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ELIANE HOOPER AMARAL
RESIDUOS DE AGROTÓXICOS
ORGANOFOSFORADOS: VALIDAÇÃO DE
MÉTODO DE CROMATOGRAFIA A GÁS E
QUANTIFICAÇÃO EM PRODUTOS AGRÍCOLAS
Faculdade de Farmácia da UFMG
Belo Horizonte, MG
2007
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ELIANE HOOPER AMARAL
RESIDUOS DE AGROTÓXICOS
ORGANOFOSFORADOS: VALIDAÇÃO DE
MÉTODO DE CROMATOGRAFIA A GÁS E
QUANTIFICAÇÃO EM PRODUTOS AGRÍCOLAS
Dissertação apresentado ao Programa de Pós –
Graduação em Ciência de Alimento da Faculdade
de Farmácia da Universidade Federal de Minas
Gerais, como requisito parcial à obtenção do título
de mestre em Ciência de Alimentos.
Orientador: Prof. Roberto Gonçalves Junqueira
Faculdade de Farmácia da UFMG
Belo Horizonte, MG
2007
2
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Amaral, Eliane Hooper.
A485r Resíduos de agrotóxicos organofosforados: validação de
método de cromatografia a gás e quantificação em produtos
agrícolas / Eliane Hooper Amaral. – 2007.
141f. : il.
Orientador: Prof. Roberto Gonçalves Junqueira.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais,
Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciência
de Alimentos.
1. Alimentos – Contaminação – Teses. 2. Análise
cromatográfica – Teses. 3. Pesticidas – Resíduos em alimentos –
Teses. 4. Produtos agrícolas – Análise – Teses. 5. Validação de
método – Teses. I. Título. II. Junqueira, Roberto Gonçalves. III.
Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia.
CDD: 664.07
3
Meu marido e filhos
Meus familiares sem exceção
Meus amigos com “A” maiúsculo
Meus colegas de convívio cotidiano
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, por mais esta etapa vencida em minha vida.
Ao Professor Roberto Gonçalves Junqueira, pela dedicação, orientação e por ter me
possibilitado enxergar outros caminhos.
À Faculdade de Farmácia da UFMG e aos professores do Programa de Pós-
Graduação em Ciência de Alimentos por ampliarem os meus conhecimentos.
Ao Instituto Mineiro de Agropecuária - IMA por apoiar e acreditar na necessidade
constante de qualificação técnica de seus funcionários e oportunidade de crescimento
profissional.
Aos colegas Alexandre, Dilma, Isis, Leandro e Regina, do Laboratório de Análise de
Resíduos de Agrotóxicos, e a ex-colega Ana Paula pelo incentivo, carinho, grande
disposição e eficiência para a realização das análises e sobretudo pelo sentimento de
equipe.
A Scheilla Vitorino pela valiosa contribuição e pelo incentivo no início deste trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Química Agropecuária pelo apoio.
Aos colegas do IMA do interior pela coleta das amostras.
Aos colegas do mestrado pela breve, mas agradável convivência.
A minha mãe, irmãos, sobrinhos e sobrinha, pela compreensão e apoio em todos os
momentos.
E a todos aqueles que ajudaram tornar possível a realização deste Trabalho.
5
"O correr da vida embrulha tudo, a vida é assim: esquenta e esfria,
aperta e daí afrouxa, sossega e depois desinquieta. O que ela quer
da gente é coragem."
Guimarães Rosa
6
SUMÁRIO
Pág.
LISTA DE TABELAS
10
LISTA DE FIGURAS
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
13
RESUMO
14
ABSTRACT
15
1 INTRODUÇÃO
16
2 OBJETIVOS
18
2.1 OBJETIVOS GERAIS 18
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 18
3 REVISÃO DA LITERATURA
19
3.1 AGROTÓXICOS 19
3.2 INSETICIDAS DO GRUPO DOS ORGANOFOSFORADOS 23
3.3 CONTAMINAÇÃO DE ALIMENTOS NO BRASIL E NO MUNDO 27
3.4 ANÁLISE DE RESÍDUOS DE INSETICIDAS ORGANOFOSFORADOS 30
3.4.1 Amostragem, transporte e armazenamento da amostra 30
3.4.2 Técnicas de extração e concentração da amostra 31
3.4.3 Técnicas de purificação de amostras 32
3.4.4 Outras técnicas de extração e purificação 33
3.4.5 Métodos analítico 34
3.4.6 O uso da cromatografia gasosa 36
3.4.7 O uso da cromatografia líquida de alta eficiência 38
3.4.8 Aplicação da Cromatografia de Camada Delgada 39
3.4.9 Métodos de Confirmação 40
3.5 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS 41
3.5.1 Aplicabilidade, seletividade, efeito de matriz e sensibilidade 42
3.5.2 Faixa de trabalho e linearidade 44
3.5.3 Exatidão e precisão 45
3.5.4 Limites de detecção, quantificação, decisão e capacidade de
detecção
47
3.5.5 Robustez 49
2.5.6 Revalidação 50
2.5.7 Matrizes representativas 50
2.5.8 Analitos representativas 51
4 MATERIAL E MÉTODOS
53
4.1 ANALITOS 53
4.2 EQUIPAMENTOS 54
4.3 REAGENTES E PADRÕES 54
4.4 SOLUÇÕES 54
4.4.1 Solução padrão estoque 54
4.4.2 Solução pool padrão Intermediária 1 55
4.4.3 Solução pool padrão Intermediária 2 55
4.4.4 Preparo da curva de calibração 55
4.4.5 Solução extratora 56
7
4.5 AMOSTRAS USADAS NA VALIDAÇÃO 56
4.6 MÉTODO DE ENSAIO 56
4.7 MÉTODO DE ENSAIO MODIFICADO 57
4.7.1 Extração 57
4.7.2 Preparo da curva de calibração no extrato da matriz 57
4.7.3 Separação, detecção e quantificação 58
4.8 VALIDAÇÃO 59
4.8.1 Linearidade 60
4.8.2 Efeito do dia 61
4.8.3 Efeitos de matriz 62
4.8.4 Seletividade, exatidão (recuperação) e precisão 62
4.8.5 Limites de detecção, quantificação, decisão e capacidade de
detecção
66
4.9 ANÁLISE DE RESÍDUOS DE ORGANOFOSFORADOS EM
HORTIFRUTÍCOLAS
67
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
69
5.1 ESCOLHA DOS ANALITOS E MATRIZES REPRESENTATIVAS 69
5.2 SELETIVIDADE 69
5.3 LINEARIDADE 74
5.4 EFEITO DO DIA 80
5.5 EFEITO DE MATRIZ 83
5.6 RECUPERAÇÃO E PRECISÃO 87
5.7 LIMITES DE DETECÇÃO, QUANTIFICAÇÃO, DECISÃO E
CAPACIDADE DE DETECÇÃO
92
5.8 ANÁLISE DE RESÍDUOS DE ORGANOFOSFORADOS EM
HORTIFRUTÍCOLAS
95
6 CONCLUSÕES
100
7 SUGESTÕES
101
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
102
APÊNDICES A - GRÁFICOS DOS RESÍDUOS DA REGRESSÃO DAS
TRÊS CURVAS DE SOLVENTES COM INDICAÇÕES DOS
RESPECTIVOS OUTLIERS DIAGNOSTICADOS PELO TESTE DE
RESÍDUOS PADRONIZADOS DE JACKNIFE
115
APÊNDICES B – GRÁFICOS DA AVALIAÇÃO DA NORMALIDADE
DOS RESÍDUOS PELO TESTE DE RYAN-JOINER DAS TRÊS CURVAS
DE SOLVENTE.
117
APÊNDICES C – GRÁFICOS DA AVALIAÇÃO DE
AUTOCORRELAÇÃO DOS RESÍDUOS PELO TESTE DURBIN-
WATSON DAS TRÊS CURVAS DE SOLVENTE.
119
APÊNDICES D - GRÁFICOS DA AVALIAÇÃO DA HOMOGENEIDADE
DA VARIÂNCIA PELO TESTE DE LEVENE MODIFICADO DAS TRÊS
CURVAS DE SOLVENTE.
121
APÊNDICES E - GRÁFICOS DAS CURVAS DE REGRESSÃO LINEAR,
APÓS A RETIRADA DOS OUTLIERS.
123
8
APÊNDICES F - GRÁFICOS DA CURVAS DE CALIBRAÇÃO DAS
SOLUÇÕES PADRÕES DE AGROTÓXICOS NO SOLVENTE E NA
SOLUÇÃO MATRIZ DE ALFACE.
125
APÊNDICES G - GRÁFICOS DA CURVAS DE CALIBRAÇÃO DAS
SOLUÇÕES PADRÕES DE AGROTÓXICOS NO SOLVENTE E NA
SOLUÇÃO MATRIZ DE BANANA.
126
APÊNDICES H - GRÁFICOS DA CURVAS DE CALIBRAÇÃO DAS
SOLUÇÕES PADRÕES DE AGROTÓXICOS NO SOLVENTE E NA
SOLUÇÃO MATRIZ DE TOMATE
127
9
LISTA DE TABELAS
Pág.
1 Classificação toxicológica dos agrotóxicos baseada na Dose Letal
50
e na
Concentração Letal
50
de formulações líquida e sólida
21
2 Informações sobre a classificação toxicológica e ingestão diária aceitável
dos inseticidas organofosforados
26
3 Níveis de adição de padrões em amostras brancas de alface, banana e
tomate para cálculo de exatidão, precisão, limite de quantificação, limite
de decisão e capacidade de detecção
63
4 Cálculo das variâncias para o delineamento fatorial completamente
aninhado
65
5 Expressões da precisão em condições de repetitividade e de
reprodutibilidade parcial
65
6 Tempo de retenção dos oito organofosforados estudados 69
7 Número de outliers retirados pelo teste de resíduos padronizados Jacknife
nas curvas de solventes obtidas no estudado de linearidade
74
8 Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de clorfenvinfós
(12,24 ng ml
-1
a 93,84 ng ml
-1
)
76
9 Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de clorpirifós
(12,12 ng ml
-1
a 92,92 ng ml
-1
)
76
10 Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de diclorvós
(12,24 ng ml
-1
a 93,84 ng ml
-1
)
77
11 Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de dimetoato
(12,12 ng ml
-1
a 92,92 ng ml
-1
)
77
12 Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de etiona (12,0
ng ml
-1
a 92,0 ng ml
-1
)
78
13 Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de etoprofós
(12,0 ng ml
-1
a 92,0 ng ml
-1
)
78
14 Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de parationa
metílica (12,0 ng ml
-1
a 92,0 ng ml
-1
)
79
15 Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de pirimifós
metílico (12,0 ng ml
-1
a 92,0 ng ml
-1
)
79
16 Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de clorfenvinfós
80
17 Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de clorpirifós
80
18 Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de diclorvós
81
19 Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de dimetoato
81
20 Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de etiona
81
21 Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de etoprofós
82
22 Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de parationa-metilica
82
23 Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de pirimifós-metilico
82
24 Número de outliers retirados pelo teste de resíduos padronizados Jacknife 83
10
nas curvas de solventes e matriz obtidas no estudado de efeito matriz
25 Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de alface para etoprofós, pirimifós-metílico,
parationa-metílica e etiona (12 ng mL
-1
a 92 ng mL
-1
)
84
26 Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de alface para clorfenvinfós e diclorvós (12,24
ng mL
-1
a 93,84 ng mL
-1
) e clorpirifós e dimetoato (12,12 ng mL
-1
a 92,92
ng mL
-1
)
84
27 Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de banana para etoprofós, pirimifós-metílico,
parationa-metílica e etiona (12 ng mL
-1
a 92 ng mL
-1
)
85
28 Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de banana para clorfenvinfós e diclorvós (12,24
ng mL
-1
a 93,84 ng mL
-1
) e clorpirifós e dimetoato (12,12 ng mL
-1
a 92,92
ng mL
-1
)
85
29 Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de tomate para etoprofós, pirimifós-metílico,
parationa-metílica e etiona (12 ng mL
-1
a 92 ng mL
-1
)
86
30 Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de tomate para clorfenvinfós e diclorvós (12,24 ng
mL
-1
a 93,84 ng mL
-1
) e clorpirifós e dimetoato (12,12 ng mL
-1
a 92,92 ng
mL
-1
)
86
31 Números de outliers retirado pelo teste de Grubbs nos resultados de
recuperação obtidos dos organofosforados nas três matrizes estudadas
88
32 Médias de recuperação e desvios padrão relativo, sob condições de
repetibilidade e reprodutibilidade parcial, obtidos para amostras de alface
adicionadas de resíduos de organofosforados em diferentes níveis de
concentração
89
33 Médias de recuperação e desvios padrão relativo, sob condições de
repetibilidade e reprodutibilidade parcial, obtidos para amostras de banana
adicionadas de resíduos de agrotóxicos em diferentes níveis de
concentração
90
34 Médias de recuperação e desvios padrão relativo, sob condições de
repetibilidade e reprodutibilidade parcial, obtidos para amostras de tomate
adicionadas de resíduos de agrotóxicos em diferentes níveis de
concentração
91
35 Valores de limites de decisão e capacidade de detecção 94
36 Amostras com resíduos e em desacordo com a legislação 96
11
LISTA DE FIGURAS
Pág.
1 Estrutura química de malationa e aldicarbe 19
2 Grupo funcional dos compostos inseticidas organofosforados 23
3 Estrutura química de inseticidas organofosforados típicos de cada um dos
grupos funcionais
24
4 Estruturas químicas dos inseticidas organofosforados analisados 53
5 Fluxograma da metodologia de análise 59
6 Cromatogramas típicos de soluções pool de padrões de organofosforados 70
7 Cromatogramas típicos de amostras brancas das matrizes, alface (a),
banana (b) e tomate (c)
71
8 Cromatogramas típicos de soluções pool de padrões de organofosforados
na solução matriz de alface
72
9 Cromatogramas típicos de soluções pool de padrões de organofosforados
na solução matriz de banana
72
10 Cromatogramas típicos de soluções pool de padrões de organofosforados
na solução matriz de tomate
73
11 Cromatogramas típicos de presença de resíduos de organofosforados em
amostras de hortifrutícolas
73
12 Freqüência de resíduos de organofosforados encontrados nas amostras de
hortifrutícolas
95
13 Número de amostras de morango com de resíduos de organofosforados
não autorizado para a cultura
97
14 Número de amostras de tomate com resíduos de organofosforados 98
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC - Association of Official Analytical Chemists
CL
50
–
Concentração Letal
50
CCFAE - Cromatografia de Camada Fina de Alta Eficiência
CG – Cromatografia gasosa
CLAE – Cromatografia liquida de alta eficiência
CPG – Cromatografia de permeação a gel
DAD – Detector de arranjo de diodos
DCE – Detector de captura de elétrons
DFC – Detector fotométrico de chama
DIC – Detector de ionização de chama
DL50 - Dose Letal50
DNF – Detector nitrogênio e fósforo
DPR
r
– Desvio padrão relativo de repetitividade
DPR
R
– Desvio padrão relativo de reprodutibilidade parcial
DTE – Detector Termiônico Específico
EFS – Extração em fase sólida
EM – Espectrômetro de massas
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
LMR – Limite Máximo de Resíduos
LD – Limite de Detecção
LQ – Limite de Quantificação
MEFS – Microextração em fase sólida
MMQO - Método dos mínimos quadrados ordinários
NA – Não Autorizado
NATA - National Association of Testing Authorities - Australia
PARA – Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos
SIA – Sistema de Informação em Agrotóxicos
SINDAG – Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola
SINITOX – Sistema Nacional de Informações Tóxico-farmacológicas
SPE - Solução padrão estoque
SPI - Solução pool padrão Intermediária
UV – Ultra violeta
13
RESUMO
Uma validação intralaboratorial de um método de multiresíduos para ensaio de
inseticidas organofosforados em produtos agrícolas por cromatografia gasosa com
detector termiônico específico foi realizada dentro de um procedimento detalhado,
incluindo um delineamento experimental. O método foi validado para os analitos
clorfenvinfós, clorpirifós, diclorvós, dimetoato, etiona, etoprofós, parationa-metílica e
pirimifós-metílico nas matrizes alface, banana e tomate. Foram realizados ensaios com
curvas de solventes e de matriz, amostras brancas e adicionadas. As premissas
relacionadas às estatísticas empregadas foram avaliadas e confirmadas. A linearidade
do método foi obtida na faixa de 12 a 92 ng mL
-1
. Houve efeito do dia nos estudos de
linearidade do método. Comprovou-se o efeito de matriz, com exceções para dimetoato
em alface, clorpirifós em banana e clorfenvinfós em tomate. As médias de recuperação,
na faixa do limite de quantificação, variaram de 76,7% a 104,2%. O método apresentou
precisão aceitável, desvios padrão relativos sob condições de repetitividade entre 5,2%
a 14,3% e reprodutibilidade parcial entre 5,7% a 21,4%. Não houve precisão para o
clorfenvinfós no nível de adição de 8,0 µg kg
-1
nas matrizes alface e banana, para o
diclorvós no nível 8,0 µg kg
-1
para a matriz alface e nos três níveis de adição estudados
para as matrizes banana e tomate. Os limites de detecção foram de 5,0 µg kg
-1
e
8,0 µg kg
-1
. Os limites de quantificação foram de 8,0 µg kg
-1
a 40,0 µg kg
-1
.
Foram
determinados limite de decisão de 6,7 µg kg
-1
a 5,1 mg kg
-1
e capacidade de detecção
de 11,3 µg kg
-1
a 5,5 mg kg
-1
. Das 309 amostras analisadas, 18,4% apresentaram
resíduos de OF, sendo que 13,6% estavam em desacordo com a legislação vigente.
Destas, 92,9% apresentaram resíduos de OF não autorizado para a cultura e 7,1%
apresentaram limites acima do permitido.
Palavras-chave: validação intralaboratorial; análise de multiresíduos;
organofosforados; cromatografia gasosa; produtos agrícolas; análise de alimentos.
14
ABSTRACT
An in-house validation of a multi-residues method for quantitative determination
of organophosphorus compounds in fruits and vegetables by gas chromatography using
a thermionic specific detection was carried out. The method was validated for the
analitos chlorfenvinphos, chlorpyrifos, dichlorvos, dimethoate, ethion, ethoprophos,
parathion-methyl and pirimiphos-methyl on the matrices lettuce, banana and tomato.
Experiments with solvent and matrix-matched calibration curves, blanks and spiked
samples were performed. The assumptions related to the statistics used were evaluated
and confirmed. The method linearity was obtained between 12 the 92 ng mL
-1
. The day
affected the method linearity studies. It was proved the matrix effect, except dimethoate
in lettuce, chorpyrifos in banana and chlorfenvinphos in tomato. The recovery averages,
in the range of the quantification limit, varied from 76.7% to 104.2%. The method
presented acceptable precision, relative standard deviations under repeatability
conditions between 5.2% and 14.3% and parcial reproducibility between 5.7% and
21.4%. In the matrices lettuce and banana there was not precision for clorfenvinfós in
the level of addition of 8.0 mg kg
-1
, for diclorvós in level 8.0 µg kg
-1
for lettuce and in the
three addition levels studied for the matrices banana and tomato. The experimental
detection limits were 5.0 µg kg
-1
and 8.0 µg kg
-1
. The quantification limits were 8.0 µg kg
-
1
to 40.0 µg kg
-1
. Decision limits raging from 6.7 µg kg
-1
to 5.1 mg kg
-1
and detection
capabilities raging from 11.3 µg kg
-1
to 5,5 mg kg
-1
were determined. Of the 309 samples
collected in different cities of Minas Gerais, 13,6% presented non authorized residues of
organophosphorus for the culture and 1.0% exceeded the maximum residue limits.
Keywords: in-house validation; multi-residue analysis; organophosphorus;
chromatography gas; fruits and vegetables; food analysis.
15
1 INTRODUÇÃO
A utilização dos agrotóxicos na agricultura iniciou-se na década de 1920, época
em que eram pouco conhecidos do ponto de vista toxicológico. Durante a Segunda
Guerra Mundial, foram utilizados como arma química, tendo seu uso se expandido
enormemente a partir de então, chegando a produção industrial mundial a atingir dois
milhões de toneladas de agrotóxicos por ano. No Brasil, foram primeiramente utilizados
em programas de saúde pública, no combate a vetores e controle de parasitas,
passando a ser utilizados mais intensivamente na agricultura a partir da década de
1960 (BRASIL, 1997).
O aumento da produção de alimentos nos países desenvolvidos, e em grande
parte dos países em desenvolvimento, se deve à modernização das práticas agrícolas,
incluindo a mecanização, a utilização de variedades melhoradas, de fertilizantes e
agrotóxicos (CAMPANHOLA et al, 1998). No entanto, as técnicas deficientes de
aplicação de agrotóxicos e o desrespeito aos períodos de carência vêm causando
sérios problemas de ordem ambiental e de segurança alimentar, com a contaminação
do solo, água e alimentos (HENAO & COREY, 1991).
Dados da Organização Mundial das Nações Unidas para Agricultura e
Alimentação apontam o Brasil como um dos países que mais aplicam agrotóxicos.
(VICENTE et al.,1998). A maior utilização dessas substâncias é na agricultura,
especialmente nos sistemas de monocultura, em grandes extensões. São também
utilizados em saúde pública, na eliminação e controle de vetores transmissores de
doenças endêmicas. E, ainda, no tratamento de madeira para construção, no
armazenamento de grãos a sementes, na produção de flores, para combate a piolhos e
outros parasitas, na pecuária (BRASIL, 1997).
A exposição de produtores rurais e consumidores aos resíduos de agrotóxicos
constituem um dos principais alvos de preocupação com a saúde pública em diversos
países e vários programas de monitoramento de resíduos de agrotóxicos têm sido
implementados. No Brasil, o problema se agrava ao se considerar o fato de que os
próprios agricultores ainda não têm consciência do perigo a que estão expostos
quando utilizam agrotóxicos e desrespeitam as medidas de segurança recomendadas
(CAMPANHOLA & BETTIOL, 2001).
Dentre os agrotóxicos utilizados na agricultura merecem destaque os inseticidas
16
organofosforados (OF), que são os que mais causam intoxicações e ainda grande
número de morte no Brasil, devido a sua alta toxicidade aguda (SINITOX, 1998). São
largamente usados na agricultura como inseticidas e podem contaminar uma variedade
de produtos agrícolas. Devido sua toxicidade e risco potencial para o consumidor, a
quantificação nos alimentos de consumo é de preocupação pública (ALBANIS &
LAMBROPOULOU, 2003).
Os OF são ésteres do ácido fosfórico com diferentes substituintes. Estes
compostos menos persistentes no ambiente que os organoclorados podem acumular
ao longo da cadeia alimentar, podendo representar um risco para a saúde humana
(PAGLIUCA et al., 2005).
Os OF são aplicados mundialmente. A preocupação pública com o excesso de
resíduos de agrotóxicos ganhou relevância na última década. Uma determinação exata
dos resíduos de agrotóxicos em frutas, vegetais e matrizes relacionadas é certamente
de grande importância na análise de alimentos (CUADROS-RODRIGUEZ et e al,
2003).
Devido à preocupação com os resíduos de agrotóxicos nos alimentos, são
realizadas análises a cada dia em milhares de laboratórios ao redor do mundo. A
necessidade progressiva de dados analíticos comparáveis e consistentes é essencial
para a eliminação de barreiras técnicas entre os países. Uma vez efetuada a medição,
para que ela seja aceita em qualquer país, requisitos legais, de acreditação devem ser
observados. As normas nacionais e internacionais do sistema da qualidade destacam a
importância da validação de métodos analíticos para a obtenção de resultados
confiáveis e adequados ao uso pretendido. Validação de métodos é um aspecto vital da
garantia da qualidade analítica (BARROS, 2002).
Dados analíticos não confiáveis podem conduzir a decisões desastrosas e a
prejuízos financeiros irreparáveis. Para assegurar que um método analítico forneça
informações confiáveis e interpretações corretas das amostras ele deve passar por
uma avaliação, denominada de validação (RIBANI et al, 2004).
Mesmo que o método analítico já tenha sido objeto de um estudo colaborativo,
ainda assim, o analista deve validá-lo no seu laboratório por meio de teste de
recuperação e avaliação da linearidade, sensibilidade, especificidade, exatidão,
precisão, limites de detecção e quantificação (EURACHEM, 1998; SOARES, 2001).
17
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
• Validar um método de análise de resíduos de inseticidas organofosforados.
• Quantificar os níveis de resíduos de inseticidas organofosforados em produtos
agrícolas de alguns municípios de Minas Gerais.
2.2 Objetivos específicos
• Validar um método de análise de resíduos de clorpirifós, clorfenvinfós, diclorvós,
dimetoato, etiona, etoprofós, parationa-metílica e pirimifós-metílico nas matrizes
alface, banana e tomate.
• Quantificar os níveis de 27 organofosforados em: alface, banana, batata, cenoura,
chuchu, jiló, morango pepino, pimentão e tomate
• Verificar se os níveis de resíduos atendem ao Limite Máximo de Resíduos (LMR) e
se são de agrotóxicos permitidos para as culturas analisadas, segundo a Agência
Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA
18
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Agrotóxicos
O uso de substâncias químicas orgânicas ou inorgânicas com o propósito de
proteger as culturas agrícolas data de tempos antigos. Nos primórdios da agricultura,
romanos e gregos descreveram o uso de produtos como o arsênio e o enxofre para o
controle de pragas. A partir do século XVI até fins do século XIX, substâncias orgânicas
como a nicotina e piretros, extraídos de plantas, eram constantemente utilizados na
Europa e EUA, do mesmo modo, para o controle fitossanitário. No início do século XX,
iniciaram-se os estudos buscando o emprego de substâncias inorgânicas à base de
cobre, chumbo, mercúrio, cádmio, empregados contra uma grande variedade de
pragas, porém com eficácia limitada e elevada toxicidade(LUNA, 2006).
Posteriormente, com a descoberta por Paul Müller, em 1939, das propriedades
inseticidas do diclorodifeniltricloroetano (DDT) teve início a geração dos agrotóxicos
constituídos de compostos organossintéticos, começando com a utilização de
organoclorados no controle das pragas (ALMEIDA, 1980; GUEDES, 1991). Para
substituir os organoclorados, em razão das características indesejáveis destes, tais
como bioacumulação e longa persistência, surgiram os OF, com destaque para o
malationa e também os inseticidas carbamatos (Figura 1). Entretanto, com o
desenvolvimento da resistência dos insetos a esses inseticidas, especialmente à
malationa, a comunidade científica foi motivada a pesquisar outras formulações mais
eficazes no combate às pragas (PACHECO et al., 1994).
Figura 1 – Estrutura química de malationa e aldicarbe
Foi a partir dos anos 70 que a utilização dos agrotóxicos ocorreu em larga escala
no Brasil, especialmente no sul, nas monoculturas convencionais, como solução de
19
Malationa (organofosforado) Aldicarbe (carbamato)
curto prazo para a infestação de pragas e doenças. Hoje, o país é um dos maiores
consumidores dessas substâncias no mundo, gastando-se, anualmente, cerca de U$
2,5 bilhões para sua compra deste produto. O Brasil supera em 7 vezes a média
mundial de 0,5 kg de agrotóxicos por habitante. Após 1986, com o ganho financeiro
momentâneo do plano cruzado o consumo saltou de 128 mil para 166 mil toneladas por
ano (LUCCHESI, 2005).
Os principais tipos de agrotóxicos são: acaricida (controle de ácaros);
bactericidas (controle de bactérias); formicidas (controle das formigas); fungicidas
(controle dos fungos); herbicidas (controle das plantas daninhas ou invasoras);
inseticidas (controle dos insetos) e nematicidas (controle de nematóides) (NOGUEIRA,
2006).
Os termos agrotóxicos, defensivos agrícolas, pesticidas, praguicidas e produtos
fitossanitários têm sido utilizados com a mesma finalidade. Porém a Lei n
o
7802,
vigente no país desde 11 de julho de 1989, utiliza o termo agrotóxicos, cuja definição é:
“produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso
nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas,
nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou plantadas, e de outros
ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar
a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres
vivos considerados nocivos, bem como as substâncias e produtos empregados como
desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento” (BRASIL, 1989).
O Decreto Estadual 41.203 (MINAS GERAIS, 2000), define como resíduo de
agrotóxicos: “substância ou mistura de substâncias remanescentes ou existentes em
alimento, em outro produto ou no meio ambiente, decorrente de uso ou não de
agrotóxico ou afim, inclusive qualquer derivado específico, tais como: produto de
conversão, de degradação, metabólitos, produtos de reação e impurezas.”
Segundo a ANVISA (BRASIL, 2002a), a classificação dos agrotóxicos é
realizada com base no grau de toxicidade do produto sendo estabelecidas quatro
classes: classe I - Extremamente Tóxico; classe II - Altamente Tóxico; classe III -
Medianamente Tóxico e classe IV - Pouco Tóxico.
A classificação toxicológica dos agrotóxicos está apresentada na Tabela 1, tendo
como parâmetros a Dose Letal (DL
50
) e a Concentração Letal (CL
50
), que representam
as doses estatisticamente derivadas a partir da administração única de uma substância
química a qual se espera causar a morte de 50% dos animais de uma dada população
20
de organismos expostos, de acordo com a via de administração, em condições
experimentais definidas.
No que se refere à quantidade de vendas realizadas em 2004 por grupo de
agrotóxicos, os herbicidas (40%) foram os mais comercializados e, em segundo lugar,
estão os fungicidas (31%) e logo a seguir, os inseticidas (24%), acaricidas (2%) e
outros (3%). As maiores vendas do produto por culturas foram: soja (50%), algodão
(10%); milho e cana de açúcar (7%); trigo, citros e café (3%) e arroz (2%). Os
agrotóxicos em linha de comercialização por classe toxicológicas no ano de 2003
foram: classe I (19%); classe II (25,8%); classe III (32,0%) e classe IV (23,2%)
(SINDAG, 2007). Como podemos observar, quase 50% dos agrotóxicos
comercializados no país ainda pertence a classe I e II.
Tabela 1 - Classificação toxicológica dos agrotóxicos baseada na Dose Letal
50
e na
Concentração Letal
50
de formulações líquida e sólida
Classe Toxicidade DL
50
oral
(mg kg
-1
)
DL
50
dérmica
(mg kg
-1
)
CL
50
inalatória
(mg L
-1
)
Líquido Sólido Líquido Sólido
I
Extremamente
≤ 20 ≤ 5 ≤ 40 ≤ 10 ≤ 0,2
II
Altamente
20 -200 5 –50 40 -400 10 –100 0,2 – 2,0
III
Medianamente
200-2000 50-500 400-4000 100-1000 2,0 – 20,0
IV
Pouco Tóxico
> 2000 > 500 > 4000 > 1000 > 20,0
DL: Dose Letal; CL: Concentração Letal; Fonte: BRASIL, 1989
As culturas com maior uso de agrotóxicos por unidade de área são a maçã,
tomate e batata, que em 2000 consumiram, em média, 49,0; 43,8; e 24,2 kg de
ingredientes ativos de agrotóxicos por hectare, respectivamente (CAMPANHOLA &
BETTIOL, 2001). Comparando os consumos médios de ingredientes ativos por hectare
de vários países no ano de 2002, o Brasil ocupa o oitavo lugar. Os países que lideram
em termos de intensidade de uso são a Holanda, Bélgica, Itália, Grécia, Alemanha,
França e Reino Unido (SINDAG, 2007).
A legislação federal de agrotóxicos e afins, Lei nº. 7.802/89, tem como aspecto
relevante o estabelecimento das competências dos órgãos nos níveis federal, estadual
e municipal quanto aos aspectos de controle, inspeção e fiscalização, das infrações e
das sanções penais e administrativas, permitindo ao governo realizar ações mais
eficientes de controle e fiscalização (GARCIA & ALMEIDA, 1991).
21
No Decreto nº. 4.074/2002, que regulamenta lei 7.802/89, cabe aos Ministérios
da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, Saúde e do Meio Ambiente, no âmbito de
suas respectivas áreas de competências: I - estabelecer as diretrizes e exigências para
registro e reavaliação de registro dos agrotóxicos, seus componentes e afins; II -
estabelecer diretrizes e exigências objetivando minimizar os riscos apresentados por
agrotóxicos; III - estabelecer o LMR e o intervalo de segurança; IV - estabelecer os
parâmetros para rótulos e bulas; V - estabelecer metodologias oficiais de amostragem e
de análise para determinação de resíduos de agrotóxicos e afins em produtos de
origem vegetal, animal, na água e no solo; VI - promover a reavaliação de registro de
agrotóxicos, seus componentes e afins quando surgirem indícios da ocorrência de
riscos que desaconselhem o uso de produtos registrados ou quando o país for alertado
nesse sentido, por organizações internacionais responsáveis pela saúde, alimentação
ou meio ambiente, das quais o Brasil seja membro integrante ou signatário de acordos;
VII - avaliar pedidos de cancelamento ou de impugnação de registro; VIII - autorizar o
fracionamento e a reembalagem; IX - controlar, fiscalizar e inspecionar a produção, a
importação e a exportação dos agrotóxicos, bem como os respectivos
estabelecimentos; X - controlar a qualidade dos agrotóxicos; XI - desenvolver ações de
instrução, divulgação e esclarecimento sobre o uso correto e eficaz; XII - prestar apoio
às Unidades da Federação nas ações de controle e fiscalização; XIII - indicar e manter
representantes no Comitê Técnico de Assessoramento para Agrotóxicos; XIV - manter
o Sistema de Informações sobre Agrotóxicos – SIA; e XV - publicar no Diário Oficial da
União o resumo dos pedidos e das concessões de registro (BRASIL, 2002b).
A competência exclusiva da ANVISA, após a avaliação dos dados disponíveis, é
estabelecer o LMR para cada cultura, considerando uma série de variáveis que podem
interferir neste cálculo. O principal objetivo é garantir, com certa segurança, que a
população possa consumir alimentos cujos níveis de resíduos, dentro destes limites
estabelecidos, não causem problemas à saúde. Compete ao Ministério da Saúde, em
conjunto com o Ministério da Agricultura, estabelecer os intervalos de segurança para
os agrotóxicos e afins, com base nos LMR determinados (BRASIL, 2002b).
3.2 Inseticidas do grupo dos organofosforados
22
Os denominados inseticidas OF, inseticidas fosforados, fosforados orgânicos,
inseticidas fosfatos, ésteres do ácido fosfórico tiveram sua utilização na agricultura
tremendamente aumentada nos últimos anos, à medida que os inseticidas
organoclorados foram banidos do comércio em virtude de sua alta persistência e poder
residual. Entre os OF, derivados estruturalmente dos ácidos fosfórico, tiofosfórico,
ditiofosfórico e fosfônico, com seus análogos na forma de ésteres, encontram-se
substâncias com alto grau de ação inseticida (MIDIO & MARTINS, 2000).
A toxicidade de uma substância em insetos não a qualifica necessariamente
como inseticida. Diversas propriedades devem estar associadas à atividade, tais como
eficácia mesmo em baixas concentrações, ausência de toxicidade frente a mamíferos e
animais superiores, ausência de fitotoxicidade, fácil obtenção, manipulação e
aplicação, viabilidade econômica e não ser cumulativo no tecido adiposo de seres
humanos e de animais domésticos (SANTOS et al., 2007).
Segundo MIDIO & MARTINS (2000) os inseticidas OF podem ser derivados
estruturalmente dos ácidos fosfórico, tiofosfórico, ditiofosfórico e fosfônico, com seus
análogos na forma de ésteres (Figura 2).
fosfato fosfonato ditiofosfato
tiofosfato
(isômero tiono)
tiofosfato
(isômero tiol)
fosfoamidato
fosfoamidotioato
Figura 2– Grupo funcional dos compostos inseticidas organofosforados
Fonte: MIDIO & MARTINS, 2000.
De acordo com esta classificação, os OF em linha de comercialização no Brasil
(ANVISA; 2006a) são derivados dos ácidos:
• fosfórico: diclorvós; mevinfós; monocrotofós; nalede; triclorfon;
23
• tiofosfórico: azametiofós; bromofós; caduzafós; clorpirifós; diazinona,
etoprofós; fenclorfós; fenitrotiona; fentiona; fosmete; foxim; parationa-
metílica; piridafentiona; pirimifós-metílico; profenofós; temefós; triazofós;
• ditiofosfórico: dimetoato; dissulfotom; etiona; fentoato; forato; fosalona;
fosmete; malationa; metidationa; protiofós; terbufós; teburinfós
• fosfônico. acefato; fenamifós; fostiazato; metamidofós.
As estruturas químicas de inseticidas OF típicos de cada um dos grupos
descritos estão apresentados na Figura 3.
Diclorvós (ácido fosfórico) Clorpirifós (ácido tiofosfórico)
Dimetoato (ácido ditiofosfórico) Metamidofós (ácido fosfônico)
Figura 3 – Estrutura química de inseticidas organofosforados típicos de cada um dos
grupos funcionais
O interesse por esta classe de agrotóxicos deve-se à facilidade de síntese de
novos derivados, à possibilidade de síntese de pró-inseticidas, que sofrem ativação
preferencial em insetos e não em mamíferos, e à maior biodegradabilidade em
comparação com os organoclorados. Os OF apresentam baixa ação residual, com
pouca estabilidade no meio ambiente e acumulação limitada em organismos vivos,
sendo que 80 a 90% dos compostos são eliminados após 48 h do contato (SANTOS et
al., 2007).
De acordo com a Tabela 2 estão autorizados no país para a utilização pelo
agricultor, 37 ingredientes ativos de agrotóxicos do grupo químico dos
organofosforados. Dez recebem a classificação toxicológica I (extremamente tóxico),
dezesseis a classificação II (altamente tóxico), nove a classificação III (medianamente
tóxico) e um a classificação IV (pouco tóxico). Cumpre destacar que 70,3% estão entre
a classificação I e II, extremamente e altamente tóxico para o ser humano. A Ingestão
Diária Aceitável (IDA) variou de 0,01 a 0,0008 mg kg
-1
por peso corpóreo (ANVISA;
2007a).
24
A ação desses agrotóxicos se dá pela inibição de enzimas no organismo,
principalmente a acetilcolinesterase levando a um acúmulo de acetilcolina nas sinapses
nervosas, desencadeando uma série de efeitos parassimpaticomiméticos. Essas
enzimas estão presentes na transmissão de impulsos nervosos em diversos órgãos e
músculos. Quando ocorre uma contaminação por organofosforados, há inibição dessas
enzimas, impedindo que as mesmas realizem sua função (FUSSEL et al, 2004).
Vários sinais e sintomas clínicos estão associados à intoxicação por
organofosforados, tais como: síndrome colinérgica (sudorese, salivação excessiva,
pupilas puntiformes, hipersecreção brônquica, vômitos, cólicas, diarréias); síndrome
nicotínica (tremores, abalos musculares, alterações da pressão arterial); síndrome
neurológica (confusão mental, dificuldade para andar, convulsões, depressão cárdio-
respiratória, coma e morte). Além das colinesterases, alguns grupos de inseticidas
organofosforados podem alterar outras enzimas, sendo a principal delas a esterase
neurotóxica. Esta enzima, quando inibida, pode determinar paralisia irreversível dos
músculos das pernas e braços por ação neurotóxica retardada, que surge após 15 dias
da intoxicação aguda inicial (TRAPÉ, 2001).
A atividade da acetilcolinesterase pode ser determinada por meio de teste
específico em sangue total, plasma ou eritrócitos. A acetil linesterase eritrocitária,
também conhecida como acetilcolinesterase verdadeira, é mais específica.
Intoxicações graves apresentarão níveis muito baixos de acetilcolinesterases. No caso
dos organofosforados, a atividade da acetilcolinesterase eritrocitária poderá
permanecer diminuída durante até noventa dias após o último contato. Apesar de ser
possível mensurar a atividade das neurotoxicoesterases por metodologia laboratorial
(análise em linfócitos), esta não está ainda disponível no país. É importante ressaltar
que a análise da atividade dessas enzimas não deve ser utilizada de maneira isolada.
O exame pode ser bastante útil, quando entendido e usado como instrumento auxiliar,
tanto no diagnóstico clínico quanto nas ações de vigilância. (BRASIL, 1997).
TABELA 2: Informações sobre a classificação toxicológica e ingestão diária aceitável
dos inseticidas organofosforados
I.A ou nome comum IDA (mg kg
-1
mc) Classe Toxicológica
acefato 0,03 III
azametifós III
bromofós 0,04 II
cadusafós 0,0003 I
clorpirifós 0,01 II
diazinona 0,002 II
25
diclorvós 0,004 II
dimetoato 0,002 II
dissulfotom 0,0003 I
etiona 0,002 II
etoprofós 0,0004 I
fenclorfós III
fenitrotiona 0,005 II
fentiona 0,007 II
fentoato III
forato 0,0005 I
fosalona 0,02 II
fosmete 0,01 II
fostiazato II
foxim III
iodofenfós
malationa 0,3 III
metamidofós 0,004 I
metidationa 0,001 II
mevinfós 0,0008 I
monocrotofós 0,0006 I
nalede III
parationa-metílica 0,003 I
piridafentiona IV
pirimifós-metílico 0,03 III
profenofós 0,01 II
protiofós II
tebupirinfós 0,0002 I
temefós III
terbufós 0,0002 I
triazofós 0,001 II
triclorfom 0,01 II
Fonte: Sistema de Informações sobre Agrotóxicos (SIA), (ANVISA, 2007c)
I. A: Ingrediente ativo. IDA: Ingestão Diária Aceitável. mc: massa corporal
3.3 Contaminação de alimentos no Brasil e no mundo
A exposição de produtores rurais e consumidores aos resíduos de agrotóxicos
constituem um dos principais alvos de preocupação com a saúde pública. Muitos
países criaram programas de monitoramento de resíduos de agrotóxicos. No Brasil, em
âmbito federal, há o Programa Nacional de Analise de Resíduos de Agrotóxicos em
Alimentos (PARA), que é gerenciado pela ANVISA. As análises são realizadas pelos
laboratórios: Instituto Adolfo Lutz em São Paulo – SP, Instituto Tecnológico do Estado
de Pernambuco em Recife – PE e Instituto Octávio Magalhães da Fundação Ezequiel
Dias em Belo Horizonte – MG. Entre as 4001 amostras analisadas de alimentos in
natura coletadas em supermercados, no período de junho de 2001 a dezembro de
26
2004, foram detectados 3271 ingredientes ativos. Concluiu-se que várias amostras
apresentavam mais de um resíduo, os quais poderiam estar de acordo ou não com a
legislação vigente. Do total de resíduos de agrotóxicos detectados, 71,5% eram
regulares e 28,5% irregulares. Entre as amostras em desacordo, 83,4% continham
agrotóxicos não autorizados para a cultura e 16,6% apresentavam resíduos acima do
LMR permitido (ANVISA, 2006b).
Vários estados brasileiros adotaram também projetos de monitoramento e
fiscalização de resíduos de agrotóxicos. No estado do Paraná, SCUCATO et al. (2001)
analisaram 523 amostras de hortifrutigranjeiros monitorados pela Secretaria de Estado,
no período de 1987 a 1992. Os resultados encontrados mostraram que 155 amostras
(29,63%) apresentaram resíduos. Em 2000, a mesma Secretaria de Estado havia
analisado 117 amostras, sendo que 37 amostras (31,62%) apresentaram resíduos não
autorizados para a cultura de morango.
Em Minas Gerais, o Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA) analisou resíduos de
agrotóxicos em 71 amostras de morangos, coletadas nas Centrais de Abastecimento
(CEASAMINAS), no período de 2001 a 2004. Constatou-se que das 31 amostras
analisadas em 2002, 21 (67,7%) apresentaram resíduos de agrotóxicos, em 2003 das
10 amostras, 8 (80,0%) continham resíduos e em 2004 das 30 analisadas 18 (60,0%)
apresentaram resíduos de agrotóxicos. As amostras que apresentaram irregularidades,
ou seja, resíduos em níveis acima dos LMR ou resíduos de produtos não autorizados
para morango, foram 29,0% em 2002, 80,0% em 2003 e 46,7% em 2004 (AMARAL &
ALTOÉ, 2006).
No estado de São Paulo, a Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de
São Paulo (CEAGESP), em programa conjunto com o Instituto Biológico da Secretaria
de Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo, analisou resíduos de
agrotóxicos em 365 amostras de produtos agrícolas, durante o ano de 2003. Observou-
se que em 63% das amostras analisadas não foram detectados resíduos de
agrotóxicos, em cerca de 15% verificou-se a presença de resíduos abaixo do limite de
tolerância e em menos de 1% havia resíduos acima dos LMR. Por outro lado, em
quase 22% das amostras foram detectados resíduos de ingredientes ativos não
registrados para a cultura (GORENSTEIN, 2004).
Em nível internacional, países com os Estados Unidos, Canadá e membros da
Comunidade Européia têm programas nacionais de monitoramente de resíduos de
agrotóxicos em alimentos in natura e alimentos processados (EUROPEAN
COMMISSION, 2005; USDA, 2007; CFIA, 2007). Nos Estados Unidos, por exemplo, o
27
Pesticide Data Program (PDP), coordenado pelo Departamento de Agricultura daquele
país, iniciou-se em 1990. Foram analisados desde então cerca de 60 tipos de alimentos
(in natura e processados), para mais de 400 agrotóxicos diferentes (inseticidas,
fungicidas, herbicidas e reguladores de crescimento), com as amostras sendo
coletadas próximas ao ponto de consumo nos 10 estados participantes. Em seu
resultado mais recente, relativo ao ano de 2005 e divulgado em novembro de 2006,
foram analisadas 14749 amostras, sendo que 10154 eram frutas e hortaliças, incluindo
ameixas frescas e secas, laranja e suco de laranja, maçãs, melão, melancia, morango,
pêra, uva, abóbora, alface, berinjela, couve-flor, vagens frescas e congeladas. Em
termos gerais, 73% das frutas frescas e hortaliças e 61% dos produtos processados
apresentaram resíduos detectáveis, sendo que, produtos frescos apresentaram um
maior número de amostras com resíduos do que em grãos e produtos processados.
Entre todas as amostras testadas, excluindo a água de beber, 34% não continham
nenhum agrotóxico detectável, 30% continham um agrotóxico e 36% mais de um.
Foram detectados níveis de resíduos abaixo do LMR em melão, couve-flor, vagens,
alface, melancia e abóbora e resíduos acima do LMR em 0,2% das amostras testados
em 2005, o que correspondeu a 25 amostras com resíduo de agrotóxico (USDA, 2007).
Vários trabalhos têm sido publicados sobre a avaliação da ocorrência de
resíduos de agrotóxicos em várias partes do mundo. Em Portugal, no período de julho
a dezembro de 1994, resíduos foram monitorados em vegetais. Onze das 96 amostras
de alface apresentaram resíduos de endosulfan excedendo os limites máximos de
resíduos, embora endosulfam não fosse permitido para aquela cultura. Similarmente,
resíduos de ditiocarbamatos foram encontrados em espinafre, embora também este
agrotóxico não fosse permitido para a cultura (CNPPA, 1995).
Pesquisa de resíduos de 22 ingredientes ativos de agrotóxicos, realizadas em
371 amostras de morango, no período de 1996 a 2000, em 5 províncias no sudeste da
Polônia, 76,1% das amostras não apresentaram resíduos e 23,9% apresentaram
resíduos com níveis abaixo do permitido. Os ingredientes ativos encontrados foram os
fungicidas: diclofluanida (16% das amostras); procimidona (14,8%); vinclozolina (3,4%)
e iprodiona (2,7%). Não foram encontrados resíduos de herbicidas e inseticidas
(ROGOZINSKA et al, 2001). Por outro lado, em 2001, das 2.125 amostras de produtos
vegetais analisados, 18% continham resíduos de agrotóxicos e aproximadamente 0,9%
excederam LMR (SADIO, 2003).
Traços de agrotóxico foram encontrados em 53% das 76 amostras de alimentos
infantis, obtidos de supermercados em Denver, Filadélfia e em São Francisco. O maior
28
número de agrotóxicos (5) foi encontrado em pêras. Todos os níveis encontrados
estavam abaixo do LMR, sendo que o maior foi detectado em ameixas (46 ppb) e
pêssegos (29 ppb) (BRIGDES, 1995).
Resíduos dos inseticidas OF, largamente utilizados na Turquia, foram
pesquisados em 32 amostras de maças e 32 de morangos. Das 32 amostras de maças
analisadas, 13 (40,6%) apresentaram resíduos com limites abaixo da tolerância de
acordo como Codex Alimentarius e seis (19,2%) com limites acima do permitido, sendo
o malationa, azinfós metil, metidationa e clorpirifós os ingredientes ativos encontrados.
No morango, 23 (71,9%) das 32 amostras apresentaram resíduos e 17 (53,1%)
excederam o LMR e os ingredientes ativos encontrados foram diazinona, metidationa,
parationa e clorpirifós etil. Das 32 amostras, 21 apresentaram resíduos de diclorvós, 15
excederam o LMR e algumas com limites 10 a 77 vezes maiores (DURMUSOGLU,
2003).
Em um trabalho realizado em Shaanxi na China foram analisados oito OF,
dentre eles o diclorvós, demetom, diazinom, dimetoato, parationa-metílica, pirimifós-
metil, sumitiona e parationa por CG-DFC. Em 18, de 200 amostras, foram encontrados
diclorvós, dimetoato, parationa-metílica, pirimifós-metílico e parationa, em
concentrações que variaram de 0,004 a 0,257 mg kg
-1
. Os níveis médios do dimetoato
e parationa nas frutas excederam os LMR permitidos pelo Ministério de Saúde daquele
pais (BAI et al., 2005).
Na Dinamarca foram monitorados resíduos de agrotóxicos em 4.150 amostras
de frutas e hortaliças, as amostras foram testadas para 130 agrotóxicos, dos quais 80
foram detectados, sendo 79 e 28 diferentes agrotóxicos para amostras importadas e
nacionais, respectivamente. Resíduos de agrotóxicos foram mais freqüentes em frutas
(54%) do que em hortaliças (13%) (ANDERSEN & POULSEN, 2001).
3.4 Análise de resíduos de inseticidas organofosforados
3.4.1 Amostragem, transporte e armazenamento da amostra
As quantidades mínimas de produtos frescos de origem vegetal a serem
encaminhadas ao laboratório dependem do peso do produto. Para produtos menores
que 25g deverá ser encaminhado 1kg, para produtos entre 25 a 250g deverá ser
encaminhado 1kg e no mínimo 10 unidades e produtos maiores que 250g deverão ser
encaminhados 2kg e no mínimo 5 unidades (CODEX ALIMENTARIUS, 1999).
29
Amostras embaladas no comércio varejista não devem ser desembaladas no
momento da amostragem. Para evitar que deteriorem, produtos perecíveis ou muito
frágeis podem ser congelados e transportados em gelo seco ou similar. Enquanto as
amostras que se danificam pelo resfriamento (por ex. bananas) devem ser protegidas
das baixas e altas temperaturas. Durante o transporte da amostra até o laboratório,
deverão ser evitadas a contaminação e a deterioração da amostra em todas as fases
que poderão afetar os resultados analíticos. As amostras frescas deverão ser mantidas
resfriadas e as congeladas permanecerem congeladas. Para amostras de produtos
frescos é essencial o transporte até ao laboratório, preferencialmente no prazo de um
dia (CODEX ALIMENTARIUS, 1999; EUROPEN COMMISSION, 2006).
Todas as amostras que chegam ao laboratório deverão vir identificadas
claramente e acompanhadas de informações completas sobre a origem, as análises
requeridas e os possíveis perigos que podem ocorrer na sua manipulação. A amostra
deverá receber um código de identificação único que acompanhara durante todo o
período de análise até a emissão do resultado (CODEX ALIMENTARIUS, 2003,
EUROPEN COMMISSION, 2006).
As análises, se possível, deverão ser realizadas imediatamente, se não, estas
devem ser armazenadas de 1 a 5º C, sem exposição à luz solar direta e serem
analisadas em um prazo de poucos dias. No entanto, as amostras que chegam
congeladas, deverão ser mantidas à temperatura de ≤ -16º C até o momento da
análise. Em alguns casos é necessário armazenar as amostras por um período mais
longo antes de proceder a análise. Em tais ocasiões, a temperatura de armazenamento
deverá ser aproximadamente de – 20º C, sendo que a esta temperatura a degradação
do resíduo de agrotóxicos pela ação de enzimas é muito lenta. Sendo necessário o
congelamento das amostras, é recomendável que se tomem as porções que serão
analisadas antes de proceder o congelamento, para reduzir ao mínimo o efeito da
separação da água em forma de cristais de gelo durante o congelamento (CODEX
ALIMENTARIUS, 2003).
3.4.2 Técnicas de extração e concentração da amostra
Em sua maioria, os protocolos relacionados com a determinação de OF em
alimentos envolvem o processo de extração, purificação, concentração do extrato e a
determinação utilizando a cromatografia (NORMA & PANTON, 2001; KRISTENSON et
al, 2001). Os solventes mais comuns utilizados na extração são acetona, acetato de
30
etila e acetonitrila (KRISTENSON et al, 2001).
A escolha do método de extração depende da propriedade da matriz, das
propriedades dos analitos e dos equipamentos e detectores disponíveis para o analista.
Para cada tipo de matriz é determinado um método de extração. É conveniente separar
os alimentos em quatro categorias de matriz, com base nos conteúdos de umidade e
gordura: (1) alta umidade, baixa gordura (frutas e vegetais); (2) alta umidade, alta
gordura (carne); (3) baixa umidade, baixa gordura (frutas secas); (4) baixa umidade,
alta gordura (castanhas) (MARSHALL, 1998).
Para amostras não gordurosas, alguns procedimentos de extração estão
disponíveis. Em um método executa-se a extração do analito pela agitação da amostra
com acetato de etila e o sulfato de sódio (CUADROS-RODRIGUEZ et e al, 2003). Em
outro, usa-se acetona para extração, seguida da partição líquido-líquido com um
solvente orgânico, como diclorometano e éter de petróleo (LUCK et al, 1975).
O método de extração com acetato de etila é mais eficiente que o com acetona
para compostos de alta polaridade. Com respeito à seletividade, a partição com
acetona em presença de sulfato de sódio é mais favorável que a extração com acetato
de etila, que em geral diminui a quantidade de interferentes polares da matriz.
Entretanto, recentemente tem sido usado um método simplificado de extração/partição
com acetona, derivado originalmente do método de LUCK (1975), o que reduz o tempo
de análise bem como a quantidade de solventes (NETHERLANDS, 1996).
A acetona foi selecionada como o solvente de extração de 90 agrotóxicos, sendo
36 inseticidas OF e seus produtos de degradação, em frutas e vegetais. A escolha se
deveu, por ser o solvente mais efetivo para moléculas polares e apolares em diversas
variedades de matrizes. Entre outras vantagens, incluem a baixa toxicidade e custo,
miscível em água e facilidade de evaporação (STAJNBAHER & ZUPANCIC-KRALJ,
2003).
Durante o processo de concentração da amostra, podem ocorrer perdas de
analitos, em quantidade traços, quando os extratos são evaporados até a secura. Um
pequeno volume de um solvente com alto ponto de ebulição pode ser usado como
protetor e a temperatura de evaporação deve ser a mais baixa possível. A secagem
final do extrato em corrente de nitrogênio seco ou centrifuga de evaporação a vácuo é
geralmente melhor que corrente de ar, pois o ar pode levar à oxidação ou à introdução
de água ou outros contaminantes. A estabilidade do analito no extrato deve ser
investigada no processo de validação. Estocagem dos extratos sob refrigeração ou
congelamento pode minimizar a degradação, mas a perda na bandeja do amostrador
31
automático não deve ser ignorada, devido à temperatura da sala de cromatografia
(EUROPEN COMMISSION, 2006).
3.4.3 Técnicas de purificação de amostras
A presença de interferentes na matriz dos extratos pode afetar a quantificação e
identificação do analito. A purificação é necessária para reduzir o limite de detecção
(LD) do método e evitar as interferências da matriz. Porém, uma extensiva purificação
pode resultar na perda parcial de alguns compostos, bem como, aumentar o custo.
Uma inadequada purificação pode levar a um efeito adverso relacionado com a
qualidade dos dados gerados, mascarando os picos dos resíduos pelos componentes
da matriz, ocorrendo um resultado falso positivo e quantificação inexata
(STAJNBAHER & ZUPANCIC-KRALJ, 2003).
A cromatografia em coluna é um dos processos utilizado na purificação. É
utilizada uma coluna de 10 ou 20 cm x 2,5 cm, empacotada com florisil, sílica gel ou
alumina (MARSHALL, 1998).
Cromatografia de permeação em gel (CPG) foi inicialmente a técnica de
purificação mais eficiente e versátil nas análises de resíduos de organofosforados. A
maior vantagem da CPG sobre a técnica convencional de cromatografia em coluna é o
fato do grande número de agrotóxicos analisados. A mesma coluna pode ser usada
para a purificação de várias amostras, com isto é requerido um menor tratamento e
torna-se possível a automatização. A desvantagem é o grande volume de eluato que
tem que ser processado (NETHERLANDS, 1996).
Método de purificação usando a cromatografia líquida com coluna de fase
normal é boa alternativa para a automatização da purificação de amostras gordurosas
comparado ao método de cromatografia de coluna que utiliza florisil, alumina ou sílica
(NETHERLANDS, 1996).
Para matrizes gordurosas, geralmente é necessária uma etapa adicional de
purificação para remover os resíduos de gordura. Com este propósito, as técnicas em
uso são: CPG; partição líquido-liquido; cromatografia em coluna e cromatografia líquida
de alta eficiência (CLAE). Esta ultima técnica executa uma separação em coluna de
sílica que combina fracionamento e purificação. A partição líquido-liquido envolve
somente a separação entre analito e gordura e, então, é necessária uma etapa
adicional de purificação. Para substâncias não gordurosas nem sempre é requerida
uma etapa de purificação após a extração (NETHERLANDS, 1996).
32
3.4.4 Outras técnicas de extração e purificação
Progressivamente, técnicas alternativas para extração e purificação de amostra
são adaptadas para análise de resíduos de OF. A principal vantagem destas técnicas é
a diminuição do tempo de análise e diminuição do consumo de solvente e
conseqüentemente a diminuição do custo. Dentre estas podemos citar: extração em
fase sólida (EFS); microextração em fase sólida (MEFS); extração por microondas e
extração por fluido supercrítico (MARSHALL, 1998).
A EFS pode ser uma valiosa alternativa clássica na preparação de amostra,
porque permite uma significativa redução no tamanho da amostra e no consumo de
solvente necessário para análise de multiresíduos. Além disso, dependendo da
natureza do adsorvente selecionado, ocorre uma simultânea purificação do extrato. O
material utilizado no empacotamento geralmente são sílicas quimicamente modificadas
(Sílica - C
18,
Sílica - C
8
) e sílica gel (KRISTENSON et al, 2001, STAJNBAHER &
ZUPANCIC-KRALJ, 2003).
A EFS tipicamente envolve uma pequena quantidade de material empacotado
(30mg a 10g de adsorventes) em cartuchos de polipropileno de 30 a 40 µm de diâmetro
As funções destes cartuchos são reter os interferentes enquanto elui seletivamente o
analito. Para o material do cartucho, a capacidade de retenção é de 5% da massa do
adsorvente, aproximadamente. Entretanto, outros componentes do extrato bruto
também podem ser retidos (MARSHALL, 1998). A eficiência da EFS depende do tipo e
quantidade de adsorvente, volume da mostra, velocidade do fluxo e pH, assim como o
conteúdo de compostos orgânicos modificados e volume do solvente eluído
(STAJNBAHER & ZUPANCIC-KRALJ, 2003).
A MEFS envolve a imersão do polímero que recobre a fibra dentro do extrato
aquoso ou o aquecimento da amostra permitindo difundir o analito para o interior do
revestimento. Após o equilíbrio a agulha da fibra é transferida para a porta do injetor do
cromatógrafo a gás (CG), enquanto os analitos são termicamente arrastados para
dentro da coluna (MARSHALL, 1998). O método de MEFS por “headspace” em
combinação com CG-EM se mostrou eficiente para a extração e quantificação dos
organofosforados diazinona, fenitrotiona, fentiona, parationa, bromofós-etílico e etion
em amostras de morango e ameixa. O método foi desenvolvido usando fibras
revestidas com 100 µm de polidimetilsiloxano (ALBANIS & LAMBROPOULOU, 2003).
As extrações com microondas geralmente podem diminuir consideravelmente o
33
tempo de extração e a quantidade de solvente utilizado. Os sistemas comerciais têm
capacidade para a extração de 8 a 12 amostras. A vantagem deste procedimento é que
a temperatura excede o ponto de ebulição do solvente, e conseqüentemente ocorre
mais rapidamente a extração do analito (MARSHALL, 1998).
A extração por fluído supercrítico envolve o uso de quantidade limitada de
solvente convencional em elevada temperatura (em torno de 200
o
C) e pressão (1500 a
2000 psi), extraindo a amostra sólida em um curto período de tempo, freqüentemente
inferior a 10 min (MARSHALL, 1998). O fluido supercrítico tem densidade semelhante
ao líquido, porém baixa viscosidade e alto coeficiente de difusão. Esta combinação de
propriedades resulta em um fluido com maior poder de penetração e solvatação,
extraindo o soluto mais rapidamente que o líquido. O CO
2
é um fluido apropriado para a
extração de resíduos de agrotóxicos e tem a vantagem de estar disponível livremente
na natureza. Um método automatizado usando o CO
2
como fluído supercrítico foi
utilizado para análise de resíduos de OF em milho e trigo com boa recuperação e baixo
limite de detecção (NORMA & PANTON, 2000).
3.4.5 Métodos analítico
O método de análise de resíduos de OF geralmente compreende as seguintes
etapas: extração da amostra, purificação, separação cromatográfica e quantificação
(BOTITSI et al., 2000).
O método deve ser adequado para a determinação dos resíduos em
conformidade com os LMR. A escolha do método depende da propriedade do analito e
os solventes mais utilizados em análise de resíduos de vários organofosforados em
amostras de produtos de origem vegetal são a acetona e acetato de etila (EUROPEAN
COMMISSION, 2004).
O desenvolvimento do método capaz de analisar vários resíduos de
organofosforados pode ser dificultado pelo fato de alguns compostos apresentarem
diferentes polaridades, solubilidades, volatilidades e valor de pK
a
, e ter que ser
simultaneamente extraído e analisado (STAJNBAHER & ZUPANCIC-KRALJ, 2003).
Quando se trabalha com o grupo de agrotóxico, os métodos de multiresíduos
são geralmente preferíveis; devido à detecção de vários analitos em uma única
extração. Os métodos de multiresíduos usados nas análises de agrotóxicos são
freqüentemente determinados por cromatografia com diferentes detectores seletivos
(JANSSON et al, 2004).
34
O método de multiresíduos contém a etapa de preparação da amostra, extração,
e purificação do extrato, seguido pela separação cromatográfica e quantificação com
emprego de detectores altamente seletivos. Dos dez métodos de multiresíduos usados
pelo Food and Drug Administration (FDA) e United States Department of Agriculture
(USDA), oito são baseados em CG e dois em CLAE. Esses métodos usados
atualmente vêm sendo modificados, expandidos e otimizados ao longo dos anos.
Entretanto estes métodos não detectam todos os resíduos em todos os tipos de
amostra (MARSHALL, 1998).
As diferentes classes químicas dos agrotóxicos bem como os diferentes tipos de
alimentos contaminados determinam diferentes estratégias de análise. Uma dificuldade
no desenvolvimento de métodos de resíduos é a necessidade de cobrir a grande
diferença química destas substâncias, usando um único procedimento analítico. Os
resíduos de OF são determinados por CG e CLAE usando várias combinações de
coluna e detectores, alcançando a necessária seletividade e sensibilidade para as
diferentes classes (HAIB et al, 2003).
As técnicas geralmente disponíveis para análise de resíduos de OF, são CG,
principalmente com detectores nitrogênio e fósforo (DNF), fotométrico de chama (DFC)
e espectrômetro de massas (EM). São utilizados também detector de captura de
elétrons (DCE), ionização de chama (DIC) e CLAE com detector de: ultravioleta (UV),
arranjo de diodos (DAD), EM/EM, fluorescência, eletroquímico (EUROPEAN
COMMISSION, 2004).
3.4.6 O uso da cromatografia gasosa
A CG é tradicionalmente o método de escolha para análise de OF, sendo uma
técnica poderosa de separação largamente utilizada para análise de traços. A técnica
tem sido aprimorada com o passar do tempo, melhorando sua eficiência, tempo e custo
efetivo e ampliando o espectro de compostos a serem analisados (HAJSLOVA et al,
2001).
As colunas utilizadas podem ser classificadas de acordo com o diâmetro em
empacotadas, megabore e capilar. As colunas capilares são fabricadas de sílica
fundida e são revestidas com uma cobertura de poliamida impermeável. A vantagem
dessa coluna é que ela apresenta uma resolução 12 vezes maior que as colunas
empacotadas de comprimento similar. As colunas megabore têm diâmetro
35
intermediário entre a empacotada e capilar (0,75 - 1,0 mm), também são vantajosas e
apresentam algumas características ainda melhores, que as colunas empacotadas e
capilares (MARSHALL, 1998). A coluna capilar é atualmente a mais utilizada para
análise de resíduos de OF e possui 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm (NORMA & PANTON,
2001; KRISTENSON et al, 2001; CUADROS-RODRIGUEZ et e al, 2003).
A escolha da fase estacionária é auxiliada pela seguinte regra, semelhante
dissolve semelhante (analitos apolares interagem mais fortemente com fase líquida
apolares e vise versa). Em geral, a natureza do analito determina a escolha da fase
estacionária. Para a separação de alguns compostos mais polares, semelhantes aos
compostos OF, OV-17 (ou DB- 1701) pode ser aplicada, e é bastante recomenda
quando se usa o detector fotométrico de chama (NETHERLANDS, 1996). Para análise
de resíduos de OF, três colunas com polaridades diferentes são utilizadas tais como:
14% cianopropila-fenila e 86% dimetilpolisiloxano (DB-1701) (NETHERLANDS, 1996;
CUADROS-RODRIGUEZ et e al, 2003), 5% de fenila e 95% de dimetilpolisiloxano (DB-
5) (NETHERLANDS, 1996; NORMA & PANTON, 2000; KRISTENSON et al, 2001;
CUADROS-RODRIGUEZ et e al, 2003, PAGLIUCA et al, 2005) e 100% de
dimetilpolisiloxano (DB-1) (NETHERLANDS, 1996; TADEO, 2001).
O sucesso na aplicação de CG nas análises de resíduos de OF depende do uso
de detectores altamente sensíveis e seletivos. Os detectores mais utilizados são: DNF
(NETHERLANDS, 1996; MARSHALL, 1998; TADEO et al, 2001, PAGLIUCA et al,
2005), DFC (NETHERLANDS, 1996; MARSHALL, 1998; CUADROS-RODRIGUEZ et e
al, 2003; FUSSELL et al, 2004). O DFC pulsado é um excelente detector para análise
de OF devido a sua bem conhecida seletividade, alta sensibilidade e linearidade de
resposta (CUADROS-RODRIGUEZ et e al, 2003).
Outro detector bastante utilizado atualmente é o espectrômetro de massas
acoplada a cromatografia gasosa que oferece a possibilidade de alta seletividade de
detecção e quantificação de resíduos de OF. Esta técnica oferece um desempenho em
termos de seletividade, com o poder de confirmação em um universo de analito que
pode ser detectado (MARSHALL, 1998). Os equipamentos usados no laboratório de
resíduos podem ser baseados em dois diferentes tipos de analisador de massas, de
um lado os detectores baseados em analisador quadrupolo e do outro mais
recentemente torna-se disponível os detectores baseados em ion trap
(NETHERLANDS, 1996).
Os dados de resíduos obtidos pelo EM podem representar a definitiva evidência
comparando a massa espectral e a razão do número adequado de fragmentos de
36
massa (NETHERLANDS, 1996). Para assegurar a presença do composto, todos os
fragmentos de massa deveriam ser diferenciados no espectro do CG – EM com
abundância maior que 10% da base do pico no tempo de retenção estabelecido
(CUADROS-RODRIGUEZ et e al, 2003).
Vários trabalhos utilizam o CG – EM para análise de confirmação e
quantificação, progressivamente tem se tornado o primeiro equipamento de escolha
para determinação de resíduos de OF em alimentos. (KRISTENSON et al., 2001;
TADEO et al., 2001; CUADROS-RODRIGUEZ et al., 2003; STAJNBAHER &
ZUPANCIC-KRALJ, 2003; ZROSTLIKOVA et al., 2003; ALBANIS & LAMBROPOULOU,
2003). Alguns autores recomendam o uso de varredura (full scan), mas este método
tem certas limitações de sensibilidade em baixa concentração do analito alvo em
presença de altas concentrações dos interferentes da matriz. O aumento da
seletividade e sensibilidade da técnica tem sido realizado usando o modo de seleção
de íons monitorados (SIM) (VIDAL et al., 2003).
A EM é a técnica de confirmação preferível, podendo oferecer provas definitivas.
Geralmente as análises de resíduos mediante EM se aplicam conjuntamente com
outras técnicas cromatográficas de separação, com a finalidade de obter
simultaneamente dados sobre o tempo de retenção, a relação massa/carga dos íons e
abundância dos mesmos. Ao confirmar a identificação dos resíduos, há de levar em
conta a abundância relativa dos íons no espectro e a ausência dos íons que interferem.
É um dos métodos menos seletivos e deve-se ter o cuidado para evitar a interferência
dos contaminantes durante o preparo e armazenamento dos extratos. Podem-se
conseguir uma confirmação complementar: i) utilizando outra coluna cromatográfica; ii)
utilizando outra técnica de ionização (por ex: ionização química); iii) controlando outros
produtos de reação de determinados íons mediante EM/EM; ou iv) controlando outros
íons com uma massa maior de resolução (CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION,
2003).
3.4.7 O uso da cromatografia líquida de alta eficiência
Em contraste com as moléculas apolares, os agrotóxicos recentemente
introduzidos no mercado são freqüentemente mais polares e menos voláteis. Esta
complicada natureza dos agrotóxicos levou ao desenvolvimento de técnicas especiais
como a CLAE-EM, que tem sido usada com sucesso em análise de resíduos de OF
(JANSSON, 2004).
37
A aplicação da CLAE para análise de multiresíduos tem sido limitada a
compostos não voláteis ou que possuem instabilidade térmica, usando UV, EM e
eletroquímicos (MARSHALL, 1998; PÉREZ-RUIZ et al, 2005).
PÉREZ- RUIZ et al (2005) descreveram um método para determinação de
fosfatos e OF em uma matriz complexa, apresentando uma alta seletividade e
especificidade, acoplando uma reator pós-coluna à CLAE com detector de
fluorescência. Entretanto, para quantificação de OF, o comprimento de onda de 215 nm
é geralmente utilizado, mas a baixa absorção na região do UV faz dele um detector não
muito desejável, principalmente em presença de grande quantidade de interferentes
A CLAE é bem conhecida como uma técnica que tem boa operabilidade, porque
pode ser realizada a temperatura ambiente. Entretanto, não fornece uma separação
eficiente quando é aplicada a análise de uma matriz biológica. Neste caso, é
necessário um complexo procedimento de purificação (LACORTE et al, 1997).
A CL-EM é uma nova técnica analítica que foi desenvolvida para resolver os
problemas da CLAE, CG e CG-EM. É reconhecido como uma técnica analítica ideal
que combina CLAE, que é grandemente utilizada para medidas de compostos
termicamente instáveis, altamente polares e não voláteis, com EM que tem excelente
sensibilidade e especificidade (LACORTE et al., 1997).
A nova técnica tornou-se rapidamente aceita para análises de resíduos de OF
em frutas e vegetais com o propósito de monitoramento. A principal tarefa foi
desenvolver um método para multiresíduos em várias matrizes, que pudesse substituir
os métodos específicos e incluir novos agrotóxicos que até agora não haviam sido
analisados. O estudo tem demonstrado que não são necessárias as etapas de
purificações, com isto diminuindo o tempo de análise. Neste tipo de cromatografia duas
técnicas de ionização estão sendo propostas: ionização química a pressão atmosférica
e a electrospray (JANSSON et al., 2004).
O emprego da CL-EM pode proporcionar dados adequados, porém
considerando que os espectros gerados são muito simples e apresentam uma escassa
fragmentação característica é improvável que os resultados obtidos mediante CL-EM
sejam definitivos. Uma técnica mais potente é a aplicação de CL-EM/EM, que combina
seletividade e especificidade e fornece provas adequadas da identidade do composto
(CODEX ALIMENTARIUS, 2003).
3.4.8 Aplicação da Cromatografia de Camada Delgada
38
A CCD tem sido usada como uma técnica valiosa e barata para purificação,
separação, identificação e uma estimativa semiquantitativa de resíduos de agrotóxicos.
Para análise de OF são utilizados como suporte sólido à sílica gel (H, G, G-HR),
alumina neutra G e o Adsorbosil G-1, e como fase móvel: hexano:acetona, 1:4;
benzeno:ciclohexano, 3:1; benzeno: hexano, 1:1; benzeno: diclorometano, 4:1;
acetona: hexano, 15:85. Para identificação dos OF as placas são submetidas a vapores
orgânicos de bromo. Alguns dos procedimentos para visualização dos inseticidas OF
nas placas de CCD incluem o uso de sílica gel fluorescente GF
254
e também a
visualização das manchas expostas aos vapores de bromo, com lâmpadas de UV
(BOWMAN, 1971).
Uma bem sucedida aplicação da CCD é a dos agrotóxicos que inibem as
colinesterases. Vários inseticidas OF e carbamatos são capazes de inibir este grupo de
enzimas. As placas CCD são preparadas com solução contendo uma ou mais dessas
enzimas, o extrato que possui o agrotóxico são hidrolisados por essas enzimas e
formam um produto colorido (MARSHALL, 1998).
Relativo às técnicas cromatográficas automatizadas, a CCD geralmente fornece
um décimo da capacidade da resolução das colunas empacotadas do CG. Além disso,
a falta de precisão associada com a quantificação e os limites de detecção levou a
redução do uso do método. Entretanto, a CCD possui fatores que podem ser
explorados vantajosamente, quando usada em uma separação semiquantitativa, para
um limitado grupo de agrotóxicos (MARSHALL, 1998).
Um apreciável aprimoramento na resolução tem sido obtido com a redução do
tamanho da partícula da fase estacionária, dando origem à Cromatografia de Camada
Delgada de Alta Eficiência - CCFAD, acoplada ao equipamento para a localização do
analito sobre a placa. A quantificação em densitômetro tem apresentado apreciável
melhora na reprodutibilidade da técnica (MARSHALL, 1998).
Entre vários métodos cromatográficos, a CCFAD é comparativamente simples,
rápida e conveniente para identificação de várias substancias químicas. Entretanto, há
poucos relatos para métodos de separação de inseticida OF por CCFAD (OISHI et al,
1997).
3.4.9 Métodos de confirmação
Quando se trabalha com análise de fiscalização, é importante a confirmação dos
dados antes de se fornecer o resultado da amostra que contém resíduos de
39
agrotóxicos não autorizados para a cultura ou acima do LMR. As amostras podem
conter substâncias químicas que interferem com a análise, que são erroneamente
identificadas como agrotóxicos. Em CG, por exemplo; os interferentes são os ésteres
de ftalato nos DCE e composto contendo enxofre e nitrogênio nos detectores seletivos
de fósforo (CODEX ALIMENTARIUS, 2003).
As seguintes técnicas de confirmação são consideradas aceitas: CG-EM; CLAE-
EM/EM; CLAE – DAD; princípios cromatográficos (CG ↔ CLAE); detectores diferentes;
derivação (se este não for o método de escolha); diferentes fases estacionárias e
diferentes fases móveis. Além disto, variações nas etapas de partição e purificação da
amostra, em casos especiais, também são consideradas métodos de confirmação
Quando o método for realizado por CG-EM ou CLAE-EM/EM não são necessários
métodos de confirmação (CODEX ALIMENTARIUS, 2003; EUROPEAN COMMISSION,
2004).
A confirmação dos resíduos detectados por CLAE é mais problemática que por
CG. Se a detecção se efetua pela absorção dos raios UV, a obtenção de um espectro
completo pode proporcionar uma prova adequada da identidade do composto.
Entretanto, os espectros UV de alguns agrotóxicos não são úteis para o diagnóstico,
por serem análogos aos produzidos por muitos outros compostos que possuem grupos
funcionais ou estruturas similares. Os dados sobre absorção no UV obtidos em
diversos comprimentos de onda podem apoiar ou refutar a identificação, porém em
geral por si só não são suficientemente característicos. Podem-se empregar dados da
fluorescência e a derivação para confirmar os resíduos detectados por CLAE (CODEX
ALIMENTARIUS, 2003).
3.5 Validação de métodos
Validação de métodos analíticos é a confirmação por exame e fornecimento de
evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinado uso
pretendido são atendidos. O laboratório deve validar os métodos não normalizados,
criados ou desenvolvidos pelo próprio laboratório, métodos normalizados usados fora
dos escopos, ampliações e modificações dos métodos normalizados (ABNT, 2005). Se
um método existente for modificado para atender aos requisitos específicos, ou um
método totalmente novo for desenvolvido, o laboratório deve assegurar que as
características de desempenho do método atendam aos requisitos para as operações
analíticas pretendidas. É fundamental que os laboratórios disponham de meios e
critérios objetivos para demonstrar, através da validação, que os métodos de ensaio
40
que executam conduzem a resultados confiáveis e adequados à qualidade pretendida.
(INMETRO, 2003).
Estudo colaborativo interlaboratorial é um dos meios de avaliar os atributos do
método, proficiência do analista, os valores de referência do material ou comparar os
métodos de análise (NATA, 1997). O laboratório que utilizar um método validado por
estudos interlaboratoriais, que tenha sido avaliado como adequado para o propósito de
uso, precisa demonstrar somente que está aplicando o método de forma correta e que
obtém determinadas características (EURACHEM, 1998).
A validação completa de um método analítico inclui avaliação das características
do método em um estudo interlaboratorial, mas nem sempre é prático ou mesmo
necessário este tipo de validação. Nestes casos uma validação intralaboratorial é
indicada para garantir a viabilidade do método antes de realizar uma dispendiosa
validação interlaboratorial e fornecer evidência da confiabilidade de um método quando
validações interlaboratoriais não forem disponíveis ou praticáveis (THOMPSON et al.,
2002).
É essencial que os estudos de validação representem a realidade do ensaio, isto
é, devem ser conduzidos em condições, as mais próximas possíveis, das de uso
normal do método, e ainda cobrir as faixas de concentração e os tipos de amostras
dentro do escopo do método (THOMPSON et al., 2002).
Está implícito no processo de validação de um método, que os estudos para
determinação dos parâmetros sejam realizados utilizando equipamentos dentro das
especificações, em boas condições de trabalho e adequadamente calibrados. Da
mesma forma, o analista envolvido nos estudos deve ser competente na área em
questão, e ter conhecimento suficiente sobre o trabalho e ser capaz de tomar decisões
apropriadas durante a realização do estudo (EURACHEM, 1998; INMETRO, 2003).
Como formas para a determinação do desempenho de um método são citadas
pela NBR ISO/IEC 17025:2005: a calibração com uso de padrões ou materiais de
referência, as comparações com resultados obtidos por outros métodos, as
comparações intralaboratoriais, a avaliação sistemática de fatores que influenciam o
resultado e, a avaliação da incerteza dos resultados com base no conhecimento
científico dos princípios teóricos do método e na experiência prática (ABNT, 2005).
Os parâmetros de desempenho típicos na validação intralaboratorial a serem
estudados em um determinado protocolo são: aplicabilidade, seletividade, linearidade
da curva de calibração analítica, exatidão, precisão, limites de detecção e
quantificação, sensibilidade.
41
3.5.1 Aplicabilidade, seletividade, efeito de matriz e sensibilidade
A aplicabilidade inclui especificações sobre a faixa de concentração coberta pela
validação, os tipos de matrizes, os equipamentos, reagentes e procedimentos
analíticos, protocolos de calibração e precauções com a segurança (THOMPSON et al.,
2002).
A EUROPEAN COMMISSION (2002) define como especificidade a capacidade
de um método distinguir o analito de outra substância. Esta característica depende,
essencialmente, da técnica de medição descrita, podendo variar de acordo com o tipo
de composto na matriz. Entretanto, segundo a IUPAC (VESSMAN et al., 2001), este
conceito expressa a seletividade do método.
A seletividade é a capacidade do método em distinguir o analito de interesse de
materiais interferentes. Para verificar a seletividade do método os resultados devem ser
testados sob circunstâncias experimentais diferentes, por exemplo, dois analitos
diferentes ou duas técnicas diferentes da detecção. O comportamento do analito
durante a análise deve ser indistinguível do padrão na matriz apropriada (AOAC, 1998).
Os termos seletividade e especificidade são frequentemente utilizados
indistintamente ou com diferentes interpretações (EURACHEM, 1998; AOAC, 1998;
EUROPEAN COMMISSION, 2002; THOMPSON et al., 2002). Um método instrumental
de separação que produz resposta para uma única substância de interesse,
normalmente um dado elemento, pode ser chamado de específico e um método que
produz resposta para vários compostos químicos, com uma característica em comum,
pode ser chamado de seletivo (INMETRO, 2003). Considerando que há poucos
métodos cromatográficos que respondem a apenas uma substância, o termo
seletividade é mais apropriado, conforme sugerido pela IUPAC (VESSMAN et al., 2001;
RIBANI et al., 2004).
A seletividade é o primeiro passo no desenvolvimento e validação de um método
e deve ser reavaliada continuamente durante a validação e subseqüente uso do
método. Algumas amostras podem sofrer degradação, gerando compostos que não
foram observados inicialmente, que podem coeluir com a substância de interesse. Se a
seletividade não for assegurada, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão
seriamente comprometidas (RIBANI et al., 2004).
Muito esforço foi dedicado para resolver os problemas de seletividade
freqüentemente encontrados com as técnicas mais comuns de espectrofotometria de
42
UV/Visível ou de CLAE. Comparações de resultados podem ser usadas, variando as
condições de medição e análise, para verificar se os interferentes estão sendo
determinados junto com o analito. Algumas vezes devem-se usar técnicas adicionais,
como CCD ou EM, após a separação e a coleta do analito. Para este propósito, as
amostras utilizadas nos ensaios são estudadas cuidadosamente para provar que
nenhum produto de degradação possa alterar o sinal do analito (INMETRO, 2003).
Os efeitos de matriz não significativos simplificam enormemente o processo de
validação, visto que os padrões dos analitos podem ser preparados diretamente no
solvente. Para que esta estratégia seja adotada, o efeito de matriz deve ser avaliado na
validação (THOMPSON et al., 2002). A matriz pode conter compostos, os quais
interferem na medida feita pelo detector selecionado. Os compostos interferentes
podem fortalecer ou reduzir o sinal e magnitude do efeito. Os diferentes tipos de
amostras, extratos e concentrações da matriz podem exibir efeitos de valores
diferentes. Uma matriz representativa pode ser usada para calibrar vários tipos de
amostras (BRUCE et al., 1998; EUROPEAN COMMISSION, 2006).
A sensibilidade é a medida da mudança na resposta do equipamento
correspondente à mudança na concentração do analito. Quando a resposta é linear
com respeito à concentração, a sensibilidade corresponde ao gradiente da resposta da
curva (WILLETTS & WOOD, 2000). A sensibilidade do método depende primariamente
das características da função de calibração e a variabilidade da recuperação do analito
sobre a faixa de concentração de interesse. Este termo é, às vezes, usado
inapropriadamente quando se refere à capacidade de detecção do processo de medida
(AOAC, 1998).
A sensibilidade é o gradiente da função de calibração do equipamento. Como é
usualmente arbitrário, dependendo de ajustes instrumentais, não é útil em validações,
podendo ser útil em procedimentos de garantia de qualidade (THOMPSON et al.,
2002).
3.5.2 Faixa de trabalho e linearidade
A faixa de trabalho de um método analítico é o intervalo entre os maiores e os
menores níveis (incluindo estes níveis) que tenham demonstrado precisão, exatidão e
linearidade usando o método como descrito. É normalmente expressa dentro das
mesmas unidades dos resultados dos testes obtidos pelo método analítico (HUBER,
1998).
43
Para qualquer método quantitativo, existe uma faixa de concentrações do analito
no qual o método pode ser aplicado. No limite inferior da faixa de concentração, os
fatores impeditivos são os limites de detecção e de quantificação e no limite superior,
os fatores dependem do sistema de resposta do equipamento de medição. Dentro da
faixa de trabalho, pode existir uma faixa de resposta linear, isto é, a resposta do sinal
ter uma relação linear com a concentração do analito. A extensão dessa faixa pode ser
estabelecida durante a avaliação da faixa linear de trabalho (INMETRO, 2003).
Um número suficiente de soluções padrão é necessário para definir a resposta
em relação a uma faixa de concentração. Na maioria dos casos, no mínimo de cinco
concentrações da solução padrão, sem incluir o zero, é apropriada para o preparo da
curva de calibração e esta deve ser estatisticamente testada (AOAC, 1998).
Linearidade é a habilidade de um método analítico produzir resultados os quais
sejam proporcionais à concentração do analito em amostras, dentro de uma faixa de
concentração, tanto diretamente quanto por meio de uma transformação matemática
bem definida (NATA, 1997; HUBER, 1998).
Linearidade define a capacidade do método de obter resultados proporcionais à
concentração do analito (EURACHEM, 1998). É necessário avaliar a curva de
calibração na faixa de concentração na qual o método pode ser aplicado, e dentro
desta faixa de trabalho, se existe uma resposta linear (SOUZA & JUNQUEIRA, 2005).
O método de avaliação da linearidade proposto por SOUZA & JUNQUEIRA (2005)
estabelece: (i) definição da faixa de interesse, considerando que a concentração
esperada na amostra deve estar no centro da faixa; (ii) preparação de soluções de
calibração em solvente ou matriz, dependendo dos resultados dos estudos de efeitos
de matriz, em pelo menos seis níveis de concentração, igualmente espaçados, em três
replicatas independentes e um nível zero, preparado como uma ferramenta de controle
para ajuste do zero instrumental; (iii) medida da resposta das soluções de calibração
em uma ordem aleatória.
3.5.3 Exatidão e precisão
Exatidão é o grau de concordância entre o valor médio de uma grande serie de
resultados de ensaios e o valor de referência aceito, sendo geralmente expresso como
erro sistemático ou tendência (EUROPEAN COMMISSION, 2002). Podem também ser
definidos como a extensão na qual os resultados gerados por um método e os valores
verdadeiros concordam (HUBER, 1998).
44
A exatidão, quando aplicada a uma série de resultados de ensaio, implica numa
combinação de componentes de erros aleatórios e sistemáticos. É declarada
quantitativamente em termos de tendência (bias) ou erro sistemático, com pequenas
tendências indicando exatidão (THOMPSON et al, 2002; INMETRO, 2003).
A exatidão expressa a proximidade de um resultado do seu valor real. Pode ser
estudada da seguinte forma: comparando os resultados de um método com outro
previamente validado; por análise de materiais de referência certificados, uso do
método de referência de incerteza conhecida ou por testes de recuperação com adição
de padrões, quando materiais certificados não estiverem disponíveis (BRUCE et al.,
1998, AOAC, 1998).
Para avaliar a exatidão usando um material de referência, deve-se determinar a
média e o desvio padrão de uma série de replicatas e comparar com o valor do material
de referência. Um material de referência ideal é um material certificado, de uma matriz
natural, muito similar às amostras de interesse. Obviamente, a disponibilidade de tais
materiais é limitada. Alternativamente, materiais de referência para validação podem
ser preparados por adição de substâncias puras certificadas a matrizes típicas. Uma
forma de determinar a eficiência da extração é adicionar diferentes concentrações do
analito a porções da matriz, proceder à extração e medir a concentração do analito. O
problema é que o analito introduzido desta forma, provavelmente não estará tão
fortemente ligado à matriz, como um naturalmente presente neste meio e assim, a
técnica poderá indicar uma eficiência de extração superior à real. Apesar desta
limitação, esta é a técnica mais comumente usada para determinação da eficiência de
recuperação e é reconhecida entre os especialistas da área (EURACHEM, 1998).
Thompson et al. (2002) consideram que, na ausência de materiais de referência,
a exatidão pode ser investigada por meio de experimentos de adição de padrões. Estes
autores também afirmam que estudos de adição e recuperação de padrões podem ser
fortemente sujeitos a erros de observação. Entretanto, enquanto boa recuperação não
é uma garantia de exatidão, certamente uma recuperação pobre é uma indicação de
falta de exatidão.
A exatidão é sempre considerada dentro de certos limites, a um dado nível de
confiança, ou seja, aparece associada a valores de precisão. Estes limites podem ser
estreitos em níveis de concentração elevados e mais amplos em níveis de traços
(RIBANI et al, 2004).
A precisão indica o grau de dispersão de diversos valores individuais em torno
do valor mais provável, sendo usualmente representada em termos de desvio padrão
45
ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação). Depende somente da distribuição
de erros aleatórios e não é relacionada ao valor verdadeiro ou valor específico.
(EURACHEM, 1998). THOMPSON et al (2002) define precisão como sendo
proximidade de concordância entre resultados independentes obtidos sob condições
estipuladas. É usualmente especificado em termos de desvio padrão ou desvio padrão
relativo.
As duas medidas de precisão mais comuns são a repetitividade e
reprodutibilidade, o que implica em um estudo adicional, utilizando análise estatística
de variância. A repetibilidade avalia a variabilidade encontrada quando resultados
independentes são obtidos utilizando o mesmo método, em um mesmo laboratório,
com o mesmo analista, usando o mesmo equipamento em um curto intervalo de tempo.
A reprodutibilidade representa a variabilidade encontrada quando resultados são
obtidos utilizando o mesmo método, em laboratórios diferentes, com diferentes
analistas e usando equipamentos diferentes. Tanto a repetitividade quanto a
reprodutibilidade são geralmente dependentes da concentração do analito
(EURACHEM, 1998; BRUCE et al., 1998).
Existe ainda o termo reprodutibilidade parcial também chamado precisão
intermediária para definir a avaliação da precisão sobre a mesma amostra, utilizando o
mesmo método, o mesmo laboratório, porém avaliando a variabilidade dos resultados
analíticos com mudança de vários fatores: diferentes operadores; diferentes
equipamentos e diferentes dias (MAROTO et al., 2001). Outros fatores incluem
condições ambientais diferentes, lotes de reagentes, solventes e temperatura ambiente
(EUROPEAN COMMISSION, 2002)
Segundo KUTTATHARMMAKUL et al, (1999) quatro fontes de variação
contribuem para a variabilidade das medidas dentro de um laboratório. Os fatores
considerados são operador, instrumento, tempo, e erro aleatório. Estes quatro fatores
são as principais fontes que contribuem para a variabilidade das medidas dentro de um
laboratório. Para cada método analítico, a amostra é analisada por vários operadores.
Cada operador executa a análise em cada um dos instrumentos, com replicatas em
dias diferentes. A precisão intermediária é útil para indicar a habilidade do método
analítico de repetir o resultado de teste sob as circunstâncias definidas.
A precisão intermediária é reconhecida como a mais representativa da
variabilidade dos resultados em um único laboratório e, como tal, mais aconselhável de
ser adotada. O objetivo da validação da precisão intermediária é verificar que no
mesmo laboratório o método fornecerá os mesmos resultados (RIBANI et al., 2004).
46
3.5.4 Limites de detecção, quantificação, decisão e capacidade de detecção
Em termos gerais, o limite de detecção (LD) é a menor quantidade ou
concentração do analito que pode ser significativamente distinguida de zero.
Entretanto, apesar da aparente simplicidade deste conceito, existem muitas definições
sobre LD na literatura (THOMPSON et al 2002).
O LD pode ser definido como a menor concentração detectada em amostras
adicionadas, mas não necessariamente quantificada e distinguida de zero
(sinal/ruído ≥ 3) (SOUZA el al., 2007). Segundo a AOAC (1998), “é a média das leituras
de amostras brancas (n ≥ 20) mais 3 vezes o desvio padrão, expresso em
concentração do analito”. Como define HUBER (1998), “é a menor concentração de um
analito em uma amostra que pode ser detectada, mas não necessariamente
quantificada.” Para sistemas cromatográficos, é a quantidade injetada que resulta em
um pico com altura pelo menos 2 ou 3 vezes a linha de base do ruído. O LD pode ainda
ser descrito como a menor concentração do analito em uma amostra que pode ser
separada do background do instrumento utilizado para a medição (BRUCE et al.,
1998).
Limite de quantificação (LQ) é a menor concentração do analito que pode ser
determinada com precisão (repetitividade) e exatidão sob as condições estabelecidas
no teste (EURACHEM, 1998). É a menor quantidade do analito na amostra que pode
ser quantitativamente determinado com precisão e exatidão apropriadas para o analito
e matriz considerados (AOAC, 1998). Pode também ser descrito como a menor
concentração do analito medida com níveis aceitáveis de exatidão e precisão (BRUCE
et al., 1998) ou a concentração abaixo da qual o método analítico não pode operar com
precisão e exatidão aceitáveis (THOMPSON et al., 2002).
Limite de decisão (CCα) é o limite a partir do qual se pode concluir que uma
amostra é não-conforme com uma probabilidade de erro α, que mede a taxa de
resultados falsos não-conformes (EUROPEAN COMMISSION, 2002).
Quando os resultados obtidos forem menores que CCα, a amostra pode ser
declarada como conforme, o que significa ausência do analito ou presença do analito
em uma concentração menor que o LMR, com um nível de confiança de (1 - α)
(ANTIGNAC et al., 2003).
Capacidade de detecção (CCβ) é o teor mais baixo de substância que pode ser
detectado, identificado ou quantificado numa amostra com uma probabilidade de erro β,
47
que mede a taxa de resultados falsos conformes. Em caso de substâncias para as
quais não se encontre definido um limite permitido, CCβ é a concentração mais baixa
que o método é capaz de detectar em amostras realmente contaminadas com uma
certeza estatística de 1 – β. No caso de substâncias com um limite permitido
estabelecido, isto significa que a capacidade de detecção é a concentração que o
método é capaz de detectar, na faixa de concentração do limite permitido, com uma
certeza estatística de 1 – β (EUROPEAN COMMISSION, 2002; VAN OVERMEIRE,
2004).
Quando o resultado obtido é maior ou igual a CCβ, com um limite de confiança
de (1 – β), a amostra pode ser declarada como não-conforme, indicando a presença do
analito ou em uma concentração maior que o LMR. Quando o resultado estiver entre
CCα e CCβ há suspeita sobre a conformidade da amostra, mas, sob o ponto de vista
estatístico, o resultado não pode ser classificado e a aplicação prática destes
parâmetros depende de decisões políticas que envolvem a proteção do consumidor e
do produtor de alimentos (ANTIGNAC et al., 2003).
Para substâncias com limite máximo de resíduos definido, em CCα, a proporção
de resultados falsos não-conformes (erro α) será de 5%, com confiança de 95%, mas
de falsos conformes (erro β) será de 50%. Por outro lado, em CCβ, a proporção de
amostras falsamente declaradas não-conformes será muito baixa e a proporção de
amostras verdadeiramente não-conformes apresentarem um resultado conforme será
igual a 5%. Se o método é utilizado com propósitos confirmatórios, nos quais a
identificação inequívoca da presença de uma substância é pretendida, tanto CCα como
CCβ terão aplicação e o método será capaz de identificar os analitos em 95% dos
casos em CCβ e em 50% de todos dos casos em CCα (EUROPEAN COMMISSION,
2002).
CCα e CCβ devem ser estabelecidos através do procedimento da curva de
calibração ou analisando o sinal ruído de pelo menos 20 amostras brancas por matriz.
A curva é representada graficamente em função do sinal do equipamento e a
concentração de amostras brancas adicionadas, próximo ao nível mínimo de
desempenho requerido ou do LMR. Em caso de substâncias relativamente às quais
não se encontre definido um limite permitido, o CCα é igual à concentração obtida na
curva de calibração mais 2,33 vezes o desvio padrão da reprodutibilidade
intralaboratorial ou três vezes o sinal ruído. Em caso de substâncias com um LMR
definido, o CCα pode ser estabelecido como igual à concentração correspondente ao
limite permitido mais 1,64 vezes o desvio padrão da reprodutibilidade intralaboratorial.
48
A CCβ é igual à concentração correspondente ao CCα mais 1,64 vezes o desvio padrão
da reprodutibilidade intralaboratorial do teor médio medido (EUROPEAN
COMMISSION, 2002).
3.5.5 Robustez
A robustez de um método analítico é a medida da sua capacidade de manter-se
inalterado com pequenas variações nos parâmetros do método (THOMPSON, 2002). A
determinação da robustez consiste em fazer variações deliberadas no método e
investigar seus efeitos. É possível então, identificar as variáveis que têm um efeito mais
significativo e garantir que, quando o método for utilizado, não afetem os resultados
obtidos (EURACHEM, 1998).
Testes de robustez examinam o efeito dos parâmetros operacionais nos
resultados de análise. Se a influência do parâmetro estiver dentro de uma tolerância
previamente especificada, é dito que o parâmetro está dentro da robustez do método.
Dados obtidos nestes efeitos permitirão avaliar se um método precisa ser revalidado
quando um ou mais destes parâmetros são alterados (HUBER, 1998).
O método analítico deve ser testado em diferentes condições experimentais.
Devem ser efetuados estudos prévios para a seleção de fatores do pré-tratamento, da
limpeza e da análise da amostra, capazes de influenciarem os resultados da medição.
Ao se Identificarem possíveis fatores que possam influenciar os resultados, devem-se
variar levemente cada fator. Quando se verificarem que um fator influencia
significativamente os resultados das medições, devem se fazer mais experiências para
decidir quanto aos limites de aceitabilidade deste fator. Nesse caso, os resultados
devem ser claramente identificados no protocolo do método Estes fatores podem incluir
o analista, a fonte e a idade dos reagentes, solventes, padrões e extratos de amostra, a
taxa de aquecimento, a temperatura, o pH assim como muitos outros fatores que se
podem verificar no laboratório. As alterações introduzidas devem ser importantes e
geralmente são avaliadas utilizando a abordagem de YOUDEN & STEINER (1975), que
é de concepção fatorial fracionária (EUROPEAN COMMISSION, 2002).
De acordo com EURACHEM (1998), a robustez deve ser tratada como parte do
desenvolvimento e de otimização do método. THOMPSON et al (2002) defendem que
os estudos de robustez em processos da validação devem somente ser conduzidos
quando os parâmetros experimentais e seus respectivos limites não forem
estabelecidos previamente.
49
3.5.6 Revalidação
A validação original de um método deve localizar os pontos fracos do
procedimento e prover dados suficientes para avaliar a qualidade do método.
Revalidação deve ser considerada quando o objetivo, o cliente ou o nível de qualidade
requerido do método muda, quando o procedimento é modificado e mesmo quando o
método é usado novamente no laboratório após certo período de tempo. O esforço
necessário aumentará com o aumento da complexidade do método e a extensão das
mudanças (BRUCE et al., 1998).
Uma revalidação é necessária sempre quando se altera os parâmetros de
análise, matriz e tipo ou características do instrumento. Deverá ser realizada, também,
uma nova validação se resultados da análise da amostra controle estiverem fora dos
critérios pré-ajustados da aceitação e a fonte de erro não puder ser localizada (HUBER,
1998).
3.5.7 Matrizes representativas
A completa validação de algum método para todas as matrizes e todos os
agrotóxicos nos alimentos é praticamente impossível. Então, a escolha dos
agrotóxicos, as concentrações, e matrizes no estudo devem ser feitas criteriosamente
para fornecer diversas faixas de combinações para demonstrar a capacidade analítica
do método (LEHOTAY, 2000).
Para o procedimento de validação do método, poderá ser selecionado um
produto representativo de cada grupo com propriedades comuns A experiência indica
que em matrizes de produtos/amostras similares geralmente se obtém um rendimento
similar na extração e purificação, podendo ser assim agrupado: elevado conteúdo de
água e clorofila (por ex: alface, espinafre, brócolis); elevado conteúdo de água e
conteúdo escasso ou ausência de clorofila (por ex: maça, pêra, cerejas, uvas, tomate,
pimentão, morango, cenoura e batata); elevado conteúdo de ácido (por ex: laranja e
limão); elevado conteúdo de açúcar (por ex: uva seca e tâmara); elevado conteúdo de
óleo ou gordura (por ex: abacate, nozes ou pistache); materiais secos (por ex: arroz,
trigo ou milho em grão) e produtos que requerem testes individuais (por ex: alho, chá,
temperos ou amora) (CODEX ALIMENTARIUS, 2003).
Se o método é idêntico para todas as matrizes listadas acima, a validação deve
50
ser realizada com no mínimo duas matrizes, sendo uma delas com alto teor de água
(EUROPEAN COMMISSION, 2004).
Para métodos de multiresíduos, matrizes representativas podem ser usadas.
Entretanto, matrizes representativas podem ser escolhidas cuidadosamente com base
na sua similaridade biológica ou analítica. Isto pode ser com relação a fatores tais
como conteúdo de água; gordura; açúcar ou pH. Assim, por exemplo, laranja pode ser
escolhida como representativas das frutas cítricas, as alfaces como representativas das
folhosas verdes (EUROPEAN COMMISSION, 2006).
3.5.8 Analitos representativas
Segundo o CODEX ALIMENTARIUS (2003) para avaliar o rendimento de um
método pode-se utilizar analitos representativos, devendo selecionar compostos que
possuem propriedades físicas e químicas dos analitos que se pretende determinar no
método. A seleção dos analitos representativos deve ser efetuada em função da
finalidade e o alcance das análises, levando em conta os seguintes fatores: os analito
representativos devem possuir amplas propriedades físicas e químicas, suficientes
para incluir os analitos representados; todos os analitos incluídos no processo de
validação inicial devem ser aqueles que serão submetidos ao ensaio regularmente e
que podem ser determinados simultaneamente pelo sistema empregado; as
concentrações dos analitos utilizados para caracterizar um método devem ser
selecionadas de maneira que compreenda os limites aceitáveis de todos os analitos
que se planeja avaliar em todos os produtos.
Na validação de um método as separações cromatográficas para análises de
uma mistura de padrões e também os analitos críticos no estudo para qual método será
usado devem ser considerados nas escolhas dos analitos representativos (AMBRUS,
2000).
51
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Analitos
As estruturas químicas dos ingredientes ativos analisados estão apresentadas
na figura 4.
clorpirifós: derivado do ác. tiofosfórico etoprofós: derivado do ác. tiofosfórico
parationa-metílica: derivado do ác. tiofosfórico pirimifós-metílica: derivado do ác.
tiofosfórico
dimetoato: derivado do ác. ditiofosfórico etiona: derivado do ác. ditiofosfórico
diclorvós: derivado do ác. Fosfórico
clorfenvinfós: derivado do ác. fosfórico
Figura 4: Estruturas químicas dos inseticidas organofosforados analisados
52
4.2 Equipamentos
Balança analítica marca Gehaka (São Paulo, Brasil) modelo HR-200, balança
semi-analítica marca Mettler (Zürich, Switzerland) modelo P1210, bomba de vácuo
marca Marconi (São Paulo, Brasil) modelo MA057, capela de segurança química marca
Veco (São Paulo, Brasil) modelo VLFS-09, cromatógrafo a gás (CG) marca Varian
(California, USA) modelo CP3800 equipado com: amostrador automático modelo
CP8200; detector termiônico específico (DTE) e coluna cromatográfica capilar CP-Sil
19CB (14% cianopropil-fenil e 86% dimetilsilano) ; 30m de comprimento; 0,32mm de
diâmetro externo; 0,25mm de diâmetro interno e espessura do filme de 0,25µm, estufa
marca Fanem (São Paulo, Brasil) modelo 315SE; evaporador rotatório marca Büchi
(Flawil, Switzerland) modelo W240N, micropipetas automáticas de volume variável: de
10,0 a 20,0 µL (P20); de 10,0 a 100,0 µL (M100); de 50,0 a 200,0 µL (P200); de 200,0 a
1000,0 µL (M1000); de 1000,0 a 5000,0 µL (P5000); de 1000,0 a 10.000,0 µL (P10mL)
marca Gilson (Villiers-le-Bel, France); mufla marca Fornitec (São Paulo, Brasil) modelo
Piromatic; homogeneizador do tipo ultra turrax marca Marconi (São Paulo, Brasil)
modelo MA102E; triturador de amostras marca Skymsen (Santa Catarina, Brasil)
modelo CR-4L.
4.3 Reagentes e padrões
Acetato de etila e diclorometano (grau para análise de resíduos) foram obtidos
da MercK (Darmstadt, Alemanha); acetona (grau para análise) foi obtido da Vetec (Rio
de Janeiro, Brasil), acetona (grau para análise de resíduos) e n-hexano (grau para
análise de resíduos) da Tédia (Fairfield, OH, EUA), sulfato de sódio anidro (grau para
análise) da Spectrum (New Jersey, EUA), água destilada e deionizada foi preparada
no laboratório.
Os padrões analíticos de agrotóxicos (clorfenvinfós, clorpirifós etílico, diclorvós,
dimetoato, etiona, etoprofós, parationa metílica e pirimifós metílico) foram fornecidos
por Ehrenstorfer (Augsburg, Alemanha).
4.4 Soluções
53
4.4.1 Solução padrão estoque (SPE)
A solução estoque de etiona, etoprofós, parationa metílica e pirimifós metílico de
200,0 µg mL
-1
foi preparada por dissolução de 10,0 mg ± 0,1 mg do padrão para
50,0 mL de acetato de etila. A solução estoque de clorpirifós etílico e dimetoato de
202,0 µg mL
-1
foi preparada pela dissolução de 10,1 mg ± 0,1 mg do padrão para
50,0 mL de acetato de etila e a de clorfenvinfós e diclorvós de 204,0 µg mL
-1
por
dissolução de 10,2 mg ± 0,1 mg do padrão para 50,0 mL de acetato de etila. Esta
solução foi armazenada sob congelamento entre -14ºC e -20ºC e preparada com
freqüência anual.
4.4.2 Solução pool padrão Intermediária 1 (SPI 1)
Foram pipetados 1000,0 µL da SPE de cada analito e transferidos para um balão
volumétrico de 10,0 mL. O volume foi completado com acetato de etila,
homogeneizando-se a seguir. As concentrações dos analitos no pool da SPI 1 foram:
de 20,0 µg mL
-1
para etiona, etoprofós, parationa metílica e pirimifós metílico; de 20,2 µ
g mL
-1
para clorpirifós etílico e dimetoato e de 20,4 µg mL
-1
para clorfenvinfós e
diclorvós. Esta solução foi armazenada sob congelamento entre -14ºC a -20ºC e
preparada com freqüência semestral.
4.4.3 Solução pool padrão Intermediária 2 (SPI 2)
Foram pipetados 1000,0 µL da SPI 1 e transferidos para um balão volumétrico
de 25,0 mL. O volume foi completado com acetato de etila, homogeneizando. As
concentrações dos analitos no pool da SPI 2 foram: de 0,800 µg mL
-1
para etiona,
etoprofós, parationa metílica e pirimifós metílico; de 0,808 µg mL
-1
para clorpirifós etílico
e dimetoato e de 0,816 µg mL
-1
para clorfenvinfós e diclorvós. Esta solução foi
preparada com freqüência diária.
4.4.4 Preparo da curva de calibração
Alíquotas de 150, 350, 550, 750, 950 e 1150 µL, respectivamente, da SPI 2
foram transferidas para balões volumétricos de 10°mL. Foram preparadas, três
replicatas independentes de cada ponto da curva de calibração, além do branco de
solvente. Os volumes foram completados com acetato de etila, homogeneizando-os. As
54
faixas de concentrações das soluções nos pools da curva de calibração foram de:
12,00; 28,00; 44,00; 60,00; 76,00 e 92,00 ng mL
-1
para etiona, etoprofós, parationa
metílica e pirimifós metílico; 12,12; 28,28; 44,44; 60,60; 76,76 e 92,92 ng mL
-1
para
clorpirifós etílico e dimetoato de e 12,24; 28,56; 44,88; 61,20; 77,52 e 93,84 ng mL
-1
para clorfenvinfós e diclorvós. Esta solução foi preparada com freqüência diária.
4.4.5 Solução extratora
A Solução extratora de diclorometano:n-hexano (1:1 v/v) foi preparada, medindo
em proveta, 500 mL de n-hexano grau para análise de resíduos e 500 mL de
diclorometano grau para análise de resíduos. Os solventes foram transferidos
diretamente para um frasco âmbar de 2500 mL e armazenada à temperatura ambiente
e preparados com freqüência diária.
4.5 Amostras usadas na Validação
As amostras brancas de alfaces, bananas e tomates foram adquiridas de lojas
que revendem produtos orgânicos em Belo Horizonte – MG, e também de produtores
que não utilizam agrotóxicos.
As amostras foram trituradas, acondicionadas, devidamente identificadas e
armazenadas sob congelamento entre -14°C e -20°C, até o momento dos ensaios.
4.6 Método de ensaio
O método validado foi baseado no método de multiresíduos descrito por
NETHERLANDS (1996). Adicionar 30 mL de acetona em 15 g de amostras trituradas,
agitar a mistura por aproximadamente 30 segundos no homogeneizador do tipo ultra
turrax. Em seguida adicionar 30 mL de diclorometano e 30°mL de éter de petróleo e
agitar a mistura no ultra turrax por mais aproximadamente 30 segundos. Centrifugar por
2 minutos a 4.000 rpm. Pipetar 25 mL do extrato e evaporar até a secura. Retomar com
5 mL de isooctano/tolueno (90:10) e injetar 0,8 µL do extrato em CG-DFC .
55
4.7 Método de ensaio modificado
O método de ensaio validado fundamentou-se na extração de resíduos de
inseticidas OF em amostras previamente trituradas e homogeneizadas. A extração foi
realizada em homogeneizador do tipo ultra turrax com acetona e em seguida com
solução de diclorometano e n-hexano. Após a extração realizou a filtração a vácuo,
pegou uma alíquota secou em corrente de nitrogênio e retomou com acetato de etila.
Empregou-se a CG para identificação e quantificação dos resíduos, utilizando-se o
DTE.
4.7.1 Extração
As amostras in natura de alface, banana e tomate foram descongeladas e
homogeneizadas. Alíquotas de aproximadamente 15 g foram pesadas em um béquer
de 600 mL, utilizando uma balança semi-analítica. Foram adicionados no béquer
aproximadamente 15 g de sulfato de sódio anidro, agitando-se o béquer
cuidadosamente para que toda a amostra entrasse em contato com o sulfato de sódio.
Adicionou-se 40 mL de acetona para análise de resíduos e agitou-se a mistura por
aproximadamente 30 segundos no homogeneizador do tipo ultra turrax. Em seguida
foram adicionados 60 mL da solução extratora de diclorometano:n-hexano (1:1 v/v) e
agitou-se a mistura no ultra turrax por mais aproximadamente 30 segundos. Filtrou-se a
mistura à vácuo, com funil de Buchner e papel de filtro, lavando-se a haste do ultra
turrax e o béquer com a solução extratora de diclorometano:n-hexano (1:1 v/v),
passando-se a solução de lavagem pelo papel de filtro. O extrato foi transferido para
uma proveta calibrada de 100 mL e completou-se o volume com a solução extratora de
diclorometano:n-hexano (1:1 v/v). O extrato da amostra foi acondicionado em um frasco
de vidro com tampa esmerilhada, previamente identificado. Pipetou-se 10 mL do
extrato em balão de fundo chato, levou-o ao evaporador rotatório para a evaporação
até quase a secura e em seguida foi seco completamente com ar comprimido. Após a
secagem os resíduos foram retomados com 1 mL de acetato de etila. Brancos das
amostras foram preparados em cada bateria analítica.
4.7.2 Preparo da curva de calibração no extrato da matriz
56
Após a extração da amostra branca, através do procedimento descrito
anteriormente, pipetou-se 10 mL do extrato em balão de fundo chato, levou-o ao
evaporador rotatório para a evaporação até quase a secura e em seguida foi seco
completamente com ar comprimido. Adicionou-se 15, 35, 55, 75, 95 e 115 µL da SPI 2,.
Após a secagem da solução, os resíduos foram retomados com 1 mL de acetato de
etila. As faixas de concentrações das soluções nos pools da curva de calibração foram
de: 12, 28, 44, 60, 76 e 92 ng mL
-1
para etiona, etoprofós, parationa metílica e pirimifós
metílico; 12,12; 28,28; 44,44; 60,60; 76,76 e 92,92 ng mL
-1
para clorpirifós etílico e
dimetoato de e 12,24; 28,56; 44,88; 61,20; 77,52 e 93,84 ng mL
-1
para clorfenvinfós e
diclorvós.
4.7.3 Separação, detecção e quantificação
As condições de operação do sistema CG - DTE foram: temperatura do forno:
80
o
C (espera 1 min), aquecimento de 30
o
C min
-1
até 200
o
C (espera 3 min),
aquecimento de 15
o
C min
-1
até 230
o
C (espera 6 min.), aquecimento de 5
o
C min
-1
até
250
o
C (patamar 10 min.); tempo total da corrida: 30 min; modo de injeção: splitless;
temperatura do injetor: 230
o
C; temperatura do detector: 300
o
C; gás de arraste: hélio;
fluxo do gás de arraste: 1,0 mL min
-1
; pressão: 12,8 psi; volume de amostra injetada:
1 µL.
Curvas de calibração da resposta (área dos picos) versus a concentração de
cada OF foram construídas. As equações das curvas foram estimadas pelo método dos
mínimos quadrados ordinários (MMQO) e utilizadas para cálculo da concentração dos
resíduos de OF nas amostras.
O fluxograma da metologia de análise está apresentada na figura 5.
57
Figura 5 – Fluxograma da metodologia de análise
4.8 Validação
A validação do método foi conduzida por três técnicos treinados no método
utilizado, dentro das boas praticas de laboratório, e desempenhada em diferentes dias.
Os parâmetros linearidade, efeito dia, efeito matriz, seletividade, exatidão,
precisão, reprodutibilidade parcial, LD, LQ, CCα e CCβ foram estabelecidos em
ensaios com soluções padrão, amostras brancas e adicionadas de padrão. A
58
15 g de amostra triturada
+ 15g de sulfato de sódio anidro
+ 40 mL de acetona
Agitar no ultra -turrax por
30 segundos
60 mL de Diclorometano/hexano (1:1),
Agitar por + 30 segundos
para 100 mL diclorometano:n-
hexano (1:1 v/v).
Filtrar em Kitasato e funil de Buchner
Pipetar 10 ml do extrato
Evaporar até quase a secura
Em seguida secar sob corrente de nitrogênio
Retomar com 1°ml de acetato de etila
Transferir para o vial de 2°mL
Injetar 1µL no GC-TSD / PFPD
adequação para uso do método foi avaliada em função dos parâmetros estudados e
respectivos critérios de aceitabilidade definidos.
4.8.1 Linearidade
Linearidade foi avaliada de acordo com o procedimento proposto por SOUZA &
JUNQUEIRA (2005). Foram preparadas, em três diferentes dias, curvas de calibração
em seis níveis e três replicatas independentes de cada nível nas concentrações de 12,
28, 44, 60, 76 e 92 µg L
-1
(correspondente a 8; 18,7; 29,3; 40; 50,7 e 61,3 µg kg
-1
de
cada resíduos de agrotóxicos nos produtos agrícolas). Para preparo destas curvas,
foram utilizadas alíquotas de 150, 350, 550, 750, 950 e 1150 µL da SPI 2,
respectivamente. Dentro de cada dia, as soluções foram analisadas em ordem
aleatória. O ajuste do zero do equipamento foi feito, para todas as curvas, com
soluções do solvente, sem a presença dos analitos. Em triplicata, foram preparados
brancos, para todas as curvas como ferramenta de controle de qualidade interno para
ajuste do zero do equipamento, mas não foram incluídos nos cálculos.
O modelo
i i
Y a bX
= +
, em que
i
Y
representa as respostas (áreas dos picos),
i
X
as concentrações dos padrões dos analitos,
a
e
b
estimativas dos parâmetros da
equação foi adotado para o ajuste das curvas pelo MMQO. Com os resultados da
análise de regressão, foram construídos gráficos de resíduos
( )
i i
Y a bX
− −
e
examinados para detecção de heteroscedasticidade ou desvio de linearidade. Os
resíduos fora do intervalo
0,975;( 2)
n res
t s
−
±
, identificados como outliers (valores extremos),
foram confirmados pelo teste de resíduos padronizados Jacknife (BELSLEY, et al.
1980). Este teste foi aplicado sucessivamente para excluir o dado, até que novos
outliers não fossem detectados ou até um limite de exclusão de 2/9 no número original
de resultados (IUPAC, 1987). Todas as premissas da análise de regressão foram
previamente verificadas: normalidade (teste de Ryan & Joiner), homoscedasticidade
(teste de Levene, modificado por Brown & Forsythe) e independência dos resíduos da
regressão (teste de Durbin & Watson). Após a análise, testes de F foram adotados para
verificar a adequação do ajuste ao modelo linear pelas significâncias da regressão e do
desvio de linearidade, avaliado contra o erro puro de repetitividade (SOUZA &
JUNQUEIRA, 2005).
4.8.2 Efeito do dia
59
A avaliação do efeito do dia foi baseada nas curvas de calibração, empregadas
para os estudos de linearidade, obtidas em três dias. As estimativas das inclinações e
das interseções das curvas foram comparadas pelo teste de t, aplicado a dois
contrastes ortogonais.
Para comparação das estimativas das inclinações, as estatísticas t foram
propostas pelas seguintes equações:
1 2
1 2 1 2
1 2
( )
( )
1 1
A
c XX XX
b b b b
t Y
EP b b
s S S
− −
= =
−
+
1 2 3
1 2 3 1 2 3
1 2 3
2 2
( )
( 2 )
1 1 4
B
c XX XX XX
b b b b b b
t Y
EP b b b
s S S S
+ − + −
= =
+ −
+ +
Analogamente, para comparação das interseções foram utilizadas:
( ) ( )
1 2
1 2 1 2
2 2
1 2
1 1 2 2
( )
( )
A
c XX XX
a a a a
t Y
EP a a
s X n S X n S
− −
= =
−
+
∑ ∑
( ) ( )
( )
1 2 3
1 2 3 1 2 3
2 2 2
1 2 3
1 1 2 2 3 3
2 2
( )
( 2 )
4
B
c XX XX XX
a a a a a a
t Y
EP a a a
s X n S X n S X n S
+ − + −
= =
+ −
+ +
∑ ∑ ∑
sendo
( )
2
2
XX
S X X n
= −
∑ ∑
, X a concentração dos analitos e n o número de pontos
de cada curva. Os subscritos 1, 2 e 3 representam os dias; Y
A
e Y
B
os contrastes
ortogonais e
( )
EP Var Y
=
, o erro padrão dos contrastes.
Após a verificação da homogeneidade das variâncias individuais extremas dos
parâmetros estimados para as curvas de calibração pelo teste de Pearson & Hartley
(SNEDECOR & COCHRAN, 1989), foram calculadas as estimativas das variâncias dos
contrastes ortogonais (Var), com base na variância combinada (
2
c
s
):
( ) ( ) ( )
2 2 2
1 1 2 2 3 3
2
1 2 3
2 2 2
6
c
n s n s n s
s
n n n
− + − + −
=
+ + −
60
O efeito do dia foi considerado significativo quando a estatística t excedeu ao
valor de t crítico para
1 2 3
6
n n n
+ + −
graus de liberdade e α = 0,05 para qualquer um dos
contrastes ortogonais.
4.8.3 Efeitos de matriz
Para avaliação dos efeitos de matriz foi empregado o método de adição de
padrão. Duas curvas de calibração em concentrações exatas em torno de 12, 28, 44,
60, 76 e 92 ng mL
-1
foram estudadas, sendo que cada nível foram preparados três
replicatas independentes, analisadas em ordem aleatória, no mesmo dia. A curva do
analito no solvente (acetato de etila) foi preparada conforme descrito nos experimentos
de avaliação da linearidade. A curva do analito na matriz utilizou-se extratos de
amostras brancas de alface, banana e tomate adicionados de 15, 35, 55, 75, 95 e
115 µL da SPI 2. Brancos da amostra foram preparados para cada curva e utilizados
como ferramenta de controle para ajuste do zero do equipamento, mas não foram
incluídos nos cálculos.
Foram estimados os parâmetros da regressão e verificadas as premissas
relativas ao MMQO para estas curvas. Os outliers foram diagnosticados pelo teste de
resíduos padronizados Jacknife. Comprovadas as premissas de normalidade,
homoscedasticidade, independência e ajuste ao modelo linear, a inclinação e a
interseção obtida para a curva de solventes foram comparadas com a inclinação e
interseção calculadas para a curva de matriz. A homogeneidade das variâncias dos
resíduos das curvas foi avaliada pelo teste de Pearson & Hartley (SNEDECOR &
COCHRAN, 1989) e as inclinações e interseções foram comparadas pelo teste de t, de
maneira análoga aos contrastes Y
A
descritos na avaliação do efeito do dia. A variância
combinada foi obtida por:
( ) ( )
2 2
1 1 2 2
2
1 2
2 2
4
c
n s n s
s
n n
− + −
=
+ −
4.8.4 Seletividade, exatidão (recuperação) e precisão
Ensaios com amostras brancas e adicionadas de padrão foram utilizados para
cálculo de seletividade; exatidão; precisão sob condições de repetitividade e
reprodutibilidade parcial; limites de detecção e quantificação; CCα e CCβ. Os três níveis
61
de adição estudados estão descritos na Tabela 3. Foram realizadas dezoito replicatas
independentes para o primeiro nível de clorpirifós, dimetoato, etiona, etoprofós e
parationa e pirimifós e também para o segundo nível de clorfenvinfós e diclorvós. Para
os demais níveis, foram utilizadas doze replicatas. As amostras foram divididas, para o
nível com 18 replicatas, em seis lotes com três replicatas, analisados em seis
diferentes dias por três analistas: dias 1 e 2 pelo analista 1; dias 3 e 4 pelo analista 2 e
5 e 6 pelo analista 3. Para os níveis com 12 replicatas, as amostras foram divididas em
quatro lotes com três replicatas, analisados em quatro diferentes dias por dois
analistas: dias 1 e 2 pelo analista 1 e dias 3 e 4 pelo analista 2. As concentrações de
OF nas amostras adicionadas foram calculadas pelas equações das curvas de
calibração na solução matriz, com base nos resultados dos estudos de efeitos de
matriz.
Tabela 3 – Níveis de adição de padrões em amostras brancas de alface, banana e
tomate para cálculo de exatidão, precisão, limite de quantificação, limite de decisão e
capacidade de detecção
Ingrediente ativo
Níveis de adição
Alface (µg kg
-1
) Banana (µg kg
-1
) Tomate (µg kg
-1
)
Clorfenvinfós 8,16 - 35,36 - 62,56 8,16 - 40,80 - 62,56 8,16 - 35,36 - 62,56
Clorpirifós 8,08 - 35,01 - 61,95 8,08 - 40,40 - 61,95 8,08 - 35,01 - 61,95
Diclorvós 8,16 - 35,36 - 62,56 8,16 - 40,80 - 62,56 8,16 - 35,36 - 62,56
Dimetoato 8,08 - 35,01 - 61,95 8,08 - 40,40 - 61,95 8,08 - 35,01 - 61,95
Etiona 8,00 - 34,67 - 61,33 8,00 - 40,00 - 61,33 8,00 - 34,67 - 61,33
Etoprofós 8,00 - 34,67 - 61,33 8,00 - 40,00 - 61,33 8,00 - 34,67 - 61,33
Parationa-metílica 8,00 - 34,67 - 61,33 8,00 - 40,00 - 61,33 8,00 - 34,67 - 61,33
Pirimifós-metílico 8,00 - 34,67 - 61,33 8,00 - 40,00 - 61,33 8,00 - 34,67 - 61,33
A ausência de picos cromatográficos nos tempos de retenção dos ingredientes
ativos estudados, para todas as amostras brancas de alface, banana e tomate,
associada à capacidade do método separar, detectar e quantificar os oito resíduos de
OF, com tempo de retenção distintos, foram consideradas suficientes para
estabelecimento da seletividade.
A presença de outliers nos resultados obtidos dos testes de recuperação foi
analisada pelo teste de Grubbs (GRUBBS, 1969; BURKE, 2001). As estatísticas de
Grubbs para um outlier (G
1
), dois outliers vicinais (G
2
) e dois outliers polares (G
3
) foram
calculadas simultaneamente, de acordo com as equações abaixo para cada nível de
concentração. A indicação de outlier por pelo menos uma destas estatísticas foi
62
suficiente para excluir o dado. Os cálculos foram feitos de modo iterativo, sendo o teste
de Grubbs sucessivamente aplicado até que novos outliers não fossem detectados ou
até um limite de 22,2 % no número original de resultados (HORWITZ, 1995).
1
i
X X
G
s
−
=
1
2
n
X X
G
s
−
=
2
2
3
2
( 3)
1
( 1)
n
n s
G
n s
−
−
= −
−
sendo, s o desvio padrão, X
i
o outliers suspeito, isto é, o valor absoluto mais distante da
média,
X
a média, n o número de dados, X
n
e X
1
são os valores extremos, s
2
a
variância calculada para n dados e
2
2
n
s
−
a variância calculada desconsiderando os
valores extremos superior e inferior (BURKE, 2001).
Exatidão foi avaliada por meio das médias de recuperação das amostras
adicionadas de padrão, obtidas em pelo menos doze replicatas independentes nos
níveis de adição descritos na Tabela 3. Foram consideradas aceitáveis médias de
recuperação entre 70 % e 110 % para amostras adicionadas em níveis próximos de
8 µg kg
-1
e de 80 % a 110 % para as amostras adicionadas em níveis de próximos de
35, 40 e 62 µg kg
-1
(EUROPEAN COMMISSION, 2002).
As precisões sob condições de repetitividade e reprodutibilidade parcial foram
expressas em termos de desvios padrão relativos e estimadas por análise de variância
dos resultados de recuperação obtidos de, no mínimo, doze replicatas de amostras
brancas adicionadas em níveis próximos de 8; 35 e 62 µg kg
-1
(alface e tomate) e
próximos de 8, 40 e 62 µg kg
-1
(banana).
Foi adotado um delineamento fatorial completamente aninhado que forneceu as
estimativas da variância de repetitividade (
2
r
s
); da variância entre bateladas (
2
Entre Batelada
s
)
que inclui as fontes de variação confundidas do dia e do analista; e da variância de
reprodutibilidade parcial (
2
R
s
), também denominada de variância da precisão
intermediária, como representado nas Tabela 4 e 5 (VAN LOCO & BEERNAERT, 2003;
MAROTO et al., 1999; MAROTO et al., 2001).
Tabela 4 – Cálculo das variâncias para o delineamento fatorial completamente
aninhado
Fonte Graus de liberdade Somas de Quadrados Quadrados Médios
63
Batelada
1
u
−
2
2
1 1 1
1 1
k
n
u n
kj i
k j i
k
X X
n n
= = =
−
∑ ∑ ∑
1
Batelada
Batelada
SQ
QM
u
=
−
Resíduo
n u
−
SQ
Total
– SQ
Batelada
Resíduo
Resíduo
SQ
QM
n u
=
−
Total
1
n
−
2
2
1 1
1
n n
i i
i i
X X
n
= =
−
∑ ∑
sendo
u
o número de bateladas;
k
n
o número de replicatas da k-ésima batelada;
1 1
1
u n
k
k i
n n
= =
= =
∑ ∑
o
número total de resultados de recuperação;
kj
X
o j-ésimo resultado de recuperação da k-ésima batelada;
i
X
o i-ésimo resultado de recuperação; SQ as somas de quadrados e QM os quadrados médios.
Tabela 5 – Expressões da precisão em condições de repetitividade e de
reprodutibilidade parcial
Fonte Variância Desvio Padrão (DP) DP relativo
Repetitividade
2
r Resíduo
s QM
=
2
r r
s s
=
100
r
s X
Entre bateladas
( )
2 2
Entre Bateladas Batelada r k
s QM s n
= −
Reprodutibilidad
e parcial
2 2 2
R r Entre Batelada
s s s
= +
2
R R
s s
=
100
R
s X
sendo
1
u
k k
k
n n u
=
=
∑
o número médio de replicatas das bateladas;
1
n
i
i
X X n
=
=
∑
a média global
dos valores de recuperação;
2
r
s
a variância da repetitividade e
2
R
s
a variância da reprodutibilidade parcial
ou da precisão intermediária.
Quando a estimativa da variância de repetitividade foi maior que o quadrado
médio da batelada, a estimativa da variância entre bateladas
2
EntreBateladas
s
foi considerada
como sendo igual a zero. Neste caso, as estimativas das variâncias de repetitividade e
de reprodutibilidade parcial foram consideradas equivalentes (KUTTATHARMMAKUL et
al., 1999; MAROTO et al., 1999).
A normalidade (teste de Ryan & Joiner) e a homoscedasticidade (teste de Brown
& Forsythe) dos resultados de recuperação utilizados na análise de variância foram
previamente testadas, como proposto por SOUZA et al. (2007). Desvios padrão
relativos de repetitividade (DPR
r
) foram considerados aceitáveis até um limite de 66,7%
do valor da precisão interlaboratorial estimada pela equação de THOMPSON (2000).
Os desvios padrões relativos de reprodutibilidade parcial (DPR
R
) foram considerados
aceitáveis se inferiores ao valor estimado pela equação de HORWITZ (1982) e
THOMPSON (2000). Como a fração de massa de todos os níveis adicionados, para
todos os analitos, era inferior a 1,2 x 10
-7
, DPR
r
e DPR
R
menores ou iguais a 14,7% e
22,0 %, respectivamente, foram os critérios de precisão adotados.
64
4.8.5 Limites de detecção, quantificação, decisão e capacidade de detecção
O LD foi a menor concentração detectada nas amostras adicionadas, mas não
necessariamente quantificada, distinguida de zero (sinal/ruído ≥ 3). O LQ foi
estabelecido como a concentração abaixo da qual o método não se pôde operar com
exatidão e precisão aceitáveis de acordo com SOUZA et al.(2007).
O
CC
α
e a
CC
β
foram estimados utilizando-se os resultados de recuperação
obtidos nos experimentos de avaliação da reprodutibilidade parcial. A informação se o
produto é autorizado e qual é seu LMR foi utilizada para o cálculo destes parâmetros,
para os oito OF estudados, de acordo com VAN LOCO & BEERNAERT (2003). O valor
da resposta que conduz à conclusão de que a resposta excede à quantidade máxima
autorizada, com uma probabilidade de
1
− α
, denominado valor significativamente
crítico da variável da resposta (
c
y
) foi determinado pela equação:
( )
( )
2
( 2),
2
1
1
L
c L res n
i
X X
y a bX s t
n
X X
α
−
−
= + + + +
−
∑
sendo a a interseção; b a inclinação; X
L
= a concentração nominal do limite permitido
(X
L
= LMR ou X
L
= zero, para analito não autorizado); s
res
o erro padrão da estimativa da
regressão linear; n o número total de resultados utilizados no cálculo,
i
X
a
concentração adicionada do analito,
( 2),
n
t
α
−
o t de Student para
( )
2
n
−
graus de
liberdade e
0,05
α
=
para analito com LMR definido ou
0,01
α
=
para analitos não
autorizados.
CC
α
foi obtido no modelo de regressão linear (
y a bx
= +
) por
c
y a
CC
b
−
α =
Calculou-se
CC
β
resolvendo-se iterativamente a equação:
65
( )
( )
2
( 2),
2
1
1
c res n
i
CC X
y a bCC s t
n
X X
β
β
β
−
−
= + − + +
−
∑
sendo
( 2),
n
t
β
−
o t de Student para
( )
2
n
−
graus de liberdade e
0,05
β
=
.
Para o cálculo iterativo de
CC
β
, uma primeira estimativa deste parâmetro
(1)
CC
β
foi
obtida pela equação:
(1)
2
L
CC CC X
β α
≈ −
deduzida das equações para determinação de
CC
α
e
CC
β
pelo método de uma única
concentração:
L L L L
CC X zs zs CC X
α α
= + ⇒ = −
e
CC
CC CC zs
α
β α
= +
(EUROPEAN
COMMISSION, 2002), assumindo que
L CC
zs zs
α
≈
. O cálculo foi considerado
convergente quando a diferença das estimativas de
c
y
de interações subseqüentes foi
inferior a
10
1 10
−
×
.
4.9 Análise de resíduos de organofosforados em hortifrutícolas
As análises foram conduzidas nas dependências do Laboratório de Análise de
Resíduos e Agrotóxicos (LARA) do Laboratório de Química Agropecuária (LQA),
Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA), no período de setembro a dezembro de 2006.
Foram coletadas 307 amostras de hortifrutícolas sendo 10 de alface, 52 de
banana, 6 de batata, 16 de cenoura, 14 de chuchu, 14 de jiló, 57 de morango, 12 de
pepino, 15 de pimentão e 111 de tomate.
A amostragem foi realizada pelos funcionários do Instituto Mineiro de
Agropecuária, nas propriedades rurais dos seguintes municípios do estado de Minas
Gerais: Alfredo Vasconcelos; Araguari; Arapuá; Barbacena; Bom Repouso; Caeté;
Cajuri; Capim Branco; Carandaí; Caratinga; Carmo do cajuru; Coimbra; Curvelo; Estiva;
Gouveia; Igarapé; Jaboticatubas; Jaíba; Jequitibá; Lagoa Formosa; Maravilhas; Nova
Ponte; Nova União; Onça do Pitangui; Paracatu; Paraopeba; Patrocínio; Piedade de
Caratinga; Pimenta; Pirapora; Pouso Alegre; Rio Manso; Rio Paranaíba; Sabará;
66
Sacramento; Santa Rita de Minas; Santo Antônio da Serra; São Joaquim de Bicas; São
José da Lapa; Sete Lagoas; Teófilo Otoni; Uberaba; Unai e Vespasiano.
A coleta das amostras foi baseada no Codex Alimentarius, representando bem o
lote do produto; sem preferência por determinadas características como tamanho; cor
ou tipo; evitando toda e qualquer contaminação das amostras pelas mãos roupas ou
qualquer outro material que tenha contato com agrotóxicos. As amostras coletadas
foram acondicionadas em embalagens plásticas e lacradas na presença do proprietário
ou de um representante. Foram enviadas ao laboratório, em caixa de isopor, no
período de 24 horas, acompanhadas de um termo de coleta contendo informações
sobre o produtor e aplicações dos agrotóxicos. Para a cultura do morango e jiló, a
quantidade de amostra coletada foi de 1 kg, assumindo as unidades amostrais de
morango e jiló menores que 25 g. Para as culturas de alface foram coletadas 10
unidades e de banana, batata, cenoura, chuchu, pepino, pimentão, tomate, 1 kg e um
mínimo de 10 unidades amostrais, considerando o peso unitário entre 25 a 250g
(CODEX ALIMENTARIUS, 1999).
Os ingredientes ativos analisados foram: acefato, azinfós etílico, azinfós metílico,
clorfenvinfós, clorpirifós, clorpirifós metílica, diazinona, diclorvós, dimetoato,
dissulfotom, etiona, etoprofós, etrinfós, fenitrotiona, fentoato, forato, malationa,
metamidofós, metidationa, mevinfós, monocrotofós, parationa etílica, parationa-
metílica, pirimifós-metílica, profenofós, perbufós e triazofós.
As extrações, os preparos dos padrões, da curva de calibração no extrato da
matriz, as separações, detecções e quantificações foram baseadas no método
validado.
67
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Escolha dos analitos e matrizes representativas
A seleção das matrizes foi baseada no CODEX ALIMENTARIUS (2003). Foram
escolhidos: a alface (elevado conteúdo de água e clorofila); a banana (elevado
conteúdo de açúcar) e o tomate (elevado conteúdo de água e conteúdo escasso ou
ausência de clorofila). Além disto, também foi levado em consideração, serem as
culturas expressivas no estado de Minas Gerais. A comercialização, no ano de 2006,
na CEASAMINAS, no entreposto Grande BH, de alface; banana e tomate chegou a
785,2; 105.519,1 e 113.551,7 toneladas, respectivamente. O Brasil é o segundo maior
produtor de banana do mundo, com 6,8 milhões de toneladas anuais, sendo que o
Norte de Minas se destaca nesta produção. (AGRIANUAL, 2001; CEASAMINAS, 2007)
5.2 Seletividade
Os cromatogramas típicos obtidos das soluções padrão de OF, amostras
brancas e amostras adicionadas encontram-se representados na Figuras 5 a 10,
indicando seletividade do método. Os tempos de retenção dos organofosforados
estudados estão descritos na Tabela 6.
Tabela 6 – Tempo de retenção dos oito organofosforados estudados
Organofosforados Tempo de retenção
diclorvós 5,95 ± 0,11 min
etoprofós 9,16 ± 0,24 min
dimetoato 12,03 ± 0,33 min
pirimifós metílico 12,58 ± 0,43 min
clorpirifós 13,23 ± 0,46 min
parationa-metílica 13,50 ± 0,44 min
clorfenvinfós 15,79 ± 0,67 min
etiona 20,32 ± 0,77 min
Picos cromatográficos não detectados (sinal/ruído < 3) foram obtidos para todas
as amostras brancas analisadas, não havendo interferências significativas nos tempos
de retenção para os OF pesquisados. Os perfis dos cromatogramas obtidos para
soluções matriz foram muito semelhantes àqueles obtidos para as soluções padrão de
organofosfosforados de concentrações correspondentes. A resolução dos picos indicou
68
capacidade do método em determinar clorfenvinfós, clorpirifós, diclorvós, dimetoato,
etiona, etoprofós, parationa-metílica e pirimifós-metílico sem interferências mútuas.
Figura 6 - Cromatogramas típicos de soluções pool de padrões de organofosforados:
(1) diclorvós; (2) etoprofós; (3) dimetoato; (4) pirimifós; (5)clorpirifós; (6) parationa; (7)
clorfenvinfós e (8) etiona. Resolução > 3,2.
Condições experimentais: temperatura do forno: 80
o
C (espera 1 min), aquecimento de 30
o
C min
-1
até
200
o
C (espera 3 min), aquecimento de 15
o
C min
-1
até 230
o
C (espera 6 min.), aquecimento de 5
o
C min
-1
até 250
o
C (patamar 10 min.); tempo total da corrida: 30 min; modo de injeção: splitless; temperatura do
injetor: 230
o
C; temperatura do detector: 300
o
C; gás de arraste: hélio; fluxo do gás de arraste: 1,0 mL
min
1
; pressão: 12,8 psi; volume de amostra injetada: 1 µL.
(a)
69
1
2
3
4
5
6
7
8
(b)
(c)
Figura 7 – Cromatogramas típicos de amostras brancas das matrizes, alface (a),
banana (b) e tomate (c).
Condições experimentais: temperatura do forno: 80
o
C (espera 1 min), aquecimento de 30
o
C min
-1
até
200
o
C (espera 3 min), aquecimento de 15
o
C min
-1
até 230
o
C (espera 6 min.), aquecimento de 5
o
C min
-1
até 250
o
C (patamar 10 min.); tempo total da corrida: 30 min; modo de injeção: splitless; temperatura do
injetor: 230
o
C; temperatura do detector: 300
o
C; gás de arraste: hélio; fluxo do gás de arraste: 1,0 mL
min
1
; pressão: 12,8 psi; volume de amostra injetada: 1 µL.
70
Figura 8 – Cromatogramas típicos de soluções pool de padrões de organofosforados
na solução matriz de alface. Sendo: (1) diclorvós; (2) etoprofós; (3) dimetoato; (4)
pirimifós; (5)clorpirifós; (6) parationa; (7) clorfenvinfós e (8) etiona. Resolução > 3,2.
Condições experimentais: temperatura do forno: 80
o
C (espera 1 min), aquecimento de 30
o
C min
-1
até
200
o
C (espera 3 min), aquecimento de 15
o
C min
-1
até 230
o
C (espera 6 min.), aquecimento de 5
o
C min
-1
até 250
o
C (patamar 10 min.); tempo total da corrida: 30 min; modo de injeção: splitless; temperatura do
injetor: 230
o
C; temperatura do detector: 300
o
C; gás de arraste: hélio; fluxo do gás de arraste: 1,0 mL
min
1
; pressão: 12,8 psi; volume de amostra injetada: 1 µL.
Figura 9 – Cromatogramas típicos de soluções pool de padrões de organofosforados
na solução matriz de banana. Sendo: (1) diclorvós; (2) etoprofós; (3) dimetoato; (4)
pirimifós; (5)clorpirifós; (6) parationa; (7) clorfenvinfós e (8) etiona. Resolução > 3,2.
Condições experimentais: temperatura do forno: 80
o
C (espera 1 min), aquecimento de 30
o
C min
-1
até
200
o
C (espera 3 min), aquecimento de 15
o
C min
-1
até 230
o
C (espera 6 min.), aquecimento de 5
o
C min
-1
até 250
o
C (patamar 10 min.); tempo total da corrida: 30 min; modo de injeção: splitless; temperatura do
injetor: 230
o
C; temperatura do detector: 300
o
C; gás de arraste: hélio; fluxo do gás de arraste: 1,0 mL
min
1
; pressão: 12,8 psi; volume de amostra injetada: 1 µL.
71
1
2
3
4
5
6
7
8
3
1
2
3
4
5
6
7
8
3
Figura 10 – Cromatogramas típicos de soluções pool de padrões de organofosforados
na solução matriz de tomate. Sendo: (1) diclorvós; (2) etoprofós; (3) dimetoato; (4)
pirimifós; (5)clorpirifós; (6) parationa; (7) clorfenvinfós e (8) etiona. Resolução > 3,2.
Condições experimentais: temperatura do forno: 80
o
C (espera 1 min), aquecimento de 30
o
C min
-1
até
200
o
C (espera 3 min), aquecimento de 15
o
C min
-1
até 230
o
C (espera 6 min.), aquecimento de 5
o
C min
-1
até 250
o
C (patamar 10 min.); tempo total da corrida: 30 min; modo de injeção: splitless; temperatura do
injetor: 230
o
C; temperatura do detector: 300
o
C; gás de arraste: hélio; fluxo do gás de arraste: 1,0 mL
min
1
; pressão: 12,8 psi; volume de amostra injetada: 1 µL.
Figura 11 – Cromatogramas típicos de presença de resíduos de organofosforados em
amostras de hortifrutícolas. Sendo (1) pirimifós-metílico; (2) clorpirifós.
Condições experimentais: temperatura do forno: 80
o
C (espera 1 min), aquecimento de 30
o
C min
-1
até
200
o
C (espera 3 min), aquecimento de 15
o
C min
-1
até 230
o
C (espera 6 min.), aquecimento de 5
o
C min
-1
até 250
o
C (patamar 10 min.); tempo total da corrida: 30 min; modo de injeção: splitless; temperatura do
injetor: 230
o
C; temperatura do detector: 300
o
C; gás de arraste: hélio; fluxo do gás de arraste: 1,0 mL
min
1
; pressão: 12,8 psi; volume de amostra injetada: 1 µL.
72
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
1
2
5.3 Linearidade
Foram aplicados o teste de resíduos padronizados Jacknife com intervalos de
confiança dos resíduos (
0,975;( 2)
n res
t s
−
±
), para a retirada de outliers, nas curvas de
solventes, os números de outliers retirados estão apresentados na Tabela 7. Em três
casos, curva do dia 1 de etoprofós, dia 3 de parationa-metílica e de pirimifós-metílico,
houve indicação de um número maior que quatro outliers; acima do limite máximo de
22,2% dos dezoito dados originais. Nestes casos, foram retirados apenas quatro
outliers e a análise de regressão foi conduzida incluindo os demais.
Tabela 7 - Número de outliers retirados pelo teste de resíduos padronizados Jacknife
nas curvas de solventes obtidas no estudado de linearidade
Ingrediente ativo
Número de outliers retirados
Curva do dia 1 Curva do dia 2 Curva do dia 3
clorfenvinfós 2 – 1
clorpirifós 4 3 2
diclorvós 3 2 4
dimetoato 2 2 4
etiona 1 1 –
etoprofós 4 0 3
parationa-metílica 0 2 4
pirimifós-metílico 3 – 4
(–): nenhum outlier retirado.
Os resultados obtidos nos experimentos para avaliação da linearidade para
clorfenvinfós, clorpirifós, diclorvós, dimetoato, etiona, etoprofós, parationa-metílica e
pirimifós-metílico estão demonstrados nas Tabelas 8 a 15, respectivamente. Foram
confirmados que os resíduos da regressão seguem a distribuição normal, são
independentes e homoscedásticos, permitindo ação mais segura dos testes de
hipóteses de t e F, além do emprego adequado da análise de variância para estimativa
da significância da regressão e do desvio da linearidade. Os coeficientes de correlação
de Ryan-Joiner indicaram que os desvios da normalidade não foram significativos com
p > 0,10, com exceção do dia 1 para etoprofós e parationa, em que esta probabilidade
foi p > 0,05. Autocorrelação dos resíduos da regressão não foi observada (p > 0,10),
visto que as estatísticas de Durbin-Watson demonstraram independência dos mesmos.
A variância dos erros ao longo dos níveis de concentração estimada pelo teste de
73
Levene modificado também não foi significativa (p > 0,05), indicando
homoscedasticidade. Os dados obtidos foram avaliados como bem ajustados ao
modelo linear. Significância da regressão (p < 0,001) e desvios de linearidade não
significativos (p > 0,05) indicaram linearidade na faixa de 12 ng mL
-1
a 92 ng mL
-1
para
as curvas 1, 2 e 3 dos oito OF pesquisados.
Não foram encontrados trabalhos na literatura de métodos para determinação de
resíduos de agrotóxicos que demonstrassem inequivocamente uma relação linear entre
a concentração do analito e a resposta. O emprego do coeficiente de correlação é
comumente utilizado na avaliação da linearidade destes métodos. Entretanto, este
coeficiente não é adequado para demonstrar a linearidade (MULHOLLAND &
HIBBERT, 1997; BURKE, 1998; THOMPSON et al, 2002). O uso de critérios
equivocados para avaliação da linearidade é predominante na literatura de validação
de métodos analíticos (SOUZA & JUNQUEIRA, 2005).
Com base apenas no coeficiente de correlação (r > 0,986), LAMBROPOULOU &
ALBANIS (2003) demonstraram que o método de MEFS por “headspace”, em
combinação com CG-EM, foi eficiente para quantificação dos organofosforados
diazinona, fenitrotiona, fentiona, parationa, bromofós-etílico e etion em amostras de
morango e ameixa, com linearidade na faixa de 50 a 500 µg kg
-1
. Em um método de
análise de OF por CLAE com detector de florescência e reação pós-coluna, assumiu-se
uma relação linear entre a concentração do analito e a área do pico dentro da faixa de
0,016 a 7,0 µg mL
−1
com coeficiente de correlação de 0,9995 (PÉREZ-RUIZ et al,
2005). Um método multiresíduos para análise de OF utilizando detector nitrogênio e
fósforo e captura de elétrons foi considerado linear com coeficientes da correlação de
pelo menos 0,99 (OLIVA et al, 2000).
74
Tabela 8 - Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de clorfenvinfós
(12,24 a 93,84 ng ml
-1
)
Estatística Curva 1 Curva 2 Curva 3
n
16 18 17
R
0,9854 0,9912 0,9695
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
d
2,704 1,784 1,90
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
t
L
-0,979 -0,272 0,874
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
F (1)
1.912,05 3.169,32 834,90
p
< 0,001 < 0,001 < 0,001
F (2)
0,959 1,368 1,405
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
n = número de observações, R = coeficiente de correlação de Ryan-Joiner (Normalidades),
d = estatística de Durbin-Watson (Independência), t
L
= estatística t de Levene (Homoscedasticidade),
F(1) = razão entre variâncias (Regressão), F(2) = razão entre variâncias (Desvio da Linearidade),
p = significância
Tabela 9 - Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de clorpirifós (12,12
a 92,92 ng ml
-1
)
Estatística Curva 1 Curva 2 Curva 3
n
14 15 16
R
0,9865 0,9810 0,9865
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
d
2,539 2,426 1,674
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
t
L
-0,193 -1,334 -0,136
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
F (1)
10.937,15 14.687,56 1.073,28
p
< 0,001 < 0,001 < 0,001
F (2)
0,582 1,038 3,208
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
n = número de observações, R = coeficiente de correlação de Ryan-Joiner (Normalidades),
d = estatística de Durbin-Watson (Independência), t
L
= estatística t de Levene (Homoscedasticidade),
F(1) = razão entre variâncias (Regressão), F(2) = razão entre variâncias (Desvio da Linearidade),
p = significância
Tabela 10 - Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de diclorvós
(12,24 a 93,84 ng ml
-1
)
Estatística Curva 1 Curva 2 Curva 3
n
15 16 14
R
0,9862 0,9711 0,9786
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
d
2,883 2,059 2,325
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
t
L
-1,493 -1,679 0,635
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
F (1)
8.418,02 4.339,67 1.585,61
p
< 0,001 < 0,001 < 0,001
75
F (2)
0,748 2,423 1,361
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
n = número de observações, R = coeficiente de correlação de Ryan-Joiner (Normalidades),
d = estatística de Durbin-Watson (Independência), t
L
= estatística t de Levene (Homoscedasticidade),
F(1) = razão entre variâncias (Regressão), F(2) = razão entre variâncias (Desvio da Linearidade),
p = significância
Tabela 11 - Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de dimetoato
(12,12 a 92,92 ng ml
-1
)
Estatística Curva 1 Curva 2 Curva 3
n
16 16 14
R
0,9695 0,9657 0,9761
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
d
1,887 1,927 2,434
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
t
L
-0,129 0,998 -1,141
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
F (1)
784,72 4.614,39 1.020,12
p
< 0,001 < 0,001 < 0,001
F (2)
1,849 0,143 2,134
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
n = número de observações, R = coeficiente de correlação de Ryan-Joiner (Normalidades),
d = estatística de Durbin-Watson (Independência), t
L
= estatística t de Levene (Homoscedasticidade),
F(1) = razão entre variâncias (Regressão), F(2) = razão entre variâncias (Desvio da Linearidade),
p = significância
Tabela 12 - Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de etiona (12,0 a
92,0 ng ml
-1
)
Estatística Curva 1 Curva 2 Curva 3
n
17 17 18
R
0,9636 0,9785 0,9844
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
d
1,965 1,731 1,824
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
t
L
-0,669 0,280 -1,526
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
F (1)
2.384,22 4.119,76 938,34
p
< 0,001 < 0,001 < 0,001
F (2)
2,070 1,572 1,716
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
n = número de observações, R = coeficiente de correlação de Ryan-Joiner (Normalidades),
d = estatística de Durbin-Watson (Independência), t
L
= estatística t de Levene (Homoscedasticidade),
F(1) = razão entre variâncias (Regressão), F(2) = razão entre variâncias (Desvio da Linearidade),
p = significância
Tabela 13 - Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de etoprofós (12,0
a 92,0 ng ml
-1
)
76
Estatística Curva 1 Curva 2 Curva 3
n
14 17 15
R
0,9471 0,9694 0,9850
p
< 0,10 > 0,10 > 0,10
d
2,407 1,641 2,162
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
t
L
0,909 -0,966 -0,050
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
F (1)
11.667,67 1.468,53 1.121,80
p
< 0,001 < 0,001 < 0,001
F (2)
1,034 0,922 2,928
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
n = número de observações, R = coeficiente de correlação de Ryan-Joiner (Normalidades),
d = estatística de Durbin-Watson (Independência), t
L
= estatística t de Levene (Homoscedasticidade),
F(1) = razão entre variâncias (Regressão), F(2) = razão entre variâncias (Desvio da Linearidade),
p = significância
Tabela 14 - Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de parationa
metílica (12,0 a 92,0 ng ml
-1
)
Estatística Curva 1 Curva 2 Curva 3
n
18 16 14
R
0,9487 0,9621 0,9657
p
< 0,10 > 0,10 > 0,10
d
2,739 2,737 2,271
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
t
L
-1,968 -0,739 -1,109
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
F
2.471,05 18.595,49 881,32
p
< 0,001 < 0,001 < 0,001
F
0,859 0,509 3,626
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
n = número de observações, R = coeficiente de correlação de Ryan-Joiner (Normalidades),
d = estatística de Durbin-Watson (Independência), t
L
= estatística t de Levene (Homoscedasticidade),
F(1) = razão entre variâncias (Regressão), F(2) = razão entre variâncias (Desvio da Linearidade),
p = significância
Tabela 15 - Avaliação da linearidade para as três curvas de solvente de pirimifós
metílico (12,0 a 92,0 ng ml
-1
)
Estatística Curva 1 Curva 2 Curva 3
n
15 18 14
R
0,9791 0,9768 0,9795
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
d
2,831 1,839 2,003
p
> 0,10 > 0,10 > 0,10
t
L
1,354 -1,339 0,072
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
F
10.034,25 4.589,37 919,98
p
< 0,001 < 0,001 < 0,001
F
0,407 0,716 2,202
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05
77
n = número de observações, R = coeficiente de correlação de Ryan-Joiner (Normalidades),
d = estatística de Durbin-Watson (Independência), t
L
= estatística t de Levene (Homoscedasticidade),
F(1) = razão entre variâncias (Regressão), F(2) = razão entre variâncias (Desvio da Linearidade),
p = significância
78
5.4 Efeito do dia
A confirmação do modelo linear, conforme descrito anteriormente, das três
curvas dos padrões de OF indicou a possibilidade de comparação das inclinações e
interseções pelo teste de t para avaliação do efeito do dia. Os valores de t e p,
conforme Tabelas 16 a 23, demonstraram que não houve diferenças significativas
(p > 0,05) quando as interseção, porém houve diferença significativa (p < 0,001) para a
inclinação. Com base nestes resultados, foi possível observar que as curvas de
solvente não fornecem as mesmas respostas nos três dias avaliados, diante disto, as
curvas de padrões não poderão ser reutilizadas para quantificação de resíduos de OF.
Tabela 16 - Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de clorfenvinfós
Estatística Inclinações Interseções
( )
A
t Y
3,78 x10
1
2,50 x 10
-2
p < 0,001 > 0,05
( )
B
t Y
4,90 x 10
1
1,40 x 10
-2
p < 0,001 > 0,05
2
c
s
5,87 x 10
4
( )
A
t Y
= estatística t para contraste (
1 2
A
Y dia dia
= −
);
( )
B
t Y
= estatística t para contraste (
1 2 3
2
B
Y dia dia dia
= + −
), p = significância,
2
c
s
= variância combinada.
Tabela 17 - Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de clorpirifós
Estatística Inclinações Interseções
( )
A
t Y
7,75 3,34 x 10
-2
p
< 0,001 > 0,05
( )
B
t Y
3,90 x 10
1
1,43 x 10
-1
p
< 0,001 > 0,05
2
c
s
6,44 x 10
4
( )
A
t Y
= estatística t para contraste (
1 2
A
Y dia dia
= −
);
( )
B
t Y
= estatística t para contraste (
1 2 3
2
B
Y dia dia dia
= + −
), p = significância,
2
c
s
= variância combinada.
Tabela 18 - Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de diclorvós
Estatística Inclinações Interseções
( )
A
t Y
2,05 x 10
1
1,06 x 10
-1
p < 0,001 > 0,05
( )
B
t Y
8,02 x 10
1
1,03 x 10
-1
79
p
< 0,001 > 0,05
2
c
s
5,22 x 10
4
( )
A
t Y
= estatística t para contraste (
1 2
A
Y dia dia
= −
);
( )
B
t Y
= estatística t para contraste (
1 2 3
2
B
Y dia dia dia
= + −
), p = significância,
2
c
s
= variância combinada.
Tabela 19 - Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de dimetoato
Estatística Inclinações Interseções
( )
A
t Y
1,19 x 10
2
1,45 x 10
-1
p < 0,001 > 0,05
( )
B
t Y
1,07 x 10
2
6,71 x 10
-2
p < 0,001 > 0,05
2
c
s
4,12 x 10
4
( )
A
t Y
= estatística t para contraste (
1 2
A
Y dia dia
= −
);
( )
B
t Y
= estatística t para contraste (
1 2 3
2
B
Y dia dia dia
= + −
), p = significância,
2
c
s
= variância combinada.
Tabela 20 - Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de etiona
Estatística Inclinações Interseções
( )
A
t Y
3,39 x 10
1
1,03 x 10
-2
p
< 0,001 > 0,05
( )
B
t Y
1,55 x 10
2
1,85 x 10
-2
p
< 0,001 > 0,05
2
c
s
2,20 x 10
5
( )
A
t Y
= estatística t para contraste (
1 2
A
Y dia dia
= −
);
( )
B
t Y
= estatística t para contraste (
1 2 3
2
B
Y dia dia dia
= + −
), p = significância,
2
c
s
= variância combinada.
Tabela 21 - Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de etoprofós
Estatística Inclinações Interseções
( )
A
t Y
4,02 x 10
1
6,63 x 10
-2
p < 0,001 > 0,05
( )
B
t Y
8,31 x 10
1
1,39 x 10
-1
p < 0,001 > 0,05
2
c
s
1,15 x 10
5
( )
A
t Y
= estatística t para contraste (
1 2
A
Y dia dia
= −
);
( )
B
t Y
= estatística t para contraste (
1 2 3
2
B
Y dia dia dia
= + −
), p = significância,
2
c
s
= variância combinada.
Tabela 22 - Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de parationa-metilica
80
Estatística Inclinações Interseções
( )
A
t Y
1,68 x 10
1
3,61 x 10
-3
p
< 0,001 > 0,05
( )
B
t Y
1,04 x 10
1
1,05 x 10
-1
p
< 0,001 > 0,05
2
c
s
7,99 x 10
4
( )
A
t Y
= estatística t para contraste (
1 2
A
Y dia dia
= −
);
( )
B
t Y
= estatística t para contraste (
1 2 3
2
B
Y dia dia dia
= + −
), p = significância,
2
c
s
= variância combinada.
Tabela 23 - Avaliação do efeito dia com as três curvas de solvente do cálculo de
linearidade de pirimifós-metilico
Estatística Inclinações Interseções
( )
A
t Y
1,68 x 10
1
3,61 x 10
-3
p < 0,001 > 0,05
( )
B
t Y
1,04 x 10
1
1,05 x 10
-1
p < 0,001 > 0,05
2
c
s
7,99 x 10
4
( )
A
t Y
= estatística t para contraste (
1 2
A
Y dia dia
= −
);
( )
B
t Y
= estatística t para contraste (
1 2 3
2
B
Y dia dia dia
= + −
), p = significância,
2
c
s
= variância combinada.
5.5 Efeito de matriz
Foram aplicados o teste de resíduos padronizados Jacknife, para a retirada de
outliers, nas curvas de solventes e matriz, os números de outliers retirados estão
apresentados na Tabela 24.
Tabela 24 - Número de outliers retirados pelo teste de resíduos padronizados Jacknife
nas curvas de solventes e matriz obtidas no estudado de efeito matriz
Ingrediente
ativo
Número de outliers retirados
alface banana tomate
solvente matriz solvente matriz solvente matriz
clorfenvinfós 3 1 4 2 4 1
clorpirifós 1 4 1 4 3 3
diclorvós 4 2 4 2 4 4
dimetoato 1 4 4 4 3 2
etiona 3 1 2 2 2 4
etoprofós 4 3 4 3 4 -
parationa 2 4 4 4 4 2
pirimifós 2 3 4 4 3 3
(-): nenhum outlier retirado.
81
Foram verificadas para as curvas de solventes e matriz, as premissas relativas
ao MMQO, dos oito analitos para as três culturas. Distribuição normal dos resíduos da
regressão foi observada pelos coeficientes de correlação de Ryan-Joiner e desvios da
normalidade não significativos (p > 0,05). Independência dos resíduos da regressão foi
indicada pelas estatísticas de Durbin-Watson (auto-correlação não significativa,
p > 0,10). Homoscedasticidade foi observada com estatísticas t de Levene não
significativas (p > 0,05). Regressões significativas (p < 0,001) e desvios de linearidade
não significativos (p > 0,05) foram diagnosticados pelos testes de F da análise de
variância. Estes resultados de confirmação do modelo linear indicaram a possibilidade
de comparação das inclinações e interseções pelo teste de t para avaliação dos efeitos
matriz. O teste de F indicou homogeneidade das variâncias dos resíduos das curvas de
solventes e matrizes e a possibilidade do uso do teste de t com variâncias combinadas.
Nas três matrizes estudadas as inclinações e interseções das curvas de
solventes foram comparadas com aquelas estimadas para as curvas de matriz. Na
matriz alface não houve diferença significativa para interseções, com exceção para o
etoprofós (p < 0,05), quanto à inclinação não houve diferença para dimetoato enquanto
os demais agrotóxicos apresentaram diferença significativa (Tabela 25 e 26).
Tabela 25 - Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de alface para etoprofós, pirimifós-metílico, parationa-metílica e
etiona (12 ng mL
-1
a 92 ng mL
-1
)
Estatística etoprofós pirimifós parationa etiona
Comparação da inclinação das curvas
t
a
16,150 3,207 2,57 2,548
p
0,001 0,01 0,05 0,05
GL
25 27 26 28
Comparação da interseção das curvas
t
b
2,470 0,960 0,362 1,317
p
0,05 0,05 0,05 0,05
GL
25 27 26 28
t
a
= estatística t para contrastes entre inclinações, t
b
= estatística t para contrastes entre interseções,
p = significância, GL = graus de liberdade (n
s
+ n
m
- 4), sendo n
s
número de pontos da curva em solvente e
n
m
número de pontos da curva em matriz.
Tabela 26 - Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de alface para clorfenvinfós e diclorvós (12,24 ng mL
-1
a 93,84
ng mL
-1
) e clorpirifós e dimetoato (12,12 ng mL
-1
a 92,92 ng mL
-1
)
82
Estatística clorfenvinfós diclorvós clorpirifós dimetoato
Comparação da inclinação das curvas
t
a
2,109 5,373 2,228 1,010
p
< 0,05 < 0,001 < 0,05 > 0,05
GL
28 26 27 27
Comparação da interseção das curvas
t
b
1,148 1,459 0,199 1,803
p
>0,05 >0,05 >0,05 >0,05
GL
28 26 27 27
t
a
= estatística t para contrastes entre inclinações, t
b
= estatística t para contrastes entre interseções,
p = significância, GL = graus de liberdade (n
s
+ n
m
- 4), sendo n
s
número de pontos da curva em solvente e
n
m
número de pontos da curva em matriz.
Na matriz de banana e tomate não houve diferença significativa para
interseções, com exceção para diclorvós (p < 0,05), quanto à inclinação não houve
diferença para clorpirifós na matriz de banana e clorfenvinfós no tomate, enquanto os
demais agrotóxicos apresentaram diferença significativa (Tabela 27 a 30). Diante disto,
foi possível verificar que não há efeito de matriz para dimetoato em alface, clorpirifós
em banana, clorfenvinfós em tomate, enquanto os demais agrotóxicos apresentaram
efeito de matriz.
Tabela 27 - Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de banana para etoprofós, pirimifós-metílico, parationa-metílica
e etiona (12 ng mL
-1
a 92 ng mL
-1
)
Estatística etoprofós pirimifós parationa etiona
Comparação da inclinação das curvas
t
a
2,982 3,011 5,094 15,42
p < 0,01 < 0,01 < 0,001 < 0,001
GL 25 24 24 28
Comparação da interseção das curvas
t
b
1,196 0,148 0,419 0,836
p > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
GL 25 24 24 28
t
a
= estatística t para contrastes entre inclinações, t
b
= estatística t para contrastes entre interseções,
p = significância, GL = graus de liberdade (n
s
+ n
m
- 4), sendo n
s
número de pontos da curva em solvente e
n
m
número de pontos da curva em matriz.
Tabela 28 - Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de banana para clorfenvinfós e diclorvós (12,24 ng mL
-1
a 93,84
ng mL
-1
) e clorpirifós e dimetoato (12,12 ng mL
-1
a 92,92 ng mL
-1
)
Estatística clorfenvinfós diclorvós clorpirifós dimetoato
Comparação da inclinação das curvas
t
a
4,491 13,33 1,730 7,705
p < 0,001 < 0,001 >0,05 < 0,001
GL 26 26 27 24
Comparação da interseção das curvas
t
b
0,181 2,631 0,420 1,097
p > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05
GL 26 26 27 24
83
t
a
= estatística t para contrastes entre inclinações, t
b
= estatística t para contrastes entre interseções,
p = significância, GL = graus de liberdade (n
s
+ n
m
- 4), sendo n
s
número de pontos da curva em solvente e
n
m
número de pontos da curva em matriz.
Tabela 29 - Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de tomate para etoprofós, pirimifós-metílico, parationa-metílica
e etiona (12 ng mL
-1
a 92 ng mL
-1
)
Estatística etoprofós pirimifós parationa etiona
Comparação da inclinação das curvas
t
a
3,100 3,118 5,108 17,817
p
< 0,01 < 0,01 < 0,001 < 0,001
GL
28 26 26 26
Comparação da interseção das curvas
t
b
0,085 1,127 0,747 1,245
p
> 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
GL
28 26 26 26
t
a
= estatística t para contrastes entre inclinações, t
b
= estatística t para contrastes entre interseções,
p = significância, GL = graus de liberdade (n
s
+ n
m
- 4), sendo n
s
número de pontos da curva em solvente e
n
m
número de pontos da curva em matriz.
Tabela 30 - Comparações entre as inclinações e interseções das curvas dos analitos
no solvente e na matriz de tomate para clorfenvinfós e diclorvós (12,24 ng mL
-1
a 93,84
ng mL
-1
) e clorpirifós e dimetoato (12,12 ng mL
-1
a 92,92 ng mL
-1
)
Estatística clorfenvinfós diclorvós clorpirifós dimetoato
Comparação da inclinação das curvas
t
a
0,877 10,337 3,199 7,482
p
> 0,05 < 0,001 < 0,01 < 0,001
GL
27 24 26 27
Comparação da interseção das curvas
t
b
0,646 2,752 1,400 1,458
p
> 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05
GL
27 24 26 27
t
a
= estatística t para contrastes entre inclinações, t
b
= estatística t para contrastes entre interseções,
p = significância, GL = graus de liberdade (n
s
+ n
m
- 4), sendo n
s
número de pontos da curva em solvente e
n
m
número de pontos da curva em matriz.
Diante destes resultados, foi possível verificar que as curvas de solvente não
fornecem as mesmas respostas que curvas com extrato de amostras contendo
diferentes OF estudados, nas mesmas faixas de concentração, caracterizando efeito de
matriz. Como o ensaio cromatográfico foi realizado com pool destes padrões, todos os
OF e matrizes estudadas para ensaio de recuperação foram quantificados nas curvas
com matriz.
Neste trabalho, o efeito de matriz foi avaliado por comparação das estimativas
dos parâmetros das curvas de calibração obtidas por regressão linear. Segundo
SOBOLEVA et al. (2000), a regressão linear não deve ser utilizada para avaliar o efeito
matriz quando há um números pequeno de pontos de calibração (n < 10), mas este
tratamento é mais sensível que o teste de t, especialmente quando o erro padrão da
diferença das médias das respostas é elevado.
84
Utilizando a técnica de calibração com adição do padrão para um método de
multiresíduos por CL-EM JANSSON et al. (2004) observaram um efeito de matriz
relativamente pequeno para diferentes matrizes, em níveis de adição de 0,01 a 0,5
mg kg
−1
. No presente estudo, o efeito de matriz foi variável, mas para a maioria dos
conjuntos analito e matriz este efeito foi significativo. É importante observar que a
medida do efeito de matriz durante a validação do método fornece apenas uma
indicação preliminar deste parâmetro de desempenho e este deve ser reavaliado com
uma certa freqüência. AMBRUS (2000) afirma que o efeito de matriz vária de dia para
dia durante o uso regular do método, dependendo das condições do sistema de
cromatografia em fase gasosa, sendo que injetores on-column induzem menor efeito de
matriz do que injetores split/splitless. Isto significa que não é possível testar somente
uma vez o efeito de matriz e usar este resultado para cálculos futuros. Além disso, com
base em dados para um analito em uma matriz específica não é possível predizer o
efeito de matriz de outros analitos na mesma matriz.
Foi observado por SCHENCK & LEHOTAY (2000) que o efeito de matriz é maior
em OF que contêm amidas, sulfonas, e/ou ligações P=O como por ex. dimetoato,
ometoato, fosmete, dicrotofós, monocrotófós, malaxona e acefato. Os agrotóxicos que
têm múltiplos de P=O ou amidas, tais como dicrotofós, monocrotofós, e ometoato,
foram afetados mais extremamente do que outros agrotóxicos com somente um único
P=O ou amida. Fosmete e carbofentiona foram mais afetados devido às duas ligações
=O. A quantidade do efeito relativo por grupo funcional pode ser observada
comparando os resultados dos compostos com pequenas diferenças estruturais, tais
como o dimetoato-ometoato, o parationa-paraoxona, e o malationa-malaoxona.
Interessante, que terbufós e os pirazofós deram umas respostas mais elevadas na
matriz em concentrações mais baixas
5.6 Recuperação e precisão
Os resultados de recuperação obtidos dos oito OF nas três matrizes estudadas
foram analisados quanto à presença de outliers pelo teste de Grubbs. O números de
outliers retirados estão apresentados na Tabela 31, não havendo presença de outliers
para o dimetoato nas três matrizes estudadas.
85
Tabela 31 - Números de outliers retirado pelo teste de Grubbs nos resultados de
recuperação obtidos dos organofosforados nas três matrizes estudadas.
Ingrediente
ativo
Número de outliers em cada nível nominal de adição (μg kg
-1
)
alface banana tomate
8 35 62 8 35 62 8 35 62
clorfenvinfós - 3 - 2 - - 2 2 -
clorpirifós 1 - - 2 - 2 2 1 -
diclorvós - 1 - - - - - - 2
etiona 3 2 - 1 - - - 2 -
etoprofós - 1 - - - - - - -
parationa - - - 2 - 1 - - -
pirimifós - 1 - 2 - 2 - - -
(-) : nenhum outlier retirado.
Os resíduos, obtidos pela diferença entre a de recuperação média e os valores
individuais de recuperação obtidos em cada dia, para cada nível de concentração,
apresentaram distribuição normal (p > 0,10) e homoscedasticidade (p > 0,05),
permitindo a estimativa de desvios padrão relativos de repetitividade (DPR
r
) e desvios
padrão relativos de reprodutibilidade parcial (DPR
R
) por análise de variância.
As médias de recuperação alcançadas para amostras de alface adicionadas
entre 8 a 62 μg kg
-1
variaram entre 82,7 a 94,8 % para clorfenvinfós; 91,4 a 92,9 % para
clorpirifós; 76,7 a 94,2 % para diclorvós; 95,7 a 104,0 % para dimetoato; 92,4 a 104,2
% para etiona; 86,7 a 94,2 % para etoprofós; 92,7 a 96,3 % para parationa-metílica e
92,5 a 95,2 % para pirimifós. Os DPR
r
foram de 14,0 a 20,9 % para clorfenvinfós; de
6,2 a 9,7 % para clorpirifós; de 9,7 a 11,8 % para diclorvós; de 6,3 a 13,0 % para
dimetoato; de 11,2 a 14,3 % para etiona; de 6,6 a 10,4 % para etoprofós; de 5,8 a 11,5
% para parationa e 5,3 a 10,2 % para pirimifós. Os valores de DPR
R
estiveram entre
14,9 a 36,2 % para clorfenvinfós; 6,4 a 10,1 % para clorpirifós; 11,6 a 29,6 % para
diclorvós; 7,3 a 13,0 % para dimetoato; 12,8 a 14,3 % para etiona; 7,5 a 17,6 % para
etoprofós; 6,0 a 15,4 % para parationa e 5,7 a 12,0 % para pirimifós (Tabelas 32).
Médias de recuperação aceitáveis foram atingidas na faixa de 8 a 62 μg Kg
-1
para todos
os OF avaliados. Todavia, DPR
r
acima de 14,7 % foram observados para clorfenvinfós
e DPR
R
acima de 22,0 para clorfenvinfós e diclorvós no nível 8
μg kg
-1
. Estes resultados sinalizaram exatidão e precisão do método validado na faixa
de 8 a 62 μg kg
-1
para clorpirifós, dimetoato, etiona, etoprofós, parationa e pirimifós e 35
μg kg
-1
e
62 μg kg
-1
para clorfenvinfós e diclorvós, considerando os critérios de
aceitabilidade determinados.
86
Tabela 32 - Médias de recuperação e desvios padrão relativo, sob condições de
repetibilidade e reprodutibilidade parcial, obtidos para amostras de alface adicionadas
de resíduos de organofosforados em diferentes níveis de concentração
Ingrediente
ativo
Nível nominal de adição
8 μg kg
-1
35 μg kg
-1
62 μg kg
-1
MR DPR
r
DPR
R
MR DPR
r
DPR
R
MR DPR
r
DPR
R
clorfenvinfós 94,8 20,9 36,2 82,7 14,0 14,9 93,2 14,1 16,6
clorpirifós 92,1 9,4 10,1 91,4 9,7 9,8 92,9 6,2 6,4
diclorvós 76,7 11,8 29,6 94,2 9,7 11,6 86,1 14,0 14,1
dimetoato 104,0 6,5 9,5 95,7 13,0 13,0 97,6 6,3 7,3
etiona 104,2 12,8 12,8 96,1 14,3 14,3 92,4 11,2 13,1
etoprofós 86,7 10,4 17,6 94,2 7,2 7,5 92,9 6,6 7,8
parationa 92,7 11,5 15,4 94,0 8,9 9,3 96,3 5,8 6,0
pirimifós 92,5 10,2 12,0 95,2 8,5 8,7 94,3 5,3 5,7
MR = média de recuperação, DPR
r
= desvio padrão relativo de repetitividade, DPR
R
= desvio padrão
relativo de reprodutibilidade parcial. Critérios de aceitabilidade para MR: 70 % a 110 % (para amostras
adicionadas 12 ng mL
-1
), 80 % a 110 % (para amostras adicionadas 52 e 92 ng mL
-1
). Critério de
aceitabilidade para DPR
r
:
≤ 14,7 %. Critério de aceitabilidade para DPR
R
: ≤ 22 %.
Para as amostras de banana as médias de recuperação alcançadas entre os
níveis 8 a 62 μg kg
-1
variaram entre 89,5 a 94,3 % para clorfenvinfós; 87,9 a 95,5 %
para clorpirifós; 93,9 a 109,3 % para diclorvós; 90,1 a 91,4 % para dimetoato; 94,8 a
97,9 % para etiona; 89,8 a 94,7 % para etoprofós; 89,1 a 92,1 % para parationa-
metílica e 88,5 a 90,8 % para pirimifós. Os DPR
r
foram de 7,6 a 19,2 % para
clorfenvinfós; de 7,4 a 10,0 % para clorpirifós; de 14,3 a 30,6 % para diclorvós; de 5,2 a
14,1 % para dimetoato; de 5,5 a 9,7 % para etiona; de 4,7 a 9,3 % para etoprofós; de
8,6 a 13,3 % para parationa e 7,8 a 11,5 % para pirimifós. Os valores de DPR
R
estiveram entre 14,7 a 19,2 % para clorfenvinfós; 10,7 a 13,1 % para clorpirifós; 33,6 a
42,1 % para diclorvós; 10,9 a 20,6 % para dimetoato; 9,3 a 21,4 % para etiona; 10,1 a
13,5 % para etoprofós; 12,4 a 19,4 % para parationa e 11,5 a 14,0 % para pirimifós
(Tabelas 33). Médias de recuperação aceitáveis foram atingidas na faixa de 8 a 62
μg kg
-1
para todos os OF avaliados. Entretanto, DPR
r
acima de 14,7 % foram
observados para clorfenvinfós no nível 8 μg kg
-1
e para diclorvós no nível 8 e 40 μg kg
-1
.
DPR
R
acima de 22,0 % para diclorvós em todos os níveis
. Estes resultados sinalizaram
exatidão e precisão do método validado na faixa de 8 a 62 μg kg
-1
para clorpirifós,
dimetoato, etiona, etoprofós, parationa e pirimifós, 35 μg kg
-1
e
62 μg kg
-1
para
clorfenvinfós e em nenhum nível de diclorvós, considerando os critérios de
aceitabilidade determinados.
87
Tabela 33 - Médias de recuperação e desvios padrão relativo, sob condições de
repetibilidade e reprodutibilidade parcial, obtidos para amostras de banana adicionadas
de resíduos de agrotóxicos em diferentes níveis de concentração
Ingrediente
ativo
Nível nominal de adição
8 μg kg
-1
35 μg kg
-1
62 μg kg
-1
MR DPR
r
DPR
R
MR DPR
r
DPR
R
MR DPR
r
DPR
R
clorfenvinfós 89,5 19,2 19,2 94,3 12,7 14,7 90,3 7,6 17,4
clorpirifós 95,5 10,0 10,7 91,9 11,8 11,8 87,9 7,4 13,1
diclorvós 96,2 30,6 33,6 93,9 23,5 42,1 109,3 14,3 36,5
dimetoato 91,4 12,9 20,6 90,1 14,1 14,5 90,4 5,2 10,9
etiona 94,8 8,7 9,3 97,9 9,7 11,8 94,9 5,5 21,4
etoprofós 94,7 9,3 13,5 90,4 8,4 14,4 89,8 4,7 10,1
parationa 92,1 13,3 17,8 89,1 12,4 12,4 90,1 8,6 19,4
pirimifós 88,9 9,0 13,1 90,8 11,5 11,5 88,5 7,8 14,00
MR = média de recuperação, DPR
r
= desvio padrão relativo de repetitividade, DPR
R
= desvio padrão
relativo de reprodutibilidade parcial. Critérios de aceitabilidade para MR: 70 % a 110 % (para amostras
adicionadas 12 ng mL
-1
), 80 % a 110 % (para amostras adicionadas 52 e 92 ng mL
-1
). Critério de
aceitabilidade para DPR
r
:
≤ 14,7 %. Critério de aceitabilidade para DPR
R
: ≤ 22 %.
Nas amostras de tomate as médias de recuperação alcançadas entre os níveis 8
a 62 μg kg
-1
variaram entre 81,7 a 84,3 % para clorfenvinfós; 85,1 a 86,5 % para
clorpirifós; 40,5 a 86,7 % para diclorvós; 84,9 a 94,0 % para dimetoato; 81,0 a 88,4 %
para etiona; 88,0 a 89,0 % para etoprofós; 86,4 a 92,5 % para parationa-metílica e 83,4
a 92,7 % para pirimifós. Os DPR
r
foram de 7,4 a 11,8 % para clorfenvinfós; de 11,4 12,9
% para clorpirifós; de 10,8 a 82,8 % para diclorvós; de 10,1 a 13,3 % para dimetoato;
de 9,9 a 10,8 % para etiona; de 6,3 a 10,4 % para etoprofós; de 8,2 a 13,1 % para
parationa e 8,8 a 12,9 % para pirimifós. Os valores de DPR
R
estiveram entre 13,7 a
19,7 % para clorfenvinfós; 12,9 a 19,3 % para clorpirifós; 33,8 a 87,4 % para diclorvós;
11,8 a 17,2 % para dimetoato; 10,3 a 20,7 % para etiona; 10,4 a 16,9 % para etoprofós;
10,3 a 17,7 % para parationa e 11,0 a 17,7 % para pirimifós (Tabelas 34). Médias de
recuperação aceitáveis foram atingidas na faixa de 8 a 62 μg kg
-1
para clorfenvinfós,
clorpirifós, dimetoato, etiona, etoprofós, parationa e pirimifós e 35 e 62 μg kg
-1
para
diclorvós. DPR
r
acima de 14,7 % foram observados para diclorvós no nível 8 8 e 35 μg
kg
-1
e DPR
R
acima de 22,0% para diclorvós em todos os níveis
. Estes resultados
sinalizaram exatidão e precisão do método validado na faixa de 8 a 62 μg kg
-1
para
clorfenvinfós, clorpirifós, dimetoato, etiona, etoprofós, parationa e pirimifós e em
nenhum nível de diclorvós, considerando os critérios de aceitabilidade determinados.
88
Tabela 34 - Médias de recuperação e desvios padrão relativo, sob condições de
repetibilidade e reprodutibilidade parcial, obtidos para amostras de tomate adicionadas
de resíduos de agrotóxicos em diferentes níveis de concentração
Ingrediente
ativo
Nível nominal de adição
8 μg kg
-1
8 μg kg
-1
8 μg kg
-1
MR DPR
r
DPR
R
MR DPR
r
DPR
R
MR DPR
r
DPR
R
clorfenvinfós 84,1 11,1 19,7 84,3 7,4 13,7 81,7 11,8 16,5
clorpirifós 85,1 12,8 19,3 89,5 11,4 14,7 86,5 12,9 12,9
diclorvós 40,5 82,8 87,4 86,7 31,6 33,8 81,0 10,8 40,4
dimetoato 93,3 13,3 17,2 94,0 10,1 11,8 84,9 12,4 14,7
etiona 81,0 9,9 20,7 88,4 10,8 16,5 84,5 10,2 10,3
etoprofós 88,1 6,3 16,9 88,0 13,1 13,8 89,0 10,4 10,4
parationa 87,5 8,2 17,7 92,5 11,5 13,1 86,4 10,3 10,3
pirimifós 83,4 8,8 17,4 92,7 12,9 16,2 87,5 11,0 11,0
MR = média de recuperação, DPR
r
= desvio padrão relativo de repetitividade, DPR
R
= desvio padrão
relativo de reprodutibilidade parcial. Critérios de aceitabilidade para MR: 70 % a 110 % (para amostras
adicionadas 12 ng mL
-1
), 80 % a 110 % (para amostras adicionadas 52 e 92 ng mL
-1
). Critério de
aceitabilidade para DPR
r
: ≤ 14,7 %. Critério de aceitabilidade para DPR
R
: ≤ 22 %.
Como não houve precisão e exatidão do método para o OF diclorvós, as
amostras que contêm o analito não puderam ser quantificadas. Entretanto, como
afirmam Thompson et al. (2002), os resultados abaixo do LQ não são desprovidos de
significado e podem se adequar ao propósito de uso do método. O diclorvós não é
autorizado para a cultura de batata e de tomate e, portanto, não podem ser
encontrados nestas culturas. Assim, a simples detecção deste inseticida será suficiente
para considerar as amostras não-conformes.
A faixa da recuperação média encontrada neste estudo (76,7% a 104,2%) foi
superior à obtida por GELSOMINO et al. (1997) para um método de multiresíduos para
análise OF utilizando colunas narrow-bore com detectores de captura de elétrons.
Esses autores encontraram recuperações em trono de 70 a 108% com níveis de adição
de padrões de 40 a 100 µg kg
-1
para amostras de cenoura, melão e tomate. Porém,
para clormefós foi encontrada uma recuperação de 51,5%. Recuperações entre 83 a
118% e DPR de 10 a 13% (n = 54) foram encontrados por KRISTENSON et al (2001)
para a determinação de uma variedade de OF em laranjas, em níveis de concentração
abaixo dos LMR . Médias de recuperação entre 70 e 116% foram obtidas para os níveis
de adição de 0,01 e 0,1 mg kg
−1
, com valores associados de DPR ≤ 20%, para vinte OF
em pêssego, pimentão e uva. (PATEL et al., 2004).
Trabalhando com outros analitos representativos, SIMPLÍCIO & VILAS BOAS
(1999) encontraram faixas de recuperação semelhantes ao presente estudo. Para
89
concentrações entre 25 e 250 µg kg
-1
, quantificando diazinona, fenitrotiona, fentiona,
quinafós triazofós, fosalona e pirazofós em frutas e sucos de frutas esses autores
encontraram médias de recuperação de 75,9% a 102,6% para sucos e 70% a 99%
para frutas, mas para pirazofós a recuperação foi de 53%. Os DPR, para análises em
triplicata, das amostras fortificadas com 25 µg kg
-1
de cada OF não eram maiores que
8,7%.
Utilizando detector semelhante ao presente estudo, OLIVA et al, (2000)
encontraram recuperação de 80 a 108% e desvios padrão relativos não maiores que
16%, para amostras de uva e vinho adicionadas de padrão, utilizando um método
multiresíduos para análise de OF. E também BRITO et al (2002) obtiveram
recuperações médias entre 75 a 104% e desvios padrões relativos entre 1,4 e 11,5%
para a determinação do malationa, parationa-metílica e monocrotofós em amostras de
água de coco adicionadas em dois níveis de concentração (0,01 e 12,0 mg kg
-1
). Cada
análise da recuperação foi repetida pelo menos cinco vezes.
5.7 Limites de detecção, quantificação, decisão e capacidade de
detecção
O LD do método para as três matrizes estudadas foi estabelecido como 5 μg kg
-1
para clorpirifós, dimetoato, etiona, etoprofós, parationa e pirimifós, visto que foram
detectadas com médias de sinal/ruído ≥ 3 nas amostras adicionadas. Para clorfenvinfós
e diclorvós foi definido um limite de detecção de 8 μg kg
-1
.
Os valores de LD observados neste estudo foram superiores a 2 µg kg
-1
obtido
por SIMPLÍCIO & BOA (1999) em pêras e suco de fruta na análise de diazinona,
fenitrotiona, fentiona, quinalfós, triazofós, fosalona e pirazofós. E também, MOL et al
(2003) em análise de OF em amostras de repolho e uva encontraram LD entre 1 e 4
µg kg
-1
. Entretanto, para a determinação de OF em laranjas, em níveis de concentração
abaixo dos LMR na União Européia, KRISTENSON et al. (2001) encontraram LD
variando de 4 a 90 µg kg
-1
. BRITO et al, (2002) obtiveram LD entre 0,002 a 2,0 mg kg
-1
para a determinação do malationa, parationa-metílica e monocrotofós em amostras de
água de coco utilizando detector termiônico específico.
O LQ, correspondente ao menor nível de concentração no quais os
experimentos indicaram exatidão e precisão do método, foi de 8 μg kg
-1
para clorpirifós,
dimetoato, etiona, etoprofós, parationa e pirimifós nas matrizes alface, banana e
90
tomate. O clorfenvinfós apresentou um limite de 8 μg kg
-1
para tomate, 35
μg kg
-1
para
alface e 40 μg kg
-1
para banana. Entretanto, diclorvós apresentou um limite de
35 μg kg
-1
para alface e as matrizes banana e tomate não houve possibilidade de
estabelecer o LQ, pois não houve exatidão e/ou precisão nos limites estudados.
Limites de quantificação semelhantes ao presente estudo foram obtidos por
OLIVA et al., (2000) para um método de análise de OF em vinho utilizando o detector
nitrogênio e fósforo. Os limites variaram 10 a 50 µg kg
-1
, que estão abaixo dos LMR
estabelecido pela legislação da União Européia, com exceção para metidationa e
quinalfós que estiveram com LQ equivalentes aos LMR (50 µg kg
-1
). E também,
LAMBROPOULOU & ALBANIS (2003), em análises de diazinona, fenitrotiona, fentiona,
parationa-etílica, bromofós e etiona em amostras de morango e cereja, utilizando
método de microextração em fase sólida e detecção por CG – EM, obtiveram LQ entre
17,3 a 35,7 µg kg
-1
com amostras adicionadas em níveis de concentração de
50 µg kg
-1
. Um método utilizando o CL – EM para análise dos OF: acefato,
metamidofós, monocrotofós, ometoato e vamidationa, em amostras de repolho e uva,
foram encontrados LQ de 10 µg kg
-1
em nível de adição de 10 e 500 µg kg
-1
(MOL et al,
2003).
Com base nos resultados dos testes de recuperação, NAKAZAWA et al (2004)
encontraram limites de quantificação estimados em 5 µg kg
-1
para 2,4-D, diclorvós e
carbaryl e 1 µg kg
-1
para malationa, em um método simples e rápido para a análise
simultânea dos 5 agrotóxicos em amostras de frutas cítricas, adicionadas em
concentrações à metade do LMR estabelecidos no Japão, utilizando espectrometria de
massas.
Os valores de CCα e CCβ encontrados para os analitos estudados nas
diferentes matrizes estão apresentados na Tabela 35. O LMR adotado no cálculo
destes parâmetros foi o estabelecido na legislação (ANVISA, 2006c). Para pirimifós em
alface e banana considerou-se um LMR de 5 mg kg
-1
. Para clorpirifós em banana, foi
adotado o LMR de 0,01 mg kg
-1
e para dimetoato e etiona em tomate os valores de
LMR utilizados foram de 1,0 mg kg
-1
e 2,0 mg kg
-1
, respectivamente. Os demais OF
pesquisados não são autorizados e, portanto, seu LMR foi considerado igual a zero
para os cálculos de CCα e CCβ.
Tabela 35 - Valores de limites de decisão e capacidade de detecção
91
Ingrediente
ativo
alface banana tomate
CCα CCβ CCα CCβ CCα CCβ
(µg kg
-1
) (µg kg
-1
) (µg kg
-1
)
clorfenvinfós 20,0 31,8 28,1 43,1 16,2 27,1
clorpirifós 7,1 11,9 16,9 13,9 12,6 21,1
diclorvós 18,9 30,2 44,4 69,1 40,9 65,6
dimetoato 9,3 15,5 11,3 19,5 1100 1100
etiona 13,1 22,0 17,2 28,9 2100 2200
etoprofós 6,8 11,5 10,7 17,9 10,4 17,5
parationa 6,7 11,3 16,1 26,9 10,9 18,3
pirimifós 5100 5300 5200 5500 11,7 19,7
CCα = limite de decisão, CCβ = capacidade de detecção.
Na literatura, são raros os artigos que tratam de resíduos de agrotóxicos que
incluem o cálculo de CCα e CCβ, apesar da importância da determinação desses
parâmetros (EUROPEAN COMMISSION, 2002; ANTIGNAC et al., 2003; VAN
OVERMEIRE, 2004).
AMBRUS (2000) descreve o cálculo para dimetoato e clorotalonil em maça e os
valores encontrados foram de 15,7 e 38,1 pg para CCα e CCβ, respectivamente.
Entretanto, o procedimento utilizado não se baseou em curvas de calibração, mas no
emprego de amostras brancas. A forma de cálculo empregada é diferente da adotada
no presente trabalho, o que dificulta uma análise comparativa.
5.8 Análise de resíduos de organofosforados em hortifrutícolas
Das 309 amostras analisadas, 57 apresentou resíduos de OF, o que significa
18,4 % do total. Sendo: 1 (10%) amostra de alface, 3 (50%) de batata, 1 (6,25%) de
cenoura, 4 (28,6%) de jiló, 8 (13,6%) de morango, 2 (16,7%) de pepino, 4 (26,7%) de
pimentão e 34 (30,6%) de tomate. Nas amostras de banana e chuchu os resíduos
estavam abaixo do LD (Figura 21).
92
0
0
10
50
6,3
28,6
13,6
16,7
26,7
30,6
0
10
20
30
40
50
60
Alface Banana Batata Cenoura Chuchu Jiló Morango Pepino Pimentão Tomate
Frequência
Figura 12 – Freqüência de resíduos de organofosforados encontrados nas amostras de
hortifrutícolas
Foram consideradas amostras em desacordo com a legislação vigente quando
apresentaram presença de resíduos acima do LMR e resíduos de uso não autorizado
para a cultura (ANVISA, 2006c).
Das amostras que apresentaram resíduos, 53 estavam em desacordo com a
legislação vigente, representando 17,2% em relação ao total analisado. As amostras
que apresentaram percentuais acima de 20% de resíduos em desacordo, em ordem
decrescente, foram as culturas de tomate, jiló, e pimentão. Na avaliação dos resultados
obtidos, resíduos de uso não autorizado foram identificados nas culturas de alface,
cenoura, jiló, morango, pepino, pimentão e tomate e resíduos acima do LMR foram
identificados nas amostras de tomate. Nas amostras de tomate, foram detectados
resíduos de uso não autorizado e acima do LMR (Tabela 34).
Tabela 36 - Amostras com resíduos e em desacordo com a legislação
Amostra
Números de amostras
Total Abaixo do LMR > LMR Não autorizados
Alface 10 - - 1
Banana 52 - - -
Batata 6 3 - -
Cenoura 16 - - 1
Chuchu 14 - - -
Jiló 14 - - 4
Morango 59 - - 8
Pepino 12 - - 2
Pimentão 15 - - 4
Tomate 111 1 03 30
Total 309 4 03 50
93
LMR: Limite Máximo de Resíduo (ANVISA, 2006), (-): não encontrado
Entre as amostras analisadas, o ingrediente ativo encontrados em uma amostra
de alface, foi acefato na concentração de 0,54 mg kg
-1
, sendo este agrotóxico não
autorizado para a cultura. Na amostra de batata das seis analisadas, três apresentaram
resíduos de clorpirifós nas concentrações de: 0,01; 0,02 e 0,10 mg kg
-1
, abaixo do limite
permitido que é de 1,0 mg kg
-1
. Das 16 amostras analisadas de cenoura uma
apresentou clorpirifós na concentração de 0,01 mg kg
-1
, sendo este não autorizado
para a cultura,. A amostra de jiló, das 14 analisadas, uma apresentou clorpirifós na
concentração de 0,02 mg kg
-1
, duas metamidofós na concentração de 0,02 e 0,18
mg kg
-1
, e uma acefato na concentração de 0,18 mg kg
-1
, todos não autorizado para a
cultura. O produto agrícola pepino das 12 analisadas, uma apresentou clorpirifós e
outra acefato, ambos não autorizado para a cultura, na concentração de 0,02 mg kg
-1
.
Das 15 amostras de pimentões, três apresentaram metamidofós nas concentrações de:
0,05; 0,02 e 0,03 mg kg
-1
e uma apresentou acefato na concentração de 0,04 mg kg
-1
,
agrotóxicos não autorizado para a cultura.
Nas amostras de morangos os ingredientes ativos encontrados estão descritos
na Figura 22, sendo todos não autorizados para a cultura. As concentrações de acefato
foram de 0,40 e 1,05 mg kg
-1
, de clorpirifós 0,01 e 0,04 mg kg
-1
, de metamidofós 0,02;
0,06 e 0,61 mg kg
-1
e parationa-metílca 0,04; 0,06 e 0,19 mg kg
-1
.
Em monitoramento prévio, realizado em Minas Gerais em amostras coletadas na
CEASAMINAS, também foram encontrados resíduos de inseticidas organofosforados
não autorizados para a cultura do morango. Em 2003, foram detectados Acefato em 4
amostras e Metamidofós em 5 amostras. No ano de 2004 Acefato, Clorpirifós,
Dimetoato e Metamidofós foram detectados em 3, 1, 1 e 4 amostras, respectivamente
(AMARAL & ALTOÉ, 2006). Das 371 amostras de morango coletadas em 5 províncias
no sudeste da Polônia, 76,1% não apresentaram resíduos e 23,9% apresentaram
resíduos com níveis abaixo do permitido (ROGOZINSKA et al. 2001). Na Turquia,
resíduos dos inseticidas OF foram pesquisados em 32 amostras de morangos, 71,9%
apresentaram resíduos e 53,1% excederam o LMR e os ingredientes ativos
encontrados foram diazinona, metidationa, parationa e clorpirifós. Em 21 amostras
apresentaram resíduos de diclorvós, sendo que 15 excederam o LMR
(DURMUSOGLU, 2003). Deve-se notar que embora os resíduos de parationa e
clorpirifós encontrados nas amostras de morango de Minas Gerais também tenham
94
sido detectados nas amostras de morando da Turquia, o tipo de infração foi diferente,
uma vez que estes agrotóxicos não são proibidos na Turquia para esta cultura. E
também que continua sendo encontrado OF não autorizados quando comparado os
resultados de AMARAL & ALTOÉ, 2006.
2
2
3
3
0 1 2 3 4 5
acefato
clorpirifós
metamidofós
parationa
Organofosforados
Número de amostras
Figura 13 - Número de amostras de morango com de resíduos de organofosforados
não autorizado para a cultura
Para a amostra de tomate os ingredientes ativos encontrados estão
apresentados na Figura 23, com as faixas de concentrações variando de: 0,06 a 1,08
para acefato, sendo 0,5 mg kg
-1
o LMR, de 0,01 a 0,07 mg kg
-1
para clorpirifós, de 0,04
a 0,14 mg kg
-1
para metamidofós. A concentração de fentoato foi de 0,2 mg kg
-1
sendo
que o LMR é de 0,1 mg kg
-1
e de profenofós foi de 0,14 mg kg
-1
, sendo 1,0 mg kg
-1
o
LMR.
95
11
1
2
1
14
5
0 5 10 15
acefato
clorpirifós
fentoato
metamidofós
Profenofós
Organofosforados
Número de amostras
AB
AC
NA
Figura 14. Número de amostras de tomate com resíduos de organofosforados
NA = produto não autorizado, AC = produto acima do permitido e AB = produto abaixo do permitido
Entre as infrações constatadas nas amostras coletadas para análise de OF, o
maior número se deveu à presença de produtos não autorizados para as culturas. Das
309 amostras coletadas, 16,2% apresentaram resíduos de OF não autorizado para a
cultura e 1,0% apresentaram limites acima do permitido.
Os resultados apresentados neste trabalho não diferem de outros estudos de
monitoramento existentes no Brasil. No PARA, das amostras que estavam em
desacordo com a legislação, 83,4% eram de agrotóxicos não autorizados para a cultura
e 16,6% estavam com o LMR acima do permitido (ANVISA, 2006b). No monitoramento
realizado em São Paulo em amostras coletadas no CEAGESP, 22% das amostras
foram detectados resíduos de ingredientes ativos não registrados para a cultura e 1%
das amostras apresentou resíduos acima dos LMR (GORENSTEIN, 2004). No estado
do Paraná, em 2000, 31,62% apresentaram resíduos não autorizados para a cultura de
morango. (SCUCATO et al., 2001).
É importante observar que as infrações cometidas no Brasil são diferentes das
encontradas em outros países. No Brasil estas se devem a resíduos não autorizados
para a cultura analisadas enquanto nos outros paises por estarem acima do LMR e
também número de infrações é menor. De 2125 amostras de produtos vegetais
analisadas na Polônia, aproximadamente 0,9% excederam LMR (SADIO, 2003). Das
32 amostras de maças analisadas, na Turquia, 19,2% apresentaram residuos com
limites acima do permitido, sendo o malationa, azinfós metil, metidationa e clorpirifós os
ingredientes ativos encontrados. (DURMUSOGLU, 2003). Amostras de alimentos
96
infantis, obtidos de supermercados em Denver, Filadélfia e em São Francisco, todos os
níveis encontrados estavam abaixo do LMR (BRIGDES, 1995). OF analisados em
amostras coletadas na China, os níveis médios do dimetoato e parationa nas frutas
excederam os LMR permitidos pelo Ministério de Saúde da China (BAI et, 2005).
Devido aos efeitos toxicológicos provocados pelos agrotóxicos, faz-se
necessário o acompanhamento e a quantificação desses produtos na água, solo,
alimentos e atmosfera, como pressuposto para a rastreabilidade e proteção da saúde
do homem e do meio ambiente (CODEX ALIMENTARIUS, 2007). Nesse sentido, os
resultados do monitoramento apresentados neste trabalho buscam contribuir para a
segurança alimentar no País e proteção de nosso ecossistema. Além disso, do ponto
de vista econômico, o Brasil tem sido penalizado, em função da globalização dos
mercados e do grau de exigência de alguns importantes ou potenciais países
importadores, quando resíduos desses compostos são encontrados em alimentos. E
também, o mercado interno, devido ao grau de informação atual, tem sido cada vez
mais exigente, definindo os preços e a aceitação comercial dos produtos
97
6 CONCLUSÕES
O procedimento utilizado foi adequado para validação intralaboratorial do
método de multiresíduos de OF. Os parâmetros de desempenho avaliados indicaram
adequação para uso na análise de resíduos de OF em hortifrutícolas, atendendo aos
limites regulamentados pelo ANVISA (2006).
A linearidade do método foi obtida na faixa de 12 a 92 ng mL
-1
para os oito OF
estudados. Houve comprovação de efeito do dia nos estudos linearidade. Comprovou-
se o efeito de matriz para os OF nas três culturas estudados, porém não houve
evidencia de efeito de matriz para o dimetoato em alface, clorpirifós em banana e
clorfenvinfós em tomate.
O método apresentou exatidão e precisão aceitáveis, na faixa do LQ, com
exceção de diclorvós em que não houve precisão nos níveis de adição estudados para
as matrizes banana e tomate.
Os limites de detecção e quantificação foram, respectivamente, 5,0 µg kg
-1
e
8,0 µg kg
-1
para clorpirifós, dimetoato, etiona, etoprofós, parationa e pirimifós, enquanto
LD para clorfenvinfós e diclorvós foi de 8,0 µg kg
-1
. Os limites de quantificação foram de
8,0; 35,0 e 40,0 µg kg
-1
para clorfenvinfós nas matrizes tomate, alface e banana,
respectivamente, e de 35,0 µg kg
-1
para diclorvós em alface. Os limites de decisão
variaram de 6,7 a 5100 µg kg
-1
e a capacidade de detecção de 11,3 a 5500 µg kg
-1
.
Das 309 amostras analisadas, 18,4% apresentaram resíduos de OF, sendo que
13,6% em desacordo com a legislação vigente. Entre as amostras em desacordo,
92,9% apresentaram resíduos de OF não autorizado para a cultura e 7,1%
apresentaram limites acima do permitido. Entre as infrações constatadas nas amostras
de produtos agrícolas coletadas em diferentes municípios do estado de Minas Gerais
para análise de OF, o maior número se deveu à presença de produtos não autorizados
para as culturas.
98
7 SUGESTÕES
• Aplicar o protocolo de validação utilizado neste trabalho para outras matrizes
representativas, com aquelas com alto teor de gordura, frutas cítricas e grãos.
• Validar métodos de ensaio para outros grupos de agrotóxicos, tais como, os
inseticidas piretróides, inseticidas organoclorados e fungicidas.
• Ampliar a abrangência da amostragem e dos grupos de agrotóxicos pesquisados
nos estudos de ocorrência de resíduos de agrotóxicos em produtos agrícolas.
99
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(109 referencias)
111
APÊNDICES
112
APÊNDICES A - GRÁFICOS DOS RESÍDUOS DA REGRESSÃO DAS TRÊS
CURVAS DE SOLVENTES COM INDICAÇÕES DOS RESPECTIVOS
OUTLIERS DIAGNOSTICADOS PELO TESTE DE RESÍDUOS
PADRONIZADOS DE JACKNIFE
Clorfenvinfós
Gráfico de resíduos(dia 1)
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos - Dia 2
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de res íduos Dia 3
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Clorpirifós
Gráfico de resíduos Dia 1
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos Dia 2
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos Dia 3
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Diclorvós
Gráfico de resíduos Dia 1
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Conce ntração
ei
Gráfico de resíduos Dia 2
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Conce ntração
ei
Gráfico de res íduos Dia 3
-1700
-1300
-900
-500
-100
300
700
1100
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
113
Dimetoato
Gráfico de resíduos Dia 1
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos Dia 2
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos dia 3
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Etiona
Gráfico de resíduos Dia 1
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos Dia 2
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos Dia 3
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Etprofós
Gráfico de resíduos Dia 1
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos Dia 2
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Parationa-metílica
114
Gráfico de resíduos Dia 1
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos Dia 2
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos Dia 3
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Pirimifós-metílico
Gráfico de resíduos Dia 1
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos Dia 2
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
Gráfico de resíduos Dia 3
-1700
-900
-100
700
1500
0 20 40 60 80 100 120
Concentração
ei
115
APÊNDICES B – GRÁFICOS DA AVALIAÇÃO DA NORMALIDADE DOS
RESÍDUOS PELO TESTE DE RYAN-JOINER DAS TRÊS CURVAS DE
SOLVENTE.
Clorfenvinfós
Gráfico Q-Q - Dia 1
-2
-1
0
1
2
-500 0 500
Valor Obs ervado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 2
-3
-2
-1
0
1
2
3
-400 -200 0 200 400
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q Dia 3
-2
-1
0
1
2
-1000 -500 0 500 1000
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Clorpirifós
Gráfico Q-Q - Dia 1
-2
-1
0
1
2
-400 -200 0 200 400
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 2
-2
-1
0
1
2
-400 -200 0 200 400
Valor Obse rvado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 3
-2
-1
0
1
2
-1000 -500 0 500 1000
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Diclorvós
Gráfico Q-Q - Dia 1
-2
-1
0
1
2
-400 -200 0 200 400
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q Dia 2
-2
-1
0
1
2
3
-500 0 500
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 3
-2
-1
0
1
2
-500 0 500
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Diimetoato
116
Gráfico Q-Q - Dia 1
-2
-1
0
1
2
-500 0 500 1000
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 2
-2
-1
0
1
2
-400 -200 0 200 400
Valor Obs ervado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 3
-2
-1
0
1
2
-1000 -500 0 500
Valor Obse rvado
Valor Normal
esperado
Etiona
Gráfico Q-Q - Dia 1
-2
-1
0
1
2
-1000 -500 0 500 1000
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q- Dia 2
-2
-1
0
1
2
-600 -300 0 300 600
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 3
-3
-2
-1
0
1
2
3
-2000 -1000 0 1000 2000
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Etoprofós
Gráfico Q-Q - Dia 1
-3
-2
-1
0
1
2
-400 -200 0 200
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 2
-3
-2
-1
0
1
2
3
-2000 -1000 0 1000
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 3
-2
-1
0
1
2
-1000 -500 0 500 1000
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Parationa-metílica
Gráfico Q-Q - Dia 1
-3
-2
-1
0
1
2
3
-500 0 500 1000
Valor Obse rvado
Gráfico Q-Q - Dia 2
-2
-1
0
1
2
-200 0 200
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 3
-2
-1
0
1
2
3
-1000 -500 0 500 1000
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Pirimifós-metílico
117
Gráfico Q-Q - Dia 1
-2
-1
0
1
2
-400 -200 0 200 400
Valor Observado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 2
-3
-2
-1
0
1
2
3
-1000 -500 0 500
Valor Obse rvado
Valor Normal
esperado
Gráfico Q-Q - Dia 3
-2
-1
0
1
2
-1000 -500 0 500 1000
Valor Observado
Valor Normal
esperado
118
APÊNDICES C – GRÁFICOS DA AVALIAÇÃO DE AUTOCORRELAÇÃO DOS
RESÍDUOS PELO TESTE DURBIN-WATSON DAS TRÊS CURVAS DE
SOLVENTE.
Clorfenvinfós
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Clorpirifós
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Diclorvós
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dimetoato
Dia 1
Dia 2
Dia 3
119
Etiona
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Etoprofós
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Parationa-metílica
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Pirimifós-metílico
Dia 1
Dia 2
Dia 3
120
APÊNDICES D – GRAFICOS DA AVALIAÇÃO DA HOMOGENEIDADE DA
VARIÂNCIA PELO TESTE DE LEVENE MODIFICADO DAS TRÊS CURVAS
DE SOLVENTE.
Clorfenvinfós
Dia 1
0
50
100
150
200
250
300
350
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 2
0
50
100
150
200
250
300
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 3
0
100
200
300
400
500
600
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Clorpirifós
Dia 1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 2
0
50
100
150
200
250
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 3
0
100
200
300
400
500
600
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Diclorvós
Dia 1
0
50
100
150
200
250
300
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 2
0
50
100
150
200
250
300
350
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 3
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dimetoato
Dia 1
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 2
0
50
100
150
200
250
300
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 3
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
121
Etiona
Dia 1
0
100
200
300
400
500
600
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 2
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 3
0
200
400
600
800
1000
1200
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Etoprofós
Dia 1
0
50
100
150
200
250
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 2
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 3
0
100
200
300
400
500
600
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Parationa-metílica
Dia 1
0
100
200
300
400
500
600
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 2
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 3
0
100
200
300
400
500
600
700
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Pirimifós-metílico
Dia 1
0
50
100
150
200
250
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 2
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Grupo 1 Grupo 2
Desvio médio
Dia 3
0
100
200
300
400
500
600
Grupo 1 Grupo 2
122
APÊNDICES E – GRÁFICOS DA CURVAS DE REGRESSÃO LINEAR, APÓS
A RETIRADA DOS OUTLIERS.
Clorfenvinfós
Gráfico Final da
Linearidade Dia 1
y = 77,914x - 121,35
R
2
= 0,9927
0
3000
6000
9000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
dia 2
y = 82.34x - 234.76
R
2
= 0.995
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Line aridade
Dia 3
y = 82,256x - 51,74
R
2
= 0,9824
0
2500
5000
7500
10000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Clorpirifós
Gráfico Final da Linearidade
Dia 1
y = 142.75x - 215.76
R
2
= 0.9989
0
4000
8000
12000
16000
0 20 40 60 80 100
Conce ntração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 2
y = 136.36x - 242.64
R
2
= 0.9991
0
3000
6000
9000
12000
15000
0 50 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 3
y = 116,28x - 115,94
R
2
= 0,9871
0
4000
8000
12000
0 20 40 60 80 100
Conce ntração
Resposta
Diclorvós
Gráfico Final da Linearidade
Dia 1
y = 136.14x - 354.9
R
2
= 0.9985
0
6000
12000
18000
0 50 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 2
y = 118,39x - 294,47
R
2
= 0,9968
0
3000
6000
9000
12000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 3
y = 112,19x - 119,55
R
2
= 0,9925
0
4000
8000
12000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Dimetoato
Gráfico Final da Linearidade
Dia 1
y = 80.05x + 333.73
R
2
= 0.9825
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 2
y = 101.52x + 27.937
R
2
= 0.997
0
3000
6000
9000
12000
0 20 40 60 80 100
Conce ntração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 3
y = 86,375x + 240,25
R
2
= 0,9884
0
4000
8000
12000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
y = resposta em área do pico, x = concentração em ng mL
-1
, R
2
= coeficiente de determinação
123
Etiona
Gráfico Final da
Linearidade Dia 1
y = 167,57x - 60,72
R
2
= 0,9937
0
6000
12000
18000
0 50 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 2
y = 164.08x - 261.53
R
2
= 0.9964
0
4000
8000
12000
16000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 3
y = 171,23x - 936,42
R
2
= 0,9832
0
6000
12000
18000
0 50 100
Concentração
Resposta
Etoprofós
Gráfico Final da
Line aridade - Dia 1
y = 152,97x - 147,88
R
2
= 0,999
0
6000
12000
18000
0 50 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 2
y = 136,31x - 329,45
R
2
= 0,9892
0
6000
12000
18000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 3
y = 114,69x + 84,292
R
2
= 0,9885
0
3000
6000
9000
12000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Paration-metílica
Grafico Final da
Line aridade Dia 1
y = 129,15x - 237,03
R
2
= 0,9936
0
4000
8000
12000
16000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 2
y = 128,41x - 297,12
R
2
= 0,9992
0
4000
8000
12000
16000
0 50 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 3
y = 109,96x - 233,16
R
2
= 0,9866
0
4000
8000
12000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Pirimifós-metílico
Gráfico Final da
Linearidade Dia 1
y = 147,99x - 51,48
R
2
= 0,9987
0
4000
8000
12000
16000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 2
y = 146,07x - 278,16
R
2
= 0,9965
0
6000
12000
18000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
Gráfico Final da Linearidade
Dia 3
y = 108,38x - 157,04
R
2
= 0,9871
0
4000
8000
12000
0 20 40 60 80 100
Concentração
Resposta
y = resposta em área do pico, x = concentração em ng mL
-1
, R
2
= coeficiente de determinação
124
APÊNDICES F - GRÁFICOS DA CURVAS DE CALIBRAÇÃO DAS
SOLUÇÕES PADRÕES DE AGROTÓXICOS NO SOLVENTE E NA SOLUÇÃO
MATRIZ DE ALFACE.
clorfenvinfós clorpirifós
y = 41,157x - 0,969
R
2
= 0,9894 (solvente)
y = 26,65x + 429,49
R
2
= 0,5598 (m atriz)
0
1000
2000
3000
4000
5000
0 20 40 60 80 100
y = 64,504x - 92,454
R
2
= 0,9959 (s olvente)
y = 70,615x - 61,808
R
2
= 0,9829 (m atriz)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100
diclorvós dimetoato
y = 52,656x - 54,33
R
2
= 0,998 (m atriz)
y = 60,622x - 175,79
R
2
= 0,9945 (solvente)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0 20 40 60 80 100
y = 66,787x - 314,84
R
2
= 0,9754 (s olvente)
y = 71,678x + 180,5
R
2
= 0,9607 (m atriz)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100
etiona etoprofós
y = 84,918x - 375
R
2
= 0,9927 (solvente)
y = 51,011x + 579,18
R
2
= 0,5359 (matriz)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100
y = 62,862x + 8,5286
R
2
= 0,9977 (solvente)
y = 93,973x - 248,71
R
2
= 0,9964 (matriz)
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 20 40 60 80 100
parationa-metílica pirimifós-metílico
y = 65,964x - 149,92
R
2
= 0,9956 (s olvente)
y = 74,82x - 81,376
R
2
= 0,9762 (matriz)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100
y = 68,807x - 120,67
R
2
= 0,9961 (s olvente)
y = 79,999x + 66,494
R
2
= 0,9774 (m atriz)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100
125
APÊNDICES G - GRÁFICOS DA CURVAS DE CALIBRAÇÃO DAS
SOLUÇÕES PADRÕES DE AGROTÓXICOS NO SOLVENTE E NA SOLUÇÃO
MATRIZ DE BANANA.
clorfenvinfós clorpirifós
y = 63,468x - 94,42
R
2
= 0,9937 (solvente)
y = 51,297x - 121,55
R
2
= 0,9759 (matriz)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100
y = 104,85x - 203,72
R
2
= 0,9867 (solvente)
y = 112,56x - 306,25
R
2
= 0,991 (matriz)
0
3000
6000
9000
12000
0 20 40 60 80 100
diclorvós dimetoato
y = 62,589x - 147,29
R
2
= 0,9983 (solvente)
y = 35,37x + 157,64
R
2
= 0,9622 (matriz)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100
y = 83,639x - 41,983
R
2
= 0,9873 (solvente)
y = 119,55x - 323,35
R
2
= 0,9882 (matriz)
0
3000
6000
9000
12000
0 20 40 60 80 100
etiona etoprofós
y = 168,71x - 265,27
R
2
= 0,9979 (solvente)
y = 95,565x - 40,145
R
2
= 0,9724 (matriz)
0
4000
8000
12000
16000
0 20 40 60 80 100
y = 94,77x - 172,09
R
2
= 0,9982 (solvente)
y = 101,27x - 32,753
R
2
= 0,9958 (matriz)
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 20 40 60 80 100
parationa-metílica pirimifós-metílico
y = 129,05x - 451,37
R
2
= 0,9919 (matriz)
y = 107,89x - 358,2
R
2
= 0,9942 (solvente)
0
3000
6000
9000
12000
0 20 40 60 80 100
y = 118,53x - 241,64
R
2
= 0,9954 (s olvente)
y = 131,45x - 207,19
R
2
= 0,9914 (m atriz)
0
3000
6000
9000
12000
15000
0 20 40 60 80 100
126
APÊNDICES H - GRÁFICOS DA CURVAS DE CALIBRAÇÃO DAS
SOLUÇÕES PADRÕES DE AGROTÓXICOS NO SOLVENTE E NA SOLUÇÃO
MATRIZ DE TOMATE
clorfenvinfós clorpirifós
y = 42,779x - 53,769
R
2
= 0,9956 (solvente)
y = 41,083x - 125,45
R
2
= 0,9757 (matriz)
0
1000
2000
3000
4000
5000
0 20 40 60 80 100
y = 75,258x - 1,7875
R
2
= 0,9938 (solvente)
y = 83,16x - 198,21
R
2
= 0,9937 (matriz)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100
diclorvós dimetoato
y = 55,236x - 91,149
R
2
= 0,9943 (solvente)
y = 27,348x + 346,35
R
2
= 0,9197 (matriz)
0
1500
3000
4500
6000
0 20 40 60 80 100
y = 48,161x + 14,967
R
2
= 0,9867 (solvente)
y = 74,271x - 265,58
R
2
= 0,9782 (matriz)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100
etiona etoprofós
y = 132,41x - 61,719
R
2
= 0,9967 (solvente)
y = 88,715x - 233,04
R
2
= 0,998 (matriz)
0
3000
6000
9000
12000
15000
0 20 40 60 80 100
y = 68,536x + 30,254
R
2
= 0,9931 (solvente)
y = 78,179x + 45,072
R
2
= 0,9848 (matriz)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100
parationa-metílica pirimifós-metílico
y = 69,1x - 181,01
R
2
= 0,9941 (solvente)
y = 85,097x - 312,65
R
2
= 0,9864 (matriz)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100
y = 84,191x - 24,95
R
2
= 0,9938 (solvente)
y = 93,272x - 209,6
R
2
= 0,9923 (matriz)
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 20 40 60 80 100
127
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