( PDF ) Desenvolvimento de metodologia espectrofotométrica multivariada para o controle de qualidade da associação ácido kójico e hidroquinona em dermocosméticos

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA APLICADA

GISELLE NATHALY CALAÇA

DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ESPECTROFOTOMÉTRICA

MULTIVARIADA PARA O CONTROLE DE QUALIDADE DA ASSOCIAÇÃO

ÁCIDO KÓJICO E HIDROQUINONA EM DERMOCOSMÉTICOS

PONTA GROSSA

2010

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GISELLE NATHALY CALAÇA

DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ESPECTROFOTOMÉTRICA

MULTIVARIADA PARA O CONTROLE DE QUALIDADE DA ASSOCIAÇÃO

ÁCIDO KÓJICO E HIDROQUINONA EM DERMOCOSMÉTICOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Química Aplicada da

Universidade Estadual de Ponta Grossa para

obtenção do título de Mestre em Química.

Orientadora: Profa. Dra. Noemi Nagata

PONTA GROSSA

2010

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iii

Dedico este trabalho ao meu esposo

César, aos meus pais Vilma e Élio, a

minha irmã Michelle e ao meu

sobrinho Lucas.

AGRADECIMENTOS

Agradeço, primeiramente, a Deus por permitir esta conquista, me fortalecer

em todos os momentos e me guiar nessa caminhada.

Ao meu amado esposo César, pela compreensão, carinho e apoio

incondicional nos momentos mais difíceis.

Aos meus pais Vilma e Élio, minha irmã Michelle e meu sobrinho Lucas, por

todo amor, dedicação, apoio e incentivo.

À minha orientadora e amiga, Profa. Dra. Noemi Nagata, não somente pela

dedicação, sabedoria e conhecimento com que conduziu este trabalho, mas também

pela compreensão, carinho, apoio e permanente disponibilidade para me receber.

Meu verdadeiro, muito obrigada!

À Universidade Federal do Paraná, em especial ao Prof. Dr. Patricio Peralta-

Zamora, pela hospitalidade com que me recebeu e por ter contribuído muito para o

aprimoramento deste trabalho com valiosas observações, além de ter aceitado o

convite para participar da minha banca de defesa de dissertação.

À Professora Dra. Christiana Andrade Pessoa, por ter aceitado o convite para

fazer parte da minha banca de defesa de dissertação e ter contribuído para

finalização dessa dissertação com colocações pertinentes.

À minha amiga e companheira de trabalho Sandritcha, pela ajuda, amizade,

paciência e, sobretudo, pelos momentos de descontração que tornaram os meus

dias bem mais alegres.

Aos professores da pós-graduação em química, especialmente a Profa. Dra.

Karen Wohnrath que, com carinho e paciência, sempre atendeu as minhas mais

diversas solicitações.

À Fundação Araucária pela bolsa concedida.

E a todas as pessoas que, direta ou indiretamente, tiveram sua parcela de

participação durante a execução e conclusão deste trabalho.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS _________________________________________________x

LISTA DE TABELAS _______________________________________________ xiii

LISTA DE ABREVIATURAS _________________________________________ xvi

RESUMO ________________________________________________________ xvii

ABSTRACT _____________________________________________________ xviii

1 INTRODUÇÃO ____________________________________________________1

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA __________________________________________3

2.1 PELE E AGENTES DESPIGMENTANTES __________________________ 3

2.1.1 Ácido Azeláico _______________________________________________ 4

2.1.2 Ácido Retinóico (Tretinoína) _____________________________________ 5

2.1.3 Ácido Ascórbico (Vitamina C) ___________________________________ 5

2.1.4 Ácido Fítico _________________________________________________ 6

2.1.5 Corticosteróide _______________________________________________ 6

2.1.6 α-hidroxiácidos _______________________________________________ 6

2.1.7 Hidroquinona ________________________________________________ 7

2.1.8 Ácido Kójico _________________________________________________ 8

2.2 MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO _________________________________ 9

2.3 QUIMIOMETRIA ______________________________________________ 12

2.3.1 Planejamento Fatorial de Experimentos __________________________ 12

2.3.2 Calibração Multivariada _______________________________________ 13

2.4 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO ___________________________ 16

2.4.1 Especificidade e Seletividade __________________________________ 18

2.4.2 Linearidade ________________________________________________ 18

2.4.3 Intervalo ___________________________________________________ 18

vii

2.4.4 Precisão ___________________________________________________ 19

2.4.5 Exatidão ___________________________________________________ 20

2.4.6 Robustez __________________________________________________ 21

3 OBJETIVOS _____________________________________________________ 22

3.1 OBJETIVOS GERAIS __________________________________________ 22

3.2

OBJETIVOS ESPECÍFICOS _____________________________________ 22

4 MATERIAIS E MÉTODOS __________________________________________ 23

4.1 REAGENTES ________________________________________________ 23

4.2 PREPARO DE SOLUÇÕES _____________________________________ 23

4.2.1 Solução trabalho de Ácido Kójico _______________________________ 23

4.2.2 Solução trabalho de Hidroquinona _______________________________ 23

4.2.3 Soluções trabalho de Cloreto Férrico _____________________________ 23

4.2.4 Soluções trabalho de 1,10-fenantrolina ___________________________ 24

4.2.5 Tampão Clark Lubs __________________________________________ 24

4.3. ANÁLISE POR ESPECTROFOTOMETRIA UV-VIS __________________ 25

4.4 PLANEJAMENTO FATORIAL ___________________________________ 25

4.4.1 Deslocamento do Planejamento Fatorial __________________________ 26

4.5 ESTUDO CINÉTICO DA REAÇÃO DE COMPLEXAÇÃO AK-FE(III) _____ 26

4.6 MÉTODO DA VARIAÇÃO CONTÍNUA (JOB) _______________________ 27

4.7 ANÁLISE DO ÁCIDO KÓJICO ___________________________________ 28

4.8 ANÁLISE DA HIDROQUINONA __________________________________ 28

4.9 ANÁLISE MULTIVARIADA _____________________________________ 29

4.10 VALIDAÇÃO DO MODELO MULTIVARIADO ______________________ 30

4.10.1 Especificidade _____________________________________________ 30

4.10.2 Linearidade e Intervalo _______________________________________ 31

4.10.3 Precisão __________________________________________________ 31

viii

4.10.4 Exatidão __________________________________________________ 32

4.10.5 Robustez _________________________________________________ 33

4.11 ANÁLISE DE AMOSTRAS REAIS _______________________________ 33

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ______________________________________ 35

5.1 ÁCIDO KÓJICO ______________________________________________ 35

5.1.1 Resultados da Otimização via Planejamento Fatorial ________________ 35

5.1.2 Deslocamento do Planejamento Fatorial __________________________ 37

5.1.3 Resultados Obtidos Através do Estudo Cinético ____________________ 38

5.1.4 Estequiometria do Complexo AK-Fe(III) ___________________________ 39

5.1.5 Curva Analítica do Ácido Kójico _________________________________ 42

5.2 HIDROQUINONA _____________________________________________ 43

5.2.1 Curva Analítica da Hidroquinona ________________________________ 44

5.3 ÁCIDO KÓJICO E HIDROQUINONA ______________________________ 46

5.3.1 Curva Analítica Convencional __________________________________ 47

5.3.2 Princípio da Aditividade Espectrofotométrica (Método de Vierordt) ______ 49

5.3.3 Primeira Derivada dos Dados Espectrais __________________________ 52

5.3.4 Calibração Multivariada _______________________________________ 57

5.3.5 Modelo Multivariado para Determinação de Ácido Kójico _____________ 58

5.3.6 Modelo Multivariado para Determinação de Hidroquinona ____________ 63

5.4 RESULTADOS DOS ESTUDOS DE VALIDAÇÃO ___________________ 69

5.4.1 Especificidade ______________________________________________ 69

5.4.2 Linearidade e Intervalo ________________________________________ 70

5.4.3 Precisão ___________________________________________________ 71

5.4.4 Exatidão ___________________________________________________ 74

5.4.5 Robustez __________________________________________________ 74

5.5 ANÁLISE DE AMOSTRAS REAIS ________________________________ 76

6 CONCLUSÕES ___________________________________________________ 78

7 TRABALHOS FUTUROS ___________________________________________ 80

8 GLOSSÁRIO _____________________________________________________ 81

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ___________________________________ 83

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Estrutura da pele incluindo a localização dos melanócitos e

melanina

Figura 02. Estrutura química do ácido azeláico 4

Figura 03. Estrutura química do ácido retinóico 5

Figura 04. Estrutura química do ácido ascórbico 5

Figura 05. Estrutura química do ácido fítico 6

Figura 06. Estrutura química do ácido glicólico 7

Figura 07. Estrutura química do ácido lático 7

Figura 08. Estrutura química da hidroquinona 7

Figura 09. Estrutura química do ácido kójico 8

Figura 10. Modelo geral do processo de calibração multivariada 15

Figura 11. Planejamento experimental para obtenção das misturas dos

conjuntos de calibração e validação

Figura 12. Interpretação geométrica do efeito de interação [FeCl

] x pH 36

Figura 13. Espectros de absorção na região do visível do complexo ácido

kójico (4,5E-04 mol L

-1

) e íon férrico (8,0E-04 mol L

-1

) nos

intervalos 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 e 27 minutos

Figura 14. Espectros de absorção na região do visível dos complexos

formados entre o ácido kójico e o íon ferro (III) pelo método da

variação contínua

Figura 15.

Gráfico da fração molar versus a absorbância em 494 nm do

complexo formado entre o ácido kójico e o ferro (III)

Figura 16. Espectros de absorção na região do visível do complexo ácido

kójico e íon férrico (8,0E-04 mol L

-1

) em pH 3,0

Figura 17:

Curva analítica para determinação de ácido kójico em 494 nm

(absorbância x concentração de AK)

Figura 18:

Reação de complexação ferro (II) e 1,10-fenantrolina 44

Figura 19:

Espectros de absorção na região do visível do complexo HQ,

(1,95E-04 mol L

-1

) e 1,10-fenantrolina (4,8E-04 mol L

-1

)

Figura 20:

Curva analítica para determinação de hidroquinona em 510 nm

(absorbância x concentração de HQ)

Figura 21:

Espectros de absorção do complexo Fe

e 1,10-fenantrolina

para determinação indireta de HQ (3,0E-05 mol L

-1

) e do

complexo AK (5,5E-04 mol L

-1

) e Fe

Figura 22:

Curva analítica (absorbância x concentração) para

determinação de AK em 510 nm (a) e HQ em 494 nm (b)

Figura 23:

Primeira derivada dos espectros na região do visível de ácido

kójico

Figura 24:

Curva analítica derivada para determinação de hidroquinona

(da/dλ x concentração HQ)

Figura 25:

Primeira derivada dos espectros na região do visível de

hidroquinona

Figura 26:

Curva analítica derivada para determinação de ácido kójico

(da/dλ x concentração de AK)

Figura 27:

Espectros de absorção na região visível das misturas de ácido

kójico e hidroquinona do conjunto de calibração, utilizados no

desenvolvimento dos modelos multivariados

Figura 28:

Representação da Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático

da Validação Cruzada (RMSECV) de ácido kójico em função

do processamento e do número de variáveis latentes

xii

Figura 29:

Gráfico do coeficiente de regressão vs. comprimento de onda

do modelo para AK

Figura 30:

Gráfico de loadings das três primeiras variáveis latentes vs.

comprimento de onda do modelo para AK

Figura 31:

Gráfico de Resíduos Student vs. Leverage do modelo para AK

Figura 32:

Valor Previsto (CV) vs. Valor Real do modelo para AK

Figura 33:

Representação da Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático

da Validação Cruzada (RMSECV) de hidroquinona em função

do processamento e do número de variáveis latentes

Figura 34:

Gráfico do coeficiente de regressão vs. comprimento de onda

do modelo para HQ

Figura 35:

Gráfico de loadings das duas primeiras variáveis latentes vs.

comprimento de onda do modelo para HQ

Figura 36:

Gráfico de Resíduos Student vs. Leverage do modelo para HQ

Figura 37:

Valor Previsto (CV) vs. Valor Real do modelo para HQ

Figura 38. Gráfico do Resíduo x Valor Real (mol/L) para o ácido kójico (A)

e para hidroquinona (B)

Figura 39. Espectros de absorção na região visível da mistura AK (1,5 E-

04 mol L

-1

) e HQ (4,0 E-05 mol L

-1

) nas temperaturas de 5 a 55

ºC na avaliação da robustez

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Ensaios necessários para a validação do método analítico

segundo sua finalidade.

Tabela 02. Concentrações das soluções trabalho utilizadas de

FeCl

.6H

O, com respectivas massas, volumes e etapas

experimentais.

Tabela 03. Variáveis e níveis estudados na reação de complexação entre

ácido kójico e íon férrico.

Tabela 04. Ensaios experimentais para todas as combinações possíveis

dos níveis selecionados do planejamento fatorial 2

Tabela 05. Variáveis e Níveis estudados no deslocamento do

planejamento fatorial 2

Tabela 06. Ensaios do método da variação contínua para determinação

da estequiometria do complexo entre o ácido kójico e o íon

férrico.

Tabela 07. Ensaios do método de recuperação para determinação da

especificidade.

Tabela 08. Concentrações de ácido kójico e hidroquinona utilizadas nos

ensaios de precisão.

Tabela 09. Ensaios para análise das amostras reais de dermocosméticos

(base gel), obtidos em farmácias de manipulação da região

de Ponta Grossa e Curitiba/PR.

Tabela 10. Resultados da otimização via planejamento fatorial 2

reação de complexação entre o ácido kójico e o íon férrico.

Tabela 11. Efeitos calculados para otimização via planejamento fatorial

da reação de complexação entre o ácido kójico e o íon

férrico.

xiv

Tabela 12. Resultados do deslocamento do planejamento fatorial 2

. 37

Tabela 13. Efeitos calculados para o planejamento 2

deslocado. 38

Tabela 14. Resultados obtidos via curva analítica para determinação de

ácido kójico nas misturas do conjunto de validação externa.

Tabela 15. Resultados obtidos via curva analítica para determinação de

hidroquinona nas misturas do conjunto de validação externa.

Tabela 16. Resultados obtidos via princípio da aditividade

espectrofotométrica para determinação de AK e HQ nas

misturas do conjunto de validação externa.

Tabela 17. Resultados obtidos via primeira derivada para determinação

de HQ (498 nm) nas misturas do conjunto de validação

externa

Tabela 18. Resultados obtidos via primeira derivada para determinação

de AK (510 nm) nas misturas do conjunto de validação

externa

Tabela 19. Resultados obtidos para o modelo PLSR para determinação

de ácido kójico nas misturas do conjunto de validação externa

Tabela 20. Resultados obtidos para o modelo PLSR para determinação

de hidroquinona nas misturas do conjunto de validação

externa

Tabela 21. Comparação das metodologias convencionais e multivariadas

para determinação de AK e HQ nas misturas do conjunto de

validação externa utilizando-se RMSEP (mol L

-1

) e erro

relativo médio

Tabela 22. Resultados do ensaio de recuperação para determinação da

especificidade

Tabela 23. Resultados do ensaio de repetibilidade (precisão intra-corrida)

Tabela 24. Resultados do ensaio de precisão intermediária (precisão

inter-corrida)

Tabela 25. Resultados obtidos na determinação da mistura AK (1,5 E-04

mol L

-1

) e HQ (4,0 E-05 mol L

-1

) via PLSR em diferentes

temperaturas na avaliação da robustez

Tabela 26. Resultados de previsão de ácido kójico e hidroquinona em

amostras reais, utilizando-se o método multivariado

desenvolvido

xvi

LISTA DE ABREVIATURAS

AHAs α-hidroxiácidos

AK Ácido Kójico

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CMD Concentração Média Determinada

CV Coeficiente de Variação

DP Desvio Padrão

DPR Desvio Padrão Relativo (sinônimo de CV)

DCM Dados Centrados na Média

HQ Hidroquinona

INMETRO

Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial

PCA

Análise de Componentes Principais (Principal Components Analysis)

PLSR

Regressão de Mínimos Quadrados Parciais (Partial Least Square

Regression)

RMSEC Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático de Calibração

RMSECV Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático da Validação Cruzada

RMSEP Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático de Previsão

UV Ultra-Violeta

VIS Visível

VL Variável Latente

VLs Variáveis Latentes

xvii

RESUMO

O Ácido Kójico (AK) e a Hidroquinona (HQ) são agentes despigmentantes

freqüentemente comercializados em associações dermocosméticas de manipulação

magistral, utilizadas no tratamento de discromias. A necessidade de metodologias

analíticas de baixo custo que viabilizem o controle de qualidade dessa associação é

evidente. Em função de características como alta sensibilidade, baixo custo e

simplicidade operacional, o presente trabalho tem por objetivo a utilização da

espectrofotometria na região do visível associada a métodos de calibração

multivariada, principalmente Regressão de Mínimos Quadrados Parciais (PLSR)

para determinação de AK e HQ. A metodologia proposta consiste na complexação

de ácido kójico com o íon Fe

(λ = 494 nm), enquanto a hidroquinona reduz os íons

a Fe

, que por sua vez complexam com 1,10-fenantrolina (λ = 510 nm). A

determinação quantitativa de AK e HQ pelos métodos convencionais de análise foi

realizada via curva analítica, princípio da aditividade espectrofotométrica e primeira

derivada, cujos erros relativos médios foram: 20,65% (HQ) e 469,91% (AK), 41,44%

(HQ) e 47,11% (AK), 57,59% (HQ) e 156,72% (AK), respectivamente. Os resultados

dos métodos convencionais foram comparados ao PLSR, sendo que os modelos de

melhor capacidade preditiva empregaram: faixa espectral de 350 a 800 nm, dados

centrados na média, 03 e 02 variáveis latentes para ácido kójico e hidroquinona,

respectivamente. Os erros relativos médios obtidos a partir desses modelos foram:

4,20% para AK e 6,05% para HQ, evidenciando que o método PLSR apresentou

melhores resultados para a quantificação dos analitos, quando comparado aos

métodos convencionais. A metodologia multivariada desenvolvida foi validada

segundo critérios da ANVISA e posteriormente utilizada para previsão dos analitos

em amostras reais obtidas em farmácias de manipulação da região.

Palavras-Chave: Ácido Kójico, Hidroquinona, Espectrofotometria UV-Vis, Calibração

Multivariada, PLSR, Validação.

xviii

ABSTRACT

Kojic Acid (KA) and Hydroquinone (HQ) are depigmenting agents used as skin-

whitening cosmetics to treat dyschromias. The need for low cost analytical

methodologies that enable quality control of this association is evident. Due to the

characteristics such as high sensitivity, low cost and operational simplicity, this work

aims to use spectrophotometry in the visible region and multivariate calibration tools,

mainly Partial Least Squares Regression (PLSR) for quantitative determination of KA

and HQ. The method is based on the complexation of kojic acid with Fe

ion (λ =

494nm), while hydroquinone reduces Fe

ions to Fe

, which complex with 1,10-

phenanthroline (λ = 510nm). The quantitative determination of KA and HQ by

conventional methods was performed by analytical curve, spectrophotometric

additivity principle and first-derivative spectrophotometry, and the average errors

were: 20,65% (HQ) and 469,91% (AK), 41,44% (HQ) and 47,11% (AK), 57,59%

(HQ) and 156,72% (AK), respectively. The results of conventional methods were

compared to PLSR, and the multivariate models with better predictive capacity used:

spectral range from 350 to 800 nm, mean center data, 03 and 02 latent variables for

kojic acid and hydroquinone, respectively. The mean relative errors obtained from

these models were: 4,20% for AK and 6,05% for HQ, indicating that PLSR method

showed better results for the quantification of analytes, when compared to

conventional methods. The multivariate methodology developed was

validated

according to ANVISA criteria and then used for quantification of analytes in real

samples, obtained from manipulation pharmacies of the region.

Keywords: Kojic Acid, Hydroquinone, UV-Vis spectrophotometry, Multivariate

Calibration, PLSR, Validation.

1 INTRODUÇÃO

Nos últimos anos o número de produtos para clarear a pele teve um grande

crescimento (AZULAY-ABULAFIA et al., 2003). Dentre os vários agentes

despigmentantes disponíveis no mercado em associações dermocosméticas,

destacam-se o ácido kójico e a hidroquinona. O ácido kójico, 5-hidróxi-2-

(hidroximetil)-4-pirona é uma substância natural produzida por vários fungos e

bactérias (LIN; YANG; WU, 2007) que possui ação clareadora em função da sua

propriedade quelante de íons cobre, responsável pela inativação da enzima

tirosinase e conseqüente inibição na formação de melanina (PICARDO e

CARRERA, 2007). A hidroquinona, 1,4-Dihidroxibenzeno, por sua vez, produz

despigmentação não definitiva, inibindo a oxidação enzimática da tirosina em 3,4-

diidroxifenilalanina e de outros processos metabólicos dos melanócitos (AZULAY-

ABULAFIA et al., 2003).

Altas concentrações de hidroquinona em produtos de uso tópico podem

causar severos efeitos colaterais, e como o ácido kójico tem ação equivalente

(DRAELOS, 2008), porém menos abrasiva que a hidroquinona, diversas

formulações contendo a associação destes princípios ativos são utilizadas no Brasil

em tratamentos dermatológicos, tendo sua origem predominante na manipulação

magistral em farmácias de manipulação. Como estes estabelecimentos produzem

quantidades pequenas das formulações, o controle de qualidade do produto final é

geralmente inexistente, já que o mesmo se fundamenta em modernas técnicas

instrumentais com elevado custo e que dificultam a implementação de rotinas

analíticas em laboratórios de pequeno ou médio porte, e em órgãos de fiscalização

ligados ao governo. Sendo assim, a necessidade de metodologias analíticas que

viabilizem o controle de qualidade deste tipo de produto farmacêutico é evidente. Em

função de características como alta sensibilidade, baixo custo e simplicidade

operacional, a espectrofotometria UV-Vis corresponde a uma ferramenta analítica de

primeira importância (BOSCH et al., 2008). No entanto, a baixa seletividade da

técnica faz com que a ocorrência de sobreposição espectral seja bastante freqüente,

o que muitas vezes inviabiliza o desenvolvimento de metodologias analíticas

orientadas à determinação de misturas.

Nos últimos anos, diversas ferramentas de calibração multivariada têm sido

propostas para contornar os problemas associados à interferência espectral entre

espécies de interesse, viabilizando a sua determinação simultânea, mesmo em

condições de severa sobreposição de bandas (CORDEIRO et al., 2008).

Métodos espectrofotométricos na região do ultravioleta poderiam ser

utilizados na determinação de ácido kójico e hidroquinona em dermocosméticos, já

que os mesmos possuem sinais de absorção nessa região. No entanto, como uma

grande variedade de compostos orgânicos também absorvem nessa região, os

constituintes da base (creme ou gel) utilizados nas formulações, dificultariam esta

determinação. Para eliminar a interferência do veículo, a qual se manifesta

intensamente na região ultravioleta do espectro, é possível recorrer ao uso de

derivatização química, objetivando a formação de espécies coloridas, e em alguns

casos obtendo-se um aumento da sensibilidade analítica. Assim, o presente trabalho

objetiva o desenvolvimento de uma metodologia analítica orientada à determinação

da associação dermocosmética de ácido kójico (complexando com íons ferro (III)) e

hidroquinona (responsável pela redução do Fe (III) a Fe (II) que posteriormente

complexa com 1,10-fenantrolina), através da utilização da espectrofotometria na

região do visível e ferramentas de calibração multivariada, principalmente Regressão

de Mínimos Quadrados Parciais (PLSR).

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 PELE E AGENTES DESPIGMENTANTES

A pele recobre a superfície do corpo e desempenha múltiplas funções. Sua

cor é resultado da presença e interação de uma série de substâncias encontradas

na epiderme e derme, denominadas cromóforos, sendo a melanina o complexo mais

importante e também a maior fonte de coloração (MONTAZ et al., 2008). A melanina

é um pigmento de cor marrom-escura, sintetizado com a participação da enzima

tirosinase, em células altamente especializadas, chamadas melanócitos, as quais

estão localizadas na camada basal da epiderme (Figura 01). Devido à ação da

enzima tirosinase, o aminoácido tirosina é transformado primeiro em 3,4

diidroxifenilanina (DOPA), e posteriormente a dopa-quinona, que após várias

transformações, converte-se em melanina (YOON et al., 2003; JUNQUEIRA et al.,

2004).

Figura 01: Estrutura da pele incluindo a localização dos melanócitos e melanina

FONTE: JUNIOR, 2008.

O aumento anômalo na formação de melanina pode estar relacionado a uma

variedade de causas, os fatores contribuintes mais comuns são: pré-disposição

genética, gravidez, uso de contraceptivos orais, disfunção endócrina ou tratamento

hormonal e principalmente exposição à radiação UV da luz solar (GUPTA et al.,

2006). Para reduzir os efeitos desta anomalia, vários agentes despigmentantes

estão disponíveis para comercialização em formulações contendo um ou mais

princípios ativos em associação, sendo que nos últimos anos o desenvolvimento de

produtos para clarear a pele teve um crescimento explosivo (AZULAY-ABULAFIA et

al., 2003). Sabe-se que o tratamento de discromias (alterações na coloração da

pele) é difícil, pois muitos compostos efetivos no tratamento apresentam

propriedades irritantes e podem, em certos casos, promover descamação.

Entre os agentes despigmentantes mais usados estão: ácido azeláico, ácido

retinóico (tretinoína), ácido ascórbico, ácido fítico, corticosteróide, α-hidroxiácidos,

hidroquinona e o ácido kójico.

2.1.1 Ácido Azeláico

O ácido azeláico (Figura 02) é um ácido dicarboxílico saturado, de ocorrência

natural, obtido de culturas de Pityrosporum ovale. É um agente terapêutico efetivo

no tratamento de discromias, devido sua propriedade inibidora na produção de

melanina, quando aplicado na forma de creme ou gel, em concentrações de 15% a

20% (GAO et al., 2008).

Figura 02: Estrutura química do ácido azeláico

FONTE: MERCK, 2009.

2.1.2 Ácido Retinóico (Tretinoína)

A ação despigmentante do ácido retinóico ou tretinoína (Figura 03) baseia-se

na habilidade de acentuar a proliferação queratinócita, acelerando a taxa de

renovação da epiderme (ORTONNE e PASSERON, 2005). Concentrações entre

0,05% - 0,1% são bastante utilizadas, sendo que os efeitos colaterais mais comuns

associado ao uso são: dermatite retinóica caracterizada por queimadura, eritema,

descamação e pele seca (GUPTA et al., 2006; RENDON et al., 2006).

Figura 03: Estrutura química do ácido retinóico

FONTE: MERCK, 2009.

2.1.3 Ácido Ascórbico (Vitamina C)

O ácido ascórbico (Figura 04) é um agente anti-oxidante que afeta a

melanogênese (processo de formação da melanina) por reduzir a dopa-quinona em

DOPA. Trata-se de uma substância muito instável e rapidamente oxidada em

solução aquosa. Para contornar essa desvantagem, dá-se preferência ao uso de seu

derivado, fosfato de ascorbil magnésio que apresenta maior estabilidade química

(PICARDO e CARRERA; 2007).

Figura 04: Estrutura química do ácido ascórbico

FONTE: LITOS et al., 2007.

2.1.4 Ácido Fítico

O ácido fítico (Figura 05) é um despigmentante de origem natural com

propriedades hidratantes encontrados nas sementes de alguns cereais como: aveia,

arroz e gérmen de trigo (ROSSETO, 2007). Atua como quelante de íons cobre,

inibindo a formação de melanina. Costuma ser utilizado em concentrações de 1-2%

e sua principal vantagem é o baixo potencial irritativo, o que permite seu uso em

regiões sensíveis da pele, como as pálpebras (ORDIZ, 2003).

Figura 05: Estrutura química do ácido fítico

FONTE: FARIA et al., 2006.

2.1.5 Corticosteróide

Vários tipos de corticosteróides, como hidrocortisona, dexametasona,

betametasona entre outros, têm sido utilizados, por via tópica, no tratamento de

discromias. Algumas vezes associado a outros agentes despigmentantes como

hidroquinona e tretinoína para obtenção de melhores resultados. Tratamentos em

longo prazo não são recomendados devido ao surgimento de numerosos efeitos

adversos próprios dos corticosteróides (PRIGNANO et al., 2007).

2.1.6 α-hidroxiácidos

Dentre os vários

α-hidroxiácidos (AHAs), o ácido glicólico (Figura 06) e o

ácido lático (Figura 07) são os mais populares e efetivos no tratamento de

discromias. Recentes estudos demonstram a capacidade desses AHAs em

aumentar a renovação celular e inibir diretamente a atividade da tirosinase

(PICARDO e CARRERA, 2007).

Figura 06: Estrutura química do ácido glicólico Figura 07: Estrutura química do ácido lático

FONTE: MERCK, 2009. FONTE: CHEMICAL BOOK, 2008.

2.1.7 Hidroquinona

A hidroquinona (Figura 08), 1,4-dihidroxibenzeno, continua sendo o agente

branqueador mais prescrito em todo o mundo, sendo introduzido para uso clínico em

1961 (OLIVEIRA et al., 2007). Os primeiros relatos a respeito de sua eficácia na

redução da pigmentação da pele datam antes de 1936. A hidroquinona é um

hidroxifenol de estrutura química similar ao precursor da melanina e atua

principalmente pela inibição da tirosinase, reduzindo a hidroxilação da tirosina em

diidroxifenilalanina. Outros supostos mecanismos de ação são: inibição das sínteses

do DNA e RNA, degradação dos melanossomos e destruição dos melanócitos. As

concentrações empregadas usualmente variam de 2% a 5% (PICARDO e

CARRERA, 2007). Recomenda-se a utilização de hidroquinona apenas sob

prescrição médica, pois em concentrações acima de 5% pode causar severos

efeitos colaterais incluindo dermatites, eritema, leucoderma, queimadura e

hiperpigmentação (LIN; YANG; WU, 2007).

Figura 08: Estrutura química da hidroquinona

FONTE: MERCK, 2009.

2.1.8 Ácido Kójico

O ácido kójico (Figura 09), também conhecido por 5-hidróxi-2-(hidroximetil)-4-

pirona é uma substância natural produzida por vários fungos e bactérias, entre elas

espécies de Aspergillus, Penicillium e Acetobacter (LIN; YANG; WU, 2007).

Figura 09: Estrutura química do ácido kójico

FONTE: CORRER, 2004.

Entre suas várias propriedades destacam-se a ação antimicrobiana e

quelante de íons cobre, sendo esta última, responsável pela inativação da tirosinase

e conseqüente ação inibidora na formação de melanina, (CANO et al., 1994;

PICARDO e CARRERA, 2007). Este mecanismo confere ao ácido kójico a ação

clareadora, permitindo seu uso em preparações cosmecêuticas utilizadas no

tratamento tópico das discromias.

Segundo o estudo do perfil das prescrições de ácido kójico realizado por

CORRER (2004), a associação dermocosmética de ácido kójico e hidroquinona

ocupa a terceira posição nas formulações freqüentemente prescritas contendo dois

agentes clareadores. Nesta pesquisa foram analisadas 163 receitas que continham

ácido kójico de forma isolada ou em associação com outros agentes

despigmentantes, preparadas no período de maio a agosto de 2003 em quatro

farmácias de manipulação da região de Curitiba.

Sabe-se que diversas formulações contendo ácido kójico e hidroquinona são

utilizadas no Brasil em tratamentos dermatológicos, geralmente comercializado em

preparações dermocosméticas, através da manipulação magistral em farmácias de

manipulação. Como estes estabelecimentos produzem quantidades pequenas das

formulações, geralmente o controle de qualidade do produto final é inexistente.

Dentro deste contexto, torna-se evidente a necessidade do desenvolvimento

de metodologias analíticas, de baixo custo, que viabilizem o controle de qualidade

desta associação dermocosmética utilizada em tratamentos dermatológicos para

clarear a pele.

2.2 MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO

Muitos autores têm quantificado separadamente ácido kójico e hidroquinona

em cosméticos (gel, creme e emulsão), assim como em outros tipos de matrizes por

diversas técnicas.

OLIVEIRA e colaboradores (2007) desenvolveram um sensor biomimético

utilizando um novo complexo dinuclear de cobre (II) [Cu

(HL)(OAc)](ClO

)

para

determinar a concentração de hidroquinona em cosméticos por voltametria de onda

quadrada. Obtiveram-se resultados satisfatórios nas amostras comerciais testadas,

sendo que os erros relativos mostraram-se inferiores a 0,53%.

Por sua vez, GARCIA e colaboradores (2005) desenvolveram e validaram

dois métodos para determinação de hidroquinona em formulações, um via

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) por fase reversa e outro via

espectrofotometria UV derivativa (UVDS). Ambas as metodologias mostraram

resultados satisfatórios, com ampla faixa linear (6-30 µg/ml para HPLC e 10-26 µg/ml

para UVDS), baixo limite de quantificação (0,26 µg/ml para HPLC e 0,46 µg/ml para

UVDS) e com Desvio Padrão Relativo (RDS) inferiores a 1,34% para HPLC e 0,98%

para UVDS na determinação do analito em gel e creme na faixa de concentração de

2 a 4%. As metodologias desenvolvidas foram comparadas por análise estatística

(teste t e Teste F) e não mostraram diferença analítica significativa com 95% de

confiança, indicando que as propostas podem ser utilizadas nas análises de rotina

para o controle de qualidade de produtos que contenham a hidroquinona como único

princípio ativo.

AHAMMAD e colaboradores (2010) desenvolveram um método eletroquímico

simples e seletivo, baseado na anodização de um eletrodo de carbono vítreo (ECV),

para a determinação simultânea de hidroquinona (HQ) e catecol (CT) utilizando

voltametria de pulso diferencial. O ECV ativado apresentou estabilidade,

reprodutibilidade (RSD de 0,61%-HQ e 0,73%-CT, n=10) e boa relação linear (R =

0,98) entre os picos de corrente anódica e concentração, no intervalo de 0,5 x 10

-6

200 x 10

-6

mol L

-1

, com o limite de detecção de 0,16 e 0,11 µmol L

-1

para

hidroquinona e catecol, respectivamente. Resultados satisfatórios foram obtidos na

determinação dos analitos em amostras de água contaminada, com taxas de

recuperação de 96,6-101,7% para a hidroquinona e 98,8-103,9% para catecol,

demonstrando claramente a aplicabilidade e a confiabilidade do método proposto.

Com o objetivo de diminuir os efeitos de matriz de amostras reais, LIN, SHEU,

WU e HUANG (2005) propuseram a quantificação de hidroquinona em emulsão

cosmética usando a técnica de microdiálise para preparação de amostras, acoplado

a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Para determinar a exatidão e

precisão do método, foram realizados ensaios em triplicata em quatro diferentes

dias. Os erros relativos foram menores que 13,0% e o RDS menor que 7,55%,

sendo que a taxa de recuperação variou de 89 a 112%. O método foi aplicado a 4

amostras reais, e os resultados se mostraram concordantes com os valores

declarados pelos fabricantes. Uma das vantagens ressaltadas pelos autores está

relacionada com o menor pré-tratamento da amostra e baixo consumo de solventes

orgânicos.

LIN, WU e HUANG (2007) também utilizaram a técnica de microdiálise on-line

para determinar simultaneamente ácido kójico, ascorbil glucosídeo e niacinamida

(vitamina B

) em cosméticos clareadores via cromatografia líquida de alta eficiência

(HPLC). Nas misturas sintéticas dos três agentes clareadores, os autores obtiveram

taxas de recuperação entre 92-106% com boa repetibilidade (RSD= 3,9-8,7%) do

método. Foram testadas seis amostras comerciais contendo os agentes clareadores

em diferentes dosagens, obtendo-se valores concordantes com os declarados pelo

fabricante e dentro dos limites estabelecidos pela legislação de Taiwan.

CORRER e colaboradores (2005) determinaram ácido kójico em creme por

espectroscopia UV-Vis e métodos de calibração multivariada. Os resultados do

ensaio de recuperação mostraram valores de 98,29%, 98,55% e 98,43% para as

três amostras analisadas e coeficientes de variação inferiores a 2%, dentro dos

limites aceitos pela ANVISA. A metodologia testada mostrou-se exata e precisa,

indicando uma boa alternativa para quantificação do analito.

LIU e colaboradores (2009) utilizaram eletrodos de pasta de nanotubo de

carbono de paredes múltiplas modificado com vermelho de alizarina S como sensor

para a determinação ácido kójico em produtos alimentícios. O eletrodo desenvolvido

mostrou-se bastante seletivo e apresentou excelente reprodutibilidade (RSD = 5,2%,

n=10). A corrente de oxidação do ácido kójico foi proporcional à sua concentração

dentro do intervalo de 4,0 x 10

-7

mol L

-1

a 6,0 x 10

-5

mol L

-1

, com um coeficiente de

correlação de

0,998 e um limite de detecção de 1,0 x 10

-7

mol L

-1

. Na análise de

amostras reais, a determinação de ácido kójico foi realizada pelo método de adição

de padrão em amostras de molho e vinagre com taxas de recuperação entre 97,7% -

101,8% e RSD inferior a 5%. Os resultados obtidos pelo método proposto

apresentaram boa concordância quando comparados aos resultados obtidos por

HPLC.

Por outro lado, relatos de determinação simultânea de ácido kójico e

hidroquinona são pouco comuns, como é o caso da proposta de análise de HUANG

e colaboradores (2004) que determinaram simultaneamente ácido kójico,

hidroquinona, fosfato de ascorbil magnésio, ascorbil glucosídeo e arbutin em

cosméticos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os ensaios de

recuperação mostraram valores entre 93,5% – 103,3%, com RSD menor que 1,3%.

Nos ensaios intra-corrida e inter-corrida obtiveram-se RSD menores que 2,4%. A

metodologia proposta mostrou-se satisfatória para determinação simultânea dos

analitos.

Na proposta de LIN, YANG e WU (2007) foi empregado um planejamento

fatorial para otimizar a metodologia de cromatografia capilar eletrocinética micelar

(MEKC) na determinação simultânea de ácido kójico, hidroquinona e arbutin em

cosméticos. Os erros relativos encontrados no método de validação foram inferiores

a 3,0% e a taxa de recuperação superior a 99%. Na análise das amostras

comerciais, a metodologia foi aplicada com sucesso no controle de qualidade dos

clareadores citados, obtendo-se valores concordantes com os declarados pelo

fabricante e com os limites estabelecidos pela legislação de Taiwan.

Por sua vez, CHISVERT e colaboradores (2010) empregaram a cromatografia

gasosa acoplada a espectrometria de massas para determinar ácido kójico, ácido

azeláico, arbutin, hidroquinona e resorcinol em cosméticos. O método proposto

mostrou-se satisfatório, com bons limites de detecção e quantificação. Nos ensaios

intra-corrida e inter-corrida obtiveram-se variações inferiores a 10%. Para determinar

a exatidão do método, quantificou-se os analitos em amostras cosméticas

preparadas no laboratório com erros relativos menores que 5%. A metodologia

desenvolvida foi aplicada com sucesso na determinação dos analitos em nove

amostras comerciais, mostrando a presença de agentes despigmentantes não

declarados no rótulo em quatro das amostras analisadas.

2.3 QUIMIOMETRIA

A quimiometria é uma área da química que emprega métodos matemáticos e

estatísticos para planejar ou selecionar experimentos de forma otimizada e para

fornecer o máximo de informação química relevante com a análise dos dados

obtidos (FERREIRA et al.,1999).

2.3.1 Planejamento Fatorial de Experimentos

O planejamento fatorial é uma metodologia que apresenta características

vantajosas para estudar a influência de variáveis em processos, pois requer um

pequeno número de ensaios, funciona bem na presença de erros aleatórios e

principalmente avalia as interações entre as variáveis, permitindo verificar os efeitos

sinérgicos ou antagônicos relacionados às respostas obtidas.

Para executar um planejamento fatorial, escolhem-se as variáveis a serem

estudadas e efetuam-se experimentos em diferentes valores destes fatores, sendo

realizados experimentos para todas as combinações possíveis dos níveis

selecionados (BRUNS et al., 2003). De um modo geral, o planejamento fatorial pode

ser representado por b

, onde "α" é o número de fatores "b" é o número de níveis

escolhidos. Em geral, os planejamentos fatoriais do tipo 2

são os mais comuns, já

que os mesmos requerem a realização de poucos experimentos. É evidente que

com um número reduzido de níveis não é possível explorar de maneira completa

uma grande região no espaço das variáveis. Entretanto, é possível observar

tendências importantes para a realização de investigações posteriores (EIRAS et al.,

1999).

LEITÃO e SILVA (2008) utilizaram planejamento fatorial fracionário e

completo, para otimização das reações do anti-hipertensivo diltiazem com

hidroxilamina e um sal de ferro (II). Primeiramente, o diltiazem reage com a

hidroxilamina formando um ácido hidroxâmico que posteriormente reage com o sal

de ferro (II) formando um complexo de coloração vermelha, com absorção em 512

nm. As condições otimizadas da reação de complexação foram: solvente metanol,

concentração de hidroxilamina de 9,4%, concentração de NaOH de 18,75%,

concentração da solução de ferro (II) de 2,0%, volume mínimo de ácido perclórico

7% (v/v) (suficiente apenas para neutralizar o NaOH) e reação a temperatura

ambiente. Uma metodologia cinética espectrofotométrica multivariada orientada a

determinação deste anti-hipertensivo em diferentes formulações farmacêuticas foi

desenvolvida utilizando a reação otimizada, na qual se obteve resultados similares

ao método cromatográfico padrão, na determinação do analito em amostras reais.

Na análise do padrão farmacêutico obteve-se limite detecção de 6 e 2 mg/L, e na

análise de formulações farmacêuticas de 41 e 39 mg/L, utilizando-se PARAllel

FACtor analysis (PARAFAC2) e Resolução de Curva Multivariada – Mínimos

Quadrados Alternados (MCR-ALS) respectivamente. Em ambas as metodologias,

dados de absorbância em três dimensões (comprimento de onda, tempo e

concentração) foram adquiridos para posterior processamento. (Leitão e Silva,

2007).

Por sua vez, GIROTTO e colaboradores (2007) aplicaram um planejamento

fatorial completo 2

para avaliar os principais fatores e suas interações no processo

de extração em fase sólida (SPE) dos hormônios 17- β- estradiol, estrona e 17 β

etinilestradiol via HPLC com detector de fluorescência. As melhores condições

obtidas foram: 500 mL da amostra, condicionamento da fase sólida (C18) com

acetona (4 mL), metanol (6 mL) e água pH 3 (10 mL), e eluição dos analitos com 4

mL de acetona.

2.3.2 Calibração Multivariada

Nos últimos anos, diversas ferramentas de calibração multivariada têm sido

propostas para contornar os problemas associados à interferência espectral,

principalmente quando os componentes presentes numa mistura necessitam ser

determinados, mas a informação analítica disponível não apresenta seletividade. Isto

é, quando em uma mistura não é possível identificar os componentes individuais, a

partir da resposta instrumental (NAGATA et al., 2001). De maneira geral,

metodologias multivariadas permitem explorar toda a informação fornecida pela

técnica instrumental, favorecendo o desenvolvimento de modelos de calibração

confiáveis, mesmo em situações de extrema sobreposição espectral ou

complexidade de sinal (CORDEIRO et al., 2008).

A base da calibração multivariada é estabelecer uma relação matemática

entre duas matrizes (ou blocos) de dados químicos, quando houver uma

dependência entre as propriedades que descrevem cada uma delas. No caso

particular deste projeto, os espectros e as concentrações de ácido kójico e

hidroquinona.

Esta metodologia consiste, basicamente, de duas fases: a calibração e a

previsão. Na etapa de calibração, “n” espectros para um conjunto de amostras com

composição conhecida são obtidos em “p” valores de comprimentos de ondas

diferentes, formando uma matriz X, com “n” linhas e “p” colunas. Também uma

matriz Y com os valores de concentração pode ser formada contendo “n” linhas,

correspondendo às diferentes amostras, e “q” colunas, indicando o número de

diferentes analitos presentes nas amostras. O próximo passo é desenvolver um

modelo matemático apropriado (determinando o vetor dos coeficientes de regressão

– b) que melhor possa reproduzir Ycal a partir dos dados da matriz Xcal (Equação

01). Esse modelo é utilizado na fase de previsão (com um conjunto teste) para

estimar as concentrações (Yprev) dos constituintes de novas amostras, a partir de

seus espectros (Xteste) (Equação 02). Como estas metodologias trabalham com

matrizes de dados, o processo de isolar o fator Y da Equação 01 para obtenção da

Equação 02, implica na utilização da matriz transposta de X, ou seja, (Xteste)

(NAGATA et al., 2001).

Xcal = b * Ycal (Equação 01)

Yteste = (Xteste)

* b (Equação 02)

Os dados para a calibração multivariada podem ser organizados conforme

ilustra a Figura 10. As respostas de absorção dos espectros, a cada valor de

comprimento de onda, são as variáveis independentes, e as concentrações dos

fármacos nas amostras, as variáveis dependentes.

Dentre os métodos existentes para determinação do vetor de regressão (b),

podemos citar a Regressão de Mínimos Quadrados Parciais (PLSR), a qual se

baseia na Análise de Componentes Principais (PCA) (FERREIRA et al., 1999).

Figura 10: Modelo geral do processo de Calibração Multivariada

FONTE: NAGATA et al., 2001

O método PCA decompõe a matriz de dados X, construindo-se um novo

sistema de eixos (denominados componentes principais). Isto possibilita que as

amostras possam ser representadas e visualizadas em um número menor de

dimensões, sem perda de informação analítica relevante. Com a obtenção de um

novo sistema de eixos, a parte não modelada de X é considerada como uma matriz

de erros (E), as novas coordenadas da amostra são denominadas “scores” (T ou U),

e o peso que cada variável antiga contribui para formar as componentes principais

são chamados “loadings” (P ou Q).

No método PLSR, tanto a matriz das variáveis independentes Xcal (Equação

03), como a das variáveis dependentes Ycal (Equação 04), sofrem decomposição

matricial, sendo representadas na forma de “scores” e “loadings”. Posteriormente,

realiza-se uma relação entre as duas matrizes de “scores” (Equação 05) de cada um

dos blocos (variáveis independentes e dependentes), utilizando um modelo linear.

Xcal = TP' + E (Equação 03)

Ycal = UQ' + E (Equação 04)

U = b * T (Equação 05)

Obtido o vetor de regressão, é possível utilizá-lo para realizar as previsões de

concentrações de novas amostras através de seus respectivos dados espectrais e

empregando-se a Equação 02 (NAGATA et al., 2001).

Este método multivariado (PLSR) possui a vantagem de a calibração poder

ser realizada eficientemente mesmo na presença de interferentes, não havendo a

necessidade do conhecimento do número e natureza dos mesmos, além de ser um

método robusto, isto é, seus parâmetros praticamente não se alteram com a

inclusão de novas amostras no conjunto de calibração (FERREIRA et al., 1999).

CORDEIRO e colaboradores (2008) utilizaram espectroscopia UV-Vis

acoplada a calibração multivariada para determinação simultânea de sulfametoxazol

e trimetoprima em associações farmacêuticas. Durante a fase de validação os erros

de previsão foram inferiores a 3% para ambos os fármacos em estudo. Na análise

das amostras reais, o modelo permite uma excelente previsão do medicamento de

referência (Bactrim), com erros inferiores a 7% em relação aos valores determinados

pela técnica cromatográfica padrão.

FERRARO e colaboradores (2001) empregaram a calibração multivariada

para contornar problemas de interferências espectrais e determinar simultaneamente

furosemida e cloridrato de amilorida em amostras sintéticas e tabletes comerciais

por espectrofotometria UV-Vis. Os resultados obtidos na análise das amostras reais

foram satisfatórios para ambos os fármacos, e estão de acordo com os obtidos via

HPLC.

Por sua vez, GONZÁLEZ e colaboradores (2005) aplicaram a

espectrofotometria UV-Vis acoplada à calibração multivariada para especiação de

antimônio (III) e antimônio (V), utilizando pirogalol como agente complexante. Na

etapa de calibração, a média do erro absoluto de previsão foi 4,8% para o Sb (V) e

0,8% no caso do Sb (III). Na análise da amostra comercial, os autores obtiveram

valores de Sb (V) e Sb (III) concordantes com o valor de Sb total obtido via ICP-MS

e também especificado pelo fabricante.

2.4 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO

A necessidade de se mostrar confiabilidade em análises químicas está sendo

cada vez mais exigida. Para garantir que um novo método analítico gere

informações confiáveis, é necessário que ele passe por uma avaliação denominada

validação, fundamental para a implementação de um sistema de controle de

qualidade em laboratórios de análises (RIBANI et al., 2004).

O objetivo de uma validação é demonstrar que o método é apropriado para a

finalidade pretendida, no caso deste trabalho, a determinação quantitativa de

princípios ativos em produtos farmacêuticos. A validação deve garantir, por meio de

estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações

analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados (ANVISA, 2003).

De modo geral, a metodologia desenvolvida deve apresentar especificidade,

linearidade, intervalo, precisão e exatidão adequados à análise.

Os testes são classificados em quatro categorias, segundo sua finalidade:

• Categoria I: Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em

produtos farmacêuticos ou matérias-primas;

• Categoria II: Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de

impurezas e produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-

primas;

• Categoria III: Testes de performance;

• Categoria IV: Testes de identificação.

Para cada categoria há um conjunto de testes que deve ser realizado,

conforme mostra a Tabela 1.

Tabela 01: Ensaios necessários para a validação do método analítico, segundo sua finalidade.

Parâmetro Categoria I

Categoria II

Categoria

III

Categoria

Quantitativo

Ensaio

limite

Especificidade Sim Sim Sim * Sim

Linearidade Sim Sim Não * Não

Intervalo Sim Sim * * Não

Precisão

Repetibilidade

Sim Sim Não Sim Não

Intermediária

** ** Não ** Não

Limite de detecção Não Não Sim * Não

Limite de quantificação Não Sim Não * Não

Exatidão Sim Sim * * Não

Robustez Sim Sim Sim Não Não

* pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico.

** se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária a comprovação da Precisão

Intermediária.

FONTE: ANVISA, 2003.

2.4.1 Especificidade e Seletividade

O parâmetro especificidade indica a capacidade que o método possui de

medir exatamente um composto, em presença de outros componentes que podem

interferir na sua determinação em uma amostra complexa. A seletividade avalia o

grau de interferência de espécies como outro ingrediente ativo, excipientes,

impurezas e produtos de degradação, bem como outros compostos de propriedades

similares que possam estar, porventura, presentes (RIBANI et al., 2004).

2.4.2 Linearidade

A linearidade corresponde à capacidade de uma metodologia analítica em

demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração

do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. Recomenda-se que a

linearidade seja determinada pela análise de, no mínimo, cinco concentrações

diferentes. O critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) deve ser igual

a 0,99 de acordo com a ANVISA (2003) e maior que 0,90 pelo INMETRO (2003).

2.4.3 Intervalo

O intervalo é a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um

método analítico, dependendo de sua aplicação. É estabelecido pela confirmação de

que o método apresenta exatidão, precisão e linearidade adequadas, quando

aplicados a amostras contendo quantidades de substâncias dentro do intervalo

especificado (ANVISA, 2003). Para o controle de qualidade de matérias-primas ou

produtos ou formas farmacêuticas o intervalo deve ter alcance de 80% a 120% da

concentração teórica do teste.

DRP = ________ x 100

CMD

2.4.4 Precisão

A precisão expressa o grau de concordância entre os resultados em uma

série de medidas feitas para uma mesma amostra homogênea em condições

determinadas (BRAGA e POPPI, 2004). Em geral, é considerada em três níveis

(ANVISA, 2003):

• Repetibilidade (precisão intra-corrida): concordância entre os resultados

dentro de um curto período de tempo, com o mesmo analista e mesma

instrumentação. Recomenda-se um mínimo de nove determinações,

contemplando o intervalo linear do método (três concentrações em triplicatas)

ou um mínimo de seis determinações a 100% da concentração do teste;

• Precisão intermediária (precisão inter-corridas): concordância entre os

resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com

analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes. Recomenda-se um

intervalo mínimo de dois dias.

• Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial): concordância entre os

resultados obtidos em laboratórios diferentes como em estudos colaborativos,

geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica.

A precisão de um método analítico pode ser expressa através do desvio

padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV%), segundo a fórmula:

Onde DP = desvio padrão e CMD = concentração média determinada.

O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia

empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do

método, não se admitindo valores superiores a 5% (ANVISA, 2003).

Exatidão = _____________________________ x 100

concentração teórica

2.4.5 Exatidão

A exatidão de um método analítico representa o grau de concordância entre

os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de

referência aceito como verdadeiro (RIBANI et al., 2004).

Várias metodologias para a determinação da exatidão estão disponíveis

(ANVISA, 2003):

• Fármacos: Pela aplicação da metodologia analítica proposta na análise de

uma substância de pureza conhecida (padrão de referência) ou pela

comparação dos resultados obtidos com aqueles resultantes de uma segunda

metodologia bem caracterizada, cuja exatidão tenha sido estabelecida;

• Forma Farmacêutica: Pela análise de uma amostra, na qual quantidade

conhecida de fármaco foi adicionada a uma mistura dos componentes do

medicamento (placebo contaminado) ou análise pelo método de adição de

padrão, no qual se adiciona quantidades conhecidas do analito (padrão de

referência) ao medicamento.

A exatidão é calculada como porcentagem de recuperação da quantidade

conhecida do analito adicionado à amostra, ou como a diferença porcentual entre as

médias e o valor verdadeiro aceito. Deve ser determinada após o estabelecimento

da linearidade, do intervalo linear e da especificidade. Em geral, é verificada a partir

de, no mínimo, nove determinações contemplando a faixa linear do método (três

concentrações em triplicatas), sendo expressa pela relação entre a concentração

média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente

(ANVISA, 2003):

concentração média experimental

2.4.6 Robustez

A robustez de um método analítico mede a sensibilidade que este apresenta

frente a variações (INMETRO, 2003), ou seja, a capacidade que este tem de resistir

a pequenas e deliberadas mudanças dos parâmetros analíticos. Indica sua

confiança durante o uso normal. Quando constatado a susceptibilidade do método à

variações nas condições analíticas, estas deverão ser controladas e precauções

devem ser incluídas no procedimento. Os principais parâmetros que devem ser

considerados na determinação da robustez de um método espectrofotométrico são:

variação do pH da solução, temperatura e diferentes fabricantes de solventes

(ANVISA, 2003).

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVOS GERAIS

Desenvolver uma metodologia analítica para determinação da associação

Ácido Kójico e Hidroquinona em dermocosméticos, utilizando-se a

espectrofotometria na região do visível associada a métodos de calibração

multivariada, principalmente Regressão de Mínimos Quadrados Parciais (PLSR).

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

i. Otimizar a reação de complexação entre o Ácido Kójico e o íon férrico,

principalmente em relação a quantidade de complexante (Fe

) e pH;

ii. Determinar a estequiometria da reação de complexação entre o Ácido Kójico

e o íon férrico utilizando-se o método da variação contínua (método de Job);

iii. Desenvolver as metodologias espectrofotométricas de curva analítica,

princípio da aditividade espectrofométrica e primeira derivada para

determinação de Ácido Kójico e Hidroquinona através de reações de

complexação;

iv. Desenvolver e otimizar modelos de calibração multivariada (PLSR) para a

determinação dos analitos de interesse;

v. Testar a capacidade de previsão dos modelos obtidos (metodologia

convencional e multivariada), por meio de um conjunto de validação externa;

vi. Validar a metodologia analítica multivariada desenvolvida, segundo os

critérios da ANVISA;

vii. Aplicar a metodologia na determinação de amostras de dermocosméticos

comercializados em farmácias de manipulação da região.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 REAGENTES

Os padrões de hidroquinona e ácido kójico (5-hidróxi-2-(hidroximetil)-4-pirona)

foram de grau farmacêutico, fornecidos pelos laboratórios SP Farma e All Chemistry,

respectivamente.

O Cloreto férrico hexaidratado (FeCl

.6H

O) com teor 97,0-102,0% foi

industrializado por VETEC Química Fina LTDA e os demais reagentes utilizados

foram de grau analítico PA.

Todas as soluções foram preparadas utilizando-se vidraria analítica e água

destilada.

4.2 PREPARO DE SOLUÇÕES

4.2.1 Solução trabalho de Ácido Kójico

Uma solução de ácido kójico (MM:142,11g/mol) na concentração de 5,0E-03

mol L

-1

foi preparada em balão volumétrico de 50,0 mL com água destilada.

4.2.2 Solução trabalho de Hidroquinona

Uma solução de hidroquinona (MM:110,11g/mol) na concentração de 1,0E-03

mol L

-1

foi preparada em balão volumétrico de 100,0 mL com água destilada.

4.2.3 Soluções trabalho de Cloreto Férrico

Soluções de cloreto férrico hexaidratado (MM: 270,30g/mol) de diferentes

concentrações foram preparadas em balões volumétricos com água destilada. A

Tabela 02 indica as concentrações, massas e volumes utilizados para cada etapa

experimental.

Tabela 02: Concentrações das soluções trabalho utilizadas de FeCl

.6H

O, com respectivas massas,

volumes e etapas experimentais.

Concent

ração

(mol L

-1

)

Massa (g) Volume (mL) Etapa experimental

1,5E-03 0,0235 50 Curva Analítica da Hidroquinona

5,0E-03 0,0676 50 Método de Job

5,05E-03 0,0682 50 Planejamento Fatorial 2

8,0E-03 0,1081 50 Estudo Cinético

8,5E-03 0,1149 50 Deslocamento do Planejamento

1,0E-02 0,2703 100

Curva Analítica do Ácido Kójico e

Misturas dos Conjuntos de Calibração e Validação

4.2.4 Soluções trabalho de 1,10-fenantrolina

Soluções de 1,10-fenantrolina (MM:198,22g/mol) foram preparadas nas

concentrações: 4,0E-03 mol L

-1

para construção da curva analítica da hidroquinona

e 6,0E-03 mol L

-1

para o desenvolvimento da metodologia multivariada. Para tal

procedimento, dissolveu-se 1,10-Fenantrolina em etanol (usando-se 10% do volume

total da solução) e diluiu-se em balão volumétrico com água destilada.

4.2.5 Tampão Clark Lubs

Preparou-se uma solução 1,0E-03 mol L

-1

de cloreto de potássio

(MM:74,55g/mol) em pH 3,0. Para tal, pesou-se 0,3728 g de KCl e dissolveu-se em

190 mL de água destilada, em seguida, gotejou-se ácido clorídrico 0,1 mol L

-1

até

obtenção de pH 3,0 e transferiu-se para um balão de 200,0 mL acertando-se o

menisco com água destilada (adaptação: MORITA e ASSUMPÇÃO, 1972).

4.3. ANÁLISE POR ESPECTROFOTOMETRIA UV-VIS

As análises espectrofotométricas foram realizadas em um espectrofotômetro

Shimadzu (2410 PC) - software UVPC v.3.91 (Shimadzu), utilizando cubetas de

vidro de 1,0 cm de caminho óptico, sendo o espectro adquirido na região do visível,

entre 350 e 800 nm. Excetuando-se a análise espectrofotométrica do planejamento

fatorial, deslocamento do planejamento e estudo cinético que foram realizadas em

um espectrofotômetro Shimadzu modelo MultiSpec-1501.

4.4 PLANEJAMENTO FATORIAL

Realizou-se um planejamento fatorial 2

para otimização da reação de

complexação entre o ácido kójico e o íon férrico.

Para execução do planejamento, adicionou-se 1,000 mL da solução trabalho

5,0E-03 mol L

-1

de ácido kójico, ajustou-se os valores de pH adicionando-se HCl

diluído, e finalmente adicionou-se alíquotas apropriadas de uma solução trabalho de

5E-03 mol L

-1

de FeCl

.6H

O, completando-se os balões volumétricos de 10,0 mL

com água destilada. Em seguida, as soluções foram submetidas à análise

espectrofotométrica.

As variáveis e os níveis estudados são mostrados na Tabela 03.

Tabela 03: Variáveis e níveis estudados na reação de complexação entre ácido kójico e íon férrico.

Variáveis\Níveis

- 0 +

[FeC

]

2,5E-04 mol L

5,0E-04 mol L

7,5E-04 mol L

3,0 4,0 5,0

Foram realizados experimentos para todas as combinações possíveis dos

níveis selecionados com quintuplicata do ponto central (cálculo da estimativa do

desvio), totalizando nove ensaios como é mostrado na Tabela 04.

Tabela 04: Ensaios experimentais para todas as combinações possíveis dos níveis selecionados do

planejamento fatorial 2

Ensaio [FeCl

] pH

01 - -

02 + -

03 - +

04 + +

05 0 0

06 0 0

07 0 0

08 0 0

09 0 0

Foram calculados os efeitos principais e de interação, observando-se a

presença ou não de efeitos significativos.

4.4.1 Deslocamento do Planejamento Fatorial

Realizou-se um deslocamento do planejamento fatorial 2

utilizando

concentrações maiores de cloreto férrico. Para isso, uma solução trabalho na

concentração de 8,5E-03 mol L

-1

de FeCl

.6H

O foi utilizada. As variáveis e os níveis

estudados são mostrados na Tabela 05, sendo que as combinações possíveis

desses novos níveis são idênticas ao mostrado na Tabela 04.

Tabela 05: Variáveis e Níveis estudados no deslocamento do planejamento fatorial 2

Variáveis\Níveis

- 0 +

[FeCl

]

7,5E-04 mol L

8,5E-04 mol L

9,5E-04 mol L

3,0 4,0 5,0

4.5 ESTUDO CINÉTICO DA REAÇÃO DE COMPLEXAÇÃO AK-FE(III)

Para realização do estudo cinético, adicionou-se alíquotas de 0,900 mL da

solução trabalho 5,0E-03 mol L

-1

de ácido kójico, 1,000 mL da solução trabalho 8,0

E-03 mol L

-1

de FeCl

.6H

O e completou-se os balões volumétricos de 10,0 mL com

solução tampão Clark Lubs. Em seguida, as soluções foram submetidas a leitura

espectrofotométrica, nos tempos 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 minutos.

4.6 MÉTODO DA VARIAÇÃO CONTÍNUA (JOB)

Para determinação espectrofotométrica da estequiometria do complexo AK-

Fe(III) utilizou-se o método da variação contínua ou método de Job (HARRIS, 2005).

Conforme propõe o método, alíquotas das soluções estoque de ácido kójico e

cloreto férrico de concentrações iguais a 5,0 E-03 mol L

-1

foram utilizadas. Como o

número de mols deve ser mantido constante, fixou-se o volume total (solução de AK

+ solução de Fe[III]) em 1000 µL e variou-se a razão entre os volumes de ácido

kójico e cloreto férrico

o que acarretou na variação da fração molar das espécies

entre 0,1 e 0,9, conforme mostrado na Tabela 06. Completou-se o volume da so-

lução final com tampão Clark Lubs (pH = 3,0) em balão volumétrico de 10,0 mL. Em

seguida, as soluções foram submetidas à análise espectrofotométrica.

Tabela 06: Ensaios do método da variação contínua para determinação da estequiometria do

complexo entre o ácido kójico e o íon férrico.

Ensaio

Razão Molar

(Fe:AK)

Alíquota (µL

)

(Fe/AK)

Fração Molar

01 9:1 900/100 0,900

02 4:1 800/200 0,800

03 3:1 750/250 0,750

04 2:1 667/333 0,667

05 1,5:1 600/400 0,600

06 1:1 500/500 0,500

07 1:1,5 400/600 0,400

08 1:2 333/667 0,333

09 1:3 250/750 0,250

10 1:4 200/800 0,200

11 1:9 100/900 0,100

O gráfico do método das variações contínuas foi obtido representando a

absorbância do complexo AK-Fe(III) em 494 nm versus a fração molar.

4.7 ANÁLISE DO ÁCIDO KÓJICO

Para construção da curva analítica do ácido kójico, foram realizadas diluições

a partir da solução trabalho 5,0E-03 mol L

-1

de AK em balões volumétricos de 10,0

mL com uma faixa de concentração entre 5,0E-05 e 9,5E-04 mol L

-1

. Posteriormente,

adicionou-se solução tampão Clark Lubs (que também foi utilizada para acertar o

menisco) e 800 µL da solução trabalho de FeCl

.6H

O 1,0E-02 mol L

-1

. Em seguida,

as soluções foram submetidas à análise espectrofotométrica.

Os gráficos da curva de calibração foram obtidos representando a

absorbância versus a concentração AK. A 1ª derivada dos dados espectrais foi

obtida com 09 pontos de alisamento derivando o espectro de absorbância versus o

comprimento de onda de AK, e a curva analítica da derivada foi obtida

representando a derivada da absorbância versus a concentração de AK. Para

montagem dos gráficos utilizou-se o software Origin Pro 6.1

4.8 ANÁLISE DA HIDROQUINONA

Para construção da curva analítica da hidroquinona, preparou-se diluições a

partir da solução trabalho de HQ em balões volumétricos de 10,0 mL com uma faixa

de concentração entre 1,0E-05 e 7,0E-05 mol L

-1

. Posteriormente, adicionou-se

solução tampão Clark Lubs (que também foi utilizada para acertar o menisco), 1300

µL da solução trabalho de FeCl

.6H

O 1,5E-03 mol L

-1

e 1200 µL da solução

trabalho de 1,10-Fenantrolina 4,0E-03 mol L

-1

. Em seguida, as soluções foram

submetidas à análise espectrofotométrica.

Os gráficos da curva de calibração foram obtidos representando a

absorbância versus a concentração HQ. A 1ª derivada dos dados espectrais foi

obtida com 09 pontos de alisamento derivando o espectro de absorbância versus o

comprimento de onda de HQ, e as curvas analíticas das derivadas foram obtidas

representando a derivada da absorbância versus a concentração de HQ. Para

montagem dos gráficos utilizou-se o software Origin Pro 6.1 ®.

4.9 ANÁLISE MULTIVARIADA

Para análise da mistura dos compostos adicionou-se alíquotas conhecidas

das soluções trabalho de ácido kójico 5,0E-03 mol L

-1

e hidroquinona 1,0E-03 mol L

. Posteriormente, adicionou-se solução tampão Clark Lubs (que também foi utilizada

para acertar o menisco), 1000 µL de solução de cloreto férrico 1,0E-02 mol L

-1

1000 µL de solução trabalho de 1,10-fenantrolina 6,0E-03 mol L

-1

, em balões

volumétrico de 10,0 mL. Em seguida, as soluções foram submetidas à análise

espectrofotométrica.

O conjunto de calibração constituiu-se por 25 misturas dos analitos de

interesse, dentro da faixa de concentração de 5,0E-05 a 2,5E-04 mol L

-1

para o

Ácido Kójico e 1,0E-05 a 7,0E-05 mol L

-1

para a Hidroquinona. O conjunto de

validação constituiu-se por 07 misturas, sendo 03 dessas em triplicata, dentro da

faixa de concentração utilizada no conjunto de calibração, totalizando 13 misturas

conforme é ilustrado na Figura 11.

Figura 11: Planejamento experimental para obtenção das misturas dos conjuntos de calibração e

validação ( =amostras do conjunto de validação e

=amostra do conjunto de validação realizada

em triplicata)

Para elaboração dos modelos de calibração multivariada empregou-se o

pacote PLS-Toolbox 3.0, que opera em ambiente Matlab 6.1.

4.10 VALIDAÇÃO DO MODELO MULTIVARIADO

O melhor modelo para determinação de ácido kójico e hidroquinona foi

validado segundo critérios estabelecidos pela ANVISA. Os parâmetros analisados

foram especificidade, linearidade, intervalo, precisão (intra-corrida e inter-corridas),

exatidão e robustez.

4.10.1 Especificidade

A especificidade do modelo multivariado foi avaliada através do ensaio de

recuperação em base gel, onde quantidades conhecidas de ácido kójico e

hidroquinona padrão foram adicionadas ao veículo e depois determinadas.

Preparou-se três amostras de dermocosméticos contendo ambos analitos.

Para tal, um saco plástico transparente foi acondicionado em um béquer de forma

que possibilitasse a pesagem de materiais dentro dele. Pesou-se o ácido kójico, em

seguida a hidroquinona, e por fim a base gel, de modo a totalizar cerca de 8,0 g de

dermocosmético. Para cada uma destas amostras, a quantificação foi realizada em

triplicata. Em cada ensaio, pesou-se uma determinada quantidade do

dermocosmético (Tabela 07) em balão de 100 mL e diluiu-se com tampão Clark

Lubs. Uma alíquota de 1000 µL desta solução foi transferida para um balão

volumétrico de 10 mL, sendo adicionada solução tampão (que também foi utilizada

para acertar o menisco), 1000 µL de solução de cloreto férrico 1,0E-02 mol L

-1

1000 µL de solução trabalho de 1,10-fenantrolina 6,0E-03 mol L

-1

. Em seguida, as

soluções foram submetidas à análise espectrofotométrica.

Tabela 07: Ensaios do método de recuperação para determinação da especificidade.

Ensaio

Amostras

Massa

Concentração

(mol L

)

dermocosméticas

pesada (g)

AK 2%

HQ 2%

0,3722 5,24E-05 6,74E-05

02 0,3698 5,21E-05 6,70E-05

03 0,3651 5,15E-05 6,62E-05

AK 2%

HQ 1%

0,7572 1,06E-04 6,92E-05

05 0,7363 1,03E-04 6,73E-05

06 0,7382 1,04E-04 6,75E-05

AK 4%

HQ 1%

0,3637 1,02E-04 3,33E-05

08 0,3673 1,03E-04 3,36E-05

09 0,3673 1,03E-04 3,36E-05

4.10.2 Linearidade e Intervalo

Para avaliação da linearidade do modelo multivariado, construiu-se um gráfico

considerando os valores reais de concentração das amostras em função dos valores

previstos pelo modelo, durante o procedimento de validação cruzada. Esta curva

considerou os valores de concentração das 25 amostras que constituíam o conjunto

de calibração do modelo multivariado. O intervalo de concentração estudado foi a

faixa do modelo multivariado, ou seja, de 5,0 x 10

-5

a 2,5 x 10

-4

mol L

-1

para o ácido

kójico e 1,0 x 10

-5

a 7,0 x 10

-5

mol L

-1

para hidroquinona.

4.10.3 Precisão

Para avaliação da precisão foram realizados ensaios de repetibilidade (intra-

corrida) e precisão intermediária (inter-corridas). Para tais ensaios, foram

preparadas 07 misturas sintéticas das espécies de interesse (conjunto de validação

externa), sendo 03 em triplicata, contemplando o intervalo linear do método.

Em cada ensaio de repetibilidade, adicionou-se alíquotas (Tabela 08)

conhecidas das soluções trabalho de ácido kójico 5,0E-03 mol L

-1

e hidroquinona

1,0E-03 mol L

-1

. Posteriormente, adicionou-se solução tampão Clark Lubs (que

também foi utilizada para acertar o menisco), 1000 µL de solução de cloreto férrico

1,0E-02 mol L

-1

e 1000 µL de solução trabalho de 1,10-fenantrolina 6,0E-03 mol L

-1

em balões volumétrico de 10,0 mL. Em seguida, as soluções foram submetidas à

análise espectrofotométrica.

Tabela 08: Concentrações de ácido kójico e hidroquinona utilizadas nos ensaios de precisão.

Ensaio Volume AK (µL) [AK] (mol L

) Volume HQ (µL) [HQ] (mol L

)

01* 110 5,50E-05 670 6,70E-05

02* 180 9,00E-05 125 1,25E-05

03* 480 2,40E-04 375 3,75E-05

04 380 1,90E-04 475 4,75E-05

05 195 9,75E-05 690 6,90E-05

06 170 8,50E-05 390 3,90E-05

07 280 1,40E-04 175 1,75E-05

* Realizados em triplicata

Para o ensaio de precisão intermediária, foram refeitos os procedimentos de

repetibilidade em dois dias diferentes, por analistas diferentes, no mesmo laboratório

e equipamentos.

A precisão foi expressa na forma de desvio padrão relativo, considerando-se

satisfatórios valores inferiores a 5% (ANVISA, 2003).

4.10.4 Exatidão

Com os resultados das previsões para as amostras sintéticas do conjunto de

validação externa, foi possível verificar a exatidão da metodologia multivariada

utilizando-se a raiz quadrada do erro médio quadrático de previsão (RMSEP) e erro

relativo médio. A exatidão também foi avaliada por meio do ensaio de recuperação

descrito anteriormente no item 4.10.1 especificidade.

4.10.5 Robustez

O único parâmetro de robustez avaliado para a metodologia multivariada foi a

influência da temperatura. Preparou-se uma solução em balão volumétrico de 10

mL, adicionando-se 300 µL da solução de ácido kójico 5,0E-03 mol L

-1

, 400 µL da

solução de hidroquinona 1,0E-03 mol L

-1

, 1000 µL da solução de FeCl

1,0E-02 mol

-1

e finalmente 1000 µL da solução de 1,10-fenantrolina 6,0E-03 mol L

-1

. Para

acertar o menisco, utilizou-se tampão Clark Lubs (pH=3,0). Submeteu-se a solução a

leitura espectrofotométrica em diferentes temperaturas (5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45

e 50

C) utilizando-se um banho termostático (Tecnal TE-184). Os resultados foram

avaliados na forma de um gráfico contendo os espectros da solução em diferentes

temperaturas e a partir da determinação da concentração de AK e HQ dessas

amostras pelo modelo multivariado sob validação.

4.11 ANÁLISE DE AMOSTRAS REAIS

Para avaliação dos modelos multivariados desenvolvidos, foram analisadas

amostras reais contendo a associação em estudo, em base gel. As oito formulações

comerciais, contendo diferentes concentrações de ácido kójico e hidroquinona,

foram obtidas em farmácias de manipulação na região de Ponta Grossa e

Curitiba/PR.

Para análise, pesou-se uma quantidade do dermocosmético (Tabela 09) em

balão de 100 mL diluiu-se com tampão Clark Lubs, agitou-se vigorosamente com

agitador Vortex (B. Braun Biotech International, modelo Certomat MV). Transferiu-se

uma alíquota de 1000 µL desta solução para um balão volumétrico de 10 mL,

adicionou-se solução tampão (que também foi utilizada para acertar o menisco),

1000 µL de solução de cloreto férrico 1,0E-02 mol L

-1

e 1000 µL de solução trabalho

de 1,10-fenantrolina 6,0E-03 mol L

-1

. Em seguida, as soluções foram submetidas à

análise espectrofotométrica.

Tabela 09: Ensaios para análise das amostras reais de dermocosméticos (base gel), obtidos em

farmácias de manipulação da região de Ponta Grossa e Curitiba/PR.

Amostra

Concentração declarad

Massa pesada (g)

01 2,0 % 2,0 % 0,3645

02 2,0 % 1,0 % 0,7284

03 2,0 % 2,0 % 0,3676

04 2,0 % 2,0 % 0,3651

05 2,0 % 2,0 % 0,3668

06 1,0 % 1,0 % 0,7299

07 2,0 % 2,0 % 0,3701

08 2,0 % 1,0 % 0,7364

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 ÁCIDO KÓJICO

Com base na literatura, sabe-se que o ácido kójico reage com o íon férrico na

razão molecular 3 para 1 na faixa de pH de 5 a 6, produzindo um complexo laranja-

amarelado, com absorção máxima em torno de 440 nm, podendo ser utilizado na

determinação espectrofotométrica de ferro (MOSS e MELLON, 1941; MEHLING e

SHEPHERD, 1949). Portanto, no presente projeto, empregou-se o complexo

formado entre o ácido kójico e o íon férrico para determinação espectrofotométrica

do ácido kójico em misturas com hidroquinona.

5.1.1 Resultados da otimização via Planejamento Fatorial

Para otimizar a reação de complexação entre o ácido kójico e o íon ferro (III),

em valores de pH’s menores que os relatados na literatura (a fim de evitar a hidrólise

do íon férrico), realizou-se um planejamento fatorial 2

com quintuplicata do ponto

central (cálculo da estimativa do desvio). Os resultados da otimização via

planejamento fatorial são ilustrados na Tabela 10.

Tabela 10: Resultados da otimização via planejamento fatorial 2

da reação de complexação entre o

ácido kójico e o íon férrico.

Ensaio

[FeCl

]

Absorbância

01 - - 0,45663

02 + - 0,53313

03 - + 0,49389

04 + + 0,53964

05 0 0 0,53531

06 0 0 0,53113

07 0 0 0,53206

08 0 0 0,51952

09 0 0 0,52574

Os resultados da otimização mostram que os efeitos principais: concentração

de cloreto férrico e pH, assim como o efeito de interação foram significativos

(Tabela 11), considerando-se a estimativa do desvio de 0,0132 (0,0062 x 2,132), em

um nível de 90% de confiança.

Tabela 11: Efeitos calculados para otimização via planejamento fatorial 2

da reação de complexação

entre o ácido kójico e o íon férrico.

Efeito Principal Efeito de interação

[FeCl

]

+0,0611 -

+0,0219 -

[FeCl3] x pH

- -0,0154

Uma vez que o efeito de interação é significativo, os efeitos principais não

podem ser interpretados individualmente. Assim, o efeito de interação [FeCl

] x pH

pode ser melhor visualizado na interpretação geométrica mostrada na Figura 12.

Figura 12: Interpretação geométrica do efeito de interação [FeCl

] x pH.

Nesta figura foi possível observar que em 2,5E-04 mol L

-1

de FeCl

(nível -)

um aumento de 0,0373 u.a. ocorre quando varia-se o pH do nível menor para o nível

maior, ou seja, do pH 3,0 para o pH 5,0. No entanto, em 7,5E-04 mol L

-1

de FeCl

(nível +) um aumento menor no valor de absorbância foi observado quando varia-se

o pH, evidenciando que o efeito do pH depende da concentração de cloreto férrico

utilizada. Esse aumento menor no valor de absorbância para uma concentração

maior de FeCl

, provavelmente está relacionado com a hidrólise do íon férrico, que

se inicia em pH ≈ 5 (NURCHI et al., 2010). Ou seja, mesmo com o aumento da

concentração de FeCl

, o aumento do pH diminui a disponibilidade de íons Fe

solução e limita assim, a formação do complexo com o AK.

Em função do efeito do pH diminuir em concentrações maiores de cloreto

férrico, conforme o observado nesse planejamento, realizou-se um segundo

planejamento com o propósito de certificar-se dessa tendência e obter as condições

otimizadas da reação de complexação entre o ácido kójico e o íon férrico.

5.1.2 Deslocamento do Planejamento Fatorial

Para certificar a tendência observada no planejamento anterior e otimizar a

quantidade necessária de cloreto férrico que proporcione a maior complexação do

analito de interesse, fez-se o deslocamento do planejamento 2

para concentrações

de FeCl

maiores. Sendo assim, os níveis (-) e (+) da concentração de FeCl

passaram a ser 7,5E-04 mol L

-1

e 9,5E-04 mol L

-1

respectivamente, utilizando-se os

mesmos pHs e também com quintuplicata do ponto central para cálculo da

estimativa do desvio. Os resultados são ilustrados na Tabela 12.

Tabela 12: Resultados do deslocamento do planejamento fatorial 2

Ensaio

[FeCl

]

Absorbância

01 - - 0,58069

02 + - 0,59458

03 - + 0,59347

04 + + 0,59435

05 0 0 0,59655

06 0 0 0,59596

07 0 0 0,59690

08 0 0 0,60415

09 0 0 0,58413

Através dos cálculos dos efeitos e considerando-se a estimativa do desvio de

0,0153 (0,0072 x 2,132), pode-se constatar que os efeitos principais (concentração

de cloreto férrico e pH) e o efeito de interação não foram significativos (Tabela 13),

considerando-se um nível de confiança de 90%.

Tabela 13: Efeitos calculados para o planejamento 2

deslocado.

Efeito Principal Efeito de interação

[FeCl

]

+0,0074 -

+0,0063 -

[FeCl3] x pH

- -0,0065

Os resultados confirmam a tendência observada anteriormente. Pode-se

concluir que para concentrações de FeCl

acima de 7,5E-04 mol L

-1

, é possível

utilizar qualquer um dos pHs estudados: 3,0, 4,0 ou 5,0, já que os efeitos

observados são menores que a estimativa do desvio.

A importância de se conduzir um planejamento experimental é enfatizada por

Bruns (2003), pois auxilia a planejar detalhadamente um experimento, promove uma

redução dos custos operacionais das análises e garante que os resultados

contenham informações relevantes para a solução do problema.

Em função desses resultados, optou-se por utilizar nas análises 8,0E-04 mol

-1

de cloreto férrico e um tampão inorgânico conhecido como Clark-Lubs (HCl/KCl)

em pH 3,0. Outras soluções tampão foram testadas, tais como: tampão fosfato,

tampão oxalato, tampão tartarato, e tampão citrato. No entanto, todos eles

apresentaram reações de complexação com os íons ferro (II) e ferro (III), sendo este

último, o complexante proposto para este trabalho.

5.1.3 Resultados obtidos através do estudo cinético

Realizou-se um estudo cinético da reação entre o ácido kójico e o íon férrico,

nos intervalos 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 e 27 minutos, para avaliar o tempo

necessário para que a reação de complexação se processasse por completo. Os

espectros na região do visível obtidos são mostrados na Figura 13.

350 400 450 500 550 600 650

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Absorbância (u.a.)

Comprimento de Onda (nm)

0 min.

3 min.

6 min.

9 min.

12 min.

15 min.

18 min.

21 min.

24 min.

27 min.

Figura 13: Espectros de absorção na região do visível do complexo ácido kójico (4,5E-04 mol L

-1

) e

íon férrico (8,0E-04 mol L

-1

) nos intervalos 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 e 27 minutos

Os espectros mostrados na Figura 13 evidenciam que a complexação entre o

ácido kójico e o íon férrico ocorreu por completo desde a primeira leitura. Isso indica

que a reação de complexação é rápida, já que não foi possível observar diferenças

significativas de absorção entre as leituras.

5.1.4 Estequiometria do complexo AK-Fe(III)

Considerando um equilíbrio onde vários complexos podem ser formados, o

método da variação contínua ou método de Job, nos permite identificar a

estequiometria do complexo predominante (HARRIS, 2005). Assim, utilizou-se este

método para determinação espectrofotométrica da estequiometria do complexo

formado entre o ácido kójico e o íon férrico.

O procedimento considera a mistura de alíquotas equimolares de AK e Fe (III)

seguidas pela diluição a um mesmo volume, tal que a concentração total (AK +

Fe[III]) permaneça constante. A absorbância máxima é alcançada na composição

correspondente à estequiometria do complexo predominante (HARRIS, 2005). Os

espectros de absorção na região do visível obtidos através do método da variação

contínua são mostrados na Figura 14.

Figura 14: Espectros de absorção na região do visível dos complexos formados entre ácido kójico e

ferro (III) pelo método da variação contínua

Observou-se que até a proporção 1:1,5 (Fe[III]:AK) houve um aumento linear

da absorbância do complexo à medida que a concentração de cloreto férrico

diminuiu. No entanto, a partir da concentração 2,0E-04 mol L

-1

de FeCl

, a

absorbância do complexo também diminuiu à medida que a concentração de cloreto

férrico diminuiu. Estes resultados deram origem a um gráfico da fração molar versus

a absorbância do complexo AK-Fe(III) em 494 nm, o qual é mostrado na Figura 15.

Figura 15: Gráfico da fração molar vs. a absorbância em 494 nm do complexo formado entre o ácido

kójico e o ferro (III)

No gráfico observou-se que o valor máximo de absorção no comprimento de

onda monitorado corresponde a fração molar de 0,400, o que indica que o complexo

possui estequiometria de 1:1,5, ou seja, 2 moléculas de Fe(lll) para cada 3

moléculas de ácido kójico. A estequiometria resultante do método de Job é diferente

da estequiometria 1Fe(III) : 3AK recentemente reportada por NURCHI e

colaboradores (2010) em um estudo envolvendo os complexos de ácido kójico e

seu derivado (6-[5-hidróxi-2-(hidroximetil)-4-pirona]-5-hidróxi-2-(hidroximetil)-4-

pirona) com os íons metálicos trivalentes Fe(III) e Al(III). Neste trabalho foram

determinadas as constantes de protonação do ácido kójico, bem como, as

constantes de formação do complexo [Fe(AK)

] utilizando-se técnicas

potenciométricas e espectrofotométricas (esta última processada por Análise

Envolvendo Fatores). Além disso, cristais do complexo [Fe(AK)

] foram sintetizados

e submetidos a análise de difração de raio-x que permitiu aos autores determinarem

a estrutura do complexo.

5.1.5 Curva Analítica do Ácido Kójico

Em função dos resultados obtidos através do planejamento fatorial 2

e do

deslocamento do planejamento, a curva analítica do ácido kójico foi obtida

empregando-se a concentração 8,0E-04 mol L

-1

de cloreto férrico e tampão Clark

Lubs em pH 3,0. Através da análise espectrofotométrica do complexo AK

Fe(III)

observou-se uma banda de máxima absorção no comprimento de onda 494 nm,

como é mostrada na Figura 16.

Figura 16: Espectros de absorção na região do visível do complexo ácido kójico e íon férrico (8,0E-04

mol L

-1

) em pH 3,0

Utilizou-se o comprimento de onda (494 nm) para a construção da curva

analítica, sendo que a lei de Beer é obedecida nos limites de concentração entre

5,0E-05 e 9,5E-04 mol L

-1

, indicando uma ampla faixa linear. A equação da reta é

mostrada na Figura 17, na qual se teve um alto coeficiente de correlação.

Figura 17: Curva analítica para determinação de ácido kójico em 494 nm (absorbância x

concentração de AK)

5.2 HIDROQUINONA

Ao contrário do complexo AK

Fe(III)

, a reação de complexação para a

hidroquinona não necessitou de otimização, uma vez que se trata de uma técnica

bastante conhecida, relatada inclusive em diversos livros (SKOOG, 1963;

OHLWEILER, 1974; HARRIS, 2005). Esta metodologia baseia-se na redução do íon

a Fe

pela ação da hidroquinona. A quantidade de Fe

gerada pode ser

determinada através da sua reação com 1,10-fenantrolina gerando um complexo

vermelho-alaranjado, [(C

)

Fe]

formado quantitativamente na faixa de pH 2 a

9 (abaixo de pH 2 a coloração se desenvolve lentamente e é mais fraca), estável por

longos períodos, com absorção máxima em torno de 510 nm, (OHLWEILER, 1974).

A reação de complexação é ilustrada na Figura 18.

Figura 18: Reação de complexação ferro (II) e 1,10-fenantrolina

FONTE: HARRIS, 2002.

5.2.1 Curva Analítica da Hidroquinona

No caso da Hidroquinona, a análise espectrofotométrica individual, evidenciou

uma banda de máxima absorção, no comprimento de onda 510 nm, como é

mostrada na Figura 19.

Figura 19: Espectros de absorção na região do visível do complexo HQ, Fe

(1,95E-04 mol L

-1

) e

1,10-fenantrolina (4,8E-04 mol L

-1

) em pH 3,0

Utilizou-se este comprimento de onda (510 nm) para a construção da curva

analítica, onde se observou que a lei de Beer é obedecida nos limites de

concentração entre 1,0E-05 e 7,0E-05 mol L

-1

. A equação da reta é mostrada na

Figura 20, na qual também se observa um alto coeficiente de correlação.

Figura 20: Curva analítica para determinação de hidroquinona em 510 nm (absorbância x

concentração de HQ)

Analisando as equações das retas obtidas (Figuras 17 e 20), pode-se

observar que o coeficiente angular da hidroquinona é 18 vezes maior que o

coeficiente angular do ácido kójico, indicando que a metodologia analítica para

determinação de hidroquinona é bem mais sensível do que àquela utilizada para a

determinação de ácido kójico.

Devido à proximidade dos comprimentos de onda onde ocorre a máxima

absorção dos compostos (Figura 21), 494 nm para AK e 510 nm para HQ, torna-se

inviável a resolução dos sinais de absorbância, o que dificulta a determinação

simultânea dos analitos em misturas sem nenhuma manipulação dos dados

espectrais.

Figura 21: Espectros de absorção do complexo Fe

e 1,10-fenantrolina para determinação indireta

de HQ (3,0E-05 mol L

-1

) e do complexo AK (5,5E-04 mol L

-1

) e Fe

em pH 3,0

5.3 ÁCIDO KÓJICO E HIDROQUINONA

Determinou-se quantitativamente ácido kójico e hidroquinona quando

associados pelos métodos convencionais de análise (curva analítica, princípio da

aditividade espectrofotométrica e primeira derivada), os quais foram comparados

aos resultados obtidos via calibração multivariada (PLSR).

A capacidade de previsão de cada uma das metodologias univariada ou

multivariada foi avaliada por um conjunto de validação externa contendo 07 misturas

sintéticas das espécies de interesse, sendo 03 delas em triplicata. O parâmetro

quantitativo utilizado para avaliar esta capacidade de previsão foi a raiz quadrada do

erro médio quadrático de previsão (RMSEP).

RMSEP = (Σ

ΣΣ

Σ(C

REAL

– C

PREVISTA

)

/n)

1/2

5.3.1 Curva analítica convencional

Utilizando-se a equação da reta: Abs=0,00224+1206,1[AK], mostrada

anteriormente na Figura 17, pôde-se determinar a concentração de ácido kójico nas

misturas do conjunto de validação, obtendo-se um RMSEP de 4,63E-04 mol L

-1

. Os

resultados de cada amostra do conjunto de validação são mostrados na Tabela 14.

Tabela 14: Resultados obtidos via curva analítica para determinação de ácido kójico nas misturas do

conjunto de validação externa

Valor Real

(mol L

-1

)

Valor Previsto

(mol L

-1

)

Erro Absoluto

(mol L

-1

)

Erro Relativo

(%)

RMSEP

(mol L

-1

)

5,50E-05 6,79E-04 6,24E-04 1135 3,89E-07

5,50E-05 6,74E-04 6,19E-04 1126 3,83E-07

5,50E-05 6,79E-04 6,24E-04 1135 3,89E-07

9,00E-05 2,45E-04 1,55E-04 172 2,40E-08

9,00E-05 2,51E-04 1,61E-04 179 2,59E-08

9,00E-05 2,39E-04 1,49E-04 166 2,22E-08

2,40E-04 6,91E-04 4,51E-04 188 2,03E-07

2,40E-04 6,86E-04 4,46E-04 186 1,99E-07

2,40E-04 6,93E-04 4,53E-04 189 2,05E-07

1,90E-04 7,00E-04 5,10E-04 268 2,60E-07

9,75E-05 7,60E-04 6,63E-04 679 4,39E-07

8,50E-05 5,27E-04 4,42E-04 520 1,95E-07

1,40E-04 3,74E-04 2,34E-04 167 5,48E-08

Médio

470

4,63E

Em seguida, utilizando-se a equação da reta: Abs=-0,00763+21906,6[HQ],

mostrada anteriormente na Figura 20, pôde-se determinar a concentração de

hidroquinona nas misturas do conjunto de validação, obtendo-se um RMSEP de

1,52E-05 mol L

-1

. Os resultados são mostrados na Tabela 15.

Tabela 15: Resultados obtidos via curva analítica para determinação de hidroquinona nas misturas

do conjunto de validação externa.

Valor Real

(mol L

-1

)

Valor Previsto

(mol L

-1

)

Erro

Absoluto

(mol L

-1

)

Erro Relativo

(%)

RMSEP

(mol L

-1

)

6,70E-05 3,98E-05 -2,72E-05 -40,6 7,40E-10

6,70E-05 3,95E-05 -2,75E-05 -41,0 7,56E-10

6,70E-05 3,99E-05 -2,71E-05 -40,4 7,34E-10

1,25E-05 1,41E-05 1,60E-06 12,8 2,56E-12

1,25E-05 1,45E-05 2,00E-06 16,0 4,00E-12

1,25E-05 1,38E-05 1,30E-06 10,4 1,69E-12

3,75E-05 3,92E-05 1,70E-06 4,53 2,89E-12

3,75E-05 3,89E-05 1,40E-06 3,73 1,96E-12

3,75E-05 3,92E-05 1,70E-06 4,53 2,89E-12

4,75E-05 4,01E-05 -7,40E-06 -15,6 5,48E-11

6,90E-05 4,43E-05 -2,47E-05 -35,8 6,10E-10

3,90E-05 3,07E-05 -8,30E-06 -21,3 6,89E-11

1,75E-05 2,13E-05 3,80E-06 21,7 1,44E-11

Médio 20,6 1,52E-05

Como já era esperado, devido à grande sobreposição espectral dos sinais

analíticos das espécies de interesse (Figura 21), foram obtidos altos erros relativos

para a determinação de ambos os analitos através da curva analítica. Também é

possível observar que na maioria das previsões os erros relativos são positivos

(principalmente no caso do AK), ou seja, os valores previstos são maiores que os

valores reais, já que a absorbância utilizada para a determinação é uma soma das

absorbâncias de ambos os complexos formados. Sendo assim, ao ser substituída na

equação da reta, é como se a soma das absorbâncias fosse atribuída somente a um

deles.

Além disso, é possível destacar que na determinação de ácido kójico obteve-

se erro relativo de até 1135% bem superior aos 41% obtido para hidroquinona. Esta

discrepância na capacidade de previsão dos clareadores provavelmente é

decorrente da diferença significativa de sensibilidade de ambas as metodologias,

conforme constatado anteriormente.

5.3.2 Princípio da aditividade espectrofotométrica (Método de Vierordt)

O princípio da aditividade espectrofotométrica ou método de Vierordt

(ABDELLATEF et al., 2007) está baseado na lei de Beer que pode ser aplicada a um

meio contendo mais de uma espécie de substâncias absorventes, sendo que em

cada comprimento de onda a seguinte relação é verdadeira:

total

= A

+...+A

A absorbância total de uma solução em um determinado comprimento de

onda é igual a soma das absorbâncias dos componentes individuais presentes na

solução.

Sendo A = εbc, têm-se:

TOTAL(λ)

= ε

+ ε

+...+ ε

Onde, A=absorbância, ε=absortividade molar, b=caminho óptico e

c=concentração (SKOOG, 2002).

Para determinação de ácido kójico e hidroquinona via princípio da aditividade

espectrofotométrica, além das curvas analíticas já obtidas (AK em 494 nm e HQ 510

nm), construiu-se a curva analítica para o AK (Figura 22 A) em 510 nm e para HQ

em 494 nm (Figura 22 B), obtendo-se o seguinte sistema de equações:

(494 nm)

= A

(HQ 494nm)

+ A

(AK 494 nm)

(510 nm)

= A

(HQ 510 nm)

+ A

(AK 510 nm)

Ou:

(494 nm)

HQ494

. C

+ ε

AK494

. C

= 20398,5. C

+ 1206,1. C

(510 nm)

= ε

HQ510

. C

+ ε

AK510

. C

= 21906,6 . C

+ 1140,7 . C

Sendo ε o coeficiente angular de cada uma das retas obtidas.

Figura 22: Curva analítica (absorbância x concentração) para determinação de AK em 510 nm (A) e

HQ em 494 nm (B)

Os resultados utilizando a metodologia são mostrados na Tabela 16.

Tabela 16: Resultados obtidos via princípio da aditividade espectrofotométrica para determinação de

AK e HQ nas misturas do conjunto de validação externa

Valor Real

(mol L

-1

)

Valor Previsto

(mol L

-1

)

rro Absoluto

(mol L

-1

)

Erro Relativo

(%)

RMSEP

(mol L

-1

)

HQ AK HQ AK HQ AK HQ AK HQ AK

6,70E-05 5,50E-05 3,37E-05 1,11E-04 -3,33E-05 5,60E-05

-49,7

102

1,11E-09 3,14E-09

6,70E-05 5,50E-05 3,32E-05 1,13E-04 -3,38E-05 5,80E-05

-50,4

105

1,14E-09 3,36E-09

6,70E-05 5,50E-05 3,42E-05 1,03E-04 -3,28E-05 4,80E-05

-49,0

87,3

1,08E-09 2,30E-09

1,25E-05 9,00E-05 7,70E-06 1,16E-04 -4,80E-06 2,60E-05

-38,4

28,9

2,30E-11 6,76E-10

1,25E-05 9,00E-05 8,09E-06 1,16E-04 -4,41E-06 2,61E-05

-35,3

29,0

1,95E-11 6,82E-10

1,25E-05 9,00E-05 8,08E-06 1,04E-04 -4,42E-06 1,37E-05

-35,4

15,2

1,95E-11 1,88E-10

3,75E-05 2,40E-04 2,31E-05 3,02E-04 -1,44E-05 6,24E-05

-38,5

26,0

2,08E-10 3,90E-09

3,75E-05 2,40E-04 2,26E-05 3,06E-04 -1,49E-05 6,63E-05

-39,8

27,6

2,23E-10 4,40E-09

3,75E-05 2,40E-04 2,28E-05 3,08E-04 -1,47E-05 6,81E-05

-39,1

28,4

2,15E-10 4,64E-09

4,75E-05 1,90E-04 2,69E-05 2,46E-04 -2,06E-05 5,65E-05

-43,3

29,7

4,23E-10 3,19E-09

6,90E-05 9,75E-05 3,59E-05 1,54E-04 -3,31E-05 5,70E-05

-47,9

58,5

1,09E-09 3,25E-09

3,90E-05 8,50E-05 2,39E-05 1,25E-04 -1,51E-05 4,04E-05

-38,8

47,5

2,29E-10 1,63E-09

1,75E-05 1,40E-04 1,17E-05 1,78E-04 -5,81E-06 3,79E-05

-33,2

27,0

3,37E-11 1,43E-09

Médio

41,4

47,1

2,11E

5,02E

Como podemos observar nos resultados mostrados na Tabela 16, os erros

relativos na quantificação de ambos os analitos continuam elevados (até 105% para

o ácido kójico e 50,4% para a hidroquinona), indicando que essa não seria a

metodologia mais adequada para determinação simultânea desses analitos, devido

a ineficiência deste procedimento em circunstâncias de interferência espectral tão

severa quanto a envolvida neste estudo.

Uma maior exatidão em uma análise desse tipo é atingida quando os

máximos de absorção dos dois analitos não se sobrepõem consideravelmente, de

modo que a substância 1, absorva fortemente no λ1 e fracamente no λ2, e a outra

vice-e-versa (SKOOG, 2002). Como foi possível observar na figura 21, os máximos

de absorção do ácido kójico e da hidroquinona se sobrepõem consideravelmente, o

que explica os erros elevados obtidos na determinação dos compostos por essa

metodologia.

5.3.3 Primeira derivada dos dados espectrais

Na primeira derivada é feita a derivação de primeira ordem dos espectros UV-

Vis de cada analito, para a determinação do λ onde ocorre a derivada da

absorbância igual a zero (ponto de anulação). No ponto em que a derivada da

absorbância de um analito é igual a zero, constrói-se a curva analítica da outra

espécie de interesse e quantifica-a utilizando a equação da reta que relaciona a

derivada da absorbância com a sua concentração (ROCHA e TEIXEIRA, 2004).

Os espectros derivados de primeira ordem do ácido kójico são apresentados

na Figura 23. É possível observar que um ponto de anulação não muito definido

ocorre em λ ≈ 495 nm, comprimento de onda em que foi construída a curva analítica

para determinação de hidroquinona.

Figura 23: Primeira derivada dos espectros na região do visível de ácido kójico

A curva analítica para determinação de hidroquinona construída no ponto de

anulação do acido kójico (λ=495 nm), ou seja, no comprimento de onda em que a

derivada da absorbância do ácido kójico é próxima de zero, é mostrada na Figura

24, onde é possível observar uma relação linear entre a derivada da absorbância

neste comprimento de onda com a concentração de HQ.

Figura 24: Curva analítica derivada para determinação de hidroquinona (da/dλ x concentração HQ)

Com a equação da reta: dAbs = -1,83E-06 + 91,5 [HQ] pode-se determinar a

concentração de hidroquinona nas misturas do conjunto de validação, obtendo-se

um RMSEP de 2,48E-05 mol L

-1

. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 17.

Tabela 17: Resultados obtidos via primeira derivada para determinação de HQ (498 nm) nas misturas

do conjunto de validação externa

Valor Real

(mol L

-1

)

Valor Previsto

(mol L

-1

)

Erro Absoluto

(mol L

-1

)

Erro Relativo

(%)

RMSEP

(mol L

-1

)

6,70E-05 3,18E-05 -3,52E-05 -52,5 1,24E-09

6,70E-05 3,10E-05 -3,60E-05 -53,7 1,30E-09

6,70E-05 3,20E-05 -3,50E-05 -52,2 1,23E-09

1,25E-05 4,83E-06 -7,67E-06 -61,4 5,88E-11

1,25E-05 4,32E-06 -8,18E-06 -65,4 6,69E-11

1,25E-05 4,97E-06 -7,53E-06 -60,2 5,67E-11

3,75E-05 1,48E-05 -2,27E-05 -60,5 5,15E-10

3,75E-05 1,41E-05 -2,34E-05 -62,4 5,48E-10

4,75E-05 2,09E-05 -2,66E-05 -56,0 7,08E-10

6,90E-05 3,29E-05 -3,61E-05 -52,3 1,30E-09

3,90E-05 2,11E-05 -1,79E-05 -45,9 3,20E-10

1,75E-05 6,37E-06 -1,11E-05 -63,6 1,24E-10

Médio 57,6 2,48E-05

Através dos erros relativos da determinação de hidroquinona é possível

observar a presença de erro sistemático negativo, o qual possivelmente está

relacionado com a difícil determinação do ponto de anulação (próximo da região de

495 nm) nos espectros derivados do ácido kójico e com a perda de sensibilidade

ocasionada pela metodologia derivativa. A sensibilidade em métodos derivativos

depende não somente dos parâmetros instrumentais e da forma de medida do sinal,

como também das características do espectro de absorção. A ordem da derivada

deve ser cuidadosamente selecionada, visto que usualmente verifica-se um aumento

do nível de ruído com o aumento da ordem de derivação (ROCHA e TEIXEIRA,

2004).

Os espectros derivados de primeira ordem da hidroquinona são apresentados

na Figura 25, o ponto de anulação ocorre em λ = 510 nm, comprimento de onda em

que foi construída a curva analítica para determinação de ácido kójico.

Figura 25: Primeira derivada dos espectros na região do visível de hidroquinona

Figura 26: Curva analítica derivada para determinação de ácido kójico (da/dλ x concentração de AK)

A curva analítica para determinação de ácido kójico construída no ponto de

anulaç da hidroquinona (λ=510 nm) é mostrada na Figura 26, juntamente com a

equação da reta, onde é possível observar uma falta de linearidade que se traduz

em um baixo coeficiente de correlação (R=0,96066). Esta tendência indica que para

baixas e altas concentrações de AK o erro de previsão do modelo será positivo

enquanto para a faixa intermediária de concentração o erro de previsão será

negativo, gerando indícios da presença de um erro sistemático nesta determinação.

Empregou-se a equação da reta: dAbs = 6,70E-04 – 6,09 [AK], para

determinar a concentração de ácido kójico nas misturas do conjunto de validação,

obtendo-se um RMSEP de 1,67E-04 mol L

-1

. Os resultados são mostrados na

Tabela 18.

Tabela 18: Resultados obtidos via primeira derivada para determinação de AK (510 nm) nas misturas

do conjunto de validação externa

Valor Real

(mol L

-1

)

Valor Previsto

(mol L

-1

)

Erro Absoluto

(mol L

-1

)

Erro Relativo

(%)

RMSEP

(mol L

-1

)

5,50E-05 2,22E-04 1,67E-04 304 2,79E-08

5,50E-05 2,03E-04 1,48E-04 269 2,19E-08

5,50E-05 2,12E-04 1,57E-04 285 2,46E-08

9,00E-05 2,11E-04 1,21E-04 134 1,46E-08

9,00E-05 2,20E-04 1,30E-04 144 1,69E-08

9,00E-05 1,96E-04 1,06E-04 118 1,12E-08

2,40E-04 3,91E-06 -2,36E-04 98,4 5,57E-08

1,90E-04 3,28E-04 1,38E-04 72,6 1,90E-08

9,75E-05 2,46E-04 1,49E-04 152 2,21E-08

8,50E-05 2,28E-04 1,43E-04 168 2,04E-08

1,40E-04 2,72E-04 1,32E-04 94,3 1,74E-08

Médio

6,6

Pode-se observar erros relativos menores para a determinação de HQ

quando comparada a determinação de AK através da primeira derivada.

Provavelmente este fato é decorrente da reta construída para HQ ter um coeficiente

de correlação maior, indicando maior linearidade entre a concentração e a derivada

da absorbância e também maior coeficiente angular, indicando que a metodologia

seria mais sensível para sua determinação.

Comparando-se as metodologias convencionais de calibração é possível

observar que melhores resultados foram obtidos na determinação dos analitos

aplicando a curva analítica para a hidroquinona (RMSEP de 1,52E-05) e o princípio

da aditividade espectrofotométrica para o ácido kójico (RMSEP de 5,02E-05) ao

invés da primeira derivada (RMSEP de 2,48E-05 para HQ e 1,67E-04 para AK). Isso

ocorreu, provavelmente, pela dificuldade na determinação dos pontos de anulação

na primeira derivada, sendo agravado pela sua proximidade (495 nm para AK e 510

nm para HQ), o que acarreta em uma diminuição ainda maior da sensibilidade da

metodologia.

5.3.4 Calibração multivariada

Os espectros na região do visível do conjunto de calibração, composto por 25

espectros UV-Vis (conforme as concentrações do planejamento experimental

ilustrado na figura 11), são apresentados na Figura 27. O desenvolvimento dos

modelos multivariados foi realizado empregando-se a metodologia de Regressão de

Mínimos Quadrados Parciais (PLSR) e procedimento de validação interna cruzada,

particularmente a rotina denominada Leave one out, para auxiliar na escolha dos

melhores modelos construídos. Neste procedimento, a calibração é realizada n

vezes (n = número de amostras) sendo que em cada oportunidade uma das

amostras do conjunto de calibração é retirada e utilizada como amostra de previsão.

Uma vez que todas as amostras tenham sido tratadas como objeto de previsão, é

possível estimar a Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático da Validação Cruzada

(RMSECV) e a Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático de Calibração (RMSEC).

Dentre os vários modelos construídos evidenciou-se a otimização de um modelo

para cada determinação de interesse apresentava as melhores capacidades de

previsão.

Figura 27: Espectros de absorção na região visível das misturas de ácido kójico e hidroquinona do

conjunto de calibração, utilizados no desenvolvimento dos modelos multivariados

5.3.5 Modelo multivariado para determinação de ácido kójico

Para elaboração do modelo multivariado para determinação de ácido kójico, o

conjunto de espectros de absorção na região do visível, foi correlacionado com a

respectiva concentração de ácido kójico. Para melhorar a eficiência dos modelos

multivariados, alguns procedimentos de transformação e pré-processamento de

dados foram testados, sendo estes: primeira derivada com alisamento e/ou dados

centrados na média. Vários modelos foram construídos e os resultados

resumidamente são apresentados na figura 28.

Figura 28: Representação da Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático da Validação Cruzada

(RMSECV) de ácido kójico em função do processamento e do número de variáveis latentes

A partir da figura 28, observou-se que a utilização de um número inferior que

3 VLs gera altos valores de erro para qualquer uma das Transformações/Pré-

processamento. Para as Transformações/Pré-processamento 1 e 2 os menores

valores de erro são obtidos utilizando 3 e 4 VLs, enquanto para a

Transformações/Pré-processamento 3 os menores erros são obtidos com um

número maior de VLs. Optou-se então, por centrar os dados na média e utilizar 03

VLs, pois a escolha de apenas 02 VLs gera erros significativamente maiores

enquanto que a inclusão de mais variáveis latentes não apresenta nenhum ganho

significativo em termos de minimização dos erros. Além disso, a escolha de um

maior número de variáveis latentes pode gerar modelos superestimados e pouco

robustos, o que faz com que pequenas variações de tipo instrumental ou a inclusão

de novas amostras no conjunto de calibração, possam provocar significativa perda

na capacidade de previsão.

Legenda

Tipos de transformação e/ou

pré-processamento

empregados:

1 – Nenhuma transformação

e/ou pré-processamento

2 - Dados centrados na média

3 - Dados centrados na média e

primeira derivada com

alisamento

Em função de todas estas observações, o modelo para determinação de

ácido kójico com melhor capacidade de previsão apresentou as seguintes

características: faixa espectral de 350 a 800 nm, com os dados centrados na média,

e utilização de 03 variáveis latentes. O RMSECV e RMSEC para o modelo

empregando três variáveis latentes foram de 3,45E-06 mol L

-1

e 2,72E-06 mol L

-1

respectivamente. Sendo que a variância capturada para a matriz X é 99,99% e

matriz Y 99,85%.

A análise dos coeficientes de regressão (Figura 29) a partir da decomposição

da matriz em 03 variáveis latentes mostra as regiões espectrais que foram

consideradas relevantes para a correlação desejada. É possível observar regiões

com valores de coeficiente de regressão maiores que estão relacionadas com os

sinais espectrofotométricos das espécies de interesse, por exemplo, em torno de

400 nm há uma leve banda de absorção do complexo formado com o ácido kójico e

em 520 nm há absorção de ambos os complexos formados para a determinação da

hidroquinona e ácido kójico.

Figura 29: Gráfico do coeficiente de regressão vs. comprimento de onda do modelo para AK

O gráfico de loadings apresentado na Figura 30 mostra a contribuição de

cada variável original na elaboração das três primeiras variáveis latentes. É possível

observar que existem informações analíticas importantes nas VLs incluídas no

modelo para AK.

Figura 30: Gráfico de loadings das três primeiras variáveis latentes vs. comprimento de onda do

modelo para AK

A análise do gráfico de “Resíduos de Student vs. Leverage” (Figura 31)

mostra que a amostra 02 (em destaque) possui um alto resíduo, considerando-se

um limite de confiança de 95% (± 2,5), porém não apresenta alta leverage (limite da

leverage é 0,36) considerando-se o modelo construído com 03 variáveis latentes.

Testou-se a retirada da amostra 02 do modelo de ácido kójico, porém a capacidade

de previsão não melhorou significativamente, dando indícios de que a amostra 02

não é uma amostra anômala.

Figura 31: Gráfico dos Resíduos de Student vs. Leverage do modelo para AK

A Figura 32 ilustra o gráfico dos valores reais vs. os valores previstos pelo

modelo de regressão durante a validação interna cruzada, como é possível observar

o modelo apresentou boa capacidade preditiva, já que o valor previsto pelo modelo é

muito próximo ao valor real de concentração do ácido kójico.

Figura 32: Valor Previsto (CV) vs. Valor Real do modelo para AK

R = 0,9995

A capacidade de previsão do modelo também foi analisada por um conjunto

de validação externa, utilizando-se os valores de RMSEP. Os resultados obtidos são

apresentados na Tabela 19.

Tabela 19: Resultados obtidos para o modelo PLSR para determinação de ácido kójico nas misturas

do conjunto de validação externa

Valor Real

(mol L

-1

)

Valor Previsto

(mol L

-1

)

Erro Absoluto

(mol L

-1

)

Erro Relativo

(%)

RMSEP

(mol L

-1

)

5,50E-05 5,87E-05 3,70E-06 6,73 1,37E-11

5,50E-05 5,84E-05 3,40E-06 6,18 1,16E-11

5,50E-05 5,12E-05 -3,80E-06 -6,91 1,44E-11

9,00E-05 8,35E-05 -6,50E-06 -7,22 4,23E-11

9,00E-05 8,57E-05 -4,30E-06 -4,78 1,85E-11

9,00E-05 8,13E-05 -8,70E-06 -9,67 7,57E-11

2,40E-04 2,36E-04 -4,00E-06 -1,67 1,60E-11

2,40E-04 2,38E-04 -2,00E-06 -0,83 4,00E-12

2,40E-04 2,39E-04 -1,00E-06 -0,42 1,00E-12

1,90E-04 1,87E-04 -3,00E-06 -1,58 9,00E-12

9,75E-05 1,00E-04 2,50E-06 2,56 6,25E-12

8,50E-05 8,59E-05 9,00E-07 1,06 8,10E-13

1,40E-04 1,33E-04 -7,00E-06 -5,00 4,90E-11

Médio

4,20

4,49E

Os erros relativos observados na determinação de ácido kójico nas misturas

sintéticas do conjunto de validação através do modelo multivariado foram baixos,

inferiores a 9,7%, com erro relativo médio de 4,20%.

5.3.6 Modelo multivariado para determinação de Hidroquinona

No caso da hidroquinona, o conjunto de calibração, foi correlacionado com a

respectiva concentração de hidroquinona. Para melhorar a eficiência dos modelos

multivariados, alguns procedimentos de transformação e pré-processamento de

dados foram testados, sendo estes: primeira derivada com alisamento e dados

centrados na média. Vários modelos foram construídos e os resultados

resumidamente são apresentados na figura 33.

Figura 33: Representação da Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático da Validação Cruzada

(RMSECV) de hidroquinona em função do processamento e do número de variáveis latentes

Nesta figura observou-se que os menores valores de erro são obtidos com a

utilização da Transformação/Pré-processamento 2 (dados centrados na média) e um

número pequeno de VLs. Optou-se por 02 VLs, pois com a escolha de mais

variáveis latentes não se observou ganho significativo em termos de minimização

dos erros que justificasse essa inclusão.

Assim, o modelo para determinação de hidroquinona com melhor capacidade

de previsão apresentou as seguintes características: faixa espectral de 350 a 800

nm, com os dados centrados na média, e utilização de 02 variáveis latentes. O

RMSECV e RMSEC para o modelo empregando duas variáveis latentes foram de

Legenda

Tipos de transformação e/ou

pré-processamento

empregados:

1 – Nenhuma transformação

e/ou pré-processamento

2 - Dados centrados na média

3 - Dados centrados na média e

primeira derivada com

alisamento

2,93E-06 e 2,53E-06, respectivamente. Sendo que a variância capturada para a

matriz X é 99,96% e matriz Y 98,57%.

A análise dos coeficientes de regressão (Figura 34) a partir da decomposição

da matriz em 02 variáveis latentes mostra as regiões espectrais que foram

consideradas relevantes para a correlação desejada. É possível observar regiões

com valores de coeficiente de regressão maiores, por exemplo, por volta de 510 nm,

que está relacionada com o sinal espectrofotométrico do complexo formado para a

determinação indireta da hidroquinona e pode ser considerada uma região de

extrema importância para determinação do analito.

Figura 34: Gráfico do coeficiente de regressão vs. comprimento de onda do modelo para HQ

Já a Figura 35 contém o gráfico dos loadings, no qual é possível observar que

existem informações analíticas importantes nas duas VLs incluídas no modelo.

Figura 35: Gráfico de loadings das duas primeiras variáveis latentes vs. comprimento de onda do

modelo para HQ

No caso da hidroquinona, outra característica importante foi a ausência de

amostras anômalas no conjunto de calibração. Os limites da leverage, considerando-

se 02 variáveis latentes foi de 0,24. Analisando o gráfico “Resíduos de Student vs.

Leverage” (Figura 36), é possível observar que não há amostras com alto resíduo,

considerando um resíduo de ± 2,5 com 95% de confiança e/ou alta leverage, sendo

assim não há evidências de amostras anômalas no modelo.

Figura 36: Gráfico dos Resíduos de Student vs. Leverage do modelo para HQ

A Figura 37 ilustra o gráfico dos valores reais vs. os valores previstos pelo

modelo de regressão durante a validação interna, como é possível observar o

modelo apresentou boa capacidade preditiva, já que o valor previsto pelo modelo é

muito próximo ao valor real de concentração de hidroquinona.

Figura 37: Valor Previsto (CV) vs. Valor Real do modelo para HQ

R = 0,9950

A capacidade de previsão do modelo da hidroquinona, também foi analisada

por um conjunto de validação externa, utilizando-se os valores de RMSEP. Os

resultados obtidos são apresentados na Tabela 20.

Tabela 20: Resultados obtidos para o modelo PLSR para determinação de hidroquinona nas misturas

do conjunto de validação externa

Valor Real

(mol L

-1

)

Valor Previsto

(mol L

-1

)

Erro Absoluto

(mol L

-1

)

Erro Relativo

(%)

RMSEP

(mol L

-1

)

6,70E-05 6,12E-05 -5,80E-06 -8,66 3,36E-11

6,70E-05 6,15E-05 -5,50E-06 -8,21 3,03E-11

6,70E-05 6,36E-05 -3,40E-06 -5,07 1,16E-11

1,25E-05 1,26E-05 1,00E-07 0,8 1,00E-14

1,25E-05 1,19E-05 -6,00E-07 -4,80 3,60E-13

1,25E-05 1,34E-05 9,00E-07 7,20 8,10E-13

3,75E-05 4,07E-05 3,20E-06 8,53 1,02E-11

3,75E-05 4,06E-05 3,10E-06 8,27 9,61E-12

3,75E-05 4,16E-05 4,10E-06 10,9 1,68E-11

4,75E-05 4,81E-05 6,00E-07 1,26 3,60E-13

6,90E-05 6,46E-05 -4,40E-06 -6,38 1,94E-11

3,90E-05 4,10E-05 2,00E-06 5,13 4,00E-12

1,75E-05 1,81E-05 6,00E-07 3,43 3,60E-13

Médio

6,05

3,25E

Os erros relativos para determinação de hidroquinona nas misturas sintéticas

do conjunto de validação externa através do modelo multivariado foram inferiores a

11%, com erro relativo médio de 6,05%, resultados que podem ser considerados

satisfatórios.

Analisando os valores de RMSEP e erro relativo obtidos na determinação de

hidroquinona e de ácido kójico nas misturas do conjunto de validação externa pelos

métodos convencionais e multivariados (Tabela 21), é possível observar uma

melhora significativa na capacidade de previsão, quando se utiliza o modelo

multivariado, em relação aos modelos convencionais.

Tabela 21: Comparação das metodologias convencionais e multivariadas para determinação de AK e

HQ nas misturas do conjunto de validação externa utilizando-se RMSEP (mol L

-1

) e erro relativo

médio

AK HQ

RMSEP E

(%) RMSEP E

(%)

Curva analítica

4,63E-04 470 1,52E-05 20,6

Método de Vierordt

5,02E-05 47,1 2,11E-05 41,4

Primeira Derivada

1,67E-04 156,6 2,48E-05 57,6

PLSR

4,49 E-06 4,20 3,25 E-06 6,05

A utilização da espectrofotometria na região do visível acoplada ao PLSR

mostrou-se satisfatória para determinação da associação dermocosmética de ácido

kójico e hidroquinona em misturas sintéticas, por se tratar de uma técnica simples,

de baixo custo, alta sensibilidade e por apresentar baixos erros relativos médios.

5.4 RESULTADOS DOS ESTUDOS DE VALIDAÇÃO

Estudos de validação foram realizados, de acordo com critérios estabelecidos

pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária, por meio de sua resolução n°899/03

(ANVISA, 2003). Os indicadores avaliados foram a especificidade, a linearidade, o

intervalo, a precisão, a exatidão e a robustez. Para realização deste estudo, os

modelos multivariados de melhor desempenho foram selecionados, os quais

empregaram faixa espectral de 350 a 800 nm, dados centrados na média, 03 e 02

variáveis latentes para AK e HQ, respectivamente.

5.4.1 Especificidade

A especificidade do modelo multivariado sob validação foi avaliada por ensaio

de recuperação, em que quantidades conhecidas de ácido kójico e hidroquinona

padrão foram adicionadas ao veículo (base gel) e posteriormente determinadas.

Os resultados obtidos para o ensaio de recuperação são apresentados na

Tabela 22.

Tabela 22: Resultados do ensaio de recuperação para determinação da especificidade

Amostra

(2%)

(1%)

(4%)

(1%)

Valor Previsto

(mol L

-1

)

1,18E-03 1,29 E-03 1,14E-03 7,39E-04 2,29E-03 7,11E-04

1,19E-03 1,46 E-03 1,12E-03 7,06E-04 2,15E-03 7,85E-04

1,25E-03 1,31 E-03 1,16E-03 7,15E-04 2,20E-03 6,76E-04

Média (mol L

-1

)

1,21E-03 1,35E-03 1,14E-03 7,20E-04 2,21E-03 7,24E-4

Valor Real (mol L

-1

)

1,13E-03 1,45E-03 1,12E-03 7,32E-04 2,25E-03 7,33E-04

Recuperação

107,08% 93,10% 101,78% 98,36% 98,37% 98,77%

Avaliando os resultados, observou-se que o método multivariado proposto

para determinação dos analitos mostrou especificidade em relação à matriz, com

boas porcentagens de recuperação, próximas a 100%.

5.4.2 Linearidade e Intervalo

A avaliação da linearidade em um modelo multivariado (PLSR ou PCR) é

problemática, já que as variáveis são decompostas pelas variáveis latentes. Assim,

uma medida quantitativa para este parâmetro não corresponde a uma tarefa

simples. Qualitativamente, o gráfico dos resíduos pode indicar se os dados seguem

um comportamento linear, se a distribuição desses resíduos for aleatória

(VALDERRAMA et. al., 2009). Neste trabalho, além de avaliar o gráfico dos resíduos

foi observado os gráficos dos valores reais de concentração das amostras em

função dos valores previstos pelo modelo durante a validação cruzada (Figuras 32 e

37). Os coeficientes de correlação obtidos a partir destas retas foram altos: 0,9995

para o ácido kójico e 0,9950 para a hidroquinona.

Os dados de coeficientes de correlação juntamente com a aleatoriedade dos

resíduos obtidos apresentados na Figura 38, indicam um bom ajuste do modelo

multivariado, sendo este linear na faixa de concentração estudada, ou seja, 5,0E-05

a 2,5E-04 mol L

-1

para o ácido kójico e 1,0E-05 a 7,0E-05 mol L

-1

para hidroquinona.

Figura 38: Gráfico do Resíduo x Valor Real (mol L

-1

) para o ácido kójico (A) e para hidroquinona (B)

5.4.3 Precisão

As análises de precisão envolveram estudos de repetibilidade (precisão intra-

corrida) e precisão intermediária (precisão inter-corridas). A reprodutibilidade do

método não foi analisada tendo em vista a não disponibilidade da realização de

medidas inter-laboratoriais. Neste trabalho, esta figura de mérito analítico foi obtida

através dos cálculos de coeficiente de variação (que foram comparados aos valores

referenciados pela ANVISA) e também através de um valor médio de precisão para

cada um dos analitos, conforme equação abaixo (BRAGA e POPPI, 2004).

onde m é o número de replicatas feitas, n o número de amostras, é a

média dos valores previstos de cada replicata .

Os resultados do ensaio de repetibilidade mostrados na Tabela 23 apontam

dois coeficientes de variação pouco acima da máxima de 5% permitida pela ANVISA

(2003) para este teste. O limite foi ultrapassado para as amostras que contemplam

as menores concentrações analisadas dos analitos, ou seja, nas amostras 01 e 02

para o ácido kójico a hidroquinona, respectivamente. A repetibilidade (mol L

-1

)

alcançada pela metodologia para determinação de AK e HQ foi de 2,91E-06 e

9,27E-07, respectivamente.

Tabela 23: Resultados do ensaio de repetibilidade (precisão intra-corrida)

Amostra 0

Amostra 02

Amostra 03

Concentração

(mol/L)

5,50E-05 6,70E-05 9,00E-05 1,25E-05 2,40E-04 3,75E-05

Previsto

5,87E-05 6,12E-05 8,35E-05 1,26E-05 2,36E-04 4,07E-05

5,84E-05 6,15E-05 8,57E-05 1,19E-05 2,38E-04 4,06E-05

5,12E-05 6,36E-05 8,13E-05 1,34E-05 2,39E-04 4,16E-05

Média 5,61E-05 6,21E-05 8,35E-05 1,26E-05 2,38E-04 4,10E-05

DP 4,25E-06 1,31E-06 2,20E-06 7,51E-07 1,53E-06 5,51E-07

CV (%) 7,57 2,11 2,63 5,94 0,64 1,34

O ensaio de precisão intermediária foi realizado em dois dias diferentes, por

dois analistas diferentes, no mesmo laboratório e mesmos equipamentos. Os

resultados obtidos são apresentados na Tabela 24.

Tabela 24: Resultados do ensaio de precisão intermediária (precisão inter-corrida)

Amostra

Concentração

(mol/L)

5,50E-05 6,70E-05 9,00E-05 1,25E-05 2,40E-04 3,75E-05

Analista 01

5,87E-05 6,12E-05 8,35E-05 1,26E-05 2,36E-04 4,07E-05

5,84E-05 6,15E-05 8,57E-05 1,19E-05 2,38E-04 4,06E-05

5,12E-05 6,36E-05 8,13E-05 1,34E-05 2,39E-04 4,16E-05

Analista 02

6,03E-05 6,81E-05 9,01E-05 1,34E-05 2,36E-04 4,18E-05

6,24E-05 6,60E-05 9,19E-05 1,27E-05 2,40E-04 4,29E-05

5,87E-05 6,65E-05 7,70E-05 1,16E-05 2,36E-04 4,17E-05

Média 5,83E-05 6,45E-05 8,49E-05 1,26E-05 2,38E-04 4,16E-05

DP 3,78E-06 2,83E-06 5,55E-06 7,46E-07 1,76E-06 8,41E-07

CV (%) 6,49% 4,38% 6,54% 5,92% 0,74% 2,02%

No ensaio de precisão intermediária, também obteve-se alguns coeficientes

de variação pouco acima da máxima (5%) permitida pela ANVISA (2003), que

ocorreram nas duas menores concentrações de ácido kójico e na menor

concentração de hidroquinona. A precisão intermediária (mol L

-1

) alcançada pela

metodologia para determinação de AK e HQ foi de 4,50E-06 e 1,96E-06,

respectivamente.

A análise final dos resultados dos ensaios de repetibilidade e precisão

intermediária permite afirmar que o método espectrofotométrico multivariado para

determinação de AK e HQ apresenta-se pouco preciso para as menores

concentrações dos analitos, tanto para análises intra-corrida como inter-corridas.

Além disso, os valores de repetibilidade e precisão intermediária mostraram que a

determinação de ácido kójico foi aquela que apresentou maiores problemas de

precisão.

5.4.4 Exatidão

Com os resultados das previsões para as amostras sintéticas (conjunto de

validação externa), foi possível verificar a exatidão do modelo multivariado,

utilizando-se a raiz quadrada do erro médio quadrático de previsão (RMSEP) e erro

relativo médio. A exatidão também foi avaliada por meio do ensaio de recuperação

discutido anteriormente no item 5.4.1 especificidade.

Os valores de RMSEP e erro relativo médio, para os modelos PLSR

multivariados foram: 3,25E-06 mol L

-1

e 6,05% (Tabela 20) para hidroquinona e

4,49E-06 mol L

-1

e 4,20% (Tabela 19) para o ácido kójico, esses os baixos valores

juntamente com as boas taxas de recuperação (próximas a 100%) indicam que a

metodologia desenvolvida para determinação dos analitos é exata.

5.4.5 Robustez

A análise da robustez determinará as condições próprias em que deve ser

desenvolvida a calibração e os fatores que devem ser levados em conta durante a

construção do modelo (CORRER, 2004). Neste trabalho, o único parâmetro de

robustez avaliado foi a influência da temperatura.

O comportamento espectral da solução contendo a mistura de ácido kójico

(1,5 E-04 mol L

-1

) e hidroquinona (4,0 E-05 mol L

-1

) foi observado em diferentes

temperaturas. A solução foi lida nas temperaturas de 5 a 55°C, com intervalos de

5ºC entre as medidas. Os espectros resultantes são apresentados na Figura 39 e

mostram uma diminuição significativa na absorbância da mistura (λ = 400 a 550 nm)

com o aumento da temperatura, principalmente para temperaturas acima de 35 ºC.

Essa diferença na absorbância indica um erro elevado na determinação de misturas,

nas temperaturas a partir de 40ºC.

Figura 39: Espectros de absorção na região visível da mistura AK (1,5 E-04 mol L

-1

) e HQ (4,0 E-05

mol L

-1

) nas temperaturas de 5 a 55 ºC na avaliação da robustez

Submeteu-se os espectros obtidos em diferentes temperaturas à

determinação dos analitos pelos modelos multivariados sob análise, os resultados

são apresentados na Tabela 25.

Tabela 25: Resultados obtidos na determinação da mistura AK (1,5 E-04 mol L

-1

) e HQ (4,0 E-05 mol

-1

) via PLSR em diferentes temperaturas na avaliação da robustez

Valor Real

(mol L

-1

)

Valor Previsto

(mol L

-1

)

Erro Relativo

(%)

Temperatura

(ºC)

4,00E-05

1,50E-04

3,87E-05

1,38E-04

-3,38 -7,73 05

4,00E-05

1,50E-04

3,80E-05

1,46E-04

-4,95 -2,47 10

4,00E-05

1,50E-04

3,73E-05

1,49E-04

-6,68 -0,73 15

4,00E-05

1,50E-04

3,67E-05

1,52E-04

-8,33 1,40 20

4,00E-05

1,50E-04

3,81E-05

1,47E-04

-4,73 -2,20 25

4,00E-05

1,50E-04

3,76E-05

1,54E-04

-6,03 2,67 30

4,00E-05

1,50E-04

3,59E-05

1,56E-04

-10,2 3,67 35

4,00E-05

1,50E-04

3,33E-05

1,56E-04

-16,9 4,07 40

4,00E-05

1,50E-04

2,93E-05

1,57E-04

-26,8 4,80 45

4,00E-05

1,50E-04

2,51E-05

1,57E-04

-37,4 4,80 50

4,00E-05

1,50E-04

2,34E-05

1,52E-04

-41,6 1,20 55

Observou-se que a determinação de ácido kójico não sofre influência da

temperatura, considerando-se o comportamento aleatório dos erros relativos e seus

baixos valores (valores inferiores a 7,8%).

As porcentagens de erro relativo superiores a 10,2% observadas para

determinação de hidroquinona e o aumento crescente deste parâmetro conforme

ocorre o aumento da temperatura indicam a limitação na capacidade preditiva do

método multivariado, quando a temperatura das amostras é elevada, ou seja,

quando a temperatura é superior a 35ºC. Este aumento no erro relativo de previsão,

provavelmente está relacionado com o fato da degradação oxidativa da hidroquinona

ser acelerada pelo calor (MANOSROI et al., 1999). Assim, recomenda-se que a

leitura das misturas contendo ácido kójico e hidroquinona seja realizada nas

temperaturas entre 5 a 35 ºC.

5.5 ANÁLISE DE AMOSTRAS REAIS

A metodologia multivariada desenvolvida foi utilizada para a determinação de

ácido kójico e hidroquinona em 08 formulações obtidas em farmácias de

manipulação da região, contendo diferentes concentrações dos analitos em base

gel. Os resultados das análises destes dermocosméticos são apresentados na

Tabela 26.

Tabela 26: Resultados de previsão de ácido kójico e hidroquinona

em amostras reais, utilizando-se o

método multivariado desenvolvido

Dermocosmético

Concentração declarada

(% m/m)

Concentração

Prevista (% m/m)

Erro (%)

AK HQ AK HQ AK HQ

Manipulado 1 2,00 2,00 2,74 1,94 37,0 -3,00

Manipulado 2 2,00 1,00 2,52 1,09 26,0 9,00

Manipulado 3 2,00 2,00 2,18 1,82 9,00 -9,00

Manipulado 4 2,00 2,00 2,33 2,84 16,5 42,0

Manipulado 5 2,00 2,00 2,12 1,93 6,00 -3,50

Manipulado 6 1,00 1,00 1,14 1,12 14,0 12,0

Manipulado 7 2,00 2,00 5,49 1,59 175 -20,5

Manipulado 8 2,00 1,00 5,15 0,96 158 -4,00

Observou-se nos resultados de quantificação, valores de erro relativo de até

42,0% para hidroquinona e 175,0% para o ácido kójico, sendo que neste último

caso, existe uma clara tendência de superestimar as concentrações declaradas pelo

fabricante.

Dois casos da Tabela 26 merecem ser destacados, pelos altos valores de

erros relativos apresentados para a determinação de AK. O manipulado 7 e 8 são

provenientes da mesma farmácia de manipulação, que produz suas formulações em

gel Aristoflex (co-polímero sintético de ácido sulfônico acriloildimetiltaurato e

vinilpirrolidona), diferente dos demais manipulados que utilizam gel Natrosol

(Hidroxietilcelulose). Outra particularidade desses manipulados é a utilização de

metabissulfito como agente conservante. O segundo caso, está relacionado ao

manipulado 1 e 2, provenientes de outra farmácia de manipulação e que utiliza para

estas formulações os conservantes imidazolidinil uréia e isotiazolinona. Estas

características indicam que a metodologia deve ser usada com precaução, já que o

tipo de base gel e os conservantes utilizados evidenciaram interferências na

metodologia de quantificação.

Outro fator que não pode ser descartado em relação às variações

encontradas para formulações similares (manipulado 3 e 4) é a falta de

homogeneidade das amostras de dermocosméticos, já que para esta análise foi

retirada uma pequena alíquota (0,3 g a 0,8 g) da amostra para diluição.

6 CONCLUSÕES

Considerando os resultados apresentados e discutidos neste projeto é

possível concluir que:

Através do planejamento fatorial, observou-se que para concentrações de

FeCl

acima de 7,5E-04 mol L

-1

a reação de complexação entre o ácido kójico e o

íon férrico não sofre influência do pH, podendo ser utilizados qualquer um dos pHs

estudados. Com as condições já otimizadas, optou-se por utilizar a concentração

8,0E-04 mol L

-1

de cloreto férrico e tampão Clark Lubs em pH 3,0.

O método da variação contínua nos permitiu identificar que a estequiometria

predominante do complexo AK-Fe(III) é 1:1,5, ou seja, 2 moléculas de Fe(lll) para

cada 3 moléculas de ácido kójico.

A severa interferência espectral observada para os complexos formados

inviabilizou a determinação dos analitos utilizando-se os métodos convencionais de

análise (curva analítica, princípio da aditividade espectrofotométrica e primeira

derivada), resultando em erros relativos médios muito altos (maiores que 20%, para

ambos clareadores).

A espectrofotometria na região do visível acoplada a técnica de calibração

multivariada (PLSR), apresentou-se adequada para determinação dos analitos em

misturas sintéticas, com erros relativos médios de previsão de 4,20% para o ácido

kójico e 6,05% para hidroquinona. Os modelos multivariados de melhor capacidade

preditiva apresentaram como características: a utilização de toda faixa espectral,

dados centrados na média e a utilização de 03 e 02 variáveis latentes para o ácido

kójico e a hidroquinona, respectivamente.

Na fase de validação, segundo os critérios da ANVISA, a metodologia

espectrofotométrica multivariada desenvolvida, apresentou boa exatidão,

especificidade em relação a matriz e linearidade na faixa de concentração estudada.

No parâmetro precisão, coeficientes de variação pouco acima da máxima permitida

pela legislação foram obtidos para as menores concentrações de ácido kójico e

hidroquinona. A leitura de amostras em temperatura superior a 35ºC tem influência

direta sobre a capacidade preditiva do método desenvolvido, aumentando a margem

de erro para determinação de hidroquinona.

Na análise de amostras reais, altos valores de erros relativos foram

encontrados para a determinação dos analitos, especialmente para determinação de

ácido kójico. Estes problemas podem estar associados a presença de interferentes

(base gel ou conservantes). No entanto, é pertinente salientar que o método

desenvolvido mostrou-se promissor para aplicação em rotinas de controle de

qualidade, por se tratar de uma técnica rápida, de baixo custo e praticamente sem

produção de resíduos de grande impacto ambiental.

7 TRABALHOS FUTUROS

A realização deste trabalho permitiu vislumbrar possibilidades para trabalhos

futuros. Seguem-se algumas sugestões:

• Desenvolver modelos de calibração multivariada para determinação da

associação de ácido kójico e hidroquinona em dermocosméticos

empregando-se a espectrofotometria em fase sólida através de medidas de

reflectância na região do visível.

• Desenvolver uma metodologia analítica para determinação de ácido kójico e

hidroquinona em dermocosméticos empregando-se técnicas voltamétricas

associadas a métodos de calibração multivariada.

• Realizar um estudo mais aprofundado da aplicabilidade da metodologia

proposta, frente a utilização de diversos tipos de conservantes nas

formulações dermocosméticas.

• Desenvolver metodologias espectroscópicas multivariadas para quantificação

de diversos princípios ativos, visando a aplicação em rotinas controle de

qualidade produtos farmacêuticos manipulados.

8 GLOSSÁRIO

Análise de Componentes Principais (Principal Components Analysis): Método

que decompõe a matriz de dados, construindo-se um novo sistema de eixos

(denominados componentes principais ou variáveis latentes). Isto possibilita que as

amostras possam ser representadas e visualizadas em um número menor de

dimensões, sem perda de informação analítica relevante.

Centrar os dados na média: procedimento de pré-processamento que tem como

objetivo facilitar a extração de informações espectrais, bem como, a interpretação

desses dados. Calcula-se a média das absorbâncias para cada comprimento de

onda e subtrai-se cada absorbância do respectivo valor médio.

Leverage: é uma medida da influência de uma amostra no modelo de regressão.

Um valor de leverage pequeno indica que a amostra em questão influencia pouco na

construção do modelo de calibração.

Loadings: o quanto cada variável antiga contribui para formar as componentes

principais.

Primeira derivada com alisamento: procedimento de transformação de dados que

permite melhorar a separação de sinais não totalmente sobrepostos com a

diminuição de ruídos instrumentais.

Regressão de Mínimos Quadrados Parciais (Partial Least Square Regression):

método de regressão multivariada em que, tanto a matriz das variáveis

independentes, como a das variáveis dependentes sofrem decomposição matricial,

sendo representadas na forma de “scores” e “loadings”.

Resíduos de Student (ou resíduos studentizados): indicam se as amostras estão

incluídas na distribuição normal, considerando-se um intervalo de confiança de 95%.

Scores: são as novas coordenadas das amostras, no novo sistema de eixos.

Validação cruzada: é uma metodologia utilizada para a escolha do número de

variáveis latentes baseada na avaliação da magnitude dos erros de previsão de um

dado modelo de calibração.

Variáveis latentes (ou Componentes Principais): novo sistema de eixos para

representar as amostras.

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