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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
MELISSA HANZEN PINNA
LEPTOSPIROSE DETERMINADA PELO SEROVAR BRATISLAVA EM
EQUINOS
NITERÓI
2008
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MELISSA HANZEN PINNA
LEPTOSPIROSE DETERMINADA PELO SEROVAR BRATISLAVA EM
EQUINOS
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária da Faculdade Federal
Fluminense, como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor. Programa de
Clínica e Reprodução Animal.
Orientador: Prof. Dr. WALTER LILENBAUM
NITERÓI
2008
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MELISSA HANZEN PINNA
LEPTOSPIROSE DETERMINADA PELO SEROVAR BRATISLAVA EM
EQUINOS
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária da Faculdade Federal
Fluminense, como requisito parcial para obtenção do
grau de Doutor. Programa de Clínica e Reprodução
Animal
Apresentada em 25 de novembro de 2008.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________________________
Prof. Dr. WALTER LILENBAUM – UFF / Orientador
_____________________________________________________________________
Profª. Drª. ANA MARIA REIS FERREIRA - UFF
_____________________________________________________________________
Prof. Dr. FELIPE ZANDONADI BRANDÃO - UFF
_____________________________________________________________________
Profª. Drª. MARIA DA CONCEIÇÃO ESTELLITA VIANNI - UFRRJ
_____________________________________________________________________
Profª. Drª. RACHEL FERREIRA - MAPA
Dedico a Waldeci e Nádia, que são os melhores pais, amigos e incentivadores que Deus
poderia colocar em meu caminho.
AGRADECIMENTOS
Nesta oportunidade, gostaria de registrar os meus agradecimentos a todos aqueles que
de maneira direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho, e em especial:
A esta casa, a Universidade Federal Fluminense, por me haver proporcionado a
oportunidade de realizar o presente curso.
Ao Professor Walter Lilenbaum, pela acolhida, orientação, apoio e confiança
depositados no meu trabalho. Minha eterna gratidão.
À equipe do Laboratório de Bacteriologia do Instituto Biomédico da Universidade
Federal Fluminense, especialmente aos colegas Renato Varges, Bruno Pena, Gabriel Martins,
Rodrigo Martins e Luciana Medeiros, pela acolhida e colaboração.
Ao proprietário do Haras utilizado neste trabalho e à Médica Veterinária Alessandra
Crossara, responsável pelo plantel, pela disponibilidade e presteza para comigo.
A Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) e Fundação
Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
(FAPERJ), pelo
apoio financeiro.
Ao Centro de Apoio Diagnóstico (CAD) e, principalmente à colega Isabel Freire pela
realização das análises hematológicas e bioquímicas.
À Professora Maria da Conceição Estelitta Vianni pelas sugestões dadas durante meu
exame de qualificação e acima de tudo por ter me ensinado o valor da profissão durante nosso
convívio na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (registro aqui minha admiração).
Aos Professores Luiz Altamiro Garcia Nogueira e Ana Maria Reis Ferreira pela
colaboração e sugestões durante meu exame de qualificação.
Ao Professor Felipe Zandonadi Brandão pelo apoio, incentivo e sugestões.
Ao Prof. Eduardo Shimoda pelo apoio e realização das análises estatísticas.
Finalmente, agradeço a Deus por ter-me dado saúde e perseverança para superar todos
os obstáculos e galgar mais um degrau na minha vida profissional.
"O Senhor é meu pastor, nada me faltará!"
PINNA, Melissa Hanzen. Leptospirose determinada pelo serovar Bratislava em eqüinos.
2008. Tese. Universidade Federal Fluminense. 2008.
RESUMO
A leptospirose é uma zoonose determinada pela espiroqueta Leptospira interrogans
(lato sensu) e acomete diversas espécies animais, inclusive a eqüina. O presente trabalho
objetivou contribuir para o conhecimento da fisiopatogenia da leptospirose em eqüinos, de
forma a detalhar seus sinais clínicos e reprodutivos, alterações bioquímicas e hematológicas
associadas á esta infecção, além de propor método de controle da infecção em eqüinos do
Estado do Rio de Janeiro. No primeiro momento do estudo (Março de 2006), identificou-se
um plantel com elevados índices de perdas reprodutivas (30%) e procedeu-se à colheita de
sangue de todos os animais (148) para a realização de exames hematológicos, bioquímicos e
sorológicos, além de avaliação clínica e reprodutiva. Dos animais avaliados, 82 (55,4%)
foram sororeativos, com predominância do serovar Bratislava, identificado em 72 (87,8%)
amostras reativas. Os parâmetros clínicos avaliados durante o exame físico não evidenciaram
anormalidades. No que se refere ao espermograma, os garanhões não apresentaram alterações
dignas de nota e que pudessem ser associados à sororeatividade para leptospirose. Os
parâmetros bioquímicos creatinina, bilirribinas total e direta, fosfatase alcalina e alanina
transaminase sofreram aumento nos animais do grupo positivo. A elevação dos parâmetros
leucometria total, segmentados e linfócitos sugere um processo infeccioso que, associado aos
valores normais do fibrinogênio, caracteriza uma infecção subclínica com tendência à
cronicidade e, portanto compatível com o fato da Bratislava ser adaptada ao hospedeiro
eqüino. Diante dos achados um amplo programa de controle da infecção foi elaborado,
incluindo o uso de vacinas, antibióticos e a adoção de medidas epidemiológicas. Treze meses
após a implementação do programa de controle (Abril de 2007) constatou-se redução no
índice de abortamento de 12% para 4%, morte embrionária de 10% para 2% e morte neonatal
de 8% para 1%, totalizando 7% de prejuízos reprodutivos. Nesta ocasião, selecionou-se
randomicamente 31 fêmeas para testagem sorológica e onze animais (35,48%) apresentaram
sororeatividade; Bratislava foi ainda o serovar mais freqüente.
Palavras chave: Leptospirose, eqüinos, controle, Bratislava, fisiopatogenia
PINNA, Melissa Hanzen. Leptospirose determinada pelo serovar Bratislava em eqüinos.
2008. Tese. Universidade Federal Fluminense. 2008.
ABSTRACT
Leptospirosis is a zoonosis determined by Leptospira interrogans (lato sensu) which
affects various species, including equines. The purpose of the present study was to contribute
for the knowledge of the phisiopathogeny of leptospirosis in horses, including its clinical and
reproductive signs, the associated biochemical and hematological alterations and its control in
Rio de Janeiro herds. In the first step of the study (March, 2006), a herd with 30% of
reproductive losses was identified and blood samples were collected from all the animals
(148) for a biochemical, hematological and serological analysis. A complete physical
evaluation was also performed. Eighty-two (55.4%) animals were seroreactive, and Bratislava
was the most frequent serovar, demonstrated in 72 (87.8%) of the reactive samples. A
complete control program was applied, including vaccines, antibiotics and the adoption of
epidemiological measures. Twelve months after the implementation of the program (April,
2007), abortion had decreased from 12% to 4%, embryonic death from 10% to 2% and
neonatal death from 8% to 1%, totaling 7% of reproductive losses. At this moment, 31 mares
were randomly chosen for serological evaluation and eleven (35.48%) showed to be
sororeactives; Bratislava was still the most frequent serovar. Results of biochemical and
hematological evaluations are being analyzed.
Key words: Leptospirosis, horses, control, Bratislava, phisiopathogeny
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO......................................................................................................................... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................ 14
2.1 AGENTE ETIOLÓGICO....................................................................................................... 14
2.1.1 TAXONOMIA ....................................................................................................................15
2.2 EPIDEMIOLOGIA................................................................................................................. 17
2.2.1 A INFECÇÃO EM EQUINOS............................................................................................18
2.3 PATOGENIA ......................................................................................................................... 20
2.4 A ENFERMIDADE................................................................................................................ 22
2.4.1 PATOLOGIA CLÍNICA ..................................................................................................... 23
2.4.2 TRATAMENTO E CONTROLE........................................................................................ 28
2.4.3 ASPECTOS ZOONÓTICOS............................................................................................... 29
3 OBJETIVOS..............................................................................................................................31
3.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................................... 31
3.2 OBJETIVO ESPECÍFICO...................................................................................................... 31
4 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................................... 32
4.1 DESENHO DO ESTUDO...................................................................................................... 32
4.2 ANIMAIS...............................................................................................................................32
4.3 ANÁLISE CLÍNICA.............................................................................................................. 33
4.4 ANÁLISE SOROLÓGICA .................................................................................................... 33
4.5 ANÁLISE REPRODUTIVA.................................................................................................. 34
4.6 ANÁLISE HEMATOLÓGICA.............................................................................................. 34
4.7 ANÁLISE BIOQUÍMICA...................................................................................................... 36
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA..................................................................................................... 37
5 RESULTADOS ......................................................................................................................... 38
5.1 ANÁLISE CLÍNICA.............................................................................................................. 38
5.2 ANÁLISE SOROLÓGICA .................................................................................................... 38
5.3 ANÁLISE REPRODUTIVA.................................................................................................. 43
5.4 ANÁLISE HEMATOLÓGICA E BIOQUÍMICA................................................................. 47
6 DISCUSSÃO............................................................................................................................. 57
7 CONCLUSÕES......................................................................................................................... 63
8 REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 65
LISTA DE QUADROS
Quadro 01: Resultados (média, erro-padrão, coeficiente de variação e intervalos de confiança
a 5%) das análises bioquímicas e hematológicas do grupo negativo. .......................................... 48
Quadro 02: Resultados da comparação estatística, pelo teste t de Student, entre os valores
referência da literatura, com as médias do grupo negativo, para validação dos intervalos de
confiança. ..................................................................................................................................... 49
Quadro 03: Valores definidos como referência para análises dos grupos positivo e suspeito..... 50
Quadro 04: Comparação, pelo teste t de Student, entre as médias das variáveis bioquímicas e
hematológicas do grupo positivo com os valores referência........................................................ 51
Quadro 05: Freqüência (%) de indivíduos do grupo positivo com valores das variáveis
bioquímicas e hematológicas acima, dentro ou abaixo dos Intervalos de Confiança...................54
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Antígenos utilizados para o diagnóstico sorológico de leptospirose em eqüinos.........34
Tabela 2: Distribuição das reações de soroaglutinação microscópica para diagnóstico de
leptospirose em 148 soros de eqüinos de um plantel no Rio de Janeiro, Brasil........................... 40
Tabela 3: Parâmetros clínicos e reprodutivos observados em plantel com 148 eqüinos durante
e após diagnóstico de leptospirose no Rio de Janeiro, Brasil....................................................... 45
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Distribuição das reações de soroaglutinação microscópica para diagnóstico de
leptospirose em 148 soros de eqüinos reativos (títulos≥ 200) de um plantel no Rio de Janeiro,
Brasil, no primeiro momento do estudo (2006)............................................................................ 41
Gráfico 2: Distribuição das reações de soroaglutinação microscópica para diagnóstico de
leptospirose em 148 soros de eqüinos fracamente reativos (títulos ≤ 100) de um plantel no Rio
de Janeiro, Brasil, no primeiro momento do estudo (2006). ........................................................42
Gráfico 3: Parâmetros clínicos e reprodutivos observados em plantel com 148 eqüinos durante
e após diagnóstico de leptospirose no Rio de Janeiro, Brasil. ..................................................... 46
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Freqüência relativa (%) de animais com valores das variáveis bioquímicas e
hematológicas abaixo, dentro e acima dos valores referência (Intervalo de confiança – IC).. .... 55
12
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT - alanina transaminase
AST - aspartato transaminase
BD - bilirrubina direta
BI - bilirrubina indireta
BT - bilirrubina total
CHGM – concentração hemoglobínica globular média
CK - creatina quinase
CV – coeficiente de variação
EDTA - etileno diamina tetra-acético
FA - fosfatase alcalina
GGT - gama glutamil transferase
HB – hemoglobina
IC – intervalo de confiança
IPEVE - Instituto de Pesquisas Aplicadas
LDH - lactato-desidrogenase
LPS – Lipopolissacarídeo
VG – volume globular
VGM - volume globular médio
VR – valor de referência
13
1 INTRODUÇÃO
A leptospirose é uma antropozoonose direta determinada pela infecção com a
espiroqueta Leptospira interrogans (sensu lato) e pode acometer diversas espécies de animais,
inclusive os eqüinos. É causada por diferentes espécies de Leptospira sp., bactérias
ubiquitárias que estão presentes na água, solo e reservatórios animais de zonas urbanas e
rurais. Os animais infectados podem desenvolver o estado de portadores crônicos renais e
tornarem-se reservatórios.
Dada à mudança no perfil de criação, o mercado da equideocultura nacional vem se
expandindo muito, atingindo a ordem de seis milhões de animais atualmente. Com isso, o
grande número de animais, associado à intensificação na criação, contribuiu para o aumento
da ocorrência de doenças, dentre elas a leptospirose. Quanto às manifestações clínicas
associadas a esta afecção, destacam-se problemas reprodutivos e oculares; porém, muitos
eqüinos sororeativos não exibem sinais clínicos evidentes desta enfermidade.
Além dos danos econômicos que a leptospirose pode determinar aos criadores de
eqüinos, cabe ressaltar que esta é uma zoonose de reconhecida importância na saúde pública
que preocupa epidemiologistas e clínicos, tanto pela dificuldade de erradicação, devido a
complexos aspectos epidemiológicos, como pela elevada taxa de letalidade. O impacto da
leptospirose sobre a saúde pública reflete-se no alto custo do tratamento nos indivíduos
acometidos, com letalidade da ordem de 5 a 20%. No entanto, quanto à saúde animal, as
14
conseqüências dessa infecção encontram-se particularmente na esfera econômica, tendo em
vista as perdas diretas (com o tratamento e morte do animal) e indiretas (queda na
produtividade, aumento do intervalo entre partos, queda de desempenho esportivo, dentre
outros). A leptospirose animal representa, portanto, um fator de preocupação para os
profissionais envolvidos com a saúde animal e a saúde pública.
As manifestações clínicas da doença variam com a espécie animal e o serovar
envolvido, sendo mais freqüentemente observadas, na espécie eqüina, alterações na esfera
reprodutiva tais como abortamento, natimortalidade, parição de crias debilitadas e
infertilidade. Além disso, podem-se identificar outras alterações clínicas, tais como uveíte,
ceratite, icterícia e miosites. Abortos eqüinos podem apresentar icterícia, fígado friável,
hemorragia em diversos sítios anatômicos, dentre outras alterações.
Devemos considerar cada área endêmica como detentora de características próprias,
sendo que as ações de controle não podem ser generalizadas para todas as regiões, o que
implica na necessidade de definir a epidemiologia da enfermidade em termos de condição
local.
O controle da infecção leptospírica pode ser realizado de duas formas principais:
aquela que objetiva a completa erradicação do agente no plantel, baseada na progressiva
identificação e tratamento de portadores; e aquela que se propõe controlar seus efeitos sobre
os animais, baseada na vacinação dos animais e uso esporádico de antibióticos (FAINE et al.,
2000). Em ambas as situações, variáveis ambientais características de países tropicais muitas
vezes não são devidamente levadas em conta.
Neste contexto, o presente estudo se propôs a contribuir para o conhecimento da
fisiopatologia da leptospirose em eqüinos determinada pelo serovar Bratislava, através das
avaliações clínica, hematológica e bioquímica de animais reativos e não reativos submetidos à
mesma situação epidemiológica.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 AGENTE ETIOLÓGICO
A palavra leptospira deriva do grego e traduz-se leptós - fino, pequeno, delicado e
speira, espiral. São bactérias helicoidais de 6 a 20 µm de comprimento e 0,1 µm de diâmetro
(LEVETT, 2001), filamentosas, delgadas, podendo apresentar uma ou ambas as extremidades
curvadas em formato de gancho (LEVETT, 2001; TORTORA, FUNKE e CASE, 2003).
Nestas extremidades, as leptospiras, que são espiroquetas, possuem dois flagelos polares
conhecidos como filamentos axiais ou flagelos periplasmáticos, que lhes garantem alta
motilidade (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001; BARTHI et al., 2003). Assim, podem
realizar movimentos de rotação e translação ao longo do seu eixo, em linha reta ou em
círculos (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001; TORTORA, FUNKE e CASE, 2003).
O lipopolissacarídeo que compõe a membrana externa das leptospiras se assemelha
com o das bactérias Gram-negativas, porém possui menor atividade endotóxica (SHIMIZU et
al., 1987). Estas espiroquetas não se coram pelos métodos usuais de coloração, sendo
visualizadas apenas em microscopia de campo escuro ou em microscopia de campo claro de
contraste de fase, ou ainda, em preparações impregnadas pela prata (FAINE et al., 2000).
Condições aeróbicas são essenciais e determinam seu crescimento
(LEVETT, 2001;
TORTORA, FUNKE e CASE, 2003). Vale salientar que uma concentração ainda indefinida
16
de CO
2
é indispensável para o início do crescimento acima citado. Desenvolvem-se em
temperatura ótima de 28 a 30ºC e pH 7,2 a 7,6 (FAINE et al., 2000). Demandam meios
especiais de cultivo, não crescendo na ausência de albumina (opta-se geralmente pela bovina
a qual se acrescenta 1% ao meio) ou soro (sendo mais utilizado o de coelho na proporção de
10%) (FAINE et al., 2000; TORTORA, FUNKE e CASE, 2003), sendo que vitaminas B1,
B12, fosfato, cálcio, magnésio, amônia e ferro são nutrientes essenciais para o seu
desenvolvimento (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001). A sua principal fonte de energia são
os ácidos graxos de cadeia longa (BASEMAN e COX, 1969). O meio de cultura mais
utilizado para o seu cultivo é o meio líquido de Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris
(EMJH), que contém ácido oléico, soroalbumina bovina como detoxificante e tween 80 como
fonte de carbono (ELLINGHAUSEN e MCCULLOUGH, 1965; JOHNSON e HARRIS,
1967). As leptospiras patogênicas possuem longo tempo de geração, variando de 8 a 18 horas.
O crescimento em meio de cultura pode variar de dois a 30 dias (FAINE et al., 2000),
podendo levar até 26 semanas em isolamentos primários (ELLIS et al., 1983b).
As bactérias do gênero Leptospira sp são pouco resistentes, sendo rapidamente
eliminadas pela desidratação e temperatura entre 50-60°C. A resistência aos desinfetantes é
bastante pequena. São inibidas em pH inferior a 6,8 ou superior a 8,0 e temperaturas
inferiores a 10°C. No entanto, quando em condições favoráveis, sobrevivem na água e em
cultura por longos períodos (FAINE et al., 2000). Solos, lama, coleções de água doce, rios
(NELSON e COUTO, 2006), pântanos, órgãos e tecidos de animais vivos ou mortos são
também citados como possíveis habitats para a espiroqueta. As espécies patogênicas podem
sobreviver no ambiente, mas preferencialmente encontram-se no hospedeiro, onde se
multiplicam (FAINE et al., 2000).
As leptospiras saprófitas e patogênicas tendem naturalmente a formar agregados em
coleções de água (TRUEBA et al., 2004; GANOZA et al., 2006) e são capazes de formar
biofilmes in vitro (RISTOW et al., 2008). Agregados de leptospiras também são observados
nos túbulos renais de ratos colonizados (ATHANAZIO et al., 2008).
2.1.1 TAXONOMIA
As leptospiras pertencem a Ordem Spirochaetales, a qual faz parte de um filo
bacteriano único, Spirochaetes. A família Leptospiraceae compreende o gênero Leptospira
17
sp, o qual é composto por bactérias saprófitas e patogênicas. A taxonomia e classificação das
leptospiras são bastante complexas e vêm sofrendo diversas alterações ao longo dos últimos
anos (PEROLAT et al., 1998; BRENNER et al., 1999; LEVETT et al., 2005). Até 1989 o
gênero Leptospira sp era classificado de acordo com a sorologia, baseando-se na variabilidade
do lipopolissacarídeo de parede, e de acordo com o fenótipo bacteriano; sendo dividido em
dois grandes grupos, Leptospira biflexa sensu lato, contendo as leptospiras saprófitas ou
ambientais e Leptospira interrogans sensu lato, contendo as leptospiras patogênicas
(BHARTI et al., 2003).
Diversos serovares foram identificados de acordo com a aglutinação sorológica que
era observada (FAINE et al., 2000) e os que se relacionavam antigenicamente foram reunidos
em sorogrupos, os quais não fazem parte da taxonomia, mas são indispensáveis à
compreensão da epidemiologia e diagnóstico da doença. Sabe-se que existem mais de 250
serovares agrupados em 24 sorogrupos (LEVETT, 2001).
A classificação fenotípica vem sendo substituída pela genotípica, baseada na
hibridização DNA-DNA, a qual agrupou as leptospiras em diversas espécies genômicas,
correspondendo então a grupos com DNA relacionado (LEVETT et al., 2005; MATTHIAS et
al., 2008). Até o momento, foram identificadas 14 espécies e quatro genomospecies (ainda
não denominadas), com cepas contendo 70% ou mais de relação DNA-DNA (PEROLAT et
al., 1998; BRENNER et al., 1999; LEVETT et al., 2005; MATTHIAS et al., 2008). Como a
reclassificação do gênero manteve os nomes das espécies L. interrogans e L. biflexa, para
evitar confusão na nomenclatura chama-se L. interrogans sensu lato e L. biflexa sensu lato
quando se refere à antiga nomenclatura sorológica, e L. interrogans sensu strictu e L. biflexa
sensu strictu quando se refere as genomoespécies (LEVETT, 2001). O maior problema da
classificação genotípica é que muitas vezes um mesmo serovar pode representar mais de uma
espécie genômica (BRENNER et al., 1999).
A classificação molecular permanece confusa para a microbiologia clínica e a
epidemiologia, sendo ainda aceito referir-se às leptospiras pela classificação sorológica antiga
(BHARTI et al., 2003).
18
2.2 EPIDEMIOLOGIA
A leptospirose é uma doença que acomete humanos e animais, tem distribuição
mundial em áreas urbanas, silvestres e rurais e sua ocorrência está ligada a fatores ambientais
e climáticos (FAINE et al., 2000; VASCONCELLOS, 2000; LEVETT, 2001; TORTORA,
FUNKE e CASE, 2003; BATISTA et al., 2004), podendo manifestar-se em níveis endêmicos
ou gerar surtos epidêmicos (VASCONCELLOS, 2000; BLAZIUS et al., 2005). Possui caráter
sazonal descrito por diversos autores, estando diretamente relacionada a períodos chuvosos,
quando há elevação do índice pluviométrico (JOUGLARD e BROD, 2000; BATISTA et al.,
2004; BLAZIUS et al., 2005).
Os roedores são os reservatórios principais do agente, onde a ratazana de esgoto
(Rattus norvegicus) tem papel fundamental na transmissão da doença no meio urbano
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003). Há uma grande diversidade de reservatórios
ou hospedeiros de manutenção de leptospiras, compreendendo animais silvestres e
domésticos, como caninos, bovinos, suínos, caprinos, eqüinos e ovinos. Cada serovar tende a
ser mantido por um hospedeiro animal específico, sendo então este serovar considerado
adaptado à determinada espécie animal (FAINE et al., 2000).
Os reservatórios animais são cronicamente infectados nos rins pelos diferentes
serovares de Leptospira (LEVETT, 2001; ATHANAZIO et al., 2008), um dos locais de
predileção da bactéria. Assim, a transmissão da leptospirose ocorre através da eliminação de
leptospiras na urina havendo a contaminação de água e solo, sendo esse o principal veículo de
transmissão da doença (JOUGLARD e BROD, 2000; MCBRIDE et al., 2005); ou ainda, as
leptospiras podem persistir no trato genital, sendo desta forma eliminadas pelo sêmen e
secreções vaginais e, portanto transmitidas pela cópula ou inseminação artificial (FAINE et
al., 2000).
Acredita-se que as leptospiras sejam eliminadas em altas concentrações na urina de
ratos, visto que recente estudo demonstrou que ratos experimentalmente infectados eliminam
até 10
7
bactérias/mL de urina (NALLY et al., 2005). O estado de portador renal dos
hospedeiros de manutenção é um elemento chave na transmissão da leptospirose. As
leptospiras naturalmente tendem a formar agregados na água, o que pode estar relacionado à
sua manutenção no meio ambiente (TRUEBA et al., 2004).
19
As vias de transmissão clássicas da leptospirose são através do contato com a pele
lesada e mucosa. O conhecimento dos serovares e seus hospedeiros de manutenção são
essenciais para a compreensão da epidemiologia da doença em uma dada região (LEVETT,
2001).
Os animais que sobrevivem à fase aguda da leptospirose podem desenvolver a
condição de portadores convalescentes onde as leptospiras instalam-se e multiplicam-se nos
túbulos renais e são eliminados para o meio ambiente por períodos variáveis. Imunoglobulinas
específicas são normalmente achadas na urina (FAINE et al., 2000).
A enfermidade nos animais domésticos apresenta diversas manifestações clínicas,
dependendo da espécie animal, do serovar infectante e do ambiente envolvidos. Serovares
adaptados tendem a causar doença crônica e por vezes subclínica nos hospedeiros de
manutenção; enquanto que serovares não adaptados causam doença aguda e grave. Os
eqüinos, além dos distúrbios reprodutivos, apresentam uveíte recorrente causada pela
presença de leptospiras ou anticorpos específicos nas câmaras oculares, e que pode evoluir
para a cegueira (HARTSKEERL et al., 2004; LÉON et al., 2006).
2.2.1 A INFECÇÃO EM EQUINOS
Exames sorológicos mostram que a doença é de ocorrência mundial, mas o serovar
predominante em diferentes países pode variar, e mesmo entre diferentes regiões de um
mesmo país (DONAHUE et al., 1995). O serovar mais frequentemente identificado em casos
de abortamento em eqüinos é Pomona. Outros serovares, entretanto, já foram isolados a partir
de tecidos fetais, tais como Bratislava e Hardjo (ELLIS et al., 1983a). Embora a prevalência
de infecção leptospírica em eqüinos por Icterohaemorrhagiae ou Pomona seja bem
documentada, Bratislava é menos freqüentemente citado (PINNA et al., 2007). ELLIS et al.
(1983a) sugerem que Bratislava pode ser um serovar adaptado aos cavalos, mas a
significância clínica da infecção por esta amostra ainda não é bem esclarecida. No Brasil,
apesar do considerável plantel de cavalos, existem poucos estudos sobre a leptospirose
eqüina. Sororeatividade para Bratislava já foi relatada no estado do Rio de Janeiro, mas a
correlação com os casos clínicos, particularmente no que se refere a alterações reprodutivas,
ainda não é bem conhecida (LILENBAUM, 1998; PINNA et al., 2007).
20
A grande prevalência de anticorpos contra Bratislava e o isolamento deste serovar dos
rins de sete de 91 eqüinos adultos indicou que os cavalos podem ser hospedeiros adaptados
para o serovar Bratislava em um estudo realizado no norte da Irlanda (ELLIS et al., 1983b)
Na República da Irlanda, EGAN e YEARSLEY (1986), ao examinarem 530 amostras
de sangue de eqüinos de várias regiões do país, verificaram que os serovares predominantes
foram Bratislava, Copenhageni e Pyrogenes. Ainda constataram a existência de uma
associação significativa entre evidência sorológica e a presença da oftalmia periódica.
Segundo KITSON-PIGGOT e PRESCOTT (1987), o serovar Bratislava foi o mais prevalente
durante um estudo sorológico realizado em Ontário, Canadá.
Em outros países já foram registradas, na espécie eqüina, aglutininas contra vários
serovares de Leptospira interrogans. Na Austrália, SWART; CALVERT e MENEY (1982)
encontraram 41,5% de soros reagentes contra os serovares Ballum, Autumnalis,
Icterohaemorrhagiae, Pomona e Hardjo. Na Argentina, BORDOY (1985) realizou um estudo
sorológico em três províncias; de 561 eqüinos examinados, 321 (57,22%) foram reagentes,
sendo que os serovares mais freqüentes foram Bratislava, Pomona, Tarassovi e
Icterohaemorrhagiae.
No Brasil, evidências da infecção, caracterizadas pela identificação de aglutininas
específicas anti-leptospiras em eqüinos, têm sido relatadas há mais de 60 anos (CORREA et
al., 1955), com relatos em diversos estados, como Minas Gerais (CORDEIRO; RAMOS e
BATISTA, 1974) (BATISTA et al., 1974) (RAMOS; SOUZA e LILENBAUM, 2006), Rio
Grande do Sul (PESCADOR et al., 2004) e no Rio de Janeiro (LILENBAUM, 1998). A maior
parte dos estudos sorológicos realizados em eqüinos no Brasil registra a predominância de
sororeatividade para Icterohaemorrhagiae, Pomona e Grippotyphosa, enquanto
sororeatividade para Bratislava é mais raramente relatada (VASCONCELLOS, 2000;
FÁVERO et al., 2002; LANGONI et al., 2004).
A perpetuação da leptospirose em um ecossistema depende sobretudo de condições
adequadas para sobrevivência e multiplicação das leptospiras, tais como clima, solo e
hospedeiros. O equilíbrio destes componentes como um todo favorece a formação de focos
endêmicos que podem eclodir sob a forma epidêmica (FAINE et al., 2000)
21
2.3 PATOGENIA
A dinâmica da patogenia da leptospirose é complexa e multifatorial. A motilidade e
morfologia das leptospiras favorecem a sua penetração através da pele lesada e mucosas
íntegras. Após a infecção segue-se uma rápida disseminação da bactéria na corrente sanguínea
do hospedeiro, ocorrendo multiplicação ou leptospiremia com duração média de três a 10
dias. Este período compreende a primeira fase da doença, não imune e com sintomatologia
branda e inespecífica. Após esta fase, ocorre o desenvolvimento de anticorpos específicos
pelo sistema imune e as leptospiras irão se localizar nos órgãos alvo, como rins, fígado,
pulmões e musculatura esquelética, provocando a sintomatologia clássica.
Os túbulos renais, áreas do organismo onde os anticorpos estão em concentrações
baixos, parecem ser o local preferencial da colonização por leptospiras. Acredita-se que a
explicação para isto se deva ao aporte sanguíneo ser limitado nestas regiões o que leva a uma
menor eficiência das imunoglobulinas nestes locais (FAINE et al., 2000). Segundo GUYTON
(1981), o fluxo sanguíneo renal na cortical corresponde a 20% do débito cardíaco, enquanto
na região medular externa e interna é de 9% e 1% respectivamente, corroborando com os
achados de ATHANAZIO et al. (2008) que sugerem que as leptospiras encontrem nos rins um
escape do sistema imune.
Uma vez a infecção instalada, pode haver a evolução para doença aguda em
hospedeiros sensíveis, bem como o desenvolvimento de imunidade protetora e eliminação do
microrganismo, ou desenvolvimento do estado de portador crônico (FAINE et al., 2000). Nos
ratos, hospedeiros resistentes à infecção por Icterohemorrhagiae, as leptospiras disseminam-se
por todos os tecidos durante a primeira semana de infecção e depois são apenas encontradas
nos rins (ATHANAZIO et al., 2008).
Os rins colonizados por leptospiras apresentam nefrite túbulo-intersticial, com a
presença de focos inflamatórios, necrose tubular e hemorragias. As leptospiras são
encontradas em grande número nos túbulos contorcidos proximais, glomérulos e interstício
(BARNETT et al., 1999; NALLY et al., 2004; YANG et al., 2006), no citoplasma de
macrófagos e em depósitos formados a partir de células degeneradas (MORRISON e
WRIGHT, 1976).
22
A obstrução tubular originada a partir do edema intersticial e menor perfusão renal
resulta em diminuição progressiva da filtração pelo glomérulo. O infiltrado celular observado
nestes casos está associado à produção local de anticorpos e, secundariamente, à fagocitose
(MORRISON e WRIGHT, 1976). O quadro de insuficiência renal provoca azotemia, aumento
de creatinina, oligúria ou anúria, alterações do sedimento urinário, proteinúria, glicosúria,
natriurese e caliurese (KO et al., 1999; DAHER et al., 2002; NALLY et al., 2004;
ANDRADE et al., 2007).
A presença de leptospiras no fígado leva a um dano hepatocelular, provocando lesões
hepáticas típicas tais como perda da arquitetura tecidual, focos de necrose hepatocitária, focos
de inflamação, presença de células de Kupffer aumentadas e eventualmente presença de
células apoptóticas (MERIEN et al., 1998; NALLY et al., 2004, YANG et al., 2006). As
leptospiras localizam-se em sinusóides e canalículos biliares, levando à colestase e
provocando um aumento de bilirrubina sérica, contribuindo para o quadro de icterícia (Da
SILVA et al., 2002). Observa-se ainda aumento das transaminases hepáticas, gama glutamil
transferase e fosfatase alcalina (DA SILVA et al., 2002; PEREIRA et al., 2005).
O dano pulmonar principal na leptospirose ocorre devido às intensas hemorragias
intra-alveolares (NALLY et al., 2004; PEREIRA et al., 2005; YANG et al., 2006), levando à
insuficiência respiratória (GOUVEIA et al., 2008). Raras leptospiras são visualizadas nos
pulmões (NALLY et al., 2004; YANG et al., 2006), sugerindo outro mecanismo de patogenia
neste órgão que não a ação direta do microrganismo. A presença de imunocomplexos em
membranas alveolares de cobaios sugere um processo auto-imune como etiologia da
hemorragia pulmonar observada na leptospirose (NALLY et al., 2004). Em casos graves os
pulmões apresentam grandes sufusões. Já no coração observa-se pericardite e petéquias no
epicárdio e endocárdio (BALDWIN e AYKINS, 1987).
A lesão tecidual primordial da leptospirose parece ser a lesão endotelial, levando à
vasculite e às hemorragias nos tecidos (LEVETT, 2001). Hemorragias, anemia hemolítica,
hemoglobinemia, hemoglobinúria e icterícia são achados decorrentes da hemólise e lesão
endotelial (DAHER et al., 2002; WAGENAAR et al., 2007). A trombocitopenia é comumente
observada nas formas graves da leptospirose, podendo ocorrer em decorrência de
hemorragias, citotoxicidade e agregação plaquetária (NICODEMO et al., 1989; GREENE,
2004; YANG et al., 2006; WAGENAAR et al., 2007).
23
A resposta imune contra leptospiras parece ser estimulada por componentes da
membrana externa, como LPS, proteínas e lipoproteínas. A resposta adquirida se desenvolve a
partir da segunda semana de infecção e é específica para o serovar infectante. A
especificidade é conferida pelo LPS, que é altamente imunogênico (LEVETT, 2001). Os
anticorpos específicos opsonizam as leptospiras, as quais são fagocitadas por macrófagos
(MERIEN et al., 1997). WANG et al. (1984) observaram resistência de leptospiras à
fagocitose por neutrófilos.
SEBASTIAN (1994) verificou que na leptospirose a intensidade das lesões teciduais
está intimamente relacionada à estirpe do serovar e a adaptabilidade do hospedeiro.
SEBASTIAN et al. (2005) identificaram a Leptospira como uma importante causa de
abortamento infeccioso e natimortalidade em eqüinos. De acordo com POONACHA et al.
1
(1994), citado por PESCADOR et al. (2004), a placentite caracteriza-se por trombose,
vasculite e infiltração de celular inflamatórias no estroma juntamente com hiperplasia
adenomatosa cística e necrose de epitélio.
2.4 A ENFERMIDADE
A leptospirose nos animais domésticos apresenta diversas manifestações clínicas,
dependendo da espécie animal, do serovar infectante e do ambiente envolvidos. Serovares
adaptados tendem a causar doença crônica e por vezes subclínica nos hospedeiros de
manutenção, enquanto serovares não adaptados causam doença aguda e grave. Os eqüinos,
além dos distúrbios reprodutivos, apresentam uveíte recorrente (também conhecida como
oftalmia periódica; cegueira da lua) causada pela presença de leptospiras ou anticorpos
específicos nas câmaras oculares, e que pode evoluir para a cegueira (HARTSKEERL et al.,
2004; LÉON et al., 2006).
De acordo com SAMAILLE (2001), a leptospirose eqüina pode ainda causar queda do
desempenho esportivo.
______________________
1
POONACHA, K.B. et al. The role of Leptospira Interrogas serovar Pomona type
Kennewicki as a cause of abortion and stillbirth in mares. In : International conference, 1994,
Tokyo, Japan. Proceedings...Tokyo: Equine Infections disease, 1994,VII. p.113-119
24
A infecção é considerada como importante causa de nascimento de crias fracas,
natimortalidade ou mortalidade neonatal e abortamento (comumente no 6º mês de gestação),
como seqüela comum após invasão sistêmica. O abortamento sem prévia doença clínica
também é comum (RADOSTITS et al., 2002).
A presença do agente no interior do globo ocular causa uveíte, com envolvimento da
úvea posterior (íris, corpo ciliar e coróide), córnea, retina e nervo óptico (HUNTER e HERR,
1994). Os sinais clínicos característicos são lacrimejamento aumentado, blefarospasmo,
fotofobia em graus variados, miose e catarata em casos mais avançados (GELLAT, 2003).
Segundo HONG et al. (1993) e HUNTER e HERR (1994) observam-se também a
ocorrência de febre, icterícia e morte por nefrite intersticial.
Na Argentina, PARMA et al. (1985) inocularam nove eqüinos adultos com 5,0 mL de
uma suspensão de uma mistura de leptospiras dos serovares Pomona, Tarassovi,
Icterohaemorrhagiae, Wolffi e Hardjo, pela via subcutânea. Oito animais apresentaram
anticorpos contra os cinco sorotipos inoculados. A única alteração clínica observada foi
opacidade da córnea na terceira semana pós-inoculação.
2.4.1 PATOLOGIA CLÍNICA
Os animais domésticos infectados por Leptospira interrogans podem apresentar
alterações sanguíneas de natureza hematológica e bioquímica que podem ser usadas para o
diagnóstico complementar da leptospirose (NAVARRO et al., 1981) possibilitando o
estabelecimento precoce da terapia adequada e minimizando a disseminação do agente no
meio ambiente (KOGIKA et al., 1990).
De acordo com SCHALM et al. (1975), na leptospirose o aumento da percentagem de
monócitos pode estar relacionado com a infecção crônica e o aumento dos níveis de
fibrinogênio plasmático pode ser um dado complementar para o diagnóstico laboratorial.
Estes dados foram confirmados por KEENAN et al. (1978) no sangue de caninos
experimentalmente infectados com o serovar Bataviae.
25
Na espécie bovina, SPRADROW e SEAWRIGHT (1963) encontraram pequena
alteração dos níveis de hemoglobina no sangue de bezerros experimentalmente infectados
com o serovar Pomona. Já SLEIGHT et al. (1964), verificaram alterações no leucograma, sem
qualquer alteração dos parâmetros bioquímicos.
MILLAR et al. (1977) relataram que níveis de proteína plasmática e de glicose em
ovinos experimentalmente infectados com o serovar Pomona estavam significativamente
aumentados. Resultados semelhantes foram encontrados no sangue de suínos infectados pelo
serovar Pomona por AZARYAN (1981) e por ÁVILA (1983). Ainda de acordo com ÁVILA
(1983), foi observada elevação nos percentuais de monócitos e níveis de bilirrubina direta em
suínos infectados.
Em cães naturalmente infectados com o serovar Icterohaemorrhagiae, Kogika et al.
(1987) observaram leucocitose, neutrofilia, monocitose, uremia e níveis aumentados de
creatinina sérica. Leucopenia é observada na fase leptospirêmica superaguda por intenso
recrutamento de polimorfonucleares pelos tecidos; que desenvolve para leucocitose com ou
sem desvio à esquerda; trombocitopenia; anemia regenerativa (por perda sanguínea) ou
anemia arregenerativa (por doença renal ou hepática crônica), sendo esta última, pouco
observada em cães acometidos pelo serovar Icterohaemorrhagiae (NELSON e COUTO,
2006). Leucócitos variam de acordo com o estágio e a severidade da doença (GREENE,
2004).
Hiponatremia, hipocloremia, hipocalemia, hiperfosfatemia, hipoalbuminemia,
hipocalcemia, azotemia, hiperbilirrubinemia, redução da concentração de dióxido de carbono
total e aumento da atividade da alanina transaminase, são anormalidades bioquímicas séricas
verificadas e que se desenvolvem por doença renal, hepática, perdas gastrintestinais ou
acidose (GREENE, 2004).
Segundo GREENE (2004), as infecções determinadas pelo serovar
Icterohaemorrhagiae resultam em lesões em diferentes órgãos, sobretudo nos tecidos hepático
e renal. Microscopicamente pode-se notar uma dissociação marcante dos hepatócitos, e
também um infiltrado linfocitário com grandes áreas de necrose ao centro, focos de
inflamação, presença de células de Kupffer aumentadas e eventualmente presença de células
apoptóticas (BALDWIN e AYKINS, 1987; MERIEN et al., 1998; NALLY et al., 2004,
26
YANG et al., 2006). As leptospiras localizam-se em sinusóides e canalículos biliares, levando
à colestase e provocando um aumento de bilirrubina sérica, contribuindo para o quadro de
icterícia (SILVA et al., 2002; GREENE, 2004). Observa-se aumento das transaminases
hepáticas, gama glutamil transferase e fosfatase alcalina (SILVA et al., 2002; PEREIRA et al.,
2005). Há uma extensa lesão hepática com posterior congestão e icterícia pré ou pós-hepática
(FREIRE, 2005).
Os cães com miosite podem apresentar a atividade da creatina quinase (CK)
aumentada uma vez que esta é um indicador altamente sensível e específico de lesão muscular
(LOPES et al., 2005). Também se observa hipofibrinogenemia e trombocitopenia em animais
com dano endotelial, como resultante de coagulação intravascular disseminada (CID)
(GREENE, 2004).
A infecção experimental de eqüinos por Leptospira interrogans é um assunto pouco
estudado. No Reino Unido, BRYANS (1955) inoculou bactérias do serovar Pomona em seis
eqüinos com idade entre oito e 22 anos e observou que a temperatura retal apresentou
elevação de 39,0ºC a 41,3ºC 48 horas após a inoculação e que esta febre persistiu por três a
cinco dias; os outros sinais clínicos observados foram anorexia, leve depressão e baixo grau
de icterícia, embora não tenham ocorrido alterações oftalmológicas. As alterações
hematológicas foram caracterizadas por leucocitose, neutrofilia, eosinopenia e linfopenia em
níveis significativos por dois a cinco dias. Cinco eqüinos apresentaram níveis elevados de
bilirrubina e dois revelaram albuminúria durante o estágio febril.
O fígado sintetiza a uréia como mecanismo para a excreção de amônia, que por sua
vez tem proteínas como principal fonte. Sendo assim, a formação de uréia depende da taxa de
catabolismo protéico. Uma vez formada, a uréia é carreada do fígado pelo sistema sanguíneo
e se difunde passivamente pelos líquidos corporais (BUSH, 1994), sendo excretada pelos rins
(KANEKO et al., 1997).
Inúmeras são as causas de doenças renais, com diferentes lesões glomerulares ou
tubulares, que podem causar aumento da uréia no plasma. Desidratação leve, dieta rica em
proteínas, catabolismo protéico aumentado e perfusão diminuída nos rins podem causar uma
azotemia pré-renal. Este aumento pode também estar relacionado a causas como obstrução do
27
fluxo de urina através dos ureteres, bexiga ou uretra, sendo então denominado azotemia pós-
renal (BURTIS e ASHWOOD, 1998).
A creatina é sintetizada no fígado, rins e pâncreas via reações enzimáticas, e é
transportada pelo sangue ao músculo, onde é fosforilada, tranformando-se em um composto
altamente energético chamado fosfocreatina. Durante o processo de contração muscular parte
da creatina livre, por reação não enzimática no músculo, transforma-se em creatinina
(KANEKO et al., 1997). A creatinina é liberada constantemente nos líquidos corporais,
portanto sofre menos influência de fatores exógenos e sua depuração é considerada um
indicador confiável da taxa de filtração do glomérulo renal (BURTIS e ASHWOOD, 1998).
Enzimas do citosol, mitocondriais e as associadas à membrana apresentam-se
aumentadas no soro nas várias formas de doença hepática existentes e são consideradas
anormalidades bioquímicas comuns nestes casos (NELSON e COUTO, 2006). De acordo com
a severidade do quadro clínico e evolução da doença o aumento da atividade dessas enzimas
pode variar (BURTIS e ASHWOOD, 1998). A alanina transaminase (ALT), a aspartato
transaminase (AST), a fosfatase alcalina (FA) e a gama glutamil transferase (GGT) são as
principais enzimas utilizadas para avaliação da função hepática (MEYER et al., 1995). A
elevação sérica de AST e ALT está relacionada com a saída destas enzimas do hepatócito
lesado (LASSEN, 2004), enquanto níveis aumentados de FA e GGT são sugestivos de
colestase (KANEKO et al., 1997).
A ALT está localizada no hepatócito principalmente no citosol, mas também na
mitocôndria (LOPES, BIONDO e SANTOS, 2007). A concentração de ALT nos hepatócitos
de eqüinos é baixa, conseqüentemente a atividade sérica da ALT nesta espécie não é útil para
detectar doença hepática. Quantidade moderada de ALT é encontrada em músculos de
eqüinos, havendo aumento moderado na sua atividade sérica na vigência de lesão muscular.
Nesta espécie, outras enzimas músculo-específicas como a creatina quinase (CK) são mais
utilizadas para diagnóstico de lesão muscular (THRALL, 2007).
A AST é uma enzima de vazamento presente em altas concentrações no músculo
esquelético, cardíaco, eritrócitos e fígado. Encontra-se livre no citoplasma, mas a maior parte
está associada à membrana mitocondrial dos hepatócitos (LASSEN, 2004; LOPES, BIONDO
e SANTOS, 2007). É considerada enzima de escolha para a detecção de rotina da lesão de
28
hepatócitos em eqüinos, nos quais se observa aumento da atividade sérica por necrose e lesão
subletal de hepatócitos e de células musculares (THRALL, 2007).
A FA é uma enzima sintetizada principalmente pelo fígado (mais precisamente pelos
hepatócitos e células epiteliais do ducto biliar), tecido ósseo (pelos osteoblastos), mucosa
gastro intestinal, e em menor grau pelos rins, placenta e baço (BUSH, 1994; KANEKO et al.,
1997; LOPES, BIONDO e SANTOS, 2007). Essa enzima pode ter sua atividade aumentada
no soro devido à liberação de fragmentos de membrana celular na circulação, um processo
que pode ser o resultado da fragmentação da membrana pelos ácidos biliares. A estase e o
contato prolongado dos ácidos biliares com os canalículos e epitélio dos canais biliares, que
ocorre nos casos de colestase, poderiam solubilizar e liberar a GGT e FA das membranas
citoplasmáticas (BURTIS e ASHWOOD, 1998).
A bilirrubina é um pigmento biliar, e quando no plasma deriva do metabolismo da
hemoglobina (LOPES, BIONDO e SANTOS, 2007). Isto ocorre quando hemácias adultas são
fagocitadas pelo sistema monocítico-fagocitário, gerando o composto heme, e este, ao sofrer
remoção da molécula de ferro, é convertido em bilirrubina. Esta bilirrubina formada é
chamada de bilirrubina não-conjugada ou indireta, e se encontra ligada à albumina para ser
transportada pela corrente sanguínea até o fígado. No fígado esta ligação com a albumina se
quebra e no interior do hepatócito a bilirrubina é conjugada ao ácido glicurônico para formar a
bilirrubina conjugada ou direta, sendo então secretada ativamente para o canalículo biliar e
posteriormente excretada na bile (CARLTON e McGAVIN, 1998; NELSON e COUTO,
2006).
A concentração aumentada de bilirrubina conjugada ou não-conjugada no sangue é
conhecida como hiperbilirrubinemia. Algumas causas de aumento na forma direta da
bilirrubina seriam deficiência na excreção por parte dos hepatócitos, obstrução do fluxo
hepático dentro do fígado, normalmente por processo inflamatório hepático, ou ainda por
obstrução extra-hepática, como uma compressão do ducto biliar. A forma indireta de
bilirrubina se mostra aumentada quando há um excesso de produção por processos
hemolíticos ou por falha hepática na conjugação com ácido glicurônico (BUSH, 1994).
O fígado é o único órgão responsável pela síntese da albumina, que corresponde a 35-
50% do total de proteínas séricas (LOPES, BIONDO e SANTOS, 2007). A degradação da
29
albumina ocorre no fígado, assim como em outros tecidos como músculos, rins e pele. A
albumina tem como funções básicas a manutenção da pressão oncótica plasmática, e o
transporte de substâncias na corrente sangüínea. Pouca albumina é armazenada no fígado, e a
sua concentração plasmática é determinada pela produção hepática, que normalmente está em
equilíbrio com a degradação (KANEKO et al., 1997). A hipoalbuminemia é observada em
várias doenças hepáticas e pode ser uma conseqüência da diminuição da síntese. Contudo,
outras enfermidades podem determinar este quadro pela perda da albumina como em
nefropatias e enterites severas (FREIRE, 2005).
Inúmeras globulinas que atuam na homeostasia são produzidas no fígado; sendo assim,
na vigência de um quadro de insuficiência hepática, pode-se observar hipoglobulinemia. Caso
a origem do dano hepático seja a infecção por Leptospira, os tecidos linfóides serão
estimulados a produzir e secretar imunoglobulinas em torno de sete a oito dias após o início
da doença. Desta forma, em casos hiperagudos ainda observa-se redução na fração globulínica
do soro (ABBAS; LICHTMAN, 2007).
2.4.2 TRATAMENTO E CONTROLE
De acordo com SELLNOW (1999), há um consenso entre clínicos e pesquisadores de
que a antibioticoterapia é o tratamento de escolha para os casos de leptospirose, ainda que não
haja, no momento, um protocolo fixo a ser seguido, sendo comum adaptar tratamentos
preconizados para outras espécies, com o uso de oxitetraciclina, estreptomicina ou penicilina.
De acordo com VASCONCELLOS (2000), do ponto de vista preventivo uma das
medidas a serem tomadas é a utilização racional de antibióticos que bloqueiem a eliminação
de leptospiras através da urina, sêmen e secreção vaginal. A estreptomicina aplicada por via
parenteral, usualmente na concentração de 25 mg/Kg de peso vivo, têm sido a medicação de
escolha. RADOSTITS (2002) ainda menciona a possibilidade de tratar animais infectados por
serovar de manutenção com diidroestreptomicina G (25 mg/Kg), durante um, três ou cinco
dias. Os esquemas de tratamento precisam ser revistos, incluindo a hipótese de emprego
integrado de tratamento e imunização (VASCONCELLOS, 2000).
30
A imunidade na leptospirose eqüina é baseada na resposta humoral. As vacinas são
importantes na redução da transmissão e manutenção da leptospirose (HEATH e JOHNSON,
1994) e as atualmente utilizadas são serovar-específicas. Assim, a vacinação contra um
determinado serovar nem sempre fornece proteção cruzada contra outros serovares, mas pode
interferir na reação de aglutinação microscópica (HAGIWARA, 2003). São compostas de
bacterinas (bactérias inteiras inativadas quimicamente) e induzem a imunidade pela
opsonização das bactérias, resultando na apresentação de antígenos de membrana -
lipopolissacarídeos e proteínas da membrana externa. Elas reduzem a gravidade da doença e a
sua prevalência, mas não impedem o desenvolvimento de estado de portador crônico nos
animais, porque nem sempre previne a instalação das leptospiras no tecido renal (GREENE,
2004).
Não há um completo entendimento sobre o mecanismo de imunidade protetora das
vacinas. O LPS parece conferir uma parte da imunidade humoral protetora (FAINE et al.,
2000; LEVETT, 2001), havendo também a participação da resposta celular (NAIMAN et al.,
2001). Acredita-se, no entanto, que a vacina não é capaz de prevenir a leptospirúria (BOLIN e
ALT, 2001), assim como não é capaz de proteger em casos de grande exposição à bactéria
(ANDRÉ-FONTAINE et al., 2003). Um dos desafios da pesquisa atual em leptospirose é
identificar frações ou subunidades bacterianas conservados, que confiram imunidade protetora
de longa duração e imunidade cruzada contra diversos serovares de leptospiras. Proteínas de
membrana externa ou Omps e lipoproteínas têm sido consideradas candidatos interessantes
para o desenvolvimento de novas vacinas (BRANGER et al., 2001; GAMBERINI et al., 2005;
YANG et al., 2006; SEIXAS et al., 2007; SILVA et al., 2007).
2.4.3 ASPECTOS ZOONÓTICOS
O homem é sempre um hospedeiro incidental no ciclo da leptospirose e não é adaptado
a nenhum serovar, sendo sensível à doença (Faine et al., 2000). O estreito contato entre
homem e animais aumenta as possibilidades de transmissão da doença especialmente para
profissionais de risco como veterinários (HEATH e JOHNSON, 1994; BATISTA et al.,
2004). Urina infectada, água contaminada por leptospiras ou hospedeiros reservatórios devem
ser evitados. Os alimentos devem ser lavados, bem como atenção especial aos cães infectados,
que devem ser manuseados com o uso de equipamentos de proteção individual. As superfícies
31
contaminadas devem ser lavadas com detergentes e desinfetantes (NELSON e COUTO,
2006).
Observam-se formas benignas com cura espontânea a formas agudas e graves, que
podem levar ao óbito. Os sintomas iniciais da doença humana são inespecíficos, como febre,
dores de cabeça e dores musculares. A doença pode evoluir para a leptospirose grave ou
Doença de Weil, com insuficiência renal aguda e icterícia, acompanhadas de hemorragias,
com letalidade de 5 a 25% (KO et al., 1999; YANG et al., 2006). São cada vez mais relatados
os casos de febre hemorrágica com acometimento pulmonar, caracterizando a Síndrome
Pulmonar Hemorrágica Severa (SPHS), a qual pode atingir taxas de letalidade de mais de
50% (TREVEJO et al., 1995; SEGURA et al., 2005; GOUVEIA et al., 2008).
As medidas sanitárias baseiam-se no controle dos roedores; limpeza do ambiente
incluindo remoção de resíduos sólidos e líquidos; restrição do acesso dos roedores a áreas
freqüentadas por animais e pelo homem e principalmente evitar coleções líquidas residuais
especialmente em épocas chuvosas, uma vez que a água contaminada é tida como principal
responsável pela disseminação das leptospiras; bem como quarentena para doentes
(JOUGLARD e BROD, 2000; NELSON e COUTO, 2006).
32
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho teve por finalidade contribuir para o conhecimento da
fisiopatogenia da leptospirose em eqüinos, de forma a detalhar seus sinais clínicos além das
alterações bioquímicas e hematológicas associadas a esta infecção.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Avaliar a ocorrência de problemas reprodutivos determinados por leptospirose em eqüinos.
b) Realizar avaliação individual dos animais sorologicamente reativos quanto ao exame
clínico, perfil bioquímico e hematológico.
c) Propor um programa de controle da infecção em eqüinos adequados à realidade verificada
em criatórios do Rio de Janeiro
33
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 DESENHO DO ESTUDO
No primeiro momento do estudo (Março de 2006), identificou-se um rebanho com
elevados índices de perdas reprodutivas (em torno de 30%), incluindo abortamentos (12%) e
natimortalidade (18%); e em seguida procedeu-se à colheita de sangue de todos os animais do
plantel para a realização de avaliação hematológica, bioquímica e sorológica, com o objetivo
de identificar alterações associadas à leptospirose. Após a análise dos parâmetros avaliados e
com base nas variáveis epidemiológicas observadas foi proposto e implantado um programa
de controle com associação de vacina, antimicrobianos e correção dos fatores
epidemiológicos associados. Um ano após a aplicação do programa de controle (Maio de
2007), nova análise clínica e sorológica foi realizada, avaliando-se os resultados do programa
aplicado.
4.2. ANIMAIS
Um plantel localizado na região serrana do Estado do Rio de Janeiro, município de
Duas Barras, com 140 éguas (entre receptoras e doadoras) e oito garanhões, da raça
Campolina, foi estudado em março de 2006. A propriedade estava situada em região com
constantes inundações e observou-se a presença de um lago natural, utilizado para atividades
34
diárias de exercício dos animais. Éguas vindas de outros plantéis eram constantemente
encaminhadas à fazenda para cobertura, sem a realização de quarentena ou exame sorológico
prévio. Os animais utilizados apresentavam idade média de cinco anos e bom escore de
condição corporal (APÊNDICE 1).
4.3 ANÁLISE CLÍNICA
Os animais utilizados na pesquisa foram submetidos à anamnese detalhada com enfoque no histórico
reprodutivo e clínico buscando identificar sinais sugestivos da doença. Em seguida realizou-se, após a colheita
das amostras sanguíneas, exame físico com a observância dos parâmetros de comportamento/atitude, estado
nutricional, apetite, pelagem, presença de ectoparasitos, classificação da secreção nasal e mucosas, turgor
cutâneo, retração de globo ocular, palpação de linfonodos, aferição de temperatura retal, pulso e tempo de
preenchimento capilar, além da ausculta digestiva, pulmonar e cardíaca (APÊNDICE 2).
4.4 ANÁLISE SOROLÓGICA
Amostras sanguíneas foram colhidas de todos os animais do plantel em tubos de vácuo através de
punção na veia jugular de cada animal, antes do exame físico. Em seguida, estas foram resfriadas e transportadas
até o laboratório, onde foram centrifugadas e o soro foi estocado em tubos plásticos do tipo Eppendorf
®
a -20º
para posterior análise.
O diagnóstico sorológico para leptospirose foi realizado de acordo com a recomendação técnica da
Organização Mundial de Saúde, pela técnica da soroaglutinação microscópica com antígenos vivos e leitura em
microscópio equipado com condensador de campo escuro, conforme LILENBAUM e SANTOS (1995).
Utilizou-se como antígenos a coleção do Laboratório de Bacteriologia Veterinária do Departamento de
Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal Fluminense, composta de 21 serovares distintos de
leptospiras, representando 16 sorogrupos (Tabela 1). Todas as amostras com atividade aglutinante em diluição
1:50 foram, posteriormente, testadas contra o antígeno reativo usando diluições em série de razão dois até que o
título mais alto fosse obtido, a fim de identificar o serovar infectante.
Tabela 1. Antígenos utilizados para o diagnóstico sorológico de leptospirose em eqüinos.
Sorogrupo Serovar Amostra de Referência
AUSTRALIS Australis Ballico
Bratislava Jez bratislava
AUTUMNALIS Autumnalis Akiyami A
Butembo Butembo
BALLUM Ballum Mus 127
Castellonis Castellon 3
BATAVIA Bataviae Van Tienen
CANICOLA Canicola Hond Utrecht IV
CELLEDONI Whitcombi Celledoni
CYNOPTERI Cynopteri 3522 C
GRIPPOTYPHOSA Grippotyphosa Moskva V
HEBDOMADIS Hebdomadis Hebdomadis
35
ICTEROHAEMORRHAGIAE Icterohaemorrhagiae RGA
Copenhageni M 20
JAVANICA Javanica Veldrat Batavia 46
PANAMA Panama CZ 214 K
POMONA Pomona Pomona
PYROGENES Pyrogenes Salinem
SEJROE Hardjo Hardjoprajitno
Wolffi 3705
TARASSOVI Tarassovi Perepelicin
36
Consideraram-se como reativas as amostras com título mínimo de 800 enquanto amostras com títulos de
200 e 400 foram consideradas fracamente reativas. Reações com títulos ≤100 foram consideradas inespecíficas e
estas amostras classificadas para o presente estudo como negativas.
4.5 ANÁLISE REPRODUTIVA
O exame do trato reprodutivo foi conduzido por palpação retal e ultra-sonografia. Diariamente, durante
a estação de monta, efetuou-se a palpação retal para identificar as estruturas do trato genital da reprodutora
(cérvix, útero e ovários). O exame ultra-sonográfico em tempo real foi realizado com um equipamento de ultra-
sonografia veterinária (Aloka 500 – equipado com transdutor 50 MHz). As estruturas previamente identificadas
foram registradas através de imagem formada na tela do ultra-som. Os folículos presentes no ovário e a
ecotextura do endométrio foram avaliados. As éguas doadoras de embriões foram examinadas ao longo de toda a
estação de monta, enquanto as éguas receptoras foram submetidas a exame somente no 15º, 45º, 90º, 180º e 270º
dias de gestação.
O exame do sêmen foi realizado de acordo com KENNEY et al. (1983) e PIMENTEL (1989). Os
garanhões tiveram o sêmen obtido no decorrer do período em que estiveram em serviço, sendo analisados
semanalmente os parâmetros de volume, percentual de motilidade, vigor e concentração (espermograma). A
avaliação da morfologia espermática foi realizada através de preparações a fresco no início, meio e fim da
estação de monta, correspondendo aos meses de agosto, janeiro e maio, de acordo com o manejo adotado no
haras, com o objetivo de identificar possíveis alterações associadas a reação sorológica.
4.6 ANÁLISE HEMATOLÓGICA
Para a determinação dos parâmetros sanguíneos as amostras foram colhidas em tubos
com e sem a adição de anticoagulante EDTA (etileno diamina tetra-acético), mantidos em
temperatura de refrigeração até a chegada ao laboratório para análise (até 24 horas), além da
confecção de esfregaço sangüíneo imediatamente após a colheita do sangue.
37
Realizou-se hemograma completo de todos os animais envolvidos nos grupos
experimentais, composto de eritrograma (hematimetria, hemoglobina, volume globular,
volume globular médio, concentração hemoglobínica globular média), leucograma
(leucometria global e leucometria específica) e plaquetometria, além da determinação de
proteína plasmática e fibrinogênio. Para tal finalidade foi utilizado o contador automático de
células da marca Coulter T 890 (Fabricante Beckman Inc) e a contagem diferencial de
leucócitos foi feita pelo veterinário em microscópio óptico.
4.7 ANÁLISE BIOQUÍMICA
Foram realizados testes bioquímicos buscando identificar possíveis alterações hepática, renal e
muscular, conforme MEYER et al. (1995), sendo:
.Perfil hepático - Determinação da atividade sérica das enzimas aspartato aminotransferase (AST),
gamaglutamiltransferase (GGT), fosfatase alcalina (FA) além da dosagem de bilirrubina total (BT), direta (BD) e
indireta (BI).
.Perfil renal - uréia e creatinina.
.Perfil muscular – creatinaquinase (CK), lactato-desidrogenase (LDH).
As dosagens bioquímicas das amostras sororeativas foram realizadas no Laboratório de Patologia
Clínica do Centro de Apoio e Diagnóstico Veterinário. Os testes foram realizados em equipamento de
bioquímica automatizado modelo Ciba Express 550 (Ciba Corning Inc.) utilizando-se kits bioquímicos da marca
Biotecnica
®
sendo o processamento das amostras realizado de acordo com as recomendações do fabricante.
Para a determinação de uréia utilizou-se o método enzimático ultra-violeta baseado na
hidrólise da uréia pela
urease formando a amônia. A creatinina foi determinada através da
reação com o
picrato alcalino. O método utilizado para determinação das transaminases foi o
cinético
ultra-violeta, baseado na transferência do grupo amina da alanina para o
cetoglutarato, com formação de glutamato e piruvato (ALT) e na transferência do grupo
amina do ácido aspártico para o cetoglutarato, com formação de glutamato e oxalacetato
(AST)
.
A
fosfatase alcalina foi determinada pela metodologia Bowers e McComb modificado,
a partir da hidrólise do
p-nitrofenilfosfato liberando p-nitrofenol e fosfato inorgânico. O
método utilizado para determinação da GGT foi a de
Szasz modificado, que se baseia na ação
desta enzima de transferência do grupamento
glutamil da gamaglutamil p-nitroanilide para a
glicil-glicina, formando a gamaglutamilglicilglicina e p-nitroanilina.
38
A atividade da enzima lactato desidrogenase foi determinada pelo método cinético
baseado na reação de catálise do piruvato em lactato e NAD+. Já a dosagem da atividade da
enzima creatinaquinase foi baseada na reação de catálise do piruvato em lactato. A bilirrubina
foi dosada por
diazotização e formação de azobilirrubina vermelha. A bilirrubina direta
(
diglicurônide) foi dosada em meio aquoso, enquanto a total (direta e indireta) foi dosada por
ação de potente
solubilizador de ação catalisadora.
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Com base nos dados dos grupos analisados (negativo, fraco reativo e reativo) foram obtidos os
resultados relacionados às análises estatística descritiva (freqüências total e relativa, média, erro-padrão,
coeficiente de variação) e inferenciais (intervalo de confiança, comparação de médias pelo teste t de Student),
para as variáveis hematológicas e bioquímicas.
Ainda, com objetivo de verificar se os animais classificados como suspeitos para leptospirose
apresentam maior semelhança das variáveis hematológicas e bioquímicas com o grupo negativo ou positivo, foi
realizada uma comparação empírica das freqüências de animais abaixo e acima dos valores de referência, para
verificar com qual tipo de distribuição o grupo suspeito mais se assemelhava.
As análises foram realizadas com o aplicativo SAEG (versão 9.1) e com o aplicativo Microsoft ®
Office Excel (versão 2003), no caso de obtenção das freqüências relativas.
39
5 RESULTADOS
5.1 AVALIAÇÃO CLÍNICA
Considerando-se os parâmetros analisados, a saber: comportamento/atitude, estado
nutricional, apetite, pelagem, presença de ectoparasitos, classificação da secreção nasal e
mucosas, turgor cutâneo, retração de globo ocular, palpação de linfonodos, aferição de
temperatura retal, pulso e tempo de preenchimento capilar, além da ausculta digestiva,
pulmonar e cardíaca, os animais utilizados no presente estudo não apresentaram alterações
evidentes no momento da avaliação clínica. Os casos de uveíte considerados na tabela 3 foram
registrados pelo serviço médico veterinário do haras.
5.2 ANÁLISE SOROLÓGICA
Dentre as cento e quarenta e oito amostras testadas, quarenta (40/148 - 27,0%) foram
reativas com títulos ≥ 800. Quarenta e duas amostras (42/148 - 28,4%) apresentaram títulos de
200 ou 400, e foram consideradas fracamente reativas. Sessenta e seis cavalos (66/148 -
44,6%) apresentaram títulos ≤100 e consequentemente classificados como não reativos. De
acordo com a literatura (LILENBAUM, 1998) e considerando que em áreas tropicais a
leptospirose pode ser endêmica, o ponto de corte do título adotado foi de 200. Portanto,
40
oitenta e dois (82/148 - 55,4%) cavalos foram classificados como sororeativos para
leptospirose.
Em relação à distribuição entre os serovares, Bratislava foi o mais freqüente,
correspondendo a trinta e sete amostras com altos títulos e trinta e cinco fracamente reativas,
totalizando assim setenta e duas (72/82 - 87,8%) amostras com títulos ≥200. Reatividade
perante os serovares Icterohaemorrhagiae e Australis também foi observada, em seis (6/82 -
7,3%) e quatro (4/82 - 4,9%) amostras com títulos ≥200, respectivamente (Gráfico 1 e Tabela
2). Dentre as amostras com títulos baixos (≤100), a distribuição dos serovares foi similar, com
ampla predominância de Bratislava (52/66 - 78,8%), seguida de Icterohaemorrhagiae (10/66 -
15,1%) e de Australis (4/66 - 6,1%), conforme Gráfico 2 e Tabela 2.
41
Tabela 2. Distribuição das reações de soroaglutinação microscópica para diagnóstico de
leptospirose em 148 soros de eqüinos de um plantel no Rio de Janeiro, Brasil.
Título
Serovar
≥800 200 ou 400 ≤100 TOTAL
Bratislava 37 35 52
124
Icterohaemorrhagiae 2 4 10
16
Australis 1 3 4
8
TOTAL 40 42 66 148
42
(72/82)87,8%
(4/82)4,9%
(6/82)7,3%
Bratislava
Icterohaemorrhagiae
Australis
Gráfico 1: Distribuição das reações de soroaglutinação microscópica para diagnóstico de
leptospirose em 148 soros de eqüinos reativos (títulos≥ 200) de um plantel no Rio de
Janeiro, Brasil, no primeiro momento do estudo (2006).
43
(52/66)78,8%
(10/66)15,1%
(4/66)6,1%
Bratislava
Icterohaemorrhagiae
Australis
Gráfico 2: Distribuição das reações de soroaglutinação microscópica para diagnóstico de
leptospirose em 148 soros de eqüinos fracamente reativos (títulos ≤ 100) de um plantel
no Rio de Janeiro, Brasil, no primeiro momento do estudo (2006).
44
A partir dos resultados sorológicos foi proposto um protocolo de tratamento e controle
da doença no plantel com base nas variáveis epidemiológicas presentes na propriedade e no
conhecimento de aspectos imunológicos. Instituiu-se em todos os animais do plantel um
programa de vacinação com a utilização de vacina (bacterina) preparada com cepa de
Bratislava formolizada no dia zero (Instituto de Pesquisas Aplicadas - IPEVE) e com a
aplicação de dose de reforço após 60 dias. Adicionalmente, todos os animais reativos foram
tratados com dose única de diidroestreptomicina (25mg/kg) no 15º dia. O teste sorológico
negativo passou a ser exigência para o ingresso de animais na fazenda. Buscando minimizar a
exposição dos animais ao agente adotaram-se medidas ambientais consideradas de suma
importância para a descontinuidade da cadeia epidemiológica, tais como a drenagem de
algumas áreas alagadas e a interdição do lago utilizado para exercício dos animais.
No segundo momento do estudo, realizado 13 meses após a implementação do
programa de controle baseado em antibioticoterapia e vacinação específica (Abril de 2007),
selecionou-se randomicamente 31 fêmeas para testagem sorológica e nova avaliação
reprodutiva. Nesta ocasião, somente dois animais (6,4%) apresentaram títulos ≥800 enquanto
nove (29%) apresentaram títulos de 200 ou 400. Os restantes 20 animais (64,9 %)
apresentaram reações ≤100, ou seja, reações fracas que os caracterizaram como
soronegativos.
5.3 ANÁLISE REPRODUTIVA
No momento do primeiro exame (março de 2006), o plantel apresentava uma alta ocorrência de
abortamentos (12%), além de outros problemas reprodutivos tais como morte embrionária (10%) e morte
neonatal (8%), totalizando prejuízos reprodutivos, ou seja, insucesso reprodutivo nos diversos níveis, em torno
de 30%. Abortos apresentavam icterícia e hepatomegalia, com fígados friáveis.
Considerando-se o conjunto de alterações que levam a baixa eficiência reprodutiva,
verificou-se, dentre as éguas utilizadas neste estudo, durante os exames ultrasonográficos, a
ocorrência de 35,79% de abortamento, 12,26% endometrites, 10,13% de natimortalidade,
6,25% de reabsorção embrionária e 2,13% de infertilidade (éguas que não emprenharam
durante a estação de monta).
A análise comparativa dos parâmetros reprodutivos do plantel nos dois momentos do estudo revelou
redução no índice de abortamento de 12% para 4%, da morte embrionária de 10% para 2% e da morte neonatal
de 8% para 1%, totalizando 7% de prejuízos reprodutivos, perante os 30% observados antes da implementação
do programa de controle (Tabela 3 e Gráfico 3). Os abortos verificados em abril de 2007 não mais apresentavam
icterícia, hepatomegalia ou fígados friáveis.
45
No que se refere ao espermograma, os garanhões não apresentaram alterações dignas de nota e que
pudessem ser associados à sororeatividade para leptospirose.
46
Tabela 3. Parâmetros clínicos e reprodutivos observados em plantel com 148 eqüinos
durante e após diagnóstico de leptospirose no Rio de Janeiro, Brasil.
Março 2006 Abril 2007
% Morte neonatal 8 1
% Morte embrionária 10 2
% Abortamento 12 4
% Prejuízos reprodutivos 30 7
Uveítes (novos casos) 16 2
47
0
5
10
15
20
25
30
35
% Morte N
e
on
a
t
a
l
% Mo
r
te E
mb
r
i
o
n
á
r
i
a
% Abortamento
%
Pre
j
u
ízo R
e
pro
d
ut
i
v
o
Uv
e
ítes
Parâmetros avaliados
Percentual
mar/06
abr/07
Gráfico 3: Parâmetros clínicos e reprodutivos observados em plantel com 148 eqüinos
durante e após diagnóstico de leptospirose no Rio de Janeiro, Brasil.
48
5.4 ANÁLISE HEMATOLÓGICA E BIOQUÍMICA
Inicialmente, procurou-se estabelecer uma referência específica para os animais da região estudada, uma
vez que valores adotados como referência pela literatura foram obtidos a partir de grupos de animais oriundos de
outros locais e com sistemas de produção diferenciados. Para tal, obteve-se o intervalo de confiança (α=0,05) a
partir dos valores dos animais do grupo negativo para leptospirose (Quadro 1). A seguir, com objetivo de validar
estes intervalos como nova referência, a média do grupo negativo foi comparada com os limites inferior e
superior encontrados na literatura, sendo então aplicado o teste t de Student (Quadro 2). Consideram-se como
novos valores-referência aqueles cuja média não diferiu significativamente de um dos limites. Nas variáveis em
que as médias diferiram de ambos os limites apresentados pela literatura, adotou-se, para as análises posteriores,
o valor-referência da literatura (RADOSTITS, 2002).
Para identificação das variáveis bioquímicas e hematológicas que melhor indicam positividade para a
doença em questão, foram comparadas, pelo teste t de Student, as médias do grupo positivo com um dos dois
limites dos valores-referência. Caso a média do grupo positivo estivesse dentro da faixa dos valores referência,
considerou-se que não havia diferença estatística. Caso a média dos animais positivos fosse maior do que os
valores-referência, foi realizada a comparação com o limite superior. No caso da média dos acometidos pela
doença ser menor do que os valores de referência procedeu-se a comparação com o limite inferior (Quadro 3).
As variáveis cujas médias do grupo positivo não apresentaram diferença em relação aos valores de
referência, procedeu-se à comparação empírica das freqüências de animais abaixo e acima dos valores de
referência (Quadro 4).
Quadro 01: Resultados (média, erro-padrão, coeficiente de variação e intervalos de confiança a 5%) das análises
bioquímicas e hematológicas do grupo negativo
VARIÁVEL X ± s(X) CV (%) INTERVALO DE
CONFIANÇA
UREIA 37,16 ± 2,01 30,1 33,06 a 41,26
CREATININA 0,8742 ± 0,0965 61,5 0,6773 a 1,0710
AST 320,2 ± 8,1 14,0 303,8 a 336,6
FAL 283,2 ± 18,5 36,4 245,3 a 321,0
GGT 17,44 ± 1,17 37,3 15,05 a 19,82
ALT 13,10 ± 1,02 43,5 11,01 a 15,19
BT 0,7968 ± 0,0693 48,4 0,6553 a 0,9382
BD 0,2871 ± 0,0307 59,5 0,2245 a 0,3497
BI 0,5032 ± 0,0655 72,5 0,3696 a 0,6368
LDH 699,6 ± 34,4 27,4 629,4 a 769,8
CK 393,7 ± 24,9 35,2 343,0 a 444,5
HEMATIMETRIA 7,565 ± 0,204 15,0 7,148 a 7,981
HB 11,37 ± 0,30 14,7 10,76 a 11,99
VG 33,29 ± 0,88 14,8 31,49 a 35,10
VGM 44,16 ± 0,59 7,4 42,96 a 45,36
49
CHGM 34,20 ± 0,21 3,4 33,78 a 34,63
PLAQUETAS 324,4 ± 41,4 71,1 239,9 a 408,9
PTNPLASMÁTICA 7,574 ± 0,127 9,4 7,314 a 7,834
FIBRINOGÊNIO 351,6 ± 34,7 54,9 280,9 a 422,3
LEUCOMETRIA 11906,5 ± 515,0 24,1 10855,9 a 12957,1
BASÓFILOS(RELATIVO) 0,6129 ± 0,1651 150,0 0,2761 a 0,9497
BASÓFILOS(ABSOLUTO) 62,68 ± 16,65 147,9 28,71 a 96,64
EOSINÓFILOS(RELATIVO) 6,097 ± 0,797 72,8 4,471 a 7,723
EOSINÓFILOS(ABSOLUTO) 706,3 ± 91,8 72,3 519,0 a 893,5
BASTAO(RELATIVO) 0,0323 ± 0,0323 556,8 - 0,0335 a 0,0981
BASTAO(ABSOLUTO) 2,419 ± 2,419 556,8 - 2,516 a 7,355
SEGMENTADOS(RELATIVO) 41,94 ± 2,00 26,6 37,85 a 46,03
SEGMENTADOS(ABSOLUTO) 4897,6 ± 263,8 30,0 4359,4 a 5435,8
LINFÓCITOS(RELATIVO) 49,58 ± 2,41 27,1 44,65 a 54,51
LINFÓCITOS(ABSOLUTO) 6002,2 ± 462,8 42,9 5058,2 a 6946,3
MONOCITOS(RELATIVO) 1,710 ± 0,263 85,7 1,173 a 2,246
MONÓCITOS(ABSOLUTO) 210,4 ± 34,3 90,8 140,4 a 280,4
ALT - alanina transaminase; AST - aspartato transaminase; BD - bilirrubina direta; BI - bilirrubina indireta; BT -
bilirrubina total; CHGM – concentração hemoglobínica globular media; CK - creatina quinase; FA - fosfatase
alcalina; GGT - gama glutamil transferase; HB – hemoglobina; LDH - lactato-desidrogenase; VG – volume
globular; VGM - volume globular médio; CHGM – concentração hemoglobínica globular media.
50
Quadro 02: Resultados da comparação estatística, pelo teste t de Student, entre os valores referência da literatura,
com as médias do grupo negativo, para validação dos intervalos de confiança (IC)
Valores referência da
literatura
Variável
limite
inferior
limite
superior
Média
(grupo
negativo)
Conclusão
estatística
UREIA 10 24 37,16 diferente
CREATININA 0,9 1,9 0,8742 dentro do IC
AST 220 600 320,2 dentro do IC
FAL 140 400 283,2 dentro do IC
GGT 4 44 17,44 dentro do IC
ALT 3 23 13,1 dentro do IC
BT 1 2 0,7968 diferente
BD 0 0,4 0,2871 dentro do IC
BI 1 1,6 0,5032 diferente
LDH 160 410 699,6 diferente
CK 145 380 393,7 dentro do IC
HEMATIMETRIA 6,8 12,9 7,565 dentro do IC
HB 11 19 11,37 dentro do IC
VG 32 53 33,29 dentro do IC
VGM 37 58,5 44,16 dentro do IC
CHGM 31 38,6 34,2 dentro do IC
PLAQUETAS 100 350 324,4 dentro do IC
PTNPLASMÁTICA 6 7,7 7,574 dentro do IC
FIBRINOGÊNIO 200 400 351,6 dentro do IC
LEUCOMETRIA 5400 14300 11906,5 dentro do IC
BASOFILOS(RELATIVO) 0,6129
BASOFILOS(ABSOLUTO) 0 200 62,68 dentro do IC
EOSINÓFILOS(RELATIVO) 6,097
EOSINÓFILOS(ABSOLUTO) 0 1000 706,3 dentro do IC
BASTAO(RELATIVO) 0,0323
BASTAO(ABSOLUTO) 0 100 2,419 dentro do IC
SEGMENTADOS(RELATIVO) 41,94
SEGMENTADOS(ABSOLUTO) 2260 8580 4897,6 dentro do IC
LINFÓCITOS(RELATIVO) 49,58
LINFÓCITOS(ABSOLUTO) 1500 7700 6002,2 dentro do IC
MONOCITOS(RELATIVO) 1,71
MONOCITOS(ABSOLUTO) 0 1000 210,4 dentro do IC
ALT - alanina transaminase; AST - aspartato transaminase; BD - bilirrubina direta; BI - bilirrubina indireta; BT -
bilirrubina total; CHGM – concentração hemoglobínica globular media; CK - creatina quinase; FA - fosfatase
alcalina; GGT - gama glutamil transferase; HB – hemoglobina; LDH - lactato-desidrogenase; VG – volume
globular; VGM - volume globular médio; CHGM – concentração hemoglobínica globular media.
51
Quadro 03: Valores definidos como referência para análises dos grupos positivo e suspeito
VARIÁVEL LIM_INF LIM_SUP FONTE:
UREIA 10 24 RADOSTITS (2002)
CREATININA 0,6773 1,071 presente trabalho
AST 303,8 336,6 presente trabalho
FAL 245,3 321 presente trabalho
GGT 15,05 19,82 presente trabalho
ALT 11,01 15,19 presente trabalho
BT 1 2 RADOSTITS (2002)
BD 0,2245 0,3497 presente trabalho
BI 1 1,6 RADOSTITS (2002)
LDH 160 410 RADOSTITS (2002)
CK 343 444,5 presente trabalho
HEMATIMETRIA 7,148 7,981 presente trabalho
HB 10,76 11,99 presente trabalho
VG 31,49 35,1 presente trabalho
VGM 42,96 45,36 presente trabalho
CHGM 33,78 34,63 presente trabalho
PLAQUETAS 239,9 408,9 presente trabalho
PTNPLASMÁTICA 7,314 7,834 presente trabalho
FIBRINOGÊNIO 280,9 422,3 presente trabalho
LEUCOMETRIA 10855,9 12957,1 presente trabalho
BASOFILOS (RELATIVO) 0,2761 0,9497 presente trabalho
BASOFILOS (ABSOLUTO) 28,71 96,64 presente trabalho
EOSINÓFILOS(RELATIVO) 4,471 7,723 presente trabalho
EOSINÓFILOS (ABSOLUTO) 519 893,5 presente trabalho
BASTAO(RELATIVO) -0,0335 0,0981 presente trabalho
BASTAO (ABSOLUTO) -2,516 7,355 presente trabalho
SEGMENTADOS(RELATIVO) 37,85 46,03 presente trabalho
SEGMENTADOS(ABSOLUTO) 4359,4 5435,8 presente trabalho
LINFÓCITOS(RELATIVO) 44,65 54,51 presente trabalho
LINFÓCITOS (ABSOLUTO) 5058,2 6946,3 presente trabalho
MONOCITOS(RELATIVO) 1,173 2,246 presente trabalho
MONOCITOS (ABSOLUTO) 140,4 280,4 presente trabalho
ALT - alanina transaminase; AST - aspartato transaminase; BD - bilirrubina direta; BI - bilirrubina indireta; BT -
bilirrubina total; CHGM – concentração hemoglobínica globular media; CK - creatina quinase; FA - fosfatase
alcalina; GGT - gama glutamil transferase; HB – hemoglobina; LDH - lactato-desidrogenase; VG – volume
globular; VGM - volume globular médio; CHGM – concentração hemoglobínica globular media.
52
Quadro 04: Comparação, pelo teste t de Student, entre as médias das variáveis bioquímicas e
hematológicas do grupo positivo com os valores referência (VR)
VARIÁVEL VALORES
REFERÊNCIA
MÉDIA
(Grupo
Positivo)
DIFERENÇA
ESTATÍSTICA
UREIA 33,06 a 41,26 (mg/dl) 39,54 ns (dentro do VR)
CREATININA 0,6773 a 1,0710(mg/dl) 1,09 ns
AST 303,8 a 336,6(UI/l) 317,46 ns (dentro do VR)
FAL 245,3 a 321,0(UI/l) 350,40 ns
GGT 15,05 a 19,82(UI/l) 18,31 ns (dentro do VR)
ALT 11,01 a 15,19(UI/l) 17,46 ns
BT 0,6553 a 0,9382(mg/dl) 1,06 ns
BD 0,2245 a 0,3497(mg/dl) 0,40 ns
BI 0,3696 a 0,6368(mg/dl) 0,63 ns (dentro do VR)
LDH 629,4 a 769,8(UI/l) 763,77 ns (dentro do VR)
CK 343,0 a 444,5(UI/l) 373,60 ns (dentro do VR)
HEMATIMETRIA
7,148 a 7,981(x10
6
/µl)
7,34 ns (dentro do VR)
HB 10,76 a 11,99g/dl 10,74 ns (dentro do VR)
VG 31,49 a 35,10(%) 31,70 ns (dentro do VR)
VGM 42,96 a 45,36 (fl) 43,16 ns (dentro do VR)
CHGM 33,78 a 34,63(g/dl) 33,45 ns
PLAQUETAS
239,9 a 408,9(x10
6
/µ)
388,34 ns (dentro do VR)
PTNPLASMÁTICA 7,314 a 7,834 (g/dl) 7,43 ns (dentro do VR)
FIBRINOGÊNIO 280,9 a 422,3 (mg/dl) 308,57 ns (dentro do VR)
LEUCOMETRIA
10855,9 a 12957,1 (/ µl)
13977,14 ns
BASÓFILOS (R) 0,2761 a 0,9497 0,34 ns (dentro do VR)
BASÓFILOS (A)
28,71 a 96,64(/ µl)
42,54 ns (dentro do VR)
EOSINÓFILOS (R) 4,471 a 7,723 4,49 ns (dentro do VR)
EOSINÓFILOS (A)
519,0 a 893,5(/ µl)
558,14 ns (dentro do VR)
BASTAO (R) - 0,0335 a 0,0981
BASTAO (A)
- 2,516 a 7,355/ µl
SEGMENTADOS (R) 37,85 a 46,03 42,17 ns (dentro do VR)
SEGMENTADOS (A)
4359,4 a 5435,8/ µl
5918,34 ns
LINFÓCITOS (R) 44,65 a 54,51 51,31 ns (dentro do VR)
LINFÓCITOS (A)
5058,2 a 6946,3/ µl
7215,34 ns
MONÓCITOS (R) 1,173 a 2,246 1,69 ns (dentro do VR)
MONÓCITOS (A)
140,4 a 280,4/ µl
237,06 ns (dentro do VR)
ALT - alanina transaminase; AST - aspartato transaminase; BD - bilirrubina direta; BI - bilirrubina indireta; BT -
bilirrubina total; CHGM – concentração hemoglobínica globular media; CK - creatina quinase; FA - fosfatase
alcalina; GGT - gama glutamil transferase; HB – hemoglobina; LDH - lactato-desidrogenase; VG – volume
globular; VGM - volume globular médio; CHGM – concentração hemoglobínica globular media; (A) - absoluto;
(R) – relativo.
53
Serão apresentados a seguir os resultados referentes à freqüência (%) de indivíduos do
grupo positivo com valores das variáveis bioquímicas e hematológicas acima, dentro ou
abaixo dos Intervalos de Confiança propostos no presente estudo. (Quadro 05).
Como se pode perceber, uma alta concentração de creatinina pode ser considerada
como um bom indicador de positividade, uma vez que a média observada no grupo positivo
(1,09) está acima do intervalo de confiança do grupo negativo, e existe uma assimetria da
distribuição dos dados, com nítida predominância relativa (60%) dos animais com valores
acima do limite superior do IC.
Observamos ainda no quadro 05 que a dosagem de bilirrubinas séricas evidenciou uma
elevação da concentração de BT (1,06) e BD (0,40) na média dos animais sororeativos (grupo
positivo). Pode-se constatar ainda que existe uma assimetria da distribuição dos dados, com
nítida predominância relativa (54,3% e 51,4%, respectivamente) dos animais com valores
acima do limite superior do IC. Por outro lado, a variável BI não representa indicador
confiável para identificação do grupo positivo. Além da média do grupo positivo (0,63) estar
dentro do IC (0,3696 a 0,6368), existe uma distribuição relativamente homogênea dos animais
com valores abaixo, dentro e acima do IC (37,1; 28,6; 34, 3, respectivamente).
O grupo positivo apresentou a média da atividade enzimática de fosfatase alcalina
(350,40) acima do intervalo de confiança do grupo negativo, bem como uma assimetria da
distribuição dos dados, com nítida predominância relativa (51,4%) dos animais com valores
acima do limite superior do IC.
Em relação à atividade enzimática de ALT, encontrou-se elevação do valor médio do
grupo positivo (17,46) em comparação com o intervalo de confiança do grupo negativo, e
ainda 54,3% dos animais com valores acima do limite superior do IC.
Para os demais parâmetros bioquímicos, a média do grupo positivo estava dentro do
intervalo de confiança do grupo negativo, estabelecido como valor de referência para este
estudo.
Os achados hematológicos referentes à comparação das médias do grupo positivo em
relação ao grupo negativo também podem ser evidenciados através do Quadro 05. Percebe-se
que as médias do grupo positivo para os dados de leucometria total (13977,14), segmentados
54
(5918,34) e linfócitos (7215,34) estavam acima do intervalo de confiança do grupo negativo,
com predominância relativa dos animais com valores acima do limite superior do intervalo de
confiança 57,1%, 45,7% e 62,9%, respectivamente.
Para os demais parâmetros hematológicos, a média do grupo positivo estava dentro do
intervalo de confiança do grupo negativo, estabelecido como valor de referência para este
estudo.
Na Figura 01, observa-se que, quanto aos parâmetros bioquímicos creatinina, AST,
FA, GGT, ALT, BT, BD, os animais classificados como suspeitos para leptospirose tem
distribuição semelhante ao do grupo considerado positivo, tanto no que se refere à freqüência
dos que apresentam valor abaixo do IC, quanto dos que possuem valores acima do valor
referência.
Quanto aos demais parâmetros analisados não foi verificada distribuição semelhante
nem ao grupo positivo e nem ao grupo suspeito.
55
Quadro 05 - Freqüência (%) de indivíduos do grupo positivo com valores das variáveis
bioquímicas e hematológicas acima, dentro ou abaixo dos Intervalos de Confiança
Variável Intervalo de
confiança
Média
(grupo
positivo)
Comparação Abaixo
(%)
No IC
(%)
Acima
(%)
UREIA 33,06 a 41,26 39,54 (=) 17,1 40,0 42,9
CREATININA 0,6773 a 1,0710 1,09 (>) 28,6 11,4 60,0
AST 303,8 a 336,6 317,46 (=) 42,9 22,9 34,3
FAL 245,3 a 321,0 350,40 (>) 22,9 25,7 51,4
GGT 15,05 a 19,82 18,31 (=) 28,6 34,3 37,1
ALT 11,01 a 15,19 17,46 (>) 14,3 31,4 54,3
BT 0,6553 a 0,9382 1,06 (>) 25,7 20,0 54,3
BD 0,2245 a 0,3497 0,40 (>) 34,3 14,3 51,4
BI 0,3696 a 0,6368 0,63 (=) 37,1 28,6 34,3
LDH 629,4 a 769,8 763,77 (=) 20,0 34,3 45,7
CK 343,0 a 444,5 373,60 (=) 54,3 20,0 25,7
HEMATIMETRIA 7,148 a 7,981 7,34 (=) 40,0 31,4 28,6
HB 10,76 a 11,99 10,74 (=) 51,4 11,4 37,1
VG 31,49 a 35,10 31,70 (=) 42,9 31,4 25,7
VGM 42,96 a 45,36 43,16 (=) 42,9 28,6 28,6
CHGM 33,78 a 34,63 33,45 (<) 65,7 11,4 22,9
PLAQUETAS 239,9 a 408,9 388,34 (=) 42,9 20,0 37,1
PTNPLASM 7,314 a 7,834 7,43 (=) 37,1 45,7 17,1
FIBRINOGÊNIO 280,9 a 422,3 308,57 (=) 34,3 57,1 8,6
LEUCOMETRIA 10855,9 a 12957,1 13977,14 (>) 28,6 14,3 57,1
BASOFILOS (R) 0,2761 a 0,9497 0,34 (=) 82,9 0,0 17,1
BASOFILOS (A) 28,71 a 96,64 42,54 (=) 82,9 2,9 14,3
EOSINÓFILOS (R) 4,471 a 7,723 4,49 (=) 60,0 25,7 14,3
EOSINÓFILOS (A) 519,0 a 893,5 558,14 (=) 57,1 25,7 17,1
BASTAO (R) - 0,0335 a 0,0981 0,0 0,0 0,0
BASTAO(A) - 2,516 a 7,355 0,0 0,0 0,0
SEGM (R) 37,85 a 46,03 42,17 (=) 34,3 37,1 28,6
SEGM (A) 4359,4 a 5435,8 5918,34 (>) 34,3 20,0 45,7
LINFÓCITOS (R) 44,65 a 54,51 51,31 (=) 25,7 37,1 37,1
LINFÓCITOS (A) 5058,2 a 6946,3 7215,34 (>) 25,7 11,4 62,9
MONOCITOS (R) 1,173 a 2,246 1,69 (=) 68,6 11,4 20,0
MONOCITOS (A) 140,4 a 280,4 237,06 (=) 37,1 31,4 31,4
ALT - alanina transaminase; AST - aspartato transaminase; BD - bilirrubina direta; BI - bilirrubina indireta; BT -
bilirrubina total; CHGM – concentração hemoglobínica globular media; CK - creatina quinase; FA - fosfatase
alcalina; GGT - gama glutamil transferase; HB – hemoglobina; LDH - lactato-desidrogenase; VG – volume
globular; VGM - volume globular médio; CHGM – concentração hemoglobínica globular media; SEGM –
segmentados; (A) - absoluto; (R) – relativo.
56
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
UREIA*CREATASTFALGGTALTBT*BDBI*
ABAIXO DO IC ACIMA DO IC
Figura 01 - Freqüência relativa (%) de animais com valores das variáveis bioquímicas e
hematológicas abaixo, dentro e acima dos valores referência (Intervalo de confiança – IC).
57
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
NEGATIVO
SUSPEITO
POSITIVO
LDH*CKHEMATIMHBVGVGMCHGMPLAQPTNPLASMFIBRIN
ABAIXO DO IC ACIMA DO IC
Figura 01 - Freqüência relativa (%) de animais com valores das variáveis bioquímicas e
hematológicas abaixo, dentro e acima dos valores referência (Intervalo de confiança – IC).
58
6 DISCUSSÃO
Os parâmetros clínicos avaliados durante o exame físico não evidenciaram
anormalidades, o que reforça a tese de que serovares adaptados tendem a causar doença
crônica e por vezes subclínica nos hospedeiros de manutenção (ELLIS et al., 1983a; FAINE
et al., 2000; HARTSKEERL et al., 2004; LÉON et al., 2006), ou ainda, a ocorrência de
abortamento sem prévia doença clínica (RADOSTITS et al., 2002). O papel de Bratislava,
apesar de determinar infecção sub-clínica e muitas vezes inaparente, vem sendo cada vez mais
reconhecido na etiologia da leptospirose, com importantes prejuízos, em especial na esfera
reprodutiva (ELLIS et al., 1983a; FAINE et al., 2000; PINNA et al., 2007).
Apesar de apresentar seroprevalência variável e de acordo com a região, vem sendo
pouco descrito no Brasil, onde ainda predominam os relatos de infecção por
Icterohaemorrhagiae (LILENBAUM, 1998; VASCONCELLOS, 2000; PESCADOR et al.,
2004). No Rio Grande do Sul, PIRES NETO; HESSE; OLIVEIRA (2004/2005) reportaram a
predominância deste serovar num estudo realizado entre os anos de 2000 e 2003.
De acordo com LILENBAUM (1998), o ponto de corte para o diagnóstico sorológico de
leptospirose é 100, sendo as reações consideradas inespecíficas. No presente trabalho,
considerando que em áreas tropicais a leptospirose pode ser endêmica, o ponto de corte de 200 foi
adotado.
59
Os serovares Pomona e Icterohaemorrhagiae são os mais freqüentemente associados a
sinais clínicos agudos e à ocorrência de surtos em eqüinos (LILENBAUM, 1998). O predomínio
da variante Icterohaemorrhagiae foi amplamente descrito no Brasil, por GIORGI et al. (1981b),
YANAGUITA et al. (1982) e ABUCHAIN (1991), enquanto SANTA ROSA et al. (1969/70);
GIORGI et al. (1981a) e CORDEIRO et al. (1974) encontraram a predominância de Pomona.
Icterohaemorrhagiae e Pomona são leptospiras incidentais, não adaptadas aos eqüinos e mantidas,
respectivamente, por roedores e por suínos (FAINE et al., 2000). Desta forma, sua presença
normalmente ocorre em surtos, com grande número de animais acometidos e com riqueza de
sintomas clínicos, o que justifica a abundancia de relatos na literatura.
No presente estudo não foi verificada a presença de alterações clínicas compatíveis com
quadros agudos de leptospirose, entretanto, registrou-se alta ocorrência de aglutininas anti-
leptospira, o que está de acordo com
DONAHUE et al (1992), que reportou perda reprodutiva
associada à infecção por Bratislava em eqüinos. Em suínos, sua presença foi recentemente
evidenciada no Rio de Janeiro determinando repetição de cio, ocorrência de natimortos e
nascimento de crias fracas (RAMOS et al., 2006). Por analogia com esta espécie, uma vez que
os animais do presente estudo apresentaram elevado índice de falha reprodutiva, sugere-se
que no eqüino a infecção por este serovar determina, principalmente, e, muitas vezes, somente
alterações reprodutivas.
Acredita-se que a ocorrência de elevadas perdas na eficiência reprodutiva identificadas
neste trabalho deva-se, portanto, ao somatório de algumas situações particulares; por um lado,
a presença de um eficiente programa de controle de roedores, reservatórios naturais de
Icterohaemorrhagiae (FAINE et al., 2000), permitiu que a ocorrência de casos agudos de
leptospirose determinada por este serovar tenha sido bastante reduzida. Deve-se notar que
alguns animais ainda apresentavam seroreatividade para esta amostra, o que confirma sua
presença neste plantel, ainda que controlado.
Por outro lado, o ingresso freqüente de animais oriundos de diferentes haras em
diversas regiões do país, sem a devida comprovação de soronegatividade para leptospirose ou
sem cumprir um período de quarentena, associado a características ambientais, como a
presença de alagadiços e do lago para exercícios, permitiu a disseminação e manutenção da
infecção por Bratislava. Uma vez que este serovar é mantido pelo próprio eqüino
(HARTSKEERL et al., 2004; LÉON et al., 2006), a fonte de infecção mais provável seria um
60
animal infectado oriundo de outro haras, visto o grande número de animais ingressantes no
plantel, sem o devido controle.
Sendo Bratislava mantida pelos eqüinos e transmitida no contato eqüino-equino
(ELLIS et al., 1983b), não se verifica a necessidade de outras espécies para a transmissão da
infecção. Este fato, que torna a epidemiologia de tal infecção bastante diversa daquela
verificada quando da infecção por Icterohaemorrhagiae, que é dependente do contato direto
ou indireto com a urina de roedores, deve ser considerado na elaboração de programas de
controle.
A elevação dos parâmetros leucometria total, segmentados e linfócitos sugere um processo infeccioso
que, associado aos valores normais do fibrinogênio, caracteriza uma infecção subclínica com tendência à
cronicidade (FAINE, 2000) e, portanto compatível com o fato da Bratislava ser adaptada ao hospedeiro eqüino,
como sugere ELLIS et al. (1983a).
A despeito de não haver registro de outros relatos sobre alterações do fibrinogênio plasmático na
leptospirose, SCHALM et al. (1975) descreveram que a determinação do fibrinogênio plasmático, associado ao
hemograma, pode prestar uma significativa contribuição para o diagnóstico de processos de doença,
principalmente na espécie eqüina. Já em cães infectados por Icterohaemohrragiae pode-se observar
hipofibrinogenemia e trombocitopenia, como resultante de coagulação intravascular disseminada (CID) em
doença aguda (GREENE, 2006). No presente estudo, a ausência de alterações hematológicas condizentes com
este quadro em associação com os outros dados laboratoriais reforça a idéia da doença em fase crônica.
KEENAN et al. (1978), trabalhando com o serovar Bataviae e ÁVILA (1983) com
Pomona, observaram a elevação nos percentuais de monócitos, o que segundo SCHALM et
al. (1975) pode estar relacionado com infecção crônica. No presente estudo, embora se
considere uma possível infecção crônica nos eqüinos estudados, determinada pelo serovar
Bratislava, essa alteração hematológica não foi evidenciada durante as análises laboratoriais.
Os dados referentes à hematimetria não sofreram qualquer alteração nos animais
estudados, enquanto na espécie bovina, SPRADROW e SEAWRIGHT (1963) encontraram
pequena alteração dos níveis de hemoglobina no sangue de bezerros experimentalmente
infectados com o serovar Pomona. A determinação da proteína plasmática total permaneceu
dentro dos valores normais, o que difere de MILLAR et al. (1977), que relataram que níveis
de proteína plasmática em ovinos experimentalmente infectados com o serovar Pomona
estavam significativamente aumentados. Resultados semelhantes foram encontrados no
sangue de suínos infectados pelo serovar Pomona por AZARYAN (1981) e por ÁVILA
(1983). Mais uma vez, verificou-se que, quando da infecção por amostras não-adaptadas,
como no caso de Pomona em ovinos ou bovinos, as alterações hematológicas são mais
61
evidentes do que naquelas verificadas quando da infecção por amostra adaptada, objeto do
presente estudo.
Observou-se elevação sérica de creatinina associada à injúria muscular, renal e em
casos de desidratação (KANEKO et al., 1997; THRALL, 2007). Os animais do presente
estudo não apresentaram alterações clínicas compatíveis com quadros de desidratação e as
dosagens de CK, LDH e AST não evidenciaram lesão muscular. Desta forma, atribui-se esta
discreta elevação a uma possível injúria renal leve, uma vez que este é um parâmetro
considerado um indicador confiável da taxa de filtração do glomérulo renal (BURTIS e
ASHWOOD, 1998).
Os níveis de uréia sanguínea observados no grupo positivo, não foram importantes
indicadores de lesão renal, embora a creatinina tenha apresentado elevação sérica. A uréia é
um indicador menos fidedigno da função renal, pois sofre influência de outras variáveis como
desidratação leve, dieta rica em proteínas, catabolismo protéico aumentado. Já a creatinina
sofre menos variação. É eliminada por secreção tubular e produzida constantemente, o que
numa lesão renal discreta pode ser mais bem evidenciado (THRALL, 2007). E tendo em vista
o fato do cavalo não ter vesícula biliar, possui canalículos mais dilatados e conseqüentemente
dificuldade maior em obstruir. A ALT não é encontrada em grande quantidade no tecido
hepático de herbívoros, mas sendo uma enzima de citossol, elevou sua atividade sérica; além
das particularidades anatômicas do fígado do eqüino.
A obstrução do fluxo biliar resulta em regurgitação de bilirrubina conjugada ao sangue
em virtude do processo inflamatório no fígado, que pode ser pela localização das leptospiras
em sinusóides e canalículos biliares (Da SILVA et al., 2002). Este quadro reativo é
evidenciado nos achados laboratoriais pelo aumento da ALT e FA, além da ausência de
anemia, sendo esta uma importante causa de aumento de bilirrubina indireta. Outra causa de
hiperbilirrubinemia poderia ser disfunção hepática por redução acentuada na quantidade de
hepatócitos devido à destruição aguda ou crônica dessas células. Entretanto, o quadro clínico
dos animais não é condizente com esse grau de lesão (THRALL, 2007).
Embora a GGT seja mais valiosa para a detecção de colestase em eqüinos, Coles
(1984) alerta que a atividade sérica desta enzima é geralmente detectada em níveis altos
durante infecções hepática e renal aguda. Este fato pode explicar a atividade sérica dentro do
62
intervalo de confiança proposto neste estudo e desta forma, sugerindo uma possível infecção
crônica.
Ainda que a literatura cite que a AST seja útil para detecção de lesão nos hepatócitos,
no presente trabalho não houve evidência do seu aumento. Esse achado pode ser atribuído,
provavelmente, à ocorrência de lesão hepática discreta, compatível com o estado de
hospedeiro de manutenção. A AST encontra-se livre no citoplasma, mas a maior parte está
associada à membrana mitocondrial dos hepatócitos, necessitando, portanto, de lesão
necrótica ou subletal para o seu extravasamento (LASSEN, 2004; LOPES, BIONDO e
SANTOS, 2007, THRALL, 2007).
Segundo GREENE (2004), as infecções determinadas por Icterohaemorrhagiae em
cães resultam em lesões em diferentes órgãos, sobretudo nos tecidos hepático e renal.
Observa-se aumento das transaminases hepáticas, gama glutamil transferase e fosfatase
alcalina (SILVA et al., 2002; PEREIRA et al., 2005). Há uma extensa lesão hepática com
posterior congestão e icterícia pré ou pós-hepática em cães infectados por
Icterohaemohrragiae (FREIRE, 2005). Ressalta-se que o serovar mencionado não é adaptado
aos cães, por isso o quadro clínico é grave e com evolução aguda, diferentemente do
observado neste estudo, no qual as lesões hepáticas foram brandas e sugestivas de
adaptabilidade.
No que se refere ao controle da leptospirose, poucos são os programas que enfatizam a
adoção do controle ambiental associado a tradicional combinação de vacinação e
antibioticoterapia. No entanto, sabe-se que manejo e ambiente influenciam na transmissão da
infecção em diversas espécies, tais como em suínos (RAMOS e LILENBAUM, 2002;
BOQVIST et al., 2002) bovinos (ALONSO-ANDICOBERRY et al., 2001; LILENBAUM e
SOUZA, 2003) e caprinos (LILENBAUM et al., 2008). Em todos estes estudos, apesar de
conduzidos com diferentes espécies e conseqüentemente com outros serovares de leptospiras,
observou-se que tais fatores interferem de forma marcante na distribuição da infecção
leptospírica entre os rebanhos e mesmo entre os animais do mesmo rebanho. Assim, o
presente estudo vem corroborar, como aplicação prática, esta missiva, associando o estudo e a
correção de fatores ambientais que favoreçam a manutenção e a transmissão do agente às
medidas tradicionais de controle da leptospirose em eqüinos, com resultados encorajadores.
63
A adoção de medidas sanitárias e higiênicas já descritas inclui a não exposição a águas
paradas, a vetores em potencial (roedores, animais silvestres, animais doentes), bem como
tornar rotina a desinfecção de baias antes ocupadas por animais suspeitos de serem portadores
e o isolamento de animais infectados; além disso, as éguas que abortaram devem ser isoladas
e os estábulos desinfetados, como qualquer outro aborto infeccioso (TROEDSON, 2003).
Desta forma, a ampla abordagem, incluindo vacinação simultânea, antibioticoterapia e
a adoção de alguns aspectos ambientais, principalmente a interdição do lago para exercício
dos animais, foi imprescindível para o sucesso no controle da infecção. O presente estudo foi
conduzido em área tropical, e acredita-se que possa ser válido também para outras regiões
com condições ambientais similares, o que contribui para um melhor entendimento da
patogenicidade da Leptospira em cavalos e mais especificamente aplicada à reprodução.
64
7 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente estudo permitiram concluir que:
O serovar Bratislava ocorre no Brasil determinando alterações subclínicas em eqüinos
e prejuízos reprodutivos.
Os achados clínicos e de patologia clínica reforçam as indicações da literatura de que
Bratislava é um serovar adaptado ao hospedeiro eqüino.
Os parâmetros clínicos avaliados durante o exame físico não evidenciaram
anormalidades.
Os garanhões não apresentaram alterações dignas de nota ao espermograma e
que pudessem ser associados à sororeatividade para leptospirose.
Os parâmetros bioquímicos creatinina, bilirribinas total e direta, fosfatase
alcalina e alanina transaminase sofreram aumento nos animais do grupo positivo.
Os parâmetros hematológicos leucometria total, segmentados e linfócitos
elevaram-se no grupo positivo.
Visto tratar-se de uma infecção subclínica e muitas vezes inaparente, a sorologia
regular para leptospirose deve fazer parte da conduta sanitária de plantéis eqüinos.
65
A aplicação de um programa específico e individualizado, associando
antibioticoterapia, vacina e medidas epidemiológicas permitiram o controle da infecção no
plantel com a conseqüente redução dos prejuízos econômicos.
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