD1
10,38 ± 2,08
13,51 ± 3,10
19,98 ± 5,51
39,74 ± 11,69
57,89 ± 17,72
66,67 ± 14,99
78,23 ± 7,86
85,46 ± 5,43
87,59 ± 1,47
71
.
Figura 30. Curvas dos perfis de dissolução de daidzeína das formulações.
Figura 31. Curvas dos perfis de dissolução de genisteína das formulações.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Concentração (%)
Tempo (Minutos)
Perfil de dissolução - Daidzeína
GU1
GU2
CD1
GU3
GU4
GU5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Concentração (%)
Tempo (Minutos)
Perfil de dissolução - Genisteína
GU1
GU2
CD1
GU3
GU4
GU5
72
A dissolução, assim como a desintegração, mais rápida da formulação GU3
foi obtida pelo uso do desintegrante croscarmelose sódica e do tensoativo lauril
sulfato de sódio. Villanova e Sá (2009) relatam que o uso de tensoativo na
formulação reduz a tensão superficial, melhorando a molhabilidade do fármaco e
aumentando a sua solubilidade, ou seja, auxiliam na redução do tempo de
dissolução dos comprimidos. E relatam, também, que o uso de desintegrantes
facilita a desagregação dos grânulos em partículas menores, quando em contato
com a água, aumentando a superfície exposta ao meio e acelerando a dissolução
(VILLANOVA e SÁ, 2009). O uso de dois por cento do LSS na formulação e três por
cento no meio de dissolução foi fundamental para melhorar a dissolução do
comprimido. A dureza e o tamanho dos pós e granulados que constituem o
comprimido também influenciam na dissolução (USP 30, 2007).
73
6 CONCLUSÃO
O extrato não apresentou contaminação microbiológica, pois não houve
crescimento de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans e
Aspergillus niger.
A melhor condição para quantificação de daidzeína e genisteína por CLAE foi:
método isocrático, metanol com 0,1% de ácido acético, água com 0,1% de ácido
acético e acetonitrila na proporção 64:32:4 como fase móvel, coluna de fase reversa
C18 150mm x 4,6mm x 5µm, fluxo de 0,7 mL/min, temperatura da coluna de 30ºC,
comprimento de onda de 254 nm, e volume de injeção de 10 µL. Sob essas
condições, os picos foram simétricos, tiveram resolução maior que 2, com tempos de
retenção de 3,13 e 3,72 da daidzeína e genisteína, respectivamente.
O teor dos marcadores encontrados no extrato foi 27,8% e 11,1% de
daidzeína e genisteína, respectivamente, ou seja, cerca de 40% de isoflavonas.
Nos resultados da análise térmica não foram observadas possíveis interações
do extrato com os excipientes testados.
Dentre as seis formulações desenvolvidas de comprimidos de isoflavona,
sendo uma por compressão direta e cinco por granulação úmida, o melhor método
de obtenção dos comprimidos foi a granulação úmida, pois apresentou melhores
propriedades compressionais com velocidade de escoamento variando entre 4,5 e
6,7 s/100g e compressibilidade entre 16,85% e 26,06%.
A formulação GU3, feita por granulação úmida, foi a que apresentou melhor
desempenho segundo os parâmetros analisados, apresentando teor de 92,66% e
92,76% de daidzeína e genisteína, respectivamente, desintegração de 15 minutos, e
fluxo caracterizado como excelente.
No desenvolvimento do método analítico para dissolução dos comprimidos de
isoflavona foi feito o teste de solubilidade para definir o melhor meio, sendo o meio
água com 3% de lauril sulfato de sódio o que dissolveu 80% de daidzeína e
genisteína na temperatura de 37ºC no tempo de 90 minutos, intervalo atendendo as
recomendações dos compêndios oficiais. Os demais parâmetros definidos através
do desenvolvimento do método foram aparato pá, velocidade de rotação de 100 rpm
e 900 mL de volume de meio.
Os resultados mostraram a possibilidade de obtenção de formas
farmacêuticas sólidas promissoras para veiculação de isoflavona, além de
74
metodologias otimizadas para controle de qualidade para análise da matéria-prima e
do produto acabado.
Os resultados obtidos neste trabalho permitem contribuir com as políticas
públicas do Ministério da Saúde viabilizando comprimidos de isoflavona de soja com
qualidade estabelecida, os quais podem servir de parâmetro para a indústria
farmacêutica nacional atender os pré-requisitos de qualidade do medicamento
fitoterápico a ser distribuído pelo Sistema Único de Saúde.
75
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