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RONALDO FRANCISCO DE LIMA
RESPOSTA MORFOLÓGICA DAS MUCOSAS RUMINAL E OMASAL
À VARIAÇÃO ALIMENTAR
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Lavras, como parte das
exigências do Programa de Pós Graduação
em Ciências Veterinárias, área de
concentração em Ciências Veterinárias,
para obtenção do título de Mestre.
Orientador
Dr. João Chrysostomo de Resende Júnior
Co-orientadores
Dra. Suely de Fátima Costa
Dr. Pedro Soares Bezerra Júnior
LAVRAS - MG
2010
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Lima, Ronaldo Francisco de.
Resposta morfológica das mucosas ruminal e omasal à variação
alimentar / Ronaldo Francisco de Lima. – Lavras : UFLA, 2010.
42 p. : il.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2010.
Orientador: João Chrysóstomo de Resende Júnior.
Bibliografia.
1. Gado leiteiro. 2. Acidose. 3. Ácido graxo volátil. 4. Dieta de
transição. 5. Índice mitótico. I. Universidade Federal de Lavras. II.
Título.
CDD – 636.2089133
Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca da UFLA
RONALDO FRANCISCO DE LIMA
RESPOSTA MORFOLÓGICA DAS MUCOSAS RUMINAL E OMASAL
À VARIAÇÃO ALIMENTAR
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Lavras, como parte das
exigências do Programa de Pós Graduação
em Ciências Veterinárias, área de
concentração em Ciências Veterinárias,
para obtenção do título de Mestre.
APROVADA em 04 de agosto de 2010.
Dra. Cristina Delarete Drummond UFLA
Dr. Márcio Gilberto Zangeronimo UFLA
Dra. Suely de Fátima Costa UFLA
Dr. João Chrysostomo de Resende Júnior
Orientador
LAVRAS - MG
2010
AGRADECIMENTOS
A Deus pela saúde e sabedoria.
À Universidade Federal de Lavras e ao Departamento de Medicina
Veterinária, pela oportunidade concedida para realização do mestrado.
À CAPES pela bolsa concedida.
Aos membros da banca de avaliação: Prof
a
. Dra. Cristina, Prof
a
. Dra.
Suely, Prof. Dr. Márcio e ao Prof. Dr. José Rafael que aceitou o convite de
membro suplente da banca.
Ao grande amigo Resende Júnior pelos sete anos de orientação,
companheirismo e amizade (obrigado João).
Ao amigo João Luiz que sempre ajudou.
À amiga Leandra Melo pela grande ajuda.
À Professora Suely pela amizade e orientação, a qual eu tenho grande
admiração e carinho, que foi indispensável na realização desse trabalho.
Ao grande amigo Berin por sempre estar pronto em ajudar na secretaria
do programa.
Aos amigos Matheus Balduíno, Tiago Teófilo, Milton Cardoso, Danilo
Santoro, Lucas de Castro, Luiz Sergio, Thiago França e Josenel.
A todos que contribuíram para a realização do tão sonhado Mestrado.
RESUMO
A capacidade de absorção de ácidos graxos voláteis (AGV) do rúmen é
proporcional à extensão de sua superfície absortiva a qual responde
positivamente ao estímulo direto e indireto dos próprios AGV. Existem indícios
de que a parede do omaso, que em vacas leiteiras é responsável por cerca de
40% da absorção de AGV, responde igualmente aos mesmos estímulos de
proliferação que a parede do rúmen. Com o objetivo de testar esta hipótese
foram comparados os aspectos morfológicos de fragmentos de rúmen e de
omaso obtidos por biopsia. Quatro vacas não lactantes e não gestantes, sem raças
definidas e idades diferentes, foram alimentadas seqüencialmente com duas
dietas, uma composta somente por forragem e outra composta por forragem e
concentrado. Nos primeiros 18 dias de experimento os animais foram
alimentados com forragem, nos 18 dias seguintes receberam a dieta de forragem
e concentrado. Seguiram-se então 72 horas de jejum. Biopsias do saco ventral do
rúmen foram feitas ao final do período de alimentação com forragem, aos 4 e
aos 18 dias do período de alimentação com concentrado e ao final do período de
jejum. Seguiu-se um período de realimentação com concentrado e forragem com
biopsias nos dias 4,12 e 18. A média de IMS e consumo de NDT (P<0,001)
variou entre os períodos de alimentação e foi maior quando atingiu 18 dias de
alimentação concentrada. O índice mitótico (IM) do rúmen e omaso e a
concentração de AGV foi maior (P=0,01) no dia quatro de alimentação
concentrada. Houve correlação positiva (r
2
=0,66; P<0,01) entre o IM do rúmen e
do omaso. A área do rúmen não apresentou diferença significativa entre os
tratamentos. A largura média das papilas variou entre os tratamentos e foi maior
(P< 0,01) no dia 18 de alimentação concentrada, mostrando que houve estímulo
proliferativo da parede do rúmen. A semelhança nas espessuras das camadas
não queratinizadas e a correlação positiva entre o índice mitótico da camada
basal do epitélio do rúmen e do omaso, indicam que os estímulos de divisão
celular desencadeados pelo teor de energia da dieta atuam simultaneamente nos
dois compartimentos, mas o omaso parece responder mais rapidamente aos
estímulos.
Palavras-chave: Acidose. Índice mitótico. Dieta de transição. Gado leiteiro.
Ácido graxo volátil.
ABSTRACT
The ability to absorb volatile fatty acids (VFA) rumen is proportional to
the extent of their absorptive surface which responds positively to the direct and
indirect stimulation of VFA own. There are indications that the wall of the
omasum, which in dairy cows is responsible for about 40% of absorption of
VFA, also responds to the same stimuli that the proliferation of the rumen wall.
Aiming to test this hypothesis we compared the morphological features of
fragments of rumen and omasum obtained by biopsy. Four non-lactating cows
and not pregnant, not defined breeds and ages were sequentially fed two diets,
one composed only of grass and other forage composed and focused. In the first
18 days of the experiment the animals were fed with forage received within 18
days following the diet of forage and concentrate. Then followed 72 hours of
fasting. Biopsies of the ventral sac of the rumen were made at the end of the
feeding of forage, at 4 and 18 days of the feeding period and concentrate at the
end of fasting period. There followed a period of refeeding with concentrate and
forage with biopsies on days 18 and 4.12. The average DMI and TDN intake (P
<0.001) varied between periods of feeding and was higher when it reached 18
days of concentrated feed. The mitotic index (MI) and omasum and rumen VFA
concentration was higher (P = 0.01) in four days of concentrated feed. A positive
correlation (r
2
= 0.66, P <0.01) between IM rumen and omasum. The area of the
rumen was not significantly different between treatments. The average width of
papillae varied among treatments and was greater (P <0.01) at 18 days of
concentrated feed, which revealed proliferative stimulus of the rumen wall. The
similarity in thickness of the layers are not keratinized and the positive
correlation between the mitotic index of the basal layer of the epithelium of
rumen, omasum, indicate that the stimulation of cell division triggered by the
energy content of the diet act simultaneously in both compartments, but the
omasum seems respond more quickly to stimuli.
Keywords: Acidosis. Mitotic index. Dietary transition. Dairy cattle. Volatile
fatty acid.
Lista de Figuras
Figura 1 Instrumento utilizado para realização das biópsias de lâminas do
omaso.......................................................................................................21
Figura 2 Média diária de ingestão de MS (■) e de NDT (●) ao longo do
período experimental de vacas não gestantes e não lactantes
alimentadas com 18 dias de silagem de milho; 4 e 18 dias de
alimentação com 50% silagem de milho e 50 % concentrado com
base na matéria seca; 72 horas de jejum; e 4, 12 e 18 dias de
realimentação com 50% de silagem e 50% de concentrado.(P <
0,001 para efeito de período de experimental)......................................28
Figura 3 Concentração de ácidos graxos voláteis (AGV) total (♦), no rúmen
de vacas não gestantes e não lactantes, alimentadas com 18 dias de
silagem de milho; 4 e 18 dias de alimentação com 50% silagem de
milho e 50 % concentrado com base na matéria seca; 72 horas de
jejum; e 4, 12 e 18 dias de realimentação com 50% de silagem e
50% de concentrado. (P < 0,001 para efeito de período
experimental)...........................................................................................30
Figura 4 Área (●), comprimento (■) e área/comprimento (▲) das papilas do
rúmen de vacas não gestantes e não lactantes, alimentadas com 18
dias de silagem de milho; 4 e 18 dias de alimentação com 50%
silagem de milho e 50 % concentrado com base na matéria seca; 72
horas de jejum ; e 4, 12 e 18 dias de realimentação com 50% de
silagem e 50% de concentrado. (P < 0.001 para efeito de período
experimental para área/comprimento, P = 0,12 para comprimento e
P = 0,22 para área)..................................................................................33
Figura 5 Correlação entre índice mitótico do rúmen e do omaso de vacas
mestiças não gestantes e não lactantes. IM do omaso = 0.8705X +
0,0281IM rúmen; r
2
= 0,66; P<0,01.......................................................35
Figura 6 Índice mitótico do omaso (●) e do rúmen (
) de vacas não lactantes
e não gestantes alimentadas com 18 dias de silagem de milho (18F);
4, 18 dias de alimentação com 50% silagem de milho e 50 %
concentrado com base na matéria seca (4C e 18C respectivamente),
72 horas de jejum e 4, 12 e 18 dias de realimentação com 50% de
silagem e 50% de concentrado (4R, 12R e 18R respectivamente). (P
= 0,01 para interação entre órgãos e períodos)......................................37
Lista de Tabelas
Tabela 1 Composição das dietas utilizadas nos períodos experimentais.............26
Tabela 2 Ingestão de matéria seca, concentração de ácidos graxos voláteis e
morfologia ruminal de vacas não gestantes e não lactantes .................27
Tabela 3 Índice mitótico, espessura de queratina, do epitélio total e do
epitélio sem queratina do rúmen e omaso de vacas mestiças não
gestantes e não lactantes.........................................................................36
Sumário
1 INTRODUÇÃO
.................................................................................. 12
2 REFERENCIAL TEÓRICO
............................................................. 13
2.1 Anatomia e morfologia do proventrículo
........................................... 13
2.2 Alterações morfológicas do ruminorretículo à variações
nutricionais
......................................................................................... 14
2.3 Estudo da morfofisiologia do omaso
.................................................. 17
3 MATERIAL E MÉTODOS
.............................................................. 19
3.1 Animais, instalações e tratamentos
.................................................... 19
3.2 Determinação do consumo de matéria seca e análises
bromatológicas
................................................................................... 19
3.3 Amostras de fluido ruminal
............................................................... 20
3.4 Avaliações morfológicas
..................................................................... 20
3.4.1 Macroscopia do rúmen
....................................................................... 21
3.4.2 Microscopia
........................................................................................ 22
3.5 Análises estatísticas
............................................................................ 23
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO
....................................................... 25
5 CONCLUSÃO
................................................................................... 38
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
............................................... 39
12
1 INTRODUÇÃO
A evolução dos ruminantes vem ocorrendo bem antes de sua domesticação.
Eram selecionadores de concentrado, passaram a ser injetores de forragens grosseiras.
Hoje, com o melhoramento genético dos animais de produção, os ruminantes,
principalmente os bovinos de alta produção, passaram a ter que ingerir dietas com alta
inclusão de concentrado para atender às suas demandas nutricionais. No entanto, esses
ruminantes nem sempre passam por um processo de adaptação para ingerir dietas com
alto teor de carboidratos não fibrosos que tem alta velocidade de degradação e
conseqüente rápida produção de ácidos graxos voláteis (AGV) podendo propiciar um
distúrbio denominado acidose ruminal.
A acidose ruminal acontece quando a taxa de produção de AGV excede a taxa
de remoção desses mesmos ácidos, diminuindo o pH ruminal. A remoção de AGV
também conhecida como clearance de AGV no ruminorretículo ocorre por duas
formas, absorção pela parede e passagem para o omaso. A capacidade de absorção está
diretamente relacionada à extensão da superfície absortiva do órgão e ela pode ser
manipulada pela dieta como demonstrado por vários autores no rúmen
Para manipular o tamanho da superfície de absorção do epitélio do rúmen,
além de mensurações macroscópicas, como medição de área e tamanho de papilas
ruminais tem-se usado o índice mitótico para medir a capacidade proliferativa do
epitélio ruminal.
Em vacas leiteiras de 36% (Voelker e Allen, 2003) a 45% de AGV (Resende
Júnior et al., 2006b) produzidos no rúmen chegam ao omaso e precisam ser absorvidos
nesse compartimento. Então o omaso é de fundamental importância para o clearance
de AGV. Apesar desta importância, há poucos estudos que relacionam a dieta ingerida
à capacidade de absorção do omaso.
O objetivo desse trabalho foi comparar a resposta morfológica das mucosas do
rúmen e do omaso à variação alimentar por meio da verificação do efeito da dieta sobre
a superfície absortiva do rúmen; sobre, os índices mitótico dos epitélios ruminal e
omasal; e sobre as espessuras das camadas queratinizadas e não queratinizadas dos
epitélios ruminal e omasal.
13
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Anatomia e morfologia do proventrículo
O estômago de animais ruminantes é constituído por quatro compartimentos
morfologicamente distinto, os três primeiros, rúmen, retículo e omaso correspondem à
parte aglandular, também chamada de proventrículo e a parte glandular é constituída
pelo abomaso (Dellman e Brown, 1982). Por não haver barreira anatômica consistente
entre o rúmen e o retículo (Nickel et al., 1981), estes compartimentos são
freqüentemente chamados ruminorretículo.
O rúmen é dividido internamente em sacos por pilares musculares. Os pilares
mais consistentes dividem o órgão em sacos cranial, dorsal e ventral, enquanto pilares
menos espessos dividem os sacos cegos caudodorsal e caudoventral. Esse
compartimento é responsável por aproximadamente 84% da capacidade de
armazenamento do estômago e sua mucosa é caracterizada por projeções denominadas
papilas ruminais. O retículo é o menor dos quatro compartimentos e, internamente,
possuí projeções anastomosadas denominadas cristas, que delimitam áreas poligonais,
as células do retículo (Nickel et al., 1981).
O omaso é um compartimento de tamanho intermediário e apresenta
aproximadamente 42 % do peso do rúmen vazio (Daniel et al., 2006). Sua parede
apresenta inúmeras projeções de diferentes tamanhos denominadas lâminas, que são
sobrepostas umas as outras como as folhas de um livro (Nickel et al., 1981). Sua
comunicação com o ruminorretículo se dá por um pequeno óstio denominado óstio
retículo-omasal (Dyce et al., 2002).
A parede da parte aglandular do estomago de ruminantes é constituída de três
túnicas que são denominadas, a partir do lúmen do órgão em direção à cavidade
abdominal, de mucosa, muscular e serosa. No omaso existe uma muscular da mucosa
que delimita também uma quarta túnica, denominada submucosa (Dellmann e Brown,
1982).
O epitélio ruminal e omasal é do tipo estratificado pavimentoso queratinizado
formado por quatro camadas de células distintas: basal, espinhosa, granulosa e córnea
ou queratinizada (Lavker et al., 1969). Como acontece em qualquer epitélio desta
natureza, a proliferação celular ocorre a partir da camada basal, onde as células entram
em divisão mitótica, conforme a necessidade de suprimento celular do epitélio. Estas
por sua vez sofrem diferenciação e migram para as demais camadas do epitélio até
14
alcançar a camada córnea e descamar para dentro do lúmen ruminal (Lavker e
Matoltsy, 1970).
2.2 Alterações morfológicas do ruminorretículo à variações nutricionais
A manipulação nutricional da morfologia e, consequentemente, da capacidade
de absorção do ruminorretículo é possível e tem sido preconizada para o controle de
acidose ruminal em vacas leiteiras (Dirksen et al., 1985). Brownlee (1956) demonstrou
que o grau de desenvolvimento das papilas do rúmen foi provavelmente determinado
pelo teor de energia da dieta ou pela velocidade com que a dieta era quebrada em
frações absorvíveis. A infusão de ácidos graxos voláteis (AGV) por 12 semanas, na
forma de solução de sais de sódio, estimulou o crescimento papilar em uma área
limitada do rúmen de bezerros (Flatt et al., 1958). Bezerros que receberam butirato ou
propionato de sódio intra-ruminal apresentaram extenso desenvolvimento papilar
(Sander et al., 1959). Tamate et al. (1962) constataram evolução no desenvolvimento
papilar entre o nascimento e as 12 semanas de idade, em bezerros holandeses
alimentados com leite, feno e concentrado. Em contrapartida, animais alimentados
apenas com leite tiveram diminuição no tamanho das papilas do rúmen no período. No
mesmo experimento, observou-se também que a dose de AGV era importante para a
estimulação do crescimento papilar.
Apesar das evidências que infusões de AGV estimulam o crescimento papilar,
nenhuma comprovação histológica deste fato havia sido realizada. Em vista disto,
Sakata e Tamate (1976), em experimento com carneiros adultos, observaram aumento
no índice mitótico da camada basal das papilas do rúmen de carneiro que receberam
infusão intra-ruminal de 500mL de butirato de sódio a 10% comparado com animais
que receberam infusão de 500mL de solução salina. Tamate e Fell (1978) delinearam
outro experimento com dois carneiros adultos com cânulas ruminais. Estes foram
alimentados preliminarmente com feno ad libitum. A seguir receberam por 16 dias
uma dieta de feno e concentrado de grão de cevada e farinha de peixe, fornecida
também ad libitum. Logo após, a dieta foi mudada abruptamente para feno em
quantidade restrita (0,5 kg por dia). Em intervalos freqüentes, eram coletadas papilas
ruminais através de biópsias. O índice mitótico da camada basal do epitélio das papilas
do rúmen aumentou abruptamente já no primeiro dia após a mudança da dieta de feno
para concentrado. Em contrapartida, caiu gradativamente ao longo dos dias após a
15
mudança da dieta de concentrado para feno com ingestão restrita, atingindo no quinto
dia, um nível mais baixo do que o observado no período em que os animais recebiam
feno ad libitum. Um dia após a dieta de cevada para feno, as células da camada basal
pareciam estar encolhidas e seus núcleos apresentavam contorno irregular,
características que se acentuavam com o prolongamento do período de restrição
alimentar. Durante o período de restrição de alimento, células isoladas morreram
(apoptose celular) e encontraram-se fragmentações por perda celular espontânea
intensa, particularmente nas regiões das cunhas epiteliais. Células necróticas isoladas,
fagocitose por células de Langehans e por células epiteliais basais apareceram um dia
após a mudança da dieta de concentrado para feno em quantidade restrita e foram
encontradas com maior freqüência nas últimas amostras de biópsia. Este experimento
mostrou que a resposta celular a um menor nível alimentar é rápida no epitélio
ruminal.
Goodlad (1981) também estabeleceu uma relação entre a proliferação celular
do epitélio ruminal e o crescimento das papilas de carneiro sob três diferentes dietas, as
quais foram formuladas para resultar em diferentes proporções de AGV no rúmen.
Inicialmente os animais foram alimentados durante sete meses com uma dieta baseada
em forragem. Esta dieta foi mudada retirando-se gradativamente a forragem e
aumentando a quantidade de concentrado, atingindo no quarto dia após a mudança, um
quilo de concentrado e zero de forragem. Após 62 dias, a dieta baseada em forragem
foi reintroduzida. Observou-se um grande aumento no índice mitótico das células
basais do epitélio do rúmen, que mudou de 0,58% ± 0,05% na dieta de forragem para
1,20% ± 0,11% no quarto dia do início da mudança da dieta para concentrado. Após
este pico, houve um declínio para um novo nível de atividade mitótica levemente mais
alto do que o observado na dieta de forragem. Houve hipertrofia das papilas quando os
carneiros foram alimentados com dieta baseada em grãos, detectada tanto
macroscopicamente quanto histologicamente. Foram detectados sinais de
paraqueratose (diferenciação precoce de células para a camada córnea) e
hiperqueratose (espessamento da camada córnea devido a pouca esfoliação), mas a
mudança mais marcante observada foi o crescimento e ramificação das papilas. As
mudanças do epitélio foram acompanhadas por extensão da lâmina própria. Estes
achados indicam que o aumento no índice mitótico provavelmente está associado a
aumento no tamanho e modificação papilar. Quando a dieta foi mudada novamente
16
para forragem houve uma queda acentuada no índice mitótico da camada basal do
epitélio das papilas do rúmen (0,35% ± 0,03).
Resende Júnior et al. (2006a) ao avaliar a freqüência de alimentação com
concentrados, em um experimento com sete vacas não lactantes, observaram que a
menor freqüência de alimentação concentrada resultou em maior índice mitótico da
camada basal do epitélio ruminal. No entanto, a maior divisão celular não se refletiu
em aumento nas dimensões macroscópicas das papilas do rúmen. Não foi detectado
efeito da freqüência de alimentação concentrada sobre o tamanho papilar,
potencialmente correlacionado com maior capacidade de absorção do epitélio ruminal
(Sutton et al, 1963; Dirksen et al, 1985). Apesar do índice mitótico do epitélio ruminal
responder agudamente às mudanças no plano alimentar (Sakata e Tamate, 1978;
Goodlad, 1981), este pode não ser o único determinante do tamanho papilar em curto
prazo. O maior fluxo sanguíneo, resultante de maior aporte nutricional e maior
necessidade de absorção, pode resultar em crescimento papilar (Tamate et al., 1974).
Mudanças agudas na capacidade de absorção da parede do rúmen podem não estar
relacionadas unicamente ao tamanho papilar (Gäbel et al, 1993).
Beharka et al. (1998) estudaram o efeito da forma física da dieta sobre o
desenvolvimento morfológico do rúmen. Os autores relataram que,
macroscopicamente, não houve diferenças marcantes na forma, distribuição e
comprimento das papilas ruminais entre as dietas. Entretanto, o exame microscópico
mostrou que papilas oriundas do saco cranial do rúmen apresentaram menos alterações
de forma e comprimento como resposta à dieta do que aquelas oriundas de outras
regiões do rúmen. Os autores especularam que este resultado ocorreu, provavelmente,
porque na região do saco cranial as partículas do alimento tendem a flutuar,
promovendo um estímulo físico menor na mucosa ruminal.
Melo (2007) avaliou a morfologia da parede ruminal de nove vacas fistuladas
submetidas a três condições experimentais. “Alta”, com vacas Holandesas produzindo
25,9 kg de leite e alimentadas com dieta completa rica em grãos. “Média” com vacas
Girolando produzindo 12,3 kg e alimentadas com silagem de milho, pastagem tropical
e concentrado comercial. “Secas”, com vacas Jersey não lactantes e alimentas
exclusivamente a pasto. As vacas Holandesas em melhor plano nutricional tiveram
maiores áreas de superfície absortiva e índice mitótico das células da camada basal do
epitélio ruminal, e menores espessuras do epitélio e da camada queratinizada se
comparadas com as vacas Girolando e Jersey. A maior superfície de absorção foi
17
associada à menor espessura de epitélio, como resultado da redução da camada
queratinizada. A maior (P<0,01) proliferação celular, mensurada pelo IM nas
condições “Alta” (0,97 %) e “Média” (0,95%) em relação à condição “Seca” (0,72%),
foi aparentemente acompanhada também de maior perda no número de células
epiteliais. A maior superfície de absorção na condição “Alta” não foi acompanhada por
diferença acentuada no IM relativamente à condição “Média”.
2.3 Estudo da morfofisiologia do omaso
Considerando que, em geral, a morfofiologia do rúmen, retículo e abomaso
está bem definida, a do omaso ainda é um pouco obscura. Inicialmente foi colocado
que a sua função primária era ajudar a reter e separar partículas, pois partículas grandes
tendem a ficar presas entre as laminas enquanto as pequenas partículas passam
rapidamente (Bost, 1970 e Langer, 1988 citado por Hackmann e Spain, 2010). Ehrlein
(1980), citado por Hackmann e Spain (2010), relatou que partículas grandes podem ser
ejetadas de volta para dentro do retículo via óstio retículo-omasal. Havia hipótese de
que o omaso também funcionava como uma bomba de sucção de líquidos e sólidos do
ruminorretículo para o abomaso (Stevens et al., 1960).
O omaso é um potente compartimento absorvente. Ele absorve cerca de 12,5%
de água, 25% sódio, 10% potássio ingeridos; 45 - 50% de AGV; 35% amônia, e 50%
de dióxido de carbono produzidos no rúmen (Engelhardt e Hauffe, 1975 citado por
Hackmann et al., 2010 e Resende Júnior et al., 2006b). Sete a nove por cento da
digestão de fibra do TGI acontece no omaso (Ahvenjarvi et al., 2000).
Costa et al. (2008) observaram maior peso do omaso em bezerros que
receberam, durante 37 dias, infusão intra-ruminal de butirato (154g), propionato (118
g) e lactato (109 g) em relação aos bezerros do tratamento controle que receberam
infusão apenas de salina (93g). O butirato foi mais eficiente em aumentar o peso do
omaso, mas desencadeou maiores danos teciduais no epitélio. Isso demonstra indícios
de que a morfologia do omaso pode ser determinada pela dieta ingerida.
Para mensurar a superfície de absorção do ruminorretículo e do omaso
comparando-as com a magnitude de absorção, Daniel et al. (2006) avaliaram o
estômago de oito bovinos removidos imediatamente após o abate. Os compartimentos
do estômago foram separados, pesados e tiveram fragmentos coletados em diversas
regiões anatômicas. Procedeu-se a mensuração da área total da superfície interna por
meio de captura e análise de imagens digitalizadas. A superfície absortiva do
18
ruminorretículo (7,7m
2
) foi maior do que a do omaso (2,1m
2
). A relação
superfície/digesta, entretanto, tendeu a ser maior no omaso (0,22m
2
/Kg) do que no
ruminorretículo (0,12m
2
/Kg), representando uma área superficial 83,3% maior. A área
de um fragmento do saco ventral do rúmen apresentou correlação positiva com a área
total da superfície do rúmen, indicando ser possível a estimativa da área total do órgão
por meio de biópsia.
Daniel et al. (2007) observaram, in vitro, maior taxa fracional de absorção no
omaso (9,1%. h
-1
.cm
2
) do que no rúmen (0,4%.h
-1
.cm
2
) e uma taxa semelhante de
metabolização de AGV na parede do rúmen e omaso, reforçando assim a importância
desse compartimento na absorção de AGV
Daniel (2007) avaliou o índice mitótico do rúmen e do omaso de oito bovinos
de peso e idade variados e de ambos os sexos provenientes de um abatedouro
comercial. O autor observou que o índice mitótico da camada basal de células do
omaso (0,52%) foi maior do que o do rúmen (0,28%). Existiu também correlação
positiva entre o índice mitótico destes compartimentos. Isso pode indicar que os fatores
estimuladores da proliferação da parede do omaso podem ser os mesmos do rúmen.
Resende Júnior et al. (2006b) comparando técnicas para a determinação do
clearance ruminal de AGV em vacas Holandesas alimentadas com azevém e
concentrado, constataram que o desaparecimento de AGV por passagem para o omaso
correspondeu a aproximadamente 45% do clearance total. Tendo em vista o grande
percentual de AGV que chega no omaso, acredita-se que esse órgão é tão importante
como o rúmen na absorção desses ácidos.
19
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais, instalações e tratamentos
O estudo foi realizado em quatro vacas de raças diversas, não lactantes, não
gestantes e com cânulas implantadas cirurgicamente no saco dorsal do rúmen. Os
animais foram abrigados e alimentados individualmente em Tié Stall com cama de
areia. Durante todo experimento foram ofertados água e premix mineral ad libitum.
O experimento teve duração de 57 dias. Foram sete períodos experimentais
subseqüentes, considerados como tratamentos para comparar o comportamento do
rúmen e do omaso em diferentes dietas e diferentes tempos de ingestão. Os tratamentos
foram: (1) 18 dias com 100% de forragem; (2) 4 dias com 50% forragem + 50%
concentrado; (3) 18 dias de 50% forragem + 50% concentrado; (4) 72 horas de jejum;
(5) 4 dias de realimentação com 50% de forragem + 50% de concentrado; (6) 12 dias
de realimentação com 50% de forragem + 50% de concentrado; e (7) 18 dias de
realimentação com 50% de forragem + 50% de concentrado. O delineamento foi em
blocos casualisados em que cada vaca era considerado um bloco. Os tratamentos foram
estabelecidos de acordo com experimentos anteriores com rúmen em que Goodlad et
al. (1981) observou maior índice mitótico com quatro dias após introdução de
concentrado e Resende Junior et al. (2006a) maior superfície absortiva no dia 12 de
introdução de concentrado na dieta. A alimentação foi fornecida como dieta completa
uma vez ao dia, às 7:00 horas. A forragem utilizada foi silagem de milho e o
concentrado foi adquirido comercialmente.
3.2 Determinação do consumo de matéria seca e análises bromatológicas
O consumo de alimentos foi determinado diariamente. Para tal, a quantidade
de ração ofertada e as sobras foram pesadas e o consumo determinado por diferença.
Diariamente, subamostras do oferecido e das sobras de cada vaca foram coletadas para
compor uma amostra a cada seis dias de experimento. As amostras compostas foram
desidratadas em estufa ventilada à 60ºC por 72 horas e moídas em moinho com peneira
de 1,0 mm.
20
Uma amostra de 3,0 g do material pré-seco foi levada à estufa de 105ºC para
determinação da matéria seca (Silva, 2002). As quantidades de matéria seca oferecida e
rejeitada diariamente foram determinadas multiplicando-se as quantidades de matéria
natural pelo teor de matéria seca das respectivas frações. O consumo de matéria seca
foi obtido por diferença, em cada fase sendo estimado pela média de consumo nos
últimos três dias da fase.
O teor de proteína bruta (PB) foi determinado por aparelho de digestão a vapor
Microkjeldhall (AOAC, 1990), o conteúdo de cinzas foi determinado por incineração a
550
o
C por 8 horas em mufla, a fibra em detergente neutro (FDN) foi determinada pelo
método de Van Soest et al. (1991) e o extrato etéreo (EE) foi determinado segundo o
AOAC (1990).
3.3 Amostras de fluido ruminal
Seis horas após a alimentação no último dia de cada fase, amostras de fluido
ruminal foram coletadas do saco ventral, utilizando-se um tubo de PVC rígido de ¾
com múltiplos orifícios no terço distal da parede, acoplado à um dispositivo de sucção.
Alíquotas de 10 ml foram preservadas com 200 µl de ácido sulfúrico a 50% e
imediatamente congeladas a -20
o
C para posterior análises de AGV por meio de
cromatografia gás-líquida (CP-3800 Gas Chromatograph Varian, Varian
Chromatography Systems, Califórnia, EUA).
3.4 Avaliações morfológicas
No último dia de cada fase, aproximadamente dez horas após a alimentação, o
ruminorretículo foi evacuado manualmente e foram realizadas biópsias de um
fragmento
da parede do saco ventral do rúmen (recesso do rúmen) e de uma lâmina do
omaso. As biópsias de rúmen foram efetuadas com auxílio de tesoura cirúrgica após
exteriorização da parede do órgão através da cânula. A biópsia da lâmina do omaso foi
realizada com auxílio de um equipamento semelhante a um alicate, confeccionado para
este fim (Figura 1). As lâminas do omaso foram alcançadas pelo óstio retículo-omasal
após a introdução da mão do experimentador, portando o alicate, através da cânula
ruminal.
21
O fragmento do rúmen foi subdivido em duas frações. Uma fração foi
imediatamente preservada em solução tampão fosfato (PBS = 0,79 g de NaCl; 0,233g
de Na
2
HPO
4
; 0,0524 g de NaH
2
PO
4
; H
2
O qsp 100 ml) ajustado a 0,1 M e pH 7,4, sendo
resfriado para posterior análise macroscópica. O outro fragmento de rúmen e o
fragmento de omaso foram fixados em Líquido de Bouin por 22 horas. Após a fixação
os tecidos foram preservados em álcool 70°GL até o processamento histológico.
Figura 1 Instrumento utilizado para realização das biópsias de lâminas do omaso.
3.4.1 Macroscopia do rúmen
As variáveis morfológicas macroscópicas avaliadas foram: número de papilas
por cm
2
de parede, área média das papilas, comprimento e largura média das papilas,
área estimada total do rúmen.
As mensurações morfológicas dos fragmentos previamente preservados em
PBS foram realizadas efetuando-se a contagem do número de papilas ruminais
presentes em cada fragmento. Doze papilas foram seccionadas na base com auxílio de
tesoura cirúrgica, colocadas em uma placa de Petri, juntamente com o fragmento sem
papilas e suas imagens foram digitalizadas por um scanner (HP Deskjet F380 All-in-
One). Ao lado da placa de Petri foi colocado uma escala de 1 cm para ser digitalizada
juntamente com as papilas e o fragmento, permitindo posterior calibração do software
de análise de imagens. As áreas das imagens digitalizadas foram estimadas através de
um programa de análise de imagens UTHSCSA Image Tool (software livre), conforme
Resende Júnior (1999), modificado por Daniel et al. (2006).
A estimativa da área do fragmento (AF) foi feita pela seguinte equação:
22
AF = (área de parede – área da base das papilas) + (número de papilas * área média das
papilas).
A área da base de cada papila foi assumida como tendo um valor médio 0,002
cm
2
(Daniel et al., 2006). A área total do rúmen (ATR) foi calculada pelo modelo
proposto por estes mesmos autores, pela seguinte equação:
ATR: área do rúmen = 26604,7*(área do fragmento/área de parede do fragmento) +
29718,0.
Dividindo-se o número total de papilas do fragmento pela área de parede do
fragmento foi obtido o número de papilas por cm
2
. O comprimento e a largura média
de cada papila foram determinados pelo software UTHSCSA Image Tool.
3.4.2 Microscopia
As mensurações microscópicas avaliadas foram: comprimento, largura e área
das papilas ruminais; espessura total do epitélio, espessura da camada de queratina e
espessura da camada não queratinizadas do epitélios ruminal e omasal; e índice
mitótico (IM) da camada basal.
Para a determinação do IM das células da camada basal dos epitélios do rúmen
e do omaso foi utilizada a coloração de Hematoxilina-Eosina. As lâminas foram
imersas em xilol por 20 minutos para serem desparafinizadas e em seguida foram
imersas em uma série decrescente de álcool (absoluto, 90º, 80º, 70º GL) para
reidratação, deixando dois minutos em cada solução. Foram então imersas em um
frasco contendo hematoxilina por dois minutos e, em seguida, colocados em banho de
água de água corrente por 25 minutos. Então, as lâminas foram imersas em eosina por
30 segundos. Outra série de álcool em concentrações crescentes foi utilizada para
desidratar o material, deixando as lâminas dois minutos em cada álcool. As lâminas
foram banhadas duas vezes em xilol, por dois minutos, e montadas utilizando-se uma
camada de bálsamo do Canadá, superpondo-se uma lamínula de vidro em cada lâmina.
Com auxílio de microscópico óptico em aumento de 400 vezes, foram
contados os núcleos de todas as células da camada basal do epitélio de revestimento
em todas as áreas que este esteja bem delimitado e todas as células com núcleo
apresentando figuras mitóticas. Esse procedimento foi executado por três avaliadores e
o valor médio entre os avaliadores calculado. O IM foi calculado dividindo-se o
23
número de células apresentando figuras mitóticas pelo número total de núcleos
contados.
As espessuras do epitélio total e da camada de queratina foram determinadas
em cortes corados com Tricrômico de Masson. Imagens de quatro campos por lâmina
foram capturadas por câmara fotográfica acoplada em microscópico óptico com
aumento de 400x. Uma imagem de lâmina com escala foi capturada para posterior
calibração do software de processamento de imagem. Em seguida, as imagens foram
processadas no software UTHSCSA Image Tool (o mesmo utilizado nas avaliações
macroscópicas). Foi mencionada a área ocupada por queratina, epitélio total e pela
diferença dos dois, área de epitélio sem queratina e o comprimento de epitélio de cada
campo fotografado. A relação entre área de queratina ou área de epitélio total ou área
de epitélio sem queratina pelo comprimento, obteve-se a largura média de cada item
avaliado e assim feito uma média dos quatro campos fotografados. A espessura total do
epitélio e da camada de queratina, a espessura das camadas não queratinizadas foi
calculada por diferença.
3.5 Análises estatísticas
A espessura total, a espessura da camada de queratina e a espessura das
camadas não queratinizadas dos epitélios ruminal e omasal; o índice mitótico da
camada basal dos epitélios ruminal e omasal foram analisados como medidas repetidas
pelo procedimento MIXED do pacote de análises estatísticas SAS, de acordo com o
seguinte modelo:
Y
ijk
= μ + a
i
+ β
j
+ aβ
ij
+ γ
k
+ βγ
jk
+ e
ijk
;
onde μ : média geral; a
i
: efeito aleatório de vaca (i = 1 à 4); β
j
: efeito fixo de
compartimento (j = rúmen ou omaso); aβ
ij
: efeito da interação entre vaca e
compartimento (termo de erro usado para testar o efeito de compartimento); γ
k
: efeito
fixo de tratamento (k = 1 à 7); βγ
jk
: efeito da interação ente compartimento e
tratamento; e
ijk
: resíduo (termo de erro usado para testar o efeito de tratamento e a
interação entre compartimento e tratamento). As estruturas de covariâncias testadas
foram: simetria composta, auto regressiva de primeira ordem e não estruturada. Aquela
com maior o valor para o critério de informação de Akaike foi utilizada.
O consumo de matéria seca; a concentração ruminal total e individual de
AGV; a área, o comprimento e a largura das papilas ruminais determinadas
24
macroscopicamente; o número de papilas/cm
2
da parede ruminal; e a área do rúmen
foram analisados pelo procedimento MIXED do pacote de análises estatísticas SAS, de
acordo com o seguinte modelo:
Y
ij
= μ + a
i
+ β
j
+ e
ij
;
onde μ : média geral; a
i
: efeito aleatório de vaca (i = 1 à 4); β
j
: efeito fixo de
tratamento (j = 1 à 7); e
ij
: resíduo, assumido independente e identicamente distribuído
em uma distribuição normal com média zero e variância σ
2
. As médias dessas mesmas
variáveis foram comparadas pelo teste de Tukey.
O índice mitótico do rúmen e omaso foram comparados por regreção linear
pelo procedimento REG e a hipótese da inclinação da reta ser igual a 1 foi testada pelo
informe TEST, ambos do programa estatístico do SAS.
25
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
As dietas experimentais (Tabela 1) apresentavam teores de carboidratos
não fibrosos (CNF) compatíveis com simulações de dietas pré-parto, baseada
em forragem e com dietas lactacionais de alta energia, baseada em concentrado
e forragem. Teoricamente a transição da dieta de forragem para a dieta de
forragem com concentrado reflete a mudança que ocorre quando a dieta de
transição é introduzida no pré-parto de vacas leiteiras, visando adaptação do
epitélio ruminal à maiores taxas fracionais de produção de AGV. O período de
jejum simula eventual queda de ingestão de matéria seca (IMS) que ocorre no
peri-parto e o período de realimentação simula a introdução de dieta lactacional
de alta energia no pós-parto. Entretanto, a baixa IMS (Tabela 2; Figura 2)
apresentada pelos animais principalmente no período de realimentação não é
compatível com animais em início de lactação, uma vez que os animais
utilizados no experimento apresentavam baixa demanda metabólica por estarem
não gestantes e não lactantes. É sabido que o epitélio ruminal responde
positivamente à introdução de dietas com maiores teores de energia (Dirksen,
1984; Melo, 2007; Teófilo et al., 2009), mas a resposta omasal à esta situação
não é conhecida.
A ingestão de matéria seca (IMS) e de NDT foram maiores quando
passados 18 dias de introdução da dieta mais energética (P<0,05), resultado já
esperado por haver maior concentração de nutrientes por unidade de matéria
seca ingerida na dieta com concentrados. O período de jejum parece ter sido
deletério à retomada da IMS, pois aos 18 dias de realimentação a IMS ainda
não havia atingido o mesmo nível dos 18 dias de introdução da dieta energética
antes do jejum, refletindo o que acontece no pós-parto de vacas leiteiras que
tiveram queda de IMS no peri-parto. Vazquez-Añon et al. (1994) observaram,
em experimento com nove vacas secas gestantes, a diminuição na IMS dois dias
antes do parto atingindo no dia do parto uma redução de 60% da IMS em
relação a matéria seca ingerida três dias antes. A ingestão de IMS no pós-parto
26
aumenta gradativamente atingindo um pico entre dez e 14 semanas de lactação
(NRC, 1989).
Tabela 1 Composição das dietas utilizadas nos períodos experimentais.
Dieta
Composição
Forragem Forragem+concentrado
MS
1
(%) 39,3 47,1
FDN
2
(% da MS) 47,0 36,8
MM
3
(% da MS) 3,8 4,0
EE
4
(% da MS) 3,9 2,7
PB
5
(% da MS) 9,2 11,1
CNF
6
(% da MS)
NDT
7
(% da MS)
36,1
48,3
45,4
59,2
1
MS – matéria seca;
2
FDN - Fibra em detergente neutro;
3
MM - matéria mineral;
4
EE – extrato etéreo;
5
PB - proteína bruta;
6
CNF – Carboidratos não fibrosos estimados pela
equação: 100 – (%PB+%FDN+%EE+%MM)
7
NDT- nutrientes digestíveis totais, estimado de
acordo com NRC (2001).
27
Tabela 2 Ingestão de matéria seca, concentração de ácidos graxos voláteis e morfologia ruminal de vacas não gestantes e não
lactantes.
Período
Erro Padrão
P
18 F 4C 18C JEJUM 4R 12R 18R
IMS (Kg.dia
-1
) 6,0b 6,8ab 8,4a 0,0c 5,1b 6,6b 7,1ab 0,7 < 0,001
NDT (Kg.dia
-1
) 2,78b 3,48ab 4,39a 0,0c 2,92ab 3,70ab
3,98a 0,4 < 0,001
Concentração de AGV (mM) 106,36 148,45 115,58 7,0 77,53 64,69 68,38 9,6 <0,001
Acetato (mM) 76,80ab
83,84a 78,13a 5,5e 46,54cd
44,17d
48,71bc
7,9 <0,001
Propionato (mM) 18,6ab 23,9a 23,3a 1,0c 23,5a 14,1b 12,8b 2,5 <0,001
Butirato (mM) 12,31 40,74 14,20 0,53 7,48 40,74 6,83 10,1 0,180
Relação acetato propionato 4,28b 3,50b 3,37b 5,70a 2,01c 3,40b 3,84b 0,4 <0,001
Área de rúmen (m
2
) 5,10 6,63 5,08 5,95 5,55 6,05 6,00 0,7 0,607
Numero de papilas/cm
2
48,20 74,90 53,05 50,58 54,93 62,05 60,60 16,0 0,888
Área de papilas (cm
2
) 0,15 0,19 0,15 0,22 0,16 0,18 0,18 0,02 0,215
Comprimento de papilas (cm
2
) 0,56 0,66 0,48 0,66 0,49 0,55 0,54 0,07 0,122
Área/comprimento de papilas (cm) 0,27d 0,51bcd
1,40a 0,72bc 0,84b 0,33d 0,33cd 0,14 < 0,001
18 dias de silagem de milho (18F); 4
0
18o dia de alimentação com 50% silagem de milho e 50 % concentrado com base na matéria seca (4C
e 18C respectivamente), 72 horas de jejum e 4
o
, 12
o
e 18
0
dias de realimentação com 50% de silagem e 50% de concentrado (4R, 12R e 18R
respectivamente).
a, b, c, d
,
e
Médias com a mesma letra na linha não diferem significativamente pelo Teste de Tukey (α=0,05%)
28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
kg.dia
-1
18 DIAS DE SILAGEM DE MILHO
4 DIAS 18 DIAS
50% SILAGEM + 50% DE CONCENTRADO
3 DIAS
JEJUM
4 DIAS 12 DIAS 18 DIAS
50% SILAGEM + 50% DE CONCENTRADO
Figura 2 Média diária de ingestão de MS (■) e de NDT (●) ao longo do período experimental de vacas não gestantes e não
lactantes alimentadas com 18 dias de silagem de milho; 4 e 18 dias de alimentação com 50% silagem de milho e 50 %
concentrado com base na matéria seca; 72 horas de jejum; e 4, 12 e 18 dias de realimentação com 50% de silagem e 50% de
concentrado.(P < 0,001 para efeito de período de experimental)
29
A concentração de AGV foi maior no quarto dia de alimentação concentrada,
provavelmente pela mudança da dieta, havendo maior aporte de carboidratos de alta
fermentabilidade e por não ter um rúmen adaptado com superfície absortiva
compatível com a nova quantidade de AGV produzida (Figura 3). Passados 18 dias da
introdução da dieta energética há de se esperar que o rúmen tenha se adaptado (Melo,
2007; Resende Júnior et al., 2006a), portanto, apesar da dieta ser a mesma, a IMS e
ingestão de NDT serem semelhantes, houve menor concentração de AGV no fluido
ruminal, refletindo provavelmente uma maior taxa fracional de absorção. A ausência
de substrato fermentável durante o jejum explica a queda na concentração de AGV no
fluido. Com a realimentação houve menor concentração de AGV no fluido do que no
período de introdução da dieta, apesar da ingestão de MS e de NDT terem sido
semelhantes. Pode ser que 72 horas de jejum não tenham sido suficientes para que o
rúmen perdesse sua capacidade absortiva, portanto no período de realimentação ainda
haveria uma superfície absortiva compatível com a produção de AGV. Isso reforçaria a
hipótese de que, apesar de haver queda na IMS no peri-parto, a dieta de transição
introduzida antes do parto é eficiente para a adaptação do epitélio ruminal, propiciando
melhor capacidade absortiva no pós-parto. Teófilo et al. (2009), trabalhando com vacas
leiteiras em período de transição, encontrou, no pós-parto, maior superfície absortiva
no rúmen de vacas que receberam dieta com alto teor de CNF, nas três semanas
anteriores ao parto. Anderson et al. (1999) e Reynolds et al. (2004) que desaconselham
a dieta de transição por entender que o jejum do peri-parto causa uma volta do epitélio
ruminal ao estágio anterior ao encontrado antes da dieta de transição parecem estar
equivocados.
A concentração de propionato foi mais alta quando a dieta foi mudada de
forragem para concentrado. Dietas baseadas em forragem apresentam altos teores de
FDN (Tabela 1). Como são carboidratos lentamente degradáveis o pH
30
Figura 3 Concentração de ácidos graxos voláteis (AGV) total (♦), no rúmen de vacas não gestantes e não lactantes, alimentadas
com 18 dias de silagem de milho; 4 e 18 dias de alimentação com 50% silagem de milho e 50 % concentrado com base na
matéria seca; 72 horas de jejum; e 4, 12 e 18 dias de realimentação com 50% de silagem e 50% de concentrado. (P < 0,001 para
efeito de período experimental)
31
do ambiente ruminal fica mais alto, favorecendo as bactérias celulolíticas cuja rota
metabólica é mais voltada para a produção de acetato. Com a introdução da dieta com
carboidratos rapidamente fermentáveis a própria elevação na concentração ruminal de
AGV propicia diminuição do pH ruminal, o que favorece a proliferação de bactérias
amilolíticas, cuja rota metabólica é mais voltada para propionato (De Gregorio et al.,
1982). Essa dinâmica reflete na mudança da relação acetato/propionato (Tabela 2),
que é diretamente proporcional ao pH ruminal e é um indicador do padrão de
fermentação e do equilíbrio do ambiente ruminal. Apesar de não ter sido mensurado o
pH ruminal, é conhecido que o maior determinante do pH é a concentração de AGV
(Pereira e Armentano, 2000). Portanto, o comportamento da concentração de AGV
nesse experimento pode ser considerada inversamente proporcional ao comportamento
do pH ruminal e da relação acetato:propionato.
Não foi detectada diferença entre os períodos experimentais na área total
estimada do rúmen. A estimativa da área total leva em consideração os valores da área
(Figura 4) e do número de papilas nos fragmentos obtidos por biopsia, onde também
não foram detectadas diferenças estatísticas entre os períodos experimentais. Os
valores de mensurações macroscópicas da extensão da superfície absortivas não estão
condizentes com a estimativa microscópica do índice mitótico (Figura 5), que diferiu
entre os períodos e refletiu a lógica de proliferação do epitélio em função do estímulo
direto e indireto (Sakata et al., 1980) de AGV sobre o desenvolvimento do epitélio.
Resende Júnior et al. (2006a) também detectaram diferença no índice mitótico de
papilas ruminais de vacas submetidas à duas freqüências de alimentação concentrada.
Entretanto, não detectaram diferença na área e comprimento das papilas. A única
variável que os autores relataram diferença foi a relação área/comprimento, a qual
reflete a largura das papilas. Semelhantemente, no presente experimento foi encontrada
diferença entre os períodos experimentais na relação área/comprimento das papilas do
rúmen. Como relatado por Resende Júnior et al. (2006a), falhas na técnica de
mensuração macroscópica podem ter levado à não detecção de diferenças que
refletissem fielmente o comportamento da extensão da superfície absortiva do rúmen.
Outros autores tem tido sucesso em mensurar eficientemente a extensão da superfície
absortiva pela técnica usada no presente experimento (Teófilo et al, 2009; Melo, 2007).
A média da largura das papilas do rúmen das vacas, medidas pela relação
área/comprimento, aumentou à medida que se elevou o nível de energia da dieta. A
largura média das papilas foi maior aos 18 dias de alimentação de forragem com
32
concentrado, mostrando que houve estímulo para aumento da área de absorção dessas
papilas, semelhantes ao relatado por Resende Júnior et al. (2006a) que encontraram
maior largura de papilas no dia 12 após o aumento nos níveis de energia da dieta. Após
o jejum, as papilas apresentaram diminuição em sua largura chegando a valores
menores, mas não tão baixos como os encontrados quando os animais estavam sendo
alimentados apenas com forragem. Na realimentação, houve recuperação da largura
das papilas, mas diferentemente do ocorrido com o índice mitótico, o aumento não foi
contínuo como era de se esperar, podendo refletir imprecisões nas mensurações
conforme discutido anteriormente.
33
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
Área (cm
2
), comprimento (cm) e área/comprimento (cm)
18 DIAS DE SILAGEM DE MILHO
4 DIAS 18 DIAS
50% SILAGEM + 50% DE CONCENTRADO
3 DIAS
JEJUM
4 DIAS 12 DIAS 18 DIAS
50% SILAGEM + 50% DE CONCENTRADO
Figura 4 Área (●), comprimento (■) e área/comprimento (▲) das papilas do rúmen de vacas não gestantes e não lactantes,
alimentadas com 18 dias de silagem de milho; 4 e 18 dias de alimentação com 50% silagem de milho e 50 % concentrado com
base na matéria seca; 72 horas de jejum ; e 4, 12 e 18 dias de realimentação com 50% de silagem e 50% de concentrado. (P <
0.001 para efeito de período experimental para área/comprimento, P = 0,12 para comprimento e P = 0,22 para área)
34
A espessura da camada queratinizada do epitélio do rúmen foi maior do que a
do epitélio do omaso (Tabela 3). Entretanto, não houve diferença na espessura de
epitélio total e na espessura das camadas não queratinizadas, entre os dois
compartimentos. É de se esperar que o epitélio do omaso apresente menor espessura
de camada queratinizada uma vez que a relação superfície digesta nesse compartimento
é muito superior do que a do rúmen (Daniel et al., 2006), possibilitando então maior
abrasividade da digesta sobre a mucosa das lâminas do omaso e conseqüentemente
maior descamação da queratina e menor espessura da camada de queratina. A
conhecida desidratação do conteúdo do omaso em relação ao conteúdo ruminal
(Becker et al., 1963) também pode favorecer essa abrasividade, bem o estreito espaço
dos recessos interlaminares e a movimentação das lâminas do omaso. A semelhança
entre as camadas não queratinizadas do epitélio podem indicar que a resposta de
proliferação celular pode ser desencadeada por estímulos comuns aos dois
compartimentos.
O índice mitótico da camada basal do epitélio do rúmen foi maior que o da
camada basal do epitélio do omaso (Tabela 3). Daniel et al. (2007), estudando o
estômago de animais de abatedouro encontrou maior média de IM para o omaso em
comparação com o rúmen. Entretanto, esses autores nesse estudo não conheciam e não
tinham controle da dieta e do período que cada animal consumia. Os animais poderiam
estar ingerindo dietas com diferentes níveis de energia durante tempos diferentes. Isso
poderia levar à inconsistências de valores uma vez que a média é obtida de animais
com padrões alimentares diferentes.
35
Figura 5 Correlação entre índice mitótico do rúmen e do omaso de vacas mestiças não
gestantes e não lactantes. IM do omaso = 0.8705X + 0,0281IM rúmen; r
2
= 0,66;
P<0,01.
O índice mitótico do omaso teve correlação positiva com o do rúmen (Figura
5). Isso fornece mais uma evidência de que os fatores estimuladores de proliferação
celular do omaso são semelhantes aos do rúmen. Esse comportamento também foi
relatado de animais de abatedouro (Daniel, et al., 2007).
O comportamento do índice mitótico, de ambos os compartimentos, ao longo
do período experimental refletiu o esperado em relação ao aporte de energia da dieta
(Figura 6). O maior índice mitótico ocorreu com quatro dias de introdução da dieta
com maior nível de energia, tanto no rúmen como no omaso, antes e depois do jejum.
Goodlad et al. (1981) observaram aumento nas células da camada basal do epitélio do
rúmen, que passou de 0,58% em dieta com apenas forragem para 1,20% no quarto dia
de mudança de dieta de forragem para concentrado. Após esse pico no índice mitótico
com quatro dias, observou-se uma diminuição no IM no dia 18 de alimentação de
forragem mais concentrado acordando com Goodlad (1981) que deixou os animais na
dieta de concentrado por mais 62 dias e observou que o IM retornou ao padrão
semelhante ao encontrado quando os animais estavam sendo alimentados apenas com
forragem.
36
A interação significativa entre compartimento e dieta pode indicar que a
resposta ao estímulo proliferativo é diferente entre os dois compartimentos. Apesar de
seguirem na mesma direção, parece que o omaso responde mais agudamente ao
estímulo positivo e negativo de proliferação celular. Sendo assim, a resposta
proliferativa é mais rápida no omaso quando se introduz a dieta de alta energia, mas
também a queda na divisão celular é mais aguda quando estimulada pelo jejum. Não
foram encontrados outros dados na literatura comparando a resposta omasal com a
resposta ruminal ao estímulo proliferativo da energia da dieta e ao estímulo involutivo
do jejum.
Tabela 3 Índice mitótico, espessura de queratina, do epitélio total e do epitélio sem
queratina do rúmen e omaso de vacas mestiças não gestantes e não lactantes.
Órgão
Rúmen Omaso EPM
1
P
Índice mitótico (%) 0,55 0,51 0,01 0,02
Queratina (µm) 76,43 56,23 4,33 < 0,01
Epitélio Total (µm) 352,94 342,71 17,43 0,674
Epitélio sem queratina (µm) 276,51 286,48 16,81 0,671
1
Erro padrão da média
37
Figura 6 Índice mitótico do omaso (●) e do rúmen (
) de vacas não lactantes e não
gestantes alimentadas com 18 dias de silagem de milho (18F); 4, 18 dias de
alimentação com 50% silagem de milho e 50 % concentrado com base na matéria seca
(4C e 18C respectivamente), 72 horas de jejum e 4, 12 e 18 dias de realimentação com
50% de silagem e 50% de concentrado (4R, 12R e 18R respectivamente). (P = 0,01
para interação entre órgãos e períodos).
38
5 CONCLUSÃO
A semelhança nas espessuras das camadas não queratinizadas e a correlação
positiva entre o índice mitótico da camada basal do epitélio do rúmen e do omaso,
indicam que os estímulos de divisão celular desencadeados pelo teor de energia da
dieta atuam simultaneamente nos dois compartimentos.
O omaso, entretanto, parece responder mais rapidamente ao estímulo
proliferativo da energia da dieta e ao estímulo involutivo do jejum, quando comparado
com o rúmen
.
39
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