Download PDF
ads:
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
RAIMUNDO NEGRÃO NETO
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES
BIOQUÍMICAS PROVOCADAS POR CONVULSÃO INDUZIDA PELO
EXTRATO HEXÂNICO DAS FOLHAS DE CLIBADIUM SYLVESTRE
EM RATOS (Wistar).
BELÉM
2010
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
3
RAIMUNDO NEGRÃO NETO
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES
BIOQUÍMICAS PROVOCADAS POR CONVULSÃO INDUZIDA PELO
EXTRATO HEXÂNICO DAS FOLHAS DE CLIBADIUM SYLVESTRE
EM RATOS (Wistar).
Orientador: Prof. Dr. Milton Nascimento da Silva
BELÉM
2010
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Programa de Pós-Graduação em
Química da Universidade Federal do
Pará, como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre em
Química, área de concentração
Química Orgânica.
ads:
4
Neto, Raimundo Negrão
Estudo fitoquímico e avaliação das alterações bioquímicas provocadas por
convulsão induzida pelo extrato hexânico das folhas de Clibadium sylvestre em ratos
(Wistar) / (Raimundo Negrão Neto); orientador, Milton Nascimento da Silva. - 2010
84 f. il. 28cm
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Pará. Instituto de Ciências
Exatas e Naturais. Programa de Pós-Graduação em Química. Belém, 2010.
1. Química Orgânica. 2. Produtos Naturais. I. Silva, Milton Nascimento da, orient. II.
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Exatas e Naturais, Programa de
Pós-Graduação em Química. III. Título.
CDD 22.ed. 547
5
RAIMUNDO NEGRÃO NETO
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES
BIOQUÍMICAS PROVOCADAS POR CONVULSÃO INDUZIDA PELO
EXTRATO HEXÂNICO DAS FOLHAS DE CLIBADIUM SYLVESTRE
EM RATOS (Wistar).
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Milton Nascimento da Silva
Orientador
PPGQ-ICEN-UFPA
Prof. Dr. Alberto Cardoso Arruda
PPGQ-ICEN-UFPA
Profa. Dra. Gilmara de Nazareth Tavares Bastos
PPGCB-ICB-UFPA
Julgado em:____/____/2010
Conceito:_______________
BELÉM
2010
6
Aos meus pais e familiares que
sempre me incentivaram durante
essa trajetória de qualificação
profissional.
7
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, pela vida abençoada que me deu.
Aos meus pais, Miguel Cândido Negrão e Ilza Barbosa Negrão, meus irmãos,
Ilzete Negrão, Ivoneide Negrão, Ivanildo Negrão, Miguel Júnior, e a todos os
familiares, por me apoiarem em todos os momentos.
A Leilane Silva de Matos que de forma maravilhosa esteve ao meu lado em
grande parte dessa difícil trajetória.
Ao professor, orientador e amigo Dr. Milton Nascimento da Silva pelos
ensinamentos e pelas oportunidades concebidas a minha pessoa.
Aos amigos do peito Moises Braga e Sínthia Patrícia pelo carinho e sobretudo
pela paciência.
A Universidade Federal do Pará pela oportunidade de realizar um curso de
Graduação e Pós-Graduação.
Aos membros da banca examinadora Prof. Dr. Alberto Cardoso Arruda e
Profa. Dra. Gilmara de Nazareth Tavares Bastos, pela revisão do texto e sugestões
importantíssimas.
Ao amigo do Instituto de Ciências Biológicas (Neuroquímica), Moíses Hamoy
pelo trabalho brilhante ali desenvolvido e pela parceria.
Ao prof. Dr. Manuel Euclides do Nascimento da Universidade Federal Rural
da Amazônia (UFRA), pelo apoio e pela identificação do material botânico.
Aos meus amigos de infância de Abaetetuba, conhecidos como P7 que
sempre estiveram ao meu lado.
A toda família do Sistema de Ensino Vestibulando.
Aos amigos da Central de Extração, aos funcionários da Pós-Graduação, em
especial aos Senhores Marçal Luna e Elinaldo Sampaio pela dedicação nas análises
de Ressonância Magnética Nuclear.
Aos colegas da graduação -Turma de 2004- em especial ao amigo Amauri Jr.
Por fim aos amigos “labcroianos” que constituem a família do Laboratório de
Cromatografia Líquida: Sônia Pamplona, Paulo Sá, Sandra Cristina, Consuelo Silva,
Kelly Castro, Daniele Monteiro, Lívia Lobo, Cecília Mariana, Geilson Alcântara,
Danila Valeriano, Roseane Brasil, Ana Carolina, Débora Arruda, Nathália Sisco,
Thalita Negrão, Ewerton, Manolo Freitas, Leandro Carvalho, Allan Ayres, Alinhe
Colares e Michelle Vaz.
8
RESUMO
No presente trabalho foi realizado o estudo fitoquímico e a avaliação das
alterações bioquímicas provocadas pelo extrato hexânico das folhas de Clibadium
sylvestre (Compositae), conhecido popularmente como cunambi, coletado na cidade
de Castanhal, Estado do Pará. As folhas desta planta são utilizadas pelas
populações ribeirinhas na pesca predatória. A partir do estudo fitoquímico de
Clibadium sylvestre, foram obtidos os seguintes extratos: etanólico, hexânico,
diclorometânico e metanólico, o primeiro foi obtido somente das folhas e os demais
foram obtidos das folhas e dos frutos. A partir de técnicas cromatográficas usuais e
avançadas (HPLC), foram isoladas quatro substâncias dos extratos hexânico e
etanólico, ambos obtidos das folhas: Estigmasterol, Sitosterol, Cunaniol e Acetato de
Cunaniol. A elucidação estrutural se deu através das análises espectrais e
comparação com os dados da literatura. O tratamento via intraperitoneal de ratos
adultos wistar com extrato hexânico das folhas na dose de 26,25 mg/kg induziu
convulsões tônico-clônicas sem causar a morte dos animais, e a dose de 32,7
mg/kg induziu convulsões tônico-clônicas seguida por morte, em média 30 minutos
após a administração. A aplicação intraperitoneal de extrato hexânico das folhas, na
concentração de 10mg/mL, causou convulsão em ratos adultos e com base nos
baixos níveis de glutationa reduzida (GSH) e altos níveis de glutationa oxidada
(GSSG) determinados no sangue de animais após 30 e 60min de convulsão,
percebeu-se que o estresse oxidativo está envolvido nas convulsões induzidas
provocadas pelo extrato hexânico.
Palavras- chave: Clibadium sylvestre, HPLC, convulsão, glutationa.
9
ABSTRACT
In this research work was realized a phytochemical study and analyses the
biochemical changes caused by the hexanic extract from Clibadium sylvestre leaves
(Compositae), It is known as cunambi. The plant was collected in Castanhal city,
state of Pará. These leaves plants are used by the riverside population at overfishing
activities. By the Clibadium sylvestre study was obtained the extracts: Etanolic,
Hexanic, dichlorometanic and metanolic. The first was only found from leaves and
the others from fruits and leaves. Through the usual chromatographic methods, It
was isolated four substances from the hexanic and etanolic extracts, both collected
from leaves: Estigmasterol, Sitosterol, Cunaniol and Cunaniol Acetate. The structural
datas were possible get by the experimental spectral and compared on chemical
literature datas. The via intraperitoneal treatment in grown-up wistar rats with hexanic
extract from leaves in doses of 26,25mg/Kg, it induced on tonic clonics convulsions
without cause by animals death and the doses of 32,7mg/Kg cause in them
convulsions and death It lasts 30 minutes. The hexanic extract via intraperitoneal
application, on 10mg/mL concentration, caused convulsion on grown-up rats, and
based on low levels of reduced glutatione (GSH) and High levels of oxidated
glutatione (GSSH). All of them obtained from blood of animals after 30 and 60
minutes convulsion. Then noticed that the oxidative stress is involved on convulsions
induced caused by the hexanic extract.
Keywords: Clibadium sylvestre, HPLC, convulsion, glutatione.
10
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................
17
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..............................................................................
19
2.1- GENERALIDADES SOBRE O GÊNERO CLIBADIUM...............................
19
2.2- CLIBADIUM SYLVESTRE..........................................................................
19
2.3- CONVULSÕES...........................................................................................
22
2.4- ESTRESSE OXIDATIVO: ATIVIDADE DA GLUTATIONA.........................
23
3. OBJETIVOS ......................................................................................................
27
3.1- GERAIS ......................................................................................................
27
3.2- ESPECÍFICOS ...........................................................................................
27
4. ESTRUTURA DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE C. SYLVESTRE.............
28
5. MATERIAS E MÉTODOS .................................................................................
29
5.1- INSTRUMENTAL E REAGENTES UTILIZADOS.......................................
29
5.1.1- Equipamentos.................................................................................
29
5.1.2- Solventes Utilizados nas preparações dos extratos orgânicos
e nas análises cromatográficas..........................................................................
30
5.1.3- Solventes utilizados na obtenção dos espectros de RMN..........
30
5.1.4- Fases estacionárias utilizadas para análises de cromatografia
sólido-líquido........................................................................................................
30
5.2- ANIMAIS....................................................................................................
30
6. PARTE EXPERIMENTAL..................................................................................
31
6.1- COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO .......................
31
6.2- PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS..............................................
31
6.2.1- Extratos brutos das folhas............................................................
31
6.2.2- Extratos brutos dos frutos.............................................................
31
6.3- PERFIL CROMATOGRÁFICO DOS EXTRATOS.......................................
33
6.4- ISOLAMENTO DAS SUBSTÂNCIAS..........................................................
37
6.4.1- Fracionamento do extrato hexânico das folhas de Clibadium
sylvestre ...............................................................................................................
37
6.4.2- Fracionamento do extrato etanólico das folhas de Clibadium
sylvestre ...............................................................................................................
40
6.5- AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE GLUTATIONA..........................................
41
6.6- ANÁLISE ESTATÍSTICA..........................................................................
41
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................
42
11
7.1- DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE S
1
, S
3
, S
4
e S
5
................................
42
7.1.1- Determinação estrutural de S
4
e S
5
...............................................
42
7.1.2- Determinação estrutural de S
3
.......................................................
48
7.1.3- Determinação estrutural de S
1
........................................................
64
7.1.4- Sugestão para novas estruturas....................................................
72
7.2- VERIFICAÇÃO DOS NÍVEIS DE GLUTATIONA REDUZIDA E OXIDADA
NO SANGUE DE RATOS, TRINTA MINUTOS E UMA HORA APÓS O INÍCIO
DAS CONVULSÕES..............................................................................................
78
8. CONCLUSÕES..................................................................................................
81
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................
82
12
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
CROMATOGRAMA I: Extrato hexânico das folhas (EHFL)...................................
34
CROMATOGRAMA II: Extrato hexânico dos frutos (EHFR)..................................
34
CROMATOGRAMA III: Extrato diclorometânico das folhas (EDFL)......................
35
CROMATOGRAMA IV: Extrato diclorometânico dos frutos (EDFR)......................
35
CROMATOGRAMA V: Extrato metanólico das folhas (EMFL)..............................
36
CROMATOGRAMA VI: Extrato metanólico dos frutos (EMFR).............................
36
CROMATOGRAMA VII: Fração Fr
1
. .....................................................................
39
CROMATOGRAMA VIII: Fração Fr
2
. ....................................................................
39
CROMATOGRAMA IX: Ampliação do cromatograma do Extrato hexânico das
folhas (EHFL)..........................................................................................................
72
FIGURA 1: Estrutura química do Cunaniol (1) e Acetato de Cunaniol (2)..............
18
FIGURA 2: Aspecto geral de Clibadium sylvestre...................................................
20
FIGURA 3: Aspecto das flores e folhas de Clibadium sylvestre............................
20
FIGURA 4: Aspecto dos frutos de Clibadium sylvestre..........................................
21
FIGURA 5: Estrutura da glutationa reduzida (GSH)...............................................
24
FIGURA 6: Estrutura da glutationa oxidada (GSSG)..............................................
24
FIGURA 7: Interconversão de glutationa em suas formas reduzida (GSH) e
oxidada (GSSG)......................................................................................................
25
FIGURA 8: Estrutura química do Cunaniol.............................................................
28
FIGURA 9: Estrutura química do Acetato de Cunaniol...........................................
28
FIGURA 10: Estrutura química do Sitosterol..........................................................
28
FIGURA 11: Estrutura química do Estigmasterol...................................................
28
FIGURA 12: Estrutura química de S
4
(Sitosterol)...................................................
42
FIGURA 13: Estrutura química de S
5
(Estigmasterol)............................................
42
FIGURA 14: Espectro de RMN
1
H de S
4
+ S
5
(300 MHz, CDCl
3
)...........................
44
FIGURA 15: Expansão do espectro de RMN
1
H de S
4
+ S
5
(300 MHz, CDCl
3
).....
45
FIGURA 16: Espectro de RMN
13
C de S
4
+ S
5
(75 MHz, CDCl
3
)...........................
46
FIGURA 17: Expansão do espectro de RMN
13
C de S
4
+ S
5
(75 MHz, CDCl
3
).....
47
FIGURA 18: Estrutura parcial para S
3
....................................................................
49
FIGURA 19: Estrutura química de S
3
(Acetato de Cunaniol).................................
50
FIGURA 20: Espectro de Massas de S
3
.................................................................
53
13
FIGURA 21: Espectro de RMN
1
H de S
3
(300 MHz, CDCl
3
)..................................
54
FIGURA 22: Expansão do espectro de RMN
1
H de S
3
(300 MHz, CDCl
3
).............
55
FIGURA 23: Espectro de RMN
13
C de S
3
(75 MHz, CDCl
3
)...................................
56
FIGURA 24: Expansão do espectro de RMN
13
C de S
3
(75 MHz, CDCl
3
).............
57
FIGURA 25: Mapa de Correlação HETCOR de S
3
(CDCl
3
, 300 x 75 MHz
)...........
58
FIGURA 26: Expansão do mapa de Correlação HETCOR de S
3
(CDCl
3
, 300 x
75 MHz
)..................................................................................................................
59
FIGURA 27: Mapa de Correlação HMBC de S
3
(CDCl
3
, 300 x 75 MHz
)...............
60
FIGURA 28: Expansão do mapa de Correlação HMBC de S
3
(CDCl
3
, 300 x 75
MHz
).......................................................................................................................
61
FIGURA 29: Expansão do mapa de Correlação HMBC de S
3
(CDCl
3
, 300 x 75
MHz
).......................................................................................................................
62
FIGURA 30: Expansão do mapa de Correlação HMBC de S
3
(CDCl
3
, 300 x 75
MHz
).......................................................................................................................
63
FIGURA 31: Estrutura química de S
1
(Cunaniol)....................................................
65
FIGURA 32: Espectro de Massas de S
1
.................................................................
66
FIGURA 33: Espectro de RMN
1
H de S
1
(300 MHz, CDCl
3
)...................................
67
FIGURA 34: Expansão do espectro de RMN
1
H de S
1
(300 MHz, CDCl
3
).............
68
FIGURA 35: Expansão do espectro de RMN
1
H de S
1
(300 MHz, CDCl
3
).............
69
FIGURA 36: Espectro de RMN
13
C de S
1
(75 MHz, CDCl
3
)...................................
70
FIGURA 37: Expansão do espectro de RMN
13
C de S
1
(75 MHz, CDCl
3
).............
71
FIGURA 38: Estrutura mais provável para S
6
, a partir da desidratação do
Cunaniol..................................................................................................................
73
FIGURA 39: Estrutura mais provável para S
7
, a partir da hidrogenação do
Cunaniol..................................................................................................................
73
FIGURA 40: Estrutura mais provável para S
8
, a partir da hidrogenação do
Acetato de Cunaniol................................................................................................
74
FIGURA 41: Espectro de massas 1........................................................................
75
FIGURA 42: Espectro de massas 2........................................................................
76
FIGURA 43: Espectro de massas 3........................................................................
77
FLUXOGRAMA I: Obtenção dos extratos brutos das folhas e dos frutos de
Clibadium sylvestre.................................................................................................
32
FLUXOGRAMA II: Fracionamento do extrato bruto hexânico das folhas de
14
Clibadium sylvestre................................................................................................
38
FLUXOGRAMA III: Fracionamento do extrato bruto etanólico das folhas de
Clibadium sylvestre.................................................................................................
40
GRÁFICO 1: Níveis de glutationa no sangue de animais submetidos a 30
minutos de convulsão provocada pela aplicação intraperitoneal de extrato
hexânico. *p<0,005.................................................................................................
79
GRÁFICO 2: Níveis de glutationa no sangue de animais submetidos a 60
minutos de convulsão provocada pela aplicação intraperitoneal de extrato
hexânico. *p<0,005................................................................................................
79
GRÁFICO 3: Razão entre os níveis de glutationa oxidade e glutationa reduzida
após 30 e 60 minutos de convulsão........................................................................
80
QUADRO I: Extratos brutos obtidos das folhas e dos frutos de Clibadium
sylvestre..................................................................................................................
32
TABELA 1: Dados de RMN
13
C (75 MHz, CDCl
3
) de S
4
e S
5
................................
43
TABELA 2: Dados de RMN
1
H,
13
C, correlações HETCOR e HMBC para S
3
(CDCl
3
, 300 e 75 MHz)...........................................................................................
51
TABELA 3: Dados de RMN
1
H,
13
C, correlações HMQC e HMBC para o Acetato
de Cunaniol (CDCl
3
/TMS, 500 MHz) - (Costa et al 2006).......................................
52
TABELA 4: Dados de RMN
1
H,
13
C, para S
1
(CDCl
3
, 300 e 75 MHz)....................
65
15
ABREVIATURAS, SIGLAS E SIMBOLOS
ACN
Acetonitrila
AcO
Acetato
AcOEt
Acetato de etila
ax
Axial
CCDC
Cromatografia em cada delgada comparativa
CCVU
Coluna cromatográfica em sílica gel por via úmida
ddd
Duplo duplo dupleto
eq
Equatorial
g
Grama
GSH
Glutationa reduzida
GSSG
Glutationa oxidada
HETCOR
Heteronuclear Correlation
HMBC
Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
Hex
Hexano
Hz
Hertz
J
Constante de acoplamento
Lit.
Literatura
m
Multipleto
mg
Miligrama
MHz
Mega Hertz
mim
Minuto
mL
Mililitro
mM
Milimolar
MS
Mass Spectrometry
16
m/z
Razão massa/carga
µm
Micrômetro
µL
Microlitro
n
Número de animais
nm
Nanômetro
p
Página
*p
Intervalo de confiança
Fig
Figura
RMN
1
H
Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio-1
RMN
13
C
Ressonância Magnética Nuclear de carbono-13
UPLC
Ultra Performance Liquid Chromatography
λ
Comprimento de onda
δ
Deslocamento Químico
17
1. INTRODUÇÃO
A flora brasileira é dotada de uma exuberante e preciosa fonte para a
pesquisa de produtos naturais, daí a importância e o interesse cada vez maior da
comunidade científica em estudar tais propriedades (Cavalcante, 1974).
Na medicina popular é muito extensa a variedade de plantas utilizadas com
comprovada ação no sistema nervoso central (Hoehne, 1939; Moreira et al., 1989),
que através de investigação podem gerar idéias e oportunidades para pesquisas de
novos agentes, quer como indicativo terapêutico quer como modelos experimentais
para o estudo de determinadas doenças.
Inúmeras plantas das famílias Sapindaceae, Leguminosae e Compositae têm
sido usadas pelos índios e caboclos brasileiros na pesca que, por ser predatória,
vem sendo combatida devido envenenar as águas dos rios, levando à morte e
captura dos peixes de todas as idades. É interessante assinalar o fato dos peixes
envenenados pelos princípios ativos dessas plantas se prestarem ao consumo, sem
que sua carne ofereça risco algum de intoxicação alimentar ao consumidor (Mascaro
et al., 1998).
Clibadium sylvestre que pertence à família Compositae é amplamente
distribuída na região Amazônica, onde é conhecida como cunambi, e sua ingestão
causa “embriaguez”, ou mesmo morte dos peixes demonstrando ter poder
ictiotóxico. Neste caso as folhas são socadas em um pilão, onde o produto é
misturado com farinha de mandioca, reduzido a bolinhas que funcionam como iscas,
e estas, jogadas na água. No que diz respeito à composição química do vegetal,
pouco foi estudado. Quilliam & Stables (1969a) e Gorinsky et al. (1973) identificaram
um álcool C
14
, Cunaniol e Acetato de Cunaniol nas folhas (Fig. 1, p.18). Costa et al.
(2006) também identificaram essas duas substâncias em outra espécie de
Clibadium, C. surinamense L.
Os compostos existentes nas folhas de Clibadium sylvestre são poderosos
estimulantes do sistema nervoso central e neuromuscular, sendo capazes de
reverter quadros de bloqueios cardíacos (Villaméa & Pinto, 2000). Quilliam & Stables
(1969b) comprovaram a ação ictiotóxica do cunaniol ao utilizá-lo em peixes de
18
aquários, onde foram observados os sintomas de hiperestimulação do sistema
nervoso central.
H
3
C C C C C C C
H
H
O
R
1- R = OH
2- R = AcO
Além da ação ictiotóxica, segundo Garcia (1975), as folhas maceradas são
também indicadas na medicina popular para o tratamento de erisipela, hemorragias,
inchaços, e podem ser utilizada como inseticida natural.
Trabalhos preliminares realizados no Laboratório de Neuroquímica da UFPA
demonstraram que o extrato bruto aquoso das folhas desta planta foi capaz de
desencadear “Status epilepticus” (convulsão) em mamíferos, ratos albinos Wistar,
quando administrado por via intraperitoneal (Hamoy, 2002), efeito este comparado
ao da pilocarpina, droga usada no tratamento de glaucoma.
Uma vez que a espécie apresenta grande atividade biológica, propomos neste
trabalho estudar os extratos hexânico e etanólico das folhas de C. silvestre,
aplicando técnicas cromatográficas modernas buscando identificar o maior número
de constituintes químicos e avaliar os efeitos destes e de suas frações como drogas
indutoras de convulsões no sistema nervoso central em ratos.
Os resultados deste estudo poderão levar à valorização da espécie,
modificando o uso tradicionalmente aplicado a esta planta, e assim, gerarem fatores
de desenvolvimento científico e econômico, uma vez que novas drogas poderão ser
elaboradas.
FIGURA 1: Estrutura química do Cunaniol (1) e Acetato de
Cunaniol (2).
19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- GENERALIDADES SOBRE O GÊNERO CLIBADIUM
Clibadium é um gênero pertencente a família Compositae, as suas 29
espécies possuem ampla distribuição geográfica na maioria das regiões neotropicais
e isso inclui muitas das espécies endêmicas locais. O gênero se estende do sul do
México, através da América Central, passando pelo Caribe até América do Sul.
Pode-se encontrar um número muito alto dessas espécies na Costa Rica, Colômbia
e Equador. Algumas espécies possuem ampla distribuição como: C. eggersii
Hieron., C. surinamense L., e C. sylvestre (Aubl.) Baill. (Arriagada, 2003).
Segundo Costa et al. (2006), no Brasil, as plantas do gênero Clibadium,
popularmente conhecidas como cunambi, são comumente encontradas nas regiões
Norte e Nordeste e devido às suas propriedades ictiotóxicas, elas são
utilizadas na pesca predatória pelas populações ribeirinhas.
As espécies de Clibadium são importantes na flora neotropical por três
principais razões. Primeiro, são arbustivas, em alguns casos pequenas árvores, que
as tornam visíveis e são freqüentemente encontradas em muitas regiões,
especialistas em flores lidam freqüentemente com as plantas desse gênero.
Segundo, os frutos são usados como alimentos pelos pássaros e podem indicar um
papel significativo relacionado aos recursos da vida selvagem e ecológica. Terceiro,
uma espécie de Clibadium, C. sylvestre, (Fig. 2 a 4; p. 20 e 21) pode ser uma fonte
de compostos químicos de interesses medicinais, baseado no seu uso como peixe-
veneno por tribos indígenas por toda America Latina (Gorinsky et al., 1973).
2.2 – CLIBADIUM SYLVESTRE
Arbusto alto, até 2 metros de altura, ramos hirsutos e folhas opostas pecioladas,
ovado-oblongas ou ovado-lanceoladas, acuminadas, agudas, cuneadas na base, de
até 13 centímetros de comprimento, geralmente menos, membranosas, denteadas,
ásperas na parte superior e vilosa na inferior, enquanto jovens, depois escabrosas, 8 a
12 flores brancacentas de cheiro forte, reunidas em capítulos ovoideglobosos,
corimboso-peniculados, as exteriores são femininas e as do disco hermafroditas,
20
apresenta envólucro violáceo com escamas agudas e pêlos espessos, fruto obovóide
sem papo (Corrêa, 1984; Hoehne, 1939).
FIGURA 2: Aspecto geral de Clibadium sylvestre
Fonte: Hamoy (2002)
FIGURA 3: Aspecto das flores e folhas de Clibadium sylvestre
Fonte: Hamoy (2002)
21
FIGURA 4: Aspecto dos frutos de Clibadium sylvestre
22
2.3- CONVULSÕES
A epilepsia é uma desordem neuronal caracterizada por convulsões
espontâneas recorrentes que afeta 1 a 2% da população mundial (Browne &
Holmes, 2001). As convulsões se caracterizam por descargas anormais em um
grupo de neurônios cerebrais, levando a uma alteração da atividade cerebral
caracterizada por manifestações motoras, sensitivas, sensoriais, psíquicas ou
neurodegenerativas. Fundamentalmente se dividem em dois grandes grupos:
parciais e generalizadas (Loscher, 1997).
Na crise generalizada não há evidência do local de início, envolve
simultaneamente todo o cérebro ou grande parte de ambos os hemisférios cerebrais,
A consciência é quase sempre comprometida, e as manifestações motoras afetam
os dois lados do corpo. Na crise parcial há evidências clínicas e
eletroencefalográficas que apontam o local de início, que se restringe a uma porção
de um hemisfério cerebral, podendo ser: parciais simples, não provocam alteração
da consciência e manifestam-se como eventos visuais, motores, autonômicos ou
sensoriais, podendo confundir com outros fenômenos transitórios; parciais
complexas, caracterizam-se por uma mudança de consciência, definida como
incapacidade de responder normalmente a estímulos externos, podendo ocorrer em
graus variáveis e associar-se a diversos eventos, como quedas abruptas e
movimentos inconscientes e involuntários (automatismos) (Loscher, 1997).
As crises podem ser convulsivas (com fenômenos motores) ou não. No
primeiro caso, são classificadas como: tônicas, quando o corpo fica rígido; clônicas,
quando há contrações ritmadas seguidas de relaxamento em rápida sucessão;
tônico clônicas, se os dois sintomas estiverem presentes e mioclônicas, caso haja
contrações não ritmadas e erráticas de apenas um ou alguns grupos de músculos
definidos. Caso não haja fenômenos motores, como os anteriormente descritos, as
crises são denominadas atônicas (perda do tônus muscular, sem rigidez do corpo)
ou de ausência (perda do contato com o meio) (Loscher, 1997).
A pesquisa experimental sobre epilepsias tem sido realizada,
predominantemente, em roedores nos quais crises epilépticas podem ser induzidas
por estimulação elétrica ou química (Loscher & Schmidt, 1988).
23
Pesquisas sugerem que o aumento na quantidade de radicais livres e/ou a
diminuição na atividade das defesas antioxidantes podem ser reportados durante os
processos convulsivos (Berg et al., 1995).
A prolongada excitação dos neurônios durante as convulsões pode levar a
injúria e morte celular, resultante de mecanismos bioquímicos desconhecidos. Um
plausível mecanismo de injúria celular envolve a formação de uma quantidade
excessiva de radicais livres (Floyd, 1990) levando a alterações estruturais em
proteínas celulares, membranas lipídicas, DNA e RNA (estresse oxidativo) (Beni &
Moretti, 1995).
2.4- ESTRESSE OXIDATIVO: ATIVIDADE DA GLUTATIONA
As espécies reativas de oxigênio (EROs) são formadas e degradadas por
todos os organismos aeróbicos em quantidades fisiológicas necessárias para as
funções celulares normais, porém quando produzidas em quantidades excessivas ou
quando as defesas antioxidantes são deficientes, elas podem causar prejuízo na
função celular, gerando o estado conhecido como estresse oxidativo (Nordberg &
Arnér, 2001). Diferentes situações induzem a esse estado, como radiação
ultravioleta, radiação ionizante, agentes quimioterápicos, citosinas inflamatórias,
entre outros, perturbando o equilíbrio celular normal, produzindo o estresse oxidativo
nas células (Finkel & Holbrook, 2000).
Todos os tecidos dos organismos aeróbicos podem sofrer danos oxidativos,
porém o tecido nervoso é o mais suscetível em comparação aos demais tecidos,
uma das razões é seu alto consumo de oxigênio, já que é responsável por
aproximadamente 20 % do consumo basal de oxigênio corporal (Halliwell &
Gutteridge, 1999). Assim, o alto consumo de oxigênio pode resultar em um aumento
da formação de espécies reativas de oxigênio.
As principais EROs vinculadas ao estresse oxidativo são: o radical ânion
superóxido (O
2
- .
), radical hidroxil (
.
OH), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), óxido nítrico
(NO) e peroxinitrito (ONOO
-
). Estes por sua vez são neutralizados por um elaborado
sistema de defesa antioxidante constituído de enzimas tais como a catalase, a
superóxido dismutase, a glutationa peroxidase, além de inúmeros sistemas de
24
defesas não-enzimáticas incluindo as vitaminas A, E e C, e o conteúdo de glutationa
reduzida (Alexi et al., 1998).
A glutationa é um tripeptídeo (g-L-glutamil-L-cisteinil-glicina), que existe no
organismo em suas formas reduzida (GSH) (Fig. 5) e oxidada (GSSG) (Fig. 6),
atuando direta ou indiretamente em muitos processos biológicos importantes,
incluindo a síntese de proteínas, metabolismo e proteção celular (Meister &
Anderson, 1983).
HO
O
NH
2
O
NH
SH
NH
O
OH
O
FIGURA 5: Estrutura da glutationa reduzida (GSH)
HO
O
NH
2
O
NH
NH
O
OH
O
HO
O
NH
2
O
NH
NH
O
OH
O
S
S
FIGURA 6: Estrutura da glutationa oxidada (GSSG)
25
O núcleo do resíduo cistenilglicina da glutationa está envolvido na sua função
como antioxidante, mais especificamente como um redutor intracelular, sendo
capaz, por exemplo, de reagir com um elétron não pareado de um radical livre,
formando um radical GS·, que produz, por dimerização, o GSSG (glutationa
oxidada). O GSSG é, então, reduzido pela glutationa redutase (GR), regenerando o
GSH, num processo às custas de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
(NADPH), tendo como objetivo impedir a paralisação do ciclo metabólico da
glutationa (Fig. 7). (Kretzschmar, 1996).
A glutationa redutase age conjuntamente com a glutationa peroxidase (GSH-
Px) que é encontrada em muitos tecidos animais, sendo também considerada um
dos principais sistemas antioxidantes. A enzima reage com uma variedade de
hidroperóxidos orgânicos, assim como o H
2
O
2
(Wendel, 1981), e é a principal
responsável pela degradação do peróxido de hidrogênio no sistema nervoso.
FIGURA 7: Interconversão de glutationa nas suas formas
reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) pela ação das enzimas
glutationa peroxidase (GSH-Px), glutationa oxidase (GO) e
glutationa redutase (GR), (Meister & Anderson, 1983).
26
A resistência de muitas células contra o estresse oxidativo está associada
com elevados níveis intracelulares de glutationa em sua forma reduzida. O estresse
oxidativo pode causar mudanças no estado redox da glutationa aumentando a
liberação de glutationa oxidada (dissulfeto) no organismo. Assim, alguns estudos
têm direcionado o interesse no monitoramento de glutationa em amostras biológicas
com o propósito de estudar a patologia de algumas doenças relacionadas ao
estresse oxidativo.
27
3. OBJETIVOS
3.1- GERAIS:
► Estudo fitoquímico das folhas e dos frutos de Clibadium silvestre.
► Avaliação bioquímica do processo convulsivo provocado por Clibadium sylvestre.
3.2- ESPECÍFICOS:
► Obter extratos das folhas e dos frutos em quantidades suficientes para o
isolamento e purificação de substâncias.
► Caracterizar as substâncias presentes nas folhas e/ou nos frutos da espécie
estudada através de técnicas cromatográficas (HPLC) e espectrométricas.
► Examinar os níveis de glutationa, como marcador de estresse oxidativo, envolvido
nas convulsões induzidas provocadas por Clibadium sylvestre em ratos adultos.
28
4. ESTRUTURA DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE C. SYLVESTRE
No presente trabalho foram isoladas as substâncias: Cunaniol (Fig.8), Acetato
de Cunaiol (Fig. 9) e uma mistura de β-sitosterol (Fig.10) e Estigmasterol (Fig.11).
FIGURA 8: Estrutura química do Cunaniol.
H
3
C C C C C C C
H
H
O
HO
H
3
C C C C C C C
H
H
O
CH
3
COO
FIGURA 9: Estrutura química do Acetato de
Cunaniol.
H
H
H
HO
FIGURA 10: Estrutura química do β-sitosterol.
H
H
H
HO
FIGURA 11: Estrutura química do
Estigmasterol.
29
5. MATERIAS E MÉTODOS
5.1- INSTRUMENTAL E REAGENTES UTILIZADOS
5.1.1- Equipamentos
► Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear VARIAN modelo Mercury 300-
Laboratório de Química – Pesquisa, Programa de Pós-Graduação em Química,
Instituto de Ciências Exatas e Naturais, UFPA;
► Balança analítica – SARTORIUS modelo BP-210S;
► Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência Shimadzu, composto por duas bombas,
modelo LC-10AD, detector com único canal de absorbância na região do ultravioleta,
operando com comprimento de onda em 254nm modelo SPD-10AV, degaseificador
IU57de membrana, modelo DGU-14, injetor de amostras Rheodyne 7752i, com alça
de amostragem de 20µL, interface de comunicação CBM 10A acoplado a
microcomputador Pentium II com software de integração Class LC-10- Laboratório
de Cromatografia Líquida (LABCROL)- UFPA.
► Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência Shimadzu, composto por duas bombas,
modelo LC-8AD, detector com único canal de absorbância na região do ultravioleta,
operando com comprimento de onda em 254nm modelo SPD-10AV, injetor de
amostras Rheodyne 7752i, com alça de amostragem de 500µL, interface de
comunicação CBM 10A acoplado a microcomputador Pentium II com software de
integração Class LC-10- LABCROL-UFPA.
► Cromatógrafo líquido de Alta Eficiência Shimadzu, modelo Prominence composto
por uma bomba quaternária, modelo LC-20AT, Degaseificador de membranas DGU-
20ª, Detector de Arranjos de Diodo (DAD), modelo SPD-M20A, auto injetor de
amostras SIL-20A, interface de comunicação CBM-20A acoplado a microcomputador
Pentium IV com software de integração LC solution- LABCROL-UFPA.
► Cromatógrafo líquido Waters Acquity UPLC;
► Seringas Hamilton com capacidade de 100 µL e 500 µL;
► Ultra-som Branson 2200;
30
► Sistema de Espectroscopia de Massas Waters Quattro premier XE (Quadrupolo
Tandem), fontes de Ionização- APCI, modo positivo, gás de colisão- Argônio;
5.1.2- Solventes utilizados nas preparações dos extratos orgânicos e nas
análises cromatográficas.
► Solventes grau HPLC (TEDIA);
► Água purificada em um sistema de água Milipore (Direct-Q3).
5.1.3- Solventes usados na obtenção dos espectros de RMN
► Solventes deuterados (TEDIA)
5.1.4- Fases estacionárias utilizadas para análises em cromatografia sólido-
líquido
► Sílica-gel 70-230 mesh para cromatografia em coluna (TEDIA);
► Sílica-gel 60 GF para cromatografia de camada delgada comparativa;
► Colunas para Cromatografia Líquida de Alta Eficiência- Foram usadas como fase
estacionária as colunas: Gemini C18 (150mm x 4,60mm, 5µm) analítica e Gemini
C18 (250mm x 10mm, 5µm) semipreparativa, ambas da fenomenex.
5.2- ANIMAIS
Para realizar o presente trabalho, foram utilizados ratos albinos Wistar
adultos do sexo masculino, pesando entre 200 a 290g, provenientes do Biotério da
Universidade Federal do Pará, e mantidos no Biotério do Laboratório de
Neuroquímica (após prévia aplicação de ectoparasiticida, vermifugação e avaliação
clínica dos animais), sob condições de livre acesso à água e alimentação, como
também à temperatura ambiente constante e ciclo claro-escuro de 12 horas, de 7:00
às 19:00.
31
6. PARTE EXPERIMENTAL
6.1- COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO
O material botânico utilizado neste estudo foi coletado no campus da
Universidade Federal do Pará, na cidade de Castanhal, Estado do Pará. A
identificação botânica foi feita pelo Dr. Manuel Euclides do Nascimento, doutor em
botânica, professor de sistemática da UFRA, sendo uma exsicata depositada em
herbário.
6.2- PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS
6.2.1- Extratos brutos das folhas
As folhas de Clibadium sylvestre correspondentes a primeira coleta, foram
limpas e em seguida secas em estufa, sendo, posteriormente trituradas, totalizando
772,7g de material seco e moído. As extrações foram realizadas por maceração
(duas extrações por um período de 24 horas, cada) com solventes em ordem
crescente de polaridade, hexano, diclorometano e metanol, respectivamente. Após
filtração foram obtidos os extratos brutos hexânico (6,10g), diclorometânico (18,20g)
e metanólico (20,65g). A partir da segunda coleta e utilizando a mesma metodologia,
420g de material seco e moido das folhas de Clibadium sylvestre foram submetidos
a extração com etanol, obtendo-se assim, o extrato bruto etanólico (21,5g).
6.2.2- Extratos brutos dos frutos
A partir de uma única coleta e realizando um procedimento similar ao anterior
(para as folhas), 117g de material seco e moído dos frutos de Clibadium sylvestre
foram submetidos à extração (exceto com etanol), obtendo-se os extratos brutos
hexânico (3,21g), diclorometânico (4,87g) e metanólico (4,14g).
Todos os extratos citados com suas respectivas massas e rendimentos
percentuais calculados em relação ao peso do material de partida seco encontram-
se descritos no Quadro I (p. 32), seguido do fluxograma que resume as etapas.
32
QUADRO I: Extratos brutos obtidos das folhas e dos frutos de Clibadium sylvestre.
PARTE
VEGETAL
SOLVENTE
DESIGNAÇÃO
EXTRATO
BRUTO (g)
RENDIMENTO (%)
Folhas
Hexano
EHFL
6,10
0,99
Diclorometano
EDFL
18,20
3,74
Metanol
EMFL
20,65
1,43
Etanol
EEFL
21,5
5,11
Frutos
Hexano
EHFR
3,21
2,75
Diclorometano
EDFR
4,87
4,16
Metanol
EMFR
4,14
3,54
FLUXOGRAMA I: Obtenção dos extratos brutos das folhas e dos frutos de
Clibadium sylvestre.
Folhas secas (772,7g)
Frutos secos (117g)
Torta
EHFL (6,01g)
EHFR (3,21g)
EDFL (18,20g)
EDFR (4,87g)
Torta
EMFL (20,65g)
EMFR (4,14g)
Torta
residual
Maceração
Hexano (2 x 24h)
Filtrar
Maceração
Diclorometano (2 x 24h)
Filtrar
Maceração
Metanol (2 x 24h)
Filtrar
Concentrar
Concentrar
Concentrar
33
6.3- PERFIL CROMATOGRÁFICO DOS EXTRATOS
Considerando os estudos de Snyder (1996), foi utilizada uma eluição
gradiente com fase móvel composta por água (solvente A) e acetonitrila (solvente B)
variando de 5 a 100% de B em 60min com vazão de 1mL/min e capacidade da alça
de amostragem de 20µL.
O perfil cromatográfico de cada extrato foi avaliado através da interpretação
de cada cromatograma, assim, além de estimar o número de componentes químicos
presentes em cada amostra, também foi possível fazer uma comparação entre os
extratos provenientes das folhas e dos frutos.
Todos os extratos, separadamente, foram submetidos a um pré-tratamento
(Extração em Fase Sólida) que consistiu na utilização de um cartucho C18 com
50mg de fase estacionária e 1mL de volume. O cartucho foi condicionado com 1mL
de acetonitrila (ACN) e em seguida 1mL de H
2
O. Foram adicionados 5mg de cada
extrato (exceto para o extrato etanólico) a 800 µL de ACN e levada ao ultra-som por
1 min. Em seguida foram adicionados 200 µL de H
2
O e novamente a fração foi
levada ao ultra-som por mais 1 min, sendo em seguida inoculada no cartucho. A
partir da solução resultante foi retirada uma alíquota de 20µL e injetada no sistema
HPLC analítico, para obter o perfil cromatográfico (Cromatogramas I a VI, p.24 a 26).
O HPLC analítico usado foi o aparelho LC-20AT (Shimadzu), como fase
estacionária, utilizou-se uma coluna Gemini C18 (150 x 4,60mm), 5 µm e pré-coluna
C18. Como fase móvel, utilizou-se mistura de solventes, água ultra-pura, obtida de
um sistema millipore (Direct-Q3), com ACN, em fluxo de 1mL/min. Os solventes
foram filtrados em membrana de nylon de 0,45µm e mantidos em um banho de ultra-
som durante 20 min.
A seguir os cromatogramas representam o perfil cromatográfico para os
extratos das folhas e dos frutos de Clibadium sylvestre.
34
0 10 20 30 40 50 60 70 min
-250
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
mAU
242nm,4nm (1.00)
/27.669
/32.383
/40.324
0 10 20 30 40 50 60 70 80 min
0
250
500
750
1000
1250
1500
mAU
242nm,4nm (1.00)
/32.330
/40.296
CROMATOGRAMA I: EHFL. Gradiente com fase móvel composta por:
solvente A=H
2
O, solvente B=ACN variando de 5 a 100% de B em 60 min com
vazão de 1mL/min e fase estacionária C18 (Gemini), λ=242nm.
min
min
CROMATOGRAMA II: EHFR. Gradiente com fase móvel composta por:
solvente A=H
2
O, solvente B=ACN variando de 5 a 100% de B em 60 min com
vazão de 1mL/min e fase estacionária C18 (Gemini), λ=242nm.
35
0 10 20 30 40 50 60 70 min
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
mAU
242nm,4nm (1.00)
/27.898/96523
/32.614/5107375
/37.607/135371
/40.602/7236361
/43.458/119395
/60.546/126805
/73.472/113060
CROMATOGRAMA III: EDFL. Gradiente com fase móvel composta por:
solvente A=H
2
O, solvente B=ACN variando de 5 a 100% de B em 60 min
com vazão de 1mL/min e fase estacionária C18 (Gemini), λ=242nm.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
mAU
242nm,4nm (1.00)
/32.398/4700765
CROMATOGRAMA IV: EDFR. Gradiente com fase móvel composta por:
solvente A=H
2
O, solvente B=ACN variando de 5 a 100% de B em 60 min
com vazão de 1mL/min e fase estacionária C18 (Gemini), λ=242nm.
36
0 10 20 30 40 50 60 70 80 min
-50
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
mAU
242nm,4nm (1.00)
CROMATOGRAMA V: EMFL. Gradiente com fase móvel composta por:
solvente A=H
2
O, solvente B=ACN variando de 5 a 100% de B em 60 min
com vazão de 1mL/min e fase estacionária C18 (Gemini), λ=242nm.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 min
-50
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
mAU
242nm,4nm (1.00)
/32.406/3062566
CROMATOGRAMA VI: EMFR. Gradiente com fase móvel composta por:
solvente A=H
2
O, solvente B=ACN variando de 5 a 100% de B em 60 min
com vazão de 1mL/min e fase estacionária C18 (Gemini), λ=242nm.
37
Analisando o perfil cromatográfico para os cromatogramas de I a VI, percebe-
se similaridade qualitativa em suas composições, temos basicamente a presença de
três substâncias majoritárias que correspondem aos sinais em 27, 32 e 40min. A
substância com o tempo de retenção 32 min é a que está presente em maior
concentração em todos os extratos.
É importante ressaltar que os primeiros extratos obtidos foram o hexânico e
etanólico das folhas de Clibadium sylvestre, imediatamente após obtenção, os
mesmos foram enviados para o laboratório de Neuroquímica Molecular e Celular
(UFPA), para realização de testes biológicos enquanto outros extratos estavam
sendo obtidos, os resultados foram muito promissores, principalmente para o extrato
hexânico. Assim, após obtenção de todos os extratos e análise dos mesmos,
decidiu-se dar seqüência no estudo fitoquímico apenas para os extratos hexânico e
etanólico das folhas, já que todos os extratos possuem similaridade em suas
composições, não havendo, portanto necessidade no momento em realizar um
estudo fitoquímico para todos.
6.4- ISOLAMENTO DAS SUBSTÂNCIAS
6.4.1- Fracionamento do extrato hexânico das folhas de Clibadium sylvestre.
O extrato hexânico das folhas (6,10g) foi fracionado em coluna cromatográfica
em sílica gel por via úmida (CCVU) filtrante, utilizando-se as misturas de solventes
com polaridade crescente, resultando num total de 4 frações: Hex- AcOEt 10%
(1,45g), Hex- AcOEt 30% (1,85g), Hex- AcOEt 50% (0,85g) e AcOEt 100% (0,60g).
As frações obtidas foram monitoradas através de cromatografia em camada delgada
comparativa (CCDC) e reveladas com solução de sulfato cérico 1%. As frações Hex-
AcOEt 30% e Hex- AcOEt 50%, foram reunidas (Fr, 2,7g) e refracionadas em coluna
cromatográfica e eluida com hexano e acetato de etila em ordem crescente de
polaridade, resultando um total de 10 frações que foram reunidas em Fr
1
(Fr. 4-7,
1,20g) e Fr
2
(Fr. 8-9, 0,2g). As frações Fr
1
e Fr
2
foram dissolvidas separadamente
em acetonitrila, filtradas em membrana filtrante com diâmetro de poros de 0,25µm,
sendo posteriormente injetadas, em alíquotas de 500µL no sistema HPLC.
O HPLC semipreparativo usado foi o aparelho LC-8 AD (Shimadzu), como
fase estacionária, utilizou-se uma coluna semipreparativa Gemini C18 (250 x 10mm),
5 µm e pré-coluna C18. Como fase móvel, utilizou-se mistura de solventes, água
38
ultra-pura, obtida de um sistema millipore (Direct-Q3), com acetonitrila, em fluxo de
4,7mL/min. Os solventes foram filtrados em membrana de nylon de 0,45µm e
mantidos em um banho de ultra-som durante 20 min. Foi utilizado um sistema
isocrático de H
2
O/ACN 60%. A separação dos picos no HPLC semipreparativo
resultou em 3 frações para Fr
1
e 1 fração para Fr
2
. Observe o fluxograma e os
cromatogramas a seguir:
FLUXOGRAMA II: Fracionamento do extrato bruto hexânico das folhas de Clibadium
sylvestre.
As porcentagens citadas no fluxograma acima se referem ao solvente acetato de
etila (AcOEt).
HPLC semipreparativo
C18 em H
2
O/ACN 60%
EHFL
6,10g
Hex-AcOEt
10%
1,45g
Hex-AcOEt
30%
1,85g
Hex-AcOEt
50%
0,85g
AcOEt
100%
0,60g
Fr
2
0,2g
Fr
1
1,2g
S
1
S
1
S
2
S
3
CCVU filtrante em sílica gel
CCVU, mistura de Hex/AcOEt
com polaridade crescente
HPLC semipreparativo
C18 em H
2
O/ACN 60%
Fr
2,7g
39
5
10
15
20
25
10.041
S
1
0
min
9.990
15.993
22.416
0
20
30
mAU
S
1
S
2
S
3
750
500
250
-86
10
min
250
500
750
mAU
CROMATOGRAMA VII: Fração Fr
1
. Sistema isocrático de eluição com fase móvel
composta por: H
2
O:ACN 40:60 em 40min e vazão de 4,7 mL/min e fase estacionária
C18 (Gemini), λ=242nm
CROMATOGRAMA VIII: Fração Fr
2
. Sistema isocrático de eluição com fase móvel
composta por: H
2
O:ACN 40:60 em 40min e vazão de 4,7 mL/min e fase estacionária
C18 (Gemini), λ=242nm
-86
40
Após análise dos dados espectrais de RMN de
1
H e
13
C das substâncias S
1
,
S
2
e S
3
verificou-se que S
1
é o Cunaniol e S
3
é o Acetato de Cunaniol a substância
S
2
ainda não possui sua estrutura elucidada, uma vez que a massa obtida foi muito
pequena e possuía impurezas, dificultando a interpretação dos espectros. A
elucidação estrutural para as substâncias serão discutidas no próximo capítulo.
6.4.2- Fracionamento do extrato etanólico das folhas de Clibadium sylvestre.
O extrato etanólico das folhas (21,5g) foi fracionado em coluna cromatográfica
em sílica gel por via úmida (CCVU), e eluido com hexano e acetato de etila em
ordem crescente de polaridade, resultando um total de 105 frações. As frações
obtidas foram monitoradas através de cromatografia em camada delgada
comparativa (CCDC) e reveladas com solução de sulfato cérico 1%. As frações
foram reunidas em Fr
3
(Fr. 31-36, 550mg); Fr
4
(Fr. 50-52, 80mg) e Fr
5
(Fr. 91- 96,
220mg).
Após análise dos dados espectrais de RMN de
1
H e
13
C das frações verificou-
se que Fr
3
é o Acetato de Cunaniol, Fr
4
corresponde a uma mistura de Sitosterol e
Estigmasterol e Fr
5
é o Cunaniol. O fluxograma a seguir resume as etapas.
FLUXOGRAMA III: Fracionamento do extrato bruto etanólico das folhas de
Clibadium sylvestre.
Hex/AcOEt 20%
EEFL
21,5g
Fr
3
31-36
550mg
Fr
4
50-52
80mg
Fr
5
91-96
220mg
S
4
+ S
5
S
1
S
3
CCVU (sílica gel), eluida com Hex-
AcOEt em ordem crescente de
polaridade
Hex/AcOEt 10%
Hex/AcOEt 15%
41
6.5- AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE GLUTATIONA
A determinação dos níveis de glutationa serão realizadas baseados no
método de Anderson (1985).
A glutationa reduzida (GSH) reduz o ácido- 5, 5-ditiobis-2 nitrobenzóico
(DTNB) para ácido nitrobenzoico (TNB), o qual pode ser medido por
espectrofotometria na absorvância de 412 nm. O método utilizado consiste em
construir uma curva padrão com concentrações de glutationa de (0 a 27µg/mL) como
base para cálculo dos valores obtidos nas amostras. Para medir os níveis de GSH,
serão utilizado, 100 L de GSH redutase 100U/mL e 50 L de NADPH a 4mM que
serão adicionados em tubos contendo 20 L da amostra diluída previamente em 2
mL de PBS a 1mM (homogeneizada através de sonicagem das amostras) e 730 L
de PBS/EDTA a 1 mM, e após 20 minutos de reação será colocado 100 L de DTNB
(substância reveladora), fechando um volume de 1mL. Imediatamente após a adição
do DTNB as amostras serão lidas em espectrofotometria. Cada amostra possuirá um
correspondente branco (sem enzima glutationa redutase), cujos valores de
absorvância serão subtraídos dos valores obtidos para as amostras com glutationa
redutase.
6.6- ANÁLISE ESTATÍSTICA
O programa Biostat 5.0 foi usado para a análise estatística. O p<0,005 foi
considerado estatisticamente significante. Os resultados foram apresentados em
estatística descritiva como média, desvio padrão, coeficiente de variação, variância,
amplitude. Na análise de variância (ANOVA) um critério seguida do teste t de
Student (amostras independentes) e intervalo de confiança (GUEDES & GUEDES,
1988; VIEIRA, 1989), na avaliação das possíveis diferenças entre os dados
apresentados neste trabalho.
42
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO
7.1- DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE S
1
, S
3
, S
4
e S
5
.
7.1.1- Determinação estrutural de S
4
e S
5
.
Os esteróides são muito comuns no reino vegetal, dentre os quais o mais
comum representante é o β-sitosterol, em geral esses compostos são obtidos em
misturas devido às suas semelhanças estruturais. Mediante interpretação dos
espectros de RMN
1
H (Fig. 14 e 15, p.44 e 45) e de RMN
13
C (Fig.16 e 17, p. 46 e
47), as substâncias S
4
(Fig. 12) e S
5
(Fig. 13) foram identificadas como uma mistura,
cujas estruturas encontram-se a seguir.
14
28
29
27
26
25
24
23
22
21
20
16
15
17
13
18
12
11
19
10
9
8
7
6
5
4
3
1
2
H
H
H
HO
14
28
29
27
26
25
24
23
22
21
20
16
15
17
13
18
12
11
19
10
9
8
7
6
5
4
3
1
2
H
H
H
HO
O espectro de RMN
1
H da mistura S
4
+ S
5
apresenta um singleto largo em δ
H
5,35 referentes aos hidrogênios H-6 em S
4
e S
5
, um multipleto em δ
H
3,52 referente
aos hidrogênios H-3 em S
4
e S
5
. O singleto largo e o multipleto citados são sinais
característicos de esteróides com grupo hidroxílico ligado ao C-3 e insaturação entre
C-5 e C-6. Observou-se também um duplo dupleto em δ
H
5,15 referente ao H-22 em
S
5
, outro duplo dupleto em δ
H
5,00 referente ao hidrogênio H-23 em S
5
, e um
acúmulo de sinais na região de δ
H
0,60 a 2,40, referentes aos vários grupos de
hidrogênios metílicos, metilênicos e metínicos.
A partir da interpretação desses conjuntos de sinais e análise dos dados do
espectro de RMN
13
C para S
4
e S
5
comparados com os dados da literatura (Brasil,
1999), tabela 1 a seguir (p. 43), foi possível confirmar a presença de β-sitosterol (S
4
)
e Estigmasterol (S
5
).
FIGURA 12: Estrutura química de S
4
(β-sitosterol)
FIGURA 13: Estrutura química de S
5
(Estigmasterol)
43
TABELA 1: Dados de RMN
13
C (75 MHz, CDCl
3
) de S
4
e S
5
C
δc de S
4
δc (Lit.)
δc de S
5
δc (Lit.)
1
37,2
37,3
37,2
37,3
2
31,8
31,7
31,8
31,7
3
71,8
71,8
71,8
71,8
4
42,3
42,3
42,3
42,3
5
140,6
140,8
140,6
140,8
6
121,7
121,7
121,7
121,7
7
31,8
31,9
31,8
31,9
8
31,8
31,9
31,8
31,9
9
50,1
50,2
50,1
50,2
10
36,4
36,5
36,4
36,5
11
21,1
21,1
21,1
21,1
12
39,7
39,8
39,6
39,7
13
42,3
42,3
42,3
42,3
14
56,7
56,8
56,8
56,9
15
24,2
24,3
24,3
24,4
16
28,2
28,2
28,2
28,2
17
56,0
56,1
55,9
56,0
18
11,8
12,0
12,2
12,2
19
19,3
19,4
19,3
19,4
20
36,1
36,1
36,1
36,1
21
18,7
18,8
21,0
21,1
22
34,0
34,0
138,2
138,3
23
26,0
26,2
129,2
129,3
24
45,8
45,8
51,2
51,2
25
29,2
29,2
31,8
31,9
26
19,7
19,8
21,1
21,2
27
19,0
19,1
19,7
19,8
28
23,0
23,1
25,3
25,4
29
12,0
11,9
12,0
12,1
44
FIGURA 14: Espectro de RMN
1
H de S
4
+ S
5
(300 MHz, CDCl
3
)
45
FIGURA 15: Expansão do espectro de RMN
1
H de S
4
+ S
5
(300 MHz, CDCl
3
)
46
FIGURA 16: Espectro de RMN
13
C de S
4
+ S
5
(75 MHz, CDCl
3
)
47
FIGURA 17: Expansão do espectro de RMN
13
C de S
4
+ S
5
(75 MHz, CDCl
3
)
48
7.1.2- Determinação estrutural de S
3
A substância S
3
foi isolada em HPLC a partir da fração Fr
1
, resultante do
fracionamento em coluna cromatográfica por via úmida do extrato hexânico das
folhas de Clibadium sylvestre. Esta substância também foi isolada a partir da fração
Fr
3
resultante do extrato etanólico.
O espectro de massas de S
3
, obtido por eletrospray no modo positivo
mostrou o pico [M+H]
+
detectado a m/z 257,4 (Fig. 20, p. 53). Esses dados, em
conjunto, com os dados de RMN
13
C permitem escrever a fórmula molecular
C
16
H
16
O
3
, (256 u.m.a.).
Analisando os dados espectrais de RMN
1
H (Fig. 21 e 22, p. 54 e 55) observa-
se a presença de dois duplos dupletos, integrando para um hidrogênio cada,
centrados em δ
H
5,75 (J= 1,2 e 15,9 Hz) e 6,27 (J= 5,4 e 15,9 Hz). Estes sinais são
característicos de hidrogênios olefínicos, relacionados através de uma configuração
trans (J= 15,9 Hz). Continuando com a análise observa-se sinais em: δ
H
3,74
integrando para um hidrogênio (ddd, J= 1,2; 5,4; 9,0 Hz), 1,45 (m), 1,66(m), 1,70(m),
2,17(m), 3,37(m), 3,91(m) e 4,45(m). A partir desse conjunto de sinais é possível
sugerir a presença de um anel pirânico.
O espectro de RMN
13
C (Fig.23 e 24, p. 56 e 57) exibiu 16 sinais, destes
apenas 9 representam carbonos ligados diretamente a hidrogênios, foi isso que
mostrou o mapa de correlações HETCOR (Fig.25 e 26, p, 58 e 59), desta forma
temos: 2 carbonos metílicos, 4 metínicos, 3 metilênicos e 7 carbonos totalmente
substituídos. Dois carbonos metínicos em δ
C
144,29 e 110,14, foram atribuídos,
respectivamente, aos carbonos olefínicos C-7 e C-8, logo os outros dois pertencem
ao anel pirânico.
Através da análise do mapa de correlações HETCOR foi possível atribuir o
sinal em δ
H
5,75 ao H-8 e δ
H
6,27 ao H-7 uma vez que eles se correlacionam com C-
8 e C-7, respectivamente.
A partir da análise do mapa de correlações HMBC (Fig. 27 a 30 p. 60 a 63)
verificou-se que o sinal em δ
C
78,63, atribuído ao carbono oximetínico (C-2), possui
correlações
2
J
CH
com H-7,
3
J
CH
com H-8,
2
J
CH
com o sinal em δH 4,45 atribuído ao
hidrogênio H-3ax e
3
J
CH
com o sinal em δH 3,37 atribuído ao hidrogênio H-6ax.
49
A atribuição dos carbonos C-3 e C-6 foi feita com base na análise do mapa de
correlações HETCOR o qual mostrou correlação de H-3ax com o sinal em δ
C
71,36 e
H-6ax com o sinal em δ
C
67,36, e ainda C-6 se correlaciona com outro sinal de
hidrogênio em δ
H
3,91 (H-6eq). Podemos sugerir que o carbono C-3 está oxidado
em função do deslocamento δ
C
71,36. Assim, podemos inicialmente inferir a
seguinte estrutura parcial para S
3
(Fig. 18).
8
7
6
5
4
3
2
1
H
H
H
H
H
H
H
O
H
H
H
OR
R
Retomando a análise de RMN de
1
H, atribuiu-se o sinal ddd em δ
H
3,74 ao H-
2 devido apresentar acoplamentos alílico (J= 1,2 Hz) com H-8 e diaxial (J= 9,0 Hz)
com H-3 e por HETCOR mostrou correlação com C-2.
O mapa de correlações HMBC, mostrou duas correlações
2
J
CH
entre C-6 e um
grupo metileno em δ
H
1,66 e δ
H
1,70 e uma correlação
3
J
CH
com H-2ax, logo foi
possível atribuir os sinais em δ
H
1,66 e δ
H
1,70 aos dois hidrogênios
diastereotópicos, H-5ax e H-5eq, respectivamente. O sinal em δ
C
24,61 foi atribuído
ao C-5, que por HETCOR mostrou correlação com os hidrogênios H-5ax e H-5eq.
Para concluir as atribuições do anel pirânico, falta definir os deslocamentos
para a posição 4, assim o HMBC mostrou correlações
3
J
CH
entre o sinal em δ
C
29,13
e os hidrogênios H-2ax e H-6ax, logo podemos atribuir o sinal δ
C
29,13 ao C-4 que
por HETCOR se correlaciona com os sinais de hidrogênios diastereotópicos em δ
H
1,45 (H-4ax) e δ
H
2,17 (H-4eq).
O espectro de RMN
13
C mostrou ainda 7 sinais, que segundo o mapa de
correlações HETCOR são de carbonos totalmente substituídos:
► O sinal em δ
C
169,83 foi atribuído ao carbono carbonílico (C-16), que por HMBC
mostrou correlação
2
J
CH
com o singleto em δ
H
2,01 e
3
J
CH
com H-3ax. O sinal em δ
H
FIGURA 18: Estrutura parcial para S
3
50
2,01 foi atribuído aos hidrogênios do grupo metila (H-17), que por HETCOR mostrou
correlação com o carbono metílico (C-17) em δ
C
20,96, essas atribuições indicam a
presença do grupo acetato.
► O sinal em δ
C
73,36 foi atribuído ao C-9 devido apresentar por HMBC correlação
3
J
CH
com H-7.
► O sinal em δ
C
75,51 foi atribuído ao C-10 devido apresentar por HMBC correlação
3
J
CH
com H-8.
► O sinal em δ
C
58,77 foi atribuído ao C-11 devido apresentar por HMBC correlação
4
J
CH
com H-8.
► O sinal em δ
C
78,21 foi atribuído ao C-14, que por HMBC mostrou correlação
2
J
CH
com o singleto em δ
H
1,95 atribuído aos hidrogênios do grupo metila (H-15).
Analisando o mapa de correlações HETCOR, observou-se uma correlação de H-15
com o sinal em δ
C
4,53 atribuído ao carbono metílico C-15.
► O sinal em δ
C
67,28 foi atribuído ao C-13 devido apresentar por HMBC correlação
3
J
CH
com H-15
► O sinal em δ
C
64,78 foi atribuído ao C-12.
A partir da discussão chega-se a seguinte estrutura (Fig. 19) para S
3
(Acetato
de Cunaniol).
8
7
6
5
4
3
2
1
H
H
H
H
H
H
H
O
H
H
H
OR
H
3
C
9
10
1112131415
R
COCH
3
16 17
Todos os dados espectrais citados para S
3
estão resumidos na tabela 2 (p.
51) e são compatíveis com a estrutura do Acetato de Cunaiol. Os dados da literatura
(Costa et al, 2006) para o Acetato de Cunaiol estão presentes na Tabela 3 (p. 52) e
FIGURA 19: Estrutura química de S
3
(Acetato de Cunaniol)
51
possuem cinco atribuições incorretas para os carbonos nas posições 7,8,9,10 e 13
e duas atribuições para os hidrogênios nas posições 7 e 8.
TABELA 2: Dados de RMN
1
H,
13
C, correlações HETCOR e HMBC para S
3
(CDCl
3
,
300 e 75 MHz)
C
HETCOR
δ
H
de S
3
δ
C
de S
3
HMBC (
2
J e
3
J)
2
CH
H ax 3,74
78,63
3,37(
3
J); 4,45(
2
J); 5,75(
3
J);
6,27(
2
J)
3
CH
H ax 4,45
71,36
3,74(
2
J); 6,27(
3
J)
4
CH
2
H ax 1,45
H eq 2,17
29,13
3,37 (
3
J); 3,74 (
3
J)
5
CH
2
H ax 1,66
H eq 1,70
24,61
3,37 (
2
J); 3,91 (
2
J)
6
CH
2
H ax 3,37
H eq 3,91
67,36
1,66 (
2
J); 1,70 (
2
J); 3,74 (
3
J)
7
CH
HC
t
= 6,27
144,29
3,74 (
2
J); 4,45 (
3
J); 5,75 (
2
J)
8
CH
HC
t
= 5,75
110,14
3,74 (
3
J); 6,27 (
2
J)
9
-
73,36
6,27 (
3
J)
10
-
75,51
5,75 (
3
J)
11
-
58,77
5,75 (
4
J)
12
-
64,78
13
-
67,28
1,95 (
3
J)
14
-
78,21
1,95 (
2
J)
15
CH
3
1,95
4,53
16
CO
169,83
2,01 (
2
J); 4,45 (
3
J)
17
CH
3
2,01
20,96
52
TABELA 3: Dados de RMN
1
H,
13
C, correlações HMQC e HMBC para o Acetato de
Cunaniol (CDCl
3
/TMS, 500 MHz) - (Costa et al, 2006).
C
HMQC
RMN
1
H (δ)
RMN
13
C (δ)
HMBC (J
2
e J
3
)
C-2
CH
H axα 3,77
78,70
3,90; 4,50
C-3
CH
H axβ 4,50
71,40
2,20; 1,76; 5,8
C-4
CH
2
H axα 1,45
H eqβ 2,04
29,2
3,9; 3,4; 3,7
C-5
CH
2
H axβ 1,50
H eqβ 1,70
24,7
2,20; 1,45 (J
2
)
C-6
CH
2
H axα 3,40
H eqβ 3,90
67,50
1,76; 2,20
C-7
CH
HC
t
= 5,80
110,4
C-8
CH
HC
t
= 6,29
144,4
C-9
-
67,39
C-10
-
73,47
C-11
-
54,4
C-12
-
64,9
C-13
-
75,6
1,94 (J
3
)
C-14
-
78,2
1,94 (J
2
)
C-15
CH
3
1,94
4,66
C-16
CO
169,9
2,04 (J
2
)
C-17
CH
3
2,04
21,10
53
FIGURA 20: Espectro de Massas S
3
54
FIGURA 21: Espectro de RMN
1
H de S
3
(300 MHz, CDCl
3
)
55
FIGURA 22: Expansão do espectro de RMN
1
H de S
3
(300 MHz, CDCl
3
)
56
FIGURA 23: Espectro de RMN
13
C de S
3
(75 MHz, CDCl
3
)
57
FIGURA 24: Expansão do espectro de RMN
13
C de S
3
(75 MHz, CDCl
3
)
58
FIGURA 25: Mapa de correlação HETCOR de S
3
(CDCl
3
, 300 x 75 MHz)
59
FIGURA 26: Expansão do mapa de correlação HETCOR de S
3
(CDCl
3
, 300 x 75 MHz)
60
FIGURA 27: Mapa de correlação HMBC de S
3
(CDCl
3
, 300 x 75 MHz)
61
FIGURA 28: Expansão do mapa de correlação HMBC de S
3
(CDCl
3
, 300 x 75 MHz)
62
FIGURA 29: Expansão do mapa de correlação HMBC de S
3
(CDCl
3
, 300 x 75 MHz)
63
FIGURA 30: Expansão do mapa de correlação HMBC de S
3
(CDCl
3
, 300 x 75 MHz)
64
7.1.3- Determinação estrutural de S
1
A substância S
1
foi isolada em HPLC a partir da fração Fr
1
e Fr
2
, resultante do
fracionamento em coluna cromatográfica por via úmida do extrato hexânico das
folhas de Clibadium sylvestre. Esta substância também foi isolada a partir da fração
Fr
5
resultante do extrato etanólico.
O espectro de massas de S
1
, obtido por eletrospray no modo positivo
mostrou o pico [M+H]
+
detectado a m/z 215,4 (Fig. 32, p. 66). Esses dados, em
conjunto, com os dados de RMN
13
C permitem escrever a fórmula molecular
C
14
H
14
O
2
, (214 u.m.a.).
Analisando os dados espectrais de RMN
1
H (Fig. 33 a 35, p. 67 a 69) observa-
se a presença de dois duplos dupletos, integrando para um hidrogênio cada,
centrados em δ
H
5,82 (J= 0,9 e 15,9 Hz) e 6,47 (J= 5,4 e 15,9 Hz). Estes sinais são
característicos de hidrogênios olefínicos, relacionados através de uma configuração
trans (J= 15,9 Hz). Continuando com a análise observou-se sinais em: δ
H
1,44(m),
1,68 (m), 1,72(m), 2,12(m), 3,30(m), 3,37(m), 3,55(m) e 3,92(m). A partir desse
conjunto de sinais é possível sugerir a presença de um anel pirânico. O espectro de
hidrogênio revela ainda um singleto, integrando para três hidrogênio, em δ
H
1,97.
O espectro de RMN
13
C (Fig. 36 e 37, p. 70 e 71) exibiu 14 sinais, que foram
atribuídos aos 14 carbonos de S
1
, segundo a discussão a seguir:
► Um sinal em δ
C
4,62, atribuído ao carbono metílico C-15 presente na
cadeia poliacetilênica.
► Seis sinais atribuídos aos carbonos poliacetilênicos: δ
C
73,55 (C-9); 75,34
(C-10); 58,87(C-11); 64,81(C-12); 67,22 (C-13) e 78,24 (C-14).
► Dois sinais em δ
C
81,82 (C-2) e 70,0 (C-3), atribuídos aos carbonos
metínicos carbinólicos.
► Dois sinais em δ
C
145,61 (C-7) e 110,10 (C-8), atribuídos aos carbonos
olefínicos.
► Três sinais atribuídos aos carbonos metilênicos em δ
C
29,13 (C-4), 25,14
(C-5) e 67,37 (C-6).
65
A partir do conhecimento da estrutura de S
3
(Acetato de Cunaniol) foi possível
elucidar a estrutura de S
1
(Cunaniol) apenas com os espectros de RMN
1
H e
13
C, já
que a diferença estrutural entre as duas substâncias baseia-se no grupo acetato,
pertencente a S
3
e ausente em S
1
,
que possui o grupo hidroxila na mesma posição.
Observe abaixo (Fig. 31) a estrutura de S
1
.
8
7
6
5
4
3
2
1
H
H
H
H
H
H
H
O
H
H
H
OH
H
3
C
9
10
1112131415
A tabela 4 resume as informações dos dados espectrais de RMN
1
H e
13
C
para a substância S
1
, comparados com S
3
.
TABELA 4: Dados de RMN
1
H,
13
C, para S
1
e S
3
(CDCl
3
, 300 e 75 MHz)
C
δ
H
de S
1
δ
C
de S
1
δ
H
de S
3
δ
C
de S
3
2
H ax 3,55
81,82
H ax 3,74
78,63
3
H ax 3,30
70,0
H ax 4,45
71,36
4
H ax 1,44
H eq 2,12
29,13
H ax 1,45
H eq 2,17
29,13
5
H ax 1,68
H eq 1,72
25,14
H ax 1,66
H eq 1,70
24,61
6
H ax 3,37
H eq 3,92
67,37
H ax 3,37
H eq 3,91
67,36
7
HC
t
= 6,47
145,61
HC
t
= 6,27
144,29
8
HC
t
= 5,82
110,10
HC
t
= 5,75
110,14
9
73,55
73,36
10
75,34
75,51
11
58,87
58,77
12
64,81
64,78
13
67,22
67,28
14
78,24
78,21
15
1,97
4,62
1,95
4,53
16
-
-
-
169,83
17
-
-
2,01
20,96
FIGURA 31: Estrutura química de S
1
(Cunaniol)
66
FIGURA 32: Espectro de Massas S
1
67
FIGURA 33: Espectro de RMN
1
H de S
1
(300 MHz, CDCl
3
)
68
FIGURA 34: Expansão do espectro de RMN
1
H de S
1
(300 MHz, CDCl
3
)
69
FIGURA 35: Expansão do espectro de RMN
1
H de S
1
(300 MHz, CDCl
3
)
70
FIGURA 36: Espectro de RMN
13
C de S
1
(75 MHz, CDCl
3
)
71
FIGURA 37: Expansão do espectro de RMN
13
C de S
1
(75 MHz, CDCl
3
)
72
7.1.4- Sugestão para novas estruturas
A partir da ampliação do cromatograma do extrato hexânico das folhas de
Clibadium sylvestre (EHFL) é possível observar a presença de outras substâncias
que se apresentam de forma minoritária, tais substâncias ainda não foram isoladas.
Assim, foi realizada uma análise em LCMS com o referido extrato. A partir dos
espectros de massas obtidos, podemos sugerir as estruturas mais prováveis para
três dessas substâncias, designadas de S
6
, S
7
e S
8
que até o momento não foram
isoladas.
A partir da análise dos espectros de massas (MS/MS) dos principais íons da
amostra EHFL, observa-se que dois espectros já são conhecidos (Fig. 20, p. 53) e
(Fig. 32, p. 66) referentes ao Acetato de Cunaniol e Cunaniol, respectivamente.
Observando-se os outros espetros (Fig. 41 a 43, p. 75 a 77) podemos sugerir
as seguintes estruturas para S
6
, S
7
e S
8
.
27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 45.0 47.5 min
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
mAU
Ch1-242nm,4nm (1.00)
/27.669
/32.383
/40.324
CROMATOGRAMA IX: Ampliação do cromatograma do EHFL. Gradiente
com fase móvel composta por: solvente A=H
2
O, solvente B=ACN variando de
5 a 100% de B em 60 min com vazão de 1ml/min e fase estacionária C18
(Gemini), λ=242nm.
73
►A partir do espectro de massas 1, obtido por eletrospray no modo positivo que
mostrou o pico [M+H]
+
detectado a m/z 197,4 (Fig. 29, p. 74), foi possível sugerir a
estrutura mais provável para S
6
(Fig. 38) que possui fórmula molecular C
14
H
12
O e
massa molecular 196 u.m.a.
H
3
C C C C C C C
H
H
O
HO
H
3
C C C C C C C
H
H
O
(- H
2
O)
CUNANIOL
C
14
H
14
O
2
214
C
14
H
12
O
196
Desidratação
S
6
► A partir do espectro de massas 2, obtido por eletrospray no modo positivo que
mostrou o pico [M+H]
+
detectado a m/z 217,4 (Fig. 30, p. 75), foi possível sugerir a
estrutura mais provável para S
7
(Fig. 39) que possui fórmula molecular C
14
H
16
O
2
e
massa molecular 216 u.m.a.
H
3
C C C C C C C
H
H
O
HO
( H
2
)
CUNANIOL
C
14
H
14
O
2
214
C
14
H
16
O
2
216
H
3
C C C C C C C
H
H
O
HO
Hidrogenação
S
7
FIGURA 39: Estrutura mais provável para S
7
, a partir da hidrogenação do Cunaniol.
FIGURA 38: Estrutura mais provável para S
6
, a partir da desidratação do Cunaniol.
74
► A partir do espectro de massas 3, obtido por eletrospray no modo positivo que
mostrou o pico [M+H]
+
detectado a m/z 259,4 (Fig. 31, p. 76), foi possível sugerir a
estrutura mais provável para S
8
(Fig. 40) que possui fórmula molecular C
16
H
18
O
3
e
massa molecular 258 u.m.a.
( H
2
)
A. DE CUNANIOL
C
16
H
16
O
3
256
C
16
H
18
O
3
258
H
3
C C C C C C C
H
H
O
CH
3
COO
H
3
C C C C C C C
H
H
O
CH
3
COO
Hidrogenação
S
8
A partir do exposto torna-se necessário a continuação desses estudos para
que essas estruturas sejam confirmadas, para isso essas substâncias devem ser
isoladas em quantidades suficientes para obtenção dos espectros de RMN de
1
H e
13
C.
FIGURA 40: Estrutura mais provável para S
8
, a partir da hidrogenação do Acetato de
Cunaniol.
75
FIGURA 41: Espectro de massas 1
76
FIGURA 42: Espectro de massas 2
77
FIGURA 43: Espectro de massas 3
78
7.2- VERIFICAÇÃO DOS NÍVEIS DE GLUTATIONA REDUZIDA E OXIDADA NO
SANGUE DE RATOS, TRINTA MINUTOS E UMA HORA APÓS O INÍCIO DAS
CONVULSÕES
Resultados obtidos no Laboratório de Neuroquímica Molecular e Celular
(UFPA), demonstraram que o tratamento via intraperitoneal de ratos com extrato
hexânico retirados de folhas de Clibadium sylvestre na dose de 26,25 mg/kg foi
capaz de induzir convulsões tônico-clônicas sem causar a morte dos animais, e a
dose de 32,7 mg/kg induz convulsões tônico-clônicas seguida por morte, em média
30 minutos após a administração.
Os Gráficos 1 e 2 (p. 79) demonstram o nível de glutationa no sangue de dois
grupos de animais, o primeiro grupo submetido a 30 e o segundo a 60 min de
convulsão provocada pela aplicação intraperitoneal de extrato hexânico na
concentração de 10mg/mL.
Observando o Gráfico 1 percebe-se que a concentração de glutationa
reduzida (GSH) no sangue após 30min de convulsão é menor que da amostra
controle (ausência de extrato hexânico), essa diminuição na concentração se deve a
conversão em glutationa oxidada (GSSG), que aparece no gráfico com concentração
maior que a amostra controle, isso representa um estado de estresse, uma vez que
em condições normais a proporção entre GSSGH e GSH é de 1:100. A diminuição
de GSH com o conseqüente aumento de GSSG representa o principal indício de
estresse oxidativo.
Neste caso quando o animal está em convulsão o seu metabolismo celular
aumenta, conseqüentemente haverá maior consumo de oxigênio gerando uma maior
quantidade de espécies de oxigênio (EROs) que provocam a oxidação da GSH.
O Gráfico 2 referente aos níveis da GSH no sangue após 60 min, possui
resultados semelhantes aquelas discutidas para o Gráfico 1, apesar do tempo de
convulsão ser o dobro, a diferença está apenas em um pequeno aumento na
concentração da GSSG devido o maior tempo de convulsão, isso é claramente
perceptível no Gráfico 3 (p. 80) que demonstra a razão entre as formas oxidada e
reduzida da glutationa para os experimentos em 30 e 60 min.
79
0
5
10
15
20
25
30
GSH
GSSG
total
Tratado
Controle
Glutationa em
mg/mL de sangue
*
0
5
10
15
20
25
30
GSH
GSSG
total
Tratado
Controle
**
Glutationa em
mg/mL de sangue
*
GRÁFICO 1 - Níveis de glutationa no sangue de animais submetidos a
30 minutos de convulsão provocada pela aplicação intraperitoneal de
extrato hexânico (10mg/mL). n= 15. *p<0,005, comparando tratado x
controle.
GRÁFICO 2 - Níveis de glutationa no sangue de animais submetidos a
60 minutos de convulsão provocada pela aplicação intraperitoneal de
extrato hexânico (10mg/mL). n=15. *p<0,005, comparando controle x
tratado do grupo de GSH; **p<0,005 comparando tratado x controle do
grupo de GSSG.
80
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
30minutos
60 minutos
Tratado
Controle
GSSG / GSH
GRÁFICO 3 – Razão entre os níveis de glutationa oxidada e
glutationa reduzida em animais sacrificados após 30 e 60 minutos de
convulsão.
81
8. CONCLUSÕES
► O extrato hexânico das folhas demonstrou ter efeito convulsivo em ratos wistar
adultos, quando administrado por via intaperitoneal.
► Será necessário o estudo bioquímico das substâncias isoladas do extrato
hexânico das folhas (Cunaniol e Acetato de Cunaniol) para avaliar separadamente
seus efeitos como drogas convulsivas, uma vez que essas substâncias se
apresentam de forma majoritária neste extrato.
► O estudo fitoquímico para o extrato hexânico das folhas deve prosseguir, para
que as estruturas de S
6
, S
7
e S
8
sejam confirmadas.
► Em função dos altos níveis de GSSG após 30 e 60min de convulsão induzidas
por extrato hexânico de Clibadium sylvestre, é possível inferir que o estresse
oxidativo está envolvido neste comportamento convulsivante.
► A glutationa se mostrou um eficiente marcador de estresse oxidativo plasmático,
uma vez que a atividade convulsivante se faz presente no sistema nervoso central.
82
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALEXI, T., HUGHES, P. E., FAULL, R. L. M., WILLIAMS, C. E. 3- Nitropropionic
acid’s lethal triplet: cooperative pathway of neurodegeneration.
Neuroreport. V.9, p. 57-64, 1998.
ANDERSON, M. E. Determination of glutathione and glutathione disulfide in
biological samples. Methods Enzymol., V. 113, p. 548-555, 1985.
ARRIAGADA, J. E. Revision of the genus Clibadium (Asteraceae, Heliantheae).
Brittonia, V. 55, p. 245-301, 2003.
BENI, G., MORETTI, A. Are reactive oxygen species involved in Alzheimer’s
disease? Neurobiology of Aging. V. 16, p. 661-674, 1995.
BERG, M., BRUHN, T., FRANDSEN, A., SCHOUSBOE, A., DIEMER, N.H. Kainic
acid-induced seizures and brain damage in the rat: role of calcium
homeiostasis. Journal of Neuroscience. Research. V. 40, p. 641-646, 1995.
BRASIL, D. S. B. Contribuição à química do gênero Aparisthmium. Dissertação
de Mestrado, Universidade Federal do Pará, Belém. 1999.
BROWNE, T. R., HOLMES, G. L. Epilepsy. New England Journal of Medicine. V.
344, p.1145 -1151, 2001.
CAVALCANTE, R. Q. Efeitos farmacológicos do suco e extrato aquoso de
Sedum praealtum. Dissertação de mestrado. Escola Paulista de Medicina, São
Paulo. 110p, 1974.
CORRÊA, P. M. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas
cultivadas. Rio de Janeiro, Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal.
V. 2, 1984.
COSTA, E. A., ROCHA, F. F., TORRES, M. L. B., SOUCCAR, C., LIMA, T. C. M.,
LAPA, A. J., LANDMAN, M. T. R. L. Behavioral effects of a neurotoxic
compound isolated from Clibadium surinamense L (Asteraceae).
Neurotoxicology and Teratology, V. 28, p. 349-353, 2006.
83
FINKEL, T., HOLBROOK, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of
ageing. Nature. V. 408, p. 239-247, 2000.
FLOYD, R. A. Role of oxygen free radicals in carcinogenesis and brain
ischemia. The FASEB. Journal. V. 4, p. 2587-2597, 1990.
GARCIA, B. H. Flora medicinal de Colômbia. Bogotá Colômbia. Botânica Médica.
Instituto de Ciências Naturales. Inprenta Nacional, 330p, 1975.
GORINSKY, C., TEMPLETON, W., ZAIDI, Z. A. H. Isolation of ichthiothereol and
its acetate from Clibadium silvestre, Journal of Natural Products, V. 36, p.
217-358, 1973.
GUEDES, M. L. S., GUEDES, J. S. Bioestatística para profissionais de saúde. Rio
de Janeiro, Livro Técnico: CNPq, 200p, 1988.
HALLIWELL, B., GUTTERIDGE, J. C. Free radicals in biology and medicine, New
York, Oxiford University Press, 3 ed , 1999.
HAMOY, M. Convulsões indizidas pelo extrato aquoso de Clibadium sylvestre,
um modelo experimental de epilepsia generalizada. Dissertação de
mestrado. Universidade Federal do Pará, Belém. 70 p, 2002.
HOEHNE, F. C. Plantas e substâncias vegetais tóxicas e medicinais. São Paulo,
Graphicars, 139p, 1939.
KRETZSCHMAR M. Regulation of hepatic glutathione metabolism and its role in
hepatotoxicity. Experimental Toxicologic Pathology v. 48, p. 439 - 446, 1996.
LOSCHER, W., SCHMIDT, D. Which animal models should be used in the search
for new antiepileptic drugs? A proposal based on experimental and clinical
considerations. Epilepsy Research, V. 2, p. 145-181, 1988.
LÖSCHER, W. New visions in the pharmacology of anticonvulsion. Eur. Journal
Pharmacology. V. 342, p. 1-13, 1997.
MASCARO, U. C. P. RODRIGUES, L. A., BASTOS, J. K., SANTOS, E., CHAVES, J.
P. C. Valores de DL
50
em peixes e no rato tratados com pó de raízes de
Derris spp e suas implicações ecotoxicológicos. Pesquisa Veterinária
Brasileira, V. 18, p. 53-56,1998.
84
MEISTER, A.; ANDERSON, M. E. Glutathione. Annual Review of Biochemistry.
V. 52, p. 711-760, 1983.
MOREIRA, V. M. T. S., MAIA, J. G. S., SOUZA, J. M., BORTOLOTTO, Z. A.,
CAVALHEIRO, E. A. Caracterization of convulsions induced by a hexanic
extract of Spilanthes acamella var. oleracea in rats. Brazilian J. Med. Biol.
Research, V. 22, p. 65-67, 1989.
NORDEBERG,J., ARNÉR, E.S.J. Reactive oxygen species, antioxidants and the
mammalian thioredoxin system. Free Radical biology & Medicine. V. 31,
p.1287-1312, 2001.
QUILLIAM, J. P., STABLES, R. Convulsant effects of cunaniol, a polyacetylenic
alcohol isolated from the plant Clibadium sylvestre, on frog and mice, J.
Pharmacol. Res. Commun. V. 1, p. 7-14, 1969a.
QUILLIAM, J. P., STABLES. R. Action of cunaniol in goldfish. J. Pharmacol, V. 35,
382p, 1969b.
SNYDER, L. R.; DOLAN, J. W. Initial experiments in high-performance liquid
chromatographic method development. I. Use of a starting gradient run. J.
Chromatogr. A. V. 721, p. 3-14, 1996
VIEIRA, S. Introdução a bioestatística. Rio de Janeiro, Campus, 220p, 1989.
VILLAMÉA, L., PINTO, M. G. Índio quer patente. Isto É, 1581: p. 53-56, 2000
WENDEL, A. Glutatione peroxidase. Methods in Enzymology. V. 77, p. 325-332,
1981.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo