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VIVIANE ALBUQUERQUE
BESERRA CORREIA
SELEÇÃO E CARACTERIZ
AÇÃO MOLECULAR DE UM
A LIPASE DO
METAGENOMA DE SOLO D
O CERRADO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Stricto Sensu em Ciências
Genômicas e Biotecnologia da Universi
dade
Católica de Brasília, como requisito parcial
para a obtenção do Título de Mestre.
Orientador: Drª Eliane Ferreira Noronha
Brasília
2010
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TERMO DE APROVAÇÃO
Dissertação de autoria de Viviane Albuquerque Beserra Correia, intitulada
SELEÇ
ÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UMA LÍPASE DE METAGENOMA DE
SOLO DO CERRADO , apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, em 13
de maio de 2010, defendida e
aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
Prof. Dra. Eliane Ferreira Noronha
Orientador
UnB
Prof. Dra. Betânia Ferraz Quirino
Membro Interno
UCB
Prof. Dr. Ricardo Henrique Krüger
Membro Externo
UnB
Brasília
2010
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AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter permitido aproveitar uma oportunidade de crescimento, pessoal e
profissional, e ter me dado forças para concluir esse trabalho.
À minha orientadora Eliane Noronha, por acreditado em mim e oferecido um projeto
tão interessante. Pelas suas conversas e pela facilidade que tem em interagir
conosco. Por mostrar seu ponto de vista, mas permitir que também possamos
contribuir com algo. Pelas explicações nos momentos de dúvida, onde depois tudo
parece mais simples e fácil. Fico feliz que você tenha
me orientado nesse projeto!
Aos amigos que estiveram presente, ajudando no que eu precisasse no laboratório
ou até mesmo com as conversas pra lá de animadoras e momentos descontraídos.
Querida Isabel, Nídia, Rodrigo, Janaína, Lucas, Samuel, Shelly, Abdalla, Virgílio,
Ciro e Ida. Gosto muito de vocês e podem ter certeza que os momentos que
passamos juntos foram especiais, apesar dos desafios e das dificuldades.
À Maíra por estar sempre disposta a me ajudar, aliás foram tantas ajudas que só
tenho a agradecer. Pelas nossas conversas, pela companhia quando voltava pra
casa e por sua preocupação comigo. Maíra, obrigada por tudo! Estarei sempre
torcendo por você.
À Thaís Lemos, por seu otimismo todas as vezes que preparávamos algo para o
experimento. Sempre me dizia: Tô sentindo que vai dar certo.
Tá
sentindo?. Mesmo
nos meus dias mais desanimados, você conseguia me animar. Sem contar a super
ajuda nesse trabalho. Obrigada!
Aos amigos Ísis, Fernanda, Luís Eduardo e Cris além do apoio no laboratório foram
comp
anhias excelentes. Tantos almoços juntos, conversas e mais conversas,
alegrias. Vocês são muito fofos!
As amigas Karla Ayres e Paulina Araújo, sempre me apoiando e incentivando.
Compreensivas em meus momentos de ausência. Vocês duas são muito queridas!
À Aline Castro, meu enorme agradecimento! Sua ajuda foi valiosíssima e contribuiu
muito nesse trabalho. Sempre disposta a me ajudar e a transmitir seus
conhecimentos. Você teve uma participação especial. Obrigada!
A todos que contribuíram de alguma maneira para o desenvolvimento desse
trabalho.
Em especial a minha família, que sempre foi e sempre será o meu alicerce. Aos
meus pais Ivo e Celina e minha irmã Eliane, por todo apoio e incentivo. Sempre
acreditando no meu sucesso. Amo vocês!
A minha segunda f
amília
sogros, cunhados (as) e sobrinhos - que entenderam
minha ausência nos eventos familiares e sempre torceram por mim. Todos vocês
são pessoas maravilhosas que eu quero sempre estar perto!
E finalmente ao meu grande amor Danilo. Com sua paciência,
compreensão,
otimismo e seu incentivo, sempre me fazendo acreditar que tudo daria certo. Você
sabe como me animar, suas conversas são muitas vezes revigorantes. Já passamos
por tantos momentos difíceis e você sempre esteve forte ao meu lado, mas
passamos
por muitos momentos alegres e esses foram sempre especiais.
Construímos muitas coisas juntos, mas sem dúvida o amor é o maior entre tudo que
temos, esse está cada vez mais forte. Te Amo!!!
Sumário
RESUMO
................................ ................................ ................................ ................................
................
..6
ABSTRACT
............................................................................................................................................
..
.7
1.
INTRODUÇÃO
................................ ................................ ................................
...............................
...
...
8
1.1.
Tecnologia
Enzimática........
..........................................................................................................
8
1.2. Microrganismos como fonte de enzimas industriais....................................................................
9
1.3. Metagenômica para a
bioprospecção de enzimas industriais....................................................
11
1.4. Lipases bacterianas.....................................................................................................................1
4
1.4.1. Classificação
e mecanismo de catálise
.........................................................................
.
......1
4
1.4.2. Aplicação industrial.
...........................................................................................................
.
19
1.5. Lipase
s metagenômicas..............................................................................................................
20
2.
OBJETIVOS
................................ ................................
................................ ................................ ........
24
2
.1.
Objetivo
Geral
..........................
...................................................................................................
24
2
.2. Objetivos Específicos
..............................................................................................
..............
......2
4
3.
MATERIAL E
MÉTODOS
................................ ................................
................................
....................
25
3
.1.
Construção da b
iblioteca metagenômica
............................................................................
......2
5
3
.2. Seleção de clones recombinantes
.......................................................................................
......2
5
3.3
.
Extração de DNA e análise do perfil de restrição.............
....................................................
......2
6
3.4
.
Teste de complementação
..................................................................................................
......
28
3.5
.
Estratégia de sequenciamento
.............................................................................................
......
28
3.5.1. Identificação da sequência codificadora da atividade lipolítica.......................................
...
28
3.5.2. Sequenciamento
..................................................................................................................
30
3.6
.
Análise de sequências
.....................................................
...........................................................
31
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
................................ ................................ ................................
..............
33
5. CONCLUSÃO
................................ ................................
................................ ................................
......
43
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
................................
................................ ................................ ........
44
6
RESUMO
O solo é um habitat com elevada diversidade de microrganismos e, portanto com
potencial de utilização como fonte de enzimas industriais. Este recurso genético
pode ser explorado para a identificação de novas biomoléculas que sejam
adequadas para aplicações biotecnológicas. Enzimas microbianas são as proteínas
mais comercializadas no mercado mundial e o microbioma solo, como outros, é uma
importante fonte de genes para aplicações biotecnológicas. No entanto, estimativas
indicam que uma pequena fração de microrganismos de solo é passível de cultivo
em laboratório. A construção de bibliotecas
meta
genômicas a partir de DNA total de
amostras ambientais surge como uma alternativa para acessar esta informação
genética ainda não explorada, e, portanto, é uma importante ferramenta para
obtenção de novos genes. As lipases são hidrolases de grande aplicação
biotecnológica, podendo ser utilizadas na indústria alimentícia, na produção de
detergentes, de biodiesel, na biorremediação de rejeitos industriais de origem
lipídica
, entre outros processos. Considerando o potencial biotecnológico de
aplicação destas enzimas, a necessidade da constante busca de enzimas com
propriedades cinéticas adequadas à utilização em processos industriais, bem como
o potencial de utilização de bibliotecas metagenômicas como fonte de novos genes,
este trabalho visa à seleção e caracterização de novas lipases do metagenoma de
solo de Cerrado. Com a triagem funcional da biblioteca metagenômica foram obtidos
três clones com atividade lipolítica de 6.720 analisados. O clone LIP3, que
apresentava um maior halo de degradação em meio com tributirina, foi caracterizado
e sequenciado. Na sequência completa de um dos fragmentos de restrição (4kb),
foram identificadas quatro ORFs (quadros de leitura aberta),
OR
F1
-
aldolase,
ORF2-
lipase/esterase,
ORF3-
acil
-CoA desidrogenase e ORF4-uridiltransferase. A
comparação desta lipase/esterase com outras sequências de lipases deposi
tadas no
banco de dados do NCBI, resultou na sua
classificação
como pertencente a uma
nova família de lipases e permitiu a identificação de motivos de aminoácidos
conservados com lipases da família V. A maior identidade de proteínas (63%) foi
observada com uma lipase de solo de florestas.
Palavras
-
chave: Lipases, Enzimas industriais, Metagenoma.
7
ABSTRACT
Soil is a habitat with high diversity of microorganisms and thus be potentially used as
a source of industrial enzymes. T
his
genetic resource can be explored to the
identification of novel biomolecules suitable
for
biotechnological applications.
Microbial enzymes are the most commercialized proteins
in the
world market, and the
soil microbiome, like others,
is
an important source of genes for biotechnological
applications
;
however, the majority of soil bacteria are not readily cultured on
standard
laboratory conditions. Therefore, the culture-independent techniques
,
such
as the metagenomic approach,
are
way
to access the genetic diversity of most
bacteria.
Lipases are hydrolases
with
biotechnological application in the food
indu
stry, production of detergents and
biodiesel,
and
in bioremediation of industrial
wastes.
Considering the potential biotechnological application of these enzymes, the
need for constant search of enzymes with kinetic properties suitable for use in
industrial processes as well as the potential use of metagenomics libraries as a
source of new genes, this work aims at the selection and characterization of novel
lipases genes from a metagenomic library of soil from the savannah-like vegetation.
The fun
ctional
screening of this library resulted in the identification of three lypolitic
clones from 6720 evaluated.
The
clone LIP3, with the highest activity against
trybutitrin was characterized and sequenced. In the complete sequence of
a
restriction fragment (4kb), four ORFs (Open Reading Frame) were identified,
ORF1
-
aldolase,
ORF2
-
lipase/esterase,
ORF
3-
acyl
-CoA dehydrogenase and ORF4-
uridyltransferase.
The
comparison of
th
e
lipase/esterase
with
other
lipase
sequences
deposited in the NCBI database resulted in
its
identification as belonging to a new
family of lipases and allowed the identification of the amino acid motifs conserved in
lipase family V. The highest identity of protein (63%) was observed with a lipase from
forest soil.
Keywords: Lipases, Industrial Enzymes, metagenomic.
8
1
INTRODUÇÃO
1.1
Tecnologia enzimática
O uso industrial de enzimas, nas últimas décadas, ganhou bastante espaço
em virtude da crescente preocupação com os problemas ambientais causados pelas
indústrias, como o acúmulo de rejeitos, o descarte de produtos tóxicos gerados em
etapas de produção, bem como pela qualidade do produto gerado (Punja e Utekde,
2003; Rao et al, 1998). As vendas no mercado mundial de enzimas cresceram de
US$
400 milhões/ano na década de 80 para mais de US$ 1 bilhão/ano na década de
90.
De acordo com o relatório do Business Communications Company Inc,o
mercado mundial de enzimas industriais aumentou de US$ 2,2 bilhões em 2006 para
US$ 2,3 bilhões até o final de 2007. Ele deve chegar a US$ 2,7 bilhões em 2012,
uma taxa de crescimento anual de 4% (T
hakore
, 2008
).
Enzimas de diferentes
classes, principalmente as microbianas, são comercializadas no mercado mundial,
sendo que as hidrolases e dentre estas as proteases representam a maior fração
das enzimas comercializadas (Godfrey
e
West, 19
95; Rao et al, 1998). No entanto, a
tendência é de mudança neste quadro de vendas, em função da crescente demanda
por enzimas passíveis de aplicação em processos de biorremediação, tratamento de
efluentes industriais, química fina e na hidrólise de biomassa vegetal para produção
de biocombustíveis (Anais do Congresso Brasileiro de Tecnologia Enzimática, 2006).
A expansão da biocatálise é particularmente importante para o Brasil, pois o
país precisa se inserir de forma representativa como usuário de tecnolo
gia
enzimática, para a obtenção de produtos de alta qualidade e de maior valor
agregado, por tecnologias limpas, e em sintonia com as necessidades tecnológicas,
de mercado e de preservação ambiental, que norteiam os processos produtivos
internacionais. O avanço desta tecnologia no Brasil é favorecido pela diversidade de
microrganismos que podem ser explorados como fontes de enzimas, a quantidade e
variedade de matérias-primas renováveis passíveis de serem transformadas, por via
enzimática, em produtos úteis e de maior valor agregado, além do domínio da
comunidade científica em tecnologias para produção de enzimas em larga escala.
9
As enzimas de aplicação industrial devem apresentar características cinéticas
adequadas ao processo industrial no qual será aplicada. Portanto, a viabilidade de
processos industriais baseados na utilização de enzimas depende de uma constante
inovação visando a um melhor desempenho e redução de custo de produção. Por
isto, a busca por novas enzimas mais termoestáveis, específicas e com maior
eficiência catalítica é uma constante dentro da tecnologia enzimática. A engenharia
de proteínas, também é uma importante ferramenta para a otimização de processos
enzimáticos industriais, através desta técnica é possível alterar a sequência de uma
dada proteína de interesse modificando as suas propriedades cinéticas. Neste caso,
as proteínas resultantes são selecionadas para a característica que se deseja, como
por exemplo, maior estabilidade a solventes orgânicos e maior estabilidade térmica.
(
Oka
mura et al, 2009).
1.2
Microrganismos como fonte de enzimas industriais
Os microrganismos são encontrados em diferentes tipos de habitats,
adaptados a diferentes condições climáticas, de temperatura, salinidade, e também
sob pressão biótica, que influenciam em sua atividade e distribuição (Xu, 2006). Em
função desta diversidade metabólica, da maior facilidade de obtenção de material e
das propriedades cinéticas de suas enzimas, mais adequadas a processos
industriais estes organismos são explorados como fonte de enzimas industriais
(Sharma et al, 2001
;
Steele et al,
2008
).
O solo é um ambiente complexo que inclui uma série de micro-
habitats
e um
dos maiores reservatórios de biodiversidade microbiana devido à sua
heterogeneidade física, química
,
biológica
, e condições ambientais descontínuas
(Torsvik e Ovreas, 2002
;
Rajendhran
e Gunasekaran, 2008; Hansel et al, 2008). A
diversidade microbiana em ecossistemas de solo ultrapassa a de organismos
eucarióticos. Essa diversidade engloba a variabilidade genética dentro de táxons
(espécies), a riqueza, a abundância relativa de táxons e os grupos funcionais nas
comunidades
(Garbeva et al, 2004). Além disto, é superior à dos ambientes
aquáticos
sendo, portanto, um importante recurso para a exploração biotecnológica
de
novos organismos, produtos e processos
(Torsvik e Ovreas, 2002)
.
10
Um grama de solo pode
conter
até 10 bilhões de microrganismos,
possivelmente milhares de espécies diferentes, no entanto estudos de diversidade
microbiana demonstram que, pelo menos para amostras de solo, somente 1% d
os
procariotos presentes são passíveis de cultivo em condições laboratoriais (Torsvik e
Ovreas, 2002). Relacionando com a estimativa do número de células procarióticas
presentes no solo, 1 grama de solo pode conter de
2.000 a 18.
000 genomas
(Daniel,
2005).
Desta forma, a bioprospecção de procariotos para obtenção de biomoléculas
de interesse industrial baseadas em cultivo acessa apenas uma pequena fração
d
est
a diversidade microbiana (Voget et al, 2003; Streit e Schmitz, 2004; Ferrer et al,
2009).
Estudos de diversidade bacteriana baseados em s
eqüências,
demonstraram
uma maior complexidade das comunidades que anteriormente eram conhecidas
apenas por técnicas baseadas em cultivo. De aproximadamente 50 filos bacterianos,
metade contém
apenas
bactérias não cultiváveis.
Estudos de diversidade de bactérias e fungos em solos do Cerrado
stricto
sensu
já foram relatados por Quirino et al (2009)
e
De Castro et al (2008),
respectivamente. Estes autores analisaram a diversidade da microbiota
associada
ao solo desta fitofisionomia em área de preservação
ambiental
do IBGE, localizada
35 km ao sul do centro de Brasília - Distrito Federal
DF, com base n
o
seqüenciamento de genes 16S e 18S
rDNA.
A comunidade bacteriana presente
nesta microbiota
fo
i distribuída
nos
filos:
-Proteobactérias (26,4%), seguido por
Acidobacteria (22,2%) e Actinobacteria (19,4%). Os demais grupos de bactérias
foram identificados -Proteobacteria, -Proteobacteria, -
Proteobacteria,
Fibrobacteres, Planctomycetes, Chloroflexi, Verrucomicrobia e bactérias
desconhecidas.
O filo Acidobacteria inclui um grupo de bactérias com importante papel
ecológico em função de sua abundância e diversidade, no entanto, pouco se sabe
de sua fisiologia e metabolismo, em função da dificuldade de seu cultivo. Já a
s
actinobacterias incluem bactérias gram-positivas produtoras de antibióticos e
enzimas de interesse industrial. Portanto, o estudo funcional do metagenoma desta
microbiota pode ser útil para a identificação de novos genes em função da
ocorrência de bactérias não cultiváveis, novos genes codificadores de proteínas de
interesse industrial, bem como, para o entendimento da fisiologia e do papel
ecológico destas bactérias.
11
1.3
Metagenômica para a bioprospecção de enzimas industriais
O termo metagenoma é definido como o conjunto de genomas presentes em
uma dada microbiota, e
foi
citado pela primeira vez na base de pesquisa bibliográfica
do NCBI
(Pubmed)
por Handelsman e colaboradores em 1998. Neste trabalho, os
autores reportaram a viabilidade da extração de DNA de amostras ambientais, bem
como a clonagem e análise funcional do metagenoma de solo. Este tipo de
abordagem experimental possibilita a análise de um conjunto de genomas de
procariotos de uma amostra independentemente de seu cultivo, e, portanto, favorece
o acesso à informação genética ainda não explorada (Cowan et al, 2005
;
Lämmle et
al, 2007
; Warnecke
e
Hess, 2009
)
.
Além do potencial de utilização na prospecção de genes de interesse
biotecnológico, as ferramentas desta nova tecnologia, denominada metagenômica,
podem
também
aumentar a compreensão do processo de evolução do genoma e os
fatores que regulam a sua diversidade (Torsvik e Ovreas, 2002
).
Além de permitirem
uma maior compreensão das suas funções, sua evolução e a maneira q
ue
interagem
nos mais diversos ambientes
(Huson et al, 2009).
As etapas básicas da construção de bibliotecas de DNA
como
: a geração de
fragmentos de DNA com tamanhos adequados, a clonagem dos fragmentos em um
vetor apropriado e
a
triagem
funcional da bibli
oteca
para os genes de interesse
,
têm
sido utilizadas com sucesso
há
mais de três décadas, porém a metagenômica só se
desenvolveu em meados da década de 90, com a sua aplicação bem sucedida n
a
construção
e triagem funcional de uma biblioteca de metagenoma
marinho
(Figura
1)
. A partir deste trabalho, outros pesquisadores e empresas também publicaram
resultados demonstrando a utilização destas técnicas na análise da diversidade de
amostras ambientais, na construção de bibliotecas de 16S rDNA, e também para
a
nálise funcional a partir de bibliotecas metagenômicas
(
Cowan et al, 2005).
12
Figura
1.
Identificação de novos genes e análise
funcional
do
metagenoma
de
comunidades
microbianas.
Etapas:
(a) o isolamento do DNA de nichos microbianos;
(b)
construção de
bibliotecas de DNA;
(c)
seleção
de clones
de interesse e seqüências de DNA; e (d) Obtenção de
de clones
de interesse
.
Adaptado de Streit e Schmitz (2004).
atccgattcggctaaaat
(A) Isolamento d
e
DNA a partir de
nichos microbianos
(B) Construção de
bibliotecas de DNA
Pequenos insertos
(plasmídeos)
Análise funcional
Análise baseada
em sequências
(C) Seleção de
clones e sequências
de DNA de interesse
(D)
Obtenção
de clones de
interesse
A
plicações biotecnológicas
13
Enzimas de interesse biotecnológico, tais como celulases, fosfatases,
amilases, lipases e peptidases, já foram obtidas de bibliotecas metagenômicas
construídas a partir de amostras de diferentes biomas como solos, água doce, água
marinha e de fluido estomacal de ruminantes (Kim et al, 2006; Knietsch et al, 2003;
Rajendhran
e Gunasekaran, 2008; Voget et al, 2006; Yun et al, 2004).
Duan
e
colaboradores (
2009
), por exemplo, obtiveram de uma biblioteca metagenômica de
rúmen 61 clones
com
atividade
celulolítica. Os genes codificadores da atividade de
interesse (
13
) foram subclonados e expressos em Escherichia coli. As celulases
recombinantes apresentaram maior atividade na faixa d
e
pH entre 4 e 7, sendo que
sete delas foram mais ativas em condições ácidas. Indicando o potencial de sua
utilização na degradação de biomassa celulósica para produção de bioetanol
.
Lämmle e colaboradores em 2007 publicaram um trabalho mostrando a
seleçã
o de clones com atividade de fosfatase a partir também de uma biblioteca
metagenômica de solo. Um importante subgrupo de fosfatases são as fitases, que
catalisam a hidrólise de fitato e conseqüente liberação de fosfato. Este composto é
encontrado em biomas
sa vegetal utilizada na nutrição de animais e responsável pela
baixa digestibilidade deste alimento, assim como pelo aumento da deposição de
cristais de fosfato nos dejetos destes animais. Desta forma, as fitases microbianas
possuem potencial de aplicação como aditivos em rações animais, melhorando a
digestibilidade do fósforo e reduzindo a sua deposição do ambiente.
As peptidases são as enzimas mais demandadas no mercado mundial,
possuindo uma extensa lista de aplicações industriais, dentre as quais pode-se citar
seu uso como aditivos alimentares e agentes de limpeza. Apesar do grande
interesse mundial nesta classe de enzimas, poucos trabalhos de prospecção de
peptidases em bibliotecas metagenômicas já foram relatados. Contudo, é possível
citar trabalhos como de Waschkowitz e colaboradores (2009) que obtiveram dois
clones com atividade proteolítica a partir de biblioteca metagenômica de solo.
Clones com atividade de quitinase já foram obtidos a partir de amostras ambientais
de um lago na Antártida, e a seqü
ência protéica predita destas enzimas possui baixo
percentual de identidade (inferior a 60%) com sequências de quitinases depositadas
em banco de dados (Xiao et al, 2005), indicando a
identificação
de novos genes
14
codificadores desta atividade enzimática. As amilases, utilizadas na indústria
alimentícia, na fabricação de ração, na produção de detergentes entre outros
processos,
também já
foram obtidas de metagenoma de solo
(Yun et al, 2004).
1.4
Lipases
bacterianas
1.4.1. Classificação e mecanismo de catá
lise
As lipases são enzimas que possuem atividade hidrolítica ou de acil-
transferases sobre substratos de origem lipídica, apresentando classificação
baseada em seu modo de ação, tipo de substrato sobre o qual atua ou na
similaridade de sequência. De acordo com o seu modo de ação e tipo de substrato
estas enzimas são classificadas como: esterases, lipases verdadeiras ou
fosfolipases.
As esterases e lipases verdadeiras pertencem à classe das carboxil-
éster
-
hidrolases que catalisam a hidrólise ou formação de ligações éster (Jeon et al,
200
9). As esterases (E.C. 3.1.1.1) hidrolisam estas ligações de acil-ésteres de
cadeia curta, solúveis ou emulsificados, enquanto as lipases (E.C. 3.1.1.3) atuam
sobre triacilglicerídeos de cadeias longas (Arpigny
e
Jaeger, 19
99)
(Figura 2)
.
15
Indicar
Além da atividade hidrolítica sobre ligação éster-
carboxílicas
as l
ipases
também
catalisam
reações de esterificação, interesterificação, acidólise, alcoólise e
aminólise
(Figura 3
).
Triacilglicerol
Ácidos graxos
Glicerol
Lipases
Figura 3.
Representação esquemática das reações catalisadas por lipases.
Adaptado de Paques e
Macedo (2006).
Figura 2.
Reação de hidrólise de triacilglicerídeos. Lipases verdadeiras hidrolisam ligações éster de
ácidos graxos de cadeia longa com mais de 10 carbonos e as esterases agem em cadeias menores. A
posição do rompimento das ligações do glicerol está indicada pelas setas largas. Adaptado de Silva
(2002).
16
As fosfolipases possuem especificidade de ligação com fosfoglicerídeos,
hidrolisando um grupo acila dos mesmos. Estas enzimas são classificadas como
fosfolipase A, C e D dependendo do seu modo de ação (White et al, 1976). A
fosfolipase A remove um dos dois ácidos graxos constituintes das moléculas de
fosfolipídios, produzindo um lisofosfolipídio e o segundo ácido graxo é removido
então pela lisofosfolipase (Vieira, 2003). A retirada da cabeça polar, através do
rompimento das ligações fosfodiéster, é feita pela fosfolipase C e D.
Em geral as lipases microbianas
possuem
massa molecular variando de
20
a
60 kDa, a tríade catalítica
Serina
-
histidina
-aspartato (
Ser
-
His
-
Asp
) e
o
motivo
estrutural conservado composto por uma estrutura em folha -pregueada central
contendo um resíduo de aminoácido de serina
ativ
o posicionado em uma volta
chamada de cotovelo catalítico e circundada por estruturas em - hélices
(Bornscheuer, 2002) (Figura 4)
.
Em função deste motivo estrutural, estas enzimas
são classificadas como pertencentes à superfamília estrutural, / hidrolases.
O
resíduo de serina ativo destas enzimas, geralmente, é encontrado em um
pentapetídeo conservado composto pelos aminoácidos glicina e serina intercalados
com qualquer resíduo de amin
oácido,
GXSXG
.
Figura 4. Representação esquemática do motivo estrutural conservado em enzimas
da família
/
hidrolase. Filamentos em conformação
(1-
8)
formando uma
estrutura em folha -
pregueada
estão indicados pelas setas,
estrutura em
-
hélices
(A
-
F)
indicadas pelas colunas. As posições relativas dos aminoácidos da tríade
catalítica estão indicadas pelo
s círculos. Retirado de Bornscheuer (2002).
17
Considerando a dificuldade na classificação de lipases com base no
mecanismo de reação, Arpigny e Jaeger
(1999)
propuseram um sistema de
classificação baseado na similaridade de seqüências. De acordo com este sistema,
as lipases de origem bacteriana foram classificadas em oito famílias distintas, I a
VIII.
A família I é representada, principalmente por lipases verdadeiras e é
subdividida
em seis subfamílias (1 a 6), em função da maior ou menor similaridade
com a seqüência de uma lipa
se de
Pseudomonas aeruginosa.
A subfamília I.1 é representada por lipases verdadeiras com similaridade de
seqüências com enzimas de espécies de
Pseudomonas
, que inicialmente deu
origem à classificação da família
I
. Esta
sub
família inclui enzimas de
Vibrio
cholerae
,
Acinetobacter calcoaceticus
,
P. wisconsinensis e Proteus vulgaris com massa
molecular em torno de 30 a 32 kDa. A subfamília I.2. é representada por prot
eínas
com massa molecular de 33kDa em função da inserção de resíduos de aminoácidos
que formam uma estrutura em folha -pregueada anti-paralela na superfície da
molécula. A atividade das enzimas destas sub-
famílias
depende
da presença de
uma proteína chaperona denominada foldase lipase-específica ( Lif ), da ligação a
íons Ca
+2
intermediada por 2 resíduos de aspartato conservados nestas enzimas e
localizados próximos à tríade catalítica. Outra característica comum entre estas
sub
famílias é a presença também na vizinhança do sítio ativo de dois resíduos de
aminoácidos de cisteína que formam uma ponte dissulfeto e provavelmente em
conjunto com o sítio de ligação a íons cálcio tem papel na estabilização do sítio
ativo.
A subfamília I.3 contem enzimas de duas espécies distintas,
Pseudomonas
fluorescens
e Serratia marcescens. Estas lipases
têm
em comum uma maior massa
molecular que as lipases das subfamílias I.1 e I.2, com valores entre 50 a 65 kDa, e
a ausência de um peptídeo sinal N-terminal e dos resíduos de cisteína. A subfamília
I.4 agrupa lipases das espécies Bacillus subtilis e Bacillus pumilus e apresentam
como característica comum enzimas com massa molecular de 20 kDa e percentual
de similaridade baixo, 15%, com as enzimas da sub-família I.5. A família I.5 é
representada por lipases de outras espécies de
Bacillus
e do gênero
Staphilococcus
apres
entando como característica comum a substituição da primeira glicina do
pentapeptídeo conservado por alanina. Por último, as lipases que possuem
18
similaridade com as lipases de Propionibacterium acnes e Streptomyces
cinnamoneus
fazem parte da subfamília I.6
(Arpigny e Jaeger, 1999)
.
As enzimas agrupadas na família II (GDSL) não apresentam o convencional
pentapeptídeo G-X-S-X-G, mas sim, um resíduo de aspartato e outro de leucina na
vizinhança do resíduo ativo de serina, G-D-S-L, sendo que a serina está muito mais
próxima da extremidade N-terminal do que em outras enzimas lipolíticas (Arpigny e
Jaeger, 1999). As hidrolases desta família apresentam propriedades multifuncionais
e ampla especificidade de substrato, devido à flexibilidade do sítio ativo que sofre
uma mudança conformacional sobre a ligação do substrato (Okamura et al, 2009).
A família III contém lipases extracelulares de
Streptomyces
sp. e
Moxarella
sp
enquanto a família IV possui lipases adaptadas ao frio apresentando similaridade
com lipases hormô
nio
-sensível de mamíferos. Membros da família V mostram
semelhanças
com várias enzimas bacterianas não lipolíticas, ou seja, de-
halogenase, haloper
oxidases e epóxido hidrolases. Na
família VI
a forma ativa dessa
enzima
é um dímero com a subunidade /
hidr
olase
e a clássica tríade catalítica
(Ser
-
Asp
-
His) e
com similaridade a lisofosfolipase de mamíferos (Jaeger et al, 1999).
Os representantes da família VII incluem esterases e enzimas com atividade
hidrolítica sobre carbamato e ésteres de p-
nitrobenzyl
.
As
esterases desta família
possuem similaridade de sequência com -lactamases. Ao contrário das outras
famílias de esterases microbianas, onde o resíduo de serina do sítio ativo está
geralmente localizado no G-X-S-X-G ou motivo GDSL, na família VIII o resíduo de
serina do sítio ativo está situado no motivo S-X-X-K (Rashamuse et al, 2009).
Apesar deste sistema de classificação ser muito utilizado na classificação de lipases,
já existem descritas na literatura seqüências de lipases que não agrupam em
nenhuma destas famílias, indicando, portanto, a necessidade da criação de novas
famílias e subfamílias.
Outra característica utilizada na distinção de esterases e lipases verdadeiras
é a estrutura tridimensional e a atividade na interface entre meio aquoso e não
aquoso.
As lipases verdadeiras apresentam uma sequência de aminoácidos que se
organiza em um volta
que recobre o domínio da fenda hidrofóbica. Na presença do
substrato estas enzimas sofrem uma ativação interfacial em função de uma
mudança conformacional. Esta ocorre em função do movimento de
sta
volta
que
19
recobre
a
bolsa hidrofóbica expondo-
a.
Esta ativação é exclusiva para a família I e
também é responsável pela versatilidade das reações de catálise, hidrólise,
esterificação, transesterificação e interesterificação de gorduras e óleos e depende
fortemente das condiç
ões da solução
(Mala
e
Takeuchi, 2008)
.
O conhecimento da estrutura de lipases e esterases tem aumentado
consideravelmente nos últimos anos através da elucidação de muitas seqüências
gênicas.
A classificação deste grande conjunto de dados e identificação das famílias
e subfamílias de enzimas lipolíticas tem sido feitos a fim de identificar as sequências
de motivos conservados em enzimas lipolíticas provenientes de uma ampla
variedade de organismos, e relacioná-las a elementos estruturais de três dimensões
envolvidos no reconhecimento do substrato e catálise, sendo essencial para a
compreensão da
fun
ção de enzimas lipolíticas
(Arpigny e Jaeger, 1999
).
1.4.2. Aplicação industrial
As lipases já foram descritas em vegetais, animais e microrganismos, sendo
qu
e as microbianas são as mais utilizadas industrialmente, devido às diferentes
atividades
que apresentam e suas propriedades cinéticas. Além de questões
relacionadas aos microrganismos como: eficiência de secreção de enzimas,
facilidade de manipulação genética, produção independente de flutuações sazonais
e a facilidade de seu cultivo em meios de cultura
de baixo custo
(Joseph et al, 2007).
Estas enzimas apresentam uma extensa lista de possibilidades de aplicações
industriais destacando-se o seu potencial de utilização em etapas de produção de
biodiesel a partir de óleos vegetais e na biorremediação de rejeitos industriais de
origem lipídica (Jeon et al, 2009
;
Noureddini
et al, 2005). Efluentes
industriais
com
elevadas concentrações de lipídeos resultam na formação de lodo com dife
rentes
características físicas e de natureza recalcitrante
, causando um grande impacto para
o meio ambiente. O tratamento destes efluentes com microrganismos ou enzimas
lipolíticas, é uma estratégia promissora na redução da sua
conce
ntração lipídica
,
e,
portanto, para diminuição do impacto ambiental causado pelo seu descarte. O bio-
tratamento apresenta
vantagens
em relação ao tratamento químico por não gerar
20
subprodutos tóxicos e também por contribuir para a redução dos custos em term
os
d
e energia e equipamentos
(Mendes e Castro, 2005).
A indústria farmacêutica também faz uso de lipases microbianas, neste caso
visando à obtenção de produtos com níveis aumentados de ácidos graxos
poliinsaturados (AGPI) a partir de óleos vegetais ou animais (Carvalho et al, 2003),
além da sua aplicação na fabricação de cosméticos (Jeon et al, 2009). Em muitos
processos em indústrias alimentícias, as lipases são utilizadas na fabricação de
novos óleos e gorduras, visando alteração de propriedades físicas ou até mesmo do
aspecto nutricional (Villeneuve, 2003). As lipases também são utilizadas na indústria
coureira no processo de remoção da gordura e dos pêlos que estão no couro. Além
do uso
na formulação de detergentes (Prazeres et al, 2006).
A maioria das lipases produzidas para fins comerciais são provenientes de
microrganismos, principalmente as isoladas de origem bacteriana como
Bacillus
,
Pseudomonas
e
Burkholderia
. As diferentes aplicações industriais destas enzimas
advêm de suas características cinéticas distintas, as lipases caracterizam-se por
apresentarem atividade em amplo intervalo de pH, 3 a 11, e temperatura de 30 a
60ºC (Gupta et al, 2004). A mudança conformacional da estrutura da enzima durante
a catálise permite a hidrólise do substrato insolúvel em água e a adsorção na
interface óleo/água (Arpigny e Jaeger, 1999). Características como a estabilidade a
solventes orgânicos, a não exigência de cofatores e ainda especificidade ao
substrato fazem dessas, enzimas com um grande potencial biotecnológico (Roh e
Villatte, 2008).
1.5
Lipases metagenômicas
Esterases e lipases bacterianas também já foram obtidas a partir de
metagenoma
de diferentes biomas (Cottrell et al, 1999; Elend et al, 2007; Jeon et al,
200
9; Sik et al, 2007; Xiao et al, 2005).
A
partir da construção de uma biblioteca
metagenômica utilizando amostras provenientes de sedimento do mar ártico, Jeon e
colaboradores (2009) encontraram seis clones com atividade lipolítica, dentre estes
dois foram caracterizados. Essas enzimas demonstraram similaridade com
21
esterases/lipases de microrganismos não cultiváveis de regiões temperadas. Wei et
al (2009) também isolaram duas lipases, mas a partir de amostras de solos da
China,
sendo que as sequências de aminoácidos apresentaram um tamanho similar
à sequência de aminoácidos da lipase de um organismo cultivável, mostrando uma
identidade de 64%. As duas enzimas obtidas apresentaram maior atividade em
baixas temperaturas, o que as tornam interessantes para aplicações na formulação
de detergentes e de a
ditivos.
Outros trabalhos já foram realizados para identificação
destas enzimas em microbiotas distintas e estão sumarizados na tabela 1.
Poucas destas enzimas já foram caracterizadas quanto a seus parâmetros
cinéticos, em função de um descompasso entre a velocidade de identificação de
clones positivos, de seu seqüenciamento e expressão da proteína de interesse. Isto
se deve, em parte, ao elevado número de clones que são detectados na triagem
funcional de uma única biblioteca metagenômica (Schmeisser et al, 2007)
.
Em um
de seus trabalhos
Schmeisser
e colaboradores (2007) relataram que cerca de 80
clones positivos para
lipases/
esterase
s derivados de metagenoma já foram
relatados
, e que a tendência é de aumento neste número em função dos
avanços
nas técnicas
de seleção de clones com a atividade desejada.
22
Fonte
Clones positivos/n
o
de
clones avaliados
Vetor
Referência
Bacias hipersalinas
(Mar Mediterrâneo)
Rúmen
de bovino
Solo de floresta, praia,
lama
Água de lagoa
Solo
Solo
Solo contami
nado e
água potável
Sedimento do Mar
Báltico
Solo de mata
Sedimento marinho
Biomassa
Solo
Lago
Solo
Fontes termais
Solo de campo
Água de rio
Solo
Hot Spring
Sedimento marinho
Solo de jardim
Lodo
estação de
esgoto
Rúmen de bovino
5/7.0
00
12/14.000
1/60.000
11/30.000
1/730.000*
3/286.000
2/28.224
1/2.500
1/1.600
1/7.000
8/33.700
1/386.400
10/10.000
2/800
1/10.000*
2/30.000
6/93.000
1/**
1/1.532
1/8.000
2/36.000
6/60.132
14/21.000
1/100.000
18/15.360
Phagemíd
eo
Phagemídeo
Fosmídeo
Plasmídeo
Plasm
ídeo
BAC
Cosmídeo
Fosmídeo
Fosmídeo
Fosmídeo
Cosmídeo
Plasmídeo
Phagemídeo
Plasmídeo
Fosmídeo
Cosmídeo
BAC
Plasmídeo
Fosmídeo
Plasmídeo
Plasmídeo
BAC
Ferrer et al (2005a)
Ferrer et a
l (2005b)
Kim et al (2006)
Rajan et al (2005)
Henne et al (2000)
Rondon et al (2000)
Elend et al (2006)
Hårdeman e Sjöling (2006)
Lee et al (2004)
Lee et al (2006)
Meileur et al (2009)
Wei et al (2009)
Rees et al (2003)
Li et al (2008
)
Rhee et al (2005)
Voget et al (2003)
Wu e Sun (2009)
Tirawongsaroj et al (2008)
Jeon et al (2009)
Lämmle et al (2007)
Roh e Villatte (2008)
Liu et al (2009)
* Utilização de substratos diferentes.
** Dado não mostrado
Tabela 1.
Clones positivos para atividade lipolítica (lipases/esterases) a partir de
construção de bibliotecas metagenômicas.
23
As lipases derivadas de metagenoma já caracterizadas possuem
propriedades cinéticas semelhantes às de organismos psicrofílicos, que catalisam
reações em baixa ou moderada temperatura. Esta característica tem valor
biotecnológico por ser adequada para as condições utilizadas
em
indústrias de
síntese orgânica.
Além
de seu potencial de utilização como aditivo em
detergentes
biodegradáveis
estáveis e ativos em temperaturas moderadas (Joseph et al, 2007).
No entanto, o mercado mundial de enzimas ainda demanda lipases termoestáveis,
por sua maior estabilidade, maior eficiência, e por ser uma condição que favorece a
solubilização dos substratos, além de reduzir o risco de contaminação microbiana
(Hasan et al, 2005).
24
2
OBJETIVOS
2
.1
Objetivo Geral
Considerando a riqueza e biodiversidade de espécies de
bactérias
da
microbiota do solo de Cerrado, o potencial de aplicação industrial de lipases, a
necessidade da constante busca de enzimas adequadas aos processos industriais e
o potencial da metagenômica na busca de novas enzimas para apli
cação
biotecnológica, p
ropõe
-se neste trabalho, a seleção de novas enzimas lipolíticas a
partir de uma biblioteca metagenômica de solo do Cerrado, com a perspectiva de
obtenção de enzimas para utilização em processos industriais.
2
.2
Objetivos Específic
os
Avaliar a produção de lipases por clones de uma biblioteca metagenômica de
solo de Cerrado Sensu Stricto ;
Verificar a estabilidade do fenótipo de produção de atividade lipolítica;
Seq
uenciar o DNA plasmidial do clone
com atividade lipolítica
;
Analisar as seq
u
ências geradas no seq
u
enciamento deste clone.
25
3
MATERIAL E MÉTODOS
3
.1
C
onstrução da b
iblioteca metagenômica
A biblioteca metagenômica utilizada neste estudo foi cedida pelo Dr. Ricardo
Henrique Krüger (Universidade de Brasília). Para a sua construção foram utilizadas
amostras de solo coletadas na reserva ecológica do Instituto Brasileiro de Geografia
e Estatística (IBGE) em outubro de 2006 compreendendo a estação chuvosa.
A
Reser
va Ecológica do IBGE situa-
se
35 km ao sul do centro de Br
asília
- Distrito
Federal
- DF, no km 0 da BR 251. As amostras de solo foram coletadas em área de
Cerrado
sensu
stricto
(15
o
57´02.4´´ S, 47
o
52´32.1´´ W). A biblioteca foi construída
por Castro (2007) com fragmentos de DNA variando de 2 a 10 kb,
utilizand
o
E. coli
EPI
-
300 como hospedeira e
o
vetor pCF430. Este vetor caracteriza
-
se pela presença
das marcas de seleção de resistência a
tetraciclina
e indução com arabinose.
3
.2
Seleção de clones recombinantes
A seleção de clones metagenômicos produtores de lipases foi realizada em
meio de cultura sólido (LB-ágar), conforme descrito por Lee et al. (2004). Para tanto,
os clones da biblioteca metagenômica foram inoculados neste meio de cultura
contendo 1% de tributirina, 40 µg/ml de tetraciclina e 0,02% de arabinose. As
culturas foram incubadas a 37
O
C por 16 horas, e posteriormente à temperatura
ambiente, sendo analisadas a cada 24 horas até 5 dias de cultivo, para visualização
dos halos de hidrólise em torno das colônias produtoras de lipases. As colônias q
ue
apresentaram o halo de hidrólise do substrato tributirina foram coletadas e
novamente plaqueadas em meio seletivo. Este procedimento foi repetido por três
vezes para a confirmação da atividade dos clones selecionados. Três clones
denominados LIP1, LIP2 e LIP3 foram confirmados como produtores de atividade
26
lipolítica, e posteriormente utilizados nos experimentos de análise do perfil de
restrição, teste de
retransformação
e seq
u
enciamento do DNA plasmidial.
3.3
E
xtração
de DNA e
a
nálise do perfil de restr
ição
Para a extração do DNA plasmidial os clones com atividade lipolítica foram
c
ultivados
em 250 mL de meio LB (g.L
-1
: Bactotriptona 10g, Extrato de levedura 5g,
NaCl 10g
pH 7,0) contendo tetraciclina (40 µg/ml), a 37ºC e 240 rpm
.
Após 18
horas de cultivo as culturas foram centrifugadas a 4000g por 10 minutos. A extração
do DNA plasmidial ocorreu conforme o protocolo
PEG
-
LiCl.
O sobrenadante foi
descartado e as células ressuspendidas em 20 mL da solução STE gelada (
NaCl
0,1M, Tris-HCl 10mM
pH 8,0, EDTA 1mM
pH 8,0), centrifugadas mais uma vez,
nas mesmas condições. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspendid
as
em
5 mL de solução I gelada (Glicose 50 mM, Tris-HCl 25 mM
pH 8,0, EDTA 10
mM
pH 8,0
)
contendo 0,5 mL de lisozima (10mg/mL) e incubadas no gelo por 10
minutos. Em seguida adicionou-se 10 mL da solução II (NaOH 0,2 N, SDS 1%), e
esta amostra foi à temperatura ambiente por 5 a 10 minutos. Decorrido esse tempo
foram adicionados à amostra 7,5 mL da solução III gelada (Acetato de potássio 3M,
Ácido acético 2M
pH 4,8-
5,0
). A amostra foi incubada no gelo por 10 minutos,
sendo possível observar nessa etapa um precipitado branco contendo o DNA
cromossomal. Esta amostra foi centrifugada a 12.000g por 15 minutos a 4ºC e o
sobrenadante transferido para outro tubo. Ao sobrenadante foi
adicionado
½ volume
de isopropanol para precipitar o DNA plasmidial, esta etapa foi realizada à
temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida foi realizada uma nova
centrifugação nas mesmas condições descritas acima, o sobrenadante foi
descartado e o precipitado lavado com etanol 70% e seco à vácuo. O precipitado foi
ressuspendido em 3mL de tampão TE (
Tris
-HCl 20 mM
pH 8,0, EDTA 20mM) e
adicionado de 3 mL de LiCl 5M previamente resfriado, misturando bem e
cen
trifugando a 12.000g por 10 minutos a 4ºC.
O sobrenadante foi transferido para outro tubo e acrescido de igual volume de
isopropanol, misturando bem e centrifugando nas mesmas condições. O precipitado
27
foi lavado uma vez com etanol 70% e deixado secar, ent
ão
ressuspendido
em 500
µL de tampão TE contendo RNase A na concentração final de 20 µg/mL. A solução
foi transferida para um microtubo e incubada à temperatura ambiente por 30
minutos. Foram adicionados a esta mistura 500 µL de uma solução de NaCl 1,6M
contendo 13% de polietileno glicol (PEG), e esta foi incubada por 30 minutos a 4ºC,
sendo em seguida centrifugada a 12.000g por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi
removido com a pipeta e o precipitado ressuspendido em 400 µL de tampão TE. A
solução foi ex
traída uma vez com fenol
equilibrado
pH 8,0
, outra com clorofane
(
25
fenol equilibrado
pH 8,0: 24 clorofil: 1 álcool) e por último com clorofil (
24
clorofórmio: 1 álcool isoamílico). A fase aquosa foi transferida para um novo
microtubo e a ela adiciono
u-
se 100 µL de acetato de amônio 10M. Em seguida foram
adicionados dois volumes de etanol 100%, esta mistura foi incubada por 10 minutos
à temperatura ambiente. Depois de centrifugar a 12.000g por 10 minutos a 4ºC, o
sobrenadante foi removido e o precipitado lavado duas vezes com etanol 70%. Após
secar o precipitado foi ressuspendido em 500 µL de tampão TR (
Tris
-HCl 10mM
pH 7,5, EDTA 1mM
)
e estocado a
-2
0ºC até sua utilização como fonte de DNA.
Para analisar a presença de insertos, fragmentos com tamanho esperado de
6 a 10
k
b,
fo
i utilizado o
DNA extraído dos clones LIP1, LIP2 e LIP3
e
digerido com a
enzima de restrição
Pst
I (10 U/µL - Promega, Madison, WI, EUA) por 16 horas a
37ºC. O sistema de digestão foi realizado da seguinte maneira: 5 µL de DNA (4 µ
g),
1 µL BSA 10X, 1µL de tampão H (promega), 1 µL de enzima
Pst
I
(10 U) e 2 µL de
água MilliQ em um volume final de 10 µL. Após 16 horas de reação a enzima
Pst
I
foi inativada à 65ºC por 15 minutos e o DNA digerido submetido a eletroforese em
gel de agarose a 0,8%, com voltagem contínua de 96V. Para visualização do DNA o
gel foi corado em solução de brometo de etídeo por 20 minutos, descorado em água
destilada por 10 minutos e irradiado com luz ultravioleta. Os três clones com
atividade lipolítica, LIP1, LIP2 e LIP3, apresentaram fragmentos de restrição de
tamanho esperado entre 6 a 10 kb. E, portanto, foram selecionados para os
próximos experimentos de confirmação do fenótipo de produção de atividade
lipolítica.
28
3.4
T
este de
retransformação
O DNA plas
midial
(0,8µg/µL)
dos clones LIP1, LIP2 e LIP3, extraído como
descrito no item anterior, foi utilizado na transformação de células de E. coli
(EPI
-
300) por eletroporação utilizando o aparelho: eletroporador Gene Pulsed® (Biorad).
A eletroporação foi realizada nas seguintes condições: capacitância 25 µF;
resistência de 200 -
700
; voltagem 1.8 Kv. Após o procedimento de eletroporaç
ão,
foi adicionado às células 1 mL de meio de cultura SOC (g.L
-1
:
20g de triptona, 5g de
extrato de levedura e 0,5g de NaCl, KCl a 250 mM - pH 7,0, acrescido de MgCl
2
2M
e glico
se
20mM
). Esta cultura foi incubada por uma hora a 37ºC, e as células,
posteriormente, plaqueadas em meio LB-ágar contendo 40 µg/ml de tetraciclina,
tributirina a 1% e arabinose a 0,02%. Estas placas foram incubadas durante a noite
a 37ºC e após esse período foram deixadas em temperatura ambiente e analisadas
a cada 24 horas até 5 dias de cultivo. Os clones recombinantes foram selecionados
pelo crescimento neste meio de cultura e pela capacidade de degradar tributirina,
evidenciada pela formação de halos de hidrólise em torno das colônias. Os clones
recombinantes foram plaqueados novamente em outra placa contendo o meio de
cultura seletivo, este procedimento foi repetido mais uma vez visando a confirmação
da atividade lipolítica dos clones selecionados.
3.5
E
stratégia de sequenciamento
3.5.1 Identificação da seq
u
ência codificadora da atividade lipolítica
O clone LIP3, apresentou maior halo de hidrólise de tributirina em teste de
atividade em placa e por isto foi selecionado para seq
u
enciamento. Como o clo
ne de
interesse apresentou dois fragmentos de restrição após tratamento com a enzima
Pst
I, o primeiro passo na estratégia de sequenciamento foi identificar em qual dos
fragmentos estava presente o gene codificador da atividade lipolítica. Para tanto, o
DN
A plasmidial (4
µg)
deste clone foi digerido com a enzima de restrição
Pst
I
29
(conforme descrito no item
Extração de DNA e Análise do perfil de restrição
)
. O
DNA
digerido foi
aplicado em gel de agarose
Low M
el
ting
a 1% (Invitrogen) e submetido a
eletrofores
e por 5 horas a 60V, utilizando o tampão de corrida TAE (40mM de Tris-
base; 40mM de ácido acético e 1mM de EDTA). O gel foi corado em solução de
brometo de etídeo por cinco minutos e
irradiado
com luz ultravioleta, possibilitando a
visualização dos fragmentos de restrição, de 6 e 4 kb, que foram excisados do gel.
Os fragmentos de restrição foram eluídos do gel utilizando o kit QIAEX II Agarose
Gel Extraction Protocol (QIAGEN). Após a defosforilação do vetor pCF430 com a
enzima de modificação, shrimp alkaline phosphatase
(SAP
-Amersham Biosciences),
conforme instruções do fabricante, foi feita uma extração com fenol-clorofórmio e
clorofórmio. Os segmentos de DNA purificados foram em seguida utilizados em uma
reação de ligação com o vetor pCF430 defosforilado
.
O sistema de ligação contendo 2 µL do vetor defosforilado, 4 µL de cada um
dos fragmentos, 1 µL de tampão T4, 1 µL de enzima T4 ligase
(5
u
/µL
Promega,
EUA) e 2 µL de água MilliQ, foi incubado a 16ºC durante a noite e após esse período
foi realizada a diálise em membrana de nitrocelulose 0,025 µM (Millipore) durante 15
minutos. Os sistemas de ligação dialisados foram posteriormente utilizados na
transformação de E. coli
EPI-300 nas condições descritas no item Teste de
Complementação.
A seleção dos clones recombinantes foi realizada pelo
crescimento e presença de halo de hidrólise em meio LB ágar contendo tetraciclina a
40
µg/mL
, tributirina 1% e arabinose 0,02%, como descrito no item Seleção de
Clones Recombinantes. As colônias que apresentaram ou não o halo de hidrólise
em tributirina foram coletadas, cultivadas em meio LB líquido contendo tetraciclina, a
37
ºC e agitação de 240 rpm, e utilizadas na extração de DNA plasmidial com o kit
comercial
QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen, Austrália) conforme o protocolo do
fabricante. O perfil de restrição destas preparações com a enzima
Pst
I
foi analisado
em gel de agarose a 1%. O subclone contendo atividade lipolítica foi denominado
LIP3F4.
30
3.5.2 Sequenciamento
Os plasmídeos do clone LIP3 e do subclone
LI
P3F4 foram sequ
enciados
utilizando a estratégia de Primer walking , iniciando pelos primers do vetor:
forward
pCF430 (5'
CTG
TTT
CTC
CAT
ACC
CGT
T 3') e
reverse
pCF430 (5'
TGC
AAG
GCG
ATT
AAG
TTG
G 3'). As reações de sequenciamento foram realizadas
em triplicata. Ao final de cada sequ
enciamento,
as
seq
uências geradas foram
alinhadas no Programa Clustal W e a partir deste alinhamento foram desenhados os
primers para dar continuidade e completar o s
eq
uenciamento do clone LIP3F4
(T
abela
2)
.
Para o fragmento subclonado LIP3F4 foram utilizados os mesmos primers no
sentido forward do plasmídeo LIP3. As reações de sequenciamento foram realizadas
no sequenciador automático ABI PRISM 377(Applied Biosystems) utilizando o Kit
de sequenciamento DYEnamc ET terminator cycle sequencing (GE Healthcare Life
Sciences, Sweden). As reações foram montadas sempre em triplicata, variando a
concentração do DNA. A sequência consenso era obtida a partir da análise d
ess
as
sequências em triplicata, dessa forma as sequências consenso foram utilizadas na
montagem dos contigs.
31
Primers
-
LIP3
Primers
LIP3F4
MetaLip1
Forward
5 AAC ACG CTG TGG TCT TC 3
MetaLip1
-
Reverse
5 CGA CGT AAC GAA CAC 3
MetaLip3
-
Forward
5' GTA TCC TGC GAA ACG C 3'
MetaLip3
-
Reve
rse
5' CCC AGA CAC TTC GTC C 3'
MetaLip4
Forward
5' TGT TTG TGT ATC GCC 3'
MetaLip4
Reverse
5' ACA ACA GCA CAT TGC 3
MetaLip5
Forward
5 ATC TCC TCC TCG AAC 3
MetaLip5
-
Reverse
5 AAA CGA TCA GAC TCG 3
Fragmento menor1
Reverse
5' TGG AGA TCG TGG CGA C 3'
F
ragmento menor2
-
Reverse
5' AGT TGA GGT CCT TCG 3'
Fragmento menor3
Reverse
5 ATC TGT GAA ATG CGG 3
3
.6
Análise de sequên
c
ias
A montagem dos contigs e obtenção da sequência consenso fora
m
realizadas utilizando o programa Staden Package versão Windows
1.7.0
.
Para a
análise das sequências, as configurações escolhidas foram: a) Estimate base
accuracies
; b)Trace Format Conversion; c) Initialise Experiment File; d)
Augement
Experiment File; e) Quality clip (sem modificações); f) Gap4 shotgun assembly
(sem
modificações). A sequência consenso em formato
Fasta
foi utilizada na identificação
Tabela 2
.
Primers desenhados para o sequenciamento do clone LIP3 de 10 kb e para o
fragmento sub
-
clonado de 4 kb.
32
das regiões codificadoras de proteínas, ORF s (Open Reading Frames). Para tanto
fo
ram utilizadas ferramentas do ExPASy Proteomics Server, u
sand
o o programa
Translate as sequências de nucleotídeos foram traduzidas em sequências de
aminoácidos, mostrando os quadros de leitura (Frames) no sentido 5 -3 e no sentido
3 -5 .
As
seq
uências protéicas preditas foram sub
metid
as
à buscas por
similaridade/identidade com proteínas já depositadas em bancos de dados
utilizando
-se o programa Blast homology search (Warren Gish) Blastp.
As sequências com identidade ou similaridade foram utilizadas para o
alinhamento múltiplo utilizado o programa Clustal W (Julie Tompson, François
Jeanmougin).
O alinhamento múltiplo com outras lipases depositadas em bancos de
dados foi utilizado para a busca por motivos conservados, e classificação da
seq
u
ência nas famílias de lipases.
Para a análise filogenética foi realizado um alinhamento múltiplo
utilizando
o
programa
ClustalW
. Em seguida, foi utilizado o programa MEGA 4.0 que é uma
ferramenta integrada para inferir árvores filogenéticas, estimando-se taxas da
evolução molecular e testes d
e hipóteses evolutivas. Para a construção da
árvore
foi
utilizado o método Neighbor-
joini
ng e para testar a confiança da árvore fil
ogenética
gerada, foi utilizado
bootstrap
com 1000 repetições.
33
4
RESULTADOS
E DISCUSSÃO
Dos 6.720 clones da biblioteca
metagenômica
do solo de Cerrado avaliados
quanto à produção de lipases três (3) apresentaram atividade lipolítica (Figura 5)
.
Conforme dados obtidos para bibliotecas metagenômicas de bacias hipersalinas e
sedimento do Mar Báltico com freqüência de 5 clones com atividade lipolítica para
uma triagem de 7.000 clones (Ferrer et al, 2005a) e uma biblioteca de solo (jardim,
campo de beterraba e vale) com
três
clones positivo em
286.000
analisados (
Henne
et al, 2000
)
os clones encontrados na biblioteca de solo de Cerrado tem uma boa
proporção.
O sucesso da triagem de bibliotecas metagenômicas derivadas do solo
depende de vários fatores, entre eles: composição da amostra, forma de coleta e
a
rmazename
nto,
método de extração utilizado para recuperação do DNA de alta
qualidade; sistemas de vetor/hospedeiro utilizado na clonagem, assim como a
estratégia de triagem funcional
(Daniel, 2005)
.
Os três clones com atividade lipolítica, denominados LIP1(6 kb), LIP2 (8 kb) e
LIP3
(10 kb), mantiveram a atividade de interesse mesmo após três passagens
consecutivas em meio seletivo. Assim como, após estocagem a -
80
o
C em glicerol a
20%. Os plasmídeos recombinantes LIP1, LIP2 e LIP3 possuem uma seqüência que
codifica atividade lipolítica confirmada pela re-transformação de E. coli EPI-
300.
Estas células após a transformação mantiveram a atividade lipolítica sobre tributirina
como mostrado na
F
igura
5 (A, B e C)
. Este resultado não foi observado para células
transformadas com o plasmídeo utilizado para a construção da biblioteca
metage
nômica, neste caso mesmo apos 5 dias de crescimento não foram
observados os halos de hidrólise (Figura 5
-
D)
.
34
Os plasmídeos LIP1, LIP2 e LIP3 apresentaram perfis de restrição distintos
após digestão com a enzima de restrição
Pst
I,
indicando a provável seleção de 3
diferentes genes codificadores de lipases (Figura 6). Além disto, para os três clones
foram observados fragmentos de restrição com o taman
ho esperado em torno de 6 a
10 k
b, estes não foram observados na digestão do plas
mídeo sem inserto (pCF430).
Figura
5. Avaliação da atividade lipolítica em placa de LB com tributirina 1% e
transformação em células E. coli EPI-300, após 5 dias de crescimento a 37ºC
.
Clones mostrando o halo hidrólise ao redor das colônias: A
LIP1; B
LIP2; C
LIP3. Plasmídeo sem
inserto indicando a ausência de
halo
de hidrólise: pCF430
A
D
C
B
35
O clone LIP3 foi selecionado para sequ
enciamento,
usando como critério
o
maior halo de degradação do substrato quando comparado aos demais (resultado
não mostrado), e esta atividade é codificada pela sequência presente no fragmento
de 4Kb. Este resultado foi confirmado pela transformação de células de E. coli EPI-
300 com o vetor (pCF430) contendo os fragmentos de restrição, o maior de 6 kb e o
menor de 4 kb. Apenas as colônias transformadas com a construção
pCF430/fragmento menor apresentaram atividade lipolítica após crescimento por 5
dias em meio de cultura sólido contendo tributirina a 1% (Figura
7)
.
O tamanho
desse inserto está de acordo com o conhecimento prévio de que algumas vias
metab
ólicas para serem clonadas necessitam de fragmentos maiores que 3 kb e,
portanto para que haja alguma chance de encontrar genes de interesse (Watson
2000).
M 1 2 3 4 M
Figura
6. Análise eletroforética da digestão do DNA
plasmidial
do clone controle (E. coli EPI-
300
transformada com o vetor pCF430) e dos clones com
atividade lipolítica após digestão com a enzima de
restrição
Pst
I. M: m
arcador
molecular
1 kb ladder; 1:
pCF430; 2: LIP1; 3: LIP2 e 4: LIP3
.
M 1 2 3 4 M
12 kb
4 kb
6 kb
36
O plasmídeos LIP3F4 e LIP3 foram sequenciados, sendo obtida a sequ
ência
completa do fragmento de restrição de 4 kb e 1.591 pares de base para a
extremidade 3 , respectivamente. As sequências obtidas foram utilizadas para
montagem dos contigs e da sequência consenso utilizando o programa
Staden
Package
. Fo
ram obtidos 2
contigs (contig1 e
c
ontig
2)
, um referente
ao fragmento de
4Kb no sentido 5
e o outro no sentido 3 com o
s 1591 pares de base
.
Foram identificadas 4 regiões codificadoras de proteínas (ORF), por análise
de similaridade no Blastp, uma aldolase, uma acil-CoA desidrogenase, um
a
lipase/esterase e uma uridiltransferase (Figura 8).
Figura
7. Avaliação da atividade lipolítica em meio LB contendo tributirina 1%. A
pCF430 sem
inserto e sem halo de hidrólise; B
clone LIP3 com halo de hidrólise; C
Ligação do fragmento maior
de LIP3 em pCF430 sem halo de hidrólise; D
Ligação do fragmento menor de LIP3 em pCF430 com
halo de
hidrólise.
A
C
B
D
37
Muitas dessas enzimas são cada vez mais estudadas a fim de melhorar os
processos industriais. A reação aldólica é uma transformação extremamente útil que
permite a formação de novas ligações carbono-carbono e introdução de até dois
estereocentros novos para o produto. A criação de bibliotecas de DNA ambiental e
melhorias no processo para superar inibição pelo substrato permitem um processo
altamente eficiente, uma boa relação custo-
benefício,
além de uma produção em
maior escala e um processo biocatalítico enantiosseletivo. Essas aldolases têm sido
bastante utilizadas para aumentar a eficiência em processos químicos (Greenberg et
al, 2004). A Acil-CoA desidrogenase pertence ao grupo das oxidorredutases, e este
grupo de enzimas é cofator dependente. A utilização de células íntegras ou de
alternativas que permitam a regeneração desses cofatores a partir de subprodutos
das reações são necessárias para viabilizar o custo na aplicação destas enzimas
industrialmente (Oliveira e Mantovani, 2009)
.
As sequências identificadas apresentaram
identidade
com proteínas já
depositadas no banco de dados do National Center for Biotechnology Information
(NCBI).
Acil-CoA desidrogenase mostrou 61
%
de identidade prot
éica
com a enzima
homóloga de
Marinobacter
algicola
,
a aldolase apresentou 71% de identidade com a
enzima homóloga de
Ralstonia eutropha
,
a lipase 63% de identidade com a enzima
homóloga de uma bactéria não cultivável e uridiltransferase com 56% de identid
ade
com enzima homóloga de
Koribacter versatilis
(Tabela 3).
Figura
8. Orientação das ORF s encontradas no sub-
clone
LIP3F4. Respectivamente: aldolase, acil-
CoA
desidrogenase, lipase/esterase e uridiltransferase.
38
ORF
Aminoácidos
Proteína
homóloga
M
icrorganismo
Identidade
Similaridade
E
value
1
147
Aldolase Classe II
Ralstonia
eutropha
JMP134
(71%)
99/138
(83%)
115/138
3e
-
55
2
3
4
216
270
230
Acil
-
CoA
desidrogenase
Lipase/Esterase
Uridil
transferase
Marinobacter algicola
DG893
Bactéria não cultivável
Candidatus
Koribacter
versatilis
Ellin345
(61%)
120/194
(63%)
170/266
(56%)
90/158
(74%)
144/194
(78%)
210/266
(71%)
113/158
4e
-62
2e
-98
2e
-42
A lipase metagenômica deste trabalho, denominada, LIP3
apresentou
similaridade de sequência com diferentes lipases e outras hidrolases da superfamília
estrutural
/
que não apresentam atividade lipolítica, já depositadas no banco de
s
eq
uências do NCBI, tanto de organismos cultiváveis como de organismos não
cultiváveis. O maior percentual de identidade, 63%, foi observado para a
comparação com a lipase/esterase de uma bactéria não cultivável (Tabela 4). Esta
enzima foi obtida do metagen
oma
de solo de floresta, apresentando uma sequência
com
273 aminoácidos, massa molecular de 29.5 k
Da
e PI predito de 6.22. Essas
características são semelhantes às encontradas em LIP3 que possui uma sequência
de 270 amino
ácidos, massa molecular de 29.3
k
Da
e PI predito de 5.97.
Em relação
as outras três lipases também identificadas de metagenoma, houve uma menor
identidade
protéica, variando entre 32% a 38% (Tabela 4). Essas bibliotecas foram
construídas com amostras de sedimento marinho
e
solo de floresta
, e as sequências
apresentavam um tamanho de 242 a 270 aminoácidos.
Tabela
3
. ORFs identificadas no clone LIP3F4.
39
Proteína
Fonte
Nº de acesso
GenBank
Identidade
Similaridade
E
value
Lipase/esterase
Lipase/esterase
Esterase
Esterase putativa
Esterase/lipase
putativa
Enzima lipolí
tica
Enzima lipolítica
Bactéria não cultivável
Bactéria não cultivável
Procarioto não cultivável
Pseudomonas fluorescens
SBW25
Bactéria NC10
sedimento
Nodularia spumigena
CCY9414
Methanosarcina
acetivorans
C2A
ABQ11270.1
ACU30832.1
ABI9404
7.1
YP_002874061.1
CBE69988.1
ZP_01630333.1
NP_617589.1
(63%)
170/266
(38%)
97/253
(34%)
91/264
(33%)
90/269
(32%)
83/256
(32%)
88/270
(32%)
85/259
(78%)
210/266
(53%)
136/253
(50%)
134/264
(49%)
132/269
(51%)
133/256
(47%)
127/270
(45%)
118/259
2e
-
96
2e
-
37
3e
-
33
1e
-
30
1e
-
29
3e
-
29
1e
-
26
A seqüência predita da enzima LIP3 foi utilizada no alinhamento múltiplo com
lipases/esterases de maior similaridade e com lipases representantes das
oito
famílias propostas pelo sistema de classificação de Arpigny e Jaeger (1999) e para
construção de uma árvore filogenética (Figura 8). A enzima identificada neste
trabalho, LIP3 está em um ramo da árvore diferente dos demais, possuindo maior
similaridade com a lipase/esterase proveniente
tam
bém de uma bactéria não
cultivável. As oito lipases/esterases, sendo três delas provenientes de metagenoma,
localizadas na árvore filogenética abaixo da família V (BAB39459.1; ABI94047.1;
YP_001527421.1; CBE69988.1; YP_001918872.1; ACU30832.1; ZP_055112092.1 e
ZP_05912918.1) provavelmente formam uma subfamília da família V. A posição de
LIP3 e ABQ11270.1 na árvore como um ramo externo a essa subfamília indica um
grupo diferente, sugerindo que
esta
s enzimas
faz
em
parte de uma nova família
de
lipases
ainda nã
o descritas (Figura 9).
Tabela
4
. Similaridade de sequências de aminoácidos de LIP3F4 e lipases/esterases homólogas.
40
YP
_
256792.1
AAC67392.1
YP
_
360549.1
CAA47949.1
CAA37863.1
BAB39459.1
ABI94047.1
YP
_
001527421.1
CBE69988.1
YP
_
001918872.1
ACU30832.1
ZP_
05512092.1
ZP
_
05912918.1
LIP3
ABQ11270.1
YP
_
002874061.1
YP
_
001347281.1
ZP
_
01630333.1
NP
_
617589.1
AAC67727.1
AAC600403.1
AAB30793.1
AAA50466
CAA49812.1
AAB01071.1
CAA67627.1
AAB71210.1
CAA47020.1
AAC38796.1
AAB61674.1
CAA37220.1
AAA53485
AAB51445.1
CAA78842.1
AAA99492.1
AAC60471.2
P37967.2
CAA22794.1
CAA37862.1
AAC38151.1
AAC41424.1
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
50
100
100
100
100
100
50
100
100
50
100
100
50
100
0.2
Família V
Família I
Família II
Família III
Família VIII
Família VII
Família IV
Família VI
41
Para a identificação da tríade catalítica e dos motivos conservados fez-se um
alinhamento múltiplo com ClustalW. A tríade catalítica
,
Ser
-
Asp
-His, foi localizad
a na
seq
uência predita da LIP3 com base na comparação com a lipase da família V. O
resíduo de serina ativo na posição 93 foi identificado no motivo de aminoácidos
conservados típico de hidrolases da superfamília estrutural / -
hi
drolase (G-X-S-X-
G)
(Figura
9
).
O aspartato
212
de LIP3 foi localizado em razão da proximidade do
motivo conservado PTLV de Sulfolobus acidocaldari
us
(AAC67392.1) da família V,
porém em LIP3 está definido com PTLL, trocando portanto a valina por leucina. A
histidina
240 também foi localizada através da comparação com o representante da
família V, que mostra um motivo de GH, no entanto em LIP3 essa glicina está
trocada por uma serina. Em geral outros motivos conservados que podem ser
característico da família V não aparecem em LIP3, indicando assim que ele possui
aminoácidos em comum com essa família, no entanto não se pode afirmar que ele
pertença a
ela.
A classificação das enzimas com base em alinhamentos de
seq
uência fornece uma indicação da relação evolutiva entre as enzimas (Levisson et
al, 2009). É uma forma de caracterização da família de sequências e serve como
padrão de reconhecimento
.
42
Figura
9. Alinhamento múltiplo de sequências da lipase LIP3 e proteínas relacionadas. Os resíduos
de aminoácidos que formam a tríade catalítica estão indicados por
e os motivos conser
vados
estão marcados com a caixa vazada. Aminoácidos idênticos indicados por * , substituição
conservada por : e substituição semi-conservada por . ABQ11270.1 (bactéria não cultivável); BAB
39459 (Kurthia sp. 538-KA26), ACU30832.1 ( bactéria não cultivável); ABI94047.1 (procarioto não cultivável);
AAC67392.1(
Sulfolobus acidocaldarius); ZP_01630333.1 (Nodularia spumigena); CBE69988.1 (NC10 bactéria
de sedimento); NP_617589.1 (Methanosarcina acetivorans
C2A); YP_002874061.1 (
Pseudomonas
fluorescens
SBW2
5)
43
5
CONCLUSÃO
A biblioteca metagenômica de solo do Cerrado mostrou que os clones
positivos para atividade lipolítica podem ser obtidos sem a necessidade de grandes
triagens, comparados com outros trabalhos os quais demonstram grande quantidade
de clones analisados para a obtenção de poucos clones com atividade. Além disso,
através do perfil de restrição foi possível observar que há genes diferentes,
aumentando a possibilidade de encontrar novas enzimas para essa atividade.
A partir do sequenciamento do s
ub
-clone LIP3
F4
houve a identificação d
o
fragmento contendo o
gene
que possui identidade com uma lipase
,
bem como de
outros
genes que possam ser interessantes
futuramente
quanto a aplicação
industrial.
Através do alinhamento múltiplo da lipase/esterase de LIP3 com outras
lipases/esterases foi possível identificar a posição da tríade catalítica, serina 93,
aspartato 212 e histidina 240. A identidade máxima de 63% da lipase/esterase de
LIP3 com outra lipase de organismo não cultivável permite inferir que se trata de
uma enzima nova, que ao ser caracterizada futuramente poderá indicar o processo
mais adequado para aplicações industriais. A não classificação desse clone em
famílias de lipases já descritas e a análise de motivos conservados com algumas
variações
sugerem uma nova família para LIP3.
O
sequenciamento e a caracterização desse clone servirão como referência
também para os outros clones encontrados com atividade lipolítica, auxiliando assim
na descoberta de novas enzimas. Com base nesse estudo futuramente poderá ser
feita a sub-clonagem do gene de interesse e expressão em Escherichia coli
,
permitindo resultados que possam ser utilizados na produção em larga escala para
as diversas aplicações biotecnológicas.
44
6
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