ads:
SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Ronilson Freitas de Souza
Parâmetros físico-químicos, bioquímicos e microbiológicos
como descritores de qualidade e discriminação dos méis do
Estado do Pará
BELÉM
2010
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Ronilson Freitas de Souza
Parâmetros físico-químicos, bioquímicos e microbiológicos
como descritores de qualidade e discriminação dos méis do
Estado do Pará
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Química
da Universidade Federal do Pará, como
parte do requisito para obtenção do grau
de Mestre em Química.
Orientador:
Prof. Dr. Alberdan Silva Santos
BELÉM
2010
ads:
Souza, Ronilson Freitas
Parâmetros físico-químicos, bioquímicos e microbiológicos como descritores
de qualidade e discriminação dos méis do Estado do Pará / (Ronilson Freitas de
Souza); Orientador, Alberdan Silva santos - 2010)
121 f. Il. 28 cm
Dissertação (Mestrado)-Universidade Federal do Pará. Instituto de Ciências
Exatas e Naturais. Programa de Pós-Graduação em química, Belém, 2010.
1. Mel. 2. Metais
. 3. Voláteis. 4. Estatística Multivariada. 5. Leveduras.
I. Santos, Alberdan Silva, orient. II. Universidade Federal do Pará,
Instituto de Ciências Exatas Naturais, Programa de Pós-Graduação em
Química. III. Título
CDD 22. D. 641.3
SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Ronilson Freitas de Souza
Parâmetros físico-químicos, bioquímicos e microbiológicos
como descritores de qualidade e discriminação dos méis do
Estado do Pará
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Alberdan Silva Santos -UFPA
(Orientador)
Prof. Dr. Heronides Adonias Dantas Filho– UFPA
(Membro)
Prof. Dr. Francisco Plácido Magalhães Oliveira – UFPA
(Membro)
BELÉM
2010
Aos meus familiares com os quais
compartilhei momentos de alegria e de ansiedade. Em
especial a minha mãe Maria Freitas de Souza e o meu pai
Rogério Batista de Souza, por todo apoio, lição de vida e
ensinamentos, e de forma muito especial, pelo o amor,
carinho, dedicação, incentivo, confiança e seus exemplos de
fé, perseverança, otimismo, responsabilidade e honestidade.
A minha namorada, Aline Klayse, pelo
amor, compreensão, dedicação, afeição, compromisso,
incentivo, enfim, pelos esforços realizados para garantir-me
esta conquista e por estar sempre ao meu lado, me
apoiando e ajudando a superar os obstáculos em todos os
momentos da vida. Amor, você é parte integrante desta
conquista e do meu sucesso.
Dedico
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pela companhia, perseverança, vida com saúde, felicidade e
conquistas;
A Universidade Federal do Pará, Programa de pós-graduação em Química e ao
Laboratório de Investigação Sistemática em Biotecnologia e Química Fina, pelo
espaço concedido para realização deste trabalho;
Ao meu orientador Prof. Dr. Alberdan Silva Santos, pela orientação, colaboração,
sabedoria, compreensão, amizade, dedicação, confiança, carinho, incentivo e
responsabilidade com a minha formação acadêmica e pessoal;
Ao Laboratório de Polimorfismo de DNA (ICB/UFPA), em especial a Cinthia Helena
Bandeira e ao Prof. Dr. Artur Silva pela colaboração na identificação das colônias de
leveduras;
A Prof
a
. Drª. Eloisa Helena de Aguiar Andrade da Faculdade de Química
(ICEN/UFPA) pela colaboração na identificação dos componentes voláteis do mel de
abelha e pelas correções e sugestões durante qualificação deste trabalho;
Ao Setor de Meio Ambiente, do Instituto Evandro Chagas-PA, em especial aos
Bolsistas Kelson Freitas, Marcos e Luana e ao Pesquisador Marcelo de Oliveira
Lima pelo auxílio prestado na análise mineral no mel;
A Prof
a
. Drª. Kelly das Graças Fernandes da Faculdade de Química (ICEN/UFPA)
pelas correções e sugestões durante exame de qualificação deste trabalho;
Aos colegas de grupo pelas opiniões e discussões que muito contribuíram com
sucesso deste trabalho: Antonio, João, Joane, Zé Luiz, Mariana, Silvana, Nelson Rosa,
Camila, Vanessa, Robson, Fábio, Josilene, Debora, Roberta, Ricardo, Raniomar e
Klayton;
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudo;
E a todos que direta e indiretamente ajudaram na realização deste trabalho.
“A arte é uma flor nascida no
caminho da nossa vida,
e que se desenvolve para
suavizá-la”
Arthur Schopenhauer
RESUMO: Este trabalho avalia a composição físico-química, bioquímica, mineral,
volátil e microbiológica dos méis de abelhas produzidos em diferentes municípios do
Estado do Pará. A maioria dos parâmetros físico-químicos e bioquímicos determinados
nas amostras de mel apresentaram valores dentro dos padrões do Regulamento
Técnico de Identidade e Qualidade do Mel. O conteúdo mineral nas amostras de méis
foi determinado por Espectrometria de Emissão Óptica com Plasma acoplado
Indutivamente (ICP OES). Os valores médios obtidos foram (mg/kg): Al (1,5 ± 0,28), Ba
(1,18 ± 0,01), Cr (0,40 ± 0,02), Cu (2,6 ± 0,44), Fe (2,33 ± 0,3), Mn (3,52 ± 0,21), Ni
(4,47 ± 0,15), Ti (0,48 ± 0,04), Pb (0,88 ± 0,20), K (346,80 ± 20,0), Ca (34,55 ± 1,0), Mg
(13,47 ± 1,65), Na (53,55 ± 1,5), Co (2,10 ± 0,23), Sr (0,42 ± 0,06), Zn (2,4 ± 0,16). Os
elementos Al, Ca, Fe, K, Mg, Na, Sr, Ti e Zn foram encontrados em todas as amostras.
Entretanto, o potássio foi o elemento quantitativamente mais importante, enquanto Ba,
Cr, Pb e Sr foram detectados em quantidades traços. Através da análise multivariada
(ACP e AHA) dos resultados dos parâmetros físico-químicos e bioquímicos, verificou a
discriminação das amostras em mesorregiões, Sudoeste e Nordeste paraense. E dos
resultados dos teores minerais, verificou a discriminação das amostras do município de
Moju. Na investigação da composição do aroma de mel paraense, foram detectadas
cerca de 66 substâncias diferentes, dessas 26 não foram identificadas, e 13
constituintes são comuns em todas as amostras de mel. Ressalta-se a técnica utilizada
neste trabalho, pois extraiu os componentes representativos do aroma, obtendo-se
substâncias nos mesmos concentrados relativos ao bouquet do aroma do mel. A flora
microbiana dos méis permitiu isolar e identificar 21 colônias de leveduras, 15 Candida
spp, 5 Candida parapsilosis (99% de máxima identidade), e uma Rhodotorula
mucilaginosa (98%). A presença destas leveduras deve está associada principalmente
à contaminação nos méis, durante a manipulação e/ou processamento, e podem
apresentar alterações na composição do mel. Através dos resultados experimentais
obtidos conclui-se que os méis produzidos no Estado do Pará apresentam um bom
nível de qualidade, tendo tratamento adequado, boa maturidade e frescura.
Palavras chaves: composição do mel, metais em mel, mel do Estado do Pará, voláteis
do mel, Leveduras do mel.
ABSTRACT: This paper describes the physicochemical, biochemical, mineral, volatile
and microbiological composition of honey bee produced in different districts of the State
of Pará. Most parameters physicochemical and biochemical determined in honey
samples showed values within the standards of the Technical Regulation of Honey
Quality and Identity. The mineral contents in honey samples were analyzed by
inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP OES). Mean values
obtained were (mg/Kg): Al (1.5 ± 0.28), Ba (1.18 ± 0.01), Cr (0.40 ± 0.02), Cu (2.6 ±
0.44), Fe (2.33 ± 0.3), Mn (3.52 ± 0.21), Ni (4.47 ± 0.15), Ti (0.48 ± 0.04), Pb (0.88 ±
0.20), K (346.80 ± 20.0), Ca (34.55 ± 1.0), Mg (13.47 ± 1.65), Na (53.55 ± 1.5), Co (2.10
± 0.23), Sr (0.42 ± 0.06), Zn (2.4 ± 0.16).The mineral contents Al, Ca, Fe, K, Mg, Na,
Sr, Ti and Zn were detected in all samples, but then the potassium was quantitatively
the most important mineral, while minerals Ba, Cr, Pb and Sr were detected in low
amounts. Multivariate analysis (PCA and HCA), of results of physicochemical and
biochemical and chemical parameters, it was found that the majority of honey samples
were grouped into two distinct groups and two samples were distinctly separated from
the formed groups and from each other. And the results of mineral content, assessed
the discrimination of samples from the region of Moju. In investigating the composition
of the aroma of honey in State Pará, were detected in total 66 different substances, 26
of these were not identified, and 13 are common components in all samples of honey.
Emphasizes the technique used in this work, for retrieving the representative of the
flavor components, resulting in substance the same concentrated on the bouquet aroma
of honey. The microbial flora of the honey allowed us to isolate and identify 21 yeast
colonies, 15 Candida spp, 5 Candida parapsilosis (99% maximum identity), and
Rhodotorula mucilaginosa (98%). The presence of these yeasts are associated mainly
with the honey contamination during handling and/or processing, and may make
changes in the composition of honey. From the experimental results obtained it is
concluded that honey produced in State of Pará, Brazil present a good quality level, with
proper treatment, good maturity and freshness.
Key words: composition of honey, metals in honey, honey of the State of Pará, volatile
of honey, yeast in honey.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Mapa de localização dos municípios de procedência das amostras de
mel de abelhas........................................................................................
23
Figura 2
Curva analítica para quantificação de proteínas pelo reagente de
Bradford. .................................................................................................
34
Figura 3
Curva padrão de glicose para quantificação de açúcares redutores.......
35
Figura 4
Curva padrão de quantificação de frutose...............................................
37
Figura 5
Colônias de leveduras após 72 horas de crescimento a 30 ºC...............
45
Figura 6
Gráfico dos scores (10 amostras de mel de abelha de diferentes
municípios do Estado do Pará)................................................................
58
Figura 7
Gráfico dos Loading (10 parâmetros químicos e bioquímicos)...............
59
Figura 8
Dendograma das 10 amostras de diferentes municípios do Estado do
Pará........................................................................................................
60
Figura 9
Gráfico dos scores (10 amostras de mel do Estado do Pará).................
65
Figura 10
Gráfico dos Loading (16 elementos químicos)........................................
66
Figura 11
Dendograma utilizando as distância euclidiana das 10 amostras de
méis e os 16 elementos químicos (minerais)..........................................
67
Figura 12
Perfil cromatográfico do solvente utilizado na extração dos aromas das
amostras de méis....................................................................................
68
Figura 13
Perfil cromatográfico das substâncias voláteis presentes nas amostras
de méis da região de Moju (A-amostra M1, B-
amostra M2 e
C-amostra M3).........................................................................................
70
Figura 14
Perfil cromatográfico das substâncias voláteis presentes nas amostras
de méis da região de São Miguel do Guamá (A: amostra M4, B:
amostra M5 e C: amostra M6)................................................................
73
Figura 15
Perfil cromatográfico das substâncias voláteis presentes na amostra
de mel da região de Irituia (M7)...............................................................
76
Figura 16
Perfil cromatográfico das substâncias voláteis presentes na amostra
de mel da região de Ourém (M8)............................................................
78
Figura 17
Perfil cromatográfico das substâncias voláteis presentes nas amostras
de méis da região de Altamira (A: amostra M9, mel de Apis mellífera;
B: amostra M10, mel de Melipona rufiventris).........................................
80
Figura 18
Foto (frente e verso) de 2 colônias de fungos filamentosos isoladas do
mel de abelhas........................................................................................
86
Figura 19
Foto de 4 colônias de leveduras isoladas do mel de abelhas.................
87
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Valores de absorbância e intervalos de tempo para leitura, conforme
Bogdanov (2002).....................................................................................
29
Tabela 2
Classificação do mel conforme a coloração............................................
31
Tabela 3
Condições de operação para digestão em forno de microondas
fechado...................................................................................................
39
Tabela 4
As especificações e as condições gerais de operação do ICP OES......
41
Tabela 5
Parâmetros químicos e bioquímicos (
a
média ±
b
desvio padrão) das 10
amostras de méis produzidos no Estado do Pará..................................
49
Tabela 6
Estimação da variância (autovalores) e porcentagem proporcional e
cumulativa da variância total (%) obtidos por componentes principais,
considerando as 10 amostras de mel do Pará, no Brasil e os 10
parâmetros avaliados..............................................................................
57
Tabela 7
Valores médios (mg/Kg ± desvio padrão da média) dos elementos
químicos das 10 amostras de méis de diferentes municípios do
Estado do Pará.......................................................................................
61
Tabela 8
Médias dos valores, mínimos e máximos, valores estabelecidos pela
legislação brasileira, para os 16 elementos químicos estudados para
as amostras de méis das microrregiões do Estado do Pará...................
63
Tabela 9
Estimação da variância (autovalores) e porcentagem proporcional e
cumulativa da variância total (%) obtidos por componentes principais,
considerando as 10 amostras de mel do Pará, no Brasil e 16
elementos químicos (minerais)...............................................................
64
Tabela 10
Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de Moju (M1, M2 e M3)...........................................................
71
Tabela 11
Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de São Miguel do Guamá (M4, M5 e M6)...............................
74
Tabela 12
Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de Irítuia (M7).........................................................................
75
Tabela 13
Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de Ourém (M8).......................................................................
77
Tabela 14
Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de Altamira (M9-Apis).............................................................
81
Tabela 15
Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de Altamira (M10-Melipona)...................................................
82
Tabela 16 Vinte e seis substâncias marcadoras de diferenciação identificadas
em amostras de méis de abelha dos municípios de Moju, São Miguel
do Guamá, Irituia, Ourém e Altamira......................................................
84
Tabela 17 Identificação das leveduras isoladas do mel correspondente ao
GenKBank após análise comparativa. Sequenciamento da região do
DNA ribossomal......................................................................................
88
LISTA DE QUADROS
Quadro 1
Especificações das amostras de mel estudadas neste trabalho...........
24
Quadro 2
Limite de detecção no ICP OES dos elementos Al, Ba, Ca, Co, Cr,
Cu, Fe, K, Mg, Mn, Ni, Na, Pb, Sr, Ti e Zn............................................
41
Quadro 3
Valores médios (UFC/g de mel) de fungos filamentosos e leveduras
de méis de abelha de diferentes municipios do Estado do Pará...........
86
LISTA DE SIGLAS
AHA Análise Hierárquica de Agrupamento
ACP Análise por Componentes Principais
ADNS Ácido 3,5 - dinitrossalicílico
CG/EM Cromatografia gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
CP Componente principal
DN Número de diástase
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
HMF Hidroximetilfurfural
HOAc Ácido Acético
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
ICP OES
do inglês Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry
(Espectrometria de Emissão Óptica com Plasma acoplado
Indutivamente)
LOD do inglês Limit of Detection (Limite de detecção)
LOQ do inglês Limit of Quantification (Limite de quantificação)
RPM Rotações por minuto
PCR Reação em Cadeia de Polimerase
pH Potencial Hidrogeniônico
SI Sólidos Insolúveis
UFC Unidades formadoras de colônias
UV-VIS Ultra-Violeta Visível
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 1
2. OBJETIVO GERAL........................................................................................ 4
2.1. Objetivos Específicos.................................................................................. 4
3. REVISÃO DA LITERATURA......................................................................... 5
3.1. Composição do mel de abelhas.................................................................. 5
3.1.1. Açúcares no mel de abelhas.........................................................................
6
3.1.2. Umidade......................................................................................................... 8
3.1.3. Hidroximetilfurfural (HMF) ........................................................................... 9
3.1.4. Atividade diastásica...................................................................................... 10
3.1.5. pH................................................................................................................... 11
3.1.6. Acidicidade......................................................................................................
11
3.1.7. Composição mineral do mel de abelhas......................................................
12
3.1.8.
Composição volátil do mel de abelh
as
........................................................
14
3.2.
Microorganismos presentes no mel
.............................................................
16
3.3. Estatística Multivariada................................................................................. 17
3.3.1. Matriz de dados.............................................................................................. 17
3.3.2. Padronização e escalamento........................................................................ 18
2.3.3. Medidas de similaridade e dissimilaridade................................................. 19
3.3.4. Análise de componentes principais (ACP)..................................................
19
3.3.5. Análise Hierárquica de Agrupamentos (AHA)........................................... 21
4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 23
4.1. Procedência das amostras de méis analisadas........................................ 23
4.2. Local de realização das análises................................................................. 24
4.3. Análises Físico-químicas e Bioquímicas....................................................
25
4.3.1. Cinzas............................................................................................................. 25
4.3.2. Hidroximetilfurfural (HMF) ............................................................................
26
4.3.3. Atividade diastásica...................................................................................... 27
4.3.4. Umidade.......................................................................................................... 29
4.3.5. Cor................................................................................................................... 31
4.3.6. Potencial hidrogeniônico (pH) ......................................................................
31
4.3.7. Acidicidade......................................................................................................
32
4.3.8.
Sólidos Insolúveis
..........................................................................................
32
4.3.9. Proteína.......................................................................................................... 33
4.3.10. Açucares redutores, açúcar total e sacarose..............................................
34
4.3.11. Frutose e Glicose........................................................................................... 36
4.4.
Determinaç
ão de minerais por Espectrometria de Emissão Óptica com
Plasma acoplado Indutivamente (ICP OES)................................................
38
4.4.1.
Principio da Técnica
......................................................................................
38
4.4.2. Preparo das amostras: digestão assistida por microondas......................
39
4.4.3. Quantificação dos elementos minerais....................................................... 40
4.5.
Análise dos compostos voláteis do mel de abelha
por Cromatografia
Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG/EM)...........................
42
4.5.1. Isolamento dos compostos voláteis.............................................................
42
4.5.2. Análise dos voláteis por CG/EM....................................................................
42
4.5.3. Identificação dos constituintes voláteis do mel......................................... 43
4.6. Investigação da flora microbiana do mel.................................................... 43
4.6.1. Contagem de bolores e leveduras................................................................
43
4.6.2 Isolamento e preservação das colônias de leveduras............................... 44
4.6.3. Identificação das colônias de leveduras por técnica de biologia
molecular........................................................................................................
45
4.6.3.1.
Extração do DNA............................................................................................
45
4.6.3.2.
Visualização em gel de Agarose 1%............................................................ 46
4.6.3.3.
Reação em Cadeia de Polimerase – PCR.................................................... 47
4.7. Análise Estatística......................................................................................... 47
5.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
......................................................................
48
5.1. Caracterização físico-química e bioquímica................................................
48
5.1.1. Umidade......................................................................................................... 50
5.1.2. Hidroximetilfurfural (HMF) ............................................................................
50
5.1.3. Cor.................................................................................................................. 51
5.1.4. Cinzas e sólidos insolúveis em água...........................................................
51
5.1.5. Acidicidade e pH.............................................................................................
52
5.1.6. Proteínas e Atividade diastásica...................................................................
53
5.1.7. Açúcares redutores totais, açúcares redutores e sacarose...................... 54
5.1.8. Frutose e Glicose........................................................................................... 55
5.1.9.
Análise multivariada
utilizando os parâmetros químicos e bioquímicos
como variáveis................................................................................................
56
5.2. Teores de minerais no mel de abelhas.........................................................
60
5.2.1. Análise Multivariada (ACP e AAH) ...............................................................
64
5.3. Constituintes químicos do aroma do mel de abelhas................................ 67
5.4. Investigação da flora microbiana do mel de abelhas................................. 85
6. CONCLUSÕES...............................................................................................
90
7. REFERÊNCIAIS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................
92
ANEXO........................................................................................................... 104
1
1. INTRODUÇÃO
Diversos tipos de méis são produzidos no Brasil, onde a criação de abelhas é
uma prática tradicional herdada de diversas origens e bem implantada em diversos
estados e regiões. Oficialmente, considera-se que a apicultura iniciou no Brasil no
segundo reinado com o decreto nº 72 de 12/06/1839. Esta lei promulgada no reinado
de D. Pedro II autorizava o padre Antonio Pinto Carneiro a importar da Europa e da
África os primeiros enxames de abelhas, os quais foram disseminados em diversos
Estados, ressaltando-se Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul e se estendendo
para os demais estados brasileiros ao longo das décadas. Um destes Estados foi o
Pará, que está localizado na região Norte do Brasil e é o segundo maior do país em
extenção territorial, além de estar situado no coração da floresta amazônica, sendo
uma das mais promissoras regiões para a produção de diferentes tipos de méis no
país, incluindo os méis de abelhas indígenas, as quais apresentam forte adaptação
nesta região em virtude das condições climáticas, posição geográfica, diferentes solos
e diversidade vegetal.
Comprovadamente o mel é uma mistura de substâncias naturais orgânicas e
inorgânicas elaborado pelas abelhas a partir do néctar das flores e/ou de exsudados
produzidos pelas plantas (BRASIL, 2000), os quais são coletados e transformados por
meio da evaporação da água e ação de enzimas invertase, diastase e glicoseoxidase,
entre outras. Dentro destas etapas ressalta-se o aspecto geográfico e climático que
influencia na composição química dos méis, o qual está diretamente relacionada com a
origem floral (botânica) e o solo, aspectos de processamento e armazenamento, além
de poeiras e diversos agentes ambientais (BARONI et al., 2009; BERTONCELJ et al.,
2007; GULER et al., 2007). Por estes fatores a caracterização dos diferentes méis se
torna de grande relevância, uma vez que isto permitirá a orientação técnica para
2
especificar padrões de qualidade e assim evitar a ocorrência de adulterações, além de
ajudar a classificar o mel ou discriminá-lo através de marcadores químicos ou
bioquímicos.
No Brasil, uma série de trabalhos científicos têm relatado estudos da qualidade
de méis de abelhas, baseados na composição química e bioquímica (ABREU et al.,
2008, ALMEIDA-MURADIAN, MATSUDA, BASTOS, 2007, ALMEIDA-ANACLETO,
MARCHINI, 2004; ALVES et al., 2005; ARAUJO, COSTA et al., 1999; SILVA, SOUZA,
2006; ARRUDA et al., 2004; CARVALHO et al., 2009; EVANGELISTA-RODRIGUES et
al., 2005; MARCHINI et al., 2004; 2007; MENDONÇA et al., 2008; MORETI et al., 2009;
SODRÉ et al., 2007a; SOUZA et al., 2009; WELKE et al., 2008), além de outros países
(AL et al., 2009; ANUPAMA, BHAT ; SAPNA, 2003; BARONI et al., 2009; CONTI, 2000;
DEVILLERS et al., 2004; FINOLA, LASAGNO, MARIOLI, 2007; GULER et al., 2007;
MENDES et al., 1998; OJEDA DE RODRÍGUEZ et al., 2004; SAXENA, GAUTAM,
SHARMA, 2010; SILVA et al., 2009; TERRAB et al., 2004). Paralelamente às
características químicas e bioquímicas, o estudo da composição mineral de méis tem
sido realizado por diversos pesquisadores (CONTI, 2000; ERBILIR, ERDOGRUL, 2005;
MENDES, 2003; MENDES, BACCAN, CADORE, 2006; RODRIGUEZ-OTERO et al.,
1994; SODRÉ et al., 2005, 2007a; YILMAZ, YAVUZ, 1999) com a finalidade de
discriminar a origem geográfica, uma vez que a quantidade e a concentração dos
metais estão associadas ao solo e flora apícola de cada região.
Um outro ponto que têm sido investigado é a composição do aroma do mel, pois
varia de acordo com sua origem botânica, e é muito dependente dos compostos
orgânicos voláteis e não-voláteis presentes nas matrizes orgânicas estudadas (ODEH
et al., 2007, SCHIEBERLE, KOMAREK, 2003). As substâncias voláteis presentes nos
méis podem ser utilizadas como marcadores químicos florais (botânicos).
Recentemente, várias pesquisas têm sido realizadas na análise de compostos voláteis
3
em mel utilizando diferentes metodologias (ALISSANDRAKIS et al., 2003, 2005a e b,
2007; AMPUERO et al., 2004; BARONI et al., 2006; BIANCHI, CARERI, MUSCI, 2005;
BICCHI et al., 2004; CONTE et al., 2002; ODEH et al., 2007; MOREIRA et al., 2002;
PIASENZOTTO, GRACCO, RADOVIC et al., 2001; SORIA; MARTÍNEZ-CASTRO,
SANZ, 2009; VÁRQUEZ, MAROTO, COELHO, 2007; VERZERA et al., 2001; ZHOU,
WINTERSTEEN, CADWALLADER, 2002), na busca de caracterizar os constituintes
químicos do aroma do mel e correlacioná-los com sua origem botânica, uma vez que
sua composição varia de acordo com a origem apícola de cada região (ODEH et al.,
2007).
Além disso, há grande interesse na quantidade e tipos de microorganismos
presentes no mel, visto que nos últimos anos, têm sido registrados na literatura
diversos artigos científicos sobre as características microbiológicas do mel
(CARVALHO et al., 2006; GOMES, 2006; GOMES et al., 2009; IURLINA, FRITZ, 2005;
MONETTO et al., 1999; SODRÉ et al., 2007b), pois este produto é utilizado como
alimento e também na formulação de medicamentos e cosméticos (SODRÉ et al.,
2007b; SNOWDON, 1999). Além do que, a presença de microorganismos indica a
qualidade e a segurança deste alimento (SILVA et al., 2008), uma vez que as
leveduras, fungos e bactérias podem ocasionar alterações na composição deste
produto.
Neste contexto a região Norte do Brasil, ressaltando-se o Estado do Pará,
apresenta um elevado potencial de produção de méis de abelhas, porque tem flora em
abundância, água e sol o ano todo, elementos necessários à produção. Hoje, a
apicultura no Estado envolve diretamente 3 mil produtores, mão de obra quase
exclusivamente familiar, e chega a proporcionar 50% de lucro para o produtor. O
Estado do Pará produziu no ano de 2009, 1100 toneladas de mel, colocando o Estado
do pará em primeiro lugar no ranking dos Estados produtores de mel de abelhas da
4
Amazônia (SAGRI, 2010) . Diante desta produção de mel, buscam-se estabelecer um
monitoramento adequado para o estabelecimento de ações de controle de qualidade e
confiabilidade, visando à geração de méis mais competitivos em um mercado cada vez
mais exigente.
2. OBJETIVO GERAL
Ø Discriminar os méis, produzidos no Estado do Pará, utilizando os
parâmetros químicos, bioquímicos e microbiológicos como descritores de qualidade e
diferenciação.
2.1. Objetivos Específicos
Ø Quantificar os parâmetros químicos (pH, acidicidade, umidade, sólidos
insolúveis, cor, cinzas, açúcares redutores e totais, sacarose, frutose, glicose,
Hidrometilfurfural e metais);
Ø Quantificar os parâmetros bioquímicos (proteinas e atividade diastásica);
Ø Quantificar os parâmetros microbiológicos (fungos e leveduras);
Ø Identificar e quantificar os minerais presentes no mel de abelhas por
Espectrometria de Emissão Óptica com Plasma acoplado Indutivamente (ICP OES);
Ø Identificar e quantificar o perfil das substâncias voláteis dos méis
produzidos por abelhas no Estado do Pará por Cromatografia Gasosa acoplada a
Espectrometria de Massas (CG/EM), a fim de avaliar se existe um padrão em função
da origem botânica do mel por região;
Ø Investigar a flora microbiana do mel (fungos filamentosos e leveduras) e
identificar as colônias de leveduras isoladas por técnicas de biologia molecular para
serem utilizadas em processos fermentativos do mel.
5
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1. Composição do mel de abelhas
O mel resulta da desidratação e transformação do néctar das flores ou de
exsudações sacarínicas de outras partes vivas das plantas, que são coletadas e
transformadas através da evaporação da água e da adição de enzimas, no sistema
digestório das abelhas (HORN, 1996). A qualidade depende de sua origem floral,
concentração do néctar, quantidade de flores visitadas pelas abelhas e número de dias
em que as flores estão secretando o néctar. A qualidade do mel também depende das
concentrações e proporções de seus carboidratos, minerais e vitaminas, entre outros,
constituindo a base da composição final. A variação da composição física e química do
mel é comumente encontrada, uma vez que vários fatores interferem na sua qualidade,
tais como: condições climáticas, grau de maturação, espécie de abelha,
processamento e armazenamento, além do tipo de florada (CRANE, 1983).
Sendo o mel um produto muito apreciado e de fácil adulteração com açúcares
ou xaropes, são necessárias algumas análises para a determinação da sua qualidade
para fins de comercialização. A necessidade de estabelecer técnicas analíticas com a
finalidade de conhecer a composição química do mel é de grande importância,
principalmente para determinar parâmetros físico-químicos, bioquímicos e biológicos
para cada grupo de méis, além de contribuir para a identificação de fraudes e
mudanças física, químicas e microbiológicas que possam surgir (OSTERKAMP, 2009).
Recentemente foram realizadas análises químicas e bioquímicas de méis,
visando a sua padronização, como também, obtenção de subsídios para garantir a
qualidade desse produto, detectando as suas possíveis adulterações. Essa
caracterização se faz necessária à qualidade do mel, pois é um alimento bastante
usado no dia-a-dia de muitas famílias, principalmente, na alimentação de crianças e
6
idosos, devido à riqueza de vitaminas e sais minerais, além de possuir propriedades
antibacterianas e anti-sépticas, sendo utilizado também nas formulações de
medicamentos e cosméticos (MELO et al., 2003; OSTERKAMP, 2009).
As características químicas e bioquímicas são pouco conhecidas,
principalmente, nas regiões tropicais onde existe uma elevada diversidade da flora
apícola associada às taxas elevadas de umidade e temperatura (SODRÉ, 2000).
O Ministério da Agricultura, através da Instrução Normativa nº 11 de 20 de
outubro de 2000, indica as análises às quais o mel brasileiro deverá ser submetido
(BRASIL, 2000), os quais são: teor de umidade, hidroximetilfurfural, açúcares
redutores, sacarose aparente, cinzas, acidicidade, sólidos insolúveis, atividade
diastásica, pH e ºBrix. Estes parâmetros são importantes para avaliar o controle de
qualidade do mel de abelha, pois é possível relacionar o teor de açúcares redutores,
sacarose e a umidade com a maturidade e processamento do mel. Por outro lado,
acidicidade, concentração de hidroximetilfurfural e atividade diastásica associam-se
com o grau de deterioração, frescor e condições de processamento e armazenamento,
enquanto que os teores de cinzas e sólidos solúveis em água refletem a pureza do mel
(MENDES, 2003).
3.1.1. Açúcares no mel de abelhas
A fração monossacarídica do mel é composta basicamente pelos açúcares
simples frutose e glicose, e somadas suas concentrações chegam à média de 65% da
composição total do mel (GONZÁLEZ-MIRET et al., 2005; SILVA et al., 2009). A
presença desses monossacarídeos no mel é descrita em vários trabalhos científicos,
além desses monossacarídeos a presença de D-galactose, em quantidades traços,
também já foi relatada em amostras de mel. Os teores de frutose e glicose
7
classificados como açúcares redutores, por estarem em maior quantidade são
extremamente importantes para o estabelecimento de uma série de características do
mel. A glicose, por exemplo, por ter pouca solubilidade, determina a tendência da
cristalização e a frutose por ter alta higroscopicidade possibilita a doçura. O maior
problema resultante da precipitação de glicose é o aumento do teor de umidade da fase
líquida que permite que células de leveduras osmofílicas (microorganismos que se
desenvolvem em condições desfavoráveis: atividade de água baixa e concentração de
açúcares alta), que ocorrem naturalmente no mel, se multipliquem e provoquem a
fermentação do produto (MOREIRA, DE MARIA, 2001).
De acordo com Moreira e De Maria (2001), um total de 15 dissacarídeos são
descritos na literatura como constituintes da matriz mel, são eles: celobiose,
gentiobiose, isomaltose, isomaltulose, kojibiose, laminaribiose, leucrose, maltose,
maltulose, melibiose, neotrealose, nigerose, palatinose, sacarose e turanose e 13
trissacarídeos: centose, 1-cestose, erlose, 4-α-gentiobiosilglicose, 3-α-
isomaltosilglicose, isomaltotriose, isopanose, laminaritriose, maltotriose, melezitose,
panose, rafinose e teanderose. O estado atual do conhecimento permite classificar os
dissacarídeos do mel em 4 grupos, com base na identificação inequívoca e na
distribuição quantitativa: grupo I-majoritário: maltose, kojibiose, turanose, sacarose;
grupo II-minoritário: isomaltose, maltulose, nigerose, palatinose, gentiobiose, celobiose;
grupo III-traços: laminaribiose, neotrealose; grupo IV- necessita de confirmação:
leucrose, isomaltulose, melibiose. Com base em resultados da literatura, os
trissacarídeos do mel podem ser classificados em 3 grupos, conforme a identificação
inequívoca e a distribuição quantitativa: grupo I-majoritário: erlose; grupo II-minoritário:
teanderose, isopanose, panose, maltotriose, melezitose, rafinose, isomaltotriose; grupo
III-necessita de confirmação: centose, 1-cestose, 3-α-isomal-tosilglicose, 4-α-
gentiobiosilglicose, laminaritriose.
8
Os açúcares no mel são os constituintes majoritários. Sua concentração
representa 95-99% m/m dos sólidos do produto, e por conseqüência, são responsáveis
pelas características como doçura, viscosidade, densidade, higroscopicidade,
capacidade de granulação (cristalização) e valor energético dos méis (STONOGA;
FREITAS, 1991).
Entre os dissacarídeos, a sacarose representa, em média, 2 a 3% dos
carboidratos presente no mel e quando superior a este valor geralmente indica um mel
verde ou adulterado. A sacarose quando sofre a hidrólise, pela ação de ácidos diluídos
ou pela ação de enzimas (invertase), resulta em dois monossacarídeos: frutose e
glicose (WHITE JR, 1978).
Nos parâmetros de qualidade, o teor de açúcares redutores permitidos no mel,
deve estar no mínimo 65% (BRASIL, 2000) e para Codex (2001), é aceitável no mínimo
60%. Para a sacarose os teores permitidos são no máximo 6% (BRASIL, 2000) e para
Codex (2001), é aceitável no máximo 5%.
3.1.2. Umidade
O teor de umidade no mel é considerado o segundo componente de qualidade
na composição deste produto. O conteúdo de água em méis de origens diferentes
apresenta variação no intervalo de 13% a 29% (KAYACIER; KARAMAN, 2008). O teor
de umidade do mel depende de vários fatores, tais como a época da colheita, o grau de
maturidade alcançado e fatores climáticos (FINOLA; LASAGNO; MARIOLI, 2007).
O teor de umidade é uma das características mais importantes na viscosidade,
peso específico, maturidade, cristalização, sabor, conservação e palatabilidade do mel
de abelhas (ALMEIDA, 2002).
9
Os microorganismos osmofílicos (tolerante aos açúcares) presentes nos corpos
das abelhas, no néctar, no solo, nas áreas de extração e armazenamento podem levar
à indesejável fermentação do mel quando o teor de água for muito elevado, resultando
na formação de álcool etílico, dióxido de carbono, ácidos orgânicos e outras
combinações com sabores e odores desagradáveis, como as moléculas de álcool
podem ser oxidado a ácido acético e água, resultando em um gosto azedo (CHIRIFE;
ZAMORA, MOTTO, 2006; SNOWDON, 1999).
A cera que fecha os opérculos na colméia impede a entrada de água e evita o
risco de fermentação. Quando o mel atinge 18% de água, a atividade da água (a
w
)
aumenta, facilitando a fermentação por leveduras osmofílicas (SCHWEITZER, 2001).
De acordo com a legislação nacional (BRASIL, 2000) e internacional (CODEX,
2001) consideram como parâmetro de qualidade para méis de Apis mellifera, o mel que
contenha no máximo 20% de umidade. Para méis de abelhas sem ferrão, Villas-Bôas e
Malaspina (2005), propõem que o mel contenha no máximo 35% de umidade.
3.1.3. Hidroximetilfurfural (HMF)
O HMF é formado pela reação de desidratação das hexoses em presença de
ácidos (BELITZ, GROSCH, 1997). O teor de HMF é utilizado para avaliar a qualidade
do mel, pois o mel fresco não contém concentrações de HMF, e aumenta o teor
durante o armazenamento ou acondicionamento do mel (ZAPPALÁ et al., 2005) ou
ainda com a elevação da temperatura para diminuir a viscosidade e/ou crescimento de
microorganismos indesejáveis.
O HMF pode ser uma indicação de alteração das propriedades químicas e
organolépticas ou tensão elevada de calor do material contendo açúcar. O
aquecimento é essencial nas diversas fases de extração e manipulação do mel, porém
10
o calor excessivo é prejudicial, conduzindo a produção de HMF o qual provoca
escurecimento, gerando menor qualidade do produto. As temperaturas em torno de 71
a 77 °C servem para destruir a maior parte das leveduras osmofílicas presentes, porém
modificam a cor do mel e reduzem a cristalização (SCHWEITZER, 2001).
O HMF é um indicador de qualidade no mel, quando seu teor está elevado indica
uma queda no seu valor nutritivo, pela destruição, por meio de aquecimento, de
algumas vitaminas e enzimas que são termolábeis (VERÍSSIMO, 1998; RÊGO,
XIMENES, CAREIRO, 2002). Porém, de acordo com arvalho et al. (2005), em países
subtropicais os méis podem ter naturalmente um alto conteúdo de HMF sem que o
mesmo tenha sido superaquecido ou adulterado, motivo pelo qual é importante saber a
região de procedência do mel.
De acordo com Brasil (2000) é considerado como parâmetros de qualidade o
mel que tenha no máximo 60 mg/kg de HMF, sendo que para Codex (2001) os teores
podem atingir no máximo 80 mg/kg em regiões tropicais.
3.1.4. Atividade diastásica
A diastase (conjunto de amilases) é produzida pelas glândulas hipofaringeanas
das abelhas e ocorre também em plantas. É adicionada pela abelha ao mel durante
sua manipulação e conversão do néctar em mel. A diastase quebra o amido, estando
envolvida na digestão do pólen. De acordo com White (1994) alguns méis necessitam
de um tempo maior de manipulação, tendo por isso, quantidades variáveis da enzima
nos diferentes tipos de mel, de acordo com o grau de hidratação do néctar.
Sua relevância principal para o mel é que ela é mais sensível ao calor que a
invertase.
11
De acordo com a legislação vigente estabelecida pelo Ministério da Agricultura e
do Abastecimento (BRASIL, 2000) o valor mínimo da atividade diastásica no mel é de 8
na escala de Göthe e os méis com baixo conteúdo enzimático deverão ter no mínimo
uma atividade diastásica correspondente a 3 da escala de Göthe, sempre que o
conteúdo de hidroximetilfurfural não exceda a 15 mg/kg.
3.1.5. pH
O pH determinado no mel refere-se aos íons hidrogênio presentes numa solução
e pode influenciar na formação de outros componentes no mel, como na velocidade de
produção de hidroximetilfurfural. Desta forma, este caráter serve como indicativo do
estado de conservação do mel, revelando a existência de processos fermentativos ou
adulteração no produto (LEAL et al., 2001).
Todos os méis são ácidos e o pH é influenciado pela origem botânica, pela
concentração de diferentes ácidos e pelo cálcio, sódio, potássio, e outros constituintes
do mel. Geralmente, encontra-se valor inferior a 4,0 para méis de origem floral (FRÍAS,
HARDISSON, 1992, ALMEIDA-ANACLETO, 2007).
O pH é considerado um importante fator antimicrobiano, embora exista alguma
discussão a este respeito, o fator relevante é que grande parte dos microorganismos
patogênicos necessita para seu crescimento de um pH ótimo na faixa de 7,2 a 7,4
(NOGUEIRA-NETO, 1997).
3.1.6. Acidicidade
A acidicidade é um importante componente do mel contribuindo para a sua
estabilidade, frente ao desenvolvimento de microorganismos. Os ácidos presentes no
12
mel estão dissolvidos em solução aquosa e produzem íons hidrogênio que promoveram
a sua acidicidade ativa, permitindo assim, identificar as condições de armazenamento e
o processo de fermentação. Os ácidos orgânicos presentes no mel representam menos
que 0,5% dos sólidos, tendo um pronunciado efeito no “flavor”, podendo também
apresentar atividade antimicrobiana (PASSAMANI, 2005).
Os ácidos orgânicos mais comuns encontrados no mel de abelha são os:
acético, benzóico, butirico, cítrico, fenilacético, fórmico, glucônico, isovalérico, lático,
málico, oxalaco, propiônico, piroglutânico, succinico e valérico. Algumas propriedades
funcionais do mel são atribuídas aos seus ácidos orgânicos, como: fatores antibióticos,
estímulo no peristaltismo intestinal e ação tonificante muscular (SERRANO,
VILLANUEVA, MARQUINA, 1994).
Pela ação da glicose oxidase o ácido glucônico em equilíbrio com a glico-lactona
é o principal ácido formado.
Para Almeida (2002), a ação de transformação é mais lenta em méis mais
densos e é influenciada pela quantidade de ácidos obtidos no tempo que transcorre
entre a coleta do néctar e o máximo do volume do néctar que é depositado nos favos.
De acordo com Brasil (2000) e Codex (2001), os parâmetros de qualidade sobre
a acidez estabelecido no mel, devem estar no máximo com 50 meq/kg.
3.1.7. Composição mineral do mel de abelha
O teor de cinzas expressa a riqueza do mel em minerais, e constitui-se um
parâmetro bastante utilizado nas determinações que visam verificar sua qualidade. Os
sais minerais encontrados no mel podem ser modificados por fatores relativos, ao
clima, solo, a flora botânica e manuseio do apicultor (SILVA et al., 2009; SAXENA,
GAUTAM, SHARMA, 2009). O conteúdo mineral no mel também considerado como um
13
critério de qualidade é um importante índice para avaliar uma possivel poluição
ambiental e indicar a origem botânica dos méis (ANKLAM, 1998, SILVA et al., 2009;
SAXENA, GAUTAM, SHARMA, 2009). De acordo com Almeida (2002), há possibilidade
de modificação do espectro mineral do mel, quando um favo de mel é prensado com
uma quantidade maior de pólen.
Os minerais influenciam diretamente na coloração do mel, de 0,04% m/m para
méis claros até 0,6% m/m para os escuros (MENDES, 2003).
A legislação nacional (BRASIL, 2000) estabelece um teor de cinzas no mel de
no máximo 0,6% m/m. A legislação internacional (CODEX, 2001) não estabelece
valores para este parâmetro.
No resíduo mineral fixo do mel já foram identificados inúmeros elementos
químicos, tais como: K, Na, Ca, Mg, Mn, Ti, Co, Fe, Cu, Li, Ni, Pb, Sn, Os, Ba, Ga, Bi,
Ag, Au, Ge, Sr, Be, Va, Zn. No entanto, os metais considerados essenciais à dieta
humana (K, Na, Ca, Mg, P e S) podem estar presentes no mel em concentrações tais
que podem qualificá-lo como boa fonte nutritiva (BULDINI et al., 2001; MENDES,
2003). Estudos realizados por Silva et al. (2009) mostram valores médios de Ca 59,88
(mg/kg), Mg 35,57 (mg/kg), K 1157,1 (mg/kg) e Na 261,43 (mg/kg) e Hernández et al.
(2004) relataram concentrações de Ca 57,3 (mg/kg), Mg 28,4 (mg/kg) e Zn 1,18
(mg/kg). Por outro lado, o mel contém metais de transição, alguns indesejáveis como
os metais pesados, por sua suposta toxicidade, mesmo em concentrações traços, que
podem está associada à flora botânica, origem geográfica ou com a poluição ambiental
da região (BULDINI et al., 2001; MENDES, 2003) ou até mesmo no processamento
e/ou armazenamento do mel pelo apicultor. Os autores Erbilir e Erdoĝrul (2005)
relataram valores médios de Cu (0,01 mg/kg) e Cd (0,32 mg/kg) e Sodré et al (2007a)
apresentaram valores médios de Cr (0,196 mg/kg), Co (0,038 mg/kg), Ni (0,728 mg/kg)
e Cu (0,179 mg/kg).
14
A determinação de espécies metálicas no mel de abelha é feita para garantir a
qualidade e sua autenticidade como alimento saudável para o consumo, neste sentido,
as concentrações dos metais presentes atuam principalmente como um indicador
ambiental (MENDES, 2003).
3.1.8. Composição volátil do mel de abelhas
As características organolépticas do mel (sabor e aroma) são muito dependentes
de compostos orgânicos voláteis e não-voláteis presentes na matriz e no espaço em
torno desta (SCHIEBERLE, KOMAREK, 2003).
Os compostos de aroma podem ser originados de: 1- transferência de
constituintes voláteis da planta; 2- conversão de constituintes da planta pela abelha; 3-
a produção de compostos pelas abelhas; 4-produção de compostos durante o
processamento pós-colheita; 5-ação de microrganismos (DE MARIA, MOREIRA, 2003).
A identificação e quantificação destes compostos são variáveis e dependem de muitos
fatores associados tais como: técnicas de análise utilizadas, tipos de vegetação da
região, processamento e armazenamento (BARTH et al., 2005; BASTOS, 1996;
ANKLAN, 1998).
Um grande número de compostos orgânicos tem sido descritos em diferentes
tipos de méis por diversos pesquisadores (ALISSANDRAKIS et al., 2003, 2005a,
2005b, 2007; AMPUERO, BODGANOV, BOSSET, 2004; BIANCHI, CARERI, MUSCI,
2005; BICCHI et al., 2004; MOREIRA et al., 2002; PIASENZOTTO, GRACCO, CONTE,
2003; RADOVIC et al., 2001; VERZERA et al., 2001; ZHOU; WINTERSTEEN,
CADWALLADER, 2002), essa busca de caracterizar os constituintes químicos do
aroma do mel tem o objetivo de correlacioná-los com sua origem botânica, uma vez
15
que sua composição varia de acordo com a origem apícola de cada região (ODEH et
al., 2007).
Recentemente, Soria; Martínez-Castro; Sanz (2009) relataram em seu trabalho
os seguintes componentes voláteis do mel de abelha: heptano, dimeti-sulfeto, octano,
butano-diona, acetonitrila, clorofórmio, butan-2-ol, 2-metil-but-3-en-2-ol, pentano-2,3-
diona, dimetil-disulfeto, hexanal, 2-metil-but-2-enal, 2-metil-propan-1-ol, butan-1-ol,
pent-1-en-3-ol, but-3-enonitrila, 2,3-dihidro-4-metilfurano, 2-metil-butan-1-ol + 3-metil-
butan-1-ol, 3-metil-but-3-en-1-ol, dihidro-2-metil-3-(2H)-furanona, furfural, 1-(2-furanil)-
etanona, benzaldeído e entre outros.
Baroni et al. (2006) estudando 42 amostras de mel de abelhas de diferentes
origens florais descreveu os seguintes compostos: furfural, benzaldeido, octanal,
benzenoacetaldeido, 1-octanol, furano-metanol, isomero methil-2-pirazinil-metanol , 2-
metóxifenol, nonanal, feniletilalcool, 3,5,5-trimetilciclohex-1-en-2-ona, ácido octanóico ,
decanal, ácido nonanóico, dimetildecano, tetradecano, α-farneseno, 2H-1-benzopiran-
2-ona, 2- metil-pentadecano, butilated-OH- tolueno, hexadecano, 2-metil-octadecano,
6,7-dimetilheptadecano, eicosano, 5-metil-eicosano.
Pereira (2007) relatou os seguintes compostos: limoneno, óxido de cis-linalol,
orto-guaiacol, óxido de trans-linalol, linalol; 3,7-dimetil-1,5,7-octatrien-3-ol,
feniletilálcool, naftaleno, dodecano, 3,4,5-trimetilfenol, α-copaeno, tridecano, Issosafrol,
tetradecano, β-cariofileno, t-α-bergamoteno, α-humuleno, pentadecano, hexadecano,
heptadecano, octadecano e ftalato.
Odeh et al. (2007) descreveu cerca de 30 compostos voláteis do mel de abelha
orindos da Palestina entre eles estão: hexanol; nonanal; decanal; benzaldeido, 3,7-
dimetil-octa-1,6-dien-3-ol; nonanal, benzilálcool; dodecanal; tetradecano; feniletilálcool;
ácido 2-etil-hexanóico, propanol-benzeno; propilbenzeno; ácido nonanóico; ácido
decanóico, 4-metóxi-fenol e 5-hidroxi-metil-2-furano-carboxi-aldeido.
16
3.2. Microorganismos presentes no mel
Quando comparado com outros produtos de origem animal, o mel apresenta
uma baixa microbiota, porém não é um alimento estéril e está susceptível a
contaminações pela manipulação inadequada (GOMES et al., 2005; AL HIND, 2005).
O mel tem várias fontes de contaminação microbiana, as quais podem ser
divididas em dois grupos de microorganismos: os de fonte primária, que são os
naturalmente ocorrentes no mel e os de contaminação secundária diretamente
relacionada ao processamento do mel. Dentre os microorganismos provenientes da
fonte primária destacam-se os bolores e as leveduras que em condições normais de
umidade, não interferem na qualidade do mel e não são patogênicos. As fontes
primárias de contaminação por microorganismos incluem néctar, pólen, trato digestivo
da abelha, poeira, ar, solo e flores, e são difíceis de eliminar. Por outro lado, as fontes
secundárias de contaminação, são devido à manipulação e o processamento do mel,
são mais fáceis de controlar através da aplicação de boas praticas de fabricação
(SNOWDON, CLIVER, 1996).
O crescimento de mofos encontrados em alguns méis, pertence aos gêneros
Penicillium e Mucor. Têm-se reportado casos de contaminação com Bettsya alvei ou
mofo do pólen, o qual é problemático apenas quando o mel absorve umidade em sua
superfície, em função de armazenamento inadequado. E as leveduras são do tipo
osmófilas, responsáveis pela fermentação do mel, quando as condições de umidade
permitem. Também é possível encontrar leveduras pertencentes à própria microbiota
do mel, as quais são introduzidas na colméia pelas abelhas através do néctar, pólen ou
melato, ou pelas próprias abelhas durante as operações de limpeza, ao veicular estes
microrganismos sobre ou dentro de seus organismos (SALAMANCA, 2002). Conforme
o conteúdo de água, o número de microorganismo presente a uma determinada
17
temperatura é possível identificar quando o mel fermentará. Todos os méis naturais
contêm leveduras tolerantes ao açúcar, das quais as espécies mais freqüentem
isoladas do mel de abelha pertencem aos seguintes gêneros: “Ascosphaera,
Debaryomyces, Hansenula, Lipomyces, Nematospora, Oosporidium, Pichia,
Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Trichosporan,
Torula, Torulopsis e Zygosaccharomyces” (SNOWDON, CLIVER, 1996). De acordo
com Tysset e Rousseau (1981) a Saccharomyces spp representa a levedura dominante
encontrado no mel.
De acordo com Crane (1983), a presença de leveduras no mel de abelhas pode
ser oriunda de varias fontes como: o néctar, o melato, do corpo da abelha, do solo ao
redor da colméia, do ar no apiário e dos equipamentos utilizados no processamento.
3.3. Estatística Multivariada
Neste trabalho, foram utilizadas duas técnicas estatísticas: análise hierárquica
de agrupamentos (AHA) e análise de componentes principais (ACP). Portanto, essas
serão apresentadas resumidamente a seguir.
3.3.1. Matriz de dados
Os dados consistem em n medidas de diferentes propriedades (variáveis)
executadas sobre m amostras (objetos), de modo que a esta série de dados pode ser
representada na forma de uma matriz de dimensão mxn (m linhas correspondentes as
amostras e n colunas correspondentes as variáveis):
18
A j-ésima variável é representada por um vetor coluna. O i-ésimo objeto, ou seja, uma
amostra qualquer, é representado por um vetor linha chamado vetor resposta e assim
pode ser descrito como um ponto no espaço n-dimensional.
3.3.2. Padronização e escalamento
Muitas vezes, a variância das variáveis da matriz apresenta amplitude
extremamente diferente uma das outras. Nestes casos, a aplicação de técnicas
estatísticas multivariadas poderá ser influenciada pelas variáveis de maior variância o
que dificulta a extração de informação do sistema estudado. Uma maneira de resolver
estes problemas, mantendo a informação estatística dos dados, é realizar a
transformação dos dados originais da matriz de modo a balancear a variância das
variáveis. Uma das transformações mais comuns é padronizar os dados pela média e
desvio padrão de cada variável (Equação 2), gerando novas variáveis centradas no
zero e com variâncias iguais a 1. Este tipo de padronização é conhecido como
autoescalamento.
X
19
3.3.3. Medidas de similaridade e dissimilaridade
Cada objeto é representado por um ponto no espaço n-dimensional e, portanto,
pode ser agrupado com outros que estejam próximos e mais se assemelham a ele. O
critério de melhor associação que pode ser utilizado é a medida de distância
Euclidiana, que a interpretação básica dada é: menores distâncias entre os pontos
estão associadas a um elevado grau de similaridade, enquanto que maiores distâncias
indicam o comportamento oposto (MINGOTI, 2005; MOITA NETO; MOITA, 1998).
3.3.4. Análise de componentes principais (ACP)
A análise por componentes principais (ACP) é um dos métodos mais comuns
empregados na análise de informações, sendo principalmente utilizada pela sua
capacidade de compressão dos dados em função da existência de correlação entre
diversas variáveis medidas.
Esta técnica estatística consiste essencialmente em reescrever as variáveis
originais da matriz em novas variáveis a partir de uma transformação de coordenadas
de modo a obter um número menor de variáveis capaz de conter as informações de
todas as utilizadas. Essa técnica estatística objetiva principalmente explicar a estrutura
de variância e covariância das variáveis pela construção de combinações lineares das
variáveis originais (MINGOTI, 2005), denominadas componentes principais (CP).
Considerando notação matriz, as componentes principais (CP) podem ser
obtidas a partir da seguinte expressão:
X = P T, (3)
onde X é a matriz original dos dados, T é a matriz de scores das componentes
principais que contém as coordenadas dos elementos da matriz novo sistema de eixos
20
e P é a matriz dos loadings, onde os elementos de cada coluna correspondem aos
coeficientes das combinações lineares das variáveis.
As componentes principais são combinações lineares das variáveis originais e
são obtidas em ordem decrescente de máxima variância de forma que a componente
principal 1 (CP1) detém mais informação estatística que a componente principal 2
(CP2), que por sua vez tem mais informação estatística que a componente principal 3
(CP3) e assim sucessivamente. Desta forma, ao utilizar a técnica ACP, é necessário
avaliar o quanto de informação das variáveis originais está preservado nas
componentes principais obtidas e isto pode ser feito pela variância total explicada pelas
mesmas. O primeiro componente principal apresenta a maior variância possível dos
dados e por isso preserva mais informação do sistema (MASSART et al., 1997, MOITA
NETO, MOITA, 1998).
A grande aplicabilidade da análise de componentes principais remete ao fato que
frequentemente se obtém mais de 90 % das informações contidas nas n-variáveis
originais em apenas dois ou três componentes principais. O gráfico da componente
principal 1 versus a componente principal 2 fornece uma janela privilegiada
(estatisticamente) para observação dos pontos no espaço n dimensional (MOITA
NETO, MOITA, 1998).
3.3.5. Análise Hierárquica de Agrupamentos (AHA)
A técnica de análise hierárquica de agrupamentos (AHA) é uma técnica
estatística que objetiva identificar os possíveis agrupamentos (cluster) dos elementos
de uma matriz em grupos de forma que os elementos pertencentes a um mesmo grupo
sejam similares entre si em relação às variáveis e os elementos em grupos diferentes
sejam heterogêneos às estas mesmas variáveis. Ou seja, esta técnica estatística
21
possibilita determinar similaridades e dissimilaridades de uma série de dados
(MINGOTI, 2005).
A AHA consiste em transformar a informação de cada elemento da matriz,
representada num sistema de coordenadas de n variáveis, em uma coordenada
dimensional. Para isto, utilizam-se as distâncias entre os elementos da matriz os quais
são representados em diagramas conhecidos como dendograma. Há várias maneiras
de medir essa distância, entretanto, a mais amplamente utilizada é a distância
euclidiana:
onde a e b são dois pontos no espaço n-dimensional e Xaj é a j-ésima coordenada da
amostra.
O índice de similaridade entre os elementos da matriz é calculada pela seguinte
expressão:
onde dij é a distância entre os pontos i e j e dmax é a distância máxima entre qualquer
par de pontos.
Os dendrogramas são especialmente úteis na visualização de semelhanças entre
amostras ou objetos representados por pontos em espaço com dimensão maior do que
três, onde a representação de gráficos convencionais não é possível (MOITA NETO,
MOITA, 1998). Os dendogramas representam as similaridades/dissimilaridades entre
os pares de elementos da matriz. Os índices de similaridades são calculados para os
pares de elementos da matriz e os mais próximos são conectados formando um
grupamento. Esse processo é repetido até que todos os elementos sejam conectados
22
formando um único agrupamento. A etapa seguinte é definir o tipo de agrupamento
entre um elemento e um grupo ou entre grupos de elementos. Há vários métodos de
agrupamentos hierárquicos: ligação simples ou vizinho mais próximo (single linkage),
ligação completa ou vizinho mais distante (complete linkage) e média (aritmética ou
ponderada) das distâncias (average linkage) (MINGOTI, 2005).
.
23
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Procedência das amostras de méis analisadas
O presente estudo foi realizado com dez amostras de méis de abelha produzidos
em diferentes municipios do Estado do Pará (Figura 1), sendo três amostras do
município de Moju (M1, M2 e M3; coordenadas geográfica (CG): 1º53'05.78''S e
48º45'52.20''O), três amostras de São Miguel do Guamá (M4, M5 e M6; CG:
1º37'39.75''S e 47º26'28.17''O), uma amostra de Irítuia (M7; CG: 1º46'28.19''S e
47º26'28.17''O), uma amostra de Ourém (M8; localização: 1º32'51.81''S e
47º06'39.25''O); e duas de Altamira (M9 e M10; CG: 3º10'18.84''S e 52º15'44.47''O). As
amostras de méis M1 a M9 são de Apis mellífera e M10 de Melipona rufiventris (quadro
1, pág. 24). Os méis foram coletados em outubro de 2008 e armazenadas em frasco de
vidro e mantidas à temperatura ambiente (25 ± 1 ºC).
.
Figura 1: Mapa de localização dos municípios de procedência das amostras de mel de
abelhas. Fonte: Google Earth (5.0.11733.9347), 05 de maio de 2009.
24
Quadro 1: Especificações das amostras de mel estudadas neste trabalho
Nº Código Localidade Tipo de abelha
1 M1 Moju
Apis mellifera
2 M2 Moju
Apis mellifera
3 M3 Moju
Apis mellifera
4 M4 São Miguel do Guamá
Apis mellifera
5 M5 São Miguel do Guamá
Apis mellifera
6 M6 São Miguel do Guamá
Apis mellifera
7 M7 Irítuia
Apis mellifera
8 M8 Ourém
Apis mellifera
9 M9 Altamira
Apis mellifera
10 M10 Altamira
Melipona rufiventris
4.2. Local de realização das análises
As análises químicas e bioquímicas (umidade, sólidos insolúveis em água,
açúcares totais e redutores, sacarose aparente, glicose, frutose, pH, atividade
diastásica, HMF, cinzas, acidez, proteína e cor), assim como a contagem de bolores e
leveduras e isolamento das colônias de fungos filamentosos e leveduras, foram
realizadas no Laboratório de Investigação Sistemática em Biotecnologia e Química
Fina, na seção de Microbiologia do Instituto de Ciências Exatas e Naturais da
Universidade Federal do Pará. A identificação das colônias de leveduras foram
realizadas no Laboratório de Polimorfismo de DNA do Instituto de Ciências Biológicas e
a análise dos constituintes químicos do aroma do mel foi realizada no Laboratório de
Produtos Naturais (Faculdade Engenharia Química) do Instituto Tecnológico da mesma
instituição. A análise da composição mineral foi realizada no Laboratório de Meio
Ambiente do Instituto Evandro Chagas.
25
4.3. Análises Físico-químicas e Bioquímicas
Todas as análises foram realizadas em triplicatas, sendo os resultados
expressos pela média aritmética das determinações, com seus respectivo desvio
padrão e coeficiente de variação.
4.3.1. Cinzas
Os resíduos minerais fixos foram determinados com auxílio de uma mufla (Linn –
Elektro Thern), cujo princípio é baseado na digestão do material orgânico pela elevada
temperatura. Uma massa de aproximadamente 5 g de mel foi pesada em um cadinho
de porcelana, desidratado em estufa até atingir peso constante (24h à 80ºC e 48h à
105ºC). O material seco foi calcinado a 550 ºC durante 6 h utilizando programação
linear de 2 ºC/min (AOAC Método Oficial nº 920.181). Após o material seco, o teor de
cinzas foi quantificado através da equação abaixo:
Cálculo do teor de cinzas:
% cinzas = (Pr+Pc) x 100
(Pc+Pa) - Pc
Pc= peso do cadinho
Pa= peso da amostra
Pr= peso resíduo mineral fixo (cinzas)
26
4.3.2. Hidroximetilfurfural (HMF)
O HMF foi determinado após clarificação das amostras com os reagentes de
Carrez (I e II) e adição de bissulfito de sódio (AOAC Método Oficial 980.23; ZAPPALLÁ
et al., 2005). Este método é recomendado pela Instrução Normativa do Ministério da
Agricultura e do Abastecimento (BRASIL, 2000).
As soluções utilizadas na análise de hidroximetilfurfural foram:
a) Solução de Carrez (I): 15 g de K
4
Fe(CN)
6
.3H
2
O foram solubilizadas em 100 mL
de água desionizada;
b) Solução Carrez (II): 30 g Zn(CH
3
COO)
2
.2H
2
O foram dissolvidas em 100 mL de
água desionizada;
c) Solução de bissulfito de sódio 0,2% (m/v): 0,20 g de NaHSO
3
foram
solubilizadas em 100 mL de H
2
O. Esta solução foi preparada no momento da
análise.
Determinação:
Na determinação de HMF nas amostras de méis foram pesadas 5 g de cada
amostra em um béquer e depois transferidas para um balão volumétrico de 50 mL. Em
seguida, foi acrescentado 25 mL de água, 0,5 mL da solução de Carrez I e 0,5 mL da
solução de Carrez II. A solução resultante foi homogeneizada e aferida para 50 mL com
água desionizada e finalmente filtrada em papel de filtro Whatman nº 1. Os primeiros 10
mL do filtrado foram desprezados.
O HMF foi determinado nos méis por espectrofotometria utilizando quatro tubos
de ensaios: No primeiro tubo, foram adicionados 5 mL da solução filtrada e 5 mL da
solução de bissulfito de sódio 0,2% (m/v), sendo este tubo considerado como
referência. Nos demais foram adicionados 5 mL do filtrado e 5 mL de água
desionizada, os quais foram denominados de soluções teste.
27
As absorbâncias foram determinadas nos comprimentos de ondas 284 e 336 nm
em um espectrofotômetro UV-VIS (Genesys-10uv) e então foram aplicadas na seguinte
fórmula:
HMF
(mg /100 g mel)
= (A
284
- A
336
) x 14,97 x 5 / g da amostra
4.3.3. Atividade diastásica
A atividade diastásica foi determinada pelo método adaptado por Santos,
Malaspina, Palma (2003). O método é uma modificação do procedimento descrito por
Bogdanov, Martin, Lüllmann, (1997) e utiliza a leitura em espectrofotômetro, através da
descoloração de uma solução de amido, iodo e mel em condições controladas. Quanto
mais rápida a descoloração, maior a atividade diastásica da amostra, expressa em
unidade da escala de Gothe ou Schade por grama de mel. A unidade Gothe é definida
como a quantidade de enzima capaz de converter 0,01 g de amido em 1,0 h a 40 °C.
As soluções usadas para se executar o método são:
a) Solução padrão de iodo: Em um balão volumétrico foram dissolvidos 2,2 g
de iodeto de potássio e em seguida foi acrescentado à solução 0,88 g de iodo
resublimado. O balão volumétrico foi aferido para 100 mL com água
desionizada.
b) Solução “trabalho” de iodo (0,02 M): Um volume de 29,41 mL da solução
(a) foi diluída com água desionizada até o volume de 50 mL (preparado no
momento da análise).
c) Solução tampão de acetato de sódio 1,59 M (pH 5,3): Em um balão
volumétrico de 500 mL foi dissolvido 87 g de NaOAc.3H
2
O em 400 mL de água,
e em seguida foi adicionado 10,5 mL de acido acético (HOAc). A solução obtida
28
foi aferida para 500 mL. No final, o pH foi ajustado para 5,3 com HOAc e
conservado sob refrigeração a 5 ºC.
d) Solução de cloreto de sódio 0,1 M.
e) Solução de amido 1% (m/v): 1 g de amido foi suspendido em 70 mL de
água. A suspensão obtida foi aquecida a 70 ºC, sob agitação constante, e
posteriormente aferida para 100 mL com água desionizada.
· Determinação da atividade diastásica na solução de amostra de mel:
Uma massa de 5 g de mel foi pesada e em seguida misturada com 20 mL de
água desionizada. O pH da solução foi corrigido para 5,3 com NaOH e então aferida
para 50 mL.
Em um tudo de ensaio foram adicionados 5 mL da solução de mel, 500 µL do
tampão acetato, 500 µL da solução de cloreto de sódio 0,1 M, 150 µL de solução de
iodo 0,02 M e 9,6 mL de água desionizada. É essencial que a solução de mel esteja
tamponada antes do contato com o cloreto de sódio, pois em pH abaixo de 4 a
atividade diastásica é inibida (BOGDANOV, MARTIN, LÜLLMANN, 1997). Por último,
foram adicionados 250 µL da solução de amido 1% (m/v) e cronometrado o tempo,
agitando-se a solução até a completa homogeneização. A absorbância da solução foi
medida imediatamente a 660 nm no espectrofotômetro (Genisys-10uv). Água
desionizada foi utilizada como branco. Durante o procedimento de leitura, o tubo com a
solução permanece em banho-maria a 40 °C ± 1 °C.
Foram realizadas leituras periódicas de absorbância, conforme a Tabela 1 (pág.
29), descrita por Bogdanov (2002), retornando sempre o tubo ao banho-maria, até
atingir um valor inferior a absorbância de 0,235. Atingindo esse valor, a contagem do
tempo no cronômetro é interrompida, sendo o tempo transcorrido registrado e calculado
na fórmula a atividade diastásica.
29
Tabela 1: Valores de absorbância e intervalos de tempo para leitura, conforme
Bogdanov (2002)
Absorbância Inicial Intervalo de tempo para leituras
A > 0,658 >10 min
0,658 > A > 0,523 5 a 10 min
0,523 > A > 0,456 2 a 5 min
Ø Quantificação da atividade diastásica na solução de mel
A quantificação da atividade diastásica foi realizada através de cálculo. A qual foi
encontrado através do tempo em que se alcançou a absorbância inferior a 0,235. O
tempo alcançado foi divido por 300 para obter a atividade de diástase (DN).
DN = 300
t
x
t
x
= tempo de reação em minutos
4.3.4. Umidade
A umidade foi determinada em sistema Dean & Stark (DS) descrito por Pereira
(2007), cujo princípio é a imiscibilidade de solventes (tolueno e a água). 10 g de mel foi
pesado em um balão de fundo redondo de 250 mL e em seguida 100 mL de tolueno
foram adicionados pelo topo do DS. O sistema foi montado e operou durante 1,5 h.
O cálculo do teor de umidade (U%) através do método DS foi realizado com o
emprego da equação abaixo:
U % = [(Va – F1) x FA x 100]
M
30
Onde:
Va = volume de água extraído, em mL, lido na escala volumétrica do aparelho DS;
M = massa da amostra em gramas;
F1= 0,65; (primeiro fator de correção da fórmula de umidade: água formada pela
desidratação da glicose)
FA = 0,9833; (segundo fator de correção da água: variação do erro experimental na
escala).
Determinação do fator de correção do equipamento Dean Stark (Pereira, 2007)
Ø FA = Fator de correção da água: foram adicionados no equipamento DS,
3 mL de água e 100 mL de tolueno e montado o sistema de destilação por um
período de 1,5 h conforme mencionado anteriormente. O experimento foi realizado
em triplicata.
Ø FG = Fator de correção da glicose: a glicose foi liofilizada até a completa
secagem e mantida no dessecador. Para determinação do fator de correção da
glicose, foi adicionado no equipamento DS uma massa de 10 g de glicose e 100 mL
de tolueno. A destilação foi realizada por um período de 1,5 h.
Ø FGA = Fator de correção da amostra (glicose + água desionizada): foi
adicionado no equipamento DS uma massa de 10 g de glicose completamente
seca, 3 mL de água desionizada e 100 mL de tolueno para determinar o fator de
correção por um período de 1,5 h.
FA = vol. médio de H
2
O destilada lida na escala de leitura
Quantidade de água desionizada (3,0 mL)
F1 = vol. médio de H
2
O destilada do FG + (vol. médio de H
2
O destilada do FGA)
2
31
4.3.5. Cor
A determinação da cor dos méis foram realizadas de acordo com o método
descrito por Biachi (1981), a 635 nm de uma solução 50% (m/v) de mel em água
desionizada. Após a diluição, a solução foi mantida em repouso durante 15 minutos
antes da leitura no espectrofotômetro (Genisys-10uv). Como branco foi usada água
desionizada.
Os valores encontrados foram transformados em cor na escala de Pfund (Tabela
2), atraves da equação abaixo.
Cor = (371,39 x Abs
635
) – 38,70
Tabela 2: Classificação do mel conforme a coloração
Cor do Mel mm Abs
635
Branco-água 0-8 0,104-0,125
Extra-branco 8-16,5 0,125-0,148
Branco 16,5-34 0,148-0,195
Âmbar extra-claro 34-50 0,195-0,238
Âmbar-claro 50-85 0,238-0,333
Âmbar 85-114 0,333-0,411
Âmbar-escuro 114 ou mais 0,411 ou mais
4.3.6. Potencial hidrogeniônico (pH)
O pH foi determinado com auxílio de um pHmetrô da marca (Quimis-sc09),
previamente calibrado. Pesou-se 2,0 g de mel em um béquer e foi diluído com 15 mL
de água desionizada (AOAC Método Oficial nº 962.19).
32
4.3.7. Acidicidade
Os ácidos orgânicos totais presentes nos méis foram determinados de acordo
com AOAC Método Ofcial nº 962.19; que se baseia na titulação da amostra com
solução de NaOH 0,05 N, até atingir o pH = 8,5; cujo método é recomendado pelo
Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do mel (BRASIL, 2000).
Uma massa de 2 g da amostra foi pesada em um béquer e em seguida
transferida para um erlenmayer de 250 mL com auxílio de 15 mL de água desionizada.
Como indicador foi usado duas gotas de fenolftaleína 1% (m/v). A solução foi titulada
com solução de hidróxido de sódio 0,05 N até atingir um pH = 8,5.
Para o cálculo da acidez foi utilizada a seguinte fórmula:
Acidez = V x f
c
x M x 1000 ; expressa em mqEg/Kg
A
V = volume gasto de solução de NaOH 0,05 N (mL)
f
c
= fator de correção da solução de NaOH (adimensional)
A = massa da amostra (g)
M= molaridade da solução de NaOH (mol/L)
4.3.8. Sólidos Insolúveis
Os teores de sólidos insolúveis em méis foram determinados de acordo com a
recomendação do Ministério da Agricultura e do Abastecimento (BRASIL, 2000). Uma
massa 20 g de mel foi pesada e em seguida diluida com 10 mL de água desionzada
80ºC. Posteriomente, esta solução foi filtrada em papel de filtro Whatman nº 1 e depois
lavada com água desionizada até a ausência de açúcares. Para quantificação do
resíduo de sólidos insolúveis, o papel de filtro foi seco em estufa a 105 ºC até peso
constante.
33
4.3.9. Proteínas
O teor de proteína foi determinado pelo método descrito por Bradford (1976).
Neste método, o corante “Coomassie Brilliant Blue G-250”, ao se ligar aos grupos
amina protonados das proteínas forma um complexo corante-proteína que pode ser
quantificado por espectrofotometria a 590 nm. O corante reage principalmente com
resíduos de arginina e em menor proporção com resíduos de histidina, lisina, tirosina,
triptofano e fenilalanina.
Para o preparo do reagente de Bradford foi pesado uma massa de 100 mg de
“Coomassie Brilliant Blue G-250”, a qual foi solubilizada em 100 mL de ácido fosfórico
(85%) e 50 mL de etanol (95%) e finalmente esta solução foi aferida em balão
volumétrico para 1000 mL com água desionizada. Nos casos em que se identifique
material particulado, a solução é filtrada. O reagente foi armazenado em frasco ambar
e mantido a uma temperatura de ± 5 ºC. Para quantificação das proteínas foi
construída uma curva analítica utilizando-se albumina sérica bovina como padrão, cuja
concentração variou de 60 a 500 µg/mL (Figura 2, pág. 34).
Para determinação no mel foi preparada uma solução diluída (10 mg/mL).
Alíquota de 0,1 mL desta solução foi misturada com 4,9 mL do reagente de Bradford.
Esta mistura foi pernaneceu em repouso por 10 minutos e em seguida foi feita a leitura
da solução a 590 nm, em um espectrofotômetro (Genesys-10uv).
34
Concentração(µg/mL)
Absorbância (590 nm)
5004003002001000
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Figura 2: Curva analítica para quantificação de proteínas pelo reagente de Bradford
4.3.10. Açúcares redutores, açúcar total e sacarose
Os açúcares redutores foram determinados pelo método do ácido 3,5-
dinitrossalicílico (ADNS) adaptado de Miller (1959). Neste método, a dosagem de
açúcares com potencial redutor foi realizado com base na redução, em solução
alcalina, do ácido 3,5-dinitrossalicílico, sendo os grupos carbonílicos do açúcar
oxidados à carboxila. A substância resultante desta reação, o ácido 3-amino-
nitrossalicíIico tem uma cor vermelho-acastanhada. A intensidade desta cor, medida a
540 nm é diretamente proporcional à concentração de açúcares redutores presentes na
solução original. Para quantificação dos açúcares redutores foi construída uma curva
analítica com padrão de glicose, cuja concentração variou de 0,1 a 10 mg/mL (Figura 3,
pág. 35).
Y = 0,00075 X + 0,00368
R
2
= 99,8%; Q
2
= 99,7%
35
Concentração de glicose (mg/mL)
Absorbância (540 nm)
1,00,80,60,40,20,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Figura 3: Curva analítica de glicose para quantificação de açúcares redutores
Para determinação no mel foi preparada uma solução diluída de mel (5 mg/mL).
Alíquota de 0,2 mL desta solução foi misturada com 0,3 mL de água destilada e 0,5 mL
do reagente ADNS, esta mistura foi incubada em banho-maria a 100 ˚C durante 5
minutos e em seguida adicionado 5 mL de água destilada. A leitura no
espectrofotômetro (Genesys-10uv) foi realizada a 540 nm.
Para determinação dos açúcares totais foi realizado uma hidrólise na solução de
mel. Foram retirados 5 mL da solução de mel e adicionado 0,5 mL de HCL 1N, em
seguida esta mistura foi incubada em um banho-maria a 80 °C por 4 minutos.
Posteriormente, foi neutralizado com NaOH 1N e resfriado até atingir a temperatura
ambiente. Uma alíquota de 0,2 mL foi retirada e quantificada pelo método ADNS.
O aquecimento de uma solução de mel em condições ácidas, garante que a
sacarose seja hidrolizada. Porém, somam-se às moléculas separadas (glicose e
frutose) os íons de uma molécula de água (H
+
e OH
-
) (LEHNINGER, 2002) e o
peso molecular da sacarose (PM = 342) fica sendo 95% dos pesos moleculares da
Y = 2,41 X + 0,004
R
2
= 99,9%; Q
2
= 99,9%
36
glicose e da frutose juntas (PM = 360). A concentração de sacarose (%) das amostras
de méis foi determinada pela diferença estequiométrica entre açúcares totais (AT) e os
açúcares redutores (AR), usando a equação: SACAROSE (%) = 0,95 x (AT – AR).
A mesma relação foi aplicada para o cálculo da estimativa de desvio
padrão da sacarose aparente:
S
sacarose aparente
= |S
açúcares redutores
– S
açúcares totais
| x 0,95.
4.3.11. Frutose e Glicose
A frutose foi quantificada de acordo com Souza, Pereira, Santos (2007) pelo
reagente de Seliwanoff. Este método é uma adaptação do procedimento descrito por
Morita e Assumpção (2007) que é composto pelas seguintes soluções: solução (I): 2,5 g
de 1,3-benzenodiol em 50 mL de etanol a 95% e solução (II): Etanol a 95% acidificada
(pH 3) com H
2
SO
4
. A mistura de I e II foi denominada de reagente de Seliwanoff. Neste
método a frutose, reage especificamente, através de reações de desidratação levando à
formação de derivados de furfural que se condensam com o 1,3–bezenodiol, produzindo
compostos com coloração rósea-avermelhados. A intensidade desta coloração medida a
486 nm é diretamente proporcional à concentração de frutose total presente na solução
original. Como na composição há ácido sulfúrico e a reação ocorre sob aquecimento a
100 ºC, as moléculas de sacarose são hidrolisadas gerando glicose e frutose. A frutose é
especificamente detectada pelo reagente. Está reação não deve ultrapassar os 3
minutos a 100 ºC, pois em aquecimento prolongado a glicose, mesmo na forma
piranosídica que é estável, pode se desidratar, apresentando resultado falso-positivo
para frutose.
A curva analítica foi traçada por meio da preparação de uma solução de frutose
cuja concentração variou no intervalo de 0,1 a 1,5 mg/mL. Alíquotas de 0,2 mL foram
37
retiradas de cada solução e transferidas para tubos de ensaio junto com 4 mL do
reagente de Selliwanoff. Os tubos foram mantidos em um banho-maria a 100 ˚C
durante 3 minutos, em seguida as amostras foram analisadas no espectrofotômetro
(Genesys-10uv) a 486 nm. A curva de quantificação foi traçada com os valores de
absorbância versus as concentrações de frutose, em mg/mL (Figura 4).
Concentração de frutose (mg/mL)
ABS
1,61,41,21,00,80,60,40,20,0
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Figura 4: Curva analítica para quantificação de frutose
Para a quantificação da frutose nos méis de abelhas foi preparada uma solução
de 0,1 mg/mL e em seguida alíquota de 0,2 mL desta solução foi transferida para um
tubo de ensaio e misturada com 4 mL do reagente, os quais foram colocados nas
mesmas condições descritas acima.
Como a sacarose é hidrolisada nas condições experimentais, liberando uma
molécula de frutose e outra glicose, sendo detectada pelo reagente de Seliwanoff a
molécula de frutose. Este método permitir quantificar o teor de frutose total, o qual é
representado pela equação a seguir:
Y=0,644 X – 0,0217
R
2
= 99,8% Q
2
= 99,8%
38
O teor da frutose total FT (%m/m) = (frutose livre + frutose presente na sacarose
que foi hidrolisada).
Para obter somente o teor de frutose livre (FL) foi utilizado a seguinte equação:
FL (%m/m) = (frutose total – frutose da sacarose hidrolisada)
A concentração de glicose livre (GL) foi obtida utilizando a fórmula: GL (%m/m) =
(açúcares redutores – frutose livre).
4.4. Determinação de minerais por Espectrometria de Emissão Óptica com
Plasma acoplado Indutivamente (ICP OES)
4.4.1. Principio da Técnica
A espectrometria de emissão óptica em plasma é uma técnica de análise
multielementar sequêncial/simultânea que é baseada no principio de emissões de
radiação dos elementos constituintes da amostra, em um plasma, que pode ser
definido como um gás parcialmente ionizado, onde coexistem cátions Ar
+
, elétrons e
átomos neutros de Ar. Os espectrômetros de emissão óptica em plasma com
acoplamento indutivo são compostos basicamente por um sistema de introdução de
amostras, tocha de quartzo para geração do plasma, um gerador de rádio freqüência,
um sistema de gás argônio e um sistema óptico para o processamento do sinal
analítico e um sistema computacional para o controle do equipamento (BOSS,
FREDEEN, 1999; BOUMANS, 1987; MONTASER, GOLIGHTLY, 1992)
O gerador de rádio-freqüência (RF) é um dispositivo elétrico empregado como
fonte de potência e tem a função de sustentar o plasma (BOSS, FREDEEN, 1999;
BOUMANS, 1987)
O sistema de nebulização é composto, em geral, por um nebulizador e uma câmara
de nebulização. O nebulizador produz um aerossol da amostra, que é conduzido
39
ao plasma pela câmara, a qual favorece a introdução apenas das gotas de menor
volume (BOSS, FREDEEN, 1999; BOUMANS, 1987).
A tocha é um dispositivo de quartzo onde se forma o plasma, é constituída por
três tubos concêntricos por onde passam os fluxos do argônio principal, auxiliar e
nebulizador. O fluxo do argônio principal é responsável pela manutenção do plasma e
proteção das paredes da tocha contra a fusão; o fluxo nebulizador introduz a amostra
no plasma e o fluxo auxiliar tem a função de direcionar o aerossol da amostra para
dentro do plasma (BOSS, FREDEEN, 1999; BOUMANS, 1987; SKOOG, LEARY,1992).
4.4.2. Preparo das amostras: digestão assistida por microondas
Uma massa aproximadamente de 1 g de mel foi pesado e em seguida
adicionado uma mistura de 2,0 mL de HNO
3
concentrado e 2,0 mL de H
2
O
2
a 30% v/v
de acordo com Mendes, Baccan, Cadore (2006). A mistura foi submetida ao programa
de aquecimento em forno de microondas fechado (CEM-Mars-Xpress, 2008) nas
condições de operação apresentadas na Tabela 3. A solução resultante foi diluída com
água desionizada para 25,0 mL em um balão volumétrico antes de ser analisados por
ICP OES.
Tabela 3: Condições de operação para digestão em forno de microondas fechado
Etapas 1 2 3 4 5*
Tempo (min.) 1 2 5 5 20
Potência(W) 248 4 248 400 0
*Ventilação durante 20 min (etapa de resfriamento)
40
4.4.3. Quantificação dos elementos minerais
Os minerais foram analisados por Espectrometria de Emissão Óptica com
Plasma acoplado Indutivamente (ICP OES), (Modelo Vista-MPX CCD simultâneo axial,
VARIAN) equipado com um sistema de amostragem automático (SPS-5). As condições
de operação e especificações do equipamento estão descritos na Tabela 4 ( pág. 41).
O controle das condições operacionais do ICP-OES foi realizado com o software ICP-
Expert Vista-Varian .
Os elementos (minerais) determinados foram: Al (396, 152 nm), Ba (455,403
nm), Cr (267,716 nm), Cu (327,395 nm), Fe (239,562nm), Mn (257,610 nm), Ni
(231,604 nm), Ti (336,122 nm), Pb (220,353 nm), K (766,491 nm), Ca (315,887nm), Mg
(279,553 nm), Na (588,995 nm), Co (238,892 nm), Sr (421,552 nm) e Zn (213,857nm).
Os limites de quantificação dos elementos no ICP OES de cada elemento estão
apresentados no quadro 2 (pág. 41).
41
Tabela 4: As especificações e as condições gerais de operação do ICP OES
CARACTERÍSTICAS CONDIÇÕES INSTRUMENTAIS
Radio Frequencia do Gerador 40 MHz
Detector
CCD (70908 pixels em arranjos
lineares)
Diametro Interno do Tubo Central da
Tocha
2,3 mm
SISTEMA ÓTICO
Policromador
Grade de difração echelle + prisma de
Dispersão de CaF
2
Densidade da Grade de Difração 95 linhas mm
-
1
Faixa de Comprimentos de Onda 167 – 785 nm
Distancia Focal 400 nm
Fenda de Entrada Altura = 0,029 mm; Largura = 0,051 mm
SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE
AMOSTRAS
Camara de nebulização Ciclônica
Nebulizador Concêntrico
PARAMETROS OPERACIONAIS
Potencia Aplicada 1,0 KW
Tempo de Integração do Sinal 1,0 s
Vazão do Gás do Plasma 15 L/min
Quadro 2: Limite de quantificação (mg/kg) no ICP OES para Al, Ba, Ca, Co, Cr, Cu, Fe,
K, Mg, Mn, Ni, Na, Pb, Sr, Ti e Zn
Al 0,7 Cr 0,04 Mg 0,3 Pb
0,5
Ba 0,2 Cu
0,1 Mn 0,5 Sr 0,2
Ca
0,9 Fe 0,1 Ni 0,1 Ti 0,2
Co
0,1 K 0,3 Na 0,4 Zn 0,5
42
4.5. Análise dos compostos voláteis do mel de abelha por Cromatografia Gasosa
acoplada a Espectrometria de Massas (CG/EM)
4.5.1. Isolamento dos compostos voláteis
A técnica empregada foi de extração seletiva por solvente orgânico, nesta
técnica foi utilizado 2 mL do mel de abelha, ao qual foi adicionado 1 mL de água
desionizada e 2 mL de hexano grau HPLC. Esta mistura foi agitada por 10 minutos e
deixada em repouso durante 15 min para separação das fases. Em seguida, foi
retirado o sobrenadante e centrifugado a 5000 RPM por 10 minutos, por duas vezes.
A fração com os voláteis foram transferidos para um eppendorf de 2 mL e, enviados
para análise em CG/EM.
A fração orgânica não foi tratada com Na
2
SO
4
anidro para não induzir o “salting
out” e se correr o risco de perder os voláteis do solvente, já que a quantidade de água
dispersa nesta fração era muita baixa.
4.5.2. Análise dos voláteis por CG/EM
Os voláteis foram analisados em cromatógrafo de fase gasosa (Focus) acoplado
com espectrômetro de massas (Thermo, modelo DSG II). Alíquotas de 0,1 µL da
amostra foram injetadas, nas seguintes condições:
Temperatura do injetor: 250 °C; Fonte de íon: 200 °C; Injeção tipo Splitless;
coluna DB5-MS 30 m x 0,25 µm x 0,25 mm DI; programação de temperatura iniciado
em 60 °C com acréscimo de 3 °C/min. até 240 °C. A velocidade do gás de arraste foi
de 32 cm/s. O espectro de massa operou pela técnica de impacto eletrônico a 70 eV
(IE) com varredura de 39-400 U.M.A.
43
4.5.3. Identificação dos constituintes voláteis do mel
Os espectros de massas obtidos para os compostos voláteis foram comparados
com a biblioteca de dados e os índices de Kovats obtidos experimentalmente
confrontados com os descritos na literatura. Para obtenção dos índices de retenção
(relativo aos Índices de Kovats), uma mistura de padrões de alcanos (C9-C20) foi
preparada usando-se hexano como solvente. Co-injeções da amostra e da mistura dos
padrões forneceram os valores experimentais dos índices de retenção nas condições
cromatográficas (ADAMS, 2007).
4.6. Investigação da flora microbiana do mel
Este estudo buscou o isolamento de leveduras naturalmente ocorrentes com
potencial de fermentação do mel de abelha, que apresentasse um bouquet aromático
diferenciado, além do que, fosse resistente principalmente ao efeito da concentração
do etanol e dos açúcares. Visto que a fermentação do mel com leveduras comerciais
(Saccharomyces cerevisiae) apresentam aroma desagradável provalvelmente por não
estarem adaptadas às condições de estresse do mel. Nesta investigação foi utilizada
10 amostras de méis (M1 a M10), estas apresentam descritas no quadro 1 (pág. 24).
4.6.1. Contagem de bolores e leveduras
Foram realizadas as contagens de bolores e leveduras utilizando como meio de
cultura GPY (glicose a 20 g/L, peptona a 5 g/L e extrato de levedura a 5 g/L) disposto
em placas de Petri descartáveis (90 x 15 mm). Para o preparo das amostras, foi
pesado assepticamente 1,0 g de mel e transferido para um tubo de ensaio (20 x 1,5
cm) com tampa contendo 9 mL de uma solução de NaCl 9 g/L, previamente
esterilizados a 121
o
C (1 Kgf/cm
2
) por 15 minutos. A homogeneização da amostra foi
44
realizada com agitação no vortex, esta suspensão foi denominada de “solução mãe”. A
partir desta solução foram preparadas as diluições: 10
-1
, 10
-2
e 10
-3
. Após as diluições
prontas, foram inoculados 0,1 mL de cada diluição sobre a superfície do GPY em
placas de Petri (análise em triplicata). Com o auxílio de alça de Drigalski, o inóculo foi
espalhado cuidadosamente por toda superfície do meio, até sua completa absorção. As
placas foram incubadas invertidas, à temperatura ambiente, por 5 dias.
Nos experimentos foi usado o antibiótico cloranfenicol dissolvido em etanol, o
mesmo não sofreu nenhum processo de esterilização e foi adicionado ao meio de
cultura no momento do plaqueamento.
A contagem das colônias seguiu as normas descritas no Anexo I
“Procedimentos para a contagem de colônias”. Os resultados foram expressos em
UFC/g (unidades formadoras de colônias por grama de mel).
4.6.2. Isolamento e preservação das colônias de leveduras
Após o crescimento das colônias (Figura 5, pág. 45), com características
macroscópicas de levedura foram semeadas, com auxílio de uma alça estéril para
placas de Petri contendo meio sólido GPY adicionado do antibiótico clorafenicol na
concentração de 500 mg/L de meio. As placas foram colocadas em estufa a 30 ºC
durante 72 horas.
O mesmo procedimento foi feito para o isolamento das colônias de fungos
filamentosos.
Todos os isolados foram preservados, os fungos em glicerol 5% v/v à 0-5
°C, e as leveduras em glicerol 15 % m/v à -20 ºC para identificações das colônias de
leveduras.
45
Figura 5: Colônias de leveduras após 72 horas de crescimento a 30 ºC
4.6.3. Identificação das colônias de leveduras por técnica de biologia molecular
As leveduras isoladas de código (L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11,
L12, L13, L14, L15, L16, L17, L18, L19, L20 e L21) foram identificadas no laboratório
de Polimorfismo de DNA da UFPA.
4.6.3.1. Extração do DNA
Para a extração do DNA, foi utilizado o protocolo adaptado que utiliza fenol-
cloroformio (SAMBROOK, FRITCH, MANIATIS, 1998), conforme descrito a seguir.
Aproximadamente 0,1 g de biomassa foi pesado em seguida tranferido para um
eppendorf de 1,5 mL. Foram adicionados 300 µL de tampão e em seguida foi feita a
homogeneização (STE) e 300 µL de tampão de lise (SDS 10% pH 7.2), 30 µL de
RNAse (10 mg/mL) para digerir o RNA. Esta amostra foi incubada à 37ºC em contínua
agitação por uma hora. Em seguida, foi adicionado 30 µL de proteinase K (10 mg/mL) e
deixada em over night a 56 ºC em contínua agitação. Após, foi adicionado 500 µL de
fenol clorofórmio álcool isoamil (respectivamente na seguinte proporção 25:24:1) e
agitado cuidadosamente por 5 minutos até completa homogeneização. Em seguida, foi
centrifugado por 5 minutos à 13.000 RPM. Então, foi transferido o sobrenadante para
46
um tubo limpo, cuidadosamente, para não transferir juntamente a camada de proteína.
E adicionado igual volume de clorofórmio álcool-isoamil (500 µL) e foi agitado
cuidadosamente por 5 minutos até completa homogeneização. Posteriormente, foi
submetido a centrifugação à 13.000 RPM por 5 minutos, promovendo uma separação
do material em 3 fases. Novamente foi transferido, cuidadosamente, o sobrenadante
para um tubo limpo, de forma que a camada intermediária não fosse removida.
Em seguida foi adicionado 100 µL de acetato de sódio 3 M pH 4,8 e 500 µL de
álcool isopropílico. Esta mistura foi agitada suavemente por aproximadamente 2
minutos até a visualização da nuvem de DNA. Em seguida, foi transferido então a
“nuvem” para um tubo eppendorf de 1,5 mL, com auxilio de uma pipeta.
Posteriormente, foi centrifugado por 2 minutos a 13.000 RPM, para que o DNA se
prendesse ao fundo do tubo. Depois, o sobrenadante foi desprezado e em seguida
adicionado 500 µL de etanol 70%, sendo centrifugado por 2 minutos nas mesmas
condições acima. Então, foi descartado o álcool e em seguida foi submetido a uma
temperatura 37 ºC em estufa por aproximadamente 15 minutos. 100 µL de TE (Tris
EDTA) foi adicionado. E deixado na estufa a 37 ºC para diluir a biomassa.
4.6.3.2. Visualização em gel de Agarose 1%
A detecção e visualização do DNA utilizado na etapa de amplificação serão
realizadas através de corridas eletroforéticas. A migração eletroforética do DNA é
amplamente empregada em técnica de biologia molecular, para separar, isolar e
manipular fragmentos de DNA, em face de seus tamanhos, sequencias ou formas.
(MILLS, FRAMKLIN, TAYLOR, 1999).
47
4.6.3.3. Reação em Cadeia de Polimerase – PCR
Para amplificar o DNA das leveduras, foram realizadas reações de PCR
utilizando o kit da Paq em um volume final de 25,15 µL, contendo 0,5 µL (10 ng) de
DNA molde; 5 pmols do iniciador ITS2F (5’-GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC-3’) e 5
pmols do iniciador ITS2R (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’), 2,5 µL de tampão,
200 mM de DNTP e 5U da enzima taq. Foi utilizado termociclador (Peltier Thermal
Cycler – MJ Research) de acordo com a programação a seguir:
14 ciclos 95 ºC - 2min; 95 ºC - 30 seg 61,3 ºC - 30 seg 0,5 ºC a cada 30 seg
até 54,3 ºC; 72 ºC - 40 seg
19 ciclos 95°C - 30 seg; 54,3°C - 30 seg; 72°C - 30 seg; 72°C - 5 min
Em todos os experimentos foi realizado um controle negativo (sem DNA). Após a
reação, foi utilizado 5 µL do produto da PCR para a observação em gel de agarose 1,0
% (m/v) para visualização de fragmentos de aproximadamente 400 pares de bases.
O seqüenciamento foi realizado direto da PCR utilizando os mesmos primers
utilizados na PCR em seqüenciador 3130 da Applied Biosystems.
4.7. Análise Estatística
As estimativas de desvio padrão (S) dos valores de cada parâmetros
químicos e bioquímicos, assim como para os terores de minerais foram calculadas
através da fórmula S = (∑(x
i
– x
m
)
2
/(N-1))
0,5
Para avaliação dos dados obtidos através de estatística multivariada foi
empregada Análise de Componentes Principais (ACP) e Análise Hierárquica de
Agrupamento (AHA), utilizando o software Meet MINITAB (2004).
48
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização química e bioquímica
Os resultados (média ± desvio padrão) das análises físico-químicas e
bioquímicas das 10 amostras de méis encontram-se descritos na Tabela 5, pág. 49. Os
valores obtidos foram comparados com os limites estabelecidos na Legislação
brasileira (BRASIL, 2000) e internacional (CODEX, 2001).
49
Tabela 5. Parâmetros físico-químicos e bioquímicos (
a
média ±
b
desvio padrão) das 10 amostras de méis produzidos no Estado do
Pará
Amo AT AR Sac Fru Gli Ph Aci Umi Cin AD S.I Prot HMF Cor
M1
77,7± 1,8 74,2±2,0 3,3±0,2
36,5±1,4 37,6±1.0 4,6±0,1 23,9±1,8 17,0±1,7 0,28±0,01 10,9±0,8 0,73± 0,03 0,04±0,01
9,0±1,6 4,7 (branco-água)
M2
76,8±1,7
71,3±1,8 5,2±0,1
26,9±1,2 44,4±1,4 4,4±0,3 47,4±1,9 18,2±1,8 0,30±0,01 20,0±2,4 0,27± 0,02 0,06±0,01
50,2±2,4 13,7 (extra-branco)
M3
76,5±2,0
73,2±1,6 3,1±0,4
37,1±1,5 36,1±1,3 4,4±0,2 35,1±2,9 17,2±1,2 0,33±0,02 18,7±0,9 0,53±0,02 0,07±0,01
9,3±0,9 15,9 (extra-branco)
M4
79,0±1,9
75,0±1,5 3,8±0,4
38,7±0,7 36,2±1,2 4,3±0,1 36,3±12,2
19,9±2,6 0,12±0,01 30,0±1,9 0,38±0,01 0,07±0,01
20,1±1,9 22,2 (branco)
M5
76,6±1,0
73,2±1,3 3,2±0,3
37,6±2,1 35,5±1,2 4,3±0,1 36,6±2,7 13,3±2,1 0,19±0,01 19,0±2,0 0,54±0,02 0,07±0,01
0,15±0,02
28,5 (branco)
M6
76,5±1,2
71,6±2,2 4,7±0,9
35,8±1,3 35,7±0,5 4,4±0,2 38,2±3,9 17,2±2,3 0,24±0,02 30,0±3,1 0,55±0,02 0,08±0,01
9,7±1,4 20,0 (branco)
M7
75,7±1,2
72,4±2,1 3,1±0,8
44,7±2,0 27,7±0,1 4,5±0,2 48,6±2,4 19,2±2,9 0,21±0,01 24,7±2,9 0,54±0,02 0,14±0,02
11,2±1,9 49,7 (ambar extra-
claro)
M8
77,8±1,8 75,7±1,4 2,0±0,4
32,2±1,8 43,5±1,0 4,0±0,2 33,9±2,1 18,2±1,1 0,25±0,01 25,7±3,2
0,31±0,01 0,09±0,01
12,7±0,4 15,1 (extra-branco)
M9
74,9±1,2 71,8±1,3 2,9±0,1
41,2±0,4 30,5±0,9 3,6±0,1 85,1±3,6 18,5±2,1 0,26 ±0,02 61,2 ±2.2
0,06±0,01 0,1±0,01 11,3±1,3 55,3 (ambar-claro)
M10
65,9±1,7
64,0±
1,1
1,8±0,5
42,5±
0,6
21,5±
0,7
3,8±
0,1
111,2±4,0
32,7±
1,3
0,28 ±0,06 **
0,24±0,02 0,05±0,01
0,15±0,02
126,9 (ambar-escuro)
Média
75,74
72,24
3,31
37,32
34,87
4,20
49,63
19,14 0,246
26,7 0,41 0,07 13,38 35,2
DP (%)
3,64
3,24
1,05
5,12
6,88
0,32
27,19
5,09 0,06 14,3
0,19 0,028 14,18 36,0
Min
65,90
64,00
1,80
26,90
21,50
3,60
23,90
13,30 0,1
10,9 0,05 0,04 0,150 4,75
Máx
79,00
75,70
5,2
44,70
44,40
4,60
111,2
32,70 0,33 61,2 0,73 0,14 50,2 126,9
1
Legislação
*
³
65,0
£
6,0
*
*
*
£
50,0
£
20,0
£
0,6
³
8
£
0,3
*
£
60,0
*
2
Legislação
*
³
60,0
£
5,0
*
*
*
£
50,0
£
20,0
* *
£
0,1
*
£
80,0
*
a
: média das três repetições; Amo: Amostra; AT: Açúcares redutores totais (%); AR: Açúcares redutores (%); Sac: Sacarose (%); Fru: Frutose (%); Gli: Glicose (%); Aci: Acidez
livre (meq.kg
-1
); Umi:Umidade (%); Cin: cinzas (%); S.I: Sólidos Insoluveis em água (%); Prot: Proteína (%); AD: Atividade Distásica (Gothe); HMF: Hidroximetilfurfural (mg/kg) e
cor (mmPfund); DP: Desvio padrão em percentagem;
1
Legislação Brasileira (BRASIL, 2000);
2
Legislação Internacional (CODEX, 2001); * ausência de limites nas legislações;
** não detectado,
b
Desvio padrão da média (a unidade do desvio está de acordo com a unidade do parâmetro) .
50
5.1.1. Umidade
A umidade do mel depende de vários fatores, como a época da colheita, o grau
de maturidade alcançado e fatores climáticos (SILVA et al., 2009). Os teores de
umidade nas amostras de méis investigadas variaram de 13,3 a 32,7% com média de
19,14 ± 5,09% (Tabela 5, pág. 49). Exceto para a amostra M10 (mel de Melipona
rufiventris, município de Altamira), todos os outros méis avaliados apresentaram teor de
umidade abaixo de 20% que é o limite máximo permitido nas legislações nacional
(BRASIL, 2000) e internacional (CODEX, 2001). O teor de água na amostra M10 não
está em conformidade com as legislações vigente para méis de Apis. No entanto, está
dentro do limite proposto por Villas-Bôas e Malaspina (2005) para méis de meliponíneo
que é de 35%, porém o alto teor de água pode levar a fermentação indesejável do mel
durante o armazenamento, causada pela ação de leveduras (SAXENA, GAUTAM,
SHARMA, 2009), podendo diminuir a sua vida útil de prateleira (EVANGELISTA-
RODRIGUES et al., 2005).
Estudos com méis de abelha do gênero Melipona em diferentes regiões do
Brasil relatam valores de umidade nas faixas de 26,8 a 43,8% (SOUZA et al., 2009);
24,8 a 30,5% (ALMEIDA-MURADIAN, MATSUDA, BASTOS, 2007). Estes valores são
considerados elevados quando comparados com a variação para méis de Apis
mellífera que é de 15,6 a 20,6% (ABREU et al, 2008); 14,7 a 19,8% (WELKE et al.,
2008); 15, 0 a 20,3% (MORETI et al., 2009).
5.1.2. Hidroximetilfurfural (HMF)
Os níveis de HMF dos méis analisadas variaram de 0,15 a 50,2 mg/Kg de mel
(média = 13,38 mg/Kg) (Tabela 5, pág. 49), estando todas as amostras em
conformidade com a Legislação Nacional que estabelece um máximo de 60 mg/Kg e a
51
Legislação Internacional com máximo de 80 mg/Kg. Os índices de HMF encontrado em
méis do Estado do Rio Grande do Sul, verificados por Welke et al. (2008) são
semelhantes aos observados neste trabalho com uma variação de 0,15 a 46,3 mg/Kg,
mas inferiores ao observados por Mendonça et al. (2008) que descreveram uma
variação de 1,9 a 19,1 mg/Kg (média = 8,3 mg/Kg), Sodré et al. (2007) que registraram
uma variação de 1,75 a 126,5 mg/kg (média = 31,45 mg/kg), Silva et al. (2009) que
obtiveram uma variação de 1,75 a 32,75 mg/kg (média = 9,41 mg/kg), e Baroni et al
(2009) que encontraram valores médios de 0,54 mg/kg e 2,94 mg/kg para méis do
Norte e Sul de Córdoba (Argentina), respectivamente.
5.1.3. Cor
As cores observadas para as 10 amostras de méis investigadas estão dentro
da norma vigente, e podem variar desde o branco-água até âmbar-escuro (BRASIL,
2000). Pelos resultados encontrados na Tabela 5 (pág. 49), constatou-se uma
predominância da cor extra-branco (30%) e branco (30%), sendo ainda verificadas
amostras de cor branco-água (10%), âmbar-extra-claro (10%) e âmbar-claro (20%).
Diferente dos resultados relatados por Moreti et al. (2006) para méis de diferentes
estados brasileiros, onde verificou que houve a predominância da cor âmbar-claro para
méis dos Estados da Bahia, Tocantins e Santa Catarina, já para o Estado do Piauí a
predominância foi para a cor âmbar-extra-claro. Recentemente, Sodré et al. (2007)
verificou a predominância da cor âmbar-claro para méis do Estado do Ceará.
5.1.4. Cinzas e sólidos insolúveis em água
O teor de cinza é um indicador do conteúdo mineral e também considerado
como um critério de qualidade que indica a possível origem do mel (SILVA et al., 2009;
52
SAXENA, GAUTAM, SHARMA, 2009). Os valores de cinzas variaram de 0,01 a 0,33%
(média = 0,246 ± 0,06%) (Tabela 5, pág. 49), e estão de acordo com o limite máximo
de cinzas nos méis, o qual é 0,6% pela legislação brasileira (BRASIL, 2000), indicando
a cristalinidade das amostras de mel (SILVA et al., 2009). Os valores de cinzas foram
próximos aos determinados por Sodré et al. (2007) que verificou média de 0,18% para
méis do Estado do Ceará e Arruda et al. (2004) que observaram uma variação de 0,127
a 0,246% com valor médio de 0,185% para méis do mesmo Estado.
O teor de sólidos insolúveis indica a fração de partículas em suspensão de cera,
e/ou insetos e restos vegetais nos méis (MENDES et al., 1998). Os valores nas
amostras de méis investigadas variaram de a 0,05 a 0,73% (média = 0,41%±0,19%
(Tabela 5, pág. 49). Comparando com o mínimo estabelecido na Legislação Nacional
(0,3%) e na Legislação Internacional (0,1%) 70 e 90% dos méis não estão em
conformidade, respectivamente. Estes valores encontram-se acima dos observados por
Evangelista-Rodriguês et al. (2005) para méis do Estado da Paraíba e os encontrados
por Welke et al. (2008) para méis do Estado do Rio Grande do Sul.
5.1.5. Acidicidade e pH
Acidicidade dos méis é devido à presença de ácidos orgânicos em equilíbrio
com os seus ésteres, lactonas correspondentes e íons inorgânicos, como o fosfato ou
sulfato (TERRAB et al., 2004) que são encontrados tanto nas plantas visitadas pelas
abelhas, como também, nas secreções produzidas pelas próprias abelhas.
Os valores encontrados de ácidos orgânicos para as amostras de méis
paraenses variaram de 23,9 a 111,2 meq/kg (média = 49,63 ± 27,19%) (Tabela 5, pág.
49). As amostras M9 a M10 apresentaram acidez acima do valor especificado nas
normas nacional e internacional para méis de Apis que é, de no máximo 50 meq/kg. No
entanto, estas normas não se aplicam a amostra M10 (Mel de Melipona rufiventris),
53
pois ainda não há uma legislação específica para mel de abelha sem ferrão. Entretanto,
Villas-Bôas e Malaspina (2005) propõem um máximo de 85 meq/kg para este tipo de
mel. De acordo com Terrab et al. (2004), a acidez elevada pode está relacionada com
início da fermentação do mel, bem como a ação de bactérias durante a maturação do
mel. A variação nos valores de acidez observada neste trabalho é inferior ao obtido por
Moreti et al. (2009) que encontraram valores de 6,0 a 48,0 meq.kg
-1
para amostras de
méis do Estado do Ceará e Mendonça et al (2008) relata valores na faixa de 15,1 a
47,0 meq.kg
-1
para amostras méis de São Paulo.
O pH do mel de abelha é afetado pelas condições durante a extração e
armazenamento do mel, o que também influencia a textura, a estabilidade e a vida útil
de prateleira (TERRAB et al., 2004, SILVA et al., 2009). O pH apresentou valores na
faixa de 3,6 a 4,6, com valor médio de 4,2 (Tabela 5, pág. 49). Os valores observados
neste trabalho são próximos ao obtido por Arruda et al. (2004), Baroni et al. (2009),
Marchini et al. (2007), Mendonça et al. (2008), Saxena, Gautam, Sharma (2009), Silva
et al. (2009), Terrab et al. (2004) e Welke et al. (2008).
5.1.6. Proteínas e Atividade diastásica
O conteúdo de proteínas encontrado variou de 0,04 a 0,14% (média = 0,07 ±
0,02%) (Tabela 5, pág. 49). Essa característica não apresenta valores de referência
estabelecidos nas legislações vigentes. Os valores para proteínas obtidos são
semelhantes aos resultados observados por Arruda et al. (2004) e Sodré et al. (2007)
que registraram variação de 0,118 a 0,254% e 0,13 a 0,71%, respectivamente.
A atividade diastásica das amostras de méis de Apis mellífera (M1 a M9) variou
de 10,9 a 61,2 Gothe (média = 26,7 Gothe) (Tabela 5, pag. 49). Estes valores estão em
conformidade com o mínimo estabelecido pela norma brasileira e européia que é de 8,0
Gothe. Estes valores são próximos aos registrados por Sodré et al. (2007a) em
54
amostras de méis do Estado do Ceará, que obtiveram uma variação de 5,3 a 43,39
(escala de Gothe) com valor médio de 16,48 (escala de Gothe) e Marchini et al. (2004)
que descreveram valores entre 11,51 e 44,84 (escala de Gothe) (média = 22,43 Gothe)
para méis do Estado do Tocantins.
No entanto, a amostra M10 (mel de Melipona rufiventris) não apresentou
atividade diastásica. Souza et al. (2009) estudaram amostras de méis de espécies do
gênero Melípona provenientes de diferentes localidades do Estado da Bahia e não
detectaram valores para atividade diastásica, assim como Pereira (2007) não registrou
valores para diastase em seu estudo com mel de Melipona fasciculata.
5.1.7. Açúcares redutores totais, açúcares redutores e sacarose
Os açúcares redutores totais, açúcares redutores e sacarose variaram de 65,9
a 79,0% (média = 75,74 ± 3,64%), 64,0 a 75,7% (média = 72,24 ± 3,24%) e 1,8 a 5,2%
(média = 3,31 ± 1,05%), respectivamente (Tabela 5, pág. 49). Destas características,
apenas açúcares redutores totais não existe valor estabelecido nas legislações
vigentes (BRASIL, 2000 e CODEX, 2001). Dentre os resultados obtidos, apenas a
amostra M10 (mel de Melipona rufiventris, município de Altamira) não atingiu o valor
mínimo de açúcares redutores (65%) permitido pela legislação nacional (BRASIL,
2000) para méis de Apis. No entanto, está dentro do limite mínimo proposto por Villas-
Bôas e Malaspina (2005) para méis de meliponíneo que é de 50%. Todas as amostras
estão dentro do limite estabelecido pela legislação internacional, que estabelece um
mínimo de 60%. Para os valores de sacarose, todas as amostras não excedem o valor
máximo (6%) permitido pela Legislação Brasileira (BRASIL, 2000). Entretanto, a
amostra M2 (mel de Apis mellífera, município do Moju) apresenta valor acima do
estabelecido pela Legislação Internacional (CODEX, 2001) que permite máximo de 5%.
55
Marchini et al. (2007) analisando amostras de méis de flores de eucalipto do
Estado de São Paulo, encontrou valores variando de 67,8 a 88,3% (média = 74,87 ±
3,57%), 67,7 a 77,1% (média = 72,34 ± 2,46%), 0,1 a 15,2% (média = 2,4 ± 2,94%),
para açúcar redutores totais, açúcar redutores e sacarose, respectivamente. Ainda
neste trabalho este autor estudou amostras de méis de flores de laranjeira, e observou
variação de 67,8 a 81,6% (média = 76,53 ± 2,4%), 66,5 a 78,2% (média = 74,14 ±
2,51%), 0,3 a 6,8% (média = 2,26 ± 1,44%), para açúcares redutores totais, açúcares
redutores e sacarose, respectivamente.
Almeida-Anacleto e Marchini (2004) encontraram para açúcares redutores uma
variação de 66,7 a 78%, com valor médio de 73,1% semelhante aos observados neste
trabalho e para sacarose uma variação de 0,2 a 11,4% com valor médio de 4,5%, em
méis produzidos em áreas de cerrado do município de Pirassununga, Estado de São
Paulo, enquanto Moreti et al. (2009) registraram para méis provenientes de vários
municípios do Estado do Ceará valores variando de 72,3 a 87,2% (média = 80,5%),
70,6 a 84,6% (média = 77,4%), 0,2 a 8,2% (média = 2,9%) para açúcares redutores
totais, açúcares redutores e sacarose, respectivamente.
5.1.8. Frutose e Glicose
Os conteúdos de frutose e glicose determinados variaram entre 26,9 a 44,7%
(média = 37,32 ± 5,12%) e 21,5 a 44,4% (média = 34,87 ± 6,88%), respectivamente
(Tabela 5, pág. 49). Para estes parâmetros não há valores de referência estabelecidos
tanto na Legislação Nacional quanto na Legislação Internacional. Estes valores
observados para frutose e glicose estão próximos aos determinados por Devillers et al.
(2004) que obtiveram para frutose uma variação de 37,9 a 42,59 % (média = 40,17%)
e para glicose 33,25 a 38,96% (média = 35,75%) e Finola, Lasagno, Marioli (2007)
verificaram valores variando de 33,0 a 48,4% (média = 41,1%) e 24 a 39,7% (média =
56
31,7%) para frutose e glicose, respectivamente, para méis multiflorais produzidos no
sul de Córdoba (Argentina). Enquanto, Baroni et al. (2009) estudando méis da mesma
região relataram valores médios de 35,9% e 30,9% para frutose e glicose,
respectivamente, os quais também são similares ao obtidos neste trabalho, e ainda são
próximos aos obtidos por Al et al. (2009), Almeida-muradian, Matsuda, Bastos, (2007),
Guler et al. (2007).
A quantificação da frutose, neste trabalho, foi realizada por um método químico
adaptado de Morita e Assumpção (2007). Este método descreve apenas análise
qualitativa e havia interferência de precipitado formado durante a reação. A
necessidade de realização de análise de frutose no campo, nos levou a desenvolver
um método que fosse de fácil realização e que pudesse ser adaptado como kit de
quantificação do referido açúcar. Por este motivo se adaptou este método o qual está
validado para a quantificação de frutose e pode ser utilizado como sistema padrão de
análise no campo.
Análises de frutose via HPLC, sem dúvida é necessário, entretanto esta prática
se torna inviável quando as amostras são processadas em locais distantes, onde não
se tem este tipo de equipamento. Além do que, é um equipamento com um custo
elevado para as comunidades e cooperativas de apicultores.
5.1.9. Análise multivariada utilizando dos parâmetros físico-químicos e
bioquímicos como variáveis
Para realizar a análise de ACP e AHA foram excluídos os parâmetros açúcar
redutores totais, pH, sólidos insolúveis em água e proteínas, pois foram altamente
correlacionados entre si ou com outras variáveis. Os dados foram todos centrados e
auto-escalados. A análise de componentes principais proporcionou um estudo
multivariado dos dados experimentais obtidos facilitando a visualização da correlação
57
entre as 10 amostras de méis de diferentes municípios do Estado do Pará e 10
parâmetros (variáveis) selecionados.
Os resultados da estimativa de variância (autovalores) são apresentados na
Tabela 6, onde se verifica que a primeira componente principal (CP1) explica 55,3% da
variância total dos dados, a segunda (CP2) 17,8% e a terceira (CP3) 11,5%. As CP1,
CP2 e CP3 juntas acumulam 84,7% da variância total.
Tabela 6. Estimativa da variância (autovalores) e porcentagem proporcional e
acumulativa da variância total (%) obtidos por componentes principais, considerando as
10 amostras de mel do Parál e os 10 parâmetros avaliados
Componentes
Principais
Autovalores % proporção
% acumulação
CP1 5,53
55,30 55,30
CP2 1,78
17,80 73,20
CP3 1,15
11,50 84,70
Observa-se no gráfico dos scores (Figura 6, pág. 58) que a CP1 é a
componente responsável pela separação das amostras do Sudoeste paraense
(amostras M9 e M10 de Altamira) das amostras do Nordeste paraense. A CP2 separa
as amostras de méis de abelha com ferrão das abelhas sem ferrão. Entretanto, para
esta discriminação ser mais confiável e conclusiva necessitaria de um estudo com mais
amostras de méis de abelha sem ferrão. Para verificar se realmente há possibilidade de
criar um modelo estatístico classificatório com base nos parâmetros físico-químicos e
bioquímicos para realizar uma discriminação do mel de abelha com e sem ferrão.
58
CP1 (53,3%)
CP2 (17,8%)
420-2-4-6
1
0
-1
-2
-3
Altamira (M10)
Moju (M2)
Altamira (M9)
Irítuia (M7)
Moju (M1)
Moju (M3)
São Miguel do Guamá (M4)
São Miguel do Guamá (M5)
São Miguel do Guamá (M6)
Ourém (M8)
Figura 6: Gráfico dos scores (10 amostras de mel de abelha de diferentes municípios
do Estado do Pará)
Observando os loadings de CP1, as variáveis mais importantes são açúcar
redutor, glicose, acidez, umidade e cor. Para CP2 são as variáveis HMF, açúcar redutor
e frutose, pois explicam a separação das amostras de méis de diferentes municípios do
Estado do Pará em mesorregiões (Sudoeste e Nordeste).
Observa-se na sobreposição dos gráficos dos scores (Figura 6) e loadings
(Figura 7) que os parâmetros responsáveis para a separação da amostra M10 das
demais são cor, acidez e umidade. Assim, como os parâmetros sacarose e HMF foram
responsáveis pelo afastamento da amostra M2, os conteúdos de frutose e cinzas foram
os parâmetros responsáveis pelo agrupamento das amostras M7 e M9.
Sudoeste paraense
Nordeste paraense
Abelha sem ferrão
59
CP1 (53,3%)
CP2 (17,8%)
0,40,30,20,10,0-0,1-0,2-0,3-0,4-0,5
0,50
0,25
0,00
-0,25
-0,50
Cor
Cinzas
Umidade
Acidez
Ativ. Diastásica
Glicose
Frutose
Sacarose
Açúcar Redutor
HMF
Figura 7: Gráfico dos Loading (10 parâmetros químicos e bioquímicos)
Estas observações obtidas através dos componentes principais são confirmadas
através da análise hierárquica de agrupamento (AHA), onde este recurso foi usado com
o propósito de verificar as similaridades e a disimilaridades entre as amostras com
base nos valores dos parâmetros químicos e bioquímicos das 10 amostras de méis
estudados. As tendências observadas através da CPs foram confirmadas através do
dendograma obtido através da análise de agrupamento hierárquico (Figura 8), onde se
observa a formação de dois grupos: grupo I (M7 e M9) e grupo II (amostras M1, M3,
M4, M5, M6 e M8) e as amostras M2 e M10 separadas dos grupos I e II. No entanto,
verifica-se que amostra M2 possui mais similaridade com os grupos I e II do que a
amostra M10. Este fenômeno deve-se ao fato de que a amostra M10, é um mel
produzido por abelha da espécie Melipona rufiventris diferente das demais amostras
que são de Apis Mellífera.
M2
M10
60
Amostras de mel de abelha de diferentes municípios do Estado do Pará
Distância Euclidiana
10297684531
8,95
5,96
2,98
0,00
Moju
(M1)
Moju
(M3)
São Miguel
(M5)
São Miguel
(M4)
Ourém
(M8)
São Miguel
(M6)
Irítuia
(M7)
Altamira
(M9)
Altamira
(M10)
Moju
(M2)
Figura 8: Dendograma das 10 amostras de diferentes municípios do Estado do Pará
5.2- Teores de minerais no mel de abelha
Os resultados da composição mineral (média ± desvio padrão) das amostras
de méis de diferentes regiões do Estado do Pará são apresentados na Tabela 7 (pág.
61).
61
Tabela 7: Valores médios (mg/Kg
± desvio padrão da média) dos elementos químicos das 10 amostras de méis de diferentes
municípios do Estado do Pará
M1 M 2 M 3 M 4 M 5 M 6 M 7 M 8 M 9 M 10
Al 1,19±0,12 0,71±0,04 2,9±0,15 1,68±0,02 1,07±0,01 1,09±0,02 0,93±0,01 3,34±0,30 0,85±0,02 1,14±0,15
Ba <LOQ <LOQ <LOQ nd Nd <LOQ <LOQ 1,18±0,01 <LOQ <LOQ
Cr 0,39±0,01 0,83±0,02 0,25±0,001
<LOQ <LOQ <LOQ nd nd 0,12±0,01 <LOQ
Cu 3,53±0,31 2,08±0,42 3,15±0,29 <LOQ <LOQ 1,66±0,24 <LOQ nd <LOQ nd
Fe 1,45±0,25 3,76±0,58 3,47±0,31 2,3±0,02 2,18±0,41 2,42±0,56 1,44±0,28 2,35±0,32 3,2±0,55 0,77±0,03
Mn nd nd 3,88±0,34 4,22±0,81 3,92±0,76 3,74±0,34 3,57±0,45 3,11±0,02 3,43±0,23 2,29±0,28
Ni 4,6±1,11 4,64±0,89 4,17±0,99 nd nd nd nd nd nd nd
Ti 0,54±0,05 0,51±0,02 0,43±0,02 0,56±0,02 0,44±0,00 0,35±0,02 <LOQ 0,51±0,02 0,40±0,02 0,61±0,01
Pb 0,62±0,03 1,3±0,02 0,72±0,02 nd nd nd nd nd nd nd
K 381,9±10,0
387,8±4,9 404±7,02 321,3±5,9 323,3±10,5
327,5±13,5
335,0±8,78
381,9±11,1
409,0±17,9
196,6±4,8
Ca 33,2±1,30 34,14±2,2 35,16±1,9 32,38±0,9 32,9±3,3 33,56±1,5 33,98±2,7 42,88±3,4 34,73±1,0 32,54±1,8
Mg 21,53±2,6 12,21±1,7 12,65±0,9 9,11±0,8 9,73±1,4 9,35±0,8 10,02±1,0 14,87±1,5 11,25±0,7 23,98±0,9
Na 47,43±3,7 48,98±4,9 53,1±2,7 52,59±1,5 50,35±3,8 53,78±2,9 61,51±5,9 61,23±4,0 53,65±2,3 52,89±3,9
Co 1,69±0,08 2,12±0,4 2,5±0,80 nd nd <LOQ <LOQ <LOQ nd nd
Sr 0,69±0,02 0,57±0,03 0,55±0,02 0,25±0,02 0,026±0,00
0,3±0,01 0,32±0,02 0,55±0,03 0,34±0,04 0,55±0,01
Zn 0,32±0,01 0,38±0,02 2,53±0,1 3,27±0,18 2,87±0,26 3,72±0,04 1,35±0,25 1,75±0,05 2,15±0,10 1,5±0,08
∑ 499,08 500,03 529,46 427,67 426,76 437,50 446,71 513,66 519,12 312,87
nd: não detectado (menor que o limite de detecção), LOQ (mg/kg): Limite de quantificação (Ba: 0,2; Cr: 0,04; Cu: 0,1; Ti: 0,2; Co: 0,1).
62
Um total de 16 elementos foram identificados e quantificados por ICP OES:
alumínio (Al), bário (Ba), cromo (Cr), cobre (Cu), ferro (Fe), manganês (Mn), níquel (Ni),
titânio(Ti), chumbo (Pb), potássio (K), cálcio (Ca), magnésio (Mg), sódio (Na), cobalto
(Co), estrôncio (Sr) e zinco (Zn).
As amostras do município de Moju foram as que apresentaram o maior número
de elementos químicos em sua composição e maior quantidade, acumulando uma
concentração mineral total de 499,08 mg/Kg; 500,03 mg/Kg e 529,46 mg/Kg
, para as
amostras M1, M2 e M3, respectivamente. Estes resultados estão correlacionados com
o teor de cinzas, uma vez que essas amostras apresentaram valores mais elevados
que as outras amostras em estudo (Tabela 5, pág. 49). Os elementos Al, Fe, Ti, K, Ca,
Mg, Na, Sr e Zn foram encontrados em todas as amostras. Estes resultados são
semelhantes aos relatados por Baroni et al. (2009) que encontrou os elementos K, Na,
Ca, Mg, Fe e Zn em todas as amostras de seu estudo.
O elemento químico quantitativamente majoritário foi o potássio. Este é
responsável por 75,17% do conteúdo total de mineral quantificado em méis paraense,
com uma concentração média de 346,80 mg/Kg e valor máximo de 409,01 mg/Kg
(Tabela 9, pág. 63). Os autores Baroni et al. (2009), Sodré et al. (2007), Terrab et al.
(2004), Hernández et al. (2005) e Silva et al. (2009) também apresentaram valores
onde o potássio foi o elemento químico mais abundante na composição mineral dos
méis. No entanto, os elementos químicos Ba, Cr, Pb e Sr estão presentes em
quantidades baixas, acumulando 0,025%, 0,034%, 0,057% e 0,09% do conteúdo de
mineral total, respectivamente.
Os elementos Cu, Ni e Zn em todas as amostras apresentaram valores
inferiores aos limites máximos estabelecidos pela Legislação Nacional (Tabela 8, pág.
63), enquanto as amostras M1, M2, M3 e M9 apresentam valores acima do
estabelecido na Legislação Brasileira para o cromo (Cr) (Tabela 8, pág. 63). As
63
amostras de méis da região do Moju (M1, M2 e M3) apresentaram valores para os
elementos Cu, Ni e Co e uma amostra da região de São Miguel do Guamá (M6)
apresentou valor para o elemento cobre (Cu), de acordo com Baroni et al. (2009). Há
evidências de que a presença desses metais são indicações de contaminações durante
o processamento de armazenamento ou transporte, devido à utilização de recipientes
de aço galvanizado.
Tabela 8: Médias dos valores, mínimos e máximos, valores estabelecidos pela
legislação brasileira, para os 16 elementos químicos estudados para as amostras de
méis das microrregiões do Estado do Pará
Elementos
químico
a
∑
a
Média±dp
b
CV (%)
a
Mínimo
a
Máximo
a
Legislação
Brasileira
1
Al 14,90 1,5 ± 0,28 60,50 0,715 3,34
*
Ba 1,18 1,18 ± 0,01 264,4 <LO Q 1,18
*
Cr 1,59 0,24 ± 0,02 162,3 <LOQ 0,83 < 0,1
Cu 10,42 2,6 ± 0,44 137,9 <LOQ 3,53 <10,0
Fe 23,34 2,33 ± 0,30 40,70 0,77 3,76
*
Mn 28,16 3,52 ± 0,21 56,00 nd 4,22
*
Ni 13,41 4,47 ± 0,15 161,3 nd 4,64 < 5,0
Ti 4,35 0,48 ± 0,04 31,20 <LOQ 0,61
*
Pb 2,64 0,88 ± 0,20 173,9 nd 1,30
*
K 3468,3 346,80 ± 20,0
18,12 196,6 409
*
Ca 345,47 34,55 ± 1,0 08,90 32,38 42,88
*
Mg 134,70 13,47 ± 1,65 38,85 9,11 23,98
*
Na 535,52 53,55 ± 1,50 8,64 47,43 61,51
*
Co 6,31 2,10 ± 0,23 163,9 <LOQ 2,50
*
Sr 4,15 0,42 ± 0,06 48,3 0,026 0,69
*
Zn 19,14 2,4 ± 0,36 57,75 <LOQ 3,72 < 50,0
nd: não detectado; * ausência de limites nas legislações;
a
mg/Kg;
b
Desvio padrão médio
(mg/kg); LOQ: ( Ba: 0,2; Cr: 0,04; Cu: 0,1; Ti: 0,2; Co: 0,1 e Zn: 0,5);
1
Legislação em vigilância
sanitária (1965) e Portaria Nº 685 (1998).
64
5.2.1. Análise Multivariada (ACP e AHA)
Para análise de componentes principais foi utilizado as 10 amostras de mel do
Estado do Pará e 16 os elementos químicos (Tabela 7, pág. 61). Resultados da
estimativa de variância (autovalores) são apresentados na Tabela 10, pode observar
que as três componentes principais foram responsáveis por explicar 81% da variância
total, o primeiro responsável por 42,7%, o segundo, por 20,5% e o terceiro por 17,7%
(Tabela 9 ).
Tabela 9: Estimação da variância (autovalores) e porcentagem proporcional e
cumulativa da variância total (%) obtidos por componentes principais, considerando as
10 amostras de mel do Estado do Pará e 16 elementos químicos (minerais)
Componentes
Principais
Autovalores
(Eigenvalue)
%
proporção
% acumulação
(Cumulative)
PC1 6,8 42,7 42,7
PC2 3,3 20,5 63,3
PC3 2,8 17,7 81,0
Nota-se no gráfico dos “scores” (Figura 9, pág. 65) que a primeira componente
principal é a responsável pela separação (discriminação) dos méis da região de Moju
dos méis das demais regiões. Verifica-se a formação de um grupo I, com as amostras
da região de Moju (M1, M2 e M3); um grupo II com as amostras M4, M5, M6, M7, M8,
M9 e M10. Entretanto, a amostra M8 apresentou uma dissimilaridade com o seu grupo.
65
PC1 (42,7%)
PC2 (20,5%)
3210-1-2-3-4-5
5
4
3
2
1
0
-1
-2
M3
M8
M1
M2
M10
M9
M7
M5
M6
M4
Figura 9: Gráfico dos scores (10 amostras de mel do Estado do Pará)
Observando a sobreposição dos gráficos dos scores (Figura 9) e loadings
(Figura 10, pág. 66) verifica-se que as variáveis mais importantes são cromo, cobre,
niquel, chumbo e cobalto e para CP2 são as variáveis alumínio, bário, cálcio e sódio,
pois explicam a separação em grupos das amostras de méis de diferentes municípios
do Estado do Pará.
Moju
66
CP1
CP2
0,40,30,20,10,0-0,1-0,2-0,3-0,4
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Zn
Sr
Co
Na
Mg
Ca
K
Pb
Ti
Ni
Mn
Fe
Cu
cr
Ba
Al
Figura 10: Gráfico dos Loadings (16 elementos químicos)
Estas observações obtidas através dos componentes principais são confirmadas
através da análise hierárquica de agrupamento (AHA). Na Figura 11 (pág. 67) observa-
se a formação de dois grupos: grupo I (M1, M2 e M3) e grupo II (M4, M5, M6, M7, M8,
M9 e M10). Nesta análise de agrupamento verifica-se que a amostra M8 faz parte do
grupo II, no entanto, apresenta maior disimilaridade entre as outras amostras.
67
Distância Euclidiana
81079654321
8,35
5,57
2,78
0,00
M1
M2
M3
M4
M5 M6 M9 M7
M10 M8
A
m
o
s
t
r
a
s
d
e
m
e
l
d
e
a
b
e
l
h
a
d
e
d
i
f
e
r
e
n
t
e
s
m
u
n
i
c
í
p
i
o
s
d
o
E
s
t
a
d
o
Figura 11: Dendograma utilizando as distância euclidiana das 10 amostras de méis e
os 16 elementos químicos (minerais)
5.3. Constituintes químicos do aroma do mel de abelha
Para extração dos compostos voláteis do mel de abelha utilizou-se a extração
seletiva com hexano destilado. No entanto, observa-se no cromatograma deste
solvente (Figura 12, pág. 68) que apresenta algumas impurezas tais como: naftaleno
(tempo de retenção (TR) 14,73; pico 1), safrol (TR de 19,24; pico 2), tetradecano (TR
de 24; pico 3), pentadecano (TR de 28,08; pico 4), hexadecano (TR de 32; pico 5), 1-
metil-undecil-benzeno (TR de 39,29; pico 6), 6-metil-heptil-4-metil-pentiladipate (TR de
57,16; pico 7) e outras (Figura 12, pág. 68). Estas substâncias foram detectadas em
algumas amostras do aroma de méis estudadas, assim a análise das substâncias nos
cromatogramas foram subtraídas das substâncias encontradas no solvente. É possivel
afirmar que estas substâncias são impurezas presentes no solvente, coluna ou
injetores.
68
RT: 10,84 - 59,71
15 20 25 30 35 40 45 50 55
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
57,16
14,73
56,79
54,33
50,73
16,02
19,2410,95 39,29
24,00 32,00
28,08
47,87
37,17
NL:
9,38E6
TIC F: MS
MB
Figura 12: Perfil cromatográfico do solvente utilizado na extração dos aromas das
amostras de méis
Nas Tabelas 10 a 15 estão os resultados experimentais obtidos na análise dos
constituintes orgânicos do aroma de mel de abelha de dez amostras em estudo de
cinco municípios do Estado do Pará. O perfil cromatográfico das 10 amostras
analisadas pode ser observado nas Figuras 10 a 14. Nas tabelas estão incluídos os
dados de tempo de retenção em minutos, identificação e porcentagem relativa (%
área).
Na investigação das dez amostras de mel de cinco municípios paraenses foram
detectadas cerca de 66 substâncias diferentes no aroma dos méis paraense, onde 26
delas não foram identificadas. Treze compostos orgânicos foram identificados (1-butil-
heptil-benzeno, 1-pentil-heptil-benzeno, 1-butil-octil-benzeno, 1-propil-nonil-benzeno, 1-
pentil-octil-benzeno, nonadecano, 1-metil-dodecil-benzeno, hexadecanoato de etila,
eicosano, linoleato de metila, oleato de etila, docosano e tricosano) e são comuns em
todas as amostras de mel, mas apresentam diferentes concentrações.
(1)
(
2
)
(
3
)
(
4
)
(
5
)
(
6
)
(
7
)
69
O perfil cromatográfico das três amostras de méis de Moju é apresentado na
Figura 13 (pág. 70), e após a identificação, foram confirmados 27 componentes
(Tabela 10, pág. 71), sendo encontrados como substâncias comuns em concentrações
diferentes nas três amostras (M1, M2 e M3): óxido de cis-linalol, 1-butil-octil-benzeno,
1-propil-nonil-benzeno, 9-hexadecenoato de etila, hexadecanoato de etila, eicosano,
linoleato de metila, oleato de etila e uma substância não identificada (Tabela 10, pág.
71). A amostra M1 apresentou como componentes majoritários, o propenoato de
dodecila (41,90%, pico 1) e o oleato de etila (29,80%, pico 2), enquanto a amostra M2 e
M3 apresentaram o oleato de etila com 46,47% e 55,27%, o óxido de cis-linalol
(14,43% e 13,90%) e o linoleato de metila (11,75% e 13,53%), respectivamente. No
cromatograma destas amostras (Figura 13, pág. 70) observa-se as impurezas do
solvente (indicado por setas), as quais não foram consideradas como pertecentes ao
aroma do mel de Moju.
70
RT: 7,48 - 59,54
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Time (min)
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
35,43
50,91
50,68
51,10
44,92
14,73
35,63
10,23 54,8145,67
39,29
33,05
32,00
24,00
15,16 19,91
NL:
1,12E7
TIC F: MS
M1
RT: 7,25 - 60,04
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Time (min)
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
50,91
50,68
51,10
10,21
59,07
44,92
14,73
45,67
57,5451,96
39,27
46,62
44,29
36,69
33,0417,21
24,00
28,08
NL:
6,24E6
TIC F: MS
M2
RT: 6,39 - 60,01
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Time (min)
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
50,91
50,68
51,10
10,26
44,92
6,52
45,67
10,90
59,06
14,73
57,54
39,29
17,22
45,89
35,7324,00
32,00
28,07
NL:
7,22E6
TIC F: MS
M3
Figura 13: Perfil cromatográfico das substâncias voláteis presentes nas amostras de
méis da região de Moju (A-amostra M1, B-amostra M2 e C-amostra M3)
A
B
C
(1)
(
2
)
(1)
(1)
71
Tabela 10: Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de Moju (M1, M2 e M3)
Nº
Tempo de Retenção
Identificação
Porcentagem relativa
M1
M2
M3
M1
M2
M3
1 10,23 10,21 10,26 Óxido de cis-linalol 2,57
14,43
13,90
2 __ 10,81 10,9 Óxido de trans-linalol __ 1,03 1,27
3 __ 11,76 11,76 Fenil etil álcool __ 1,73 1,28
4 33,05 33,04 __ 1-butil-heptil-benzeno 0,95 0,79 __
5 33,43 __ __ 1-propil-octil-benzeno 0,81 __ __
6 34,23 34,23 __ 1-etil-nonil-benzeno 0,75 0,78 __
7 35,43 __ __ Propenoato de dodecila
41,90
__ __
8 __ 35,64 __ 1-metil-decil-benzeno __ 0,91 __
9 __ __ 35,73 NI __ __ 0,50
10 36,53 36,52 __ 1-pentil-heptil-benzeno 0,62 0,61 __
11 36,68 36,69 36,69 1-butil-octil-benzeno 1,22 0,77 0,66
12 37,13 37,14 37,13 1-propil-nonil-benzeno 0,88 0,57 0,93
13 37,92 __ __ 1-etil-decil-benzeno 0,59 __ __
14 40,01 __ __ 1-pentil-octil-benzeno 0,55 __ __
15 40,21 __ __ 1-butil-nonil-benzeno 0,43 __ __
16 42,67 __ __ Nonadecano 0,31 __ __
17 42,8 42,89 __ 1-metil-dodecil-benzeno 0,30 0,42 __
18 44,27 44,29 44,27 NI 0,38 1,30 0,67
19 44,92 44,92 44,92 9-hexadecenoato de etila 2,36 3,03 4,70
20 45,67 45,67 45,67 Hexadecanoato de etila 1,22 2,48 2,79
21 45,88 45,90 45,89 Eicosano 0,42 1,24 0,51
22 __ 46,62 __ Hexadecanoato de isopropila
__ 0,73 __
23 50,68
50,68 50,68
Linoleato de metila 7,07 11,75 13,53
24 50,91
50,91 50,91
Oleato de etila
29,80
46,47
55,27
25 51,96 51,96 __ Docosano 0,33 0,70 __
26 54,81 __ __ Tricosano 0,61 __ __
27 __ 59,07 __ Pentacosano __ 2,72 __
NI: substâncias não identificada
72
No perfil do aroma das três amostras de mel do município de São Miguel do
Guamá (Figura 14, pág. 73), foram detectadas 41 substâncias diferentes (Tabela 11,
pág. 74). Entre as substâncias detectadass 9 não foram identificadas. Dezoito
substâcias detectadas são comuns nas três amostras (M4, M5 e M6) (Figura 11). Os
aromas das três amostras apresentaram como substâncias majoritarias o oleato de
etila (pico 1) e o linoleato de metila (pico 2), sendo mais abundante o oleato de etila,
nas concentrações 48,64%, 54,76% e 61,72% para M4, M5 e M6, respectivamente.
Nesta amostra observa-se substâncias consideradas como impurezas do solvente, tais
como naftaleno, pentadecano, hexadecano e outros.
73
RT: 5,69 - 60,02
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Time (min)
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
50,91
50,68
5,88
14,73
44,92
39,27
45,9010,45
59,09
33,04
54,81
16,04
32,00
28,08
18,66
NL:
7,55E6
TIC F: MS
M4
RT: 6,63 - 60,02
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
50,91
50,68
44,92
45,65
39,27
6,87
51,96
35,73
57,1433,03
8,16
48,98
14,73
24,00
28,08
16,02
NL:
1,65E7
TIC F: MS
M5
RT: 7,17 - 60,02
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
50,91
50,70
51,11
44,92
45,67
33,05
35,64
39,2914,718,20
24,00
51,96
28,07
16,06
57,54
48,88
NL:
3,92E7
TIC F: MS
M6_09120
9211936
Figura 14: Perfil cromatográfico das substâncias voláteis presentes nas amostras de
méis da região de São Miguel do Guamá (A: amostra M4, B: amostra M5 e C: amostra
M6)
A
B
C
(1
)
(1)
(1)
(
2
)
(
2
)
(
2
)
74
Tabela 11: Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de São Miguel do Guamá (M4, M5 e M6)
Nº Tempo de Retenção
Identificação Porcentagem relativa
M4 M5 M6 M4 M5 M6
1 __ __ 6,53 NI __ __ 0,9
2 __ 10,26
__ Óxido de cis-linalol __ 0,14 __
3 10,45
__ __ Óxido de cis-linalol+Mist. 3,55 __ __
4 11,78
__ __ Fenil etil álcool 0,32
__ __
5 16,04
__ __ NI 0,53
__ __
6 __ 29,23
9,25 1-butil-hexil-benzeno
__
0,23 0,25
7 __ __ 29,61
1-propil-heptil-benzeno
__
__ 0,23
8 30,35
30,35
30,35
1-etil-octil-benzeno 0,55 0,32 0,34
9 31,83
31,83
31,83
1-metil-nonil-benzeno 0,65 0,30 0,42
10
32,91
__ 32,91
1-pentil-hexil-benzeno 0,53 __ 0,29
11
33,04
33,03
33,05
1-butil-heptil-benzeno 1,58 0,91 0,87
12
33,43
33,43
33,43
1-propil-octil-benzeno 1,49 0,86 0,70
13
34,23
34,23
34,23
1-etil-nonil-benzeno 1,31 0,73 0,74
14
35,64
__ 35,64
1-metil-decil-benzeno 2,82 __ 1,3
15
__ 35,73
__ NI __ 2,04 __
16
__ __ 36,21
NI
__ __
0,14
17
36,52
36,52
36,53
1-pentil-heptil-benzeno 1,27 0,80 0,68
18
36,69
36,67
36,68
1-butil-octil-benzeno 1,13 0,76 0,76
19
37,12
37,12
37,13
1-propil-nonil-benzeno 1,39 1,11 1,00
20
37,91
37,91
37,92
1-etil-decil-benzeno 0,73 0,64 0,57
21
40,01
40,01
39,99
1-pentil-octil-benzeno 1,12 0,77 0,46
22
__ 40,21
40,22
1-butil-nonil-benzeno
__
0,47 0,27
23
__ 40,66
40,66
1-propil-decil-benzeno
__
0,30 0,16
24
__ 41,45
41,46
1-etil-undecil-benzeno
__
0,36 0,16
25
42,65
42,65
42,67
Nonadecano 1,08 1,05 0,18
26
__ 42,87
42,80
1-metil-dodecil-benzeno __ 0,80 0,37
27
44,27
44,27
44,29
NI 1,05 0,77 0,58
28
44,92
44,92
44,92
9-hexadecenoato de etila 2,65 4,97 5,99
29
45,67
45,65
45,67
Hexadecanoato de etila 2,47 2,27 1,79
30
45,90
45,90
45,90
Eicosano 1,40 1,06 0,34
31
48,90
48,88
__ NI 1,40 0,32
__
32
49,00
48,98
__ Heneicosano 0,52 0,41
__
33
50,68
50,68
50,67
Linoleato de metila 10,53
16,06
14,57
34
50,91
50,91
50,91
Oleato de etila 48,64
54,76
61,72
35
51,75
__ __
NI 0,44
__ __
36
51,96
51,96
51,96
Docosano 0,46 0,36 0,28
37
__ __ 54,66
NI
__ __
0,41
38
54,81
54,79
54,81
Tricosano 0,51 0,23 0,21
39
55,84
55,86
__ NI 0,64 0,29
__
40
__ 57,56
__ Tetracosano
__
0,24
__
41
__ 59,09
__ Pentacosano
__
0,20
__
NI: substâncias não identificada
75
No aroma do mel de Irituia (M7), perfil cromatográfico mostrado na Figura 15
(pág. 76), foram detectados 22 componentes (Tabela 12). Dentre os constituintes
detectados apenas um não foi possivel identificar e assim como os méis de Moju e São
Miguel do Guamá, apresentou o oleato de etila (54,88%, pico 1) como componente
majoritário.
Tabela 12: Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de Irítuia (M7)
Nº Tempo de
retenção
Identificação Porcentagem
relativa
1 10,4 Óxido de cis-linalol+Mistura 4,36
2 11,76 Fenil etil álcool 0,55
3 33,04 1-butil-heptil-benzeno 1,03
4 33,43 1-propil-octil-benzeno 0,79
5 34,23 1-etil-nonil-benzeno 0,82
6 35,63 1-metil-decil-benzeno 1,99
7 36,52 1-pentil-heptil-benzeno 0,63
8 36,67 1-butil-octil-benzeno 0,97
9 37,14 1-propil-nonil-benzeno 1,08
10 39,99 1-pentil-octil-benzeno 0,65
11 41,45 1-etil-undecil-benzeno 0,41
12 42,65 Nonadecano 0,86
13 42,80 1-metil-dodecil-benzeno 0,25
14 44,27 NI 1,44
15 44,92 9-hexadecenoato de etila 3,06
16 45,67 Hexadecanoato de etila 3,55
17 45,90 Eicosano 1,30
18 48,98 Heneicosano 0,48
19 50,68 Linoleato de metila 11,98
20 50,91 Oleato de etila 54,88
21 51,96 Docosano 0,55
22 54,81 Tricosano 0,53
NI: Substância Não Identificada
76
RT: 5,61 - 60,01
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
50,91
50,68
51,10
45,67
6,07
44,92
10,40
14,71
39,29 45,90
51,96
57,54
42,6535,63
18,62
31,9924,00
NL:
7,42E6
TIC F: MS
M7
Figura 15: Perfil cromatográfico das substâncias voláteis presentes na amostra de mel
da região de Irituia (M7)
Na amostra de Ourém (M8), perfil cromatográfico apresentado na Figura 16
(pág. 78), foram detectadas 42 substâncias (Tabela 13, pág. 77), onde 14 não foram
identificadas. O aroma desta amostra apresenta um grupo de substâncias com tempo
de retenção entre 11,43 a 20,45 que não estão presentes nas outras amostras de méis
dos demais municípios estudados, estas podem ser uma característica do mel da
região de Ourém. No entanto, necessita-se ser melhor investigado na busca de suas
identificações e sua presença ou não em outras amostras da mesma região e outras
distintas. O componente majoritário (10,92%) deste aroma é uma substância não
identificada com tempo de retenção de 55,81 minutos.
Observa-se no cromatograma do aroma desta amostra de mel (Figura 16, pág.
78) um pico com tempo de retenção de 14,71 que corresponde ao naftaleno com uma
percentagem relativa de 20,37% (Figura 16, pág. 78)). No entanto, nas condições
experimentais adotadas neste trabalho, o naftaleno foi considerado como impureza do
solvente.
(1)
77
Tabela 13: Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de Ourém (M8)
Nº Tempo de
retenção
Identificação Porcentagem
relativa
1 11,43 NI 0,36
2 16,02 NI 0,79
3 18,64 NI 1,41
4 19,72 NI 1,00
5 20,07 NI 1,48
6 20,45 NI 1,07
7 20,64 Tridecano 0,95
8 26,33 NI 0,20
9 27,53 2-metil-tetradecano 1,29
10 29,35 NI 0,85
11 32,72 Benzofenona 1,52
12 33,04 1-butil-heptil-benzeno 0,35
13 35,71 NI 2,28
19 36,53 1-pentil-heptil-benzeno 0,46
20 36,68 1-butil-octil-benzeno 0,38
21 37,14 1-propil-nonil-benzeno 0,73
22 37,92 1-etil-decil-benzeno 0,34
23 39,99 1-pentil-octil-benzeno 0,59
24 40,22 1-butil-nonil-benzeno 0,60
25 40,66 1-propil-decil-benzeno 0,26
26 41,09 NI 0,92
27 41,45 1-etil-undecil-benzeno 0,45
28 42,65 Nonadecano 1,60
29 42,80 1-metil-dodecil-benzeno 0,33
30 43,15 NI 0,25
31 44,27 NI 1,40
32 45,67 Hexadecanoato de etila 2,29
33 45,88 Eicosano 2,19
34 48,98 Heneicosano 0,71
35 50,73 Linoleato de metila 0,72
36 50,90 Oleato de etila 6,36
37 51,95 Docosano 0,94
38 54,79 Tricosano 0,93
39 55,86 NI 10,92
40 56,66 NI 0,36
41 59,07 Pentacosano 2,56
NI: Substância não Identificada
78
RT: 8,50 - 60,04
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Time (min)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
Relative Abundance
14,71
50,90
24,00
57,99
55,86
8,61 19,21
28,08
39,27
45,88
54,79
31,98
20,07 35,7118,64 42,65
27,53
NL:
1,27E6
TIC F: MS
M16
Figura 16: Perfil cromatográfico das substâncias voláteis presentes na amostra de mel
da região de Ourém (M8)
Neste trabalho também foi investigado a composição do aroma de duas
amostras de mel oriundas do município de Altamira, sendo uma de abelha Apis
mellifera (M9) (perfil cromatográfico mostrado na Figura 17-A, pág. 80) e outra de
Melipona rufiventris (M10) (perfil cromatográfico na Figura 17-B, pág. 80). No aroma do
mel de Melipona foram detectadas 38 substâncias (Tabela 14, pág. 81) e no de Apis
49 (Tabela 15, pág. 82). Nos dois tipos de méis, o oleato de etila foi o componente
majoritário com 27,67% (pico 1) e 36,60% (pico 1) para mel de Melipona rufiventris e
Apis mellifera, respectivamente. Apesar das amostras de méis serem de abelhas
diferentes, a maioria das substâncias são comum as duas amostras, devido estarem
na mesma área geográfica e visitarem provalvemente a mesma flora apícola. No
entanto, o metil-eugenol (pico 2), hexadecanoato de isopropila (pico 3) e 8 substâncias
não identificadas foram detectadas somente para o mel de A. mellifera.
Pereira (2007) em seu estudo sobre aromas do mel de Melipona fasciculata
(Tracuateua, nordeste paraense) relatou a presença de substâncias como o limoneno
Naftaleno (20,37%)
79
(55%), orto-guaiacol (10,31%), óxido de cis-linalol (9,81%) e óxido de trans-linalol
(10,41%). Pode ser observado na Tabela 15 (pág. 82), que o aroma do mel de
Melipona rufiventris estudado neste trabalho não apresentou nem um destes
constituintes. Este fato se deve provavelmente por estar em uma localização diferente
e/ou pela técnica de extração ser diferente. Neste trabalho foi empregada a técnica de
extração seletiva por solvente orgânico, onde através desta técnica captura todas as
substâncias voláteis e não-voláteis que caracterizam o aroma de fato do mel, enquanto
Pereira (2007) adotou a técnica de extração por destilação simultânea, a qual
concentra somente as substâncias mais voláteis do mel.
De outra maneira, a técnica utilizada neste trabalho extraiu os componentes
representativos do aroma, obtendo-se substâncias nos mesmos concentrados relativos
ao bouquet do aroma do mel, fato que não acontece com o SDE (simultaneous
distillation–extraction-Likens–Nickerson), SPE (Solid-phase extraction) e SPME (Solid-
phase microextraction). Nestes métodos apenas as substâncias mais voláteis são
concentrados no solvente, fato que não pode ser uma fração representativa do aroma.
Entretanto, muitos trabalhos publicados ressaltam que, estas substâncias voláteis
representam este aroma (GUYOT et al., 1999; BOUSETA, COLLIN, 1995; PEREIRA,
2007; ALISSANDRAKIS et al., 2005 e 2007; PIASENZOTTO, GRACCO, CONTE, 2003;
VÁZQUEZ et al., 2006; BARONI et al., 2006), porém sua comprovação sensorial
(análise organoléptica) ainda não é comprovada.
80
RT: 6,47 - 60,02
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
50,91
23,90
50,68
51,10
57,54
51,96
44,92
45,67
39,29
54,81
33,04
39,99
7,38
8,73
31,8114,71
29,25
16,06
NL:
1,01E7
TIC F: MS
M8
RT: 8,03 - 60,04
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
50,91
50,68
59,44
51,10
35,64
39,29
54,81
33,04
39,99
45,90
8,38
40,22
49,00
31,81
14,73
30,36
21,45
16,02
27,52
NL:
3,88E6
TIC F: MS
M9
Figura 17: Perfil cromatográfico das substâncias voláteis presentes nas amostras de
méis da região de Altamira (A: amostra M9, mel de Apis mellífera; B: amostra M10,mel
de Melipona rufiventris)
A
B
(1)
(1)
(2
)
(3
)
81
Tabela 14: Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de Altamira (M9-Apis)
Nº Tempo de
retenção
Identificação Porcentagem
relativa
1 23,90 Metil-eugenol 16,18
2 29,25 1-butil-hexil-benzeno 0,41
3 29,63 1-propil-heptil-benzeno 0,30
4 30,35 1-etil-octil-benzeno 0,52
5 31,81 1-metil-nonil-benzeno 0,50
6 32,92 1-pentil-hexil-benzeno 0,47
7 33,04 1-butil-heptil-benzeno 1,30
8 33,43 1-propil-octil-benzeno 1,11
9 34,23 1-etil-nonil-benzeno 1,13
10 35,64 1-metil-decil-benzeno 2,29
11 36,53 1-pentil-heptil-benzeno 1,17
12 36,69 1-butil-octil-benzeno 1,24
13 37,14 1-propil-nonil-benzeno 1,36
19 37,92 1-etil-decil-benzeno 0,98
20 39,99 1-pentil-octil-benzeno 1,23
21 40,22 1-butil-nonil-benzeno 0,71
22 40,66 1-propil-decil-benzeno 0,50
23 41,45 1-etil-undecil-benzeno 0,53
24 42,65 Nonadecano 0,80
30 42,80 1-metil-dodecil-benzeno 0,95
31 44,27 NI 0,45
32 44,92 9-hexadecenoato de etila 2,45
33 45,67 Hexadecanoato de etila 1,98
34 45,90 Eicosano 1,56
35 46,62 Hexadecanoato de isopropila 0,84
36 48,10 NI 0,19
37 49,00 Heneicosano 0,83
38 50,68 Linoleato de metila 7,81
39 50,91 Oleato de etila 36,60
40 51,78 NI 0,40
41 51,96 Docosano 2,26
42 52,18 NI 0,31
43 53,01 NI 0,16
44 54,01 NI 0,32
45 54,81 Tricosano 0,80
46 55,86 NI 2,20
47 56,16 NI 0,20
48 57,54 Tetracosano 2,95
49 59,06 Pentacosano 0,37
NI: Substância Não Identificado
82
Tabela 15: Identificação das substâncias voláteis presentes no mel de abelhas do
município de Altamira (M10-Melipona)
Nº Tempo de
retenção
Identificação Porcentagem
relativa
1 21,45 NI 0,68
2 29,25 1-butil-hexil-benzeno 0,66
3 29,61 1-propil-heptil-benzeno 0,62
4 30,36 1-etil-octil-benzeno 1,02
5 31,81 1-metil-nonil-benzeno 1,23
6 32,91 1-pentil-hexil-benzeno 0,83
7 33,04 1-butil-heptil-benzeno 2,66
8 33,43 1-propil-octil-benzeno 2,41
9 34,23 1-etil-nonil-benzeno 2,67
10 35,64 1-metil-decil-benzeno 4,06
11 36,52 1-pentil-heptil-benzeno 2,42
12 36,69 1-butil-octil-benzeno 2,78
13 37,12 1-propil-nonil-benzeno 2,07
19 37,92 1-etil-decil-benzeno 2,11
20 39,99 1-pentil-octil-benzeno 2,46
21 40,22 1-butil-nonil-benzeno 1,52
22 40,66 1-propil-decil-benzeno 0,96
23 41,45 1-etil-undecil-benzeno 1,16
24 42,67 Nonadecano 0,90
25 42,80 1-metil-dodecil-benzeno 1,30
26 44,92 9-hexadecenoato de etila 1,78
27 45,67 Hexadecanoato de etila 1,82
28 45,90 Eicosano 1,80
29 49,00 Heneicosano 0,66
30 50,68 Linoleato de metila 5,69
31 50,91 Oleato de etila 27,67
32 50,96 Docosano 1,52
33 52,75 NI 3,23
34 54,84 Tricosano 1,90
35 55,84 NI 4,98
36 57,54 Tetracosano 0,83
37 59,09 Pentacosano 2,91
38 59,44 NI 5,19
NI: Substância não Identificada
Na Tabela 16 (pág. 84) são listados os constituintes que possivelmente possam
ser utilizados como marcadores das amostras de mel do Estado do Pará. Estas
substâncias poderiam ser utilizadas para caracterizar a origem geográfica e/ou
83
botânica do mel paraense dentro do próprio Estado, pois estes constituintes não estão
presentes em todas as amostras de mel, como por exemplo, na amostra de mel do
município de Ourém onde estão presentes as substâncias: tridecano, 2-metil-
tetradecano e benzofenona. Estes componentes químicos orgânicos não estão
presentes nas outras amostras de outros municípios estudados, assim como nas
amostras de Moju estão presentes: óxido de trans-linalol, propenoato de dodecila e
hexadecanoato de isopropila, e na do município de Altamira apresenta como composto
marcador o metil-eugenol. Estes compostos podem ser utilizados como marcadores do
mel paraense, a partir da comprovação da sua sazonalidade, assim como a
reprodutibilidade desses resultados, com outras amostras da mesma região, para que
se possa montar um modelo no sentido de discriminar a procedência do mel, através
de marcadores químicos.
No entanto, as substâncias como o 1-propil-octil-benzeno, 1-etil-nonil-benzeno,
1-metil-decil-benzeno, 1-etil-undecil-benzeno, 9-hexadecenoato de etila e heneicosano,
não seriam indicadas para serem utilizadas como possíveis marcadores, pois dos cinco
municípios estudados, estas substâncias foram detectadas apenas em quatro (Tabela
16, pág. 84).
Os marcadores moleculares podem também ser denominados de marcadores
químicos voláteis pela presença ou ausência. Neste estudo pode ser observado que a
discriminação dos méis poderá estar relacionada com a presença ou ausência das
substâncias marcadas (enumeradas na Tabela 16, pág. 84). Um estudo investigativo
poderá analisá-las sazonalmente e verificar se estas substâncias se apresentam como
marcadoras.
84
Tabela 16: Vinte e cinco substâncias marcadoras de diferenciação identificadas em
amostras de méis de abelha dos municípios de Moju, São Miguel do Guamá, Irituia,
Ourém e Altamira; código: quadrado preto - indica presença e quadrado branco - indica
ausência.
Nº
Substâncias Marcadoras
Moju
SMG
Irituia
Ourém
Altamira
01 Oxido de cis-linalol
4
02 Oxido de trans-linalol
3
03 Fenil etil álcool
4
04 Metil-eugenol
1
05 Tridecano
2
06 2-metil-tetradecano
07 1-butil-hexil-benzeno
08 1-propil-heptil-benzeno
09 1-etil-octil-benzeno
10 1-metil-nonil-benzeno
11 Benzofenona
2
12 1-pentil-hexil-benzeno
4
13 1-propil-octil-benzeno
14 1-etil-nonil-benzeno
15 Propenoato de dodecila
3
16 1-metil-decil-benzeno
17 1-etil-decil-benzeno
5
18 1-butil-nonil-benzeno
5
19 1-propil-decil-benzeno
20 1-etil-undecil-benzeno
21 9-hexadecenoato de etila
22
Hexadecanoato de isopropila
3
23 Heneicosano
24 Tetracosano
4
25 Pentacosano
5
SMG: São Miguel do Guamá.
85
Dos 66 constituintes relatados neste trabalho, os mais comuns encontradas na
literatura são: xido de cis-linalol (PEREIRA, 2007; BASTOS et al., 2002; VÁZQUEZ;
MAROTO; COELLO, 2007), óxido de trans-linalol (PEREIRA, 2007; MOREIRA et al.,
2002) estes compostos são típicos de laranjeira ou plantas cítricas. Também se
encontra o fenil etil álcool (BARONI et al., 2006; ODEH et al., 2007; PEREIRA, 2007) e
o eicosano (BARONI et al., 2006).
5.4. Investigação da flora microbiana do mel de abelha
O resultado da contagem de fungos filamentosos e leveduras presentes nas
amostras de méis produzidos no Estado do Pará podem ser observados no quadro 3
(pág. 86). Nesta investigação foi possível observar que todas as amostras
apresentaram valores médios para bolores e leveduras muito baixos, isso indica uma
boa qualidade microbiologica dessas amostras. As Legislações Brasileira e
Internacional vigentes (BRASIL, 2000; CODEX, 2001) não estabelecem valores
para as análise microbiológicas em mel. Estabelecem apenas que sejam seguidas
boas práticas de higiene na manipulação do produto.
Os resultados encontrados, neste trabalho para bolores e leveduras
encontram-se abaixo dos relatados por Silva et al. (2008) com média de 2,9 x10
4
ufc/g,
e próximos ao descritos por Gomes et al. (2009) com média de 34 cfu/g.
86
Quadro 3: Valores médios (UFC/g de mel) de fungos filamentosos e leveduras de méis
de abelha de diferentes municipios do Estado do Pará
Amostras M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
Média* <10
1
<10
1
<10
1
<10
1
<10
1
<10
1
<10
1
<10
1
1,0x10
1
3,0x10
1
* (UFC/g)
Na expectativa dessa flora microbiana encontrada ser natural do mel, isolou-se
10 colônias de fungos filamentosos, levando em consideração as caracteristicas
morfológicas das colônias (cor, formato, aspecto e etc), Figura 18, as quais ainda não
se pode afirmar se são 10 linhagens de fungos diferentes, pois ainda não foram
identificados. Neste trabalho o foco era realizar a identificação das leveduras,
buscando-se encontrar leveduras naturalmente ocorrentes no mel com potencial
tecnológico. No total foram isoladas 21 colônias de leveduras e identificadas por
Técnicas de Biologia Molecular. Algumas dessas colônias são apresentadas na Figura
19 (pág. 87)
Figura 18: Foto (frente e verso) de 2 colônias de fungos filamentosos isoladas do mel
de abelha
87
Figura 19: Foto de 4 colônias de leveduras isoladas do mel de abelha
As sequências obtidas foram alinhadas e editadas manualmente utilizando-se o
programa Bioedit e em seguida submetidas ao algoritmo BLASTn
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) contra a base de dados (GenBank) para análise
de identidade com seqüências de espécies de leveduras já depositadas. E após análise
comparativa foi feita a identificação, mostrada na Tabela 17 (pág. 88).
88
Tabela 17: Identificação das leveduras isoladas do mel correspondente ao GenKBank
após análise comparativa. Sequenciamento da região do DNA ribossomal
Código
Pares
de Bases
Máx.
Identidade(%)
Identificação GenkBank
L01 260 94
Cândida spp
FJ755821
L02 259 93
Cândida spp
FJ755821
L03 261 92
Cândida spp
FJ755821
L04 257 94
Cândida spp
FJ755821
L05 258 93
Cândida spp
FJ755821
L06 256 93
Cândida spp
FJ755821
L07 257 85
Cândida spp
FJ755821
L08 279 99 Cândida parapsilosis DQ347485
L09 257 93
Cândida spp
FJ755821
L10 259 94
Cândida spp
FJ755821
L11 279 99 Cândida parapsilosis DQ347485
L12 259 93
Cândida spp
FJ755821
L13 262 92
Cândida spp
FJ755821
L14 282 98 Cândida parapsilosis DQ347485
L15 277 99 Cândida parapsilosis DQ347485
L16 259 93
Cândida spp
FJ755821
L17 259 94
Cândida spp
FJ755821
L18 283 98 Cândida parapsilosis DQ347485
L19 254 93
Cândida spp
FJ755821
L20 254 93
Cândida spp
FJ755821
L21 363 98 Rhodotorula
mucilaginosa
AF444649
Dentre as 21 colônias de leveduras isoladas das amostras de méis do Estado
do Pará, 15 foram identificadas como Candida spp, e só foi possivel identificar o
gênero. Para confirmar as identificações feitas, nas condições experimentais deste
trabalho, há necessidade de sequenciar outras regiões do DNA mais especificas para
leveduras como as realizadas por Ferreira et al. (2009), o qual identificou leveduras
naturalmnete ocorrentes em mandioca. Cinco isolados foram identificadas como
Candida parapsilosis, onde foi possivel uma identificação com uma máxima identidade
de 99%, assim não deixa dúvida que a identificação molecular desta levedura é
confiável a nível de espécie. E uma colônia de Rhodotorula mucilaginosa com uma
máxima identidade de 98%.
89
As leveduras pertecentes ao gênero Rhodotorula já foram detectatadas no mel de
abelha (SNOWDON, CLIVER, 1996; CARVALHO et al., 2006), assim como a levedura
Candida parapsilosis (CARVALHO et al., 2006). Em seu trabalho Mitroiu et al. (1966)
relatou diversas leveduras isoladas do mel pertecentes ao gênero Candida tais como:
Candida spp, Candida albicans, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida
tropicalis e associou estes microorganismo pertecentes ao intestino das abelhas, no
entanto as leveduras do gênero Candida spp isoladas e identficadas neste trabalho
devem está associada principalmente como contaminação no mel, durante a
manipulação e/ou processamento.
Estas leveduras encontradas no mel de abelha são osmofílicas ou tolerante ao
açúcar, podem ser um problema para a qualidade do mel paraense, pois podem
crescer, mesmo nas condições adversas que o mel apresenta e como resultado, o mel
poderá sofrer alterações na sua composição.
90
6. CONCLUSÕES
A maioria dos parâmetros avaliados apresentaram valores dentro dos padrões
do Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Mel (Ministério da Agricultura e
do Abastecimento) e legislação internacional entre eles estão: proteína, cinzas,
açúcares redutores, sacarose, hidroximetilfurfural. Com exceção dos valores de sólidos
insolúveis, umidade, atividade diastásica da amostra M10 e a acidicidade das amostras
M9 e M10 que se encontraram fora dos limites estabelecidos pela legislação brasileira
e internacional para méis de Apis, porém todos os valores apresentaram-se dentro do
encontrado por trabalhos relacionados com características físico-químicas, químicas e
bioquímicas de mel de abelhas. O estudo multivariado dos dados, mostrou que as
amostras de méis de diferentes localidades se agruparam em dois grupos, sendo que
duas amostras se separaram dos grupos formados e entre si.
Os minerais Al, Fe, Ti, K, Ca, Mg, Na, Sr e Zn foram encontrados em todas as
amostras, no entanto potássio é o mais abundante dos elementos determinados. Com
base no teor de minerais e análise multivariada verificou a discriminação das amostras
do município do Moju.
Na investigação da composição do aroma de mel paraense, foram detectadas no
total 66 substâncias diferentes, dessas 26 não foram identificadas, e 13 componentes
são comum em todas as amostras de mel. E ressalta-se a técnica utilizada neste
trabalho, pois extraiu os componentes representativos do aroma, obtendo-se
substâncias nos mesmos concentrados relativos ao bouquet do aroma do mel. As
substâncias: oxido de trans-linalol, propenoato de dodecila, metil-eugenol entre outras,
podem ser utilizados como marcadores do mel paraense, a partir da comprovação da
sua sazonalidade.
A flora microbiana dos méis permitiu isolar e identificar 21 colônias de leveduras,
15 Cândida spp, 5 Cândida parapsilosis, e uma Rhodotorula mucilaginosa). A presença
91
destas leveduras devem está associada principalmente à contaminação nos méis,
durante a manipulação e/ou processamento, e podem apresentar alterações na
composição do mel.
Deste modo podemos concluir que méis produzidos no Estado do Pará
apresentam um bom nível de qualidade, tendo tratamento e manejo adequado, boa
maturidade e frescura.
92
7. REFERÊNCIAIS BIBLIOGRÁFICAS
ABREU, B. X. et al. A.; Avaliação de parâmetros de qualidade de amostras de méis de
Apis Mellifera coletados nos estados de são Paulo e Mato Grosso do Sul, Brasil.
Boletim de Indústria animal, v.65, n.4, 347-354, 2008.
ADAMS, R. P.; Identification of Essential Oil Components by Gas
Chromatography/Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation: Carol Stream,
2007.
AL-HIND, R. R.; Microbiological quality and safety of some “honey pastes” marketed in
Jeddah, Saudi Arábia. Umm Al-Qura J. Sci. Med. Eng., v.17, n. 2, 113-119, 2005.
AL, M. L. et al.; Physico-chemical and bioactive properties of different floral origin
honeys from Romania. Food Chemistry, v.112, n.5, 863–867, 2009.
ALMEIDA-ANACLETO, D.; Recursos alimentares, desenvolvimento das colônias e
características físico-químicas, microbiológicas e polínicas de mel e cargas de pólen de
meliponíneos, do município de Piracicaba, Estado de São Paulo. 2007. 134f.Tese de
doutorado. Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – USP. Piracicaba, 2007.
ALMEIDA-ANACLETO, D.; MARCHINI, L.C.; Composição físico-química de amostras
de méis de Apis mellifera L. provenientes do cerrado paulista. Boletim de Indústria
animal, v.61, n.2, 161-172, 2004.
ALMEIDA, D.; Espécies de abelhas (Hymenoptera:Apoidea) e Tipificação dos méis por
elas produzidas em áreas de Cerrado do município de Pirassununga - São Paulo.
Dissertação (Mestrado). Escola Superior Agrícola “Luiz de Queroiz”. Universidade de
são Paulo, 2002.
ALMEIDA-MURADIAN, L.B.; MATSUDA, A. H., BASTOS, D. H. M.; Physicochemical
parameters of Amazon Melipona honey. Química Nova, v.30, n.3, 707-708, 2007.
ALVES, R. M. O. et al.; Características físico-químicas de amostras de mel de Melipona
mandacaia Smith (Hymenoptera: Apidae). Ciência e Tecnologia de Alimentos. v.25, n.
4, 644-650, 2005.
ALISSANDRAKIS, E., et al.; Ultrasound-assisted extraction of volatile compounds from
citrus flowers and citrus honey. Food Chemistry, v.82, n.4, 575–582, 2003.
93
ALISSANDRAKIS, E. et al.; Flavour compounds of Greek cotton honey.Journal of the
Science of Food and Agriculture, v.85, n.9, 1444–1452, 2005a.
ALISSANDRAKIS, E. et al.; Evaluation of four isolation techniques for honey aroma
compounds. Journal of the Science of Food and Agriculture, v.85, n.1, 91–97, 2005b.
ALISSANDRAKIS, E. et al.; Aroma investigation of unifloral Greek citrus honey using
solid-phase microextraction coupled to gas chromatographic–mass spectrometric
analysis. Food Chemistry, v.100, n.1, 396–404, 2007.
AMPUERO, S., BODGANOV, S., BOSSET, J. O.; Classification of unifloral honeys with
an MS-based electronic nose using different sampling modes SHS SPME and INDEX.
European Food Research Technology, v.218, n.2, 194–207, 2004.
ANUPAMA, D., BHAT, K.K., SAPNA, V.K. ; Sensory and physicochemical properties of
commercial samples of honey. Food research international, v. 36, n.2, 183–191, 2003.
ANKLAM, E.; A review of the analytical methods to determine the geographical and
botanical origin of honey, Food Chemistry. V.63, n.4, 549–562, 1998.
AOAC – Association of Official Analytical Chemists. (1995). Sugar and sugar products.
In AOAC (Ed). Official Methods of Analysis. Arlington, VA, USA, (p.44.20).
ARAÚJO, D. R. SILVA, R. H. D. SOUSA, J. S.; Avaliação da qualidade físico-química
do mel comercializado na cidade de Crato, CE. Revista de Biologia e Ciências da
Terra, v. 6, n.1, 51-55, 2006.
ARRUDA, C.M.F. et al.; Características físico-químicas de amostras de méis de Apis
mellifera L. 1758 (HYMENOPTERA, APIDAE) da região da Chapada do Araripe,
município de Santana do Cariri, Estado do Ceará. Boletim de Indústria Animal, v.61,
n.2, 141-150, 2004.
BASTOS, D. H. M.; Compostos Voláteis de Méis de Eucalipto e Laranjeira. 1996. 175f.
Tese de Doutorado (Faculdade de Engenharia de Alimentos) – Unicamp, Campinas,
1996.
BASTOS, D. H. M. et al.; Composição de voláteis e perfil de aroma e sabor de méis de
Eucalipto e Laranjeira. Ciência e Tecnologia de Alimentos. v. 22, n. 2, 122-129, 2002.
BARTH, M.O.; MAIORINO, C.; BENATTI, A.P.T.; BASTOS, D.H.M. Determinação
de parâmetros físico-químicos e da origem botânica de méis indicados monoflorais do
94
Sudeste do Brasil. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 25, n. 2, 229-233,
2005.
BARONI, M. V. et al.; Determination of Volatile Organic Compound Patterns
Characteristic of Five Unifloral Honey by Solid-Phase Microextraction−Gas
Chromatography−Mass Spectrometry Coupled to Chemometrics. Journal of Agricultural
Food Chemistry, v.54, n.19, 7235–7241, 2006.
BARONI, M. V. et al.; Composition of honey from Córdoba (Argentina): Assessment of
North/South provenance by chemometrics. Food Chemistry, v.114, n.2, 727–733, 2009.
BELITIZ, H. D.; GROSCH, W.; Química de los alimentos. Ed. Acribia, S. A. Zaragoza.
Espanha,1997.
BERTONCELJ, J. et al.; Evaluation of the phenolic content, antioxidant activity and
colour of Slovenian honey. Food Chemistry, v.105, n.2, 822-828, 2007.
BIANCHI, F., CARERI, M., MUSCI, M.; Volatile norisoprenoids as markers of botanical
origin of Sardinian strawberry-tree (Arbutus unedo L.) honey: characterisation of aroma
compounds by dynamic headspace extraction and gas chromatography–mass
spectrometry. Food Chemistry, v.89, n.4, 527–535, 2005.
BIACHI, E. M.; La miel, caracteristicas y composición – Análisis y Adulteraciones.
Santiago del Estero: UNSE –CEDIA, 1981.
BICCHI, C., et al.; Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the
volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A, v.1024, n.1-2, 217–226,
2004.
BOGDANOV, S.; Harmonised Methods of the International Honey Commission. Swiss
Swiss Bee Research Centre, Bern, Switzerland, Extra Issue, p.1-62, 2002.
BOGDANOV, S.; MARTIN, P.; LÜLLMANN, C.; Harmonised Methods of the European
Honey Commission. Apidologie, Extra Issue, p.1 - 59, 1997.
BOSS, C.B; FREDEEN, K.J.; Concepts, Instrumentation and Techniques in
Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry, 2nd ed, Perkin-Elmer
Corp., USA, 1999.
BOUMANS, P.W.J.M.; (Ed) Inductively Coupled Plasma Emission Spectroscopy, Part
1, John Wiley & Sons, New York, 1987.
95
BOUSETA, A., COLLIN, S.; Optimized Likens–Nickerson method ology for quantifying
honey flavors. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.43, n.7, 1890–1897,1995.
BRADFORD, M.M.; A rapid and sensitive method for the quantifications of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analitycal
Biochemistry, v. 72, 248-254, 1976.
BRASIL. Instrução Normativa nº 11, de 20 de outubro de 2000. Estabelece o
regulamento técnico de identidade e qualidade do mel. Diário Oficial da República
Federativa do Brasil, Brasília, 23 out. Seção 1, p.16-17, 2000.
BULDINI, P. L. et al.;
Ion chromatographic and voltammetric determination of heavy
and transition metals in honey. Food Chemistry. 73, n.4, 487-495, 2001.
CARVALHO, C. A. L. et al.; Physicochemical characteristics and sensory profile of
honey samples from stingless bees (Apidae: Meliponinae) submitted to a
dehumidification process. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v.81, n.1, 143-
149, 2009.
CARVALHO, C. A. L. de et al.; Mel de abelha sem ferrão: contribuição para a
caracterização físico-química. Cruz das Almas: Universidade Federal da
Bahia/SEAGRI-BA, 2005
CARVALHO, M. C. et al.; Identification of honey yeast species based on RELP
analyses of the ITS region. Ciencia y Tecnologia Alimentaria, v.5, n.1, 11–17, 2006.
CHIRIFE, J., ZAMORA, M. C., MOTTO, A.; The correlation between water activity and
% moisture in honey: Fundamental aspects and application to Argentine honeys.
Journal of Food Engineering, v.72, n.2, 287–292, 2006.
CODEX, Revised Codex Standard for Honey. CODEX STAN 12-1981. Codex
Alimentarius Commission. FAO/OMS. Rome, Italy. 7 pp. (2001). Disponivel:
http://www.codexalimentarius.net/web/standard_list.do?lang=en, acesso em
03/08/2009.
CONTE, L. et al.; Determination of honey volatiles in relation to their botanical origin.
Bologna, 247–252, 2002.
CONTI, M. E.; Lazio region (central Italy) honeys: a survey of mineral content and
typical quality parameters. Food Control, v.11, n.6, 459–463, 2000.
96
COSTA, L. et al.; Determination of non-volatile compounds of different botanical origin
Brazilian honeys. Food Chemistry, v.65, n.3, 347–352. 1999.
CRANE, E.; O livro do mel. São Paulo: Nobel, 1983. 226p.
DE MARIA, C. A. B.; MOREIRA, R. F. A.; Compostos voláteis em méis florais, Quimica
Nova, v.26, n.1, 90-96, 2003.
DEVILLERS, J. et al.; Classification of monofloral honeys based on their quality control
data. Food Chemistry, v.86, n.2, 305–312, 2004.
EVANGELISTA-RODRIGUES, A. et al.; Análise físico-química dos méis das abelhas
Apis mellifera e Melipona scutellaris produzidos em duas regiões no Estado da Paraíba.
Ciência Rural, v.35, n. 5, 2005.
ERBILIR, F.; ERDOĜRUL, Ö.; Determination of Heavy Metals in Honey in
Kahramanmaraş City, Turkey Environmental Monitoring and Assessment. V.109, 181–
187, 2005
FERREIRA, N. R. et al.; Yeast Microflora Isolated From Brazilian Cassava Roots:
Taxonomical Classification Based on Molecular Identification. Current Microbiology
(Print), 2009. ; ISSN/ISBN: 03438651
FINOLA, M. S.; LASAGNO, M.C.; MARIOLI, J. M.; Microbiological and chemical
characterization of honeys from central Argentina. Food Chemistry, v.100, n.4, 1649–
1653, 2007.
FRÍAS, I.; HARDISSON, A.; Estudio de los parámetros analíticos de interés en la miel.
II. Azúcares, cenizas y contenido mineral y color. Alimentaria, La Rioja, v.28, n.235, 41-
43, 1992.
GOMES, L. P.; Contaminação bacteriana em amostras de méis de Apis mellifera L.
comercializados no Estado do Rio de Janeiro. 2006. 46f. Dissertação (Mestrado em
Microbiologia Veterinária) – Departamento de Microbiologia, Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, 2006.
GOMES, L. P. et al.; Determinação de Barcelos SP em amostras de mel produzidos por
abelhas melíferas (Apis mellifera L.). Anais do Congresso Brasileiro de Microbiologia,
Santos, 2005.
97
GOMES, S. et al.; Physicochemical, microbiological and antimicrobial propertie of
commercial honeys from Portugal. Food and Chemical Toxicology v.48, n.2, 544-548,
2010.
GONZÁLEZ-MIRET, M. L. et al.; Multivariate correlation between color and mineral
composition of honeys and by their botanical origin, Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v.53, n.7, 2574–2580, 2005.
GULER, A. et al.; Determination of important biochemical properties of honey to
discriminate pure and adulterated honey with sucrose (Saccharum officinarum L.)
syrup. Food Chemistry, v.105, 1119–1125, 2007.
GUYOT, C., SCHEIRMAN, V., COLLIN, S.; Floral origin markers of heather honeys:
Calluna vulgaris and Erica arborea. Food Chemistry, v.64, n.1, 3–11, 1999.
HERNÁNDEZ, C. M. et al.; Characterization of honey from the Canary Islands:
determination of the mineral content by atomic absrption sectrophotometry. Food
chemistry. V.93, n.3, 449-458, 2004.
HORN, H.; Intensive practical cours on honey analysis.1996. 43f. Dissertação
(Mestrado em Entomologia). FFCLRP-USP, São Paulo. 1996.
IURLINA, M. O.; FRITZ, R.; Characterization of microorganisms in Argentinean honeys
from different sources. International Journal of Food Microbiology. v.105, 297– 304,
2005.
KAYACIER, A.; KARAMAN, S.; Rheological and some physicochemical characteristics
of selected Turkish honeys. Journal of Texture Studies, 39(1), 17- 27, 2008.
LEAL, V. M.; SILVA, M. H.; JESUS, N. M.; Aspecto físico-químico do mel de abelhas
comercializado no município de Salvador-Bahia. Revista Brasileira de Saúde e
Produção Animal, Salvador, v. 1, p. 14-18, 2001.
LEGISLAÇÃO EM VIGILÂNCIA SANITÁRIA, Decreto nº 55871, de 26 de março de
1965. disponível em: http://e-legis.bvs.br/leisref/public/showAct.php?id=22, acesso em
28 de novembro de 2009.
LEHNINGER, A. L.; Princípios de Bioquímica. São Paulo: Sarvier, 2002, 975p.
MARCHINI, L. C. et al.; Physicochemical composition of Apis mellifera honey samples
from São Paulo State, Brazil. Quím. Nova., v.30, n.7, 1653-1657, 2007.
98
MARCHINI, L. C. et al.; Composição físico-química de amostras de méis de Apis
mellifera L. do Estado de Tocantins, Brasil. Boletim de Indústria Animal, v.61, n.2, 1001-
114, 2004.
MASSART, D. L. et al.; Handbook of chemometrics and qualimetrics: Part A. Elsevier:
Amsterdam, p. 867, 1997
Meet MINITAB Release 14 for Windows, Revised Printing, January Printed in the USA.
2004.
MELO, Z. F. N.; DUARTE, M. E. M.; MATA, M. E. R. M. C.; Estudo das
alterações do hidroximetilfurfural e da atividade diastásica em méis de abelha em
diferentes condições de armazenamento. Revista Brasileira de Produtos
Agroindustriais, Paraíba, v.5, n. 01, p. 89- 99, 2003
MENDONÇA, K. et al.; Caracterização físico-química de amostras de méis produzidas
por Apis mellifera L. em fragmento de cerrado no município de Itirapina, São Paulo.
Ciência Rural, v.38, n.6, p.1748-1753, 2008.
MENDES, E. et al.; Quality evaluation of Portuguese honey, Carbohydr. Polym. 37,
219-223, 1998.
MENDES,T M. F. F; BACCAN, N.; CADORE, S.; Sample Treatment Procedures for the
Determination of Mineral Constituents in Honey by Inductively Coupled Plasma Optical
Emission Spectrometry. J. Braz. Chem. Soc., v. 17, n.1, 168-176, 2006.
MENDES, T M. F.; Determinação de espécies metálicas em mel de abelhas por ICP
OES. 2003. 102f. Tese de Doutorado. Instituto de Química - Unicamp, 2003.
MINGOTI, S. A.; Análise de dados através de métodos de estatística multivariada: uma
abordagem aplicada. Belo Horizonte: Editora UFMG. P. 297, 2005.
MILLER, G. L.; Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.
Analytical Chemistry, v.31. n.3, 126-128, 1959.
MILLS, A. L.; FRANKLIN, R. B.; TAYLOR, D. R.; Characterization of microbial
communities using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Journal of
microbiological Methods, v.35, 225-235, 1999.
MITROIU et al.; Étude sur La flore “mycosique” intestinale dês abeilles soumices aux
traitements aux antibiotiques at sulfathiazol. Bull Apicole. v. 9, 43-65, 1966.
99
MOITA NETO, J. M.; MOITA, G. C.; Uma introdução à análise exploratória de ados
multivariados. Química nova, v.21, n.4, 467-468, 1998.
MONETTO, A. M. et al.; A study of botulinum spores in honey. Anaerobe, v.5, 185–186,
1999.
MONTASER, A.; GOLIGHTLY, D.W.; (eds) Inductively coupled plasmas in analytical
atomic spectrometry. 2ª Ed., New York, VCH Publishers, 1992, 1017p.
MORETI, A. C. C. C. et al.; Cor de amostras de méis de Apis mellifera L. de diferentes
estados brasileiros. Boletim de Indústria Animal, v.63, n.3, p. 159-164, 2006.
MORETI, A. C.C. C. et al.; Características físico-químicas de amostras de méis de
Apis mellifera L. do estado do Ceará, Brasil. Ciência e agrotecnologia, v.33, n.1, 191-
199, 2009.
MOREIRA, R. F. A.; DE MARIA, C. A. B.; Glicídios no mel. Química Nova, v.24, n.4,
516-525, 2001.
MOREIRA, R. F. A. et al.; Flavor composition of cashew (Anacardium occidentale) and
Marmeleiro (Croton Species) honeys. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.50,
7616–7621, 2002.
MORITA, T.; ASSUMPÇÃO, R. M. V.; Manual de Soluções, Reagentes e Solventes-
editora Bucher. 2ª Edição Revista. 2007, 724 p
NOGUEIRA-NETO, P.; Vida e criação de abelhas indígenas sem ferrão. Ed.
Nogueirapis, São Paulo, 1997.
ODEH, I. et al.; A variety of volatile compounds as markers in Palestinian honey from
Thymus capitatus, Thymelaea hirsut, and Tolpis virgata. Food Chemistry 101, 1393–
1397, 2007.
OJEDA DE RODRÍGUEZ, G. et al.; Characterization of honey produced in Venezuela.
Food Chemistry, v.84, 499–502, 2004.
OSTERKAMP, I. C.; Características polínicas e físico-química de amostras de méis de
Apis melífera l., 1758 (himenóptera, Apidea) e de Tetragonista angustula Latreille, 1811
(Hymenóptera, Trigonini) da região do vale do taquari, Estado do Rio Grande do Sul.
100
2009. 59f. Dissertação (Mestrado em Ambiente e Desenvolvimento) – PPGAD, Centro
Universitário Univates, 2009.
PASSAMANI, L.; Estudo das características físicas, químicas e microbiológicas de
compostos de mel produzidos no estado do Rio de Janeiro. 2005, 70f. Dissertação de
mestrado. Instituto de Tecnologia - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro, 2005.
PEREIRA, E. O. L.; Adaptação de métodos fisico, químico e bioquímicos no controle de
qualidade de méis de abelha sem ferrão produzidas no Nordeste paraense. 2007.
Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos). 96f. ITEC/UFPA, 2007.
PIASENZOTTO, L.; GRACCO, L.; CONTE, L.; Solid phase microextraction (SPME)
applied to honey quality control. Journal of Science of Food and Agriculture, 83, 1037–
1044, 2003.
PORTARIA N º 685, de 27 de agosto de 1998, disponível em: http://e-
legis.bvs.br/leisref/public/showAct.php?id=90, acesso em 28 de novembro de 2009.
RADOVIC, B. S. et al.; Contribution of dynamic headspace GC–MS analysis of aroma
compounds to authenticity testing of honey. Food Chemistry, 72(4), 511–520, 2001.
RÊGO, J. G. S.; XIMENES, R. S. S.; CAREIRO, J. G. M.; Hidroximetilfurfural e dias
tases em amostras de méis de A. mellifera. In. ENCONTRO SOBRE ABELHAS 5.,
Ribeirão Preto. 2002. Anais. Ribeirão preto: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras,
Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 2002. p.285
RODRIGUEZ-OTERO, J. L. et al.; Mineral content of honeys produced in Galicia (north-
west Spain). Food Chemistry, 49, 169-171,1994.
SAGRI (2010). Apipará reúne em Soure cerca de 400 agricultores de todo o país.
Disponível em: http://www.sagri.pa.gov.br/?q=node/298, acesso em 07/04/2010.
SALAMANCA, G. C.; Sistema de pontos críticos na atividade apícola, extração e
beneficiamento do mel. Disponível em:
< www.brasil.terravista.pt/claridade/3630/apiario/cientifico2.htm>. Acesso em:
23/05/2008.
SAMBROOK, J.; FRITCH, E.F.; MANIATIS, T.; Molecular cloning – A Laboratory
Manual. 2nd ed; Cold Spring Harbor Lab. New York, Press, 1998.
101
SANTOS, K. S.; MALASPINA, O.; PALMA, M. S. Cinética da diastáse em méis de
diferentes origens florais. Um novo protocolo experimental. Mensagem Doce, n.70,.2-4,
2003.
SAXENA, S.; GAUTAM, S.; SHARMA, A.; Physical, biochemical and antioxidant
properties of some Indian honeys, Food Chemistry, v.118, n. 2, 391-397, 2010.
SCHIEBERLE, P.; KOMAREK, D.; Changes in key aroma compounds during natural
beer aging. Freshness and Shelf Life of Foods ACS Symposium Series, 836, 70–79,
2003.
SCHWEITZER, M. P.; Qualidade do mel. Mensagem Doce, n. 61, maio de 2001.
SERRANO, R. B; VILLANUEVA, M. T. O; MARQUINA, A. D.; La miel. Edulcorante
natural por excelência II. Composición, producción y legislación. Alimentaria, n. 253,
29 – 35, 1994.
SILVA, L. R. et al.; Honey from Luso region (Portugal): Physicochemical characteristics
and mineral contents, Microchemical Journal, v. 93, n.1, 73-77, 2009.
SILVA, M. B. L. et al.; Microbial quality of honey from small beekeepers and honey from
honey houses under federal sanitary inspection service within Minas Gerais State.
Alim.Nutr., Araraquara, v.19, n.4, 417-420, 2008.
SKOOG, D. A.; LEARY, J. J.; Principles of Instrumental Analysis, 4
th
Edition, Harcourt
Brace College Publishing, Orlando, 1992, 802p.
SNOWDON, J. A.; The microbiology of honey-meeting your buyersí specifications (Why
they do what they do) American Bee Journal, v.1, 51-60, 1999.
SNOWDON, J. A.; CLIVER, D. O. Microorganisms in honey. Int. J. Food Microb., v. 31,
p.1-26, 1996.
SODRÉ, G. S.; Características físico-química e análises políticas de amostras de méis
de Apis mellifera L. da região litoral norte do Estado da Bahia. Piracicaba – SP.
Dissertação (Mestrado). 83f. Escola Superior Agrícola ”Luiz de Queiroz”. Universidade
de são Paulo. 2000.
102
SODRÉ , G. S. et al.; Minerais encontrados em amostras de méis de Apis mellifera
africanizada (Hymenoptera: Apidae) provenientes de alguns municípios do Estado do
Ceará. Boletim de Indústria animal, v.62, n.1, p.09-18, 2005.
SODRÉ, G. S. et al.; Determination of chemical elements in africanized Apis mellifera
(hymenoptera: apidae) honey samples from the State of Piauí, Brazil. Química Nova, v
30, n.4, 920-924, 2007a.
SODRÉ, G. S. et al.; Conteúdo microbiológico de méis de Apis mellifera
(Hymenoptera: apidae) dos Estados do Ceará e Piaui. Boletim de Indústria animal,
v.64, n.1, p.39-42, 2007b.
SORIA, A. C.; MARTÍNEZ-CASTRO, I.; SANZ, J.; Study of the precision in the purge-
and-trap–gas chromatography–mass spectrometry analysis of volatile compounds in
honey. Journal of Chromatography A. v.1216, n.15,2009
SOUZA, B. A. et al. Caracterização do mel produzido por espécies de Melipona Illiger,
1806 (Apidae: Meliponini) da região nordeste do Brasil: 1. Características físico-
químicas. Química Nova, v.32, n.2, 303-308, 2009.
SOUZA, R. F; PEREIRA SENA, E.O. L; SANTOS, A. S. Adaptação e utilização do
reagente de Seliwanoff na análise quantitativa de frutose presente em méis de abelha.
In: 59a Reunião Anual da SBPC, Belém. 2007. v. 59. p.101-102.
STONOGA, V. I.; FREITAS, R. J. S.; Conteúdo de água e açúcares em mel de abelha.
Boletim CEPPA, v.9, n.1, 9-16, 1991.
TERRAB, A. et al.; Characterisation of Spanish thyme honeys by their physicochemical
characteristics and mineral contents. Food Chemistry, 88, 537–542, 2004.
TYSSET, C.; ROUSSEAU, M.; Problem of microbes and hygiene of commercial
honey. Rev. Med. Vet. 132, 591-600, 1981.
VÁZQUEZ, L. C.; MAROTO, M. C. D.; COELLO, M. S. P.; Aroma composition and new
chemical markers of Spanish citrus honeys. Food Chemistry 103, 601–606, 2007.
VÁZQUEZ, L. C. et al.; Analysis of volatile compounds of eucalyptus honey by solid
phase extraction followed by gas chromatography coupled to mass spectrometry. Eur
Food Res Technol 224: 27–31, 2006.
103
VERÍSSIMO, M. T. L.; Saiba o que é o HMF. Apicultura no Brasil, v. 4, n. 24, 31, 1988.
VERZERA, A. et al.; SPME-GC–MS analysis of honey volatile components for the
characterization of diff erent floral origin. American Laboratory, 18–21, 2001.
VILLAS-BÔAS, J. K.; MALASPINA, O.; Parâmetros físico-químicos propostos para o
controle de qualidade do mel de abelhas sem ferrão no Brasil. Mensagem Doce,
v.82, 6-16, 2005.
WELKE, J. E. et al.; Caracterização físico-química de méis de Apis mellifera L. da
região noroeste do Estado do Rio Grande do Sul. Ciência Rural, v. 38, n. 6, 2008.
WHITE JR, J.W.; Honey. Advances in Food Reserch, v. 22, 287-374, 1978
WHITE, J. W.; The role of HMF and diastase assays in honey quality evaluation. Bee
World, v.75, n.3, 104-117, 1994.
YILMAZ H.; YAVUZ, O.; Content of some trace metals in honey from south-eastern
Anatolia. Food Chemistry, v.65, 475-476, 1999.
ZAPPALÁ, M. et al.; Methods for the determination of HMF in honey: a comparison.
Food Control, n.16, 273–277, 2005.
ZHOU, Q., WINTERSTEEN, C. L., CADWALLADER, K. R. Identification and
quantification of aroma-active components that contribute to the distinct malty flavor of
buckwheat honey. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50 (7), 2016–2021, 2002
104
ANEXO I
PROCEDIMENTOS PARA A CONTAGEM DE COLÔNIAS
1. REGRAS GERAIS PARA CÁLCULO E REGISTROS
1.1 Expressão de resultados de contagem; No cálculo das contagens, o resultado final
será expresso em UFC/g ou mL, levando-se em conta a diluição empregada, da
seguinte maneira:
R = a x 10
b
UFC/g ou mL
R = resultado
a = os dois primeiros algarismos significativos, números de 0 a 9
b = expoente (0 a 10)
UFC = unidade formadora de colônias
g = grama e mL= mililitro
Exemplos:
Diluição 10
-2
(1:100)
Média das contagens: 25 UFC
Resultado: 25 x 100 = 2.500 = 2,5 x 10
3
UFC/g ou mL
Diluição 10
-3
(1:1.000)
Média das contagens: 38 UFC
Resultado: 38 x 1.000 = 38.000 = 3,8 x 104 UFC/g ou mL
O resultado final será expresso considerando-se os dois primeiros algarismos
representativos, separados por vírgula. Os algarismos subseqüentes, quando existirem,
deverão ser arredondados e transformados em potência de 10.
De uma outra maneira usa-se a seguinte formula:
A partir do número de colônias formadas, estas foram contadas e calculadas o
número de UFC’s, que é dado por:
n° UFC/mL = n° colônias x vol. alíquota x inverso da diluição
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
