( PDF ) Resposta do condrócito, proteoglicana, colágeno e fibronectina da cartilagem articular, após aplicação de um protocolo de imobilização, alongamento e remobilização articular

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS E DA SAUDE

DEPARTAMENTO DE FISIOTERAPIA

Adriana Frias Renner

Resposta do condrócito, proteoglicana, colágeno e fibronectina da

cartilagem articular, após aplicação de um protocolo de

imobilização, alongamento e remobilização articular.

Profa. Dra. Stela Márcia Matiello Gonçalves Rosa

Orientadora

São Carlos

2010

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS E DA SAUDE

DEPARTAMENTO DE FISIOTERAPIA

Adriana Frias Renner

Resposta do condrócito, proteoglicana, colágeno e fibronectina da

cartilagem articular, após aplicação de um protocolo de

imobilização, alongamento e remobilização articular.

TESE DE DOUTORADO

APRESENTADA AO PROGRAMA

DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

FISIOTERAPIA DA UNIVERSIDADE

FEDERAL DE SÃO CARLOS, PPG-

FT/UFSCAR COMO PARTE DOS

REQUISITOS PARA OBTENÇÃO DO

TÍTULO DE DOUTOR EM

FISIOTERAPIA – ÁREA DE

CONCENTRAÇÃO PROCESSOS DE

AVALIAÇÃO E INTERVENÇÃO EM

FISIOTERAPIA.

Profa. Dra. Stela Márcia Matiello Gonçalves Rosa

Orientadora

São Carlos

2010

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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitária/UFSCar

R414rc

Renner, Adriana Frias.

Resposta do condrócito, proteoglicana, colágeno e

fibronectina da cartilagem articular, após aplicação de um

protocolo de imobilização, alongamento e remobilização

articular / Adriana Frias Renner. -- São Carlos : UFSCar,

2010.

45 f.

Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos,

2010.

1. Fisioterapia. 2. Cartilagem articular. 3. Imobilização

articular. 4. Alongamento muscular. I. Título.

CDD: 615.82 (20

)

DEDICATÓRIA

Ao meu marido Raphael, pelo seu apoio, carinho e parceria.

Sem você seria bem mais difícil a finalização do meu doutorado.

À nossa filha Luisa, um grande presente na minha vida.

Aos meus pais Margarida e Martin.

Sempre estiveram na torcida e,

mesmo com o coração apertado pela distância,

me deram um grande apoio para a concretização deste doutorado.

À minha irmã Mariana pelo ombro amigo,

e infindáveis trocas de experiências

Agradecimento especial à Profª Drª Stela Marcia Mattiello Gonçalves Rosa

pelos ensinamentos, pelo apoio e pela confiança depositada em mim

em parte dessa minha caminhada.

iii

AGRADECIMENTOS

À Marilene Castiglia pelo carinho e pela força que sempre me deu.

Ao amigo Filipe pelo carinho.

Às minhas grandes amigas Ana Carolina Evangelista, Ana Carolina Abrão e Carolina

Miño, sempre ao meu lado.

Aos amigos e colegas de laboratório Karina, Paula, Carol, Fernando, Michele, Gisele,

Giovanna, Anderson, Andressa, Renata e Luis Fernando.

Ao Fernando “Zé” pela prontidão em me ajudar sempre que precisei.

Ao Prof Dr José Roberto Goldim pelo seu entusiasmo pelo “conhecer” e respeito pela

pesquisa que me incentivaram a trilhar este caminho.

Ao Thiago e à Davi pela disponibilidade em ajudar. Sempre um socorro amigo.

À Sabrina pela amizade e pelas nossas boas conversas.

À Anna Raquel e Ana Paula pelos convites e pelas parcerias em pesquisa. Sempre na

correria, mas muito importante para mim.

Ao Prof Dr Nivaldo Parizotto pelo espaço aberto em seu laboratório e pelo grande apoio

inicial em relação à birrefrigência.

Às secretárias do Programa de Pós Graduação em Fisioterapia Kelly e Cristiane pela

disponibilidade em ajudar sempre.

Aos colegas do Laboratório de Plasticidade Muscular sempre dispostos em ajudar.

À profa Dra Tânia de Fátima Salvini pelo espaço aberto em seu laboratório.

A Tereza pela ajuda técnica e dicas de laboratório.

À Mônica e Deise pelo grande suporte técnico que me deram. Vocês me ensinaram que

imunohistoquímica tem seus truques, mas é possível!

Profª Drª Ana Claudia Sverzut pelo espaço aberto em seu laboratório.

À Anabelle pela grande ajuda nos meus primeiros passos no mundo da

imunohistoquímica.

À profª Drª Walcy Rosolia Teodoro pelos ensinamentos, pelo espaço aberto em seu

laboratório e pela disponibilidade em me ajudar.

Aos professores do Programa de Pós Graduação em Fisioterapia pelos ensinamentos ao

longo das disciplinas cursadas.

Ao Prof Dr. Jorge Oishi pela orientação com relação ao tratamento estatístico deste

estudo.

À Ana Rocha pelos meus incontáveis telefonemas cheios de dúvidas técnicas sempre

atendidos com muito carinho e disposição.

Aos componentes da banca examinadora pelas observações e considerações que

contribuíram para o enriquecimento desta tese.

Ao CNPq pela bolsa de estudos que permitiu o desenvolvimento do meu doutorado.

À FAPESP que com o auxilio pesquisa me possibilitou participar da montagem de um

laboratório e posteriormente de usufruí-lo.

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA ..............................................................................................................I

AGRADECIMENTOS.................................................................................................III

SUMÁRIO.......................................................................................................................V

ÍNDICE DE FIGURAS.............................................................................................VIII

1. RESUMO................................................................................................................. 1

2. ABSTRACT ............................................................................................................ 3

3. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 5

Influência de Carga Cíclica e Estática sobre as Estruturas da Cartilagem

Articular

................................................................................................................ 7

Influência do alongamento muscular sobre a cartilagem articular....................... 8

3.1. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 9

4. ESTUDO I............................................................................................................. 12

ALONGAMENTO MUSCULAR APÓS IMOBILIZAÇÃO É MAIS BENÉFICO À CARTILAGEM

ARTICULAR QUANDO REALIZADO EM DIAS ALTERNADOS

............................................. 12

4.1.1. Resumo ................................................................................................... 12

4.1.2. Introdução .............................................................................................. 13

4.1.3. Material e Métodos................................................................................. 15

Grupos experimentais:........................................................................................ 15

Procedimentos Experimentais:........................................................................... 15

Processamento das Amostras ............................................................................. 15

Análises dos cortes:............................................................................................ 16

4.1.4. Análise estatística................................................................................... 16

4.1.5. Resultados............................................................................................... 17

Celularidade........................................................................................................ 17

Clones................................................................................................................. 17

Proteoglicanas..................................................................................................... 18

Fibrilas de Colágeno........................................................................................... 19

4.1.6. Discussão................................................................................................ 22

4.1.7. Conclusão............................................................................................... 24

4.1.8. Referências bibliográficas:..................................................................... 25

5. ESTUDO II............................................................................................................ 28

COMPARAÇÃO ENTRE O EFEITO DA REMOBILIZAÇÃO E DO ALONGAMENTO MUSCULAR

APÓS IMOBILIZAÇÃO SOBRE A EXPRESSÃO DA FIBRONECTINA

, SULFATO DE

CONDROITINA NA CARTILAGEM ARTICULAR

................................................................ 28

5.1.1. Resumo ................................................................................................... 28

5.1.2. Introdução .............................................................................................. 29

5.1.3. Material e Métodos................................................................................. 31

Grupos experimentais:........................................................................................ 31

Procedimentos Experimentais:........................................................................... 31

Processamento das Amostras ............................................................................. 32

Imunohistoquimica............................................................................................. 32

5.1.4. Análise Estatística.................................................................................. 33

5.1.5. Resultados............................................................................................... 33

Imunomarcação para Fibronectina..................................................................... 33

Imunomarcação para sulfato de condroitina 4.................................................... 36

5.1.6. Discussão................................................................................................ 37

5.1.7. Conclusão............................................................................................... 39

5.1.8. Referências bibliográficas...................................................................... 39

6. ANEXO I............................................................................................................... 42

ARTIGO SUBMETIDO – ESTUDO I: MUSCLE STRETCHING AFTER IMMOBILIZATION IS

MORE BENEFICIAL TO ARTICULAR CARTILAGE WHEN APPLIED ON ALTERNATE DAYS

... 42

7. ANEXO II.............................................................................................................. 43

ARTIGO SUBMETIDO – ESTUDO II: COMPARISSON BETWEEN THE EFFECTS OF

REMOBILIZATION AND MUSCLE STRETCHIG AFTER IMMOBILIZATION ON THE

IMMUNOSTAINING OF FIBRONECTIN AND CHONDROITIN SULFATE IN ARTICULAR

CARTILAGE

.................................................................................................................. 43

8. ANEXO III............................................................................................................ 44

ARTIGO PUBLICADO: THE REMODELING OF COLLAGEN FIBERS IN RAT ANKLES

SUBMITTED TO IMMOBILIZATION AND MUSCLE STRETCH PROTOCOL

............................ 44

vii

9. ANEXO IV ............................................................................................................ 45

ARTIGO PUBLICADO: THE EFFECT OF A PASSIVE MUSCLE STRETCHING PROTOCOL ON

THE ARTICULAR CARTILAGE

. ....................................................................................... 45

viii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Média e desvios padrão da celularidade das patas tratadas. I= imobilizados,

IA7= imobilizados e alongados 7x/sem, IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem,

A7= alongados 7x/sem, A3= alongados 3x/sem, C=controle. * IA7 > I (p= 0,04) e

C (p= 0,04). Não foi encontrada diferença entre os demais grupos.

...................... 17

Figura 2: Média e desvios padrão da presença de clones. I= imobilizados, IA7=

imobilizados e alongados 7x/sem, IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A7=

alongados 7x/sem, A3= alongados 3x/sem, C=controle. * IA3 > A7 (p=0,003), A3

(p=0,00) e C (p=0,01). ** A3 < I (p=0,04), IA7 (p=0,004), IA3 (p=0,00). Não foi

encontrada diferença entre os demais grupos.

........................................................ 18

Figura 3: Média e desvios padrão da perda de proteoglicanas. I= imobilizados, IA7=

imobilizados e alongados 7x/sem, IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A7=

alongados 7x/sem, A3= alongados 3x/sem, C=controle. * I > IA3 (p=0,00), A7

(0,00), A3 (p=0,00) e C (p=0,00). ** IA7 > IA3 (p=0,00), A7 (0,00), A3 (p=0,00) e

C (0,00).

.................................................................................................................. 18

Figura 4: Painel montado a partir das fotomicrografias apresentando as diferentes

graduações da ortocromasia para safranina-o fast green, indicando perda de

proteoglicanas, encontradas nos grupos estudados. A: coloração avermelhada

caracterizada como normal (graduação 0); B: redução leve da coloração

avermelhada do corte (graduação 1 quando em até metade da área total do corte e 2

quando na extensão total do corte) e C: redução intensa da coloração avermelhada

(graduação 3 quando em metade da área total do corte e 4 quando na extensão total

do corte). Aumento de 400x.

.................................................................................. 19

Figura 5: Apresentação das porcentagens de fibras colágenas finas e grossas observadas

nas patas tratadas dos diferentes grupos. I= imobilizados, IA7= imobilizados e

alongados 7x/sem, IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A7= alongados 7x/sem,

A3= alongados 3x/sem, C=controle. Fibras finas: * I < IA7 (p= 0,00), IA3 (p=

0,00), A7 (p=0,00), A3 (p= 0,00) e C (0,00); ** IA7 < IA3 (p= 0,00), A7 (p= 0,00)

e C (p= 0,00); C*** > I (p= 0,00), IA7 (p= 0,00), A3 (p= 0,001). Fibras grossas: +

I > IA3 (p=0,00), A7 (p= 0,009); ++ IA3 < I (p= 0,00), IA7 (0,008), C (p= 0,00);

+++ C > IA7 (p= 0,01), IA3 (p= 0,00), A7 (0,00), A3 (p=0,001).

......................... 20

Figura 6: Fotomicrografias de cortes histológicos das articulações talo crurais dos

animais dos diferentes grupos estudados. Todas foram coradas com picrossírius red

e visualizadas sob luz polarizada. Os tons laranja avermelhados representam as

fibrilas grossas de colágeno e os tons esverdeados, as fibrilas finas. A: um animal

do grupo I apresentando predominantemente coloração laranja/avermelhada (seta),

há redução da proporção da coloração esverdeada. B: animal do grupo IA7 com

predomínio da coloração alaranjada (seta). C: animal do grupo IA3, com redução

da coloração alaranjada e aumento da proporção de coloração esverdeada (cabeça

de seta). D: animal do grupo A7, com coloração alaranjada (seta) e coloração

esverdeada (cabeça de seta). E: animal do grupo A3, coloração alaranjada (seta) e

coloração esverdeada (cabeça de seta). F: animal do grupo C, proporção normal da

coloração alaranjada (seta) e coloração esverdeada (cabeça de seta). Aumento de

400X.

...................................................................................................................... 21

Figura 7: Fotomicrografia de reação de imunohistoquímica para fibronectina. A:

imunomarcação positiva na camada calcificada (seta) e fracamente positiva na

camada não calcificada (cabeça de seta), grupo Remobilizado. B: imunomarcação

positiva na camada calcificada (seta) e fortemente positiva na camada não

calcificada (cabeça de seta),grupo IA3. C: marcação fracamente positiva na

camada calcificada (seta) e na camada não calcificada (cabeça de seta), grupo A3.

D: marcação fracamente positiva na camada calcificada (seta) e também na camada

não calcificada (cabeça de seta), grupo controle. Aumento de 400x.

.................... 34

Figura 8: Média da graduação para fibronectina na camada calcificada. R=

remobilizados, IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A3= alongados 3x/sem,

C=controle. * IA3 > A3 (p=0,03), e C (p=0,00).

.................................................... 35

Figura 9: Média da graduação para fibronectina na camada não calcificada. R=

remobilizados, IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A3= alongados 3x/sem,

C=controle. * IA3 > I (0,00), A3 (p=0,00), e C (p=0,00).

...................................... 35

Figura 10: fotomicrografia da reação imunohistoquimica para sulfato de condroitina 4.

Em A: imunomarcação positiva na camada calcificada (seta) e fortemente positiva

na não calcificada(cabeça de seta)de um animal do grupo remobilizado. Em B:

imunomarcação positiva na camada calcificada (seta) e fortemente positiva na não

calcificada (cabeça de seta) de um animal do grupo IA3. Em C imunomarcação

positiva na camada calcificada (seta) e fortemente positiva na não calcificada

(cabeça de seta) de um animal do grupo controle. Aumento de 400x

.................... 36

Figura 11: Média das graduações para sulfato de condroitina 4 nas camadas não

calcificadas e camadas calcificadas. R= remobilizados, IA3 =imobilizados e

alongados 3x/sem, A3= alongados 3x/sem, C=controle. Não houve diferença

estatística nas comparações entre os diferentes grupos.

......................................... 37

1. RESUMO

A função da cartilagem articular é dependente do condrócito e dos

componentes de sua matriz extracelular, que por sua vez, podem ser regulados por

estímulos mecânicos. Assim, alterações no suporte de carga podem afetar sua

composição ou sua estrutura e interferir na sua capacidade funcional de sustentar e

distribuir cargas e minimizar os estresses de contato. Desta forma, investigações dos

componentes da cartilagem articular, como o condrócito e ou componentes da matriz

são essenciais para prevenção e tratamento de doenças articulares. É necessário um

maior entendimento das relações de uso/desuso e degeneração, assim como das

conseqüências que situações como estresse de cisalhamento, carga estática prolongada

ou ausência de carga possam gerar neste tecido. O objetivo do presente estudo foi

avaliar a resposta do condrócito, proteoglicana, colágeno e fibronectina da cartilagem

articular, após aplicação de um protocolo de imobilização, alongamento e remobilização

articular. Material e Métodos: foram utilizados 36 animais divididos em 6 grupos (n=6):

imobilizado (I), imobilizado e alongado 7 dias por semana (IA7), imobilizado e

alongado 3 dias por semana (IA3), alongado 7 dias por semana (A7), alongado 3 dias

por semana (A3), e controle (C). Os grupos I, IA7 e IA3 foram submetidos a 4 semanas

de imobilização da pata traseira esquerda. Os grupos IA7 e IA3, após a imobilização,

foram submetidos a 3 semanas de alongamento da musculatura posterior da pata traseira

esquerda diariamente ou 3 vezes por semana, respectivamente. Os grupos A7 e A3

permaneceram livres na gaiola por 4 semanas e posteriormente foram submetidos a 3

semanas de alongamento da musculatura posterior da pata traseira esquerda diariamente

ou em dias alternados, respectivamente. Após esses procedimentos, os tornozelos

esquerdos foram coletados, descalcificados, processados em parafina e corados com

H&E, Safranina, Picrossiruius Red e imunomarcados para fibronectina e sulfato de

condroitina 4 para posterior análise. Foram avaliados por dois observadores parâmetros

como: celularidade, contagem de clones, perda de proteoglicanos, conteúdo de fibrilas

finas e grossas de colágeno e expressão de fibronectina e sulfato de condroitina 4. Para

comparação destes parâmetros entre os diferentes grupos foram utilizados os seguintes

testes estatísticos: Kruskal Wallis com post hoc Newman Keuls: formação de clones e

conteúdo de proteoglicanas; Comparações múltiplas de Duncan: avaliação morfométrica

de celularidade e Anova com post hoc de Tukey: proporção das fibrilas finas e grossas

de colágeno. Para análise das reações de imunohistoquímica para fibronectina e sulfato

de condroitina 4 foi utilizado o teste não paramétrico de Kruscal Wallis e post hoc

Newman Keuls. Em todos os testes o nível de significância foi de p≤0,05. Resultados:

com relação a celularidade o grupo IA7 apresentou aumento significativo da

celularidade em relação aos grupos I e C. O grupo IA3 também apresentou alteração

celular significativa com formação de clones em relação aos grupos A7, A3 e C. A

maior perda significativa de proteoglicanas foi do grupo IA7 em relação a todos os

outros grupos. O grupo I também perdeu significativamente mais proteoglicanas que os

demais, somente não com relação ao grupo IA7. Com relação às fibrilas colágenas foi

observado que a imobilização (I) reduziu significativamente as fibrilas finas em relação

aos grupos IA3, A7, A3 e C. Já a quantidade de fibrilas grossas sofreu influência da

sobrecarga mecânica, pois que houve diminuição significativa das mesmas em todos os

grupos em relação ao controle. Com relação aos achados de fibronectina, os grupos

imobilizados e alongados (IA7 e IA3) apresentaram significativamente maior

intensidade de marcação desta que os outros grupos. Não houve diferença estatística das

imunomarcações para sulfato de condroitina 4 entre os diferentes grupos. Conclusão: Os

protocolos de alongamento muscular, após imobilização, realizados em dias alternados e

diariamente, provocaram respostas adaptativas distintas na cartilagem articular. A

imobilização desencadeou um quadro de atrofia tecidual que quando estimulada por

alongamentos musculares em dias alternados, manteve alguns componentes da matriz,

como fibrilas finas de colágeno e proteoglicana. Esta resposta foi agravada quando o

mesmo protocolo foi aplicado diariamente. Desta forma, podemos concluir que o

alongamento muscular aplicado em articulações previamente imobilizadas deve ser

aplicado com cautela, respeitando períodos intercalados de estímulo mecânico.

Palavras Chave: Cartilagem Articular, Colágeno, Proteoglicana, Fibronectina,

Fisioteapia

2. ABSTRACT

The function of articular cartilage depends on the chondrocytes and on the

components of the extracellular matrix, which in turn may be regulated by mechanical

stimuli. Thus, changes in load support may affect its composition or its structure and

interfere with their functional ability to sustain and distribute loads and minimize the

stresses of contact. Thus, investigations of articular cartilage components, such as

chondrocyte and or matrix components are essential for prevention and treatment of

arthritic disease. A greater understanding of the relationship of use / disuse and

degeneration as well as the consequences of situations such as shear stress, static load or

unloading can generate in this tissue. The aim of this study was to evaluate the response

of chondrocytes, proteoglycan, collagen and fibronectin in articular cartilage after

application of a protocol of immobilization, stretching and joint remobilization. Material

and Methods: We used 36 animals divided into six groups (n = 6): immobilized (I),

immobilized and stretched seven days per week (IS7), immobilized and stretched three

days per week (IS3), stretched seven days per week (S7), stretched three days per week

(S3) and control (C). Groups I, IS3 and AS7 underwent four weeks of immobilization of

the left hind limbs. Groups IS7 and IS3, after immobilization, were subjected to three

weeks of the posterior muscle stretching of the left hind leg daily or three times per

week, respectively. The S3 and S7 groups remained free in the cage for 4 weeks and

subsequently underwent three weeks of posterior muscle stretching of the left hind limb

daily or three times per week, respectively. After these procedures, the left ankle were

collected, decalcified, processed in paraffin and stained with H&E, Safranin-O,

Picrossiruius Red and immunostained with fibronectin and chondroitin sulfate 4 for

further analysis. Two observers evaluated parameters such as chondrocyte cloning, loss

of proteoglycan content, thin and thick fibrils collagen content, intensity of staining for

fibronectin and chondroitin sulfate 4. For statistical analysis we used the following tests:

Kruskal Wallis and post hoc Newman Keuls: cloning and the proteoglycan content of

the different groups); Duncan multiple comparison: morphometric evaluation of

cellularity; ANOVA and post hoc Tukey: proportion of thin and thick fibrils of

collagen. For analysis of the immunohistochemistry reactions of fibronectin and

chondroitin sulfate 4 it was used nonparametric test Kruscal Wallis and post hoc

Newman Keuls. In all tests the significance level was p ≤ 0.05. Results: With respect to

the cellularity IS7 group showed significant increase in cellularity compared to groups I

and C. The IS3 group also showed significant celullar change with the formation of

chondrocyte cloning compared to groups S7, S3 and C. The most significant loss of

proteoglycan was in IS7 group compared to all other groups. The I group also lost

significantly more proteoglycan than the others, except for IS7 group. With respect to

collagen fibrils was observed that immobilization (I) significantly reduced the thin

fibrils in relation to groups IS3, S7, S3 and C. The quantity of thick fibrils was

influenced by mechanical overload, as there was a significant decrease of it in all groups

compared to control. With respect to the findings of the fibronectin, the groups

immobilized and stretched (IS3 and IS7) had significantly higher intensity staining of

fibronectin than other groups. There was no statistical difference of chondroitin sulfate

4 immunostaining among the different groups. Conclusion: The protocols of muscle

stretching after immobilization, applied on alternate days and daily provoked distinct

adaptive responses in articular cartilage. The immobilization stimulated tissue atrophy

that when stimulated by muscle stretching on alternate days, kept some matrix

components, such as fine fibrils of collagen and proteoglycan, unlike the protocol used

daily. Thus we can conclude that muscle stretching applied in previously immobilized

joints should be applied with caution, on alternate days of mechanical stimulation.

Key words: articular cartilage, collagen, proteoglycan, fibronectin, physical therapy.

3. INTRODUÇÃO

A cartilagem articular é um tecido conectivo especializado que tem como

funções principais absorver e distribuir cargas. Ela é composta por condrócitos, seu tipo

específico de célula, e pelos componentes de sua matriz extracelular. Ambos são

influenciados e regulados por estímulos mecânicos. Sendo assim, alterações no suporte

de carga podem afetar a composição e a estrutura da cartilagem. Tais alterações, por sua

vez, podem interferir na sua capacidade funcional de sustentar e distribuir cargas e

minimizar os estresses de contato. Desta forma, investigações destes componentes da

cartilagem articular são essenciais para prevenção e tratamento de doenças articulares. É

necessário um maior entendimento das relações de uso/desuso e degeneração, assim

como das conseqüências que situações como estresse de cisalhamento, carga estática

prolongada ou ausência de carga possam gerar neste tecido

1,2,3

O condrócito é responsável pela biosíntese e turnover contínuos das

macromoléculas da matriz extracelular. Isso ocorre a fim de manter a homeostase do

tecido. O condrócito ocupa 3% a 5% do volume tecidual dependendo da idade e

localização da cartilagem estudada

4,5

. Já a matriz extracelular, abundante na cartilagem,

é composta por uma densa rede de fibras colágenas, proteoglicanas agregadas e não-

agregadas, água, sais inorgânicos e pequenas quantidades de outras proteínas,

glicoproteínas e lipídios.

A macromolécula predominantemente encontrada na matriz é o colágeno

(60%), principalmente do tipo II. Entretanto, também estão presentes os tipos V, VI, IX,

X, XI, XII e XV em menores quantidades. Estes colágenos se encontram embebidos em

um firme gel hidratado de proteoglicanas

4,5

Já a proteoglicana é formada por um núcleo protéico central e possui

glicosaminoglicanas sulfatadas (GAGs) ligadas a esse núcleo. Essas proteoglicanas

podem ser encontradas como monômeros e também na forma agregada. A forma

agregada é composta de uma cadeia de ácido hialurônico central (GAG não sulfatada)

com múltiplos monômeros de proteoglicana ligados a ele. Componentes importantes das

proteoglicanas, as GAGs são formadas por polissacarídeos sulfato de condroitina 4 e 6 e

querato sulfato

2,6,7,8

. O agrecano é a maior proteoglicana de sustentação de peso da

matriz extracelular presente na cartilagem articular. É essa molécula que permite a

resistência à compressão tecidual através de interações eletrostáticas e de pressões de

tumefação osmótica, resistindo à perda de fluidos. Além disso, agregados de agrecanos

permanecem densamente entrelaçados na rede de fibrilas colágenas, que têm como

função resistir às forças de deformação tênsil e de cisalhamento da cartilagem

A fibronectina é uma glicoproteína presente em pequena quantidade na

matriz extracelular da cartilagem articular normal. Entretanto, Zack et al (2006)

descrevem que em culturas de fragmentos de cartilagem osteoartrítica pode haver até 10

vezes mais fibronectina do que na cartilagem normal.

Ela possui domínios funcionais

distintos que podem se ligar a integrinas, heparina, fibrina e colágeno. Como resultado

da atividade desses muitos domínios funcionais, esta glicoproteína está envolvida em

uma grande quantidade de processos biológicos como migração celular, reparo,

angiogenese e diferenciação celular

10,11

Como descrito anteriormente, a cartilagem articular, quando submetida a

forças de compressão mecânica, carga de cisalhamento, pressão hidrostática e carga

osmótica, apresenta alterações na transcrição gênica do condrócito, sinalização celular e

biosíntese das macromoléculas da matriz extracelular

9,12

. Entretanto, a resposta do

condrócito depende da associação de fatores como freqüência, magnitude e tempo de

aplicação da carga compressiva

3,13

. Dentre as diferentes formas de aplicação de

compressão mecânica, de uma forma geral, a compressão estática tem sido apontada

como fator de diminuição de síntese, enquanto que a compressão dinâmica em uma

determinada freqüência pode estimular síntese de matriz

Entretanto, se for aplicada uma carga mecânica na cartilagem articular,

mesmo que superficialmente mas que lese condrócitos, esta limitará a capacidade

metabólica de reparo da cartilagem, levando a uma concentração diminuída de

proteoglicanas, hidratação aumentada e alteração da organização das fibrilas de

colágeno

. O que tem sido observado, é que após aplicação de cargas na cartilagem

articular, a diminuição do conteúdo de proteoglicanas parece ser uma das primeiras

anormalidades detectáveis na cartilagem articular, aparecendo antes mesmo de sinais

visíveis de deteriorização de sua superfície

. Outra alteração que ocorre com a

cartilagem articular sob processos lesivos mais avançados é a diminuição do colágeno

tipo II, ou até sua substituição por colágeno tipo I em uma tentativa de reparo

Influência de Carga Cíclica e Estática sobre as Estruturas da Cartilagem Articular

Sabe-se que a percepção do meio mecânico pelo condrócito se dá pela

interação biológica e biofísica entre o mesmo e sua matriz extracelular

. Forças

mecânicas têm grande influência na síntese e taxa de turnover de moléculas da

cartilagem articular, como as proteoglicanas. Estudos relatam que uma carga cíclica

regular aplicada na articulação aumenta a síntese de proteoglicanas e mantém a rigidez

fisiológica da cartilagem. Por outro lado, uma compressão contínua diminui essa síntese

e causa lesão do tecido através de necrose

Em um estudo realizado por Thibault et al (2002) foram investigadas a

quebra de colágeno, seu consequente turnover, as alterações dos agrecanos e as

alterações das propriedades mecânicas, resultantes da aplicação de cargas mecânicas in

vitro a fragmentos de cartilagem. Essas avaliações foram realizadas antes da aplicação

das cargas, logo após a aplicação e 10 dias após a aplicação, em fragmentos mantidos

em cultura sem aplicação de cargas adicionais nesses 10 dias. Em alguns fragmentos

foram aplicadas cargas entre 2 e 5 MPa e em outros uma carga entre 5 e 8 MPa (todas

consideradas altas, porém fisiológicas). Testes mecânicos realizados antes e após o

período de aplicação das cargas cíclicas, mostraram um enfraquecimento da rede

colágena e uma permeabilidade aumentada pela carga cíclica. Nos fragmentos avaliados

imediatamente após a aplicação da carga, as alterações da matriz extracelular, induzidas

pela carga, foram evidenciadas claramente por um aumento no colágeno desnaturado. Já

os fragmentos mantidos em cultura por 10 dias, sem intervenção após a aplicação da

carga cíclica, não expressaram o aumento na desnaturação do colágeno. Segundo os

autores, isso pode representar turnover, reparo ou o início de degradação progressiva

Waldman et al (2003) aplicaram carga de cisalhamento estático e dinâmico

em tecido cartilaginoso formado in vitro. Após realizarem a cultura dos condrócitos por

quatro semanas as aplicações das cargas foram iniciadas. Foram avaliadas a síntese de

colágeno e proteoglicana e as propriedades mecânicas em culturas após quatro semanas

de estímulo. Neste estudo, existiam amostras submetidas a cargas de cisalhamento

estático (400s), dinâmico (400 ciclos de 1Hz) e controle (sem estímulo). As amostras

submetidas às forças estáticas apresentaram menor conteúdo de proteoglicanas e

colágeno que as amostras não estimuladas. Já o mesmo período e duração de forças

dinâmicas de cisalhamento aplicadas em outras amostras, geraram nas mesmas um

conteúdo de colágeno e proteoglicanas 40% e 35%, respectivamente, maiores quando

comparados com as amostras não estimuladas. Quanto às propriedades mecânicas, as

amostras submetidas às cargas de cisalhamento dinâmico apresentaram aumento

significativo da capacidade de sustentação de carga compressiva e aumento na rigidez,

ambas comparadas com o grupo controle

Já Hall et al (1991) obtiveram resultados positivos de síntese de

proteoglicanas ao realizarem compressões estáticas em fragmentos de cartilagem

bovina, com magnitudes consideradas fisiológicas de 5 e 10Mpa, por 20s e 2h,. Quando

essa compressão aumentou para 20Mpa, a biossíntese foi significativamente suprimida

na exposição de 2h, mas não na exposição de 20s

. Ikenoue et al (2003), através de

pressão hidrostática intermitente em culturas de condrócitos, obtiveram respostas

positivas conforme o período de aplicação do protocolo. Foi observado aumento de

sinal para síntese de agrecano 4 horas após a aplicação de compressões de 1Hz com

magnitudes de 5 e 10 MPa, no primeiro dia. Já o sinal para síntese de colágeno só

ocorreu, com as mesmas cargas, freqüência e duração, no quarto dia de compressão

Os estudos citados anteriormente controlaram a carga, frequência e duração,

entretanto se distanciam da realidade da carga aplicada no tecido cartilaginoso de

humanos durante atividade física, já que são realizados em cultura de células. Estudos

com humanos controlando tais variáveis são escassos. Uma forma semelhante de

pressão hidrostática intermitente aplicada em humanos é o movimento passivo contínuo;

observações clínicas sobre a eficácia deste recurso foram observadas por Salter

(1994)

Influência do alongamento muscular sobre a cartilagem articular

O alongamento muscular cíclico é um recurso terapêutico utilizado na

reabilitação, para aumento da amplitude de movimento de sujeitos previamente

submetidos à imobilização ou não.

Durante protocolos de alongamento muscular, as forças compressivas

estáticas realizadas possuem diferentes durações e magnitudes de compressão.

Entretanto, o efeito do alongamento muscular, muito utilizado na reabilitação, tem sido

pouco estudado na cartilagem articular. Quando submetemos um grupo muscular a uma

posição de alongamento, essa articulação estará, em amplitudes extremas, comprimindo

a cartilagem articular em alguns pontos. Essa compressão gera alterações na

conformação da matriz, na pressão hidrostática e no fluido intersticial, que são

percebidas pelos condrócitos. Eles detectam a compressão e respondem às cargas

aplicadas alterando seu estado metabólico

22,23

Em estudo prévio realizado pelo grupo de pesquisa no qual foi desenvolvida

esta tese (Renner et al, 2006), foi utilizado um protocolo de quatro semanas de

imobilização talocrural seguido de três semanas de alongamento da musculatura

posterior da pata traseira em ratos. O protocolo de alongamento consistia em flexão

dorsal máxima com 10 repetições de 60s, intercaladas por 30s de relaxamento. O

protocolo foi aplicado uma vez ao dia durante três semanas. Os resultados encontrados

mostraram danos na cartilagem articular dos tornozelos previamente imobilizados e

posteriormente submetidos ao alongamento muscular. Foram avaliados celularidade,

clone de condrócitos, conteúdo de proteoglicanas, medidas da espessura da cartilagem e

contagem de condrócitos. As respostas encontradas foram diminuição significativa no

conteúdo de proteoglicanas e aumento na celularidade no grupo submetido ao

alongamento após imobilização, quando comparado ao grupo que foi apenas submetido

à imobilização e ao grupo apenas submetido ao alongamento. Essas importantes

alterações teciduais são compatíveis com respostas degenerativas e podem estar

diretamente relacionadas à magnitude da compressão, bem como à duração dos

estímulos

. Alterações na quantidade de colágeno, bem como em sua orientação podem

fortalecer as evidências de prejuiso e indicar, de forma indireta, a perpetuação da lesão

por perda da qualidade biomecânica do tecido. Portanto, é necessário que seja

investigado o comportamento do colágeno e de outros componentes da matriz

extracelular frente a esse método terapêutico, bem como que seja estabelecido um

parâmetro terapêutico não lesivo à cartilagem para o alongamento muscular.

3.1. REFERÊNCIAS

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13. Ikenoue T, Trindade MCD, Lee MS, et al. 2003. Mechanoregulation of human

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23. Mobasheri A, Carter SD, Martin-Vasallo P, Shakibaei M. 2002 Integrins and Stretch

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Mechanoreceptors in Articular Chondrocytes. Cell Biology International. 26: 1-18.

4. ESTUDO I

ALONGAMENTO MUSCULAR APÓS IMOBILIZAÇÃO É MAIS BENÉFICO À

CARTILAGEM ARTICULAR QUANDO REALIZADO EM DIAS ALTERNADOS

Adriana Frias Renner, Fernando Augusto Vasilceac, Carolina Kalil Dias, Anderson

Amaro dos Santos, Walcy Rosolia Teodoro, Stela Márcia Mattiello Gonçalves Rosa

4.1.1. R

ESUMO

O alongamento muscular é um recurso terapêutico utilizado na reabilitação

após protocolos de imobilização articular. Objetivo: comparar a resposta da cartilagem

articular frente a um alongamento muscular aplicado diariamente a um aplicado em dias

alternados, ambos após imobilização. Material e Métodos: foram utilizados 36 animais

divididos em 6 grupos (n=6): imobilizado (I), imobilizado e alongado 7 dias por semana

(IA7), imobilizado e alongado 3 dias por semana (IA3), alongado 7 dias por semana

(A7), alongado 3 dias por semana (A3), e controle (C). Os grupos I, IA7 e IA3 foram

submetidos a 4 semanas de imobilização da pata traseira esquerda. Os grupos IA7 e

IA3, após a imobilização, foram submetidos a 3 semanas de alongamento da

musculatura posterior da pata traseira esquerda, diariamente e 3 vezes por semana,

respectivamente. Os grupos A7 e A3 permaneceram livres na gaiola por 4 semanas e

posteriormente foram submetidos a 3 semanas de alongamento da musculatura posterior

da pata traseira esquerda, diariamente e 3 vezes por semana, respectivamente. No grupo

C não foi realizada nenhuma intervenção. Após esses procedimentos, foi realizada

eutanásia, os tornozelos esquerdos foram coletados e processados em parafina e corados

com H&E, Safranina e Picrossirius Red para análise. Foram avaliados por dois

observadores, sem conhecimento prévio dos grupos, parâmetros como celularidade,

contagem de clones, perda de proteoglicanos e conteúdo de fibrilas finas e grossas de

colágeno. Para análise estatística foram utilizados os seguintes testes: Kruskal Wallis

com post hoc Newman Keuls para formação de clones e conteúdo de proteoglicanas,

comparações múltiplas de Duncan para avaliação morfométrica de celularidade e Anova

com post hoc de Tukey para proporção das fibrilas finas e grossas de colágeno. Em

todos os testes o nível de significância foi de p≤0,05. Resultados: com relação a

celularidade, o grupo IA7 apresentou aumento significativo da celularidade quando

comparado aos grupos I e C. O grupo IA3 também apresentou alteração celular

significativa com formação de clones quando comparado com os grupos A7, A3 e C. A

maior perda significativa de proteoglicanas foi do grupo IA7, em relação a todos os

outros grupos. O grupo I também perdeu significativamente mais proteoglicanas que os

demais, com exceção do IA7. Com relação às fibrilas de colágeno foi observado que a

imobilização (I) reduziu significativamente as fibrilas finas em relação aos grupos IA3,

A7, A3 e C. Já a quantidade de fibrilas grossas sofreu influência da sobrecarga

mecânica, já que houve diminuição significativa das mesmas em todos os grupos em

relação ao controle. Conclusão: O protocolo de alongamento muscular após

imobilização realizado nesse estudo foi prejudicial à cartilagem articular, já que houve

alteração celular, perda de proteoglicanas e redução das fibrilas finas e grossas de

colágeno. Entretanto, sua intervenção em dias alternados foi menos lesiva, tendo em

vista a manutenção das proteoglicanas e das fibras finas de colágeno.

4.1.2. I

NTRODUÇÃO

Uma evidência presente na prática da reabilitação é que a imobilização

articular prolongada reduz a amplitude de movimento. Segundo Trudel et al (2008), essa

redução da amplitude de movimento é causada por uma contratura articular que se dá

por influência de estruturas articulares (artrogênica) e musculares (miogênica). A

influência do componente artrogênico na contratura articular, aumenta de maneira linear

continuamente enquanto é mantida a imobilização. Para os autores as hipóteses sobre os

componentes articulares envolvidos na restrição artrogênica são: a proliferação de

tecido conectivo, alterações colágenas e encurtamento da cápsula articular. Com

relação ao componente miogênico, os autores relatam uma maior influência das

estruturas musculares apenas nas primeiras semanas da imobilização. Após 16 a 32

semanas, relatam haver um predomínio artrogênico como fator limitante da amplitude

de movimento

Um estudo recente em modelo animal, investigando contratura articular

após imobilização, descreve que após 8 semanas de imobilização não houve

recuperação da amplitude de movimento, quando a única alternativa terapêutica

aplicada foi a remobilização. Os autores desse estudo discutem que a presença de uma

reversibilidade incompleta das contraturas articulares demonstra a necessidade de um

tratamento ativo nas articulações imobilizadas

Baseados no encurtamento muscular (componente miogênico da restrição

articular) que ocorre após períodos de imobilização, os protocolos de alongamento

muscular são alternativas terapêuticas nos pacientes previamente imobilizados.

Entretanto, é importante ter em mente que o alongamento muscular provoca, em

diferentes magnitudes, compressão na cartilagem articular através da carga mecânica

resultante desse movimento articular ativo

A influência dessas cargas mecânicas na cartilagem articular tem sido

amplamente estudada. Elas influenciam a estrutura e organização dos componentes da

matriz extracelular da cartilagem. Como o condrócito percebe seu meio e essas

influências mecânicas através de interações biológicas e biofísicas complexas com sua

matriz extracelular, as cargas mecânicas também acabam influenciando nas taxas de

síntese/degradação dos diferentes componentes da matriz extracelular

4,5,6,7,8,9

Além do estudo das cargas, muitos pesquisadores também já investigaram

as alterações na cartilagem provocadas pela imobilização

10,11,22

. Entre os resultados, é

observada diminuição na espessura

, amaciamento da cartilagem

10,11

, diminuição do

conteúdo de proteoglicanas

13,14,11

e redução das ligações cruzadas do colágeno

13,14

Segundo Brandt et al (2003), a imobilização articular gera alterações atróficas na

cartilagem articular

Um estudo prévio, realizado pelo presente grupo, investigou a resposta de

um protocolo de alongamento muscular realizado diariamente em animais previamente

imobilizados

. De acordo com os resultados, o alongamento muscular aplicado

diariamente após período de imobilização foi prejudicial à cartilagem articular em

alguns parâmetros estudados. Baseado nos resultados do estudo anterior do grupo, foi

considerado que dados como o período e intervalos entre as intervenções in vivo ainda

necessitam de maiores investigações. Além disso, permanece a questão sobre a

influências destas intervenções sobre o colágeno.

Portanto, o presente estudo tem como objetivo comparar a resposta da

cartilagem articular frente a um protocolo de alongamento muscular aplicado

diariamente e a um protocolo aplicado em dias alternados, após um período de

imobilização articular.

4.1.3. M

ATERIAL E MÉTODOS

Grupos experimentais:

Foram utilizados 36 ratos Wistar machos, adultos jovens pesando em média

280g

+ 25,4g. Os animais permaneceram em gaiolas plásticas em biotério do

departamento de Fisioterapia da Universidade Federal de São Carlos, sob condições

controladas de luz (ciclo 12:12h) e temperatura (22±2°C) e acesso livre a água e ração

peletizada. O estudo obteve aprovação do comitê de ética em pesquisa animal desta

instituição (Protocolo CEEA: 15/20006).

Procedimentos Experimentais:

Os animais foram divididos em 6 grupos (n=6): imobilizado (I), imobilizado

e alongado 7 dias por semana (IA7), imobilizado e alongado 3 dias por semana (IA3),

alongado 7 dias por semana (A7), alongado 3 dias por semana (A3), e controle (C).

Os grupos I, IA7 e IA3 foram submetidos a 4 semanas de imobilização, em

flexão plantar das articulações talocrurais das suas patas posteriores esquerdas, com

modelo previamente utilizado

3,16

. Após a retirada do aparato de imobilização, o grupo I

permaneceu livre na gaiola por três semanas, e os grupos IA7 e IA3 foram submetidos a

3 semanas de alongamento da musculatura posterior da pata traseira esquerda,

diariamente e 3 vezes por semana, respectivamente.

Os grupos A7 e A3 permaneceram livres na gaiola por 4 semanas e

posteriormente foram submetidos a 3 semanas de alongamento da musculatura posterior

da pata traseira esquerda, diariamente ou 3 vezes por semana, respectivamente. No

protocolo de alongamento muscular, realizado sob anestesia (ketamina, 95mg/kg e

xilazina, 12 mg/kg), o tornozelo posterior esquerdo foi mantido em flexão dorsal

máxima por 10 repetições de 60s, com intervalos de 30s de repouso entre eles. O grupo

C permaneceu livre na gaiola durante as 7 semanas do experimento

Processamento das Amostras

Ao final das sete semanas, os animais foram eutanasiados com overdose

anestésica e seus tornozelos esquerdos foram coletados, fixados com formol tamponado

(10%), descalcificados com ácido nítrico 7,5% acrescido de glicerina (70ml/l de

solução) e processados em parafina. Com o uso de um micrômetro, foram realizados

cortes de 6 µm, que foram montados em lâminas tratadas com aminosilane. As amostras

foram coradas com Hematoxilina & Eosina (H&E), Safranina O fast green e

Picrossirius Red para as análises.

Análises dos cortes:

Através da coloração de H&E foi realizada a contagem de clones ao longo

da extensão de cada corte. Também foi realizada a avaliação morfométrica da

celularidade da cartilagem, utilizando-se o software de análise de imagens Axiovision

rel 4.7 (Carl Zeiss).

Inicialmente foi delimitada uma área central do corte de 40.000 µm

para posterior contagem dos condrócitos

Nos cortes corados com Safranina O fast green, foi realizada a mesma

classificação do estudo anterior

. A classificação consistia em normal (grau 0) com a

cartilagem avermelhada, passando por perda leve em até metade da área total (grau 1),

perda leve na extensão total (grau 2), perda importante em até metade da extensão total

(grau 3) até perda importante das proteoglicanas (grau 4), quando o tecido não

apresentava nenhuma coloração avermelhada em toda sua extensão. Já os cortes corados

com Picrosirius Red foram avaliados em microscópio de luz polarizada, através do

software Image Pro Plus (Olympus), com aumento de 400X. As fibras de colágeno

coradas com Picrosirius Red (específico para detecção do colágeno), visualizadas sob

luz polarizada, apresentam uma coloração dependente da espessura das fibras e de seu

estado de agregação. Com o aumento da espessura e da agregação física, a cor varia de

verde para amarelo, laranja até a cor vermelha nas fibrilas mais grossas

18,19,20

. Através

do software, as imagens amarelo/esverdeadas foram definidas como de fibrilas finas e

as laranja/avermelhadas definidas como de fibrilas grossas. As áreas identificadas pelo

software, correspondentes a fibrilas finas e fibrilas grossas de colágeno, foram divididas

pela área total analisada e o resultado final foi expresso em porcentagem. Obtivemos

assim, a porcentagem de fibrilas finas e a de fibrilas grossas da área total avaliada para

cada grupo estudado.

4.1.4. A

NÁLISE ESTATÍSTICA

Para a comparação da classificação de clones e conteúdo de proteoglicanas

entre os diferentes grupos, foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal Wallis com

post hoc Newman Keuls. Para as comparações intergrupos da avaliação morfométrica

de celularidade, foi utilizado o teste de comparações múltiplas de Duncan. A avaliação

da proporção das fibrilas finas e grossas de colágeno nos diferentes grupos foi realizada

através do teste de Anova com post hoc de Tukey. Em todos os testes o nível de

significância foi de p≤0,05.

4.1.5. R

ESULTADOS

Não foram observadas ulcerações de pele ou edemas nos pés após remoção

do aparato de imobilização. Na avaliação macroscópica das articulações, não foram

observadas erosões, osteófitos, irregularidades de superfície ou fissuras nos diferentes

grupos.

Celularidade

A celularidade das cartilagens articulares do grupo submetido à

imobilização e posterior alongamento diário (IA7) aumentou quando comparado aos

grupos imobilizado (I) (p= 0,04) e controle (C) (p= 0,04), como ilustrado na Figura 1.

Celularidade Pata Tratada

100

120

140

IIA7IA3A7A3C

Grupos

N° de ocorrências

Figura 1: Média e desvios padrão da celularidade das patas tratadas. I= imobilizados, IA7=

imobilizados e alongados 7x/sem, IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A7= alongados

7x/sem, A3= alongados 3x/sem, C=controle. * IA7 > I (p= 0,04) e C (p= 0,04). Não foi

encontrada diferença entre os demais grupos.

Clones

Os animais do grupo imobilizado e alongado três dias por semana (IA3)

também apresentaram alteração celular. Houve aumento significativo na formação de

clones em relação aos grupos alongado diariamente A7 (p=0,003), alongado em dias

alternados A3 (p=0,00) e controle C(p=0,01). Outro achado foi que o grupo alongado

em dias alternados apresentou menor quantidade de clones que os grupos I (p=0,04),

IA7(p=0,00) e IA3(p=0,00). Os resultados estão ilustrados na Figura 2.

Presença de Clones Patas Tratadas

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

IIA7IA3A7A3C

Grupos

Presença de clones

Figura 2: Média e desvios padrão da presença de clones. I= imobilizados, IA7= imobilizados e

alongados 7x/sem, IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A7= alongados 7x/sem, A3=

alongados 3x/sem, C=controle. * IA3 > A7 (p=0,003), A3 (p=0,00) e C (p=0,01). ** A3 < I

(p=0,04), IA7 (p=0,004), IA3 (p=0,00). Não foi encontrada diferença entre os demais grupos.

Proteoglicanas

Com relação às proteoglicanas, o grupo imobilizado e alongado diariamente

(IA7) apresentou uma maior perda em relação aos grupos IA3 (p=0,00), A7 (p=0,00),

A3 (p=0,00) e C (p=0,00), como pode ser visualizado na Figura 3. O grupo imobilizado

(I) também perdeu mais proteoglicanas que os demais, IA3 (p=0,00), A7 (0,00), A3

(p=0,00) e C (p=0,00), também visualizado na Figura 3.

Perda de Proteoglicanas Patas Tratadas

0,5

1,5

2,5

3,5

4,5

IIA7IA3A7A3C

Grupos

graduação de perda de

proteoglicanas

Figura 3: Média e desvios padrão da perda de proteoglicanas. I= imobilizados, IA7=

imobilizados e alongados 7x/sem, IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A7= alongados

7x/sem, A3= alongados 3x/sem, C=controle. * I > IA3 (p=0,00), A7 (0,00), A3 (p=0,00) e C

(p=0,00). ** IA7 > IA3 (p=0,00), A7 (0,00), A3 (p=0,00) e C (0,00).

A Figura 4 ilustra os diferentes padrões de coloração avermelhada da

Safranina-O, encontrada nos grupos estudados. Na Figura 4A pode ser observada uma

coloração avermelhada considerada normal. A Figura 4B representa um corte com perda

leve de proteoglicanas, definido por uma redução parcial do avermelhado da Safranina-

O. A Figura 4C ilustra uma perda importante do tom avermelhado e portanto, redução

intensa de proteoglicanas.

Figura 4: Painel montado a partir das fotomicrografias apresentando as diferentes graduações

da ortocromasia para safranina-o fast green, indicando perda de proteoglicanas, encontradas

nos grupos estudados. A: coloração avermelhada caracterizada como normal (graduação 0);

B: redução leve da coloração avermelhada do corte (graduação 1 quando em até metade da

área total do corte e 2 quando na extensão total do corte) e C: redução intensa da coloração

avermelhada (graduação 3 quando em metade da área total do corte e 4 quando na extensão

total do corte). Aumento de 400x.

Fibrilas de Colágeno

Com relação às fibrilas de colágeno, foi observado que a imobilização (I) e a

imobilização seguida de alongamento diário (IA7) geraram redução e ou rearranjo das

fibrilas finas em relação aos grupos IA3 (p= 0,00 e p=0,00), A7 (p= 0,00 e p=0,00) e C

(p= 0,00 e p=0,00), respectivamente. Os dados estão representados na Figura 5.

Já com relação às fibrilas grossas, houve diminuição e ou rearranjo das

mesmas em todos os grupos em relação ao grupo controle (C). O grupo controle só não

apresentou diferença com relação ao grupo imobilizado. As diferenças entre o grupo

controle e os demais foram: IA7 (p= 0,01), IA3 (p= 0,00), A7 (0,00), A3 (p=0,001).

Também representados na Figura 5.

Porcentagem de Fibrilas Colagenas

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

70,00%

Grupos

Porcentagem média

IIA7IA3A7A3C

fibrilas finas de colageno

fibrilas grossas de colageno

+ +++

***

* **

Figura 5: Apresentação das porcentagens de fibras colágenas finas e grossas observadas nas

patas tratadas dos diferentes grupos. I= imobilizados, IA7= imobilizados e alongados 7x/sem,

IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A7= alongados 7x/sem, A3= alongados 3x/sem,

C=controle. Fibras finas: * I < IA7 (p= 0,00), IA3 (p= 0,00), A7 (p=0,00), A3 (p= 0,00) e C

(0,00); ** IA7 < IA3 (p= 0,00), A7 (p= 0,00) e C (p= 0,00); C*** > I (p= 0,00), IA7 (p= 0,00),

A3 (p= 0,001). Fibras grossas: + I > IA3 (p=0,00), A7 (p= 0,009); ++ IA3 < I (p= 0,00), IA7

(0,008), C (p= 0,00); +++ C > IA7 (p= 0,01), IA3 (p= 0,00), A7 (0,00), A3 (p=0,001).

Na Figura 6 podem ser visualizados diferentes padrões de coloração

presentes nas articulações talocrurais dos diferentes grupos estudados. Estes foram

corados com picrossirius red e observados sob luz polarizada. Nas diferentes

fotomicrografias, podemos observar colorações laranja/avermelhadas (setas), que

indicam a presença de fibrilas colágenas grossas e mais fortemente agregadas, bem

como, podemos visualizar colorações esverdeadas (cabeças de seta) que indicam fibrilas

colágenas finas e com fraco estado de agregação. Em A observamos uma redução dos

tons esverdeados e um aumento do tom alaranjado (seta). Esta fotomicrografia pretence

a um animal do grupo imobilizado e seu padrão de coloração nos indica uma maior

proporção de fibrilas grossas de colágeno. Na figura B observamos novamente um

predomínio da coloração alaranjada com redução da coloração esverdeada (seta). Essa

fotomicrografia pertence a um animal do grupo IA7 e indica uma redução das fibrilas

finas de colágeno com concomitante aumento das fibrilas grossas. A figura C apresenta

redução da coloração alaranjada seguida de aumento da proporção de coloração

esverdeada (cabeça de seta). Esta imagem pertence a um animal do grupo IA3, e indica

um aumento das fibrilas colágenas finas. Na figura D encontramos um predomínio da

coloração alaranjada (seta), mas também pode ser visualizada a coloração esverdeada

(cabeça de seta). Esta imagem pertence a um animal do grupo A7. Na figura E, de um

animal do grupo A3, novamente observamos as colorações alaranjadas (seta) e

esverdeadas (cabeça de seta). A figura F pertence a um animal do grupo C. Nesta

podemos visualizar uma proporção normal da coloração alaranjada (seta) e da coloração

esverdeada (cabeça de seta), onde há o predomínio dos tons alaranjados.

Figura 6: Fotomicrografias de cortes histológicos das articulações talo crurais dos animais dos

diferentes grupos estudados. Todas foram coradas com picrossírius red e visualizadas sob luz

polarizada. Os tons laranja avermelhados representam as fibrilas grossas de colágeno e os tons

esverdeados, as fibrilas finas. A: um animal do grupo I apresentando predominantemente

coloração laranja/avermelhada (seta), há redução da proporção da coloração esverdeada. B:

animal do grupo IA7 com predomínio da coloração alaranjada (seta). C: animal do grupo IA3,

com redução da coloração alaranjada e aumento da proporção de coloração esverdeada

(cabeça de seta). D: animal do grupo A7, com coloração alaranjada (seta) e coloração

esverdeada (cabeça de seta). E: animal do grupo A3, coloração alaranjada (seta) e coloração

esverdeada (cabeça de seta). F: animal do grupo C, proporção normal da coloração

alaranjada (seta) e coloração esverdeada (cabeça de seta). Aumento de 400X.

4.1.6. D

ISCUSSÃO

A imobilização articular prolongada gera alterações atróficas na cartilagem

articular

. De uma forma geral, as alterações da cartilagem mais comumente

encontradas em diferentes estudos, como resposta à imobilização articular, são a

diminuição na espessura

, o amaciamento da cartilagem

, a diminuição do conteúdo de

proteoglicanas

13,14

e a redução das ligações cruzadas do colágeno

13,14

. Estas são

respostas diferentes das observadas frente a um trauma ou ao processo de instalação e

evolução da osteoartrite.

No trauma, segundo o relatório de avaliação histológica de reparo da

cartilagem articular, elaborado pela sociedade internacional de reparo em cartilagem

(ICRS), a cartilagem articular, assim como outros tecidos, segue uma seqüência definida

de eventos como reação à lesão. São eles: aumento do conteúdo de água, degradação da

matriz por enzimas endógenas, apoptose e necrose celular, seguida por ruptura da matriz

extracelular com perda de seus constituintes no espaço articular. Esse último serve

como gatilho de resposta inflamatória na sinóvia. Assim, o processo de reparo é

iniciado, envolvendo atividades limitadas de replicação celular, síntese aumentada de

matriz extracelular e uma reorganização da matriz por células endógenas

Além do prejuízo da cartilagem que é observado na imobilização, há

também a redução da amplitude de movimento

. Esta é influenciada por um

componente miogênico, que é o encurtamento muscular nas semanas iniciais de

imobilização

. Portanto, o alongamento muscular é um recurso terapêutico bastante

indicado e utilizado na reabilitação após protocolos de imobilização articular.

Entretanto, segundo Brandt

, podem ocorrer danos irreversíveis na cartilagem articular

previamente imobilizada, devido a cargas que quando aplicadas em articulações

normais não produziriam alterações morfológicas, bioquímicas ou metabólicas, levando

a condropatias. Ele afirma que deve haver cautela na aplicação de cargas excessivas em

uma cartilagem articular atrófica antes das proteoglicanas terem sido repostas. É

interessante lembrar que em nosso estudo, as maiores alterações foram observadas no

grupo imobilizado e alongado diariamente, ou seja, em um modelo de compressão

gerado em uma cartilagem articular atrófica.

De acordo com a literatura, a birrefrigência das moléculas colágenas,

quando corada com picrossírius e vista através de microscópio de luz polarizada, é

influenciada pela sua espessura e por seu estado de agregação física. As moléculas mais

fortemente agregadas, bem alinhadas e de maior espessura apresentam uma maior

birrefrigência

18,19,20

. Segundo Montes

, o colágeno tipo I forma fibras de maior

espessura e fortemente agregadas, identificadas por meio de fibrilas grossas quando

coradas por picrosirius. Essas características geram uma maior birrefrigência e podem

ser visualizadas através de luz polarizada. Já o colágeno tipo II, composto por finas

fibrilas dispostas como uma rede, apresenta fraca birrefrigência em função desse tipo de

agregação.

No presente estudo não houve aumento de birrefrigência das fibras grossas

nos grupos submetidos às intervenções propostas. Isso pode indicar que não houve

produção de colágeno tipo I frente às diferentes intervenções. Esse é um resultado

positivo, pois sabe-se que o colágeno tipo I não é típico da cartilagem, mas ele está

presente nas fases iniciais da osteoartrite

. Pelo contrário, com relação às fibras

grossas, houve diminuição de sua proporção, detectada pelo software utilizado. Essa

redução encontrada pode indicar uma desorganização ou redução das agregações das

fibrilas grossas. Os grupos que apresentaram essa redução foram todos os submetidos ao

alongamento com ou sem imobilização prévia (IA7, IA3, A7 e A3). Esse resultado pode

indicar uma influência do estímulo mecânico na alteração e ou desorganização das

fibrilas mais grossas de colágeno.

Em um estudo experimental, Hyttinen et al (2001) submeteram porcos da

índia jovens e idosos a exercícios em esteira e observaram que nos animais jovens,

houve aumento da organização ou quantidade de colágeno, enquanto que o mesmo

exercício provocou grande redução da organização ou quantidade de colágeno nos

animais idosos. Assim como em nosso estudo, esses resultados demonstraram uma

influencia de força mecânica na organização/síntese-degradação do colágeno. Ainda

com relação às fibras grossas do colágeno, observamos que a imobilização, como um

fator isolado, não provocou resposta na agregação das fibrilas colágenas grossas. A

ausência de compressão que ocorreu na imobilização, influenciou apenas na redução ou

desorganização das fibrilas finas de colágeno. Essa alteração das fibrilas finas foi

perpetuada no grupo imobilizado e alongado diariamente, o que não ocorreu no grupo

submetido ao alongamento em dias alternados. Portanto, considerando a resposta

colágena como um todo, houve um maior prejuízo desse componente frente à

imobilização seguida de alongamento muscular diário.

A resistência da cartilagem às compressões a que ela é submetida nas

atividades de vida diária se dá, entre outros fatores, em função do funcionamento

adequado de dois de seus componentes. São eles: as proteoglicanas, responsáveis pela

elasticidade e resiliência da cartilagem, e o colágeno que propicia uma rigidez tênsil e

força ao tecido

. Quando avaliamos a resposta das proteoglicanas às intervenções,

encontramos uma redução de seu conteúdo nos animais imobilizados e uma maior

redução nos animais imobilizados e alongados diariamente. Entretanto, o grupo que

recebeu alongamento em dias alternados não apresentou redução de seu conteúdo. O

que mais uma vez, demonstra que essa freqüência de intervenção pode ser menos lesiva

ao tecido.

No estudo de Hyttinen et al (2001), anteriormente citado, também não foram

encontradas alterações significativas no conteúdo de glicosaminoglicanas nos dois

modelos de intervenção, apesar das alterações geradas no colágeno

. Essas alterações,

que ocorreram no colágeno sem alteração da proteoglicana, podem indicar uma certa

independência entre a resposta colágena e a resposta da proteoglicana frente a esses

tipos de sobrecarga.

Resultados importantes, que podem estar relacionados com resposta de

reparo frente às intervenções de nosso estudo, foram as respostas celulares encontradas.

Houve formação de clones no grupo imobilizado e alongado em dias alternados, e

aumento da celularidade no grupo imobilizado e alongado diariamente. Diferentes

escores de avaliação histológica da cartilagem articular apresentam esse tipo de

alteração celular como parte do processo de reparo

17,23

. As alterações celulares têm

relação direta com as respostas de reparo e manutenção da cartilagem, uma vez que é o

condrócito que produz e mantém em equilíbrio os componentes da matriz . Mankin et al

(1971) já descrevem em seu modelo de avaliação da cartilagem, alterações do

condrócito como formação de clone, e alterações na celularidade como parte do

processo de lesão e reparo da cartilagem

4.1.7. C

ONCLUSÃO

O protocolo de alongamento muscular após imobilização realizado nesse

estudo foi prejudicial à cartilagem articular, já que houve alteração celular, perda de

proteoglicanas e redução das fibrilas finas e grossas de colágeno. Entretanto, sua

intervenção em dias alternados foi menos lesiva, tendo em vista a manutenção das

proteoglicanas e das fibras finas de colágeno.

4.1.8. R

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5. ESTUDO II

COMPARAÇÃO ENTRE O EFEITO DA REMOBILIZAÇÃO E DO

ALONGAMENTO MUSCULAR APÓS IMOBILIZAÇÃO SOBRE A EXPRESSÃO

DA FIBRONECTINA

, SULFATO DE CONDROITINA NA CARTILAGEM

ARTICULAR

Adriana Frias Renner, Fernando Augusto Vasilceac, Stela Márcia Mattiello Gonçalves

Rosa.

5.1.1. R

ESUMO

O objetivo do presente estudo foi investigar a resposta da fibronectina e do

sulfato de condroitina frente a um protocolo de imobilização seguido de remobilização e

outro seguido de alongamento muscular aplicado em dias alternados. Materiais e

métodos: foram utilizados 20 ratos Wistar machos, adultos jovens, pesando em média

280g

+ 25,4g. Eles foram divididos aleatoriamente em 4 grupos (n=5): remobilizado (R),

imobilizado e alongado 3 dias por semana (IA3), alongado 3 dias por semana (A3), e

controle (C). Os grupos R e IA3 foram submetidos a 4 semanas de imobilização (patas

posteriores esquerdas). Após esse período, o grupo R permaneceu livre na gaiola por

três semanas e o grupo IA3 foi submetido a 3 semanas de alongamento (3 vezes por

semana). O grupo A3 permaneceu livre na gaiola por 4 semanas e, posteriormente, foi

submetido a 3 semanas de alongamento, 3 vezes por semana. Os protocolos de

alongamento muscular foram realizados sob anestesia. Os tornozelos esquerdos foram

mantidos em flexão dorsal máxima, 10 séries de 60s, com intervalos de 30s de repouso

entre eles. O grupo C permaneceu livre na gaiola durante as 7 semanas do experimento.

Após esses procedimentos, os animais foram eutanasiados, os tornozelos esquerdos

foram coletados, processados em parafina e incubados com anti fibronectina e anti

sulfato de condroitina 4. As intensidades das reações foram avaliadas de forma semi-

quantitativa por dois observadores, sem conhecimento prévio dos grupos, e descritas

como: 0 (sem marcação), 1 (marcação fraca), 2 (marcação positiva) e 3 (marcação

intensa). Foram realizados: o teste não paramétrico de Kruscal Wallis com post hoc de

Newmann Keuls e o teste de correlação de Spearman para fibronectina e sulfato de

condroitina. Resultados: o grupo imobilizado e alongado em dias alternados (IA3)

apresentou significativamente maior expressão de fibronectina que os outros grupos.

Não houve diferença na expressão de sulfato de condroitina 4 entre os diferentes grupos.

Houve uma fraca correlação entre as respostas da fibronectina e do sulfato de

condroitina 4 frente às diferentes intervenções. Conclusão: O alongamento aplicado

após imobilização provocou uma resposta de lesão/reparo bastante inicial sem evoluir

para perda de sulfato de condroitina 4. Já esta mesma resposta inicial de lesão/reparo

não foi desencadeada com a remobilização pura. Além disso, o alongamento aplicado

em tecido sadio não provocou sinais de respostas deletérias.

5.1.2. I

NTRODUÇÃO

A fibronectina é uma glicoproteína presente em pequena quantidade na

matriz extracelular da cartilagem articular normal. Ela possui domínios funcionais

distintos que podem se ligar a integrinas, heparina, fibrina e colágeno. Como resultado

da atividade desses muitos domínios funcionais, esta glicoproteína está envolvida em

uma grande quantidade de processos biológicos como a migração celular, reparo,

angiogênese e diferenciação celular

. Há múltiplas isoformas de fibronectina. Elas são

produzidas na superfície celular e depositadas na matriz extracelular como fibrilas de

fibronectina altamente insolúveis. Zack et al (2006) afirmaram que apesar da

fibronectina ser um componente em menor quantidade na matriz da cartilagem articular

normal, em culturas de fragmentos de cartilagem osteoartrítica, pode haver até 10 vezes

mais fibronectina. Isso ocorre em função dos aumentos tanto na sua síntese, como em

seu acúmulo. Ela pode ser proteolisada em fragmentos menores, por múltiplas enzimas,

e essa fragmentação é vista na sinóvia e na cartilagem de sujeitos com OA. Para esses

autores, essa glicoproteína poderia ser um biomarcador da artrite e estaria envolvida no

início e progressão da doença artrítica

Wolf et al (2003) realizaram estudo com o objetivo de investigar se diferentes

freqüências de cargas mecânicas cíclicas, aplicadas intermitentemente em fragmentos de

cartilagem, alterariam a biosíntese e retenção da fibronectina. Eles concluíram que o

efeito das diferentes freqüências e tempos de compressão e descompressão de cargas

intermitentes não pode ser descrito na forma de uma correlação. Entretanto, afirmam

que tais formas de carga induziram alterações no metabolismo da fibronectina, similares

aos observados na osteoartrite humana e animal

No caminho inverso da fibronectina, que aumenta com o início da doença

artrítica, o sulfato de condroitina, uma glicosaminoglicana, componente importante da

matriz extracelular, tem sua depleção como evento patofisiológico precoce na mesma

Apesar dessa perda ser um evento chave no processo osteoartrítico, estudos em modelos

animais mostraram que a cartilagem em um processo degenerativo inicial, antes de

ocorrerem fibrilações, apresenta uma resposta de reparo hipermetabólica com aumento

na síntese e degradação desses componentes da matriz

O sulfato de condroitina colabora fortemente com a compressibilidade da

cartilagem articular. Aproximadamente 100 cadeias de sulfato de condroitina e 100

cadeias de queratan sulfato (ambas glicosaminoglicanas) estão ligadas a uma proteína

central formando uma molécula de proteoglicana (agrecan). Essas glicosaminoglicanas

criam uma grande pressão osmótica que atrai a água ao tecido fazendo com que a rede

colágena se expanda. As moléculas colágenas permanecem organizadas em uma rede

fibrilar densa e se encontram embebidas em uma alta concentração de agregados dessas

proteoglicanas. Portanto, a propriedade de compressibilidade da cartilagem articular

resulta do equilíbrio entre a pressão osmótica de tumefação garantidos pelas

proteoglicanas/glicosaminoglicanas, mas também, de uma força de tensão que é

proporcionada pelas fibrilas colágenas. Isso faz com que a capacidade biomecânica de

sustentação de carga da cartilagem articular dependa tanto da sua composição como da

organização de sua matriz extracelular

A imobilização articular ainda é um recurso necessário e utilizado na prática

clínica para disfunções do sistema músculo-esquelético. Já está bem descrito que tal

recurso provoca redução da amplitude de movimento

e alterações atróficas na

cartilagem articular. Essa cartilagem atrófica, por sua vez, estará mais propensa a sofrer

danos com determinadas cargas compressivas, que normalmente não seriam lesivas

Todos os sinais mecânicos que a cartilagem articular recebe modulam alterações na

atividade bioquímica e no comportamento do condrócito. A compressão da cartilagem

resulta em alterações complexas nesse tecido incluindo as deformações da matriz e da

célula, alterações da pressão hidrostática e osmótica e alteração do conteúdo de água da

matriz

. As cargas mecânicas excessivas

ou cargas mecânicas fisiológicas quando

aplicadas em uma cartilagem atrófica

, podem influenciar de forma negativa e levar a

um desequilíbrio entre as atividades anabólicas e catabólicas, resultando em depleção

dos componentes da matriz

Após períodos de imobilização, alguns recursos terapêuticos utilizados para

ganho de amplitude de movimento têm sido estudados. Diferentes aspectos do efeito do

alongamento muscular

e da remobilização

na cartilagem já foram descritos.

Entretanto, não foram encontrados estudos investigando a resposta da fibronectina e do

sulfato de condroitina nessas intrevenções.

Tendo em vista o envolvimento da fibronectina e das glicosaminoglicanas em

estágios iniciais de lesão e reparo da cartilagem articular, o objetivo do presente estudo

foi investigar suas respostas e correlações frente a um protocolo de imobilização

seguido de remobilização e outro seguido de alongamento muscular, aplicado em dias

alternados.

5.1.3. M

ATERIAL E MÉTODOS

Grupos experimentais:

Foram utilizados 20 ratos Wistar machos, adultos jovens pesando em média

280g

+ 25,4g. Os animais permaneceram em gaiolas plásticas, em biotério do

Departamento de Fisioterapia da Universidade Federal de São Carlos, sob condições

controladas de luz (ciclo 12:12h) e temperatura (22±2°C) e acesso livre a água e ração

peletizada. O estudo obteve aprovação do comitê de ética em pesquisa animal desta

instituição (Protocolo CEEA: 15/20006).

Procedimentos Experimentais:

Os animais foram divididos em 4 grupos (n=5): remobilizado (R), imobilizado e

alongado 3 dias por semana (IA3), alongado 3 dias por semana (A3), e controle (C).

Os grupos R e IA3 foram submetidos a 4 semanas de imobilização, em

flexão plantar da articulação talocrural das suas patas posteriores esquerdas, com

modelo previamente utilizado

9,11

. Após a retirada do aparato de imobilização, o grupo R

permaneceu livre na gaiola por três semanas, e o grupo IA3 foi submetido a 3 semanas

de alongamento da musculatura posterior da pata traseira esquerda, 3 vezes por semana.

O grupo A3 permaneceu livre na gaiola por 4 semanas e, posteriormente, foi submetido

a 3 semanas de alongamento da musculatura posterior da pata traseira esquerda, 3 vezes

por semana. Os protocolos de alongamento muscular foram realizados sob anestesia

(ketamina, 95 mg/kg e xilazina 12 mg/kg). Os tornozelos eram mantidos em flexão

dorsal máxima, 10 séries de 60s, com intervalos de 30s de repouso entre eles. O grupo C

permaneceu livre na gaiola durante as 7 semanas do experimento.

Processamento das Amostras

Ao final das sete semanas, os animais foram eutanasiados com overdose

anestésica e seus tornozelos esquerdos foram coletados, fixados com formol tamponado

(10%), descalcificados com ácido nítrico (7,5%) acrescido de glicerina e processados

em parafina. Foram realizados cortes de 6 µm em microtomo, montados em lâminas

tratadas com aminosilane e incubados com anticorpos anti-sulfato de condroitina 4 ou

anti-fibronectina.

Imunohistoquimica

Anti-fibronectina

Os cortes foram hidratados em série decrescente de álcool, submetidos a

digestão enzimática com protease (Sigma P6911) 0,025%, diluído em PBS por 15

minutos em temperatura ambiente, lavados em PBS, para bloqueio da peroxidase

endógena, incubados em solução aquosa de H

3% por 20 minutos, novamente

lavados com PBS acrescido de Triton 0,5% por 10 minutos. Para bloqueio das ligações

inespecíficas, foram incubados com BSA 0,5%, por 30 minutos, e incubados overnight a

4°C com anticorpo primário rabbit anti-fibronectin (Dako), em uma diluição de 1:100.

O anticorpo secundário (PK 6200 Vector) foi aplicado na diluição de 1:200 por 1h em

temperatura ambiente. Os cortes foram lavados em PBS e incubados com avidina

biotina 1:100 (PK 6200 Vector) por 30 minutos. Lavados em PBS e revelados com

DAB solução cromógena (DAB, DAKO). Os cortes foram contracorados com

hematoxilina, desidratados e montados com meio de montagem Permount.

Anti-sulfato de condroitina 4

Os cortes foram hidratados em série decrescente de álcool, incubados com

chondroitinase ABC (Sigma Chemical Co) 0.02 U/ mL em tampão Tris-acetato com pH

8 por 30 minutos, lavados em PBS, realizado bloqueio da peroxidase endógena com

por 20 minutos, lavados em PBS e PBS com Triton 0,5% por 10 minutos. Na

seqüência, foi realizado o bloqueio das ligações inespecíficas com soro normal 1:50 em

PBS (kit ABC PK 6200), por 30 minutos. Depois, os cortes foram incubados com

anticorpo primário mouse anti-chondroitin-4-sulphate (Chemicon) na diluição de 1:200,

overnight a 4°C. O anticorpo secundário (PK 6200 Vector) foi aplicado na diluição de

1:200 por 1h, em temperatura ambiente. Os cortes foram lavados em PBS e incubados

com avidina biotina 1:100 (PK 6200 Vector), por 30 minutos. Lavados em PBS e

revelados com DAB solução cromógena (DAB, DAKO). Os cortes foram contracorados

com hematoxilina, desidratados e montados com meio de montagem Permount.

As fotomicrografias das reações de imunohistoquímica foram adquiridas através

de câmera acoplada ao microscópio Zeiss, com aumento de 400x. As intensidades das

reações foram avaliadas de forma semiquantitativa por dois observadores, sem

conhecimento prévio dos grupos, e descritas como: 0 (ausente), 1 (fracamente positiva),

2 ( positiva) e 3 (fortemente positiva), baseadas no estudo de Ustunel et al

. Foram

avaliadas separadamente: as camadas calcificadas (limite do osso subcondral até a linha

de crescimento) e não calcificadas (linha de crescimento até superfície articular).

5.1.4. A

NÁLISE ESTATÍSTICA

Foram utilizados os testes não paramétrico de Kruskal Wallis, com post hoc

Newman Keuls, para a comparação da classificação semiquantitativa de fibronectina e

sulfato de condroitina 4 entre os diferentes grupos. Para testar a correlação entre as

respostas da fibronectina e sulfato de condroitina 4, foi utilizado o teste de correlação de

Spearman. Em todos os testes o nível de significância foi de p≤0,05 e considerada forte

correlação o R≥0,8.

5.1.5. R

ESULTADOS

Imunomarcação para Fibronectina

Foram observadas diferentes intensidades de marcação para fibronectina na

cartilagem articular dos diferentes grupos estudados. Estas marcações podem ser

traduzidas como maior ou menor expressão da mesma neste tecido. As fotomicrografias

que ilustram esses achados podem ser visualizadas na Figura 7. Na Figura 7A, de um

animal do grupo remobilizado, pode ser observada uma imunomarcação positiva na

camada calcificada (seta), o que indica expressão da fibronectina. Já na camada não

calcificada há uma marcação fracamente positiva (cabeça de seta), indicando fraca

expressão da mesma. A Figura 7B, de um animal do grupo IA3, apresenta

imunomarcação positiva na camada calcificada (seta), indicando expressão da

fibronectina. Na camada não calcificada, a marcação é fortemente positiva (cabeça de

seta) e indica forte expressão desta glicoproteína. Na Figura 7C, de um animal do grupo

A3, podemos observar uma marcação fracamente positiva na camada calcificada (seta) e

na camada não calcificada (cabeça de seta), o que significa que ambas apresentaram

fraca expressão da fibronectina. A Figura 7D também apresenta uma marcação

fracamente positiva na camada calcificada (seta), assim como, na camada não

calcificada (cabeça de seta). Esse resultado indica fraca expressão da fibronectina nas

duas camadas, e a imagem pertence a um animal do grupo controle.

Figura 7: Fotomicrografia de reação de imunohistoquímica para fibronectina. A:

imunomarcação positiva na camada calcificada (seta) e fracamente positiva na camada não

calcificada (cabeça de seta), grupo Remobilizado. B: imunomarcação positiva na camada

calcificada (seta) e fortemente positiva na camada não calcificada (cabeça de seta),grupo IA3.

C: marcação fracamente positiva na camada calcificada (seta) e na camada não calcificada

(cabeça de seta), grupo A3. D: marcação fracamente positiva na camada calcificada (seta) e

também na camada não calcificada (cabeça de seta), grupo controle. Aumento de 400x.

Na camada calcificada, o grupo imobilizado e alongado em dias alternados

(IA3) apresentou maior intensidade de marcação de fibronectina que os grupos A3

(p=0,03) e C (p=0,00), como mostra a Figura 8. A maior intensidade de marcação está

diretamente relacionada com uma maior expressão da fibronectina.

Graduação Fibronectina Camada Calcificada

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

R IA3 A3 C

Grupos

Graduação

Imunohistoquímica

Figura 8: Média da graduação para fibronectina na camada calcificada. R= remobilizados,

IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A3= alongados 3x/sem, C=controle. * IA3

(p=0,03), e C (p=0,00).

Na camada não calcificada, o grupo imobilizado e alongado em dias

alternados (IA3) apresentou maior intensidade de marcação que os grupos remobilizado

(R) (p=0,00), alongado em dias alternados (p=0,00) e controle (p=0,00), ilustrado na

Figura 9. Portanto, o grupo IA3 apresentou uma maior expressão de fibronectina que os

demais grupos estudados.

Graduação Fibronectina Camada Não-Calcificada

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

R IA3 A3 C

Figura 9: Média da graduação para fibronectina na camada não calcificada. R=

remobilizados, IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A3= alongados 3x/sem, C=controle. *

IA3

I (0,00), A3 (p=0,00), e C (p=0,00).

Imunomarcação para sulfato de condroitina 4

Os condrócitos não apresentaram diferença entre as intensidades de

imunomarcações para sulfato de condroitina nos diferentes grupos estudados. Isso

significa que houve uma expressão semelhante dessa glicossaminoglicana nas diferentes

intervenções aplicadas. As imagens podem ser vistas na Figura 10. Pode ser identificada

na Figura 10A, uma imunomarcação positiva nos condrócitos da camada calcificada

(seta) e uma marcação fortemente positiva na camada não calcificada (cabeça de seta),

fotomicrografia de um animal do grupo remobilizado. Na Figura 10B, pode ser

observada uma imunomarcação semelhante: positiva na camada calcificada (seta) e

fortemente positiva na camada não calcificada (cabeça de seta), de um animal do grupo

IA3. O mesmo ocorre com os condrócitos da Figura 10C: marcação positiva na camada

calcificada (seta) e fortemente positiva na camada não calcificada (cabeça de seta), ela

pertence a um animal do grupo C.

Figura 10: fotomicrografia da reação imunohistoquimica para sulfato de condroitina 4. Em A:

imunomarcação positiva na camada calcificada (seta) e fortemente positiva na não

calcificada(cabeça de seta)de um animal do grupo remobilizado. Em B: imunomarcação

positiva na camada calcificada (seta) e fortemente positiva na não calcificada (cabeça de seta)

de um animal do grupo IA3. Em C imunomarcação positiva na camada calcificada (seta) e

fortemente positiva na não calcificada (cabeça de seta) de um animal do grupo controle.

Aumento de 400x

Na Figura 11 pode ser visualizado que não houve diferença de marcação dos

condrócitos para sulfato de condroitina entre os diferentes grupos estudados. Esse

resultado, que significa uma expressão semelhante entre os condrócitos foi observado

tanto na camada calcificada, como na camada não calcificada.

Sulfato de Condroitina 4

0,5

1,5

2,5

3,5

R IA3 A3 C

Grupos

Graduação

Imunohistoquímica

Camada não

calcificada

Camada calcificada

Figura 11: Média das graduações para sulfato de condroitina 4 nas camadas não calcificadas

e camadas calcificadas. R= remobilizados, IA3 =imobilizados e alongados 3x/sem, A3=

alongados 3x/sem, C=controle. Não houve diferença estatística nas comparações entre os

diferentes grupos.

Na camada não calcificada foi encontrada fraca correlação entre as respostas da

fibronectina e do sulfato de condroitina 4 (R=0,03), nos diferentes grupos todos com p<

0,05.

Uma fraca correlação também foi observada na camada calcificada com relação

às respostas da fibronectina e sulfato de condroitina 4 (R= - 0,19) nos diferentes grupos,

todos com p< 0,05.

5.1.6. D

ISCUSSÃO

Em nossos resultados pudemos observar um aumento significativo de

fibronectina no grupo imobilizado e posteriormente alongado, tanto na camada

calcificada como na não calcificada quando realizamos comparações com os demais

grupos.

Brandt (2003) descreve que a cartilagem articular previamente imobilizada se

torna atrófica e que, por isso, estímulos que não seriam lesivos em uma cartilagem

articular normal, podem provocar lesões em uma cartilagem nessa condição

. Essa

hipótese se confirma quando observamos que o mesmo protocolo de alongamento

muscular, que provocou aumento de fibronectina no grupo previamente imobilizado

(IA3), não provocou aumento de expressão da mesma quando aplicado na cartilagem

articular sadia (grupo somente alongado). Isso demonstra que esse protocolo não é um

estímulo prejudicial para um tecido normal.

O grande problema do acúmulo da fibronectina é que, além de ser um

biomarcador da doença artrítica

, está envolvido com efeitos deletérios no tecido.

Diversos estudos buscaram identificar qual a influência dessa produção aumentada e

desse acúmulo de fibronectina. Segundo Chevalier (1993), em estudo de revisão, um

conteúdo aumentado de fibronectina durante os processos osteoartriticos pode implicar

em conseqüências relacionadas às múltiplas funções da fibronectina e de seus

fragmentos como a alteração do fenótipo do condrócito , mudança no tipo de colágeno

sintetizado, atividade aumentada das metaloproteases no local e uma indução de

atividades auto proteolíticas contra gelatina e fibronectina

. Zack et al (2006) relataram

que já foi demonstrado que os fragmentos da fibronectina induzem metaloproteases

incluindo MMP3 , MMP13 agrecanases e serino proteases. Essas proteases têm a

habilidade de quebrar a maioria dos componentes da matriz da cartilagem, incluindo o

colágeno tipo II e agrecan, que são marcas da OA

. Já Guo et al (2009) demonstraram

que os produtos de degradação da fibronectina e seus fragmentos, gerados pelo dano a

matriz, regulam o metabolismo do condrócito, já que expressam muitas propriedades

esperadas no remodelamento ou em dano extenso da cartilagem. A exposição

prolongada da cartilagem a altas concentrações de fragmentos de fibronectina pode

suprimir a síntese de matriz e assim, limitar a resposta anabólica da cartilagem para o

reparo da lesão

Tendo em vista o prejuízo causado pelo acúmulo de fibronectina, podemos

considerar que o grupo remobilizado apresentou uma resposta favorável frente ao

estímulo aplicado. Esse grupo permaneceu com seus níveis de fibronectina iguais ao

grupo controle. Entretanto, para a prática clínica se torna inviável o uso de apenas a

remobilização (livre movimentação) como proposta terapêutica após um período de

imobilização. Segundo Trudel et al, a remobilização aplicada isoladamente não foi

suficiente para recuperar a amplitude de movimento após período de imobilização

Desta forma, ainda persiste a busca por estímulos mecânicos funcionais, que restabeleça

a função articular, sem prejudicar a cartilagem articular.

A fibronectina é descrita na cartilagem como um colaborador na quebra da

proteoglicana

. Ayman et al (1996) afirmam que uma sobrecarga excessiva pode gerar

redução do conteúdo de glicosaminoglicanas

. E, além disso, a redução da

glicosaminoglicana é um achado precoce nas alterações cartilaginosas frente a estímulos

lesivos

. Entretanto, em nosso estudo, apesar do aumento da síntese e acúmulo da

fibronectina no grupo imobilizado e alongado, não encontramos alteração concomitante

do sulfato de condroitina neste grupo, e conseqüentemente, não houve correlação entre

suas respostas frente aos protocolos aplicados. Uma possível explicação para esse

resultado foi citada por Chevalier (1993). Ele descreve, em estudo de revisão, que o

conteúdo de fibronectina já aumenta em uma cartilagem com alterações iniciais até

mesmo antes das alterações nas glicosaminoglicanas serem detectadas

. Uma outra

hipótese para esse resultado é que a fibronectina tenha sim estimulado quebra de

proteoglicanas, mas essa quebra pode não ter sido detectada em função da resposta de

reparo hipermetabólica dos condrócitos frente a estímulos lesivos precoces, como

descrito por Hardingham

(1998)

. Essa resposta de aumento na síntese dos componentes

da matriz poderia manter inalterados os níveis de sulfato de condroitina frente a esse

protocolo.

5.1.7. C

ONCLUSÃO

O alongamento aplicado após imobilização provocou uma resposta de

lesão/reparo bastante precoce sem evoluir para perda de condroitin. Já esta mesma

resposta precoce de lesão/reparo não foi desencadeada com a remobilização pura. Além

disso, o alongamento aplicado em tecido sadio não provocou sinais de respostas

deletérias.

5.1.8. R

EFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Zack MD, Arner EC, Anglin CP, et al. 2006. Identification of Fibronectin

Neoepitopes Present in Human Osteoarthritic Cartilage. Arthritis Rheum 54: 2912–22.

2. Wolf A, Raiss RX, Steinmeyer J. 2003. Fibronectin metabolism of cartilage explants

in response to the frequency of intermittent loading. J Orthop Res 21:1081–89.

3. Huang K, Wu LD. 2008. Aggrecanase and Aggrecan Degradation in Osteoarthritis: a

Review. J Int Med Res 36:1149 – 1160.

4. Hardingham 1998. Chondroitin sulfate and joint disease

Osteoarthritis Cartilage 6s: 3-5.

5. Sauerland K, Plaas AHK, Raiss RX, et al. 2003. The sulfation pattern of chondroitin

sulfate from articular cartilage explants in response to mechanical loading. Biochimica

et Biophysica Acta 1638:241– 248.

6. Trudel G, Uhthoff HK. 2000. Contractures Secondary to Immobility: Is the

Restriction Articular or Muscular? An Experimental Longitudinal Study in the Rat

Knee. Arch Phys Med Rehabil 81: 6-13.

7. Brandt KD. 2003. Response of Joint Structures to Inactivity and to Reloading After

Immobilization. Arthritis Rheum (Arthritis Care & Research) 49:267–271.

8. Ramage L, Nuki G, Slater DM. 2009. Signalling cascades in mechanotransduction:

cell-matrix interactions and mechanical loading. Scand J Med Sci Sports 19 :457-69.

9. Renner AF, Carvalho E, Soares E, Mattiello-Rosa S. 2006. The effect of a passive

muscle stretching protocol on the articular cartilage. Osteoarthritis Cartilage 14:196-

202.

10. Haapala J, Arokoski JPA, Hittinen MM, et al. 1999. Remobillization does not fully

restore immobilization induced articular cartilage atrophy. Clin ortop 1:218-29.

11. Coutinho EL, Gomes ARS, França CN, et al. 2002. A new model for the

immobilization of the rat hind limb. Braz J Med Biol Res 11:1329-32

12. Ustunel I, Sahin Z, Akkoyunlu G, et al. 2003. The Zonal Distributions of Alkaline

Phosphatase, Adenosine Triphosphatase, Laminin, Fibronectin and Chondroitin 4-

Sulphate in Growing Rat Humerus Proximal Epiphyseal Cartilage: a Histochemical and

an Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol 32:356–361.

13. Guo D, Ding L, Homandberg GA. 2009. Telopeptides of type II collagen upregulate

proteinases and damage cartilage but are less effective than highly active fibronectin

fragments. Inflamm Res 58:161–169.

14. Trudel G, Zhou J, Uhthoff HK et al. 2008. Four weeks of mobility after 8 weeks of

immobility fails to restore normal motion: a preliminary study. Clin Orthop Relat Res

466: 1239–1244.

15. Ali AM, Sharawy M. 1996. Histochemical and lmmunohistochemical Studies of the

Effects of Experimental Anterior Disc Displacement on Sulfated Glycosaminoglycans,

Hyaluronic Acid, and Link Protein of the Rabbit Craniomandibular Joint. J Oral

Maxillofac Surg 54:992-1003.

16. Chevalier X. 1993. Fibronectin, Cartilage, and Osteoarthritis. Seminars in Arthritis

and Rheumatism 122: 307-318.

6. ANEXO I

ARTIGO SUBMETIDO – ESTUDO I: MUSCLE STRETCHING AFTER

IMMOBILIZATION IS MORE BENEFICIAL TO ARTICULAR CARTILAGE

WHEN APPLIED ON ALTERNATE DAYS

Adriana Frias Renner, Fernando Augusto Vasilceac, Carolina Kalil Dias, Anderson

Amaro dos Santos, Walcy Rosolia Teodoro, Stela Márcia Mattiello Gonçalves Rosa

Submetido ao Journal of Orthopaedic Research

For Peer Review

Muscle stretching after immobilization is more beneficial to

articular cartilage when applied on alternate days

Journal:

Journal of Orthopedic Research

Manuscript ID:

JOR-10-0126

Wiley - Manuscript type:

Research Article

Date Submitted by the

Author:

20-Feb-2010

Complete List of Authors:

Renner, Adriana; Federal University of São Carlos, Physical Therapy

Vasilceac, Fernando; Federal University of São Carlos, Physical

Therapy

Santos, Anderson; Federal University of São Carlos, Physical

Therapy

Dias, Carolina; Federal University of São Carlos, Physical Therapy

Teodoro, Walcy; Universidade de São Paulo, Reumatology

Mattiello-Rosa, Stela; Federal University of São Carlos, physical

therapy

Keywords:

immobilization, muscle stretching exercises, articular cartilage

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For Peer Review

Muscle stretching after immobilization is more beneficial to articular cartilage when

applied on alternate days

Adriana Frias Renner, Fernando Augusto Vasilceac, Carolina Kalil Dias, Anderson Amaro

dos Santos, Walcy Rosolia Teodoro, Stela Márcia Mattiello Gonçalves Rosa

Summary

Objective: To compare the response of articular cartilage after muscle stretching daily or on

alternate days after immobilization. Methods: A total of 36 animals divided into 6 groups:

immobilized (I), immobilized and stretched 7 days/week (IS7), immobilized and stretched 3

days/week (IS3), stretched 7 days/week (S7), stretched 3 days/week (S3) and control (C).

Groups I, IS7 and IS3 were immobilized for 4 weeks (left hind limb). After, IS7 and IS3

were subjected to 3 weeks of muscle stretching (same limb), daily or 3 times per week,

respectively. The S7 and S3 underwent a 3-week stretch (same limb) daily or 3 times per

week, respectively. Then, the ankles were removed and processed in paraffin and stained

with H&E, Safranin O and Picrossiruius Red. Two blind observers evaluated cellularity,

chondrocyte cloning, loss of proteoglycan and thin and thick fibril collagen content.

Results: The IS7 group showed a significant increase in cellularity when compared with

groups I and C. IA3 increased the chondrocyte cloning formation significantly compared

with the S7, S3 and C groups. Significant loss of proteoglycans presented the IS7 group

compared to all groups. IS7 significantly reduced the thin fibril content in relation to the

IS3, S7, S3 and C groups. Conclusion: The muscle stretching protocol applied after

immobilization was harmful to articular cartilage, as there was cellular alteration, loss of

proteoglycans and a reduction in thin and thick fibrils of collagen. However, the

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intervention on alternate days was less harmful because of the maintenance of

proteoglycans and thin collagen fibers.

Introduction:

It is well known in rehabilitation practice that immobilization reduces the range of

motion. According to Trudel et al (2000) a reduced range of motion is caused by joint

contracture which occurs under the influence of joint (arthrogenic) and muscle structures

(myogenic). The influence of the arthrogenic component in joint contracture increases

linearly and continuously according to maintained immobilization. However, the authors

only describe hypotheses concerning which components could influence the arthrogenic

component of the joint restriction, such as the proliferation of connective tissue, collagen

changes and shortening of the joint capsule. Regarding the myogenic component, the

authors reported a greater influence of muscle structures only in the first weeks of

immobilization. After 16 to 32 weeks there was an arthrogenic predominance in limiting

the range of motion

A recent study in an animal model, investigating joint contracture after

immobilization describes that after 8 weeks of immobilization there was no recovery of

range of motion when the only alternative therapy was remobilization. The authors discuss

that the presence of an incomplete reversibility of joint contractures demonstrates the need

for active treatment in the immobilizated joints

Based on the influence of the myogenic component of joint restriction after periods

of immobilization (muscle shortening), the muscle stretching protocols are options of

treatment in patients previously immobilized as this tissue would also be a restricting range

of motion. However it is important to remember that stretching muscle causes compression

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in articular cartilage in different magnitudes by the mechanical load resulting from this

joint movement

The influence of mechanical load on articular cartilage has been widely studied. It

influences the structure and organization of the extracellular matrix components of

cartilage. As the chondrocyte perceives its environment and these mechanical effects

through complex biological and biophysical interactions with the extracellular matrix, the

mechanical loads also ultimately influence the rates of synthesis / degradation of different

extracelular matrix components

4,5,6,7, 8,9

Besides the studies of mechanical loads, many studies have also investigated the

changes in the cartilage caused by immobilization

10, 11,12

. The results observed are decreases

in thickness

, cartilage softening

10,11

, decreased content of proteoglicans

13, 14, 11

and

reduction of colagen cross-linking

13,14

. According to Brandt et al (2003) immobilization

produces atrophic changes in articular cartilage

A previous study from our group, investigated the response of a muscle stretching

protocol performed daily in animals previously immobilized

. According to our results,

muscle stretching applied daily after a period of immobilization was harmful to the articular

cartilage. Based on the results of our previous study, we consider that data as the frequency

and intervals between interventions in vivo still need further investigation.

Therefore, the aim of this study is to compare the response of a protocol applied daily to a

protocol applied on alternate days after a period of joint immobilization.

Methods

Groups:

Thirty six male Wistar rats, young adults at 16 weeks old and weighing 280g + 25.4 g were

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used for this experiment. The animals were housed in plastic cages in an animal room under

controlled environment conditions of light and temperature and free access to water and

standard food. The study was approved by the ethics committee of animal research in this

institution (EAEC Protocol: 15/20006).

Experimental Procedures:

The animals were divided into 6 groups: immobilized (I), immobilized and stretched 7 days

a week (IS7), immobilized and stretched 3 days per week (IS3), stretched 7 days a week

(S7), stretched 3 days per week (S3) and control (C).

Groups I, IS7 and IS3 were submitted to 4 weeks of immobilization of their left hind limbs,

according to the model previously used

3, 16

. After removing the immobilization device, the

immobilized group (I) remained free in the cage for three weeks and the IS7 and IS3 groups

underwent 3 weeks of stretching of the posterior muscles of the left hind limb daily and 3

times per week, respectively. The S7 and S3 groups remained free in the cage for 4 weeks

and then underwent a 3-week stretch of the posterior muscles of the left hind limb daily or

3 times per week, respectively. The muscle stretching protocol was performed under

anesthesia, and consisted of maintaining the ankle held in dorsiflexion at a maximum 10

repetitions of 60 s with intervals of 30 seconds of rest between them. Group C remained

free in the cage during the 7 weeks of the experiment.

Preparation of the Samples

At the end of seven weeks, the animals were euthanized and their left ankles were

removed, fixed with buffered formaldeide (10%), decalcified with nitric acid 7.5% and

glycerin (70ml / l of solution) and processed in paraffin. Cuts were made of 6 mm in a

micrometer (Leica) and mounted on slides treated with aminosilane. The samples were

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stained with hematoxylin & eosin (H & E), Safranin O fast green and picrosirius red for

analysis.

Histologic Analysis:

Chondrocyte cloning was evaluated by two blind observers along the length of each

cut on the slides stained with H&E. Morphometric analysis of cellularity was also carried

out using this stain. Concerning the morphometric evaluation of cellularity, the Axiovision

4.7 (Carl Zeiss) image analysis software was used. A central area of the cut of 40,000 mm

was initially defined and the chondrocytes were subsequently counted

In sections stained with Safranin O, it was made the same classification of the previous

study

The sections stained with Sirius Red were evaluated using a polarized light

microscope using the Image Pro Plus software (Olympus). The collagen fibers stained with

Sirius Red (specific for detecting collagen) observed under a polarized light stain presents a

color that depends on the thickness of the fibers and their state of aggregation. With the

increase in thickness and physical aggregation, the color changes from green to yellow,

orange to red

18, 19,20

. Using the software, the images yellow / green were defined as thin

fibrils and the orange / red defined as thick fibrils. The areas identified by the software

corresponding to thin fibrils and thick collagen fibrils were then divided by the total area

examined and the final result was expressed as a percentage. The percentage of thin fibrils

and thick fibrils of the total area assessed for each group studied could be observed.

Statistical analysis

We used the nonparametric Kruskal Wallis test with post hoc Newman Keuls to

compare the classification of clones and the proteoglycan content between the different

groups. In terms of intergroup comparisons of morphometric evaluation of cellularity,

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Duncan´s multiple comparison test was used. The evaluation of the proportion of thin and

thick fibrils of collagen in different groups was performed using ANOVA with the Tukey

post hoc test. In all tests, the level of significance was p≤0.05.

Results

There was no skin ulceration or edema in the legs after removing the immobilization

device. According to the macroscopic examination of the joints, there were no erosions,

osteophytes, surface irregularities or cracks in the different groups.

The cellularity of the articular cartilage of the immobilized and stretched daily

group (AC7) increased when compared to the immobilized group (I) (p = 0.04) and control

group (C) (p = 0.04). Figure 1.

The immobilized group which was stretched three days a week (IS3) also had a

significant chondrocyte cloning increase in relation to groups stretched daily (A7) (p =

0.003), stretched on alternate days (A3) (p = 0.00) and the control (C) ( p = 0.01). Figure 2.

The greatest loss of proteoglycan was in the group immobilized and stretched daily

(IS7) (figure 4C) in relation to all the other groups IS3 (p = 0.00), I7 (0.00), I3 (p = 0.00)

and C (0 , 00). The immobilized group (I) also lost more proteoglycan than the others

(figure 4B), IS3 (p = 0.00), S7 (0.00), S3 (p = 0.00) and C (p = 0.00). Figure 3.

With respect to collagen fibrils, it was observed that the immobilization (I) and

immobilization followed by daily stretching (IS7) produced a reduction and rearrangement

of thin fibrils in relation to groups IS3 (p = 0.00 and p = 0.00), S7 ( p = 0.00 and p = 0.00)

and C (p = 0.00 and p = 0.00), respectively.

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Regarding thick fibrils, there was a decrease and or rearrangement of them in all

groups compared to the control (C), with the exception of the immobilized group (I). As

such: IS7 (p = 0.01), IS3 (p = 0.00), S7 (0.00), S3 (p = 0.001).

Discussion

The prolonged joint immobilization produces atrophic changes in articular

cartilage

. In general, the most common changes of the cartilage in response to joint

immobilization described in different studies are decreases in thickness

, cartilage softening

, decreased content of proteoglicans

13,14

and reduction of colagen cross-linking

13,14

. These

are different responses from the observed ones in a trauma or process of installation and

development of osteoarthritis. According to the report of the histological evaluation of

repair of articular cartilage prepared by the International Cartilage Repair Society (ICRS),

joint cartilage, as well as other tissues, follows a defined sequence of events in response to

injury. It increases the water content, matrix degradation by endogenous enzymes,

apoptosis and cell necrosis, followed by disruption of the extracellular matrix with loss of

their constituents into the joint space. The latter serves as a trigger of inflammatory

response in synovium. Thus, the repair process is initiated. It involves limited activities of

cell replication, increased synthesis of extracellular matrix and a reorganization of matrix

by endogenous cells

In addition to tissue damage generated by immobilization, there is a decrease in the

range of motion

. Considering that this joint restriction is also influenced by a myogenic

component, muscle shortening

, muscle stretching is a therapeutic resource, which is

recommended and used in rehabilitation after joint immobilization protocols. However,

according to Brandt

(2003) irreversible damage to the previously immobilized articular

cartilage can occur with loads that when applied to normal joints would not produce

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morphological, biochemical, or metabolic disorders leading to condropathies. The author

says that one must be cautious when applying excessive loads to an atrophic articular

cartilage before proteoglycans are restored

Therefore, this study brings a compression model generated in an atrophic articular

cartilage. In our study, major changes were observed in the immobilized and stretched

every day group. According to the literature, the birefringence of collagen molecules when

stained with picrosirius red and viewed through a polarized light microscope is influenced

by its thickness and its physical aggregation state. Molecules which were more strongly

aggregated, better aligned and thicker have a higher birrefrigece

18, 19, 20

. According to

Montes

collagen type I, for example, forms thick and strong aggregated fibrils identified

through thick fibrils when stained by picrosirius. These characteristics generate higher

birefringence and can be viewed through polarized light. Collagen type II consists of thin

fibrils and is arranged as a network and it has low birefringence due to this type of

aggregation. In our study, there was no increase in birefringence of thick fibrils in groups

submitted to the proposed interventions. This may indicate that there was no production of

collagen type I in the different interventions. This is a positive result, since it is known that

collagen type I is not typical of the cartilage, but it is present in the early stages of

osteoarthritis

. On the contrary, the thick fibers birrefrigence decreased their proportion

detected by the software. This reduction may indicate a disruption or reduction of

aggregations of thick fibrils. The groups that showed this reduction were all the groups

subjected to stretching with or without prior immobilization (IS7, IS3, S7 and S3). This

result may indicate a mechanical influence in the disorganization or disruption of the

thicker collagen fibrils.

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In an experimental study, Hyttinen et al (2001) subjected young and old Guinea pigs

to exercise on a treadmill and found that in young animals there was an increasing

organization or quantity of collagen while the same exercise caused great reduction in the

amount or organization of collagen in the older animals

. As in our study, these results

demonstrate an influence of mechanical force in the organization / synthesis-degradation of

collagen. Regarding thick collagen fibrils, we observed that immobilization alone did not

result in an alteration of its aggregation response. The absence of compression that occurred

in immobilization only influenced the reduction or disruption of the thin collagen fibrils.

This alteration of thin fibrils was perpetuated in the immobilized group and stretched every

day (IS7). It did not occur in the immobilized and stretched on alternate days group (IS3).

Therefore, considering the collagen response, there was a greater loss of this component in

the immobilization followed by daily muscle stretching (IS7) compared with the

immobilized and stretched on alternate days group (IS3).

The cartilage resistance to compression to which it is subjected in everyday

activities is given, among other factors, according to the proper functioning of two of its

components. They are proteoglycans which are responsible for elasticity and resilience of

cartilage and collagen which provides tensile stiffness and strength to the tissue

. When we

evaluated the proteoglycans response concerning the interventions, we found a reduction in

its content in the immobilized animals and a further reduction in animals immobilized and

stretched every day. However, the immobilized and stretched on alternate days group

showed no reduction in their content. This response once again demonstrates that this

frequency of intervention may be less harmful to the tissue. In the study conducted by

Hyttinen et al (2001), mentioned above, no significant changes in glycosaminoglycan

content in two models of intervention were found despite the changes generated in

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collagen

. Collagen alterations without changing the proteoglycan content may indicate a

degree of independence between the response of collagen and proteoglycan against this

kind of overload.

The chondrocyte cloning formation in the immobilized and stretched on alternate

days group and the increased cellularity in the immobilized and stretched every day group

may be related to the repair response to our interventions. Different histological scores of

articular cartillage describe this type of cellular change as part of the repair process

18,23

The cellular changes are directly related with the responses of repair and maintenance of

cartilage as it is the chondrocytes that produce and maintain balance in the matrix

components. Mankin et al (1971) already described chondrocyte cloning and cellular

changes as part of the lesion and cartilage repair in his assessment model

. Regardless of

both groups presenting cellular responses, the immobilized and everyday stretched group

presented worse matrix results.

The muscle stretching protocol applied after immobilization in this study was

harmful to articular cartilage, as there was cellular alteration, loss of proteoglycans and a

reduction in thin and thick fibrils of collagen. However, the intervention on alternate days

was less harmful because of the maintenance of proteoglycans and thin collagen fibers.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Ana Rocha, Department of Pathology,

University of Sao Paulo for her technical assistance, Professor

Jorge Oishi, Department of Biostatistics, Federal University

of Sao Carlos for his helpful advice regarding statistical methods. This study was supported

by grants from CNPq (141890/2006-1) and FAPESP (2006/04112-4).

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Cellularity

100

120

140

I IS7 IS3 S7 S3 C

Groups

Cellurarity Couting

Cellularity

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Chondrocyte cloning

0,2

0,4

0,6

0,8

I IS7 IS3 S7 S3 C

Groups

Cloning Classification

Chondrocyte cloning

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Proteoglycan Loss

I IS7 IS3 S7 S3 C

Groups

Loss of Safranin-O

Graduation

Proteoglycan Loss

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176x44mm (96 x 96 DPI)

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Percentage of Collagen

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

70,00%

I IS7 IS3 S7 S3 C

Groups

Mean Percentage

percentage of thin collagen

fibrils

percentage of thick collagen

fibrils

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185x47mm (96 x 96 DPI)

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Figure 1: Mean cellularity. I = immobilized, IS7 = immobilized and stretched 7x/week , IS3

= immobilized and stretched 3x/week, S7= stretched 7x/week, S3 = stretched 3x/week, C =

control. * IS7> I (p = 0.04) and C (p = 0.04)

Figure 2: Mean of chondrocyte cloning of the treated hind limbs. I = immobilized, IS7 =

immobilized and stretched 7x/week, IS3 = immobilized and stretched 3x/week, S7 =

stretched 7x/week, S3 = stretched 3x/week, C = control. * IS3> S7 (p = 0.003), S3 (p =

0.00) and C (p = 0.01). ** S3 <I (p = 0.04), IS7 (P = 0.004), IS3 (p = 0.00).

Figure 3: Mean and standard deviation of the loss of proteoglycans . I = immobilized, IS7 =

immobilized and stretched 7x/week, IS3 = immobilized and stretched 3x/week, S7=

stretched 7x/week , S3 = stretched 3x/week, C = control. * I> IS3 (p = 0.00), S7 (0.00), S3

(p = 0.00) and C (p = 0.00). IS7 **> IS3 (p = 0.00), S7 (0.00), S3 (p = 0.00) and C (0.00).

Figure 4: Photomicrographs of tibial articular cartilage (Safranin-O staining). (A) normal

Safranin-O staining intensity, from control group, (B) slight reduction of matrix staining

intensity, treated hind limb from an I group rat, (C) severe reduction on Safranin-O

staining, treated hind limb from IS7 group rat (400x).

Figure 5: Mean and standard deviation of the thin and thick collagen fibrils. I =

immobilized, IS7 = immobilized and stretched 7x/week, IS3 = immobilized and stretched

3x/week, S7= stretched 7x/week , S3 = stretched 3x/week, C = control.

Thin fibrils: * I < IS7 (p= 0,00), IS3 (p= 0,00), S7 (p=0,00), S3 (p= 0,00) and C (0,00); **

IS7 < IA3 (p= 0,00), S7 (p= 0,00) and C (p= 0,00);

Thick fibrils:

C > IS7 (p= 0,01), IS3 (p= 0,00), S7 (0,00), S3 (p=0,001)I > IS3 (p=0,00),

S7 (p= 0,009);

IS3 < I (p= 0,00), IS7 (0,008), C (p= 0,00).

Figure 6: Photomicrographs of tibial articular cartilage (Picrosirius Red staining). (A)

normal Picrosirius Red staining , from control group, (B) decrease and or rearrangement of

thick collagen fibrils, IS7 group rat (C) reduction or rearrangement of thin fibrils, from an I

group rat, (400x).

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7. ANEXO II

ARTIGO SUBMETIDO – ESTUDO II: COMPARISSON BETWEEN THE

EFFECTS OF REMOBILIZATION AND MUSCLE STRETCHIG AFTER

IMMOBILIZATION ON THE IMMUNOSTAINING OF FIBRONECTIN AND

CHONDROITIN SULFATE IN ARTICULAR CARTILAGE

Adriana Frias Renner, Fernando Augusto Vasilceac, Stela Márcia Mattiello Gonçalves

Rosa.

Submetido ao Journal of Orthopaedic Research

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Comparison between the effects of remobilization and

muscle stretching after immobilization on the

immunostaining of fibronectin, chondroitin sulfate in

articular cartilage

Journal:

Journal of Orthopedic Research

Manuscript ID:

JOR-10-0129

Wiley - Manuscript type:

Research Article

Date Submitted by the

Author:

22-Feb-2010

Complete List of Authors:

Renner, Adriana; Federal University of São Carlos, Physical Therapy

Vasilceac, Fernando; Federal University of São Carlos, Physical

Therapy

Mattiello-Rosa, Stela; Federal University of São Carlos, physical

therapy

Keywords:

immobilization , remobilization, muscle stretching, articular

cartilage

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Comparison between the effects of remobilization and muscle stretching after

immobilization on the immunostaining of fibronectin, chondroitin sulfate in articular

cartilage

Authors

Adriana Frias Renner, Fernando Augusto Vasilceac, Stela Márcia Mattiello Gonçalves

Rosa.

Summary

Objective: to investigate the response of fibronectin and chondroitin sulfate after a protocol

of immobilization followed by remobilization and the other followed by muscle stretching

applied every other day. Methods: A total of 20 animals divided into 4 groups:

remmobilized (R), immobilized and stretched 3 days/week (IS3), stretched 3 days/week

(S3) and control (C). Groups I, and IS3 were immobilized for 4 weeks (left hind limb).

After, IS3 were subjected to 3 weeks of muscle stretching (same limb), 3 times per week,

The S3 underwent a 3-week stretch (same limb) 3 times per week. Group C remained free

in cage 7 weeks. Then, the ankles were removed and processed in paraffin and incubated

with anti fibronectin and anti chondroitin sulfate 4. The intensities of the reactions were

evaluated semi quantitatively by two blind observers and described as: 0 (negative), 1

(weakly positive), 2 (positive) and 3 (strongly positive). Results: IS3 group showed

significantly higher intensity staining of fibronectin than the other groups. There was no

statistical difference of chondroitin sulfate 4 immunostaining comparing all the groups.

Conclusion: We concluded with this study that muscle stretching applied in this study had

increased synthesis and accumulation of fibronectin only when applied to atrophied

cartilage. The remobilization, in turn, did not cause glycoprotein response. Moreover, none

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of the stimuli used in this study generated detectable change in the chondroitin sulfate. As a

consequence of these results there was a weak correlation between the responses of

fibronectin and chondroitin sulfate concerning the different interventions.

Key words:

Immobolization, muscle stretching, remmobilization, articular cartilage

Introduction

Fibronectin is a glycoprotein present in small amounts in the extracellular matrix of

normal articular cartilage. It has distinct functional domains that can bind to integrins,

heparin, fibrin and collagen. As a result of the many functional domains activity, this

glycoprotein is involved in many of biological processes such as cell migration, repair,

angiogenesis and cell differentiation. There are multiple isoforms of fibronectin. They are

produced in the cell surface and deposited in the extracellular matrix as highly insoluble

fibronectin fibrils

. However, Zack et al (2006) describes that although fibronectin is a

component to a lesser extent in the matrix of normal articular cartilage, in cultured

osteoarthritic cartilage can be up to 10 times more fibronectin. This is due to the increases

in both its synthesis and in its accumulation. It can be proteolysed into smaller fragments

by multiple enzymes and this fragments is seen in the synovium and cartilage of subjects

with OA. For these authors, this glycoprotein could be a biomarker of arthritis and is

involved in the initiation and progression of the arthritic disease

Wolf et al (2003) conducted a study to investigate whether different frequencies of

cyclic mechanical loads applied intermittently in cartilage plugs could alter the biosynthesis

and retention of fibronectin. They concluded that the effect of different frequencies and

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time compression and unloading of intermittent load can not be described as a correlation.

However, they state that such forms of load induced changes in the metabolism of

fibronectin, similar to those observed in human and animal osteoarthritis

Differently of the fibronectin, which increases with the onset of arthritic disease, the

chondroitin sulfate, a glycosaminoglycan, an important component of the extracellular

matrix, has its depletion as an early pathophysiologic event in osteoartrhitis

. Despite this

loss is a key event in the osteoarthritic process, studies in animal models showed that the

cartilage in the early degenerative process, before fibrillations occur, has a repair

hypermetabolic response with increased synthesis and degradation of these matrix

components

The chondroitin sulfate collaborates strongly with the compressibility of the

articular cartilage. About 100 chains of chondroitin sulfate and 100 chains of keratan

sulphate (both glycosaminoglycans) are connected to a central protein to form a molecule

of proteoglycan (aggrecan). These glycosaminoglycans create a large osmotic pressure that

attracts water to the tissue causing the collagen network expansion. The collagen molecules

remain organized in a dense fibrillar network and are embedded in a high concentration of

proteoglycan aggregates. Therefore, the property of compressibility of the articular

cartilage results from the balance between the osmotic pressure of swelling guaranteed by

proteoglycans / glycosaminoglycans and the tensile strength that is provided by collagen

fibrils. Then the ability of the articular cartilage to support loading depends on both its

composition and the organization of its matrix extracelular

The joint immobilization is still a necessary and applied resource in clinical practice

for the musculoskeletal system disorders. It is well described that such resource causes a

reduction in range of motion

and atrophic changes in articular cartilage. This atrophic

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cartilage, in turn, is more likely to suffer damage to certain compressive loads, which

normally would not be harmful

. All mechanical signals that the cartilage receives

modulate changes in biochemical activity and behavior of the chondrocyte. Compression of

cartilage results in complex alterations in tissue including the deformations of the matrix

and the cell, changes in hydrostatic and osmotic pressure and changing the matrix water

content

. The mechanical overloads

or mechanical physiological loads when applied to an

atrophic cartilage

can influence negatively and lead to an imbalance between the anabolic

and catabolic activities resulting in depletion of matrix components

Some resources used for therapeutic gain of range of motion after immobilization

has been studied. Different aspects of the effect of muscle stretching

and remobilization

at the cartilage have been described. However there are no studies investigating the

response of fibronectin and chondroitin sulfate in these intreventions.

According to the involvement of fibronectin and glycosaminoglycans in the early

stages of injury and repair response of articular cartilage the aim of this study was to

investigate their responses and correlations compared to a protocol of immobilization

followed by remobilization and the other followed by muscle stretching applied on alternate

days.

Methods

Groups:

Twenty male Wistar rats, young adults at 16 weeks old and weighing on average

280g + 25.4 g were used for this experiment. The animals were housed in plastic cages in

an animal room under controlled environment conditions of light and temperature and free

access to water and standard food. The study was approved by the ethics committee of

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animal research in this institution (CEEA Protocol: 15/20006).

Experimental Procedures:

The animals were divided into 4 groups: remobilized (R), immobilized and stretched 3 days

per week (IS3), stretched 3 days per week (S3) and control (C).

The R, and IS3 groups were submitted to 4 weeks of immobilization of their left

hind limbs with a device previously used

9, 11

. After removal of the apparatus of the

immobilization R group remained free in the cage for three weeks and IS3 group underwent

3 weeks of stretching of the posterior muscles of the left hind limb 3 times per week.

The S3 groups remained free in the cage for 4 weeks and then underwent a 3-week

stretch of the posterior muscles of the left hind limb 3 times per week. The muscle

stretching protocol was performed under anesthesia, and consisted of maintaining the ankle

held in at a maximum dorsiflexion 10 repetitions of 60 s with intervals of 30 seconds of rest

between them. Group C remained free in the cage during the 7 weeks of the experiment.

Preparation of the Samples

At the end of seven weeks, the animals were euthanized and their left ankles were removed,

fixed with buffered formaldeide (10%), decalcified with nitric acid 7.5% and glycerin

(70ml / l of solution) and processed in paraffin. Cuts were made of 6 mm in a micrometer

(Leica) and mounted on slides treated with aminosilane. The samples were incubated with

anti-chondroitin sulfate 4 or anti-fibronectin.

Immunohistochemistry

Anti fibronectin

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The sections were hydrated in descending series of alcohol, subjected to enzymatic

digestion with protease (Sigma P6911) 0.025%, diluted in PBS for 15 'at room temperature,

and washed in PBS. To block endogenous peroxidase it was incubated in aqueous solution

of H2O2 3% for 20 minutes, then washed with PBS plus 0.5% Triton for 10 minutes. To

block inespecific binding it was incubated with BSA 0.5% for 30 'and then incubated

overnight at 4 ° C with primary antibody rabbit anti-fibronectin (Dako ) in a dilution of 1:

100. The secondary antibody (Vector PK 6200 kit) was used at a dilution of 1:200 for 1

hour at room temperature. The sections were washed in PBS and incubated with avidin

biotin 1:100 (Vector PK 6200 kit) for 30 '. Washed in PBS and revelated with DAB

chromogen solution (DAB, DAKO). The sections were counterstained with hematoxylin,

dehydrated and mounted with mounting medium Permount.

Anti chondroitin sulfate 4

The sections were hydrated in descending series of alcohol, incubated with

chondroitinase ABC (Sigma Chemical Co) 0.02 U / mL in Tris-acetate pH 8 for 30 ',

washed in PBS. To block endogenous peroxidase it was incubated in aqueous solution of

H2O2 3% for 20 minutes, then washed with PBS plus 0.5% Triton for 10 minutes. To block

inespecific binding it was incubated with BSA 0.5% for 30 'and then incubated overnight at

4 ° C with primary antibody mouse anti-chondroitin-4-sulphate (Chemicon) at a dilution of

1:200, overnight at 4 ° C. The secondary antibody (Vector PK 6200) was used at a dilution

of 1:200 for 1 hour at room temperature. The sections were washed in PBS and incubated

with avidin biotin 1:100 (Vector PK 6200) for 30 '. Washed in PBS and revelated with

DAB chromogen solution (DAB, DAKO). The sections were counterstained with

hematoxylin, dehydrated and mounted with mounting medium Permount.

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Photomicrographs were acquired through a camera attached to Zeiss microscope

with a magnification of 400x. The intensities of the reactions were evaluated semi

quantitatively by two blind observers and described as: 0 (negative), 1 (weakly positive), 2

(positive) and 3 (strongly positive) based on the study of Ustunel et al

. Calcified layers

(between subchondral bone and tidemark) and noncalcified layers (between tidemark and

articular surface) were evaluated separately.

For the statistical analysis we used the nonparametric Kruskal Wallis test and post

hoc Newman Keuls test to compare the semiquantitative classification of fibronectin and

chondroitin sulfate 4 between the different groups. To test the correlation between the

responses of fibronectin and chondroitin sulfate 4 we used Sperman test. In all tests the

level of significance was p ≤ 0.05 and found a strong correlation R ≥ 0.8.

Results

Immunostaining for fibronectin

The immobilized and stretched on alternate days group (IS3) showed significantly

higher intensity staining of fibronectin (Figure 3A) than the stretched on alternate days (p =

0.03) and control groups (p = 0.00), (Figure 3C) in the the calcified layer. Shown in Figure

Figure 1: Mean classification of the fibronectin immonolabeling in calcified layer. R =

remobilized, IS3 = immobilized and stretched 3x/week, S3 = stretched 3x/week, C =

control. * IS3> S3 (p = 0.03) and C (p = 0.00).

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Immobilized and stretched every other day group (IA3) pesented significantly greater

intensity of immunolabeling for fibronectin than remobilized (p = 0.00), stretched on

alternate days (p = 0.00) and control groups ( p = 0.00) in non-calcified layer (Figure 2).

Figure 2: Mean classification of the fibronectin immonolabeling in non-calcified layer. R =

remobilized, IS3 = immobilized and stretched 3x/week, S3 = stretched 3x/week, C =

control. IS3 *> I (0.00), S3 (p = 0.00) and C (p = 0.00).

Figure 3: photomicrograph of immunohistochemical reaction for fibronectin. A: positive

immunostaining in the calcified layer and strongly positive immunostaining in the

noncalcified layer of the IA3 group. B: positive immunostaining in the calcified layer and

weakly positive immunostaining in the noncalcified layer of the remobilized group. C:

weak immunostaining in the calcified layer and negative immunostaining in noncalcified

layer of the control group.

There were no significant difference in chondroitin sulfate immunostainig among the

different groups in the calcified and non-calcified layer (Figure 4). Immunostaining for

condroitin sulfate 4 in different groups (figure 5).

Figure 4: Mean classification for chondroitin sulfate 4 immunostainig in the noncalcified

and calcified layers. R = remobilized, IS3 = immobilized and stretched 3x/week, S3 =

stretched 3x/week, C = control. There was no difference in the comparisons among the

different groups.

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Figure 5: photomicrograph of immunohistochemical reaction for chondroitin sulfate 4. A:

positive immunostaining in the calcified layer and strongly positive immunostaining in the

noncalcified layer of the C group. B: positive immunostaining in the calcified layer and

strongly positive immunostaining in the noncalcified layer of the IA3 group.

There were weak correlation between the responses of fibronectin and chondroitin sulfate 4

in the non calcified layer comparing the different groups (R = 0.03 and p <0.05).

A weak correlation was also observed in the calcified layer comparing the responses of

fibronectin and chondroitin sulfate 4 among the different groups (R = - 0.19 and p <0.05).

Discussion

In our results we observed a significant increase in the immunostaining for

fibronectin in the immobilized and stretched group, both in the calcified and the non-

calcified layer compared to other groups.

Brandt (2003) describes that previously immobilized articular cartilage becomes

atrophic and therefore stimuli that would not be harmful in a normal articular cartilage, can

cause injuries to this atrophic one

. This hypothesis is confirmed when we observe that the

same muscle stretching protocol that resulted in an increase of fibronectin in the group

previously immobilized (IA3) did not result in increased immunostaining for this

glycoprotein when applied to the healthy articular cartilage of the solely stretched group.

This demonstrates that this protocol is not a harmful stimulus to a normal tissue.

The major problem of the accumulation of fibronectin is that besides being a

biomarker of arthritic disease

it is involved with deleterious effects on tissue. Several

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studies have attempted to identify the influence of increased production and accumulation

of fibronectin. According to Chevalier (1993), in a review article, an increased content of

fibronectin during the osteoarthritic process may result in consequences related to multiple

functions of fibronectin and its fragments as the change of the chondrocyte phenotype,

change in type of collagen synthesized, activity increased site of metalloproteases and

induction of proteolytic activities against gelatin and fibronectin. Zack et al (2006) report

that has been shown that fragments of fibronectin induce metalloproteases including

MMP3, MMP13, and aggrecanase serine proteases. These proteases have the ability to

break most of the components of cartilage matrix including collagen type II and aggrecan

that are the hallmark of OA

. Guo et al (2009) demonstrated that the degradation products

of fibronectin and its fragments generated by the damage to matrix regulate the metabolism

of the chondrocyte since it has many properties that express the expected remodeling or

extensive damage to the cartilage. Prolonged exposure of cartilage to high levels of

fibronectin fragments can suppress the synthesis of matrix and thus limit the anabolic

response of cartilage to repair

According to the damage caused by the accumulation of fibronectin we can consider

that the remobilized group showed a favorable response to this applied stimulus. This group

stayed with their levels of fibronectin equal to the control group. However, for clinical

practice is not feasible using only the remobilization as the only therapeutic purpose after a

period of immobilization. According to Trudel et al, the remobilization applied alone was

not sufficient to recover range of motion after a period of immobilization

Fragments of fibronectin are described as indirectly envolved in proteoglycan break

down in the cartilage

. Ayman et al (1996) state that an excessive load might lead to

reduced content of glycosaminoglycans

. And furthermore, the reduction of the

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glycosaminoglycan is present in the early cartilaginous alteration related to harmful

stimuli

. However, in our study despite the increased synthesis and accumulation of

fibronectin in the group immobilized and stretched we did not observe concomitant

alteration of chondroitin sulfate in this group. A possible explanation for this result was

mentioned by Chevalier (1993). He describes, in a review article, that the content of

fibronectin already increases in cartilage while the changes in glycosaminoglycans are not

yet detected

. Another hypothesis for this result is that the fibronectin could have

stimulated proteoglycan breakdown but this decrease may not have been detected because

of the hypermetabolic repair response of chondrocytes in the face of injurious stimuli

described by Hardingham (1998)

. This response of increased synthesis of matrix

components could remain unchanged the levels of chondroitin sulfate in spite of this

protocol.

Therefore, we conclude with this study that muscle stretching applied after

immobilization stimulated fibronectin response while the remobilization did not generate a

response from this glycoprotein. Moreover, none of the stimuli used in this study generated

detectable change in the chondroitin sulfate. As a consequence of these results was a weak

correlation between the responses of fibronectin and chondroitin sulfate in the face of

different interventions.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Monica Abreu and Deise Simões, Department of

Pathology,University of Sao Paulo for their technical assistance, Professor Ana Claudia

Mattiello Sverzut, Department of Pathology,University of Sao Paulo for her technical

advices, Professor Jorge Oishi, Department of Biostatistics, Federal University

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of Sao Carlos for his helpful advice regarding statistical methods. This study was supported

by grants from CNPq (141890/2006-1) and FAPESP (2006/04112-4).

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Fibronectin Classification

Calcified Layer

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

R IS3 S3 C

Groups

Immunostaining

Classification

Fibronectin Classification

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Fibronectin Classification

Non Calcified Layer

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

R IS3 S3 C

Groups

Immunostaining

Classification

Fibronectin Classification

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Chondroitin Sulfate 4

0,5

1,5

2,5

3,5

R IS3 S3 C

Groups

Immunostaining

Classification

calcified layer

non calcified layer

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8. ANEXO III

ARTIGO PUBLICADO: THE REMODELING OF COLLAGEN FIBERS IN RAT

ANKLES SUBMITTED TO IMMOBILIZATION AND MUSCLE STRETCH

PROTOCOL

Fernando Augusto Vasilceac, Adriana Frias Renner, Walcy Rosolia Teodoro, Stela

Márcia Mattiello Gonçalves Rosa

Rheumatology International, v30, 2010.

Rheumatol Int

DOI 10.1007/s00296-010-1371-z

123

ORIGINAL ARTICLE

The remodeling of collagen Wbers in rats ankles submitted

to immobilization and muscle stretch protocol

Fernando Augusto Vasilceac · Adriana Frias Renner ·

Walcy Rosólia Teodoro · Stela Márcia Mattiello-Rosa

Received: 18 September 2009 / Accepted: 27 January 2010

Abstract To evaluate the remodeling of collagen Wbers in

the articular cartilage of rat ankles, with and without immo-

bilization, after application of muscle stretching protocol.

Twenty three Wistar rats were divided into four groups:

immobilized (I), n = 6; immobilized and stretched (IS),

n = 6; stretched (S), n = 6 and control (C), n = 5. The ani-

mals in groups I and IS were submitted to immobilization.

After the period of immobilization, the animals in groups

IS and S were submitted to a muscle stretching protocol. At

the end of the experiment, the animals were euthanized and

the joints removed, processed and stained with Picrosirius

red. The analysis was carried out using a polarized light

microscope. The density of collagen Wbers were quantiWed

according to the intensity of birefringence displayed. By

way of statistical analyses, the right and left hind limbs of

the diVerent groups were compared based on the total den-

sity of collagen Wbers, the density of thick collagen Wbers

and the density of thin collagen Wbers. Immobilization pro-

moted a reduction in density of the thin Wbers and of total

collagen. The muscle stretching protocol after immobiliza-

tion promoted a reduction in density of the total collagen

and of the thick Wbers, but the density of the thin Wbers

showed the same values as control. The collagen Wbers

were remodeled by the diVerent stimuli. Immobilization

was harmful to the collagen Wbers and the muscle stretching

protocol only recovered the thin collagen Wbers.

Keywords Articular cartilage · Collagen Wbers · Articular

immobilization · Muscle stretching

Introduction

The crucial problem in degenerative joint disease is a pro-

gressive reduction of the cartilage and its constituents, par-

ticularly collagen, which is the main constituent of articular

cartilage [1–5]. The collagen exists in the form of collagen

Wbers in the extracellular matrix [2, 6]. These can be classi-

Wed as thin Wbers when less than 0.8 m or as thick Wbers

when the thickness is in the range from 1.6 to 2.4 m [6, 7].

Some authors emphasize that measurement of the integrity

and organization of the collagen Wbers represents the most

sensitive indicator of the repair activity of articular carti-

lage [8, 9

Biomechanical models have shown that changes in the

collagen network directly inXuence the biomechanical

behavior of the cartilage [10, 11]. Animal studies have

shown that joint immobilization leads to mechanical, bio-

chemical, and morphological changes, which are not

always fully recovered on remobilization [5].

Some studies have shown that collagen was resistant to

load application and immobilization [5, 12, 13], but there is

still a discrepancy between the results of the diVerent stud-

ies on cartilage and the mechanical stimuli applied to the

joint. In general, there are diVerent opinions about which

procedure would be more appropriate to restore the func-

tionality of the articular cartilage [14, 15].

Muscle stretching is a therapeutic method used in reha-

bilitation and no injury to any of the articular cartilage com-

ponents has been observed [16]. However, since it

promotes compressive forces it may lead to an increase or

decrease in the degradation and synthesis of collagen [17],

F. A. Vasilceac · A. F. Renner · S. M. Mattiello-Rosa (&)

Departamento de Fisioterapia da,

Universidade Federal de São Carlos,

São Carlos, SP 13565-905, Brazil

e-mail: [email protected]fscar.br

W. R. Teodoro

Departamento de Reumatologia da,

Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil

Rheumatol Int

123

and it is thus possible that muscle stretching can be of ben-

eWt to the articular cartilage and hence to the collagen Wbers

in the articular cartilage. However, no conclusive studies

were found in the literature showing the remodeling of col-

lagen Wbers with muscle stretching as a method of cartilage

rehabilitation, with or without joint immobilization.

Objective

This study aimed to assess the remodeling of collagen

Wbers in the articular cartilage of the ankles of previously

immobilized rats, after application of a muscle stretching

protocol.

Methods

Experimental groups

Twenty-three male, 19 week-old albino rats weighing

320 § 34.7 g were used in this experiment. The animals

were housed in plastic cages in an animal room under con-

trolled environmental conditions, with free access to stan-

dard food and water. The study was carried out in

accordance with the guide for care and use of laboratory

animals [18] and carried out in agreement with the Ethics

Committee of the Federal University of São Carlos.

The animals were randomly distributed into four groups:

immobilized (I), immobilized and stretched (IS), stretched

(S) and control (C). The I group had their left ankles immo-

bilized for 4 weeks. The animals were able to walk with the

immobilization. The immobilization device was removed

and they were allowed free cage activity for 3 weeks; the IS

group had their left ankles immobilized for 4 weeks and

after the immobilization device was removed, they were

allowed free cage activity and submitted to a muscle

stretching protocol 3 days a week for 3 weeks; the S group

were allowed free cage activity for 4 weeks and then sub-

mitted to the muscle stretching protocol 3 days a week for

3 weeks; group C were allowed free cage activity for

7 weeks. In all treatments, only the left ankles were treated

and the right ones remained non-treated. At the end of the

7th week all the animals were euthanized.

Immobilization procedure

Groups I and IS were anaesthetized with 0.4 ml of 1.0 mg/

kg of xylazine and 0.75 mg/kg of ketamine before the pro-

cedure. The left ankle joints were immobilized in full plan-

tar Xexion with micropore and adhesive tape [19] and the

immobilization device maintained in place for 4 weeks.

The right hind limb was free to move. The animals were

allowed free cage activity with the device. After 4 weeks

the device was removed. Group I was allowed free cage

activity and group IS was submitted to the muscle stretch-

ing protocol.

Muscle stretching protocol

The groups IS and S were anesthetized and submitted to

posterior left hind limb muscle stretching. The ankle joints

were manually held in full dorsal Xexion for 10£ for 60 s

periods, with a 30 s interval between each 60 s period [16].

This protocol was applied for 3 days a week for 3 weeks.

Procedure for the histological assessment

After euthanasia, the left and right (treated and non-treated)

ankles were removed and the samples Wxed with 4% form-

aldehyde. All pieces were processed and sectioned in the

same way for the same person. The samples were decalci-

Wed in 7.5% nitric acid and the same concentration of glyc-

erin, for 7 days (95 h). Then, they were divided into two

pieces, with a blade at mean point between maleollus, per-

pendicular to the articular surface. The pieces (full half

ankles e proximal and distal part) were processed in par-

aYn in a plane surface and cut into six sections, each half

(six medial and six lateral) 6 mm thick with 50 mm

between each. Complete half joint and plane surface

allowed for perpendicular positioning during the paraYn

processing and control of the cutting procedure in this

study. The samples were stained with Picrosirius red.

Polarized light microscope analysis

The slides were examined by the same observer under opti-

cal microscope equipped with a polarizing light coupled to

an image analysis system (Sony CCD Camera/Olympus

Microscope BX-51). The images were analyzed with the

Image Pro Plus Software, which identiWes the color of the

collagen Wbers. The collagen Wbers stained with Picrosirius

red and observed under polarized light microscope shows a

color that depends on the thickness of the

Wbers. From thin

to thicker Wbers the color varies from green to yellow, then

to orange and Wnally to red [6, 7]. In brief, ten Welds of each

slide were analyzed, viewed with a magniWcation of 400£.

The density of the collagen Wbers was expressed as a per-

centage of the thin or thick Wber divided by the total area

(all of them detected by the software).

Statistical analysis

After quantiWcation of the results obtained using the polari-

zation microscope, the densities of the thick, thin and total

collagen Wbers were compared amongst the diVerent

Rheumatol Int

123

groups, comparing the results of both the non-treated (right)

and treated (left) limbs. The data were analyzed using the

statistical program (Statistic 7), applying the statistical test

ANOVA followed by a post hoc Tukey when necessary.

Results

No ulceration or bone edema of the joint was found in the

animals after the immobilization was removed, and there

were no complications such as erosion, osteophytes, sur-

face ulceration or other irregularities found in the joints of

the ankles of the animals studied.

The analysis of the histological sections of the treated

limbs stained with Picrosirius red allowed for an evaluation

of the organization of the collagen Wbers and their remodel-

ing as a result of the interventions used in the present study.

It could be seen that in groups I (Fig. 1a) and IS3 (Fig. 1b)

the collagen Wbers did not exhibit the same organization as

shown in group S (Fig. 1c) and especially in group C

(Fig. 1d). From this analysis, it could be seen that both

immobilization alone and immobilization followed by the

muscle stretching protocol generated disorganization of the

collagen Wbers in the joints, changing their organization in

the articular cartilage (Fig. 1).

No diVerences could be seen in the non-treated limbs of

any of the groups when assessed. None of the joints exam-

ined showed any statistical diVerences for the density of the

thin collagen Wbers, the density of the thick collagen Wbers

or the density of total collagen. However, in the treated

limbs, changes were observed in the density of the collagen

Wbers and in the color of the diVerent groups when com-

pared to the control (Fig. 2).

The analysis of the density of the thin collagen Wbers

showed a signiWcant reduction for group I as compared to

the other groups: I and IS (p < 0.001); I and S (p = 0.001); I

and C (p < 0.001). The IS and S groups showed no signiW-

cant diVerence from the control (Fig. 3).

The density of the thick Wbers in the treated joints also

changed in the present study. Group S showed a statistical

diVerence in relation to the other groups with a signiWcant

reduction in the density of the thick Wbers: S and I

(p <0.001); IS and S (p < 0.001); IS and C (p <0.001).

Groups I and S showed no signiWcant change in their den-

sity when compared to group C (Fig. 4).

Finally, the analysis of the density of total collagen in

the articular cartilage of the treated limb showed that the

stimuli applied in the present study were able to generate

remodeling of the collagen Wbers. Group IS showed

reduced values for the density of total collagen in relation

to the other groups: IS and I (p < 0.001); IS and S

(p < 0.001); IS and C (p < 0.001), and group I showed a

signiWcant reduction in their density when compared to

group C: I and C (p = 0.020). Based on the statistical analy-

sis, only group S showed no signiWcant diVerence from the

control group (Fig. 5).

Fig. 1 Photomicrograph of the

articular cartilage of the treated

limbs (Picrosirius red) showing

disorganization of the collagen

Wbers in: a the immobilized

group and b the immobilized and

stretched group; and the expect-

ed organization and arrangement

of the collagen Wber network in:

c the stretched group and d the

control

Rheumatol Int

123

Discussion

The properties of the collagen Wbers evaluated in the pres-

ent study were remodeled by the stimuli applied, as already

demonstrated in other studies [12, 13, 20, 21]. It was

observed that muscle stretching applied in normal joints

was a therapeutic intervention not harmful to collagen

Wbers, characterizing the protocol used of muscle stretching

3 days a week for 3 weeks, as a safe intervention with

respect to the collagen Wbers. This Wnding complements

another study [16], where it was observed that the applica-

tion of a muscle stretching protocol to joints without immo-

bilization did not generate damage to the constituents of the

articular cartilage.

However, when analyzing articular joints submitted to

immobilization, it was observed that this type of interven-

tion modiWed the collagen Wbers, although only the thin col-

lagen Wbers were susceptible to remodeling as a result of

this intervention. The fact that immobilization changes the

structure of articular cartilage is well documented in the

Fig. 2 Photomicrograph of the

articular cartilage of the treated

limbs (Picrosirius red). Birefrin-

gence of the collagen Wbers can

be visualized in all groups with

diVerent colours: a the immobi-

lized group; b the immobilized

and stretched group; c the

stretched group and d the control

Fig. 3 Graphical representation of the percentage of thin collagen

Wbers with the mean and standard error. Group I shows a reduction in

the density of the thin Wbers as compared to the other groups. Statisti-

cally signiWcant diVerences between the groups: *IS and I (p < 0.001);

I and S (p = 0.001); I and C (p < 0.001)

Density of thin collagen fibers for each group

Mean

Mean±SE

Mean±1,96*SE

I C IS S

Groups

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Density of thin collagen fibers (%)

Fig. 4 Graphical representation of the percentage of thick collagen

Wbers with the mean and standard error. The MI group showed a de-

crease in the density of this type of Wber as compared to the other

groups. Statistically signiWcant diVerences between the groups: *IS

and I (p < 0.001); IS and S (p < 0.001); IS and C (p < 0.001)

Density of thick collagen fiber for each group

Mean

Mean±SE

Mean±1,96*SE

I C IS S

Groups

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Density of thick collagen fibers (%)

Rheumatol Int

123

literature [5], and some authors have even classiWed it as an

intervention in detriment of the cartilage constituents. How-

ever, the thick collagen Wbers were shown to be a structure

resistant to joint immobilization. It is worth mentioning that

there are several protocols for joint immobilization, result-

ing in the obvious diYculty of correlating the data and

establishing consensus with respect to the response of col-

lagen to immobilization.

It was observed in the present study that the same stimu-

lus that promoted remodeling in one type of Wber did not

modify the other. It seems that the thin collagen Wbers

began a process of remodeling in an attempt to repair the

tissue, while the thick collagen Wbers remained stable to

minimize the deleterious eVects of immobilization.

In the present study, the response observed when

the joints were subjected to immobilization followed by the

muscle stretching protocol was that of a reduction in the

density of the thick collagen Wbers, a remodeling character-

istic of this type of Wber. Since the resistance of the thick

collagen Wbers was conWned to the articular immobilization

it did not support the following intervention. Such abnor-

mal remodeling of the collagen network has also been used

to justify weakening of the articular cartilage [22, 23].

The thin collagen Wbers were resistant to the application

of two subsequent diVerent external stimuli. If we consider

only the analysis of the values for the density of the thin

collagen Wbers, we could suppose that once hampered by

joint immobilization, the articular cartilage was able to pro-

mote a return to the initial values for density before the

muscle stretching was applied by remodeling its Wbers. In

this situation, the muscle stretching protocol was only an

eYcient method for restoring the levels of the thin collagen

Wbers to those present at the beginning of the experiment.

The change in density of the total collagen, deemed

harmful in the present study, can be correlated with the

organization and arrangement of the collagen Wbers, char-

acteristics that can be observed in the photomicrographs of

the cartilage. The muscle stretching and joint immobiliza-

tion procedures promoted disorganization of the collagen

Wbers in the tissue, a change that could also harm the tissue,

representing a result reinforcing the idea that the collagen

Wbers had undergone remodeling and were directly aVected

by a process harmful to the articular cartilage.

The disorganization of the collagen Wbers due to

changes occurring at the start of the process of articular

cartilage degeneration is well described in the literature

[1, 3–5, 9], and it is also evidenced in some studies after

the application of physical exercise [20] and remobiliza-

tion after periods of immobilization [21]. In the present

study, the chronology of the results was not observed, and

thus the remodeling of the collagen Wbers could be either

the cause or a consequence of the disorganization of the

collagen Wbers. The results could also indicate that the

responses of both remodeling and disorganization occur

concurrently.

Conclusion

Collagen Wbers are structures with remodeling properties and

responded diVerently to the diVerent stimuli applied in the

present study. The immobilization protocol was harmful to

this tissue, whereas the muscle stretching protocol was shown

to be a safe intervention when applied to a healthy joint. The

muscle stretching protocol, when performed after immobiliza-

tion, only resulted in beneWt to the thin collagen Wbers.

Acknowledgments We acknowledge the Fundação de Amparo a

Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) for Wnancial support.

ConXict of interest statement The authors declare that they have no

conXicts of interest.

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Fig. 5 Graphical representation of the percentage of total collagen

Wbers with the mean and standard error. Group I showed a signiWcant

reduction in their density when compared to the control group. The IS

group showed a reduction in the values for the density of total collagen

when compared to the other groups. *I and C (p = 0.020); **IS and I

(p < 0.001); IS and S (p < 0.001); IS and C (p <0.001)

Density of total collagen fibers for each group

Mean

Mean±SE

Mean±1,96*SE

ICISS

Groups

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Density of total collagen fibers (%)

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9. ANEXO IV

ARTIGO PUBLICADO: THE EFFECT OF A PASSIVE MUSCLE STRETCHING

PROTOCOL ON THE ARTICULAR CARTILAGE

Adriana Frias Renner, Elaine Carvalho, Edson Soares, Stela Márcia Mattiello-Rosa.

Osteoarthritis and Cartilage 14:196-202, 2006.

The effect of a passive muscle stretching protocol

on the articular cartilage

A. F. Renner P.T., M.S.y, E. Carvalhoy, E. Soares M.D., Ph.D.z and S. Mattiello-Rosa P.T., Ph.D.y*

y Department of Physiotheraphy, Federal University of Sa˜ o Carlos, Sa˜ o Paulo, Brazil

z Department of Pathology, School of Medicine of Ribeira˜ o Preto, University of Sa˜ o Paulo

Summary

Objective: The aim of this study is to evaluate the articular cartilage alterations of rat ankles, after applying unilateral cyclic passive muscle

stretching protocol in previously immobilized rats.

Methods: Twenty-two male albino rats divided into four groups, I e immobilized; IS e immobilized and stretched; S e stretched and C e con-

trol, were used in this experiment. The I and IS groups were immobilized for 4 weeks. In the muscle stretching protocol the treated ankle joint

(groups IS and S) was manually full dorsal ﬂexed 10 times for 60 s with a 30 s interval between each 60 s period, 7 days a week for 3 weeks, to

stretch the ankle plantar ﬂexors muscle group. The right hind limb was free to move. At the end of the experiment, the ankles were removed,

processed in parafﬁn and stained with hematoxylineeosin and Safranin-O. Two blinded observers evaluated cellularity, chondrocyte cloning

and Safranin-O staining through light microscopy. And a morphometric study was carried out using a hand count of chondrocyte cells and

cartilage thickness measurement.

Results: No signiﬁcant effect of solely muscle stretching concerning cellularity, chondrocyte cloning and Safranin-O staining parameters was

detected. However, IS group presented a signiﬁcantly higher reduction of proteoglycans content than the solely stretched and solely immo-

bilized groups and the morphometric analysis showed signiﬁcant cellularity increase without thickness alteration compared to control.

Conclusions: These ﬁndings suggest that the stretching protocol used was harmful to the previously immobilized articular cartilage. However,

the same stretching protocol did not harm the cartilage of non-immobilized groups.

Key words: Articular cartilage, Proteoglycans, Muscle stretching, Physiotherapy.

Introduction

Muscle stretching is a therapeutic method used in rehabili-

tation protocols after immobilization. Mechanical forces

have great inﬂuence in the structure, organization, synthe-

sis and rate of turnover of articular cartilage

1,2

. The chon-

drocyte perceives its mechanical environment through

complex biological and biophysical interactions with the ex-

tracellular cartilage matrix

Since articular cartilage is sensitive to abnormal loading,

when it is unloaded and deprived of mechanical stimuli,

there is a rapid deterioration of biochemical and biomechan-

ical properties

4,5

. This limitation in motion results in degen-

erative changes

4,6e8

, therefore this model of reduced joint

loading has been used to study the process of cartilage

degeneration

However, it should be noted that the ﬁndings of several

studies suggest that articular changes associated with joint

immobilization are different from those associated with de-

generative joint disease

. Haapala et al.

demonstrated

that immobilization causes atrophic changes in articular car-

tilage resulting in synthetic quiescence in this tissue. There

is a glycosaminoglycan (GAGs) depletion combined with in-

tact collagen ﬁbril network, which, as shown in their study, is

not sufﬁcient to initiate cartilage deterioration. Based on

these results, they concluded that immobilization and

changes in early osteoarthritis clearly differ.

Immobilization decreases thickness, mainly in the uncal-

ciﬁed region

2,4,10

and reduces cartilage stiffness

1,4,11,12

Reduced proteoglycans (PG) content have also been re-

ported following immobilization

2,5e7

After immobilization removal, there are different kinds of

treatment, such as, remobilization, exercise and muscle

stretching

. The aim of previous studies was to evaluate

the recovery of cartilage after remobilization, which means

leaving the animal free in a cage after immobilization remov-

6,8,10,11,14,15

. Haapala et al.

, demonstrated that after a re-

mobilization period, no signiﬁcant thickness difference

remained, compared to age matched controls. However, Ki-

viranta et al.

demonstrated no thickness recovery in some

regions, mainly the ones subject to less compression. The

PG concentrations that were reduced in all sample sites im-

mediately after immobilization, remained 14e28% lower

than those in controls after 50 weeks of remobilization in

some regions. In the non-treated joint, there was a 49% in-

crease of PG in some regions but a 34% decrease in others.

The response of previously immobilized articular cartilage

to muscle stretching is still unclear. This therapeutic method

may provide articular cartilage compression with different

magnitude and duration under extreme range of motion.

Chondrocytes can detect and respond to this applied load

*Address correspondence and reprint requests to: Mrs Stella

Marcia Mattiello-Rosa, Ph.D., Department of Physiotherapy,

Federal University of Sa

o Carlos, Via Washington Luis km 235,

13565-905 Sa

o Carlos, Sa

o Paulo, Brazil. Tel: 55-16-3351-8039;

Fax: 55-16-3361-2081; E-mail: [email protected]

Received 3 February 2005; revision accepted 30 August 2005.

OsteoArthritis and Cartilage (2006) 14, 196e202

doi:10.1016/j.joca.2005.08.011

International

Cartilage

Repair

Society

196

by altering their metabolic state

16,17

. Nevertheless, there is

a lack of studies describing the effect of this kind of load in

previously immobilized articular cartilage.

Objective

The purpose of this study is to evaluate the effect of

a muscle stretching protocol on the articular cartilage of

rat ankles, normal and previously immobilized.

Methods

EXPERIMENTAL GROUPS

Twenty-two albino male rats 16 weeks old weighing

280 G 25.4 g were used for this experiment. The animals

were housed in plastic cages in an animal room under con-

trolled environment conditions, with free access to standard

food and water. The study was conducted in accordance

with the Guide for Care and Use for Laboratory Animals

They were randomly distributed into four groups: immobilized

(I), immobilized and stretched (IS), stretched (S) and control

(C). The I group (n Z 6) had their left ankles immobilized for 4

weeks and after the immobilization device was removed, they

were allowed free cage activity for 3 weeks; the IS group had

their ankles immobilized for 4 weeks and after the immobiliza-

tion device was removed, they were allowed free cage activity

and were submitted to muscle stretching protocol daily for 3

weeks; the S group were allowed free cage activity for 4

weeks and were then submitted to muscle stretching protocol

daily for 3 weeks; group C were allowed free cage activity for 7

weeks. At the end of the seventh week all the animals were

euthanized. For this reason we considered left ankles as trea-

ted and right ones as non-treated.

IMMOBILIZATION PROCEDURE

Groups I and IS were anesthetized with an intra-

peritoneal dose of Ketamine (95 mg/kg) and Xylazine

(12 mg/kg) before the procedure. The Coutinho et al.

model of immobilization was used. The left ankle joints

were immobilized in full plantar ﬂexion with Micropore

and adhesive tape and this immobilization device was

kept on for 4 weeks. The device limited load and movement

of the treated ankle. The right hind limb was free to move.

The animal was allowed free cage activity with the device.

After 7 weeks the device was removed. Group I was

allowed free cage activity and group IS was submitted to

the muscle stretching protocol.

INTERMITTENT PASSIVE MUSCLE STRETCHING

Groups IS and S were anesthetized and submitted to pos-

terior left hind limb muscle stretching. The ankle joints were

manually full dorsal ﬂexed for 10 times for 60 s with a 30 s in-

terval between each 60 s period, 7 days a week for 4 weeks.

PREPARATION OF THE SAMPLES

After euthanasia, the left and right (treated and non-trea-

ted) ankles were removed and samples were ﬁxed with 4%

formaldehyde.

HISTOLOGICAL AND HISTOCHEMICAL ANALYSES

All pieces were processed and sectioned in the same

way for the same person.

The samples were decalciﬁed in 7.5% nitric acid and the

same concentration of glycerin, for 7 days (95 h). Then,

they were divided into two pieces, with a blade at mean

point between maleollus, perpendicular to the articular sur-

face. The pieces (full half ankles e proximal and distal part)

were processed in parafﬁn in a plane surface and cut into

six sections, each half (six medial and six lateral) 6 mm thick

with 50 mm between each. Complete half joint and plane

surface allowed perpendicular positioning during parafﬁn

processing and cut control for this study. The samples

were stained with hematoxylineeosin (H&E) and Safranin-

O (three H&E and three Safranin-O) for histological and his-

tochemical analyses, respectively. For histological and

histochemical grading we used the system demonstrated

in Table I. The following were evaluated: (1) cellularity, (2)

chondrocyte cloning, and (3) Safranin-O staining. Each sec-

tion was evaluated by two blinded observers and then

correlated.

MORPHOMETRIC ANALYSIS

A morphometric study was carried out using two random-

ized slides (one medial and one lateral) stained with H&E of

each ankle of each rat. One central ﬁeld was analyzed in

each slide. Axiovision 3.1 Image Analysis (Carl Zeiss)

was used to measure the cartilage thickness. We ﬁrst mea-

sured a central thickness and than 300 mm left and right two

more measures to record a mean thickness from three

measures (Fig. 1), all from subcondral bone to articular sur-

face. To hand count chondrocyte cells a 40,000 mm

central

loading area (Fig. 2) was delimited including calciﬁed layer

and articular surface. Cells were marked also with Axiovi-

sion

. The same randomized slides (one medial and one

lateral) were used to measure thickness.

STATISTICAL ANALYSIS

Correlation between observers (graduation of grading

system) was determined by the Spearman test with

R R 0.8 and P % 0.05. The KruskaleWallis non-parametric

test with the post hoc NewmaneKeuls (P % 0.05) was used

to compare the graduation of the grading system of the

Table I

Grading system

I Cellularity

Normal 0

Hypercellularity 1

Severe hypercellularity 2

Hypocellularity 3

II Chondrocyte cloning

Absent 0

Occasional clone pairs 1

Dense clone pairs 2

Clone clusters 3

III Safranin-O staining

Normal 0

Slight reduction 1

Up to half of total area

Slight reduction 2

On total area or total surface

Severe reduction 3

Up to half of total area

Severe reduction 4

On total area or total surface

197

Osteoarthritis and Cartilage Vol. 14, No. 2

non-treated and treated ankles from different groups. To

compare the non-treated and treated ankles, also related

to the grading system, in the same group we used the

Wilcoxon non-parametric test (P % 0.05). To compare the

morphometric analysis of cellularity of the treated ankles

analysis among groups we used multiple comparisons Dun-

can test. To compare media thickness of treated ankles

among groups, we used analysis of variance and also mor-

phometric analysis.

Results

At the ﬁrst day after immobilization all the animals were

able to feed and drink with the device. No skin ulceration

or foot swelling was found in the animals when the immobi-

lization was removed. Within 4 days after device removal

their gait seemed similar to controls.

Gross pathology identiﬁed that IS and I groups treated

and non-treated ankles presented some areas of non-

columnar organization, occasional clone pairs, hypercellu-

larity, chondrocyte hypertrophy and tidemark irregularities.

No abnormalities such as erosions, osteophytes, superﬁcial

ulcers or superﬁcial irregularities could be found on gross

inspection in IS, I, S or C group.

All sections evaluated based on grading system correlated

within observers (R R 0.8 and P % 0.05).

CHONDROCYTE CLONING

The non-treated hind limb of the IS group was statistically

different from all other groups. This group presented

a higher grading for chondrocyte cloning than the other

groups, which meant occasional cloning pairs (Fig. 3). Clon-

ing was deﬁned as the presence of more than one chondro-

cyte within the same lacunae within the surface zone of the

cartilage

. The statistical signiﬁcance of the difference from

other groups was: the IS group and the I group (P Z 0.014),

the IS and the S (P Z 0.000) and the IS and the C

(P Z 0.000). Only the IS group presented difference be-

tween the treated and non-treated limbs (P Z 0.038). The

non-treated limb presented occasional cloning pairs com-

paring treated and non-treated at the same group. The clon-

ing evaluation of the treated hind limb showed a difference

between the IS and the S (P Z 0.033) (Fig. 4). The IS pre-

sented higher grading than the other groups, but is still

nearly absent, while S presented smaller grading than all

the other groups, and is also absent. Both groups were

not statistically different from the control group (Fig. 4).

CELLULARITY

Based on qualitative analysis only the control group was

different from the other groups when comparing treated or

non-treated limbs among the groups. Only the C group

was normal. Other groups showed a slight cellularity in-

crease. The non-treated hind limb: C and I (P Z 0.000), C

and IS (P Z 0.000), C and S (P Z 0.000); treated limb: C

and I (P Z 0.015), C and IS (P Z 0.005), C and S

(P Z 0.024) (Fig. 5). However, the non-treated hind limb

from group IS showed some histological hypercellularity

sections (Fig. 6).

Fig. 1. Slide presenting morphometric analysis method of mean

thickness measure.

Fig. 2. Slide presenting morphometric analysis method of chondro-

cyte cells hand count.

Fig. 3. Photomicrographs of tibial rat articular cartilage (H&E) Chon-

drocyte cloning pairs (arrowheads), section fro m the non-treated

hind limb of IS group rat (40!).

198

A. F. Renner et al.: Muscle stretch and articular cartilage

Comparing treated and non-treated limbs in each group,

IS group non-treated limb presented higher cellularity

increase.

SAFRANIN-O STAINING

Assessment of Safranin-O staining among groups

showed that in the I and IS groups the non-treated hind

limbs were different from the other groups: I and IS

(P Z 0.004); I and S (P Z 0.000); I and C (P Z 0.000); IS

and S (P Z 0.000); IS and C (P Z 0.000). The IS group pre-

sented the higher loss of the PG content [Fig. 7(C)]. As-

sessment of the treated hind limbs showed the same

results, given that groups I and IS were different from all

the others: I and IS (P Z 0.002); I and S (P Z 0.000); I

and C (P Z 0.000); IS and S (P Z 0.000); IS and C

(P Z 0.000). The IS group presented a higher loss of this

dye in the treated limbs as compared to different groups

(Fig. 8). There was no statistical difference in the

comparison between the treated and non-treated limbs

within the IS group.

MORPHOMETRIC ANALYSIS

Cellularity

The chondrocyte cells hand count conﬁrmed that the trea-

ted ankles of the IS group showed signiﬁcant higher cellu-

larity compared to control group: IS and C, P Z 0.043

(Fig. 9).

Thickness

No difference on mean thickness was observed compar-

ing treated ankles among groups (Fig. 10).

Discussion

The results shown here demonstrated that the stretched

group that was previously immobilized presented important

tissue alterations in the treated and non-treated joint.

Response of articular cartilage under immobilization/

stretching and contralateral limb overloading differs

according to some parameters assessed in this study.

Although both limbs presented signiﬁcative PG content

loss as compared with other groups, treated and non-trea-

ted hind limbs presented signiﬁcantly different cellularity

and chondrocyte cloning responses. The non-treated

hind limb of the IS group was statistically different from

all other groups comparing chondrocyte cloning presence.

This group presented a higher grading for chondrocyte

cloning than the other groups. This hind limb in IS group

was also different from controls. It presented cellularity

increase at qualitative analysis. Comparing treated and

non-treated limbs in each group, IS group non-treated

hind limb presented higher cellularity increase. It should

be mentioned that cellularity, chondrocyte cloning and

loss of PG content are related to degenerative

responses

. The results presented here suggest a slight

degenerative response of the non-treated limb in the

IS group. Jortikka et al.

reported an alteration in the

contralateral limb and a plausible explanation for this

ﬁnding was that the period of immobilization changed the

gait or loading proﬁle of this limb, promoting matrix

changes in the cartilage. Andriacchi et al.

concluded

that the initiation of the degenerative changes was not

directly due to the high contact pressures, but rather, it

was associated to alterations in joint kinematics. Shifting

the normal loading bearing regions of the cartilage to

infrequently loaded regions caused mechanical damage

to this cartilage.

Articular cartilage response to muscle stretching

following immobilization was different from control, I and

S groups, as it presented a cellularity increase, without

change in cartilage thickness and a signiﬁcant higher loss

of Safranin-O staining. The correlation between the

Safranin-O staining and the PG content of the articular

cartilage has been well documented

. Previous studies

used Safranin-O, a cationic dye that binds in a stoichiomet-

ric way to GAG polyanions

, to evaluate articular cartilage

PG content

7,10,12

. The decrease of GAGs concentration

may be one of the ﬁrst detectable abnormalities following

joint immobilization

. In the present study the immobilized

group also showed Safranin-O decrease, however, this

decrease was signiﬁcantly higher in the immobilized and

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

IISSC

Groups

Grading of Chondrocyte Cloning

non-treated

treated

***

Fig. 4. Chondrocyte cloning grading of different groups. IS group

presented a higher grading for chondrocyte cloning than the other

groups at non-treated hind limb, which meant occasional c loning

pairs. Data plotted as means G SD. Statistical differences in non-

treated and treated lim bs among groups: *I and IS groups

(P Z 0.014), **IS and I, IS and S (P Z 0.000), IS and C

(P Z 0.000), ***IS and S, groups (P Z 0.033).

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

IISSC

Groups

Cellularity Graduation

Non-treated

Treated

Fig. 5. Cellularity grading scores of different groups. Only the con-

trol group has normal cellula rity compared to the other groups

(treated or non-treated limbs) Data plotted as means G SD. Statis-

tical differences in the non-treated and treated limbs comparing

among groups: *C and I (P Z 0.000), C and IS (P Z 0.000 ), C

and S (P Z 0.000). **C and I (P Z 0.015), C and IS (P Z 0.005),

C and S (P Z 0.024).

199

Osteoarthritis and Cartilage Vol. 14, No. 2

stretched groups. Our immobilization results were similar to

previous studies

5,6,10,14

, signiﬁcative PG content loss was

found. The functional capacity of articular cartilage largely

depends on collagen and PG, and its depletion affects bio-

mechanical properties. A signiﬁcant correlation coefﬁcient

has been established for compressive stiffness of cartilage

and concentration of GAGs, the higher the concentration of

GAGs, and the stiffer the cartilage

. In qualitative analysis

the IS group presented a slight reduction of Safranin-O

staining in the total area while the I group showed a slight

reduction up to half of the total area, both signiﬁcantly differ-

ent from control. The S group was normal, showing no dif-

ference from the control group. According to previous

studies there are different responses to overload according

to the animal model investigated

. Despite PG content de-

crease, there were no thickness alterations from surface to

calciﬁed layer. It is well known that articular cartilage per-

ceives mechanical environment. In the present study there

was a signiﬁcant hypercellularity following immobilization/

stretching, which suggests tissue response to this stimuli.

Palmoski and Brandt

mention that when the integrity of

the extracellular matrix of articular cartilage has been di-

minished by immobilization, it may be vulnerable to loading

during subsequent exercise and that may damage the

chondrocyte and affect its capacity for repair. They found

irreversible changes after cessation of vigorous exercise

Fig. 7. Photomicrographs of tibial articular cartilage (Safranin-O staining) (A) normal Safranin-O staining intensity, treated hind limb from

control group, (B) slight reduction of matrix staining i ntensity, matrix staining around chondro cytes (arrowhead), treated hind limb from an

I group rat, (C) severe reduction on Safranin-O staining, treated hind limb from IS group rat (40!).

Fig. 6. Photomicrographs of tibial articular cartilage (H&E) (A) normal cellularity, non-treated hind limb from a control group rat, (B) hypercel-

lularity, non-treated hind limb from a IS group rat (40!).

200

A. F. Renner et al.: Muscle stretch and articular cartilage

in previously immobilized canine knee cartilage. Haapala

et al.

based on their study suggest that lengthy immobi-

lization of a joint can cause long lasting articular cartilage

PG alterations at the same time as collagen organization

remains largely unchanged. And because PG exerts

strong inﬂuence on the biomechanical properties of carti-

lage, it may jeopardize the well being of articular cartilage.

According to those conclusions we can suggest that the

loss of PG content and cellularity increase found in IS

group may show an articular response to applied protocol

in the present study. This response seems to be harmful

and irreversible.

Intermittent hydrostatic pressure (IHP) applied in vitro

(chondrocyte cultures) demonstrated that IHP increased

messenger RNA (mRNA) signals and protein levels for

aggrecan and type II collagen; according to the duration

and the magnitude of stimulus, mRNA aggrecan signals

increased by 1 Hz after 4 h of 5 and 10 MPa compres-

sions on the ﬁrst day. However, mRNA type II collagen

signals, with the same compression duration and magni-

tude, only increased on the fourth day. They concluded

that mechanoregulation of cartilage extracellular matrix in

vivo depends on speciﬁc parameters of diarthrodial joint

loading. The effect of this stimulus depends on whether

the applied load is within physiological levels or at levels

that exceed a normal range

. Palmoski and Brandt

sub-

mitted cartilage plugs to static and cyclic stresses that

were equivalent to about 1.5 times the body weight.

They demonstrated a positive response, a 38% increase

in synthesis of GAGs with a cycle of 4 s on/11 s off, but

also a negative response, a decrease with a cycle of

60 s on/60 s off. Hall et al.

showed that, in the physio-

logical pressure range (5e10 MPa), both short-term

(20 s) and long-term (2 h) exposures to hydrostatic pres-

sure stimulated PG and protein syntheses in bovine carti-

lage explants. In a higher pressure range (O20 MPa),

however, this biosynthesis was signiﬁcantly suppressed

by long-term exposure, but not by short-term exposure.

According to previous studies articular cartilage loading

response depends on compressive duration, magnitude

and rate. The results presented here demonstrated that

full dorsal ﬂexion was harmful to previously immobilized

cartilage. However, the same protocol did not harm the

previously non-immobilized one. Loss of range of motion

is a common ﬁnding following immobilization. It is possible

that a previously immobilized group required a higher

compressive load to achieve the same range of motion

than the solely muscle stretched group. During application

of our protocol we could control the duration but not the

magnitude of stimuli. Overload associated with ‘‘static’’

or at least ‘‘non-short time’’ compression could be the

cause of this degenerative response.

Data found in present study suggest that it seems

important to control the magnitude, rate and duration of

the stretching load. Indeed, during muscle stretching

protocols static compressive load are applied, but the

real magnitude is still unclear. Further studies are required

to ﬁnd out a physiological magnitude to this clinical muscle

stretching protocol in previously immobilized articular

cartilage.

Acknowledgments

We acknowledge Ana Rocha, Department of Pathology,

University of Sa

o Paulo for her technical assistance, Profes-

sor Jorge Oishi, Department of Biostatistics, Federal Uni-

versity of Sa

o Carlos for his helpful advice regarding

statistical methods, Professor Walcy Rosolia Teodoro,

Department of Rheumatology, University of Sa

o Paulo

100

120

140

IIS

Groups

Morphometric Analysis

of Cellularity

Treated Hind Limbs

Fig. 9 . Mean cellula rity of different groups. IS group presente d

higher cellularity compared to control group (IS and C, P Z 0.043).

100

120

140

160

IISSC

Groups

Mean Thickness

Treated Hind Limbs

Fig. 10. Mean thickness of treated hind limbs presented no differ-

ence among groups.

0,5

1,5

2,5

3,5

IIS

Groups

Loss of Safranin-O staining

Graduation

Non-treated

Treated

***

Fig. 8. Safranin-O staining non-treated and treated limb grading sys-

tem among groups. The IS group presented a signiﬁcant loss of the

PG content (treated and non-treat ed hind limb) compared to other

groups. Data plotted as means G SD. Statistical differences in

non-treated and treated limbs among groups: *I and IS

(P Z 0.004), I and S (P Z 0.000), I and C (P Z 0.000). **IS and S

(P Z 0.00), IS and C (P Z 0.000). ***I and IS (P Z 0.002), I and S

(P Z 0.000), I and C (P Z 0.000). ****IS and S (P Z 0.000), IS and

C(P Z 0.000).

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Osteoarthritis and Cartilage Vol. 14, No. 2

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