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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
ANÁLISE CITOGENÉTICA DE PEIXES DOS GÊNEROS: Astyanax,
Moenkhausia E Bryconops PROVENIENTES DAS REGIÕES DE
UBERLÂNDIA-MG E MONTE DO CARMO-TO.
Luana Pereira dos Santos
UBERLÂNDIA-MG
2010
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
ANÁLISE CITOGENÉTICA DE PEIXES DOS GÊNEROS: Astyanax,
Moenkhausia E Bryconops PROVENIENTES DAS REGIÕES DE
UBERLÂNDIA-MG E MONTE DO CARMO-TO.
Aluna: Luana Pereira dos Santos
Orientadora: Dra. Sandra Morelli
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de
Uberlândia como parte dos
requisitos para obtenção do
Título de Mestre em Genética e
Bioquímica (Área Genética).
UBERLÂNDIA-MG
2010
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iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
S237a
Santos, Luana Pereira dos, 1984-
Análise citogenética de peixes dos gêneros: Astyanax,
Moenkhausia e Bryconops provenientes das regiões de
Uberlândia-MG e Monte do Carmo-TO / Luana Pereira dos
Santos. - 2010.
63 f.: il.
Orientador: Sandra Morelli.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Uberlândia,
Programa de Pós-Graduação em Genética e Bioquímica.
Inclui bibliografia.
1. Peixe - Citogenética - Teses. 2. Citogenética animal -
Teses. I. Morelli, Sandra. II. Universidade Federal de
Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em Genética e
Bioquímica. III. Título.
CDU: 597-115
Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação
iv
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
ANÁLISE CITOGENÉTICA DE PEIXES DOS GÊNEROS: Astyanax,
Moenkhausia E Bryconops PROVENIENTES DAS REGIÕES DE
UBERLÂNDIA-MG E MONTE DO CARMO-TO.
Aluna: Luana Pereira dos Santos
COMISSÃO EXAMINADORA
Presidente: Profa. Dra. Sandra Morelli
Examinadores:
Prof°. Dr° Paulo César Venere (UFTM)
Prof°. Dr° Roberto Ferreira Artoni (UEPG)
Data da Defesa: 26/02/2010
____________________________________________
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Sandra Morelli
v
Confio no Senhor de todo o meu
coração e não dependo do meu
próprio entendimento. Reconheço
o Senhor em todos os meus
caminhos e ELE me dirige os
passos.
vi
Dedico aos meus pais e
ao meu amado esposo.
vii
Agradecimentos
Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento – CNPq, pela bolsa
de mestrado, à FAPEMIG e CAPES pelos auxílios concedidos;
Ao Laboratório de Citogenética de Peixes do Instituto de Genética e
Bioquímica da Universidade Federal de Uberlândia, pela oportunidade e infra-
estrutura necessária para a realização dos experimentos, coletas e viagens;
A Professora Dra. Sandra Morelli, pela orientação, amizade, companheirismo
e pela confiança a mim dedicada principalmente em me receber de tão longe;
A todos os professores da Pós-Graduação em Genética e Bioquímica pelos
ensinamentos durante as disciplinas e à Coordenação do Programa na pessoa do
Secretário Gerson Fraissat por toda ajuda e orientação fornecida (Paz);
A Universidade Federal do Tocantins, na pessoa da amiga Luciana Oliveira e
do professor Gilvan pela ajuda, amizade e por nos cederem gentilmente o
laboratório para a realização do processamento dos peixes;
Aos membros da banca examinadora pelas contribuições neste trabalho;
Ao professor Oscar Shibatta da Universidade Estadual de Londrina pela
identificação dos exemplares;
Ao José Clidenor (Pé) técnico do laboratório pela amizade e toda ajuda
durante as coletas;
Aos queridos amigos do Laboratório Alessandra, Vanessa, Robson, Dany,
Lívia, Naiara, Sabrina e Aurélio pela ajuda nas saídas de campo e apoio durante o
desenvolvimento deste trabalho, pelos ótimos momentos de alegria;
Ao Sr. Estácio proprietário da Fazenda Taboquinha por nos tê-la cedido para
as coletas;
A todos os colegas de outros laboratórios sempre presentes pelos
corredores, empréstimo de equipamentos e notificações por e-mails
especialmente às amigas Ana Carolina, Kelly e Luciana Calábria;
Ao laboratório de Citogenética da UNESP de Botucatu na pessoa do
professor Fausto Foresti, Cláudio Oliveira e especialmente as amigas Patrícia
Elda e Débora Diniz por me receberem gentilmente e pela ajuda;
viii
Sou especialmente grata:
A Deus pelo cuidado inefável e por ter colocado em meu caminho todas as
pessoas maravilhosas que contribuíram significativamente para a realização
desta;
À minha mãe Erlinda que sempre foi a pessoa mais importante em toda
minha formação com toda sua ajuda e exemplo de perseverança. Amo muito
você! (seria impossível expressar em palavras toda minha gratidão);
Ao meu querido e amado esposo Fernando pela inestimável ajuda nas
coletas, companheirismo, compreensão, amor e cuidado! Te amo!
Às minhas irmãs Karina e Vielka.
ix
Lista de Figuras
Figura 1 - Localização geográfica da Fazenda Taboquinha................................... 2
Figura 2 - Mapa mostrando a localização do Córrego dos Caetano. ..................... 3
Figura 3 – Astyanax fasciatus do Córrego dos Caetano ......................................31
Figura 4 – Astyanax sp do Córrego Taboquinha...................................................32
Figura 5 – Astyanax bimaculatus do Córrego Taboquinha....................................33
Figura 6 – Bryconops sp do Córrego Taboquinha.................................................34
Figura 7 – Moenkhausia oligolepis do Córrego Taboquinha. Cariótipo.................47
x
Índice – Sumário
Apresentação......................................................................................................................1
Fundamentação Teórica
1 Considerações Gerais Sobre os Peixes Neotropicais ...........................................4
1.1 Aspectos Taxonômicos da Família Characidae ...................................................5
1.2 Aspectos Citogenéticos da Família Characidae ...................................................6
1.2.1 Bandamentos Cromossômicos........................................................................9
1.3 Cromossomos B em peixes...............................................................................12
1.4 Referências.......................................................................................................16
2 Estudos citogenéticos em Astyanax fasciatus, de Uberlândia-MG, Astyanax sp, A.
bimaculatus e Bryconops sp de Monte do Carmo-TO. .............................................26
2.1 Introdução ........................................................................................................28
2.2 Material e Métodos...........................................................................................30
2.3 Resultados........................................................................................................30
2.4 Discussão .........................................................................................................34
2.5 Referências Bibliográficas................................................................................37
3 Estudo citogenético em Moenkhausia oligolepis de Monte do Carmo-TO.........43
3.1 Introdução ........................................................................................................44
3.2 Material e Métodos...........................................................................................45
3.3 Resultados ........................................................................................................46
3.4 Discussão .........................................................................................................47
3.5 Referências Bibliográficas................................................................................49
Apresentação
A família Characidae é o grupo mais complexo entre os Characiformes e
compreende a maioria dos peixes de água doce da América do Sul. Sua
distribuição geográfica compreende desde a fronteira do México com os EUA
até a Argentina. O gênero Astyanax é o mais estudado citogeneticamente
dentro dessa família, conhecidos popularmente por lambaris e piabas. Ao lado
destes, outros como Moenkhausia e Bryconops anteriormente considerados
membros da subfamília Tetragonopterinae (sensu Gery), estão listados como
Incertae Sedis devido a suas características de difícil diagnose. Durante cerca
de 30 anos estes peixes têm sido alvo de estudos cromossômicos, que os
caracterizaram como um grupo com grande diversidade cariotípica.
Recentemente, o advento de técnicas de citogenética molecular forneceu
novos dados sobre a biologia evolutiva do grupo que possibilitaram a análise
de antigos problemas, como sua difícil classificação taxonômica. O gênero
Astyanax está intimamente relacionado ao gênero Moenkhausia, havendo
hipóteses deste último ter conservado um possível cariótipo ancestral deste
grupo. Vários trabalhos realizados com Moenkhausia e Astyanax evidenciaram
a presença de cromossomos supranumerários, contribuindo com os estudos de
origem e evolução destes elementos. Diante do exposto, através da aplicação
de técnicas citogenéticas são apresentados dados cariotípicos para Astyanax
aff. fasciatus coletados no Córrego dos Caetano pertencente à bacia do Rio
Paranaíba município de Uberlândia-MG, as demais espécies, Astyanax aff.
bimaculatus, Astyanax sp., Bryconops sp. e Moenkhausia cf. oligolepis são
oriundas do Córrego Taboquinha (Figura 1a), bacia do Rio Tocantins, em
Monte do Carmo-TO, já na divisa com Porto Nacional-TO. Nesta região o Rio
Tocantins foi afetado pela construção de uma Hidrelétrica localizada em
Lajeado-TO e ocasionou a mudança do leito do rio, formando um enorme lago.
Apesar de próximo dessa região afetada pela usina, a nascente do Córrego
Taboquinha (Figura 1b) está localizada numa serra ainda muito preservada. O
ponto de coleta fica a aproximadamente 5 Km abaixo dessa nascente. À
jusante desse ponto o córrego Taboquinha deságua no Ribeirão Ponte de
Pedra, que deságua no Ribeirão Conceição, em seguida no Ribeirão Areias
que, finalmente tem sua fóz no Rio Tocantins (Figura 1b). Na época da
estiagem esta nascente seca e o local de coleta passa a ser a cabeceira do
2
córrego. As análises cromossômicas apresentadas neste trabalho forneceram
dados adicionais sobre a ictiofauna desta região nunca antes estudada,
evidenciando variações que podem ser ocasionadas por um isolamento
geográfico destas populações nas cabeceiras deste tributário.
Figura 1 – Localização geográfica da Fazenda Taboquinha. Em a temos um detalhe da carta
geográfica mostrando a localização geográfica da Fazenda Taboquinha. Em b. observa-se uma
foto de satélite retirada do software on line Google indicando o ponto de coleta (B), a nascente do
Córrego Taboquinha (A), Ribeirão Ponte de Pedra (C), Ribeirão Conceição (D), Ribeirão Areias (E) e
o Rio Tocantins (F).
A
B
C
D
E
F
a
b
3
Figura 2 - Mapa mostrando a localização do Córrego dos Caetano.
4
CAPÍTULO I
Fundamentação Teórica
1 Considerações Gerais Sobre os Peixes Neotropicais
Os peixes são os vertebrados mais antigos e numerosos do planeta,
com aproximadamente 25.000 espécies habitando quase todos os ambientes
aquáticos (LOWE-McCONNELL, 1999; NELSON, 2006).
Constituem aproximadamente metade do número total de espécies de
vertebrados reconhecidos vivos. Há descrição de um número estimado de
27.977 espécies de peixes válidas comparado a 26.734 tetrapodas (NELSON,
2006).
Além do grande número de espécies, outro aspecto relacionado com os
peixes é a importância que representam para as populações humanas, pois
constituem a dieta principal de muitas comunidades, ocupam um papel
importante na economia de muitas nações e representam uma significativa
fonte de trabalho nas sociedades que dependem em grande medida da
atividade pesqueira. Em relação com a diversidade biológica, os peixes formam
também um grupo a parte dos demais vertebrados, pois apresentam formas
com os mais diversos hábitos (NIRCHIO; OLIVEIRA, 2006).
De acordo com Reis et al. (2003) a fauna de peixes de água doce
Neotropical é muito rica, constituída por 71 famílias e 4.475 espécies descritas.
Além disso, uma estimativa sugere que cerca de 8.000 espécies de peixes de
água doce podem existir no Neotrópico, aproximadamente 25% de todas as
espécies do mundo (SCHAEFER, 1998). Vari e Malabarba (1998) concordam
com este número e mostraram que toda esta diversidade ocorre somente em
cerca de 0,003% da água do planeta. Somente na América do Sul, Bohlke et al.
(1978) já estimavam mais de 2.500 espécies distribuídas em 60 famílias.
Estes dados são impressionantes considerando que o número de
espécies de água doce no mundo inteiro é estimado em cerca de 13.000. A
diferença entre o número de espécies descritas e o número atual de espécies,
dificulta muitos estudos, incluindo os genéticos e citogenéticos, uma vez que
muitas espécies ainda não têm nem mesmo seu nome científico (OLIVEIRA et
al., 2009).
5
A ordem Characiformes compreende um dos maiores grupos de peixes
conhecidos na região Neotropical, como as piranhas, os tetras e os lambaris.
São aproximadamente 1.674 espécies distribuídas entre 18 famílias e em
aproximadamente 270 gêneros. Destas espécies, por volta de 209 são
africanas e o restante é distribuído do Sudoeste da América do Norte, América
Central e América do Sul (NELSON, 2006).
Nesta ordem a família Characidae é a maior e mais complexa,
compreendendo a maioria dos peixes de água doce no Brasil, com espécies
variando consideravelmente em tamanho, peso, forma, alimentação e
comportamento, com destaque para representantes dos gêneros Astyanax,
Moenkhausia e Bryconops (BRITSKI et al., 1988; MOREIRA-FILHO et al.,
2004).
1.1 Aspectos Taxonômicos da Família Characidae
A sistemática, estudo das relações evolutivas entre os organismos, é a
área da biologia na qual convergem todas as demais áreas. Considerando que
a história evolutiva dos organismos está associada às mudanças climáticas e
geográficas ocorridas durante a história do planeta, elucidar as relações
filogenéticas entre os seres vivos permite o estudo de sua evolução bem como
se torna base para estudos biogeográficos e ecológicos (NIRCHIO; OLIVEIRA,
2006).
A família Characidae é representada por cerca de 776 espécies, as
quais eram distribuídas em 30 subfamílias e 250 gêneros com características
altamente heterogêneas entre si (BRITSKI et al., 1988). Apenas aquelas
subfamílias para as quais existem evidências de monofiletismo foram mantidas
como tal, porém, Reis et al. (2003) listam uma enorme diversidade de
caracídeos como Incertae Sedis devido a falta de evidências consistentes de
monofiletismo entre seus representantes. Diante disso, a família passou então
a ser considerada como composta por apenas 12 subfamílias (LIMA et al.,
2003). Sendo assim, dos antigos Tetragonopterinae, 620 espécies distribuídas
em 88 gêneros são na atualidade consideradas Incertae Sedis, incluindo
grupos abundantes em espécies como os gêneros Astyanax, Moenkhausia,
Bryconamericus, Hemigrammus, Hyphessobrycon e Bryconops (REIS et al.,
2003).
6
Muitos desses gêneros estiveram até recentemente incluídos na
subfamília Tetragonopterinae (WEITZMAN; MALABARBA, 1998; REIS et al.,
2003) que nos dias atuais compreendem apenas duas espécies do gênero
Tetragonopterus (T. argenteus e T. chalceus) (LIMA et al., 2003).
Lucena (1993) já relatava que as relações de parentesco entre
Characidae e outros Characiformes estavam sendo prejudicadas por causa da
falta de conhecimento das relações filogenéticas dentro da família.
O gênero Astyanax corresponde à maior unidade taxonômica
peviamente localizada na subfamília Tetragonopterinae (GERY, 1977 apud
LIMA et al., 2003). Contém 85 espécies e subespécies nominais descritas e
distribuídas amplamente na região Neotropical do Sul dos Estados Unidos ao
norte da Argentina (LIMA et al., 2003). Astyanax necessita de uma ampla
revisão para melhor definição taxonômica de suas formas e muitas espécies
devem ainda ser descritas. De acordo com Melo (2000), as espécies de
Astyanax são, em geral, similares morfologicamente e sua separação tem sido
historicamente difícil.
1.2 Aspectos Citogenéticos da Família Characidae
Devido a ampla diversidade e aos escassos estudos realizados até o
momento, o conhecimento que se tem da ictiofauna é reduzido. Este problema
tem sido agravado nos últimos tempos pelo fato do ser humano estar
danificando de forma irreparável o ambiente em muitas áreas, conduzindo a
extinção de espécies ainda nem conhecidas no mundo científico. Por estas
razões, se torna cada vez mais importante e urgente a necessidade de estudar
as espécies presentes em nosso ecossistema, envolvendo a maioria dos
aspectos possíveis, de maneira que as futuras gerações disponham de
informações que os permita aproveitar esse recurso ao máximo (NIRCHIO;
OLIVEIRA, 2006).
Os estudos citogenéticos provêem informações que contribuem para
uma melhor identificação das diferentes espécies, contribuindo para o
conhecimento da estrutura, organização molecular e comportamento dos
cromossomos, assim como para o mapeamento de genes específicos
(NIRCHIO; OLIVEIRA, 2006).
7
As análises do cariótipo possuem importantes aplicações e contribuem
para o entendimento da evolução e filogenia cromossômica, possibilitando a
realização de estudos citotaxonômicos, principalmente nos casos de espécies
crípticas e de complexos de espécies. Estas análises, se estendida a vários
exemplares coletados em diferentes localidades, e com o emprego de
diferentes técnicas de marcação cromossômica, podem caracterizar espécies
de forma mais completa, possibilitando entender a ocorrência de casos de
polimorfismos cromossômicos e diferentes citótipos restritos a uma dada
localidade (KASAHARA, 2009).
Hoje, as informações citogenéticas estão avaliadas para 475 espécies
de Characiformes, 318 de Siluriformes, 48 de Gymnotiformes, 199 de água
doce que não pertencem a super Ordem Ostariophysi, e 109 de peixes
marinhos (OLIVEIRA et al., 2009).
A evolução do cariótipo na família Characidae é caracterizada pela
redução no número cromossômico relativamente pouco frequente e inversões
que alteram a morfologia estrutural dos cariótipos (OLIVEIRA et al., 1988). Uma
diversidade significativa da composição morfológica dos cariótipos em função
dos valores diplóides relativamente estáveis confirmaria que a evolução
cromossômica em Characidae está ligada às inversões pericêntricas (FALCÃO;
BERTOLLO, 1985).
Dentro do gênero Astyanax, estudos citogenéticos comprovaram a
ocorrência de diferentes números diplóides em condições de alopatria
(MORELLI et al., 1983; PAGANELLI; MOREIRA-FILHO, 1986; BERTOLLO et
al., 1986; KANTEK et al., 2007).
Neste gênero, a espécie Astyanax scabripinnis, a mais estudada,
apresenta um alto grau de variação citogenética, mostrando uma grande
diversidade cromossômica. Esta espécie apresenta um número diplóide de
2n=46, 48 e 50, onde podem ser encontradas diversas formas de
cromossomos supranumerários, casos de triploidia natural, além de variações
no número e na morfologia cromossômicas (MOREIRA-FILHO et al., 1978;
MOREIRA-FILHO; BERTOLLO, 1991; SALVADOR; MOREIRA-FILHO, 1992;
SOUZA; MOREIRA-Filho, 1995; VICENTE et al., 1996; MIZOGUCHI;
MARTINS-SANTOS, 1997; MAISTRO et al., 1998; MIZOGUCHI; MARTINS-
SANTOS, 1998; MESTRINER et al., 2000; NÉO et al., 2000a; NÉO et al.,
8
2000b; ALVES; MARTINS-SANTOS, 2002; FERNANDES; MARTINS-SANTOS,
2003; FERRO et al., 2003; MOREIRA-FILHO et al., 2004; PAZZA, 2005;
KANTEK et al., 2007).
Estes dados, associados a estudos morfológicos utilizando a análise de
variáveis canônicas, sugerem que A. scabripinnis é um complexo de espécies
na maioria das vezes representadas por populações isoladas nas cabeceiras
de pequenos tributários de grandes bacias hidrográficas (MOREIRA-FILHO;
BERTOLLO, 1991; MIZOGUCHI; MARTINS-SANTOS, 1998; KAVALCO;
MOREIRA-FILHO, 2003; MOREIRA-FILHO et al., 2004; FERNANDES;
MARTINS-SANTOS, 2005; ARAÚJO; MORELLI, 2006; VICARI et al., 2008).
No complexo Astyanax altiparanae-bimaculatus, estudos citogenéticos
têm mostrado grandes variações como diferença em suas fórmulas cariotípicas
e no número de cromossomos marcados pela prata (Ag-RONs) que não afetam
o número diplóide de 2n = 50 (MOREIRA-FILHO, 1989; PACHECO et al., 2001;
FERNANDES; MARTINS-SANTOS, 2004; DOMINGUES et al., 2007). A.
altiparanae é uma designação recente, dada às populações do Alto rio Paraná
do grupo conhecido anteriormente como A. bimaculatus (GARUTTI; BRITSKI,
2000). Esta espécie possui a descrição mais antiga e é considerada a mais
comum do gênero. A localidade tipo, América Meridional, é incerta, como
também sua distribuição geográfica.
Astyanax fasciatus por sua vez, também é considerada como um
complexo de espécies diversificado cromossomicamente, apresentando
distintos citótipos com variantes específicas (JUSTI, 1993; PAZZA et al., 2008).
Moenkhausia apresenta 65 espécies válidas amplamente distribuídas
nas bacias dos rios Cis-Andinos Neotropicais, exceto na Patagônia, com sua
maior diversidade ocorrendo na bacia Amazônica e Guianas (LIMA et al.,
2003). Recentemente, uma nova espécie de Moenkhausia foi encontrada nos
tributários do Rio Paraguai no Brasil tendo sido descrita como M. forestii
(BENINE et al., 2009).
O gênero Bryconops contém 16 espécies e é amplamente distribuído
das planícies cis-Andinas da América do Sul ao Orinoco para as bacias do
Paraná-Paraguai, incluindo muitas bacias costeiras das Guianas e do Brasil
(LIMA et al., 2003).
9
Em outros táxons de peixes sul-americanos, estudos citogenéticos têm
contribuído para uma melhor compreensão das relações sistemáticas,
caracterizando grupos de peixes com cariótipos bem conservados (PAULS;
BERTOLLO, 1983, 1990; NAVARRETE; JULIO Jr., 1997; BRASSESCO et al.,
2004).
1.2.1 Bandamentos Cromossômicos
Nos últimos anos, a citogenética se expandiu significativamente,
sobretudo a partir da aplicação de técnicas de bandamento, as quais fornecem
importantes resultados na comparação de espécies intimamente relacionadas.
Alguns caracteres citogenéticos, como o número e a distribuição de
regiões organizadoras de nucléolos (Ag-RONs), também podem ajudar a
entender a evolução cariotípica nos peixes. Na família Cichlidae, Feldberg
(1983) observou que em algumas espécies a localização das Ag-RONs é
encontrada no primeiro par do complemento, enquanto em outras espécies a
RON foi observada em outro cromossomo do complemento, caracterizando a
ocorrência de rearranjos envolvendo essa região.
Os peixes neotropicais podem apresentar dois padrões de distribuição
de Ag-RONs: em alguns grupos esses sítios estão localizados em um único par
de cromossomos (Ag-RONs simples), enquanto outros grupos os apresentam
em vários cromossomos do cariótipo (Ag-RONs múltiplas) (MOREIRA-FILHO,
1983).
Existe uma enorme diversidade de comportamento das regiões
organizadoras de nucléolos entre os peixes, existindo espécies cujas Ag-RONs
se mostram de forma regular e uniforme e espécies que apresentam um
heteromorfismo dessas regiões tanto intra como interindividualmente
(MORELLI, 1981). Em algumas espécies de peixes, a ocorrência de Ag-RONs,
banda C positiva (heterocromática), tem possibilitado um melhor entendimento
do seu significado em termos de estrutura cromossômica e participação
evolutiva tornando-se necessários para estudos mais detalhados (PAZZA et al.,
2008).
Juntamente com as Ag-RONs, a heterocromatina (Banda C) é de grande
importância para o estudo da diversificação cariotípica nos peixes Neotropicais,
constituindo-se metodologias fundamentais para caracterização citogenética
10
básica de quaisquer organismos, pois permitem a identificação de
cromossomos particulares, revelando informações muito úteis para estudos
taxonômicos e evolutivos (AMORES et al., 1993).
Uma das características principais da heterocromatina é a ausência da
atividade gênica e a chamada replicação tardia do DNA, isto é, a
heterocromatina inicia sua replicação depois da eucromatina no final da fase S
do ciclo celular. Ela se encontra constantemente condensada durante todo o
ciclo celular e em todas as células do indivíduo. Geralmente se distribui em
blocos nos cromossomos, com seqüências de DNA altamente repetitivas
(GUERRA, 1988). A quantidade de heterocromatina constitutiva varia entre as
espécies, porém se localiza preferencialmente nas regiões pericentroméricas e
teloméricas, podendo também estar presente nas regiões intersticiais e nos
cromossomos sexuais (SUMNER, 1990).
Brown, em 1966, fez uma revisão do que se conhece sobre heterocromatina
e concluiu haver pelo menos 2 tipos distintos, que ele chamou de
heterocromatina constitutiva e heterocromatina facultativa. A constitutiva se
caracteriza por permanecer condensada durante todo o ciclo celular e em todas
as células do indivíduo; aparece em ambos os homólogos, na mesma posição
e com o mesmo tamanho; não contém genes estruturais, ou só muito
excepcionalmente tem sido localizados genes nesse tipo de heterocromatina; é
o local onde se situa, se não todo, ao menos a maior parte do DNA satélite,
embora a heterocromatina constitutiva não seja formada exclusivamente de
DNA satélite.
No complexo Astyanax encontramos vários trabalhos relatando que as
marcações de heterocromatina foram utilizadas para estudos de evolução,
polimorfismo, diversificação das espécies, dimorfismo sexual e caracterização
populacional (PAZZA, 2005; ARTONI et al., 2006; KAVALCO et al., 2007;
KANTEK et al., 2007; DOMINGUES et al., 2007; VICARI et al., 2008).
Além das técnicas citogenéticas citadas acima, novas técnicas estão
sendo usadas para estudo dos peixes Neotropicais. As análises de DNAs
satélites, por exemplo, está fornecendo dados importantes no que diz respeito
à composição da heterocromatina e a origem dos cromossomos
supranumerários e sexuais (MESTRINER et al., 2000; JESUS et al., 2003;
VICENTE et al., 2003; PAZZA, 2005).
11
Até a década de setenta os estudos citogenéticos em peixes eram mais
limitados quanto às informações mais precisas do genoma desse grupo. A
citogenética clássica era a mais difundida, empregando a coloração
convencional com Giemsa, o bandamento C e a localização das Ag-RONs. Na
década seguinte, com o advento da citogenética molecular, começaram a
surgir informações mais detalhadas, principalmente com o advento da técnica
de hibridação “in situ” fluorescente (FISH). Assim, a utilização das sondas de
rDNA 45S, rDNA 18S e rDNA 5S, bem como de DNAs repetitivos distintos, se
tornou uma importante ferramenta para o estudo da composição do material
genético e a estrutura dos cromossomos dos peixes. Estas sondas
representam importantes marcadores em estudos populacionais, e vêm sendo
empregadas com grande freqüência (DINIZ, et al., 2009).
A associação da citogenética clássica com a molecular possibilitou um
grande desenvolvimento da citogenética de peixes nos últimos 20 anos,
principalmente no Brasil, fornecendo informações valiosas sobre a estrutura e
evolução do cariótipo, cromossomos sexuais, cromossomos B, polimorfismos
cromossômicos, heterocromatina e regiões organizadoras de nucléolos
(GALETTI Jr.; MARTINS, 2004).
A citogenética molecular é baseada principalmente na técnica de FISH,
onde uma sonda de DNA marcada é hibridada sobre alvos citológicos
(cromossomos metafásicos, núcleos interfásicos, fibras de cromatina
extendidas, etc) (GUERRA, 2004).
O uso de fluorocromos GC-específicos já foi utilizado na identificação de
regiões organizadoras de nucléolos (NORs), no entanto, sabe-se atualmente
que nem todo sítio GC
+
, assim como nem toda marcação com nitrato de prata
nos cromossomos é seguramente um sítio portador de rDNA (ARTONI et al.,
2008; dentre outros).
Alguns trabalhos descrevem a combinação de corantes fluorescentes.
Tais combinações podem fornecer padrões de bandas complementares no
mesmo cromossomo, uma vez que um determinado fluorocromo tem
especificidade para um tipo de base de DNA e o outro para bases diferentes
(SOUZA et al., 1996; MANTOVANI, 2001).
Assim, a utilização de tais metodologias na citogenética de peixes é
bastante promissora, pois possibilita um conhecimento mais refinado da
12
estrutura molecular dos cromossomos, podendo ser também aplicadas em
estudos citogenéticos evolutivos e no melhor entendimento das relações
existentes entre espécies e populações.
1.3 Cromossomos B em peixes
Cromossomos B, acessórios ou cromossomos supranumerários têm sido
encontrados em várias espécies de animais e plantas (JONES; REES, 1982;
CAMACHO et al., 2000). São caracterizados por ocorrência esporádica;
variação numérica; não essencialidade para os organismos que os possuem,
estando presentes em alguns indivíduos da população, mas não em todos e
não possuem homologia com os cromossomos do cariótipo normal das
espécies dos quais provavelmente surgiram acompanhados por um mecanismo
evolutivo que os converte num verdadeiro reservatório de variabilidade
genética (JONES; REES, 1982; REJÓN et al., 1987; MAISTRO, 1996;
CAMACHO et al., 2000).
Segundo Néo et al. (2000b) indivíduos da espécie Astyanax scabripinnis
que habitam regiões onde as condições ambientais são mais favoráveis podem
ter maior tolerância com respeito a presença de cromossomos B, favorecendo
sua fixação assim como condições polimórficas nas populações.
Morfologicamente, os cromossomos B são, em geral, menores do que os
cromossomos do complemento normal A, contudo, cromossomos de diferentes
tamanhos e morfologias têm sido descritos, incluindo cromossomos B grandes
com tamanho similar ao maior par cromossômico da espécie (JONES, 1991).
Estes cromossomos não mostram segregação mendeliana, o que resulta
em instabilidade tanto na mitose quanto na meiose, e em vários modos de
transmissão (JONES, 1991). Eles podem constituir uma forma alternativa de
organização do material genético e serem considerados verdadeiros parasitas,
permanecendo exclusivamente nas populações pelo seu mecanismo distintivo
de transmissão (REJÓN et al., 1987).
Sua ocorrência pode ser freqüentemente relacionada a eventos
esporádicos e os cromossomos adicionais pode ser um traço individual entre
os indivíduos de uma população. Em geral eles são caracteres comuns dentro
da população ou espécie, tornando-se fixados naquela população de geração a
geração (VENERE, et al., 1999).
13
No entanto, nem todos os cromossomos B respondem a todas estas
características, existindo casos onde há a presença de regiões organizadoras
de nucléolos nos B e a correta disjunção na anáfase mitótica. Sendo assim, a
definição que atende melhor às suas características é que são cromossomos
dispensáveis que não se recombinam com os cromossomos A e seguem sua
própria trajetória evolucionária (BEUKEBOOM, 1994; MAISTRO, 1996;
CAMACHO et al., 2000).
Existe a idéia de que a origem de alguns cromossomos B tenha se dado
através de isocromossomos (MESTRINER et al. 2000; ARTONI et al. 2006),
onde análise do complexo sinaptonêmico permitiu observar um
emparelhamento sináptico entre o braço maior e o menor e a formação de um
anel na meiose (DUPLESSES; SPIES, 1993; DIAS, 1995).
Outra hipótese a respeito dos mecanismos de origem dos cromossomos
B sugere que um novo cromossomo tenha se originado devido a não disjunção
ou outro tipo de rearranjo. Este fato foi seguido por alteração gradual deste
cromossomo através de sucessivas mutações e modificações estruturais até
uma completa perda de homologia e capacidade de parear com o cromossomo
A original (CARVALHO et al., 2008).
Segundo Oliveira et al. (2009) em recente revisão, cromossomos
supranumerários foram descritos para 38 espécies de peixes Neotropicais. E
quase todas as informações relativas aos cromossomos supranumerários,
vieram de peixes coletados em áreas afetadas pela poluição ou construção de
represas, ou ainda sujeito a uma grande mudança na temperatura e volume da
água, que podem provocar um tipo diferente de estresse ao peixe. Os autores
sugerem que os cromossomos B são co-ou bi-produtos de um estresse ao qual
o peixe esta sujeito sendo originado por mutações de cromossomos normais e
que foram mantidos nas populações como um polimorfismo cromossômico.
Carvalho et al. (2008) encontraram na literatura científica publicada, e
não publicadas, como teses, dissertações, monografias e resumos de
congressos a ocorrência de cromossomos B em 61 espécies, distribuídas em
16 famílias de sete diferentes ordens e distintas bacias hidrográficas, sendo
que a maior abundancia deles encontra-se na ordem Characiformes onde
foram encontrados em 31 espécies de seis famílias diferentes: Anostomidae,
Characidae, Crenuchidae, Curimatidae, Parodontidae e Prochilodontidae.
14
Os cromossomos B podem ser encontrados em organismos haplóides
ou diplóides, estudos com técnica de bandamento C revelaram que estes
cromossomos podem se apresentar quase todo heterocromático, mas para
muitas espécies, a exemplo de Moenkhausia sanctaefilomenae (FORESTI et
al. 1989), foram encontrados cromossomos B eucromáticos e
heterocromáticos.
Em M. sanctaefilomenae, análises de FISH confirmaram a presença de
regiões organizadoras de nucléolos nos cromossomos B desta espécie
(SOBRINHO et al., 2006). Nas espécies deste gênero, são encontradas
variações no padrão de Ag-RONs, onde há casos de Ag-RONs múltiplas
(FORESTI et al., 1989) bem como simples (PORTELA-CASTRO; JULIO Jr.,
2002).
Uma alta freqüência de cromossomos supranumerários é encontrada em
espécies do gênero Moenkhausia, variando em número, morfologia e
distribuição. Em M. sanctaefilomenae Foresti et al. (1989) encontraram uma
variação de 1 a 8 microcromossomos em ambos os sexos, ao passo que nesta
mesma espécie Portela-Castro et al. (2001) encontraram de 0 a 2
cromossomos B, presentes apenas nos machos.
Nenhum efeito fenotípico tem sido encontrado até agora relacionado a
presença de cromossomos supranumerários. Em diferentes populações de A.
scabripinnis foi observado macrocromossomos B restritos às fêmeas
(MAISTRO et al., 1992; MIZOGUCHI; MARTINS-SANTOS, 1997),
microcromossomos B somente nos machos (ROCON-STANGE; ALMEIDA-
TOLEDO, 1993) bem como em fêmeas (MIZOGUCHI; MARTINS-SANTOS,
1997). Foi encontrado também de 1 a 2 macrocromossomos B em uma
população de A. eigenmanniorum (TORRES-MARIANO; MORELLI, 2008) e 1
microcromossomo B em uma população natural de A. altiparanae
(HASHIMOTO et al., 2008).
A classificação taxonômica animal baseada na filogenia não é apenas
uma classificação informativa e útil, mas que também espelha as relações
evolutivas entre os organismos. Para que se obtenha sistematicamente um
táxon natural é necessário que o grupo em questão seja monofilético, ou seja,
o grupo deve possuir um ancestral comum recente a todos os seus
15
descendentes, isso implica em características exclusivas compartilhadas pelo
grupo (FUTUYMA, 1997).
Algumas bacias hidrográficas estão isoladas das demais, tornando-se
assim, barreiras geográficas para alguns grupos de peixes e se constituindo em
vários isolados que favorecem a especiação (FUTUYMA, 1997). Gery (1968,
apud MOREIRA-FILHO, 1983) considera que entre as bacias hidrográficas, as
do Leste do Brasil evidenciam um isolamento mais acentuado, existindo casos
em que algumas conexões podem ser permanentes entre os sistemas de
drenagem, submergindo imensas áreas nas cheias e constituindo rotas de
migração para formas generalizadas de peixes.
Lowe McConnell (1969) ressalta que o tamanho absoluto de certos
sistemas de rios é fator importante, pois pode permitir que muitas espécies
evoluam dentro do próprio sistema, desenvolvendo-se em isolamento
geográfico nas cabeceiras dos tributários. As barreiras entre as populações
podem ser físicas, como a velocidade do fluxo da água ou tipo do leito do rio;
químicas, como o tipo de água (águas pretas e brancas do sistema Amazônico,
por exemplo) ou mesmo bióticas e sua existência acaba por dificultar a
passagem de uma espécie de uma bacia para a outra, criando algumas das
situações necessárias ao isolamento reprodutivo e consequente especiação.
Estes aspectos zoogeográficos em conjunto aumentam em importância
o estudo da citogenética de peixes, sobretudo quando a investigação se faz em
nível populacional. Ao se estudar a citogenética de alguns peixes, se pode
fazer um levantamento do padrão cromossômico das espécies, dos tipos de
cromossomos existentes e com isso estudar os possíveis modos da evolução
cariotípica (PAZZA; KAVALCO, 2007).
16
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26
CAPÍTULO 2
2 Estudos citogenéticos em Astyanax fasciatus, de Uberlândia-MG,
Astyanax sp, A. bimaculatus e Bryconops sp de Monte do
Carmo-TO.
Santos LP¹; Morelli, S¹
¹Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
Resumo:
A família Characidae é a maior e mais complexa dentre os Characiformes,
compreendendo a maioria dos peixes de água doce do Brasil, com espécies
variando consideravelmente em tamanho, peso, forma, alimentação e
comportamento. Recentemente, várias espécies deste grupo foram listadas
como Incertae Sedis devido a falta de evidências consistentes de
monofiletismo. Atualmente essa família é composta por 12 subfamílias, além
daqueles grupos citados acima. Com o objetivo de levantar informações que
possam ser úteis para auxiliar na compreensão dessa complexa ictiofauna,
foram realizadas análises citogenéticas em espécies de Astyanax aff. fasciatus,
provenientes da região de Uberlândia-MG, Astyanax sp, Astyanax aff.
bimaculatus e Bryconops sp da região de Monte do Carmo-TO. A. fasciatus
apresentou número diplóide igual a 46 cromossomos e um sistema de Ag-
RONs múltiplas, as quais se mostraram positivamente coradas pela
Cromomicina A
3
(CMA
3
). Astyanax sp e Astyanax bimaculatus apresentaram 50
cromossomos, sendo que no primeiro se verificou a presença de 0 a 6
cromossomos B e um sistema de Ag-RONs simples. Estes sítios se mostraram
também heterocromáticos. Além disso, conspícuas marcações
heterocromáticas centroméricas e pericentroméricas também foram
observadas, Astyanax bimaculatus apresentou sistema de Ag-RONs múltiplas
com até três pares marcados, alguns dos quais também CMA
3
+
. O bandamento
C revelou marcas pericentroméricas em quase todos os cromossomos.
Bryconops sp apresentou 2n = 48 cromossomos, Ag-RONs simples coincidindo
com as marcações de CMA
3
e blocos heterocromáticos centroméricos. Esses
resultados vão de encontro à idéia de que o grupo anteriormente tratado como
Tetragonopterinae engloba uma diversidade de grupos bastante acentuada o
que é um reflexo de sua natureza polifilética.
27
Palavras-chaves: Characidae, cariótipo, bandamento, cromomicina.
Abstract:
The family Characidae is the largest and most complex among the
Characiformes, including the majority of freshwater fish in Brazil, with species
varying considerably in size, weight, shape, diet and behavior. Recently, this
group was listed as Incertae Sedis due to lack of consistent evidence of
monophyly going to have only 12 subfamilies beyond those cited groups above.
With the objective of raising information that can be useful to assist in the
understanding of this complex ictiofauna, cytogenetic analysis were performed
on species of Astyanax aff. fasciatus from the region of Uberlândia-MG,
Astyanax sp, Astyanax aff. bimaculatus and Bryconops sp the region of Monte
do Carmo-TO. A. fasciatus showed diploide number of 46 chromosomes and a
system of multiple Ag-NORs, which proved to positively stained Chromomycin
A
3
(CMA
3
). Astyanax sp and Astyanax bimaculatus showed 50 chromosomes,
being that in the first one if it verified the presence from 0 to 6 chromosomes B
and a system Ag-NORs simple. These small farms if had also shown
heterochromatic. Moreover, conspicuous centromeric and pericentromeric
heterochromatics markings had been also observed, Astyanax bimaculatus
presented system Ag-NORs multiple with up to three pairs marked, some of
which also CMA
3
+
. C-banding revealed centromeric marks in almost all
chromosomes. Bryconops sp presented 2n = 48 chromosomes, Ag-NORs
simple coinciding with the markings CMA
3
and centromeric heterochromatic
blocks. These results go of meeting to the idea that the group previously treated
as Tetragonopterinae encompasses a diversity to groups sufficiently accented
what it is a consequence of its polifiletic nature.
Key-words: Characidae, karyotype, banding, chromomycin.
28
2.1 Introdução
Os Characiformes constituem um grupo composto por cerca de 12
famílias, apresentando uma grande amplitude de variações morfológicas.
Representantes desse grupo ocorrem em praticamente todos os ambientes de
água doce, sendo coletados com relativa facilidade na maioria dos cursos de
água, tanto pela abundância de espécies como pelo grande número de
espécimes (BRITSKY et al., 1988).
A família Characidae é uma das maiores e mais complexas entre os
peixes Neotropicais (NELSON, 2006). Além disso, existem diversos gêneros
ainda não bem caracterizados quanto às suas relações filogenéticas. Lima et
al. (2003) consideram vários gêneros “Incertae Sedis” em Characidae, dentre
os quais se encontram os gêneros Astyanax e Bryconops.
O gênero Astyanax corresponde à maior unidade taxonômica dos
antigos Tetragonopterinae, contendo 85 espécies e subespécies nominais
descritas e distribuídas amplamente na região Neotropical (LIMA et al., 2003).
Entretanto, esse número está subestimado, uma vez que várias novas
espécies tem sido descritas (HALUCH; ABILHOA, 2005; BERTACO; LUCINDA,
2005; BERTACO; LUCENA, 2006; MELO; BUCKUP, 2006; VARI; CASTRO,
2007; GARUTTI; VENERE, 2009), seja por constituírem táxons ainda
desconhecidos ou por fazerem parte de grupos maiores, mas com
diferenciação morfológica e que tem passado por revisões taxonômicas. A.
altiparanae, por exemplo, é uma designação recente, dada às populações do
Alto rio Paraná do grupo conhecido anteriormente como A. bimaculatus
(GARUTTI; BRITSKI, 2000).
Dentro do gênero Astyanax, os lambaris que compõem o grupo A.
altiparanae-bimaculatus, conhecidos popularmente por “lambaris do rabo
amarelo” ou “lambari relógio”, são caracterizados por apresentarem uma
mancha ovalada e escura na região umeral e outra na base da nadadeira
caudal. É composto por peixes com grande capacidade de se ajustar a
condições ambientais diferenciadas e com amplo espectro de interação, devido
a sua estrutura e densidade populacional (ORSI et al., 2004). O reflexo disso é
uma ampla distribuição geográfica do grupo, que se estende por praticamente
toda a região Neotropical (EIGENMANN, 1921 apud KAVALCO et al., 2009).
29
Segundo Garutti (1995) o gênero Astyanax tem uma distribuição
estruturada, sugerindo um grande nível de endemismo. Mesmo dentro de uma
mesma bacia hidrográfica há múltiplas formas com distribuição geográfica
relativamente restrita. Em vista disso, supõe-se que os lambaris não formem
um grupo uniforme, havendo variações de população para população,
provavelmente por esse grupo habitar uma grande variedade de
microambientes (GARUTTI; BRITSKI, 2000), embora seja mais bem sucedido
em habitats melhor preservados (ORSI et al., 2004). Portanto, espera-se que
populações destes lambaris apresentem estruturação genética ao longo de um
rio (LEUZZI et al., 2004), embora estudos anteriormente tenham indicado baixa
variabilidade entre populações dos rios Paraná e Iguaçu, devendo serem
mantidas no mesmo grupo, sob uma mesma denominação específica (PRIOLI
et al., 2002).
Os dados citogenéticos são potencialmente informativos sobre os
padrões evolutivos dos diferentes táxons de peixes de água doce Neotropicais.
Embora a variação cromossômica seja comum entre as espécies, os
mecanismos de fixação de rearranjos cromossômicos são ainda motivo de
muita discussão. Além disso, alguns caracteres interessantes tem sido
descritos no gênero Astyanax, como polimorfismos cromossômicos (PAZZA et
al., 2006) e cromossomos B (MOREIRA-Filho et al., 2004). Adicionalmente, os
dados sobre diferentes espécies podem contribuir com o conhecimento sobre a
evolução cariotípica do gênero e da família que de maneira geral ainda é
obscura.
Embora estudos prévios tenham caracterizado citogeneticamente várias
populações de Astyanax, ainda são escassas as análises de exemplares
provenientes das bacias dos rios da Região Norte do país, assim como
Bryconops que quase não possui estudos.
Com o intuito de fornecer dados citogenéticos recentes e
complementares aos já descritos, que possibilitem estudos posteriores
comparativos, foram realizadas análises cariotípicas em exemplares de A.
fasciatus, Astyanax sp., A. bimaculatus e Bryconops sp., os quais foram
analisados utilizando-se metodologias de coloração convencional, bandamento
cromossômico e fluorocromos.
30
2.2 Material e Métodos
Foram analisados 23 exemplares (15 machos e 8 fêmeas) de Astyanax
fasciatus, coletados no Córrego dos Caetano (18º44’56’’ S 048º 18’39’’W)
(bacia do Rio Paranaíba) na região de Uberlândia Minas Gerais, Brasil; 10
exemplares (6 machos e 4 fêmeas) de Astyanax sp, 32 exemplares (12
machos, 8 fêmeas e 12 com sexo indeterminado) de A. bimaculatus e 17
exemplares (9 machos e 8 fêmeas) de Bryconops sp, coletados no Córrego
Taboquinha (10º47’11.12’’S 48º13’16.57’’W) (bacia do Rio Tocantins) na região
de Monte do Carmo Tocantins, Brasil.
Os peixes foram identificados pelo Dr. Oscar Akio Shibatta da
Universidade Estadual de Londrina, onde foram depositados.
As preparações cromossômicas foram obtidas a partir de células do rim
anterior descrita por Bertollo et al. (1978) e Foresti et al. (1993).
A heterocromatina constitutiva foi obtida por meio da técnica descrita por
Sumner (1972). As Ag-RONs foram detectadas utilizando-se a técnica descrita
por Howell e Black (1980). As heterocromatinas ricas em bases GC foram
obtidas pela técnica de coloração com Cromomicina A
3
descrita por Schmid
(1980). A morfologia de cada cromossomo foi estabelecida conforme a
nomenclatura proposta por Levan et al. (1964).
2.3 Resultados
Astyanax fasciatus (Figura 3b), apresentou 2n = 46 cromossomos para
machos e fêmeas e fórmula cariotípica composta de 6 pares m, 11sm, 4st, 2a e
NF = 88 (Figura 3a). A detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo pelo
nitrato de prata (Ag-RONs), demonstrou um sistema múltiplo desses sítios, com
variabilidade no número de cromossomos marcados, observando-se até 10
marcações Ag-NORs
+
(Figura 3c). A análise dos padrões de heterocromatina
constitutiva pelo bandamento C mostrou blocos marcados na região telomérica
e as Ag-RONs se apresentaram banda C positivas (Figura 3d).
O emprego do fluorocromo CMA
3
evidenciou marcas teloméricas em
alguns cromossomos, sendo que alguns foram correspondentes aos cístrons
ribossômicos (Figura 3e).
31
Figura 3 – Astyanax fasciatus do Córrego dos Caetano. Cariótipo (a), exemplar (b), metáfases
indicando os sítios de Ag-NOR (c), bandamento C (d) e Cromomicina A
3
(e).
Astyanax sp (Figura 4b), apresentou 2n = 50 cromossomos, e cariótipo
composto por 8 pares m, 15sm, 2st e NF = 100 (Figura 4 a). Foi observada a
ocorrência de microcromossomos B em alguns indivíduos machos variando de
0 a 6 em 30% das metáfases analisadas, sendo que a maior freqüência
encontrada foi de 2 microcromossomos (Figura 4e). As análises das Ag-RONs
mostraram apenas um par cromossômico ativo (Figura 4c). O padrão de banda
C foi caracterizado por marcas centroméricas, pericentroméricas e uma
marcação telomérica coincidindo com a região AgNORs
+
(Figura 4d).
a)
b)
e)
d
c)
32
Figura 4 – Astyanax sp do Córrego Taboquinha. Cariótipo (a), exemplar (b). Metáfases indicando
os sítios de Ag-NOR (c), bandamento C (d) e os cromossomos B (e).
Os exemplares de A. bimaculatus (Figura 5b) apresentaram um número
diplóide modal de 50 cromossomos em ambos os sexos, constituído por 4
pares m, 13sm, 5st, 3a e NF = 94 (Figura 5a).
As análises das Ag-RONs mostrou mais de um cístron ribossômico ativo
com até três pares por célula (Figura 5c). O bandamento C revelou marcas
centroméricas em quase todos os cromossomos do complemento. Os blocos
localizam-se predominantemente em posição pericentromérica (Figura 5d).
Após tratamento com fluorocromo GC específico Cromomicina A
3
, algumas
destas regiões correspondentes às Ag-RONs mostraram-se intensamente
brilhantes além de outras regiões brilhantes não correspondentes a esses
sítios, como por exemplo, na região centromérica do primeiro par
cromossômico (Figura 5e).
c)
b)
e)
d)
a)
33
Figura 5 – Astyanax bimaculatus do Córrego Taboquinha. Cariótipo (a), exemplar (b), metáfases
indicando os sítios de Ag-RONs (c), o bandamento C (d) e Cromomicina A
3
(e).
Em Bryconops sp (Figura 6b), as análises citogenéticas mostraram 2n =
48 cromossomos, sendo o cariótipo composto por 2 pares m, 5sm, 3st, 14a e
NF = 68 (Figura 6a). A impregnação pelo nitrato de prata mostrou duas
marcações terminais nos braços curtos de dois cromossomos do tipo
subtelocêntricos, correspondentes ao par 8 (Figura 6c), evidenciando-se assim
Ag-RONs simples. O padrão de banda C evidenciou marcações nas regiões
centroméricas e teloméricas, marcando principalmente o centrômero dos
cromossomos acrocêntricos (Figura 6d). Após tratamento com o fluorocromo
GC específico Cromomicina A
3
(CMA
3
), observou-se regiões brilhantes
coincidentes às RONs e outras não correspondentes a esses sítios (Figura 6e).
e
)
d)
b)
a)
c)
34
Figura 6 – Bryconops sp do Córrego Taboquinha. Cariótipo (a), exemplar (b). metáfases indicando os
sítios de Ag-RONs (c), o bandamento C (d) e os sítios de Cromomicina A
3
(e).
2.4 Discussão
As informações citogenéticas disponíveis para o gênero Astyanax
mostram a existência de “complexos de espécies”, relativos à pelo menos três
grupos: A. scabripinnis (MOREIRA-FILHO; BERTOLLO, 1991); A. fasciatus
(JUSTI, 1993, PAZZA et al., 2006, 2008; KANTEK et al., 2008) e A. altiparanae
(FERNANDES; MARTINS-SANTOS, 2006). Nestes complexos são verificados:
alto grau de variabilidade; presença de cromossomos supranumerários ou Bs
(os quais podem também variar em tamanho e composição); polimorfismos de
blocos heterocromáticos e das regiões organizadoras de nucléolos (Ag-RONs).
A. fasciatus apresenta uma ampla variação cariotípica dentro dos
Astyanax. É caracterizada por uma variação entre populações, com citótipos
e)
d)
c)
b)
a)
35
que possuem de 2n = 45 a 2n = 48 cromossomos, bem como distintas fórmulas
cariotípicas os quais se adequam a este conceito de “complexo de espécie”
(JUSTI, 1993; CENTOFANTE et al., 2003; ARTONI et al., 2006; PAZZA et al.,
2008). Os exemplares aqui estudados apresentaram 46 cromossomos sem
diferenciação aparente entre machos e fêmeas, uma vez que apenas uma
fórmula cariotípica foi observada. Além disso, o primeiro par metacêntrico,
característico dos Characidae também se mostrou presente (SCHEEL, 1973;
MORELLI et al., 1983; PORTELA et al., 1988; DANIEL-SILVA; ALMEIDA-
TOLEDO, 2001; 2005). Por outro lado, houve variação no padrão de
distribuição das Ag-RONs, onde até 10 cromossomos mostraram-se marcados,
sendo que apenas alguns coincidiram com as regiões CMA
3
+
. Assim sendo,
faz-se necessário a utilização de outras técnicas de marcações utilizando
sondas 5S e 18S para confirmar os sítios das regiões organizadoras de
nucléolo nesta população.
Em acréscimo, como na maioria das espécies de Astyanax, Astyanax sp.
apresentou 50 cromossomos com similaridades com o cariótipo de outras
populações de Astyanax e, especialmente não evidenciou a presença de
nenhum par de cromossomos acrocêntricos, o que não é comum no gênero
Astyanax. O padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva apontou
fracas marcações centroméricas e pericentroméricas, além de um bloco
heterocromático de tamanho maior que os demais localizado na região
telomérica de um par submetacêntrico equivalente ao par 16, que
correspondeu à região responsável pela organização nucleolar.
Segundo Pazza e Kavalco (2007), a maioria das espécies de Astyanax
com número cromossômico conservado apresenta 2n = 50 cromossomos. Essa
informação aparentemente se refere a espécies de distribuição restrita,
endêmicas a certas bacias hidrográficas e com poucas amostragens ao longo
dos sistemas hidrográficos em que habitam.
A presença não obrigatória de elementos supranumerários tem sido
muito discutida nos dias atuais, principalmente em relação a sua relevância
evolutiva bem como influências nos organismos que os possuem. Embora
sejam cromossomos encontrados em uma ampla diversidade de organismos, o
gênero Astyanax tem mostrado variações em relação ao tamanho, número e
36
freqüência desses elementos (MIZOGUCHI; MARTINS-SANTOS, 1997; 1998a;
1998b).
A presença de microcromossomos supranumerários variando de 0 a 6
intraespecificamente e em um mesmo exemplar, pode indicar uma possível
estruturação genética desta população. Estudos adicionais sobre a composição
do DNA destes cromossomos são necessários para um melhor entendimento
sobre suas origens e função.
Em A. altiparanae os estudos cariotípicos iniciaram juntamente com as
primeiras pesquisas realizadas por grupos brasileiros envolvendo
cromossomos de peixes. As primeiras citações, entretanto, usam a
denominação A. bimaculatus para as populações do Alto rio Paraná (JIN;
TOLEDO, 1975; MORELLI et al., 1983), uma vez que a denominação A.
altiparanae fora criada apenas anos mais tarde (GARUTTI; BRITSKI, 2000).
Atualmente, estudos citogenéticos em várias populações no grupo A.
altiparanae-bimaculatus e espécies próximas têm mostrado uma
homogeneidade cromossômica quanto ao número diplóide e fórmula
cariotípica, quando comparado a outras espécies de Astyanax (MORELLI et al.,
1983; FERNANDES; MARTINS-SANTOS, 2004; FERNANDES; MARTINS-
SANTOS, 2006; DOMINGUES et al., 2007; PAMPONET et al., 2008).
Os presentes dados revelam que esta população do Estado do
Tocantins tem um cariótipo diferenciado em relação a outras regiões
brasileiras. No entanto apresenta alta similaridade cariotípica com as
populações do Estado da Bahia estudada por Pamponet e colaboradores em
2008, corroborando os dados de número, localização das NORs e morfologia
cromossômica (PAMPONET et al., 2008).
Os dados do presente trabalho corroboram dados prévios da biologia
dos “lambaris de rabo amarelo” com relação ao número 2n igual a 50
cromossomos, confirmando a predominância de ocorrência desse número
cromossômico para esta espécie.
Em Bryconops sp. o número cromossômico encontrado (2n = 48) e a
fórmula cariotípica semelhante, ou seja 2 pares m, 5sm, 3st e 14a são bastante
similares ao encontrado por Souza (2003) para Bryconops aff giacopinni do rio
Araguaia (2m+2sm+4st+16a). O autor também descreve a presença de vários
37
blocos heterocromáticos localizados nas regiões pericentroméricas dos
cromossomos acrocêntricos.
Estudos adicionais comparando estas populações com as de outras
bacias são necessários, bem como o emprego de técnicas moleculares mais
precisas que contribuam para uma melhor caracterização destas espécies e
para o melhor entendimento da origem e função destes cromossomos
adicionais.
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43
CAPÍTULO 3
3 Estudo citogenético em Moenkhausia oligolepis de Monte do
Carmo-TO.
Santos, LP¹; Morelli, S¹
¹Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
Resumo:
Várias espécies do gênero Moenkhausia já foram estudadas citogeneticamente
e a presença de cromossomos B é considerada uma interessante característica
nas espécies deste grupo. Estes elementos supranumerários dispensáveis que
não se recombinam com os cromossomos do complemento padrão A e
seguem seu próprio mecanismo evolucionário variam em número, morfologia e
distribuição. Este trabalho apresenta dados citogenéticos de uma população de
M. oligolepis pertencente à bacia do Rio Tocantins com 2n = 50 cromossomos,
distribuídos em 5 pares m, 16sm e 4 st e além do número diplóide modal, todos
os indivíduos apresentaram microcromossomos supranumerários variando de 0
a 10 em ambos os sexos. O padrão de banda C evidenciou blocos
heterocromáticos localizados principalmente na região pericentromérica e nos
microcromossomos. A impregnação por nitrato de prata usada para evidenciar
as regiões organizadoras de nucléolos (Ag-RONs), apontou uma variação no
padrão de distribuição desses sítios, sendo que alguns se mostraram positivos
e coincidentes quando corados pelo fluorocromo GC-específico cromomicina.
Palavras-chave: Moenkhausia, supranumerário, cromossomo, Tocantins.
Abstract:
Several species of the genus Moenkhausia were studied cytogenetically and B
chromosomes are considered as an interesting feature in species of this group.
These dispensable supernumerary elements that not recombine with the
standard karyotype and follow their own evolutionary mechanism vary in
number, morphology and distribution. In this study show cytogenetic data of a
population of Moenkhausia oligolepis belonging to the Tocantins River basin,
with 2n = 50 chromosomes , divided intro 5 pairs m, 16sm and 4st and beyond
44
the modal diploid number, all specimens, showed supernumerary
microchromosomes ranging from 0 to 10 in both sexes. The standard C-band
showed heterochromatic blocks located mainly in the pericentromeric and
regions of microchromosomes. The impregnation by silver nitrate (Ag-NORs),
used to reveal the nucleolar organizer regions showed a variation in the pattern
of distribution of these sites, some of which proved positive and consistent
when stained by the GC-specific chromomycyn.
Key-words: Moenkhausia, supernumerary, chromosome, Tocantins.
3.1 Introdução
Na família Characidae, os cromossomos Bs, ocorrem com relativa
freqüência. Estes são elementos que apresentam características diferenciadas
com relação ao número, tamanho, morfologia e distribuição relacionada ou não
ao sexo (PORTELA-CASTRO et al., 2001).
Segundo Futuyma (1997), animais aquáticos mostram uma maior
diversidade regional em regiões montanhosas onde há sistemas de rios
isolados e o isolamento geográfico de espécies de peixes nas cabeceiras dos
rios pode levar estas comunidades a processos evolutivos importantes,
culminando na especiação por alopatria. Além disso, sistemas de rios tropicais
de grande porte admitem que algumas espécies de peixes se isolem
geograficamente nas cabeceiras de seus tributários, através de barreiras
intrapopulacionais físicas, químicas ou bióticas, permitindo que estas evoluam
dentro do próprio sistema (LOWE-McCONNEL, 1969).
Portela et al. (1988) encontraram 2n = 50 cromossomos dos tipos meta e
submetacêntricos em Moenkhausia intermedia e Moenkhausia costae, e
sugerem que apesar deste gênero ser bem mais relacionado à Astyanax, ele
pode ter conservado um cariótipo ancestral entre os Tetragonopterinae.
Em Moenkhausia sanctaefilomenae, análise através da técnica de
hibridização fluorescente in situ (FISH), confirmou a presença de regiões
organizadoras de nucléolos (RONs) também localizados sobre os
cromossomos B (SOBRINHO et al., 2006), descrevendo o primeiro caso de
cromossomos B com genes ativos em peixes Neotropicais.
Percebe-se então que a evolução cariotípica dos peixes ainda precisa
ser mais amplamente analisada. São muitos os processos pelos quais os
45
cariótipos podem sofrer modificações, numéricas ou morfológicas, ao longo de
sua evolução. Além do mais, cada grupo pode ter sua evolução cariotípica
explicada por um processo diferente em que alguns se caracterizam por um
sistema mais variável ao passo que outros são explicados por modelos mais
conservadores em termos de números diplóides ou morfologia cromossômica
(OLIVEIRA et al., 2009).
Marcadores citogenéticos apresentam potencial informativo para vários
níveis sistemáticos, desde a avaliação dos níveis de variação genética até o
teste de hipóteses evolutivas em grandes grupos (NIRCHIO; OLIVEIRA, 2006).
Aqui visamos abordar aspectos da macro e microevolução cariotípica em uma
espécie do gênero Moenkhausia ainda não explorada sobre este aspecto.
3.2 Material e Métodos
Foram analisados 18 exemplares (6 machos, 6 fêmeas e 6 com sexo
indeterminado) de M. oligolepis, coletados no Córrego Taboquinha (bacia do
Rio Tocantins) (10º47’11.12’’S 48º13’16.57’’W) na região de Monte do Carmo-
TO.
Os peixes foram identificados pelo Dr. Oscar Akio Shibatta da
Universidade Estadual de Londrina, onde foram depositados.
As preparações cromossômicas foram obtidas a partir de células do rim
anterior como descrito por Bertollo et al. (1978) e Foresti et al. (1993). A
heterocromatina constitutiva foi evidenciada por meio da técnica de banda C
descrita por Sumner (1972), enquanto as regiões organizadoras de nucléolos
foram detectadas pelo emprego do nitrato de Prata coloidal (AgRONs) segundo
Howell e Black (1980). As heterocromatinas ricas em bases GC foram coradas
pela técnica de coloração com Cromomicina A
3
contracorada com Distamicina
segundo o protocolo de Schmid (1980). A morfologia de cada cromossomo foi
estabelecida conforme a nomenclatura proposta por Levan et al. (1964).
46
3.3 Resultados
Moenkhausia oligolepis (Figura 7b) apresentou 2n = 50 cromossomos
para machos e fêmeas como número diplóide modal e fórmula cariotípica
composta por 5 pares de cromossomos m, 16sm e 4st com número de braços
cromossômicos representados pelo número fundamental NF = 100 (Figura 7a).
Além dos cromossomos do complemento padrão, foram encontrados
cromossomos supranumerários em aproximadamente 80% das metáfases
analisadas variando de 0 a 10 por célula (Figura 7f-g). As AgRONs foram
caracterizadas por uma variação no número de cromossomos marcados
caracterizando um padrão múltiplo (Figura 7c-d). A análise da distribuição da
heterocromatina constitutiva pelo bandamento C no cariótipo mostrou blocos
marcados principalmente na região centromérica dos cromossomos do
complemento A, enquanto os microcromossomos se mostraram parcialmente
heterocromáticos (Figura 7e).
O emprego do fluorocromo CMA
3
evidenciou marcas teloméricas em
alguns cromossomos (Figura 7h), sendo que algumas foram correspondentes
aos cístrons ribossômicos verificados pela Prata.
47
Figura 7 – Moenkhausia oligolepis do Córrego Taboquinha. Cariótipo (a), exemplar (b), metáfases
indicando os sítios de Ag-NOR (c-d), o bandamento C (e), metáfases com 3 (f) e 10 (g) cromossomos B e
os sítios de Cromomicina A
3
(h).
3.4 Discussão
Várias espécies de Characidae apresentam populações pequenas,
sobretudo aquelas que representam táxons característicos de ambientes de
cabeceiras de rios ou ambientes de pequenos riachos. Castro (1999) ressalta
que muito da fauna das cabeceiras dos rios ainda está por ser descrita na
região Neotropical, e provavelmente será constituída de peixes de pequeno
porte.
Nesse contexto, a aplicação de técnicas de marcação cromossômica
diferencial em algumas espécies de peixes tem ajudado na caracterização de
vários grupos caracteristicamente habitantes de cabeceiras e pode ser de
grande valor na definição de muitas unidades taxonômicas ainda não descritas.
Especificamente em relação ao gênero Moenkhausia, o estudo dos
cromossomos B tem sido de grande valia no sentido de se buscar um melhor
h)
g)
f)
c)
d)
b)
a)
e)
48
entendimento dos mecanismos relacionados à sua origem (MAISTRO et al.,
2000).
As espécies M. sanctaefilomenae e M. oligolepis apresentam morfologia
semelhantes, como o olho vermelho e corpo prateado com mancha preta na
cauda. Segundo Lima et al. (2003), M. oligolepis ocorre nas Guianas e na bacia
dos Rios da Amazônia, enquanto M. sanctaefilomenae está distribuída nas
bacias dos Rios Parnaíba, São Francisco, Alto Paraná, Paraguai e Uruguai.
Análises detalhadas de M. oligolepis revelaram que novas espécies
similares ocorrem em simpatria na bacia do Rio Paraguai, sugerindo que esta
espécie corresponda a um complexo de espécies e não uma única espécie
(BENINE et al., 2009).
Foresti et al. (1989) encontraram uma variação de 1 a 8
microcromossomos em ambos os sexos de M. sanctaefilomenae, ao passo que
nesta mesma espécie Portela-Castro et al. (2001) encontraram de 0 a 2
cromossomos B, presentes apenas nos machos.
O número cromossômico de 2n=50 também foi encontrado em M.
intermedia e M. costae estudados por Portela et al. (1988). Esses autores
encontraram cromossomos do tipo meta e submetacêntricos e a presença de
um pequeno cromossomo supranumerário em M. intermedia e sugerem que
espécies deste gênero retiveram um provável cariótipo ancestral dos
Tetragonopterinae composto por 50 cromossomos M-SM. Os novos estudos
realizados nas espécies deste gênero poderão contribuir na validação desta
hipótese, pois no presente trabalho e em outros já realizados (PORTELA-
CASTRO; JULIO Jr., 2002; DOMINGOS, 2008) foram encontrados também
cromossomos do tipo ST, assim como um número cada vez maior de
supranumerários, o que poderia indicar um evento de quebras e rearranjos no
complemento padrão seguido do aumento de microcromossomos.
Em uma população de M. sanctaefilomenae, coletados no ribeirão
Araquá, região de Botucatu, SP foi encontrado 2n=50 e uma variação inter e
intra-individual de microcromossomos B com freqüência de 0 a 6, foi
encontrado também sítios de rDNA 18S e coloração diferencial após a
utilização de DAPI/CMA
3
nos cromossomos B desta espécie (SOBRINHO-
SCUDELER et al., 2008). Estes dados demonstram a alta diversificação
49
cromossômica neste grupo, particularmente quanto ao comportamento dos
cromossomos B.
Num estudo anterior nesta espécie de M. oligolepis aqui estudada,
Domingos (2008) coletou indivíduos do Rio Araguaia e também detectou 2n=50
cromossomos e a presença de até 3 cromossomos Bs nos machos, as
AgRONs se revelaram simples, ou seja, com apenas um par de cromosomos
marcado. Apesar da diferença na quantidade de cromossomos
supranumerários e no padrão de AgRONs, estes dados mostram-se
semelhantes aos encontrados no presente trabalho, confirmando o número e a
morfologia dos pares cromossômicos, as quais se diferiram apenas na
quantidade de cromossomos subtelocêntricos.
Dessa foram, o presente trabalho, mostra pela primeira vez dados
citogenéticos de M. oligolepis pertencente à bacia do Rio Tocantins e a
presença de até 10 microcromossomos nunca antes observada. Estes achados
podem estar relacionados às características intrínsecas de córregos de
cabeceira desta bacia, a qual possui uma riqueza populacional necessária de
estudos adicionais.
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