( PDF ) Desenvolvimento de ferramentas sorológicas e moleculares para identificação de vírus em videiras e cochonilhas, alterações fisiológicas e na qualidade enológica da uva de videiras infectadas

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA

SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANIDADE

MARCOS FERNANDO BASSO

DESENVOLVIMENTO DE FERRAMENTAS SOROLÓGICAS E MOLECULARES PARA

IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS EM VIDEIRAS E COCHONILHAS, ALTERAÇÕES

FISIOLÓGICAS E NA QUALIDADE ENOLÓGICA DA UVA DE VIDEIRAS

INFECTADAS

PONTA GROSSA

2010

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MARCOS FERNANDO BASSO

DESENVOLVIMENTO DE FERRAMENTAS SOROLÓGICAS E MOLECULARES PARA

IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS EM VIDEIRAS E COCHONILHAS E ALTERAÇÕES

FISIOLÓGICAS E NA QUALIDADE ENOLÓGICA DA UVA DE VIDEIRAS

INFECTADAS

Dissertação apresentada para obtenção do título de

mestre em Agronomia na Universidade Estadual de

Ponta Grossa, Área de concentração: Agricultura.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Antonio Ayub

Co-orientadores: Dra. Carolina Weigert Galvão

Dr. Thor Vinícius Martins Fajardo

PONTA GROSSA

2010

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III

“Pouca Ciência torna os homens orgulhosos, muita Ciência torna-os humildes.

Assim, como as espigas vazias elevam a cabeça soberba, as cheias inclinam-se humildemente

para a terra”. (Anônimo)

“O mundo precisa de pessoas mais simples e transparentes, que trabalhem para

realizar seus projetos de vida e não para impressionar os outros”. (Roberto Shinyashiki)

“Prefiro morrer como homem, a que me acovardar por de trás de uma conquista sem

ter lutado por ela”. (Autor desconhecido)

Dedico este trabalho aos meus pais, Irineu e Delvina Giacomini Basso pela

confiança, compreensão, amor e principalmente pelo apoio para que meus objetivos se

tornassem realidade. Ao Dr. Thor V. M. Fajardo, pela excelente co-orientação, pela

confiança e pela oportunidade do desenvolvimento do trabalho e do aprendizado. A essas

pessoas, dedico e agradeço, o sucesso deste trabalho é graças a vocês.

Muito obrigado!

AGRADECIMENTOS

Agradeço a DEUS, por iluminar e guiar minha vida, aos meus pais pelo apoio, incentivo e incansável

disposição e aos meus irmãos: Marcelo, Márcia e Maurício pela amizade.

Ao Faustino e Tiago Fresqui e a Larissa Basso, pela amizade e alegria de sempre.

Aos professores Dr. Ricardo Antonio Ayub e Dra. Carolina Weigert Galvão pela orientação na parte

acadêmica.

Aos professores, colegas e funcionários do Departamento de Fitotecnia e Fitossanidade e a

coordenação do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, em especial, ao Prof. Dr. David S. J. Filho.

Em especial, ao Dr. Thor V. M. Fajardo pela excelente co-orientação em todo o trabalho teórico e

prático, pela confiança e oportunidade, pela amizade, dedicação, disponibilidade e, principalmente, pelo exemplo

de profissional. Ao Marcos Fernando Vanni, pelos valiosos ensinamentos, auxílio no desenvolvimento dos

trabalhos e acima de tudo por sua atenção e amizade.

A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa Uva e Vinho) por permitir e auxiliar no

desenvolvimento deste trabalho em seus laboratórios e vinhedos experimentais.

Ao Dr. Marcelo Eiras pelo auxílio nos trabalhos, incentivo, pelos valiosos conselhos e amizade.

À Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Paraná, pela

concessão da bolsa de estudos.

Aos doutores Osmar Nickel, Henrique P. dos Santos, Celito C. Guerra e Marcos Botton, pela

amizade, incentivo e auxílio na condução dos trabalhos.

Aos técnicos da Embrapa: Vanessa Buffon, Celso G. R. Oliveira, Gisele E. Perissutti, Daniel A.

Souza, Heitor Corbelini, Fabrício A. B. Barbosa, Ronaldo A. Regla e Roque A. Zílio pelo auxílio, amizade e

motivação em contribuir.

Aos amigos que tornaram as horas de trabalho muito mais agradáveis: Fabiana de Souza, Sheila

Montipó, Jakeline K. Poppe, Norma M. da Silva, Fernando Gomes, Catherine Ribeiro, Maiara Good, Rafael M.

Etto, Fernanda Almeida, Isabel Stets, Marcelo Sozim, Mariane Gioppo, Tânia Eidan, Jaciara Gonçalves, Mario

Naldoni, Thiago Senne, Diogo Manzano, Leonardo Cury e Clever Briedis.

Aos colegas da Pousada Embrapa: Daniel Bernardi, Marcelo Zart, Leonardo Ferrari, Tatiane Storch,

Cindy Chaves, Natalia Pungillo, Ednaldo, Aline, Renata, Ruben e Cintia, pela amizade.

Aos professores e bons amigos: Dr. Francisco M. Zerbini Júnior, Dr. Vera Quecini, Dr. Marco A.

Dalbó, Dr. Luiz A. Biasi, Dr. César M. Baratto, Dra. Jane M. L. N. Gelinski, Dr. Guilherme Schnell e Schühli,

Dr. Marcos Gonçalves, Dr. Alexandre Levi, Prof. Vinícius Caliari e Leandro Crestani pelos bons conselhos,

amizade e ensinamentos.

A Vinícola Salton e ao Eng. Agrônomo Agliberto Bianchi pela disponibilização de seus vinhedos para

condução de parte do trabalho experimental.

A todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho.

Meu sincero agradecimento!

VII

RESUMO

A videira (Vitis spp.), por ser propagada vegetativamente, facilita a disseminação dos vírus. O

objetivo do Capítulo I foi identificar e caracterizar molecularmente os vírus presentes em dois

vinhedos antigos: um da cv. Cabernet Sauvignon (CS) (Vitis vinifera) de 1995 e outro da cv.

Isabel (V. labrusca) de 1971 além de detectar sorologicamente tais isolados. Foram

amplificados, por RT-PCR, fragmentos que compreendem genes virais completos ou parciais,

utilizando-se 17 pares de oligonucleotídeos específicos para a detecção dos seguintes vírus:

Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine virus D (GVD), Grapevine

fleck virus (GFkV), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV), Grapevine

chrome mosaic virus (GCMV), Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine

leafroll-associated virus 1 a 4 (GLRaV-1 a -4), além de oligonucleotídeos degenerados para a

família Betaflexiviridae e os gêneros Closterovirus, Trichovirus e Vitivirus. Pelo menos um

fragmento amplificado, para cada par de oligonucleotídeos, foi clonado e sequenciado,

identificando-se sete isolados de RSPaV, três de GLRaV-2 e dois de GLRaV-3. As sequências

obtidas e depositadas no GenBank apresentaram identidades superiores a 90% com os

respectivos isolados virais do GenBank. Também GVA, GVB e GLRaV-3 foram detectados

via RT-PCR, em três de cinco amostras de cochonilhas coletadas em vinhedos de Caxias do

Sul (RS) e Petrolina (PE). A variabilidade genética do RSPaV e a indisponibilidade de anti-

soro comercial têm dificultado a detecção deste vírus em videiras. No Capítulo II o objetivo

foi produzir anti-soro policlonal utilizando a proteína capsidial (CP) recombinante do RSPaV.

O gene completo da CP deste vírus foi previamente amplificado, clonado e sequenciado e,

posteriormente subclonado em vetor de expressão pRSET-B, sendo o plasmídeo recombinante

utilizado para a expressão em Escherichia coli BL21:DE3. O rendimento foi de 17,35 µg de

CP do RSPaV expressa por ml de cultura, sendo utilizados 2,55 mg para a imunização do

coelho. O anti-soro produzido apresentou uma concentração de 1939 µg de IgG/ml, foi capaz

de reconhecer a proteína recombinante em Western blot e detectar o RSPaV em tecidos

infectados de videira em ELISA indireto. De forma geral, os vírus são capazes de induzir

desordens na célula vegetal que incluem alterações fotossintéticas e metabólicas, refletindo na

qualidade da uva. No Capítulo III estudaram-se as alterações fisiológicas e da qualidade

enológica da uva produzida em videiras infectadas com os vírus GLRaV-2 e RSPaV. Foram

determinados nas folhas: potencial fotossintético, clorofilas total (a e b), açúcares solúveis

totais e amido. Quanto às variáveis de qualidade da uva, foram observadas diferenças

VIII

significativas, em favor das uvas de plantas sadias, em 5 das 6 variáveis. Uvas sadias

apresentaram 2,53 (C. Franc, CF) e 2,72 (CS) °Brix a mais do que as infectadas. Para as

variáveis relacionadas às alterações fisiológicas foram observadas diferenças significativas,

em favor das folhas sadias ou assintomáticas, para quase todas variáveis analisadas, sendo a

fotossíntese de saturação 2,9 (CF) e 2,25 (CS) vezes superior em plantas sadias. Estes vírus

podem comprometer a produtividade e a qualidade da produção destas cultivares.

Palavras-chave: Vitis, diagnose, variabilidade, sorologia, qualidade da uva.

ABSTRACT

The grapevine (Vitis spp.) being vegetatively propagated facilitates the spread of viruses. In

general, viruses are able to induce disorders in plant cells including photosynthesis and

metabolic changes, causing alterations in grape quality. The purpose of Chapter I was to

identify and molecularly characterize the viruses present in vector mealybugs in two

establised vineyards (Rio Grande do Sul, Brazil), one of cv. Cabernet Sauvignon (Vitis

vinifera), cultivated since 1995, and the of cv. Isabel (V. labrusca), cultivated since 1971.

Plants were checked serologically for six viruses detected. Fragments that comprise complete

or partial viral genes were amplified by RT-PCR using 17 pairs of specific primers for

detection of the following viruses: Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB),

Grapevine virus D (GVD), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine fanleaf virus (GFLV),

Arabis mosaic virus (ArMV), Grapevine chrome mosaic virus (GCMV), Rupestris stem

pitting-associated virus (RSPaV) and Grapevine leafroll-associated virus 1-4 (GLRaV-1 to -

4). Degenerate primers were used for detection of Closterovirus, Trichovirus and Vitivirus

genera and Betaflexiviridae family. For each primer pair at least one amplicon was cloned and

sequenced, identifying seven isolates of RSPaV, three isolates of GLRaV-2 and two isolates

of GLRaV-3. The obtained sequences (submitted to GenBank) showed identities higher than

90% with the homologous viral isolates from the GenBank. GVA, GVB and GLRaV-3 were

detected in three of five samples of mealybugs collected in Caxias do Sul (RS) and Petrolina

(PE) vineyards. High genetic variability of RSPaV and unavailability of commercial

antiserum have impaired the detection of this virus in grapevines. In Chapter II the objective

was to produce polyclonal antiserum against the recombinant coat protein (CP) of RSPaV.

The complete CP gene of this virus was amplified, cloned, sequenced and subcloned into

expression vector pRSET-B, and the recombinant plasmid was used for expression in

Escherichia coli cells (strain BL21:DE3). The yield of RSPaV CP, expressed per ml of

culture, was 17.35 µg for rabbit immunization 2.55 mg were used. The antiserum showed a

concentration of 1939 µg IgG/ml which was able to recognize the recombinant protein in

Western blot and detect RSPaV in grapevine infected tissues using the indirect ELISA

technique. In Chapter III physiological alterations of plant and enological quality changes of

the grapes from infected grapevines GLRaV-2 and RSPaV infected were studied. For these

evaluations the photosynthetic potential, total chlorophyll (a and b), total soluble sugars and

starch were determined in leaves. Healthy or asymptomatic leaves showed favourable values

for almost all characteristics. The saturation photosynthesis was 2.9 (C. Franc) and 2.25 (C.

Sauvignon) times higher in healthy than in infected grapevines. Considering the grape quality

significant differences between grapes from infected and non-infected grapevine were also

observed in five from six characteristics studied. Healthy grapes showed 17.88 (cv. C. Franc)

and 16.10 (cv. C. Sauvignon)

Brix values while infected showed 15.35 and 13.38,

respectively. Therefore, these viruses can damage the productivity and quality production of

these grape cultivars.

Key-words: Vitis, diagnosis, variability, serology, quality of grapes.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

CAPÍTULO I:

Figura 1 - Sintomas de infecção viral nas folhas e no tronco/porta-enxerto em videira cv. Cabernet

Sauvignon e ausência de sintomas de infecção viral na cv. Isabel. Início do ciclo vegetativo (estacas

propagadas em casa de vegetação provenientes das plantas avaliadas neste trabalho), meio e final do

ciclo vegetativo (aspecto das folhas, tronco e ramos das mesmas plantas a campo).............................12

Figura 2 - Eletroforese em gel de agarose dos produtos da RT-PCR. Géis: (A) RSPaV-SY

(SY9F/SY8R); (B) RSPaV (RSPaV_v1/RSPaV_c1); (C) Closterovirus (HSP-P1/HSP-P2); (D)

Tricho/Vitivirus (dPR1_v/dPR2_c); (E): Betaflexiviridae (dRW up1/dRW do2); (F) RSPaV

(RSP2/RSP21), GLRaV-2 (V2CPf/V2CPr2), GLRaV-3 (LR3 8504/LR3 9445); (G) RSPaV

(RSP2/RSP21), GLRaV-2 (V2CPf/V2CPr2), GLRaV-3 (LR3 8504/LR3 9445). M: marcador

DNAλ/PstI, SD: planta sadia, CS1 e CS2: plantas cv. Cabernet Sauvignon, IS1, IS2 e IS3: plantas cv.

Isabel......................................................................................................................................................23

Figura 3 - Árvore filogenética por parcimônia, não enraizada, obtida com o software MEGA 4.1,

baseada nas sequências de nucleotídeos do gene da proteína capsidial (780 pb) dos isolados de

Rupestris stem pitting-associated virus. Valores percentuais de “bootstrap” são mostrados nos ramos.

As barras indicam número de substituições de nucleotídeos por sítio (50 = 0,05). Códigos dos

nucleotídeos dos isolados no GenBank e país: RSPaV (AF026278, EUA), RSPaV-1 (NC_001948,

EUA), SG1 (AY881626, EUA), BS (AY881627, Canadá), SY (AY368590, EUA), PN (AY368172,

EUA), CS1 (GU166290, Brasil), IS2a (GU166289, Brasil), CF207 (EF636804, Brasil) e RSP-SP

(DQ443732, Brasil). Para o grupo externo da árvore foi utilizado a espécie tipo do gênero: Apple stem

pitting virus (ASPV, Foveavirus, NC_003462).....................................................................................26

Figura 4 - Árvore filogenética por parcimônia, não enraizada, obtida com o software MEGA 4.1,

baseada nas sequências parciais de nucleotídeos do gene (339 pb) da proteína replicase de isolados de

Rupestris stem pitting-associated virus. Valores percentuais de “bootstrap” são mostrados nos ramos.

As barras indicam número de substituições de nucleotídeos por sítio (10 = 0,01). Códigos dos

nucleotídeos dos isolados no GenBank e país: RSPaV (AF026278, EUA), RSPaV-1 (NC_001948,

EUA), SG1 (AY881626, EUA), BS (AY881627, Canadá), SY (AY368590, EUA), PN (AY368172,

EUA), CS2b (HM059038, Brasil), Hai1 (AB277787, Japão), IS2b (HM358051, Brasil). Para o grupo

externo da árvore foi utilizado á espécie tipo do gênero: Apple stem pitting virus (ASPV, Foveavirus,

NC_003462)...........................................................................................................................................28

Figura 5 - Árvore filogenética por parcimônia, não enraizada, obtida com o software MEGA 4.1,

baseada nas sequências parciais de nucleotídeos do gene (831 pb) da proteína replicase dos isolados de

Rupestris stem pitting-associated virus. Valores percentuais de “bootstrap” são mostrados nos ramos.

As barras indicam número de substituições de nucleotídeos por sítio (50 = 0,05). Códigos dos

nucleotídeos dos isolados no GenBank e país: RSPaV (AF026278, EUA), RSPaV-1 (NC_001948,

EUA), SG1 (AY881626, EUA), BS (AY881627, Canadá), SY (AY368590, EUA), PN (AY368172,

EUA), CS2a (HM059036, Brasil), IS1 (HM059037, Brasil). Para o grupo externo da árvore foi

utilizado a espécie tipo do gênero: Apple stem pitting virus (ASPV, Foveavirus, NC_003462)...........30

Figura 6 - Árvore filogenética por parcimônia, não enraizada, obtida com o software MEGA 4.1,

baseada nas sequências parciais de nucleotídeos do gene (628 pb) da proteína replicase dos isolados de

Rupestris stem pitting-associated virus. Valores percentuais de “bootstrap” são mostrados nos ramos.

As barras indicam número de substituições de nucleotídeos por sítio (20 = 0,02). Códigos dos

nucleotídeos dos isolados no GenBank e país: RSPaV (AF026278, EUA), RSPaV-1 (NC_001948,

EUA), SG1 (AY881626, EUA), BS (AY881627, Canadá), SY (AY368590, EUA), PN (AY368172,

EUA), IS3 (HM130524, Brasil). Para o grupo externo da árvore foi utilizado a espécie tipo do gênero:

Apple stem pitting virus (ASPV, Foveavirus, NC_003462). .................................................................32

Figura 7 - Árvore filogenética por parcimônia, não enraizada, obtida com o software MEGA 4.1,

baseada nas sequências parciais de nucleotídeos do gene (431 pb) da proteína capsidial dos isolados de

Grapevine leafroll-associated virus 2. Valores percentuais de “bootstrap” são mostrados nos ramos. As

barras indicam número de substituições de nucleotídeos por sítio (20 = 0,02). Códigos dos

nucleotídeos dos isolados no GenBank: PN (AF039204, EUA), 93/955 (NC_007448, África do Sul),

RG (AF314061, EUA), BD (DQ286725, Itália), H4 (AY697863, Itália), CS2 (HM059035, Brasil), IS3

(HM358050, Brasil). Para o grupo externo da árvore foi utilizado a espécie tipo do gênero: Beet

yellows virus (BYV, Closterovirus, NC_001598)..................................................................................34

Figura 8 - Árvore filogenética por parcimônia, não enraizada, obtida com o software MEGA 4.1,

baseada nas sequências parciais de nucleotídeos do gene (623 pb) da proteína HSP70 dos isolados de

Grapevine leafroll-associated virus 2. Valores percentuais de “bootstrap” são mostrados nos ramos. As

barras indicam número de substituições de nucleotídeos por sítio (50 = 0,05). Códigos dos

nucleotídeos dos isolados no GenBank e país: PN (AF039204, EUA), 93/955 (NC_007448, África do

Sul), RG (AF314061, EUA), BD (DQ286725, Itália), Alfie (AY456132, Nova Zelândia), SE

(HM130523, Brasil), CS1 (HM059039, Brasil), PV20 (EF012721, França). Para o grupo externo da

árvore foi utilizado a espécie tipo do gênero: Beet yellows virus (BYV, Closterovirus, NC_001598). 36

XII

Figura 9 - Árvore filogenética por parcimônia, não enraizada, obtida com o software MEGA 4.1,

baseada nas sequências completas (942 pb) de nucleotídeos do gene da proteína capsidial dos isolados

de Grapevine leafroll-associated virus 3. Valores percentuais de “bootstrap” são mostrados nos ramos.

As barras indicam número de substituições de nucleotídeos por sítio (50 = 0,05). Códigos dos

nucleotídeos dos isolados no GenBank e país: GP18 (EU259806, África do Sul), Pet4 (AY753208,

Brasil), Pet1 (DQ680141, Brasil), Pet2 (DQ680142, Brasil), Cl766 (EU344893, Chile), DW2

(DQ119574, China), Pet3 (DQ062152, Brasil), IS2 (HM059034, Brasil), NY (NC_004667, EUA).

Para o grupo externo da árvore foi utilizado a espécie: Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-

1, Ampelovirus, AF195822)...................................................................................................................38

Figura 10 - Árvore filogenética por parcimônia, não enraizada, obtida com o software MEGA 4.1,

baseada nas sequências parciais (593 pb) de nucleotídeos do gene da proteína HSP70 dos isolados de

Grapevine leafroll-associated virus 3. Valores percentuais de “bootstrap” são mostrados nos ramos. As

barras indicam número de substituições de nucleotídeos por sítio (50= 0,05). Códigos dos nucleotídeos

dos isolados no GenBank e país: GP18 (EU259806, África do Sul), WC-HSP-2 (EF103903, África do

Sul), M.T (AH013319S2, República Tcheca), NY (NC_004667, EUA), CL766 (EU344893, Chile),

NZ-1 (EF508151, Nova Zelândia), WC-HSP-10 (EF103904, África do Sul), IS1 (HM059040, Brasil).

Para o grupo externo da árvore foi utilizado a espécie: Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-

1, Ampelovirus, AF195822)...................................................................................................................40

Figura 11 - Eletroforese em gel de agarose dos produtos da RT-PCR a partir de RNA total extraído de

cochonilhas. Géis: (A) Grapevine leafroll-associated virus 1; (B) Grapevine leafroll-associated virus

3; (C) Grapevine virus A; (D) Grapevine virus B; Amostras: (M) Marcador DNAλ/PstI; (1)

Pseudococcus viburni, livre de vírus; (2) Planococcus citri, amostra n. 40; (3) Planococcus citri,

amostra n. 51; (4) Pseudococcus viburni, amostra caxias; (5) Planococcus citri, amostra n. 53; (6)

Pseudococcus viburni, amostra venturin................................................................................................44

Figura 12 - Árvore filogenética por parcimônia, não enraizada, obtida com o software MEGA 4.1,

baseada nas sequências parciais de nucleotídeos do gene (451 pb) da proteína capsidial dos isolados de

Grapevine virus A. Valores percentuais de “bootstrap” são mostrados nos ramos. As barras indicam

número de substituições de nucleotídeos por sítio (20 = 0,02). Códigos dos nucleotídeos dos isolados

no GenBank e país: PC40 (HM358052, Brasil), GVA-SP (AY340581, Brasil), GVA-RS (AF494187,

Brasil), GTR1-1 (DQ787959, África do Sul), P163-1 (DQ855088, África do Sul), LQ58 (DQ911145,

China), 92/778 (AF441234, África do Sul), MSH18-1 (DQ855085, África do Sul). Para o grupo

externo da árvore foi utilizado a espécie Heracleum latent virus (HLV, Vitivirus, X79270)................47

XIII

CAPÍTULO II:

Figura 13 - Eletroforese em gel de agarose do plasmídeo recombinante pRSET-B/CP RSPaV (780 pb)

digerido com enzima de restrição EcoRI; (M) Marcador DNAλ/PstI, (1) e (2) clones de E. coli, estirpe

BL21:DE3, transformadas com o plasmídeo pRSET-B/CP RSPaV......................................................62

Figura 14 - Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 12% corado com Coomassie blue; (M) Marcador de

massa molecular em kDa, (1) Alíquota (5 µl) de uma fração da proteína expressada em Escherichia

coli transformada com a construção pRSET-B CP/RSPaV e purificada em coluna Ni-NTA. ..............63

Figura 15 - A. Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 12% corado com Coomassie blue; B. Western

blot utilizando anti-soro comercial anti-histidina (1:1000, Invitrogen). Amostras: (M) Marcador de

massa molecular em kDa, (1) alíquota (2,5 µl) do extrato de proteínas totais de E. coli induzida após a

transformação com o vetor de expressão pRSET vazio, (2) alíquota (5 µl) do extrato de proteína totais

não purificada de E. coli transformada e induzida com o vetor pRSET-B/CP RSPaV, (3) alíquota (10

µl) do extrato de proteína total purificada de E. coli induzida com o vetor pRSET-C/CP GLRaV-3

(controle positivo, FAJARDO et al., 2007a), (4) alíquota de 2,5 µl da CP de RSPaV após a purificação

do extrato de proteínas totais de E. coli (fração do poço 2 purificada)..................................................64

Figura 16 - Western blot utilizando anti-soro produzido contra a CP do RSPaV, expressa e purificada

a partir de E. coli; (M) Marcador de massa molecular em kDa, (1 a 4) anti-soro produzido nas 3ª, 4ª, 5ª

e 6ª sangrias do coelho (1:250 v/v), respectivamente. Poços 1 a 4 carregados com 2,5 µl da proteína CP

do RSPaV expressada e purificada.........................................................................................................65

Figura 17 - Árvore filogenética por parcimônia (“bootstrap” com 2000 replicações), não enraizada,

obtida com o programa MEGA 4.1, baseada nas sequências completas (780 pb) de nucleotídeos do

gene da proteína capsidial de isolados de Rupestris stem pitting-associated virus. Valores percentuais

de “bootstrap” são mostrados nos ramos. As barras indicam número de substituições de nucleotídeos

por sítio (50 = 0,05). Códigos no GenBank dos isolados brasileiros caracterizados e detectados pelo

anti-soro policlonal produzido neste trabalho: CF207 (EF636804), 420A (EU040204), MG

(EF690380), CF210 (EF690384), CF195 (EF636803), PN (EF690381), CS1 (GU166289), IS2

(GU166290). Na análise filogenética foram incluídas o isolado RSPaV1 (NC_001948), isolado tipo da

espécie e, para o grupo externo da árvore, a espécie tipo do gênero: Apple stem pitting virus (ASPV,

Foveavirus, NC_003462).......................................................................................................................69

XIV

CAPÍTULO III:

Figura 18 - Sintomas foliares de infecção viral nas cvs. Cabernet Franc e Cabernet Sauvignon, no

início, meio e final do ciclo vegetativo, observados a campo nas plantas avaliadas..............................75

Figura 19 - Formação de tecido corticento (foto a direita) na região de inserção do ramo do ano na cv.

C. Sauvignon, verificado a campo nas plantas avaliadas.......................................................................75

Figura 20 - Videiras das cvs. Cabernet Franc e Cabernet Sauvignon, plantas sadias e infectadas,

evidenciando os sintomas de infecção viral nas folhas de plantas infectadas........................................76

Figura 21 - Curvas com valores médios de fotossíntese líquida ou taxa de assimilação líquida de CO

em resposta à densidade de fluxo de fótons fotossinteticamente ativo (Radiação). (A) videiras cv. e (B)

videiras cv. Cabernet Sauvignon; folhas de plantas infectadas sintomáticas e assintomáticas e folhas de

plantas sadias. Sintomas avaliados visualmente e plantas infectadas com RSPaV e GLRaV-2............81

Figura 22 - Amostras de uva colhidas em videiras sadias e infectadas das cvs. Cabernet Franc e

Cabernet Sauvignon, podendo-se observar maturação irregular nas amostras provenientes de plantas

infectadas................................................................................................................................................87

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I:

Tabela 1 – Espécies virais relatadas em videiras (Vitis spp.) em todo mundo........................................6

Tabela 2 - Número total de depósitos de sequências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos de

espécies virais que infectam a videira e que foram estudadas neste trabalho, com base no banco de

dados do NCBI (GenBank) em 10/05/2010.............................................................................................8

Tabela 3 - Relação das espécies de cochonilhas relatadas como transmissoras de vírus em videiras...11

Tabela 4 - Oligonucleotídeos específicos e degenerados utilizados na detecção viral por RT-PCR. ...15

Tabela 5 - Relação das amostras de cochonilhas Planococcus citri e Pseudococcus viburni (Família:

Pseudococcidae) avaliadas para a presença de vírus..............................................................................18

Tabela 6 – Resultados obtidos por RT-PCR para as amostras de videiras avaliadas para presença de 12

espécies virais.........................................................................................................................................20

Tabela 7 - Relação das sequências dos isolados virais de RSPaV, GLRaV-2 e GLRaV-3 obtidos no

trabalho e depositados no banco de dados do NCBI (GenBank). ..........................................................21

Tabela 8 - Identidade (%) das sequências de nucleotídeos (abaixo da diagonal) e de aminoácidos

deduzidos (acima da diagonal) do gene da proteína capsidial (780 pb) entre diferentes isolados de

Rupestris stem pitting-associated virus..................................................................................................25

Tabela 9 - Identidade (%) das sequências de nucleotídeos (abaixo da diagonal) e de aminoácidos

deduzidos (acima da diagonal) da sequência parcial (339 pb) do gene da replicase dos diferentes

isolados de Rupestris stem pitting-associated virus...............................................................................27

Tabela 10 - Identidade (%) das sequências de nucleotídeos (abaixo da diagonal) e de aminoácidos

deduzidos (acima da diagonal) do gene parcial (831pb) da proteína replicase entre diferentes isolados

de Rupestris stem pitting-associated virus.............................................................................................29

Tabela 11 - Identidade (%) das sequências de nucleotídeos (abaixo da diagonal) e de aminoácidos

deduzidos (acima da diagonal) do gene parcial (628pb) da proteína replicase entre diferentes isolados

de Rupestris stem pitting-associated virus.............................................................................................31

XVI

Tabela 12 - Identidade (%) das sequências de nucleotídeos (abaixo da diagonal) e de aminoácidos

deduzidos (acima da diagonal) do gene parcial (431pb) da proteína capsidial parcial dos diferentes

isolados de Grapevine leafroll-associated virus 2.................................................................................33

Tabela 13 - Identidade (%) das sequências de nucleotídeos (abaixo da diagonal) e de aminoácidos

deduzidos (acima da diagonal) do gene parcial (623 pb) da HSP70 entre os diferentes isolados de

Grapevine leafroll-associated virus 2....................................................................................................35

Tabela 14 - Identidade (%) das sequências de nucleotídeos (abaixo da diagonal) e de aminoácidos

deduzidos (acima da diagonal) do gene completo (942 pb) da proteína capsidial entre diferentes

isolados de Grapevine leafroll-associated virus 3.................................................................................37

Tabela 15 - Identidade (%) das sequências de nucleotídeos (abaixo da diagonal) e de aminoácidos

deduzidos (acima da diagonal) do gene parcial (593 pb) da proteína HSP70 entre diferentes isolados de

Grapevine leafroll-associated virus 3....................................................................................................39

Tabela 16 - Relação de isolados “estrangeiros”, depositados no GenBank e que apresentaram maiores

identidades de nucleotídeos com os isolados virais de RSPaV, GLRaV-2 e GLRaV-3, caracterizados

neste trabalho. ........................................................................................................................................41

Tabela 17 - ELISA indireto das cinco amostras de videiras, para a presença dos vírus RSPaV e

GLRaV-2 e ELISA direto para GLRaV-3. Valores das leituras de absorbância no comprimento de

onda em 405 nm, aproximadamente 2 horas após a adição do substrato. Resultado de RT-PCR,

conforme consta na Tabela 6..................................................................................................................42

Tabela 18 - Relação das amostras de cochonilhas vetoras (Família: Pseudococcidae) testadas por RT-

PCR para a presença de vírus.................................................................................................................43

Tabela 19 - Identidade (%) das sequências de nucleotídeos (abaixo da diagonal) e de aminoácidos

deduzidos (acima da diagonal) do gene parcial (451pb) da proteína capsidial de diferentes isolados de

Grapevine virus A. .................................................................................................................................46

CAPÍTULO II:

Tabela 20 - Resultados do teste ELISA indireto com amostras de videiras infectadas com RSPaV,

utilizando-se o anti-soro produzido contra a CP do RSPaV, expressa e purificada a partir de células de

E. coli. Valores das leituras de absorbância, no comprimento de onda de 405 nm, aproximadamente, 2

horas após a adição de substrato. Conjugado geral diluído 1:1000 (v/v)...............................................66

XVII

Tabela 21 - Identidade (%) das sequências de nucleotídeos (abaixo da diagonal) e de aminoácidos

deduzidos (acima da diagonal) dos genes da proteína capsidial de diferentes isolados de RSPaV,

previamente caracterizados e detectados por ELISA indireto com o anti-soro policlonal produzido....70

CAPÍTULO III:

Tabela 22 - Valores de fotossíntese máxima, radiação de saturação, ponto de compensação de luz, taxa

de respiração no escuro e rendimento quântico aparente de folhas de videiras (Vitis vinifera) cvs.

Cabernet Franc e Cabernet Sauvignon sadias e infectadas (folhas sintomáticas e assintomáticas) com

Rupestris stem pitting-associated virus e Grapevine leafroll-associated virus 2. .................................82

Tabela 23 - Teores totais e individuais de clorofila (a e b) em folhas de videiras (Vitis vinifera) cv.

Cabernet Franc e Cabernet Sauvignon, sadias e infectadas (folhas sintomáticas e assintomáticas) com

Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV) e Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2).

................................................................................................................................................................84

Tabela 24 - Teores de açúcares solúveis totais e de amido em folhas de videiras (Vitis vinifera) cv.

Cabernet Franc e Cabernet Sauvignon, sadias e infectadas (folhas sintomáticas e assintomáticas) com

Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV) e Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2).

................................................................................................................................................................85

Tabela 25 - Resultados da avaliação da qualidade enológica de uvas colhidas de videiras cvs. Cabernet

Franc e Cabernet Sauvignon infectadas com Rupestris stem pitting-associated virus e Grapevine

leafroll-associated virus 2 e sadias. Média de 10 plantas......................................................................88

Tabela 26 - Valores de fotossíntese de saturação, radiação de saturação, fotossíntese máxima, ponto de

compensação, taxa de respiração no escuro e rendimento quântico aparente de folhas de videiras (Vitis

vinifera) cv. Cabernet Franc sadias e infectadas (folhas sintomáticas e assintomáticas) com Rupestris

stem pitting-associated virus (RSPaV) e Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2). ..............90

Tabela 27 - Valores de fotossíntese de saturação, radiação de saturação, fotossíntese máxima, ponto de

compensação, taxa de respiração no escuro e rendimento quântico aparente de folhas de videiras (Vitis

vinifera) cv. Cabernet Sauvignon sadias e infectadas (folhas sintomáticas e assintomáticas) com

Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV) e Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2).

................................................................................................................................................................91

Tabela 28 - Teores totais e individuais de clorofila (a e b) em folhas de videiras (Vitis vinifera) cv.

Cabernet Sauvignon sadias e infectadas (folhas sintomáticas e assintomáticas) com Rupestris stem

pitting-associated virus (RSPaV) e Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2)........................92

XVIII

Tabela 29 - Teores totais e individuais de clorofila (a e b) em folhas de videiras (Vitis vinifera) cv.

Cabernet Franc sadias e infectadas (folhas sintomáticas e assintomáticas) com Rupestris stem pitting-

associated virus (RSPaV) e Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2). ..................................93

Tabela 30 - Teores de açúcares solúveis totais e amido em folhas de videiras (Vitis vinifera) cv.

Cabernet Franc sadias e infectadas (folhas sintomáticas e assintomáticas) com Rupestris stem pitting-

associated virus (RSPaV) e Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2). ..................................94

Tabela 31 - Teores de açúcares solúveis totais e amido em folhas de videiras (Vitis vinifera) cv.

Cabernet Sauvignon sadias e infectadas (folhas sintomáticas e assintomáticas) com Rupestris stem

pitting-associated virus (RSPaV) e Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2)........................95

Tabela 32 - Resultados da avaliação da qualidade enológica das uvas provenientes de videiras da cv.

Cabernet Franc infectadas com Grapevine leafroll-associated virus 2 e Rupestris stem pitting-

associated virus ou de plantas sadias.....................................................................................................96

Tabela 33 - Resultados da avaliação da qualidade enológica das uvas provenientes de videiras cv.

Cabernet Sauvignon infectadas com Grapevine leafroll-associated virus 2 e Rupestris stem pitting-

associated virus ou de plantas sadias.....................................................................................................97

XIX

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO GERAL................................................................................................. 1

1.1 A cultura da videira e a importância das viroses no Brasil ........................................ 1

2 CAPÍTULO I: RT-PCR para detecção de vírus em vinhedos antigos e em cochonilhas

vetoras e estudo de variabilidade................................................................................................ 4

2.1 Resumo....................................................................................................................... 4

2.2 Introdução................................................................................................................... 5

2.3 Material e métodos ................................................................................................... 11

2.4 Resultados e discussão ............................................................................................. 19

2.5 Anexos...................................................................................................................... 48

3 CAPÍTULO II: Produção de anti-soro policlonal utilizando a proteína capsidial

recombinante do Rupestris stem pitting-associated virus ........................................................ 54

3.1 Resumo..................................................................................................................... 54

3.2 Introdução................................................................................................................. 55

3.3 Materiais e métodos.................................................................................................. 57

3.4 Resultados e discussão ............................................................................................. 61

3.5 Anexos...................................................................................................................... 71

4 CAPÍTULO III: Fisiologia foliar e qualidade enológica da uva em videiras infectadas

por vírus.................................................................................................................................... 72

4.1 Resumo..................................................................................................................... 72

4.2 Introdução................................................................................................................. 72

4.3 Material e métodos ................................................................................................... 74

4.4 Resultados e discussão ............................................................................................. 80

4.5 Anexos...................................................................................................................... 90

4.6 Referências bibliográficas ........................................................................................ 97

1 INTRODUÇÃO GERAL

1.1 A cultura da videira e a importância das viroses no Brasil

A videira pertence a família Vitaceae e ao gênero Vitis, o qual possui inúmeras

espécies, destacando-se a Vitis vinifera L., conhecida como produtora de uvas finas, de origem

européia e a Vitis labrusca L., conhecida como produtora de uvas rústicas, de origem

americana e que predominam no Brasil (TEIXEIRA et al., 2002; ROBERTO et al., 2008;

GIOVANNINI, 2008; CORRÊA et al., 2008).

Conforme o “Panorama 2009” da vitivinicultura brasileira (EMBRAPA, 2010a), a área

cultivada com vinhedos no Brasil em 2009 foi de 82.584 hectares, com produção de 1.345.719

toneladas, sendo 678.169 toneladas destinadas para processamento e 667.550 toneladas para

consumo in natura. A viticultura no Brasil está concentrada principalmente nos Estados das

Regiões Sul, Sudeste e Nordeste, onde se destacam os maiores produtores nacionais, em

ordem decrescente de área cultivada: Rio Grande do Sul, São Paulo, Pernambuco, Paraná,

Bahia, Santa Catarina e Minas Gerais. Além destas, a cultura da videira também tem se

expandido para outras regiões não tradicionais a exemplo de áreas situadas no Mato Grosso do

Sul, Goiás, Espírito Santo e Ceará (EMBRAPA, 2010a).

O Brasil nos últimos anos tem demonstrado bom desempenho na produção de uvas,

seja para consumo in natura ou para processamento. Contudo, a ocorrência de doenças é

sempre mencionada como uma das ameaças ao setor, pois pode ocasionar danos significativos

à produção e elevar os custos da mesma. Dentre os patógenos da videira, os vírus merecem

destaque devido aos danos que podem causar, podendo resultar na inviabilidade econômica

desta atividade. Assim, é de fundamental importância o conhecimento dos principais

fitopatógenos associados a esta cultura, principalmente das viroses. Em determinadas

cultivares e porta-enxertos, por não produzirem sintomas visualmente perceptíveis ou

facilmente distinguíveis, as viroses podem passar despercebidas, havendo maior probabilidade

de que sejam propagados indefinidamente, o que resultaria em maior grau de infecção dos

materiais propagativos (FAJARDO et al., 2003a; MARTELLI & BOUDON-PADIEU, 2006).

No Brasil, as viroses ocorrem em todas as regiões vitícolas e a incidência na maioria

das cultivares americanas e principalmente nas viníferas é considerada alta. Dentre os

prejuízos causados citam-se redução na produtividade e na qualidade das uvas, redução da

vida útil do vinhedo e, dependendo da severidade da infecção, pode causar perda total da

produção, ou até a morte da planta (BRAR et al., 2008; CABALEIRO et al., 1999).

Até o momento, já foram relatadas no mundo pelo menos 60 espécies virais na cultura

da videira, embora nem todas se destaquem em nível de importância (MARTELLI, 2009;

MONIS et al., 2010). No Brasil, dez destes vírus já foram detectados: Grapevine leafroll-

associated virus (GLRaV-1, -2, -3, -5 e -6), Grapevine virus A e B (GVA e GVB), Rupestris

stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine fleck virus (GFkV) e Grapevine fanleaf

virus (GFLV) (FAJARDO et al., 2003a). As viroses que se destacam pelas maiores incidência

e importância econômica são o enrolamento da folha (GLRaV-1, -2 e -3) e o lenho rugoso da

videira, complexo formado por quatro viroses, do qual fazem parte o intumescimento dos

ramos (GVB), acanaladura do lenho de Kober (GVA), caneluras do tronco de Rupestris

(RSPaV) e acanaladura do lenho de LN33 (vírus desconhecido) (KUNIYUKI et al., 2002;

MOREIRA et al., 2004).

A videira, por ser propagada vegetativamente, facilita a disseminação e favorece o

aparecimento de doenças complexas, pelo acúmulo de diferentes espécies/estirpes virais em

uma mesma planta (MONIS, 2008; MARTELLI, 2009). Nem sempre despertam a atenção dos

viticultores, talvez pelo desconhecimento de sua sintomatologia, a qual pode também ser

confundida visualmente, por exemplo, com deficiências nutricionais ou até com outros

fitopatógenos (GARRIDO et al., 2008). Dependendo da combinação entre a cultivar e a

espécie viral, os primeiros sintomas característicos poderão ser perceptíveis somente após 2 ou

3 anos da infecção (FAJARDO et al., 2003a).

As plantas afetadas apresentam sintomas que variam com as condições climáticas,

estádio fenológico da planta, fertilidade do solo, estirpe viral e com a cultivar da videira

(CHARLES et al., 2006). Os sintomas das viroses do enrolamento das folhas e do complexo

rugoso, por exemplo, podem ser percebidos em cultivares sensíveis (viníferas), principalmente

no final do ciclo vegetativo (CABALEIRO & SEGURA, 2006) e, em plantas muito afetadas,

os sintomas podem começar a se pronunciar a partir da floração. Porém, o mais comum é na

época próxima à maturação da uva ou ao final do ciclo vegetativo (CREDI & BABINI, 1997).

Até o momento o único controle viável a campo é a utilização de mudas ou material

propagativo proveniente de plantas matrizes sadias (livre de vírus). Uma vez que a planta

esteja infectada no campo, é impossível curá-la por métodos tradicionais como aqueles

utilizados para outros patógenos (bactérias, fungos, etc) (ANDRET-LINK et al., 2004). A

partir de uma planta infectada, somente pela adoção de técnicas laboratoriais (ex. cultura de

tecidos, termoterapia, quimioterapia) é possível a obtenção e regeneração de plantas livres de

viroses (LAIMER et al., 2009; VALAT et al., 2003; SALAMI et al., 2010).

Além da disseminação por meio do material propagativo, o GFLV é disseminando por

nematoídes do gênero Xiphinema e as espécies do gênero Ampelovirus (GLRaV-1 e -3, -5, -9)

e Vitivirus (GVA e GVB) são também disseminados de maneira semipersistente por

cochonilhas algodonosas (Família Pseudococcidae) e de carapaça (Família Coccidae) (Tabela

3). De maneira geral, neste tipo de transmissão, o vírus é adquirido pelos insetos quando estes

se alimentam em planta infectada (LIMA, 2009).

Desta forma a recomendação ao viticultor é que utilize material propagativo

certificado, que apresente garantia de sanidade, além de se fazer monitoramento e o controle

destes insetos vetores (EMBRAPA, 2010b).

Embora progressos consideráveis tenham ocorrido nos últimos anos sobre as

características biológicas e moleculares, formas de disseminação, técnicas de detecção e

identificação e os efeitos fisiológicos induzidos pelos vírus que infectam a videira, a

compreensão destes temas ainda não é completa, a ponto de permitir a definição de métodos

de controle eficientes. Os resultados obtidos neste trabalho visam contribuir neste sentido.

2 CAPÍTULO I: RT-PCR para detecção de vírus em vinhedos antigos e em

cochonilhas vetoras e estudo de variabilidade

2.1 Resumo

A propagação vegetativa da videira favorece a ocorrência de infecções virais múltiplas. A

variabilidade genética de espécies virais, muitas vezes, resultam em dificuldades para gerar

ferramentas moleculares confiáveis, sejam específicas ou universais, para a detecção e/ou

identificação viral. Os objetivos deste capítulo foram identificar os vírus presentes em dois

vinhedos experimentais: um da cv. Cabernet Sauvignon (CS) (Vitis vinifera), implantado em

1995, e outro da cv. Isabel (IS) (Vitis labrusca) de 1971. Também se realizou a detecção

sorológica destes isolados, comparando-se os resultados dos testes sorológicos e moleculares.

Marcou-se duas plantas de C. Sauvignon e três de Isabel, extraíram-se dsRNAs de ramos

maduros, que foram submetidos a RT-PCR com 17 pares de oligonucleotídeos específicos

para a detecção dos seguintes vírus: Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB),

Grapevine virus D (GVD), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine fanleaf virus (GFLV),

Arabis mosaic virus (ArMV), Grapevine chrome mosaic virus (GCMV), Rupestris stem

pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine leafroll-associated virus 1 a 4 (GLRaV-1 a -4),

além de oligonucleotídeos degenerados para a família Betaflexiviridae e os gêneros

Closterovirus, Trichovirus e Vitivirus. Pelo menos um fragmento amplificado, com cada para

de oligonucleotídeos, correspondente a um dos isolados, foi clonado e sequenciado. Nas

plantas avaliadas foram detectados RSPaV, GLRaV-2 ou GLRaV-3, tendo sido sequenciados

sete isolados de RSPaV: CS1 (GU166289), CS2a (HM059036), CS2b (HM059038), IS1

(HM059037), IS2a (GU166290), IS3 (HM130524), IS2b (HM358051); três isolados de

GLRaV-2: CS1 (HM059039), CS2 (HM059035) e IS3 (HM358050); dois isolados de

GLRaV-3: IS1 (HM059040) e IS2 (HM059034). As sequências obtidas e depositadas em

banco de dados (GenBanK) apresentaram identidades superiores a 90% com os respectivos

isolados virais do GenBank. Os anti-soros testados reconheceram todos os isolados das três

espécies virais detectadas e caracterizadas. Amostras de cochonilhas Pseudococcus viburni e

Planococcus citri provenientes de vinhedos de Caxias do Sul (RS) e Petrolina (PE),

respectivamente, foram avaliadas por RT-PCR para a presença de GVA, GVB, GLRaV-1 e

GLRaV-3 com oligonucleotídeos específicos. Três espécies virais, GVA, GVB, GLRaV-3

foram detectadas em três de cinco amostras, comprovando indiretamente, o potencial destas

como vetoras de vírus e a eficiência dos oligonucleotídeos empregados na detecção.

Palavras-chave: Viroses, RSPaV, GLRaV-2, GLRaV-3, Vitis, variabilidade

2.2 Introdução

Já foram relatadas infectando videiras 55 espécies virais distintas (Tabela 1), além de

inúmeras estirpes específicas de algumas destas espécies (MARTELLI, 2009; MONIS et al.,

2010). Também foram relatadas em videiras cinco doenças consideradas de origem viral,

enação da videira (Grapevine enation), mosqueado de verão da videira (Grapevine summer

mottle), mosaico das nervuras da videira (Grapevine vein mosaic), necrose das nervuras da

videira (Grapevine vein necrosis) e acanaladura do lenho de LN 33 (LN 33 stem grooving),

cujos os agentes causais (vírus) ainda não foram identificados. Entre os vírus mais importantes

que afetam a videira destacam-se aqueles pertencentes as famílias Closteroviridae,

Secoviridae, Betaflexiviridae e Tymoviridae (MARTELLI & BOUDON-PADIEU, 2006).

Tabela 1 – Espécies virais relatadas em videiras (Vitis spp.) em todo mundo.

Família Gênero Espécie Referência

Alphaflexiviridae Potexvirus Potato virus X (PVX)

Fauquet et al. (2005);

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Foveavirus

Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV) (=

Grapevine rupestris stem pitting-associated virus,

GRSPaV)

Adams et al. (2004);

Martelli et al. (2007)

Trichovirus Grapevine berry inner necrosis virus (GINV)

Fauquet et al. (2005);

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Grapevine virus A (GVA)

Grapevine virus B (GVB)

Grapevine virus D (GVD)

Martelli et al. (1997);

Adams et al. (2004)

Betaflexiviridae

Vitivirus

Grapevine virus E (GVE) Nakaune et al. (2008)

Alfamovirus Alfalfa mosaic virus (AMV)

Cucumovirus Cucumber mosaic virus (CMV)

Fauquet et al. (2005);

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Ilarvirus Grapevine line pattern virus (GLPV)

Bromoviridae

Ilarvirus não

classificado

Grapevine angular mosaic virus (GAMoV)

Martelli (2009)

Bunyaviridae Tospovirus Tomato spotted wilt virus (TSWV)

Fauquet et al. (2005);

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Closterovirus

Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) (=

Grapevine rootstock stem lesion associated virus,

GRSLaV)

Karasev (2000); Martelli et

al. (2002)

Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-1)

Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3)

Ampelovirus

Grapevine leafroll-associated virus 5 (GLRaV-5)

Ling et al. (1997); Martelli

et al. (2002)

Grapevine leafroll-associated virus 4 (GLRaV-4)

Grapevine leafroll-associated virus 6 (GLRaV-6)

Grapevine leafroll-associated virus 8 (GLRaV-8)

Ampelovirus

não classificado

Grapevine leafroll-associated virus 9 (GLRaV-9)

Abou Ghanem-

Sabanadzovic (2006);

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Closteroviridae

não classificado

Grapevine leafroll-associated virus 7 (GLRaV-7)

Turturo et al. (2000);

Alrwahnih et al. (2008)

Potyviridae Potyvirus

Vírus semelhante a potyvírus, não identificado, isolado no

Japão de uma cultivar russa

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Continuação: (Tabela 1 - Espécies virais relatadas em videiras (Vitis spp.) em todo mundo).

Família Gênero Espécie Referência

Fabavirus Broad bean wilt virus (BBWV)

Fauquet et al. (2005);

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Arabis mosaic virus (ArMV)

Grapevine fanleaf virus (GFLV)

Raspberry ringspot virus (RpRSV)

Nepovirus

Subgrupo A

Tobacco ringspot virus (TRSV)

Wetzel et al. (2001);

Andret-Link et al. (2004);

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Artichoke Italian latent virus (AILV)

Grapevine chrome mosaic virus (GCMV)

Nepovirus

Subgrupo B

Tomato black ring virus (TBRV)

Blueberry leaf mottle virus (BBLMV)

Tomato ringspot virus (ToRSV)

Peach rosette mosaic virus (PRMV)

Cherry leafroll virus (CLRV)

Grapevine Tunisian ringspot virus (GTRSV)

Nepovirus

Subgrupo C

Grapevine Bulgarian latent virus (GBLV)

Grapevine Anatolian ringspot virus (GARSV)

Nepovirus não

classificado

Grapevine deformation virus (GDefV)

Fauquet et al. (2005);

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Secoviridae

não

classificado

Strawberry latent ringspot virus (SLRV) Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Carmovirus Carnation mottle virus (CarMV)

Necrovirus Tobacco necrosis virus D (TNV-D)

Grapevine Algerian latent virus (GALV)

Tombusviridae

Tombusvirus

Petunia asteroid mosaic virus (PetAMV)

Fauquet et al. (2005);

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Maculavirus Grapevine fleck virus (GFkV)

Maculavirus

não classificado

Grapevine Red Globe virus (GRGV)

Grapevine rupestris vein feathering virus (GRVFV)

Grapevine asteroid mosaic-associated virus (GAMaV)

Fauquet et al. (2005);

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Tymoviridae

Marafivirus

Grapevine virus Q (GVQ) = (Grapevine Syrah virus -1,

GSyV-1)

Sabanadzovic et al. (2009);

Alrwahnih et al. (2009)

Tobacco mosaic virus (TMV)

Virgaviridae Tobamovirus

Tomato mosaic virus (ToMV)

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

- Idaeovirus Raspberry bushy dwarf virus (RBDV)

- Sobemovirus Sowbane mosaic virus (SoMV)

- - Grapevine Ajinashika virus (GAjV)

- - Grapevine stunt virus (GSV)

- - Grapevine labile rod-shaped virus (GLRSV)

Fauquet et al. (2005);

Martelli & Boudon-Padieu

(2006)

Nem todas as espécies mencionadas na Tabela 1 apresentam significativa importância

econômica, pois esta pode ser em função da origem geográfica, da estirpe viral e da cultivar

da videira.

Dentre as doenças virais que afetam a videira (Vitis spp.) e que ocorrem no Brasil, o

complexo rugoso e o enrolamento das folhas apresentam-se como as de maior relevância,

devido a expressiva incidência e aos danos causados pelos vírus que compõem estes dois

complexos (FAJARDO et al., 2003a). Visando apresentar, mesmo que de maneira indireta, a

importância relativa das espécies virais, objeto de estudo neste Capítulo, a Tabela 2 mostra o

número de sequências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos depositados no banco de

dados do NCBI (GenBank).

Tabela 2 - Número total de depósitos de sequências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos de

espécies virais que infectam a videira e que foram estudadas neste trabalho, com base no banco de

dados do NCBI (GenBank) em 10/05/2010.

Vírus Família / sub-família / Gênero

N° de seq. de

nucleotídeos

N° de seq. de

aminoácidos

deduzidos

Arabis mosaic virus (ArMV) Secoviridae / Comovirinae / Nepovirus 49 65

Grapevine fanleaf virus (GFLV) Secoviridae / Comovirinae / Nepovirus 350 374

Grapevine chrome mosaic virus (GCMV) Secoviridae / Comovirinae / Nepovirus 4 14

Grapevine fleck virus (GFkV) Tymoviridae / Maculavirus 8 15

Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV) Betaflexiviridae / Foveavirus 368 421

Grapevine virus A (GVA) Betaflexiviridae / Vitivirus 49 113

Grapevine virus B (GVB) Betaflexiviridae / Vitivirus 75 95

Grapevine virus D (GVD) Betaflexiviridae / Vitivirus 3 4

Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-1) Closteroviridae / Ampelovirus 69 82

Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) Closteroviridae / Closterovirus 213 265

Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3) Closteroviridae / Ampelovirus 127 176

Grapevine leafroll-associated virus 4 (GLRaV-4) Closteroviridae / Ampelovirus não

classificado

17 18

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Root (acessado em 10/05/2010)

A virose do enrolamento das folhas, que ocorre em praticamente todas as regiões do

mundo onde a videira é cultivada, é causada por um complexo de até nove espécies virais,

sorologicamente distintas e denominadas “vírus associados ao enrolamento da folha da

videira” (Grapevine leafroll-associated virus, GLRaV-1 a -9). Os principais vírus do

complexo do enrolamento são o GLRaV-2 e GLRaV-3 (Tabela 2) em função da maior

incidência e dos danos que podem induzir (MARTELLI et al., 2002; FAJARDO et al., 2003a).

Mesmo que esta doença seja causada por um complexo viral, em situações específicas,

embora raras, estes vírus podem ocorrer de forma isolada (FAJARDO et al., 2003a). No Brasil

já foram detectados GLRaV-1, -2, -3, -5 e -6 (RADAELLI et al., 2009; KUNIYUKI et al.,

2003).

O GLRaV-2 também está associado a sintomas de incompatibilidade da enxertia e

declínio em vinhedos novos (ABOU GHANEM-SABANADZOVIC et al., 2000; MARTELLI

et al., 2002; BERTAZZON & ANGELINI, 2004; MENG et al., 2005b). Pertence a família

Closteroviridae e ao gênero Closterovirus, possui partículas alongadas e flexuosas, genoma de

RNA fita simples e senso positivo, com 16.494 nucleotídeos (nt) organizados em oito fases

abertas de leituras (ORFs, “open reading frame”) e é mecanicamente transmissível (ABOU-

GHANEM et al., 1998; MENG et al., 2005b; BEUVE et al., 2007).

O GLRaV-3, família Closteroviridae e gênero Ampelovirus, possui partículas alongadas

e flexuosas de cerca de 1800-2100 nm de comprimento por 12 nm de diâmetro e genoma

composto de RNA fita simples, senso positivo com 17.919 nt organizados em 13 ORFs

(LING et al., 1997; MARTELLI et al., 2002). É o vírus melhor caracterizado dentre aqueles

que compõem o complexo do enrolamento da folha da videira, sendo o membro-tipo do seu

gênero. Não é transmissível mecanicamente e se dissemina naturalmente nos vinhedos pela

transmissão, de maneira semi-persistente, por várias espécies de pseudococcídeos e coccídeos

(BOTTON et al., 2003).

O Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV) foi identificado e caracterizado

molecularmente (MENG et al., 1998; ZHANG et al., 1998) como o agente causal das

caneluras do tronco de Rupestris, conhecida por “lenho estriado de Rupestris” em São Paulo e

por “caneluras do tronco de Rupestris” no Rio Grande do Sul (ESPINHA et al., 2003). Faz

parte do “complexo rugoso da videira” e caracteriza-se por induzir alterações no lenho das

videiras, com reflexos negativos na qualidade e na produção (MARTELLI, 1993; CREDI,

1997). RSPaV, família Betaflexiviridae, gênero Foveavirus, possui partículas alongadas e

flexuosas com cerca de 800 x 12 nm, genoma de RNA de fita simples, senso positivo, com

aproximadamente 8.726 nt organizados em 5 ORFs.

Alguns trabalhos relatam que o RSPaV se apresenta como uma espécie muito variável,

sendo que infecções múltiplas com outros vírus também são comumente detectadas em

videiras, o que dificulta a definição das propriedades biológicas das diferentes estirpes deste

vírus (MENG et al. 1999 e 2005a), a exemplo das estirpes “Syrah” (LIMA et al., 2006a) e

“Pinot Noir, PN” (LIMA et al., 2009). Recentemente, Nakaune et al. (2008) e Radaelli et al.

(2009) destacaram a variabilidade genética deste vírus, por meio do estudo de análises de

sequências de isolados do RSPaV.

De modo geral, os vírus apresentam grande potencial de exibirem variabilidade

genética, pois são agentes infecciosos que podem e estabelecem longos processos infecciosos

ao longo de todo o ciclo de vida da hospedeira associado a propensão a erros na replicação do

seu genoma e deficiências nos mecanismos de reparo do RNA (KOMÍNEK et al., 2005;

PROSSER et al., 2007).

A expressiva variabilidade genética apresentada por algumas das espécies virais que

infectam a videira tem conduzido a dificuldades para gerar ferramentas moleculares universais

de detecção e identificação. Já foi demonstrada que a indexação por RT-PCR de videiras

infectadas, com determinado isolado viral, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para

outro isolado, pode resultar em falso-negativo (BERTAZZON & ANGELINI, 2004). Tais

resultados servem para ressaltar a importância do estudo de variabilidade genética viral.

Embora diversas espécies já tenham sido identificadas e caracterizadas no Brasil e no

mundo e em diferentes genótipos de videiras, ainda há carência de trabalhos de caracterização

molecular mais abrangentes, o que permitiria aumentar o conhecimento destes patógenos,

além do estabelecimento de ferramentas para o diagnóstico mais preciso e sensível (BEUVE

et al., 2007).

A transmissão do GLRaV-2, GLRaV-3 e RSPaV ocorre principalmente através de

enxertia utilizando-se gemas infectadas, enquanto a dispersão se dá por meio de material

propagativo infectado. No caso do GLRaV-3, também pode ser transmitido por insetos vetores

(cochonilhas).

Uma vez que a videira esteja infectada por vírus a campo, é impossível cura-lá pelos

métodos tradicionalmente utilizados para outras doenças, agravando-se o problema quando se

considera que a planta infectada também poderá servir de fonte de inóculo para a

disseminação por insetos vetores, enquanto as mesmas permanecerem no vinhedo.

As cochonilhas das famílias Pseudococcidae e Coccidae têm sido consideradas como

as principais vetoras de algumas das principais espécies virais que infectam a videira, sendo

responsáveis pela dispersão destes patógenos (Tabela 3) (CABALEIRO & SEGURA, 1997;

KUNIYUKI et al., 2005). Segundo Botton et al. (2003), algumas espécies já identificadas em

vinhedos brasileiros, como Pseudococcus viburni, P. vitis, P. longispinus e Planococcus citri,

são consideradas importantes vetoras de vírus.

Tabela 3 - Relação das espécies de cochonilhas relatadas como transmissoras de vírus em videiras.

Vírus

Espécies

Complexo do enrolamento da folha

Acanaladura do

lenho de Kober

Intumescimento

dos ramos

Cochonilha "Algodonosa"

(Pseudococcidae)

GLRaV-1 GLRaV-3 GLRaV-5 GLRaV-9 GVA GVB

Heliococcus bohemicus

x x x

Phenacoccus aceris

x x

Planococcus citri

x x x

Planococcus ficus

x x x

Pseudococcus viburni (= P. affinis)

x x x

Pseudococcus calceolariae

Pseudococcus comstocki

x x

Pseudococcus longispinus

x x x x x

Pseudococcus maritimus

Cochonilha de "Carapaça" (Coccidae)

Neopulvinaria innumerabilis

Parthenolecanium corni

Pulvinaria vitis

x x

Pulvinaria innumerabilis

x x

No Brasil inexistem trabalhos conduzidos sobre dispersão de vírus de videira em

condições naturais (vinhedos), e os poucos trabalhos conduzidos se restringem a testes de

transmissão sob condições controladas (KUNIYUKI et al., 2005 e 2006). A concentração viral

em insetos vetores, as técnicas de detecção, incluindo a definição de oligonucleotídeos

adequados, são aspectos importantes a serem estudados para que possam contribuir com

resultados que permitam fundamentar a proposição de estudos epidemiológicos.

Os objetivos deste trabalho foram identificar e caracterizar molecularmente os vírus

presentes em dois vinhedos, com diferentes pares de oligonucleotídeos e comparar a detecção

molecular com a sorológica, além de detectar molecularmente vírus em cochonilhas vetoras.

2.3 Material e métodos

Isolados virais: Os isolados virais foram obtidos a partir de diferentes videiras,

provenientes de vinhedos antigos da Embrapa Uva e Vinho, Bento Gonçalves (RS). Os dois

vinhedos avaliados são da cultivar Isabel (Vitis labrusca), plantio em pé franco, implantado

em 1971, e o outro, da cv. Cabernet Sauvignon (V. vinifera), plantio com porta-enxerto

Paulsen 1103 e implantado em 1995.

Os sintomas observados a campo na cv. C. Sauvignon, a partir do meio para o final do

ciclo vegetativo, foram folhas coriáceas com avermelhamento e enrolamento dos bordos das

folhas para baixo, sendo que as nervuras principais permaneceram verdes, presença de

caneluras no porta-enxerto e intumescimento com formação de tecido corticento na base do

ramo do ano. Já na cv. Isabel não foi verificado sintomas típicos de infecção viral nas folhas,

ramos e tronco em todo seu ciclo vegetativo. Estacas lenhosas provenientes das plantas

avaliadas a campo, de ambos os vinhedos, também foram propagadas em casa-de-vegetação,

nas quais, no início do ciclo vegetativo não foi verificado sintomas típicos de infecção viral

(Figura 1).

Figura 1 - Sintomas de infecção viral nas folhas e no tronco/porta-enxerto em videira cv. Cabernet

Sauvignon e ausência de sintomas de infecção viral na cv. Isabel. Início do ciclo vegetativo (estacas

propagadas em casa de vegetação provenientes das plantas avaliadas neste trabalho), meio e final do

ciclo vegetativo (aspecto das folhas, tronco e ramos das plantas a campo).

Extração de dsRNA: Foram selecionadas duas plantas da cv. C. Sauvignon, três de

Isabel e uma Paulsen 1103 (sadia, material obtido por meio de cultura de tecidos) nas quadras

7, 16 e 4, respectivamente, no campo experimental da Embrapa Uva e Vinho. O dsRNA foi

extraído a partir de ramos maduros de acordo com a metodologia descrita por Valverde et al.

(1990) com algumas modificações. Trinta gramas de tecido vegetal foram macerados em

almofariz na presença de nitrogênio líquido e tampão de extração [90 ml 2X STE, 35 ml SDS

10%, 2 ml de bentonita (45 mg/ml) e 2 ml β-mercaptoetanol]. Após agitação durante 5

minutos a temperatura ambiente, acrescentaram-se 35 ml de fenol saturado com STE 2X, pH

7,5 e 35 ml de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1 v/v), mantendo-se novamente em agitação

por 45 min e, posteriormente, centrifugando a 16274 g por 10 min. O dsRNA obtido foi

purificado em coluna de celulose (CF 11, Whatman) e ressuspendido em água autoclavada.

Síntese de cDNA e PCR: A síntese do cDNA e as reações da PCR foram conduzidas

conforme metodologia descrita por Sambrook & Russel (2001) e Fajardo et al. (2000), com

algumas modificações. As reações de síntese do cDNA consistiram, para todas as amostras de:

4 µl de dsRNA, 1 µl de oligonucleotídeo antisenso (10 µM) (Tabela 4), 5 µl de água

autoclavada, incubando-se a 94ºC por 5 min, e, posteriormente, adicionando-se: 5 µl de

tampão da enzima RT 5X, 1 µl de dNTP (2,5 mM), 1 µl de enzima transcriptase reversa M-

MLV (200 U/µl, Promega), 1 µl de inibidor de RNAse (40 U/µl, Promega) e 7 µl de água

autoclavada. Na sequência, a reação foi incubada a 37ºC por uma hora.

As reações de PCR consistiram de: 10 µl de cDNA, 5 µl de tampão da enzima Taq

DNA polimerase 10X, 1,5 µl de MgCl

(50 mM), 5 µl de dNTP (2,5 mM), 1 µl de cada

oligonucleotídeo senso e antisenso (10 µM) (Tabela 4), 0,5 µl de Taq DNA polimerase (5

U/µl, Invitrogen) e 26 µl de água autoclavada.

As reações foram submetidas a uma desnaturação inicial (94ºC por 5 min) seguida por

35 ciclos de amplificação: desnaturação (94ºC por 50 seg), pareamento (50ºC por 50 seg) e

extensão (72ºC por 1 min), além de uma extensão final (72ºC por 7 min). Para os fragmentos

menores que 500 pb, a extensão foi 72ºC por 50 seg e para os pares de oligonucleotídeos

degenerados, o pareamento foi de 48ºC.

Os produtos da RT-PCR foram analisados em géis de agarose 1,2% preparado em

tampão TBE pH 8,0, corados com brometo de etídeo e visualizados em transluminador sob luz

UV. As bandas observadas, com o fragmento de tamanho esperado, foram recortadas do gel e

eluídas com a utilização do kit comercial "HiYield™ Gel/PCR DNA Extraction" (RBC Real

Genomics), de acordo com as especificações do fabricante.

Oligonucleotídeos utilizados: As plantas foram avaliadas para a presença de 12

espécies virais: Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine virus D

(GVD), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus

(ArMV), Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), estirpes “típica” deste mesmo

vírus, Syrah (SY) e Pinot Noir (PN), Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV-1 a 4) e

Grapevine chrome mosaic virus (GCMV), com 17 pares de oligonucleotídeos específicos,

além de três pares degenerados para a família Betaflexiviridae e para os gêneros

Closterovirus, Trichovirus e Vitivirus, os quais amplificam fragmentos em diferentes regiões

do genoma viral (Tabela 4).

Tabela 4 - Oligonucleotídeos específicos e degenerados utilizados na detecção viral por RT-PCR.

Vírus Oligonucleotídeos

Sequência 5’-3’ Orientação

Fragmento

amplificado (pb)

Referência

766 GGGGAGGTAGATATAGTAGG Senso

GVA

C1197 TACCCGTGAGAAATGATGGG Antisenso

451 (CP, meio e 3’

terminal)

Fajardo et al.

(2003b)

GVB_v CAAGCAATTCCCCGAGAGT Senso

GVB

GVB_c TTTAGCCGCACTCCTTGACT Antisenso

693 (CP e regiões que

flanqueiam)

Moreira et al.

(2005)

GVD_v GACGCAGGGATGTAACCTTAGGACG Senso

GVD

GVD_c CCTCTACTTATGGAAATTGCGCTC Antisenso

963 (CP e regiões que

flanqueiam)

Abou-

Ghanem et al.

(1997)

GFkV_v ATGAGCCTCCCCGCTGACCTCC Senso

GFkV_r TCATGACGAGGGAGTGGGGCGG Antisenso

693 (CP)

baseado no acesso

NC_003347

GFkV_v AGTACCTCCTCCACCGCACC Senso

GFkV

GFkV_c TTTCTCGGGCAGAGAGCCGT Antisenso

245 (REP, parcial)

Fajardo et al.

(2004b)

GFLVs2515 GGAAGAGGCCACTTCTTTCCTTGGG Senso

GFLV

GFLVa3300 CCCACCAGCTTCGTGATGGTAACGC Antisenso

809 (CP, parcial)

Bashir & Hajizad

(2007)

H428v GCGGCGGATTGGGAGTT Senso

ArMV

C867c CGATGGTAGGGGGAGCGTATT Antisenso

440 (CP, parcial)

Stewart & Nassuth

(2001)

RSPaV_v1 ATGGCAAGTCAAATTGGGAAAC Senso

RSPaV_c1 TCATTCATGTGTAACATTTGAA Antisenso

780 (CP)

Radaelli et al.

(2009)

RSP2 CAAGCATGCTCTTGGCAAC Senso

RSPaV

RSP21 CCCTCTGGCGATTGAATTG Antisenso

831 (REP, parcial)

Fajardo et al.

(2004b)

2R TTCCCCAAACTTCCAACTTAC Senso

RSPaV-PN

PN1F GATGGATACAAGTTACGGGC Antisenso

505 (Metil-transferase,

parcial)

Lima et al. (2009)

SY9F AGGATTCCAAACTGTAGAGCAA Senso

RSPaV-SY

SY8R TTGGTCGTCATCTTCCAGTT Antisenso

628 (REP, parcial) Lima et al. (2006a)

GLRaV-1_v ATGGCTAGCGTTATATCTCAAA Senso

GLRaV-1_r TTACACCTTAAGCTCGCTAGTA Antisenso

969 (CP)

baseado no acesso

AF195822

LRA ACGTTGAGATTAGTCTGACTC Senso

GLRaV-1

CPdR TCACAGCATCAATATCTTTTCC Antisenso

1019 (CPd2, parcial) Little et al. (2001)

V2CPf CTAGTCTAAATGGTGTCGA Senso

GLRaV-2

V2CPr2 TTCAGAGAGCTTCGGGCAAG Antisenso

431 (CPm, parcial)

Bertazzon &

Angelini (2004)

LR3 8504v ATGGCATTTGAACTGAAATT Senso

GLRaV-3

LR3 9445c CTACTTCTTTTGCAATAGTT Antisenso

942 (CP)

Fajardo et al.

(2007a)

LR4f ACCCTTCATAAGCAGGAACC Senso

GLRaV-4

LR4r CTTGTGAAACCGACGGCC Antisenso

500 (OFR1 e 2, parcial) Fazeli et al. (1998)

GCMVsense ATGTGTGCCACTACTGGCATGCA Senso

GCMV

GCMVantisense TTCTCTTCAAGAAATGCCTAAGA Antisenso

391 (CP parcial e região

que flanqueia 3’)

Digiaro et al.

(2007)

HSP-P1 GGITTIGAITTYGGIACIAC Senso

Closterovirus

HSP-P2 RTCIAAIGTICCICCICCCRAA Antisenso

560-660 (HSP70,

parcial)

Tian et al. (1996);

Radaelli (2009)

dPR1_v GCDAARGCNGGNCARACHHTVGCBTGYTT Senso

Tricho/Vitivirus

dPR2_c RAAYTCNCCNSWRAANCKCAT Antisenso

363 (REP, parcial)

Saldarelli et al.

(1998)

dRW up1 WGCIAARGCIGGICARAC Senso

Betaflexiviridae

dRW do2 RMYTCICCISWRAAICKCAT Antisenso

330 (REP, parcial)

Dovas & Katis

(2003)

Todos os oligonucleotídeos utilizados (Tabela 4) foram previamente testados na

amplificação de controles positivos, a exceção daqueles direcionados para a amplificação dos

vírus ArMV, GLRaV-4, GVD, GCMV, RSPaV-SY e RSPaV-PN, pois não havia

disponibilidade de tais controles (vírus ainda não relatados no Brasil).

Clonagem e seleção de clones recombinantes: Os fragmentos de DNA eluídos foram

ligados ao vetor pGEM-T Easy (Promega), de acordo com as instruções do fabricante. A

seguir, as ligações foram utilizadas na transformação de células competentes de Escherichia

coli DH5α, por choque térmico ou eletroporação no aparelho Gene Pulse II (Biorad),

conforme metodologia descrita por Sambrook & Russel (2001).

O DNA plasmidial das colônias bacterianas transformadas foi extraído utilizando-se o

kit comercial “Illustra plasmid Prep Mini Spin Kit” (GE Healthcare), seguindo as

recomendações do fabricante. A confirmação da presença dos fragmentos virais amplificados

nos plasmídeos recombinantes foi realizada por digestão com a enzima de restrição EcoRI.

Procedeu-se ao sequenciamento automático de pelo menos um clone (isolado viral) obtido

para cada fragmento amplificado.

Análises das sequências: As sequências de nucleotídeos (nt) foram alinhadas com o

auxílio do software Clustal X 1.8 (LARKIN et al., 2007). As comparações entre as sequências

de nt e aminoácidos deduzidos (aad) obtidas com outros isolados disponíveis no GenBank

foram realizadas utilizando-se o programa BLASTn ou BLASTp do NCBI

(www.ncbi.nlm.nih.gov). Os alinhamentos múltiplos e as análises filogenéticas foram

realizados para as sequências completas ou parciais de nt dos diferentes genes de cada vírus

(RSPaV, GLRaV-2 e GLRaV-3), utilizando o software Mega 4.1 (TAMURA et al., 2007). As

árvores filogenéticas foram obtidas por meio de análise de máxima parcimônia e “bootstrap”

com 2000 replicações.

Foram incluídas nestas análises, sequências dos genes homólogos de isolados

“estrangeiros” depositadas no banco de dados do NCBI (GenBank). Também foram incluídas

as sequências dos isolado-tipo de cada espécie viral (RSPaV, NC_001948; GLRaV-2,

NC_007448; GLRaV-3, NC_004667) e, para os grupos externos das árvores, foram utilizadas

as espécies-tipo de cada gênero: Apple stem pitting virus (ASPV, Foveavirus, NC_003462) e

Beet yellows virus (BYV, Closterovirus, NC_001598). Para o grupo externo aos isolados de

GLRaV-3 foi utilizado o Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-1, Ampelovirus,

AF195822).

Detecção sorológica dos isolados: As mesmas plantas testadas por RT-PCR também

foram avaliadas pelo teste ELISA indireto, utilizando-se anti-soros policlonais contra as CPs

do GLRaV-2 (RADAELLI et al., 2008) e do RSPaV (anti-soro produzido neste trabalho,

Capítulo II) e por ELISA direto para GLRaV-3, com anti-soro comercial (Agritest, Bari -

Valenzano, Itália).

As amostras para os testes ELISA consistiram de ramos e/ou pecíolos maduros de

videiras, os quais foram triturados em almofariz na presença de nitrogênio líquido. Como

controle negativo foi utilizada a cv. Rupestris du Lot obtida por cultura de tecidos e

previamente testada.

Para o teste ELISA indireto (GLRaV-2 e RSPaV), placas de poliestireno foram

carregadas com 200 µl de cada amostra, diluída 1:3 (p/v) em tampão de revestimento

(carbonato de sódio 0,05, M, pH 9,6), incubando-se por 12h a 4°C. Após lavagens (três vezes

com tampão PBS-T, pH 7,4 em intervalos de 5 min cada) foi adicionada a IgG (4 µg/ml)

diluída em tampão de conjugado [PBS-T, pH 7,4, 2% de PVP 40.000 (p/v) e 0,2% de BSA

(p/v)]. Após incubação por 3 horas a 37°C, seguida de nova lavagem, adicionaram-se 200 µl

de conjugado geral (Sigma), diluído 1:1000 em tampão de conjugado e, novamente,

incubando a 37°C por 3 horas. Após nova lavagem, adicionou-se o substrato da enzima (4-

nitrofenil-fosfato dissódico hexahidratado, Sigma) diluído (1 mg/ml) em dietanolamina 10%,

pH 9,8 (ALMEIDA & LIMA, 2001).

Para o ELISA direto (GLRaV-3), placas de poliestireno foram submetidas a cobertura

com 200 µl de anti-soro comercial diluído em tampão de revestimento, conforme instruções

do fabricante e em seguida incubadas a 37°C por 4 horas. Após lavagens, as amostras

trituradas e diluídas 1:3 (p/v) em tampão de extração [Tris-HCl 0,5 M, pH 8,2, 0,8% NaCl

(p/v), 2% PVP 40.000 (p/v), 1% PEG 6000 (p/v) e 0,05% Tween 20 (v/v)] foram adicionadas

à placa (200 µl) e incubadas por 12h a 4°C. Após novas lavagens, foram adicionados 200 µl

de “conjugado específico”, diluído em tampão de conjugado, conforme as instruções do

fabricante. Após incubação por 3 horas a 37°C, seguida de lavagens, adicionou-se o substrato

da enzima, conforme descrito anteriormente (ALMEIDA & LIMA, 2001).

As leituras de absorbância, em 405 nm, foram registradas no aparelho leitor de placas

(Anthos 2020). As amostras foram consideradas positivas quando a leitura de absorbância foi

duas vezes superior àquela verificada para a planta sadia. Os valores foram obtidos, em média,

2 a 3h após a adição do substrato.

Detecção de vírus em cochonilhas vetoras: As cochonilhas foram coletadas em

vinhedos de Caxias do Sul (RS) e Petrolina (PE) (Tabela 5). A extração do RNA total (RNAt)

foi realizada com o reagente TRIzol (Invitrogen), conforme as instruções do fabricante. As

amostras foram compostas de 6 a 8 insetos adultos ou ninfas em diferentes estádios,

maceradas em tampão de extração [0,5 M Tris-HCl, pH 8,3, 0,14 M NaCl, 2% PVP-40 (p/v),

0,05% Tween 20 (v/v)] e homogeneizadas no reagente TRIzol. Foram utilizados clorofórmio

para a separação de fases, álcool isopropílico para a precipitação do RNAt e, o sedimento final

seco foi ressuspendido com água autoclavada. Em seguida procedeu-se à síntese do cDNA

viral e as reações de PCR conforme descrito anteriormente.

As amostras de cochonilhas foram avaliadas para a presença dos vírus: GVB

(oligonucleotídeos GVB6445 5' ATGGAAAATATATCCCGGATGG 3' e antisenso

GVB7038r 5' ACTCGTCAGACAACTCTATATC 3') (SALDARELLI et al., 1996;

RADAELLI et al., 2008), GVA (766/C1197), GLRaV-1 (GLRaV-1_v/GLRaV-1_r) e

GLRaV-3 (LR3 8504v/LR3 9445c) (Tabela 4). Como controle negativo das reações da RT-

PCR, foram utilizadas cochonilhas da espécie Pseudococcus viburni, não virulíferas, criadas e

mantidas em frutos de abóbora, no Laboratório de Entomologia da Embrapa Uva e Vinho.

Tabela 5 - Relação das amostras de cochonilhas Planococcus citri e Pseudococcus viburni (Família:

Pseudococcidae) avaliadas para a presença de vírus.

Amostra Localização do vinhedo Data coleta Espécie

n. 40 Fazenda Terra do Sol, Petrolina (PE) 07.10.09 Planococcus citri

n. 51 Fazenda Queiroz Galvão Alimentos, Petrolina (PE) 08.10.09 Planococcus citri

n. 53 Petrolina (PE) 17.02.10 Planococcus citri

caxias Caxias do Sul (RS) 28.01.10 Pseudococcus viburni

venturin Caxias do Sul (RS) 26.01.10 Pseudococcus viburni

Os produtos da RT-PCR foram analisados em géis de agarose. Para a comprovação da

especificidade das reações de RT-PCR, uma das amostras foi sequenciada. Para isto, a banda

correspondente ao fragmento de 451 pb de GVA, da amostra n. 40, foi recortada do gel, eluída

e clonada conforme mencionado anteriormente.

A sequência de nt deste isolado de GVA foi analisada conforme descrito

anteriormente. Foram incluídas nestas análises as sequências homólogas de isolados

brasileiros e “estrangeiros” depositadas no banco de dados do NCBI (GenBank) e que

apresentaram maiores identidades de nt com o isolado de GVA obtido. Para o grupo externo

da árvore filogenética foi adicionada a espécie Heracleum latent virus (HLV, Vitivirus,

X79270).

2.4 Resultados e discussão

Detecção molecular dos vírus: De modo geral, os vírus que infectam a videira

apresentam baixa concentração na planta, são restritos a tecidos específicos (ex. floema), além

de o título viral flutuar bastante segundo o estádio fenológico da planta hospedeira, quando se

compara com vírus que infectam outras culturas (BOSCIA et al., 1992). Contudo, a extração a

partir de dsRNA possibilitou a obtenção de ácidos nucléicos com maior integridade,

qualidade, pureza e concentração, quando comparada a extração de RNAt de videiras (dados

não mostrados), o que resultou em reações de RT-PCR com maior especificidade e

sensibilidade.

As cinco plantas provenientes dos dois vinhedos avaliados foram testadas para a

presença de 12 espécies virais, sendo apenas 3 delas detectadas: RSPaV, GLRaV-2 e GLRaV-

3 (Tabela 6). A não detecção das demais espécies pode ser atribuída a sua efetiva ausência nas

amostras, ou a presença de isolados específicos para os quais os oligonucleotídeos utilizados

não foram adequados, ou ainda, devido ao título viral extremamente baixo nas amostras. Além

dos vírus anteriormente mencionados, que não possuem relatos no Brasil, o GLRaV-1 é

prevalente em vinhedos do Vale do São Francisco, apresentando menor incidência no Rio

Grande do Sul. O vírus GFLV e GFkV normalmente também apresentam baixa incidência,

além da infecção ser latente nos vinhedos brasileiros.

Tabela 6 – Resultados obtidos por RT-PCR para as amostras de videiras avaliadas para presença de 12

espécies virais.

Amostra

Vírus Oligonucleotídeos

Localização do fragmento

amplificado em relação ao

acesso completamente

sequenciado

Tamanho

Fragmento

(pb)

CS1

CS2 IS1 IS2

IS3

GVA 766/C1197 CP 451 - - - - -

GVB GVB_v/GVB_c CP 693 - - - - -

GVD GVD_v/GVD_c CP 963 - - - - -

GFkV_v/GFkV_r CP 693 - - - - -

GFkV

GFkV_v/GFkV_c REP 245 - - - - -

GFLV GFLVs2515/GFLVa3300 CP 809 - - - - -

ArMV H428v/C867c CP 440 - - - - -

RSPaV_v1/RSPaV_c1

7771-8550 (NC_001948) 780

(+)* + + (+)* +

RSPaV

RSP2/RSP21 654-1484 (NC_001948) 831 - (+)* (+)* - -

RSPaV-PN 2R/PN1F MTR 505 - - - - -

RSPaV-SY SY9F/SY8R 2082-2710 (NC_001948) 628 + + + + (+)*

GLRaV-1_v/GLRaV-1_r CP 969 - - - - -

GLRaV-1

LRA/CPdR CPd2 1019 - - - - -

GLRaV-2 V2CPf/V2CPr2 14631-15061 (NC_007448) 431 + (+)* + + (+)*

GLRaV-3 LR3 8504v/LR3 9445c 13269-14210 (NC_004667) 942 - - + (+)* +

GLRaV-4 LR4f/LR4r ORF1 e 2 500 - - - - -

GCMV GCMVsense/GCMVantisense CP 391 - - - - -

10554-11176 (NC_007448) 623

Closterovirus HSP-P1/HSP-P2

10104-10896 (NC_004667) 593

(+)

LR2

+ (+)

LR3

+ +

Tricho/Vitivirus dPR1_v/dPR2_c 5729- 6068 (NC_001948) 339

- + + (+)

RSP

Betaflexiviridae dRW up1/dRW do2 5746-6084 (NC_001948) 339 + (+)

RSP

+ + +

(+)* Sequências depositadas no banco de dados do NCBI (GenBank); CS: Cabernet Sauvignon; IS: Isabel

No total, foram obtidos e clonados 12 isolados virais: sete isolados de RSPaV: CS1 e

IS2a (780 pb), CS2a e IS1 (831 pb), CS2b (339 pb), IS2b (339 pb) e IS3 (628 pb), três

isolados de GLRaV-2: CS1 (623 pb), CS2 (431 pb) e IS3 (431 pb) e dois isolados de GLRaV-

3: IS1 (593 pb) e IS2 (942 pb) (Tabela 6 e 7), os quais foram sequenciados e tiveram suas

sequências depositadas no banco de dados do NCBI (GenBank) (Tabela 7).

Tabela 7 - Relação das sequências dos isolados virais de RSPaV, GLRaV-2 e GLRaV-3 obtidos no

trabalho e depositados no banco de dados do NCBI (GenBank).

Vírus Gene sequenciado

n° nucleotídeos /

n° aminoácidos deduzidos

Código no GenBank

Nome do isolado

viral

780 GU166289

259 ACZ43912

CS1

780 GU166290

proteína capsidial (completa)

259 ACZ43913

IS2a

831 HM059036

276 ADG57583

CS2a

831 HM059037

276 ADG57584

IS1

339 HM059038

113 ADG57585

CS2b

339 HM358051

112 ADI87216

IS2b

628 HM130524

RSPaV

replicase (parcial)

209 ADG57589

IS3 (RSPaV

estirpe Syrah)

431 HM059035

143 ADG57582

CS2

431 HM358050

proteína capsidial (parcial)

143 ADI87215

IS3

623 HM059039

GLRaV-2

proteína de choque térmico 70

(parcial) (HSP70)

207 ADG57586

CS1

942 HM059034

proteína capsidial (completa)

313 ADG57581

IS2

593 HM059040

GLRaV-3

proteína de choque térmico 70

(parcial) (HSP70)

197 ADG57587

IS1

Para a presença de RSPaV, as plantas foram avaliadas com dois pares de

oligonucleotídeos específicos (RSPaV_v1/RSPaV_c1 e RSP2/RSP21) e dois pares

degenerados (dPR1_v/dPR2_c e dRW up1/dRW do2). Todos promoveram a detecção de

RSPaV nas amostras avaliadas, com diferentes eficiências, variando de 2 a 5 plantas

infectadas (Tabela 6 e Figuras 2B, 2D, 2E, 2F e 2G), fato, provavelmente atribuído a

especificidade do oligonucleotídeos em relação ao isolado de RSPaV presente na amostra.

Com o par dPR1_v/dPR2_c desenhado para os gêneros Tricho/Vitivirus foi possível detectar o

RSPaV em apenas 3 amostras. Este par de oligonucleotídeo permitiu a detecção do RSPaV,

Foveavirus, em função da suas sequências degeneradas.

Resultados semelhantes aos obtidos neste trabalho foram obtidos por Bertazzon &

Angelini (2004), em testes de detecção de diferentes isolados de GLRaV-2, os quais

obtiveram resultados falso-negativos em função do oligonucleotídeo utilizado.

Meng et al. (1999) destacam a importância da escolha dos oligonucleotídeos na

indexagem de plantas infectadas por RSPaV, e demonstram que a eficiência entre diferentes

pares de oligonucleotídeos testados foi de 85 a 100%. Beuve et al. (2007) também ressaltam a

importância de oligonucleotídeos desenhados com base em regiões conservadas, levando-se

em consideração a variabilidade entre os isolados da mesma espécie.

Todas as plantas avaliadas também se mostraram infectadas com RSPaV, estirpe Syrah

(RSPaV-SY) (Figura 2A), uma estirpe específica do RSPaV que causa engrossamento na

região da enxertia na videira cultivar Syrah, além de necroses nesta região (LIMA et al.,

2006a). Este pode ser considerado o primeiro relato desta estirpe em vinhedos brasileiros, o

que reforça a importância de estudos da variabilidade. Estudos adicionais de caracterização

biológica necessitam ser conduzidos neste caso.

Estes resultados demonstram a ocorrência de infecções virais múltiplas, considerando

espécies e estirpes virais, em uma mesma planta (videira). Tal situação torna o diagnóstico

mais complexo e o estudo de eficiência/eficácia de utilização de ferramentas moleculares

adquire particular relevância.

Os oligonucleotídeos específicos para a estirpe Syrah (LIMA et al., 2006a) foram

desenhados com base no gene da replicase, uma região considerada bastante variável e que

permite diferenciar esta estirpe específica da estirpe típica do RSPaV (HALIBI et al., 2006).

Também se avaliou a presença da estirpe Pinot Noir (PN) do RSPaV (RSPaV-PN) com

oligonucleotídeos específicos (LIMA et al., 2009) porém não houve amplificação nas plantas

avaliadas. Ainda não há relato da ocorrência desta estirpe em vinhedos brasileiros até o

presente momento. Esta estirpe, caracterizada por Lima et al. (2009) possui identidade de nt

com outros isolados de RSPaV, variando de 76% a 78%.

Para a presença do GLRaV-2, foram testados um par de oligonucleotídeos específico

(V2CPf/V2CPr2) e um degenerado (HSP-P1/HSP-P2). Pôde-se verificar que os mesmos

apresentaram alta sensibilidade, permitindo a detecção desta espécie viral em todas as plantas

avaliadas, tanto com o par específico (Figuras 2F e 2G), quanto com o degenerado (Figura

2C).

Para o vírus GLRaV-3 foram utilizados um par de oligonucleotídeos específico (LR3

8504v/LR3 9445c) e um degenerado (HSP-P1/HSP-P2). Apenas as plantas da cv. Isabel

apresentaram-se infectadas, tanto na determinação com o par de oligonucleotídeos específicos

(Figuras 2F e 2G), quanto com o degenerado (Figura 2C). O par HSP-P1/HSP-P2, desenhado

para o gênero Closterovirus, permitiu também a detecção do GLRaV-3, o qual pertence a

família Closteroviridae.

1700_

1159_

805_

514_

339_

339pb

M SD CS1 CS2 IS1 IS2 IS3

1700_

1159_

805_

514_

339_

1700_

1159_

805_

514_

339_

M SD CS1 CS2 IS1 IS2 IS3

628pb

780pb

1700_

1159_

805_

514_

339_

593-623 pb

M SD CS1 CS2 IS1 IS2 IS3

M SD CS2 SD CS2

IS3 SD IS3

1700_

1159_

805_

514_

339_

-- 942pb

-- 831pb

_ 431pb

Figura 2 - Eletroforese em gel de agarose dos produtos da RT-PCR. Géis: (A) RSPaV-SY (SY9F/SY8R); (B)

RSPaV (RSPaV_v1/RSPaV_c1); (C) Closterovirus (HSP-P1/HSP-P2); (D) Tricho/Vitivirus (dPR1_v/dPR2_c);

(E): Betaflexiviridae (dRW up1/dRW do2); (F) RSPaV (RSP2/RSP21), GLRaV-2 (V2CPf/V2CPr2), GLRaV-3

(LR3 8504/LR3 9445); (G) RSPaV (RSP2/RSP21), GLRaV-2 (V2CPf/V2CPr2), GLRaV-3 (LR3 8504/LR3

9445). M: marcador DNAλ/PstI, SD: planta sadia, CS1 e CS2: plantas cv. Cabernet Sauvignon, IS1, IS2 e IS3:

plantas cv. Isabel.

M SD CS1 CS2 IS1 IS2 IS3

1700_

1159_

805_

514_

339_

363pb

1700_

1159_

805_

514_

339_

M SD IS1 SD CS1 IS2 IS1 SD IS2 IS1

__942pb

__831pb

_ -431pb

RSPaV

Closterovirus

Tricho/Vitivirus

Betaflexiviridae

RSPaV

GLRaV-2

GLRaV-3

GLRaV-2 GLRaV-3 RSPaV

Os resultados obtidos demonstram a ocorrência de infecções virais múltiplas nas cinco

plantas avaliadas, envolvendo GLRaV-2, GLRaV-3 e RSPaV, incluindo a estirpe RSPaV-SY.

Estas mesmas plantas não apresentaram infecções com as espécies virais de GVA, GVB,

GFkV, GFLV, GLRaV-1, GVD, ArMV, GLRaV-4 e GCMV.

As plantas avaliadas de ambos o vinhedos, como mencionadas anteriormente, eram

assintomáticas no início o ciclo vegetativo, sendo que a cv. Isabel, não expressou sintomas de

infecção viral em todo seu ciclo vegetativo, contudo, nesta cultivar também foram detectadas

infecções múltiplas.

Os resultados demonstram a prevalência e a importância das três espécies virais

detectadas nas amostras, o que está em concordância com outros relatos em diferentes países

vitícolas do mundo (MARTELLI, 2009) e, indiretamente, também expresso pelo número de

sequências destes três vírus depositadas no banco de dados do NCBI (GenBank) (Tabela 2).

Análises das sequências: Todas as 12 sequências obtidas para os vírus RSPaV,

GLRaV-2 e GLRaV-3 foram comparadas com regiões genômicas homólogas de outros

isolados disponíveis no GenBank, através de análise de identidade de nucleotídeos (nt) e

aminoácidos deduzidos (aad), além de terem sido submetidas a análises filogenéticas.

RSPaV (Identidade do gene da proteína capsidial): Nas comparações de sequência foram

considerados os isolados-tipo de RSPaV completamente sequenciados (RSPaV, RSPaV-1),

suas estirpes (SG1, BS, SY, PN) além do isolado CF207, cujo gene foi expressado no

Capítulo II deste trabalho e o isolado RSP-SP, obtido em vinhedos de São Paulo (Pereira,

2008).

Pela análise de identidade de nt do gene completo da CP, verifica-se que os isolados

caracterizados CS1 e IS2a apresentaram maiores identidades de nt com os isolados SG1

(95,7%) e BS (91,5%), respectivamente. As identidades de nt e aad apresentadas entre os dois

isolados caracterizados foram de 84,7% e 81,8%, respectivamente. Em relação ao isolado tipo

da espécie (RSPaV-1), o isolado CS1 apresentou identidade de 91,6% (nt) e 89,5% (aad) e o

isolado IS2a apresentou 84,7% (nt) e 89,5% (aad). Quando comparados com os outros dois

isolados brasileiros, CF207 caracterizado por Radaelli et al. (2009), também proveniente de

vinhedos do Rio Grande do Sul e RSP-SP caracterizado por Pereira (2008), verificou-se baixa

identidade de nt, entre 82,9-90,6% (Tabela 8).

Tabela 8 - Identidade (%) das sequências de nucleotídeos (abaixo da diagonal) e de aminoácidos

deduzidos (acima da diagonal) do gene da proteína capsidial (780 pb) entre diferentes isolados de

Rupestris stem pitting-associated virus.

RSPaV RSPaV-1 SG1 BS SY PN CS1 IS2a CF207

RSP-SP

RSPaV - 99,6 95,7 92,6 92,6 93,4 89,5 89,5 98,1 91,8

RSPaV-1 99,4 - 96,1 92,6 93,0 93,4 89,5 89,5 98,4 91,8

SG1 90,9 90,8 - 90,7 91,5 91,8 88,8 87,2 94,5 89,1

BS 82,4 82,5 81,9 - 92,6 95,3 84,5 93,0 93,4 96,9

SY 85,2 85,6 85,8 84,2 - 93,4 85,3 88,0 93,8 92,2

PN 82,6 83,0 81,1 88,1 84,3 - 85,7 91,1 94,2 94,9

CS1 91,4 91,6 95,7 83,2 85,7 82,4 - 81,8 88,0 92,7

IS2a 84,7 84,7 83,5 91,5 85,1 89,1 84,7 - 89,5 83,3

CF207 96,8 96,8 88,8 84,6 86,2 84,7 89,7 85,1 - 92,6

RSP-SP 83,7 81,2 85,0 92,8 84,4 87,6 82,9 90,6 86,1 -

Códigos dos nucleotídeos dos isolados no GenBank e país: RSPaV (AF026278, EUA), RSPaV-1 (NC_001948,

EUA), SG1 (AY881626, EUA), BS (AY881627, Canadá), SY (AY368590, EUA), PN (AY368172, EUA), CS1

(GU166290, Brasil), IS2a (GU166289, Brasil), CF207 (EF636804, Brasil)

e RSP-SP (DQ443732, Brasil).

Pôde-se verificar, com base na análise filogenética do gene da proteína capsidial

desses isolados, a formação de agrupamentos distintos, à semelhança de outros trabalhos

(RADAELLI et al., 2009; LIMA et al., 2006a; MENG et al., 2006; NOLASCO et al., 2006;

NAKAUNE et al., 2008). Observa-se a formação de pelo menos dois grupos, no qual o

isolado IS2a se apresenta no grupo II, próximo aos isolados RSP-SP (Brasil), BS (Canadá) e

PN (Estados Unidos) (Figura 3).

RSPaV EUA

RSPaV1 EUA

CF207 Brasil

SG1 EUA

CS1 Brasil

SY EUA

PN EUA

IS2a Brasil

BS Canadá

RSP-SP Brasil

ASPV

100