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Às placas estéreis de 96 poços (Becton Dickinson, EUA) foram adicionados 100μL de
suspensões de PBMC na concentração de 2 x 10
5
células por poço. Em seguida, a cada poço
foram adicionados 100 μl de meio RPMI 1640 completo e 10μg/mL de Brefeldina A (SIGMA,
St. Louis, Estados Unidos). Após homogeneização as placas foram mantidas a 37ºC , em
ambiente rico em CO
2
(5%) durante, aproximadamente, 15 horas. Após este período as placas
foram lavadas em 200µL/poço de PBS 0,15M estéril (0.15 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8 mM
Na
2
HPO
4
.7H
2
O, 1.5 mM KH
2
PO
4
; pH 7.2) com rotação de 350 X g por 5 min e depois
incubadas em 100µL de solução de PBS/ 0,1% BSA (Sigma, EUA) contendo 5% de leite
desnatado (Molico, Nestlé, Brasil), durante 5 min a 20ºC, para bloqueio do receptor Fc. Em
seguida, 100μL das soluções contendo combinações específicas de anticorpos monoclonais
marcados com fluorocromos distintos (Tabela 4.2) para análise simultânea de marcadores de
superfície celular necessários para a caracterização de populações celulares de interesse, foram
adicionados às placas de 96 poços, em concentrações/volumes previamente estabelecidas
(Tabela 4.2).
Após incubar durante 25 min a 4ºC duas lavagens, com 200 μL tampão PBS/ 0,1%
BSA/poço, foram realizadas por centrifugação a 350 X g durante 5 min a 20º C e o
sobrenadante desprezado. As amostras foram então fixadas com 100μL de solução fixadora
(4% de paraformaldeído em PBS, pH 7) durante 10 min a 20ºC. Em seguida, as amostras
foram lavadas 1 vez com 200 μL tampão PBS/ 0,1% BSA/poço (350 X g, 5 min, 20ºC). Mais
duas lavagens com 200 μL/poço de tampão PBS/ 0,1% BSA/ 0,1% de Saponina (SIGMA, St.
Louis, Estados Unidos) (350 X g, 5 min, 20ºC) foram realizadas. Após as lavagens, as placas
foram incubadas durante 1 hora a 4ºC, em 100μL de tampão PBS/ 0,1% BSA contendo 5% de
leite desnatado e 0,1% de Saponina-A para permeabilização celular. Subseqüentemente a
permeabilização, as misturas de anticorpos para marcação intracelular de citocinas (IL-2, IL-4,
IL-10, IFN-γ, TNF-α e TGF-β) foram adicionadas aos seus respectivos poços, em
concentrações previamente estabelecidas (Tabela 4.2).
Após um período de incubação de 30 min a 4ºC, 200μL de PBS/0,1%BSA/0,1%
Saponina-A foi adicionado nos poços, exceto nos poços da marcação 4 nos quais foram
adicionados streptavidina conjugada com peroxidase. As placas foram incubadas durante 20
min a 4ºC. Duas lavagens por centrifugação a 350 X g, por 5 min a 20ºC foram realizadas.
Uma em PBS/ 0,1% BSA/ 0,1% Saponina seguida de outra com PBS/ 0,1% BSA sem
Saponina. Posteriormente as células foram ressuspensas em 200μL de PBS/ 0,1% BSA e
transferidas para os tubos próprios para leitura. Adicionalmente, 300μL de PBS/ 0,1% BSA
foram adicionados em cada amostra totalizando 0,5mL por tubo.