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Mariana Bisarro dos Reis
“Análise de variantes alélicas de genes de reparo e expressão de genes
relacionados com resistência à cisplatina em carcinoma bucal”
Londrina
2010
Universidade Estadual de Londrina
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Mariana Bisarro dos Reis
“Análise de variantes alélicas de genes de reparo e expressão de genes
relacionados com resistência à cisplatina em carcinoma bucal”
Londrina
2010
Instituto Agronômico do Paraná
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Universidade Estadual de Londrina
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1
Mariana Bisarro dos Reis
“Análise de variantes alélicas de genes de reparo e expressão de genes
relacionados com resistência à cisplatina em carcinoma bucal”
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós–Graduação, em
Genética e Biologia Molecular, da
Universidade Estadual de
Londrina, como requisito parcial
para a obtenção do título de
Mestre.
Orientadora: Profª Drª Ilce Mara de
Syllos Cólus
Londrina
2010
2
Mariana Bisarro dos Reis
“Análise de variantes alélicas de genes de reparo e expressão de genes
relacionados com resistência à cisplatina em carcinoma bucal”
COMISSÃO EXAMINADORA
Profª Drª Silvia Helena Sofia
Universidade Estadual de Londrina
Prof
a
Dr
a
. Regina Célia Poli-Frederico
Universidade do Norte do Paraná
Profª Drª Ilce Mara de Syllos Cólus
Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 24 de fevereiro de 2010
2
Catalogação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca Central
da Universidade Estadual de Londrina.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
R375a Reis, Mariana Bisarro dos.
Análise de variantes alélicas de genes de reparo e expressão de genes relacionados com
resistência à cisplatina em carcinoma bucal / Mariana Bisarro dos Reis. –
Londrina, 2010.
93 f. : il.
Orientador: Ilce Mara de Syllos Cólus.
Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) – Universidade Estadual
de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética
e Biologia Molecular, 2010.
1. Boca – Câncer – Teses. 2. DNA – Reparo – Teses. 3. Genética – Expressão –
Teses. 4. Polimorfismo (Genética) – Teses. I. Cólus, Ilce Mara de Syllos. II. Universidade
Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação
em Genética e Biologia Molecular. III. Título.
CDU 616.31-006
3
Dedico este trabalho aos meus pais
Antonio e Silvana e a todos que de
algum modo estiveram presente na
minha vida durante esse período
4
AGRADECIMENTOS
À Prof.ª Dr.ª Ilce Mara de Syllos Cólus, minha orientadora e amiga, pela paciência,
dedicação e exemplo de profissionalismo. Agradeço, pela confiança, mais uma vez
depositada no meu trabalho, mas principalmete pelo apoio e disponibilidade fora do
laboratório. Obrigada por tudo.
À Dr.ª Roberta, pela coorientação, pela amizade e conselhos, pela disposição e
interesse, principalmente pela ajuda na última etapa da realização deste trabalho.
Aos membros da comissão examinadora Profa. Dra. Berenice Quinzani Jordão e Profa.
Dra. Regina Célia Poli-Frederico, pela contribuição na finalização deste trabalho.
Aos amigos do laboratório, Hellen, Maressa, Pri Matos, Pri Cardoso, Manu, Vick,
Heloísa, André, Milene, Lara e Lucas, que se tornaram mais uma família, que sempre
estiveram presente, pela ajuda no dia a dia, nas horas de sufoco e por escutarem minhas
reclamações quando os experimentos davam errado. Obrigada pelas horas de apoio, pela
companhia dentro e fora do laboratório, pelas risadas e pelos conselhos durante todos
esses anos de convivência. Todos foram essenciais de alguma forma para que eu
terminasse esse trabalho
Aos meus amigos, de perto ou longe, que me apoiaram de algum modo, me deram
forças pra agüentar a saudade, que fizeram com que eu ganhasse várias famílias.
Obrigada Flavinha, Marina, por sempre me ouvirem e muitas vezes serem meu
conforto. Vocês são para a vida toda. À Juliana, que durante meu primeiro ano de
mestrado foi minha companhia inseparável, por me “emprestar“ a sua família (Paulino,
Edna e Jamile) que fez com que eu sentisse menos saudades de casa. Pessoas especiais
que eu vou levar sempre comigo.
À Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro; Prof Dr, Iglenir João Cavalli
e
Profª Drª Silvia Regina Rogatto, por cederem parte das amostras utilizadas no trabalho
Aos técnicos Carlinhos, Dário e Melissa, pelo apoio nas tarefas diárias.
5
Ao Prof. Dr. Mario Sérgio Mantovani, por me permitir utilizar a estufa de CO
2
e o
espectrofotômetro durante a realização dos experimentos e à Dani, pela força nesse
último mês de correria.
À Sueli, secretária do Programa, pela paciência e ajuda durante esses anos.
Ao Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
apoio financeiro.
Ao Prof. Dr. Edgard Graner, por gentilmente nos ceder a linhagem celular usada neste
trabalho.
A Profª Drª Eiko Nakagawa Itano por ceder o equipamento espectrofotômetro para
utilização durante os experimentos.
Aos pacientes participantes, que mesmo em um momento difícil se dispuseram a ajudar,
permitindo que este trabalho fosse realizado.
Aos professores do Curso de Pós Graduação e todos aqueles que de alguma forma me
ensinaram alguma coisa dentro e fora da sala de aula.
Em especial.....aos meus pais, Antonio e Silvana, razão de eu sempre querer ser melhor,
por me apoiarem incondicionalmente em qualquer situação, pela força para que pudesse
continuar buscando os meus sonhos. Obrigada por serem meu porto seguro em qualquer
situação, sem vocês nada na minha vida seria possível. À minha irmã Gabriela e ao meu
irmão Victor, que apesar da distância, estão sempre comigo. Aos meus avós, por sempre
me acolherem tão bem quando eu volto pra casa, em especial meu avô Victório, meu
exemplo de vida, que sempre me incentivou e que apesar da ausência eu sei que ele
ficaria feliz com mais uma conquista minha...saudades.
À Deus, por me dar forças e colocar pessoas tão especiais no meu caminho.
6
“Os que se encantam com a prática sem a
ciência são como os timoneiros que
entram no navio sem timão nem bússola,
nunca tendo certeza do seu destino.”
[ Leonardo da Vinci ]
7
REIS, MARIANA BISARRO. Análise de variantes alélicas de genes de reparo e
expressão de genes relacionados com resistência à cisplatina em carcinoma bucal.
2010. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) – Universidade
Estadual de Londrina.
RESUMO
Este trabalho objetivou investigar a associação entre a presença de variantes alélicas nos
genes XRCC1 e XRCC3 e a suscetibilidade ao câncer de boca e correlacionar os
resultados dos testes genéticos com parâmetros histopatológicos. Adicionalmente,
implementar técnicas de análise de expressão gênica no laboratório de Mutagênese e
Oncogenética da UEL pela realização de experimentos com uma linhagem celular de
carcinoma bucal tratada com cisplatina, avaliando genes de reparo do DNA (ERCC1 e
XPA) e de apoptose (BAX). A genotipagem das variantes genéticas foi realizada por
PCR-RFLP em 150 pacientes com carcinoma bucal e 150 controles. Os SNPs
investigados foram Arg194Trp e Arg399Gln no gene XRCC1 e Thr241Met no gene
XRCC3. Para a análise de expressão foi utilizada a linhagem SCC25 tratada com
cisplatina na concentração de 0,01 µM. O RNA total foi extraído e a quantificação
relativa foi realizada por PCR em Tempo Real. A presença das variantes polimórficas
de XRCC1 códon 194 (OR 0,82, 95% IC 0,44-1,51), códon 399 (OR 0,94, 95% IC 0,59-
1,50) e XRCC3 (OR 0,72; 95% IC 0,45-1,16) não foram significativamente associadas
com aumento de risco de câncer bucal isoladamente ou em combinações genotípicas. Os
genótipos variantes também não se mostraram associados a parâmetros
histopatológicos: diferenciação tumoral, invasão de linfonodos e tamanho do tumor. Na
análise de expressão gênica, apenas o gene XPA mostrou expressão aumentada,
indicando que pode conferir uma diminuição da sensibilidade à cisplatina da linhagem
celular utilizada neste estudo. Entretanto, os dados de expressão são preliminares e
serão confirmados com análises adicionais, que também incluirão novos genes. Nossos
resultados sugerem ainda que variantes polimórficas nos genes XRCC1 e XRCC3 não
constituem bons marcadores de suscetibilidade para carcinomas orais e também não
estão associadas a estágios mais avançados do processo tumoral.
Palavras chaves: carcinoma bucal, polimorfismos, genes de reparo, genes de apoptose,
expressão gênica.
8
REIS, MARIANA BISARRO. Analysis of allelic variants in repair genes and
expression of genes associated with resistance to cisplatin in oral carcinoma. 2010.
Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) – Universidade Estadual de
Londrina.
ABSTRACT
This study aimed to investigate the association between the presence of allelic variants
in XRCC1 and XRCC3 genes and susceptibility to oral cancer and to correlate the results
of genetic tests with histopathological parameters. Additionally, implementing technical
analysis of gene expression in the laboratory of Mutagênese e Oncogenética at UEL,
conducting experiments with a cell line of oral carcinoma treated with cisplatin,
evaluating the DNA repair genes (ERCC1 and XPA) and apoptosis genes (BAX).
Genotyping by PCR-RFLP was carried out on 150 patients with oral squamous cell
carcinoma and 150 controls. SNPs investigated included Arg194Trp and Arg399Gln of
the XRCC1 gene and Thr241Met of the XRCC3 gene. To analyze the expression was
used the cell line SCC25 treated with cisplatin at a concentration of 0.01µM. Total RNA
was extracted and relative quantification was performed by Real Time PCR. Presence of
the polymorphic variant of XRCC1 codon 194 (OR 0.82, 95% CI 0.44-1.51), codon 399
(OR 0.94, 95% CI 0.59-1.50) and XRCC3 (OR 0.72; 95% CI 0.45-1.16) were not
significantly associated with increased risk of oral cancer alone or in combination
genotype. Genotypes variants also were not associated with histopathological
parameters: tumor differentiation, invasion of lymph nodes and tumor size. In the
analysis of gene expression, only the XPA gene showed increased expression, indicating
that it may provide a decreased sensitivity to cisplatin of the cell line used in this study.
However, the expression data are preliminary and will be confirmed with additional
analysis, which also include new genes. Our results also suggest that polymorphic
variants in genes XRCC1 and XRCC3 are not good markers of susceptibility to oral
carcinomas and are also not associated with later stages of the tumor.
Key words: oral cancer, polymorphisms, repair genes, apoptotic genes, genic expression
9
LISTA DE TABELAS
ARTIGO 1
Table 1: Summary on PCR-RFLP assay of polymorphisms in DNA repair genes…....41
Table 2: Characteristics of the study population……………………………..…….….42
Table 3: Frequencies of allelic variants isolated for XRCC1 and XRCC3 genes in
patients with oral cancer and matched controls…………………………………….…..43
Table 4: Distribution of patients with presence or absence of risk genotypes in relation
to the regional lymph nodes invasion,
tumor differentiation and tumor
size……………....
.44
ARTIGO 2
Table 1: List of primers used in the study…………………………………...………58
10
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO
Figura 1: Interação proteína-proteína mediada por XRCC1. NTD: Domínio N-terminal,
NLS: sinal de localização nuclear...................................................................................22
Figura 2: Reparo por excisão de bases...........................................................................24
Figura 3: Reparo Homólogo de quebra de dupla fita.....................................................26
Figura 4: Estrutura do quimioterápico cisplatina...........................................................28
Figura 5: Formação e efeitos dos aductos de cisplatina.................................................29
Figura 6: Reparo por Excisão de Nucleotídeos Global do Genoma..............................31
ARTIGO 2
Figure 1: Matemathical model of relative expression ratio in Real Time
PCR…………………………………………………………………………………….58
Figure 2: Cytotoxicity of SCC25 cells induced by cisplatin. After 24 h of treatment
with the drug, MTT activity was read at 550 nm and values were expressed as viability
percentage………………………………………………………………………….…..59
Figure 3: Results of relative quantification of repair genes ERCC1 and XPA and pro-
apoptotic gene BAX…………………………………………………………….………60
11
LISTA DE ABREVIATURAS
5´dRP – 5´desoxiribose-5-fosfato
AP – sítio apurínico/pirimidinico
APEX1 – gene “APEX nuclease (multifunctional DNA repair enzyme) 1”
ATM – gene “Ataxia telangiectasia mutated
BAX – gene “Bcl2-associated X protein”
BCL2 – gene “B-cell CLL/lymphoma 2”
BER – do inglês: Reparo por Excisão de Bases
BRCA1 – gene “Breast cancer 1”
BRCT1 – BRCA1 carboxyl-terminal 1
DNA – Ácido desoxirribunucleico
DNA-PKcs – DNA-dependent protein kinase
DSB – do inglês: Reparo de quebra de dupla fita
EGFR – Epidermal growth factor receptor
ERCC1 – gene “Excision Repair Cross-complementing rodent repair deficiency,
complementation group 1”
FEN1 – structure-specific nuclease Flap endonuclease 1
GGR – do inglês: Reparo por Excisão de Nucleotídeos Global do Genoma
CCECP – Carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço
HR – do inglês: Recombinação Homóloga
IC – Intervalo de confiança
ICD – Classificação Internacional de Doenças
INCA – Instituto Nacional do Câncer
NER – do inglês: Reparo por Excisão de Nucleotídeos
NHEJ – do inglês: Recombinação não Homóloga
OR – razão de probabilidade
PCNA – do inglês: antígeno nuclear de proliferação celular
PCR – reação em cadeia da polimerase
PARP1 – poli (ADP ribose) polimerase 1
PHA – do inglês: hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
RFLP – do inglês: polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição
SNP – do inglês: polimorfismo de base única
TCR – do inglês: Reparo por Excisão de Nucleotídeos Acoplada a Transcrição
12
TNM – Sistema de Classificação de Tumores Malignos
TP53 – Gene “Tumor protein p53”
XPA – Gene “Xeroderma Pigmentosum, complementation group A”
XPD – Gene “Xeroderma Pigmentosum, complementation group D”
XRCC1 – Gene “X-ray Cross Complementing Group 1”
XRCC2 – Gene “X-ray Cross Complementing Group 2”
XRCC3 – Gene “X-ray Cross Complementing Group 3”
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO…………………………………………………………………..
15
1.1 Câncer de Cabeça e Pescoço.................................................................................
16
1.1.2 Tumores de Cavidade Bucal.............................................................................. 17
1.1.3 Diagnóstico, Prevenção e Tratamento............................................................... 18
1.1.4 Fatores de Risco................................................................................................ 19
1.2 Câncer de Cavidade Bucal: aspectos genéticos e moleculares............................. 20
1.2.1 Gene XRCC1..................................................................................................... 22
1.2.2 Gene XRCC3..................................................................................................... 24
1.3 Resistência ao Tratamento.................................................................................... 27
1.3.1 Cisplatina e Resistência..................................................................................... 27
1.3.2 Reparo por Excisão de Nucleotídeos, Gene ERCC1 e XPA............................. 29
1.3.3 Resposta à Apoptose e Gene BAX..................................................................... 32
2 OBJETIVOS
............................................................................................................ 33
3 ARTIGOS……..........................................................................................................
34
Artigo 1 ....................................................................................................................
35
Abstract...................................................................................................................... 37
Introduction ......................................................................................................................
38
Material and Methods.......................................................................................................
39
Studied Population............................................................................................................
39
Genetic polymorphisms....................................................................................................
40
Statistical Analysis....................................................................................................... 40
Results....................................................................................................................... 42
Association between polymorphisms for DNA repair genes and oral cancer............ 42
Association between polymorphisms for DNA repair genes and histopathologic
paramemetrs...............................................................................................................
43
Discussion …………………………………………………………………………...
45
Acknowledgements…………………………………………………………………..
47
References……………………………………………………………………………
48
Artigo 2......................................................................................................................
52
Abstract.......................................................................................................................
54
14
Introduction ......................................................................................................................
55
Material and Methods.......................................................................................................
56
Cell lines……………………………………………………………………………..
56
Cytotoxicity………………………………………………………………………….
56
Culture Conditions…………………………………………………………………..
57
RNA preparation and Reverse transcriptase-polymerase chain reaction…………… 57
Real Time PCR…………………………………………………………………….. 57
Statistical analysis………………………………………………………………….. 58
Results……………………………………………………………………………….
59
Cytotoxicity induced by cisplatin in SCC25cell line………………………………..
59
Relative Quantfication of ERCC1, XPA and BAX Transcript Expression in SCC25
cell line……………………………………………………………………………...
59
Discussion………………………………………………………………………….. 60
References………………………………………………………………………...... 63
4 CONCLUSÕES……………………………….………………………….......…..
67
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................
68
Anexo I…………………………………………………………………………...… 85
Anexo II……………………………………………………………………………. 87
Anexo III…………………………………………………………………………… 88
15
1 INTRODUÇÃO
Hoje, o câncer é uma das principais causas de morte em todo o mundo, o que
tem levado a comunidade científica a dar grande ênfase ao estudo das características
que tornam o indivíduo suscetível a desenvolver tumores.
O câncer é resultado do acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas que leva
a progressão de uma célula normal a uma célula cancerosa, em um processo que
envolve múltiplos passos (BRAAKHUIS, BRAKENHOFF e LEEMANS, 2005), sendo
considerado uma coleção de doenças nas quais crescimento e divisão celulares estão
desregulados. Sem regulação, as células se dividem sem parar, acumulando-se umas em
cima das outras para formar tumores (SNUSTAD e SIMMONS, 2001).
Para que esse crescimento desregulado ocorra, é necessário que haja uma
alteração inicial. Segundo a Teoria Clonal do Câncer, proposta parcialmente por
Knudson, esta alteração inicial é transmitida a todos os descendentes da célula-mãe,
permitindo então a formação de um clone de células contendo a mesma alteração. Uma
vez estabelecido, este grupo de células passa por uma segunda alteração genética, que se
propaga pelos descendentes celulares, conferindo novas características e criando um
clone dentro de um clone - ou ainda, um subclone (LOURO, 2000).
Alberts et al. (2002) afirmam que uma única mutação não é suficiente para
converter uma célula sadia típica numa célula cancerosa, pois há várias evidências
indicando que a gênese de um câncer requer, como regra geral, que vários acidentes
raros e independentes ocorram juntos em uma célula.
Portanto, devido à complexidade e à presença de vias alternativas no controle da
proliferação celular, é necessário a ocorrência de mutações adicionais e sucessivas em
diferentes genes para que haja a formação de um tumor. Cada nova mutação é
acompanhada de uma nova onda de expansão clonal e, ao final desse processo, surge
uma população celular com grande potencial de crescimento, um tumor maligno
(CAMARGO et al., 1999).
Em alguns casos a predisposição a desenvolver câncer é herdada. Entretanto, a
maioria dos casos de câncer é devida ao acúmulo de mutações nos tecidos somáticos
(SNUSTAD e SIMMONS, 2001), resultado de uma interação genética-ambiente
(PERERA, 1997).
Segundo Field (1995), são reconhecidas duas classes de genes ligados ao câncer:
oncogenes e genes supressores de tumor. A ativação de proto-oncogenes juntamente
16
com a inativação de supressores tumorais são as principais alterações genéticas
envolvidas no desenvolvimento tumoral (PONDER, 2001). A classe de oncogenes está
provavelmente envolvida na iniciação e progressão da doença (FIELD, 1995). A
ativação dos proto-oncogenes em oncogenes pode se dar por translocações
cromossômicas, amplificação gênica, mutações de ponto ou deleções (KNUDSON,
1985 apud FIELD, 1995), e levar à desregulação do controle do ciclo celular. Isto
ocorre porque os proto-oncogenes são genes que atuam no controle do ciclo celular e
que apresentam sua expressão rigorosamente regulada nas células normais.
Os genes supressores tumorais atuam como reguladores negativos da
proliferação celular (VERMA e TRIANTAFILLOU, 1998). São genes normais, que
quando ativados por uma mutação, deleção ou por vírus, causam desregulação das vias
críticas que controlam o crescimento e diferenciação celular (HARRIS, 1991).
Relacionados aos mecanismos de reparo de DNA, uma terceira classe de genes
tem sido associada ao desenvolvimento do câncer. Estes genes são responsáveis pela
manutenção da estabilidade genética, reparando as lesões que podem ocorrer no
material genético. O sistema de reparo atua em diferentes vias, removendo as diferentes
lesões de acordo com a natureza química do agente genotóxico (BENHAMOU e
SARASIN, 2000).
1.1 Câncer de Cabeça e pescoço
Os cânceres de cabeça e pescoço têm uma expressiva incidência e são
responsáveis por uma substancial morbidade e mortalidade, havendo uma relevante
preocupação para a saúde no mundo, particularmente nos países em desenvolvimento
(PISANI, BRAY e PARKIN, 2002). Os sítios anatômicos do trato aéreo digestivo
superior acometidos compreendem a faringe, cavidade bucal, cavidade nasal e laringe
(ARGIRIS et al., 2008).
Durante os últimos 5 anos, os novos casos de câncer aumentaram 25%, enquanto
as taxas globais da doença aumentaram apenas 5% no mesmo período (LIU et al.,
2009).
Os tumores de cabeça e pescoço pela expressiva incidência e mortalidade, assim
como alta letalidade, constituem uma relevante preocupação para a saúde no mundo,
particularmente nos países em desenvolvimento (PISANI, BRAY e PARKIN, 2002).
17
Dentre os cânceres de cabeça e pescoço estão os carcinomas de células escamosas, que
constituem 90% de todos e estão associados a altas taxas de mortalidade, devido ao seu
alto potencial infiltrativo (DE HERDT e BAATENBURG DE JONG, 2008).
1.1.2 Tumores de Cavidade Bucal
O câncer de cavidade bucal é considerado o tipo mais comum de câncer de
cabeça e pescoço (LIPPMAN e HONG, 2001), sendo o carcinoma de células escamosas
o tipo histológico prevalente (ZAKRZEWSKA, 1999). Entre os tipos menos comuns de
câncer bucal estão os tumores malignos das glândulas salivares, melanomas, linfomas,
neoplasias do tecido ósseo e conjuntivo, alguns tipos de tumores odontogênicos,
carcinomas maxilar antral, neoplasias metastáticas (do peito, pulmão, estômago ou do
fígado) e o sarcoma de Kaposi (SCULLY e POTER, 2000).
O câncer bucal refere-se a um subgrupo de câncer de cabeça e pescoço que se
desenvolve nos lábios, língua, glândulas salivares, gengiva, assoalho da boca,
orofaringe, superfície bucal e outras localizações intra-orais, de acordo com a
International Classification of Diseases (ICD version 9, categories: 140-146, 149)
(TSANTOULIS et al., 2007).
Este tipo de tumor é incomum em países desenvolvidos, exceto em partes da
França, mas se encontra disseminado em países subdesenvolvidos e em
desenvolvimento, particularmente no sudeste da Ásia e no Brasil, principalmente em
indivíduos de classes sócio-econômicas menos favorecidas (SCULLY e PORTER,
2000).
Mais de 300.000 novos casos de câncer de células escamosas de cavidade oral
são diagnosticados por ano no mundo (PARKIN apud TSANTOULIS et al., 2007). Este
tipo de tumor é considerado como o sexto tipo mais comum de câncer no mundo
(BOYLE et al., 1992) e sétimo no Brasil, estando entre as principais causas de óbitos
por neoplasias. A estimativa de incidência de câncer de boca no Brasil para o ano de
2010, incluindo os cânceres de lábio e bucal, foi de 14.120 casos (www.inca.gov.br).
18
1.1.3 Diagnóstico, Prevenção e Tratamento
Há vinte anos, diagnósticos e tratamentos para câncer de cabeça e pescoço têm
sido aprimorados através de esforços combinados em cirurgias, radioterapia e
quimioterapia, mas as longas taxas de sobrevida têm sido melhoradas apenas
marginalmente e a taxa de sobrevivência de acima de 5 anos para pacientes com
carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (CCECP) está entre as mais baixas
entre os tumores mais prevalentes (HARDISSON, 2003).
O prognóstico de casos avançados de carcinoma de células escamosas de cabeça
e pescoço é particularmente ruim, devido à variação do comportamento biológico do
tumor. Atualmente, os únicos fatores específicos de prognóstico que são rotineiramente
considerados para se decidir o tratamento são o estágio, o local do tumor primário e a
presença de nódulos e metástases à distância (HARDISSON, 2003). A biópsia realizada
com anestesia local é considerada o melhor e o mais simples método, sendo a mais
usada para o diagnóstico. Radiografia intra-oral e tomografia computadorizada podem
ajudar a definir a extensão da lesão (ZAKRZEWSKA, 1999).
Segundo Zakrzewska (1999), o carcinoma pode se apresentar de várias
maneiras, mas a maioria das lesões são assintomáticas. A leucoplasia oral, definida
como uma mancha crônica branca na mucosa, é de fácil acesso para o diagnóstico e
pode ser considerada como um indicador de risco de carcinoma bucal (MAJUMDER et
al., 2005).
Segundo dados do INCA (www.inca.gov.br) a prevenção do câncer bucal deve
ser feita promovendo a higiene bucal, consultas odontológicas periódicas, combatendo o
tabagismo e o álcool e estimulando uma dieta saudável. A detecção precoce de lesões
pré-malignas também ajuda na prevenção deste tipo de tumor (ZAKRZEWSKA, 1999).
Os carcinomas são frequentemente tratados cirurgicamente, sendo este o fator
prognóstico mais importante para os pacientes (SAWAIR et al.,2003). Em casos em que
o tumor se encontra em estágios mais avançados, a remoção cirúrgica é combinada com
radioterapia e/ou com quimioterapia pós-operatória como tratamento adjuvantes
(HADDAD e SHIN, 2008).
A terapia do câncer bucal nem sempre é satisfatória (TANTOULIS et al., 2007).
Utilizando uma combinação de protocolos com radioterapia pré e pós operatória e/ou
juntamente com quimioterapia, a taxa de sobrevida de 2 e 5 anos para câncer avançado
diminui para 20% e 12%, respectivamente (REICHARD et al., 1993).
19
1.1.4 Fatores de Risco
As doenças complexas, incluindo o câncer, são baseadas em três fatores
principais: o estilo de vida, a exposição ambiental e a suscetibilidade genética. Sendo o
câncer uma das principais causas de morte em todo o mundo, a comunidade científica
tem dado grande ênfase ao estudo das características que tornam o indivíduo suscetível
a desenvolver tumores (AU et al., 2001).
Segundo Doll & Peto (apud HATAGIMA, 2002), estudos epidemiológicos
mostram que 80-90% de todos os cânceres são relacionados com fatores ambientais,
como hábito de fumar, exposição ocupacional e dieta.
O uso de cigarro é o comportamento predominante, com maior implicação em
doenças e na mortalidade em todos os países, sendo o tabaco um importante fator de
risco no desenvolvimento de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço
(JENSEN, JENSEN e GRAU, 2007), devido ao fato dos componentes do cigarro terem
a capacidade de formar aductos no DNA (SCULLY e BAGAN, 2007). As N-
nitrosaminas, aminas aromáticas e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PHA) são
considerados os maiores carcinógenos que contribuem para o carcinoma bucal
(BARTSCH et al., 2000).
O álcool também é considerado um fator de risco no desenvolvimento do câncer
bucal (OGDEN, 2005) e, embora a bebida e o cigarro sejam fatores de risco
independentes, eles apresentam um efeito sinergístico, ou seja, aumentam o risco do
desenvolvimento de câncer quando juntos (TSANTOULIS et al., 2007). O fato do
álcool ser considerado um fator de risco pode ser devido ao acetaldeído, o primeiro
metabólito do etanol a ser considerado um carcinógeno (SCULLY e BAGAN, 2007).
Alguns autores também indicam a presença do HPV como um fator de risco
(FORASTIERE et al., 2001 e TSANTOULIS et al., 2007), sendo que o DNA viral foi
encontrado em 91% das lesões orais em estudos realizados por Tsantoulis et al. (2007).
Os indivíduos mais acometidos pelo carcinoma da boca são do sexo masculino,
principalmente de meia idade, embora esteja aumentando a incidência desta patologia
entre indivíduos mais jovens, tabagistas e grupos populacionais de baixo poder sócio-
econômico (SCULLY e POTER, 2000). No Brasil, os números estimados para o ano de
2010 são de 10.330 entre homens e 3.790 entre as mulheres (www.inca.gov.br).
Embora o uso do tabaco e consumo de álcool sejam os maiores fatores de risco
para o carcinoma bucal, apenas uma fração das pessoas com esses hábitos desenvolvem
20
este tipo de tumor, sugerindo que existe uma variação individual nesses fatores que
contribuem para uma suscetibilidade genética na população (FRANCESCHI et al.,
1990). A identificação desses fatores genéticos que modulam o risco de carcinoma
bucal é particularmente importante para a identificação de sub-grupos de alto risco que
poderiam ser beneficiados em programas de prevenções primárias (SATHYAN et al.,
2006).
1.2 Câncer de Cavidade Bucal: aspectos genéticos e moleculares
Apesar da alta prevalência dos tumores de cabeça e pescoço, as alterações
genéticas envolvidas no comportamento maligno e progressão desses carcinomas não
são ainda completamente entendidas.
Estudos de investigação de anormalidades genéticas associadas com carcinomas
orais levaram à identificação de perda de regiões cromossômicas, como as da região 9p,
que foram encontradas em 70-80% das displasias estudadas por Califano et al. (1996),
sugerindo que esta perda é um evento inicial no processo de carcinogênese bucal. Além
disso, a perda da região 3p cromossômica, ativação de EGFR, alterações no gene TP53
e P16, além da superexpressão de Ciclina D1 também estão envolvidos na
transformação do epitélio normal a displasia e carcinoma bucal (LIPPMAN et al.,
2005).
Além de mutações raras em genes de alta penetrância, polimorfismos genéticos
também são considerados fatores que contribuem para o desenvolvimento de cânceres.
Embora geralmente associados a um pequeno aumento no risco de câncer, esses
polimorfismos são altamente prevalentes na população; sendo assim, a atribuição ao
risco de câncer pode ser alta (MATULLO et al., 2001).
Foram descobertos vários genes de reparo polimórficos, o que normalmente
ocorre por substituições nas bases do DNA. Estes polimorfismos ocorrem em resíduos
que são idênticos no homem, hamsters e camundongos, sugerindo que os aminoácidos
codificados são conservados evolutivamente (AGNEZ-LIMA, MEDEIROS e MAGGI,
2001).
A associação entre polimorfismos genéticos e marcadores moleculares
intermediários envolvidos na cascata de eventos de genotoxicidade/ carcinogênese pode
fornecer informações úteis na modulação de efeitos de polimorfismos genéticos, na
21
sucetibilidade individual ligada a carcinógenos ambientais e ocupacionais e à
possibilidade de ligação entre polimorfismos de reparo de DNA e taxa de reparo de
DNA (VODICKA et al., 2004).
Pesquisas realizadas abordando a prevalência de polimorfismos genéticos e
exposição a fatores ambientais poderão conduzir a resultados relevantes para a
compreensão da etiologia do câncer e, ainda, trazer novas contribuições sobre o
prognóstico e a terapia dessa doença (WÜNSCH e ZAGO, 2005).
O reparo de DNA é um processo que está constantemente operando nas células;
é essencial para a sobrevivência porque protege o genoma de danos e mutações nocivas.
Existe uma variedade de mecanismos de reparo, cada um catalisado por um conjunto
diferente de enzimas e os detalhes da etapa de excisão na reparação do DNA dependem
do tipo de lesão (ALBERTS et al., 1997).
Segundo Benhamou e Sarasin (2000), as vias de reparo do DNA são usualmente
específicas para as classes que determinaram o dano: mau-pareamento ou
anormalidades estruturais na forquilha de replicação são reparadas pela via de reparo de
mau pareamento; quebras de dupla fita são reparadas por processos de recombinação
homóloga ou ilegítima; bases danificadas são usualmente reparadas pela via de reparo
de excisão de bases (BER), e grandes lesões no DNA são exclusivamente reparadas pela
via de reparo por excisão de nucleotídeo (NER).
Vários estudos têm demonstrado a existência de uma grande variação inter-
individual na capacidade de reparo de DNA e de indivíduos com capacidade de reparo
de DNA abaixo da média da população, o que pode levar a um aumento do risco de
desenvolvimento de vários tipos de câncer (VODICKA et al., 2004).
Dentre os polimorfismos de reparo mais estudados destacam-se os genes do
reparo por excisão de nucleotídeos (NER), tais como os genes XPD (MATULLO et al.,
2001), os genes do reparo de quebra de dupla fita no DNA (reparo DSB), como o gene
XRCC3 (MATULLO et al., 2001 e VODICKA et al., 2004) e os genes envolvidos com
o reparo por excisão de bases (BER), como o XRCC1 (OLSHAN et al., 2002 e
MATULLO et al., 2001) e APEX1 (ITO et al., 2004; DE RUYCK et al., 2007).
22
1.2.1 Gene XRCC1
O gene XRCC1 (X-ray cross complementing group 1) apresenta um papel no
reparo por excisão de bases (BER) e também é requerido para um reparo eficiente de
quebra de fita simples (HUNG et al., 2005). Este gene contém 17 éxons e está
localizado no cromossomo 19q13.2 (LAMERDIN et al., 1995). A proteína codificada
pelo XRCC1 interage com a DNA polimerase β, PARP [poli (ADP ribose) polimerase
1] e DNA ligase III (CALDECOTT et al., 1996); apresenta um domínio BCRT,
característico de proteínas envolvidas nos checkpoints do ciclo celular e que reagem a
danos no DNA (Figura 1) (BORK et al., 1997). Essa interação pode facilitar o reparo de
lesões como quebras na fita de DNA e reparo por excisão de bases causadas por
radiação ionizante, danos oxidativos e aductos não grandes (OLSHAN et al., 2002).
Figura 1: Interação proteína-proteína mediada por XRCC1. NTD: Domínio N-
terminal, NLS: sinal de localização nuclear. Fonte: CALDECOTT, 2003.
O reparo por excisão de bases (BER) (Figura 2) é uma das mais importantes vias
de reparo contra danos no DNA (LINDAHL e WOOD, 1999), sendo responsável pela
remoção diária de mais de 10.000 lesões no DNA (KRWAWICZ et al., 2007).
Essa via de reparo é iniciada com o reconhecimento da base danificada ou
incorreta por DNA glicosilases específicas, sendo essas subdivididas em glicosilases
tipo I e tipo II. A glicosilase tipo I remove a base danificada deixando um sítio AP no
DNA, enquanto as enzimas tipo II removem a base e subsequentemente clivam o sítio
AP com uma endonuclease, aumentando a quebra na fita simples de DNA
(CHRISTMANN et al., 2003). Para a glicosilase tipo I, a incisão dentro da ligação
fosfodiéster do sítio AP ocorre por uma AP endonuclease, como por exemplo, APE1,
que pode interagir e estimular a ação do gene XRCC1 (VIDAL et al., 2001). A ação da
enzima glicosilase tipo I resulta em 5´desoxiribose-5-fosfato (5´dRP) e 3´OH, sendo a
23
remoção de 5´dRP um passo crítico para a escolha entre a via longa ou via curta deste
tipo de reparo (CHRISTMANN et al., 2003). O próximo passo é a inserção de um
primeiro nucleotídeo. Durante a via curta, 5´dRP é deslocado por uma DNA polimease
β (Pol β), que insere um único nucleotídeo no sítio AP (CHRISTMANN et al., 2003).
Ao contrário da via curta, vários passos adicionais ocorrem na via longa: após a
dissociação da Pol β, a fita de DNA é deslocada e a síntese de DNA é feita pela Polε ou
Polδ acompanhada pela PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) e FEN1
(structure-specific nuclease Flap endonuclease 1) (STUCKI et al., 1998). O último
passo é a ligação, que é feita por uma DNA ligase I e III. A ligase I interage com PCNA
e pol β, participando principalmente da via longa, já a ligase III interage com XRCC1,
Pol β e PARP1 e está envolvida somente na via curta (KUBOTA et al., 1996).
Os polimorfismos no gene XRCC1 têm sido associados com o risco de muitos
cânceres relacionados ao cigarro, como câncer de pulmão, bexiga e esôfago (GOODE,
ULRICH e POTTER 2002) e carcinoma bucal (MATULLO et al., 2001; OLSHAN et
al., 2002; MAJUMDER et al., 2005).
Embora muitos polimorfismos tenham sido documentados no gene XRCC1
(HAN et al., 2003), dois diferentes polimorfismos: Arg194Trp (troca alelica C→T rs:
1799782) e Arg399Gln (troca alélica G→A rs: 25487 ) têm demonstrado alterações na
capacidade de reparar o DNA em alguns fenótipos estudados (LUNN et al., 1999;
DUELL et al., 2000; MATULLO et al., 2001; WANG et al., 2003). Devido a este
importante papel na capacidade de reparar bases, a variabilidade na expressão de
XRCC1 tem sido examinada extensivamente em relação a doenças relacionadas com a
idade, incluindo o câncer (GOODE, ULRICH e POTTER, 2002).
O polimorfismo no códon 194 não se encontra mapeado dentro de um domínio
BRCT do gene XRCC1, entretando, a variante Arg399Gln (éxon 10) se encontra dentro
do domínio BRCT1, uma região de extensa homologia ao BRCA1 e inclui sítios de
ligação para PARP (RAMACHANDRAN, 2006). Dessa maneira, alterações nos
aminoácidos dessa enzima poderiam diminuir sua eficiência no processo de reparo.
24
Figura 2: Reparo por excisão de bases. Fonte: CHRISTMANN et al., 2003.
1.2.2 Gene XRCC3
O gene XRCC3 (X-ray cross complementing group 3) é um membro da família
de genes de reparo de DNA Rad51 (HU et al., 2001) e participa do reparo de
quebra/recombinação de dupla fita de DNA (LIU et al., 1998).
Quebras de fita dupla de DNA são geradas por radicais produzidos
endogenamente e agentes exógenos como radiação ionizante. O reparo de quebra de fita
dupla (DSB) é de fundamental importância para prevenir fragmentação cromossômica,
translocações e deleções (KANAAR, HOEIJMAKERS e VAN GENT, 1998). Existem
25
duas principais vias de reparo de quebra de fita dupla, recombinação homóloga (HR) e
não homóloga (NHEJ), as quais são, respectivamente, livres e propensas a erro
(CHRISTMANN et al., 2003). A recombinação homóloga requer uma extensa região de
DNA homólogo e o reparo DSB usa a informação da cromátide irmã não danificada ou
do cromossomo homólogo, enquanto a recombinação não homóloga não utiliza este tipo
de molde, sendo, portanto, mais suscetível a erro (KANAAR, HOEIJMAKERS e VAN
GENT, 1998).
Durante a recombinação homóloga (Figura 3), o cromossomo danificado entra
em contato físico com a molécula de DNA não danificada, sendo esta usada como
modelo para o reparo (CHRISTMANN et al., 2003). O processo de reparo é iniciado
com um complexo protéico denominado MRN (MRE11-Rad51-NBS1) e ATM
(proteína mutada Ataxia Telangiectasia) (KARRAN, 2000) que fazem um corte no
sentido 5’→3’ no DNA (CHRISTMANN et al., 2003). Esse corte na extremidade do
DNA é requerido para gerar uma cauda de fita simples de DNA 3’, que será o substrato
para a recombinação homóloga (AGARWAL, TAFEL e KANAAR, 2006). A proteína
Rad51, em seguida, polimeriza a cauda 3’ para formar um filamento nucleoprotéico,
que tem como função procurar DNA homólogo (KANAAR, HOEIJMAKERS E VAN
GENT, 1998). Na montagem do filamento nucleoprotéico a atividade da Rad51 é
facilitada pela ação de diferentes proteínas, principalmente Rad51B, C e D; XRCC2 e
XRCC3 (WIESE et al., 2002). Esse filamento nucleoprotéico invade então o “duplex”
no sítio de homologia do DNA não danificado, criando um D-loop. Essa molécula
ligada entre a cromátide irmã “quebrada” e a cromátide irmã intacta é usada como
molde para a DNA polimerase, como a informação da sequência que foi perdida no
processamento inicial da DSB. Em seguida, ocorre a ligação das fitas de DNA e a
separação das moléculas ligadas às duas cópias intactas do DNA (AGARWAL, TAFEL
e KANAAR, 2006).
O sistema NHEJ liga-se às duas extremidades da quebra de fita dupla sem
requerer a sequência homóloga entre os dois finais do filamento de DNA
(CHRISTMANN et al., 2003). O primeiro passo nesse tipo de reparo é a ligação de um
complexo heterodímero de proteínas Ku 70 e Ku 80 à região danificada do DNA. Essa
ligação sequencial ativa a função de fosforilação de proteínas quinases dependentes de
DNA (DNA-PKcs), fosforilando ela mesma, o hetrodímero Ku e outras proteínas
envolvidas no ciclo celular (WETERINGS e van GENT, 2004). Isso facilita a ligação de
26
um complexo DNA ligase IV/Xrcc4 (KARRAN, 2000); esse complexo liga-se às
extremidades das moléculas, unindo-as (AGARWAL, TAFEL e KANAAR, 2006).
Figura 3: Reparo Homólogo de quebra de dupla fita. Fonte: CHRISTMANN et al., 2003
O gene XRCC3 está localizado no cromossomo 14q32.3 (MANUGUERRA et
al., 2006) e apresenta uma variação na sequência do éxon 7 (rs: 861539), a qual resulta
em uma substituição do aminoácido no códon 241 (Thr241Met), que pode afetar a
função da enzima e/ou a interação desta com outras proteínas envolvidas em danos e
reparo do DNA (MATULLO et al., 2001).
Estudos mostram que há uma relação positiva entre o polimorfismo Thr241Met
e câncer de mama (SMITH et al., 2003) e de pulmão (JACOBSEN et al., 2004), e
também uma associação com carcinoma de células escamosas de cavidade bucal
(KIETTHUBTHEW et al., 2006).
27
Células mutantes para XRCC3 apresentam uma hipersensibilidade moderada à
radiação ionizante e devido à sensibilidade dessas células a drogas que causam
crosslink, esse gene tem sido candidato a ser um dos responsáveis pelo reparo por
recombinação homóloga (BRENNEMAN et al., 2000).
1.3 Resistência ao Tratamento
O uso de drogas citotóxicas na quimioterapia contra o câncer tornou-se uma
rotina a partir da década de 50 e embora muitos tipos de tumores tenham se tornado
refratários ao tratamento, as perspectivas de sobrevida para pacientes com alguns tipos
de tumores aumentaram após anos de intervenção (FERGUSON e PEARSON, 1996).
A terapia contra o câncer envolve a exposição do indivíduo a agentes que matam
as células cancerosas de uma maneira mais eficiente que as células de tecidos normais.
As células tumorais proliferam mais rapidamente que células normais, assim, muitas
drogas têm como alvo o ciclo celular. Existem várias maneiras de barrar a divisão
celular, entretanto, o meio mais comum é explorar os efeitos de drogas que causam
danos ao DNA, levando assim, a uma parada do ciclo celular e à morte da célula.
Contudo, a toxicidade de drogas que causam esses danos pode ser reduzida pela
atividade de várias vias de reparo do DNA, que removem lesões antes destas se
tornarem tóxicas para a célula. Portanto, a eficácia da terapia baseada em drogas que
causam danos no DNA pode ser modulada por vias de reparo a danos no DNA
(HELLEDAY et al., 2008).
Outro fator associado à resistência do tratamento é a alteração na expressão de
genes reguladores de apoptose, que podem alterar a sensibilidade das células após o
tratamento. Um exemplo disso está no fato de que células com alto nível de expressão
de inibidores de apoptose ou baixo nível de promotores de apoptose requerem um alto
nível de danos antes de iniciarem o processo de morte celular (KARTALOU e
ESSIGMANN, 2001).
1.3.1 Cisplatina e Resistência
O cis-Diamminedichloroplatinum (II) (cisplatina ou cis-DDP) (Figura 4) é um
28
agente quimioterápico amplamente utilizado em terapias, mostrando uma significante
atividade anti-tumor contra cânceres de testículos, ovário, cabeça e pescoço e pulmão
(KARTALOU e ESSIGMANN, 2001). Sua principal atividade citotóxica é baseada na
formação de aductos de DNA, o qual causa crosslink inter- e intrafita (JUN et al.,
2008).
Figura 4: Estrutura do quimioterápico cisplatina (Fonte: KARTALOU e
ESSIGMANN, 2001).
A cisplatina torna-se ativada intracelularmente por um processo do tipo
hidratação, no qual moléculas de água são incorporadas ao composto, no caso da
cisplatina, deslocando um ou dois cloros da sua estrutura (KELLAND, 2007). A baixa
concentração celular de íons cloro facilita este processo e após essa transformação, a
cisplatina se torna mais reativa a alvos celulares (WANG e LIPPARD, 2005).
A molécula transformada é então capaz de interagir com moléculas dentro da
célula, incluindo DNA, RNA e proteínas (RABIK e DOLAN, 2007). Ao se ligar
covalentemente a molécula de DNA, forma aductos na molécula de DNA (KELLAND,
2007). O átomo de platina da cisplatina forma uma ligação covalente na posição N7 das
bases purina, principalmente crosslinks 1,2 e 1,3-intrafita (WANG e LIPPARD, 2005),
formando também crosslinks inter-fita, entretanto, essas representam menos de 1% das
lesões induzidas pela cisplatina (SANDERSON et al., 1996) (Figura 5).
Esse processo de formação de aductos ativa sinais de várias vias de transdução,
como, por exemplo, os envolvidos no reconhecimento de danos e reparação de DNA, a
parada do ciclo celular, e morte celular programada / apoptose (KELLAND, 2007).
29
Figura 5: Formação e efeitos dos aductos de cisplatina (Fonte: WANG e LIPPARD,
2005).
Logo após o início do uso da cisplatina como uma promessa no tratamento de
diversos tipos tumorais, a atenção se voltou para estudos envolvendo resistência a essa
droga, já que alguns tumores apresentam uma resistência intrínseca a este tratamento ou
são capazes de desenvolver essa resistência (STEWART, 2007). Vários trabalhos
mostram diversos tipos de mecanismos de resistência à cisplatina, como aumento do
efluxo, inativação da droga por proteínas intracelulares como glutationas, aumento da
capacidade de replicação mesmo com danos no DNA, aumento das taxas de reparo de
aductos causados pela cisplatina e defeitos na via de resposta à morte celular
programada (STEWART, 2007; KARTALOU e ESSIGMANN, 2001; BRENES et al.,
2007).
No tratamento dos cânceres de cabeça e pescoço, a quimioterapia é usada como
um tratamento paliativo quando o paciente apresenta recorrência local do tumor ou
metástases (ZAKRZEWSKA, 1999); entretanto, apenas 20-30% dos pacientes
apresentam resposta a agentes platina (RABIK e DOLAN, 2007)
1.3.2 Reparo por excisão de nucleotídeos, Gene ERCC1 e Gene XPA
O reparo a danos no DNA apresenta um importante papel na modulação da
citotoxicidade da cisplatina (WANG e LIPPARD, 2005). O reparo por excisão de
nucleotídeos (NER- Nucleotide Excsion Repair) é considerado como uma das mais
importantes vias que mantém a integridade do genoma por reconhecimento e excisão de
30
uma variedade de crosslinks causados por cisplatina e radiação (MURRAY e
ROSENBERG, 1996).
O reparo por excisão de nucleotídeos é uma via altamente conservada que repara
lesões que alteram a estrutura helicoidal da molécula de DNA e interfere na replicação e
transcrição. Importantes passos nessa via incluem o reconhecimento do dano no DNA e
a demarcação da área específica afetada, seguida pela formação de um complexo que
faz a excisão da área danificada; o passo final envolve a síntese da área excisada e a
ligação da molécula de DNA (MARTIN, HAMILTON e SCHILDER, 2008).
Duas vias do reparo por excisão de nucleotídeos tem sido descritas: uma via
chamada Reparo por Excisão de Nucleotídeos Acoplada à Transcrição (TCR –
Transcription-coupled Nucleotide Excision Repair), que apresenta como alvo lesões na
fita transcrita de genes expressos, e uma via chamada Reparo por Excisão de
Nucleotídeos Global do Genoma (GGR – Global Genome Nucleotide Excision Repair)
que repara lesões no resto do genoma (GOSSAGE e MADHUSUDAN, 2007).
O gene ERCC1 (Excision repair cross-complementation group 1), localizado no
cromossomo 19q13.2-q13.3 (www.ncbi.nlm.nhi.gov) apresenta um papel chave no
reparo por excisão de nucleotídos e na remoção de aductos no DNA causados por
agentes platina (STEWART et al., 2007). Esse gene participa da via de reparo GGR e
formando um heterodímero com o “Xeroderma Pigmentosum group F” (XPF), que faz a
excisão do segmento de nucleotídeos contendo as lesões (SHIMIZU et al., 2008)
(Figura 6 ).
Segundo Damia, Guidi e D´Incalci (1998), a cisplatina causa um aumento dose
e tempo dependente na expressão de mRNA- ERCC1 e proteína ERCC1 em células de
câncer de ovário, sendo que sua superexpressão está associada com a redução da
eficácia deste tipo de tratamento em alguns cânceres (STEWART et al., 2007). Em
SCCHN, a alta expressão do gene ERRC1 foi correlacionada como um fator de risco
para pacientes tratados com uma combinação de quimioterapia, radioterapia e cirurgia
(JOSHI et al., 2005).
O gene XPA (Xeroderma Pigmentosum, complementation group A) localizado
no cromossomo 9q22.3 (www.ncbi.nlm.nhi.gov) assim como o gene ERRC1, participa
do reparo GGR (Figura 6) e codifica uma proteína chamada dedo de zinco, que faz parte
de um complexo de reparo por excisão de nucleotídeos (www.ncbi.nlm.nhi.gov), sendo
responsável pelo reconhecimento da lesão (BENHAMOU e SARASIN, 2000). O
aumento da expressão de mRNA desse gene é observado em tecidos tumorais de ovário
31
em pacientes resistentes à quimioterapia, quando comparado aos níveis em tecidos de
pacientes que respondem ao tratamento (DABHOLKAR et al.,1994). A superexpressão
desse gene também foi verificada em um trabalho realizado com linhagens celulares de
câncer de pulmão de células não pequenas (WEAVER et al., 2005). Entretanto, não
existem dados na literatura relacionando a expressão deste gene com a resistência à
cisplatina em carcinoma bucal.
Figura 6: Reparo por Excisão de Nucleotídeos Global do Genoma (Fonte: GOSSAGE e
MADHUSUDAN, 2007).
1.3.3 Resposta à Apoptose e Gene BAX
Apoptose é uma via de morte celular programada que é iniciada por uma
ativação sequencial de proteases cisteína da família caspase e é dividida em duas vias,
uma extrínseca e uma intrínseca (ADAMS, 2003). A via intrínseca (também chamada
“via mitocondrial” ou “via de estresse”) ativa a Caspase-9 quando Citocromo C é
liberado da mitocôndria danificada em resposta a estresses diversos, como danos ao
DNA. Essa caspase iniciadora pode clivar e ativar caspases efetoras (-3, -6 e -7) que
32
mediam a desorganização celular por clivagem múltipla de proteínas celulares criticas
(ADAMS e CORY, 2007).
Apoptose induzida por cisplatina é geralmente resultado da capacidade desta
droga de danificar o DNA (EASTMAN, 1990). Agentes quimioteráipicos que usam essa
estratégia são dependentes da ativação da via mitocondrial por meio de uma cascata
intacta de caspases. Essa via apoptótica é regulada por membros pró e anti- apoptóticos
da Família Bcl2 (TAKAOKA et al., 2007). Como a apoptose é um processo regulado,
alterações bioquímicas que tornam as células mais ou menos suscetíveis a apoptose
podem afetar a sua sensibilidade a um grande número de agentes antineoplásicos
(KAUFMANN e EARNSHAW, 2000), como por exemplo a cisplatina, e segundo
Kartalou e Essigmann (2001), células que apresentam altos níveis de inibidores
apoptóticos ou baixos níveis de promotores dessa via, poderiam requerer altos níveis de
danos antes de iniciar a via de morte celular.
O gene BAX (BCL2-associated X protein) localizado no cromossomo 19q13.3-
q13.4 codifica uma proteína pertencente à Família de proteína Bcl2. Esta proteína forma
um heterodímero com BCL2 e funciona como um ativador de apoptose na célula. A
proteína interage com o canal de voltagem ânion dependente da mitocôndria e aumenta
a intensidade da sua abertura, o que leva à perda do potencial de membrana, levando à
liberação do citocormo c. A expressão desse gene é regulada pelo gene TP53 e parece
estar envolvida em apoptose mediada por esse gene supressor tumoral
(www.ncbi.nlm.nih.gov). Por ser um gene que induz morte celular programada, a
alteração de sua expressão pode estar envolvida no mecanismo de resistência a drogas
que causam danos ao DNA. Essa resistência foi observada em uma linhagem celular de
ovário resistente à cisplatina (PEREGO et al., 1996). Entretanto, em um trabalho
realizado com linhagens celulares de hepatoma, os autores não encontraram alteração na
expressão do gene BAX (BRENES et al., 2007).
2.OBJETIVOS
2.1 Gerais:
• Verificar a freqüência de variantes alélicas em genes de reparo a danos no DNA
em pacientes com carcinoma de células escamosas de cavidade bucal e
indivíduos controles e se existe alteração de expressão de genes ligados à
resistência a quimioterapia em células submetidas ao quimioterápico cisplatina.
33
2.2 Específicos:
• Determinar as freqüências genotípicas de três variantes polimórficas nos genes
de reparo do DNA: XRCC1 e XRCC3 em pacientes com carcinoma bucal e em
indivíduos controles sem histórico de neoplasia.
• Realizar um estudo de associação do tipo caso-controle para avaliar se os genes
selecionados constituem bons marcadores moleculares de suscetibilidade ao
câncer bucal, visando determinar sub-populações mais suscetíveis a este tipo de
câncer.
• Correlacionar os dados moleculares com aspectos histopatológicos relevantes.
• Implantar a técnica de extração de RNA e PCR em Tempo Real no laboratório
de Mutagênese e Oncogenética por meio da investigação da expressão de genes
de reparo (XPA e ERCC1) e de controle de apoptose (BAX) em células tumorais
tratadas com cisplatina.
34
3.ARTIGOS
35
3.1 ARTIGO 1
Presence of allelic variants in XRCC1 and XRCC3 repair genes do not increase
susceptibility of oral cancer in Brazilian patients.
Artigo a ser submetido a Journal of Oral Pathology & Medicine
ISSN: 1600-0714
Fator de Impacto: 1,63
36
Presence of allelic variants in XRCC1 and XRCC3 repair genes do not increase
susceptibility of oral cancer in Brazilian patients.
Mariana Bisarro dos Reis
1
; Roberta Losi Guembarovski
1
; Enilze Maria de Souza
Fonseca Ribeiro
2
; Iglenir João Cavalli
2
; Maria Celeste Morita
3
; Gyl Ramos
4
, Benedito
W. Oliveira
4
, Lauro Toyshi Mizuno
5
, Silvia Regina Rogatto
6
, Ilce Mara de Syllos
Cólus
1
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina (Londrina – PR -
Brazil)
2
Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná (Curitiba - PR-Brazil)
3
Departamento de Medicina Oral e Odontologia Infantil, Universidade Estadual de
Londrina (Londrina - PR-Brazil)
4
Hospital Erasto Gaertner, Serviço de Cabeça e Pescoço (Curitiba-PR-Brazil)
5
Centro Odontológico Norte do Paraná, Universidade Estadual de Londrina, Londrina,
Brazil
6
Departamento de Urologia, Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade
Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (Botucatu- SP- Brazil)
37
Abstract
Background: DNA repair capacity is essential in maintaining cellular functions and
homeostasis. However, this capacity can be altered based on DNA sequence variations
in DNA repair genes and thus may contribute to the origin of cancer. Many single
nucleotide polymorphisms (SNPs) in repair genes have been found to be associated with
oral cancer. The aim of this study was to investigate the relationship between the
presence of allelic variants rs: 1799782 and rs: 25487 of XRCC1 gene and rs: 861539 of
XRCC3 gene and susceptibility to oral cancer and to correlate the results of genetic
testing to histopathological parameters of patients.
Methods: Genomic DNA was extracted by "salting out". Genotyping by PCR-RFLP
was carried out on 150 patients with oral squamous cell carcinoma and 150 controls.
Results and conclusions: Presence of the polymorphic variants of XRCC1 gene: codon
194 (OR 0.82, 95% CI 0.44-1.51), codon 399 (OR 0.94, 95% CI 0.59-1.50) and XRCC3
gene (OR 0.72; 95% CI 0.45-1.16) were not associated with increased risk of oral
cancer. The combinational analysis also indicated no association. When compared the
analysis of allelic variants of genes with the histopathological parameters: tumor
differentiation, lymph node invasion and tumor size, data were not statistically
significant. These results suggest that the allelic variants studied are not suitable
markers for susceptibility to carcinomas of the oral cavity and are also not related to
later stages of such tumor.
Key words: XRCC1, XRCC3, polymorphisms, oral cancer, histopathological parameters
38
Introduction
DNA damage plays a central role in carcinogenesis and, consequently, genes
involved in DNA repair are considered key genes in cancer development (1).
Recent genetic association studies on cancer risk have focused the identification
of the effects of single nucleotide polymorphisms in some genes, among which DNA
repair genes, that are increasingly studied because they have a critical role in
maintaining genome integrity (2). Although these polymorphisms are associated with a
slight individual cancer risk, they are prevalent in population, so may contribute to
determine populational risks of cancer (3).
Oral cancer is the sixth most frequent cancer worldwide (4) and the estimated
incidence of oral cancer in Brazil for 2010 was 14.120 cases (5). Some repair genes
have been reported to be associated with oral cancer, among them, the genes of X-ray
repair cross complementing 1 and 3 (XRCC1 and XRCC3).
The DNA repair gene XRCC1 gene codes for a protein involved in base excision
repair (BER) of damaged bases caused by endogenous and exogenous oxidant and in
the repair of single-strand breaks (SSB) (6). The product of this gene interacts with
DNA polymerase, poly(ADP)ribose polymerase, and DNA ligase III and also contains a
BRCA1 COOH terminus domain, which is characteristic of proteins involved in cell
cycle checkpoint functions (7).
Several polymorphisms are described for the XRCC1 gene, however three
polymorphisms occurring at conserved sequences in this gene and were found at codons
194 (Arg-Trp), 280 (Arg-His) and 399 (Arg-Gln) in a study realized by Shen et al. (8).
The polymorphism at codon 194 (rs: 1799782) results in a nonconservative substitution
occurring within a hydrophobic core and this change is not mapped into a BRCT
domain of XRCC1 gene, however the variant Arg399Gln (exon 10) (rs: 25487) is within
of the domain BRCT1, a region of extensive homology to the BRCA1 and includes
binding sites for PARP (9). Thus, these changes in amino acids of this enzyme could
affect its efficiency in repair process.
A common variant of XRCC3, comprise a threonine to methionine substitution at
amino acid position 241 (rs: 861539) and this is a change that can affect the function of
the enzyme and / or its interaction with other proteins involved in damage and DNA
repair (3). This gene is involved in the repair of DNA double-strand breaks (DSB)
39
through the process of homologous recombination (HR) (10) and this repair is important
to prevent chromosomal fragmentation, translocations and deletions (11).
Some studies have linked the polymorphism in XRCC3 gene with breast cancer
(12), lung cancer (13), and also an association with squamous cell carcinoma of the oral
cavity (14).
In the present report we attempt to investigate associations between DNA repair
genetic polymorphisms (XRCC1 Arg194Trp and Arg399Gln, and XRCC3 Thr241Met)
and their association with the risk of oral squamous cell carcinoma (OSCC) in Brazilian
patients. Because there are no work that study variations in these genes and tumor
aggressiveness, we also correlated the molecular data with histopathological parameters
of patients.
Material and Methods
Studied Population
The case group comprised 150 patients (57.52 ± 11.85 range 22-84 years) with a
histopathologically confirmed diagnosis of oral squamous cell carcinoma that were
recruited from Hospital Erasto Gaertner (PR), Hospital do Câncer de Londrina (PR),
Hospital A.C Camargo (SP) and Faculdade de Medicina de Botucatu (SP) in Brazil. A
total of 150 normal controls (57.27±11.89 range 22-82 years) were also included. All
the controls were matched to patients by sex, age, ethinicity and tabagist habit. Research
protocols were approved by the Ethics Committee of the participant institutions and
written informed consent was obtained from all individuals.
Histopathologic analysis was performed with HE staining (hematoxylin-eosin)
routine, for clinical confirmation. The pathological classification of tumors was
performed according to international standards established by the International
Classification of Tumors (WHO). Clinical staging was determined according to the
TNM staging (size, lymph node invasion, tumor differentiation) of cancer.
40
Genetic polymorphism
The polymerase chain reaction (PCR) was performed in 20µL reaction buffer
containing 12.5 pmol each primer, 2 mM of dNTPs, 1.5 mM of MgCl
2
, about 100 ng
DNA and 1 U of Taq DNA polymerase. PCR was carried out in a PXE 0.2 Thermal
Cycler thermocycler. PCR was performed on each DNA sample using the primer
sequences, annealing temperatures and restriction enzymes for RFLP that are detailed in
Table 1. All the RFLP fragments were determined on 2.5% agarose gels stained with
etidium bromide.
Statistical Analysis
The comparison of the gene frequencies observed in patients and controls was
performed using contingency tables to calculate the odds ratios (OR) with a confidence
interval (CI) of 95%, in an association study. For these genes, which the three genotypes
were identified, a 3x2 contingency table was constructed taking the wild genotype as
reference (OR=1.0) to determine the OR value for heterozygote and rare genotypes,
using the program DPP Braile Biomedical (http://www.braile.com.br).
The different genotypes of XRCC1 and XRCC3 were compared with the
histopathological parameters: tumor differentiation, lymph node invasion and tumor
size, using the Fisher’s Exact Test.
41
Table 1: Summary on PCR-RFLP assay of polymorphisms in DNA repair genes
F= Forward primer; R= Reverse primer; Ta= Annealing temperature
P= Prevalent genotype; H= Heterozygous genotype; R= Rare genotype
Gene
Polymorphism PCR primer PCR
product
(bp)
Restriction
enzyme
Fragments identifying
genotypes (bp)
Genotypes Reference
Arg194Trp F=5’GCCAGGGGCCCCTCCTTCAA3’ 485 PvuII CC=485 P
R=5’TACCCTCAGACCCACGAGT3’ CT=485/396/89 H (15)
Ta= 63° C TT=396/89 R
XRCC1
Arg399Gln F=5’TCTGTCTCCCCTGTCTCGTT3’ 239 HpaII GG=187/52 P
R=5’ATTGCCCAGCACAGGATAAG3’ GA=239/187/52 H (16)
Ta=60°C AA=239 R
XRCC3
Thr241Met F=5’GGTCGAGTGACAGTCCAAAC3’ 456 NlaIII CC=316/140 P
R=5’TGCAACGGCTGAGGGTCTT3’ TC=316/211/140/105 H (16)
Ta=63°C TT=211/140/105 R
42
Results
Characterization of sample is summarized in Table 2. Because of frequency-
matching by age, there were no differences in the mean age between cases (57.52 ± 11.85
range 22-84 years) and controls (57.27±11.89 range 22-82 years).
Table 2: Characteristics of the study population.
Cases Controls
Gender
N % N %
Male 122 81.33 122 81.33
Female 28 18.67 28 18.67
Ethnicity
Euro descendants 134 89.34 134 89.34
African descendants 14 9.33 14 9.33
Asian descendants 2 1.33 2 1.33
Smoke Status
Yes 129 86 129 86
No 21 14 21 14
Association between polymorphisms for DNA repair genes and oral cancer
In this work we studied 150 patients for the XRCC1 polymorphisms (Arg194Trp
and Arg399Gln). It was not possible to amplify some samples for XRCC3 gene, so just 144
individuals were genotyped.
The genotype distributions for individual DNA repair genes are shown in Table 3.
Statistical analysis showed no positive or negative association between
polymorphisms Arg194Trp (OR 0.82, 95% CI 0.44-1.51) and Arg399Gln (OR 0.94, 95%
CI 0.59-1.50) of XRCC1 gene and risk of oral cancer. For the XRCC3 gene polymorphism,
there was no association between the variant allele and cancer study (OR 0.72; 95% CI
0.45-1.16).
All possible combined analysis between the three polymorphisms studied were
analyzed and were not statistically significant (Data not show).
43
Table 3:
Frequencies of allelic variants isolated for XRCC1 and XRCC3 genes in patients with oral
cancer and matched controls.
Case Controls OR (CI 95 %) Gene/
Polymorphism
Genotypes
Nº % Nº %
C/C(Arg/Arg) 127 84.67 123 82 Reference
C/T(Arg/Trp) 23 15.33 24 16 0.92 (0.49-1.73) p=0.93
T/T(Trp/Trp) 0 0 3 2 ------
XRCC1
Arg194Trp
C/T and T/T 23 15.33 27 18 0.82 (0.44-1.51) p=0.64
G/G (Arg/Arg) 64 42.67 62 41.33 Reference
G/A (Arg/Gln) 62 41.33 54 36 1.11 (0.67-1,84) p=0.77
A/A (Gln/Gln) 24 16 34 22.67 0.68 (0.36-1.28) p=0.30
XRCC1
Arg399Gln
A/G and A/A 86 57.33 88 58.67 0.94 (0.59-1.50) p=0.90
C/C (Thr/Thr) 63 43.75 52 36.11 Reference
C/T(Thr/Met) 72 50 78 54.17 0.76 (0.46-1.24) p=0.33
T/T(Met/Met) 9 6.25 14 9.72 0.53 (0.21-1.32) ) p=0-25
XRCC3
Thr241Met
C/T and T/T 81 56.25 92 63.89 0.72 (0.45-1.16) p=0.23
Association between polymorphisms for DNA repair genes and histopathologic
parameters
In relation to the degree of tumor differentiation was possible to obtain information
from the medical records of 127 patients. Of these, 14 (11.02%) had well differentiated
tumors (Grade I), 74 (58.27%) moderately differentiated tumors (Grade II) and 39
(30.71%) poorly differentiated tumors (Grade III).
For the parameter invasion of regional lymph nodes, information was available for
131 patients (85% of the sample). Of these, 72 (54.96%) had lymph node involvement and
59 (45.04%) had no impairment.
The analysis of tumor size was possible for 124 samples. Of these, 51 (41.13%)
patients showed tumors with T1 and T2 and 73 (58.87%) patients with T3 and T4 in TNM
Classification of Malignant Tumors.
The analysis of three polymorphisms in relation to histopathological parameters
44
(invasion of regional lymph nodes, differentiation and tumor size) showed that the
presence of allelic variants was not associated with a more aggressive or more advanced
stage of tumors. The data are presented in Tables 4.
Table 4: Distribution of patients with presence or absence of risk genotypes in relation
to the regional lymph nodes invasion, tumor differentiation and tumor size.
XRCC1 Arg194Trp XRCC1 Arg399Gln XRCC3Thr241Met
Analyzed
Parameters
Risk Genotype
Regional Lymph
nodes Invasion
P A P A P A
With
13 59 42 30 41 29
Without
8 51 34 25 30 27
Fisher’s Exact Test
1.32 (IC 95%=0.59-2.99)
p= 0.62
1.01(IC 95%=0.75-1.36)
p=1.00
1.11 (IC 95%=0.81-
1.52)
p=0.59
Tumor
Differentiation
P A P A P A
Grade I and II
13 75 48 40 50 36
Grade III
9 30 26 13 20 17
Fisher’s Exact Test
0.64 (IC 95%=0.30-1.37)
p=0.31
0.81 (IC 95%=0.61-1.1)
p=0.24
1.076(IC 95%=0.76-
1.52)
p=0.69
Tumor Size
P A P A P A
T1 and T2
7 44 27 24 25 26
T3 and T4
13 60 45 28 39 31
Fisher’s Exact Test
0.77 (IC 95%=0.33-1.80)
p=0.63
0.86 (IC 95%=0.62-1.18)
p=0.36
0.88(IC 95%=0.62-1.24)
p=0.58
P= Presence of risk genotype; A= Absence of risk genotype
45
Discussion
A large percentage of cancers have been associated with environmental risk factors.
The head and neck squamous cell carcinoma is a heterogeneous disease with distinct
patterns of presentation and behavior (17), and is an example of carcinogenic process
triggered by environmental factors. The accurate functioning of the DNA-repair proteins is
a crucial step in maintaining genomic homeostasis and preventing carcinogenesis (18) and
polymorphisms in repair genes could alter individual susceptibility to cancer.
Although a large number of studies have been undertaken in respect of strategies to
prevent oral cancer, few studies are known about the clinical significance of single
nucleotide polymorphisms (SNPs) in DNA repair genes and its possible role as tool for
identifying high risk sub-groups (9).
Brazilian population is one of the most heterogeneous (19) in the world with a
mixture of native indigenous people and immigrants from Europe, Africa and Asia and
beyond that polymorphisms in some genes show different frequencies in different
populations (20). When studying samples from Brazilian individuals must also take into
account the heterogeneity, because both factors make it difficult to compare data obtained
from homogeneous populations with the Brazilian population.
Studies of allelic variants in repair genes are of great importance since they are
responsible for correct damaged nucleotide residues generated by exposure to carcinogens
and so maintaining cellular functions and homeostasis. Besides that, access to care with
oral health has been hindered in Brazil, because of bad condition of major part of
population, which makes difficult to prevent and diagnoses early disease.
In this study we analyzed the allelic variants of genes involved in repair processes
of DNA damage (XRCC1 and XRCC3), since many studies have indicated that some allelic
variants in these genes are associated with cancers related to exposure to environmental
carcinogens (15). We did not found the association between the Arg194Trp and
Arg399Gln (XRCC1 gene) and significant differences in cancer development. Studies with
these variants are controversial in the literature since some authors found positive results
and others not. Ramachandran et al. (9) reported the Arg194Trp is associated with an
increased risk of oral cancer in a Indian population and a marginally significant risk of oral
cancer was observed in a case-control study in Thailand (14).
46
Kietthubthew et al. (14) found a protective effect against oral cancer for the
presence of the homozygous variant 399Gln, although the presence of this genotype was
associated with a reduction in the excision repair of bases. However Sturgis et al. (15)
found a positive relationship with the presence of this genotype and smoking (OR= 3.18
IC95% 1.28 – 7.94). In a metaanalysis conducted by Hung et al. (21) with various tumor
types, was observed the modification of the effect of the XRCC1 Gln/Gln genotype by
tobacco smoking. Although the sample of this study was composed of 86% smokers, we
found no change in the risk of oral cancer and the presence of this polymorphism.
We also studied the XRCC3 polymorphism (Thr241Met) and no association was
found between this variant and an increased risk of oral cancer. This gene participates in
the repair of DNA double-stranded breaks and this type of damage is the most common
lesion in the genome and can occur as a result of multiple damaging agents, such as
ionizing radiation or chemical exposure (22).
Similar results to those found in this study were seen by Yen et al. (23), who found
a higher frequency of allelic variant 241Met between the control group and by Huang et al.
(24), which found no association between the variant and the risk of head and neck cancer.
An association of this allelic variant with oral cavity cancer was observed by Kietthubthew
et al. (15) in a study conducted in Thai population. Shen et al. (25) also observed an
association of this variant in squamous cell of head and neck cancer for women and also
smokers individuals.
However, the study of allelic variants isolated has no big information power as the
combined analysis. According Yen et al. (23), the combined analysis of the allelic variants
is justified by the fact that the interaction between these variants within the same gene, and
variants of multiple genes is widely accepted as a factor that influence the oral
carcinogenesis. When the analysis was performed for the combined risk genotypes of
XRCC1 and XRCC3 genes studied in the present study, the OR indicated no association
between allelic variants and OSCC.
Regarding the association of genotypes and histopathological data, no analysis was
statistically significant. Thus, the risk genotypes did not influence the later differentiated
tumor, regional lymph nodes invasion or tumor growth. The histopathological criteria are
extremely important to define and support the diagnosis and prognosis of the patient.
However, in the literature are few studies that compare histopathological parameters in oral
cavity tumors with genes that can increase the risk of developing this type of cancer. An
47
example is the study of Raju et al. (26), who found a correlation between tumor grade and
expression of cell cycle proteins, cyclin D1 and Ki-67 in patients from Yemen and India.
Pathways that involve the DNA damage repair has been studied in relation to risk
of developing cancer and its evolution, though the evaluation of multiple genes interacting
among themselves is of great importance. This is because the use of tobacco and alcohol
are important environmental factors involved in oral carcinogenesis and biometabolism
enzymes can influence the biological response to carcinogens. In a recent study published
by our group (27) was found no association between polymorphisms in CYP1A1, GSTM1,
GSTT1 genes and risk of development of OSCC and also with prognostic parameters in 91
patients. In the present study it was made a combined analysis of the genes XRCC1 and
XRCC3 and allelic variants of the 3 genes mentioned above in 63 individuals. Due to
stratification of the sample, was not possible to carry out a statistical analysis, but the
combinations suggested no association with oral cancer, reinforcing the data of individual
study, where we concluded that none of the 6 polymorphisms assessed individually or in
combination are good markers of susceptibility to malignant oral tumors.
Based on the selected polymorphisms, we found no associations between allelic
variants and susceptibility to OSCC and also with advanced stages of cancer. This can be
explained by the polygenic model for tumor susceptibility that indicated that much of the
inherited cancer susceptibility is due to multiple risk alleles, each with a low to moderate
risk and that the number of alleles for any cancer is unknown, may be hundreds or
thousands (28).
Acknowledgements
We thank Hospital Erasto Gaertner, Hospital do Câncer de Londrina and Centro
Odontológico Universitário Norte do Paraná, Hospital A.C Camargo (SP) and Faculdade
de Medicina de Botucatu (SP), for providing samples, to SETI (PR Tecnologia), Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq for financial support and for
provindig a grant to I.M.S. Cólus, S.R. Rogatto, I.J. Cavalli and for a Master’s Scholarship
to M.B. Reis.
48
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52
3.2 ARTIGO 2
Expression of repair and apoptotsis genes in human oral squamous cell carcinoma
cell lines treated with cisplatin drug
Artigo em redação
53
Expression of repair and apoptotsis genes in human oral squamous cell carcinoma
cell lines treated with cisplatin drug
Mariana Bisarro dos Reis
1
; Roberta Losi Guembarovski
1
; Silvia Regina Rogatto
2
, Ilce
Mara de Syllos Cólus
1
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina (Londrina - PR -
Brazil)
2
Departamento de Urologia, Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista Júlio de Mesquita Filho (Botucatu- SP- Brazil)
54
Abstract
The use of cisplatin in cancer chemotherapy is limited by acquired or intrinsic resistance of
cells to the drug. ERCC1 and XPA genes involved in NER (nucleotide excision repair) and
BAX involved in response to apoptosis pathway has been related to an increase the
resistance to cisplatin. The purpose of the present study was to evaluate the expression of
these genes in a cell line of oral squamous cell carcinoma treated with cisplatin. The
mRNA expression levels for the ERCC1, XPA and BAX genes were examined by
Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. A statistically significant correlation
was observed between the relative expression of XPA in cell treated with cisplatin, while
we did not observe changes in the expression of repair gene ERCC1 and of pro-apoptotic
gene BAX in the cell line studied. These results suggest that XPA gene could confer a
decreased sensitivity to cell line used in this study. However, data are preliminary and will
be confirmed with further analyzes.
55
Introduction
Head and neck cancer is the sixth most common cancer worldwide (GIL and
FLISS, 2009) and over the past few decades the five years survival associated with head
and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) has significantly increased from less than
50% in the 1960s to approximately 70% at the present time (YAO et al., 2007).
Cisplatin-based combination chemotherapy (cis-Diamminedichloroplatinum(II))
displays significant antitumor activity against testis, ovary and lung cancers (KARTALOU
and ESSIGMANN, 2001) and presents an important role in multidisciplinary treatment of
head and neck cancer (TAKEMURA et al., 2005).
Although the survival of patients has increased, resistance to cisplatin, a commonly
used chemotherapy drug in the treatment of HNSCC, has limited the efficacy of this agent.
Resistance to platinum-based chemotherapy can be intrinsic or acquired and may be
mediated by factors outside or within the cancer cell or at its cell membrane (MARTIN,
HAMILTON, and SCHILDER, 2008).
Many studies showed several types of mechanisms of cisplatin resistance, such as
increased efflux; drug inactivation by intracellular proteins such as glutathione; increased
replication capacity even with DNA damage; increased rates of repair of adducts caused by
cisplatin and defects in way of response to programmed cell death (STEWART, 2007;
KARTALOU and ESSIGMANN, 2001; BRENES et al., 2007).
Cisplatin, a bifunctional alkylators, can cause double-strand breaks, DNA
crosslinks, bulky adducts and replication lesions (HELLEDAY et al., 2008). The efficacy
of anticancer drugs, as the cisplatin, is highly influenced by ability of cells repair these
damages and whether cisplatin-DNA adducts may kill cells by induction of apoptosis.
Among the repair pathways, NER is the main mechanism for removing cisplatin
adducts (FURUTA et al., 2002) and the ERCC and XP genes appears to be involved in
recognition and excision of these lesions. In the NER pathway, XPA protein stabilizes the
open segment around the damage during the process (FURUTA et al., 2002) and ERCC1
forms a heterodimer with the Xeroderma Pigmentosum group F (XPF) protein and excises
the nucleotide segment containing the adducts in coordination with XPG protein
(SHIMIZU et al., 2008
).
Regarding to the apoptotic events induced by clinicaldrugs used, alterations in the
expression of regulators of apoptosis can alter the sensitivity of the cells to apoptosis
56
following cisplatin treatment (KARTALOU and ESSIGMANN, 2001). Apoptosis is a form
of physiological cell death mediated by caspases (KAUFMANN and VAUX, 2003) and
these are controlled by Bcl-2 family members (CORY and ADAMS, 2002), including,
BAX and BCL-2 genes. The BAX gene is a proapoptotic family member and facilitate
opening of the voltage dependent ion channel in the mitochondrial membrane (SHIMIZU
et al., 1999).
In the present study, we examined the mRNA levels of XPA and ERCC1 genes
involved in the NER and BAX genes involved in apoptosis, once the differential expression
of these in the presence of cisplatin could affect sensitivity to the drug. Thus a better
understanding of these mechanisms may contribute to the elucidation of the processes that
culminate with the resistance to chemotherapy in some patients.
Material and Methods
Cell line
The cell line used [SCC-25 (CRL-1628)] was established from primary tongue
carcinoma of male patients with 70 years (ATCC, USA) and was provided to our
laboratory by Prof. Dr.Edgad Graner (ESALQ-USP).
Cytotoxicity
The cytotoxicity of cisplatin was determined using the 3-(4,5-dimethylthiazo-2-yl)-
2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay as described previously by Mosmann
(1983). In brief, cells were seeded in 96-well plates at a density of 1x10
4
cells/well (200
µl/well) for 24h before use. The culture medium was replaced by fresh medium containing
different concentrations of cisplatin (Bergamo®) ranging from 0µM to 0,1µM for 24 h.
Water-soluble tetrazolium MTT (Invitrogen, USA) was added (0,5 mg/mL). After 4 h
incubation, the supernatant was discarded and the purple crystals were re-suspended in 200
µL of DMSO. After 10 minutes the analysis was performed in espectrophotometer
(Uniscience) at 550 nm. The cellular viability was calculated as the ratio of the absorbance
of the experimental well to that of a blank well.
57
Culture Conditions
Cell line was cultured in 25cm
2
polyethylene flasks in DMEM/F-12 (Invitrogen,
USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (GIBCO- Brazil), 400 ng/mL
hydrocortisone (hydrocortisone sodium succinate) and 100 µg/mL kanamycin (kanamycin
sulfate- GIBCO) at 37ºC in atmosphere containing 5% CO
2
and
95% humidity. The culture
medium was changed every 48 hours.
After the test of citotoxicity, 3x10
6
cells were seeded and after 48h of stabilization,
the cells were treated with 0,01µM cisplatin for 24 h. The treatments were performed in
duplicate.
RNA preparation and reverse transcriptase-polymerase chain reaction
Total RNA was isolated from cell line without treatment as a control and after
treatment with the chemotherapeutic agent, using PureLink
TM
RNA Mini Kit. The kit
included a DNase treatment step. Thereafter, 1µg of total RNA was reverse transcribed
(RT) using M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen) according to the manufacturer’s
protocol.
Real Time PCR
PCR was carried out by SYBER Green method and was performed using a
Chromo4 Detection System (MJ Research). The primers were designed by Gene Runner
program and their sequences are shown in Table 1.
The Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UGD (Invitrogen) was used as the
reaction mixture with 10pmol of each primer and 2µL of template cDNA in final volume
of 20µL. The real-time PCR conditions were: an initial step at 95̊ C for 5 min, and 40
cycles at 95̊ C for 20 sec, 60̊ C for 15 sec and 72̊ C for 20 sec, followed by 95̊ C for 10 sec
and 40̊ C for 1 min. A melting curve analysis was performed at the end of the experiment
to check for primer-dimer artifacts and contamination.
All experiments were performed with two independents cultures for control, treated
cells and each cDNA was analyzed in two technical replicates for each gene studied.
58
Table 1: List of primers used in the study
Gene Primer
Anneling Temperature (̊C)
BAX F:GATGATTGCCGCCGTGGAC 60
BAX R:GCCTTGAGCACCAGTTTG 60
ERCC1 F:CGAGGAAGCTGGGCGGTA 60
ERCC1 R:CAAATGTGGTCAGGAGGGTC 60
XPA F:GGGTAGAGGGAAAAGGGTT 60
XPA R:CATCGTGGAGACAGAAATCG 60
GAPDH F:GGGCATCCTGGGCTACACT 60
GAPDH R:GGTCCAGGGGTCTTACTC 60
Statiscal analysis
The Kruskal-Wallis (p <0.05) was used to evaluate the cytotoxicity of cisplatin to
the line SCC25.
To quantify changes in gene expression, the Pfaffl method (Figure 1) (Pfaffl, 2001)
was used to calculate the relative fold changes, normalized against GAPDH
(glyceraldehydes-3-phosphate-dehydrogenase) gene.
Figure 1: Matemathical model of relative expression ratio in Real Time PCR.
Where:
E
target
is the real time efficiency of target gene transcript
E
ref
is the real time efficiency of reference gene transcript
∆CP
target
is the crossing point deviation of control – sample of target gene transcript
∆CP
ref
is the crossing point deviation of control – sample of reference gene transcript
59
Results
Cytotoxicity induced by cisplatin in SCC25cell line
The data for the cytotoxicity evaluation of cisplatin in the SCC25 cell line are
shown in Figure 2. Concentrations higher than 0.03 µM of cisplatin reduced mitochondrial
activity when compared with the control group, indicating cytotoxicity. From this
evaluation the concentration of 0.01 µM was determined for use in the treatment of SCC25
cell line for 24 hours.
Figure 2: Cytotoxicity of SCC25 cells induced by cisplatin. After 24 h of treatment with the drug,
MTT activity was read at 550 nm and values were expressed as viability percentage.
Relative Quantfication of ERCC1, XPA and BAX Transcript Expression in SCC25 cell line.
We examined the mRNA expression levels of genes previously highlighted as
important in cisplatin resistance in head and neck squamous cell carcinoma.
Treatment with cisplatin for 24h did not induce changes in the expression of repair
gene ERCC1 and of pro-apoptotic gene BAX in the cell line studied (Figure 3). A
60
significant difference was observed between control and treated cell in relation to repair
gene XPA (Figure 3).
Figure 3: Results of relative quantification of repair genes ERCC1 and XPA and pro-apoptotic
gene BAX.
Discussion
Cisplatin is a commonly used chemotherapeutic agent in the treatment of various
tumors, however there is a limitation in the successful treatment with platinun drugs, since
the cancer cells may be resistant or acquire drug resistence (KARTALOU and
ESSIGMANN, 2001).
It is well known that cisplatin cytotoxicity is attributed to the formation of various
DNA adducts that trigger a cellular response culminating in apoptosis (ZHANG et al.,
2006) and that DNA repair and apoptosis pathway have a significant role in the modulating
of this citotoxicity (WANG and LIPPARD, 2005), being considered mechanisms of
resistance to cisplatin.
In the present study, real-time quantitative RT-PCR was used to quantify the
mRNA expression of ERRC1, XPA and BAX genes in response to treatment of SCC25 cells
61
for 24h with cisplatin. All the three genes showed expression, however there was no
difference in expression of genes in cells treated with the drug from those used as control.
Increased expression of ERCC1 gene has been linked to chemotherapy resistance in
several cancers such as ovarian cancer, where a 3-folder higher expression of ERCC1 was
correlated with cisplatin resistence in vitro (FERRY et al., 2000) and cervical cancer
(BRITTEN et al., 2000). In a study realized with squamous cell carcinoma of the head and
neck patients treated with cisplatin-based concurrent chemoradiation, the low expression of
ERRC1 was a factor associated with lower risk of cancer death (JUN et al., 2008), in
agreement with the fact that a high expression of this gene could lead to a small tumor
response to treatment.
Our results show that repair gene ERCC1 appears not be activated to repair the
damage caused by cisplatin for 24 hours, since there was no difference in expression
between the treated and control groups. However the expression of the XPA gene,
indicated an enhanced activation. This type of activation of NER factors, has been
proposed to account for cisplatin resistance (KARTALOU and ESSIGMANN, 2001).
Some studies have shown an increase in the expression of this gene in non-small cell lung
cancer cell lines (WEAVER et al., 2005) and that XPA downregulation sensitised DU145
cells (prostate cancer cell lines) to cisplatin (CUMMINGS et al., 2006). However in a
study with metastatic ovarian carcinoma, Stevens et al. (2005) found that XPA increased
expression was associated with better response to chemotherapy and predicted better
progression-free survival and overall survival of patients.
Faced with conflicting results in the literature, the genic expression data obtained in
this study for the XPA gene does not allow a final conclusion, because the average obtained
for the ratio of gene expression of treated and control groups was 1.839. When it is
subtracted the baseline 1.0, the XPA gene was 0.83-fold more expressed in the cells treated
with cisplatin than control cells.
Although cisplatin-DNA aducts are removed primarily by the NER pathway in
vitro and in vivo (WANG et al., 2003), other pathways are able to remove the damage
caused by cisplatin, as Homologous Recombination Repair (HR), Fanconi Anemia (FA)
repair pathway and endonuclease-mediated repair (HELLEDAY et al., 2008). The fact that
the cell line SCC25 did not show a change in the expression of 2 repair genes analyzed
may be due to the fact that this cell line is sensitive to chemotherapy or have other repair
pathways that could be activated to remove the damage caused by cisplatin.
62
We also studied BAX gene in oral squamous cell carcinoma cell line and no
significant expression was observed for this gene, suggesting that in the conditions studied,
this pathway was not activated. An explanation could be that the cisplatin concentration
used was not sufficient to induce apoptosis, since it was chosen from the cell viability test.
In a study with oral SCC cell lines, Takemura et al. (2005) found a decrease in the number
of viable cells in cell lines in which Bax protein expression was enhanced after treatment
with cisplatin.
The cell line used in this study was obtained from a primary tumor and during the
experiment received only one dose of cisplatin for 24 hours. Several studies on resistance
to chemotherapy have been published using resistant cell lines generated in the laboratory
after prolonged exposure (around 2 years) to anti-cancer drugs (NICOLANTONIO et al.,
2005). Although these studies can show changes in expression of some genes, this may not
be similar to what happens in clinical treatment, when patients are exposed to one cycle of
chemotherapy to each 3-4 weeks.
Due to the complex nature of the NER and apoptosis process, the molecular basis
for the increased platinum–DNA adduct repair capacity and changes that lead to altered
response to cell death, many studies still are necessary to define predictive tools for
chemotherapy in oral SCC.
However, the elucidation of the activity of genes responsible for DNA repair and
apoptosis pathway gene expression, as well as other means of resistance to drugs, could
provide insight into strategies to control the resistence to quimioterapeutic in human
cancers.
63
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67
4. CONCLUSÕES
1. As três variantes alélicas de genes do reparo de DNA estudadas não mostraram
associação significativa quando analisadas separadamente ou de maneira
combinada em relação ao câncer oral.
2. A análise das mesmas variantes em relação aos dados histopatológicos dos
pacientes também não mostrou diferença estatisticamente significativa, o que nos
leva a concluir que os genótipos em questão não influenciam no desenvolvimento e
nem na progressão dos tumores malignos da boca.
3. O estudo da expressão de genes relacionados com a resistência à cisplatina mostrou
que apenas o gene XPA apresentou um pequeno aumento de expressão, indicando
que o tratamento com o quimioterápico para essa linhagem celular pode conferir
um aumento de resistência à morte das células tumorais; entretanto, não foi
observado aumento de expressão do gene ERCC1 que atua na mesma via de reparo
do gene XPA e do gene pró- apoptótico BAX.
4. A investigação da expressão dos genes de reparo XPA, ERCC1, e do gene de
controle de apoptose BAX em células tumorais tratadas com cisplatina permitiu
implantar a técnica de extração de RNA e PCR em Tempo Real no Laboratório de
Mutagênese e Oncogenética.
68
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YAO, M.; EPSTEIN, J.B.; MODI, B.J.; PYTYNIA, K.B.; MUNDT, A.J.; FELDMAN,
L.E. Current surgical treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck. Oral
Oncology, 43, 3, 213-23, 2007.
YEN, C.Y.; LIU, S.Y.; CHEN, C.H.; TSENG, H.F.; CHUANG, L.Y.; YANG, C.H.; LIN,
Y.C.; WEN,C.H.; CHIANG, W.F.; HO, C.H.; CHEN, H.C.; WANG, S.T.; LIN, C.W.;
CHANG, H.W.. Combinational polymorphisms of four DNA repair genes XRCC1,
XRCC2, XRCC3, and XRCC4 and their association with oral cancer in Taiwan. Journal
of Oral Pathology & Med
icine
, 37, 271–277, 2008.
ZAKRZEWSKA, J.M. Fortnightly review: Oral cancer. British Medical Journal, 318,
1051-1054, 1999.
84
ZHANG , P.; ZHANG, Z.; ZHOU, X.; QIU, W.; CHEN, F.; CHEN, W. Identification
of genes associated with cisplatin resistance in human oral squamous cell carcinoma cell
line. BMC Cancer, 6, 224, 2006.
85
ANEXO I
INFORMAÇÕES AO DOADOR
Nome do projeto de pesquisa: “Investigação Genético Molecular de Lesões da
Cavidade Bucal”
1. Justificativa e objetivos da pesquisa:
Este estudo tem como principal objetivo estudar algumas características genéticas
encontradas em tumores da cavidade oral. Esta pesquisa é muito importante, pois
acreditamos que haja uma correlação entre estas características genéticas que desejamos
estudar e o desenvolvimento das lesões (malignas ou benignas).
O que se chama de “características genéticas”, compreendem basicamente o estudo
de genes que metabolizam agentes tóxicos das células que normalmente podem estar
presentes em locais de trabalho, como defensivos agrícolas, raios-X, metais pesados, etc...,
além de alterações genéticas em seqüências específicas do nosso genoma (microssatélites).
2. Procedimentos a serem utilizados:
Serão recrutados cerca de 100 pacientes portadores de lesões na cavidade bucal, os
quais serão submetidos aos seguintes procedimentos:
a) Os doadores responderão a um questionário padrão referente ao seu grupo
étnico, estilo de vida, idade, local de nascimento, hábito tabagista, história
familial de câncer etc... Nesta etapa eles poderão fazer todas as perguntas que
acharem necessárias para um perfeito esclarecimento de todas as suas dúvidas.
b) Um profissional da área de saúde, devidamente treinado, colherá de cada
voluntário cerca de 10 ml de sangue (punção venosa) com seringa plástica
descartável, bem como uma amostra do tecido tumoral através de biópsia.
c) O sangue e o tecido tumoral serão levados ao Laboratório de Genética e
Mutagênese da UEL e serão devidamente processados para extração do DNA e
análise genética molecular.
d) Os resultados serão analisados e correlacionados com hábito de vida, idade,
história familial de câncer e outros fatores da vida de cada doador.
e) O término deste estudo está previsto para aproximadamente 48 meses.
3. Desconforto e Riscos:
Durante a colheita do sangue e do tecido lesionado o doador poderá sentir
desconfortos, ou uma ligeira dor decorrente da picada da agulha no braço ou na região oral,
ou ainda, dependendo do estado emocional da pessoa, sentir pânico ao ver seu próprio
86
sangue ou mesmo uma fobia pela agulha da seringa. Ás vezes, podem ocorrer sentimentos
de desconfiança por parte do doador em relação ao profissional que está retirando o
sangue. Quanto aos riscos de se doar sangue, estes são desprezíveis, pois todo o material
utilizado será descartável, eliminando qualquer possibilidade de contaminação por esta via.
4. Benefícios esperados:
Os benefícios com relação a este estudo se constituirão em informar ao médico
oncologista responsável os resultados obtidos nesta pesquisa e suas implicações ao
paciente. O médico, por sua vez, ficará encarregado de passar as informações pertinentes
ao paciente. Além disso, os dados obtidos nesta pesquisa poderão ser divulgados em
eventos e periódicos que poderão contribuir para um melhor conhecimento dos
mecanismos envolvidos com tais lesões.
5. Informações adicionais a respeito deste estudo:
O sangue periférico e o tecido serão coletados com seringas e agulhas estéreis e
descartáveis e serão processados nas dependências da UEL/UFPR, em ambiente
esterilizado e por profissionais especializados. No entanto, existem diferenças entre as
células dos indivíduos em responder aos procedimentos técnicos utilizados e, portanto, em
alguns casos, há a necessidade de se repetir á colheita do material. Caso isto aconteça, o
doador poderá ser contactado para uma nova doação de sangue.
6. Confiabilidade do estudo:
Os doadores em hipótese alguma terão sua identidade divulgada para outras pessoas
ou entidades, além daquelas que participam efetivamente do estudo. Também serão
mantidas em sigilo todas as informações obtidas e que estejam relacionadas com a
privacidade do doador.
7. Acesso às informações obtidas:
Os pesquisadores e a Comissão de Ética que aprovaram este estudo, comprometem-
se a fornecer aos doadores todas as informações que venham a ser obtidas durante a
pesquisa.
87
ANEXO II
TERMO DE CONSENTIMENTO
Nome do estudo: “Investigação genético-molecular de tumores da cavidade bucal”.
CONSENTIMENTO
Concordo em participar livremente deste estudo, entendo que serei entrevistado e
submetido a uma avaliação laboratorial (exame de sangue). E, entendo que os riscos de
minha participação nesta pesquisa são mínimos.
Entendo que minha participação é inteiramente voluntária, podendo me recusar a
responder qualquer questão ou retirar o meu consentimento em participar neste estudo a
qualquer hora, sem nenhum prejuízo ao meu tratamento atual ou futuro.
Eu,__________________________________________, após ter lido e entendido todas
as informações e esclarecido todas as minhas dúvidas referentes a este estudo com a profa.
Dra. Ilce Mara de Syllos Cólus, concordo voluntariamente em participar do mesmo. Atesto
também o recebimento das “Informações ao doador”, necessário para a minha
compreensão do estudo.
__________________________________________Data: __/__/__
Assinatura (do doador ou responsável) ou impressão datiloscópica
Eu, profa. Dra. Ilce Mara de Syllos Cólus ou profa. Dra. Enilze Ribeiro, declaro que
forneci todas as informações referentes ao estudo ao doador.
_____________________________________________ Data: __/__/__
Profas. Dras. Ilce Mara de Syllos Cólus ou Enilze M.S.F. Ribeiro
88
ANEXO III
QUESTIONÁRIO PESSOAL
Por favor, leia as questões seguintes cuidadosamente e responda-as da forma mais
completa e precisa possível. A informação que você der não será associada a seu nome em
nenhum documento público, e será conhecida somente dos principais pesquisadores deste
estudo. As informações que você der podem ter influencia direta na interpretação dos
nossos resultados, portanto, pedimos que coopere gentilmente, fornecendo informações
corretas. Obrigado pelo interesse.
1- Nome: _____________________________________________________________
último primeiro do meio
2- A ser preenchido pelo pesquisador:
Código:_________
Data: ___/___/___
Esta folha deve ser destacada do restante do questionário e preenchida pelo
pesquisador. Somente o código será usado como identificação para as páginas
subseqüentes. Se for necessário espaço adicional para complementar a sua resposta,
escreva no verso da página e identifique a parte restante da questão com seu respectivo
número.
89
Código n°____________
HISTÓRIA PESSOAL
1- Registro hospitalar: _______________________
2- Sexo: ( ) masculino ( ) feminino
3- A qual grande grupo étnico você pertence ?
Negro ( ) Caucasiano ( ) Asiático ( ) Indígena ( ) Outros ( )
Idade: a) 0-20 anos. b) 20 –50 anos. c) mais que 50 anos.
Local de nascimento: Paraná ? ( ) sim ( ) não
Se não: Que região brasileira ? Norte ( ) Sul ( ) Nordeste ( ) Centro-Oeste ( )
Sudeste ( )
Número de filhos: (i.e. não se incluem aí filhos adotados): a)0 b) 1 c) 2 d) + de 2
6- Sua moradia era na zona rural ou urbana? ( ) Rural ( ) Urbana
7- Quanto tempo viveu neste local? ______anos _______meses
8- No local onde morou por mais tempo qual era o tipo de moradia?
( ) casa ( ) apartamento ( ) barraco ( ) cortiço ( ) outra
9- A residência onde mora é servida por água encanada? ( ) sim ( ) não
10- Qual o seu grau de instrução?
( ) analfabeto ( ) 1° grau incompleto ( ) 1° grau completo ( ) 2° grau incompleto
( ) 2°grau completo ( ) técnico ( ) profissional ( ) superior
11- Qual sua religião? a) ( ) Católico b) ( )Protestante c) ( )Outras
Histórico de moradia
12- Qual era o tipo de construção onde você morou mais tempo?
( ) alvenaria ( ) madeira ( ) barro ( ) mista
13- Que tipo de cobertura tinha essa moradia? ( ) telha barro comum ( ) laje
( ) folha de zinco ( ) brasilit-eternit ( ) sapé ( ) outro (qual?)_______
14- Você poderia me contar se morou a menos de 1 Km de uma destas indústrias por mais
de 1 ano? Se sim, por quanto tempo?___________________
Indústria têxtil ou tecelagem ( ) sim ( ) não
Processamento de madeira ( ) sim ( ) não
Papel ou celulose ( ) sim ( ) não
Fábrica de sapatos ou curtume ( ) sim ( ) não
90
Metalúrgica (cromo/níquel) ( ) sim ( )não
Usina de açúcar ou álcool ( ) sim ( ) não
Plástico ou borracha ( ) sim ( ) não
Refinaria de petróleo ( ) sim ( ) não
Histórico de exposição relacionado ou não ao trabalho
15- Você já se expôs a alguma destas substâncias abaixo em seu trabalho?
Se SIM, por quanto tempo e há quanto tempo foi: _________________________
Derivados de petróleo querosene,
gasolina, solventes,...)
( )sim ( )não
Tintas/ corantes
( )sim ( )não
Indústrias têxteis ou tecelagem
( )sim ( )não
Praguicidas / Herbicidas
( )sim ( )não
Radiação
( )sim ( )não
Metais pesados (Pb, Ni, Cr,...)
( )sim ( )não
Processamento de madeira
( )sim ( )não
Papel ou celulose
( )sim ( )não
Mineração
( )sim ( )não
Fábrica de sapatos ou curtume
( )sim ( )não
Metalúrgica
( )sim ( )não
Usina de açúcar ou álcool
( )sim ( )não
Plástico ou borracha
( )sim ( )não
Outras substâncias químicas:
( )sim ( )não
16- Se SIM para a pergunta acima: Você utilizava equipamentos de proteção individual
para trabalhar com essas substâncias químicas? (máscaras, luvas, óculos,...)
a) ( )sim b) ( )não
91
Histórico Tabagista
17- Você fuma atualmente? ( )sim ( )não
18- Se NÃO, mas já fumou, há quanto tempo parou de fumar?
a) ( )0-5 anos b) ( )5-10 anos c) ( ) >10
19- Quanto você fuma/fumava por dia ?
( )menos de ½ maço ( )de meio a 1 maço ( )mais de um maço (quantos:________)
20- Você costuma/costumava fumar charutos? ( )sim ( )não
21- Você costuma/costumava fumar cachimbo? ( )sim ( )não
22- Você costuma/costumava fumar cigarro de palha? ( ) sim ( ) não
23- Você costuma/costumava mascar fumo? ( ) sim ( ) não
24- Você convive/conviveu em seu trabalho ou em casa com pessoas que fumam?
a) ( )sim b)( )não
Histórico de Etilismo
25-Você consome/consumiu bebidas alcóolicas com frequência? ( ) sim ( ) não
26- Se já parou, há quanto tempo parou de consumir esta bebida?
a) ( )0-5 anos. b) ( ) 5 –10 anos. c) ( ) mais 10 anos.
27- Que tipo de bebida alcóolica você costuma/ costumava consumir ?
a) ( )Destiladas b) ( )Não-Destilada c) ( )Outra
28-Quanto você costuma/ costumava beber por semana?
( ) no máximo um copo ( ) de 2 a 5 copos ( ) de 6 a 10 ( ) de 11 a 30 ( ) mais de 30
29- Durante a sua vida, já consumiu ou consome alguma bebida diariamente por mais de 6
meses continuamente?
a) ( )Sim b) ( ) Não
92
Histórico de Saúde
30- Há cerca de um ano você tem se automedicado com, por exemplo, aspirinas,
antiácidos, antihistamínicos, sedativos, ou outras drogas? ( ) sim ( )não ( )não
sabe
31- Você toma vitaminas freqüentemente ou tem tomado nos últimos seis meses?
( )sim ( )não ( )não sabe
32- Você já operou da garganta (amígdalas)? ( ) sim ( ) não
33- Você se submeteu a algum Raio-X de cabeça e pescoço recentemente ?
( )sim ( )não
34- Se SIM, quantos? a) ( )Menos de 10 b) ( )Mais de 10
35- Você já teve as seguintes doenças?
( ) Bronquite asmática ( ) Pressão alta ( ) Diabetes ( ) Tuberculose ( ) Câncer
(localização do tumor______________)
36- Em casos de câncer na família, qual era o parentesco?
( ) Pai ( ) Mãe ( ) Irmão ( ) Filho ( ) Tio ( ) Primo ( ) Outro
37- Qual era a localização do tumor?
( ) Boca/garganta ( ) Pulmão ( ) Estômago ( ) Intestino ( ) Ginecológico ( ) Mama
( ) Outro (qual?) _________
38- Você já teve alguma moléstia venérea?
a) ( )sim b) ( )não
Histórico de Saúde Dentária
39- Você usa/usou dentadura ou aparelho móvel? ( ) sim ( ) não
40- (Se sim) há quanto tempo? a) ( )0-5 anos. b) ( )5 –10 anos. c) ( )mais 10 anos.
41- Esta dentadura já lhe causou alguma ferida na boca? ( ) sim ( ) não
42- Com que freqüência você vai ao dentista? ( ) nunca ( ) <1/ano ( ) >1/ano
43- Você tem algum dente estragado? ( ) sim ( ) não
44- (Se sim) eles estão lhe machucando? ( ) sim ( ) não
93
Histórico alimentar: (refira-se somente a hábitos freqüentes)
45- De qual tipo é o fogão da sua casa? ( ) gás ( ) lenha ( ) elétrico ( ) outro
46- Já residiu em casa com fogão á lenha? ( ) sim ( ) não
47- Você tem o hábito de ingerir alimentos e bebidas muito quentes? ( ) sim ( ) não
48- Você toma chimarrão? ( ) sim ( ) não
49- Você se alimenta apenas de vegetais? ( )sim ( )não
50-Você come carne? ( )sim ( )não
51-Se SIM, com que freqüência você come estes alimentos:
Dias/Semana
________________________________________________________________
menos que 1 1-2 3-4 5-6 Diariamente
Carne ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
Peixe ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
Frango ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
Porco ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
Outros ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
Histórico genético
52-Para mulheres: você já sofreu algum aborto espontâneo?
( )sim ( )não
53-Para ambos os sexos: você possui algum(a) irmão(a) gêmeo idêntico(a)?
( )sim ( )não
Incluir informações das amostras do tumor (localização, laudo histo-patológico):
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
________________________________________________________________
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