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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
Defesas celulares e sistema antioxidante em bivalves marinhos (Mytilus
edulis e Perna perna) expostos a metais
RAFAEL TREVISAN
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Bioquímica
do Centro de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Santa Catarina,
como requisito parcial para a obtenção
do Título de Mestre
Orientador: Prof. Dr. Alcir Luiz Dafre (UFSC)
Co-orientador: Prof. Dr. John Moody (Universidade de Plymouth, UK)
FLORIANÓPOLIS, JULHO DE 2010
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ii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS E FIGURAS ............................................................................................ iv
RESUMO ...................................................................................................................................... v
ABSTRACT ................................................................................................................................. vi
1. Introdução ................................................................................................................................. 1
1.1 Espécies reativas de oxigênio ........................................................................................ 1
1.2 Danos oxidativos ........................................................................................................... 3
1.2.1 Lipoperoxidação .................................................................................................... 4
1.2.2 Oxidação de proteínas ........................................................................................... 7
1.2.3 Dano oxidativo ao DNA ........................................................................................ 9
1.3 Defesas antioxidantes ........................................................................................................ 11
1.4 Efeitos do selênio e do zinco no sistema antioxidante ...................................................... 20
2. Justificativa ............................................................................................................................. 23
3. Objetivos ................................................................................................................................. 26
2.1 Objetivos gerais ................................................................................................................. 26
2.2 Objetivos específicos ......................................................................................................... 26
4. Materiais e métodos ................................................................................................................ 27
4.1 Obtenção dos animais e exposição .................................................................................... 27
4.1.1 Estudo 1:Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis ........................ 27
4.1.2 Estudo 2:Análise temporal da exposição à zinco em mexilhões Perna perna ........... 29
4.2 Preparação das amostras .................................................................................................... 30
4.2.1 Estudo 1:Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis ........................ 30
4.2.2 Estudo2 Análise temporal da exposição à zinco em mexilhões Perna perna ............ 31
4.3 Análise química dos níveis de selênio e cobre na água e tecido: ...................................... 32
4.3.1 Estudo 1:Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis ........................ 32
4.4 Análise de tióis: ................................................................................................................. 32
4.4.1 Estudo 1:Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis ........................ 32
4.4.2 Análise temporal da exposição à zinco em mexilhões Perna perna .......................... 33
4.5 Análise das atividades enzimáticas ................................................................................... 34
4.6 Dano ao DNA (Teste do cometa) ...................................................................................... 37
4.7 Análise dos níveis de peróxidos totais e de peroxidação lipídica ..................................... 37
5. Resultados ............................................................................................................................... 39
5.1. Estudo 1: Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis ............................. 39
5.1.1 Exposição do mexilhão Mytilus edulis a cobre com ou sem pré-exposição a selênio 39
5.1.2 Glutationa total (GSH-t) e tióis protéicos (PSH) em brânquias ................................. 40
5.1.3 Atividade de enzimas antioxidantes ........................................................................... 41
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iii
5.2 Estudo 2: Análise temporal da exposição à zinco em mexilhões Perna perna ................. 44
5.2.1 Efeitos do zinco sobre o estado tiólico celular ........................................................... 44
5.2.2 Efeitos do zinco sobre enzimas antioxidantes ............................................................ 45
5.2.3 Efeitos do zinco sobre marcadores de estresse oxidativo ........................................... 46
6. Discussão ................................................................................................................................. 48
6.1. Estudo 1:Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis .............................. 48
6.1.1 Níveis de selênio e cobre na água e nos tecidos ......................................................... 48
6.1.2. Alterações em parâmetros antioxidantes ................................................................... 49
6.1.3 Dano ao DNA ............................................................................................................. 51
6.1.4 Selenoproteínas .......................................................................................................... 51
6.2 Estudo 2:Análise temporal da exposição à zinco em mexilhões Perna perna .................. 53
6.2.1 Estado tiólico celular e glutationa redutase ................................................................ 54
6.2.2 Amplificação das defesas antioxidante ...................................................................... 55
6.2.3 Efeitos oxidativos da exposição ao zinco ................................................................... 57
Conclusão .................................................................................................................................... 61
PERSPECTIVAS ........................................................................................................................ 63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 64
ANEXOS...................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Artigos submetidos e respectivos comprovantes de submissão ............. Error! Bookmark not
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iv
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Tabela 1: Delineamento experimental do período de exposição...................................XX
Figura 1: O estado redox e o potencial de redução do oxigênio e seus derivados........................1
Figura 2: Representação esquemática de danos celulares causados por espécies reativas de
oxigênio na presença ou não de xenobiontes................................................................................4
Figura 3: Processo de lipoperoxidação..........................................................................................5
Figura 4: Oxidação da cadeia polipeptídica de proteínas por espécies reativas de oxigênio........9
Figura 5: O mecanismo de formação de produtos de guanina a partir a partir de reações de
oxidação......................................................................................................................................10
Figura 6: Estrutura química do tripeptídeo glutationa.................................................................11
Figura 7: Sistema de defesas antioxidantes celulares e espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio....................................................................................................................................14
Figura 8: Mecanismo catalítico da catalase.................................................................................15
Figura 9: Mecanismo de ação da glutationa peroxidase..............................................................16
Figura 10: Mecanismo catalítico da glutationa redutase (GR)....................................................17
Figura 11: Mecanismo catalítico da peroxiredoxina 2-cis..........................................................19
Figura 12: Delineamento experimental do período de exposição...............................................29
Figura 13: Análises químicas na água e no tecido de mexilhões Mytilus edulis.........................40
Figura 14: Níveis tiólicos em brânquias de mexilhões Mytilus edulis após a exposição à Se e/ou
Cu................................................................................................................................................41
Figura 15: Atividade de enzimas antioxidantes em brânquias de mexilhões Mytilus edulis após
exposição a Se e/ou Cu.
...............................................................................................................42
Figura 16: Parâmetros na hemolinfa de Mexilhões Mytilus edulis após a exposição a Se e/ou Cu.
.....................................................................................................................................................43
Figura 17: Níveis tiólicos em mexilhões Perna perna expostos a zinco por até 21 dias............44
Figura 18: Atividades de enzimas antioxidantes em mexilhões Perna perna expostos ao zinco
por até 21 dias.............................................................................................................................45
Figura 19: Atividades de enzimas antioxidantes em mexilhões Perna perna expostos a zinco por
até 21 dias....................................................................................................................................46
Figura 20: Marcadores bioquímicos de estresse oxidativo em mexilhões Perna perna expostos a
zinco por até 21 dias....................................................................................................................47
Figura 21: Possível mecanismo de toxicidade do zinco em mexilhões Perna perna..................60
v
RESUMO
As espécies reativas de oxigênio (ERO), metabólitos secundários do
metabolismo do oxigênio, são moléculas geradas e reguladas constantemente pela
célula. O aumento na sua produção pode levar a inúmeros processos patológicos, e para
evitar esses efeitos tóxicos das ERO, a célula conta com um complexo sistema de
defesas celulares, chamadas de defesas antioxidantes. Esse sistema é bem estudado e
caracterizado em eucariotos mais complexos, como os mamíferos, e em eucariotos mais
simples, como as leveduras, mas ainda pouco se sabe sobre esse sistema e sua regulação
em invertebrados marinhos. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo estudar
o sistema antioxidante de bivalves marinhos em situação de estresse oxidativo, e propor
possíveis mecanismos de modulação e regulação redox nesses modelos animais. O
trabalho foi dividido em dois experimentos: no primeiro, mexilhões azuis Mytilus edulis
foram pré-expostos ao selênio (4µg/L) por 3 dias, e subseqüentemente expostos por
mais 3 dias a cobre (56 µg/L). Neste experimento, objetivamos detectar se os efeitos
oxidativos do cobre podem ser atenuados pela pré-exposição ao selênio. Vários
parâmetros antioxidantes e de dano celular foram avaliados. Nesta primeira etapa,
observou-se que o cobre causa oxidação de tióis protéicos (PSH) e inibição da enzima
tioredoxina redutase (TrxR) na brânquia e induz danos no DNA em hemócitos. O
selênio aumenta a atividade da enzima glutationa peroxidase dependente de selênio
(GPx-Se) e os níveis de glutationa (GSH). Quando os animais são pré-expostos a
selênio e expostos em seguida ao cobre, a pré-exposição ao selênio é capaz de
neutralizar os efeitos deletérios desse metal, revertendo a oxidação dos PSH, evitando a
indução de danos no DNA e revertendo parcialmente a inibição da TrxR. No segundo
experimento, mexilhões Perna perna foram expostos por até 21 dias ao zinco (10 µM),
um metal conhecido por afetar o metabolismo da glutationa. A exposição aguda (2 dias)
ao zinco causou consumo de GSH e inibição da GR, porém estes valores retornam aos
níveis basais após 7 e 21 dias de exposição. Os animais expostos por 7 e 21 dias ao
zinco demonstram uma amplificação do sistema antioxidante, com aumento na
atividade de diversas enzimas auxiliares (TrxR, GR) ou de detoxificação de ERO
(catalase, glutationa peroxidase total, superóxido dismutase). Apesar disso, essa
amplificação não impediu um aumento nos níveis de peróxidos citosólicos e nos índices
de peroxidação lipídica evidenciados após a exposição por 7 ou 21 dias O conjunto de
dados desses dois experimentos demonstram a importância do sistema antioxidante para
esses animais em situações de estresse oxidativo. O aumento dos níveis de GSH e da
atividade da GPx-Se parecem ser uma importante via de proteção contra os danos
oxidativos em mexilhões M. edulis, mediados pelo cobre. Já com relação ao zinco, o
restabelecimento do metabolismo da glutationa, o qual é afetado pelo zinco, é
fundamental para a sobrevivência das células branquiais de mexilhões Perna perna, o
qual responde ao insulto oxidativo com uma forte resposta adaptativa de amplificação
das defesas antioxidantes celulares.
Palavras-chave: selênio, cobre, bivalves, Perna perna, Mytilus edulis, glutationa,
estresse oxidativo, glutationa peroxidase, glutationa redutase.
vi
ABSTRACT
Reactive oxygen species (ROS), secondary metabolites of the oxygen
metabolism, are molecules constantly generated and regulated by the cell. The increase
in its production may lead to several pathological processes. To counterbalance the
deleterious effecs of ERO, cells are endowed with an elaborated cellular defense
system, known as antioxidant defenses. This system is well studied and characterized in
complex eukaryotes, such as mammals, or simple eukaryotes, such as yeast, but little is
known about either system or its regulation in marine invertebrates. The objective of the
present work is to study the antioxidant system of marine bivalves that are under
oxidative stress conditions, and propose mechanisms of its modulation. The study was
separated in two parts. In the first part, blue mussels Mytilus edulis were exposed to
copper (56 µg/L) during 3 days to observe the oxidative effects of this metal upon
antioxidant and cell damage parameters. A group of animals were pre-exposed to
selenium (3 days) and further exposed to copper for 3 additional days. This experiment
has the objective of observing the possible interactions between the anti- and pro-
oxidative effects of these compounds upon the cellular defenses of these animals.
During the first part, it was observed that copper caused oxidation of protein thiols
(PSH) and a decrease in the activity of thioredoxin reductase (TrxR) in gills and DNA
damage in haemocytes. Selenium produced an increase in gills glutathione peroxidase
selenium-dependent activity and glutathione (GSH) levels. When animals were pre-
exposed to selenium and further exposed to copper, selenium is able to prevent the
deleterious effects of copper, by preventing PSH oxidation, avoiding DNA damage and
partially restoring TrxR activity. In the second part, mussels Perna perna were exposed
for up to 21 days to zinc (10µM), a metal known for affecting the glutathione
metabolism. Acute exposure (2 days) to zinc caused a consumption of GSH and a
decrease in GR activity, but these values returned to normal levels after 7 or 21 days of
exposure. Animals exposed to 7 and 21 days to zinc showed an amplification in the
antioxidant system. The activity of several antioxidant-related enzymes was increased
by zinc exposure for 7-21 days, such as the auxiliary enzymes (GR and TrxR) and ROS
detoxification enzymes (catalase, total glutathione peroxidase and superoxide
dismutase). Even so, this amplification could not prevent an increase in cytosolic
peroxides and lipid peroxidation index at 7 or 21 days of exposure. Together, these data
demonstrate the importance of the antioxidant system for these animals in oxidative
stress situations. The increase in GSH levels and GPx-Se activity seem to be an
important protection mechanism against the oxidative damage in mussels M. edulis, and
studies indicate that they may share the same regulation pathway. Regarding zinc, the
reestablishment of glutathione metabolism, which is affected by zinc, is essential for the
cell survival, and the further response to the oxidative insult was related to a
coordinated amplification of several cellular antioxidant defenses.
Keywords: selenium, copper, bivalve, Perna perna, Mytilus edulis, glutathione,
oxidative stress, glutathione peroxidase, glutationa reductase
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Espécies reativas de oxigênio
O oxigênio é uma molécula fundamental para os organismos aeróbios, utilizada
tanto na produção de energia através da cadeia transportadora de elétrons na
mitocôndria dos eucariotos, como na membrana celular de muitas bactérias, e em
inúmeras vias metabólicas fundamentais. Ao mesmo tempo, seu consumo é capaz de
gerar substâncias tóxicas a nível intracelular e extracelular, criando então o chamado
“paradoxo do oxigênio”, devido ao balanço existente entre suas vantagens e
desvantagens. Essas substâncias tóxicas são geradas durante o transporte de elétrons,
reações enzimáticas, reações de auto-oxidação, ou ainda, pelo grupo heme de proteínas,
e são comumente chamadas de espécies reativas de oxigênio (ERO), como o oxigênio
singlet (
1
O
2
), o ânion superóxido (O
2
.-
), o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e o radical
hidroxil (
.
OH) (HALLIWELL et al., 2007). Na Figura 1 podemos observar os potencias
de redução do oxigênio molecular e das diferentes ERO. O valor negativo do potencial
de redução do oxigênio demonstra sua fraca capacidade oxidante e reatividade quando
comparado com as demais moléculas derivadas de sua parcial redução, sendo o radical
hidroxil o mais reativo.
Figura 1: O estado redox e o potencial de redução do oxigênio e seus derivados.
Abreviações: O
2
−
, ânion superóxido; H
2
O
2
, peróxido de hidrogênio; HO
.
,
radical hidroxil
;
OH
-
hidroxila.
(IMLAY, 2008)
2
Algumas dessas ERO são radicais livres, outras são agentes oxidantes não
radicalares (como o peróxido de hidrogênio). O próprio termo “reativo” acaba criando
certa confusão, uma vez que há bastante diferença entre as constantes de reatividade do
peróxido de hidrogênio (k = 2.26 M
-1
s
-1
) (CARBALLAL et al., 2003) e do radical
hidroxil com a albumina (k = >10
10
M
-1
s
-1
) (HALLIWELL et al., 2007), por exemplo.
Além disto,
algumas destas moléculas reagem rapidamente apenas com algumas
substâncias, como é o caso do peróxido de hidrogênio, enquanto outras, como radical
hidroxil, reagem rapidamente com inúmeras moléculas. Estas características geram
diferentes níveis de efeitos biológicos, dependendo da sua taxa e local de formação,
ambiente, compartimento celular, etc. Para uma melhor explicação do termo radical
livre, ele acaba sendo designado para qualquer espécie capaz de existência independente
(por isso o termo livre), que contenha um ou mais elétrons desemparelhados
(HALLIWELL et al., 2007), além de incluir outras espécies radicalares que não
somente as ERO, como por exemplo, aquelas centradas em carbono e nitrogênio.
Para lidar com este paradoxo, a célula possui uma série de defesas capazes de
evitar o efeito deletério destas ERO geradas pelo metabolismo aeróbio, organizada em
diferentes níveis. Estas defesas são comumente chamadas de defesas antioxidantes, e
podem ser produzidas endogenamente ou adquiridas pela dieta. Estas estratégias de
defesa incluem diferentes níveis de proteção, que podem ser resumidos em três formas
principais de atuação: evitar a formação de ERO, a neutralização destas espécies
reativas e a reparação de danos ocasionados por elas. Assim, o termo antioxidante pode
ser considerado como qualquer substância que atrase, previna ou remova o dano
oxidativo de uma molécula-alvo (HALLIWELL et al., 2007). É interessante observar
que, mesmo a nível fisiológico, não há uma total prevenção na formação/atuação das
ERO. Alguns trabalhos têm demonstrado que, mesmo em pequenas concentrações, estas
3
moléculas não só não causam grandes danos, como podem adquirir importantes funções
celulares. Por exemplo, a sinalização celular, ao longo da história evolutiva dos seres
vivos, utiliza processos oxidativos como sinalizadores, além de outros mecanismos.
Alguns exemplos são: controle da ventilação respiratória, apoptose, diferenciação e
desenvolvimento celular, aderência de leucócitos a células endoteliais ou mesmo na
ativação da resposta imunológica específica contra patógenos (DROGE, 2002).
1.2 Danos oxidativos
O ataque de ERO a biomoléculas (Fig. 2) pode causar disfunções celulares (YU,
1994). Alterações relacionadas ao ataque de ERO podem ser causadas por sua excessiva
formação e/ou ineficiência em sua interceptação pelas defesas antioxidantes, gerando o
chamado estresse oxidativo. Este pode ocorrer devido à ação de xenobiontes, através da
alteração na regulação redox celular, pelo metabolismo de citocromos P450, ou ainda,
pela presença de íons metálicos livres, gerando ciclos de reações oxidativas (REGOLI et
al., 2002).
Os tipos de dano oxidativo causado pelas ERO a biomoléculas (Fig. 2) podem
ser dividido em 3 categorias principais, conforme visualizado na Figura 1, e descritos a
seguir.
4
Figura 2: Representação esquemática de danos celulares causados por espécies reativas de oxigênio
na presença ou não de xenobiontes.
Xenobiontes podem induzir a formação de espécies reativas de oxigênio, as quais podem causar danos a
proteínas, lipídios e DNA caso as defesas antioxidantes celulares não sejam capazes de neutralizar seus
efeitos. O
2
.-
- Ânion superóxido; H
2
O
2
- Peróxido de Hidrogênio;
.
OH – Radical hidroxil; SodMn -
Superóxido Dismutase-Manganês; SodCuZn - Superóxido Dismutase-Cobre/Zinco; GPx - Glutationa
Peroxidase; CAT – Catalase (RAMAKRISHNAN et al., 2007).
1.2.1 Lipoperoxidação
O ataque a cadeias de ácidos graxos poliinsaturados (com dois ou mais carbonos
de sua cadeia com ligação dupla) pode ocorrer através de processos de peroxidação, que
é uma reação em cadeia envolvendo três etapas distintas: iniciação, propagação e
terminação. O começo desta reação geralmente ocorre através da abstração de átomo
hidrogênio de um grupo metileno (-CH
2
-) através do ataque de uma molécula reativa,
como ERO, metais, ou outros radicais livres, formando um radical de carbono. Este, por
sua vez, realizará um rearranjo molecular, formando um dieno conjugado, o qual pode
reagir com moléculas de oxigênio, formando um radical peroxil (ROO
.
). A partir da
.
5
formação deste radical ocorre a fase de propagação, devido à sua capacidade de abstrair
átomos de hidrogênio de outros grupos metilenos de cadeias adjacentes (transformando-
se em um peróxido lipídico). Estes sofrerão processos de rearranjo molecular, formação
de dienos conjugados e, posteriormente, ataque de moléculas de oxigênio, formando um
novo ROO
.
. Este reinicia o processo, gerando uma reação oxidativa em cadeia (Fig. 3)
(HALLIWELL et al., 2007).
Figura 3: Processo de lipoperoxidação.
A abstração de átomos de hidrogênio de um ácido graxo poliinsaturado (neste esquema representado por
três ligações duplas) leva à formação de um dieno conjugado por rearranjo molecular. Esta molécula pode
sofrer o ataque de oxigênio, formando um radical peroxil. Este radical pode continuar o ciclo de
lipoperoxidação através da abstração de átomos de hidrogênio de cadeias poliinsaturadas próximas,
transformando-se em um peróxido lipídico. (HALLIWELL et al., 2007)
6
Ao mesmo tempo, quando o átomo de hidrogênio é abstraído das cadeias
adjacentes pela reação com ROO
.
, forma-se um peróxido lipídico (ROOH) (Fig. 3). Este
peróxido é geralmente estável sob temperatura fisiológica, mas na presença de íons
metálicos, pode iniciar um novo tipo de reação em cadeia, quebrando a ligação O-O,
formando um radical alcoxil (ROH
.
) (HALLIWELL et al., 2007).
ROOH + Fe
2+
→ Fe
3+
+ OH
-
+ ROH
.
Estes radicais alcoxilas também podem abstrair átomos de hidrogênio, tanto de
outros peróxidos como de grupos metilenos de ácidos graxos poliinsaturados,
continuando as reações em cadeia.
Outro grande problema destas reações é a formação de Fe
3+
, o qual também pode
reagir com peróxidos lipídicos formando radicais peroxilas e Fe
2+
, em um ciclo
autosustentável (HALLIWELL et al., 2007).
ROOH + Fe
3+
→ ROO
.
+ H
+
+ Fe
2+
Vários fatores contribuem para o término deste processo cíclico de
lipoperoxidação, tais como a neutralização desses inúmeros radicais por antioxidantes,
formação de produtos não radicalares, consumo dos reagentes, dentre outros.
7
Entre os produtos finais formados durante o processo de lipoperoxidação,
destacam-se gases de hidrocarbonetos e os aldeídos, como o malondialdeído (MDA) e o
4-hidroxynonenal (4-HNE). Acredita-se que níveis elevados de 4-HNE (acima de 1µM)
atuem em processos citotóxicos e genotóxicos, provocando danos mitocondriais,
inibindo a ação de chaperonas e algumas isoformas de citocromos P450 (CYP2E1 e
CYP1A1), síntese de DNA e de proteínas (HALLIWELL et al., 2007). Entretanto, o 4-
HNE também é um potente indutor de defesas antioxidantes. Já o MDA pode atacar
proteínas quando presente em ambientes de baixo pH, resultando em modificações de
inúmeros resíduos de aminoácidos (especialmente lisina). Ele ainda pode reagir com
bases de DNA (especialmente guanina) gerando lesões mutagênicas. Outra importante
característica do MDA é sua capacidade de reagir com o ácido tiobarbitúrico sob altas
temperaturas e baixo pH, gerando um produto com cor que pode ser detectada em 532
nm (DRAPER et al., 1990), base para método de detecção de produtos finais de
lipoperoxidação.
1.2.2 Oxidação de proteínas
O dano a proteínas pode ocorrer pelo ataque direto de ERO à sua estrutura, ou
através de moléculas originadas de processos de oxidação, como o MDA e 4-HNE.
Como a estrutura primária de uma proteína pode ser muito variável, esta pode
sofrer inúmeros tipos de processos oxidativos (Fig. 4), gerando diferentes produtos
finais. Além disso, as próprias ligações peptídicas podem ser atacadas, como por
exemplo, na abstração de hidrogênio pelo radical hidroxil. No geral, este radical exerce
mais efeitos nocivos a proteínas, enquanto que o peróxido de hidrogênio, ânion
superóxido e óxido nítrico ficam mais restritos aos ataques de grupos facilmente
8
oxidáveis, como os grupos tióis. Uma vez que as proteínas podem facilmente combinar-
se a íons metálicos, e caso sejam posteriormente expostas a peróxido de hidrogênio,
pode ocorrer a reação de Fenton, e consequentemente, a formação de radical hidroxil.
Inicialmente, o ataque de
.
OH pode gerar outros radicais capazes de combinar com o O
2
,
gerando radicais alcoxilas e peroxilas, os quais podem fazer a abstração de H
.
e formar
peróxidos nas cadeias laterais ou na cadeia central das proteínas. Os radicais alcoxil
podem ainda realizar fragmentações de proteínas, formando grupos carbonilas. Assim
como os peróxidos lipídicos, os peróxidos aminoacídicos são estáveis à temperatura
fisiológica, mas na presença de calor ou de íons metálicos podem formar novos radicais
orgânicos, gerando reações cíclicas. Eles também podem atacar grupos tiólicos de
outras proteínas, assim como os peróxidos lipídicos, e sua degradação é extremamente
difícil por não serem substratos para as enzimas antioxidantes catalase, glutationa
peroxidase ou a peroxiredoxina (HALLIWELL et al., 2007).
9
Figura 4: Oxidação da cadeia polipeptídica de proteínas por espécies reativas de oxigênio.
Radicais hidroxilas (
.
OH) gerados por raios X, γ (a) ou pela reação de Fenton (b) atacam um carbono da
cadeia polipeptídica, causando a abstração de um hidrogênio (c). Este, na presença de oxigênio (d) é
rapidamente convertido a um radical peroxil. A forma protonada do ânion superóxido (HO
2
.
) (e) ou a
abstração de um hidrogênio de outra molécula (f) pode transformar esse radical peroxil em um peróxido
de alquila. Reações em cadeia com a forma protonada do ânion superóxido (h, j) ou com o íon Fe(II) (g, i,
k) pode gerar como produto final um grupo hidroxila no carbono originalmente atacado na reação c. Na
ausência de oxigênio (l), dois radicais centrados em carbono podem reagir entre si, produzindo derivados
com ligações carbono-carbono cruzadas. (STADTMAN et al., 2003).
1.2.3 Dano oxidativo ao DNA
Os radicais livres estão envolvidos com processos de envelhecimento,
desenvolvimento de câncer, mutações e morte celular, através de alterações químicas,
tanto nas bases nitrogenadas, na ribose do DNA e na quebra de suas ligações.
A ERO com maior capacidade de causar danos ao DNA é o radical hidroxil. Ele
tem a capacidade de adicionar ligações duplas nas bases heterocíclicas de DNA, assim
como, de abstrair hidrogênio da base nitrogenada timina e de cada um dos carbonos da
desoxirribose. Além disso, reações de adição podem formar adutos de radical
.
OH que,
10
na presença de oxigênio, pode vir a formar radicais peroxil. O processo de formação de
adutos pode ser utilizado como marcador de dano oxidativo ao DNA. O produto 8-oxo-
7,8-diidro-2'-deoxiguanosina (comumente chamado de 8-oxodGuo) pode ser detectado
através da técnica de cromatografia líquida de alta performance com detecção
eletroquímica (HPLC-ECD) (Fig. 5)(DIZDAROGLU et al., 2002).
Figura 5: O mecanismo de formação de produtos de guanina a partir a partir de reações de
oxidação.
Radical hidroxil (
.
OH), elétrons livre (
.
e
-
) e oxigênio singlet (
1
O
2
) (BERRA et al., 2006).
A abstração de átomos de hidrogênio feita por este radical leva à formação de
radicais de carbono, que na presença de oxigênio são rapidamente convertidos a radicais
peroxil de açúcares. A partir de processos de rearranjo molecular, fragmentação e
liberação de água podem-se gerar mais de 20 tipos de produtos(DIZDAROGLU et al.,
2002).
11
Algumas proteínas nucleares podem ser atacadas pelo radical hidroxil, e
posteriormente realizar ligações cruzadas com o DNA, ocasionando falhas no reparo
celular, replicação, transcrição e descondensamento da cromatina(DIZDAROGLU et
al., 2002).
1.3 Defesas antioxidantes
Entre as principais defesas antioxidantes não-enzimáticas da célula estão as
vitaminas C e E, carotenóides, flavonóides, pigmentos biliares, urato e o tripeptídeo
glutationa (GSH), todos sendo captadores de radicais. A GSH é composta por gamma-
glutamil-cisteinil-glicina, atuando contra a formação de radicais livres, na homeostase
tiólica, na manutenção do balanço redox da célula e na defesa contra agentes
eletrofílicos. Essa capacidade antioxidante se dá pelo grupamento reativo de sua
cisteína, o grupamento tiol (SH) (Fig.6), o qual também pode ser encontrado em
proteínas (PSH) ou em tióis de baixo peso molecular (NPSH), como a cisteína e a GSH
(REISCHL et al., 2007). A oxidação da glutationa leva a formação da sua forma
disulfeto (GSSG), a qual será posteriormente reciclada à GSH ou transportada para fora
da célula.
Figura 6: Estrutura química do tripeptídeo glutationa.
O grupamento tiol (-SH) está presente no resíduo de cisteína. Fonte:
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Glutathion.svg
12
A GSH pode reagir in vitro com várias ERO, como radical hidroxil, ácido
hipoclorito, peróxinitrito e peróxidos orgânicos. Por estar presente em concentrações
intracelulares na ordem de mM, ela também pode reagir com ERO in vivo. Além disso,
participa como cofator de diversas enzimas e processos metabólicos, como o sistema da
glutationa peroxidase, metabolismo do ascorbato, protege tióis protéicos contra
oxidação e atua como principal tampão redox celular. Na concentração de 1 mM, o
pontencial de redução é de -220 mV, e desta forma torna-se uma importante fonte de
neutralização de ERO (HALLIWELL et al., 2007).
A GSH é sintetizada no citoplasma de todas as células animais, mas o fígado é o
órgão com a síntese mais ativa. A mitocôndria também possui GSH, em torno de 10-
20% dos níveis celulares, mas ser captada do citoplasma através de transportadores na
membrana interna (FERNANDEZ-CHECA et al., 2005). Sua síntese é realizada em
duas etapas, com gasto de 2 moléculas de ATP, realizadas pelas seguintes enzimas:
1. Glutamato-cisteína ligase (GCL): catálise da primeira etapa, através da
formação do dipeptídeo γ-glutamil-cisteína. A ligação entre o grupo amina da
cisteína e o grupo carboxil da cadeia lateral do glutamato (carbono γ) (Fig. 6) é
uma ligação incomum na estrutura dos peptídeos, geralmente ocorrendo entre o
carbono α (o qual contem o grupo carboxila) de um aminoácido e o grupo amina
de outro aminoácido.
2. Glutationa sintetase (GS): catálise da segunda etapa, através da formação
da GSH a partir do dipeptídeo formado na etapa anterior e adição do aminoácido
glicina
A GSH está em constante renovação dentro da célula. Este processo pode
envolver o transporte de GSSG para fora da célula por transportadores dependentes de
13
ATP. No fígado, a GSH está em constate síntese e transporte para o plasma, a fim de
fornecer substrato para sua síntese para outros tecidos. Devido a ligação gama existente
entre os resíduos de glutamato e de cisteína na GSH, esta ligação não pode ser clivada
por peptidases comuns: a proteína de membrana γ-glutamiltranspeptidase (GGT,
descrita a seguir) é responsável pela clivagem da GSH extracelular para posterior
incorporação da célula, a fim de fornecer os precursores necessários para sua síntese
(WHITFIELD, 2001).
As defesas antioxidantes enzimáticas também são fundamentais (Fig. 7). Entre
as principais estão as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa
redutase (GR), glutationa peroxidase (GPx), tioredoxina redutase (TRxR),
Peroxiredoxina (Prx) e glicose-6 fosfato desidrogenase, conforme descritas a seguir.
A descoberta da SOD foi responsável pela definição da teoria de toxicidade do
oxigênio, onde ERO são importantes produtos metabólicos (FRIDOVICH, 1995). A
SOD é uma metaloenzima que age sobre o radical O
2
.-
dismutando-o a H
2
O
2
e
protegendo em até 97% os alvos do ataque do ânion superóxido. Em eucariotos são
encontradas duas principais isoformas, no citosol a forma SOD-CuZn (possui cobre e
zinco em seu sítio ativo), enquanto que na mitocôndria a forma SOD-Mn (com
manganês em seu sítio ativo). A SOD-CuZn é capaz de aumentar a taxa de dismutação
do ânio superóxido em 3 ordens de grandeza, através de reações redox do cobre
presente em sua estrutura: após a redução do Cu
2+
a Cu
+
pelo ânion superóxido, ocorre a
formação de oxigênio molecular. Em seguida, a reação com outro ânion superóxido, na
presença de prótons, causa a oxidação do Cu
+
a Cu2
+
, e formação de água. A reação
geral é descrita como: 2O
2
.-
+ 2H
+
= H
2
O
2
+ O
2
. O zinco não tem função catalítica, mas
é responsável pela coordenação estrutural da enzima, auxiliando em sua estabilidade.
14
No caso da SOD-Mn, a reação ocorre da mesma forma que com o cobre da SOD-Cu/Zn,
através da redução do Mn
3+
a Mn
2+
e a formação de oxigênio molecular, seguido da
oxidação do Mn
2+
a Mn
3+
na presença de prótons e outro ânion superóxido. Em pH
fisiológico, a taxa de reação dessas duas isoformas de SOD é basicamente a mesma, em
torno de 1x10
9
M
-1
s
-1
(HALLIWELL et al., 2007).
Figura 7: Sistema de defesas antioxidantes celulares e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio.
Legenda: O
2
.-
- Ânion superóxido; NO
.
- Óxido nítrico; ONOO
.
- Peróxido nitrito; H
2
O
2
- Peróxido de
Hidrogênio; SOD - Superóxido Dismutase; GGT – gamma-glutamil transpeptidase; GCL – gamma-
glutamil-cisteinil ligase; GS – glutationa sintetase; G6PDH – glicose-6 fosfato desidrogenase; GR –
glutationa redutase; GPx red - Glutationa Peroxidase reduzida; GPx oxd – glutationa peroxidase oxidada;
Prx red – peroxiredoxina reduzida; Prx oxd – peroxiredoxina oxidada; CAT – Catalase; GSH – glutationa
reduzida; GSSG – disulfeto de glutationa; NADP – nicodinamina adenina dinucleotídeo fosfato oxidado;
NADP – nicodinamina adenina dinucleótido fosfato oxidado; NADP – nicodinamina adenina
dinucleótido fosfato reduzido; Trx oxd – tioredoxina oxidada; Trx red – tioredoxina reduzida; TR –
tioredoxina redutase. (KENSLER et al., 2007).
Para a eliminação de peróxidos existem duas enzimas principais, a CAT e a
GPx. A CAT tem como função dismutar diretamente o H
2
O
2
em H
2
O e O
2
, e está
localizada em maior abundância em peroxissomos. Como o peróxido de hidrogênio
pode se difundir entre membranas, uma importante fonte de defesa contra peróxido de
15
hidrogênio é a CAT presente na corrente sanguínea (WINTERBOURN et al., 1987),
protegendo órgãos e tecidos que contêm pouca atividade catalase, como músculo
esquelético, coração e cérebro, contra o ataque do peróxido de hidrogênio formado no
sangue pela autooxidação da hemoglobina. A CAT é uma proteína composta de 4
subunidades, cada uma com um grupo hemo, o qual contém ferro (REID et al., 1981). É
através do grupo hemo que ocorre a atividade catalítica da enzima (Fig. 8): O ferro,
inicialmente na forma Fe
3+
, ao receber dois elétrons do peróxido de hidrogênio é
oxidado a um radical catiônico Fe
4+
(hemo
.+
) gerando uma forma intermediária da
enzima e uma molécula de água. Esta forma intermediária retorna a forma Fe
3+
pela
redução através de uma nova molécula de H
2
O
2
, formando uma molécula de água e
oxigênio.
Figura 8: Mecanismo catalítico da catalase.
A oxidação por dois elétrons da forma Fe
3+
pelo peróxido de hidrogênio leva a formação de um radical
catiônico Fe
4+
. Uma segunda molécula de peróxido de hidrogênio reduz o grupo hemo à sua forma Fe
3+
,
gerando água e oxigênio. (KIM et al., 2002).
A GPx está relacionada à função antioxidante da GSH com atividade
peroxidásica contra peróxido de hidrogênio e peróxidos orgânicos. São conhecidas pelo
menos 4 isoformas de GPx: GPx1, presente no citoplasma; GPx2 presente nas células
gastro-intestinais; GPx3, presente no plasma e outros fluídos extracelulares; GPx4,
responsável pela degradação de peróxidos derivados de ácidos graxos e colesterol,
16
presente em baixas concentrações nos tecidos, exceto nos testículos. A GPx1, 2 e 3
contém 4 subunidades, cada uma com um selênio, enquanto a GPx4 é um monômero
com apenas 1 selênio. O selênio está presente na forma de selenocisteína, uma cisteína
com um selênio no lugar do átomo de enxofre, o qual é facilmente ionizável em pH
fisiológico (HALLIWELL et al., 2007). O mecanismo de ação da GPx pode ser
observado na Figura 9.
Figura 9: Mecanismo de ação da glutationa peroxidase.
O selenol, (ESeH) forma reduzida da selenocisteína é oxidado por peróxidos a ácido selênico (ESeOH).
Em sequência, uma glutationa (GSH) reage com o ácido selênico, formado o selenil dissulfeto (ESeSG).
Uma segunda molécula de GSH ataca o enxofre dessa molécula, gerando dissulfeto de glutationa (GSSG)
e regenerando o selenol, completando o ciclo catalítico. (REN et al., 2001).
Processos oxidativos celulares e a atividade GPx geram o dissulfeto da
glutationa ou glutationa oxidada (GSSG). Para a manutenção do ambiente redutor
intracelular a razão entre glutationa reduzida e oxidada (GSH/GSSG) é mantida em
níveis acima de 1/100 (SIES et al., 1978). Para evitar a depleção da GSH e aumento da
17
GSSG, a glutationa redutase (GR) reduz a GSSG às custas de NADPH, regenerando a
GSH e mantendo desta forma o estado redox intracelular. A GR é uma proteína
composta de duas subunidades, cada uma contendo uma molécula de flavina adenina
dinucleotídeo (FAD) (Fig. 10). O FAD recebe elétrons do NADPH, passando os
elétrons em seguida para a ponte dissulfeto no sítio ativo. Os grupos SH formados
dentro do sítio ativo interagem com a GSSG, reduzindo a 2 GSH e a ponte dissulfeto é
refeita dentro do sítio ativo da GR (BERKHOLZ et al., 2008).
Figura 10: Mecanismo catalítico da glutationa redutase (GR).
(1) GR na forma natica (oxidada) recebe um elétron de uma molécula de NADPH (2) através do FAD, o
qual repassa esse elétron para a ponte dissulfeto do sítio ativo (3). Uma nova molécula de NADPH se liga
covalentemente a FAD (4), e a glutationa oxidada é inserida no sítio ativo da enzima (5). Uma das
cisteínas (58) ataca covalentemente a GSSG (6), liberando uma molécula de GSH e refazendo a ponte
dissulfeto entre as cisteínas do sítio ativo da enzima (7). Em seguida, a outra molécula de GSH é liberada,
refazendo o início do ciclo catalítico. O NADPH que estava ligado covalentemente ao FAD pode repassar
o elétron para a GR, reduzindo novamente a enzima.(BERKHOLZ et al., 2008).
A enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) não deixa de estar
envolvida com as defesas antioxidantes, pois fornece os equivalentes redutores
(NADPH) para regeneração de GSSG. Quando o fornecimento de NADPH fica
18
prejudicado, a função antioxidante da glutationa também fica afetada, pois a GSSG não
pode ser regenerada, causando sérios danos ao metabolismo celular. Neste sentido, a
G6PDH também pode ser considerada uma enzima antioxidante co-adjuvante
(SLEKAR et al., 1996).
A gamma-glutamil transpeptidase (GGT) é uma glicoproteína ligada à
membrana celular, responsável pela transferência de grupos glutamil da GSH para
inúmeros aminoácidos ou peptídeos. Sua ação possibilita a captação de cisteína, que é o
elemento limitante para a síntese de GSH (MEISTER, 1973). A GGT também é
responsável pela degradação da glutationa, tornando-a disponível como fonte de cisteína
para síntese protéica (TATEISHI et al., 1977).
A GST é responsável pela conjugação de xenobióticos eletrofílicos a GSH,
reduzindo sua toxicidade e permitindo que o sistema de transporte elimine estes
conjugados para o meio extracelular, metabolizados pela via do ácido mercaptúrico.
São conhecidas diversas isoformas de GST, mas também podem possuir outras funções,
como transporte intracelular de proteínas e atividade glutationa peroxidase. Esta última
função ocorre pela capacidade das GSTs em conjugar GSH a peróxidos orgânicos,
gerando GSSG e o respectivo álcool (HALLIWELL et al., 2007).
Nos últimos anos têm-se aumentando a atenção no sistema PRx/TRxR,outra
importante fonte de detoxificação de peróxidos. A família das Prxs compreende 6
diferentes isoformas, responsáveis pela degradação de diferentes tipos de peróxidos
através de seus resíduos de cisteína (Fig. 11). Entre os peróxidos metabolizados,
incluem-se os hidroperóxidos pequenos como o de hidrogênio e de cadeias mais longas
e hidrofóbicos, como o peróxido de cumeno, os peróxidos derivados de ácidos graxos
ou de fosfolipídeos, além do peroxinitrito. As Prxs possuem 2 cisteínas em sua
19
estrutura: a cisteína peroxidásica (ou catalítica), e a cisteína de resolução (ou auxiliar).
A cisteína peroxidásica é responsável pela redução do peróxido, tornando-se ácido
sulfênico. Essa cisteína peroxidásica oxidada irá reagir com a cisteína de resolução de
outra subunidade do dímero Prx, gerando uma ponte dissulfeto. A orientação das
cadeias polipeptídica se dá na forma “head to tail”, ou seja, em paralelo com o N
terminal de uma subunidade emparelhado com a região C terminal da outra. Desta
forma, a cisteína peroxidásica oxidada de cada monômero irá reagir com a cisteína de
resolução do outro monômero, formando 2 pontes dissulfeto (Fig. 11). Essas pontes
dissulfeto serão reduzidas pela Trx, a qual ficará oxidada (FLOHE et al., 2007).
Figura 11: Mecanismo catalítico da peroxiredoxina 2-cis.
O ciclo inicia com a oxidação da cisteína peroxidásica (S
p
H) dos dois monômeros a partir do peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) formando ácido sulfênico (SOH). Em seguida, cada cisteína de resolução (S
r
H) reage
com o ácido sulfênico do outro monômero, gerando duas pontes dissulfeto intermolecular. Este dímero é
reduzido pela tioredoxina à custa de NADPH. No excesso de peróxido de hidrogênio, pode ocorrer a
superoxidação da Prx, com a reação do ácido sulfênico da Prx oxidada, gerando ácido sulfinico (SO
2
H)
ou até mesmo sulfônico (SO
3
H).(LOW et al., 2008).
20
As diferentes isoformas de Prx podem ser classificadas em Prx 1 ou 2-Cis,
levando em consideração o número de cisteínas que participam do ciclo catalítico. Em
mamíferos, apenas a Prx6 possui uma única cisteína envolvida no metabolismo de
peróxidos. Neste caso, a oxidação da cisteína pelo peróxido leva à formação do
respectivo álcool, enquanto a cisteína se encontra na forma de ácido sulfênico. Este será
reduzido por moléculas de baixo peso molecular que contém tiol, entre elas GSH
(outros candidatos como ácido lipóico e ciclofilina também são apontados). Já as Prx 2-
Cis ainda podem ser classificadas em típicas e atípicas. Durante o processo de redução
do peróxido, pontes dissulfeto entre as cisteínas peroxidásicas e de resolução são
formadas: se isso ocorrer entre diferentes monômeros, com a formação de um dímero, a
PRx é classificada como Prx 2-cis típica; se a ponte dissulfeto ocorrer dentro do próprio
monômero, entre suas duas cisteínas, e consequentemente sem a formação de um
dímero, a Prx é classificada como Prx 2-cis atípica. Em ambos os casos, a redução da
ponte dissulfeto é feita, mas não exclusivamente, pela tioredoxina (WOOD et al., 2003).
A tioredoxina redutase é responsável pela ciclagem da tioredoxina, uma proteína
doadora de elétrons envolvida no ciclo catalítico da peroxiredoxina. Assim como a GR,
a TrxR acaba estando envolvida no processo antioxidante celular por auxiliar no sistema
Prx/Trx. Em mamíferos, a Trx e TrxR também podem atuar em outras moléculas e
processos metabólicos, como no sistema imune, apoptose e na regulação da atividade de
fatores de transcrição, dependendo a função celular de cada tecido (NORDBERG et al.,
2001).
1.4 Efeitos do selênio e do zinco no sistema antioxidante
21
Inúmeras substâncias químicas têm sido utilizadas para controlar o sistema
antioxidante, principalmente através da inibição ou aumento da expressão de enzimas
chave. Entre estas substâncias, podemos citar os inibidores da glutationa redutase
(carmustina), da glutationa peroxidase (mercapto succinato), da tioredoxina redutase
(compostos derivados de ouro, como auranofin e aurotiomalato), da síntese de
glutationa (butionina sulfoximina), da glicose-6-fosfato desidrogenase
(dehidroepiandrosterona), entre outros. Através destes estudos, estima-se obter
informações sobre a importância de cada uma destas enzimas na homeostase celular e
no sistema antioxidante em condições fisiológicas e também de desafios oxidativos.
Estudos envolvendo selênio, citotoxidade e proteção em mamíferos vêm sendo
realizados a décadas (RAYMAN, 2000; STEINBRENNER et al., 2009). O selênio
participa de como cofator de enzimas envolvidas na síntese e metabolismo de
hormônios da tireóide, além de estar presente no sítio ativo de enzimas como GPx e
TrxR. Sua deficiência pode causar problemas musculares, de articulações e reprodutivos
(principalmente em machos, uma vez que a GPx participa da maturação do
espermatozóides) (RAYMAN, 2000). Sabe-se que suplementação com baixas
concentrações de selênio levam a um aumento na síntese de GSH e na expressão e
atividade de selenoproteínas, como GPx e TrxR em diferentes modelos de estudo
(ADESIYAN et al., 2010; WANG et al., 2010; WOJEWODA et al., 2010), além de
reduzir a mortalidade em peixes devido ao manejo de cultivo (HARDY et al., 2010).
Desta forma, espera-se que a suplementação com selênio cause um aumento na
capacidade antioxidante celular, devido ao aumento na expressão e na atividade da GPx
e da TrxR, relacionadas com a detoxificação de peróxidos intracelulares.
O zinco é um metal de transcrição que participa na modulação de proteínas
regulatórias e em diferentes atividades celulares (MACKENZIE et al., 2005), sendo um
22
micronutriente essencial e abundante em invertebrados como mexilhões (WONG et al.,
2000; SHI et al., 2004). Em baixas concentrações, está relaciona a funções como
expressão gênica, síntese de DNA, catálise enzimática, sinalização celular e
neurotransmissão (FREDERICKSON et al., 2000). Entretanto, níveis elevados de zinco
intracelular podem levar a produção de ERO na mitocôndria, depleção de NAD
+
(KIM
et al., 1999) e inibição da glicólise (SHELINE et al., 2000). Um dos efeitos mais
marcantes do zinco sobre o sistema antioxidante celular é através da inibição da GR e
na alteração do metabolismo da glutationa. Esta inibição já foi demonstrada por nosso
grupo de pesquisa em peixes (FRANCO et al., 2008b), ratos (FRANCO et al., 2008a) e
bivalves(FRANCO et al., 2006). Essa inibição da GR pode causar um distúrbio redox
celular, e diminuir a capacidade antioxidante celular, uma vez que a GR é responsável
pela ciclagem da glutationa utilizada no ciclo da GPx.
23
2. JUSTIFICATIVA
O sistema antioxidante tem sido amplamente estudado em mamíferos, devido à
sua importância para a célula e às possíveis aplicações farmacológicas de drogas que
estimulem ou inibam este sistema em situações patológicas. Porém, pouco se sabe a
respeito deste sistema em invertebrados marinhos. Uma vez que estes animais vêm sido
utilizado como modelo em trabalhos de toxicologia aquática a fim de observar os efeitos
de contaminantes antrópicos liberados nos ecossistemas aquáticos, e também em
trabalhos de monitoramento ambiental para detectar locais impactados pela atividade
humana, é importante que se estabeleça bases e fundamentos teóricos desse sistema
também para estes animais, a fim de complementar e facilitar as análises de dados
destes trabalhos.
De acordo com dados obtidos pelo ISI Web of Knowledge
®
se compararmos a
quantidade de pesquisa realizada em mamíferos com invertebrados marinhos
envolvendo o sistema antioxidante, temos aproximadamente: 15000 trabalhos com os
termos antioxidante e rato contra 250 para mexilhões, 12000 envolvendo os termos
peroxidase e rato contra 150 para mexilhões, 5000 itens envolvendo os termos ERO e
rato, contra 90 para mexilhões (pesquisa feita em julho de 2010). Desta forma, observa-
se que a informação necessária a ser obtida em estudos de toxicologia aquática nestes
modelos animais é muito necessária. O predomínio de dados com mamíferos pode até
gerar dificuldade em compreender os processos de regulação antioxidante nestes
animais, uma vez que a abordagem comparativa acaba sendo feita, muitas vezes,
baseada em dados de mamíferos.
24
Em estudos de nosso grupo de pesquisa, observamos que o zinco causa inibição
da GR in vivio após exposição aguda, além de diversas outras alterações enzimáticas.
Apesar de ser, a curto prazo, uma importante via de toxicidade do zinco, pouco se sabe
sob o efeito desse metal nesses animais em estudos de exposição mais prolongada. Hoje
em dia, utilizam-se protocolos de monitoramento ambiental com 1 semana a 1 mês ou
mais de exposição de invertebrados marinhos em ambientes potencialmente
contaminados. Assim, são necessários estudos mais prolongados sobre os efeitos de
compostos tóxicos sob os parâmetros antioxidantes destes animais. Além disso,
desejamos observar se os efeitos em curto prazo no metabolismo da glutationa seriam
mantidos após uma exposição mais prolongada ao zinco, ou se iriam ocorrer
mecanismos compensatórios para reverter esse quadro de toxicidade.
Em um estágio de 3 meses realizado na cidade de Plymouth, Inglaterra, sob
orientação do professor Dr. John Moody, houve a possibilidade de se analisar os efeitos
da suplementação com selênio nos parâmetros antioxidantes de mexilhões. Já era
conhecido que a suplementação com selênio era capaz de impedir os efeitos genotóxicos
do mercúrio em hemócitos desses animais, porém não se sabia os efeitos dessa
suplementação em outros parâmetros antioxidantes ou em outros tecidos. Ao mesmo
tempo, inúmeros trabalhos vêm demonstrando a toxicidade do cobre em bivalves
marinhos, um metal naturalmente presente no ambiente aquático e também intimamente
relacionado com contaminação industrial. Desta forma, o efeito antioxidante do selênio
poderia contribuir para a proteção celular contra a exposição ao cobre.
Através destes dois modelos de estudos, espera-se compreender melhor o
sistema antioxidante destes animais em situações de estresse oxidativo, seja através da
inibição de uma importante enzima antioxidante (e conseqüentemente de um sistema de
detoxificação de peróxidos) pelo zinco ou então pela exposição ao cobre, com seus
25
conhecidos efeitos oxidantes intracelulares em contrapartida aos efeitos protetores do
selênio.
26
3. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
O presente estudo tem como objetivo, através da indução de situações de
estresse oxidativo, investigar as respostas antioxidantes do sistema antioxidante em
bivalves marinhos.
2.2 Objetivos específicos
a) avaliar o metabolismo da glutationa e glutationa redutase em mexilhões Perna perna
b) avaliar os efeitos a curto e médio prazo da inibição da enzima glutationa redutase em
mexilhões P. perna expostos a zinco
c) avaliar o metabolismo da glutationa e glutationa peroxidase em mexilhões Mytilus
edulis
d) avaliar os efeitos oxidativos do cobre e os efeitos antioxidantes do selênio em
mexilhões M. edulis
e) avaliar o possível efeito protetor da pré-exposição de mexilhões M. edulis a selênio
frente à uma subseqüente exposição a cobre.
27
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Obtenção dos animais e exposição
4.1.1 Estudo 1:Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis
Mexilhões azuis Mytilus edulis forma coletados na praia de Trebarwith (sudoeste
da Inglaterra) e foram aclimatados em laboratório por 2 semanas, numa sala fria a 15
0.2 °C sob constante aeração e alimentados com uma preparação comercial da alga
unicelular Isochrysis galbana (Liquifry, Inglaterra).
Após aclimatação, os animais foram transferidos para aquários plásticos de 10
litros (9 animais por aquário e 1 litro de água do mar por animal) para exposição ao
cobre e ao selênio (Tabela 1). Durante os primeiros 3 dias (“pré-exposição”), os animais
foram expostos à água do mar (grupo Ctl) ou à 4µg/L de selênio (grupo selênio, na
forma de selenito de sódio). Durante os últimos 3 dias de experimento, (“exposição”) os
animais foram expostos à água do mar ou 56 µg/L de cobre (grupo Cu, na forma de
sulfato de cobre penta hidratado). Assim, obteve-se 4 diferentes grupos (“pré-
exposição”/”exposição”): Ctl/Ctl; Ctl/Cu; Se/Ctl; Se/Cu, com três aquários por grupo.
As concentrações de Se e Cu utilizados de basearam em trabalhos de bioquímica e
toxicologia anteriores realizado nesta espécie ou espécies do gênero Mytilus (vide Tran
et al., 2007 para estudo com selênio, Bolognesi et al., 1999 para cobre). Além disso,
estudos do laboratório do Prof. John Moody observaram que a concentração de cobre de
56µg/L não causava letalidade, mas induzia danos no DNA (dados não publicados).
Ao fim de cada dia de exposição, uma alíquota de cada aquário foi coletada logo
após a troca de água e antes da próxima troça de água, 24 horas depois. Desta forma,
28
podem-se analisar as concentrações de selênio e de cobre ao começo e fim de cada dia
de exposição.
Ao fim do sexto dia de exposição, os animais fora sacrificados, e os tecidos
foram coletados da seguinte forma: hemolinfa de 3 animais foram combinadas do
músculo adutor posterior através das valvas (AL-SUBIAI et al., 2009) para obter uma
amostra; brânquias de dois animais foram combinadas para análise das atividades
enzimáticas; brânquias de indivíduos únicos foram utilizadas para análise de tióis. Um
total de 9 amostras (amostras individuais ou amostras de mais de um indivíduo) foram
coletadas para cada análise (n = 9) Após a remoção das brânquias, os animais foram
congelados a -80 °C para posterior análise química do tecido.
.
Tabela 1: Delineamento experimental do período de exposição. Mexilhões Mytilus edulis foram
expostos ao selênio e/ou cobre durante 3 dias. O experimento foi dividido em duas etapas: durante os dias
1-3, os animais foram expostos à água do mar ou ao selênio; durante os dias 4-6 os animais foram
expostos à água do mar ou ao cobre.
Grupos
Dias 1-3 Dias 4-6
Período de pré-exposição Período de exposição
Ctl/Ctl Água do mar Água do mar
Se/Ctl Selênio 4µ/L Água do mar
Ctl/Cu Água do mar Cobre 56µ/L
Se/Cu Selênio 4µ/L Cobre 56µ/L
29
4.1.2 Estudo 2:Análise temporal da exposição à zinco em mexilhões Perna perna
Mexilhões marrom Perna perna forma obtidos de uma fazenda marinha de
cultivo no Ribeirão da ilha (Florianópolis, Brasil). Os animais foram aclimatados
durante uma semana no laboratório em aquários de plástico (1 litro de água do mar por
animal), temperatura de 20-25°C, aeração constante e alimentados com uma solução
da alga unicelular Chaetoceros muelleri, obtida no Laboratório de Cultivo de Moluscos
Marinhos (CCA, UFSC).
Após aclimatação, os animais foram mantidos durante 21 dias em aquários
plásticos (6 animais/aquário e 1 litro de água do mar por animal) para exposição a 10
µM de cloreto de zinco (Zn) por 2, 7 ou 21 dias (Figura 12). Essa concentração foi
escolhida baseada em trabalho anterior do grupo de pesquisa (Franco et al., 2006), o
qual demonstrou ser um concentração não letal, mas capaz de causar distúrbio redox e
inibição da GR em mexilhões P. perna. Durante o experimento, os animais foram
alimentados com algas 1 hora antes da troca de água, para evitar possíveis interações
com o zinco.
Figura 12: Delineamento experimental do período de exposição.
Mexilhões Perna perna foram aclimatados por 7 dias (Aclimatação) e em seguida expostos a zinco
(Exposição) durante 2, 7 ou 21 dias, conforme indicado na figura.
30
Ao fim do período de exposição, os animais foram sacrificados e as brânquias
foram retiradas para as análises bioquímicas. Um total de 12 animais por grupo (n = 12)
foi utilizado para as análises bioquímicas.
4.2 Preparação das amostras
4.2.1 Estudo 1:Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis
Para análise de glutationa total (GSH-t), 100mg de tecido fresco foi
homogeneizado (3:1 vol:vol) em tampão TRIS/HCl 20mM contendo EDTA 1mM,
sacarose 500mM, 150mM KCl pH 7,6 e centrifugado a 15.000 g por 35 minutos a 4°C.
Uma alíquota do sobrenadante (50µL) foi diluída em 450µL de tampão fosfato de
potássio (KPi) 0,1M EDTA 1mM pH 7,0 para posterior análise espectofotométrica.
Para análise dos níveis de tióis protéicos (PSH), 200µL do sobrenadante de
15.000 g foi acidificado com ácido perclórico (PCA, concentração final de 0,5M) e em
seguida centrifugado a 13.000 g por 2 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado, e a
fração particulada foi ressuspensa em 300 µL de tampão TRIS/HCl 0,5M contendo 1%
SDS, pH 8,0.
Para análise das atividades enzimáticas nas brânquias, 200mg de tecido foi
homogeneizado (3:1 vol:vol) em tampão TRIS/HCl 20mM contendo EDTA 1mM,
sacarose 500mM, 150mM KCl pH 7,6 e centrifugado a 15.000 g por 35 minutos a 4°C.
O sobrenadante foi guardado a -80°C para posteriores ensaios enzimáticos.
Para análise de atividade enzimática na fração solúvel da hemolinfa, ela foi
centrifugada a 1.000g por 3 minutos a 4°C e o sobrenadante foi guardado a -80°C para
posteriores ensaios enzimáticos.
31
Para análise química dos níveis de selênio e cobre no tecido, os animais (todo o
animal exceto as brânquias, usada para análises bioquímicas) foram seco em estufa a
60-80ºC durante 2 a 3 dias. Em seguida, o tecido foi retirado das conchas, e triturado
manualmente com o auxílio de um cadinho e um pistilo de cerâmica até obter um pó de
granulometria bem fina. Após utilizar uma peneira de malha de 180µM para a retirada
de partículas não trituradas. O tecido foi então pesado, e aproximadamente 300-500mg
foi utilizado para o processo de digestão, através da acidificação com 7ml de ácido
clorídrico (HCl) e ácido nítrico (HNO
3
) concentrado (1,5:1 vol:vol) por uma hora a
temperatura ambiente, em béquers de 50ml cobertos com vidro de relógio. Após esse
tempo, os béquers eram aquecidos em uma placa quente por 1 hora a aproximadamente
80ºC para finalizar a digestão das amostras, e ao final do processo o volume era
ajustado para 50ml em balões de vidro com HNO
3
2%.
Para a análise química dos níveis de selênio na água, as amostras foram diluídas
10 vezes com HNO
3
2%, e adicionado metanol para uma concentração final de 5% e um
padrão interno (indium ng/ml) para posterior análise através de espectofotometria de
massa por ionização acoplada por plasma (ICP-MS). No caso das análises de cobre na
água, as amostras foram diretamente analisadas por espectofotometria de emissão ótica
por ionização acoplada por plasma (ICP-OES).
4.2.2 Estudo2 Análise temporal da exposição à zinco em mexilhões Perna perna
Para a determinação dos níveis de glutationa total (GSH-t), tióis protéicos (PSH) e não-
protéicos (NPSH), aproximadamente 100 mg de brânquia foi homogeneizado em 0,9 ml de
ácido perclórico (PCA) 0,5 M, centrifugado a 15.000 g por 2 minutos a 4ºC, e o extrato ácido
foi utilizado para as determinações de GSH-t e NPSH. A fração particulada foi utilizada para a
determinação de PSH.
32
Para análise das atividades enzimáticas e marcadores de estresse oxidativo,
aproximadamente 300-400mg de brânquia foi homogeneizado em tampão HEPES 20 mM, pH
7,4 e centrifugado a 20.000 g por 30 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi então utilizado para a
determinação das atividades enzimáticas, produtos finais da lipoperoxidação e níveis de
peróxidos totais, enquanto a fração particulada foi utilizada para a determinação atividade
gamma-glutamil transpeptidase.
4.3 Análise química dos níveis de selênio e cobre na água e tecido:
4.3.1 Estudo 1:Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis
As amostras de água coletada diariamente e as amostras de tecido já digeridas
foram utilizadas para a quantificação dos níveis de selênio e cobre. As amostras de
tecido, assim como as amostras de água para análise de cobre, foram analisadas por
ICP-OES (Varian, modelo 725-ES). As amostras de água para análise de selênio foram
analisadas por ICP-MS (Thermo Scientific, modelo X Series 2). Os níveis de cobre e
selênio foram baseados em uma curva padrão utilizando soluções certificadas (Fischer
Scientific e Merk, Reino Unido). Os níveis de selênio na água ainda foram comparados
e corrigidos com o padrão interno de indium adicionado às amostras.
4.4 Análise de tióis:
4.4.1 Estudo 1:Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis
Os níveis de GSH-t (GSH + GSSG) foram medidos espectofotometricamente
pelo método de ciclagem com glutationa redutase (OWENS et al., 1965). Após a
diluição de 10 vezes em tampão fosfato de potássio, 100µL de amostra foi incubada
com 100µL de tampão KPi 0,1M pH 7,5 contendo 5mM de EDTA e 10mM de DTNB e
deixada no gelo. Em seguida, 40 µL da amostra incubada com DTNB foi adicionada
num poço de uma placa de 96 poços contendo 210 µL de tampão KPi na concentração
33
final de 100mM contendo EDTA 5mM, NADPH 200µM, GR 0,4U/ml pH 7,5, e lido
em 412nm por 5 minutos. A quantificação dos níveis de GSH-t foi baseada a partir de
uma curva padrão com GSH realizada no momento da leitura.
O ensaio para análise de PSH foi realizado em placas de 96 poços, contendo 30
µL de amostra, 260µL de tampão TRIS/HCl 0,5M contendo 1% SDS, pH 8,0 e 12µL de
ácido ditionitrobenzóico (DTNB) 5mM, e lido em um leitor de placas em 412nm após
30 minutos de incubação (ELLMAN, 1959). Em paralelo, as amostras foram lidas em
uma segunda placa na presença do tampão e ausência do DTNB, para descontar a
absorbância basal da amostra.
4.4.2 Análise temporal da exposição à zinco em mexilhões Perna perna
Para determinar a glutationa total (GSH-t), 50µL do extrato ácido foi adicionado
a 450µL de tampão KPi 0,1M contendo EDTA 1mM pH 7,0. As amostras foram
analisadas pelo método enzimático de Tietze, modificado posteriormente
(AKERBOOM et al., 1981). As concentrações finais do ensaio foram de KPi 100mM,
EDTA 1mM, NADPH 225µM, DTNB 100µM e GR 0,2U/ml. As quantificações dos
níveis de GSH-t e GSSG foram baseadas a partir de uma curva padrão com GSSG
realizada no momento da leitura.
Para a análise dos níveis de NPSH, 100µL do extrato ácido foi adicionado a
400µL de tampão TRIS/HCl 0,5 M, pH 8,0 e 25 µL de DTNB 5 mM. Para a análise dos
PSH, a fração particulada da amostra acidificada com PCA foi ressuspensa em 1ml de
tampão TRIS/HCl 0,5M contendo SDS 1% pH8,0. Em seguida, 100µL dessa
ressuspensão foi adicionada a 400µL de tampão TRIS/HCl 0,5M contendo SDS 1%
pH8,0 e 25 µL de DTNB 5mM. Paralelamente, as amostras também foram preparadas
na ausência de DTNB, para descontar a absorbância basal da amostra (ELLMAN,
1959).
34
4.5 Análise das atividades enzimáticas
Para ambos os trabalhos, os métodos enzimáticos foram os mesmos, conforme
descritos a seguir.
Catalase (CAT): A alta velocidade de reação desta enzima, associada a uma
baixa “afinidade”, permite a determinação de sua atividade com concentrações elevadas
de H
2
O
2
(10 mM). A atividade foi determinada pela velocidade de consumo da H
2
O
2
no
primeiro minuto da reação, 240nm (ε = 40 M
-1
cm
-1
) (AEBI, 1984). É descontado ainda
o desaparecimento do peróxido de hidrogênio sem a presença da amostra. O ensaio
enzimático de 40 segundos é realizado em tampão fosfato de potássio (KPi) 50 mM,
EDTA 0,5 mM, pH 7,0 contendo 0,012% de Triton X-100. Como substrato iniciador
utiliza-se 10 mM de H
2
O
2
. A absorbância basal é descontada a partir da leitura da
reação do ensaio na ausência da amostra.
Gamma-glutamil transpeptidase (GGT): A análise de sua atividade foi realizada
através de um kit comercial da marca Biotécnica®, conforme recomendações do
fabricante.
Glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH): Na presença de glicose-6-fosfato, o
NADPH é formado a partir de nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato (NADP
+
) e,
dessa forma, o aumento da absorbância é medido em 340nm (ε = 6.220 M
-1
cm
-1
)
(GLOCK et al., 1953). É descontada da reação a atividade basal obtida pela formação
de NADPH pela leitura do ensaio enzimático sem a presença do substrato. O ensaio
enzimático de 5 minutos é realizado em tampão TRIS/HCL 50 mM. pH 7,4 contendo
0,127 mM NADP
+
e 3 mM de cloreto de magnésio (MgCl
2
). Como substrato iniciador
utiliza-se 1,5 mM de glicose-6-fosfato (G6P). A absorbância basal foi descontada a
partir da leitura da reação do ensaio na ausência de G6P.
35
Glutationa peroxidase selênio dependente (GPx-Se): Através deste ensaio, mede-
se a atividade proveniente apenas da GPx verdade, que contem uma selenocisteína em
seu grupo catalítico. É acompanhada indiretamente pelo desaparecimento do NADPH.
A enzima, ao utilizar GSH para degradar peróxido de hidrogênio, gera glutationa
oxidada (GSSG), que por sua vez, é reduzida pela glutationa redutase, adicionada ao
meio de reação, com o consumo de NADPH (ε = 6.220 M
-1
cm
-1
). Este consumo de
NADPH é acompanhado espectrofotometricamente em 340nm, similar à determinação
de GR (LAWRENCE et al., 1976). Desta velocidade de consumo é descontado o
consumo basal de NADPH, obtido pela leitura do ensaio enzimático sem a presença do
substrato (peróxido). O ensaio enzimático de 5 minutos é realizado em tampão HEPES
30mM pH 7,5 contendo EDTA 0,7mM, GSH 1,5mM, GR 0,75U/ml e NADPH 100mM.
Peróxido de hidrogênio (200 µM) foi utilizado como substrato, e a oxidação do NADPH
foi monitorado em 340nm.
Glutationa peroxidase total (GPx): Através deste ensaio, mede-se a atividade
glutationa peroxidase proveniente da própria enzima GPx como da enzima glutationa S-
transferase, a qual também é capaz de doar elétrons da GSH para a detoxificação de
peróxidos orgânicos. O ensaio enzimático se baseia no mesmo método da GPx-Se,
porém utiliza-se peróxido orgânico para permitir a ação da glutationa S-transferase no
ensaio (WENDEL, 1981), o qual é realizado em tampão fosfato de potássio (KPi) 50
mM, EDTA 0,5 mM, pH 7,0 contendo NADPH 0,2 mM, GSH 1 mM e GR 0,2 U/ml. É
necessário 5-10 minutos de incubação com os reagentes (exceto substrato iniciador)
para a ativação da enzima. Como substrato iniciador utiliza-se 1 mM de peróxido de
cumeno.
Glutationa redutase (GR): Ao utilizar o substrato GSSG a enzima consume
NADPH, que é acompanhado em 340nm (ε = 6.220 M
-1
cm
-1
). A velocidade de consumo
36
de NADPH, em condições de saturação, expressa a atividade enzimática (CARLBERG
et al., 1985). Desta velocidade é descontada a reação basal de consumo de NAPDH
obtido pela leitura do ensaio enzimático sem a presença do substrato (GSSG). O ensaio
enzimático de 5 minutos foi realizado em tampão fosfato de potássio (KPi) 100 mM,
EDTA 1mM, pH 7,0 contendo 0,2 mM de NADPH. Como substrato iniciador utiliza-se
1 mM GSSG.
Glutationa-S-transferase (GST): A conjugação de GSH com o substrato
clorodinitrobenzeno (CDNB) catalisada pela GST produz um composto que pode ser
detectado em 340nm (ε = 9.600 M
-1
cm
-1
). A atividade enzimática é proporcional à
velocidade de produção do composto conjugado (HABIG et al., 1981). Desta atividade
é descontada a reação basal obtida pela leitura da reação entre a GSH do ensaio e o
CDNB, sem a presença da amostra. O ensaio enzimático de 5 minutos foi realizado em
tampão fosfato de potássio (KPi) 100 mM, EDTA 1 mM, pH 7,0 contendo 1 mM GSH.
Como substrato iniciador foi utilizado 1 mM de CDNB. A absorbância basal foi
descontada a partir da leitura da reação do ensaio na ausência da amostra.
Tioredoxina redutase (TrxR): A TrxR é capaz de causar a redução do DTNB a
duas moléculas de TNB, causando um aumento na absorbância em 412nm. Para
descontar a formação basal de TNB através das reações dos tióis presentes na amostra
com DTNB, as amostras são incubadas 15 minutos numa cubeta com tampão KPi
100mM contendo EDTA 10mM, DTNB 5mM e albumina de soro bovino (BSA)
0,2mg/ml. Após este tempo, a reação específica da TrxR é iniciada através da adição de
200 µM de NADPH, acompanhando-se a formação de TNB em 412nm (ARNER et al.,
1999).
37
4.6 Dano ao DNA (Teste do cometa)
Após a coleta de hemolinfa de mexilhões Mytilus edulis, 200µL de hemolinfa foi
adicionado a 300µL de tampão fosfato salina (PBS) e centrifugado a 400g por 2
minutos a 4°C. O sobrenadante foi discartado e as células foram ressuspensas em
agarose (0,75% em tampão PBS) de baixo ponto de fusão. Em seguida, duas gotas da
suspensão cellular foram adicionadas em uma lâmina de microscópio (previamente
cobertas com agarose 1,5%), cobertas com uma lamínula e deixadas em geladeira por
15 minutos para solidificação da agarose. As lamínulas foram retiradas, e as lâminas
foram incubadas em solução de lise (NaCl 2,5M, EDTA 100mM, TRIS 10mM, Triton
X-100 1% e DMSO 10%, pH 10) por uma hora a 4°C no escuro. Após a lise, as laminas
foram colocadas na cuba de eletroforese horizontal e incubadas em tampão de
neutralização eletroforese (NaOH 300mM e EDTA 200mM pH 13) por 40 minutos. Em
seguida, a eletroforese foi iniciada a 400 mA e 25V durante 30 minutos em uma câmara
fria de 4°C no escuro. Após a eletroforese, as laminas foram incubadas 3 vezes em
tampão de neutralização (Tris/HCl 400mM pH 7,5) por 5 minutos e guardadas a 4°C
por até uma semana antes da coloração (40µL de iodeto de propídio 2µg/L). As lâminas
foram analisadas em microscópio de fluorescência Leica modelo DMR HC (Leica
Microsystems, Reino Unido) através da contagem de 100 células escolhidas
aleatoriamente para cada lâmina. A percentagem de fragmentação do DNA foi medida
através do software Komet 5.0 (Kinetic Imaging, Reino Unido), e é considerado um dos
parâmetros mais confiáveis para meditar quebras de fita simples e dupla, além de sítios
alcali lábeis (KUMARAVEL et al., 2006).
4.7 Análise dos níveis de peróxidos totais e de peroxidação lipídica
A quantificação dos níveis de peróxidos totais do sobrenadante de brânquias de
mexilhões P. perna foi realizada a partir do método de PCA-FOX (GAY et al., 2002). A
38
presença de peróxidos leva à redução do íon Fe
2+
a Fe
3+
, o qual reage com o sal xylenol
orange, gerando uma cor característica (laranja/marrom), a qual pode ser medida
fotometricamente em 560 nm. O ensaio é realizado em PCA 110 mM, contendo xylenol
orange 0,25 mM e sulfato ferroso amoniacal 0,25 mM. A quantificação dos níveis de
peróxidos foi realizada a partir da comparação com uma curva padrão de peróxido de
cumeno.
A lipoperoxidação foi estimada pelo método de TBARS (DRAPER et al., 1990),
com algumas modificações. Uma alíquota (100 µl) da amostra foi adicionada a 1 ml de
solução contendo 400 µl de tampão ácido acético 1,3M/HCl, 0,27 M, pH 3,4, 400 µl
TBA 0,8% e 200 µl de SDS 8,1%. A mistura foi incubada a 95 °C por 60 minutos. A
reação de MDA com o TBA produz um cromóforo que pode ser medido
fotometricamente a 532nm.
39
5. RESULTADOS
5.1. Estudo 1: Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis
5.1.1 Exposição do mexilhão Mytilus edulis a cobre com ou sem pré-exposição a
selênio
Mexilhões Mytilus edulis foram pré-tratados com selênio (Se) por 3 dias, e
subseqüentemente por mais 3 dias com cobre (Cu), como descrito em Materiais e
Métodos (seção 4.1.1). Dois grupos de animais (Se/Ctl e Se/Cu) foram expostos a
selênio nos 3 primeiros dias (período de pré-exposição) e os outros dois gurpos foram
expostos ao cobre (Ctl/Cu e Se/Cu) durante os últimos 3 dias (período de exposição).
Um grupo (Ctl/Ctl) não foi exposto nem a selênio nem a cobre. Durante os 6 dias de
experimento, alíquotas de água dos aquário eram coletadas para medir os níveis de Se e
Cu. Durante o período de pré-exposição (Fig. 13A) os níveis de Se permaneceram
inalterados entre o início e o fim de cada dia, com valores próximos à concentração
nominal de 4 µg/L. Foram detectados níveis de Se acima do limite de detecção (0,5
µg/L) apenas nos aquários onde foi adicionado Se. Nenhuma diferença foi observada
nas concentrações de Se nos tecidos dos animais após os 6 dias de experimento (Fig.
13C).
Como esperado, durante o período de pré-exposição foram observados baixos
níveis de Cu na água (aproximadamente 5 µg/L), mas durante o período de exposição os
níveis de Cu alcançaram valores próximos à concentração nominal de 56 µg/L nos
grupos Ctl/Cu e Se/Cu, enquanto que nos outros dois grupos os níveis foram similares
aos do período de pré-exposição. Além disso, também foi observada uma diminuição de
20 a 30% nos níveis de Cu na água entre o início e fim de cada dia (Fig. 13B). A
concentração de Cu nos tecidos dos animais dos grupos Ctl/Cu e Se/Cu após 6 dias de
experimento foi de 3 a 5 vezes maior que nos grupos Ctl/Ctl e Se/Ctl (Fig. 13D).
40
Também foi observada uma interação entre as exposições [F (1, 31) = 5.51, p < 0.05], o
que pode ser explicado pela menor assimilação de Cu nos animais pré-expostos a Se
(Fig. 13D)
0.5
2.0
3.5
5.0
6.5
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
Início
Fim
n.d n.d
Se (ug/l)
0
20
40
60
80
100
Inicio
Fim
aa aa
b
b
c
c
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
Cu (ug/l)
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0
1
2
3
4
Se (mg/kg tecido seco)
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0
20
40
60
80
b
c
aa
Cu (mg/kg tecido seco)
(A) (B)
(C) (D)
Figura 13: Análises químicas na água e no tecido de mexilhões Mytilus edulis.
(A) níveis de selênio (Se) na água durante o período de pré-exposição (dias 1-3); (B) níveis de cobre na
água durante os dias de exposição (dias 4-6). “Início” representa os valores médios de Se ou Cu na água
no início de cada dia, logo após a troca de água; “Fim” representa os valores médios de Se ou Cu na água
ao fim de cada dia, antes da próxima troca de água. Níveis de Se (C) e Cu (D) nos tecidos dos mexilhões
após 6 dias de experimento. Ctl/Ctl grupo controle; Ctl/Cu animais expostos ao cobre; Se/Ctl animais pré-
expostos a selênio; Se/Cu animais pré-expostos a selênio e expostos ao cobre; n.d valores abaixo do limite
de detecção (0,5 µg/L). Letras diferentes significam diferenças (p<0,05, ANOVA de duas vias seguido
por teste post hoc de Duncan)
5.1.2 Glutationa total (GSH-t) e tióis protéicos (PSH) em brânquias
O tratamento apenas com Se (Se/Ctl) induziu um aumento nos níveis de GSH-t.
Animais pré-expostos a Se e posteriormente expostos a Cu (Se/Cu) também tiveram
41
elevados níveis de GSH-t (Fig. 14A). Exposição ao Cu (Ctl/Cu) causou uma diminuição
nos níveis de PSH (Fig. 13B), mas nenhuma alteração significativa foi observada nos
níveis de GSH-t (Fig. 14A). Uma interação foi observada entre as exposições [F (1, 28)
= 7.97, p < 0,05], evidenciada pelos níveis de PSH nos animais pré-tratados com Se e
posteriormente com Cu (Se/Cu), os quais retornaram aos valores basais (Ctl/Ctl).
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0
20
40
60
80
b
a
a
b
GSH-t (nmol/g tecido úmido)
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
a,b
a
b
a
PSH (umol/g tecido úmido)
(A) (B)
Figura 14: Níveis tiólicos em brânquias de mexilhões Mytilus edulis após a exposição à Se e/ou Cu.
Níveis de glutationa total (GSH-t) (A) e tióis protéicos (PSH) (B) após 6 dias de experimento. Ctl/Ctl
grupo controle; Ctl/Cu animais expostos ao cobre; Se/Ctl animais pré-expostos a selênio; Se/Cu animais
pré-expostos a selênio e expostos ao cobre. Letras diferentes significam diferenças (p<0,05, ANOVA de
duas vias seguido por teste post hoc de Duncan)
5.1.3 Atividade de enzimas antioxidantes
Várias atividades enzimáticas foram analisadas nas brânquias de M. edulis (Fig.
15), incluindo glutationa peroxidase total (GPx), glutationa peroxidase dependente de
selênio (GPx-Se), catalase (CAT), glutationa redutase (GR), tioredoxina redutase
(TrxR) e glutationa S-transferase (GST), todas elas possuindo uma ação direta (GPx-t,
GPx-Se, CAT) ou indireta (GR, TrxR e GST) nas defesas antioxidantes. Pré-exposição
a Se induziu um aumento significativo na atividade da GPx-Se. Houve também um
42
aumento na atividade da GPx, mas apenas significativo no intervalo de confiança de
90% (p=0,07).
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0
2
4
6
8
GPx (mU/mg proteía)
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0
1
2
3
c
a,b
a
b,c
GPx-Se (mU/mg proteína)
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0
5
10
15
GR (mU/mg proteía)
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0
5
10
15
20
a
a,b
a,b
b
TrxR (mU/mg proteína)
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0
5
10
15
20
CAT (umol/min/mg proteína)
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0
5
10
15
20
25
GST (mU/mg proteína)
(A)
(B)
(C)
(D)
(E) (F)
Figura 15: Atividade de enzimas antioxidantes em brânquias de mexilhões Mytilus edulis após
exposição a Se e/ou Cu.
Atividades das enzimas glutationa peroxidase total (GPx) (A); glutationa peroxidase dependente de
selênio (GPx-Se) (B); glutationa redutase (GR) (C); tioredoxina redutase (TrxR) (D); catalase (CAT) (E);
glutationa S-transferase (GST) (F). Ctl/Ctl grupo controle; Ctl/Cu animais expostos ao cobre; Se/Ctl
animais pré-expostos a selênio; Se/Cu animais pré-expostos a selênio e expostos ao cobre; Letras
diferentes significam diferenças (p<0,05, ANOVA de duas vias seguido por teste posthoc de Duncan)
Nenhuma alteração significativa foi observada nas atividades da GPx, GPx-Se,
GR, CAT e GST em animais expostos a cobre (Fig. 15), porém a atividade da TrxR foi
43
diminuída em aproximadamente 60% quando comparado ao grupo controle (Fig. 15D).
Para TrxR, uma interação entre as exposições foi observada no intervalo de confiança
de 90% [F (1, 29) = 3.29, p < 0.1].
O mesmo padrão de aumento da atividade da GPx-Se das brânquias foi
observada no plasma da hemolinfa. A atividade permaneceu acima dos níveis do
controle mesmo nos animais pré-expostos a Se e expostos a Cu (Fig. 15A). É possível
que alguma parte da atividade da GPx-Se encontrada na hemolinfa seja originada da
contaminação do músculo adutor, como previamente proposto (AL-SUBIAI et al.,
2009). Entretanto, a resposta a exposição a Se foi similar aos resultados da GPx e GPx-
Se das brânquias, o que sugere que esta contaminação pode não ter interferido
fortemente com os resultados.
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0
50
100
150
b,c
c
a
a,b
GPx-Se (mU/ml)
Ctl/Ctl Ctl/Cu Se/Ctl Se/Cu
0
10
20
30
40
a
b
a
a
Dano ao DNA
(% fragmentação do DNA)
(A)
(B)
Figura 16: Parâmetros na hemolinfa de Mexilhões Mytilus edulis após a exposição a Se e/ou Cu.
(A) atividade da glutationa peroxidase selênio dependente (GPx-Se) no plasma da hemolinfa; (B) dano no
DNA (teste do cometa) em hemócitos. Ctl/Ctl grupo controle; Ctl/Cu animais expostos ao cobre; Se/Ctl
animais pré-expostos a selênio; Se/Cu animais pré-expostos a selênio e expostos ao cobre; Letras
diferentes significam diferenças (p<0,05, ANOVA de duas vias seguido por teste posthoc de Duncan)
5.1.4 Dano ao DNA estimado pelo teste do cometa
Para melhor compreender os efeitos do cobre nos mexilhões M. edulis, o teste do
cometa foi realizado nos hemócitos para observar possíveis danos oxidativos no DNA.
Cobre causou um aumento no dano ao DNA (Fig. 15B), como observado pelo aumento
44
da porcentagem de cauda de DNA, um indicativo dos níveis de quebras de fita de DNA
e sítios álcali-lábeis. A pré-exposição ao Se foi capaz de prevenir esse dano induzido
pelo cobre nos hemócitos.
5.2 Estudo 2: Análise temporal da exposição à zinco em mexilhões Perna perna
5.2.1 Efeitos do zinco sobre o estado tiólico celular
Exposição aguda (2 dias) ao zinco causou depleção dos níveis de tióis celulares
nas brânquias de mexilhões P. perna. Após 2 e 7 dias de exposição, os níveis de NPSH
(Fig. 17A) e GSH-t (Fig. 17B) reduziram entre 30-40%, porém estes valores retornaram
aos níveis basais após 21 dias de exposição. Com relação aos níveis de PSH, não foi
observada alteração entre 2 e 7 dias, porém após 21 dias de exposição, os níveis
estavam mais elevados que os animais controles (Fig. 17C)
0 2 7 21
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
a
b,c
b
a,c
Dias de exposição
NPSH (umol/g)
0 2 7 21
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
a
b
b
a,b
Dias de exposição
GSH-t (umol/g)
0 2 7 21
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
a,c
c
a,b
b
Dias de exposição
PSH (umol/g)
(A) (B)
(C)
Figura 17: Níveis tiólicos em mexilhões Perna perna expostos a zinco por até 21 dias.
Níveis de tióis não-protéicos (NPSH) (A); glutationa total (GSH-t) (B); tióis protéicos (PSH) (C).
Animais foram expostos a 10 µM de ZnCl
2
durante 2, 7 e 21 dias. Valores representados como média +
EPM (n=9-12). Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05, ANOVA de uma via seguido
por teste post hoc de Duncan).
45
5.2.2 Efeitos do zinco sobre enzimas antioxidantes
Animais expostos a Zn 10 µM demonstraram diversas alterações no sistema
antioxidante. Após 2 dias de exposição, Zn causou redução da atividade GR, porém a
atividade voltou ao valor basal em 7 e 21 dias após de exposição (Fig. 18A).
0 2 7 21
0
20
40
60
80
a,b
c
a
b,c
Dias de exposição
GR (mU/mg)
0 2 7 21
0
50
100
150
200
Dias de exposição
G6PDH (mU/mg)
0 2 7 21
0
500
1000
1500
a,b
a
a,b
b
Dias de exposição
GST (mU/mg)
0 2 7 21
0
5
10
15
20
25
a,b
b
b
a
Dias de exposição
GGT (U/mg)
0 2 7 21
0
10
20
30
40
50
a
a
b
a,b
Dias de exposição
TrxR (mU/mg)
(A) (B)
(C) (D)
(E)
Figura 18: Atividades de enzimas antioxidantes em mexilhões Perna perna expostos ao zinco por até
21 dias.
Atividade das enzimas glutationa redutase (GR) (A); glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) (B);
glutationa S-transferase (GST) (C); γ-glutamiltranspeptidase (GGT) (D); tioredoxina redutase (TrxR) (E).
Valores representados como média +
EPM (n=9-12). Letras diferentes indicam diferenças significativas
(p<0,05, ANOVA de uma via seguido por teste post hoc de Duncan).
46
Enquanto nenhuma alteração foi observada após exposição aguda, após 7 e 21
dias a exposição a Zn causou uma resposta coordenada na indução das defesas
antioxidantes. As enzimas GPx, SOD e CAT tiveram suas atividades aumentadas após a
exposição por 7 ou 21 dias (Fig. 19). Ao mesmo tempo, foi observado um aumento na
atividade da TrxR, mas somente após 7 dias (Fig. 18E).
0 2 7 21
0
5
10
15
a
a,c
b
b,c
Dias de exposição
GPx (mU/mg)
0 2 21 7
0
5
10
15
20
25
a
a
b
b
Dias de exposição
SOD (U/mg)
0 2 7 21
0
2
4
6
8
a
a,b
bb
Dias de exposição
CAT (U/mg)
(A) (B)
(C)
Figura 19: Atividades de enzimas antioxidantes em mexilhões Perna perna expostos a zinco por até
21 dias.
Atividades da glutationa peroxidase (GPx) (A); superóxido dismutase (SOD) (B); catalase (CAT) (C).
Valores representados como média +
EPM (n=9-12). Letras diferentes indicam diferenças significativas
(p<0,05, ANOVA de uma via seguido por teste post hoc de Duncan).
5.2.3 Efeitos do zinco sobre marcadores de estresse oxidativo
Para medir possíveis efeitos do zinco sobre a geração de um cenário pró-
oxidativo, marcadores de dano oxidativo a lipídios foram medidos através do método de
47
TBARS. Os níveis de produtos finais da peroxidação lipídica aumentaram após 7 e 21
dias de exposição ao Zn, mas nenhuma alteração foi observada após 2 dias de exposição
(Fig. 20A). Os resultados demonstram que os níveis de peróxidos também aumentaram
apenas após 7 e 21 dias (Fig. 20B), de modo similar aos níveis de TBARS.
0 2 7 21
0
2
4
6
8
10
a
a
b
b
Dias de exposição
TBARS (umol/mg)
0 2 7 21
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
b
b
a
a
Dias de exposição
FOX assay (umol/mg proteína)
(A) (B)
Figura 20: Marcadores bioquímicos de estresse oxidativo em mexilhões Perna perna expostos a
zinco por até 21 dias.
Níveis de (A) produtos finais de peroxidação lipídicas medidos pelo método de substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS); (B) peróxidos citosólicos medidos pelo método do PCA-FOX. Valores
representados como média +
EPM (n=9-12). Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05,
ANOVA de uma via seguido por teste post hoc de Duncan)
48
6. DISCUSSÃO
6.1. Estudo 1:Efeitos protetores do selênio em mexilhões Mytilus edulis
6.1.1 Níveis de selênio e cobre na água e nos tecidos
As análises químicas demonstraram que os níveis nominais foram semelhantes
aos níveis reais de Se e Cu analisados na água do mar. O Se permaneceu constante na
água ao longo do dia e nos tecidos após 3 dias de exposição, indicando que a
assimilação foi mínima comparado à quantidade de selênio adicionado à água.
Aparentemente, o aumento na disponibilidade de selênio inorgânico não está
diretamente relacionado à quantidade de selênio mensurável no tecido (2-3 mg/Kg).
Porém, isso não pode ser confirmado por este experimento, uma vez que as brânquias,
um importante tecido para acumulação e excreção de contaminantes, foram removidas
para análises bioquímicas e, desta forma, não foram incluídas para as análises químicas.
Além disso, quando a assimilação de Se é maior que a quantidade necessária para a
homeostase celular (e.g. síntese de selenoproteínas), ele é rapidamente excretado como
metabólito. A acumulação só ocorre quando a assimilação de Se for maior que a taxa de
excreção (BURK, 1986). Uma vez que a concentração de Se utilizada foi muito mais
baixa quando comparado com outros estudos toxicológicos (HAMILTON, 2004), é
possível que o excesso tenha sido excretado de volta para a água, evitando uma
acumulação.
Animais expostos ao cobre incorporaram este metal em seus tecidos causando
um aumento de 3-5 vezes comparado aos níveis basais. Este dado está consistente com
o fato que os níveis de Cu na água diminuíram entre 30-35% após 24 horas na presença
49
dos animais. Interessantemente, houve uma menor acumulação de cobre no tecido dos
mexilhões pré-expostos ao Se (Se/Ctl x Se/Cu) (Fig. 13D). Infelizmente, não foram
encontrados estudos na literatura levantando uma possível interferência do Se na
assimilação de Cu.
6.1.2. Alterações em parâmetros antioxidantes
Foi demonstrado que o Se leva a um aumento nos níveis de GSH-t (Fig. 14A),
mesmo após a exposição ao cobre (grupo Se/Cu). Sabendo que a GSH é um importante
neutralizados de ERO, e substrato para diversas enzimas relacionadas com as defesas
antioxidantes (VIARENGO et al., 1993; SIES, 1999), é provável que este aumento na
GSH-t seja um dos fatores envolvidos na proteção contra os processos oxidativos
mediados pelo cobre. Células tumorais expostas a selenito de sódio (3,2-12,6 µg/L)
demonstraram aumento nos níveis de GSH celular (KUCHAN et al., 1990), e outros
autores (PANEE et al., 2007) demonstraram a superexpressão da selenoproteína H
(SelH) humana, uma proteína redox nuclear, induz a transcrição da enzima glutamato-
cisteína ligase (GCL), responsável por uma das etapas de síntese de GSH. Se a
disponibilidade de Se é capaz de modular os níveis de selenoproteínas em mexilhões, o
que foi demonstrado neste estudo no caso da GPx-Se (Fig. 15B), então o aumento nos
níveis de GSH pode ser modulado por um mecanismo semelhante a SelH. Independente
do mecanismo, um aumento na GSH-t traz duas conseqüências. Primeiro, aumenta a
capacidade do organismo de neutralizar metais, como o cobre, por conjugação e
estocagem em lisossomos ou vacúolos, para posterior excreção (VIARENGO et al.,
1993). Segundo, maior disponibilidade de glutationa pode aumentar a disponibilidade
de substrato, permitindo um maior turnover de enzimas que necessitam GSH.
50
Estudos anteriores demonstraram que o cobre causa diminuição nos níveis de
GSH em mexilhões após exposição aguda, um padrão que não foi observado neste
experimento. Mexilhões de água doce Unio tumidus expostos a cobre (30 µg/L) tiveram
baixos níveis de GSH e altos níveis de GSSG nas brânquias e glândulas digestivas
(DOYOTTE et al., 1997). Outro estudo em laboratório demonstrou que exposição ao
cobre (60 µg/L) por 1 a 3 semanas é capaz de diminuír os níveis de GSH-t nas brânquias
e glândula digestiva de duas populações diferentes de Mytilus galloprovincialis
(REGOLI et al., 1995). Entretanto, recentemente, outro estudo (AL-SUBIAI et al.,
2009) encontrou um aumento nos níveis de GSH-t no músculo adutor de M. edulis após
5 dias de exposição ao Cu (40 µg/L). Interessantemente, apesar da exposição ao cobre
(38 µg/L) por 7 dias causar uma depleção nos níveis de GSH-t, também observa-se um
aumento na atividade da GCL (CANESI et al., 1999). Em conjunto, estes dados
sugerem que a primeira resposta de mexilhões expostos ao Cu é um aumento na síntese
de GSH, e posteriormente, se os níveis de estresse oxidativo induzido pelo Cu for alto o
suficiente, ocorre a oxidação e depleção de GSH.
Os níveis de PSH diminuíram após a exposição ao Cu (Fig. 14B), um sinal
evidente de estresse oxidativo. O que poderia estar correlacionado à uma maoir
consumo de GSH, o qual poderia estar sendo compensado pelo amento de sua síntese,
impedindo a observação de alterações nos níveis de GSH. Cobre pode se ligar a
proteínas, particularmente aquelas que contem tióis, diminuindo a disponibilidade de
sua participação em reações de Fenton e Haber-Weiss (LETELIER et al., 2005). Ao
mesmo tempo, a ligação de metais a proteínas pode causar distúrbio na função
protéica/enzimática, e em conseqüência, induzir perda da homeostase celular ou ativar
vias de sinalização. Neste contexto, a proteção contra a perda de PSH pela pré-
exposição a Se (Fig. 14B) poderia ser explicada por uma maior capacidade desses
51
organismos em neutralizar ERO, devido aos maiores níveis de GSH e de atividade da
GPx-Se observados.
6.1.3 Dano ao DNA
Exposição ao cobre causa aumento no dano ao DNA, como observado em
eritrócito de peixes e em hemócitos de bivalves (GABBIANELLI et al., 2003). Outro
estudo demonstrou que mexilhões M. galloprovincialis expostos ao cobre (60 µg/L) por
dez dias tinham maiores níveis de dano oxidativo no DNA de glândulas digestivas e
hemócitos (MACHELLA et al., 2004). Pode ser esperado que a formação catalítica de
ERO pelo Cu cause uma resposta antioxidante. O aumento na atividade da GPx-Se nas
brânquias e no plasma da hemolinfa; a reversão parcial na inibição da atividade da
TrxR; os níveis elevados de GSH e a proteção contra a oxidação de PSH estão de
acordo com uma resposta contra a toxicidade do Cu, e podem limitar o aumento nos
níveis de ERO, e conseqüentemente, diminuir os danos celulares mediados pelo cobre.
6.1.4 Selenoproteínas
Muitos estudos têm demonstrado que o tratamento com Se leva a um aumento na
atividade de uma ou duas importantes selenoproteínas, GPx-Se e TrxR, em linhagens
celulares (EL-BAYOUMY, 2001; HAMILTON, 2004; HOFFMANN et al., 2007;
ZHANG et al., 2008), peixes (ATENCIO et al., 2009) e invertebrados aquáticos (TRAN
et al., 2007). Mesmo assim, o mecanismo de regulação dessas enzimas ainda não foi
totalmente elucidado. O aumento na GPx-Se encontrado em M. edulis foi similar a
outras espécies, mas contrasta com a falta de indução da atividade da TrxR nos animais
52
expostos a Se. Esta resposta diferencial pode estar relacionada com os baixos níveis de
Se utilizado neste estudo, quando comparado com os níveis utilizados em trabalhos com
vertebrados.
Um estudo recente com M. edulis (TRAN et al., 2007) demonstrou que a
suplementação com Se foi capaz de aumentar a atividade GPx-Se na hemolinfa desses
animais e impedir os danos no DNA de hemócitos induzido pelo mercúrio. Até onde se
sabe, o estudo de Tran et al. (2007) e o presente trabalho foram os únicos trabalhos
relacionados a proteção de bivalves marinhos contra a toxicidade de metais através da
GPx-Se.
A TrxR é uma importante enzima relacionada ao sistema Trx/Prx, responsável
pela manutenção dos níveis de Trx reduzida, participando da detoxificação de peróxidos
e também de outros processos enzimáticos e regulatórios (ARNER et al., 2000). O
conhecimento sobre a TrxR, Trx e Prx em invertebrados é ainda limitado, mas alguns
poucos trabalhos demonstraram que a TrxR também tem um papel fundamental na
defesa antioxidante do abalone Haliotis discus discus (DE ZOYSA et al., 2008; DE
ZOYSA et al., 2009) contra estresse físico, metais e peróxidos. A redução na atividade
da TrxR em animais expostos ao Cu, como demonstrado no presente estudo (Fig. 15D),
pode diminuir a eficiência do sistema Trx/Prx através da limitação da taxa de redução
da Trx, aumentando a susceptibilidade ao dano oxidativo induzido pelo Cu. Em
conjunto, estes dados sugerem que a TrxR (junto com o sistema Trx/Prx) é um
interessante parâmetro antioxidante, com potencial promissor em estudos toxicológicos
com organismos aquáticos.
Em conjunto (Tabela 2), todos estes resultados sugerem que o Cu pode afetar o
metabolismo da glutationa e outras enzimas antioxidantes, gerando um cenário pró-
oxidativo e causando dano molecular e celular. Ao mesmo tempo, a exposição ao
53
selênio é capaz de causar uma modulação no sistema antioxidante, amplificando sua
defesa contra ERO, as quais são capazes de prevenir, ao menos parcialmente, os danos
mediados pelo cobre em mexilhões M. edulis.
Tabela 2: Resumo dos efeitos antioxidantes do selênio e oxidativos do cobre em
mexilhões Mytilus edulis.
(GSH) níveis glutationa; (GPx-Se) atividade da glutationa peroxidase selênio-
dependente; (TrxR) atvidade tioredoxina redutase; (PSH) níveis de tióis protéicos. Os
tratamentos com selênio e/ou cobre causaram (↓) diminuição, (↑) aumento, (◊) proteção
ou (―) nenhuma alteração nos parâmetros avaliados.
6.2 Estudo 2:Análise temporal da exposição à zinco em mexilhões Perna perna
Exposição a metais é um assunto extensivamente estudado em vertebrados,
especialmente mamíferos, uma vez que eles estão relacionados com diversos processos
patológicos. Com relação a invertebrados como bivalves, os estudos de exposição a
metais se concentram em análises dos efeitos da contaminação por metais nos
ecossistemas aquáticos, mas pouco se sabe sobre os processos bioquímicos e
mecanismos regulatórios envolvidos nesses processos.
54
6.2.1 Estado tiólico celular e glutationa redutase
Zinco causou diversas alterações no sistema antioxidante do mexilhão Perna
perna, após exposição aguda e sub-crônica. Após 2 dias, o metabolismo da glutationa
foi afetado, com baixos níveis de tióis (GSH-t e NPSH) e da atividade da GR.
Glutationa é uma importante molécula para a célula, a qual participa de detoxificação e
excreção de inúmero químicos e contaminantes. Consumo de glutationa pela exposição
ao zinco também foi observado em outros organismos, como caramujos (RADWAN et
al., 2010) e linhagens celulares de mamíferos (PAVLICA et al., 2009; WISEMAN et
al., 2010), possivelmente pela conjugação do zinco com a glutationa. A glutationa
redutase é uma importante enzima celular, responsável pela ciclagem da GSSG,
mantendo-a na sua forma reduzida (GSH). A inibição da GR causada pela exposição ao
zinco já foi reportado anteriormente em mexilhões P. perna (FRANCO et al., 2006), e
pode causar desequilíbrio nas defesas celulares, ou mesmo comprometer a própria
célula. Baixos níveis de GSH e da atividade da GR pode ser perigoso para a célula, uma
vez que estão relacionados com a capacidade redutora do citosol, protegendo a célula
contra processos oxidativos patológicos. Foi demonstrado que a toxicidade do zinco é
inversamente proporcional aos níveis celulares de GSH, e sua toxicidade pode ser
diminuída através da indução da síntese de GSH em culturas de células (WALTHER et
al., 2008). Em um trabalho com células endoteliais de mamíferos (WISEMAN et al.,
2010), 4 horas de exposição ao zinco (até 1 mM) foi capaz de consumir os níveis de
GSH, inibir a GR e causar uma alteração do estado redox celular do citosol e da
mitocôndria, induzindo uma situação de estresse oxidativo e levando à morte celular por
apoptose, sem causar um aumento na geração de ERO. Isto demonstra que a disfunção
55
do metabolismo da glutationa afetar a homeostase celular, podendo levar a morte da
célula.
Apesar de ter ocorrido um consumo dos tióis, após a exposição aguda, os níveis
de NPSH e GSH-t foram reestabelecidos aos níveis basais após 21 dias de exposição ao
Zn, enquanto os níveis de PSH foram ainda maiores que àqueles do grupo controle (Fig.
17). Essa restauração dos níveis de tióis pode estar relacionada com a síntese de GSH,
como um mecanismo compensatório e antagonista à toxicidade do zinco. A enzima
GCL, responsável por uma das etapas da síntese de GSH, é regulada positivamente pelo
fator de transcrição “fator 2 relacionado ao NF-E2” (Nrf2) em células endoteliais de
mamíferos (CORTESE et al., 2008).
6.2.2 Amplificação das defesas antioxidante
Metais podem regular diversos genes envolvidos na proteção celular e
homeostasia de metais, especialmente através da interação com fatores de transcrição
(DEMOOR et al., 2000). Sabe-se que o zinco causa a ativação do fator de transcrição
dependente de metais (MTF1) através da seqüência gênica de elementos de resposta a
metais (ERM), responsável pela regulação da expressão de metalotioneínas, do
transportador de zinco (ZnT1), de enzimas de síntese de GSH, entre outros
(ANDREWS, 2001). Este mecanismo poderia levar ao seqüestro e neutralização de
zinco através da propriedade quelante da GSH e das metalotioneínas, além da excreção
extracelular do zinco pelo ZnT1, conferindo proteção celular adicional contra a
toxicidade do zinco. Em um trabalho prévio de nosso grupo com mexilhões P. perna
(FRANCO et al., 2006), foi demonstrado que a exposição aguda ao zinco causa um
aumento na expressão de proteínas chaperonas HSP60 e glicoproteínas-P dependentes
56
de ATP (PGP). Isto pode impedir o malfuncionamento de proteínas e aumentar a
tolerância a metais através da excreção na forma de conjugados de GSH (DEY et al.,
1994; BROEKS et al., 1996). Apesar da modulação por Nrf2 e MTF1 não ter sido
estudada neste trabalho, é um possível mecanismo de ação, o qual merece futuros
estudos em invertebrados aquáticos, uma vez que esse modelo animal é extensamente
utilizado em trabalhos de contaminação ambiental por metais.
Experimentos de campo com a truta marrom Salmo trutta demonstraram que a
exposição a ambientes contaminados por metais (principalmente cádmio, cobre e zinco)
causaram um aumento na expressão de genes e no conteúdo de metalotioneínas em
brânquias, fígado e rins. A atividade ou a expressão gênica das enzimas SOD, CAT e
GPX também foram aumentadas em pelo menos um dos 3 tecidos analisados
(HANSEN et al., 2006). Exposição sub-crônica (30 dias) a mercúrio, cobre, chumbo ou
cádmio também causaram um aumento na atividade da SOD, ascorbato peroxidase e
nos conteúdos de GSH-t do dinoflagelado Gonyaulax polyedra (OKAMOTO et al.,
2001). Em mexilhões M. galloprovincialis, 6 dias de exposição a cádmio, cobre, zinco e
chumbo causam um aumento na expressão gênica das isoformas 10 e 20 das
metalotioneínas (DONDERO et al., 2005). Em conjunto, estes dados demonstram que
os metais podem modular a expressão de enzimas antioxidantes e de moléculas
quelantes de metais maneira similar em diferentes organismos
Após a exposição ao zinco por 7 ou 21 dias foi possível observar uma
amplificação do sistema antioxidante no mexilhão P. perna. O aumento simultâneo nos
níveis de GSH-t (Fig. 17), atividade da GPx, CAT, SOD (Fi.g 18), TrxR e GR (Fig. 19)
pode conferir à célula uma maior proteção contra o estresse oxidativo, e também pode
indicar um possível mecanismo de regulação em comum dessas moléculas no mexilhão
P. perna. Após 21 dias de exposição ao zinco a atividade das enzimas GST e da GGT
57
tenderam a serem maiores que os níveis basais (p=0,09 e 0,08 contra o grupo controle,
respectivamente), o que reforça a idéia de uma regulação em comum do sistema
antioxidante desses animais. Um trabalho de nosso grupo de pesquisa demonstrou que
tilápias do Nilo Oreochromis niloticus expostas a ambientes contaminados com metais
tiveram uma resposta adaptativa similar, com um aumento mútuo de diversas enzimas
antioxidantes e danos em lipídios (FRANCO et al., 2010), reforçando esta idéia. Este
mecanismo poderia ser explicado pelo fator de transcrição Nrf2 e a seqüência gênica
regulatória elementos de resposta antioxidante (do Inglês ARE), os quais estão
relacionados com a regulação da transcrição de enzimas responsáveis pela síntese de
GSH , detoxificação de ERO, geradores de NADPH e de detoxificação eletrofílica
(ITOH et al., 1999; CHAN et al., 2000). Apesar desta informação ser facilmente
aplicada a mamíferos e outros vertebrados, não existe dados disponíveis sobre a
expressão/translocação nuclear de Nrf2 e ativação de ARE em invertebrados aquáticos.
6.2.3 Efeitos oxidativos da exposição ao zinco
Com relação aos efeitos tóxicos do zinco aumentando a produção de ERO e
induzindo morte ou dano celular, células neuronais expostas a 250µM de zinco pó até 6
horas causaram uma intensa produção de ERO e posteriormente morte celular por
necrose (SANCHEZ-MARTIN et al., 2010). Em outro trabalho, neutrófilos humanos
expostos a zinco (5-1000 µM) iniciaram um burst oxidativo através da ativação da
NADPH oxidase e conseqüentemente geração de ânion superóxido (FREITAS et al.,
2010), um mecanismo dependente a proteína cinase C. Em um trabalho com o bivalve
Ruditapes decussates, zinco causou um aumento na CAT e peroxidação lipídica nas
58
brânquias, como resposta a um possível aumento na produção de peróxido de
hidrogênio (GERET et al., 2004).
No presente estudo, após 2 dias de exposição, não foram observadas alterações
nos níveis de peróxidos e nos índices de peroxidação lipídica (Fig. 20). Entretanto, a
exposição sub-crônica revelou maiores índices desses parâmetros, possivelmente devido
à disfunção mitocondrial e lisossomal, como demonstrado por outros autores. Um
trabalho com células humanas demonstrou que zinco causa apoptose e é rapidamente
incorporado em lisossomos e mitocôndrias (RUDOLF et al., 2010). Este mesmo
trabalho revelou que zinco causa uma diminuição no potencial de membrana da
mitocôndria e distúrbios na membrana dos lisossomos, aumento na atividade de
caspases, liberação de citocromo c, p53 e outras moléculas pró-apoptótica para o
citosol. Além disto, sabe-se que o zinco causa a inibição do complexo I da mitocôndria
(NADH:ubiquinona oxidoredutase), o que pode causar outras conseqüências
patofisiológicas (SHARPLEY et al., 2006).
Em resumo (Tabela 3), estes resultados, em conjunto com descobertas e idéias
de outros autores, sugerem que o metabolismo da glutationa é um importante fator de
toxicidade do zinco, apesar de não ser um distúrbio permanente para a célula. Como
resposta (Fig. 2), a célula pode iniciar importantes vias de sinalização, possivelmente
terminando na modulação dos fatores Nrf2 e MTF1, o que irá aumentar a capacidade
antioxidante da célula e a maquinaria responsável pela neutralização (GSH e
metalotioneínas) e excreção de metais (ZnT1 e PGP). Esta resposta é fundamental para
uma proteção mais prolongada: o aumento nas defesas celulares é capaz de restabelecer
o balanço tiólico e antioxidante da célula, protegendo o organismo contra os efeitos
tóxicos mediados pelo zinco, entretanto esta amplificação nas defesas celulares não foi
59
capaz de impedira o dano aos lipídios, com demonstrado pelo aumento nos níveis de
TBARS e de peróxidos.
Tabela 3: Resumo dos efeitos do zinco em parâmetros antioxidantes de Perna
perna após 2, 7 e 21 dias de exposição.
Níveis de (GSH-t) glutationa total, (NPSH) tióis não-protéicos, (PSH) tióis protéicos; atividade da (GR)
glutationa redutase, (TrxR) tioredoxina redutase, (GPx) glutationa peroxidase, (SOD) superóxido
dismutase, (CAT) catalase, (GST) glutationa S-transferase, (G6PDH) glicose-6fosfato desiddrogenase,
(GGT) γ-glutamil transpeptidase. O exposição ao zinco causou (↓) diminuição, (↑) aumento, (==) retorno
aos níveis basais ou (―) nenhuma alteração nos parâmetros avaliados.
60
Figura 21: Possível mecanismo de toxicidade do zinco em mexilhões Perna perna.
No esquema, são propostos dois mecanismos relacionados aos efeitos celulares do zinco (Zn
2+
): Painel
superior representa a exposição aguda (2 dias), enquanto que o inferior a exposição sub-crônica (7-21
dias). Etapas da exposição aguda: (1) zinco é assimilado na célula e incorporado na mitocôndria e
lisossomos; (2) no citosol, o zinco pode afetar o metabolismo da glutationa, pela inibição da glutationa
redutase (GR) ou ligando com a glutationa (GSH), o que leva a uma alteração redox na célula; (3)
distúrbios em organelas e estresse oxidativo causado pelo zinco podem ativar o fator de transcrição Nrf2,
causando sua translocação ao núcleo. Ao se ligar a regiões gênicas conhecidas como elementos de
resposta antioxidante (ERA), haveria uma modulação de genes de defesas antioxidantes; (5) no citosol,
zinco pode ativar o fator de transcrição dependente de metais (MTF1), o qual é translocado ao núcleo (6)
e liga-se a regiões gênicas conhecidas como elementos de respostas a metais (ERM) modulando a
transcrição de proteínas de detoxificação/neutralização de metais; (7) zinco pode também levar a um
aumento nos níveis de proteínas de transporte de conjugados de GSH (PGP) e chaperonas (HSP60),
caracterizadas como proteínas de resposta a estresse celular. Etapas da exposição sub-crônica: (8) após a
indução de ARE por Nrf2, ocorre a síntese de enzimas antioxidantes, conferindo um aumento na proteção
celular; (9) após indução de ERM por MTF1 ocorre a síntese de proteínas como metalotioneínas (MTs) as
quais irão (10) neutralizar o excesso de zinco citosólico; ERM também é responsável pela (11) síntese de
transportadores de zinco (e.g. ZnT1), responsável por (12) excretar o zinco intracelular; o qual ainda pode
afetar organelas como lisossomos (13) e mitocôndrias (14), podendo causar um aumento (15) na
produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e conseqüentemente, levar a danos à moléculas
orgânicas, como (16) lipídios.
61
CONCLUSÃO
Os resultados deste trabalham indicam que o sistema antioxidante de mexilhões
M. edulis é modulado por selênio inorgânico através de um aumento na síntese de GSH
e de um aumento na atividade da GPx-Se, provavelmente através de um aumento da
transcrição para essa enzima. Uma vez que ambas as moléculas (GSH e GPx-Se) são
importantes defesas antioxidantes, e com grande capacidade de degradação de
peróxidos, é possível que esses animais possuam uma maior capacidade de
detoxificação de EROs, e conseqüentemente, serem mais resistentes ao estresse
oxidativo. Essa informação pode ser baseada no fato de que o pré-tratamento com
selênio diminui a toxicidade do cobre, um metal cuja toxicidade é mediada por ERO e
estresse oxidativo.
O distúrbio no metabolismo da glutationa também é uma importante via de
toxicidade celular. A exposição de mexilhões P. perna ao zinco afetou diretamente esse
metabolismo, diminuindo a disponibilidade de GSH intracelular e inibindo a GR. Dessa
forma, a neutralização direta de ERO pela GSH e as reações acopladas com peroxidases
dependentes de tióis (e.g. GPx e Prx6) são diretamente afetadas nessas condições, e a
célula torna-se susceptível ao estresse oxidativo. Um interessante mecanismo de
regulação do sistema antioxidante foi observado nesses animais após a exposição sub-
crônica ao zinco, onde foi constatado um aumento na atividade de diversas enzimas
antioxidantes e o restabelecimento do estado redox celular. Isso mostra a capacidade de
resposta adaptativa desses animais a situações pró-oxidativas, como já foi constatado
em estudos com mamíferos. O mecanismo proposto para essa regulação envolve os
fatores de transcrição Nrf2 e MTF-1, os quais são ativados em situações de desbalanço
redox e excesso intracelular de metais, respectivamente. Apesar de não ter sido estudado
62
diretamente estas vias de ativação/sinalização, esta área é bastante promissora para
trabalhos com invertebrados marinhos.
Além disso, um importante fator constatado em ambos o experimento é a
modulação da TrxR pelo cobre e pelo zinco. Em mamíferos, essa enzima, em conjunto
com o sistema Trx/Prx tem sido amplamente estudada, principalmente nas vias de
sinalização celular e toxicidade em mitocôndrias. Em bivalves marinhos o
conhecimento sobre esse sistema é praticamente nulo, mas os poucos trabalhos com
estas moléculas destacaram as importância na área de toxicologia aquática.
Este estudo demonstrou fortes evidências da regulação redox de bivalves
marinhos em situações de desafios oxidativos, e propôs interessantes modelos de estudo
in vivo para avaliar os efeitos do metabolismo da glutationa nestes animais. Novos
trabalhos ainda são necessários para complementar esse cenários, relacionados às
diferentes vias de sinalização ativadas/reprimidas nestas situações, e uma abordagem
comparativa entre os diferentes grupos de defesas antioxidantes e suas capacidades de
detoxificação nestes animais.
63
PERSPECTIVAS
1. Trabalhar com diferentes sistemas antioxidantes celulares em estados
reprimidos/ativados
2. Trabalhar com desafios oxidativos por diferentes agentes (quinonas, peróxidos,
metais)
3. Trabalhar com diferentes espécies de bivalves e observar se há diferença de
susceptibilidade entre as espeçies, e se há relação com diferentes mecanismos de
regulação (Fisiologia/Bioquímica comparativa)
4. Causar a inibição de diferentes enzimas antioxidantes ou auxiliares, e observar
os efeitos dessas inibições no consumo de peróxido (protocolo em
desenvolvimento no laboratório)
5. Estudar possíveis vias de sinalização celular responsável por respostas
adaptativas ao estresse oxidativo
6. Observar a importância dos sistemas de degradação de peróxido na questão da
morte celular.
7. Investigar o sistema Trx/Prx de bivalves marinhos, através da quantificação e
análise de oxidação destas moléculas através do uso de anticorpos específicos.
64
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADESIYAN,AC;OYEJOLA,TO;ABARIKWU,SO;OYEYEMI,MO;FAROMBI,EO.Seleniumprovides
protection to the liver but not the reproductive organs in an atrazine‐model of experimental
toxicity. Experimental and Toxicologic Pathology, In Press, (doi:10.1016/j.etp.2009.11.008),
2010.
AEBI,H.Catalaseinvitro.MethodsinEnzymology,v.105,p.121‐126,1984.
AKERBOOM,
TP; SIES, H. Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed
disulfidesinbiologicalsamples.MethodsinEnzymology,v.77,p.373‐382,1981.
AL‐SUBIAI, SN; JHA, AN; MOODY, AJ. Contamination of bivalve haemolymph samples by
adductormusclecom pon ents:implicationsforbiomarkerstudies.Ecotoxicology,v.18,p.334‐
342,2009.
ANDREWS,GK.
Cellularzincsensors:MTF‐1regulationofgeneexpression.Biometals,v.14,p.
223‐237,2001.
ARNER, ES; HOLMGREN, A. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase.
EuropeanJournalofBiochemistry,v.267,p.6102‐6109,2000.
ARNER, ES; ZHONG, L; HOLMGREN, A. Preparation and assay of mammalian thioredoxin and
thioredoxinreductase.
MethodsinEnzymology,v.300,p.226‐239,1999.
ATENCIO,L;MORENO,I;JOS,A;PRIETO,AI;MOYANO,R;BLANCO,A;CAMEAN,AM.Effectsof
dietary selenium on the oxidative stress and pathological changes in tilapia (Oreochromis
niloticus) exposed to a microcystin‐producing cyanobacterial water bloom. Toxicon, v.53, p.
269‐282,2009.
BERKHOLZ, DS; FABER, HR; SAVVIDES, SN; KARPLUS, PA. Catalytic cycle of human glu tathione
reductasenear1Aresolution.JournalofMolecularBiology,v.382,p.371‐384,2008.
BERRA, CM; MENCK, CRM; DI MASCIO, P. Oxidative stress, genome lesions and signaling
pathwaysincellcyclecontrol.QuímicaNova,v.29,p.1340‐
1344,2006.
BOLOGNESI, C; LANDINI, E; ROGGIERI,P;FABRI, R; VIARENGO, A.Genotoxicity biomarkers in
the assessment of heavy metal effects in mussels: Experimental studies. Environmental and
MolecularMutagenesis,v.33,p.287‐292,1999.
BROEKS,A;GERRARD,B;ALLIKMETS,R;DEAN,M;PLASTERK,RHA.Homologuesofthehuman
multidrug resistance genes
MRP and MDR contribute to heavy metal resistance in the soil
nematodeCaenorhabditiselegans.TheEmboJournal,v.15,p.6132‐6143,1996.
BURK, RF. Selenium and Cancer‐Meaning of Serum Selenium Levels. Journal of Nutrition,
v.116,p.1584‐1586,1986.
CANESI,L;VIARENGO,A; LEONZIO, C; FILIPPELLI, M; GALLO, G. Heavy
metalsandglutathione
metabolisminmusseltissues.AquaticToxicology,v.46,p.67‐76,1999.
65
CARBALLAL, S; RADI, R; KIRK, MC; BARNES, S; FREEMAN, BA; ALVAREZ, B. Sulfenic acid
formation in human serum albumin by hydrogen peroxide and peroxynitrite. Biochemistry,
v.42,p.9906‐9914,2003.
CARLBERG, I; MANNERVIK, B. Glutathione reductase . Methods in Enzymology, v.113, p. 484‐
490,1985.
CHAN,JY;KWONG,M.Impaired
expressionofglutathionesyntheticenzymegenesinmicewith
targeteddeletionoftheNrf2basic‐leuci nezipperprotein.BiochimicaEtBiophysicaActa‐Gene
StructureandExpression,v.1517,p.19‐26,2000.
CORTESE, MM; SUSCHEK, CV; WETZEL, W; KRONCKE, KD; KOLB‐BACHOFEN, V. Zinc protects
endothelial cells from hydrogen peroxide via
Nrf2‐dependent stimulation of glutathione
biosynthesis.FreeRadicalBiologyandMedicine,v.44,p.2002‐2012,2008.
DEZOYSA, M;LEE,J.Expressionprofilingofantioxidantandselectedimmunegenesinthegill
ofdisk abalone against thermal, low‐salinityand hy poxic stresses. Comparative Biochemistry
andPhysiologyA‐Molecular&IntegrativePhysiology,
v.154,p.S6‐S6,2009.
DEZOYSA,M;PUSHPAMALI,WA;WHANG,S;KIM,SJ;LEE,J.Mitochondrialthioredoxin‐2from
disk abalone (Haliotis discus discus): Molecular characterization, tissue expression and DNA
protection activity of its recombinant protein. Comparative Biochemistry and Physiology B‐
Biochemistry&MolecularBiology,v.149,p.630‐639,
2008.
DEMOOR, JM; KOROPATNICK, DJ. Metals and cellular signaling in mammalian cells. Cellular
andMolecularBiology,v.46,p.367‐381,2000.
DEY, S; PAPADOPOULOU, B; HAIMEUR, A; ROY, G; GRONDIN, K; DOU, D; ROSEN, BP;
OUELLETTE, M. High‐Level Arsenite Resistance in Leishmania‐Tarentolae Is Mediated by an
ActiveExtrusionSystem.
MolecularandBiochemicalParasitology,v.67,p.49‐57,1994.
DIZDAROGLU,M;JARUGA,P;BIRINCIOGLU,M;RODRIGUEZ,H.Freeradical‐induceddamageto
DNA:mechanismsandmeasurement.FreeRadicalBiologyandMedicine,v.32,p.1102‐1115,
2002.
DONDERO,F;PIACENTINI,L;BANNI,M;REBELO,M;BURLANDO,B;VIARENGO,A.Quantitative
PCR
analysis of two molluscan metallothionein genes unveils differential expression and
regulation.Gene,v.345,p.259‐270,2005.
DOYOTTE, A; COSSU, C; JACQUIN, MC; BABUT, M; VASSEUR, P. Antioxidant enzymes,
glutathioneandlipidperoxidationasrelevantbiomarkersofexperimentalorfieldexposurein
the gills and the digestive gland of the freshwater
bivalve Unio tumidus. Aquatic Toxicology,
v.39,p.93‐110,1997.
DRAPER, HH; HADLEY, M. Malondialdehyde determination as index of lipid peroxidation.
MethodsinEnzymology,v.186,p.421‐431,1990.
DROGE, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological Reviews,
v.82,p.47‐95,2002.
EL‐BAYOUMY,K.
Theprotectiveroleofseleniumongeneticdamageandoncancer.Mutation
Research‐FundamentalandMolecularMechanismsofMutagenesis,v.475,p.123‐139,2001.
66
ELLMAN,GL.Tissuesulfhydrylgroups.ArchiveofBiochemistryandBiophysic s,v.82,p.70‐77,
1959.
FERNANDEZ‐CHECA,JC; KAPLOWITZ,N.Hepaticmitochondrial glutathione: transportandrole
indiseaseandtoxicity.ToxicologyandAppliedPharmacology,v.204,p.263‐273,2005.
FLOHE, L; HARRIS, JR. Peroxiredoxin systems: structure and functions. 1.
ed.New York:
Springer,2007.407p.
FRANCO, JL; POSSER, T; BROCARDO, PS; TREVISAN, R; ULIANO‐SILVA, M; GABILAN, NH;
SANTOS,ARS;LEAL,RB; RODRIGUES,ALS;FARINA,M;DAFRE, AL.Involvementofglutathione,
ERK1/2phosphorylation andBDNF expression intheantidepressant‐like effect ofzincin rats.
BehaviouralBrainResearch,v.188,p.
316‐323,2008a.
FRANCO, JL; POSSER, T; MATTOS, JJ; SANCHEZ‐CHARDI, A; TREVISAN, R; OLIVEIRA, CS;
CARVALHO, PSM; LEAL, RB; MARQUES, MRF; BAINY, ACD; DAFRE, AL. Biochemical alterations
in juvenile carp (Cyprinus carpio) exposed to zin c: Glutathione reductase as a target. Marine
EnvironmentalResearch,v.66,p.88‐89,2008b.
FRANCO,
JL;TREVISAN,R;POSSER,T;TRIVELLA,DB;HOPPE,R;MARTINSROSA,J;FERNANDES
DINSLAKEN,D;DECKER,H;INESTASCA,C;BAINYLEAL,R;FREIREMARQUES,MR;DIASBAINY,
AC; LUIZ DAFRE, A. Biochemical alterations in caged Nile tilapia Oreochromis niloticus.
EcotoxicoloyandEnvironmentalSaf,v.73,p.864‐872,2010.
FRANCO, JL;
TRIVELLA, DBB; TREVISAN, R; DINSLAKEN, DF; MARQUES, MRF; BAINY, ACD;
DAFRE,AL.AntioxidantstatusandstressproteinsinthegillsofthebrownmusselPernaperna
exposedtozinc.Chemico‐BiologicalInteractions,v.160,p.232‐240,2006.
FREDERICKSON,CJ;SUH,SW;SILVA,D;FREDERICKSON,CJ;THOMPSON,RB.Importanceofzinc
in the central nervous system: The zinc‐containing neuron. Journal of Nutrition, v.130, p.
1471s‐1483s,2000.
FREITAS,M;PORTO,G;LIMA,JLFC; FERNANDES,E.Zincactivatesneutrophils'oxidativeburst.
Biometals,v.23,p.31‐41,2010.
FRIDOVICH,I.Superoxideradicalandsuperoxidedis mutases.AnnualReviewsofBiochemistry,
v.64,p.97‐112,
1995.
GABBIANELLI, R; LUPIDI, G; VILLARINI, M; FALCIONI, G. DNA damage induced by copper on
erythrocytes of gilthead sea bream Sparus aurata and mollusk Scap harca inaequivalvis.
ArchivesofEnvironmentalContaminationandToxicology,v.45,p.350‐356,2003.
GAY, CA; GEBICKI, JM. Perchloric acid enhances sensitivity and reproducibility of the ferric‐
xylenolorangeperoxideassay.AnaliticalBiochemistry,v.304,p.42‐46,2002.
GERET,F;BEBIANNO,MJ.DoeszincproducereactiveoxygenspeciesinRuditapesdecussatus?
EcotoxicologyandEnvironmentalSafety,v.57,p.399‐409,2004.
GLOCK, GE; MC, LP. Further studies on the properties and assay of glucose 6‐phosphate
dehydrogenase and 6
‐phosphogluconate dehydrogenase of rat liver. Biochemistry Journal,
v.55,p.400‐408,1953.
HABIG,WH;JAKOBY,WB.Assaysfor differentiationofglutathioneS‐transferases.Methodsin
Enzymology,v.77,p.398‐405,1981.
67
HALLIWELL, B; GUTTERIDGE, J. Free Radical in Biology and Medicine. 4. ed.Oxford: Oxford
UniversityPress,2007.704p.
HAMILTON, SJ. Review of selenium toxicity in the aquatic food chain. Science of the Total
Environment,v.326,p.1‐31,2004.
HANSEN, BH; RO MMA, S; GARMO, OA; OLSVIK, PA; ANDERSEN, RA.
Antioxidative stress
proteins and their gene expression in brown trout (Salmo trutta) from three rivers with
different heavy metal levels. Comparative Biochemistry and Physiology C‐Toxicology &
Pharmacology,v.143,p.263‐274,2006.
HARDY, RW; ORAM, LL; MOLLER, G. Effects of Dietary Selenomethionine on Cutthroat Trout
(Oncorhynchus clarki bouvieri) Growth and
Reproductive Performance Over a Life Cycle.
ArchivesofEnvironmentalContaminationandToxicology,v.58,p.237‐245,2010.
HOFFMANN, PR; HOGE, SC; LI, PA; HOFFMANN, FW; HASHIMOTO, AC; BERRY, MJ. The
selenoproteome exhibits widely varying, tissue‐specific dependence on selenoprotein P for
seleniumsupply.NucleicAcidsResearch,v.35,p.3963‐3973,
2007.
IMLAY, JA. Cellular defenses against s uperoxide and hydrogen peroxide. Annual Review of
Biochemistry,v.77,p.755‐776,2008.
ITOH,K;WAKABAYASHI,N;KATOH,Y;ISHII,T;IGARASHI,K;ENGEL,JD;YAMAMOTO,M.Keap1
repressesnuclearactivationofantioxidantresponsiveelementsbyNrf2throughbindingtothe
amino‐terminalNeh2domain.
Genes&Development,v.13,p.76‐86,1999.
KENSLER,TW;WAKABAYASHI,N;BISWAL,S.Cellsurvivalresponsestoenvironmentalstresses
via the Keap1‐Nrf2‐ARE pathway. Annual Reviews of Pharmacology and Toxicology, v.47, p.
89‐116,2007.
KIM, YH; KIM, EY; GWAG, BJ; SOHN, S; KOH, JY. Zinc‐induced cortical
neuronal death with
featuresofapoptosisandnecrosis,mediationbyfreeradicals.Neuroscience,v.89,p.175‐182,
1999.
KIM,YS;KIM,SM;HAN,S.NitricOxideConvertsCatalaseCompoundsIIandIIItoFerricatalase.
BulletingoftheKoreanChemicalSociety,v.23,p.1664‐1666,2002.
KUCHAN, MJ; FICO SANTORO, M; MILNER,
JA. Consequences of selenite supplementation on
the growth and metabolism of cultures of canine mammary cells. Journal of Nutritional
Biochemistry,v.1,p.478‐483,1990.
KUMARAVEL, TS; JHA, AN. Reliable Comet assay measurements for detecting DNA damage
inducedbyionisingradia tionandche micals.MutationResearch,v.605,p.7‐16,2006.
LAWRENCE, RA; BURK, RF. Glutathione peroxidase activity in selenium‐deficient rat liver.
BiochemicalandBiophysicalResearchCommunication,v.71,p.952‐958,1976.
LETELIER, ME; LEPE, AM; FAUNDEZ, M; SALAZAR, J; MARIN, R; ARAC ENA, P; SPEISKY, H.
Possible mechanisms underlying copper‐induced damage in biological membranes leading to
cellulartoxicity.Chemico‐Biological
Interactions,v.151,p.71‐82,2005.
LOW, FM; HAMPTON, MB; WINTERBOURN, CC. Peroxiredoxin 2 and peroxi de metabolism in
theerythrocyte.AntioxidandandRedoxSignalling,v.10,p.1621‐1630,2008.
68
MACHELLA, N; REGOLI, F; CAMBRIA, A; SANTELLA, RM. Application of an immunoperoxidase
staining method for detection of 7,8‐dihydro‐8‐oxodeoxyguanosine as a biomarker of
chemical‐induced oxidative stress in marine organisms. Aquatic Toxicology, v.67, p. 23‐32,
2004.
MACKENZIE, GG; KEEN, CL; OTEIZA, PI. Reductions in the expression
of NF‐kappa B‐driven
genescontributetozincdeficientneuronalpathologies. FasebJournal,v.19,p.A1498‐A1498,
2005.
MEISTER,A.EnzymologyofAmino‐AcidTransport.Science,v.180,p.33‐39,1973.
NORDBERG, J; ARNER, ES. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian
thioredoxinsystem.FreeRadicalBiologyandMedicine,v.31,
p.1287‐1312,2001.
OKAMOTO, OK; PINTO, E; LATORRE, LR; BECHARA, EJH; COLEPICOLO, P. Antioxidant
modulation in response to metal‐induced oxidative stress in algal chloroplasts. Archives of
EnvironmentalContaminationandToxicology,v.40,p.18‐24,2001.
OWENS, CWI; BELCHER, RV. A Colorimetric Micro‐Method for Determination of Glutathione.
Biochemical
Journal,v.94,p.705‐711,1965.
PANEE, J; ST OYTCHEVA, ZR; LIU, W; BERRY, MJ. Selenoprotein H is a redox‐sensing high
mobility group family DNA‐binding protein that up‐regulates genes involved in glutathione
synthesisand phaseII detoxification. Journal ofBiological Chem istry, v.282, p.23759‐23765,
2007.
PAVLICA,S;GAUNITZ,
F;GEBHARDT,R.Comparativeinvitrotoxicityofsevenzinc‐saltstowards
neuronalPC12cells.ToxicologyinVitro,v.23,p.653‐659,2009.
RADWAN,MA; EL‐GENDY, KS; GAD, AF. Oxidative Stress Biomarkers in the Digestive Gland of
Theba pisana Exposed to Heavy Metals. Archives of Environmental Contamination and
Toxicology,
v.58,p.828‐835,2010.
RAMAKRISHNAN, S; RAJESH, M; SULOCHANA, KN. Eales' disease: oxidant stress and weak
antioxidantdefence.IndianJournalofOphthalmology,v.55,p.95‐102,2007.
RAYMAN,MP.Theimportanceofseleniumtohumanhealth.Lancet,v.356,p.233‐41,2000.
REGOLI,F; GORBI, S;FRENZILLI, G;NIGRO,M;
CORSI,I;FOCARDI,S;WINSTON,GW. Oxidative
stress in ecotoxicology: from the analysis of individual antioxidants to a more integrated
approach.MarineEnvironmentalResearch,v.54,p.419‐423,2002.
REGOLI, F; PRINCIPATO, G. Glutathione, Glutathione‐Dependent and Antioxidant Enzymes in
Mussel, Mytilus‐Galloprovincialis, Exposed to Metals under Field and Laboratory
Conditions‐
Implications for the Use of Biochemical Biomarkers. Aquatic Toxicology, v.31, p. 143‐164,
1995.
REID, TJ3RD; MURTHY, MR; SICIGNANO, A; TANAKA, N; MUSICK, WD; ROSSMANN, MG.
Structureandhemeenvironmentofbeef livercatalaseat2.5Aresolution.Proccedingsofthe
NationalAcademyofScienceoftheUnitedStatesof
America,v.78,p.4767‐4771,1981.
REISCHL, E; DAFRE, AL; FRANCO, JL; WILHELM FILHO, D. Distribution, adaptation and
physiologicalmeaning of thiolsfromvertebratehemoglobins. Comparative Biochemistryand
PhysiologyC‐Toxicology&Pharmacology,v.146,p.22‐53,2007.
69
REN, XJ; GAO,SJ; YOU, DL; HUANG, HL; LIU, Z; MU, Y; LIU, JQ;ZHANG, Y; YAN, GL; LUO, GM;
YANG,TS; SHEN, JC. Cloning and expression ofasingle‐chain catalytic antibody that acts as a
glutathioneperoxidasemimicwithhighcatalyticefficiency.BiochemicalJournal,v.359,p.369‐
374,2001.
RUDOLF, E; CERVINKA, M. Zinc pyri thione induces cellular stress signaling and apoptosis in
Hep‐2 cervical tumor cells: the role of mitochondria and lysosomes. Biometals, v.23, p. 339‐
354,2010.
SANCHEZ‐MARTIN,FJ;VALERA,E;CASIMIRO,I;MERINO,JM.Nervegrowthfactorincreasesthe
sensitivity to zinc toxicity and
induces cell cycle arrest in PC12 cells. Brain Research Bulletin,
v.81,p.458‐466,2010.
SHARPLEY, MS; HIRST, J. The inhibition of mitochondrial complex I (NADH : ubiquinone
oxidoreductase)byZn2+.JournalofBiologicalChemistry,v.281,p.34803‐34809,2006.
SHELINE,CT;BEHRENS, MM;CHOI,DW.Zinc‐induced corticalneuronal
death:Contributionof
energy failure attributable to loss of NAD(+) and inhibition of glycolysis. Journal of
Neurosciences,v.20,p.3139‐3146,2000.
SHI, DL; WANG, WX. Modification of trace metal accumulation in the green mussel Perna
viridisbyexposuretoAg,Cu,andZn.EnvironmentalPollutionv.132,p.265‐277,2004.
SIES,H.Glutathioneanditsroleincellularfunctions.FreeRadicalsBiologyandMedicine,v.27,
p.916‐921,1999.
SIES,H; MOSS,KM.RoleofMitochondrialGlutathionePeroxidaseinModulatingMitochondrial
OxidationsinLiver.EuropeanJournalofBiochemistry,v.84,p.377‐383,1978.
SLEKAR,KH;KOSMAN,DJ;CULOTTA, VC.Theyeast
copperzincsuperoxidedismutaseandthe
pentose phosphate pathway play overlapping roles in oxidative stress protection. Journal of
BiologicalChemistry,v.271,p.28831‐28836,1996.
STADTMAN, ER; LEVINE, RL. Free radical‐mediated oxidation of free amino acids and amino
acidresiduesinproteins.AminoAcids,v.25,p.207‐218,2003.
STEINBRENNER, H; SIES, H. Protection against reactive oxygen species by selenoproteins.
BiochimBiophysActa,v.1790,p.1478‐1485,2009.
TATEISHI, N; HIGASHI, T; NARUSE, A; NAKASHIMA, K; SHIOZAKI, H; SAKAMOTO, Y. Rat‐Liver
Glutathione‐Possible Role as a Reservoir of Cysteine. Journal of Nutrition, v.107, p. 51‐60,
1977.
TRAN, D;
MOODY, AJ; FISHER, AS; FOULKES, ME; JHA, AN. Protective effects of selenium on
mercury‐induced DNA damage in mussel haemocytes. Aquatic Toxicology, v.84, p. 11‐18,
2007.
VIARENGO, A; NOTT, JA. Mechanisms of heavy metal cation homeostasis in marine
invertebrates.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartC:ComparativePharmacology,
v.104,p.
355‐372,1993.
WALTHER, UI; WALTHER, SC; MUCKTER, H; FICHTL, B. Enhancing glutathione synthesis can
decreasezinc‐mediatedtoxicity.BiologicalTraceElementResearch,v.122,p.216‐228,2008.
70
WANG, HW; XU, HM; XIAO, GH; ZHAO, CL; WANG, ZH; CAI, DB; LI, HQ; ZHAO, JH. Effects of
Selenium on the Antioxidant Enzymes Response of Neocaridina heteropoda Exposed to
Ambient Nitrite. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, v.84, p. 112‐117,
2010.
WENDEL,A.Glutathioneperoxidase.MethodsinEnzymol,
v.77,p.325‐333,1981.
WHITFIELD, JB. Gamma glutamyl transferase. Critical Reviews in Clinical Laboratory Science,
v.38,p.263‐355,2001.
WINTERBOURN,CC;STERN,A. Humanredcellsscavenge extracellularhydrogenperoxide and
inhibitformationofhypochlorousacidandhydroxylradical.JournalofClinicalInvestigations,
v.80,p.1486‐1491,1987.
WISEMAN,
DA; SHARMA, S; BLACK, SM. Elevated zinc induces endothelial apoptosis via
disruptionofglutathione metabolism:role oftheADPtranslocator. Biometals,v.23,p.19‐30,
2010.
WOJEWODA, M; DUSZYNSKI, J; SZCZEPANOWSKA, J. Antioxidant defence systems and
generation of reactive oxygen spe cies in osteosarcoma cells with defective mitochondria:
Effect of selenium.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA)‐Bioenergetics, v.1797, p.890‐896,
2010.
WONG,CKC;CHEUNG,RYH;WONG,MH.Heavymetalconcentrationsingreen‐lippedmussels
collected from Tolo Harbour and markets in Hong Kong and Shenzhen. Environmental
Pollution,v.109,p.165‐171,2000.
WOOD,ZA;POOLE,LB;KARPLUS, PA.Peroxiredoxin evolutionand the
regulation ofhydrogen
peroxidesignaling.Science,v.300,p.650‐653,2003.
YU,BP.Cellulardefensesagainstdamagefromreactiveoxygenspecies.PhysiologicalReviews,
v.74,p.139‐162,1994.
ZHANG, JS; WANG, HL; PENG, DG; TAYLOR, EW. Further insight into the impact of sodium
selenite on selenoenzymes: High‐dose selenite enhances
hepatic thioredo xin reductase 1
activityasaconsequenceofliverinjury.ToxicologyLetters,v.176,p.223‐229,2008.
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