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CRISTIANO DIAS
Rosiglitazone pode causar lesão tubular renal em ratos
normais mas não em ratos hipercolesterolêmicos
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Mestre em ciências
Área de concentração: Nefrologia
Orientadora: Profª Drª Claudia Maria de Barros Helou
SÃO PAULO
2009
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CRISTIANO DIAS
Rosiglitazone pode causar lesão tubular renal em ratos
normais mas não em ratos hipercolesterolêmicos
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Mestre em ciências
Área de concentração: Nefrologia
Orientadora: Profª Drª Claudia Maria de Barros Helou
SÃO PAULO
2009
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Dias, Cristiano
Rosiglitazone pode causar lesão tubular renal em ratos normais mas não em
ratos hipercolesterolêmicos / Cristiano Dias. -- São Paulo, 2009.
...Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Departamento de Clínica Médica.
Área de concentração: Nefrologia.
Orientadora: Claudia Maria de Barros Helou.
Descritores: 1.Tiazolidinedionas/efeitos adversos 2.Taxa de filtração glomerular
3.Ratos Wistar 4.Hipercolesterolemia
USP/FM/SBD-380/09
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho a todos que de alguma forma contribuíram para
a sua elaboração.
Dedico também a meu filho, a minha mãe, a meus irmãos e a minha
namorada, pelo apoio que sempre me deram para nunca desistir, mesmo
nos momentos mais difíceis, pois, souberam me respeitar e valorizar, sem
contar, pelas horas em que furtei-lhes a atenção para a dedicação à
pesquisa e aos estudos, sem a qual não seria possível a conclusão de mais
esse objetivo.
Aos membros da minha família que me apoiaram em todos os
obstáculos.
A vocês o meu profundo respeito
AGRADECIMENTOS
Sobretudo, a Deus, Nosso Senhor, por ter me guiado e protegido
sempre, dando-me forças para persistir e acreditar que posso, e posso
porque tenho fé Nele.
Minha eterna gratidão a minha mãe e irmãos pelos valores morais que
me fizeram conhecer, moldando meu caráter e minha personalidade, valores
imprescindíveis para esta caminhada até aqui; a eles que sempre me
apoiaram e incentivaram nesta longa escalada, sobrepondo-me aos
percalços e obstáculos naturais de toda e qualquer evolução.
À Drª Claudia Maria de Barros Helou, pelo carinho, atenção, muitas
vezes como uma mãe, pela oportunidade, pelas broncas e pela orientação e
ensinamentos que levarei para resto da vida.
À Ms. Fabíola M. Oshiro, pela paciência, apoio técnico e os
ensinamentos transmitidos de forma brilhante.
À Drª Maria Heloisa Massola Shimizu, pelo apoio técnico e
ensinamentos.
À Cecília da Conceição Costa, pelo constante zelo dos animais do
nosso laboratório, apoio técnico e pela sua amizade.
Aos colegas do Laboratório de Pesquisa Básica – LIM 12 – Hospital
das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Aos componentes dos Postos de Bombeiros de Taubaté.
E a todas as pessoas que sempre me apoiaram e incentivaram.
SUMÁRIO
Listas de tabelas
Lista de figuras
Lista de anexos
Lista de apêndices
Resumo
Abstract
1 INTRODUÇÃO................................................................................... 14
2 OBJETIVO......................................................................................... 18
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................ 19
4 ESTATÍSTICA ................................................................................... 26
5 RESULTADOS ................................................................................. 27
5.1 Fase I................................................................................................ 27
5.2 Fase II............................................................................................... 32
5.3 Fase III.............................................................................................. 44
6 DISCUSSÃO...................................................................................... 49
7 CONCLUSÕES.................................................................................. 55
8 ANEXOS............................................................................................ 57
9 REFERÊNCIAS................................................................................. 71
10 APÊNDICES...................................................................................... 78
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Análise do ganho de peso, da ingestão de comida e do
consumo de água ...........................................................
27
TABELA 2 - Comparação dos parâmetros plasmáticos dos animais
dos grupos C, RGL24, RGL48 e RGL72......................... 29
TABELA 3 - Comparação da função tubular dos animais dos grupos
C, RGL24, RGL48 e RGL72............................................
30
TABELA 4 - Função renal em condição basal e durante a infusão de
Ang II nos grupos NC e NC+RGL.................................... 33
TABELA 5 - Comparação dos parâmetros plasmáticos dos grupos
HC e HC+RGL................................................................. 36
TABELA 6 - Função renal em condição basal e durante a infusão de
Ang II nos grupos HC e HC+RGL....................................
40
TABELA 7 - Pesos dos órgãos dos animais NC e HC tratados ou
não com Rosiglitazone.................................................... 44
TABELA 8 - Atividade da ATPase Total, da Na
+
,K
+
-ATPase e da
ATPase Basal no rim dos animais NC e HC tratados ou
não com Rosiglitazone.................................................... 47
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Desenho do estudo............................................................ 22
FIGURA 2 - Pressão Arterial dos animais no grupo C e RGL 24, RGL
48, RGL 72......................................................................... 28
FIGURA 3 - Clearance de inulina dos animais dos grupos C e RGL
24, RGL 48, RGL 72..........................................................
30
FIGURA 4 - Função tubular dos animais dos grupos C e RGL 24,
RGL 48, RGL 72................................................................ 31
FIGURA 5 - Pressão Arterial dos animais NC tratados ou não com
Rosiglitazone nas condições basal e durante a infusão
de Ang II............................................................................. 32
FIGURA 6 - Clearance de inulina dos animais NC tratados ou não
com Rosiglitazone na condição basal e durante a infusão
de Ang II............................................................................. 34
FIGURA 7 - Função tubular dos animais NC tratados os não com
Rosiglitazone..................................................................... 35
FIGURA 8 - Parâmetros Plasmáticos referentes ao Colesterol total
(LDL, VLDL e HDL), triglicérides e glicose dos animais
dos grupos NC e HC tratados ou não com
Rosiglitazone..................................................................... 37
FIGURA 9 - Pressão Arterial dos animais HC tratados ou não com
Rosiglitazone na condição basal e durante a infusão de
Ang II.................................................................................. 38
FIGURA 10 - Clearance de inulina dos animais HC tratados ou não
com Rosiglitazone nas condições basal e durante a
infusão de Ang II................................................................ 39
FIGURA 11 - Função tubular dos animais HC tratados ou não com
Rosiglitazone..................................................................... 41
FIGURA 12 - Clearance de Inulina dos animais NC e HC tratados os
não com Rosiglitazone.......................................................
42
FIGURA 13 - Função tubular dos animais NC e HC tratados ou não
com Rosiglitazone submetidos ou não a ação do
vasoconstritor (Ang II)........................................................
43
FIGURA 14 - Pesos dos órgãos dos animais NC e HC tratados ou não
com Rosiglitazone.............................................................. 45
FIGURA 15 - Atividade da ATPase Total, da Na+,K+-ATPase e da
ATPase Basal no córtex e medula externa dos animais
NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone....................
48
LISTA DE ANEXOS
Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com
Rosiglitazone quanto ao:
ANEXO A -
Peso Inicial, final e variação de peso.................................
58
ANEXO B -
Sódio, potássio e hematócrito............................................
59
ANEXO C - Colesterol total, triglicérides e glicose................................ 60
ANEXO D - LDL, HDL e VLDL-colesterol.............................................. 61
ANEXO E - Ingestão de sólidos e líquidos............................................ 62
ANEXO F - Clearance de inulina nas condições basais e durante a
infusão de Ang II................................................................ 63
ANEXO G - Pressão arterial na condição basal e durante a infusão
de Ang II............................................................................
64
ANEXO H - Volume urinário na condição basal e durante a infusão
de Ang II............................................................................ 65
ANEXO I - Carga excretada de sódio nas condições basais e
durante a infusão de Ang II................................................ 66
ANEXOJ - Carga excretada de potássio na condição basal e
durante a infusão de Ang II................................................ 67
ANEXO K - Peso dos órgãos................................................................ 68
ANEXO L - Atividade da ATPase Total, da Na
+
,K
+
-ATPase e da
ATPase Basal no córtex.................................................... 69
ANEXO M - Atividade da ATPase Total, da Na
+
,K
+
-ATPase e da
ATPase Basal na medula externa..................................... 70
LISTA DE APÊNDICES
APÊNDICE 1
-
TABELA 1 - Dietas....................................................... 78
APÊNDICE 2
-
TABELA 2 - Solução de vitaminas............................... 78
APÊNDICE 3
-
TABELA 3 - Mistura de sais ........................................ 78
RESUMO
Cristiano Dias. Rosiglitazone pode causar lesão tubular renal em ratos
normocolesterolêmicos mas não em ratos hipercolesterolêmicos
[Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São
Paulo; 2009.
Introdução: Rosiglitazone (RGL) é um ligante dos receptores PPAR e vem
sendo usada no tratamento do Diabetes Mellitus tipo 2 e nas doenças
inflamatórias. Mas, RGL pode reduzir a filtração glomerular (FG), a carga
excretada de sódio na urina (UV
Na
) e aumentar a expressão da Na
+
,K
+
-
ATPase na medula renal. Então, RGL pode causar edema e insuficiência
cardíaca congestiva. Entretanto, não tem sido reportado se RGL pode
induzir insuficiência renal aguda (IRA).
Objetivo: Verificar se a redução da
FG causada pelo tratamento com RGL predispõe à IRA em ratos. Avaliar em
condições basais e de vasoconstrição renal e se há diferenças entre ratos
normocolesterolêmicos (NC) e hipercolesterolêmicos (HC). Métodos: A FG
foi medida pelo clearance de inulina no 8º dia em ratos (~200g) NC e HC
tratados ou não com RGL (48 mg/kg/dieta) na situação basal e durante a
infusão endovenosa de Ang II (40 ng/kg/min). Além disso, a atividade da
Na
+
,K
+
-ATPase foi avaliada em homogenato renal em outra série de
animais. Resultados: Na situação basal, NC e HC apresentaram FG
semelhante e o tratamento com RGL reduziu a FG apenas em NC de
0,78±0,03 para 0,50±0,05* ml/min/100g, *p<0,001. Apesar da redução da
FG, a UV
Na
em NC+RGL não se modificou. Durante a infusão de Ang II, a
FG de NC, HC e HC+RGL reduziu-se para o mesmo patamar de NC+RGL e
um significante aumento da UV
Na
foi observada apenas em NC+RGL (NC=
3,32±0,88; NC+RGL=5,86±1,04*; HC= 2,63±0,43 e HC+RGL= 2,23±0,39
uEq/min, *p<0,01). Além disso, RGL induziu aumento na atividade da
Na
+
,K
+
-ATPase em HC+RGL e não modificou em NC+RGL. Os valores
expressos em µM Pi/mg proteína.h
-1
foram de 45±7 em NC, 43±5 em
NC+RGL, 48±7 em HC e 64±4* em HC+RGL, *p<0,05. Analisando todos os
resultados em conjunto, a redução da FG associada com a alta natriurese e
ausência da modulação da atividade da Na
+
,K
+
-ATPase em NC+RGL
sugerem lesão renal neste grupo. Conclusão: Os mecanismos de ação da
RGL diferem de acordo com a condição metabólica. Então, RGL deve ser
prescrita com cautela na ausência de hipercolesterolemia e requer a
monitoração da função renal principalmente nas situações de
vasoconstrição.
ABSTRACT
Cristiano Dias. Rosiglitazone may induce renal injury in normal rats but not in
hypercholesterolemic rats [Dissertation]. São Paulo: Faculdade de Medicina,
Universidade de São Paulo (Brazil); 2009.
Introduction: Rosiglitazone (RGL) is a ligand for PPAR used to treat type 2
Diabetes Mellitus and inflammatory diseases. However, RGL can reduce the
glomerular filtration rate (GFR), urinary sodium excretion (UV
Na
) and increase
the expression of Na
+
, K
+
-ATPase in renal medulla. Thus, RGL may induce
edema and congestive heart failure. However, acute renal failure (ARF)
provoked by RGL treatment has not been reported. Aim: To test whether
reduced GFR by RGL may predispose to ARF at baseline and during a renal
vasoconstriction state, and if the findings differ between
normocholesterolemic (NC) and hypercholesterolemic (HC) rats. Methods:
GFR was measured by inulin clearance on the 8th day in NC and HC rats
(~200g) treated or not with RGL (48 mg/kg diet) at baseline and during
intravenous infusion of Ang II (40 ng/kg/min). Furthermore, the Na
+
,K
+
-
ATPase activity was determined in renal homogenates in other series of
animals. Results: At baseline, NC and HC had similar GFR and the
treatment with RGL reduced GFR only in NC from 0.78±0.03 to 0.50±0.05*
ml/min/100g, *p<0.001. Although GFR was reduced, UV
Na
was unchanged in
NC+RGL. During Ang II infusion, GFR was significantly reduced in NC, HC
and HC+RGL and it remained at the same reduced level in NC+RGL. At this
time, when GFR was reduced the same range in all groups, a significant
increment in UV
Na
was only observed in NC+RGL (NC = 3.32±0.88; NC+RGL
= 5.86±1.04*; HC = 2.63±0.43 and HC+RGL = 2.23±0.39 µEq/min, *p<0.01).
Moreover, RGL induced an increase in the activity of Na
+
, K
+
-ATPase in
HC+RGL, but it did not modify the activity of this enzyme in NC+RGL. The
values expressed in µM Pi/mg.protein.h
-1
were 45±7 in NC, 43±5 in
NC+RGL, 48±7 in HC and 64±4* in HC+RGL, *p<0.05. Taken together,
reduction in GFR associated with high natriuresis and without changes in the
Na
+
, K
+
-ATPase activity in renal medulla of NC+RGL may suggest renal
injury in this group. Conclusion: RGL may act distinctly in
normocholesterolemia and in hypercholesterolemia. Thus, RGL may be
prescribed with caution in absence of hypercholesterolemia and requires
monitoring of renal function specially if a renal vasoconstriction state is
associated.
14
1. INTRODUÇÃO
A Rosiglitazone é uma droga pertencente ao grupo das
Thiazolidinedionas que age como ligante do receptor de ativação da
proliferação peroxisomal do subtipo gama (PPAR
). Por isso, a Rosiglitazone
vem sendo utilizada no tratamento do Diabetes Mellitus tipo 2 (1-4).
Os receptores PPAR
encontram-se expressos nos adipócitos, no
endotélio vascular, nos macrófagos, nas células pancreáticas do tipo beta,
nas células mesangiais e nas células do ducto coletor (1-9). A ação do
PPAR é na transcrição nuclear e pode ser tanto de ativação como de
inibição. No mecanismo de ativação, a ação depende do DNA o que não
ocorre no mecanismo de inibição. Entretanto, é necessária a presença de
um ligante para que os mecanismos sejam acionados (1).
Na situação de ativação, o ligante ao se unir ao receptor PPAR
recruta co-fatores e junto com o receptor retinóide X forma um heterodímero.
Este por sua vez age na modulação da transcrição gênica e a sua principal
ação são as relacionadas ao metabolismo lipídico e à diferenciação celular
(1,2,6,7).
Na situação de inibição, a ação do PPAR é independente do DNA.
Neste caso, o PPAR interfere de maneira negativa nas vias de sinalização
de certos fatores como, por exemplo, a do fator nuclear – kappa B (NF-B) e
de diferentes citoquinas, moléculas de adesão e metaloproteinases (2,9).
15
Então, os agonistas PPAR vem sendo também prescritos no tratamento das
doenças inflamatórias como a doença de Crohn, artrites e psoríases (10,11).
Entre as diversas ações da Rosiglitazone no tratamento do Diabetes
Mellitus tipo 2 podemos citar a melhora da sensibilidade à insulina e da
hipercolesterolemia e a redução da concentração dos ácidos graxos livres no
plasma. Se por um lado, há melhora no controle glicêmico, por outro lado,
observa-se ganho de peso corpóreo associado ao aumento do tecido
adiposo no sub-cutâneo (1).
Existem várias teorias para explicar a melhora da sensibilidade à
insulina, sendo a “hipótese do roubo do ácido graxo” a mais aceita. Esta
hipótese baseia-se no fato das Thiazolidinedionas aumentarem a captação e
a permanência dos ácidos graxos no tecido adiposo (1). Assim, a quantidade
dos ácidos graxos é reduzida no plasma, ficando estes estocados no sub-
cutâneo. Em conseqüência ao aumento do estoque dos ácidos graxos nos
adipócitos, as células hepáticas e as da musculatura esquelética poupam-se
dos efeitos lipotóxicos (9,12,13). Existem ainda outras explicações, como por
exemplo, está relacionada a diminuição da síntese hepática de glicose. Esta
diminuição estaria relacionada com a menor liberação de ácido graxo livre,
do fator de necrose tumoral do tipo alfa (TNFα), da resistina e da leptina
para a corrente sanguínea concomitante ao aumento da quantidade das
adiponectinas plasmáticas (14). Então, a liberação da glicose no tecido
músculo-esquelético estaria beneficiada, reduzindo, portanto, a produção de
glicose hepática e aumentando os estoques de gordura no tecido adiposo
(12).
16
O ganho do peso corpóreo induzido pelo uso das Thiazolidinedionas
também pode ser devido ao aumento da volemia decorrente da retenção
hídrica (11-13). Por isso, os efeitos colaterais como o aparecimento do
edema e da insuficiência cardíaca congestiva (ICC) são observados em
alguns pacientes (15-19). A expansão do volume extra-celular e o edema
podem ser explicados pela redução na excreção de sódio devido ao
aumento da reabsorção tubular de sódio associada ou não à redução da
filtração glomerular (20).
Alguns autores têm proposto que a redução da filtração glomerular é
devida a diminuição da pressão arterial sistêmica e outros pela ação
vasodilatadora nas arteríolas glomerulares (21,22). Há estudos
experimentais que demonstram que os ligantes PPAR tem ação direta na
musculatura lisa dos vasos bloqueando a abertura dos canais cálcio
voltagem dependente do tipo L (VOCC) (23-25). Estudos “in vitro” com
células endoteliais sugerem que as Thiazolidinedionas podem interferir na
liberação ou na ação do óxido nítrico (NO) (20,26). Entretanto, há
controvérsias sobre a participação do NO na ação da vasodilatação exercida
pelas Thiazolidinedionas (23,24).
Em todo caso, o risco de redução no suprimento sanguíneo às células
epiteliais do néfron é pertinente, uma vez que poderá ocorrer a redução da
pressão arterial sistêmica ou a vasodilatação das arteríolas glomerulares.
Além disso, o risco de isquemia das células epiteliais renais aumenta se
ocorrer alguma instabilidade hemodinâmica. Esta situação não é incomum
ocorrer nos pacientes internados em condições críticas, como por exemplo,
17
na insuficiência cardíaca e no choque. Então, os pacientes com redução da
filtração glomerular devido ao tratamento com Rosiglitazone podem ser
acometidos de uma vasoconstrição renal mediada pela angiotensina II (Ang
II). Convém lembrar que a Ang II é um importante agonista para o
restabelecimento da hemodinâmica sistêmica nas situações de insuficiência
cardíaca e choque (27). E, portanto, nestes casos o risco de insuficiência
renal aguda (IRA) poderá ser grande se o indivíduo sob tratamento com
Rosiglitazone apresentar redução da filtração glomerular.
Então, é interessante realizar estudo experimental com ratos a fim de
se verificar se os animais que apresentam redução da filtração glomerular
devido ao tratamento com Rosiglitazone apresentam predisposição à IRA
em condição basal e de vasoconstrição renal mediada pela Ang II.
Considerando que as Thiazolidinedionas são indicadas no tratamento
de pacientes com Diabetes Mellitus tipo 2 que cursam muitas vezes com
hipercolesterolemia, é também interessante verificar se há mudanças na
função renal de ratos hipercolesterolêmicos tratados com Rosiglitazone nas
mesmas condições dos ratos normais.
18
2. OBJETIVO
Verificar se a redução da filtração glomerular causada pelo tratamento
com Rosiglitazone predispõe à insuficiência renal aguda em ratos. Avaliar:
- em condição basal e de vasoconstrição renal;
- na situação de normocolesterolemia e hipercolesterolemia.
19
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Este estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa
de nossa instituição (CAPPesq) em 12 de julho de 2006, protocolo 562/06.
Foram utilizados ratos Wistar machos fornecidos pelo Biotério Central
da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e foram mantidos
no Biotério do nosso Laboratório (LIM – 12) com livre acesso à água e à
comida.
Os estudos foram divididos em Fases I, II e III, como segue:
Fase I - Estabelecer o modelo no qual a Rosiglitazone diminua a
filtração glomerular sem repercutir na função tubular
Os animais foram colocados em gaiolas individuais e receberam dieta
Normal (Apêndices 1, 2 e 3) produzida em nosso laboratório, acrescida de
Maleato Rosiglitazone (Avandia, GlaxoSmithKline, gsk) nas dose de 24, 48 e
72 mg/kg de dieta (20,28).
A função renal foi avaliada no 8º dia através do estudo do clearance
de inulina em animais anestesiados após jejum prévio de 12 horas.
Foram estudados os seguintes grupos:
1 – Grupo Controle (C): Os animais que foram alimentados com dieta
normal.
20
2 –
Grupo Rosiglitazone 24 mg (RGL24): Os animais que foram
alimentados com dieta normal acrescida de 24 mg/kg de dieta de
Rosiglitazone.
3 –
Grupo Rosiglitazone 48 mg (RGL48): Os animais que foram
alimentados com dieta normal acrescida de 48 mg/kg de dieta de
Rosiglitazone.
4 – Grupo Rosiglitazone 72 mg (RGL72): Os animais que foram
alimentados com dieta normal acrescida de 72 mg/kg de dieta de
Rosiglitazone.
Fase II - Estudo da função renal em ratos normocolesterolêmicos e
hipercolesterolêmicos tratados ou não com Rosiglitazone
Os animais foram colocados em gaiolas individuais e receberam dieta
por 8 dias e agrupados da seguinte maneira:
1 – Grupo Normocolesterolêmico (NC): Animais alimentados com dieta
normal.
2 – Grupo NC tratados com Rosiglitazone (NC+RGL): Animais
alimentados com dieta normal acrescida de Rosiglitazone.
3 – Grupo Hipercolesterolêmico (HC): Animais alimentados com dieta
enriquecida com 4% de Colesterol e 1% de Ácido Cólico e ajuste calórico
semelhante à dieta normal (29-32).
4 – Grupo HC tratados com Rosiglitazone (HC+RGL): Animais
alimentados com dieta enriquecida com 4% de Colesterol e 1% de Ácido
21
Cólico e ajuste calórico semelhante à dieta normal e tratados com
Rosiglitazone.
A função renal foi avaliada no 8º dia através do estudo do clearance
de inulina em animais anestesiados após jejum prévio de 12 horas. Foram
realizados dois períodos de coleta de urina de no mínimo 30 minutos cada
em condição basal. A seguir, infundia-se Ang II (40 ng/kg) na velocidade de
0,04 ml/min e dois novos períodos de no mínimo 20 minutos cada foram
coletados (33).
Fase III - Estudos “In Vitro”
1 - Estudo do peso dos órgãos dos animais
No final dos experimentos do clearance de inulina os animais foram
submetidos à eutanásia, com a administração endovenosa de anestésico em
dose letal. A seguir, os rins, as adrenais e o coração foram retirados e
pesados. Os valores foram expressos em g/kg corrigidos para 100 gramas
de peso corpóreo, ou seja, em g/kg/100g.
2 - Estudo da atividade da Na
+
,K
+
-ATPase no rim
Numa outra série de animais, a Na
+
,K
+
-ATPase foi determinada em
homogenato do córtex e da medula externa dos rins dos animais NC,
NC+RGL, HC e HC+RGL.
22
Clearance de Inulina
Os animais foram anestesiados com pentobarbital de sódio na
dose de 50 mg/kg pela via intraperitoneal. Inicialmente, realizava-se a
traqueotomia (cateter PE240) para evitar intercorrências ventilatórias. A
seguir, foram cateterizadas as duas veias jugulares (cateter PE60) para a
infusão de soluções, a artéria carótida (cateter PE50) para mensuração da
pressão arterial sistêmica (PA) e a bexiga (cateter PE240) para as coletas
urinárias. Uma vez finalizada a etapa cirúrgica, administrava-se o “priming”
de inulina na dose 100mg/kg por uma das veias jugulares. A seguir,
iniciava-se infusão contínua de inulina pela veia jugular na velocidade de
0,04 ml/min (Bomba Harvard Appataus, Mass, USA). Assim, a concentração
plasmática desse marcador manteve-se estável durante todo o experimento.
Após um período mínimo de 30 minutos de estabilização, duas coletas de
urina eram feitas na condição basal por um período mínimo 30 minutos
cada. Durante a infusão endovenosa contínua de Ang II pela outra veia
jugular, realizavam-se mais duas coletas de urina com períodos mínimos de
20 minutos cada. A Figura 1 ilustra o protocolo.
Figura 1 - Desenho do estudo
10 min
20
min
20
min
30 min
30 min
30 min
Estabilização
Estabilização
Basal
Exp
osição Ang II
Infusão inulina
Infusão Ang II
23
A mensuração da pressão arterial média realizou-se no inicio e no
final da coleta urina dos períodos basal e sob infusão de Ang II. Utilizou-se o
medidor de pressão arterial em coluna de mercúrio.
As concentrações da inulina no plasma e na urina foram dosadas pelo
método da Antrona (34). O clearance de inulina (C
in
) foi calculado segundo
a fórmula:
onde:
U - é a concentração da inulina na urina expressos em mg/ml.
P - é a concentração da inulina no plasma expressos em mg/ml.
V - é o volume urinário expresso em ml/min.
Os resultados foram expressos em ml/min corrigidos para 100 gramas
de peso corpóreo, ou seja, em ml/min/100g.
As concentrações de sódio e potássio também foram determinadas
nas amostras de plasma e urina através da técnica de fotometria de chama
(CELM-FC280).
As cargas excretadas (UV
x
) de sódio, potássio foram calculadas
segundo a fórmula:
onde:
U
x
- é a concentração da substância na urina.
V - é o volume urinário.
Os resultados foram expressos em µEq/min.
O colesterol total, HDL-colesterol, triglicérides e glicose no plasma
foram também analisados utilizando-se o método enzimático colorimétrico
C
in
= U
in
x V
P
in
UV
x
= U
x
x V
24
(kit LABTEST), leitura no espectrofotômetro, CELM-FC280. O LDL-
colesterol e o VLDL-colesterol foram determinados através das seguintes
formulas:
Determinação da Na
+
,K
+
-ATPase
Os animais eram anestesiados com Tiopental Sódico (CEME-
Cristália) na dose de 50 mg/kg de peso pela via intraperitoneal e os rins
eram retirados através da incisão mediana abdominal.
Os fragmentos córtex e da medula externa renal foram isolados
através de microdissecção à 0°C. A seguir, os tecidos renais do córtex e da
medula externa foram homogeneizados em solução contendo 0,25M de
sacarose, 6mM de EDTA e 20mM de imidazole, acrescida de 2,4mM de
deoxicolato de sódio na proporção 1:3, pH 6,8. Após a homogeneização
com pestilo de Teflon, os produtos originados neste processo foram filtrados
em dupla gaze para o ensaio da determinação da atividade da Na
+
,K
+
-
ATPase.
A determinação da atividade da Na
+
,K
+
-ATPase foi medida pela
capacidade desta enzima em hidrolisar o ATP com liberação de Pi (fósforo
inorgânico). A atividade enzimática foi definida pela diferença da quantidade
de Pi liberado em condições de estímulo em relação ao basal, corrigido pela
quebra espontânea do ATP, pela concentração de proteína e pelo tempo de
-
LDL
-
colesterol
= colesterol total - (triglicérides/5+ HDL-colesterol)
- VLDL-colesterol = colesterol total - (LDL+HDL)
25
incubação de uma hora. Assim, a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase foi expressa
em μM Pi/mg proteína.h
-1
(35).
A atividade da Na
+
,K
+
-ATPase foi então determinada ao se pipetar,
em triplicata, 0,1 ml da solução filtrada produto homogeizado em 0,4 ml da
solução de incubação por 15 minutos a 37°C. A reação era interrompida
pelo resfriamento das amostras em gelo triturado e por meio da adição de
0,1 ml de ácido tricloroacético a 30%. Imediatamente após, eram
adicionados 0,9 ml de uma mistura contendo 10% de carvão ativado e 0,2%
da solução de albumina. Os tubos foram centrifugados e os sobrenadantes
transferidos para quantificar
32
P em um líquido de cintilização para contagem
(Parkard).
A atividade da ATPase total foi determinada na presença de 5 mM
KCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl
2
, 100mM TRIS-HCl, 1 mM EGTA, 10 mM
ATP (Sigma), e traços de ATP γ[
32
P] (Perkin Elmer), pH 7,4. A atividade da
ATPase basal foi medida em solução de incubação similar à ATPase total,
mas na ausência de KCl e NaCl e na presença de 1mM de ouabaína. A
quebra espontânea do ATP foi medida em duplicata em soluções e em
condições idênticas às realizadas para se medir a ATPase total e basal.
Essas soluções não continham os produtos homogeneizados. Os valores
médios das amostras foram calculados para obter um valor único para cada
experimento. A proteína foi dosada de acordo com Lowry e colaboradores
(36).
26
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média e erro padrão (média ±
ep). A análise estatística foi feita através aplicação do teste t Student
pareado, para a comparações entre condições basais e exposição à Ang II,
e não pareado para comparações entre tratados ou não com Rosiglitazone.
Para comparações entre mais de dois resultados de diferentes grupos,
aplicou-se a análise de variância (ANOVA) seguida do pós-teste de
Newman-Keuls. O nível de significância adotado foi o de 5%.
27
5. RESULTADOS
5.1 Fase I: Estabelecer o modelo no qual a Rosiglitazone diminua
o clearance de inulina sem repercutir na função tubular
Os resultados referentes ao ganho de peso, a ingestão de comida e o
consumo de água pelos animais estão demonstrados na Tabela 1. Observa-
se que as diferentes doses de Rosiglitazone por 8 dias não modificaram
esses parâmetros.
TABELA 1 – Análise do ganho de peso e a ingestão de comida e o
consumo de água
Grupos C RGL24 RGL48 RGL72
Peso inicial (g) 204,1±6,5 203,6±7,8 202±7,5 207,9±4,2
Peso final (g) 252,2±6,4 252,6±8,8 251,1±6,9 254±4,3
∆ peso (g) 48,1±6,2 49±3,6 49,1±7,1 46,1±7,3
Comida (g/dia) 24,4±1,7 27,91±2,8 21,48±1,8 20,12±1,2
Água (ml/dia) 22,95±2,3 27,25±1,2 21,59±2,5 26,92±5
(n = 12) (n = 9) (n = 10) (n = 7)
Valores expressos em média e erro padrão. Avaliados por ANOVA com
pós-teste de Newman-Keuls.
Como ilustra a Figura 2, as diferentes doses de Rosiglitazone não
modificaram os valores da PA. A PA no grupo C era de 126,5±3,7 e nos
grupos RGL24, RGL48 e RGL72 eram respectivamente de 129,6±2,3;
130,3±3,3 e 132,1±2,4 mmHg.
28
C RGL 24 RGL 48 RGL 72
0
50
100
150
n = 12 n = 9 n = 10 n = 7
mm Hg
FIGURA 2 – Pressão Arterial dos animais do grupo C, RGL24, RGL48 e
RGL72. Avaliados por ANOVA com pós-teste de Newman-Keuls.
A Tabela 2 mostra os resultados referentes à comparação da
composição plasmática e o hematócrito dos animais. As diferentes doses de
Rosiglitazone não apresentaram qualquer efeito significativo nesses
parâmetros. Entretanto, observa-se uma redução no hematócrito no grupo
RGL48.
29
TABELA 2 – Comparação da composição plasmática e o hematócrito
Grupos C RGL24 RGL48 RGL72
Na
+
(meq/l) 139±1,2 141±1,2 138±1,0 141±1,2
K
+
(meq/l) 3,9±0,1 3,9±0,2 4,1±0,1 3,5±0,2
Ht (%) 40,6±1,0 43,4±1,5 36,5±1,5
a
44±1,6
Glicose (mg/dL) 103±5,3 115±2,8 102±5,1 96±5,1
Colesterol Total (mg/dL) 91,4±4,6 65,8±9,1 75,8±9,1 70,8±12
Triglicérides (mg/dL) 97,2±15,3 75,1±12,1 82,5±10,2 86,1±14,1
(n = 12) (n = 9) (n = 10) (n = 7)
Valores expressos em média e erro padrão,
a
p<0,05 em relação aos
demais grupos. Avaliados por ANOVA com pós-teste de Newman-Keuls.
Como ilustra a Figura 3, observa-se uma significante redução no
clearance de inulina no grupo RGL 48 em relação ao grupo C. Os valores
encontrados foram de 0,50±0,05 no grupo RGL48 e 0,78±0,03 ml/min/100g
no grupo C, p<0,01.
30
C RGL 24 RGL 48 RGL 72
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
*
n = 12 n = 9 n = 10 n = 7
ml/min/100g
FIGURA 3 – Clearance de inulina dos animais dos grupos C, RGL24, RGL48
e RGL72. *p<0,001 em relação a C. Avaliados por ANOVA com pós-teste
de Newman-Keuls.
Quanto à função tubular, observa-se que RGL48 não apresentou
diferenças significantes em relação ao grupo C, conforme demonstra a
Tabela 3 e a Figura 4. No grupo RGL72 observa-se efeito significativo na
função tubular quanto ao volume urinário e a carga excretada de sódio.
TABELA 3 – Comparação da função tubular dos animais dos grupos C,
RGL24, RGL48 e RGL72
Grupos
C
(n=12)
RGL24
(n=9)
RGL48
(n=10)
RGL72
(n=7)
Vol Urin. (ml/min) 7,3±0,7 8,8±0,8 9,9±1,7 18,0±4,7
a
UV
Na+
(μEq/min) 0,99±0,2 1,07±0,2 1,7±0,4 2,4±0,6
b
UV
K+
(μEq/min) 0,86±0,1 1,02±0,2 1,07±0,1 1,17±0,2
Valores expressos em média e erro padrão.
a
p<0,01 versus demais grupos;
b
p<0,05 versus C e RGL24. Avaliados por ANOVA com pós-teste de
Newman-Keuls.
31
C RGL 24 RGL 48 RGL 72
0
10
20
30
40
50
n = 12 n = 9 n = 10 n = 7
Volume Urinário
ml/min
a
C RGL 24 RGL 48 RGL 72
0.0
2.5
5.0
7.5
b
n = 12 n = 9 n = 10 n = 7
Carga Excretada Sódio
Eq/min
C RGL 24 RGL 48 RGL 72
0.0
2.5
5.0
7.5
n = 12 n = 9 n = 10 n = 7
Carga Excretada Potássio
Eq/min
FIGURA 4 – Função tubular dos animais dos grupos C, RGL24, RGL48 e RGL72.
a
p<0,05 versus os demais grupos;
b
p<0,05
versus C e RGL24. Avaliados por ANOVA com pós-teste de Newman-Keuls.
32
5.2 Fase II: Estudo da função renal em ratos
normocolesterolêmicos (NC) e hipercolesterolêmicos (HC) tratados ou
não com Rosiglitazone
O protocolo escolhido para se verificar o efeito da Rosiglitazone
em NC e HC foi a adição de 48 mg de Rosiglitazone por kg de dieta durante
8 dias, conforme os resultados já demonstrados nos estudos da FASE I.
Como está ilustrado nas Figuras 2 e 3, este tratamento reduziu o clearance
de inulina de maneira significativa e não alterou a função tubular.
A Tabela 4 mostra os resultados referentes à função renal do
grupo NC e NC+RGL em condições basais e durante à infusão de Ang II.
Como ilustra a Figura 5, a infusão de Ang II elevou
significativamente a PA no grupo NC e não alterou no grupo NC+RGL.
Basal Ang II Basal Ang II
0
50
100
150
NC
NC+RGL
*
n = 12 n = 10
mm Hg
FIGURA 5 – Pressão arterial dos animais NC tratados ou não com
Rosiglitazone na condição basal e durante a infusão de Ang II. *p<0,01 em
relação ao Basal. Avaliado por teste de Student de t pareado.
33
TABELA 4 – Função renal dos grupos NC e NC+RGL na condição basal
e durante a infusão de Ang II
NC (n=12)
NC+RGL (n=10)
Basal Ang II Basal Ang II
PA (mmHg)
126,4±3,8 134,3±3,1* 130,3±3,3 131,1± 3,1
C
In
(ml/min/100g) 0,78±0,1 0,62±0,1* 0,50±0,2
##
0,54±0,2
Vol Urin (ml/min) 7,32±2,3 15,8±4** 9,38±4,3 36,19± 23,0*
UV
Na+
(μEq/min) 0,97±0,8 3,32±3,0* 1,41±0,9 5,63± 3,4*
UV
K+
(μEq/min) 0,86±0,4 1,35±0,6** 1,07±0,5 2,16± 0,9*
#
Valores expressos em média e erro padrão. *p<0,01; **p<0,05 teste de
Student de t pareado, Basal versus Ang II.
#
p<0,05;
##
p<0,0001 teste de
Student de t nao pareado, NC versus NC+RGL.
Quanto ao clearance de inulina observou-se que a infusão de Ang
II reduziu de maneira significativa este parâmetro no grupo NC. Entretanto,
o clearance de inulina não se modificou durante a infusão de Ang II no grupo
NC+RGL (Figura 6). Convém lembrar que o clearance de inulina já se
encontrava reduzido nesse grupo na condição basal.
34
Basal Ang II Basal Ang II
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
*
NC
NC+RGL
n = 12 n = 10
ml/min/100g
FIGURA 6 – Clearance de inulina dos animais NC tratados ou não com
Rosiglitazone na condição basal e durante a infusão de Ang II.
*
p<0,01 em
relação ao Basal. Avaliado por
teste de Student de t pareado.
Quanto à função tubular, observou-se que a infusão de Ang II
aumentou o volume urinário e a carga excretada de sódio e potássio (Tabela
4). Entretanto, a diurese e a excreção dos eletrólitos foram
significantemente mais intensa no grupo NC+RGL em relação ao NC (Figura
7).
35
NC
NC+RGL
NC
NC+RGL
0
10
20
30
40
50
Basal
Ang II
#
Volume urinário
L / min
NC
NC+RGL
NC
NC+RGL
0.0
2.5
5.0
7.5
Basal
Ang II
#
Carga excretada sódio
Eq / min
NC
NC+RGL
NC
NC+RGL
0.0
2.5
5.0
7.5
Basal
Ang II
##
Carga excretada potássio
Eq / min
FIGURA 7 – Função tubular dos animais NC tratados os não com Rosiglitazone.
#
p<0,01 e
##
p<0,05 NC versus NC+RGL.
Avaliado por teste de Student de t não pareado.
36
Em relação aos ratos hipercolesterolêmicos, observou-se que o
tratamento com Rosiglitazone reduziu de maneira significativa os valores da
glicose sérica, colesterol total, HDL-colesterol e triglicérides (Tabela 5). A
Figura 8 ilustra a composição plasmática dos ratos normocolesterolêmicos e
hipercolesterolêmicos tratados ou não com Rosiglitazone.
TABELA 5 – Comparação da composição plasmática dos Grupos HC e
HC+RGL
HC (n=13) HC+RGL (n=9)
Peso Inicial (g) 201,9±3,7 210±4,7
Peso Final (g) 225,4±3,3 222,1±11,1
∆ peso (g) 22,9±4,5 12,1±9,4
Consumo comida (g) 23,9±1,5 23,7±1,0
Ingestão água (ml) 33,5±2,9 30,2±2,5
Na
+
(meq/l) 141,2±1,4 141,7±1,7
K
+
(meq/l) 3,9±0,1 3,6±0,1
Ht (%) 38,7±0,7 37,2±0,6
Glicose (mg/dL) 114,3±3,0 96,5±4,7
#
Colesterol Total (mg/dL) 242,8±13,1 187,0±20,7
##
HDL-colesterol (mg/dL) 5,6±1,0 5,3±1,3
LDL-colesterol (mg/dL) 222,9±14,8 178,6±21,9
VLDL-colesterol (mg/dL) 13,5±1,2 8,5±1,21
##
Triglicérides (mg/dL) 74,2±6,7 44,8±5,9
#
Valores expressos em média e erro padrão.
#
p<0,01,
##
p<0,05 teste de
Student de t não pareado HC versus HC+Ros.
37
FIGURA 8 – Composição plasmática dos grupos NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone, referentes ao colesterol total
demonstrado em suas frações (LDL, VLDL e HDL), triglicérides e glicose dos animais. *p<0,001 versus NC e NC+RGL,
#
p<0,01 versus HC ,
&
p<0,001 versus NC. Avaliados pelo ANOVA com pós-teste de Newman-Keuls.
*
*#
&
38
Os ratos hipercolesterolêmicos tratados ou não com Rosiglitazone
não apresentaram diferenças estatísticas em relação à PA em condições
basais quando comparados entre si ou em relação aos grupos NC e
NC+RGL. A infusão de Ang II também não modificou a PA (Figura 9 e
Tabela 6).
Basal Ang II Basal Ang II
0
50
100
150
HC
HC+RGL
n = 13
n = 09
mm Hg
FIGURA 9 – Pressão arterial dos animais HC tratados ou não com
Rosiglitazone na condição basal e durante a infusão de Ang II. Avaliados
pelo teste t de Student pareado.
Os ratos hipercolesterolêmicos tratados ou não com Rosiglitazone
apresentaram semelhante clearance de inulina em relação ao grupo NC. A
infusão de Ang II reduziu de maneira significante o clearance de inulina tanto
dos ratos HC quanto dos HC+RGL (Figura 9). Esta redução foi semelhante
à observada com o grupo NC.
39
Basal Ang II Basal Ang II
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
HC
HC+RGL
**
*
n = 13
n = 09
ml/min/100g
FIGURA 10 - Clearance de inulina dos animais HC tratados ou não com
Rosiglitazone na condição basal e durante a infusão de Ang II.
*
p<0,05 e
**
p<0,01 versus Basal. Avaliados pelo teste de Student de t pareado.
Quanto à função tubular, observou-se que a infusão de Ang II
aumentou o volume urinário e a excreção dos eletrólitos tanto nos animais
HC quanto HC+RGL (Tabela 6 e Figura 10)
40
TABELA 6 – Função renal dos grupos HC e HC+RGL em condição
basal e durante a infusão de Ang II
HC (n=13)
HC+RGL (n=9)
Basal Ang II Basal Ang II
PA (mmHg) 137±2,8 137±3,4 131±1,0 132±2,3
C
In
(ml/min/100g) 0,8± 0,0 0,6±0,0*** 0,8±0,0 0,6±0,1*
Vol Urin (ml/min) 11,5±1,6 18,5±3,4* 7,2±0,7 13,1±2,1*
UV
Na+
(μEq/min) 1,4±0,2 2,6±0,4*** 0,9±0,1 2,2±0,4*
UV
K+
(μEq/min) 0,9±0,1 1,5±0,4 0,7±0,1 1,0±0,1
Valores expressos em média e erro padrão. *p<0,05 ; ***p<0,001 teste de
Student de t pareado, Basal versus Ang II
.
41
HC
HC+RGL
HC
HC+RGL
0
10
20
30
40
50
Basal Ang II
Volume Urinário
L / min
HC
HC+RGL
HC
HC+RGL
0.0
2.5
5.0
7.5
Basal Ang II
Carga excretada sódio
Eq / min
HC
HC+RGL
HC
HC+RGL
0.0
2.5
5.0
7.5
Basal Ang II
Carga Excretada potássio
Eq / min
FIGURA 11 – Função tubular dos animais HC tratados os não com Rosiglitazone. Avaliado por teste de Student de t não
pareado.
42
As Figuras 12 e 13 ilustram os resultados obtidos com os quatro
grupos de animais estudados. Quando os animais foram submetidos ao
tratamento com Rosiglitazone houve redução do clearance de inulina nos
animais normocolesterolêmicos (NC+RGL) e não houve modificações desse
parâmetro nos animais hipercolesterolêmicos (HC+RGL). Ao se infundir Ang
II, todos os grupos apresentaram redução do clearance de inulina, exceto o
grupo NC+RGL que já apresentava o clearance de inulina reduzido no
período basal. Quanto à função tubular verificou-se que a infusão de Ang II
aumentou de maneira significativa a diurese e a carga excretada de sódio
dos animais NC+RGL. Esta observação não foi encontrada nos animais
HC+RGL (Figura 13). Estes resultados mostram que o efeito tubular só é
evidenciado nos ratos normocolesterolêmicos submetidos a tratamento com
Rosiglitazone.
Basal
NC NC+RGL HC HC+RGL
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
*
n = 12 n = 10 n = 13 n = 09
ml/min/100g
Ang II
NC NC+RGL HC HC+RGL
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
n = 12 n = 10 n = 13 n = 09
ml/min/100g
FIGURA 12 – Clearance de inulina dos animais NC e HC tratados os não
com Rosiglitazone submetidos ou não a ação do vasoconstritor (Ang II).
*p<0,001 em relação ao demais grupos. Avaliados por ANOVA com pós-
teste de Newman-Keuls.
43
Basal
NC
NC+RGL
HC HC+RGL
0
10
20
30
40
50
n = 12 n = 10 n = 13 n = 09
Volume Urinário
L / min
Ang II
NC NC+RGL HC HC+RGL
0
10
20
30
40
50
*
n = 12 n = 10 n = 13 n = 09
Volume Urinário
L / min
Basal
NC NC+RGL HC HC+RGL
0.0
2.5
5.0
7.5
n = 12 n = 10 n = 13 n = 09
Carga Excretada Sódio
Eq / min
Ang II
NC
NC+RGL
HC
HC+RGL
0.0
2.5
5.0
7.5
*
n = 12 n = 10 n = 13 n = 09
Carga Excretada Sódio
Eq / min
FIGURA 13 – Função tubular dos animais NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone submetidos ou não a ação do
vasoconstritor (Ang II). *p<0,01 em relação ao demais grupos. Avaliados por ANOVA com pós-teste de Newman-Keuls.
44
5.3Fase III: Estudos “In Vitro”
1 - Peso dos órgãos dos animais
Após o término das coletas do clearance de inulina, os animais ainda
sob anestesia eram submetidos a eutanásia e seus órgãos eram retirados
para serem pesados. Na Tabela 7 e Figura 14, observa-se que o peso do
coração, quando corrigido pelo peso corporal, dos ratos no grupo normal
quando tratados com Rosiglitazone (NC+RGL) eram maiores em relação do
grupo NC. Esta observação não ocorreu com o peso dos rins e das adrenais.
TABELA 7 – Pesos dos órgãos dos animais NC e HC tratados ou
não com Rosiglitazone
Valores expressos em média e erro padrão. *p<0,05 versus NC.
Avaliados por ANOVA com pós-teste de Newman-Keuls.
NC
(n=06)
NC+RGL
(n=10)
HC
(n=06)
HC+RGL
(n=05)
Coração(g/kg/100g) 0,42±0,006 0,47±0,01* 0,43±0,01 0,45±0,01
Rins(g/kg/100g) 0,40±0,01 0,39±0,01 0,42±0,01 0,44±0,02
Adrenais(g/kg/100g) 0,011±0,001 0,012±0,000 0,013±0,000 0,012±0,001
45
NC NC+RGL HC HC+RGL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
*
n = 12 n = 10 n = 13 n = 09
Coração
g/kg/100g
NC NC+RGL HC HC+RGL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
n = 12 n = 10 n = 13 n = 09
Rins
g/kg/100g
NC NC+RGL HC HC+RGL
0.000
0.005
0.010
0.015
n = 12 n = 10 n = 13 n = 09
Adrenais
g/kg/100g
FIGURA 14 – Pesos dos órgãos dos animais NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone. *p<0,05 versus NC. Avaliados por
ANOVA com pós-teste de Newman-Keuls.
46
2- Estudos da atividade da ATPase Total, da Na
+
,K
+
-ATPase e da
ATPase Basal no rim
A atividade da ATPase Total, da Na
+
,K
+
-ATPase e da ATPase Basal
no córtex e na medula externa renal dos animais NC e HC tratados ou não
com Rosiglitazone estão demonstrados na Tabela 8 e ilustrados na Figura
15. Observou-se que no córtex renal, a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase foi
semelhante em todos os grupos. Entretanto, esta enzima teve a sua
atividade significantemente aumentada na medula externa renal nos ratos
hipercolesterolêmicos tratados com Rosiglitazone.
47
TABELA 8 – Atividade da ATPase Total, da Na
+
,K
+
-ATPase e da ATPase Basal no rim dos animais
Grupos de
animais
ATPase total
(µM Pi/mg proteína.h
-1
)
Na
+
,K
+
-ATPase
(µM Pi/mg proteína.h
-1
)
ATPase basal
(µM Pi/mg proteína.h
-1
)
Córtex Medula Córtex Medula Córtex Medula
NC (n=06) 39,22±3,98 63,86±8,21 21,12±2,90 45,35±6,57 18,10±2,58 18,51±2,81
NC+RGL(n=10) 46,27±2,67 71,92±6,53 20,22±1,92 42,75±5,44 26,05±2,20 29,16±3,11
HC (n=06) 40,95±2,10 76,95±3,68 18,46±3,51 48,10±6,82 22,46±2,40 28,84±4,41
HC+RGL(n=09) 45,58±3,5 88,43±7,01 25,53±2,54 64,10±4,1
a
20,05±2,6 24,82±8,1
Valores expressos em média e erro padrão.
a
p<0,05 versus HC+RGL. Avaliados por ANOVA com pós-teste de Newman-
Keuls.
48
ATPase Total
Córtex
NC NC+RGL HC HC+RGL
0
25
50
75
100
n = 06 n = 10 n = 06 n = 09
M Pi/mg proteína.h
-1
Na
+
,K
+
-ATPase
Córtex
NC NC+RGL HC
HC+RGL
0
25
50
75
100
n = 06 n = 10 n = 06 n = 09
M Pi/mg proteína.h
-1
ATPase Basal
Córtex
NC NC+RGL HC HC+RGL
0
25
50
75
100
n = 06 n = 10 n = 06 n = 09
M Pi/mg proteína.h
-1
ATPase Total
Medula
NC NC+RGL HC HC+RGL
0
25
50
75
100
n = 06 n = 10 n = 06 n = 09
M Pi/mg proteína.h
-1
Na
+
,K
+
-ATPase
Medula
NC NC+RGL HC
HC+RGL
0
25
50
75
100
a
n = 06 n = 10 n = 06 n = 09
M
Pi/mg proteína.h
-1
ATPase Basal
Medula
NC NC+RGL HC HC+RGL
0
25
50
75
100
n = 06 n = 10 n = 06 n = 09
M Pi/mg proteína.h
-1
FIGURA 15 – Atividade da ATPase Total, da Na
+
,K
+
-ATPase e da ATPase Basal no córtex e na medula externa
renal dos animais tratados ou não com Rosiglitazone.
a
p<0,05 versus NC+RGL. Avaliados por ANOVA com pós-
teste de Newman-Keuls.
49
6. DISCUSSÃO
Este estudo demonstrou que o tratamento com Rosiglitazone na dose
de 48 mg/kg de dieta por 8 dias reduziu a filtração glomerular sem alterar a
função tubular nos ratos normais na condição basal. Entretanto, esse
mesmo tratamento não modificou a filtração glomerular nos ratos
hipercolesterolêmicos nessa mesma condição. Além disso, se observou
aumento na atividade da Na
+
,K
+
-ATPase da medula externa dos rins dos
ratos hipercolesterolêmicos o que não ocorreu com os ratos normais. Outra
constatação foi de que a infusão aguda de um vasoconstritor potente, como
a Angiotensina II, resultou em: 1) aumento significativo da pressão arterial
sistêmica apenas nos ratos normais; 2) redução da filtração glomerular para
o mesmo patamar em todos os animais; 3) efeito tubular caracterizado por
aumento significativo da diurese e natriurese apenas nos ratos normais
tratados com Rosiglitazone.
Estudo prévio demonstrou que a Rosiglitazone pode reduzir a filtração
glomerular em ratos normais (20) e camundongos (55). O mecanismo
provável para este efeito pode ser devido à ação vasodilatadora exercida
pelas Thiazolidinedionas diretamente na parede vascular das arteríolas
glomerulares (22) ou na redução da pressão arterial sistêmica (28, 37-39).
Estudos “in vitro” com cultura de célula muscular lisa sugerem que os
ligantes do PPAR podem interferir na sinalização via cálcio, bloqueando a
abertura dos canais VOCC do tipo L (23-25). Outros estudos sugerem que
50
as Thiazolidinedionas possuem ação nas células endoteliais (20,24,26,40) e
que também haveria a participação do óxido nítrico através do aumento da
expressão da enzima Oxido Nítrico Síntase (eNOS) (20). Entretanto, há
divergências se o aumento do óxido nítrico é via eNOS (26,39). Além da
inibição dos canais VOCC, das possíveis interferências do óxido nítrico, a
reatividade vascular também é modificada pelas Thiazolidinedionas devido a
melhora da sensibilidade à insulina que vem sendo apontada como fator
vasorelaxante (28).
A redução da filtração glomerular causada pela ação vasodilatadora
da Rosiglitazone quer seja por ação direta nas arteríolas glomerulares ou na
redução da pressão arterial sistêmica ocasiona resposta imediata sobre o
Sistema-Renina-Angiotensina-Aldosterona (SRAA). Este uma vez acionado
reduz a carga excretada de sódio (27). Assim, as Thiazolidinedionas podem
causar edema e a insuficiência cardíaca congestiva (ICC) (11, 15-19) devido
à retenção hidro-eletrolítica (12,13,21). Song J. e colaboradores (20)
demonstraram em ratos normais tratados com Rosiglitazone na dose de 94
mg/kg de dieta por 3 dias a ocorrência do aumento da expressão dos
transportadores tubulares renais de sódio associada à redução da filtração
glomerular. Entretanto, não ficou evidente se o aumento da expressão dos
transportadores foi conseqüente a uma modulação direta da Rosiglitazone
nos transportadores tubulares renais ou seria uma resposta à interferência
sistêmica exercida pela Rosiglitazone consequente à redução da filtração
glomerular.
51
O presente estudo mostrou que os ratos normais tratados com
Rosiglitazone na dose de 48 mg/kg de dieta por 8 dias apresentaram
redução da filtração glomerular, não alteraram a função tubular e não
mudaram os parâmetros referentes ao peso corpóreo e da pressão arterial
sistêmica. Entretanto, se observou aumento do peso do coração. Como já foi
referido anteriormente, o tratamento com Rosiglitazone não alterou a
pressão arterial sistêmica apesar desta droga ter efeito vasodilatador.
Considerando que a pressão arterial sistêmica é o produto do débito
cardíaco multiplicado pela resistência periférica, a observação do aumento
do peso do coração pode ser um sinal de insuficiência cardíaca devido a
uma resposta compensatória do coração a possível modificação na
resistência periférica. Estudos com ratos espontaneamente hipertensos e
com cães tratados com Rosiglitazone mostraram presença de hipertrofia
cardíaca e aumento da mortalidade pós-infarto (41-43). Como já foi referido
acima, neste estudo foi encontrado aumento significativo do peso do coração
nos ratos normais tratados com Rosiglitazone. Esta observação necessita de
uma especial investigação funcional e histológica do sistema cardio-vascular
para um melhor esclarecimento.
Estudos recentes demonstram que o ligante do PPAR pode também
ter ação na regulação da inflamação e da resposta isquêmica (10). Por isso,
as Thiazolidinedionas são também indicadas no tratamento das doenças
inflamatórias crônicas (44,45), e estudadas nos modelos experimentais de
infarto agudo do miocárdio (10) e da sepse (46,47). Vale lembrar que o risco
de hipotensão nesses casos não é desprezível. Então, na tentativa do
52
restabelecimento da hemodinâmica sistêmica ocorre a liberação de vários
agentes vasoconstritores entre eles a Ang II. Este agonista que tem papel
importante no restabelecimento da hemodinâmica sistêmica causa
vasoconstrição renal e também deflagra mecanismos de estresse oxidativo
(27,48). Então, a prescrição da Rosiglitazone que pode reduzir a filtração
glomerular poderá acarretar na instalação da IRA caso ocorra situação de
vasoconstrição mediada por Ang II.
No presente estudo, os ratos normais tratados com Rosiglitazone que
já apresentavam redução da filtração glomerular ao serem submetidos à
vasoconstrição aguda através da infusão de Ang II mostraram aumento
significativo da diurese e da natriurese.
Os rins são capazes de aumentar a excreção de sódio e água em
decorrência da elevação da pressão arterial e este mecanismo recebe o
nome de natriurese pressórica. No presente estudo, os ratos normais
tratados com Rosiglitazone não apresentaram mudanças na pressão arterial
sistêmica durante a infusão de Ang II. Portanto, os efeitos tubulares
encontrados não podem ser atribuídos ao mecanismo da natriurese
pressórica. Então, os efeitos tubulares associados à manutenção de uma
filtração glomerular reduzida encontrados nos animais normais tratados com
Rosiglitazone são sugestivos de lesão tubular e de provável instalação de
IRA.
A Na
+
,K
+
-ATPase é uma bomba que se localiza na membrana basal e
tem como função básica manter baixa a concentração intracelular de Na
+
e
alta a de K
+
. A atividade desta enzima é aumentada nos segmentos com
53
maior transporte de sódio. Portanto, a relação medula : córtex é de 2 a 3:1
nos rins de ratos (49). Na situação de isquemia renal, as células perdem a
sua capacidade energética e, portanto, a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase se
reduz de maneira drástica. Então, a relação da atividade da Na
+
,K
+
-ATPase
na medula em relação ao córtex tende a diminuir chegando a 1:1, ou seja, as
células isquêmicas deixam de realizar o transporte (27). Song e
colaboradores (20) demonstraram que o tratamento de ratos com
Rosiglitazone na dose de 94 mg/kg de dieta por 3 dias aumentou a
expressão da Na
+
,K
+
-ATPase da medula renal o que justificaria a retenção
de sódio. Entretanto, estes autores não mediram a atividade dessa enzima.
No presente estudo, a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase não se modificou nos
ratos normais tratados com Rosiglitazone na dose de 48 mg/kg de dieta por
8 dias, como também não apresentaram modificação na pressão arterial
sistêmica. Então, é de se esperar que a ausência do aumento da atividade
da Na
+
,K
+
-ATPase seja um indício de lesão tubular e por isso foi observada
a perda da capacidade de transporte tubular ao se infundir Ang II.
Outro dado interessante do nosso estudo refere-se ao grupo de ratos
hipercolesterolêmicos. Estes animais apresentaram a função renal
semelhante aos normais em condições basais, como já foi descrito
anteriormente (50). O tratamento com Rosiglitazone reduziu de maneira
significativa a concentração plasmática do colesterol total e dos triglicérides,
aumentou a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase medular e não modificou a filtração
glomerular na situação basal. A infusão aguda de Ang II reduziu a filtração
glomerular a valores semelhantes ao dos outros grupos de animais
54
estudados. Mas, não se observou aumento significativo da natriurese e da
diurese como ocorreu nos animais normais tratados com Rosiglitazone.
Portanto, o mecanismo de ação da Rosiglitazone na situação de
hipercolesterolemia difere ao da condição normal. Assim, os possíveis
efeitos colaterais da Rosiglitazone podem não ocorrer na situação de
hipercolesterolemia. Então, se justificam as conclusões dos estudos que
apontam as Thiazolidinedionas como drogas benéficas à função renal, uma
vez que se evidenciou melhora da hiperfiltração glomerular em ratos
Sprague-Dawley com Diabetes Mellitus tipo I induzido (51), nos ratos obesos
Zucker (52, 53) e na melhora da microalbuminúria nos pacientes com
Diabetes Mellitus tipo II (54). Nestas situações, o mecanismo da ação da
Rosiglitazone foi benéfica como também foi benéfico o tratamento com
Rosiglitazone aos ratos hipercolesterolêmicos neste estudo. Então, o
presente estudo sugere que deva ser realizado o controle da função renal
nos indivíduos normocolesterolêmicos tratados com Rosiglitazone que
tenham apresentado elevação da creatinina plasmática e principalmente se
estes se encontram em situação de instabilidade hemodinâmica.
55
7. CONCLUSÕES
Em condições basais, o tratamento com Rosiglitazone na dose de 48
mg/kg de dieta por 8 dias:
diminuiu os triglicérides e o colesterol total plasmáticos dos
ratos hipercolesterolêmicos. A diminuição do colesterol total plasmático foi
às custas da fração não-HDL-colesterol;
não modificou o ganho de peso e a composição hidro-
eletrolítica plasmática de nenhum grupo estudado (ratos normais e
hipercolesterolêmicos);
não alterou a pressão arterial sistêmica de nenhum grupo
estudado (ratos normais e hipercolesterolêmicos);
reduziu a filtração glomerular apenas dos ratos normais;
não modificou a diurese e a excreção urinário de sódio de
nenhum grupo estudado (ratos normais e hipercolesterolêmicos);
induziu o aumento da atividade da Na
+
,K
+
-ATPase da medular
renal apenas dos ratos hipercolesterolêmicos.
Em condições de vasoconstrição renal aguda induzida pela Ang II
observou-se:
elevação da pressão arterial sistêmica apenas nos ratos
normais sem o tratamento;
56
redução da filtração glomerular para o mesmo patamar em
todos os grupos de animais estudados (ratos normais e
hipercolesterolêmicos);
aumento significativo da diurese e da excreção urinaria de
sódio apenas nos animais normais tratados com Rosiglitazone.
Então, o presente estudo sugere que o mecanismo de ação da
Rosiglitazone em condições normais é diferente ao da hipercolesterolemia
porque:
a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase da medular renal modificou-se
apenas nos ratos hipercolesterolêmicos tratados com Rosiglitazone;
a redução da filtração glomerular não se modificou nos ratos
hipercolesterolêmicos tratados com Rosiglitazone em condições basais;
a presença de um vasoconstritor renal potente não causou
significativo aumento da diurese e natriurese nos ratos hipercolesterolêmicos
tratados com Rosiglitazone em condições basais.
Portanto, o controle da função renal dos indivíduos
normocolesterolêmicos sob tratamento com Rosiglitazone se faz necessário.
Esta recomendação será mais apropriada se esses pacientes apresentarem
instabilidade hemodinâmica, especialmente nas situações em que a Ang II
está presente.
57
8. ANEXOS
Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com
Rosiglitazone quanto ao:
ANEXO A -
Peso Inicial, final e variação de peso
ANEXO B -
Sódio, potássio e hematócrito
ANEXO C - Colesterol total, triglicérides e glicose
ANEXO D - LDL, HDL e VLDL-colesterol
ANEXO E - Ingestão de sólidos e líquidos
ANEXO F - Clearance de inulina nas condições basais e durante a
infusão de Ang II
ANEXO G - Pressão arterial na condição basal e durante a infusão
de Ang II
ANEXO H - Volume urinário na condição basal e durante a infusão
de Ang II
ANEXO I - Carga excretada de sódio nas condições basais e
durante a infusão de Ang II
ANEXOJ - Carga excretada de potássio na condição basal e
durante a infusão de Ang II
ANEXO K - Peso dos órgãos
ANEXO L - Atividade da ATPase Total, da Na
+
,K
+
-ATPase e da
ATPase Basal no córtex
ANEXO M - Atividade da ATPase Total, da Na
+
,K
+
-ATPase e da
ATPase Basal na medula externa
58
ANEXO A – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto ao peso
inicial, final e variação de peso
Peso inicial Peso final Variação peso
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 208,00 170,00 200,00 195,00 262,00 240,00 222,00 165,00 54,00 70,00 22,00 -30,00
2 220,00 170,00
200,00 210,00
247,00 252,00 220,00 182,00
27,00 82,00 20,00 -28,00
3
210,00
227,00
17,00
4 190,00 205,00
262,00 263,00
72,00 58,00 18,00
5 190,00
215,00 205,00
288,00 222,00 210,00
98,00 7,00 5,00
6 220,00 215,00
220,00 205,00
270,00 279,00 251,00 208,00
50,00 64,00 31,00 3,00
7 216,00 225,00
200,00 220,00
235,00 263,00 210,00 242,00
19,00 38,00 10,00 22,00
8 220,00
220,00
236,00 215,00
16,00 -5,00
9 200,00 220,00
210,00 190,00
245,00 285,00 212,00 234,00
45,00 65,00 2,00 44,00
10 190,00
200,00 230,00
232,00 220,00 242,00
42,00 20,00 12,00
11 210,00 205,00
200,00 205,00
260,00 246,00 250,00 252,00
50,00 41,00 50,00 47,00
12 200,00
190,00 230,00
215,00 235,00 264,00
15,00 45,00 34,00
13 175,00
180,00
207,00 221,00
32,00 41,00
14 180,00
180,00
235,00 223,00
55,00 43,00
15 230,00
277,00
47,00
16 210,00
238,00
28,00
n=12 n=10 n=13 n=9 n=12 n=10 n=13 n=9 n=12 n=10 n=13 n=9
M 204,1 202,0 201,9 210,0 252,2 251,1 225,2 222,1 48,1 49,1 22,9 12,1
DP 17,2 19,9 13,2 14,1 22,1 21,7 12,9 33,2 21,6 22,5 16,9 28,1
EP 5,0 6,3 3,6 1,8 6,4 6,9 3,6 4,3 6,2 7,1 4,7 3,7
59
ANEXO B – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto ao
sódio, potássio e hematócrito
Sódio Potássio Hematócrito
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 140,00 137,00
150,50 149,50
4,40 4,20 4,10 3,25
42,30 35,72 38,10 40,62
2 136,00 134,00
144,00 147,50
4,50 3,90 4,15 2,95
43,00 40,00 41,93 37,50
3
140,50
4,15
35,92
4 146,00 138,00
4,20 4,40
44,26 25,75 34,43
5 139,00
137,50 146,50
4,00 3,75 3,85
39,70 42,10 35,59
6 135,00 140,00
150,00 140,50
4,60 4,00 4,75 4,05
43,93 39,10 37,52 35,20
7 138,00 140,00
136,00 134,50
3,90 4,70 3,85 3,85
31,34 35,00 37,09 36,66
8 140,00
139,00
3,80 3,25
38,98 42,18
9 135,00 139,50
137,50 141,00
4,00 4,20 4,05 3,50
38,70 32,00 42,19 36,88
10 132,00
144,00 137,50
3,65 3,90 3,35
40,00 37,87 38,70
11 135,50 141,50
145,00 141,50
3,55 3,75 4,20 4,10
40,98 42,18 35,89 37,70
12 140,50
139,00 136,50
4,00 3,55 3,40
36,00 36,60 36,06
13 142,00
135,00
3,95 3,80
39,46 40,00
14 138,00
138,00
3,35 3,60
40,32 40,00
15 141,50
3,60
42,64
16 148,00
3,65
40,00
n=12 n=10 n=13 n=9 n=12 n=10 n=13 n=9 n=12 n=10 n=13 n=9
M 139,5 138,3 141,2 141,7 4,0 4,1 3,9 3,6 40,6 36,5 38,7 37,2
DP 4,2 3,1 5,1 5,2 0,4 0,3 0,4 0,4 3,4 4,8 2,7 1,7
EP 1,2 1,0 1,4 0,7 0,1 0,1 0,1 0,1 1,0 1,5 0,7 0,2
60
ANEXO C – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto ao
colesterol total, triglicérides e glicose
Colesterol total Triglicérides Glicose
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1
65,3 66,9 250,2 149,8
131,87 117,58 33,51 17,3
65,3 65,3 65,3
111,11
2
89,0 58,0 264,7 78,3
85,71 102,2 28,11 36,76
89,0 89,0 89,0
82,54
3
333,3
97,30
4
99,6 35,1
186,81 53,85
99,6 99,6 99,6
5
113,5 190,3 207,7
106,59 70,27 32,43
113,5 113,5 113,5
118,52
6
89,0 80,0 326,6 196,1
151,65 136,26 90,81 44,32
89,0 89,0 89,0
111,64
7
92,2 58,0 259,9 230,9
36,26 78,02 78,92 36,76
92,2 92,2 92,2
99,47
8
40,0 215,5
52,75 46,49
9
108,6 102,9 220,3 195,2
56,04 87,91 80,00 72,43
108,6 108,6 108,6
85,71
10
106,1 268,6 178,7
81 107,03 37,84 82,01
11
112,7 92,2 230,9 302,4
168,13 87,91 89,73 60,54
112,7 112,7 112,7
84,66
12
118,4 195,2 144,0
27,47 75,68 64,86 92,59
13
74,3 208,7
35,16 78,92
74,3 74,3 74,3
14
80,8 192,3
104,4 87,57
80,8 80,8 80,8
15 100,4
62,64 100,4 100,4 100,4
16
71,0
41,76
71,0 71,0 71,0
n=12 n=10 n=13 n=08 n=12 n=10 n=13 n=09 n=12 n=12 n=12 n=09
M 91,4 75,8 242,8 187,0 97,3 82,5 74,2 44,8 91,4 91,4 91,4 96,5
DP 16,2 28,7 47,3 62,2 53,1 32,2 24,1 17,7 16,2 16,2 16,2 14,2
EP 4,7 9,1 13,1 20,7 15,3 10,2 6,7 5,9
4,7 4,7 4,7 4,7
61
ANEXO D – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto ao
LDL, HDL e VLDL-colesterol
LDL
-
colesterol
HDL
-
colesterol
VLDL
-
colesterol
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 20,3 12,9 241,2 144,2 18,7 30,5 2,4 2,1 26,4 23,5 6,7 3,5
2 50,8 10,4 253,8 70,1 21,1 27,1 5,3 0,8 17,1 20,5 5,7 7,4
3 306,2 31,8 7,6 4,7 19,5
4 43,8 -7,5 18,4 12,9 8,9 7,6 37,4 10,8
5 73,7 167,3 196,5 18,4 15,0 9,5 9,7 21,3 14,1 6,5
6 28,9 39,9 298,9 179,6 29,7 22,1 2,6 9,5 30,3 27,2 18,2 8,9
7 64,7 27,4 241,5 213,8 20,3 17,6 8,7 6,8 7,3 15,6 15,8 7,4
8 7,3 197,5 12,6 1,3 10,6 9,3
9 73,9 67,6 171,2 23,4 20,5 11,2 17,6 14,5
10 77,2 164,3 24,5 16,3 7,6
11 53,5 54,1 206,7 289,0 25,5 6,3 33,6 17,6 12,1
12 88,4 179,2 0,8 5,5 9,7
13 35,2 189,0 32,1 3,9 7,0 18,9
14 32,0 27,9 20,9 17,5
15 60,5 27,4 12,5
16 44,0 144,2 18,7 8,4
n=12
n=10
n=13
n=08
n=12
n=10
n=10
n=08
n=12
n=10
n=10
n=08
M
48,45
37,77
208,0
178,6
23,46
21,47
5,61
5,33
19,45
16,51
13,52
8,48
DP
17,57
32,88
66,25
62,06
4,91
6,99
3,
08
3,62
10,62
6,43
5,27
3,42
EP
5,07
10,40
19,12
21,94
1,42
2,21
0,98
1,28
3,07
2,03
1,67
1,21
62
ANEXO E – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto ao
consumo de comida e a ingestão de água
Consumo comida Ingestão água
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 34,25 21,25 20,00 25,00 37,58 20,87 20,00 23,75
2 19,37 18,50 17,50 28,12 14,62 17,62 23,50 16,37
3 28,12 33,75
4 30,13 19,75 28,87 20,75
5 23,12 31,87 21,87 28,37 24,25 30,62
6 23,12 24,62 29,37 26,62 16,00 37,00 33,50 33,25
7 17,12 18,50 21,25 26,87 19,12 18,33 34,75 31,25
8 23,75 26,87 18,87 33,00
9 20,14 32,75 21,87 22,50 20,00 28,37 37,12 38,50
10 23,50 20,00 20,62 28,30 47,00 23,87
11 30,00 21,50 21,87 23,10 12,50 17,62 47,87 39,60
12 10,63 18,80 8,13 34,40
13 14,30 18,00
14 25,00 27,55
15 25,75 33,25
16 30,50 19,50
n=12
n=10
n=13
n=09
n=12
n=10
n=13
n=09
M
24,40
21,48
23,87
23,72
22,95
21,59
33,47
30,18
DP
6,05
5,62
4,79
3,13
7,93
7,89
9,26
7,57
EP
1,75
1,78
1,33
1,04
2,29
2,50
2,57
2,52
63
ANEXO F – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto ao
clearance de inulina na condição basal e durante a infusão de Ang II
Clearance de inulina
Basal Ang II
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 0,90 0,79 0,65 0,73 0,84 0,70 0,70 0,52
2 0,73 0,42 0,65 0,97 0,62 0,99 0,66 0,92
3 0,58 0,54
4 0,58 0,33 0,28 0,27
5 0,87 0,84 0,73 0,50 0,52 0,73
6 0,78 0,41 0,77 0,59 0,71 0,53 0,43 0,48
7 0,69 0,27 0,91 0,71 0,47 0,46 0,66 0,86
8 0,69 0,81 0,71 0,59
9 0,95 0,48 0,71 0,89 0,58 0,20 0,54 0,55
10 0,69 0,85 0,87 0,46 0,63 0,38
11 0,74 0,40 0,72 0,90 0,83 0,53 0,52 0,64
12 0,50 0,92 0,92 0,55 0,62 0,56
13 0,73 1,01 0,53 0,79
14 0,90 0,79 0,70 0,77
15 0,69 0,63
16 0,83 0,70
n=12
n=10
n=13
n=09
n=12
n=10
n=13
n=09
M
0,78
0,50
0,78
0,81
0,62
0,54
0,61
0,63
DP
0,11
0,17
0,12
0,13
0,16
0,23
0,
10
0,18
EP
0,03
0,05
0,03
0,04
0,04
0,07
0,03
0,06
64
ANEXO G – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto a
pressão arterial na condição basal e durante a infusão de Ang II
Pressão Arterial
Basal Ang II
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 90,50 128,00 145,00 122,50 111,50 128,00 147,25 122,25
2 134,50 125,00 137,50 131,50 144,00 128,00 140,25 128,50
3 142,50 143,00
4 132,00 107,50 155,00 110,00
5 116,50 125,00 133,50 127,50 123,00 136,00
6 122,50 127,50 142,00 130,50 128,50 133,00 146,25 131,25
7 127,50 128,50 130,00 132,50 126,50 133,50 126,00 139,25
8 133,50 156,00 137,00 161,75
9 130,00 132,50 114,00 138,00 138,00 131,00 115,25 140,00
10 149,50 128,50 136,50 149,00 124,00 137,75
11 135,50 134,00 137,00 121,00 135,25 135,25 138,00 121,75
12 136,50 142,50 132,25 126,00 140,00 134,75
13 136,50 137,00 140,00 134,00
14 137,50 137,00 139,50 140,75
15 131,00 137,75
16 124,00 128,25
n=12
n=10
n=13
n=09
n=12
n=10
n=13
n=09
M
126,5
130,3
136,5
130,9
134,3
131,1
136,9
132,4
DP
13,0
10,5
10,4
5,7
10,9
9,8
12,4
6,9
EP
3,7
3,3
2,9
1,9
3,1
3,1
3,4
2,3
65
ANEXO H – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto ao
volume urinário na condição basal e durante a infusão de Ang II
Volume urinário
Basal Ang II
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 9,82 11,68 8,63 5,24 10,28 48,35 11,50 6,53
2 4,83 4,43 5,27 5,30 5,92 50,45 10,13 10,73
3 3,17 8,20
4 10,15 10,78 11,65 11,95
5 11,95 9,22 5,37 8,26 12,38 19,60
6 6,73 17,60 19,63 12,03 13,05 58,48 14,75 4,57
7 7,13 11,93 11,73 5,94 10,25 73,13 25,23 21,35
8 8,09 21,47 25,58 42,50
9 7,38 3,59 17,72 7,25 14,03 6,74 31,03 12,73
10 14,37 9,58 9,00 78,65 7,57 7,65
11 5,53 7,30 9,87 7,73 16,18 36,40 7,53 19,93
12 9,02 16,98 6,89 14,63 41,03 14,45
13 5,03 6,72 6,40 10,78
14 6,60 9,30 11,53 17,70
15 7,98 64,00
16 4,70 18,03
n=12
n=10
n=13
n=09
n=12
n=10
n=13
n=09
M
7,32
9,88
11,48
7,19
15,80
40,44
18,49
13,06
DP
2,31
4,32
5,70
2,22
15,60
25,53
12,46
6,23
EP
0,67
1,37
1,58
0,74
4,50
8,07
3,46
2,08
66
ANEXO I – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto a carga
excretada de sódio na condição basal e durante a infusão de Ang II
Carga excretada de sódio
Basal Ang II
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 0,89 2,22 0,73 0,18 0,70 10,05 1,44 0,62
2 0,55 0,55 0,71 0,74 0,82 7,56 1,53 2,09
3 0,29 0,70
4 1,29 0,65 2,02 1,22
5 3,37 0,70 0,61 11,56 2,41 1,43
6 0,89 3,28 1,88 1,61 1,51 10,62 1,55 0,53
7 0,71 1,77 2,01 0,70 1,57 4,75 5,18 3,66
8 0,98 3,55 5,04 4,92
9 0,55 0,28 2,36 1,43 3,67 1,43 4,86 2,95
10 3,82 1,37 1,32 7,88 1,44 2,31
11 0,79 1,67 0,68 0,50 3,87 6,65 1,19 3,28
12 1,33 1,50 0,73 3,39 2,84 3,20
13 0,64 1,50 1,18 2,62
14 0,82 1,11 3,01 3,56
15 0,79 6,23
16 0,63 3,68
n=12
n=10
n=13
n=
09
n=12
n=10
n=13
n=09
M
0,97
1,66
1,42
0,87
3,32
5,86
2,63
2,23
DP
0,77
1,17
0,89
0,48
3,06
3,28
1,55
1,16
EP
0,22
0,37
0,24
0,16
0,88
1,04
0,43
0,39
67
ANEXO J – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto a carga
excretada de potássio na condição basal e durante a infusão de Ang II
Carga excretada de Potássio
Basal Ang II
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 0,61 1,25 0,86 0,12 1,39 3,00 1,19 0,57
2 0,64 0,47 0,55 0,42 1,20 3,07 0,85 0,69
3 0,24 0,70
4 1,10 0,81 0,63 0,95
5 1,87 1,10 0,49 2,07 1,29 1,50
6 1,00 1,34 0,96 1,13 1,88 2,81 1,24 0,40
7 0,54 1,35 0,86 0,55 0,99 1,65 1,38 1,39
8 0,95 0,74 1,84 0,74
9 1,34 0,33 1,47 1,34 1,12 0,83 1,69 1,64
10 0,97 1,33 0,87 1,57 1,21 0,84
11 0,64 1,34 0,75 0,84 0,71 3,14 1,11 1,22
12 1,84 1,86 0,47 2,14 5,95 1,13
13 0,53 0,49 0,73 0,43
14 0,96 0,95 1,29 1,96
15 0,59 2,88
16 0,48 1,32
n=12
n=10
n=13
n=09
n=12
n=10
n=13
n=09
M
0,9
1,1
0,9
0,7
1,4
2,1
1,5
1,0
DP
0,4
0,5
0,4
0,4
0,7
0,9
1,4
0,4
EP
0,1
0,1
0,1
0,1
0,2
0,3
0,4
0,1
68
ANEXO K– Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto ao
peso dos órgãos nos animais
Coração Rins Adrenais
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 0,41 0,47 0,45 0,50 0,46 0,46 0,46 0,59 0,01 0,01 0,02 0,02
2 0,40 0,53 0,40 0,42 0,45 0,43 0,37 0,40 0,01 0,01 0,01 0,01
3 0,40 0,40 0,01
4 0,48 0,42 0,42 0,40 0,01 0,01
5 0,43 0,39 0,42 0,38 0,39 0,43 0,01 0,01 0,01
6 0,43 0,50 0,35 0,40 0,37 0,37 0,34 0,42 0,01 0,01 0,01 0,01
7 0,41 0,41 0,44 0,39 0,38 0,40 0,45 0,44 0,01 0,01 0,01 0,01
8 0,45 0,46 0,39 0,43 0,01 0,02
9 0,41 0,52 0,51 0,55 0,38 0,40 0,43 0,44 0,01 0,01 0,01 0,01
10 0,50 0,45 0,43 0,42 0,47 0,39 0,00 0,01 0,01 0,01
11 0,42 0,50 0,43 0,49 0,39 0,37 0,42 0,40 0,01 0,01 0,01 0,01
12 0,42 0,45 0,42 0,34 0,45 0,46 0,01 0,01 0,01
13 0,41 0,44 0,39 0,42 0,01 0,02
14 0,43 0,44 0,43 0,42 0,01 0,01
15 0,41 0,38 0,01
16 0,42 0,38 0,01
n=12
n=10
n=13
n=09
n=12
n=10
n=13
n=09
n=12
n=10
n=13
n=09
M
0,42
0,47
0,43
0,45
0,40
0,40
0,42
0,44
0,011
0,012
0,013
0,012
DP
0,02
0,05
0,04
0,05
0,03
0,03
0,04
0,06
0,004
0,002
0,001
0,003
ep
0,01
0,01
0,01
0,02
0,01
0,01
0,01
0,02
0,001
0,001
0,000
0,001
69
ANEXO L – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto a
atividade da ATPase Total, da Na
+
,K
+
-ATPase e da ATPase Basal no córtex
ATPase total Na
+
,K
+
-ATPase ATPase basal
Córtex Córtex Córtex
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 49,6 49,6 43,5 45,7 29,7 30,1 21,7 21,5 19,9 19,4 21,8 24,2
2 21,7 32,3 43,4 44,1 9,2 18,2 19,0 20,8 12,5 14,1 24,3 23,3
3 40,8 52,1 45,9 21,8 21,8 28,9 19,0 30,3 17,1
4 35,4 50,5 39,5 58,7 26,7 18,0 24,5 38,2 8,7 32,6 15,0 20,4
5 44,7 52,5 42,0 47,6 19,5 28,5 10,7 22,7 25,3 24,0 31,2 24,9
6 43,1 39,1 31,4 36,9 19,9 20,0 6,0 15,6 23,2 19,1 25,4 21,2
7 55,6 42,6 22,0 34,6 33,6 8,1
8 52,0 25,1 20,0 19,5 32,0 5,6
9 46,1 58,8 14,2 31,8 31,9 27,0
10 33,0 50,8 9,5 25,1 23,5 25,7
n=6 n=10 n=6 n=5 n=6 n=10 n=6 n=9 n=6 n=10 n=6 n=9
M
39,2
46,3
41,0
45,6
21,1
20,2
18,4
25,5
18,1
26,0
22,4
20,0
DP
9,8
8,5
5,1
10,5
7,1
6,1
8,6
7,6
6,3
6,9
5,9
7,8
EP
3,9
2,7
2,1
3,5
2,9
1,9
3,5
2,5
2,6
2,2
2,4
2,6
70
ANEXO M – Valores individuais dos animais do grupo NC e HC tratados ou não com Rosiglitazone quanto a
atividade da ATPase Total, da Na
+
,K
+
-ATPase e da ATPase Basal na medula externa
ATPase total Na
+
,K
+
-ATPase ATPase basal
Medula Medula Medula
NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL NC NC+RGL HC HC+RGL
1 69,9 54,2 75,5 78,3 51,7 46,6 42,4 48,0 18,2 7,6 33,1 30,3
2 33,9 58,2 67,7 94,1 19,6 31,5 43,7 42,9 14,3 26,7 23,9 51,2
3 92,3 101,2 80,6 98,0 67,8 71,5 61,5 24,4 29,7 19,2 38,9
4 51,0 56,9 89,2 114,4 44,0 33,5 73,4 73,1 7,0 23,4 15,8 41,4
5 61,5 51,8 82,8 97,1 38,0 19,6 41,5 64,0 23,6 32,2 41,2 33,1
6 74,5 51,0 66,0 86,8 50,9 17,7 26,1 58,2 23,6 33,2 39,9 28,7
7 84,8 56,1 51,2 67,0 33,6 -10,9
8 104,9 46,6 57,9 78,2 47,1 -31,6
9 84,1 101,0 54,8 70,0 29,3 31,0
10 72,2 111,8 43,2 75,6 29,0 36,2
n=6 n=10 n=6 n=10 n=6 n=10 n=6 n=9 n=6 n=10 n=6 n=10
M
63,8
71,9
76,9
88,4
45,3
42,7
48,1
64,1
18,5
29,1
28,8
24,8
DP
20,1
20,6
9,0
22,3
16,1
17,2
16,7
12,2
6,9
9,8
10,8
25,6
EP
8,2
6
,5
3,7
7,0
6,6
5,4
6,8
4,1
2,8
3,1
4,4
8,1
71
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*De acordo com:
Adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver).
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de
Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de
dissertações, teses e moografias da FMUSP. Eleborado por
Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia A. L. Freddi, Maria F.
Crestana, Marinalva de S. Aragão, Suely C. Cardoso, Valéria
Vilhena. 2ª ed. São Paulo: Serviço de Biblioteca e
Documentação; 2005.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of
Journals Indexed in Index Medicus.
78
10. APÊNDICES
Apêndice 1 –
Dietas
Apêndice 2 –Solução de vitaminas
Tiamina............................... 0,6 g/l
Caseína............................... 0,6 g/l
Piridoxina............................ 0,6 g/l
Pantotenato de Cálcio........ 0,2 g/l
Ácido Nicotínico.................. 1,0 g/l
Cloreto de Colina................ 30,0 g/l
Biotina................................. 0,002 g/l
Ácido Fólico........................ 0,004g/l
Inositol................................. 0,08 g/l
Ácido p-amino Benzóico..... 6,0 g/l
Vitamina K........................... 0,2 g/l
Vitamina B12...................... 0,6 g/l
Apêndice 3 –- Mistura de sais (para cada kg de dieta)
NaCl.............................. 2,0 g/kg
MgSO
4
. 7H
2
O.............. 2,29 g/kg
CaCO
3.....................................
15,32 g/kg
FeSO
4
. 7H
2
O............... 1,08 g/kg
MnSO
4 .
H
2
O................. 0,16 g/kg
ZnSO
4
. 7H
2
O............... 0,022 g/kg
CuSO
4
. 5H
2
O............... 0,02 g/kg
CoCl . 6 H
2
O................. 0,009 g/kg
Nal................................ 0,0282 g/kg
NaH
2
PO
4
. H
2
O............. 15,56 g/kg
KCL............................... 8,55 g/kg
Composição da
dieta Normal
Composição da dieta
rica em Colesterol
Amido de milho................... 700 g/kg 665 g/kg
Caseína ............................. 200 g/kg 190 g/kg
Óleo de milho...................... 50 ml/kg 47,5 ml/kg
Óleo de fígado de bacalhau 10 ml/kg 9,5 ml/kg
Solução de vitaminas.......... 50 ml/kg 50 ml/kg
Mistura de sais.................... 40 g/kg 40 g/kg
Colesterol............................ - 19,4 g/kg
Ácido cólico......................... - 9,6 g/kg
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