( PDF ) Desenvolvimento e padronização de um método molecular diagnóstico de larga escala para infecções virais do trato respiratório

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Rodrigo Melim Zerbinati

“DESENVOLVIMENTO E PADRONIZAÇÃO DE UM MÉTODO

MOLECULAR DIAGNÓSTICO DE LARGA ESCALA PARA

INFECÇÕES VIRAIS DO TRATO RESPIRATÓRIO”

Dissertação apresentada ao Instituto de Medicina

Tropical de São Paulo da Universidade de São Paulo

para obtenção do titulo de Mestre em Ciências

Área de concentração: Doenças Tropicais e Saúde

Internacional

Orientador: Dr. Luiz Vicente R. Ferreira da Silva Filho

São Paulo

2010

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Ficha catalográfica

Preparada pela Biblioteca do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo da

Universidade de São Paulo

Zerbinati, Rodrigo Melim

Desenvolvimento e padronização de um método molecular

diagnóstico de larga escala para infecções virais do trato respiratório /

Rodrigo Melim Zerbinati. – São Paulo, 2010.

Dissertação (Mestrado) – Instituto de Medicina Tropical de São

Paulo da Universidade de São Paulo para obtenção do título de

Mestre em Ciências.

Área de concentração: Doenças Tropicais e Saúde Internacional

Orientador: Luiz Vicente R. Ferreira da Silva Filho

Descritores: 1. VIROLOGIA. 2. TÉCNICAS E PROCEDIMENTOS

DE LABORATÓRIO. 3. INFECÇÕES RESPIRATÓRIAS. 4. REAÇÃO

EM CADEIA POR POLIMERASE.

USP/IMTSP/BIB-02/2010.

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Universidade de São Paulo

Insitituto de Medicina Tropical de São Paulo

Candidato: Rodrigo Melim Zerbinati

Titulo da Dissertação: “DESENVOLVIMENTO E PADRONIZAÇÃO DE UM

MÉTODO MOLECULAR DIAGNÓSTICO DE LARGA ESCALA PARA INFECÇÕES

VIRAIS DO TRATO RESPIRATÓRIO”

Orientador: Dr. Luiz Vicente R. Ferreira da silva Filho

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em

sessão pública realizada a ......./......../........, considerou

( ) APROVADO(A) ( ) REPROVADO(A)

Examinador(a)

Assinatura

..................................................................................

Nome

..................................................................................

Instituição

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Examinador(a)

Assinatura

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Nome

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Instituição

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Presidente

Assinatura

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Nome

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Instituição

..................................................................................

À Adriana, amada esposa. Pelo seu amor e companheirismo,

sempre dando suporte e apoio para realização de todos os

meus objetivos. Sem ela jamais teria passado por essa fase

da minha vida.

Aos meus pais, que com muito esforço, amor, carinho e

dedicação me educaram da melhor forma possível.

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Luiz Vicente R. F. Da Silva Filho por ter me proporcionado a realização

deste trabalho, sendo seu aluno. Por ser um orientador acima de qualquer

expectativa. Passando com muita paciência todo seu conhecimento. Dedicando o

máximo do seu tempo para realização deste trabalho. Pela sua dedicação e por

estar sempre disponível quando precisei. E mesmo nas horas profissionais ser um

amigo.

À Adriana F. Tateno por ter dedicado uma grande parte do seu tempo me ajudando

na realização deste trabalho. Por me ensinar, com muita paciência, todos os seus

conhecimentos em biologia molecular e técnicas de detecção de vírus. Pela grande

contribuição no desenvolvimento do projeto. Além do suporte na finalização do

mesmo.

À minha família que sempre esteve presente na minha vida, dando suporte e

atenção a todos os meus objetivos.

Ao Prof. Dr. Claudio Sergio Pannuti, que ao me aceitar como aprimorando no

Laboratório de Virologia me abriu grandes portas para o conhecimento. Pela

participação em projetos sobre sua supervisão, me proporcionando conhecimento

em virologia.

À Lucy Santos Villas Boas pela sua ajuda na realização das metodologias

tradicionais de detecção de vírus respiratórios. Pelos seus ensinamentos em

imunoflurescência e isolamento viral em cultura de células. E pela sua amizade.

Ao Dr. José Eduardo Levi, que sempre esteve disponível para me ajudar com as

dúvidas de técnicas em biologia molecular.

À Dr. Vanda Akico Ueda pelos ensinamentos em sorologia e virologia. Pelo apoio

no início da minha caminhada na pós-graduação.

À Dr. Clarisse M. Machado pela contribuição no meu desenvolvimento no

laboratório. Por ter me convidado a participar do projeto com vírus respiratórios em

pacientes de transplantes de células hematopoiéticas sobre sua supervisão.

À Cristina Mendes de Oliveira pela sua grande amizade. Pela sua ajuda e pelos

tantos cigarros fumados na hora do estresse.

Ao Marcelo Plaisant, grande amigo. Pelos momentos de descontração. Pelas

conversas sem sentido e por conservar o apartamento.

Ao Prof. Dr. Heitor Franco Andrade Junior, presidente da Comissão de pós-

graduação em Medicina Tropical do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo.

Pelo seu apoio e pelo seus ensinamentos.

Ao Dr. Andrés J. Galisteo Jr por me ajudar com a encadernação do trabalho,

suporte e pela amizade.

À Secretaria do Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical do Instituto de

Medicina Tropical de São Paulo pelo suporte oferecido.

Aos amigos Sonia e Luciano que tanto ajudaram em diversos momentos.

Aos amigos Daniel, Cícero e Anderson pela conversas, o futebol e momentos de

descontração.

Aos amigos e colegas do laboratório, Prof. Dr. Aluísio Segurado, Dra. Daisy

Machado, Ana Carolina Mamana, Jaila Borges, Camila Romano, Tânia Tozetto,

Célia Luiza Rodrigues, Renata Romão, Luciana Aguiar, Adriana Machado, Silvia

Helena Lima, Maria Cristina Fink, Laura M. Sumita, Cynthia Canto, Renato Reis

Oliveira, Paulo Urbano, Luiz Nali, Cristiane Centrone, Maria Carolina Bernal, Wilton

Freire, José de Paula Paz, Maria Auxiliadora Felix de Lima, Alessandra Machado,

Marli de P. Estevam, Débora Alves dos Santos, José Eduardo R. Martins, pela boa

convivência durante todos esses anos.

Aos colegas do LIM 56, Dra. Erica Fuji e Dra. Karen Brunialti, pelo suporte e ajuda

com as corridas eletroforéticas capilar no seqüenciador MegaBace®.

Agradeço à CAPES - Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de

nível superior, pelo apoio financeiro.

À todos aqueles que direta ou indiretamente participaram deste trabalho.

“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho

original.”

- Albert Einstein

“A experiência nunca falha, apenas as nossas opiniões falham, ao esperar da

experiência aquilo que ela não é capaz de oferecer.”

- Leonardo Da Vinci

“A maior ameaça ao domínio do homem sobre o planeta é o vírus.”

- Joshua Lederberg

RESUMO

Zerbinati, R M. Desenvolvimento e Padronização de um Método Molecular

Diagnóstico de Larga Escala para Infecções Virais do Trato Respiratórias.

A grande diversidade etiológica associada às infecções respiratórias e os diferentes

impactos clínicos imediatos e tardios associados a algumas destas causas indicam

a necessidade de se avançar nos métodos de investigação etiológica de infecções

respiratórias agudas. O uso de métodos em larga escala capazes de detectar

múltiplos agentes parece ser a abordagem ideal para a investigação etiológica das

infecções respiratórias agudas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e

padronizar um método baseado em RT-PCR e PCR convencional, com detecção

de fragmentos através de eletroforese capilar em seqüenciador automatizado, para

identificação concomitante de 11 diferentes vírus respiratórios. Os primers foram

selecionados através de pesquisa na literatura e previamente testados com

amostras clínicas. As reações de PCR e RT-PCR foram padronizadas para

realização em placa de 96 orifícios, sendo que cada coluna corresponde às

diferentes reações para identificação dos alvos e cada linha às amostras. O método

foi testado em 72 amostras de lavado nasofaríngeo de crianças com fibrose cística

atendidas na Unidade de Pneumologia do Instituto da Criança HCFMUSP. Uma

mistura única foi padronizada, à exceção dos primers, para todos os alvos; o

mesmo foi feito para os parâmetros de ciclagem. Como controle interno da reação

foram testadas a amplificação do gene da beta-actina e do gene Npro do vírus da

diarréia bovina (BVDV). A amplificação do gene Npro do BVDV apresentou

resultados mais satisfatórios e foi escolhida como controle interno da técnica. A

revelação dos produtos de cada reação foi feita com pools de 5!l de cada linha

para a corrida eletroforética em capilar no seqüenciador automatizado MegaBace.

O primer forward de cada reação foi marcado com uma fluorescência para a

detecção no seqüenciador. Como controle positivo da reação foi construído um

plasmídeo contendo todas as seqüências alvos. Amostras do controle com

diluições seriadas foram testadas, assim como amostras clínicas para avaliar

sensibilidade e especificidade, e a técnica foi ainda comparada ao método de PCR

em tempo real para alguns vírus respiratórios. A sensibilidade para diluições

seriadas do controle positivo foi de 100 cópias por reação, para todos os alvos. O

método foi capaz de identificar pelo menos um vírus em 33 amostras (46%) e em

39 amostras (64%) nenhum vírus foi identificado. Os picornavirus foram

identificados em 30,5% das amostras, seguido por bocavírus humano em 6,9%,

parainfluenza 3 e influenza A em 4,2%, e influenza B, coronavírus humano e

metapneumovírus humano em 1 amostra cada. Quando comparado ao método de

PCR em tempo real, uma concordância de 94% dos resultados foi observada. Estes

resultados indicam que o método de PCR/RT-PCR em placa com detecção de

produtos através de eletroforese capilar no seqüenciador automatizado apresenta

sensibilidade e especificidade adequadas para a detecção de 11 diferentes vírus

respiratórios em amostras de lavado nasofaríngeo, capaz de ser utilizado para

estudos de larga escala.

Descritores: 1. VIROLOGIA. 2. TÉCNICAS E PROCEDIMENTOS DE

LABORATÓRIO. 3. INFECÇÕES RESPIRATÓRIAS. 4. REAÇÃO EM CADEIA

POR POLIMERASE

ABSTRACT

Zerbinati, R M. Development and Standardization of a High Throughput Molecular

Diagnostic Method for Viral Respiratory Tract.

The etiological diversity associated with respiratory infections and the diverse

clinical impact associated with them indicate the need for further research on

techniques for etiological diagnosis of acute respiratory infections. The use of high

throughput methods able to identify multiple agents seems to be the ideal approach

for etiological investigation of acute respiratory infections. The aim of this study was

to develop and standardize a method based on RT-PCR and PCR with fragment

detection using automated fluorescent capillary electrophoresis to identify 11 distinct

respiratory viruses. The primers were selected by searching the literature and

previously tested with clinical samples. The standardization of the PCR and RT-

PCR reactions was performed in 96-wells plates, which each column corresponding

to different reactions to identify the targets and each row corresponding to the

samples. The method was tested in 72 nasopharyngeal aspirate samples from

cystic fibrosis children attending the Unidade de Pneumologia at Instituto da Criança

- HCFMUSP. A unique mix was determined, except for the primers, for all targets’

amplification and the same was done for the cycling parameters. We tested both

amplification of beta-actin gene and Npro gene of bovine diarrhea virus (BVDV) as

internal controls of the reaction. The BVDV Npro gene amplification showed best

results and was chosen as the internal control. PCR and RT-PCR products’

detection was done by pooling 5 !l of each reaction for each sample and

transferring it to automated fluorescent capillary electrophoresis in the DNA

sequencer MegaBace®. Forward primers of all reactions were labeled with

fluorescence for detection in the sequencer. As a positive control, a plasmid

containing all sequence targets was designed. Serial dilutions of positive control

(plasmid) as well as clinical samples were used to evaluate sensitivity and

specificity, and a comparison with real time PCR method was made for some

viruses. Sensitivity for detection of the positive control was 100 copies per reaction

for all targets. The method was able to identify at least one virus in 33 samples

(46%) and in 39 samples (64%) no virus was identified. The picornaviruses were

identified in 30.5% of samples, followed by human bocavirus in 6.9%, and

parainfluenza 3 and influenza virus A in 4.2% of the samples, while influenza virus

B, human coronavirus, and human metapneumovirus were identified in 1 sample

each. When compared with real-time PCR, a concordance of 94% was observed.

These results indicate that the method based on PCR/RT-PCR done in a plate with

detection of products by automated fluorescent capillary electrophoresis showed

appropriate specificity and sensitivity to detect 11 distinct respiratory viruses in

nasopharyngeal aspirate samples, able to be used in high throughput studies.

Descriptors: 1. VIROLOGY. 2. LABORATORY TECHNIQUES AND PROCEDURES.

3. RESPIRATORY INFECTIONS. 4. POLYMERASE CHAIN REACTION.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etideo

mostrando produtos de amplificação por PCR de reações individuais para

identificação dos vírus respiratórios. M – marcador de peso molecular 100pb; 1 -

RSV; 2 - InfV A; 3 - InfV B; 4 - PIV 1; 5 - PIV 2; 6 - PIV 3; 7 - hAdV; 8 - hMPV; 9 -

hCoV; 10 - Picornavírus; 11 - hBoV e 12 - Controle interno (beta-

actina)...................................................................................................................... 43

Figura 2: Perspectiva gráfica dos diferentes tamanhos dos amplímeros de cada

alvo. Os primers selecionados geram produtos com uma diferença mínima de cinco

pares de base. A menor diferença foi observada entre os produtos gerados para

hMPV e hBoV (7 pb)................................................................................................ 44

Figura 3: Representação esquemática da distribuição de ragentes e amostras nas

placas para identificação de 11 vírus respiratórios e amplificação do controle do

método..................................................................................................................... 46

Figura 4: Representação esquemática do preparo da placa de PCR utilizando

micropipetas eletrônicas em modo seqüencial para distribuição dos primers nas

colunas correspondentes para cada alvo, micropipeta multicanal (12 canais) para

distribuição da mistura única e micropipeta para distribuição de amostras em cada

linha......................................................................................................................... 47

Figura 5: Imagem gerada pela software de análise de fragmento mostrando pico

correspondente ao fragmento do gene b-actina de 525 pares de bases e o

aparecimento de picos de inespecificidades de aproximadamente 420pb e

470pb....................................................................................................................... 48

Figura 6a: Imagem gerada pelo software de análise de fragmentos do pico

resultante da amplificação do gene Npro do BVDV com 161pb.............................. 49

Figura 6b: Imagem gerada pelo software de análise de fragmentos dos picos

resultantes da amplificação do do gene Npro do BVDV com 161pb e da região 5`

não codificante (5`NCR) Picornavírus (PicV) com tamanho de 390pb.................... 49

Figura 7: Seqüência do fragmento construído para atuar como controle positivo de

todas as amplificações do método. As seqüências dos primers de cada uma das

etiologias estão destacadas por caixas de cor diferente, uma para cada alvo. A

seqüência de um organismo vegetal (Populus trichocarpa) foi inserida no fragmento

para checagem de eventuais suspeitas de contaminação...................................... 51

Figura 8: Representação gráfica do pool de produtos de PCR formado a partir de

uma linha da placa, correspondente a uma amostra, para corrida eletroforética

capilar em seqüenciador de DNA. A placa que vai ao seqüenciador contém os pools

de cada linha, comportando portanto 12 placas de PCR (72 amostras, 12 controles

positivos e 12 negativos)......................................................................................... 53

Figura 9: Visualização do Software “Fragment Analysis”, com uma imagem dos

resultados de uma amostra de amplificação de controle positivo – picos das

diferentes amplificações. No eixo vertical podemos observar a altura dos picos

(intensidade) de cada fragmento em Unidades Relativas de Fluorescência. No eixo

horizontal é visualizado o tamanho do fragmento gerado pela reação em pares de

base......................................................................................................................... 54

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Primers e sondas utilizadas na PCR em tempo real............................. 41

Quadro 2: Seqüências dos primers selecionados com suas respectivas

características e referências.................................................................................... 45

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Vírus identificados pelo método de analise fragmento (VR11) nas 72

amostras estudadas................................................................................................ 55

Tabela 2: Comparação dos resultados de identificação viral em 72 amostras de

lavado nasofaríngeo utilizando os métodos de VR11 e PCR em tempo real.......... 55

Tabela 3: Co-detecções identificadas pelo método VR11...................................... 56

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO................................................................................................

1.2. JUSTIFICATIVA.........................................................................................

1.3. OBJETIVO GERAL....................................................................................

1.3.1.OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................

2. DESENVOLVIMENTO...................................................................................

2.1. MATERIAS E MÉTODOS...........................................................................

2.2. RESULTADOS...........................................................................................

2.3. DISCUSSÃO...............................................................................................

3. CONCLUSÕES..............................................................................................

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................

ANEXOS............................................................................................................

1. INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO

1.INTRODUÇÃO

As infecções virais do trato respiratório causam morbidade e mortalidade em

todo o mundo, principalmente em crianças, imunocomprometidos e idosos (Gillim-

Ross e Subbarao, 2006). Nos países desenvolvidos, doenças respiratórias agudas

são responsáveis por grande parte dos atendimentos médicos sendo

aproximadamente 80% deles causadas infecções virais (Mahony, 2008). Nos

países em desenvolvimento, 90% das infecções respiratórias agudas do trato

superior e uma grande parte das infecções do trato inferior são ocasionadas por

vírus (Hinman, 1998; Rodrigues et al, 2002), que também são responsáveis por

aproximadamente 30% dos óbitos na infância (Hinman, 1998; Tiveljung-Lindell et al,

2009). Diversos tipos de vírus que acometem as vias respiratórias estão envolvidos

nessas infecções e novos vírus associados às infecções respiratórias estão sendo

descritos nos últimos anos (Allander et al, 2005; van den Hoogen et al, 2001). Os

vírus tradicionalmente conhecidos e com impacto bem descrito em doenças

respiratórias são o vírus sincicial respiratório (RSV), o parainfluenza vírus (PIV), o

vírus influenza (InfV), o adenovírus humano (hAdV), rinovírus humano (hRV) e os

coronavírus humanos (hCoV) . As infecções por estes vírus respiratórios podem

resultar em danos ao epitélio respiratório de indivíduos normais. Outros vírus

envolvidos nas infecções do trato superior e inferior mais recentemente

identificados são o metapneumovírus humano (hMPV) e o bocavírus humano

(hBoV). Outro vírus recentemente associado a doenças respiratórias,

principalmente com pneumonia, é o vírus “gigante” de amebas chamado Mimivírus

(La Scola et al, 2003). Em 2007 foram descritos ainda dois novos vírus envolvidos

nas infecções respiratórias, KI e WU, pertencentes à família dos poliomavírus

(Allander et al, 2007a; Gaynor et al, 2007).

INTRODUÇÃO

O vírus sincicial respiratório (RSV) é considerado como o de maior

importância nas infecções da via aérea inferior na faixa etária pediátrica.

Pertencente à família Paramixoviridae e gênero Pneumovirus, é um vírus de RNA

de fita simples não segmentado e de polaridade negativa, composto por um

nucleocapsídeo helicoidal envelopado e com aproximadamente 150 a 300nm

(O'Shea e Cane, 2004; Vieira et al, 2001). O RSV foi isolado pela primeira vez em

1950 de uma criança com pneumonia (Chanock et al, 1957), e possui dois

subgrupos denominados A e B. Ocorre predominantemente nos meses de outono e

inverno, resultando em elevado número de internações de crianças menores de 5

anos de idade (Cintra et al, 2001; Vieira et al, 2001). Além disso, há evidências de

que infecções precoces e graves por RSV resultam em risco de sibilância

recorrente e mesmo asma durante os primeiros anos de vida (Sigurs et al, 2000;

Stein et al, 1999,).

O vírus da parainfluenza (PIV) pertence à mesma família que o RSV,

Paramixoviridae. É classificado em quatro tipos PIV 1, 2, 3 e 4, sendo o tipo 4

dividido em dois subtipos A e B. Os tipos 1 e 3 pertencem ao gênero Paramixovirus

e os tipos 2, 4A, 4B pertencem ao gênero Rubulavirus. O PIV é composto por uma

fita simples de RNA de polaridade negativa não segmentado (Vainionpää e Hyypiä,

1994). Os tipos PIV 1, 2 e 3 são o segundo grupo causador de doenças

respiratórias em lactentes e pré-escolares, seguindo o RSV (Echevarría et al, 1998;

Henrickson, 2003) . O PIV4 está apenas relacionado a doenças brandas do trato

respiratório superior em crianças e adultos. Os PIV 1, 2 e 3 causam infecções das

vias respiratórias superiores e são os principais causadores de crupe na infância

(Henrickson, 2003). O PIV 3 também pode causar bronquiolite e pneumonia

(Echevarría et al, 1998). As infecções por PIV 3 aparecem durante todo o ano, e as

pelo PIV 1 e 2 em surtos durante o outono em anos alternados (Henrickson, 2003).

INTRODUÇÃO

O vírus influenza (InfV), classificado em tipos A, B e C, é o único membro da

família Orthomyxoviridae, mas apenas os tipos A e B causam doença significativa

nos seres humanos. Os subtipos virais, principalmente do tipo A, são determinados

pelas glicoproteínas presentes no vírus, a hemaglutinina (H) e a neuraminidase (N)

(ex: H1N1, H3N2) que são responsáveis pela grande variação antigênica. O vírus é

envelopado e composto por oito RNAs segmentados de fita simples e de polaridade

negativa, o que facilita o desenvolvimento de mutações entre diferentes cepas,

gerando uma instabilidade genética. Essa instabilidade é responsável por

epidemias anuais e pandemias periódicas mundiais (Gillim-Ross e Subbarao, 2006;

Shaw et al, 1992). A infecção pelo vírus começa no trato respiratório superior

causando coriza e obstrução nasal. Após essa etapa inicia-se a gripe, que é a

doença clássica causada pelo vírus influenza, caracterizando-se pelos sintomas

típicos, de febre, mal-estar, cefaléia e mialgia. A gripe é considerada uma das

doenças respiratórias mais importantes da humanidade (Cintra e Rey, 2006; Shaw

et al, 1992). A infecção por influenza vírus pode se manifestar com doenças mais

graves como pneumonia (Vidal et al, 2008), miocardites e encefalopatia (Guarner et

al, 2009).

Em abril de 2009, perto do final da temporada da gripe sazonal no

Hemisfério Norte, os dois primeiros casos de Influenza suína em humanos foram

identificados nos Estados Unidos (Perez-Padilla et al, 2009; Zimmer et al, 2009). O

CDC (Centro de Controle de Doenças – EUA) confirmou que esses casos foram

causados por um vírus influenza novo. A análise genética das cepas mostrou que

eles são provenientes de um rearranjo de influenza vírus suíno, aviário e humano

(Perez-Padilla et al, 2009). No mesmo mês a Organização Mundial de Saúde

(OMS) declarou epidemia global e atenção com a saúde publica.

Existe controvérsia quanto ao impacto clínico de infecções pelo vírus

influenza A H1N1. Alguns autores descrevem maiores taxas de mortalidade de

INTRODUÇÃO

infecções por influenza A H1N1, principalmente associados a comprometimento

pulmonar (Libster et al 2009).

O adenovírus foi isolado pela primeira vez em 1953 em cultura de células da

adenóide humana. Existem aproximadamente 100 sorotipos diferentes, dentre os

quais 47 infectam humanos e pertencem à família Adenoviridae. O adenovírus é

composto de um DNA de fita-dupla linear não-segmentado, não envelopado, com

diâmetro que varia entre 70 a 90 nm (Hierholzer, 1992). As infecções por

adenovírus atingem o trato respiratório, gerando uma diversidade de quadros

clínicos como nasofaringite, faringite, amidalite, laringotraqueite, bronquiolite e

pneumonia (Colom et al, 2006). Também causam conjuntivite, cistite hemorrágica e

gastroenterite (Colom et al, 2006). É também o principal agente infeccioso

associado ao desenvolvimento de bronquiolite obliterante na infância (Castro-

Rodriguez et al, 2006; Colom et al, 2006). O vírus pode ser encontrado no mundo

todo e causa endemias ou epidemias no inverno, primavera e no início do verão

(Castro-Rodriguez et al, 2006).

O rinovírus humano (hRV) é o principal representante da família

Picornaviridae, quando se fala em infecções respiratórias. Os picornavírus são vírus

pequenos, de RNA fita simples com polaridade positiva, não envelopados (Lee et

al, 2007b). A família possui diversos membros divididos em cinco gêneros:

Rhinovírus, Enterovírus, Heparnavírus, Cardiovírus e Aphthovírus. O hRV constitui

a causa mais importante do resfriado comum e infecções das vias áreas superiores,

e também esta associado com sinusite, otite media e exacerbação da asma

(Deffernez et al, 2004). Mais de 100 sorotipos já foram descritos e vários podem

circular ao mesmo tempo em uma determinada região (Lee et al, 2007b;

Papadopoulos et al, 1999). Nos últimos anos foram descritos novos rinovírus

humanos, até então classificados em dois subgrupos A e B. Estes novos rinovírus

foram classificados em um novo subgrupo denominado C (Lee et al, 2007b;

INTRODUÇÃO

McErlean et al, 2008). O rinovírus é objeto de grande interesse na última década

por seu importante papel como desencadeador de crise de asma e um possível

envolvimento na gênese da asma na infância (Lemanske, 2004).

O coronavírus humano (hCoV), família Coronaviridae, é um vírus

envelopado com um extenso genoma de RNA de polaridade positiva, medindo

aproximadamente de 80 a 160 nm (van der Hoek et al, 2004). As infecções por

coronavírus estão habitualmente associadas a manifestações de vias aéreas

superiores, e os vírus descritos em humanos até pouco tempo atrás eram o hCoV-

229E e o hCoV-OC43 causadores de resfriado comum (Pyrc et al, 2007). Novos

subtipos deste vírus como a cepa de New Haven (identificada na Holanda),

denominada hCoV-NL63 (van der Hoek et al, 2004) e outra conhecida como HKU1

(Woo et al, 2005) identificada em Hong Kong têm sido descritos em crianças abaixo

de cinco anos de idade como freqüentemente associados a manifestações do trato

respiratório inferior, como taquipnéia, alterações de ausculta pulmonar e hipóxia

(Esper et al, 2005). O coronavírus ganhou grande notoriedade após ser identificado

como o agente causador da epidemia da Síndrome Respiratória Severa Aguda no

ano de 2003 (SARS) (Pyrc et al, 2007). As infecções por coronavírus acontecem

esporadicamente ou em surtos durante o inverno e a primavera (Pyrc et al, 2007).

No ano de 2001, o metapneumovírus humano (hMPV) foi identificado por

van den Hoogen et al (2001), e classificado no gênero Metapneumovirus,

subfamília Pneumovirinae e família Paramyxoviridae (Alto, 2004). De forma análoga

aos outros vírus da mesma família, o hMPV é um vírus envelopado de tamanho

aproximado de 150-600nm, possui um RNA de fita simples e polaridade negativa

(van den Hoogen et al, 2001). Os estudos iniciais sobre este vírus em várias

regiões do planeta mostraram que ele tem uma importante prevalência entre

pacientes pediátricos (van den Hoogen et al, 2004), e produz sintomatologia muito

semelhante à observada nas infecções por RSV (Alto, 2004).

INTRODUÇÃO

O hMPV é um agente com prevalência entre 10 a 15% nas infecções

respiratórias agudas em crianças e habitualmente associado à bronquiolite (van

den Hoogen et al, 2004). Dados nacionais demonstraram a identificação de hMPV

em 17% das crianças com infecção de vias aéreas inferiores durante os meses de

abril e maio de 2002 em Aracajú, Sergipe (Cuevas et al, 2003). Outro estudo em

São Paulo identificou o hMPV em 18% dos pacientes pediátricos com doença

respiratória aguda (Thomazelli et al, 2007) um estudo realizado no Paraná descreve

prevalência de 6,4% em crianças hospitalizadas (do Carmo Debur et al, 2007).

Oliveira et al (2008), estudando adultos, relataram 7,2% de prevalência do hMPV

em pacientes submetidos a transplante de células tronco hematopoiéticas.

O bocavírus humano (hBoV) é um recente vírus respiratório identificado. Em

2005, Allander et al (2005) descreveram a clonagem, seqüenciamento e análise

filogenética de um parvovírus até então não identificado em humanos, o bocavírus

humano (hBoV), assim denominado devido às suas semelhanças com os

parvovírus bovino e canino. Vários estudos se seguiram ao achado de Allander et al

(2005), realizados na Europa, América do Norte, Ásia, África e Austrália indicando

evidências de patogenicidade, além da distribuição mundial deste patógeno

(Allander et al, 2007b; Anderson, 2007; Ma et al, 2006).

Ma et al (2006) observaram em amostras positivas para hBoV com infecção

única diagnóstico clínico característico de doença respiratória como pneumonia,

bronquite, bronquiolite, asma e laringotraqueíte. Também há relatos de febre e

diarréia associados aos sintomas respiratórios, corroborados pela recente

descoberta da presença de bocavírus humano em fezes de crianças com

gastroenterite, numa freqüência semelhante à que tem sido encontrada em

amostras respiratórias (Arthur et al, 2009; Kapoor et al, 2009).

Gagliardi et al demonstraram uma prevalência de 10,5% de hBoV em

crianças hospitalizadas em Ribeirão Preto, Brasil. Dessas amostras positivas 81%

INTRODUÇÃO

obtiveram resultado positivo para outro vírus respiratório. Apesar de alta taxa de co-

infecções não foram encontradas diferenças entre infecções simples e co-infecções

no que diz respeito aos sintomas (Gagliardi et al, 2009).

Kantola et al (2008) observaram que as infecções respiratórias pelo hBoV

tem uma resposta sistêmica de células B, constituída por IgM e IgG. Sendo a

proteína do capsídeo VP2 a mais imunoreativa. Através da medição dos anticorpos

específicos para hBoV foi possível identificar infecções agudas em crianças

hospitalizadas por doença respiratória grave com resultado positivo para hBoV.

(Kantola et al, 2008).

Muito pouco se sabe ainda sobre o hBoV. Entre as muitas questões a serem

respondidas, mecanismos de infecção, o modo de transmissão, a sazonalidade, a

resposta imunológica e a variedade de sorotipos são pontos importantes para

futuras investigações (Allander et al, 2007b; Anderson, 2007).

Os métodos tradicionais de detecção dos vírus respiratórios são a técnica

de detecção antigênica por imunofluorescência e o isolamento em cultura de

células (Bellau-Pujol et al, 2005; Erdman et al, 2003; Kehl et al, 2001; Tiveljung-

Lindell et al, 2009). A imunofluorescência, que compreende a detecção de antígeno

específico através de anticorpos marcados com fluorescência, é considerada rápida

e de baixo custo. Entretanto, possui um desempenho limitado em relação à

sensibilidade para detecção de alguns vírus, não é capaz de identificar vírus

respiratórios de significativa importância e é bastante dependente do profissional

que a realiza (Freymuth et al, 2006). As técnicas de isolamento viral através de

cultura de células foram muito usadas e consideradas “padrão-ouro” para o

diagnóstico de infecções respiratórias virais. A seleção das células para cultivo é

essencial e uma linhagem de células pode ser adequada para o crescimento de um

vírus e não para outro (Bellau-Pujol et al, 2005; Freymuth et al, 2006; Templeton et

al, 2004). A grande quantidade de passagens, transferências e trocas de placas

INTRODUÇÃO

aumentam o risco de contaminação e assim como o tempo de incubação, sujeitam

a técnica a uma maior possibilidade de erro. Além disso, os métodos citados acima

são usados principalmente para o diagnóstico de RSV, InfV A e B, PIV 1, 2 e 3 e

hAdV (Tiveljung-Lindell et al, 2009).

A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi descrita no final dos anos 1980

por Kary Mullis (Saiki et al, 1988), e hoje é a principal ferramenta dos métodos

moleculares para detecção de agentes causadores de doença. Utilizando uma DNA

polimerase foi possível desenvolver uma técnica in vitro para amplificação de uma

molécula alvo de DNA (Saiki et al, 1988). A PCR inclui o DNA ou DNA

complementar (cDNA) contendo a seqüência alvo a ser amplificada, uma DNA

polimerase, oligonucleotídeos iniciadores (primers), desoxirribonucleotídeos

(dNTPs), tampão de reação e concentração de cloreto de Magnésio (MgCl

). Os

reagentes são misturados em um tubo e colocados em um termociclador (Zaha et

al, 2003) que faz ciclos de temperatura com tempos pré-estabelecidos específicos

para cada reação. Em cada ciclo a temperatura atinge níveis de aproximadamente

C , o que pode desnaturar enzimas, por isso é necessário o uso de uma DNA

polimerase termoestável, isolada de uma bactéria que sobrevive a

aproximadamente 100

C (Thermus aquaticus). Esta enzima é estável a

temperaturas muito mais altas do que o normal, com isso a enzima não é

desnaturada durante os repetidos ciclos de aquecimento. O termo reação em

cadeia tem origem na necessidade de repetidos ciclos – aproximadamente 30

ciclos por reação, podendo variar de acordo com o protocolo utilizado e

características – para amplificação efetiva do DNA alvo (Alberts, 2008).

Quando o alvo a ser amplificado é uma amostra de RNA, é necessário

utilizar uma etapa de transcrição reversa. Esse método tem por objetivo

“transformar” moléculas de RNA em DNA (DNA complementar ou cDNA). A

transcrição reversa utiliza uma enzima, DNA polimerase RNA-dependente, capaz

INTRODUÇÃO

de sintetizar uma molécula de DNA a partir de uma molécula de RNA, além de

utilizar primers específicos para o alvo ou ainda utilizar primers randômicos pra

sintetizar uma grande parte dos RNAs existentes na amostra. Essa reação

combinada ao PCR é conhecida como RT-PCR (Bustin, 2000; Sambrook e Russel,

2001). Em vista que a maioria dos vírus respiratórios são vírus de RNA, essa etapa

se faz necessária para a detecção de muitos desses agentes.

O diagnóstico de doenças infecciosas foi revolucionado com o emprego de

técnicas de detecção através de métodos moleculares, principalmente com a

aplicação da reação em cadeia da polimerase (PCR) (Ratcliff et al, 2007). A técnica

de amplificação de ácidos nucléicos (NAT) promoveu uma melhora no diagnóstico

de doenças causadas por vírus, como a AIDS e as hepatites virais (Levi et al,

2007). Estas técnicas atualmente já estão presentes em laboratórios de pesquisa e

de rotina para detecção de vírus respiratórios (Mahony, 2008).

Nos últimos anos, os métodos moleculares se firmaram como o novo

“padrão-ouro” para o diagnóstico de infecções respiratórias virais e existem

evidências de sensibilidade e especificidade ao redor de 100% quando comparados

aos métodos de cultura em tecido ou detecção de antígenos virais com anticorpos

monoclonais (Henrickson, 2004). Quando comparados à cultura em células, os

métodos moleculares apresentam sensibilidade superior em até 30% (Henrickson,

2004; Liolios et al, 2001; Weinberg et al, 2004). Reis et al (2008) observaram uma

sensibilidade maior para detecção do RSV utilizando a técnica de RT-PCR quando

comparado aos métodos tradicionais de imunofluorescência e/ou isolamento viral

em cultura de células (Reis et al, 2008). Além disso, alguns vírus respiratórios de

grande relevância clínica só podem ser adequadamente identificados através de

métodos moleculares, como o rinovírus, coronavírus, metapneumovírus humano e

bocavírus humano.

INTRODUÇÃO

Os métodos moleculares vêm sendo progressivamente otimizados a fim de

reduzir o tempo e o custo para o diagnóstico, além de melhorar sua sensibilidade

para detecção dos vírus. Métodos de multiplex RT-PCR, que amplificam vários

alvos em uma única mistura, reduzem o trabalho e o gasto com reagentes, além de

reduzir o tempo para o resultado. Entretanto, muitos métodos descritos utilizam um

segundo “round” de PCR (nested-PCR) para melhorar a sensibilidade do teste,

resultando em risco aumentado de contaminação da reação (Bellau-Pujol et al,

2005; Coiras et al, 2003; Coiras et al, 2004; Freymuth et al, 2006). Além disso, a

grande variação genética de agentes como o rinovírus pode resultar na falha de

detecção de alguns subtipos (Bellau-Pujol et al, 2005).

Os métodos de PCR e RT-PCR em tempo real, interessantes por minimizar

tempo de processamento e risco de contaminação, apresentam também algumas

limitações. O método de PCR em tempo real é mais sensível quando comparado às

técnicas convencionais e traz uma significante melhora no trabalho manual quando

comparado a ensaios de PCR que usam eletroforese em gel de agarose ou

poliacrilamida ou hibridização. O número de fluorescências detectadas, entretanto,

varia de duas a oito, o que pode interferir no custo e no trabalho manual se o

ensaio for mono-específico ou multiplex (Kuypers et al. 2006; Templeton et al,

2004; van de Pol et al, 2007). Além disso, a quantidade de sondas marcadas

interfere nas temperaturas usadas durante o ensaio, pode haver competição entre

as sondas, resultando em redução de sensibilidade da reação e dificultando a

padronização nos casos de ensaios multiplex. Apesar das enormes vantagens na

redução do tempo de processamento e dos riscos de contaminação, o custo dos

reagentes e dos equipamentos (aquisição e manutenção) ainda representa um

sério obstáculo para sua implantação em larga escala.

A otimização dos métodos de detecção molecular de vírus respiratórios

vem, portanto, evoluindo através do desenvolvimento de diferentes métodos de

INTRODUÇÃO

detecção de produtos de PCR e RT-PCR. Existem atualmente kits comerciais de

multiplex PCR para identificação de até 7 vírus através de PCR ou PCR em tempo

real, que reduzem significamente custo e trabalho quando comparado às reações

de PCR independentes para cada um dos vírus respiratórios (Fan et al, 1998). Um

dos métodos, denominado Hexaplex® (Prodesse Inc., Winconsin, EUA), aplica

multiplex RT-PCR para os principais vírus respiratórios (RSV A e B, InfV A e B e

PIV 1, 2 e 3) e utiliza um sistema de detecção através de sonda de hibridização

enzimática, com alta sensibilidade em relação aos métodos convencionais (Kehl et

al, 2001). O cDNA é sintetizado inicialmente através de random primers, enzima

Transcriptase reversa e que são adicionados ao RNA extraído das amostras. Os

alvos são amplificados usando uma mistura única (Super-Mix) contendo 13 primers

específicos para os sete vírus respiratórios detectáveis no kit. Os primers foram

desenhados para os regiões conservadas de cada vírus. Após a amplificação é

feita uma purificação do produto de PCR utilizando um kit comercial e o produto é

adicionado a uma placa de 96 orifícios contendo sondas específicas para cada

vírus para a hibridização ser realizada. A densidade óptica de cada poço é medido

em 450 nm de comprimento de onda em espectrofotômetro. O procedimento do

ensaio, apesar de ter uma super-mistura para facilitar seu emprego, contém muitos

reagentes e passagens na fase de detecção, aumentando o tempo necessário para

a obtenção do resultado.

Outra técnica nova para detecção de vírus respiratórios é um sistema que

integra multiplex PCR e citometria de fluxo com tecnologia de microesferas

marcadas, usando o aparelho Luminex®, chamado MultiCodePLx Assays System

(Nolte et al, 2007). A hibridização nas microesferas marcadas possibilita uma

detecção de 80 diferentes produtos de PCR. O MultiCodePLx system contém três

etapas principais, PCR, extensão de alvo específico e detecção do produto (liquid

chip). Quando o alvo é RNA um passo de transcrição reversa é adicionado. O

INTRODUÇÃO

método utiliza um par de bases complementares não encontradas na natureza que

é construído a partir de bases complementares isoguanina (IG) e 5-metil-isocitosina

(IC) para o sítio enzimático específico de rotulagem e de lavagem de decodificação

na temperatura ambiente. Todas as etapas da reação são realizadas no mesmo

recipiente, sem transferências ou lavagens, e a mesma é concluída em cerca de 4

horas. Este ensaio mostrou-se rápido, sensível e específico para os alvos de

detecção quando desenhado para grandes estudos clínicos de infecções

respiratórias, pois detecta diferentes “linhagens” de vírus de mesmo grupo e/ou

subgrupo (Lee et al, 2007a; Mahony et al, 2007; Nolte et al, 2007). Utilizando esta

metodologia de liquid chip, alguns kits comerciais foram testados para detecção de

bactérias e vírus mais comuns que causam infecções respiratórias (Wang, 2009).

Outros ensaios em forma de “painel”, como o NGEN RVA-ASR (NGEN

respiratory vírus analyte-specific reagent), combinam amplificação por multiplex

PCR com microarray e sonda fluorescente para a detecção dos amplímeros (Li et

al, 2007). O Virochip também é um método baseado em PCR com detecção por

microarray. Um “painel” para vírus respiratórios foi desenvolvido e, assim como o

ensaio de microesferas do Luminex®, também é capaz de detectar uma

diversidade grande de vírus e seus subgrupos (Kistler et al, 2007). Estes métodos,

apesar de muito promissores, ainda têm custo extremamente elevado para

aquisição de equipamentos e reagentes.

Uma alternativa a estes novos métodos para detecção dos vírus

respiratórios é o uso de eletroforese automatizada em capilar para detecção dos

produtos amplificados pela PCR utilizando um seqüenciador de DNA com um

programa de análise de fragmentos. Esta técnica foi usada para detecção de 6

vírus respiratórios por Erdman et al (2003), que fizeram um ensaio para detecção

de infecções respiratórias virais comuns. Seguindo a linha de trabalho de Erdman

et al (2003), a técnica de eletroforese automatizada em capilar foi modificada por

INTRODUÇÃO

Thomazelli et al (2007) para detecção de 9 vírus (RSV, InfV A e B, PIV 1, 2 e 3,

hMPV, hAdV e picornavírus). Os autores relataram, comparando os resultados

observados com o método de imunofluorescência, um significativo ganho na

sensibilidade (Thomazelli et al, 2007). A sensibilidade para detecção por este

método foi também superior à observada na detecção de produtos de PCR e RT-

PCR com eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio e

visualizado em luz ultravioleta (Erdman et al, 2003).

JUSTIFICATIVA

1.2 Justificativa

O uso de métodos para detecção de múltiplos agentes virais e em larga

escala parece ser a abordagem ideal para a investigação etiológica de infecções

respiratórias em estudos epidemiológicos e possivelmente para utilização na prática

clínica num futuro próximo. A escolha do método deve, entretanto, levar em conta a

disponibilidade de equipamentos, experiência profissional e recursos financeiros.

Tendo em vista a disponibilidade de um seqüenciador automatizado de DNA capaz

de realizar eletroforese capilar concomitante de 96 amostras, decidimos pelo

desenvolvimento de uma técnica para detecção de onze diferentes vírus

respiratórios, baseada em reações de PCR e RT-PCR realizadas em uma placa,

com posterior detecção dos produtos amplificados no seqüenciador automatizado

MegaBace (GE Healthcare – Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido).

A hipótese deste estudo é de que seria possível padronizar um método de simples

execução baseado em amplificação de seqüências de DNA e cDNA de vírus

respiratórios com detecção em eletroforese capilar para o diagnóstico das principais

infecções respiratórias virais em amostras de aspirado nasofaríngeo, aplicável em

estudos de larga escala.

OBJETIVOS

1.3 OBJETIVO GERAL

Desenvolver e padronizar um método baseado em RT-PCR e PCR

convencional, com detecção de fragmentos através de eletroforese capilar em

seqüenciador automatizado, para identificação concomitante de 11 diferentes vírus

respiratórios.

OBJETIVOS

1.3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

I. Determinar as sondas iniciadoras (primers) para identificação de cada uma

das etiologias: vírus respiratório sincicial, influenza A e B, parainfluenza 1, 2 e

3, adenovírus, picornavírus, coronavírus, metapneumovírus humano e

bocavírus humano;

II. Padronizar uma única mistura de reagentes (à exceção dos primers) capaz de

viabilizar a amplificação eficiente de todos os alvos escolhidos;

III. Determinar os controles internos do método, a fim de assegurar a

confiabilidade dos resultados obtidos;

IV. Avaliar a sensibilidade e especificidade do método, comparando-o a reações

de RT-PCR ou PCR em tempo real (método TaqMan®) de cada um dos alvos

individualmente.

2. DESENVOLVIMENTO

MATERIAL E MÉTODO

2.1 MATERIAL E MÉTODO

Amostras controle de vírus respiratórios

Isolados de cultura viral do Laboratório de Virologia do Instituto de Medicina

Tropical de São Paulo – Universidade de São Paulo foram utilizados para RSV,

adenovírus e parainfluenza vírus 1, 2 e 3 isolados em células Hep2; Influenza vírus

A e B isolados em células MDCK; e enterovírus (echovirus 7) isolados em células

Vero. Amostras clínicas com resultado conhecido foram utilizadas para rinovírus

humano, metapneumovírus humano e coronavírus humano.

Uma amostra de bocavírus humano, isolado ST2 (número de acesso

genBank DQ000496), gentilmente cedida pelo prof. Tobias Allander, do Karolinska

Institute da Suécia, foi utilizada como controle para o HBoV. Uma clonagem deste

fragmento (nucleotídeo 28 ao 5209 do isolado ST2) foi realizada no laboratório de

virologia - IMT/USP, utilizando como vetor o pCR4-TOPO de 3954 pb (Invitrogen,

São Paulo, Brasil).

Amostras Clínicas:

As amostras de lavado nasofaríngeo utilizadas neste estudo foram

selecionadas dentre as amostras coletadas no estudo intitulado “Avaliação das

infecções respiratórias virais em pacientes com fibrose cística”. As coletas foram

realizadas em sala própria do ambulatório do Instituto da Criança HCFMUSP.

Durante o referido estudo, 408 amostras foram coletadas de 103 pacientes durante

consultas agendadas e emergenciais, ou seja, em pacientes assintomáticos e

durante exacerbação da doença respiratória.

MATERIAL E MÉTODO

O lavado nasofaríngeo foi coletado por aspiração com sonda estéril após

instilação de 1 ml solução salina (cada narina) estéril em frasco coletor ou através

da técnica de lavado nasal sem uso da sonda (“nasal blow”). Estes pacientes, em

geral com idade superior a cinco anos, foram submetidos à instilação de 1 ml da

solução salina na narina, elevação do queixo e posterior expiração nasal forte e

abrupta, coletando-se a solução instilada junto com o muco nasal. Cada uma das

narinas foi “lavada”, separadamente, mas o produto resultante foi coletado em

apenas um recipiente. Os aspirados/lavados nasais foram conservados e

transportados em banho de gelo. O processamento inicial das amostras no

Laboratório de Virologia do IMT incluiu homogeneização e normalização do volume,

preparo de alíquotas para imunofluorescência, extração de ácidos nucléicos e

estocagem de amostra de reserva.

Dentre o total de 408 amostras sequencialmente numeradas, as primeiras

72 amostras pares foram escolhidas, sem conhecimento dos resultados de

imunofluorescência.

Extração de DNA e RNA:

As extrações de DNA e RNA viral foram realizadas com kit comercial QIAmp

Viral RNA Mini Kit® (QIAGEN, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do

fabricante. Um volume de 140!L da amostra foi adicionado a 560!L de solução

tampão de lise contendo Carrier RNA (RNA carreador), homogeneizado através de

vórtex e incubado por 10 minutos a temperatura ambiente. Após a incubação,

560!L de etanol absoluto foi adicionado e homogeneizado. Um volume de 630 !L

da mistura – máximo suportado pela coluna por vez - foi adicionado em uma coluna

com filtro e tubo coletor e centrifugado a 8000 rpm por um minuto. O filtrado foi

descartado e a coluna foi colocada em um novo tubo coletor e o passo se repetiu

MATERIAL E MÉTODO

para o restante do volume. Novamente o filtrado foi descartado e a coluna foi

colocada em um novo tubo coletor. Duas etapas de lavagem com solução tampão

se seguiram para retirada das impurezas (ex. proteínas) da coluna. Primeiro foi

adicionado 500 !L de solução tampão AW1 e centrifugado a 8000 rpm por um

minuto. O filtrado foi novamente descartado e a coluna colocada em um novo tubo

coletor. A seguir foi adicionado 500 !L de solução tampão AW2 na coluna e

centrifugado a 14000 rpm por três minutos. O filtrado foi descartado e a coluna

contendo o material genético foi colocada em um tubo estéril de 1,5 mL e nova

centrifugação da coluna foi realizada a fim de se retirar quaisquer resquícios de

etanol, potente inibidor da PCR. A coluna foi colocada em um novo tubo estéril de

1,5mL e 60 ! L de solução tampão de eluição (AVE) adicionado, seguido de uma

incubação por 1 minuto a temperatura ambiente e centrifugação a 8000 rpm

também por um minuto. A coluna foi descartada e o RNA extraído da amostra

estocado a -80

Não foi realizada quantificação total de ácidos nucléicos extraídos na

amostra.

Síntese de cDNA (Transcrição Reversa – RT):

A síntese do cDNA foi realizada através do High Capacity cDNA Kit (Applied

Biosystems®, Foster City, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Para o

mix de cada reação, foram adicionados 10!L de solução 10x buffer (tampão), 4! L

de dNTP’s, 10!L de random primers, 5!L da enzima transcriptase reversa

Multiscribe e 21!L de água DEPC (livre de RNAse), totalizando um volume final de

50!L. Os reagentes, exceto a água DEPC, são fornecidos pelo kit. Ao mix foi

adicionado um volume de 50!L de RNA extraído de cada amostra, perfazendo um

total de 100!L de volume final. O tempo de ciclagem para síntese foi de 25

C por

MATERIAL E MÉTODO

10 minutos, 37

C por 120 minutos e 85

C por 5 segundos. Após a síntese, o

material foi estocado em freezer -20

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR):

(i) Escolha das sondas iniciadoras (primers):

Os primers foram selecionados a partir de pesquisa feita na literatura

científica. Publicações contendo resultados de estudos com uso de amostras

clínicas de características semelhantes, como secreção respiratória, foram

priorizadas na escolha. Além do tipo de amostra em que foram testados, outros

critérios na escolha dos primers incluíram o tamanho do fragmento de DNA gerado

e o número de publicações que os utilizaram. Para uma boa diferenciação entre os

picos de amplímeros no programa de análise de fragmentos “FragmentProfiler”

(GeneticProfiler) do MegaBace™ (GE Healthcare – Amersham Biosciences, Little

Chalfont, Reino Unido), consideramos satisfatória uma diferença de no mínimo

cinco pares de base no tamanho dos fragmentos.

(ii) Padronização de uma única mistura de reagentes e condições de

termociclagem:

Diferentes concentrações de solução de tampão de reação, MgCl

, dNTP’s

(dATP, dTTP, dCTP, dGTP) e primers foram testadas em reações individuais de

RT-PCR e PCR utilizando como molde (template) os controles positivos de cada

um dos vírus de interesse, com revelação feita por eletroforese em gel de agarose

a 1,5% corado com brometo de etídio e visualizado em luz ultravioleta. Os critérios

para escolha das concentrações de reagentes foram a geração de produto único do

MATERIAL E MÉTODO

tamanho esperado e de intensidade satisfatória, sem aparecimento de

inespecificidades ou excesso de primers-dimers.

(iii) Controle interno da reação:

Dois tipos de controle interno foram avaliados, o gene da beta-actina

humana e o vírus da diarréia bovina (BVDV). Este último, que pertence à família

Flavivirus, é de fácil cultivo e não possui riscos de transmissão para humanos. Os

critérios para escolha incluíram o tamanho do fragmento adequado ao restante dos

amplímeros gerados, a ausência de inespecificidades e a eficiência adequada da

amplificação nos moldes padronizados.

Análise de Fragmentos:

As corridas eletroforéticas foram realizadas no Analisador Automático de

DNA MegaBace™ (GE Healthcare – Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino

Unido), em capilares preenchidos por polímero (MegaBace™ LongReadMatrix® -

GE Healthcare – Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido), sob uma

tensão elétrica de 10.000 volts por 120 minutos. Os fragmentos foram detectados

através de feixe a laser e em seguida analisados pelo programa MegaBace™

FragmentProfiler (GeneticProfiler - GE Healthcare – Amersham Biosciences, Little

Chalfont, Reino Unido), que é capaz de determinar o tamanhos dos fragmentos em

pares de bases (pb) e a intensidade da fluorescência em Unidades relativas de

Fluorescência (URF). Um padrão de peso molecular com outra fluorescência

(MegaBace™ ET900-R Standard®, marcado com rox - GE Healthcare – Amersham

Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido) foi adicionado a cada pool de amostra.

MATERIAL E MÉTODO

Os primers forward de cada par de primers selecionados foram marcados

com fluorescência FAM para visualização durante a corrida eletroforética

automatizada. A discriminação dos picos no programa Fragment profile foi possível

pois os fragmentos gerados tinham uma diferença de pelo menos cinco pares de

bases.

PCR em tempo real:

Foi utilizada a metodologia TaqMan® para as reações de PCR em tempo

real. As reações foram individualizadas, de acordo com protocolos já descritos para

RSV (van Elden et al, 2003), hMPV (Oliveira et al, 2008) e hBoV (Lu et al, 2006). As

reações para InfV A, InfV B, PIV 1, PIV 2 , PIV 3 foram modificadas de Templeton

et al (2004). Para comparação dos resultados de picornavírus foram feitos dois

PCRs em tempo real, um para HRV e outro para HEV, de acordo com a

metodologia descrita por Deffernez et al (2004). Não foi realizado PCR em tempo

real para HCoV e AdV. Os primers podem ser visualizados na quadro 1.

MATERIAL E MÉTODO

Quadro 1: Primers e sondas utilizadas na PCR em tempo real

Virus

Nome

Primers/sondas

HRV

HRV fwd

HRV reverse

RHP1

RHP2

5' GCACTTCTGTTTCCCC 3'

5' AGCCTGCGTGGCTGCC 3'

5' FAM - AGCCTCATCTGCCAGGTCTA - TAMRA 3'

5' VIC - AGCCTCATCGACCAAACTA - TAMRA 3'

HEV

HEV fwd

HEV reverse

HEV probe A

HEV probe B

5' CCCCTGAATGCGGCTAAT 3'

5' CAATTGTCACCATAAGCAGCCA 3'

5' FAM - GGACACCCAAAGTAGTCGGTTCCGCTGC - TAMRA 3'

5' VIC - GAGTTGCCCGTTACGACACATGCCC - TAMRA 3'

MPV

Care 1

Care 2

Care 3

Care4 probe

5' GCACCAGACACACCCATAATCTT 3'

5' TCAGCACCAGACACACCTATAATCTT 3'

5' TTGAGTGCATCACTTAGTACACGGT 3'

5' FAM - TTATGTGTAGGTGCCTTAATA - MGB 3'

RSV A

RSV A fwd

RSV A reve

RSV A sonda

5' AGATCAACTTCTGTCATCCAGCAA 3'

5' TTCTGCACATCATAATTAGGAG 3'

5' FAM - CACCATCCAACGGAGCACAGGAGAT - NFQ 3'

RSV B

RSV B fwd

RSV B reve

RSV B sonda

5' AAGATGCAAATCTATAATTCACAGGA 3'

5' TGATATCCAGCATCTTTAAGTA 3'

5' VIC - TTCCCTTCCTAACCTGGACATA - NFQ 3'

hBoV

NP1 fwd

NP1 reverse

sonda NP1

5' - AGAGGCTGCGGCTCATATCA - 3'

5' - CACTTGGTCTGAGGTCTTCGAA - 3'

5' FAM - AGGAACACCCAATCARCCACCTATCGTCT - NFQ 3'

InfV A

FluA fwd

FluA reverse

sonda FluA

5' - AAAGCGAATTTCAGTGTGAT - 3'

5' - GAAGGCAATGGTGAGATTT - 3'

5' FAM - GCTGCCAGGGCTTTCACCGAAGAGGGGGCAGC - NFQ 3'

InfV B

FluB fwd

FluB reverse

sonda FluB

5' - GTCCATCAAGCTCCAGTTTT - 3'

5' - TCTTCTTACAGCTTGCTTGC - 3'

5' NED - GCTGCCAACGAAGTAGGTGGAGACGGAGGGGCAGC - NFQ 3'

PIV 1

PIV1 fwd

PIV1 reverse

sonda PIV1

5' - ACCTACAAGGCAACAACATC - 3'

5' - CTTCCTGCTGGTGTGTTAAT - 3`

5' NED - GCTGCCCAAACGATGGCTGAAAAAGGGAGGCAGC - NFQ 3'

PIV 2

PIV2 fwd

PIV2 reverse

sonda PIV2

5' - CCATTTACCTAAGTGATGGAA - 3'

5' - CGTGGCATAATCTTCTTTTT - 3'

5' VIC - AATCGCAAAAGCTGTTCAGTCAC - NFQ 3'

PIV 3

PIV3 fwd

PIV3 reverse

sonda PIV3

5' - CCAGGGATATAYTAYAAAGGCAAAA - 3'

5' - CCGGGRCACCCAGTTGTG - 3'

5' FAM - TGGRTGTTCAAGACCTCCATAYCCGAGAAA - NFQ 3'

MATERIAL E MÉTODO

Avaliação de Especificidade, Sensibilidade e Reprodutibilidade

A especificidade dos primers para amplificação dos alvos virais, não foi

diretamente avaliada, pois estes primers foram selecionados na literatura e,

portanto, previamente avaliados neste quesito.

A sensibilidade do método foi avaliada inicialmente utilizando diluições

seriadas do controle positivo e verificando a mínima quantidade de DNA (ou cDNA)

molde capaz de resultar na identificação de um pico na avaliação do software de

análise de fragmentos. Em seguida, foi feito um teste comparativo da “performance”

do método em relação ao PCR em tempo real utilizando 72 amostras clínicas de

crianças com fibrose cística. Para a avaliação de reprodutibilidade do método, as

72 amostras clínicas foram feitas em duplicata. A reprodutibilidade inter-teste foi

avaliada através de repetição da avaliação de amostras clínicas.

RESULTADOS

2.2 RESULTADOS:

Os primers selecionados para o estudo, com suas características e

referências de origem, estão apresentados no Quadro 2.

Todos os primers escolhidos foram testados produzindo resultados

satisfatórios com amostras controle (figura 1); observamos as menores diferenças

de tamanhos de fragmentos entre os primers de hMPV e hBoV, com 7 pares de

bases. Na figura 2 pode-se avaliar os diferentes amplímeros numa perspectiva

gráfica.

Figura 1: Eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etideo

mostrando produtos de amplificação por PCR de reações individuais para

identificação dos vírus respiratórios. M – marcador de peso molecular 100pb; 1 -

RSV; 2 - InfV A; 3 - InfV B; 4 - PIV 1; 5 - PIV 2; 6 - PIV 3; 7 - hAdV; 8 - hMPV; 9 -

hCoV; 10 - Picornavírus; 11 - hBoV e 12 - Controle interno (beta-actina).

M M

600pb

100pb

RESULTADOS

Figura 2: Perspectiva gráfica dos diferentes tamanhos dos amplímeros de cada

alvo. Os primers selecionados geram produtos com uma diferença mínima de cinco

pares de base. A menor diferença foi observada entre os produtos gerados para

hMPV e hBoV (7 pb).

Inicialmente as reações de RT-PCR e PCR foram realizadas de acordo com

as descrições das publicações originais. Verificamos que não existiam grandes

diferenças nas concentrações de reagentes entre as reações, e determinamos

então uma concentração “consenso”, que fosse capaz de manter os resultados

observados com as misturas individualizadas. Ficou estabelecida uma

concentração final de reagentes contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCl,

200uM de dNTPs, 2 mM de MgCl2 e 0,4 uM de cada primer, 1 U de Platinum Taq

DNA polymerase (Invitrogen, São Paulo, Brasil), 2,5uL de cDNA ou DNA em

volume final de 25 !L. Além da concentração final de 400 nM de de cada primer

adicionada separadamente. Esta mistura atendeu à proposta inicial de manter a

amplificação de produto único, sem o aparecimento de inespecificidades.

Após otimização da mistura de reagentes, verificamos ainda que apesar de

uma significativa diferença de Tm entre os diferentes primers, os mesmos exibiam

bom funcionamento quando uma temperatura de pareamento de 57ºC foi testada.

Deste modo, além de uma mistura única de reagentes, estabeleceu-se um

protocolo simplificado de termociclagem com uma única temperatura de

pareamento para todas as reações. O protocolo final de termociclagem ficou deste

modo determinado: 95

C por 5 minutos, 40 ciclos de 95

C por 1 minuto, 57

C por

1 minuto e 72

C por 1 minuto, com uma extensão final de 7 minutos a 72

C em um

termociclador MastercyclerGradient (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha).

RESULTADOS

Quadro 2: Seqüências dos primers selecionados com suas respectivas características e

referências.

Vírus

Nome do Primer

Sequência (5`-3`)

Gene

Amplímero

RSV

(O'Shea e Cane

2004)

RSVAB-P1-FAM

RSVAB-P2

GGA ACA AGT TGT TGA GGT TTA TGA ATA TGC

TTC TGC TGT CAA GTC TAG TAC ACT GTA GT

277pb

PIV1

(Echevarría et al.

1998)

HPIV1-F1-FAM

HPIV1-R1

CCG GTA ATT TCT CAT ACC TAT G

CCT TGG AGC GGA GTT GTT AAG

317pb

PIV2

(Echevarría et al.

1998)

HPIV2-F1-FAM

HPIV2-R1

CCA TTT ACC TAA GTG ATG GAA T

GCC CTG TTG TAT TTG GAA GAG A

203pb

PIV3

(Echevarría et al.

1998)

HPIV3-F1-FAM

HPIV3-R1

ACT CCC AAA GTT GAT GAA AGA T

TAA ATC TTG TTGTTG AGA TTG A

102pb

InfV A

(Claas et al. 1992)

FLUA-F1-FAM

FLUA-R1

CTA AGG GCT TTC ACC GAA GA

CCC ATT CTC ATT ACT GCT TC

NS1

192pb

InflV B

(Claas et al. 1992)

FLUB-F1-FAM

FLUB-R1

ATG GCC ATC GGA TCC TCA AC

TGT CAG CTA TTA TGG AGC TG

NS1

241pb

hAdV

(Sarantis et al. 2004)

AD1-FAM

AD2

CTG ATG TAC TAC ACC AGC ACT GGC AAC ATG GG

CGC TTG CGG TGG TGG TTA AAT GGG TTT ACG TTG TCC AT

Hexon

608-629pb

hMPV

(Falsey et al. 2003)

MPVF- F1

MPVF- R1

GAG CAA ATT GAA AAT CCC AGA CA

GAA AAC TGC CGC ACA ACA TTT AG

347pb

Picornavírus

(Papadopoulos et al.

1999)

OL26

OL27

GCA CTT CTG TTT CCC C

CGG ACA CCC AAA GTA G

5’NCR

383-392pb

hCoV

(Adachi et al. 2004)

CORO1

CORO2

TGA TGG GTT GGG ACT ATC CTA AAT GTG A

GTA GTT GCA TCA CCG GAA GTT GTG CCA CC

Pol 1b

220pb

hBoV

(Allander et al. 2005)

188F

542R

GAC CTC TGT AAG TAC TAT TAC

CTC TGT GTT GAC TGA ATA CAG

NP1

354pb

Controle de RNA

(Mathieu et al. 2005)

"-Actina-Fwd-FAM

"-Actina-Rev

AAA TCG TGC GTG ACA TTA AGG

CTA AGT CAT AGT CCG CCTAG

"-Actina

humana

525pb

BVDV

(Yoo et al. 2006)

BVDV - F

Z5393

GTG GAG GAA CCT GTT TAT GAT C

TTA CCC GAC CTG CAG TCA CCT C

N-pro

161pb

RESULTADOS

Definiu-se, então, a disposição das amostras e reagentes na microplaca. Os

primers foram distribuídos nas colunas e as amostras nas linhas da placa. Deste

modo, em uma placa de 96 poços poderiam ser avaliadas 6 amostras, um controle

positivo e um controle negativo, para 12 diferentes reações de PCR ou RT-PCR

(figura 3).

Figura 3: Representação esquemática da distribuição de ragentes e amostras nas

placas para identificação de 11 vírus respiratórios e amplificação do controle do

método.

Na programação de preparo da placa, definimos pela utilização de pipetas

multicanal e berços para acomodar maiores volumes de reagentes. Os primers

foram pipetados nas colunas utilizando micropipetas eletrônicas em modo de

repetição e a mistura da reação adicionada com pipeta multicanal usando doze

RESULTADOS

ponteiras. Por fim, as amostras foram acrescentadas nas linhas da placa, usando

ponteiras individuais (figura 4).

Figura 4: Representação esquemática do preparo da placa de PCR utilizando

micropipetas eletrônicas em modo seqüencial para distribuição dos primers nas

colunas correspondentes para cada alvo, micropipeta multicanal (12 canais) para

distribuição da mistura única e micropipeta para distribuição de amostras em cada

linha.

Com relação ao controle do método, elegemos inicialmente a amplificação

do gene da beta-actina como controle interno de reação. O produto amplificado

consiste de um fragmento de 525 pares de bases, porém verificou-se o

aparecimento de fragmentos de amplificação inespecífica de aproximadamente 420

e 470 pares de bases nas amostras de lavado nasofaríngeo (figura 5). Como

nenhuma outra reação gerava um fragmento deste tamanho, esta inespecificidade

não gerou conflitos na análise dos resultados, mas poderia em tese causar perda

de sensibilidade por haver competição por reagentes.

RESULTADOS

Figura 5: Imagem gerada pela software de análise de fragmento mostrando pico

correspondente ao fragmento do gene b-actina de 525 pares de bases e o

aparecimento de picos de inespecificidades de aproximadamente 420pb e 470pb.

Decidimos então testar a amplificação do gene Npro do Vírus da Diarréia

Bovina (BVDV) como controle do método, através da adição de 10!L de uma

diluição de 10 vezes do sobrenadante da cultura de BVDV à amostra, antes de se

proceder à extração de RNA/DNA. Esta diluição e volume adicionada à amostra foi

testada por outro grupo de pesquisa do Laboratório de Virologia do Instituto de

Medicina Tropical de São Paulo, Universidade de São Paulo e não resultou em

mudanças de volumes de amostras e/ou reagentes do protocolo de extração.

Observamos a amplificação satisfatória do fragmento de 160 pb do gene

Npro, sem interferência com a amplificação de outros alvos e sem aparecimento de

inespecificidades (figura 6a e 6b).

RESULTADOS

Figura 6a: Imagem gerada pelo software de análise de fragmentos do pico

resultante da amplificação do gene Npro do BVDV com 161pb.

Figura 6b: Imagem gerada pelo software de análise de fragmentos dos picos

resultantes da amplificação do do gene Npro do BVDV com 161pb e da região 5`

não codificante (5`NCR) Picornavírus (PicV) com tamanho de 390pb.

RESULTADOS

Além deste controle interno da reação capaz de confirmar a qualidade

(eficiência) das etapas de extração de ácidos nucléicos, síntese de cDNA e

amplificação do cDNA, decidimos construir um controle positivo único para todas

as amplificações virais, no sentido de facilitar sua utilização na placa. Ao invés de

utilizarmos uma mistura de todos os controles positivos, decidimos pela construção

de um plasmídeo contendo todas as seqüências alvo (figura 7). Esta escolha levou

em conta a possibilidade de se descartar contaminação de forma mais confiável e

rápida, pois as seqüências contidas dentro de cada trecho amplificado do

plasmídeo são distintas dos vírus selvagens. Além disso, uma seqüência de

cloroplasto conhecida de uma espécie vegetal (Populus trichocarpa) foi inserida

neste plasmídeo, o que facilita sua caracterização por seqüenciamento em caso de

suspeita de contaminação.

O fragmento construído contendo todas as seqüências alvo foi inserido no

plasmídeo pUC57 (2710 pb) ficando ao final com tamanho de 3677pb (GenScript

Corporation, New Jersey, EUA). Cepas de E. coli TOP10 contendo o plasmídeo

(fornecidos pelo fabricante) foram colocadas diretamente para crescimento em

meio LB líquido com ampicilina a 37

C durante um período de aproximadamente

12 horas. Após a constatação de crescimento da bactéria, a purificação plasmidial

foi feita através do kit PureYield™ Plasmid Miniprep System (Promega, Madison,

EUA) seguindo as instruções do fabricante. Uma quantificação foi feita em

espectrofotômetro com resultado de 283,53 !g de DNA/mL. Um cálculo para saber

quantidade de cópias/mL foi realizado chegando a um total de 7.10

cópias/mL ou

7.10

cópias/!L. O cálculo foi baseado na suposição de que um mol de um par de

base pesa 660g (peso médio de um par de base 660 Daltons) e que o peso

molecular de uma fita dupla de DNA molde pode ser estimado pelo seu

comprimento em pares de base.

RESULTADOS

A solução estoque foi diluída 17,5x para ficar com uma concentração de

cópias/2,5!L. A partir desta solução foram feitas diluições seriadas de 10x até

a concentração mínima de 0,1 cópias/2,5!L.

Figura 7: Seqüência do fragmento construído para atuar como controle positivo de

todas as amplificações do método. As seqüências dos primers de cada uma das

etiologias estão destacadas por caixas de cor diferente, uma para cada alvo. A

RESULTADOS

seqüência de um organismo vegetal (Populus trichocarpa) foi inserida no fragmento

para checagem de eventuais suspeitas de contaminação.

As corridas eletroforéticas foram realizadas utilizando um pool contendo 10

!l de cada amostra em cada linha da placa. Este pool foi transferido para uma nova

placa para leitura no seqüenciador (figura 8). A placa de corrida continha em cada

um dos 96 poços 7,75 µl de Tween 20 0,1%, 0,25 µl de ET-ROX (MegaBace™

ET900-R Standard® - GE Healthcare – Amersham Biosciences, Little Chalfont,

Reino Unido) e 2,0 µl de cada amostra. Cada placa de PCR gerou, portanto, oito

pools de produtos, sendo dois controles (um positivo e um negativo) e seis

amostras clinicas. O seqüenciador utilizado na corrida eletroforética capilar

comporta, em uma única corrida, uma placa de 96 orifícios. Com isso foi possível

realizar uma corrida contendo 72 diferentes amostras de 12 diferentes placas de

reação.

Após a corrida eletroforética no seqüenciador MegaBace™ (GE Healthcare

– Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido), a análise dos resultados foi

feita com o programa FragmentProfiler (GeneticProfiler – GE Healthcare –

Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido). A figura 9 exemplifica uma

análise de uma amostra controle positivo, contendo doze diferentes amplímeros.

A sensibilidade do método foi avaliada utilizando diluições seriadas do

plasmídeo por reação. As diluições testadas para a reação foram de 10

até 0,1

cópias do plasmídeo. O limite de detecção observado foi de 100 cópias por reação

para todos os alvos. Em nenhum caso foi visualizado reação cruzada ou

inespecificidade. A altura dos picos (URF – unidade relativa de fluorescência) foi

diferente para cada alvo e observamos menores intensidades para o AdV.

RESULTADOS

Figura 8: Representação gráfica do pool de produtos de PCR formado a partir de

uma linha da placa, correspondente a uma amostra, para corrida eletroforética

RESULTADOS

capilar em seqüenciador de DNA. A placa que vai ao seqüenciador contém os pools

de cada linha, comportando portanto 12 placas de PCR (72 amostras, 12 controles

positivos e 12 negativos)

Figura 9: Visualização do Software “Fragment Analysis”, com uma imagem dos

resultados de uma amostra de amplificação de controle positivo – picos das

diferentes amplificações. No eixo vertical podemos observar a altura dos picos

(intensidade) de cada fragmento em Unidades Relativas de Fluorescência. No eixo

horizontal é visualizado o tamanho do fragmento gerado pela reação em pares de

base.

RESULTADOS

O uso de nosso método resultou na identificação de pelo menos um vírus

respiratório em 33 amostras (46%) e em 39 amostras não foi detectado nenhum

vírus (64%). Os vírus identificados estão apresentados na tabela 1:

Tabela 1: Vírus identificados pelo método de analise fragmento (VR11) nas 72

amostras estudadas.

Vírus identificado

Número de amostras positivas(%)

Picornavirus

22 (30,5)

hBoV

5 (6,9)

PIV 3

3 (4,2)

InfV A

3 (4,2)

InfV B

1 (1,4)

hCoV

1 (1,4)

hMPV

1 (1,4)

No teste comparativo da “performance” do método com detecção de análise

de fragmento (VR11) em relação ao PCR em tempo real verificamos uma boa

correlação, exceto para influenza A e metapneumovírus, que não resultaram

positivos no método de PCR em tempo real (tabela 2).

Tabela 2: Comparação dos resultados de identificação viral em 72 amostras de

lavado nasofaríngeo utilizando os métodos de VR11 e PCR em tempo real.

Metodo

RSV

PIV 1

PIV 2

PIV 3

InfV A

InfV B

AdV

hMPV

hCoV

Picorna

hBoV

VR11

Real time

RESULTADOS

Co-detecções foram observadas em cinco das 72 amostras, todas elas com

detecção do picornavírus como um dos agentes. Apenas uma amostra apresentou

detecção tripla (tabela 3).

Tabela 3: Co-detecções identificadas pelo método VR11.

Amostras

Vírus Detectados

vFC20

hBoV + Picornavírus

vFC34

InfVB + Picornavírus

vFC42

PIV3 + hMPV + Picornavírus

vFC134

PIV3 + Picornavírus

vFC140

hBoV + Picornavírus

Para a avaliação de reprodutibilidade do nosso método (VR11), as amostras

foram testadas em duplicatas. Uma amostra positiva para RSV e uma para AdV

não reproduziram o mesmo resultado nas duplicatas e foram consideradas

negativas.

Na avaliação visual dos resultados da amplificação no software de análise

de fragmentos, um “Cut-off” foi definido entre 100 e 650 pb para conter todos os

fragmentos esperados. Picos fora desse limite foram desconsiderados, já que picos

abaixo de 100pb poderiam ser resultado de “primers-dimers” e picos acima

poderiam ser inepecificidades.

De forma análoga, a sensibilidade do método usando o software de análise

de fragmentos foi definido através de um “Cut-off” vertical. Foram considerados

RESULTADOS

apenas os picos com uma URF (unidade relativa de fluorescência) acima de 50

(#50URF) (figura 8).

DISCUSSÃO

59!

2.3 DISCUSSÃO

A diversidade de agentes virais envolvidos em infecções respiratórias

agudas é um dos grandes obstáculos para a investigação etiológica mais

abrangente destes casos. Neste estudo, foi possível padronizar um método

baseado em PCR e RT-PCR combinado a eletroforese capilar em seqüenciador

automatizado e análise de fragmentos por software específico para detecção de 11

diferentes vírus respiratórios em amostras de trato respiratório. O método foi

otimizado para facilitar sua preparação e economizar recursos, como o uso de

ponteiras, e mostrou-se eficiente na identificação dos vírus em amostras de

crianças e adolescentes com fibrose cística.

Os métodos tradicionais como imunofluorescência e isolamento viral em

cultura de células foram extensivamente utilizados para detecção de vírus

respiratórios antes da adoção dos métodos moleculares pela maioria da

comunidade científica (Spyridaki et al, 2009). O uso de métodos de biologia

molecular, em particular a PCR, no diagnóstico de infecções respiratórias virais é

hoje uma realidade em vários países e pode ser considerado como “padrão-ouro”.

Os métodos de biologia molecular receberam durante muito tempo críticas quanto

ao seu custo, confiabilidade e reprodutibilidade. Atualmente, entretanto, vários

Centros do mundo utilizam métodos de biologia molecular em pesquisa e

assistência (Mahony, 2008; Lee et al, 2007; Templeton et al, 2004; Tiveljung-Lindell

et al. 2009).

Os métodos clássicos de amplificação do genoma viral sempre tiveram a

desvantagem de necessitar de etapas pós-amplificação trabalhosas; dependerem

de visualização de bandas em corridas eletroforéticas, trazendo ainda riscos de

contaminação da cadeia diagnóstica. Além disso, uma reação visa, em geral, à

amplificação de um único alvo genômico, o que complica a investigação de vários

DISCUSSÃO

60!

alvos de uma única vez. Uma solução buscada por Bellau-Pujol et al (2005) para a

detecção de vários vírus respiratórios de uma única vez foi a adoção do método de

multiplex, quando várias amplificações ocorrem de forma concomitante em um

único tubo de PCR (Bellau-Pujol et al, 2005). Esta solução, entretanto, traz diversos

problemas de padronização e reprodutibilidade, de tal modo que métodos deste tipo

ficam fadados a utilização in-house, com restrições quanto à confiabilidade em seus

resultados pela comunidade científica. Mesmo assim, algumas empresas lançaram

produtos e relataram boa eficiência de métodos baseados em PCR e RT-PCR com

revelação em gel de agarose para identificação de até 6 vírus respiratórios (Fan et

al, 1998). Para minimizar os problemas com a etapa de revelação, este método foi

posteriormente otimizado com a adição de uma etapa de hibridização com placas

sensibilizadas para detectar os amplímeros gerados (Kehl et al, 2001). A escolha

do método de PCR/RT-PCR em placa com eletroforese capilar no seqüenciador de

DNA teve por objetivo contornar dois destes problemas: em primeiro lugar, evitar a

necessidade de reações do tipo multiplex e em segundo lugar evitar a revelação em

gel de agarose, facilitando o trabalho e melhorando a sensibilidade analítica.

Outros métodos descritos mais recentemente, como a tecnologia xMAP e

liquid chip utilizando equipamento Luminex (Lee et al, 2007; Nolte et al, 2007) e o

uso de Microarrays (Kistler et al, 2007) parecem superiores à metodologia

desenvolvida no presente estudo, pois oferecem uma possibilidade ainda maior na

identificação de novos vírus e possuem potencial para detecção concomitante de

um número muito maior de alvos. Estas tecnologias, entretanto, têm alto custo de

implantação e realização e estão, no momento, distantes da nossa realidade local,

não só pelo custo do equipamentos, mas também pela manutenção e reagentes.

O PCR em tempo real pode ser considerado hoje a ferramenta mais

utilizada para detecção de vírus respiratórios, mesmo sendo considerado mais caro

quando comparado a ensaios de PCR multiplex convencional. Muitos ensaios para

DISCUSSÃO

61!

detecção de vírus respiratórios foram descritos nos últimos anos, porém somente

alguns podem ser considerados plataformas completas de diagnóstico (Templeton

et al, 2004; Tiveljung-Lindell et al, 2009; van de Pol et al, 2007).

Nossa idéia foi desenvolver uma plataforma completa, incluindo etapas bem

estabelecidas de extração, amplificação e leitura de resultados, com controles de

todas as etapas do método. Uma plataforma flexível e prática de PCR em tempo

real foi descrita pelo grupo do Prof. Dr. Tobias Allander, do Instituo Karolinska na

Suécia, para o diagnóstico de 15 vírus respiratórios. As reações foram

individualizadas e uma abordagem escalonada foi sugerida: em apenas quatro

horas e 3 vezes ao dia o resultado de detecção dos principais vírus respiratórios –

que foi chamado de “pacote básico” (RSV, InfV A e B) fica disponível, enquanto a

investigação dos alvos restantes, como AdV, PIV 1 - 3, HRV, HEV, HMPV, HCoV e

HBoV, chamada de pacote completo, é realizada e finalizada em adicionais 4

horas, completando um dia de trabalho. Essa plataforma tem como principais

vantagens a capacidade de detectar um amplo espectro de vírus respiratórios e um

aumento da sensibilidade quando comparada aos métodos tradicionais e um fluxo

racional (Tiveljung-Lindell et al, 2009). Para atingir o objetivo de tempo para o

resultado, entretanto, grande parte de seu fluxo necessita automação, incluindo os

processos de extração, preparo de reagentes e placas para amplificação, o que

pode elevar o custo significativamente, a não ser que o volume de amostras seja

muito grande.

Nosso método foi capaz de analisar 72 amostras clinicas em uma única

corrida eletroforética automatiza em capilar em aproximadamente 2 horas para 11

diferentes vírus (alvos). Porém, cada placa de PCR é capaz de amplificar somente

6 amostras clinicas e o tempo de preparo e termociclagem é de cerca de 4 horas.

Sendo assim, seria possível realizar a investigação de 11 diferentes alvos num

período de aproximadamente 6 horas. Entretanto, o fato de que uma corrida

DISCUSSÃO

62!

eletroforética no seqüenciador automatizado pode acomodar até 12 placas de PCR

indica que a melhor utilização desta plataforma é na avaliação de grandes volumes

de amostras (eventualmente amostras estocadas), sem uma preocupação

significativa com o tempo de realização. Claro que uma organização direcionada do

processo, com disponibilidade de vários termocicladores e preparo prévio de placas

com primers liofilizados, poderia viabilizar sua utilização na rotina de diagnóstico

molecular de vírus respiratórios em um laboratório clínico.

A idéia de utilizar a eletroforese capilar dos seqüenciadores automatizados

para diagnóstico de infecções respiratórias virais já havia sido descrita por Erdman

et al (2003) e Thomazelli et al (2007), que relataram métodos para detecção de 6 e

9 vírus respiratórios, respectivamente. Nas referidas publicações, ambos relataram

ganho de sensibilidade e um aumento na detecção de vírus respiratórios em

amostras de lavado/aspirado nasofaríngeo quando comparado aos métodos

tradicionais de imunofluorescência e isolamento viral através de cultura. A proposta

de nosso estudo foi ampliar o número de agentes identificados e aperfeiçoar a

metodologia de preparo da placa no sentido de viabilizar sua utilização em larga

escala.

A opção de utilizar primers previamente testados em amostras de trato

respiratório teve por objetivo economizar tempo de análises mais aprofundadas de

sensibilidade e especificidade, mantendo a confiabilidade nos resultados

observados. A busca de métodos confiáveis e ao mesmo tempo abrangentes para

determinada espécie resultou, por outro lado, na escolha de primers para detecção

de mais de um subtipo para a espécie coronavírus e para o gênero Picornavírus

(Adachi et al, 2004; Papadopoulos et al, 1999). De fato, verificamos que a

estratégia foi adequada para identificação de diferentes subtipos de coronavirus,

pois amostras dos subtipos OC43, 229E, HKU1 e NL63 foram caracterizadas por

seqüenciamento de amplímeros entre pacientes com fibrose cística (Zerbinati et al,

DISCUSSÃO

63!

2009). Para as espécies rinovírus e enterovírus, entretanto, esta escolha trouxe

como conseqüência a necessidade de uma etapa subseqüente (PCR em tempo

real) para a identificação da espécie, mas tivemos a grata surpresa de verificar que

os primers OL26 - OL27 e o método de PCR em tempo real foram suficientemente

abrangentes para identificar amostras do recentemente descrito rinovírus C (Kiang

et al, 2008). Este agente, identificado através de seqüenciamento de amplímeros

de aproximadamente 390 pares de bases da região 5` não codificante (5`NCR),

mostrou-se associado a risco de exacerbação da doença respiratória nas crianças

com fibrose cística (de Almeida et al, 2010)

Uma das vantagens da padronização do método de PCR/RT-PCR em placa

foi a possibilidade de individualização das reações, dispostas nas colunas da placa,

evitando-se o formato de PCR em multiplex. Entretanto, esta individualização

poderia resultar em maior trabalho na preparação das placas, motivo pelo qual

padronizamos uma mistura única de reagentes para todas as reações propostas.

Esta adaptação não trouxe prejuízo aparente na sensibilidade e especificidade das

reações na identificação de seus alvos, mas um teste com maior número de

amostras pode ser necessário para confirmação desta impressão.

Além da padronização da mistura única de reagentes, uma rotina de preparo

da placa foi definida neste estudo, com o intuito de reduzir o tempo de preparo e o

trabalho de bancada. Com a disposição das reações em colunas e as amostras em

linhas foi possível utilizar uma micropipeta eletrônica multicanal em modo

seqüencial automático de pipetagem para a adição dos reagentes (primers e a

mistura única). Optou-se ainda pela utilização de berços (barcas) para acomodar

maiores volumes de reagentes (mistura única), possibilitando o preparo rápido de

diversas placas em uma “jornada” de trabalho. Os métodos de biologia molecular

evoluíram muito nos últimos anos e há uma forte tendência à automação de etapas

(Templeton et al, 2004; Tiveljung-Lindell et al, 2009), mas soluções de rotina de

DISCUSSÃO

64!

trabalho como as propostas no presente estudo podem ser de grande relevância

para serviços que não dispõem de automação. A melhora de condições de trabalho

é uma das metas de todos os grandes laboratórios de análises clínicas e

profissionais que atuam na área de biologia molecular freqüentemente são vítimas

de lesões de esforço repetitivo (Baker e Cooper, 1998; Müller et al, 2004). Não

encontramos detalhamento das etapas com propostas similares nos trabalhos que

testaram previamente a metodologia de eletroforese capilar em seqüenciador

automatizado (Erdman et al, 2003; Thomazelli et al 2007).

Além da padronização de uma mistura única de reagentes e de uma rotina

de preparo das placas, a utilização de controles de qualidade para todas as etapas

do método é outro aspecto essencial na elaboração de métodos diagnósticos

baseados em biologia molecular. A opção inicial pela amplificação do gene da beta-

actina foi baseada no seu uso freqüente em métodos diagnósticos para vírus

respiratórios, robustez e confiabilidade (Bellau-Pujol et al, 2005; Erdman et al,

2003). Apesar dos resultados obtidos nos trabalhos citados acima, Selvey et al.

(2001) demonstrou em seu estudo que o uso do gene da beta-actina como controle

interno pode ser inadequado em reações de RT-PCR quando utilizado para avaliar

expressão gênica. Já nos estudos de Erdman et al (2003) e Thomazelli et al (2007),

a amplificação do gene da beta-actina mostrou-se um controle interno satisfatório

para amostras de secreção respiratória.

Durante nosso estudo, todas as amostras que testamos resultaram positivas

para a amplificação do gene da beta-actina, mas verificamos o aparecimento de

inespecificidades nas corridas no seqüenciador com o uso de amostras clínicas. A

despeito dos picos de amplificação destas inespecificidades não coincidirem com

outros amplímeros do método, optamos pela substituição deste controle pela

amplificação do gene Npro do vírus da diarréia bovina (BVDV), um patógeno que

atinge gado bovino causando desde infecções assintomáticas até deficiência no

DISCUSSÃO

65!

sistema imunológico do animal levando à morte (Greiser-Wilke et al, 2003). O

BVDV foi utilizado como controle interno por Cleland et al (1999) e Yoo et al (2003)

em reações para detecção do vírus da hepatite C (HCV) em doadores de sangue,

com resultados satisfatórios. O tamanho do fragmento gerado pela reação de

BVDV foi de aproximadamente 161pb, dentro da faixa preestabelecida dos

amplímeros e com uma diferença mínima de 5 pares de base para outros alvos

testados. A adição do BVDV como controle externo (spike) tem como objetivo

garantir a qualidade da amostra durante as etapas do processamento (extração,

amplificação e revelação), confirmando que não há nenhuma interferência no

processo, como inibidores de reação, e ao mesmo tempo é um procedimento

seguro, já que não há relatos de infecção pelo agente na espécie humana. A

amplificação do gene Npro do BVDV não resultou no aparecimento de

inespecificidades e não houve interferência com a amplificação de outros alvos, de

tal modo que este passou a ser o controle adotado.

Outro aspecto inovador do estudo foi a construção de um controle positivo

único contendo seqüências complementares aos primers para produzir amplímeros

de tamanho esperado. A decisão veio após um longo período procurando controles

positivos para cada uma das reações, com grande dificuldade em obtê-los em

nosso Laboratório e mesmo em outras Instituições. As seqüências de cada alvo

foram desenhadas em um único fragmento de 967 pares de bases, são distintas

das seqüências amplificadas nos vírus selvagens, além de conter uma inserção de

uma seqüência de cloroplasto de uma espécie vegetal conhecida (Populus

trichocarpa). Além de facilitar o preparo da placa, pois uma única amostra é

acrescentada na 1ª linha de todas as colunas da placa, facultando o uso de pipeta

automatizada multicanal, esta abordagem também facilita o processo de

investigação em caso de suspeita de contaminação (carry-over), pois o

seqüenciamento é capaz de indicar se há ou não a presença de seqüências do

DISCUSSÃO

66!

fragmento nas amostras em questão. A grande maioria dos trabalhos tem utilizado

diluições seriadas de vírus isolados em cultura de células como controle positivo

(Bellau-Pujol et al, 2005; Erdman et al, 2003; Tiveljung-Lindell et al, 2009), e mais

recentemente alguns estudos relatam o uso de plasmideos clonados contendo a

seqüência do vírus alvo (Raymond et al, 2009; Tiveljung-Lindell et al, 2009).

A sensibilidade analítica do método na amplificação de diluições seriadas do

controle positivo (plasmídeo) foi determinada em 100 cópias por reação para todos

os alvos, demonstrando uma sensibilidade inferior à descrita por outros autores que

empregaram métodos de PCR em tempo real (Lu et al, 2006; Templeton et al 2004;

van Elden et al, 2003). Esta sensibilidade analítica, entretanto, é mais do que

suficiente para o emprego do método em amostras de nasofaringe, onde um

grande número de partículas virais pode ser identificado (Spyridaki et al, 2009;

Tiveljung-Lindell et al, 2009). Martin et al (2008), investigando a relação entre carga

viral em nasofaringe (aspirado nasofaringeo – NPA) e gravidade clínica de crianças

infectadas por RSV ou hMPV descrevem valores médios de carga viral de 10

cópias/mL de NPA e 10

cópias/mL de NPA, respectivamente. Gerna et al (2009)

encontrou valores médios de carga viral em lavado nasofaringeo de

aproximadamente 10

cópias/mL NPA de rinovírus humano em crianças admitidas

no hospital com infecção aguda do trato respiratório. Um limite de detecção como

este observado por nós, por outro lado, poderia limitar a identificação de co-

detecções ou de períodos de excreção viral mais prolongados.

Não foi possível realizar a comparação da sensibilidade analítica com

diluições seriadas do plasmídeo entre nossa técnica e PCR em tempo real para os

diferentes vírus respiratórios porque tínhamos disponível apenas o método

TaqMan® para PCR em tempo real, e o uso de hibridização de sondas seria

inviável com o nosso controle positivo, que contém apenas a região dos primers

idêntica à dos alvos biológicos.

DISCUSSÃO

67!

Na comparação entre nossa técnica e o PCR em tempo real utilizando

amostras clínicas para a identificação dos vírus RSV, InfV A e B, PIV 1 – 3, hBoV,

hMPV e picornavirus (dividido em duas reações uma hRV e outra para hEV),

verificamos uma boa concordância entre os resultados, exceto para InfV A e hMPV.

O achado de amostras positivas para hMPV e InfV A no método de eletroforese

capilar que resultaram negativas no PCR em tempo real provavelmente não foi

devido a questões de limite de detecção (sensibilidade), já que os limites do PCR

em tempo real (Oliveira et al, 2008; Templeton et al, 2004) são menores que os do

nosso método. Duas possibilidades podem ser aventadas neste caso: 1.

amplificação inespecífica de fragmentos de igual tamanho com o nosso método, o

que parece improvável frente aos testes prévios já publicados com estes primers e

2. incapacidade de ligação da sonda do método Taqman por mutações na

sequencia dos vírus selvagens.

Raymond et al (2009) comparou dois ensaios para detecção de vírus

respiratórios, o método de PCR em tempo real com reações individualizadas e a

metodologia de detecção por hibridização (microarrays) utilizando multiplex PCR.

Os autores relataram uma boa concordância entre os resultados (aproximadamente

94%). Os autores relataram entretanto uma maior taxa de detecção com o método

de PCR em tempo real, provavelmente pela abordagem de reações

individualizadas.

A sensibilidade do método pode também ser avaliada de forma individual

para cada um dos alvos observando-se a altura dos picos em Unidade Relativa de

Fluorescência (URF), e de fato verificamos alturas diferentes, com menores valores

para o AdV. Isso se deve, provavelmente, à eficiência na amplificação de cada

reação, que poderia ser resultado, em teoria, de fatores como tamanho do

fragmento a ser amplificado, tempo de extensão do alvo durante a termociclagem e

capacidade dos primers de se anelarem a fita de DNA alvo. Curiosamente, esta

DISCUSSÃO

68!

diferença de altura dos picos não resultou em valores discrepantes na sensibilidade

analítica do método.

Uma das limitações deste estudo foi a falta de análise de sensibilidade

analítica utilizando-se diluições seriadas de culturas virais. A decisão pela utilização

do plasmídeo foi tomada pelo fato de não dispormos de culturas de todos os vírus

de interesse, mas uma alternativa seria a construção de plasmídeos contendo as

seqüências selvagens de cada um dos vírus isoladamente.

Nossos resultados demonstram uma boa eficácia do método para detecção

concomitante de 11 importantes vírus respiratórios conhecidos, RSV, InfV A, InfV B,

PIV 1, 2 e 3, AdV, HMPV, picornavírus, HCoV e HBoV em amostras de secreção

respiratória. Através da metodologia proposta, conseguimos padronizar uma

técnica capaz de ser utilizada em larga escala. Em uma única corrida eletroforética

é possível analisar até 72 amostras em 6 horas, o que é interessante para estudos

em que amostras são armazenadas para processamento conjunto. Entretanto, se

levarmos em conta o tempo de extração, preparo da placa e reação, o tempo total

para o resultado de uma amostra seria de cerca de um dia de trabalho.

Este estudo traz ainda perspectivas interessantes, com o emprego da técnica

em amostras de lactentes com infecção respiratória aguda (que apresentam uma

positividade muito mais expressiva) e a possibilidade de desenvolvimentos técnicos

como a automação do preparo das placas e a fabricação de placas contendo

primers liofilizados e um design mais amigável para o usuário, como linhas de cores

distintas.

3. CONCLUSÕES

CONCLUSÕES

70!

3. CONCLUSÕES

Foi possível padronizar um método baseado em RT-PCR e PCR

convencional com detecção de fragmentos através de eletroforese capilar em

seqüenciador automatizado para identificação concomitante de onze diferentes

vírus respiratórios;

Todos os primers selecionados para o estudo mostraram resultados

satisfatórios na amplificação dos alvos virais, permitindo uma visualização

adequada dos amplímeros no software de análise de fragmentos;

Uma única mistura de reagentes (à exceção dos primers) foi determinada

para a amplificação eficiente de todos os alvos escolhidos;

Um protocolo de termociclagem com apenas uma temperatura de

pareamento foi determinado, permitindo o uso do método em termocicladores sem

o recurso de gradiente de temperaturas;

A amplificação do gene Npro do BVDV foi o controle escolhido por não

apresentar inespecificidades e possibilitar o controle de todas as etapas do método;

A sensibilidade analítica do método foi de 100 cópias/reação para cada um

dos vírus utilizando como amostras diluições seriadas do controle positivo

(plasmídeo);

Houve uma boa correlação entre os resultados obtidos com a nossa técnica

e o método de PCR em tempo real (68/72 amostras – 94,4% de concordância).

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viruses. N Engl J Med. 2009 Jul;361(3):279-85.

ANEXOS

82!

ANEXO A – Termo de Consetimento

HOSPITAL DAS CLÍNICAS

FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

TERMO DE CONSENTIMENTO PÓS -INFORMAÇÃO

(Instruções para preenchimento no verso)

_____________________________________________________________________________________________________

I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL

1. NOME DO PACIENTE .:............................................................................. ....................................................................

DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ...................................... SEXO: M F DATA NASCIMENTO: ......../......../......

ENDEREÇO .......................................................................................... Nº ........................... APTO: ..................

BAIRRO: ........................................................................ CIDADE .................................,....................................

CEP:......................................... TELEFONE: DDD (............) ...............................................................................

2.RESPONSÁVEL LEGAL .......................................................................................................................................

NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) ............................................................................................

DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ...................................... SEXO: M F DATA NASCIMENTO: ......../......../......

ENDEREÇO: ....................................................................................................... Nº ................... APTO: .............................

BAIRRO: ................................................................................ CIDADE: ...............................................................................

CEP: .............................................. TELEFONE: DDD (............)...........................................................................................

_______________________________________________________________________________________________________________________________________

II - DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA

1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: “Avaliação das Infecções Respiratórias Virais em Pacientes

com Fibrose Cística”.

PESQUISADOR: Dr. Luiz Vicente Ribeiro Ferreira da Silva Filho

CARGO/FUNÇÃO: MÉDICO INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº

69.437

UNIDADE DO HCFMUSP: INSTITUTO DA CRIANÇA

3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:

SEM RISCO RISCO MÍNIMO X RISCO MÉDIO

RISCO BAIXO RISCO MAIOR

(probabilidade de que o indivíduo sofra algum dano como conseqüência imediata ou tardia do estudo)

4.DURAÇÃO DA PESQUISA : 1 ano

_____________________________________________________________________________________________________

III - REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU

REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA, CONSIGNANDO:

Trata-se de uma pesquisa para tentar conhecer melhor as infecções causadas por vírus

nas crianças com mucoviscidose. Pretende-se estudar, durante um ano, os episódios de

infecção por vírus e suas conseqüências para os pacientes, como necessidade de

antibióticos, aparecimento de novas bactérias e piora da função pulmonar. Para tanto, os

pacientes farão uma medida da oxigenação através de um aparelho que é colocado no dedo

(oxímetro de pulso) e também a medida da função pulmonar (crianças acima de 6 anos), que

é o exame de assoprar que é feito rotineiramente durante seu seguimento no ambulatório.

Além disso, serão colhidas amostras de escarro ou de esfregaço da garganta (que você está

habituado(a) a colher) e um lavado nasal, que é feito através de uma pequena sonda com

83!

soro fisiológico (“como uma lavagem do nariz com soro, só que aspirando o líquido de volta”).

Serão colhidas ainda amostras de sangue no início e no fim do estudo. Estas amostras

servirão para verificar se existe reação do organismo à presença das bactérias e vírus

encontrados durante a pesquisa. Os exames e coletas de amostras serão feitos no próprio

ambulatório e no dia de atendimento, mas não substituirão as amostras colhidas

rotineiramente, pois serão estudadas em outro laboratório, somente com fins de pesquisa.

_____________________________________________________________________________________________________

IV - ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO

SUJEITO DA PESQUISA:

Fui informado que tal procedimento tem o risco mínimo da realização de qualquer coleta de

lavado nasal, escarro ou esfregaço de garganta, o risco de provocar o vômito durante a

coleta.

As coletas de sangue também apresentam o risco mínimo de trazer desconforto durante sua

realização e provocar o aparecimento de pequeno inchaço ou mancha roxa no local da

picada.

As condutas necessárias a estes procedimentos bem como as intercorrências previsíveis

(vômito, dor durante a punção, inchaço no local) me foram devidamente esclarecidas pela

equipe responsável.

Posso, a qualquer momento, como responsável pelo paciente, solicitar a interrupção de

qualquer procedimento previsto no estudo e, nesta situação, fica garantida a continuidade do

tratamento nas dependências do Instituto da Criança.

Declaro ainda que, tendo ciência quanto aos procedimentos de coleta de exames a que será

submetido, autorizo a participação do meu filho(a) nesta Pesquisa.

_____________________________________________________________________________________________________

V. INFORMAÇÕES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS RESPONSÁVEIS PELO

ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM CASO DE INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E

REAÇÕES ADVERSAS.

Dr. Luiz Vicente Ferreira da Silva Filho – médico assistente da Unidade de Pneumologia do Instituto da Criança

Tel. 3069-8537 / 3069-8538 / 3069-8566

Bip: 3444-4545 código 95990

_____________________________________________________________________________________________________

VI. OBSERVAÇÕES COMPLEMENTARES:

_____________________________________________________________________________________________________

VII - CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO

Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me

foi explicado, consinto em participar do presente Protocolo de Pesquisa

São Paulo, de de 20 .

____________________________________________ ___________________________________

assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal assinatura do pesquisador

(carimbo ou nome Legível)

84!

ANEXO B – APROVAÇÃO CAPPesq

85!

ANEXO C – APROVAÇÃO CEP-IMTSP

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