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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
DOUTORADO
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: CIRURGIA E TRAUMATOLOGIA
BUCOMAXILOFACIAL
VLADIMIR DOURADO POLI
ANÁLISE DA FLUÊNCIA DO LASER FOSFETO DE ÍNDIO-GÁLIO-ALUMÍNIO NO
PROCESSO DE REPARO DE FERIDAS EM DORSO DE RATOS
ANALYSIS OF INDIUM-GALLIUM-ALUMINUM PHOSPHIDE LASER FLUENCY ON
SKIN WOUND HEALING IN RATS
Porto Alegre
2010
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
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VLADIMIR DOURADO POLI
ANÁLISE DA FLUÊNCIA DO LASER FOSFETO DE ÍNDIO-GÁLIO-ALUMÍNIO NO
PROCESSO DE REPARO DE FERIDAS EM DORSO DE RATOS
ANALYSIS OF INDIUM-GALLIUM-ALUMINUM PHOSPHIDE LASER FLUENCY ON
SKIN WOUND HEALING IN RATS
Tese apresentada como parte dos requisitos
exigidos para obtenção do título de Doutor em
Odontologia, pela Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul, na área de
concentração em Cirurgia e Traumatologia
Bucomaxilofacial.
Orientadora: Profa. Dra. Marília Gerhardt de Oliveira
Porto Alegre
2010
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2
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Rosária Maria Lúcia Prenna Geremia
Bibliotecária CRB 10/196
English title: Analysis of indium-gallium aluminum phosphide laser fluency on skin
wound healing in rats.
Medical Subjects Headings: LASER THERAPY, LOW LEVEL; WOUND HEALING; DOSIMETRY;
LASERS SOLID STATE; WOUNDS AND INJURIES; SKIN /injuries; ANIMAL
EXPERIMENTATION; RATS; CORRECTIVE MAINTENANCE.
Thesis: PhD in Dentistry
Adviser: Marilia Gerhardt de Oliveira, PhD
P766a Poli, Vladimir Dourado
Análise da fluência do Laser fosfeto de índio-gálio-alumínio no
processo de reparo de feridas em dorso de ratos / Vladimir Dourado
Poli. Porto Alegre: PUCRS, 2010.
92 f.: il. graf. tab.
Orientadora: Profª. Drª. Marília Gerhardt de Oliveira.
Tese (Doutorado) – Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do
Sul. Faculdade de Odontologia. Programa de Pós-Graduação em
Odontologia. Doutorado. Área de concentração: Cirurgia e Traumatologia
Bucomaxilofacial.
1. TERAPIA A LASER EM BAIXA INTENSIDADE. 2. CICATRIZAÇÃO DE
FERIDAS. 3. DOSIMETRIA. 4. LASERS DE ESTADO SÓLIDO. 5.
FERIMENTOS E LESÕES. 6. PELE/lesões. 7. EXPERIMENTAÇÃO
ANIMAL. 8. RATOS. 9. MANUTENÇÃO CORRETIVA. I. Oliveira, Marília
Gerhardt de. II. Título.
C.D.D. 615.85
C.D.U. 621.373.826:616-
003.92(043.2)
N.L.M.
WO 511
3
Dedicatória
4
Para Fernanda, minha esposa.
Para Marcelino, meu pai.
Para Nardila, minha mãe.
Para Débora, minha irmã.
5
Agradecimentos
6
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Á minha orientadora, Profa. Dra. Marília Gerhardt de Oliveira, colega que sempre
me apóia, incentiva e me acompanha em todas as fases de minha vida acadêmica.
Ao meu consultor de pesquisa, Prof. Dr. Manoel Sant’Ana Filho, pela amizade,
pelos ensinamentos diários e pela ajuda indispensável para com este trabalho.
Em particular, ao Prof. Dr. José Antônio Poli de Figueiredo, Coordenador do
Programa de Pós-Graduação em Odontologia, colega e amigo, pelo constante apoio
profissional e pela grande qualificação prestada a este Programa.
Também em particular, ao Prof. Dr. Raphael Carlos Drumond Loro, pelo constante
apoio e confiança profissional para comigo.
Em especial, à minha esposa, Fernanda, pelo apoio constante em minha vida, em
todos seus aspectos.
7
AGRADECIMENTOS
À Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - PUCRS, representada
pelo Magnífico Reitor, Prof. Dr. Joaquim Clotet.
À Faculdade de Odontologia da PUCRS, representada pelo seu Excelentíssimo
Diretor, Prof. Marcos Túlio Mazzini Carvalho, por capacitar a realização deste
Curso.
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, na pessoa do Prof. Dr. José
Antônio Poli de Figueiredo.
À CAPES, por viabilizar recursos para a realização deste Curso de Doutorado em
Odontologia, na área de concentração em CTBMF.
Aos Professores do Curso de Doutorado em CTBMF, pelo empenho e dedicação
demonstrados na qualificação de profissionais, investindo no ensino e na pesquisa.
Aos meus colegas de Doutorado em CTBMF.
Aos colegas-professores do Curso de Especialização em CTBMF, Dra. Ângela
Ehlers Bertoja, Dr. Cláiton Heitz, Dr. Fernando Santos Cauduro, Me. Guilherme
Genehr Fritscher, Dr. Manoel Sant’Ana Filho, Dra. Marília Gerhardt de Oliveira,
Dr. Raphael Carlos Drumond Loro, Dr. Rogério Belle de Oliveira, Dr. Rogério
Miranda Pagnoncelli, Me. Tomás Geremia, Dr. Vinicius Nery Viegas, pelo
convívio diário gratificante e enriquecedor.
Aos funcionários da Faculdade de Odontologia da PUCRS.
Aos funcionários da Secretaria de Pós–Graduação em Odontologia, Ana, Davenir,
Marcos e Carlos, pela disponibilidade, alegria, atenção e presteza para comigo.
Ao Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontoloiga da PUCRS,
representado por seu chefe, Prof. Dr. Manoel Sant’Ana Filho.
À Vanessa, funcionária do Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontoloiga
da PUCRS, pelo brilhante trabalho na preparação e confecção das lâminas.
À cirurgiã-dentista, Daniela Elisa Miotto, por sua ajuda indispensável na parte
prática deste trabalho.
Ao Prof. Dr. João Feliz Duarte de Moraes, pelo apoio junto à parte estatística deste
trabalho.
A Profa. Dra. Fernanda Bueno Morrone, Coordenadora do Vivário da Faculdade
de Farmácia da PUCRS, pela colaboração e disponibilização deste vivário.
8
Resumo
9
RESUMO
O presente estudo teve como propósito comparar, em diferentes tempos, diferentes
fluências do laser vermelho de fosfeto de índio-gálio-alumínio (=685 nm) sobre o processo
de reparo em feridas cutâneas padronizadas em dorso de ratos. Foram realizadas duas
feridas cirúrgicas em 36 ratos, sendo uma tratada com laser e a outra servindo como
controle. Os ratos foram divididos em três grupos. No grupo 1, as irradiações foram
realizadas com a dose de energia equivalente a média das doses mais utilizadas nas
pesquisas recentes, determinada como 8 J/cm
2
. O grupo 2 foi irradiado com o dobro da dose
de energia, ou seja, 16 J/cm
2
, e o grupo 3 com metade da dose, ou 4 J/cm
2
. As irradiações
foram realizadas imediatamente após o término da cirurgia, em 48 horas, em 4 e 7 dias, e os
animais foram mortos aos 4, 7 e 9 dias. Portanto, cada animal recebeu, na dependência de
sua morte, duas, três ou quatro irradiações. As lesões foram excisadas e analisadas em
microscopia óptica. Foram realizadas análises histomorfométricas, considerando as medidas
entre as bordas epiteliais, e análises histomorfológicas.
Verificou-se, utilizando-se o teste t pareado, que houve diferença significativa (p =
0,004) entre os valores referentes às médias das medidas entre as amostras teste e
controle. Ao se analisar as doses de energia utilizadas (4, 8 e 16 J/cm
2
) e o tempo de
observação dos animais (4, 7 e 9 dias), verifica-se que não houve diferença em relação ao
fator fluência, mas ocorreu quanto ao fator tempo, sendo as alterações mais evidentes nos
momentos iniciais (4 dias) do processo de reparo.
A partir das análises histomorfométrica e histomorfológica, este estudo
demonstrou um aumento na velocidade de cicatrização em ferimentos produzidos em dorso
de ratos quando irradiados com o laser em baixa intensidade de fosfeto de índio-gálio-
aluminio ( = 685 nm). Não há diferenças entre as doses de energia utilizadas (4, 8 e 16
J/cm
2
), mas há em relação ao fator tempo, sendo as alterações evidenciadas nos momentos
iniciais da cicatrização.
Palavras-chaves: Fluência. Laser. Reparo. Feridas. Ratos.
Descritores: Dosimetria. Lasers de Estado Sólido. Ferimentos e Lesões. Manutenção
Corretiva. Ratos.
1
____________________________
1
DeCS/MeSH – Descritores em Ciências da Saúde/ Medical Subject Headings, disponível em
http://decs.bvs.b
10
Abstract
11
ABSTRACT
This study aimed to compare the effects of different fluencies of indium-
gallium-aluminum phosphide laser ( = 685 nm) on skin wound healing in rats. Thirty
six male rats were used, divided in three groups of 12 animals each. Two
standardized skin wounds were created on the back of each animal, one treated with
laser and the other serving as control. In group 1, the irradiations were performed
with a dose of energy equivalent to average doses used in most recent polls,
determined as 8 J/cm
2
. The second group was irradiated with twice the dose of
energy (16 J/cm
2
) and group 3 with half the dose (4 J/cm
2
). The irradiations were
performed immediately after surgery, in 48 hours, on 4 and 7 days, and the animals
were killed at 4, 7 and 9 days. Therefore, each animal received, depending on his
death, two, three or four irradiations. The healing tissues were excised and analyzed
with optical microscopy. Histomorphometric analysis was performed, considering the
measures between the epithelial edges, and histomorphological analysis.
Using the paired t-test, there was a significant difference (p = 0.004) between
values referring to the average of the measures between the test and control
samples. When analyzing the energy doses used (4, 8 and 16 J/cm
2
) and time of
observation of the animals (4, 7 and 9 days), it appears that there was no difference
in the fluency factor, but it occurred on the time factor, with changes most evident in
the early stages (4 days) of the healing process.
Based on histomorphologic and histomorphometric analysis, this study
demonstrated an increase in the rate of wound healing in rats when irradiated with
indium-gallium-aluminum phosphide laser ( = 685 nm). There are no differences
between fluencies used (4, 8 and 16 J/cm2), but the time factor seems to be relevant,
with changes most evident in the early stages of the healing.
Keywords: Fluency. Laser. Repair. Wounds. Rats
Descriptors: Dosimetry. Lasers, Solid-State. Wound Healing. Rats.
2
____________________________
2
DeCS/MeSH – Descritores em Ciências da Saúde/ Medical Subject Headings, disponível em
http://decs.bvs.b
12
Lista de Figuras e Quadro
13
LISTA DE FIGURAS E QUADRO
Figura 01: Espécimes mantidos em gaiolas...............................................
Figura 02: Tricotomia da região.................................................................
Figura 03: Posicionamento do punch.........................................................
Figura 04: Demarcação da lesão através do punch...................................
Figura 05: Utilização de lâmina de bisturi para dissecção do tecido..........
Figura 06: Lesão padronizada na região dorsal dos ratos.........................
Figura 07:Laser de fosfeto de índio-gálio-alumínio (In-Ga-Al-P) THERA
LASE
®
, da marca DMC
®
.............................................................................
Figura 08: Irradiação com laser de In-Ga-Al-P...........................................
Figura 09: Exemplo da medição entre as margens epiteliais. Evidencia-
se a predominante zona de tecido de granulação e o epitélio....................
Figura 10: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20
X (c) de uma amostra sem tratamento com laser e morte do animal em 9
dias (grupo IIC)............................................................................................
Figura 11: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20
X (c) de uma amostra tratada com 16 J/cm
2
e morte do animal em 9 dias
(grupo IIC)...................................................................................................
Figura 12: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20
X (c) de uma amostra tratada com 8 J/cm
2
e morte do animal em 4 dias
(grupo IA)....................................................................................................
Figura 13: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20
X (c) de uma amostra tratada com 8 J/cm
2
e morte do animal em 7 dias
(grupo IB). ..................................................................................................
Figura 14: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20
X (c) de uma amostra tratada com 8 J/cm
2
e morte do animal em 9 dias
(grupo IC)....................................................................................................
Figura 15: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20
X (c) de uma amostra tratada com 4 J/cm
2
e morte do animal em 9 dias
(grupo IIIC)..................................................................................................
Quadro 01: Organização dos grupos e tempos de observação.................
Páginas
44
48
48
49
50
50
51
52
56
66
67
69
70
71
73
45
14
Lista de Tabelas e Gráfico
15
LISTA DE TABELAS E GRÁFICO
Páginas
Tabela 01: Medidas de massa dos animais...............................................
Tabela 02: Autores, revista de publicação, fator de impacto da revista,
comprimento de onda e fluência dos lasers dos artigos utilizados para
definição da fluência utilizada neste estudo................................................
Tabela 03: Medições entre as bordas epiteliais.........................................
Tabela 04: ANOVA fatorial univariada da diferença entre as duas
medidas do processo de reparo das feridas cutâneas................................
Tabela 05: Estimativa para a variável dependente diferença, segundo o
fator grupo...................................................................................................
Tabela 06: Estimativa para a variável dependente diferença, segundo o
fator tempo..................................................................................................
Tabela 07: Teste t de Student para a diferença das medidas das
amostras entre teste e controle...................................................................
Tabela 08: Média, desvio padrão e erro padrão da média das amostras
teste e controle por tempo de morte dos animais.......................................
Tabela 09: Média, desvio padrão, erro padrão da média e significância
dos valores referentes à diferença entre as medidas entre as amostras
teste e controle separados por tempo de morte dos animais.....................
Gráfico 01. Medidas teste e controle por grupos.......................................
42
53
60
61
61
61
62
63
64
62
16
Sumário
17
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................
2 FUNDAMENTAÇÃO CIENTÍFICA...........................................................
2.1. REPARO TECIDUAL...........................................................................
2.2. LASERS...............................................................................................
2.3. INTERAÇÃO DA LUZ LASER COM OS TECIDOS BIOLÓGICOS......
2.4. LITERATURA ATUAL SOBRE COMPRIMENTOS DE ONDA E
FLUÊNCIAS DE LLLT EM CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EM DORSO
DE RATOS..................................................................................................
3. METODOLOGIA.....................................................................................
3.1. CONFIGURAÇÃO DA AMOSTRA.......................................................
3.2. ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS.........................................................
3.3. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO........................................
3.4. MATERIAL E INSTRUMENTAL...........................................................
3.5. TÉCNICA CIRÚRGICA........................................................................
3.6. IRRADIAÇÃO A LASER.......................................................................
3.6.1 Parâmetros de irradiação utilizados...................................................
3.7. OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS............................................................
3.8. PROCESSAMENTO E ESTUDO HISTOLÓGICO...............................
4 RESULTADOS.........................................................................................
4.1 ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA......................................................
4.2 ANÁLISE HISTOMORFOLÓGICA........................................................
5 DISCUSSÃO............................................................................................
6 CONCLUSÕES........................................................................................
REFERÊNCIAS...........................................................................................
ANEXOS.....................................................................................................
ANEXO A: Aprovação do Projeto de Tese pela Comissão Científica e de
Ética da Faculdade de Odontologia da PUCRS..........................................
ANEXO B: Aprovação do Projeto de Tese pelo Comitê de Ética para o
Uso de Animais da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da
PUCRS........................................................................................................
18
21
22
26
28
34
40
41
43
46
46
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55
55
58
59
64
74
82
84
90
91
92
18
Introdução
19
1 INTRODUÇÃO
Uma das áreas da saúde mais interessantes e atuais diz respeito ao estudo
das interações dos diversos tipos de lasers com os tecidos biológicos,
compreendendo inúmeras pesquisas a fim de avaliar benefícios e possíveis efeitos
adversos desta técnica (GUTKNECHT; EDUARDO, 2004).
O reparo tecidual e a cicatrização de ferimentos na pele são processos
complexos que envolvem uma série de eventos dinâmicos, incluindo coagulação,
inflamação, formação de tecido de granulação, contração do ferimento e
remodelação tecidual. Assim, nas últimas décadas, inúmeros estudos e pesquisas
foram realizados para investigar o uso da terapia a laser em favorecimento do reparo
tecidual (GUTKNECHT; EDUARDO, 2004).
Muitos benefícios estão associados à biomodulação através da terapia a
laser em baixa intensidade (Low Level Laser Therapy – LLLT). Segundo Belkin e
Schwartz (1989), os efeitos requerem um limiar de exposição à irradiação, ou seja,
dependendo do efeito desejado é calculada a fluência, ou dose de energia,
necessária. O limiar é específico e cada tecido responde de maneira diferente a um
determinado comprimento de onda (). De acordo com a fluência, é possível ter
estimulação ou inibição de atividades bioquímicas, fisiológicas e proliferativas. Altas
doses de energias, dentro de limites específicos para cada combinação tecido-laser,
podem gerar prejuízo; logo, os efeitos são dose-dependentes (BELKIN;
SCHWARTZ, 1989).
Tal relação, todavia, não é simples, mas é relatada para a maioria das
irradiações e dos parâmetros teciduais. Desse modo, pesquisas com diferentes
fluências das relatadas na literatura atual, tanto para maiores doses de energias
como para menores, são de extrema valia para a comunidade científica,
possibilitando a observação das diferentes reações do tecido frente a essas
modificações de fluências.
Com o propósito de verificar a ação local do laser vermelho de fosfeto de
índio-gálio-alumínio (=685 nm) sobre o processo de reparo em feridas cutâneas
padronizadas em dorso de ratos, realizou-se esta pesquisa, a qual teve por objetivos
20
específicos comparar as feridas cutâneas irradiadas com o laser de fosfeto de índio-
gálio-alumínio com fluência de 8 J/cm
2
com as feridas irradiadas com fluências de 4
e 16 J/cm
2
nos tempos de 4, 7 e 9 dias de observação e verificar com qual dose de
energia e em qual tempo as feridas cutâneas respondem melhor, considerando o
processo de reparo das mesmas.
21
Fundamentação Científica
22
2 FUNDAMENTAÇÃO CIENTÍFICA
2.1 REPARO TECIDUAL
Zanini (1990) classifica as feridas de acordo com a sua etiologia: trauma,
agentes físicos e químicos e microrganismos patogênicos. Ainda segundo esse
autor, nas reações regenerativas das feridas ocorre uma substituição do tecido
lesado por outro do mesmo tipo, sobrevindo à cicatrização da ferida.
O processo de reparo de feridas é um fenômeno biológico fundamental
compreendendo os inúmeros aspectos de proliferação celular, diferenciação celular,
síntese e secreção de proteínas, proteoglicanos e outras substâncias extracelulares,
assim como o processo inflamatório em seus vários parâmetros. O estado de saúde
geral do indivíduo influencia diretamente todos estes processos (ROSS, 1971).
Inúmeros são os fatores que podem interferir na velocidade do reparo de
ferimentos, a saber: imunossupressão, desnutrição, doenças malignas, idade
avançada, diabetes e isquemias decorrentes de doenças vasculares (JAMES, 1994).
Kwon e Laskin (1997) salientam a importância de seguir meticulosamente
os princípios gerais para cuidados de ferimentos. Para tanto, é necessário completo
conhecimento da anatomia regional e da fisiologia, inspeção cuidadosa e palpação
da lesão, debridamento de corpos estranhos e restos necrótico, hemostasia local,
manuseio cauteloso do tecido, fechamento por planos e sem tensão tecidual e,
quando possível, aproximação das bordas.
Segundo Robbins (2003), o crescimento e a diferenciação celular são
decisivos no processo de reparação tecidual. Logo após a lesão, os fibroblastos e as
células endoteliais vasculares começam a proliferar para formar, em três a cinco
dias, o tipo especializado de tecido que é a característica da cicatrização: o tecido de
granulação.
O nome tecido de granulação deve-se a sua aparência rósea, de
consistência amolecida e granular, localizdo na superfície das feridas. Entretanto, é
seu aspecto microscópico que é característico:
23
a) Proliferação de novos pequenos vasos sangüíneos, originando-se por
brotamento ou geminação de vasos preexistentes, um processo denominado
angiogênese ou neovascularização. Este processo, por sua vez, apresenta
quatro etapas:
a.1) Degradação proteolítica da membrana basal do vaso original
para permitir a formação de um brotamento capilar e posterior migração
celular;
a.2) Migração de células endoteliais em direção ao estímulo
angiogênico;
a.3) Proliferação de células endoteliais, imediatamente atrás das
células migratórias líderes; e
a.4) Maturação de células endoteliais e organização nos tubos
capilares.
Estes novos vasos possuem junções interendoteliais com extravasamento,
permitindo a passagem de proteínas e hemácias para o espaço extracelular.
Assim, o novo tecido de granulação freqüentemente se apresenta
edemaciado. Este é o fenômeno responsável pela permanência do edema
mesmo muito tempo após diminuir a resposta inflamatória aguda.
b) Proliferação de fibroblastos, ou fibroplasia; e
c) Celularidade: macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e
mastócitos (ROBBINS et al., 2003)
Fonseca e Walker
(1991) e Barros e Souza (2000) dividem o reparo de
ferimentos em tecidos moles em três fases: inflamatória, proliferativa e de
maturação. A fase inflamatória é responsável pelo aumento na permeabilidade
capilar e afluxo de células sangüíneas para a região da ferida; durante a fase
proliferativa, os fibroblastos afluem para o local da ferida acompanhados por notável
proliferação endotelial. E, por último, a fase de maturação corresponde à migração
epitelial.
O tecido epitelial é constituído pelas células epiteliais, as quais estão em
íntimo contato entre si. Revestindo as superfícies externas do corpo, oferecem a
proteção e a impermeabilidade necessárias, apresentando-se, por este motivo, em
diversas camadas nesses locais. Em virtude de sua localização e organização, os
epitélios apresentam uma superfície livre, em que não existem elementos aderentes
24
de natureza celular ou extracelular, e uma superfície oposta, contígua ao tecido
conjuntivo subjacente e aderida à membrana basal (ROSS et al., 1993).
Anatomicamente, ROSS et al. (1993) classificam o tecido epitelial da pele
como estratificado, ou seja, constituído por duas ou mais camadas de células. Estas,
por sua vez, apresentam-se com forma cilíndrica, caracterizada por apresentarem
sua altura bem maior que a sua largura e seu comprimento.
O epitélio lesado tem uma capacidade regenerativa que lhe permite
restabelecer a sua integridade por meio de migração e de um processo conhecido
como inibição de contato. Em geral, uma borda livre do epitélio continua a migrar,
através da proliferação de células germinativas do epitélio que empurram a borda
livre adiante, até que entre em contato com a outra borda livre de epitélio, onde
então se sinaliza para parar de crescer lateralmente (PETERSON et al., 2005).
Feridas em que apenas a camada superficial foi lesada (abrasões)
cicatrizam pela migração do epitélio através do leito da ferida. Tendo em vista que o
epitélio normalmente não contém vasos sanguíneos, nos casos em que o tecido
subepitelial também foi atingido, o epitélio migra através de qualquer camada de
tecido vascularizado que esteja disponível, ficando abaixo da porção do coágulo
superficial que resseca (forma uma crosta), até que alcance outra margem epitelial.
Uma vez que a ferida esteja completamente epitelizada, a crosta se desprende e é
eliminada (PETERSON et al., 2005).
É tradicional e fundamental estabelecer a distinção entre a cicatrização de
um ferimento inciso, com margens opostas bem delimitadas (cicatrização por
primeira intenção ou união primária) de um ferimento lacerado, com bordas
irregulares e separadas (cicatrização por segunda intenção ou união secundária)
(ROBBINS, 1969).
Em ferimentos humanos de bordas bem-aproximadas, na qual a
cicatrização é por primeira intenção, a hemorragia e a formação de um hematoma
rico em fibrina e fibronectina são acompanhadas por inflamação aguda e dissolução
do colágeno. No período de 24 horas após a lesão, as células epiteliais migram da
epiderme adjacente e invadem o coágulo, os neutrófilos aparecem nas bordas da
incisão e a epiderme sofre espessamento em suas bordas seccionadas em
conseqüência da atividade mitótica das células basais. Dentro de 48 horas esporões
de células epiteliais das bordas migram e crescem ao longo das bordas seccionadas
25
da derme. No terceiro ou quarto dia, o tecido de granulação invade o ferimento e tem
início a deposição de colágeno. Em aproximadamente 15 dias, há um acúmulo
contínuo de colágeno e proliferação de fibroblastos. O infiltrado leucocítico, edema e
aumento da neovascularização diminuem bastante. E, em cerca de 30 dias, é
possível evidenciar um paralelismo entre a resistência tênsil e o conteúdo de
colágeno do ferimento. O tecido de granulação impede a migração epitelial em
direção à profundidade do ferimento, ocorrendo degeneração dos esporões epiteliais
iniciais. As células epiteliais, na superfície, dividem e diferenciam-se, restaurando,
assim, um epitélio estratificado. À medida que ocorre a reorganização vascular no
tecido de granulação, a cicatriz reduz a sua dimensão e altera sua cor, de
avermelhado para branco (ROBBINS, 1969).
Quando ocorre extensa perda de tecido ou simplesmente um fracasso na
aproximação das bordas, o processo de reparo é mais complicado. A regeneração
das células parenquimatosas não pode reconstruir completamente a arquitetura
original. O tecido de granulação abundante cresce da borda para completar o
reparo. Esta é a forma de cicatrização por segunda intenção. O denominador comum
nestas situações é uma grande falha tecidual que deve ser preenchida (JAMES,
1994).
Robbins et al. (2003) citam 3 distinções significativas entre as cicatrizações
secundárias e primárias:
a) Grandes falhas teciduais inicialmente possuem mais fibrina, resíduos
necróticos e exsudato, os quais devem ser removidos;
b) Quantidades muito maiores de tecido de granulação são formadas; e
c) Fenômeno da contração da ferida. A contração é atribuída à presença
de miofibroblastos, que são, na verdade, fibroblastos alterados e que
possuem vários aspectos ultra-estruturais e funcionais das células
musculares lisas contráteis.
De acordo com os resultados obtidos por Gloster (2001), em uma análise do
reparo por segunda intenção em região de vermelhão de lábio após cirurgia para
remoção de carcinoma de células escamosas, o reparo por segunda intenção deve
ser fortemente considerado para o reparo de defeitos superficiais envolvendo
mucosa labial e/ou mucosa de transição do lábio que não se estendam para a
porção do músculo orbicular da boca. Esse tipo de cicatrização apresentou
26
resultados estéticos de bons a excelentes em 12 dos 13 casos avaliados, sem
impedimento funcional ou complicações pós-operatórias.
2.2 LASERS
A palavra LASER é um acrônimo e é composta pelas iniciais de Light
Amplification by Stimulated Emission of Radiation, ou seja, “amplificação da luz por
emissão estimulada de radiação”.
Em 1960, Theodore Maiman, baseado na teoria quantitativa da luz, nos
conceitos de emissão estimulada, absorção estimulada, decaimento espontâneo e,
principalmente, na teoria específica do laser – amplificação da luz por emissão
estimulada – desenvolve o primeiro laser (FREIRE Jr. et al., 1997). Este
equipamento foi construído com uma barra de rubi sintético, que produzia a ação
laser, ou emissão laser, quando uma luz comum intensa, por meio de bombeamento,
incidia sobre essa barra (HELLWARTH, 1961).
Para entender alguns princípios da luz laser é importante o conhecimento
de algumas características presentes em todos os tipos de luz.
A luz pode ser descrita como uma onda eletromagnética e, como tal,
apresenta algumas características ondulatórias que a identificam plenamente
(MELLO; MELLO, 2001).
Esta onda tem uma característica importante chamada de comprimento de
onda, que nada mais é do que a distância medida entre dois picos consecutivos
desta trajetória. É o comprimento de onda que define a cor da luz. A unidade
utilizada para a medição deste comprimento é uma fração do metro, o nanômetro
(nm), que é equivalente a 10
-9
metro. Essa característica, juntamente com a
freqüência e a amplitude, define a luz dentro do espectro completo de ondas
eletromagnéticas (DEDERICH, 1993).
Fóton é a menor unidade da luz que é composta por um número inteiro de
fótons, ou quanta de luz. Este fóton é um quantum de energia eletromagnética com
polarização, direção e comprimento de onda únicos (POLI, 2006).
27
Segundo Mello e Mello (2001), além das características de comprimento de
onda, freqüência e amplitude, os lasers apresentam três propriedades específicas:
- monocromaticidade: apresenta grande pureza espectral, ou seja, cada
cor é constituída de fótons de mesmo comprimento de onda e freqüência,
apresentando coerência temporal;
- colimação: os fótons viajam em uma única direção e de forma paralela,
sem divergências significativas, até mesmo em grandes distâncias; e
- coerência: os fótons caminham em fase uns com os outros, no tempo e no
espaço, e na mesma direção.
A coerência manifesta-se, simultaneamente, pela monocromaticidade
(coerência temporal) e pela frente de onda unifásica (coerência espacial), permitindo
que o feixe laser seja focalizado em regiões extremamente pequenas, até o limite
teórico do comprimento de onda do laser (KUTSCH, 1993; RENSON, 1989).
Para uso odontológico, algumas propriedades do laser são muito úteis. A
coerência temporal possibilita a emissão em um único comprimento de onda,
permitindo a absorção da luz laser apenas por tecidos ou células (moléculas)
desejadas como, por exemplo, água, hemoglobina, melanina, etc, minimizando
possíveis efeitos adversos. A coerência espacial, por sua vez, possibilita concentrar
em uma pequena área altas potências ou energias, permitindo um trabalho
extremamente preciso e com proteção das estruturas vizinhas (POLI, 2006).
De acordo com Mello e Mello (2001), os raios absorvidos podem causar ou
produzir diversas situações:
a) reações químicas (provocar transformação química), rompendo as
ligações químicas;
b) oxidação calórica;
c) recombinação de elétrons;
d) ionização de átomos e/ou moléculas;
e) colisão de átomos e elétrons; e
f) excitação de átomos e/ou moléculas.
28
2.3 INTERAÇÃO DA LUZ LASER COM OS TECIDOS BIOLÓGICOS
Quando se discute a interação de um feixe laser com um tecido biológico,
deve-se levar em consideração tanto as propriedades e os parâmetros da radiação
laser como as propriedades térmicas e ópticas dos tecidos (GUTKNECHT;
EDUARDO, 2004; FETHERSTONE et al., 1998).
Os parâmetros e as propriedades do feixe laser, diretamente relacionados
com a interação com os tecidos biológicos, são os seguintes:
a) comprimento de onda do laser;
b) modo de ação do laser: contínuo, interrompido, pulsado ou Q-switch;
c) potência de pico do laser;
d) taxa de repetição ou freqüência;
e) área focalizada do feixe laser (densidades de energia e de potência);
f) duração do pulso;
g) quantidade de energia fornecida;
h) modo de entrega: fibra óptica ou braço articulado (mais usados);
i) modo de aplicação: com ou sem contato, focalizado ou não, em
movimentos circulares ou sem deslocamento;
j) presença ou não de sistema de refrigeração;
l) tempo de exposição (GUTKNECHT; EDUARDO, 2004).
Em relação às propriedades ópticas e térmicas dos tecidos devem ser
consideradas as seguintes:
a) propriedades ópticas:
- coeficiente de absorção;
- coeficiente de reflexão;
- coeficiente de espalhamento;
b) propriedades térmicas:
- condutividade térmica;
- capacidade térmica (GUTKNECHT; EDUARDO, 2004).
A luz laser interage com os tecidos biológicos basicamente de quatro
formas: parte da luz é refletida; parte da luz pode ser transmitida através do tecido
sem atenuação; parte da luz remanescente pode ser absorvida pelos componentes
29
do tecido, ocasionando, no caso dos processos ressonantes, uma transferência de
energia para o tecido; e, finalmente, parte da luz pode ser espalhada dentro do
tecido, podendo ocasionar interação em locais distantes da região de aparente
propagação da luz (POLI, 2006).
É importante salientar que, quando se fala em feixe laser, na realidade, para
considerar a interação com o tecido biológico, leva-se em conta um único átomo ou
molécula ou, ainda, um conjunto deles, mas restrito a um único elétron e um único
fóton. Para que a interação seja efetiva, os fótons oriundos dos equipamentos laser
devem poder ser absorvidos pelos elétrons dos átomos do tecido-alvo. Se isso
ocorrer, ou seja, o chamado processo de absorção, diz-se que o comprimento de
onda do laser é ressonante com o tecido biológico irradiado (POLI, 2006).
A partir da penetração dos fótons no tecido, outros processos passam a
ocorrer: alguns fótons isolados da luz laser atravessam o tecido sem produzir
nenhuma reação, processo este denominado de transmissão, ou esses fótons
sofrem espalhamento, caso em que mudam de direção. É possível que parte desses
fótons incidentes que sofreram espalhamento voltem para a mesma direção da
entrada dos raios (GUTKNECHT; EDUARDO, 2004).
Transmissão refere-se, portanto, à habilidade da energia em difundir-se por
meio do tecido sem nenhum efeito. Essa habilidade, no entanto, está diretamente
relacionada com o tipo de tecido e o comprimento de onda. A energia pode
transmitir-se até alcançar um tecido específico, no qual as características de
absorção ocorram. Só então algum efeito poderá ser observado (MELLO; MELLO,
2001).
O espalhamento da energia laser, no interior do tecido, é o resultado da
reflexão aleatória da energia do seu ângulo original. Por exemplo, a energia
luminosa, na região infravermelha, espalha-se de forma reduzida. Já a luz, na
porção visível do espectro, apresenta maior espalhamento (MELLO; MELLO, 2001).
Outro processo que acontece após a penetração dos raios na intimidade
dos tecidos é a refração. Esta sempre ocorre quando a luz passa de um meio para
outro. Segundo O’Brien et al. (1989), a velocidade do feixe é alterada e se a
incidência do raio não for perpendicular à superfície do tecido, o mesmo é desviado.
30
A partir da penetração dos fótons no tecido, no entanto, o processo mais
relevante, para que ocorra a interação laser-tecido, é o fenômeno de absorção
(POLI, 2006).
Quando um fóton incide sobre uma molécula, sua energia pode ser
absorvida, levando a molécula ao seu estado excitado. Ela sofre, então, uma colisão
inelástica (com perda de energia) com um vizinho que pode ser um elétron, um
átomo ou outra molécula transferindo parte da sua energia e decaindo para um
estado de energia mais baixo. A quantidade de energia presente na molécula
excitada pelo fóton, somada à energia cinética da partícula vizinha, representa o
aumento de agitação térmica dessa partícula vizinha e, conseqüentemente, o
pequeno aumento de temperatura ocorrido pela absorção de energia do fóton
(MCKENZIE, 1990).
Absorção e espalhamento são caracterizados pelos coeficientes de
absorção (
a
) e de espalhamento (
s
) e representam, respectivamente, a taxa de
perda de energia da radiação por unidade de comprimento de penetração, devido à
absorção e ao espalhamento de fótons. Esses dois coeficientes são específicos para
cada tecido e para cada comprimento de onda (MULLER et al., 1990).
Os elementos do tecido que exibem um alto coeficiente de absorção de um
particular comprimento de onda, ou por uma região do espectro eletromagnético, são
chamados de cromóforos. Desse modo, os cromóforos exercem papel fundamental
sobre a interação da radiação com o tecido (POLI, 2006).
A absorção da luz pela água é de fundamental importância para a aplicação
dos lasers nas áreas biomédicas por ser o corpo humano, em grande parte,
constituído por este elemento. O alto teor de água na composição dos tecidos é que
determina o uso predominante dos lasers, emitindo no espectro infravermelho,
quando se busca uma interação ressonante desse comprimento de onda com a
molécula da água. Outros cromóforos, como a melanina, adenina, hemoglobina e
proteínas, apresentam-se mais ressonantes com radiação laser emitida no espectro
da luz vermelha (POLI, 2006).
Mello e Mello (2001) afirmam que a absorção depende da composição do
tecido, da pigmentação e do conteúdo de água do mesmo.
31
Denomina-se feixe o conjunto de raios de luz que partem de uma mesma
fonte. Sendo assim, chama-se a luz emergente do sistema laser de feixe laser de
saída (POLI, 2006).
Os efeitos do feixe laser são devidos, essencialmente, a essa energia
transferida dos fótons incidentes ao tecido, durante o processo de absorção. É de
fundamental importância a característica do tecido quanto à sua capacidade de
dispersão da luz, pois é ela que determina os locais onde se processa a absorção
(GUTKNECHT; EDUARDO, 2004).
Essa interação da energia do laser com o tecido é determinada por três
fatores principais: quantidade de energia depositada pelo laser no tecido,
distribuição dessa energia no espaço, ou seja, o volume de absorção, e por seu
tempo de permanência em contato com o tecido. Portanto, é de se esperar que os
tecidos altamente absorventes apresentem volumes de absorção pequenos, pois o
feixe não penetra em profundidade (GUTKNECHT; EDUARDO, 2004).
Dessa forma, para o presente trabalho, os seguintes parâmetros são
importantes:
Área do feixe (A):
É medida em centímetros quadrados (cm
2
) e é definida pela equação:
2
r.A
,
onde r é o raio do feixe laser em centímetros (cm).
Normalmente, costuma-se medir o diâmetro do feixe (), o qual pode ser
também denominado de spot size, ou tamanho da mancha. Sabendo-se que o raio é
a metade do diâmetro (r = / 2), tem-se:
2
2
.A
Tempo de exposição (t):
É o tempo de duração da exposição da amostra à radiação laser, o tempo
total da interação laser-tecido, sendo medido em segundos (s).
32
Freqüência:
A freqüência de uma onda é sua taxa de oscilação, onde um hertz é igual a
uma oscilação por segundo. A unidade é o Hertz (Hz).
Energia (E):
É medida em Joule (J), que corresponde a W.s, e é definida multiplicando-
se a potência pelo tempo de exposição.
E = P. t
Potência (P):
É medida em watts (W), que corresponde a J/s, e é a quantidade de energia
depositada por unidade de tempo em um dado processo.
t
E
P
Intensidade do campo ou densidade de potência ou densidade de
fluxo emitido (I):
É medida em watts por centímetro quadrado (W/cm
2
) e corresponde à
quantidade de energia por unidade de tempo que passa por uma unidade de área.
No caso, a unidade de área é expressa em cm
2
.
A
P
I
ou
A.t
E
I
Fluência ou densidade de energia ou dose de energia (Fl):
É medida em Joules por centímetro quadrado (J/cm
2
) e corresponde a
potência do laser multiplicada pelo tempo de exposição e dividida pela área de
interação.
Fl = P . T
A
33
Nos tecidos, a energia absorvida se transforma em outras formas não
ópticas de energia que podem afetá-los por vários mecanismos de interação
(MCKENZIE, 1990). Segundo Gutknecht e Eduardo (2004), há três grupos de
interações que ocorrem nos tecidos, sendo divididas de acordo com a transformação
da energia absorvida:
a) efeitos fotoquímicos;
b) efeitos fototérmicos; e
c) processos não-lineares que se transformam nos dois primeiros.
Para o estudo em questão, onde será utilizado um laser em baixa
intensidade no espectro vermelho, apenas os efeitos fotoquímicos são observados.
Esses processos fotoquímicos podem ser de diversos tipos, como a terapia
fotodinâmica, a fotoindução, a fotoativação e a biomodulação. Tais processos são o
resultado da baixa absorção de energia pelo tecido, o que possibilita a ativação de
processos bioquímicos no interior da célula (GUTKNECHT; EDUARDO, 2004).
Está comprovado que, nos processos fotoquímicos, o aumento da
temperatura nunca é superior a 1ºC; não há choque térmico, assim como nenhuma
resposta térmica é observada (MELLO; MELLO, 2001).
Para o presente estudo, ou seja, reparo de feridas em dorso de ratos,
considera-se, principalmente, o processo da biomodulação tecidual, representado
pelos efeitos antiinflamatórios, antiedematosos e de trofismo celular.
O efeito antiinflamatório da terapia a laser em baixa intensidade é
determinado pelo aumento significativo de mastócitos em degranulação. Desse
modo, há um aumento na quantidade de histamina, o que provoca alterações
circulatórias locais, representadas basicamente por vasodilatação e aumento da
permeabilidade vascular. Em relação às prostaglandinas, a terapia a laser em baixa
intensidade inibe e bloqueia a ação da enzima ciclooxigenase sobre o ácido
aracdônico (GENOVESE, 2000).
O efeito trófico tecidual é devido a um aumento na produção de ATP
mitocondrial pela energia laser. O estímulo trófico provém provavelmente da união
do efeito em nível circulatório com o efeito potencializador da produção de energia
disponível na célula. A radiação a laser aumenta a neoformação capilar e a
multiplicação celular (GENOVESE, 2000).
34
Estudos realizados por Genovese (2000) sobre alguns tecidos
demonstraram os seguintes efeitos:
- aumento de fibroblastos e, como conseqüência, de fibras colágenas;
- regeneração de vasos sanguíneos a partir dos já existentes;
- aumento da velocidade de crescimento de nervos seccionados;
- aumento da reepitelização a partir dos restos basais, como no caso de
úlceras superficiais;
- como conseqüência, existe um aumento do ritmo de divisão celular.
A ação antiedematosa da energia a laser em baixa intensidade se manifesta
por meio de dois fenômenos importantes:
a) estímulo à microcirculação (dilatação dos vasos linfáticos) que irá
proporcionar melhores condições de drenagem do plasma que forma o edema; e
b) ação fibrinolítica, que irá proporcionar resolução efetiva do isolamento
proporcionado pela coagulação do plasma (GENOVESE, 2000).
De acordo com Cruañes (1994) os efeitos da LLLT levam ao aumento da
microcirculação local e da drenagem linfática, proliferação celular e dos fibroblastos
e, por conseguinte, aumento na síntese de colágeno. A atuação nos tecidos
biológicos inicia-se com uma vasodilatação periférica, degranulação dos mastócitos,
estimulação mitocondrial, aumento da produção de ATP, da síntese de
prostaglandinas, histamina e heparina, levando a ação antiinflamatória. Há também
um aumento da síntese de DNA e do número de mitoses, com estimulação da
síntese de colágeno e aumento da proliferação fibroblástica. Conseqüentemente, há
um aumento da velocidade de regeneração epitelial e da estimulação e aceleração
do processo de osteogênese (ABERGEL et al., 1996; KARU, 1999; SILVEIRA;
LOPES, 1991).
2.4 LITERATURA ATUAL SOBRE COMPRIMENTOS DE ONDA E FLUÊNCIAS DE
LLLT EM CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EM DORSO DE RATOS
A maioria das pesquisas in vivo demonstra a ação do laser em baixa
intensidade sobre a síntese e a remodelação de colágeno, o número de fibroblastos,
o diâmetro e a força de tração das feridas tratadas, a viabilidade dos enxertos
35
tratados, a vascularização, a vasodilatação, o sistema linfático, os efeitos
antibacteriano e imunológico, assim como os seus efeitos sistêmicos (TRELLES et
al., 1996).
Trelles et al. (1983) constataram que a aplicação do laser, na fluência de 2,4
J/cm
2
e com potência de 50 mW, em língua de ratos, provocou um aumento de 30%
da histamina em relação ao grupo controle. Já no grupo irradiado com o mesmo
laser, porém na potência de 4 mW, foi observado um aumento de 100% no nível de
histamina em relação ao grupo controle.
Os mesmos pesquisadores, ao utilizarem cortes semifinos para microscópio
e análise ultra-estrutural de língua de ratos irradiada, verificaram degranulação de
mastócitos significativamente aumentada nos grupos tratados com terapia a laser
em baixa intensidade (TRELLES et al., 1989
a
; TRELLES et al., 1989
b
).
O fluxo de sangue em capilares mesentéricos aumenta após a irradiação
com laser não-cirúrgico. O incremento do fluxo sangüíneo pode perdurar por até 20
minutos após cessar a irradiação com o laser, inclusive quando a área-alvo for
resfriada (BENEDICENTI, 1982; MIRÓ et al., 1984). Ainda sobre os efeitos
vasculares do laser, em um estudo realizado com 50 animais, Lievens (1991)
realizou incisões na região abdominal de ratos, irradiando-as com laser de He-Ne
(632 nm) e de As-Ga (904 nm). O autor avaliou a adesão peritoneal pós-cirúrgica, o
edema local e a regeneração de veias e vasos linfáticos na região mesentérica.
Após a irradiação do mesentério, o fluxo linfático instalou-se rapidamente. A
neovascularização e a regeneração dos vasos linfáticos, nos animais irradiados,
foram significativamente mais rápidas que nos animais do grupo controle. A adesão
peritoneal foi escassa, nos grupos tratados com laser, mas normal nos grupos
controle.
Anneroth et al (1988) avaliaram o efeito do tratamento com laser
infravermelho na cicatrização de feridas em ratos, tanto histológica quanto
macroscopicamente. Para o estudo, empregaram 14 espécimes Sprague-Dawley,
nos quais produziram duas feridas bilaterais, na região caudal de cada rato. Uma
ferida em cada rato recebeu tratamento com radiação laser. A ferida contralateral foi
mantida sem tratamento, servindo como grupo controle. O período de observação
total foi de 15 dias, sendo que, a cada dia, um animal era morto para avaliação. Os
animais foram irradiados diariamente com laser de As-Ga (904 nm), na freqüência
36
de 500 Hz e potência de 0,5 mW, por um período de oito minutos e com uma
distância de 5 mm, até o momento de sua morte. Os resultados não mostraram
nenhuma diferença no que se refere ao período de cicatrização ou à formação de
crosta. Durante o período de observação, nenhuma ferida apresentou sinais de
infecção. O exame histológico também não mostrou diferença morfológica óbvia
entre as feridas tratadas e as não-tratadas. Com esse estudo, os autores não
confirmaram que o uso de LLLT pode melhorar o processo de cicatrização de
feridas.
Al-Watnaban e Zhang (1999) realizaram um estudo para definir a fluência
ideal no tratamento de feridas cutâneas no dorso de ratos. Utilizaram diferentes
lasers com diversos comprimentos de onda. Nas fluências de 10, 20 e 30 J/cm
2
,
irradiados três vezes por semana, a que apresentou os melhores resultados foi a
com 20 J/cm
2
. Em relação ao comprimento de onda, os melhores resultados obtidos
foram os seguintes, na seguinte ordem crescente: He-Ne (632,8 nm), As-Ga-Al (780
nm), argônio (488-514 nm), As-Ga-Al (830 nm), He-Cd (442 nm) e criptônio (640-670
nm). Esta última constatação comprova que a profundidade de penetração do laser,
a qual está relacionada com o comprimento de onda, não é proporcional aos efeitos
biomodulatórios da laserterapia em ferimentos superficiais, como os gerados no
dorso dos ratos.
Em outro estudo realizado por Al-Watban e Zhang (2004), foram
comparados os efeitos dos lasers contínuo e pulsátil quando aplicados em
ferimentos provocados em ratos. Os autores perceberam que a laserterapia pulsada,
na fluência e na freqüência apropriadas, pode levar à aceleração da cicatrização dos
ferimentos. Em seus resultados, os autores mostraram que o melhor efeito na
cicatrização dos ferimentos foi obtida na freqüência de 100 Hz.
Com base nos resultados obtidos por Al-Watnaban e Zhang (1999), outras
pesquisas (MENDEZ, 2002; OLIVEIRA, 2002) têm utilizado a fluência de 20 J/cm
2
para comparar o reparo de feridas cutâneas provocadas no dorso de ratos. Mendez
(2002) constatou, ainda, que a associação entre os comprimentos de onda de 685
nm e 830 nm (10 J/cm
2
para cada) foram os que promoveram os melhores
resultados no reparo de feridas cutâneas pela análise óptica utilizada.
Maegawa et al. (2000) avaliaram o efeito da LLLT na microcirculação
mesentérica de ratos, in vivo, e na concentração sistólica de cálcio em células
37
musculares de vasos de ratos, in vitro. O laser utilizado possuía λ= 830 nm, sendo
utilizada a fluência de 38,2 J/cm
2
. Os resultados mostraram uma potente dilatação
das arteríolas irradiadas, o que levou a um aumento marcante na circulação
sangüínea arteriolar. Os autores concluíram que as alterações circulatórias
observadas parecem ser mediadas amplamente pela redução do íon cálcio
intracelular nas células musculares dos vasos.
Vinck et al. (2003) avaliaram a capacidade de influenciar o aumento da
proliferação de fibroblastos por meio de LED e LLLT. Em culturas de fibroblastos,
nas quais aplicavam LLLT e LED com vários comprimentos de ondas (950 nm, 660
nm e 570 nm), perceberam que todas as irradiações provocaram aumento da
proliferação de fibroblastos, in vitro, sugerindo possíveis efeitos de estimulação da
cicatrização de ferimento.
Maiya et al. (2005) realizaram estudo para avaliar o efeito da terapia laser
de He-Ne (632 nm) na dinâmica da cicatrização de ferimentos em ratos diabéticos.
Os autores observaram que a fotoestimulação com LLLT, com correto comprimento
de onda, pode melhorar o reparo tecidual por liberar fatores de crescimento dos
fibroblastos e facilitar o processo de reparo de ferimentos em organismos diabéticos.
Na análise dos parâmetros bioquímicos e histopatológicos, os ferimentos mostraram
que o grupo tratado com laser cicatrizou de forma melhor e mais rápida quando
comparado ao grupo controle.
Procurando comparar o efeito do laser em baixa intensidade no processo de
cicatrização de ferimentos em ratos diabéticos e não-diabéticos, Rabelo et al. (2006)
realizaram um experimento utilizando laser de He-Ne (632 nm). Utilizaram dois
grupos de animais, controle e experimental, que, por sua vez, foram subdivididos em
diabéticos e não-diabéticos. Foram, então, produzidos ferimentos na pele na região
dorsal e avaliaram histologicamente em períodos de quatro, sete e 15 dias. Quando
compararam os componentes teciduais (células inflamatórias, vasos e áreas de
fibroblastos) perceberam que os animais tratados possuíam processos inflamatórios
menos intensos que os animais não-tratados.
Para avaliar a cicatrização de ferimentos em pele de ratos, Araújo et al.
(2007) planejaram um experimento no qual foram realizados dois ferimentos
circulares em cada animal, sendo um deles irradiado com laser de He-Ne (632 nm) e
o outro o controle do próprio animal. Os ferimentos foram analisados nos períodos
38
de um, cinco, oito, 12 e 15 dias de pós-operatório por análise histológica. Os
pesquisadores concluíram que as lesões irradiadas apresentaram reepitelização
acelerada quando comparadas com o grupo controle. A derme irradiada continha
maior número de fibroblastos ativos que no grupo controle, e a radiação laser
reduziu o processo inflamatório local, além de, aparentemente, organizar as fibras
colágenas na área do reparo.
Al-Watban (2009
a
) testaram vários comprimentos de onda em ferimentos
cutâneos e queimaduras em ratos normais e diabéticos. Os comprimentos de onda
testados foram os seguintes: 532, 633, 810, 980 e 10.600 nm. Os autores
concluíram que o comprimento de onda de 633 nm, portanto um laser vermelho, foi o
que apresentou os melhores resultados, com melhoras entre 38.5% e 53.4% nos
ferimentos cutâneos. As doses de energia utilizadas foram de 4,71 J/cm
2
nos ratos
diabéticos e 2,35 J/cm
2
nos ratos normais, com 3 irradiações por semana.
Al-Watban et al.
(2009
b
) testaram vários comprimentos de onda e fluências
diferentes em queimaduras em ratos diabéticos: 532, 633, 670, 810 e 980 nm com 5,
10, 20 e 30 J/cm
2
, sendo 3 irradiações por semana. O percentual de cicatrização foi
de 78,37% para o laser visível e 50,68% para os lasers invisíveis (p < 0,005%). Os
autores concluíram que os lasers visíveis produzem melhores efeitos sobre a
cicatrização de queimaduras em ratos diabéticos do que os lasers invisíveis.
Rocha et al. (2009) avaliaram a cicatrização cutânea em dorso de ratos com
a utilização de LLLT, realizando três irradiações com 3,8 J/cm
2
cada. Os resultados
encontrados indicaram que a LLLT pode ser um importante indutor da apoptose
durante o processo de reparo tecidual. Além disso, foi demonstrado que a LLLT tem
um efeito imunomodulatório na expressão sobre a TGF-beta (2) nos locais de
cicatrização de feridas.
Em outro estudo, foi comparada a eficácia da LLLT com a da luz polarizada
em queimaduras de segundo grau em roedores. Os lasers utilizados foram o
vermelho (660 nm) e o infravermelho (780 nm), com 4 irradiações de 5 J/cm
2
e
intervalos de 24 hs entre as mesmas. A análise dos resultados demonstrou que os
tecidos danificados foram capazes de absorver e processar eficientemente a luz em
todos os comprimentos de onda testados. A LLLT com 660 nm foi a terapia que
apresentou os melhores resultados nas fases iniciais da cicatrização, demonstrando
um tecido recém-formado semelhante à derme normal (OLIVEIRA et al., 2008).
39
Medrado et al. (2008) avaliaram a cicatrização de ferimentos cutâneos em
dorso de ratos submetidos a irradiação laser de As-Ga-Al (670 nm). A dose de
energia utilizada foi de 4 J/cm
2
, com tempos de observação de 3, 7, 10, 15, 20, 30 e
60 dias. Foi demonstrado que o laser foi o responsável pela redução do edema local
e das células inflamatórias (p <0,05) e um evidente aumento do número de células
actina-positivo foi também observado. Por último, os autores afirmam que o
tratamento com laser contribuiu para melhor diferenciação e modulação em todos os
grupos irradiados, sendo capaz de induzir várias alterações durante o processo de
cicatrização cutânea, especialmente em fibras colágenas recém formadas,
organizando-as e compactando-as.
Em outro estudo, foi investigado o comportamento celular e da matriz
extracelular durante as fases da cicatrização em ferimentos cutâneos em dorso de
ratos, seguidos da utilização de LLLT e de dexametasona. O laser utilizado foi o As-
Ga-Al (670 nm) com dose de energia de 4 J/cm
2
. O grupo tratado com laser
apresentou um aumento de colágeno e melhor arranjo da matriz extracelular (p
<0,05). Os fibroblastos nestes tecidos estavam aumentados em número e tornaram-
se mais ativos. No grupo tratado somente com dexametasona, o colágeno mostrou-
se desorganizado e não homogêneo, com diminuição do número de fibroblastos. No
grupo tratado com ambos os tipos de terapia, os fibroblastos estavam em maior
quantidade e exibiam um vigoroso retículo endoplasmático rugoso. Entretanto, o
tecido apresentou menor produção de colágeno em comparação ao observado no
grupo tratado exclusivamente com laser. Os autores concluíram que a LLLT sozinha
acelera reparação tecidual pós-cirúrgica e reduz o edema e infiltrado
polimorfonuclear mesmo na presença de dexametasona (REIS et al., 2008).
Araújo et al. (2007) investigaram as características morfológicas e
funcionais da cicatrização de feridas produzidas na pele de camundongos. Foi
utilizado um laser de He-Ne (632,8 nm), com fluência de 1 J/cm
2
e tempo de
exposição de 3 min. As lesões do grupo irradiado mostraram uma reepitelização
mais rápida, uma derme contendo um maior número de fibroblastos ativos e redução
da inflamação local, parecendo influenciar na organização das fibras colágenas na
área de reparação. Os autores sugerem que a radiação laser pode acelerar a
cicatrização de feridas cutâneas nesse modelo animal.
40
Metodologia
41
3 METODOLOGIA
O presente estudo é inédito e foi desenvolvido de acordo com o paradigma
tradicional, no design de estudo quase-experimental, com grupos de trabalho
selecionados de forma aleatória e controle pós-teste, tendo sido aprovado pela
Comissão Científica e de Ética da Faculdade de Odontologia da PUCRS (ANEXO A)
e pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-
Graduação da PUCRS (ANEXO B).
3.1 CONFIGURAÇÃO DA AMOSTRA
O modelo animal utilizado foi o rato albino da espécie Ratthus norvegicus,
classe Mammalia, ordem Roedentia, da linhagem Wistar, machos, com peso
variando de 318 a 396 gramas (tabela 01), clinicamente sadios. Os animais foram
obtidos junto ao Biotério Central do Campus Universitário - Capão do Leão, da
Universidade Federal de Pelotas.
42
Tabela 01: Medidas de massa dos animais.
Grupo
Subgrupo
Peso (g)
GRUPO I
8 J/cm2
n = 11
I A (4 dias)
340
330
394
392
I B (7 dias)
368
319
370
348
I C (9 dias)
330
364
320
GRUPO II
16 J/cm2
n = 12
II A (4 dias)
322
343
396
362
II B (7 dias)
332
357
386
382
II C (9 dias)
318
321
348
355
GRUPO III
4 J/cm2
n = 121
III A (4 dias)
346
385
339
371
III B (7 dias)
341
338
339
394
III C (9 dias)
359
341
371
309
43
Os ratos passaram por um período de sete dias de ambientação no Vivário
da Faculdade de Farmácia da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do
Sul, no qual permaneciam acomodados em gaiolas plásticas, mantidos em
condições adequadas de temperatura (25
o
C), umidade e ventilação, sendo
identificados e numerados de acordo com o grupo correspondente. Durante o
período experimental, os animais foram alimentados com dieta sólida, exceto nas
primeiras 24 horas após a intervenção, e água ad libitum.
Respeitaram-se, aqui, os princípios éticos da experimentação animal, bem
como as normas para a prática didático-científica da vivissecção dos mesmos, de
acordo com a Lei 11.794/2008.
3.2 ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS
Para determinação do tamanho da amostra deste estudo, optou-se pelo n
de 12 para cada grupo, baseando-se nos estudos de Rabelo et al. (2006), Chagas-
Oliveira et al. (2008), Reis et al. (2008) e Rocha et al. (2009), nos quais o n de cada
grupo, seja teste ou controle, era sempre entre 08 e 15. Estas pesquisas foram
realizadas em ratos, nas quais se estudou a cicatrização de feridas com a
associação da LLLT e todas elas apresentaram resultados estatisticamente
significativos.
Os animais foram selecionados aleatoriamente, pesados e divididos em três
grupos distintos, com 12 animais em cada um, totalizando 36 animais (AL-WATBAN,
et al., 2009
b
; ROCHA JR., et al.).
Os espécimes foram mantidos em gaiolas
plásticas, com cobertura metálica e assoalho forrado por serragem de pinho (Figura
01).
44
Figura 01: Espécimes mantidos em gaiolas.
Em todos os grupos, o período de observação foi de quatro, 7 e 9 dias.
Assim, cada grupo foi subdividido em três subgrupos (A, B e C), de acordo com
período de observação (Quadro 01).
45
Quadro 01: Organização dos grupos e tempos de observação.
* Ocorreu a morte de um animal durante o período de observação.
Optou-se pela realização de dois ferimentos em cada animal, sendo um
controle (sem irradiação) e um teste (com irradiação). Esta decisão baseou-se em
dois critérios: diminuição de vieses, na medida em que teste e controle são o mesmo
organismo, e minimização do uso de animais de experimentação.
As gaiolas receberam etiquetas, durante todo o período de estudo,
conforme o grupo no qual pertencia cada animal. Para a identificação dos animais,
foram utilizadas marcações na cauda, realizadas com caneta de tinta permanente,
onde o número de marcas indicava o número do respectivo animal.
Os procedimentos de manipulação e alimentação foram realizados durante
todo o período do experimento. A serragem e a água foram trocadas, assim como a
lavagem das gaiolas, a cada 48 horas.
GRUPOS
PROCEDIMENTOS
SUBGRUPOS
PERÍODO DE OBSERVAÇÃO
I
(11 ratos*)
Fl = 8 J/cm
2
1 – A
4 dias (4 ratos)
1 – B
7 dias (4 ratos)
1 – C
9 dias (3 ratos
*
)
II
(12 ratos)
Fl = 16 J/cm
2
2 – A
4 dias (4 ratos)
2 – B
7 dias (4 ratos)
2 – C
9 dias (4 ratos)
III
(12 ratos)
Fl = 4 J/cm
2
3 – A
4 dias (4 ratos)
3 – B
7 dias (4 ratos)
3 – C
9 dias (4 ratos)
46
3.3 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
Para que os animais pudessem ser incluídos nos experimentos, todos
cumpriram com os seguintes requisitos:
- ser da espécie Ratthus norvegicus;
- da classe Mammalia;
- da ordem Roedentia;
- da linhagem Wistar;
- machos;
- pesar entre 300 e 400 gramas no momento do estudo;
- estar em bom estado nutricional;
- chegar ao final do período relativo aos seus grupos em bom estado de
saúde.
Os animais que apresentassem qualquer uma das complicações a seguir
seriam excluídos do estudo:
- infecções;
- necroses;
- debilitação do estado geral;
- desconforto durante o período dos testes.
3.4 MATERIAL E INSTRUMENTAL
Foram utilizados os seguintes materiais:
- hidrato de cloral a 10%;
- solução de formalina tamponada 10%;
- gaze estéril;
- solução de cloreto de sódio a 0,9%;
- digluconato de clorexidina a 2%;
- seringas estéreis e descartáveis de 20 ml;
47
- lâminas de bisturi nº 15;
- anestésico (Zoetil
);
- mesa cirúrgica adaptada, com mantenedores de posição do rato em
decúbito ventral;
- instrumental cirúrgico individualizado e esterilizado em autoclave;
- punch metálico com 8 mm de diâmetro e com ranhuras de 1 mm em sua
superfície para marcação da profundidade de penetração;
- cabo de bisturi tipo Bard-Parker número n°. 3;
- porta-agulha tipo Mayo-Hegar;
- pinças tipo Adson-Brown;
- tesouras de ponta reta;
- aparelho de laser THERA LASE
®
, da marca DMC
®
, devidamente calibrado.
3.5 TÉCNICA CIRÚRGICA
Previamente ao ato cirúrgico, os animais foram submetidos à anestesia
geral, por meio da injeção intramuscular do anestésico Zoletil
, com uma dose de
20,0 mg/kg de peso.
Após a anestesia, os animais foram submetidos à tricotomia da região
dorsal, por arrancamento dos pêlos (Figura 02). A assepsia da região foi realizada
com digluconato de clorexidina a 2%.
48
Figura 02: Tricotomia da região.
O punch foi posicionado perpendicularmente à superfície da pele, na região
tricotomizada, junto à linha média e próximo à cabeça do animal (Figura 03).
Figura 03: Posicionamento do punch.
49
Promoveram-se movimentos giratórios para facilitar a penetração de 1 mm
da lâmina, com um diâmetro de 8 mm, correspondendo às medidas do instrumental
utilizado (Figura 04).
Figura 04: Demarcação da lesão através do punch.
Posteriormente, foi utilizado cabo de bisturi montado com lâmina nº. 15 e
pinça tipo Adson-Brown (Figura 05) para remover, delicadamente, a quantidade de
tecido necessário à produção de uma lesão de 1 mm de profundidade e 8 mm de
diâmetro (Figura 06).
50
Figura 05: Utilização de lâmina de bisturi para dissecção do tecido.
Figura 06: Lesão padronizada na região dorsal dos ratos.
51
O mesmo procedimento foi repetido a uma distância de cerca de 7 cm da
primeira, próximo a região caudal do animal.
3.6 IRRADIAÇÃO A LASER
Foi utilizado o laser vermelho fosfeto de índio-gálio-alumínio (In-Ga-Al-P)
THERA LASE
®
, da marca DMC
®
(Figura 07).
Figura 07: Laser de fosfeto de índio-gálio-alumínio (In-Ga-Al-P) THERA LASE
®
, da
marca DMC
®
.
Em todos os animais padronizou-se que somente a ferida próxima à cabeça
receberia irradiação. Também ficou estabelecido que a irradiação fosse de forma
pontual e no centro do ferimento (Figura 08).
52
Figura 08: Irradiação com laser de In-Ga-Al-P.
As irradiações foram realizadas imediatamente após o término da cirurgia,
em 48 horas, em 4 e 7 dias, adequando-se ao funcionamento do Vivário, totalizando,
na dependência da época da morte do animal duas, três ou quatro irradiações.
Os animais receberam as irradiações seguindo as regulamentações
brasileiras, ou seja, com as devidas medidas de proteção e em local isolado, com
caracteres e simbologia internacionais para área em uso ou presença de radiação.
Após o procedimento cirúrgico, os animais retornaram ao Vivário da
Faculdade de Farmácia da PUCRS, na qual permaneceram até o final do
experimento.
53
3.6.1 Parâmetros de irradiação utilizados
Selecionaram-se, com base na literatura atual, oito artigos de relevância na
comunidade científica que cumpriram os seguintes requisitos:
- Publicados no ano de 2009;
- Revistas com fator de impacto superior a 1,5;
- Serem experimentais em ratos;
- Utilizar lasers no espectro eletromagnético da cor vermelha ou próximo
(Tabela 02).
Tabela 02: Autores, revista de publicação, fator de impacto da revista, comprimento
de onda e fluência dos lasers dos artigos utilizados para definição da fluência
utilizada neste estudo.
Autores
Revista
Fator de
impacto
(nm)
Fluência
(J/cm
2
)
NUSSBAUM EL et al.
(2009)
Lasers Surg Med
3,539
635
1 e 20
EZZATI A et al. (2009)
J Rehabil Res Dev
1,446
660
2,3 e
11,7
IORDANOU P et al.
(2009)
Photomed Laser Surg
1,785
580
2,4
ROCHA Jr. AM et al.
(2009)
Photomed Laser Surg
1,785
635
3,8
GÁL P et al. (2009)
Lasers Med Sci
1,675
635
5
AL-WATBAN FA et al.
(2009
b
)
Photomed Laser Surg
1,785
633 e 670
5, 10 e
20
RIBEIRO MA et al.
(2009)
Photomed Laser Surg
1,785
660
20
DALL AGNOL MA et
al. (2009)
Lasers Med Sci
1,675
640 e 660
6
Média da fluência
8,93
54
Desse modo, optou-se por utilizar a fluência de 8 J/cm
2
no grupo I, o dobro
da dose de energia (16 J/cm
2
) no grupo II e a metade (4 J/cm
2
) no grupo III.
A seguir, todos os parâmetros utilizados separados por grupos:
Grupo I:
- λ = 685 nm
- A = 1 cm
2
- E = 8,015 J
- Fl = 8,015 J/cm
2
- t = 3 min e 49 s
- P = 35 mW
- I = 35 mW/cm
2
- F = 437653 GHz
- modo de ação do laser: contínuo
- modo de entrega: fibra óptica
- modo de aplicação: pontual, com contato e sem deslocamento
Grupo II:
- λ = 685 nm
- A = 1 cm
2
- E = 16,03 J
- Fl = 16,03 J/cm
2
- t = 7 min e 38 s
- P = 35 mW
- I = 35 mW/cm
2
- F = 437653 GHz
- modo de ação do laser: contínuo
- modo de entrega: fibra óptica
- modo de aplicação: pontual, com contato e sem deslocamento
55
Grupo III:
- λ = 685 nm
- A = 1 cm
2
- E = 4,025 J
- Fl = 4,025 J/cm
2
- t = 1 min e 55 s
- P = 35 mW
- I = 35 mW/cm
2
- F = 437653 GHz
- modo de ação do laser: contínuo
- modo de entrega: fibra óptica
- modo de aplicação: pontual, com contato e sem deslocamento
3.7 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS
Para a obtenção das amostras, os animais foram mortos aos quatro, 7 e 9
dias de pós-operatório, por meio da administração de uma dose letal (3-4 ml) de
hidrato de cloral a 10%, por via intraperitoneal.
As duas lesões estabelecidas por animal foram dissecadas em forma de
uma elipse, com uma lâmina de bisturi nº. 15, estabelecendo-se uma margem de
segurança para não danificar a peça. O material removido foi fixado em solução de
formalina tamponada a 10% até o momento do processamento histológico. Cada
recipiente foi identificado com o número do animal, o grupo e sua zona respectiva
(teste ou controle).
3.8 PROCESSAMENTO E ESTUDO HISTOLÓGICO
Após o período de fixação, os espécimes de tecidos foram processados de
acordo com a rotina para inclusão em parafina.
56
Os blocos submetidos à inclusão foram identificados e submetidos à
microtomia. Cortes de 5 m foram assim destinados à técnica de coloração
histológica HE.
A aquisição das imagens foi realizada no Parque Científico e Tecnológico da
PUCRS (TECNOPUC), no Centro de Excelência em Pesquisa sobre
Armazenamento de Carbono (CEPAC), no Laboratório de Petrologia. Foi utilizado
um microscópio óptico petrográfico da marca Carl Zeiss
®
, modelo AXIO
Imager.A1m
®
, com uma ocular de 2 X para as medições entre as margens epiteliais
(Figura 09) e de 10 X e 20 X para as análises descritivas do epitélio. As lâminas
foram identificadas com um código para garantir que, durante a leitura, o examinador
desconhecesse a qual grupo pertencia cada lâmina observada.
Figura 09: Exemplo da medição entre as margens epiteliais. Evidencia-se a
predominante zona de tecido de granulação e o epitélio.
Zona com
predominância
de tecido de
granulação
Medida entre
as margens
epiteliais
Epitélio
57
Para calibração, a cada 20 lâminas observadas, o examinador repetiu,
individual e separadamente, a observação de 10 lâminas, comparando as medidas
obtidas entre ambas as observações e aplicando o teste Kappa intra-examinador a
fim de verificar a veracidade das medidas. Para quantificar o grau de concordância
para os resultados dos testes Kappa aplicados, utilizou-se a porcentagem de
concordância recomendados por Landis e Koch (1977), em que são aceitos apenas
os seguintes valores: 0,61 a 0,80, representando importante concordância, e 0,81 a
1,0, representando quase concordância completa (SIEGEL, 1975). Caso essas
concordâncias não eram obtidas, a análise das lâminas era repetida.
Por ser representativa no processo de cicatrização, estabeleceu-se como
critério de avaliação a reepitelização da ferida. Para tanto, foi medida a distância
entre as bordas epiteliais utilizando-se o programa ImageJ 1.43u
®
. No software,
utilizou-se a ferramenta Straight, sendo considerado os números fornecidos pelo
programa em relação à medida Lenght (comprimento).
O artigo base utilizado para as análises histológicas é o estudo dirigido por
Braiman-Wiksman et al. (2007).
58
Resultados
59
4 RESULTADOS
4.1 ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA
As lâminas foram analisadas em microscópico óptico com aumento de 2 X,
fotografadas e inseridas no programa ImageJ 1.43u
®
para as medições.
Para as análises histomorfológicas, foram também realizadas fotografias
com aumentos de 10 X e 20 X.
Os dados coletados referentes as medidas entre as bardos epiteliais dos
grupos (I, II e II), subgrupos (A, B e C) e ferimentos tratados com laser (teste) e sem
laser (controle) estão disponíveis na tabela 03.
60
Tabela 03: Medições entre as bordas epiteliais.
Teste
Controle
GRUPO I
8 J/cm
2
n = 11
IA (4
dias)
1.915,620
2.298,814
1.711,683
2.702,696
2.319,110
2.564,851
2.181,204
2.298,691
IB (7
dias)
1.956,343
1.565,000
2.593,347
2.012,254
962,469
804,955
0,000
3.191,542
IC (9
dias)
0,000
1.534,000
253,178
797,577
174,158
0,000
GRUPO II
16 J/cm
2
n = 12
IIA (4
dias)
3.389,620
2.499,548
1.995,066
3.250,931
3.085,867
3.709,952
2.724,951
3.418,351
IIB (7
dias)
1.467,994
1.766,552
1.960,839
2.023,407
1.819,231
1.084,502
1.329,037
2.084,026
IIC (9
dias)
1.572,849
1.364,232
1.067,863
505,898
726,099
734,261
0,000
241,471
GRUPO III
4 J/cm
2
n = 12
IIIA (4
dias)
2.816,295
2.860,000
2.557,517
3.123,165
2.004,144
3.583,395
2.677,889
2.871,026
IIIB (7
dias)
1.857,039
3.306,974
2.564,197
2.399,774
1.824,904
2.730,823
1.978,494
2.524,840
IIIC (9
dias)
904,317
697,226
0,000
787,440
0,000
985,346
0,000
866,678
Determinou-se a diferença entre as medidas do comprimento sobre o
processo de reparo das feridas cutâneas (as bordas epiteliais), sem o uso de laser
(controle) e com a irradiação laser (teste). Estas diferenças foram analisadas por
meio de Análise de Variância (ANOVA) fatorial univariada. As feridas cutâneas
61
foram irradiadas com o laser de fosfeto de índio-gálio-alumínio com fluência de 8
J/cm
2
(padrão), 4 e 16 J/cm
2
nos tempos de 4, 7 e 9 dias de observação. Os
resultados obtidos estão disponíveis na tabela 04.
Tabela 04: ANOVA fatorial univariada da diferença entre as duas medidas do
processo de reparo das feridas cutâneas.
Fonte de variação
Estatística do teste - F
p
Grupo
1,123
0,340
Tempo
0,049
0,953
Grupo X Tempo (Interação)
0,204
0,934
Nas tabelas 05 e 06 são apresentadas as estimativas para a variável
dependente “diferença” para cada um dos fatores analisados.
Tabela 05: Estimativa para a variável dependente diferença, segundo o fator grupo.
Grupo
n
Média
Desvio padrão
Intervalo de 95% de
confiança
I – 8 J/cm
2
11
528,17
262,32
(-11,03; 067,37)
II – 16 J/cm
2
12
128,64
248,86
(-382,89; 640,17)
III – 4 J/cm
2
12
629,32
248.86
(117,79; 1140,86)
Tabela 06: Estimativa para a variável dependente diferença, segundo o fator tempo.
Tempo
n
Média
Desvio padrão
Intervalo de 95% de
confiança
I – 4 dias
11
483,54
248,86
(-27,99; 995,07)
II – 7 dias
12
431, 73
248,86
(-79,80; 943,26)
III – 9 dias
12
370,87
262,32
(-168,33; 910,07)
De acordo com os resultados expressos na tabela 04 os efeitos isolados,
grupo e tempo, não foram significativos, a um nível de significância de 5% e também
não há evidências de interação entre eles.
62
Na tabela 07 é apresentado o resultado do estudo considerando somente o
uso ou não do laser, sem levar em conta o tempo de observação e as diferentes
doses de energias utilizadas.
Tabela 07: Teste t de Student para a diferença das medidas das amostras entre
teste e controle.
n
Média
Desvio padrão
Erro padrão da média
Controle
(sem laser)
35
1976,86
1058,30
178,89
Teste
(com laser)
35
1554,04
1016,97
171,90
Diferença
35
422,82
798,42
134,96
O teste t de Student pareado (laser X sem laser) apresentou uma estatística
de teste igual a 3,13 com um valor de p = 0,004.
No gráfico 01, observa-se a comparação entre as medidas teste e controle
nos diferentes grupos.
Gráfico 01. Medidas teste e controle por grupos.
1797.3
1278.8
1890.3
1761.6
2228.1
1598.2
0
500
1000
1500
2000
2500
Grupo 1
(8 J/cm
2
)
Grupo 2
(16 J/cm
2
)
Grupo 3
(4 J/cm
2
)
Distância entre as bordas epiteliais
Controle
Teste
63
Na tabela 08, observam-se os valores referentes à média das medidas das
amostras teste e controle separados por tempo de morte dos animais.
Tabela 08: Média, desvio padrão e erro padrão da média das amostras teste e
controle por tempo de morte dos animais.
Tempo
Média
n
Desvio padrão
Erro padrão da média
4 dias
Controle
2931,7850
11
485,20123
140,06553
Teste
2448,24,72
11
512,23655
147,86995
7 dias
Controle
2124,5541
12
764,49138
220,68965
Teste
1692,8245
12
702,94612
202,92307
9 dias
Controle
774,0117
12
440,67924
132,86979
Teste
427,1333
12
551,97412
166,42646
Na tabela 09, observam-se os valores referentes à diferença entre as
médias das medidas entre as amostras teste e controle separados por tempo de
morte dos animais. Verifica-se, utilizando-se o teste t pareado, que existe diferença
significativa (p = 0,024) somente entre as medidas médias das diferenças entre as
amostras teste e as amostras controle dos animais mortos no quarto dia de
observação.
64
Tabela 09: Média, desvio padrão, média do erro padrão e significância dos valores
referentes à diferença entre as medidas entre as amostras teste e controle
separados por tempo de morte dos animais.
Diferença
Intervalo de
confiança da
diferença = 95 %
Tempo
Média
Desvio
padrão
Erro padrão da
média
Significância
4 dias
483,53783
638,91558
184,43904
0,024
7 dias
431,72958
1083,60931
312,81106
0,195
9 dias
346,87845
644,90079
194,44491
0,105
4.2 ANÁLISE HISTOMORFOLÓGICA
Através das imagens obtidas, podem-se estabelecer comparações entre as
feridas tratadas e não tratadas com laser, entre as feridas tratadas com a mesma
dose de energia e analisadas em tempos diferentes e entre as feridas tratadas com
doses de energias diferentes e analisadas com o mesmo tempo de observação.
Desse modo, avaliam-se os fatores laser, dose de energia e tempo de observação.
Ao analisar as figuras 10 e 11 (fotomicrografias referentes ao animais com
menores valores histomorfométricos no grupo IIC), estabelece-se a comparação
entre as feridas tratadas sem laser (grupo IIC, controle) e tratadas com laser (grupo
IIC, teste - 16 J/cm
2
), respectivamente. Em ambas as figuras, observa-se uma área
de coágulo desprendida do tecido, uma intensa área de tecido de granulação
dominando praticamente toda a região de tecido subepitelial, e o epitélio. O tecido
cicatricial caracteriza-se por inúmeros vasos sanguíneos (neovascularização),
fibroblastos ainda sem orientação (fibroplasia inicial) e intensa celularidade, com a
presença significativa de células inflamatórias.
Este foi um padrão cicatricial encontrado em praticamente todos os cortes
histológicos analisados, independentes do tempo de observação, do tratamento ou
não com laser e da dose de energia utilizada. Verificou-se sempre uma grande área
65
de tecido de granulação sob o local do ferimento, compreendendo praticamente toda
a região de tecido subepitelial. Verificaram-se diferenças na espessura do tecido
epitelial e na distância entre as margens epiteliais rompidas pelo ferimento.
Em relação ao tecido epitelial observado na figura 10, verifica-se que as
margens epiteliais estão em processo de migração em direção ao centro do
ferimento, migrando por cima do tecido de granulação. Já na figura 11, o ferimento já
se encontra epitelizado, com pequena espessura de tecido epitelial.
66
Figura 10: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20 X (c)
de uma amostra sem tratamento com laser e morte do animal em
9 dias (grupo IIC, controle).
a
b
c
67
Figura 11: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20 X (c)
de uma amostra tratada com 16 J/cm
2
e morte do animal em 9
dias (grupo IIC, teste).
c
b
a
68
Na análise das figuras 12, 13 e 14 (fotomicrografias referentes ao animais
com menores valores histomorfométricos nos grupos IA, IB e IC, respectivamente),
comparam-se as feridas tratadas com a mesma dose de energia (8 J/cm
2
) e
analisadas em tempos diferentes. O padrão cicatricial de tecido de granulação é
claramente identificado e, ao observar o tecido epitelial, nota-se que o mesmo ainda
está em processo de migração apenas na figura 12 (observa-se apenas a margem
epitelial esquerda da lesão), com período de observação de 4 dias, estando as
feridas das figuras 13 e 14 já epitelizadas.
69
Figura 12: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20 X (c)
de uma amostra tratada com 8 J/cm
2
e morte do animal em 4 dias
(grupo IA).
b
a
c
70
Ao comparar o tecido epitelial das figuras 13 (7 dias) e 14 (9 dias), observa-
se uma maior espessura do tecido epitelial quando analisado com 9 dias de período
observatório, caracterizado por um maior número de camadas de células epiteliais.
Figura 13: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20 X (c)
de uma amostra tratada com 8 J/cm
2
e morte do animal em 7 dias
(grupo IB).
c
c
c
71
Figura 14: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20 X (c)
de uma amostra tratada com 8 J/cm
2
e morte do animal em 9 dias
(grupo IC).
Na análise das figuras 14 (8J/cm
2
), 11 (16 J/cm
2
) e 15 (4 J/cm
2
)
(fotomicrografias referentes ao animais com menores valores histomorfométricos nos
grupos IC, IIC e IIIC), comparam-se as feridas tratadas com doses de energia
diferentes e morte do animal no mesmo tempo (9 dias). O padrão cicatricial de tecido
de granulação é novamente identificado e, ao se observar o tecido epitelial, nota-se
que os três grupos apresentam as feridas já epitelizadas.
b
c
a
72
Em relação à espessura do tecido epitelial, observa-se que o epitélio
correspondente a ferida tratada com 8J/cm
2
é ligeiramente maior que o da ferida
tratada com 4 J/cm
2
, que por sua vez é discretamente superior a ferida tratada com
16J/cm
2
.
73
Figura 15: Fotomicrografia em aumento original de 2 X (a), 10 X (b) e 20 X (c)
de uma amostra tratada com 4 J/cm
2
e morte do animal em 9 dias
(grupo IIIC).
c
b
a
74
Discussão
75
5 DISCUSSÃO
Al-Watban et al. (2009
b
)
afirmam que a LLLT tem sido usada para aumentar
a velocidade de cicatrização de feridas em animais e seres humanos, apresentando
resultados positivos e negativos (nenhum efeito). Em concordância, Gál et al.
(2009)
afirmam que os parâmetros ótimos da terapia laser em baixa intensidade para a
cicatrização de feridas ainda são amplamente discutidos. Portanto, comprimentos de
onda, doses de energia e tempos de observação têm sido utilizados nas atuais
pesquisas com uma variedade extremamente alta.
A luz laser interage com os tecidos biológicos basicamente de quatro
formas: reflexão, transmissão, espalhamento e absorção.
Para que a interação seja
efetiva, os fótons oriundos dos equipamentos laser devem ser absorvidos pelos
elétrons dos átomos do tecido-alvo, ou seja, o comprimento de onda do laser deve
ser ressonante com o tecido-alvo (POLI, 2006).
Então, quando sua energia é absorvida, as moléculas do tecido atingem
um estado de excitação molecular. A quantidade de energia presente na molécula
excitada pelo laser, somada à energia cinética da partícula vizinha, representa o
aumento de agitação térmica dessa partícula vizinha e, conseqüentemente, o
pequeno aumento de temperatura ocorrido pela absorção de energia laser. Essas
modificações, a nível molecular, resultarão nas alterações celulares e teciduais
(MCKENZIE, 1990). Desse modo, o comprimento de onda da luz laser que age
sobre os cromóforos é o que define a interação da radiação com o tecido (POLI,
2006).
Al-Watban et al. (2009
b
)
compararam lasers com diferentes comprimentos
de onda (532, 633, 670 e 810 nm) no processo de cicatrização de queimaduras em
ratos. O percentual de cura após LLLT foi de 78,37% para o laser visível e de
50,68% para o laser invisível. Os autores concluíram que o laser, tanto visível como
invisível, pode acelerar a cicatrização de queimaduras e que os efeitos dos lasers
visíveis (vermelho) foram melhores do que os lasers invisíveis (infravermelho).
Para avaliar a cicatrização de ferimentos em pele de ratos, Araújo et al.
(2007) planejaram um experimento no qual foram realizados dois ferimentos
76
circulares em cada animal, sendo um deles irradiado com laser de He-Ne (632 nm) e
o outro controle. Os ferimentos foram analisados nos períodos de um, cinco, oito, 12
e 15 dias de pós-operatório por análise histológica. Os pesquisadores concluíram
que as lesões irradiadas apresentaram reepitelização acelerada quando
comparadas com o grupo controle. A derme irradiada continha maior número de
fibroblastos ativos que no grupo controle, e a radiação laser reduziu o processo
inflamatório local, além de, aparentemente, organizar as fibras colágenas na área do
reparo.
A absorção depende da composição do tecido, da pigmentação e do
conteúdo de água do mesmo (MELLO; MELLO, 2001). Cromóforos, como a
melanina, adenina, hemoglobina e proteínas, apresentam-se mais ressonantes com
radiação laser emitida no espectro da luz vermelha (POLI, 2006).
Partindo dessas premissas, optou-se, neste estudo, pela utilização de um
laser de fosfeto de índio-gálio-alumínio, o qual emite radiação com 685 nm de
comprimento de onda. Portanto, um laser altamente ressonante com os tecidos que
participam do processo de reparo epitelial.
Dall Agnol et al. (2009) compararam os efeitos da LLLT com LED no
processo de reparo de feridas produzidas em dorso de ratos. Utilizaram 36 ratos,
divididos em diabéticos e não diabéticos e os irradiaram com laser (660 nm e 6
J/cm
2
) e LED, uma única vez, 30 minutos após o procedimento cirúrgico. A morte
dos animais ocorreu no sétimo dia. As análises histomorfológica e histomorfométrica
mostraram que tanto o laser como o LED promoveram uma aceleração na
cicatrização das feridas cutâneas.
Rocha et al.
(2009) avaliaram o efeito da LLLT na expressão da citocina
imunossupressora beta-TGF no sítio de reparação tecidual, assim como a presença
de células apoptóticas no tecido epitelial. Os pesquisadores realizaram ferimentos
cutâneos em ratos e avaliaram a cicatrização cutânea. Foram utilizados 30 ratos,
com morte no décimo dia, e os animais foram divididos em dois grupos: controle e
tratamento com LLLT em 635 nm e 3,8 J/cm
2
. Os resultados mostraram que a
laserterapia pode ser um importante indutor de apoptose durante o processo de
reparação tecidual e que a LLLT tem um efeito imunomodulador na expressão da
TGF-beta em locais de cicatrização de feridas.
77
Em outro estudo, foi comparada a eficácia da LLLT com a da luz polarizada
em queimaduras de segundo grau em roedores. Os lasers utilizados foram o
vermelho (660 nm) e o infravermelho (780 nm), sendo realizadas 4 irradiações de 5
J/cm
2
em intervalos de 24 hs. A análise dos resultados demonstrou que os tecidos
danificados foram capazes de absorver e processar eficientemente a luz em todos
os comprimentos de onda testados. A LLLT com 660 nm foi a terapia que
apresentou os melhores resultados (OLIVEIRA et al., 2008)
Al-Watnaban e Zhang (1999) realizaram um estudo para definir o
comprimento de onda ideal no tratamento de feridas cutâneas no dorso de ratos. Os
melhores resultados obtidos foram os seguintes, na ordem crescente de efetividade:
He-Ne (632 nm), As-Ga-Al (780 nm), argônio (488-514 nm), As-Ga-Al (830 nm), He-
Cd (442 nm) e criptônio (640-670 nm). Esta constatação comprova que a
profundidade de penetração do laser, a qual está relacionada com o comprimento de
onda, não é proporcional aos efeitos biomodulatórios da laserterapia em ferimentos
superficiais, como os gerados no dorso dos ratos.
Al-Watban (2009
a
) testaram vários comprimentos de onda laser em
ferimentos cutâneos e queimaduras em ratos normais e diabéticos. Os
comprimentos de onda testados foram os seguintes: 532, 633, 810, 980 e 10.600
nm. Os autores concluíram que o comprimento de onda de 633 nm, portanto um
laser vermelho, foi o que apresentou os melhores resultados, com melhoras entre
38.5% e 53.4% nos ferimentos cutâneos.
O presente trabalho comprova os resultados apresentados pelos estudos
acima citados, tanto no aspecto de aumento na velocidade de reparação tecidual
nas feridas tratadas com laser como no aspecto da radiação emitida no espectro
vermelho apresentar resultados efetivos.
Nesta pesquisa, através da análise histomorfométrica, comprovou-se a
eficácia do laser vermelho no processo de reparo de feridas em dorso de ratos, com
resultados estatisticamente significantes quando se comparou as feridas irradiadas
com laser com as feridas sem irradiação. Na análise histomorfológica, também se
comprovou estes resultados: observou-se um grau de epitelização, ou fechamento
da ferida, superior nas feridas tratadas com laser em comparação com as não
tratadas. Portanto, confirma-se com este estudo que a LLLT aumenta a velocidade
78
de cicatrização epitelial em ferimentos em dorso de ratos, sendo o comprimento de
onda de 685 nm efetivo para este fim.
Outro fator controverso nas pesquisas que avaliam a cicatrização de
feridas com a utilização da radiação laser é a dose de energia que deve ser
utilizada.
Nussbaum et al. (2009) produziram feridas cutâneas em ratos e trataram
com laser vermelho (635 nm) nas fluências de 1 e 20 J/cm
2
. Foi avaliado o potencial
bactericida do laser assim como a aceleração da atividade tecidual. As feridas
irradiadas com 1 J/cm
2
cicatrizaram da mesma forma que os controles. As que foram
irradiadas com 20 J/cm
2
, cicatrizaram piores que os controles no dia 3. Com esta
mesma dose de energia, os autores observaram um retardo no fechamento da ferida
no dia 19. Em relação à flora bacteriana, verificaram diminuição da flora da pele
sadia e aumento da colonização de S. aureus.
Ezzati et al.
(2009) investigaram a influência da LLLT na cicatrização de
queimaduras de terceiro grau em ratos. Duas queimaduras (distal e proximal) foram
produzidas na pele de 74 ratos, os quais foram divididos em quatro grupos: no grupo
1, o ferimento distal recebeu a LLLT com laser desligado, nos grupos 2 e 3, as
queimaduras distais foram tratados com laser de diodo com 660 nm e com
densidades de energia de 2,3 e 11,7 J/cm
2
, respectivamente, e no grupo 4 as
queimaduras distais foram tratadas topicamente com nitrofurazona a 0,2%. O
ferimento proximal foi considerado controle e os animais foram mortos todos no
mesmo tempo. Foi observado que LLLT com 11,7 J/cm
2
aumentou
significativamente a taxa de fechamento da ferida em 3 e 4 semanas em
comparação com o controle.
Al-Watnaban e Zhang
(1999) realizaram um estudo para definir a fluência
ideal no tratamento de feridas cutâneas no dorso de ratos. Utilizaram 10, 20 e 30
J/cm
2
, irradiados três vezes por semana. A dose de energia que apresentou os
melhores resultados foi a com 20 J/cm
2
.
Em outro estudo, Al-Watban et al. (2009
b
) utilizaram doses de energia de 5,
10 e 20 J/cm
2
, com 3 irradiações por semana e tempo de morte único. Novamente
constataram que os melhores resultados eram os obtidos com 20 J/cm
2
.
79
Diversos estudos têm utilizado a fluência de 20 J/cm
2
para analisar o
reparo de feridas cutâneas provocadas no dorso de ratos (Al-Watnaban; Zhang,
1999; Mendez, 2002; Oliveira, 2002).
Mendez (2002) constatou que a associação entre os comprimentos de
onda de 685 nm e 830 nm (10 J/cm
2
para cada) foram os que promoveram os
melhores resultados no reparo de feridas cutâneas.
Em um estudo mais recente, Al-Watban (2009
a
) utilizou doses de energia
de 4,71 J/cm
2
em ratos diabéticos e 2,35 J/cm
2
em ratos normais, com 3 irradiações
por semana.
No presente estudo, através da análise histomorfométrica, ao comparar as
diferentes fluências utilizadas, não se evidenciou diferenças estatisticamente
significativas. Na análise histomorfológica, ao analisarmos a ferida em 9 dias,
evidenciou-se uma epitelização avançada, e por vezes completa, do ferimento tanto
das feridas tratadas com 4, 8 ou 16 J/cm
2
. Portanto, neste estudo, os ferimentos
responderam positivamente e sem diferenças entre eles para as diferentes fluências
utilizadas.
O último fator que este estudo se propôs a analisar e comparar com a
literatura atual é o tempo de observação das feridas tratadas com laser.
Araújo et al. (2007) realizaram experimento utilizando como períodos de
observação um, cinco, oito, 12 e 15 dias. Oliveira et al. (2008) utilizaram um, dois,
três e quatro dias e Nussbaum et al.(2009) avaliaram 3 vezes por semana, entre os
dias 1 e 19. Dall Agnol et al.(2009) utilizaram tempo único (7 dias), assim como
Rocha et al. (2009) (10 dias).
Ribeiro et al.(2009) avaliaram o efeito biomodulatório em miofibroblastos e
células T e B da terapia a laser em baixa intensidade durante a cicatrização. Feridas
cirúrgicas foram realizadas no dorso de 24 ratos machos, onde metade deles foram
submetidos à LLLT com 20 J/cm
2
e comprimento de onda de 660 nm, sendo as
feridas irradiadas diariamente, por 7 dias. Aos 8 e 14 dias de pós-operatório, as
feridas foram removidas e submetidas à análise imunohistoquímica de
miofibroblastos, células T e células B. A média do número de miofibroblastos foi
significativamente maior no grupo irradiado do que no grupo não irradiado no oitavo
dia, mas não no 14
0
dia. As células T e as células B foram significativamente mais
visíveis no grupo irradiado, tanto no oitavo dia como no 14
0
. Os autores concluíram
80
que a LLLT facilita a diferenciação de miofibroblastos durante as fases iniciais do
processo de reparo cicatricial, assim como a laserterapia parece modular a resposta
inflamatória positivamente.
Gál et al. (2009) compararam os efeitos de diferentes densidades de
potência da LLLT com = 635 nm em ferimentos em ratos tratados ou não com
esteróides. Quatro feridas na pele do dorso de 48 ratos foram produzidas, gerando
dois grupos (LLLT sem esteróides e LLLT com esteróides). Três feridas foram
estimuladas diariamente com um laser de diodo com fluência de 5 J/cm
2
, cada uma
com diferente densidade de potência (1 mW/cm
2
, 5 mW/cm
2
e 15 mW/cm
2
),
enquanto a quarta ferida serviu como controle. Dois dias, seis dias e 14 dias após a
cirurgia, oito animais de cada grupo foram sacrificados e as amostras foram retiradas
para avaliação histológica. Nos ratos tratados sem esteróides, uma aceleração
significativa da síntese de colágeno e epitelização em dois e seis dias após a cirurgia
foi observada. Nos ratos tratados com esteróides, em 2 e 14 dias, observou-se uma
diminuição de leucócitos e macrófagos, assim como redução da área de tecido de
granulação. Os autores concluíram que a laserterapia melhorou a cicatrização de
feridas em ratos tratados sem esteróides.
No estudo de Oliveira et al. (2008), a LLLT com 660 nm também
apresentou os melhores resultados nas fases iniciais da cicatrização, demonstrando
um tecido recém-formado semelhante à derme normal.
No presente estudo, ao se analisar o tempo de morte dos animais e
comparar os valores referentes à diferença entre as médias das medidas entre as
amostras teste e controle, verifica-se que existe diferença significativa somente nos
animais mortos no quarto dia de observação.
Este resultado corrobora com os artigos acima citados que afirmam que a
LLLT tem seus efeitos mais evidentes nos momentos iniciais do processo de reparo
tecidual.
Este resultado é elucidado pela análise histomorfológica, pois ao se
comparar os diferentes tempos de cicatrização, observa-se que em 4 dias a ferida
ainda está em processo de cicatrização, sem a epitelização completa do ferimento.
Porém, ao se analisar os tempos de 7 e 9 dias, observa-se o ferimento já epitelizado,
distinguindo discretamente apenas em relação a espessura da camada epitelial,
81
onde no nono dia é mais espessa em relação ao sétimo dia, porém sem
significância.
Já na comparação entre os valores referentes à diferença entre as médias
das medidas entre as amostras teste e controle considerando-se o tempo de morte
dos animais e as fluências, verifica-se que não houve diferença significativa em
nenhuma das comparações. Isto decorre do fato de os grupos, separados por dose
de energia utilizada, não apresentarem diferenças entre si.
Nesta mesma comparação, através do teste ANOVA fatorial univariada,
evidenciou-se que não há interação entre os fatores dose de energia e tempo de
observação.
Portanto, este estudo indica a realização de novas pesquisas neste campo,
considerando os parâmetros utilizados de 4, 8 e 16 J/cm
2
, visto que a grande maioria
dos estudos demonstra diferenças entre fluências distintas, porém em um único
período observacional, devendo este ser um período curto de tempo, na qual o
processo de reparo tecidual esteja em sua fase inicial.
82
Conclusões
83
6 CONCLUSÕES
A partir das análises histomorfométrica e histomorfológica, este estudo
demonstrou haver uma aceleração no processo cicatricial em ferimentos produzidos
em dorso de ratos, quando irradiados com o laser em baixa intensidade de fosfeto
de índio-gálio-aluminio ( = 685 nm). Não há diferenças entre as doses de energia
utilizadas (4, 8 e 16 J/cm
2
), mas o fator tempo parece ser relevante, sendo as
alterações mais evidentes nos momentos iniciais do processo de reparo.
84
Referências
85
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90
Anexos
91
ANEXO A
Aprovação do Projeto de Tese pela Comissão Científica e de Ética da Faculdade de
Odontologia da PUCRS
92
ANEXO B
Aprovação do Projeto de Tese pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Pró-
Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da PUCRS
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