( PDF ) Alterações metabólicas induzidas pelo consumo de dietas hiperlipídicas ou hiperglicídicas associadas à hidroclorotiazida: possível papel protetor do disseleneto de difenila em ratos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

ALTERAÇÕES METABÓLICAS INDUZIDAS PELO CONSUMO DE DIETAS

HIPERLIPÍDICAS OU HIPERGLICÍDICAS ASSOCIADAS À

HIDROCLOROTIAZIDA: POSSÍVEL PAPEL PROTETOR DO

DISSELENETO DE DIFENILA EM RATOS

MARINEI CRISTINA PEREIRA RIBEIRO CAMARGO

Orientador: Prof. Dr. João Batista Teixeira da Rocha

Tese apresentada ao curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas –

Bioquímica, como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Bioquímica.

Porto Alegre

2009

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Dedico esta tese a minha família,

pelo amor, compreensão e apoio.

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III

"Um homem não pode fazer o certo numa área da vida, enquanto está ocupado em fazer o

errado em outra. A vida é um todo indivisível"

(Mahatma Gandhi)

“A coisa mais importante no mundo não é tanto onde nós chegamos,

como em qual direção estamos nos movendo”.

(Oliver Wendall Holmes)

AGRADECIMENTOS

A Deus, digno de toda a honra e louvor, por ser minha fortaleza e meu escudo nos

momentos difíceis, por ser meu mais e fiel amigo de todas as horas. A Ele, minha eterna

gratidão.

Aos grandes amores da minha vida, meu marido e minha filhinha. Ao Potiguara

pelo amor, carinho, amizade, compreensão, paciência, apoio e palavras de incentivo para

continuar o trabalho nas horas de alegria e também de dificuldade. A minha filha, que

durante a gestação me oferece força, amor, compreensão e tem participação ativa na

elaboração dessa tese.

Aos meus amados pais e irmão, Aldomiro, Zaíra e Robson, pelo ensinamento e

cultivo dos verdadeiros valores da vida, pelo apoio, compreensão e amor incondicional.

Não há palavras para agradecer...

Ao prof. João Batista, pela oportunidade de participar do seu grupo, continuar

desenvolvendo a pesquisa e aprender com sua experiência.

Um agradecimento muito especial a Nilda, pela grande ajuda na realização de todos

os meus trabalhos, pelas importantes sugestões e também pela amizade.

Aos colegas de laboratório que participaram da realização deste estudo: Roger,

Lutiane, Daiana, Nilda, Viviane, Danúbia, Andreza, Robson, Gustavo, Verônica, Vanderlei,

Juliano, Tiele e Marta.

Ao pessoal dos laboratórios dos professores João, Cristina e Gilson, pela troca de

experiências científicas e pronta colaboração na solução das dificuldades que surgiram.

Agradeço os bons momentos em que a amizade, companheirismo e alegria fizeram parte do

nosso dia a dia no laboratório.

Aos queridos colegas do Serviço de Hemoterapia pelo auxílio, prestatividade,

companheirismo e os inesquecíveis momentos de descontração.

Aos professores Maria Rosa Chitolina Schetinger, Andreza Fabro de Bem, Luiz

Fernando Royes, Lisiane de Oliveira Porciúncula e Liane Nanci Rotta pela disponibilidade

de fazer a leitura desta tese e compor sua comissão examinadora.

A Cléia, pela ajuda, eficiência e palavras de conforto e amizade.

A UFRGS e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica

pela oportunidade de continuar aprendendo e desenvolvendo a pesquisa.

Aos colegas, professores e funcionários do Setor de Bioquímica da UFSM, pelo

apoio para a concretização deste estudo.

Enfim, a todos aqueles que com seus conhecimentos, comentários, sugestões e

apoio tornaram possível a realização deste trabalho.

ÍNDICE

PARTE I

RESUMO...............................................................................................................................1

ABSTRACT ..........................................................................................................................3

LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................................5

INTRODUÇÃO ....................................................................................................................7

1. Dietas hiperlipídicas e hiperglicídicas ........................................................................7

2. Diabetes Mellitus ........................................................................................................11

2.1 Histórico ................................................................................................................11

2.2. Fisiopatologia .......................................................................................................12

2.3. Etiologia e Classificação......................................................................................13

2.4. Prevalência ...........................................................................................................20

3. Diuréticos tiazídicos....................................................................................................22

3.1. Hidroclorotiazida (HCTZ)..................................................................................24

4. Estresse oxidativo .......................................................................................................25

5. A enzima Na

-ATPase ...........................................................................................27

6. Selênio..........................................................................................................................28

6.1. Disseleneto de difenila (PhSe)

............................................................................29

OBJETIVOS .......................................................................................................................30

PARTE II

CAPÍTULO 1 – Artigo publicado.....................................................................................33

CAPÍTULO 2 – Manuscrito 1. ..........................................................................................40

CAPÍTULO 3 – Manuscrito 2. ..........................................................................................66

PARTE III

DISCUSSÃO .....................................................................................................................108

CONCLUSÕES.................................................................................................................118

PERSPECTIVAS..............................................................................................................120

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................121

LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................148

LISTA DE TABELAS......................................................................................................150

RESUMO

As dietas suplementadas com lipídios e/ou frutose têm sido associadas com o

estresse oxidativo, a resistência à insulina e ao desenvolvimento da Síndrome Metabólica.

Os diuréticos tiazídicos, como a hidroclorotiazida (HCTZ) são, frequentemente, usados por

pacientes com esses distúrbios para o tratamento da hipertensão, mas também podem

exacerbar essas alterações metabólicas. Então, com intenção de desenvolver um modelo

animal para o estudo dos efeitos adversos da HCTZ, o objetivo desse trabalho foi investigar

se a associação entre uma dieta hiperlipídica (HF) ou hiperglicídica (HFD) e o tratamento

com hidroclorotiazida (HCTZ) produz uma influência sinérgica negativa na homeostase da

glicose e em outros parâmetros bioquímicos associados ao desenvolvimento do Diabetes

Mellitus (DM) tipo 2. Além disso, também foi avaliado se o disseleneto de difenila (PhSe)

um composto orgânico de selênio com propriedades antioxidantes, poderia reduzir as

alterações metabólicas induzidas pelo consumo crônico da dieta hiperglicídica e/ou HCTZ.

No modelo animal de alterações metabólicas induzidas pela dieta HF e/ou HCTZ, os ratos

foram alimentados por 16 semanas com uma dieta controle ou com uma dieta HF, ambas

suplementadas com diferentes doses de HCTZ (0,4; 1,0 e 4,0 g/kg de dieta). A HCTZ

associada com uma dieta HF causou um aumento nos níveis de glicemia, frutosamina e

também na peroxidação lipídica no tecido hepático e cerebral. Além disso, a ingestão da

dieta HF foi associada com um aumento nos níveis de peroxidação lipídica cerebral,

vitamina C e grupos tióis não-protéico (NPSH). Houve um aumento nos níveis de vitamina

C e NPSH nos grupos tratados com HCTZ (1,0 e 4,0 g/kg) e HCTZ associada com dieta

HF. A atividade da Na

-K

-ATPase foi inibida no cérebro dos animais tratados com HCTZ

(4,0 g/kg) e HCTZ associada com a dieta HF. A ingestão de HCTZ e dieta HF produziram

uma redução nos níveis de magnésio e potássio, bem como um aumento na peroxidação

lipídica e vitamina C no fígado. Nesse contexto, a associação de HCTZ com a dieta HF

causou uma exacerbação nos parâmetros bioquímicos relacionados à homeostase da glicose

(particularmente, uma acentuada redução de magnésio) e um maior aumento no estresse

oxidativo hepático e cerebral. Os dados indicam que a ingestão crônica de doses elevadas

de HCTZ (4,0 g/kg) ou de uma dieta HF altera os índices bioquímicos de estresse oxidativo

no cérebro de ratos. Assim, os resultados sugerem que a ingestão crônica de HCTZ ou dieta

HF causa alterações metabólicas relacionadas à homeostase da glicose e que a associação

de uma dieta HF com o tratamento com HCTZ pode exacerbar algumas dessas alterações

bioquímicas. Portanto, pode-se sugerir que este modelo experimental pode ser usado para o

estudo dos efeitos adversos da HCTZ. No modelo experimental de alterações bioquímicas

causadas pela ingestão de dieta hiperglicídica e/ou HCTZ, os ratos foram alimentados com

uma dieta controle (CT) ou com uma dieta enriquecida com frutose (HFD), ambas

suplementadas com HCTZ (4,0 g/kg) e/ou (PhSe)

(3 ppm) durante 18 semanas. A HFD

causou um aumento nos níveis de glucose, frutosamina, triglicerídios e colesterol dos

animais, os quais não foram restaurados ao nível do controle pela suplementação com

(PhSe)

ou potencializado pela HCTZ. No entanto, os níveis de colesterol e triglicerídios

foram menores nos grupos que receberam HFD ou HCTZ suplementados com (PhSe)

. A

ingestão de HCTZ causou uma redução na atividade da catalase (CAT) hepática e da

superóxido dismutase (SOD) renal, as quais foram restauradas pela suplementação com

(PhSe)

. No fígado, o (PhSe)

também foi efetivo no aumento dos níveis de vitamina C

reduzidos pela ingestão de HFD e HFD associada a HCTZ. Além disso, o (PhSe)

aumentou per se a atividade de SOD hepática e renal e reduziu a oxidação de lipídios e

proteínas causada pela HCTZ associada ou não com a ingestão de HFD. A associação entre

HFD e HCTZ causou uma redução nos níveis de potássio e exacerbou a hipomagnesemia e

a hipertrigliceridemia induzidas pela HCTZ. Esses resultados sugerem que algumas

alterações bioquímicas podem ser potencializadas pela ingestão simultânea de HCTZ e

HFD. Esses dados também demonstraram que a suplementação com (PhSe)

reduz os

distúrbios metabólicos relacionados com o estresse oxidativo e que esse composto pode ser

considerado um agente promissor para o tratamento dos distúrbios metabólicos induzidos

pela HFD e pela HCTZ devido às suas propriedades antioxidantes.

ABSTRACT

High fat and/or high fructose diets have been associated with oxidative stress,

insulin resistance and Metabolic Syndrome development. Thiazide diuretics, such as

hydrochlorothiazide (HCTZ) are frequently used by patients with these disorders for

treatment of hypertension, but they also can exacerbate these metabolic disturbances. Thus,

in an attempt to develop a rodent model to study the adverse effects of HCTZ, the objective

of this work was to investigate whether an association between a high fat (HF) or high-

fructose diet (HFD) and HCTZ treatment produces a negative synergic influence on glucose

homeostasis and in other biochemical parameters associated to type 2 Diabetes Mellitus

(DM) development. Moreover, also was evaluated whether dietary diphenyl diselenide

(PhSe)

, a organoselenium compound with antioxidant properties, could reduce the

metabolic alterations induced by chronic consumption of diets enriched with fructose

and/or HCTZ. In animal model of metabolic alterations induced by HF diet and/or HCTZ,

rats were fed for 16 weeks with a control diet or with an HF, both supplemented with

different doses of HCTZ (0.4, 1.0, and 4.0 g/kg of diet). HCTZ associated with an HF diet

caused an increase in blood glucose, fructosamine and lipid peroxidation levels in hepatic

and cerebral tissues. In addition, HF ingestion was associated with an increase in cerebral

lipid peroxidation, vitamin C and non-protein thiol groups (NPSH) levels. There was an

increase in vitamin C as well as NPSH levels in HCTZ (1.0 and 4.0 g/kg of diet) and HF

plus HCTZ groups. Cerebral Na

-K

-ATPase activity of HCTZ (4.0 g/kg of diet) and

HCTZ plus HF-fed animals was inhibited. The intake of HCTZ and HF diet produced a

reduction in magnesium and potassium levels as well as an increase in lipid peroxidation

and vitamin C in liver. Importantly, the association of HCTZ with HF diet caused

additional worsening of biochemical parameters related to glucose homeostasis

(particularly accentuated magnesium depletion) and further increase in oxidative stress in

hepatic and cerebral tissues. The data indicate that chronic intake of a high dose of HCTZ

(4.0 g/kg of diet) or HF change biochemical indexes of oxidative stress in rat brain. Thus,

results suggest that chronic intake of HCTZ or HF diet causes metabolic changes related to

glucose homeostasis and that the association of HF diet and HCTZ treatment can

exacerbate some of these biochemical alterations. Therefore, we can suggest that this

experimental model can be used for studying the adverse effects of HCTZ. On experimental

models of biochemical alterations caused by fructose and\or HCTZ intake, rats were fed

with a control diet (CT) or with a high fructose diet (HFD), both supplemented with HCTZ

(4.0 g/kg) and/or diphenyl diselenide (3 ppm) for 18 weeks. HFD diets caused an increase

in the levels of glucose, fructosamine, triglycerides and cholesterol of animals, which were

not restored to control levels by (PhSe)

supplementation or potentiated by HCTZ.

However, the levels of cholesterol and triglycerides were lower in the groups that received

HFD or HCTZ diet supplemented with (PhSe)

. The ingestion of HCTZ caused a decrease

in hepatic catalase (CAT) and renal superoxide dismutase (SOD) activities, which were

restored by (PhSe)

supplementation. In liver, diphenyl diselenide was also effective in

increasing vitamin C levels reduced by HFD and HFD plus HCTZ intake. Indeed, the

compound increased per se hepatic and renal SOD activity and reduced the oxidation of the

lipids and proteins caused by HCTZ associated or not with HFD intake. Furthermore, the

association between HFD and HCTZ caused a decrease in potassium levels and aggravated

the hypomagnesemia and the hypertriglyceridemia HCTZ-induced. Theses findings suggest

that some biochemical changes can be aggravated by ingestion simultaneous of HCTZ and

HFD diet. In addition, data also demonstrate that (PhSe)

supplementation reduces

metabolic disorders linked to oxidative stress and that this compound can be considered a

promising agent for treatment of metabolic disturbances HFD and HCTZ-induced, via its

antioxidant properties.

LISTA DE ABREVIATURAS

ADA: American Diabetes Association

ANOVA: Análise de variância

CAT: Catalase

DM: Diabetes mellitus

EROs: Espécies reativas de oxigênio

HCTZ: Hidroclorotiazida

HDL: Lipoproteína de alta densidade

HF: High fat

HFD: High fructose diet

LDL: Lipoproteína de baixa densidade

MDA: Malondialdeído

(PhSe)

: Disseleneto de difenila

Se: Selênio

NPSH: Tióis não protéicos

SOD: Superóxido dismutase

TBARS: Espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico

APRESENTAÇÃO

Esta tese apresenta os resultados sob a forma de artigo publicado (capítulo 1) e

manuscritos submetidos à publicação (capítulos 2 e 3).

O item Discussão apresenta interpretação e comentários gerais dos resultados

obtidos em todos os artigos que compõem esse trabalho.

O item Conclusões apresenta as conclusões finais do trabalho, considerando os

artigos científicos (capítulos 1, 2 e 3).

As Referências Bibliográficas referem-se somente às citações que são apresentadas

nos itens Introdução e Discussão.

INTRODUÇÃO

1. Dietas hiperlipídicas e hiperglicídicas

As dietas suplementadas com elevado teor de lipídios, elevado teor de carboidratos

ou ambos estão associadas com intolerância à glicose, obesidade, doenças cardiovasculares,

Diabetes Melitus (DM) tipo 2 (Feskens et al., 1991; Hill et al., 1992; Barnard et al., 1998;

Liu & Manson, 2001), hipertensão e estresse oxidativo (Roberts et al., 2000; Girard et al.

2005; Roberts et al., 2005).

A nutrição e os tipos de dietas têm um papel muito importante nas alterações

metabólicas relacionadas ao desenvolvimento do DM tipo 2, porém os fatores dietéticos

específicos não estão claramente definidos. Ainda existem muitas controvérsias sobre a

relação entre o risco de DM e a quantidade e os tipos de lipídios e de carboidratos que

devem compor uma dieta adequada. No entanto, prevalece as recomendações dietéticas que

sugerem dietas com baixas quantidades de lipídios e carboidratos para a prevenção do DM,

doenças cardíacas e outras doenças crônicas (National Research Council, 1989; U. S.

Department of Agriculture, 2000). Contudo, os lipídios e os carboidratos não são moléculas

homogêneas, portanto diferentes tipos de lipídios e carboidratos têm efeitos diferenciados

sobre a homeostase da glicose e a sensibilidade à insulina.

A obesidade está associada com a resistência à insulina e é um dos fatores mais

importantes para o desenvolvimento do DM tipo 2 (Reaven, 1988; Pi-Sunyer, 1993), porém

os ácidos graxos da dieta podem afetar a ação da insulina independente da existência de

obesidade (Storlien et al., 1996). Nesse contexto, acredita-se que os efeitos dos ácidos

graxos da dieta são mediados pela composição dos lipídios das membranas celulares (Pan

et al., 1995; Storlien et al., 1996; Vessby, 2000). O perfil específico dos lipídios nas

membranas celulares pode influenciar a ação da insulina por vários mecanismos potentes,

incluindo uma alteração na ligação ou na afinidade dos receptores de insulina e

influenciando a permeabilidade a íons e a sinalização celular (Vessby, 2000). Assim, é o

percentual de gordura saturada que parece ter maior importância, uma vez que a resistência

à insulina está associada a uma maior proporção de gorduras saturadas e, a uma menor

porcentagem de gorduras poliinsaturadas (Pan et al., 1995; Storlien et al., 1996).

A origem e o mecanismo das alterações metabólicas induzidas pela dieta não estão

completamente esclarecidos na literatura (McDonald, 1995; Busserolles et al., 2002;

Flanagan et al., 2008). No entanto, há evidências de que a ingestão crônica de dietas com

alto teor de glicídios ou lipídios está associada com o dano oxidativo (McDonald, 1995;

Folmer et al., 2002; Folmer et al., 2003; Brito et al., 2007), uma vez que essas dietas podem

diminuir as defesas antioxidantes (Rayssiguier et al., 1981; Rayssiguier et al., 1993; Folmer

et al., 2003; Brito et al, 2007) e causar um aumento na produção de espécies reativas ao

oxigênio (EROs) (Rayssiguier et al., 1981; Rayssiguier et al., 1993; Folmer et al., 2002;

Folmer et al., 2003, Fachineto et al., 2005; Brito et al., 2007). Neste contexto, estudos

sugerem que a quantidade e os tipos de lipídios na dieta afetam a sensibilidade das células à

peroxidação lipídica e ao dano oxidativo (Thomas & Rudel, 1996). Há evidências na

literatura de que os ácidos graxos poliinsaturados podem sofrer oxidação e resultar em

produtos que podem ser tóxicos às células (Halliwell & Chirico, 1993) e que os ácidos

graxos saturados demonstram menor suscetibilidade à oxidação do que ácidos graxos

insaturados (Nanji et al., 1995; Varghese & Oommen, 2000). Enfim, a composição da dieta

em relação aos ácidos graxos pode afetar a composição da membrana celular (Sprecher,

1989) e, conseqüentemente alterar a suscetibilidade dessas células a agentes pró-oxidantes.

De acordo com isso, o trabalho realizado por Farina el al. (2003) mostrou que o efeito

protetor do selenito contra a peroxidação lipídica induzida pelo mercúrio depende da

saturação de gordura na dieta.

Vários estudos sobre a hiperinsulinemia e a hiperglicemia sugerem um efeito

prejudicial da gordura saturada (Feskens & Kromhout, 1990; Maron et al., 1991; Parker et

al., 1993; Feskens et al., 1994; Feskens et al., 1995; Marshall et al., 1997) e um efeito

benéfico da gordura polinsaturada (Trevisan et al.,1990; Feskens et al., 1994; Salmeron et

al., 2001). No entanto, outros estudos não confirmam esses resultados (Mayer et al., 1993;

Mooy et al., 1995; Mayer-Davis et al., 1997). Assim, em estudos animais, ambos os tipos e

quantidades de lipídios têm mostrado efeito na sensibilidade à insulina (Storlien et al.,

1991). Em geral, os estudos relatam que o elevado teor de lipídios na dieta aumenta o

ganho de peso, a intolerância à glicose e a resistência à insulina (Alsaif & Duwaihy, 2004).

De acordo com a literatura, algumas das inconsistências nos resultados podem ter ocorrido

pela falta de ajuste na composição da dieta ou ainda, por fatores de risco para o DM que

não estejam relacionados à dieta. As divergências entre os resultados observados em

diferentes populações podem ter ocorrido, porque os efeitos da dieta com alto teor de

lipídio pode variar de acordo com as características da população estudada, tais como

idade, sexo, índice de massa corporal e atividade física, que estão associados com

sensibilidade à insulina (Paolisso et al., 1995; Ferrannini et al., 1997; Mayer-Davis et al.,

1998).

Semelhante aos lipídios, os carboidratos não são homogêneos no que diz respeito à

estrutura química e às funções biológicas, assim diferentes tipos de lipídios e carboidratos

apresentam diferentes efeitos na homeostase da glicose e na resistência à insulina (Hu et al.,

2001). Os carboidratos são classificados em simples ou complexos com base nas estruturas

químicas. As recomendações dietéticas têm enfatizado o uso de carboidratos complexos ou

amidos e a limitação de carboidratos ou açúcares simples baseado na crença de que os

carboidratos simples seriam digeridos e absorvidos mais rapidamente e, portanto, iriam

induzir uma resposta mais rápida à glicemia pós-prandial. No entanto, numerosos estudos

contestam essa opinião, pois é reconhecido que muitos alimentos amiláceos, como batatas

cozidas e pão branco podem produzir respostas glicêmicas mais elevadas do que os

carboidratos simples (Kalergis et al., 1998). Portanto, as recomendações dietéticas para a

prevenção das alterações metabólicas associadas ao DM tipo 2 investem mais na qualidade

dos lipídios e carboidratos do que, somente na quantidade e ainda, no balanceamento da

energia total ingerida para evitar o sobrepeso e a obesidade (Hu et al., 2001).

Há vários modelos experimentais que utilizam animais para o estudo do DM. O DM

tipo 1 pode ser induzido em animais por uma pancreatectomia parcial ou pela

administração de drogas diabetogênicas. As drogas mais usadas para a indução de DM em

roedores são o Aloxano e a estreptozotocina, as quais destroem seletivamente as células β

das ilhotas de Langerhans no pâncreas (Oberley, 1988). Na literatura, há também diversos

modelos experimentais para o estudo do DM tipo 2, incluindo a utilização de dietas

suplementadas com elevadas quantidades ou tipos diferentes de carboidratos e/ou lipídios

(Folmer et al., 2002, Folmer et al., 2003, Brito et al., 2007, Ribeiro et al., 2009). Nesse

sentido, quantidades elevadas de sacarose e frutose têm sido usadas em modelos animais

para induzir alterações metabólicas observadas na Síndrome Metabólica, uma desordem

caracterizada por resistência à insulina, hipertensão, dislipidemia e alta incidência de

doenças cardiovasculares (Reaven, 1988). Similarmente, as dietas com elevadas

quantidades de lipídios têm sido muito utilizadas para o estudo dos processos que envolvem

a resistência à insulina e para investigação dos efeitos anti-obesidade e anti-diabetogênicos

de algumas drogas. O modelo de ingestão de dietas suplementadas com lipídios é útil para o

estudo da resistência à insulina branda porque ele é mais parecido com os animais normais

do que com os animais diabéticos. Assim, se a ingestão calórica for controlada

cuidadosamente para evitar a obesidade, esse modelo não exibe hiperglicemia mesmo

depois de muitas semanas submetidos à dieta (Kraegen et al., 1986; Storlien et al., 1986).

Portanto, a resistência à insulina desenvolve-se dentro de poucas semanas com

hiperinsulinemia associada à intolerância à glicose, mas o desenvolvimento de

hiperglicemia franca demora mais tempo.

2. Diabetes Mellitus

2.1 Histórico

O Diabetes Mellitus é um distúrbio metabólico, cuja existência e sintomatologia são

relatadas há mais de 20 séculos. O papiro de Ebers, um dos documentos médicos mais

antigos e importantes que se conhece e que foi escrito no antigo Egito, em data aproximada

de 1550 a.C. relata uma doença caracterizada por micção freqüente, sintoma mais comum

da DM. No ano 70 (d.C.), após estudos relacionados aos sintomas e ao quadro clínico

apresentados pelos pacientes, o médico Areteu da Capadócia denominou “Diabetes”,

palavra grega que significa sifão, ao conjunto de sintomas constituído por polidipsia,

poliúria e polifagia (Dinsmoor, 1996). Durante muitos anos a pesquisa pouco avançou no

estudo do Diabetes, portanto somente em 1670, o médico Thomas Wills observou que a

urina dos pacientes diabéticos tinha sabor adocicado (Dinsmoor, 1996). Em 1815, o médico

Michel Chevreul confirmou que o açúcar específico presente na urina dos pacientes

diabéticos tratava-se de glicose (Dinsmoor, 1996). Portanto, a partir dessa descoberta a

doença passou a ser denominada “Diabetes Açucarada” ou “Diabetes Mellitus”. Em estudos

realizados em 1869, Paul Langerhans observou que o pâncreas continha dois grupos

distintos de células, as células acinares, que secretam enzimas digestivas, e as células

agrupadas em ilhas ou ilhotas, as quais poderiam ter função endócrina. Em 1889, essa

função endócrina foi confirmada por dois médicos pesquisadores, Oskar Minkowski e

Joseph Von Mering, após a realização de experimentos com cães pancreatomizados que

desenvolveram uma síndrome semelhante ao DM nos seres humanos. Entre 1916 e 1920,

Nicolas Paulesco demonstrou que extratos pancreáticos reduziam a glicemia e as cetonas

urinárias. Em 1921, Frederick G. Banting e seu colaborador Charles H. Best descobriram a

insulina (Banting et al., 1922; Minkowski, 1989). Esse achado rendeu ao mesmo o prêmio

Nobel de Medicina e uma melhor qualidade de vida aos pacientes com DM.

2.2. Fisiopatologia

O DM é um grupo de doenças metabólicas caracterizado por hiperglicemia

resultante de defeitos na secreção de insulina, ação da insulina, ou ambos. A hiperglicemia

crônica do diabetes está associada a danos que ocorrem ao longo do tempo, disfunção e

falência de vários órgãos, especialmente os olhos, rins, nervos, coração e vasos sanguíneos

(ADA, 2008). Os sintomas dessa acentuada hiperglicemia são poliúria, polidipsia, perda de

peso, polifagia, visão desfocada e aumento de risco para infecções (ADA, 2008; Hall &

Davies, 2008). No entanto, a ausência dos mesmos é comum em muitos pacientes com DM

e não descarta a possibilidade de que exista um grau de hiperglicemia suficiente para causar

alterações funcionais ou patológicas antes que o diagnóstico seja estabelecido.

A hiperglicemia crônica do DM é caracterizada por complicações que incluem

retinopatia com perda potencial de visão, nefropatia levando à insuficiência renal,

neuropatia periférica com risco de úlceras dos pés, amputações e danos nas articulações, e

ainda neuropatia autonômica causando sintomas gastrointestinais, geniturinários e

cardiovasculares (ADA, 2008). Os pacientes diabéticos têm uma incidência aumentada de

doença cardíaca coronária, doença vascular cerebral e doença vascular periférica, que

representam a principal causa de morbidade e mortalidade entre esses pacientes (ADA,

2008; Hall & Davies, 2008). Essas patologias ocorrem em uma idade muito mais jovem

comparado com a população não diabética (Adisakwattana, 2005; Hall & Davies, 2008). A

hipertensão e anormalidades no metabolismo de lipoproteínas também são complicações,

freqüentemente, encontradas em pacientes diabéticos (Ferrannini et al., 1997; Hayden &

Sowers, 2006; ADA, 2008).

2.3. Etiologia e Classificação

Segundo o “Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes” da

“American Diabetes Association” (ADA, 2008), a classificação etiológica do DM é a

seguinte: DM tipo 1, DM tipo 2, outros tipos específicos de DM e DM gestacional. Na

maioria dos casos os pacientes podem ser clinicamente, classificados como portadores de

DM tipo 1 ou tipo 2. Os critérios da American Diabetes Association (ADA) para o

diagnóstico de diabetes incluem os sintomas clássicos de hiperglicemia (poliúria, polidipsia

e perda de peso inexplicada) e a concentração plasmática de glicose casual superior a 200

mg/dL (11,1 mmol), concentração plasmática de glicose em jejum igual ou superior a 126

mg/dL (7,0 mmol) ou concentração plasmática de glicose igual ou superior a 200 mg/dL

(11,1 mmol/dL) dentro de 2 horas após a ingestão de uma carga de glicose oral (The Expert

Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes, 2003; ADA, 2008).

2.3.1. Diabetes Mellitus tipo 1

No DM tipo 1, a causa é uma deficiência absoluta da secreção de insulina (ADA,

2008), provocada por uma redução na massa das células β do pâncreas. Assim, uma

destruição das células β pancreáticas pode ocorrer por intermédio de três mecanismos que

parecem estar interligados: suscetibilidade genética, ataque auto-imune e algum tipo de

agressão ambiental (Bach, 1994). Os indivíduos que apresentam maior risco de desenvolver

este tipo de diabetes podem ser identificados por intermédio de evidências sorológicas de

um processo patológico auto-imune que ocorre nas ilhotas pancreáticas, e também por

marcadores genéticos (ADA, 2008). Portanto, o DM tipo 1 pode ser classificado em:

 Diabetes Mellitus tipo 1 (causa imunológica): Esse tipo de DM representa apenas 5

a 10 % dos casos de DM, denominado, anteriormente, diabetes dependente de insulina,

diabetes tipo I, ou diabetes de início juvenil e resulta de uma autodestruição das células β

do pâncreas. Neste tipo de diabetes, a taxa de destruição das células β é bastante variável,

sendo rápida em algumas pessoas (principalmente bebês e crianças) e lenta em outros

(principalmente adultos). Alguns pacientes, principalmente crianças e adolescentes, podem

apresentar a cetoacidose como primeira manifestação da doença. Outros apresentam

modesta hiperglicemia em jejum que pode mudar rapidamente para hiperglicemia grave

e/ou cetoacidose na presença de infecção ou de outro estresse. Outros ainda, sobretudo

adultos, podem apresentar uma função residual das células β suficiente para impedir

cetoacidose durante muitos anos. Esses indivíduos, eventualmente, tornam-se dependente

de insulina para sobreviver e estão em risco de cetoacidose. Neste último estágio da doença,

há pouca ou nenhuma secreção de insulina. O DM causado por características

imunológicas, geralmente, manifesta-se na infância e adolescência, mas pode ocorrer em

qualquer idade. A autodestruição das células β tem múltiplas predisposições genéticas e

está relacionada a fatores ambientais que ainda não estão bem definidos. Devido ao DM,

esses pacientes tornam-se mais susceptíveis a outros distúrbios imunológicos. Os pacientes

que apresentam esse tipo de DM, raramente, são obesos, mas a presença de obesidade não é

incompatível com o diagnóstico.

 Diabetes Mellitus tipo 1 (causa idiopática): Algumas formas de DM tipo 1 não

apresentam etiologia conhecida. Alguns destes doentes têm permanente insulinopenia e são

propensos à cetoacidose, mas não apresentam evidências de auto-imunidade. Poucos

pacientes têm DM tipo 1 que se enquadra nesta categoria, e dentre eles, a maioria são

africanos ou de ascendência asiática. Os indivíduos com esta forma de DM sofrem com

episódios de cetoacidose e apresentam diferentes graus de deficiência de insulina entre os

episódios. Essa forma de DM está associada com características hereditárias, mas faltam

evidências imunológicas para a auto-imunidade de células β.

2.3.2. Diabetes Mellitus tipo 2

Esse tipo de diabetes, que representa aproximadamente 90% dos pacientes

diabéticos, denominado, anteriormente, diabetes não dependente de insulina, diabetes tipo

II ou diabetes de início adulto, abrange indivíduos que têm resistência à insulina e,

geralmente possuem relativa (e não absoluta) deficiência de insulina. Inicialmente, e muitas

vezes ao longo da sua vida útil, estes indivíduos não necessitam de tratamento com insulina

para sobreviver. Há provavelmente muitas causas diferentes para essa forma de diabetes.

Apesar de não se conhecer as etiologias específicas, a destruição auto-imune das células β

não ocorre, e os pacientes não apresentam outras causas de diabetes que sejam conhecidas,

atualmente.

A maioria dos pacientes com este tipo de diabetes é obeso, e a obesidade por si

causa algum grau de resistência à insulina. Pacientes que não são obesos, segundo o critério

tradicional para o peso, podem apresentar um aumento da percentagem de gordura corporal

distribuída, predominantemente, na região abdominal. Nesse tipo de diabetes, a cetoacidose

raramente ocorre, espontaneamente, mas quando ocorre, geralmente está associada com o

estresse de outra doença como uma infecção. Este tipo de diabetes, freqüentemente não é

diagnosticado por muitos anos, devido à hiperglicemia evoluir gradualmente e, em estágios

iniciais da diabetes, pode não ser suficientemente grave para que o paciente perceba algum

sintoma clássico de diabetes. No entanto, essa hiperglicemia provoca alterações patológicas

e funcionais em diversos tecidos (Baynes & Thorpe, 1996) e, esses pacientes apresentam

maior risco de desenvolver complicações microvasculares e macrovasculares (Hu &

Tuomilehto, 2007).

A resistência à insulina pode ser beneficiada por redução do peso e/ou tratamento

farmacológico da hiperglicemia, mas raramente é restaurada ao valor normal. O risco de

desenvolver este tipo de diabetes aumenta com a idade, obesidade e a falta de atividade

física. Ocorre mais, freqüentemente, em mulheres com DM gestacional prévia e em

indivíduos com hipertensão arterial ou dislipidemia, e sua freqüência varia entre os

diferentes subgrupos étnicos raciais. Além disso, pode ser associado à predisposição

genética. No entanto, as características genéticas dessa forma de diabetes são complexas e

não estão claramente definidas.

2.3.3. Outros tipos Específicos de Diabetes

Nessa classificação são incluídos os defeitos genéticos da função das células β, os

defeitos genéticos na ação da insulina, doenças exócrinas do pâncreas, endocrinopatias,

indução por agentes químicos ou drogas, infecções, formas não comuns de diabetes

mediadas por características imunológicas e outras síndromes genéticas associadas com o

diabetes (ADA, 2008).

A indução de DM por agentes químicos ou drogas tem um importante significado

para o nosso estudo, uma vez que usamos a hidroclorotiazida, um diurético tiazídico, em

nosso modelo experimental. Nesse contexto, muitas drogas podem prejudicar a secreção de

insulina, visto que estas não causam o DM, por si, mas podem precipitar o DM em

indivíduos com resistência à insulina (ADA, 2008). Assim, estudos sugerem que os

pacientes que desenvolvem o DM após o tratamento com diuréticos tiazídicos,

provavelmente já tinham a doença, a qual foi exacerbada pela droga, pois o uso de

diuréticos tiazídicos, raramente provoca hiperglicemia grave (ADA, 2008).

2.3.4. Diabetes Mellitus Gestacional (DMG)

O DM G é definido como qualquer grau de intolerância à glicose com início ou

identificação durante a gravidez (ADA, 2008). Essa definição é aplicada,

independentemente do uso de insulina ou de apenas uma modificação na dieta para

tratamento ou ainda, se a condição persistir após a gravidez. A intolerância à glicose ocorre

normalmente durante a gravidez, especialmente no terceiro mês de gestação (ADA, 2008).

O nível de glicose em jejum com resultado de 126 mg/dL (7,0 mmol/L) ou uma

glicose plasmática aleatória com resultado de 200 mg/dL (11,1 mmol/L) significa que essa

gestante encontra-se no limiar para o diagnóstico de diabetes

É recomendado que se realize uma triagem para o DMG em todas as gestações. A

avaliação para o risco de desenvolvimento de DMG deve ser realizada na primeira consulta

do pré-natal. Após, as mulheres com características clínicas compatíveis com um elevado

risco para o DMG (obesidade, história pessoal de DMG, glicosúria ou uma história familiar

de DM) devem fazer um teste de tolerância à glicose, ou seja, a gestante ingere 75g de

glicose em jejum e, após são realizadas coletas de sangue em intervalos de tempo de 1 hora

para a realização de dosagens de glicemia. Para as três primeiras coletas os valores

máximos esperados são os seguintes: 95 mg/dL (jejum), 180 mg/dL (1h) e 155 mg/dL (2h)

(ADA, 2008).

Intolerância à glicose e glicemia em jejum alterada

O Comitê de Peritos sobre o Diagnóstico e Classificação de Diabetes Mellitus

(Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, 1997, 2003)

reconhece um grupo de indivíduos cuja glicemia, embora não corresponda aos critérios

para a diabetes, é elevada para ser considerada normal. Este grupo apresenta nível de

glicemia de jejum superior ou igual a 100 mg/dL (5,6 mmol/L), mas inferior a 126 mg/dL

(7,0 mmol/L) ou concentração plasmática de glicose dentro de 2 horas após a ingestão de

uma carga de glicose oral, no teste de tolerância a glicose superior a 140 mg/dL (7,8

mmol/dL), mas inferior a 200 mg/dL (11,1 mg/dL). Então, as categorias dos valores de

glicose em jejum são as seguintes:

1. Normal: glicemia de jejum inferior a 100 mg/dL (5,6 mmol/L).

2. Tolerância à glicose diminuída: glicose de jejum apresenta valores de 100 – 125

mg/dL (5,6 – 6,9 mmol/L).

3. Diagnóstico provisório de diabetes: glicemia de jejum superior a 126 mg/dL (7,0

mmol/L).

O diagnóstico provisório é confirmado pelo teste de tolerância oral a glicose que

apresenta as seguintes categorias:

1. Tolerância a glicose normal: concentração plasmática de glicose dentro de 2 horas

após a ingestão de uma carga de glicose oral apresenta valores inferiores a 140

mg/dL (7,8 mmol/L).

2. Intolerância a glicose: concentração plasmática de glicose dentro de 2 horas após a

ingestão de uma carga de glicose oral entre 140 - 199 mg/dL (7,8 -11,1 mmmol).

3. Diagnóstico provisório de diabetes: concentração plasmática de glicose dentro de 2

horas após a ingestão de uma carga de glicose oral apresenta valores superiores a

200 mg/dL (11,1 mg/dL).

2.4. Prevalência

O DM é um distúrbio metabólico crônico que tem um impacto significativo sobre a

saúde, a qualidade de vida e a expectativa de vida dos pacientes, bem como sobre o Sistema

de Saúde. A prevalência do diabetes para todas as faixas etárias em nível mundial foi

estimada em 2,8% para o ano de 2000 e 4,4% para 2030 (Wild et. al., 2004), isso significa

que 171 milhões de pessoas têm diabetes e que este valor, provavelmente, seja maior do

que o dobro em 2030 (Wild et al., 2004). No mundo, cerca de 2,9 milhões de mortes no ano

de 2000 foram atribuídas às complicações do diabetes, isso equivale a 5,2% de todas as

mortes (Roglic et al., 2005).

Embora de caráter controlável, o diabetes vem despontando como uma epidemia de

proporções graves. A sua prevalência está aumentando assustadoramente, como resultado

do crescimento e envelhecimento da população, da urbanização e das alterações negativas

no estilo de vida, como prevalência da obesidade e da inatividade física (Wild et al., 2004;

Sicree & Shaw, 2007). De fato, em alguns países têm se divulgado a existência de uma

epidemia de DM tipo 2, sendo a obesidade um dos principais fatores que contribui para

aumentar a incidência dessa patologia (Wild et al., 2004; Sicree & Shaw, 2007). Por outro

lado, embora a prevalência da obesidade se mantenha estável até 2030, o que parece

improvável, é previsível que o número de pessoas com diabetes irá aumentar mais do que o

dobro do número de diabéticos existentes, atualmente, como conseqüência do

envelhecimento populacional e da urbanização (Wild et al., 2004; Sicree & Shaw, 2007).

Portanto, a partir do aumento na prevalência da obesidade em muitos países do mundo e da

importância da obesidade como fator de risco para o diabetes, o número de casos de

diabetes em 2030 poderá ser superior a previsão dos estudos epidemiológicos (Wild et al.,

2004). Nesse contexto, as intervenções efetivas para a redução da prevalência do diabetes,

incluindo mudanças na dieta, exercícios físicos ou tratamentos farmacológicos poderiam

representar importantes fatores de prevenção.

A prevalência do diabetes é maior em homens do que em mulheres, mas existem

mais mulheres do que homens com diabetes (Wild et al., 2004). Há uma projeção que

revela que a população urbana, em países em desenvolvimento, apresentará no ano de 2030

o dobro da população existente no ano de 2000 (Wild et al., 2004). No entanto, a alteração

demográfica mais importante para a prevalência do diabetes em todo o mundo parece ser o

aumento na proporção de pessoas com mais de 65 anos de idade (Wild et al., 2004), uma

vez que o DM tipo 2 é mais comum em idosos (Peter et al., 2006).

No Brasil, a diabetes atingiu cerca de 4,6 milhões de brasileiros no ano de 2000,

ocupando o oitavo lugar entre os dez países com maior prevalência no mundo. O número

estimado de diabetes em indivíduos adultos para o ano de 2030 é de, aproximadamente,

11,3 milhões (Malerbi & Franco, 1992; King & Rewers, 1993; King & Aubert, 1998; Wild

et al., 2004). É notável que, aproximadamente, 40% dos indivíduos com DM desconhecem

que possuem a doença e 90% deles são portadores de DM tipo 2 (Malerbi & Franco, 1992;

King & Rewers, 1993; King & Aubert, 1998).

Alguns dados epidemiológicos relatam que o DM ocorre em cerca de 10% dos

pacientes hospitalizados em qualquer unidade hospitalar no mundo, em cerca de 29% dos

pacientes submetidos a cirurgia cardíaca e que a hiperglicemia ocorre em,

aproximadamente, 38% dos pacientes hospitalizados, o que leva a maior tempo de

internação e uma maior taxa de admissão na Unidade de Tratameto Intensivo (UTI) e,

conseqüentemente, maior custo (Sociedade Brasileira de Diabetes, 2008). Portanto, uma

iniciativa global é necessária para tratar a epidemia do DM.

3. Diuréticos tiazídicos

Os diuréticos aumentam o fluxo urinário e a excreção de sódio e são utilizados para

ajustar o volume e/ou a composição dos líquidos corporais em uma variedade de situações

clínicas, incluindo hipertensão, insuficiência cardíaca, insuficiência renal, síndrome

nefrótica e cirrose. O mecanismo exato envolvido na redução da pressão arterial pelos

diuréticos tiazídicos ainda não está totalmente elucidado. No entanto, estudos relatam que

esses fármacos diminuem o volume extracelular através de sua interação com um co-

transportador de Na-Cl sensível a tiazidas no rim. A depleção dos estoques de cloreto de

sódio (NaCl) no corpo reduz a pressão arterial e o débito cardíaco. Entretanto, o efeito

hipotensor é mantido durante a terapia a longo prazo, devido à redução da resistência

vascular. Após algumas semanas, o débito cardíaco retorna aos valores anteriores ao

tratamento (Goodman & Gilman, 2006; Parekh et al., 2008) e o volume extracelular retorna

quase a seu valor normal, em conseqüência de respostas compensatórias, como a ativação

do sistema renina-angiotensina (Goodman & Gilman, 2006). Não se sabe como esse

processo ocorre, todavia os diuréticos tiazídicos promovem vasodilatação em vasos

isolados de animais de laboratório e seres humanos (Goodman & Gilman, 2006).

Embora considerados seguros e eficazes, a sua utilização está associada com

alterações metabólicas, incluindo dislipidemia, hiperglicemia, intolerância à glicose e um

risco aumentado de desenvolvimento de DM tipo 2 (Wilcox, 1999; Huen & Goldfarb,

2007). Além disso, dados da literatura mostram que o uso de diuréticos tiazídicos também

está associado com hiponatremia, hipocalemia e hipomagnesemia (Carlsen et al., 1999;

Verdecchia et al., 2004). Portanto, tem sido questionada a segurança dos diuréticos para os

diabéticos hipertensos.

O mecanismo pelo qual os diuréticos tiazídicos causam alteração na tolerância à

glicose não está bem esclarecido, mas parece envolver uma redução da secreção de

insulina, bem como alterações no metabolismo da glicose (Bonner, 1994). Nesse contexto,

os efeitos dos diuréticos tiazídicos na secreção ou na sensibilidade à insulina podem ser

responsáveis pela alteração no perfil lipídico, uma vez que a insulina ativa a lipoproteína

lipase, a qual hidrolisa os triglicerídios em lipoproteínas de baixa densidade (LDL) (Grimm

et al., 1981). Portanto, os diuréticos tiazídicos podem induzir aumento nos níveis séricos de

colesterol total, triglicerídeos e LDL (Grimm et al., 1981; Perez-Stable & Carilis, 1983),

além de alterações no metabolismo dos carboidratos, com conseqüente hiperglicemia. Mas

esses efeitos adversos, em geral são dependentes da dose. Além disso, a redução da dose,

além de modificações na dieta e do aumento da atividade física é suficiente, na maioria dos

casos, para controlar tais alterações (Jones & Sands, 1994). Então, uma vez que os

diuréticos tiazídicos, em doses baixas, não costumam produzir tais efeitos adversos (Huen

et al., 2007), torna-se crescente a recomendação para o uso cada vez mais intenso desse

fármaco, porém em doses cada vez menores.

Na literatura, há evidências de que os efeitos adversos dos diuréticos tiazídicos nos

níveis de lipídios e na tolerância à glicose são, em parte, conseqüência da depleção de

potássio (Helderman et al., 1983; Andersson et al., 1991), pois esses efeitos diminuem

quando é administrado potássio simultaneamente com esses diuréticos (Wilcox et al.,

1999). Por outro lado, a hiperglicemia na ausência de um bom controle metabólico, bem

como a terapia com diuréticos tiazídicos podem aumentar a excreção urinária de magnésio

(Barbagallo & Dominguez, 2007). O magnésio intracelular desempenha um papel

fundamental na regulação da ação da insulina, na captação de glicose mediada pela insulina

e no tônus vascular, portanto a insulina e a glicose são importantes reguladores do

NCl

metabolismo do magnésio (Barbagallo & Dominguez, 2007). Assim, a hipomagnesemia

pode resultar em defeito na atividade da tirosina quinase no receptor de insulina,

comprometimento da ação da insulina e desenvolvimento ou piora da resistência à insulina

(Paolisso & Barbagallo, 1997; Barbagallo & Dominguez, 2007). Então, a deficiência de

magnésio tem sido proposta como um possível mecanismo para o desenvolvimento da

resistência à insulina causada pelos diuréticos tiazídicos. Neste contexto, o DM tipo 2 é

caracterizado por deficiência celular e extracelular de magnésio, que é um importante co-

fator para mais de trezentas reações enzimáticas. Evidências sugerem que a deficiência de

magnésio está associada com um controle metabólico deficiente, aumento de dano tecidual

oxidativo dependente de radicais livres e crônicas complicações em pacientes com DM tipo

2 (Rayssiguier et al., 1993; Lourdes et al., 1998; Gums, 2004).

3.1. Hidroclorotiazida (HCTZ)

A Hidroclorotiazida (HCTZ) (Figura 1) e seus similares (tiazídicos) são os

diuréticos mais utilizados em todo o mundo para o controle da hipertensão arterial. A

hidroclorotiazida (6-cloro-3, 4-dihidro-2H-1, 2, 4-benzotiadiazina-7-sulfonamida 1, 1-

dióxido) é um diurético, derivado sulfonamida representante da classe das benzotiadiazinas,

comumente conhecido como tiazida (Dollery, 1998).

Figura 1. Estrutura química da Hidroclorotiazida

Vários estudos relatam a eficácia e segurança dos diuréticos tiazídicos na redução da

morbidade e da mortalidade em pacientes hipertensos (The ALLHAT Study Group, 2002;

Turnbull, 2003), uma vez que esses diuréticos têm demonstrado eficácia em diminuir a

pressão arterial e uma comprovada capacidade de prevenir acidente vascular cerebral,

infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca congestiva (McInnes, 1992; The ALLHAT

Study Group, 2002; Turnbull, 2003). Como resultado, os tiazídicos, assim como a HCTZ

são recomendados como terapia de primeira linha para a hipertensão arterial (The

ALLHAT Study Group, 2002). No entanto, o seu uso tem sido associado com

anormalidades metabólicas, tais como distúrbios eletrolíticos, hiperlipidemia e

comprometimento do metabolismo da glicose (Plavinik et al., 1992; Franse et al., 2000;

Punzi & Punzi, 2004; Verdecchia et al., 2004). Portanto, esses efeitos adversos podem

causar o desenvolvimento ou exacerbação de distúrbios metabólicos e DM tipo 2 (Reungjui

et al., 2007), uma vez que muitos pacientes com hipertensão arterial apresentam algum tipo

de distúrbio metabólico.

4. Estresse oxidativo

Um radical livre é qualquer átomo, grupo de átomos ou moléculas capaz de existir

sob a forma independente e que contém um ou mais elétrons desemparelhados (Del

Maestro, 1980; Southorn & Powis, 1988; Bergendi et al., 1999; Halliwell, 2006b; Halliwell

& Gutteridge, 2006). O termo “Espécies Reativas de Oxigênio” (ROS) inclui os radicais de

oxigênio pouco reativos como o O

•-

e os radicais altamente reativos, como o HO

•

(todos

são radicais que contém um ou mais elétrons desemparelhados), e alguns não-radicais (sem

elétrons desemparelhados), que são agentes oxidantes e/ou são facilmente convertidos em

radicais, como por exemplo, HOCl, HOBr, O

, ONOO

e H

. Portanto, todos os

radicais de oxigênio são ROS, mas nem todas as ROS são radicais de oxigênio (Halliwell,

2006a). Há também as Espécies Reativas de Nitrogênio (RNS), termo que inclui as espécies

radicais como NO

•

e NO

•

bem como espécies não-radicais como HNO

e N

(Halliwell,

2006a).

As EROs são produtos do metabolismo normal das células (Valko et al., 2007). No

entanto, um aumento na produção destas espécies reativas ou uma diminuição das defesas

antioxidantes pode levar ao estresse oxidativo, que está relacionado com a etiologia ou

progressão de diversas doenças (Halliwell & Gutteridge, 2006; Valko et al., 2007). O

excesso de produção de EROs pode causar dano em lipídios, proteínas e no ácido

desoxirribonucléico (DNA) inibindo a sua função normal (Valko et al., 2007).

Os seres vivos dispõem de mecanismos protetores para evitar o acúmulo de EROs e

de seus efeitos deletérios (Halliwell, 2006). Esses sistemas de defesa podem ser de origem

enzimática ou não-enzimática. As principais enzimas antioxidantes são a superóxido

dismutase, a catalase e a glutationa peroxidase. Essas enzimas evitam o acúmulo de radical

superóxido, peróxido de hidrogênio e a conseqüente produção de radical hidroxil. As

defesas não enzimáticas incluem os antioxidantes lipofílicos (tocoferóis, carotenóides e

bioflavonóides) e hidrofílicos (glutationa e ascorbato) (Heffner & Repine, 1989; Cao et al.,

1997; Halliwell, 2006; Halliwell & Gutteridge, 2006).

Os mecanismos moleculares que levam às complicações patológicas do diabetes não

estão completamente esclarecidos na literatura, mas envolvem a participação de EROs

(Maritim et al., 2003) devido à hiperglicemia crônica (Baynes & Thorpe, 1996). A elevada

produção de EROs pode ocorrer em conseqüência da auto-oxidação da glicose, glicação

não-enzimática de proteínas e formação de produtos terminais de glicação avançada

(PTGAs), então os níveis elevados de EROs e a redução simultânea nos mecanismos de

defesa antioxidantes podem causar danos em organelas celulares, desenvolvimento de

resistência à insulina (Maritim et al., 2003), alterações nas estruturas das proteínas,

inativação de enzimas e aumento nos níveis de peroxidação lipídica em vários tecidos (Jain

et al., 2001; Rosen et al., 2001; Folmer et al., 2002; Morgan et al., 2002; Maritim et al.,

2003). Essa peroxidação lipídica leva à destruição oxidativa de ácidos graxos poli

insaturados que constituem a membrana celular (Esterbauer et al., 1992; Cheeseman &

Slater, 1993).

5. A enzima Na

-ATPase

A Na

-K

-ATPase (EC 3.6.1.37) é uma enzima que está incorporada na membrana

das células e é responsável pelo transporte ativo de íons sódio (Na

) e potássio (K

) no

sistema nervoso. Este processo regula a concentração celular de Na

conseqüentemente, os seus gradientes através da membrana plasmática, os quais são

necessários para as funções vitais, tais como co-transporte pela membrana, regulação do

volume celular e excitabilidade da membrana (Jorgensen, 1986; Doucet, 1988). Esta

enzima dimérica existe em várias isoformas no cérebro e consome cerca de 40-50% do

ATP gerado nesse tecido (Erecinska & Prata, 1994). A inativação de Na

-K

-ATPase

conduz à despolarização parcial da membrana, permitindo a entrada excessiva de Ca

nos

neurônios com conseqüente produção de eventos neurotóxicos (Beal, 1993). A Na

-K

ATPase pode ser sensível à oxidação causada por agentes oxidantes (Carfagna et al., 1996;

Folmer et al., 2004), uma que possui grupos sulfidrilas, os quais são, altamente, suscetíveis

ao estresse oxidativo (Yufu et al, 1993; Folmer et al., 2004).

Estudos mostram que o consumo crônico de dietas com grande quantidade de

lipídios ou carboidratos pode promover o desenvolvimento de estresse oxidativo associado

à hiperglicemia em vários tecidos, o que pode conduzir à inibição de enzimas como a δ-

aminolevulinato desidratase (Folmer et al., 2002; Folmer et al., 2003) e a Na

-K

-ATPase

(Morgan et al., 2002, Folmer et al., 2004). Nesse contexto, dados da literatura têm indicado

que a atividade da Na

-K

-ATPase em eritrócitos pode ser inibida após exposição in vitro a

altas concentrações de glicose (Jain & Lim, 2001). No entanto, estudos relativos aos efeitos

de modelos experimentais de alterações metabólicas induzidas pela dieta ou por diuréticos

tiazídicos, na atividade da Na

-K

-ATPase no tecido cerebral, são raros na literatura.

6. Selênio

O selênio é um elemento químico que foi descoberto em 1817 por Berzelius e está

localizado no grupo VI da tabela periódica. Na forma de selenocisteína, este micronutriente

encontra-se presente no sítio ativo de diversas enzimas que desempenham atividades

antioxidantes nos sistemas biológicos como a glutationa peroxidase e a fosfolipídio

hidroperóxido glutationa peroxidase (Flohe et al., 1973; Rotruck et al., 1973; Urisini et al.,

1985).

O selênio em baixas concentrações é um elemento traço essencial aos mamíferos

(Navarro-Alarcón & Lopes-Martinez, 2000; Rayman, 2000). No entanto, estudos mostram

que altas concentrações de compostos de selênio orgânico ou inorgânico podem causar

efeitos tóxicos e pró-oxidantes devido a sua habilidade de catalisar a oxidação de tióis e

produzir EROs (Nogueira et al., 2004; Schiar et al., 2009). Por outro lado, a deficiência de

selênio na dieta está relacionada com a gênese e/ou progressão de diversas patologias como

doenças cardiovasculares, disfunções imunológicas, câncer, diabetes e anormalidades

metabólicas (Combs & Gray, 1998; Navarro-Alárcon & Lopez-Martinez, 2000; Rayman,

2000; Barbosa et al., 2006; Barbosa et al., 2008). Além disso, dados da literatura relatam

que alguns compostos de selênio têm sido estudados em modelos clínicos e experimentais

de diabetes (Bonnefont-Rousselot, 2004; Faure et al., 2007; Barbosa et al., 2008) e parecem

ter efeitos benéficos na sensibilidade à insulina e na prevenção de lesão degenerativa

vascular (Faure et al., 2007).

A atividade antioxidante exibida pelo selênio parece ser responsável pela sua

eficácia no tratamento e prevenção das patologias que têm o estresse oxidativo como

processo central no seu desenvolvimento. Assim, nas últimas décadas tem crescido muito o

interesse em investigar o papel de compostos de selênio como possíveis agentes

terapêuticos no tratamento de diversas patologias. No entanto, a dose de selênio a ser

administrada constitui um fator crítico na atividade biológica do elemento, uma vez que a

quantidade requerida, nutricionalmente é muito próxima da quantidade tóxica.

6.1. Disseleneto de difenila (PhSe)

Figura 2. Estrutura química do Disseleneto de Difenila

O disseleneto de difenila (Figura 2) é um composto orgânico sintético de selênio

que reage, eficientemente, com hidroperóxidos e peróxidos orgânicos através de reação

similar a catalisada pela glutationa peroxidase (GPx). Vários estudos do nosso grupo de

pesquisa têm demonstrado que o (PhSe)

apresenta importantes propriedades

farmacológicas como antioxidante, anti-inflamatória, analgésica, neuroprotetora e anti-

aterogênicas (Ghisleni et al. 2003; Nogueira et al., 2004; Zasso et al., 2005; Barbosa et al.,

2006, Barbosa et al., 2008, Bem et al., 2008a; Bem et al., 2008b). Recentemente, dados do

nosso laboratório mostraram que o tratamento crônico com (PhSe)

reduziu a hiperglicemia

e outras alterações bioquímicas relacionadas ao estresse oxidativo em ratos tratados com

estreptozotocina (Barbosa et al., 2006). No entanto, o efeito do (PhSe)

em alterações

metabólicas induzidas por outros fatores como dietas suplementadas com carboidratos e/ou

lipídios associadas ao tratamento com HCTZ não está disponível na literatura.

OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

O presente estudo visa entender melhor como o estresse oxidativo contribui para o

estabelecimento do diabetes em modelos animais. Nesse trabalho também abordamos a

análise dos efeitos toxicológicos relacionados à dose de HCTZ e a possível interação

sinérgica entre a ingestão de dietas hiperlipídicas ou hiperglicídicas associadas ao

tratamento com HCTZ, dois fatores de risco para o desenvolvimento de diabetes. Além

disso, procuramos desenvolver um modelo animal para o estudo da toxicidade da HCTZ

associada aos sintomas bioquímicos do Diabetes Mellitus tipo 2 e avaliar o uso de (PhSe)

organocalcogênio antioxidante, como possível agente terapêutico nesse modelo animal.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Capítulo 1

- Investigar a possível interação sinérgica entre a ingestão crônica de uma dieta

hiperlipídica e o tratamento com HCTZ pela avaliação dos parâmetros bioquímicos

relacionados ao estresse oxidativo no cérebro.

- Avaliar os efeitos toxicológicos de HCTZ no cérebro durante uma suplementação

oral com diferentes doses desse anti-hipertensivo.

Capítulo 2

- Investigar se a associação entre uma dieta hiperlipídica e o tratamento com HCTZ

apresenta uma influência sinérgica negativa na homeostase da glicose e nos parâmetros

bioquímicos relacionados ao desenvolvimento de hiperglicemia, bem como investigar a

possível relação entre essas alterações com o estresse oxidativo.

- Estudar os efeitos toxicológicos de HCTZ no fígado, pela avaliação dos

parâmetros bioquímicos e marcadores de estresse oxidativo, durante uma suplementação

oral com diferentes doses desse anti-hipertensivo.

- Desenvolver um modelo animal para o estudo da toxicidade da HCTZ associada

aos sintomas bioquímicos do DM tipo 2.

Capítulo 3

- Estudar os efeitos da associação de uma dieta hiperglicídica com o tratamento com

HCTZ nos parâmetros bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo e aos marcadores

bioquímicos de desenvolvimento de DM tipo 2, a fim de investigar se a HCTZ poderia

exacerbar as alterações bioquímicas induzidas pela dieta hiperglicídica, uma vez que esses

distúrbios são comuns em pacientes com hipertensão.

- Avaliar se a ingestão crônica de (PhSe)

pode prevenir e/ou reduzir as alterações

bioquímicas causadas pela ingestão de uma dieta enriquecida com frutose e/ou

hidroclorotiazida.

CAPÍTULO 1 – Artigo publicado.

High-fat diet and hydrochlorothiazide change biochemical indexes of oxidative stress

in brain of rats

Marinei Cristina Pereira Ribeiro, Nilda Berenice de Vargas Barbosa, Roger Monteiro,

Lutiane Mozzaquatro Parcianello, Verônica Bidinotto Brito, Juliano Perottoni, Daiana Silva

de Ávila, João Batista Teixeira Rocha.

Cell Biochemistry & Function, 27: 473-478, 2009.

CAPÍTULO 2 – Manuscrito 1.

Hydrochlorothiazide with a high fat diet hampers glucose homeostasis and increases

oxidative stress in rats

Marinei Cristina Pereira Ribeiro, Roger Monteiro, Lutiane Mozzaquatro Parcianello,

Daiana Silva de Ávila, Nilda Berenice de Vargas Barbosa e João Batista Teixeira Rocha.

Submetido à Life Sciences.

Hydrochlorothiazide with a high fat diet hampers glucose homeostasis and

increases oxidative stress in rats

Marinei Cristina Pereira Ribeiro

a,b

*, Roger Monteiro

Lutiane Mozzaquatro Parcianello

, Daiana Silva Ávila

, Nilda Berenice de Vargas

Barbosa

and João Batista Teixeira Rocha

Hospital Universitário de Santa Maria,

Universidade Federal de Santa Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil

Departamento de Química, Centro de Ciências Naturais e Exatas,

Universidade Federal de Santa Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil

Corresponding author: Marinei Cristina Pereira Ribeiro or João Batista Teixeira da Rocha

Hospital Universitário de Santa Maria

Universidade Federal de Santa Maria

97105-900 Santa Maria, RS, Brazil

Tel.: +55 55 3220 8513; fax: +55 55 3220 8005

E-mail: mcpribeiro@yahoo.com.br or [email protected]

Abstract

Aims: This study was designed to investigate whether an association between a high fat (HF)

diet and hydrochlorothiazide (HCTZ) produces a negative synergic influence on glucose

homeostasis and in other biochemical parameters associated to hyperglycemia development.

Main methods: Rats were fed for 16 weeks with a control diet (CT) or with an HF diet

supplemented or not with different doses of HCTZ (0.4, 1.0 and 4.0 g/kg of diet).

Key findings: In experimental trials, HCTZ associated with an HF diet caused a significant

increase in blood glucose and fructosamine levels. The intake of HCTZ and HF diets

produced a significant reduction in magnesium and potassium levels as well as an increase in

lipid peroxidation and vitamin C in liver. Importantly, the association of HCTZ with HF diet

caused additional worsening of biochemical parameters related to glucose homeostasis

(particularly accentuated magnesium depletion) and further increase in hepatic oxidative

stress.

Significance: Our results suggest that chronic intake of HCTZ or HF diet causes metabolic

changes related to glucose homeostasis and that the association of HF diet and HCTZ

treatment can exacerbate some of these biochemical alterations. Therefore, we can suggest

that this experimental model can be used for studying the adverse effects of HCTZ.

Keywords: High fat diet, hydrochlorothiazide, hyperglycemia, oxidative stress, magnesium.

Introduction

Hydrochlorothiazide (HCTZ) is a diuretic that belongs to the thiazide class of

compounds and is widely used for the treatment of hypertension (George et al. 1995). HCTZ

safety and efficacy in reducing morbidity and mortality in hypertensive patients have been

attested by numerous studies (JAMA 1991, BMJ 1992, Grossman and Messerli 2006),

however, its use can be associated with the development of metabolic abnormalities such as

hyperglycemia and type 2 diabetes mellitus (Weir and Moser 2000, Zee et al. 2005).

Therefore, the intake of this class of diuretic in diabetic hypertensive patients has been

questioned (Grossman 2006).

Similarly to HCTZ treatment, chronic intake of diets with a high proportion of fat

can promote the appearance of hyperglycemic state, which ultimately leads to an increased

risk of developing type 2 diabetes mellitus (Kamgang et al. 2005, Messier et al. 2007).

Consequently, high fat diets have been commonly used in rodent to mimic experimentally

human type 2 diabetes mellitus (Han et al. 1997, Hansen et al. 1998, Tremblay et al. 2001,

Folmer et al. 2003, Kamgang et al. 2005, Shih et al. 2008).

Hyperglycemia, the primary clinical manifestation of diabetes mellitus, is associated

with non enzymatic glycation of proteins and free radical generation (Maiese et al 2007).

These processes can cause permanent chemical alterations in proteins and increase lipid

peroxidation in a variety of tissues (Folmer et al. 2002, Brito et al. 2007, Maiese et al. 2007).

In this context, excessive production of reactive oxygen species (ROS) or inadequate

antioxidant protection facilitates the development and progression of diabetes and its

complications (Rosen et al. 2001, Maritim et al. 2003).

Liver is one of the primary insulin-responsive organs and has a central role in

modulating normal glucose homeostasis (Maiese et al. 2007). Literature reports have

demonstrated that hepatic damage induced by ROS can disrupt cellular homeostasis and

aggravate metabolic syndrome features (Kohen and Nyska 2002, Raval et al. 2006). Thus, in

an attempt to develop a rodent model to study the adverse effects of HCTZ, the main

objective of this work was to investigate whether an association between HF diet and HCTZ

could have a negative synergic influence on glucose homeostasis and on other biochemical

parameters related to hyperglycemia development. Moreover, a possible relationship between

these changes with oxidative stress was also investigated.

Materials and Methods

Chemicals

Casein (technical grade), comassie brilliant blue G, 2,4-dinitrophenylhydrazine,

HCl, sodium sulphate dodecyl (SDS), heptane, acetate, ethanol, reduced glutathione, ouabain,

malondialdehyde (MDA) and thiobarbituric acid (TBA) were obtained from Sigma, (St.

Louis, MO., USA). Mono and dibasic potassium phosphate, acetic acid, ascorbic acid, ortho-

phosphoric acid, tris buffer (tris[hydroxymethyl]aminomethane) and trichloroacetic acid were

obtained from Merck (Rio de Janeiro, Brasil). Hydrochlorothiazide, cornstarch, lard, bone

meal, wheat bran, soybean oil, vitamin and mineral complex were obtained from various

commercial sources.

Animals and diets

Adult male Wistar rats (2 months old), weighing 250-300 g were used for the

experiments. The animals were kept on a 12 h light/12 h dark cycle, in a room with the

temperature regulated to 21-25 ºC and humidity at roughly 56% and with free access to food

and water. Animals were used according to the guidelines of the Committee on Care and Use

of Experimental Animal Resources of the Federal University of Santa Maria, Brazil.

Rats were randomly divided in eight experimental groups with five animals per

group and fed for 16 wk with: (1) control diet (CT); (2) CT plus HCTZ (0.4 g/kg of diet); (3)

CT plus HCTZ (1.0 g/kg of diet); (4) CT plus HCTZ (4.0 g/kg of diet); (5) high fat diet (HF);

(6) HF plus HCTZ (0.4 g/kg of diet); (7) HF plus HCTZ (1.0 g/kg of diet) and (8) HF plus

HCTZ (4.0 g/kg of diet). The composition of the diets is shown in Table 1. Diets were

prepared weekly and stored at 4ºC. The food intake and the body weight of animals were

measured daily and every week, respectively.

Blood samples and tissue preparation

At the end of the experimental period, after 12 h of fasting, the animals were

sacrificed under mild ether anesthesia and blood was collected by cardiac puncture in

heparinized tubes for vitamin C determination. A blood fraction was collected in tubes with

sodium fluoride to determine glucose concentration. In addition, a parallel blood fraction was

collected without anticoagulant for magnesium, potassium and fructosamine determination.

The samples of liver were quickly removed, rinsed with saline, weighed, placed on ice and

homogenized in 10 volumes (w/v) in cold 50 mM Tris-HCl pH 7.4. The homogenate was

centrifuged at 4,000 x g at 4ºC for 10 min to yield low-speed supernatant fraction (S1) that

was used for biochemical assays, except for measurement of protein carbonyl content (PCO),

which was determined in samples of the homogenate. In addition, total adipose tissue

deposits (total weight of perirenal, mesenteric, epididymal and subcutaneous fat-pads)

content was also determined.

Biochemical analysis

Plasma glucose concentration was measured as previously described by Bergmeyer

(1984) and fructosamine concentration was determined as described by Baker et al. (1985).

The levels of magnesium were estimated according to the method of Bohuon (1962) and

potassium levels were measured as previously described by Kavanagh and Mills (1997).

Lipid peroxidation (LPO) levels

Lipid peroxidation was estimated by measuring thiobarbituric acid reactive

substances (TBARS) and was expressed in terms of malondialdehyde (MDA) content,

according to the method of Ohkawa et al. (1979), in which MDA, an end product of fatty acid

peroxidation, reacts with thiobarbituric acid (TBA) to form a colored complex. In brief,

samples were incubated at 100ºC for 60 min in acid medium containing 0.45% sodium

dodecyl sulfate, 1.27 mol/L acetic acid/270 mmol/L HCl, pH 3.5 and 0.8% thiobarbituric

acid. TBARS produced were measured at 532 nm and the absorbance was compared with the

standard curve using malondialdehyde.

Protein carbonyl (PCO) content

The PCO content was determined as described by Levine et al. (1989) with some

modifications. Briefly, homogenates were diluted to 750-800 µg/mL of protein in each

sample, and 1 mL aliquots were mixed with 0.2 mL of 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH,

10 mM) or 0.2 mL HCl (2 M). After incubation at room temperature for 1h in a dark ambient,

0.6 mL of denaturing buffer (150 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8, containing 3%

SDS), 1.8 mL of heptane (99.5%) and 1.8 mL of ethanol (99.8%) were sequentially added,

mixed with vortex agitation for 40 sec and centrifuged for 15 min. The protein isolated from

the interface was washed two times with 1 mL of ethyl acetate/ethanol 1:1 (v/v) and

suspended in 1 mL of denaturing buffer. Each DNPH sample was read at 370 nm in a

spectrophotometer against the corresponding HCl sample (blank), and total carbonylation

calculated using a molar extinction coefficient of 22,000M

-1

. Protein was measured by

method of Bradford (1976) using bovine serum albumin as standard.

Vitamin C levels

Total content of vitamin C (ascorbic acid) in plasma and liver was determined by

the method of Jacques-Silva et al. (2001). Proteins of plasma and liver were precipitated with

1 vol. of a cold 10% trichloroacetic acid followed by centrifugation. An aliquot of 300 µL of

the supernatants was mixed with 2,4-dinitrophenylhydrazine (4.5 mg/mL), CuSO

(0.075

mg/mL) and trichloroacetic acid 13.3% (final volume 1 mL) and incubated for 3 h at 37ºC.

Then, 1 mL of H

65% (v/v) was added to the medium. Ascorbic acid levels were

measured spectrophotometrically at 520 nm and calculated using a standard curve (1.5-4.5

µmol/L ascorbic acid freshly prepared in sulfuric acid).

Statistical analysis

All values obtained are expressed as mean ± standard error. Data were analyzed by

one-way, two-way or three-way ANOVA analyses of variance followed by Duncan’s

multiple range tests when appropriate. Differences between groups were considered to be

significant when p < 0.05.

Results

Body weight, organ weight and total adipose tissue deposit weight

Three-way ANOVA (2 diets x 4 HCTZ x 16 sampling times) revealed significant

HCTZ x time interaction (Fig. 1A and 1B, p < 0.05), indicating that HCTZ treatment caused

a reduction in body weight gain rate (Table 2). Two-way ANOVA of total adipose tissue

weight revealed a significant main effect of HCTZ [F(3,32)=10.75, p < 0.05], indicating that

HCTZ treatment decreased total adipose tissue deposits (Table 2). However, the proportion

of lipid to body weight was significantly higher in the high fat diet group that was fed with

4.0 kg HCTZ than in other groups (data not shown).

Blood glucose levels

Two-way ANOVA of blood glucose levels revealed a significant main effect of the

diet [F(1,32)=9.74, p < 0.05] and a significant main effect of the HCTZ treatment

[F(3,32)=4.73, p < 0.05. HCTZ and HF treatment tended to increase blood glucose; however,

post-hoc comparisons indicated that a significant increase in glucose levels occurred only

after simultaneous ingestion of HF and HCTZ (1.0 and 4.0 g/kg; Table 3).

Fructosamine levels

Two-way ANOVA for fructosamine data revealed a significant main effect of the

diet (F(1,32)=32.23, p < 0.05). In fact, the ingestion of the HF diet increased fructosamine

levels in all groups (Table 3).

Magnesium and potassium determination

Two-way ANOVA of magnesium levels revealed a significant main effect of the

diet [F(1,32)=17,23, p < 0.05] and a significant main effect of HCTZ [F(3,32)=8.34, p <

0.05]. Post-hoc treatment by Duncan’s multiple range tests revealed that HF diet caused a

significant reduction in magnesium level. Analyses also demonstrated that HCTZ caused

further decrease in magnesium level in control and HF diets (Table 3). Of particular

importance, negative correlations were found between the magnesium and glucose levels (r =

- 0.51, p < 0.05) as well as between magnesium and fructosamine levels (r = - 0.37, p < 0.05).

Two-way ANOVA of potassium levels revealed a significant main effect of the diet

(F(1,32)= 20.8. p < 0.05) and of the HCTZ treatment [F(3,32)=10,99, p < 0.05] and a

tendency for significant diet x HCTZ interaction [F(3,32)=2.44, p < 0.10]. Post-hoc

comparisons indicated that HCTZ and HF caused a significant decrease in potassium levels

when compared to CT group (Table 3). In addition, positive correlation was found between

the potassium and magnesium levels (r = 0.62, p < 0.05).

Lipid peroxidation levels

Two-way ANOVA of LPO levels revealed a significant diet x HCTZ interaction

[F(3, 32)=45,93, p < 0.05]. Post-hoc comparisons indicated that HCTZ caused a significant

increase in hepatic TBARS levels that was higher in the HF + HCTZ (4.0 g/kg) group (Table

4) than in the corresponding CT group.

Protein carbonyl group content

No significant difference was observed in PCO levels in liver of animals (Table 4, p

> 0.05).

Vitamin C levels

Two way ANOVA revealed that the intake of the HF diet [F(1,32)=50.96, p < 0.05]

and HCTZ treatment [F(3,32)=21.16, p < 0.05] caused a significant increase in the vitamin C

levels in liver of animals. However, the increase was proportionally higher in the HF groups

treated simultaneously with HCTZ as evidenced by a significant interaction diet x HCTZ

treatment [F(3,32)=8.85, p < 0.05] (Table 4). No significant difference was observed in

vitamin C levels in plasma of animals (Table 4, p > 0.05).

Discussion

It has been shown that long-term consumption of HF diet as well as HCTZ

treatment are important factors for the appearance of some metabolic changes related to

hyperglycemia. In this way, in the present study we observed that HF supplemented with

HCTZ caused an increase in blood glucose levels and, that HF diet, associated or not with

HCTZ, enhanced the fructosamine levels, which are compatible with the development of

hyperglycemic state. Thus, we can observe that the experimental model, with certain

limitations, mimics the epidemiological data from literature and may indicate that

simultaneous ingestion of high fat diets and the use of thiazides as diuretics for the treatment

of hypertension could potentiate the adverse effects of this class of drug.

Literature data have reported that chronic intake of a HF diet (Folmer et al. 2003) as

well as the hyperglycemia condition is linked to oxidative stress generation (Maiese et al.

2007, Lopes et al. 2008). However, data about the potential facilitating effects of HCTZ on

these parameters in animal models are scarce or lacking in literature. In this context, we

observed that chronic HF consumption caused a significant increase in hepatic TBARS levels

that was potentialized by HCTZ treatment. The fact that PCO levels were not modified

indicates that the hepatic oxidative stress caused by HCTZ chronic intake was more restricted

to biomembranes than proteins. In this way, HF diet produced an increase in glucose and

fructosamine that triggered oxidative stress in hepatic tissue which was potentiated by HCTZ.

In general, the non enzymatic glycation of proteins generates highly reactive products that

could explain the relationship between hyperglycemia and lipid peroxidation (Lopes et al.

2008).

Another aspect that must be considered is that the treatment with HCTZ alone or in

combination with HF diet increased vitamin C levels; a fact that could have occurred as a

mechanism of protection against lipid peroxidation. Accordingly, an increase on the

antioxidant defense systems has been observed in a variety of experimental models of

pathologies possibily as a compensatory response of the tissues to the presence of oxidative

insults (Barbosa et al. 2006, 2008).

It has been suggested that the depletion of potassium levels by thiazide is likely to

have a role in impaired glucose metabolism (Rowe et al. 1980) and, that potassium

supplementation can attenuate glucose intolerance induced by thiazides (Helderman et al.

1983). Intracellular magnesium also seems to play a key role in modulating glucose uptake

(Barbagallo et al. 2003, Sontia and Touyz 2007). In fact, studies have evidenced a

relationship between low magnesium levels with metabolic diseases such as type 2 diabetes

mellitus, hypertension (Ma et al. 1995, Sontia and Touyz 2007) and with increased levels of

free radical dependent-oxidative tissue damage (Lourdes 1998, Gums 2004). Accordingly,

here we found a significant decrease in plasmatic magnesium and potassium levels as well as

an increase in hepatic lipid peroxidation in rats fed with HF diet, associated or not with

HCTZ. It is important to emphasize that the association of the HF diet with HCTZ (4.0 g/kg

of diet) potentiated magnesium depletion and increased lipid peroxidation. Moreover, it has

been reported that a diet rich in saturated fats hinders magnesium absorption (Johnson 2001).

In this context, we suggest that someone who eats a diet with high fat content may present

loss of magnesium and potassium; a fact that may contribute to diabetes and oxidative stress

development. Furthermore, the use of HCTZ by these patients may accelerate the

development of diabetes and its complications. In this vein, the results here presented may

indicate that magnesium and potassium play an important role in the adverse effects of

HCTZ. Besides, the association of HCTZ and HF diet caused additional loss of magnesium,

which may indicate that this element has a more fundamental role in HCTZ toxicity than

potassium. Since biochemical changes were exacerbated by the combined consumption of

HCTZ and HF diet, we can suppose that magnesium loss may have a central role in the

adverse effects of HCTZ associated with high fat intake in rats. These results are in

agreement with literature which indicates that intracellular magnesium plays a central role in

glucose metabolism (Paolisso and Barbagallo 1997, Barbagallo 2000, 2001, 2003, 2007). Of

particular importance, epidemiological studies have indicated that type 2 diabetes and

hypertension can be associated with lowered intracellular magnesium (Paolisso and

Barbagallo 1997, Barbagallo et al. 2000, 2001).

Conclusion

The data presented in this study show that the chronic intake of HCTZ or HF diet

causes metabolic changes related to glucose homeostasis and that the association of the HF

diet with HCTZ treatment can exarcebate some of these biochemical alterations. Besides, we

can suggest that our experimental model can be used to study the adverse effects of HCTZ.

Furthermore, in view of the fact that HF ingestion aggravated the effects of HCTZ, it would

be important to investigate whether the incidence of type 2 diabetes by use of HCTZ is more

frequent in hypertensive patients who eat diets with high levels fat.

Acknowledgements

The financial support by FINEP Research Grant ‘‘Rede Instituto Brasileiro de

Neurociência (IBN-Net)’’ # 01.06.0842-00, FAPERGS, CAPES/SAUX, VITAE Fundation

and CNPq is gratefully acknowledged. J.B.T.R. is the recipient of CNPq fellowships.

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Figure legends

Figure 1A: Effect of control diet supplemented with hydrochlorothiazide on body weight.

Data are expressed as means ± S.E.M. of five animals.

Figure 1B: Effect of high fat diet supplemented with hydrochlorothiazide on body weight.

Data are expressed as means ± S.E.M. of five animals. * Denoted p < 0.05 as compared to

the HF group. (ANOVA/Duncan, p < 0.05).

Figure 1A

Figure 1B

Table 1: Composition of the diets (g/kg).

Components High fat diet Control diet

Sucrose 200 200

Cornstarch - 280

Casein 180 180

Albumin 22 22

Lard 280 -

Soybean Oil 20 20

Bone's flour 60 60

Wheat bran 188 188

Mineral mixture

40 40

Vitamin mixture

10 10

The mineral mixture contained (g/kg): bone meal (449); NaCl (38); KCl (134.2); MgSO

(20); ZnCl

(0.4); CuSO

(0.175); MnSO

(1.2); FeSO

(2), and cornstarch (355).

The vitamin mixture (mg or IU/g) was composed of Vitamin A, 2000 IU; Vitamin D 200

IU; tocopherol, 10 IU; menadione, 0.5 mg; choline, 200 mg; folic acid, 0.2 mg; p-

aminobenzoic acid, 1.0 mg; inositol, 10 mg; calcium D-panthotenate, 4.0 mg; riboflavin,

0.8 mg; thiamin-HCl, 0.5 mg; pyridoxine-HCl, 0.5 mg; niacinamide, 0.3 mg; and biotin,

0.04.

Table 2: Effect of hydrochlorothiazide associated with control or high fat diet on body weight, organ weight and total adipose tissue deposits weight.

CT + HCTZ

(0.4 g/kg)

CT + HCTZ

(1.0 g/kg)

CT + HCTZ

(4.0 g/kg)

HF + HCTZ

(0.4 g/kg)

HF + HCTZ

(1.0 g/kg)

HF + HCTZ

(4.0 g/kg)

Initial body

weight (g)

270.0±0.8 276.6±3.9 268.0±12.4 273.0±12.4 266.0±0.8 261.0±6.6 259.0±19.5 269.6±14.4

Final body

weight (g)

418.6±17.3

a,b

399.0±10.2

a,b

383.0±18.5

a,b

353.0±21.9

a,c

444.2±17.3

384.6±22.1

a,b

397.0±31.3

a,b

298.6±39.1

Body weight

gain (g)

148.5±16.4

a,b

122.5±7.9

a,b

115.0±26.2

a,b

80.0±14.1

a,c

178.2±17.7

123.5±15.5

a,b

138.0±35.6

a,b

29.0±28.3

Liver (g)

11.2±0.2

11.2±0.4 10.3±0.5 10.7±0.8 11.3±0.3 11.6±0.5 10.8±1.3 10.0±0.5

Total adipose

tissue

deposits (g)

5.1±0.1

5.6±0.1

5.1±0.2

4.2±0.4

5.4±0.3

5.6±0.1

5.1±0.1

4.8±0.1

The total weight of perirenal, mesenteric, epididymal and subcutaneous fat-pads.

Data are expressed as means ± S.E.M. of five animals.

abc

Mean values within a row not sharing a common superscript letter were significantly different, p < 0.05.

Table 3: Effect of hydrochlorothiazide associated with control or high fat diet on biochemical parameters.

CT + HCTZ

(0.4 g/kg)

CT + HCTZ

(1.0 g/kg)

CT + HCTZ

(4.0 g/kg)

HF + HCTZ

(0.4 g/kg)

HF + HCTZ

(1.0 g/kg)

HF + HCTZ

(4.0 g/kg)

Glucose *

70.8±0.5

70.8±13.1

90.0±8.3

a,b

89.2±5.8

a,b

76.6±4.8

95.8±10.0

a,b

119.2±11.2

114.0±14.4

Fructosamine **

0.99±0.13

1.0±0.01

1.1±0.02

1.0±0.07

1.62±0.07

1.32±0.06

1.43±0.04

1.40±0.2

Magnesium *

1.4±0.13

1.3±0.06

a,b

1.1±0.02

b,c,d

1.1±0.04

b,c,d

1.2±0.11

b,c

1.0±0.08

c,d

0.9±0.03

0.9±0.04

Potassium *

6.8±0.16 5.2±0.22

5.2±0.29

5.3±0.38

5.3±0.12

4.7±0.28

4.5±0.21

4.8±0.11

Data are expressed as means ± S.E.M. of five animals.

abcd

Mean values within a row not sharing a common superscript letter were significantly different, p < 0.05.

* Data of glucose, magnesium and potassium levels are presented as mg/dL.

** Data of fructosamine levels are presented as mmol/L.

Table 4: Effect of hydrochlorothiazide associated with control or high fat diet on TBARS, PCO and vitamin C levels.

CT+ HCTZ

(0.4 g/kg)

CT+ HCTZ

(1.0 g/kg)

CT + HCTZ

(4.0 g/kg)

HF + HCTZ

(0.4 g/kg)

HF + HCTZ

(1.0 g/kg)

HF + HCTZ

(4.0 g/kg)

TBARS *

Liver

68.7±0.9

75.2±0.2

b,c

77.4±0.3

73.3±0.7

75.1±0.4

b,c

75.3±1.6

b,c

76.0±1.2

b,c

90.5±0.1

Protein

carbonylation **

Liver

23.2±1.3

18.8±2.3

20.1±0.6

20.7±2.4

17.7±1.0

19.1±0.7

19.1±0.4

19.5±1.0

Vitamin C

Liver

Plasma

498.0±20.0

5.3±0.8

717.6±32.4

b,c

5.8±0.2

721.1±55.7

b,c

5.5±0.8

696.0±50.9

5.4±0.4

684.0±17.4

5.9±0.4

811.4±69.1

b,c

7.1±0.6

842.8±59.7

7.0±0.2

1198.8±15.6

6.0±0.5

Data are expressed as means ± S.E.M. of five animals.

abcd

Mean values within a row not sharing a common superscript letter were significantly different, p < 0.05.

* TBARS is expressed as nmol/g tissue. TBARS: Thiobarbituric acid reactive substances.

** Protein carbonylation is expressed as nmol/mg protein.

Vitamin C is expressed as µg ascorbic acid/g tissue.

CAPÍTULO 3 – Manuscrito 2.

Diphenyl diselenide supplementation reduces biochemical alterations associated to

oxidative stress in rats fed with fructose and hydrochlorothiazide

Marinei Cristina Pereira Ribeiro, Roger Monteiro, Daiana Silva Ávila, Nilda Berenice de

Vargas Barbosa, Viviane Patrícia Pires Schiar, Danúbia Bonfanti dos Santos, Marta Maria

Medeiros Frescura Duarte, Robson Puntel e João Batista Teixeira Rocha.

Submetido à Chemico-Biological Interactions

Diphenyl diselenide supplementation reduces biochemical alterations

associated to oxidative stress in rats fed with fructose and

hydrochlorothiazide

Marinei Cristina Pereira Ribeiroa,b *, Roger Monteirob, Daiana Silva Ávila

, Nilda

Berenice de Vargas Barbosa

, Viviane Patrícia Pires Schiar

, Danúbia Bonfanti dos Santos

Marta Maria Medeiros Frescura Duarte

, Robson Puntel

and João Batista Teixeira Rocha

Hospital Universitário de Santa Maria,

Universidade Federal de Santa Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brasil

Departamento de Química, Centro de Ciências Naturais e Exatas,

Universidade Federal de Santa Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brasil

Universidade Federal do Pampa, Campus Uruguaiana,

97500-970, Uruguaiana, RS, Brasil

* Corresponding author: Marinei Cristina Pereira Ribeiro or João Batista Teixeira da Rocha

Hospital Universitário de Santa Maria

Universidade Federal de Santa Maria

97105-900 Santa Maria, RS, Brazil

Tel.: +55 55 3220 8513, fax: +55 55 3220 8005

e-mail: mcp[email protected] or [email protected]

ABSTRACT

High fructose diets have been associated with oxidative stress, insulin resistance and

metabolic syndrome development. Thiazides, such as hydrochlorothiazide (HCTZ), are

frequently used by patients with these disorders for the treatment of hypertension; however

they also can exacerbate metabolic disturbances. This study evaluated whether dietary

diphenyl diselenide (PhSe)

, a simple synthetic organoselenium compound with antioxidant

properties, could reduce the biochemical alterations induced by chronic consumption of

diets enriched with fructose and/or HCTZ. Rats were fed with a control diet (CT) or with a

high fructose diet (HFD), both supplemented with HCTZ (4.0 g/kg) and/or (PhSe)

(3 ppm)

for 18 weeks. HFD diet caused a significant increase in the levels of glucose, fructosamine,

triglycerides and cholesterol of animals, which were not restored to control levels by

(PhSe)

supplementation or potentiated by HCTZ. However, the levels of cholesterol and

triglycerides were lower in the groups that received HFD or HCTZ diet supplemented with

(PhSe)

. The ingestion of HCTZ caused a decrease in hepatic catalase (CAT) and renal

superoxide dismutase (SOD) activities, which were restored by (PhSe)

supplementation. In

liver, (PhSe)

was also effective in increasing vitamin C levels reduced by HFD and HFD

plus HCTZ intake. Indeed, the compound increased

per se

hepatic and renal SOD activity

and reduced the oxidation of the lipids and proteins caused by HCTZ associated or not with

HFD intake. Furthermore, the association between HFD and HCTZ caused a decrease in

potassium levels and aggravated the hypomagnesemia and the hypertriglyceridemia HCTZ-

induced. Our findings suggest that some biochemical changes can be aggravated by

ingestion simultaneous of HCTZ and HFD diet. In addition, our data also demonstrate that

(PhSe)

supplementation reduces metabolic disorders linked to oxidative stress and that this

compound can be considered a promising agent for treatment of metabolic disturbances

HFD and HCTZ-induced, via its antioxidant properties.

Keywords: High fructose diet, hydrochlorothiazide, diphenyl diselenide, oxidative stress.

1. INTRODUCTION

High fructose diets have been commonly used in animal models to induce metabolic

changes as those observed in metabolic syndrome, a disorder characterized by insulin

resistance, hypertension and dyslipidemia, which are risk factors for cardiovascular

diseases and type 2 diabetes mellitus [1,2]. The origin and mechanisms involved on

detrimental consequences fructose-induced in animal models are not completely

established; however, there are points of evidence that chronic fructose feeding is

associated with oxidative damage [3]. In line with this, literature data indicate that high

fructose intake can decrease antioxidant defenses and cause an overproduction of reactive

oxygen species (ROS) [4,5].

Hydrochlorothiazide (HCTZ) is a diuretic, representative of the benzothiadiazine

class of sulfonamide derivatives, usually known as thiazides [6]. The use of HCTZ is

beneficial to patients with hypertension because it reduces both morbidity and mortality

process [7,8]. In fact, this diuretic prevents strokes, myocardial infarction and congestive

heart failure by its blood pressure-lowering efficacy [7-9]. Consequently, thiazides are

frequently recommended as the first-line therapy for hypertension [8]. However, HCTZ can

cause several adverse effects, such as electrolyte disorders (hypokalemia, hyponatremia,

and hypomagnesemia), hyperlipidemia, and impairment of glucose metabolism [10-12].

Moreover, these adverse effects can result in the development or exacerbation of metabolic

syndrome and type 2 diabetes, since many patients with hypertension have metabolic

disturbances [13].

Selenium is a nutritionally essential trace element to mammals [14,15]. Importantly,

selenium plays a crucial role as an integral component of several enzymes with antioxidant

properties, including glutathione peroxidase isoforms [16-18]. In addition, its deficiency

has been linked to an increase in the incidence of cardiovascular diseases, immune

dysfunctions, cancer, diabetes and metabolic abnormalities [14,15,19]. Of particular

importance, literature reports have indicated that some selenium compounds can attenuate

diabetes complications via its insulin-mimetic and anti-glycating properties [20,21].

Furthermore, selenium compounds have been documented as pharmacological agents in

insulin sensitivity dysfunctions and vascular degenerative lesions in both experimental and

clinical diabetes [22,23].

The interest on chemistry and biochemistry of organoselenium compounds have

increased in the last three decades mainly due the antioxidant activity exhibited by several

selenium organic forms [16]. In this context, diphenyl diselenide (PhSe)

, the simplest of

the synthetic diaryl diselenides, has glutathione peroxidase-like activity and other

antioxidant properties [24]. Importantly, this compound also displays neuroprotective, anti-

nociceptive, anti-hipercolesterolemic and anti-inflammatory activities in different

experimental models of human pathologies [16,25-29]. Regarding to metabolic disorders,

recent data from our group have demonstrated that chronic treatment with (PhSe)

reduces

hyperglycemia and biochemical changes associated to oxidative stress in streptozotocin-

treated rats [26,30]. However, the effect of (PhSe)

in metabolic disturbances induced by

other factors as diets enriched with carbohydrates and/or by HCTZ treatment is not

available in literature. Hence, the present study was designed to evaluate whether (PhSe)

supplementation could prevent or reduce biochemical alterations caused by fructose and\or

HCTZ intake. Furthermore, we were interested to know whether thiazides consumption

could exacerbate these features, since metabolic disorders are common in patients with

hypertension.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Chemicals

Casein (technical grade), coomassie brilliant blue G, 2,4-dinitrophenylhydrazine,

HCl, sodium sulphate dodecyl, heptane, acetate, ethanol, malondialdehyde (MDA) and

thiobarbituric acid (TBA) were obtained from Sigma, (St. Louis, MO., USA). Mono and

dibasic potassium phosphate, acetic acid, ascorbic acid, ortho-phosphoric acid, tris buffer

(tris[hydroxymethyl]aminomethane), fructose and trichloroacetic acid were obtained from

Merck (Rio de Janeiro, Brazil). Diphenyl diselenide compound was synthesized by method

described by Paulmier [31]. Analysis of the

H NMR and

C NMR spectra showed

analytical and spectroscopic data in full agreement with its assigned structure. The

chemical purity of (PhSe)

(99.9%) was determined by GC/HPLC. All other chemicals

were of analytical grade and obtained from standard commercial suppliers.

2.2 Animals and diets

Adult male Wistar rats (2 months old), weighing 250-300 g were used for the

experiments. The animals were kept on a 12 h light/12 h dark cycle, in a room with the

temperature regulated to 21-25 ºC and humidity at roughly 56% with free access to food

and water. Animals were used according to the guidelines of the Committee on Care and

Use of Experimental Animal Resources of the Federal University of Santa Maria, Brazil.

Rats were fed for 18 wk and randomly divided into eight experimental groups

(n=6): (1) control (CT); (2) CT + HCTZ (4.0 g/kg); (3) CT + (PhSe)

(3 ppm); (4) CT +

HCTZ + (PhSe)

; (5) high fructose diet (HFD); (6) HFD + HCTZ; (7) HFD + (PhSe)

and

(8) HFD + HCTZ + (PhSe)

. The composition of the diets is shown in Table 1. Diphenyl

diselenide was dissolved in soybean oil and mixed in the diet with a food mixer to insure

uniform distribution. This diet provided 3 µg selenium/g of diet/per day, which is

considered acceptable amount for this element [23]. The diets were prepared weekly and

stored at 4 ºC.

2.3. Blood samples and tissue preparation

At the end of the experimental period, rats were fasted 12 h, anesthetized with ether

and sacrificed by decapitation. A blood fraction was collected without anticoagulant and

was centrifuged at 4000 × g for 10 min to yield serum samples that were used for

fructosamine, total cholesterol, triglycerides, magnesium, potassium, urea and creatinine

determination. A parallel blood fraction was collected in tubes with sodium fluoride to

determine glucose concentration.

The samples of the tissues were quickly removed, rinsed with saline, weighted,

placed on ice and homogenized in 10 volumes (w/v) in cold 50 mM Tris-HCl pH 7.4. The

homogenate was centrifuged at 4000 x g at 4ºC for 10 min to yield low-speed supernatant

fraction (S1) that was used for biochemical assays, except for measurement of protein

carbonylation, which was determined in samples of the homogenates. In addition, adipose

tissue deposit (total weight of perirenal, mesenteric, epididymal and subcutaneous fat-pads)

content was also determined.

2.4. Measurements

Food and water consumption were measured daily at the same time (9:00 to 10:00

h). The body weights were determined once a week.

2.5. Biochemical analysis

Plasma glucose concentration was measured as previously described by Bergmeyer

[32] and fructosamine concentration was determined as described by Baker et al. [33].

Serum total cholesterol concentration was measured as previously described by Alain et al.

[34] and triglycerides concentration was measured as described by Bucolo and David [35].

The levels of magnesium were estimated according to the method of Bohuon [36] and

potassium levels were measured as previously described by Kavanagh and Mills [37]. In

addition, serum urea and creatinine were determined by method of Bergmeyer [38] and,

Yatzidis [39], respectively. The biochemical assays were done using a Johnson &

Johnson:Vitros 750XRC chemistry analyzer

2.6. Lipid peroxidation (LPO) levels

Lipid peroxidation was estimated by measuring thiobarbituric acid reactive

substances (TBARS) and expressed in terms of malondialdehyde (MDA) content,

according to the method of Ohkawa et al. [40], in which MDA, an end product of fatty acid

peroxidation, reacts with thiobarbituric acid (TBA) to form a colored complex. In brief,

samples were incubated at 100ºC for 60 min in acid medium containing 0.45% sodium

dodecyl sulfate, 1.27 mol/L acetic acid/270 mmol/L HCl, pH 3.5 and 0.8% thiobarbituric

acid. TBARS produced were measured at 532 nm and the absorbance was compared with

the standard curve using malondialdehyde.

2.7. Protein carbonyl (PCO) content

The PCO content was determined as described by method of Levine et al. [41] with

some modifications. Briefly, homogenates were diluted to 750-800 µg/mL of protein in

each sample, and 1 mL aliquots were mixed with 0.2 mL of 2,4-dinitrophenylhydrazine

(DNPH, 10 mM) or 0.2 mL HCl (2 M). After incubation at room temperature for 1h in a

dark ambient, 0.6 mL of denaturing buffer (150 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8,

containing 3% SDS), 1.8 mL of heptane (99.5%) and 1.8 mL of ethanol (99.8%) were

sequentially added, and mixed with vortex agitation for 40 sec and centrifuged for 15 min.

The protein isolated from the interface was washed two times with 1 mL of ethyl

acetate/ethanol 1:1 (v/v) and suspended in 1 mL of denaturing buffer. Each DNPH sample

was read at 370 nm in a spectrophotometer against the corresponding HCl sample (blank),

and total carbonylation calculated using a molar extinction coefficient of 22,000M

-1

Protein was measured by method of Bradford [42] using bovine serum albumin as standard.

2.8. Vitamin C levels

Hepatic and renal vitamin C (ascorbic acid) levels were determined by method of

Jacques-Silva et al. [43]. Proteins of liver and kidney were precipitated with 1 vol. of a cold

10% trichloroacetic acid followed by centrifugation. An aliquot of 300 µL of the

supernatants were mixed with 2,4-dinitrophenylhydrazine (4.5 mg/mL), CuSO

(0.075

mg/mL) and trichloroacetic acid 13.3% (final volume 1 mL) and incubated for 3 h at 37ºC.

Then 1 mL of H

65% (v/v) was added to the medium. Ascorbic acid levels were

measured spectrophotometrically at 520 nm and calculated using a standard curve (1.5-4.5

µmol/L ascorbic acid freshly prepared in sulfuric acid).

2.9. Catalase (CAT) activity

The measurement of CAT activity from liver and kidney was determined as

described by method of Aebi [44]. Samples of S1 from liver and kidney were added to a

cuvette and the reaction was started by the addition of 70 µL of freshly prepared 300 mM

in phosphate buffer (50 mM, pH 7.0; total volume of incubation: 1 mL). The rate of

decomposition was measured spectrophotometrically at 240 nm during 120 s. One

unit of the enzyme is considered as the amount of enzyme which decomposes 1 µmol

/min at pH 7.0.

2.10. Superoxide dismutase (SOD) activity

Hepatic and renal SOD activity in S1 was determined as described by Misra and

Fridovich [45]. This method is based on the capacity of SOD in inhibiting autoxidation of

adrenaline to adrenochrome. The color reaction was measured at 480 nm. One unit of

enzyme was defined as the amount of enzyme required to inhibit the rate of epinephrine

autoxidation by 50% at 26°C. The S1 was diluted 1:10 (v/v) for determination of SOD

activity in the test day. Aliquots of supernatant were added in a glycine buffer 50 mM pH

10.3. Enzymatic reaction was started by adding of epinephrine. One unit of enzyme was

defined as the amount of enzyme required to inhibit the rate of epinephrine autoxidation by

50% at 26°C. The enzymatic activity was expressed as Units U/mg protein.

2.11. Statistical analysis

All values obtained are expressed as mean ± standard error. Data were analyzed by

one-way, two-way or three-way ANOVA analysis of variance, followed by Duncan’s

multiple range tests when appropriate. Differences between groups were considered to be

significant when p < 0.05.

3. RESULTS

3.1. Body weight, organ weight and total adipose tissue deposits weight

The data of table 2 show that the intake of HFD, HCTZ or (PhSe)

alone did not

modify neither body weight gain nor final body weight of the rats when compared to

control group (Table 2, p > 0.05). On the other hand, three-way ANOVA (2 diets (CT or

HFD) x 2 (CT or HCTZ) x 2 (CT or (PhSe)

) revealed significant HCTZ x HFD interaction,

indicating that HCTZ plus HFD caused a reduction in final body weight (Table 2, p < 0.05).

The consumption of (PhSe)

diet caused a significant increase in the organ weight

for liver and kidney when compared to control group (Table 2, p < 0.05).

HCTZ caused

per se

a significant reduction in total adipose tissue deposits weight

when compared to control group (Table 2, p < 0.05), that were not restored by (PhSe)

supplementation or modified in HCTZ plus HFD group.

3.2. Water and food consumption

Water consumption of animals fed with HFD or HCTZ alone was significantly

greater than animals fed with control diet (Table 3, p < 0.05). Moreover, three-way

ANOVA (2 diets (CT or HFD) x 2 (CT or HCTZ) x 2 (CT or (PhSe)

) revealed significant

HCTZ x HFD interaction (Table 3, p < 0.05), showing that HCTZ and HFD caused a

increase in water consumption. The animals supplemented with HFD diet also had a

significant reduction in food consumption when compared to control groups (Table 3, p <

0.05).

3.3. Blood glucose and fructosamine levels

The results of table 4 demonstrate that HCTZ and (PhSe)

intake did not change the

levels of glucose and fructosamine of rats. Different, HFD consumption caused a

significant increase in blood glucose and fructosamine contents of animals when compared

to values found in control group (Table 4, p < 0.05). However, (PhSe)

supplementation

was not effective in restoring the levels of glucose and fructosamine enhanced by HFD

intake (Table 4, p > 0.05).

3.4. Total cholesterol and triglycerides levels

The animals fed with HFD diets had a significant increase in total cholesterol levels

when compared to values found in control group (Table 4, p < 0.05). Statistical analysis

revealed again that the intake of HCTZ and HFD diets caused a significant increase in the

levels of triglycerides and that this enhance was proportionally higher in the HFD groups.

The data of table 4 also demonstrate that triglycerides and cholesterol levels were lower in

the groups that received HFD and HCTZ diet supplemented with (PhSe)

3.5. Magnesium and potassium levels

HCTZ intake caused a significant decrease in magnesium levels, which were not

prevented by (PhSe)

supplementation when compared to control group (Table 4, p < 0.05).

Furthermore, the reduction in magnesium levels HCTZ-induced was higher in the groups

that received HCTZ associated to HFD. However, in this reduction in the magnesium levels

did not modify by (PhSe)

supplementation. Similarly, the animals fed with HCTZ plus

HFD had an decrease in the content of potassium, which were not prevented by (PhSe)

supplementation when compared to values found in control group (Table 4, p < 0.05). In

these parameters, three-way ANOVA (2 diets (CT or HFD) x 2 (CT or HCTZ) x 2 (CT or

(PhSe)

) revealed a significant HCTZ x HFD interaction (Table 4, p < 0.05), indicating that

HCTZ plus HFD caused a reduction in magnesium and potassium levels. Of particular

importance, negative correlations were found between the magnesium and glucose levels (r

= - 0.18, p < 0.05); magnesium and fructosamine levels (r = - 0.09, p < 0.05), as well as

potassium and glucose levels (r = - 0.18, p < 0.05) and between potassium and

fructosamine levels (r = - 0.05, p < 0.05). Indeed, positive correlation was found between

the potassium and magnesium levels (r = 0.42, p < 0.05).

3.6. Urea and creatinine levels

No significant difference was observed in the levels of urea and creatinine of groups

(Table 4, p > 0.05).

3.7. Lipid peroxidation (LPO) levels

HFD, HCTZ and HFD plus HCTZ intake caused a significant increase on hepatic

and renal lipid peroxidation (Fig. 1A and 1B). Moreover, three-way ANOVA of LPO levels

in liver and kidney revealed a significant HFD x HCTZ interaction (p < 0.05). In both

tissues, (PhSe)

supplementation was effective in reducing the LPO induced by

consumption of HFD plus HCTZ diet (Fig. 1A and 1B, p < 0.05).

3.8. Protein carbonyl content

HCTZ, HFD and HCTZ plus HFD intake caused a significant increase in hepatic

and renal protein oxidation (Fig. 2A and 2B, p < 0.05), which were restored to control

levels by (PhSe)

supplementation (Fig. 2A and 2B, p < 0.05).

3.9. Vitamin C levels

The data of figure 3A show that HCTZ, HFD and HCTZ plus HFD intake caused a

significant decrease in hepatic vitamin C levels, which were restored to control levels by

(PhSe)

supplementation only in HFD-fed rats (Fig. 3A, p < 0.05). In liver, three-way

ANOVA of vitamin C levels revealed a significant HFD x HCTZ interaction (p < 0.05).

Contrary, no significant difference was observed in renal vitamin C content between groups

(Fig. 3B, p > 0.05).

3.10. Catalase and SOD activities

HCTZ and HCTZ plus HFD diet caused a significant reduction in hepatic catalase

activity that was restored to control levels by (PhSe)

supplementation (Fig. 4A, p < 0.05).

Different, no change was observed in renal catalase activity of groups (Fig. 4B, p > 0.05).

The consumption of HCTZ, HFD or HCTZ plus HFD did not modify hepatic SOD

activity (Fig. 5A, p < 0.05). On the other hand, all groups supplemented with (PhSe)

had

an increase in SOD activity of liver. In kidney, HCTZ alone or associated to HFD caused a

significant decrease in renal SOD activity of rats that was restored to control values by

(PhSe)

supplementation (Fig. 5B, p < 0.05).

4. DISCUSSION

Thiazide diuretics are frequently used in patients with metabolic disorders as well as

in type 2 diabetes for treatment of hypertension. However, the chronic use of thiazides also

may exacerbate theses metabolic alterations [7-13]. Indeed, literature data have reported

that long-term consumption of HFD as well as HCTZ treatment are important factors for

the appearance of some metabolic changes related to type 2 diabetes [46-49]. According, in

the present study we observe that HFD intake, associated or not with HCTZ, increased

glucose, fructosamine, total cholesterol and triglycerides levels, which are factors related

with the development of insulin resistance. Thus, we can suggest that the experimental

protocol used in this work, with certain limitations, mimics the epidemiological data from

literature and may indicate that simultaneous ingestion of HFD and thiazides as diuretics

for the treatment of hypertension potentiates the adverse effects of this class of drug.

It has been suggested that the oxidative stress is partly responsible for metabolic

disorders induced by diets enriched with carbohydrates and that antioxidants are potential

therapeutic agents by preventing or reducing the oxidative damage [46-49]. In this way,

numerous studies have showed that selenium supplementation increase antioxidant

defenses; decrease lipid peroxidation levels and up-regulated mRNA expression for

antioxidant enzymes in patient and animal diabetics [50-52]. In line with this, our results

showed that (PhSe)

supplementation provided a protective effect against the alterations in

antioxidant defenses induced by HFD and HCTZ intake. In fact, the long-term (PhSe)

intake restored the decrease in hepatic vitamin C levels caused by association between

HCTZ and HFD as well as reduced the lipids and proteins oxidation in liver and kidney of

animals fed with HCTZ associated or not with HFD. Indeed, (PhSe)

dietary was able on

reversing the reduction in CAT (liver) and SOD activities (kidney) HCTZ-induced. The

antioxidant potential of (PhSe)

can be explained, at least in part, by its glutathione

peroxidase-like activity [24]. Interestingly, this compound increased

per se

hepatic and

renal SOD activity.

Another point that we have observed was that (PhSe)

intake did not attenuate the

increase of glycemia induced by HFD consumption. The lack of anti-hyperglycemic

activity of compound in this protocol model can be related with the route used. This

hypothesis is supported by studies showing that chronic administration of (PhSe)

, via

subcutaneous, promotes a significant decrease in plasma glucose levels of streptozotocin-

induced diabetic rats [26].

The chronic intakes of an HFD as well as hyperglycemia condition are linked to

oxidative stress generation and increased levels of ROS with the development of insulin

resistance [3,4,53]. In this context, fructose is considered a potent agent involved in the

glycoxidation process, therefore may intensify oxidative stress [54]. In general, the

nonenzymatic glycation of proteins has been postulated to explain the relationship between

hyperglycemia and oxidant events as lipid peroxidation [55]. This process generates

radicals and highly reactive oxidants from the glycated proteins under physiologic

conditions [55]. However, data about the potential facilitating effects of HCTZ in

promoting insulin resistance and oxidative stress in animal models is scarce or lacking in

literature. Regarding to, our results suggest that HFD associated or not with HCTZ elevates

glucose and fructosamine levels, which can trigger oxidative damage in hepatic and renal

tissues, since TBARS and protein carbonylation were enhanced in these tissues.

It has been showed that long-term treatment with thiazide diuretics may impair

glucose tolerance and decrease insulin sensitivity and thereby accelerate the development

of diabetes mellitus [56]. In addition, diuretic therapy has been associated with increases in

serum total cholesterol and LDL-cholesterol of up to 10% of baseline levels. Moreover,

triglyceride concentrations can increase by 5% to 15% [57]. Different, here we observed an

increase in the total cholesterol levels only when HCTZ was associated with HFD in rats.

Furthermore, our results demonstrated that HCTZ caused an increase in triglycerides levels

that was aggravated by association between HFD and HCTZ. Moreover, (PhSe)

intake

attenuated the increase of triglycerides and cholesterol levels caused by HFD or HCTZ

intake.

It is important to emphasize that HCTZ caused a decrease in magnesium levels and

that the association between HFD and HCTZ aggravated the hypomagnesemia condition.

Through these data we can suggest that hypertensive patients that use HCTZ and eat a diet

with high fructose content may present loss of magnesium, a fact that may contribute to

metabolic disorders and oxidative stress development. Furthermore, the use of HCTZ by

these patients could precipitate further the onset of diabetes and its complications. In fact,

several studies suggest that intracellular magnesium may play a key role in modulating

insulin-mediated glucose uptake and vascular tone [58,59]. Accordingly, points of evidence

indicate an association between low magnesium levels and metabolic diseases, including

the type 2 diabetes mellitus, hypertension [58,59] and increased free radical dependent-

oxidative tissue damage [59]. In addition, has been reported that hypokalemia may be an

important factor in hyperglycemia, hyperinsulinemia, and insulin resistance in patients

receiving HCTZ, because these features can be restored with potassium supplements [13].

Our results also show that potassium depletion is significantly associated with exacerbation

of hyperglycemia as well as hypomagnesemia. Thus, we can suggest that the model

experimental developed in this work can be used for further studies regarding HCTZ

toxicity, as well as to clarify the role of magnesium and potassium in insulin resistance

associated with HCTZ treatment and high fructose ingestion. Besides, this model may also

allow the investigations whether the incidence of metabolic disturbances as well as type 2

diabetes HCTC-induced is more frequent in hypertensive patients who eat diets with high

fructose content. Indeed we suggest that the reduction in electrolytes is related with HCTZ,

since the animals treated with fructose or (PhSe)

did not show these changes.

5. CONCLUSIONS

In conclusion, the results obtained in this study suggest that some biochemical

changes can be aggravated by ingestion simultaneous of HCTZ and HFD diet. In addition,

our data demonstrate that (PhSe)

supplementation reduces metabolic disorders linked to

oxidative stress and that this compound can be considered a promising agent for treatment

of metabolic disturbances by antioxidant therapy. Nevertheless, it will be important to

determine whether similar protection can be provided by this way in humans.

Acknowledgements

The financial support by FINEP Research Grant ‘‘Rede Instituto Brasileiro de

Neurociência (IBN-Net)’’ # 01.06.0842-00, FAPERGS, CAPES/SAUX, VITAE Fundation

and CNPq is gratefully acknowledged. J.B.T.R. is the recipient of CNPq fellowships.

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Figures legends

Figure 1. Thiobarbituric acid-reactive species content in the liver (A) and kidney (B) of

diphenyl diselenide-fed rats associated to fructose and HCTZ intake. Data are expressed as

means ± SEM of six animals.

abcd

Mean values that do not share a common superscript

letter were significantly different, p < 0.05 (ANOVA/Duncan). CT, control; HFD, high

fructose diet; HCTZ, hydrochlorothiazide; Se, diphenyl diselenide; MDA,

malondialdehyde.

Figure 2. Protein carbonylation levels in the liver (A) and kidney (B) of diphenyl

diselenide-fed rats associated to fructose and HCTZ intake. Data are expressed as means ±

SEM of six animals.

abc

Mean values that do not share a common superscript letter were

significantly different, p < 0.05 (ANOVA/Duncan). CT, control; HFD, high fructose diet;

HCTZ, hydrochlorothiazide; Se, diphenyl diselenide.

Figure 3. Vitamin C levels in the liver (A) and kidney (B) of diphenyl diselenide-fed rats

associated to fructose and HCTZ intake. Data are expressed as means ± SEM of six

animals.

abcd

Mean values that do not share a common superscript letter were significantly

different, p < 0.05 (ANOVA/Duncan). CT, control; HFD, high fructose diet; HCTZ,

hydrochlorothiazide; Se, diphenyl diselenide.

Figure 4. Catalase activity in the liver (A) and kidney (B) of diphenyl diselenide-fed rats

associated to fructose and HCTZ intake. Data are expressed as means ± SEM of six

animals.

Mean values that do not share a common superscript letter were significantly

different, p < 0.05 (ANOVA/Duncan). CT, control; HFD, high fructose diet; HCTZ,

hydrochlorothiazide; Se, diphenyl diselenide.

Figure 5. Superoxide dismutase activity in the liver (A) and kidney (B) of diphenyl

diselenide-fed rats associated to fructose and HCTZ intake. Data are expressed as means ±

SEM of six animals.

abc

Mean values that do not share a common superscript letter were

significantly different, p < 0.05 (ANOVA/Duncan). CT, control; HFD, high fructose diet;

HCTZ, hydrochlorothiazide; Se, diphenyl diselenide.

Figures

100

101

102

103

104

Tables

Table 1 - Composition of the diets (g/kg)

Components

Control diet

Diet enriched with fructose

Fructose - 600

Casein 150 150

Soybean Oil 50 50

Lard 50 50

Wheat flour 105 105

Cornstarch 600 -

Mineral mixture

35 35

Vitamin mixture

10 10

The mineral mixture contained (g/kg): bone meal (449); NaCl (38); KCl (134.2); MgSO

(20); ZnCl

(0.4); CuSO

(0.175); MnSO

(1.2); FeSO

(2), and cornstarch (355).

The vitamin mixture (mg or IU/g) was composed of Vitamin A, 2000 IU; Vitamin D 200

IU; tocopherol, 10 IU; menadione, 0.5 mg; choline, 200 mg; folic acid, 0.2 mg; p-

aminobenzoic acid, 1.0 mg; inositol, 10 mg; calcium D-panthotenate, 4.0 mg; riboflavin, 0.8

mg; thiamin-HCl, 0.5 mg; pyridoxine-HCl, 0.5 mg; niacinamide, 0.3 mg; and biotin, 0.04.

Diphenyl diselenide (3 ppm) was dissolved in soybean oil and mixed in the diet in a food

mixer to insure uniform distribution.

Wheat flour (4g/kg of diet) was substituted by HCTZ.

105

Table 2. Body weight, organ weight and total adipose tissue deposits (g) changes in diphenyl diselenide-fed rats associated to fructose and HCTZ

intake.

Groups

Parameters

Control

HCTZ

Se + HCTZ

HFD

HFD + HCTZ

HFD + Se

HFD + HCTZ +Se

Initial body

weight

254.0±18.4

259.3±19.8

254.7±17.4

258.7±19.0

264.0±11.8

256.7±15.6

251.3±21.2

257.3±18.6

Final body

weight

357.3±13.1 a

359.3±5.1 a

355.3±3.6 a

340.0±17.2 a

330.7±8.8 a,b

271.3±2.2 c

306.3±10.3 b

277.3±8.4 c

Body weight

gain

103.3±31.2 a

100.0±17.2 a

100.7±20.7 a

81.3±29.7 a,b

66.7±6.6 a,b,c

14.7±13.5 c

54.7±10.9 a,b,c

20.0±24.0 b,c

Liver

8.8±0.3 a,b

8.9±0.2 a,b

10.5±0.1 c

8.6±0.2 a,b

8.9±0.2 a,b

8.2±0.2 a

8.9±0.3 a,b

9.2±0.4 b

Kidney

2.0±0.03 a,b

1.9±0.03 a

2.3±0.04 d

2.1±0.06 b,c

2.2±0.02 b,c,d

2.1±0.02 b,c

2.2±0.05 c,d

2.3±0.03 d

Total adipose

tissue

deposits

6.7±0.3 a

4.6±0.1 b,c

5.9±0.8 a,b

5.3±0.7 a,b,c

5.9±0.4 a,b

3.7±0.6 c

5.2±0.7 a,b,c

4.2±0.7 b,c

Data are expressed as means ± S.E.M. of six animals per group.

abcd

Mean values within a row not sharing a common superscript letter were significantly different, p < 0.05.

The total weight of perirenal, mesenteric, epididymal and subcutaneous fat-pads.

106

Table 3. Water and food consumption (months) changes in diphenyl diselenide-fed rats associated to fructose and HCTZ intake.

Groups

Parameters

Control

HCTZ

HCTZ + Se

HFD

HFD + HCTZ

HFD + Se

HFD + HCTZ + Se

Water

consumption

15.1±1.6

23.9±1.3 a,b

21.9±1.3 a

22.9±0.9 a

23.7±1.4 a

31.8±1.3 c

31.0±2.3 b,c

35.6±1.7 c

14.6±1.1

21.6±1.3 a

22.7±1.3 a

22.9±2.1 a

18.5±0.3

23.8±1.7 a,b

22.7±1.5 a

20.9±1.9 a

26.3±1.5 a

33.9±0.8 c

28.6±1.8 b,c

31.7±1.4 b,c

23.9±1.1 a

35.4±0.9 c

33.9±1.9 c

32.9±2.5 b,c

25.7±2.1 a

27.5±2.0 b

27.9±1.6 b

29.2±2.3 b

22.9±1.9 a

26.4±0.8 b

29.9±2.0 b,c

29.5±0.5 b

Food

consumption

22.9±0.9 a

18.9±0.9 a

19.3±0.7

16.9±0.9

22.2±0.5 a

20.6±0.8 a

18.7±1.0

16.6±0.9

22.9±0.8 a

20.4±0.9 a

18.4±0.7

17.4±0.9

21.0±0.8 a

20.9±0.8 a

18.5±0.6

15.5±0.6

12.9±0.8 b

12.9±0.6 b

12.9±0.4 a

11.7±0.6 a

11.3±0.6 b,c

12.4±0.5 b,c

12.7±0.6 a

10.5±0.4 a

11.2±0.6 b,c

12.3±0.7 b,c

11.5±0.4 a

11.1±0.4 a

10.8±0.6 c

10.7±0.5 c

12.2±0.6 a

10.9±0.5 a

Data are expressed as means ± S.E.M. of six animals per group.

abc

Mean values within a row not sharing a common superscript letter were significantly different, p < 0.05.

Data of water and food consumption are presented as months.

107

Table 4. Effect of diphenyl diselenide supplementation on biochemical parameters associated to fructose and HCTZ intake.

Groups

Parameters

Control

HCTZ

HCTZ + Se

HFD

HFD + HCTZ

HFD + Se

HFD + HCTZ + Se

Glucose

84.4±1.5 a

84.3±0.8 a

85.6±0.3 a,b

89.2±2.9 a,b,c

92.0±3.2 c

93.3±1.1 c

91.0±2.9 b,c

93.2±0.4 c

Fructosamine

100.7±0.9 a

98.5±0.8 a

97.2±3.1 a

102.5±4.1 a,b

113.0±1.3 c

108.5±1.6 b,c

107.8±2.4 b,c

108.5±0.5 b,c

Cholesterol

94.3±1.2 a

91.2±2.2 a

89.7±3.4 a

88.3±3.0 a

151.3±3.3 c

102.3±1.4 b

101.2±2.1 b

101.7±0.4 b

Triglycerides

86.3±1.9 a

110.0±1.2 b,c

96.0±7.7 a,b

103.0±4.8 a,b,c

144.7±3.1 d

141.7±9.1 d

117.7±0.3 c

140.8±9.5 d

Magnesium

2.6±0.12 a

2.1±0.06 b,c,d

2.4±0.10 a,b

2.1±0.08 c,d

2.6±0.15 a

1.6±0.03 e

2.3±0.07 b,c

1.9±0.05 d

Potassium

6.9±0.20

6.8±0.07

6.7±0.21

6.9±0.16

5.8±0.55 a

6.7±0.10

5.6±0.47 a

Urea

48.3±0.3

49.7±1.0

44.6±3.7

45.2±3.1

49.7±2.5

44.0±1.2

44.2±1.4

44.4±0.4

Creatinine

0.8±0.02

0.7±0.01

0.9±0.07

0.7±0.05

0.9±0.03

0.7±0.06

0.8±0.04

Data are expressed as means ± S.E.M. of six animals per group.

abcd

Mean values within a row not sharing a common superscript letter were significantly different, p < 0.05.

Data of glucose, fructosamine, cholesterol, triglycerides, magnesium, potassium, urea and creatinine levels are presented as mg/dL.

108

DISCUSSÃO

O consumo crônico de dietas hiperlipídicas e/ou hiperglicídicas (Folmer et al., 2002;

Folmer et al., 2003; Brito et al., 2007; Faure et al., 2007), assim como o tratamento com o

anti-hipertensivo, HCTZ (Pepine & Cooper-DeHoff, 2004) são fatores importantes para o

aparecimento de algumas alterações metabólicas relacionadas ao DM tipo 2. A partir dessas

evidências, associou-se a HCTZ com modelos de distúrbios metabólicos relacionados ao

desenvolvimento de DM tipo 2 induzidos pelas dietas hiperlipídicas e hiperglicídicas, uma

vez que essas desordens metabólicas são comuns em pacientes com hipertensão e, portanto

seria importante determinar se os diuréticos tiazídicos poderiam exacerbar esses alterações

metabólicas. Dessa maneira, um dos objetivos desta pesquisa foi avaliar o efeito de uma

dieta hiperlipídica suplementada com diferentes concentrações de hidroclorotiazida, em

ratos, com a intenção de investigar uma possível interação sinérgica desses dois fatores de

risco para o desenvolvimento do DM tipo 2 sobre os parâmetros bioquímicos relacionados

ao estresse oxidativo. Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que altas doses de

HCTZ associadas com dietas hiperlipídicas causaram um aumento nos níveis de glicose

sangüínea (artigo 1 e manuscrito 1), e que a dieta hiperlipídica, associada ou não com a

HCTZ, aumentou os níveis de frutosamina (manuscrito 1), fatos que são compatíveis com o

desenvolvimento de resistência à insulina. Então, pode-se sugerir que a ingestão simultânea

de dietas hiperlipídicas e o uso de HCTZ como diurético para o tratamento da hipertensão

pode potencializar o aumento da glicemia causada por essa classe de drogas. O mecanismo

pelo qual os diuréticos tiazídicos induzem aumento na glicemia e intolerância à glicose não

está bem esclarecido. No entanto, algumas evidências da literatura sugerem esses diuréticos

109

causam uma redução na secreção de insulina pelas células β do pâncreas e uma diminuição

na sensibilidade à insulina pelos tecidos (Grossman & Messerli, 2006).

Há estudos que relatam que os diuréticos tiazídicos, em doses baixas e médias, são

eficazes na redução da pressão sanguínea e causam mínimos efeitos colaterais. Porém,

quando a dose é aumentada, uma pequena contribuição é observada em relação ao controle

da pressão arterial, enquanto é significativo o aumento de efeitos colaterais (Pepine &

Cooper-DeHoff, 2004; Zee et al., 2005; Grossman & Messerli, 2006). De fato, trabalhos

prévios indicaram uma clara correlação entre a dose de HCTZ e o aumento nas

concentrações de glicemia em jejum (Carlsen et al., 1990) e, que a HCTZ, em dose média

de 40 mg/dia, causou hiperglicemia (Pollare, 1989). Recentes dados têm indicado que o

tratamento prolongado de pacientes hipertensos com uma dose baixa de HCTZ (12,5

mg/dia) melhora a elasticidade arterial, mas não em pacientes com DM tipo 2 ou com

glicemia de jejum alterada. Além disso, esses estudos demonstraram que o tratamento com

uma dose de 25 mg/dia de HCTZ agravou os parâmetros metabólicos e a rigidez arterial

(Zimlichman et al., 2004). De acordo com essas considerações, as doses testadas nesse

trabalho foram maiores do que aquelas, comumente, utilizadas para o tratamento da

hipertensão, no entanto, são inferiores às do Nível sem Efeito Adverso Observado

(NOAEL) para HCTZ em ratos (George et al., 1995) e pode indicar que uma extrapolação

direta de doses tóxicas de ratos para humanos não é possível.

Dados da literatura têm relatado que a ingestão crônica de uma dieta hiperlipídica

(Folmer et al., 2003; Fachineto et al., 2005), bem como a hiperglicemia estão ligados à

produção de estresse oxidativo e que o aumento dos níveis de EROs estão envolvidas no

desenvolvimento de resistência à insulina (Folmer et al., 2002; Aksoy et al., 2003; Brito et

110

al., 2007; Maiese et al., 2007) e neuropatia diabética (McCall, 1992; Greene et al., 1999;

Baydas et al., 2003; Baydas et al., 2004). Entretanto, dados sobre os efeitos da HCTZ na

promoção da resistência à insulina e estresse oxidativo em modelos animais são raros na

literatura.

Vários pesquisadores relataram que as EROs podem causar degeneração celular,

especialmente no cérebro (Baydas et al., 2003; Baydas et al., 2004), uma vez que é

particularmente vulnerável ao estresse oxidativo, devido à sua limitada capacidade

antioxidante (Shulman et al., 2004). Por outro lado, o fígado é o órgão que apresenta papel

central na modulação da homeostase da glicose (Maiese et al., 2007). Assim, estudos

demonstraram que o dano hepático induzido pelas EROs pode prejudicar a homeostase

celular e potencializar as características da Síndrome Metabólica (Kohen & Nyska, 2002;

Raval et al., 2006). Em nosso trabalho, constatou-se que o consumo crônico da dieta

hiperlipídica produziu um aumento na glicose (artigo 1 e manuscrito1) e na frutosamina

(manuscrito 1), as quais provocaram estresse oxidativo nos tecidos cerebral e hepático,

evidenciado pelo aumento dos níveis de peroxidação, estes que foram exacerbados pelo

tratamento com HCTZ (artigo 1 e manuscrito 1). Em consonância com este resultado,

dados da literatura têm indicado que a hiperglicemia provoca uma excessiva glicação não

enzimática de proteínas, com acentuada inativação de enzimas, aumento na peroxidação

lipídica e alterações no sistema de defesa antioxidante (Morgan et al., 2002; Aksoy et al.,

2003). Em geral, a glicação não enzimática de proteínas gera produtos altamente reativos,

fato que poderia explicar a relação entre a hiperglicemia e a peroxidação lipídica (Lopes et

al., 2008).

Neste estudo, observou-se um significativo aumento nos níveis de vitamina C, no

tecido hepático e cerebral, dos ratos alimentados com doses elevadas de HCTZ, quando

111

foram administradas isoladamente ou em combinação com a dieta hiperlipídica (artigo 1 e

manuscrito 1). Da mesma forma, os níveis de grupos tiol não-protéico (NPSH) foram

aumentados em animais tratados com 1,0 e 4,0 g/kg de HCTZ e o aumento foi,

proporcionalmente, maior nos ratos alimentados com a dieta hiperlipídica (artigo 1). De

acordo com esses resultados, um aumento nos sistemas de defesa antioxidante foi

observado em uma variedade de modelos experimentais de patologias, possivelmente como

uma resposta compensatória dos tecidos à presença de danos oxidativos (Barbosa et al.,

2006; Barbosa et al., 2008).

Neste estudo, observou-se uma inibição significativa da atividade da Na

-K

ATPase no cérebro dos animais tratados com altas doses de HCTZ. A inibição dessa

enzima induzida pela HCTZ pode estar associada a um aumento no estresse oxidativo, o

qual pode acelerar a desnaturação da Na

-K

-ATPase (Thevenod & Friedmann, 1999). De

fato, os grupos -SH da enzima são altamente suscetíveis ao estresse oxidativo (Yufu et al.,

1993) e a agentes oxidantes (Carfagna et al., 1996). Além disso, os dados obtidos nesse

estudo indicaram uma interação entre os efeitos da dieta hiperlipídica e da HCTZ na

atividade da Na

-K

-ATPase no cérebro. Assim, torna-se razoável sugerir que simultânea

ingestão de uma dieta hiperlipídica com o co-tratamento com HCTZ pode causar efeitos

pró-oxidativos adicionais a este órgão com inibição da atividade da Na

-K

-ATPase. No

entanto, mais estudos são necessários para entender o mecanismo envolvido nos efeitos

interativos da dieta e hidroclorotiazida na atividade da Na

-ATPase. A significativa

correlação positiva entre o TBARS cerebral e a glicemia, assim como a correlação negativa

entre Na

-K

-ATPase e níveis de glicose sanguínea podem indicar um papel potencial para

a hiperglicemia, pelo menos em parte, nas alterações neuroquímicas após a exposição à

HCTZ e/ou uma dieta hiperlipídica (artigo 1).

112

Há evidências de que a diminuição dos níveis de potássio causada pelos diuréticos

tiazídicos pode ter um papel importante no metabolismo da glicose (Rowe et al., 1980), e

que uma dieta suplementada com potássio pode atenuar a intolerância à glicose induzida

pelas tiazidas (Helderman et al., 1983). Neste contexto, o magnésio intracelular, também

parece desempenhar um papel fundamental no metabolismo da glicose (Paolisso &

Barbagallo, 1997; Barbagallo et al., 2000; Barbagallo et al., 2001; Barbagallo et al., 2003,

Barbagallo & Dominguez, 2007; Sontia & Touyz 2007), uma vez que estudos

epidemiológicos têm indicado que as doenças metabólicas, tais como o DM tipo 2 e a

hipertensão podem ser associados com a redução do magnésio intracelular (Ma et al., 1995;

Paolisso & Barbagallo, 1997; Barbagallo et al., 2000; Barbagallo et al., 2001; Sontia &

Touyz, 2007) e aumento no dano oxidativo em vários tecidos (Lourdes, 1998; Gums,

2004). Assim, os dados obtidos no manuscrito 1 mostram uma diminuição significativa nos

níveis de magnésio e potássio plasmáticos, bem como um aumento na peroxidação lipídica

hepática em ratos alimentados com uma dieta hiperlipídica associada ou não à HCTZ. É

importante ressaltar que a associação da dieta hiperlipídica com a HCTZ (4,0 g/kg de

ração) potencializou a depleção de magnésio e aumentou a peroxidação lipídica. Então,

considerando que as dietas suplementadas com gorduras saturadas dificultam a absorção de

magnésio (Johnson, 2001), sugere-se que indivíduos que ingerem uma dieta suplementada

com lipídios do tipo saturado podem apresentar perda de magnésio e potássio, fato que

pode contribuir para o desenvolvimento de diabetes e estresse oxidativo. Nesse sentido, os

resultados apresentados nesse trabalho podem indicar que o magnésio e o potássio

desempenham um papel importante nos efeitos adversos da HCTZ e, uma vez que as

alterações bioquímicas foram exacerbadas pelo consumo combinado de HCTZ com uma

dieta hiperlipídica, pode-se supor que a perda de magnésio pode ter um papel central nos

113

efeitos adversos da hidroclorotiazida associada com a ingestão de dietas hiperlipídicas em

ratos.

Enfim, os dados apresentados no artigo 1 e no manuscrito 1, indicam que a ingestão

crônica de doses elevadas de HCTZ ou dieta hiperlipídica provoca alterações metabólicas

relacionadas com a homeostase da glicose e com o estresse oxidativo no tecido cerebral e

hepático. Além disso, os resultados também sugerem que a associação da dieta hiperlipídica

com o tratamento com HCTZ pode exacerbar algumas destas alterações bioquímicas.

Assim, podemos sugerir que o nosso modelo experimental pode ser usado para o estudo dos

efeitos adversos da HCTZ.

Atualmente, tem sido intensa a procura por compostos naturais ou sintéticos

efetivos no tratamento da diabetes e suas complicações. Assim, compostos com

propriedades antioxidantes e hipoglicemiantes são usados com relativo sucesso no controle

da hiperglicemia e do estresse oxidativo. Nesse contexto, nas últimas três décadas, os

estudos químicos e bioquímicos dos compostos de selênio têm aumentado, principalmente

devido ao fato de que uma variedade de formas orgânicas de selênio possui atividade

antioxidante (Andersson et al., 1994; Nogueira et al., 2004). Similarmente, a suplementação

com formas inorgânicas de selênio como o selenito e selenato de sódio, são bastante usadas

no tratamento de pacientes e de animais com diabetes por apresentarem estas propriedades

(Berg et al., 1995; Mukherjee et al., 1998; Stapleton, 2000; Faure, 2004). Baseando-se

nestas evidências e pelo fato de que não existem dados na literatura que avaliem o efeito de

compostos de selênio sobre as alterações metabólicas induzidas por outros fatores como

dietas suplementadas com carboidratos e/ou tratamento com HCTZ, os objetivos do

manuscrito 2 foram avaliar se o (PhSe)

poderia evitar ou reduzir as alterações bioquímicas

provocadas pela ingestão de uma dieta hiperglicídica e/ou HCTZ, bem como investigar se o

114

consumo de tiazidas poderia exacerbar essas alterações, uma vez que esses distúrbios

metabólicos são comuns em pacientes com hipertensão.

Os resultados obtidos no manuscrito 2 demonstraram que a ingestão da dieta

hiperglicídica, associada ou não com a HCTZ, causou aumento na glicemia, frutosamina,

colesterol total e triglicerídios, que são fatores relacionados com o desenvolvimento da

resistência à insulina. Assim, pode-se sugerir que a ingestão simultânea de dietas

hiperglicídicas com o tratamento com tiazidas potencializa os efeitos adversos desta classe

de drogas.

Vários estudos sugerem que o estresse oxidativo é parcialmente responsável por

distúrbios metabólicos induzidos por dietas suplementadas com carboidratos e que os

antioxidantes são agentes terapêuticos efetivos para prevenir ou reduzir esse dano oxidativo

(Ho et al., 2001; Chander et al., 2004; Di Leo et al., 2004; El-Dermerdasch et al., 2005;

Miranda et al., 2006). De acordo com essas evidências, os dados obtidos no manuscrito 2

mostram um efeito protetor da suplementação com (PhSe)

contra as alterações nas defesas

antioxidantes induzidas pela dieta hiperglicídica e pelo tratamento com a HCTZ. De fato, o

(PhSe)

restaurou a diminuição dos níveis de vitamina C hepática causada pela associação

entre HCTZ e dieta hiperglicídica, bem como reduziu a oxidação de lipídios e proteínas no

fígado e rins de animais tratados com HCTZ associada ou não com a dieta hiperglicídica.

Além disso, o (PhSe)

foi capaz de reverter a redução das atividades da catalase (fígado) e

da superóxido dismutase (SOD) (rim) induzidas pela HCTZ. De particular importância, este

composto também causou um aumentou

per se

na atividade da SOD hepática e renal. Esses

resultados estão de acordo com outros estudos que mostram que a suplementação com

selênio aumenta as defesas antioxidantes, diminui os níveis de peroxidação lipídica e

incrementam a expressão de RNAm para as enzimas antioxidantes em pacientes diabéticos

115

e modelos animais (Naziroglu & Cay, 2001; Faure, 2003; Faure et al., 2004; El-

Dermerdasch et al., 2005). Pode-se sugerir que o potencial antioxidante do (PhSe)

pode ser

explicado, pelo menos em parte, pela sua atividade mimética a glutationa peroxidase

(Wilson et al., 1989).

Nesse trabalho (manuscrito 2) observou-se que a ingestão de (PhSe)

não atenuou o

aumento da glicemia induzida pelo consumo da dieta hiperglicídica. Portanto, sugere-se

que a falta de atividade anti-hiperglicemiante desse composto neste modelo experimental

pode estar relacionado com a via de administração utilizada, uma vez que estudos

mostrando que a administração crônica de (PhSe)

, via subcutânea, promove uma

diminuição significativa nos níveis plasmáticos de glicose em ratos diabéticos (Barbosa et

al., 2006).

A ingestão crônica de uma dieta hiperglicídica, bem como a hiperglicemia está

associada à geração de estresse oxidativo e com o desenvolvimento da resistência à insulina

(Rayssiguier et al., 1981; Rayssiguier et al., 1993; McDonald, 1995; Maiese et al., 2007).

Neste estudo, observou-se que a dieta hiperglicídica associada ou não com a HCTZ (que

provoca um efeito

per se

) elevou os níveis de glicose e frutosamina, fato que pode ter

causado danos oxidativos nos tecidos hepático e renal, uma vez que os níveis de

peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas foram aumentados nesses tecidos.

Há evidências de que o tratamento crônico com diuréticos tiazídicos pode prejudicar

a tolerância à glicose e diminuir a sensibilidade à insulina e, assim, acelerar o

desenvolvimento de DM (Bonner, 1994). Além disso, a terapia com diuréticos tem sido

associada com o aumento nos níveis de colesterol e triglicerídios. Neste trabalho, observou-

se um aumento nos níveis de colesterol total, somente quando a HCTZ foi associada com a

dieta hiperglicídica. Além disso, também foi observado um aumento nos níveis de

116

triglicerídios causado pela HCTZ, o qual foi exacerbado pela associação entre a dieta

hiperglicídica e HCTZ. Nesse aspecto, a ingestão de (PhSe)

atenuou o aumento dos

triglicerídios causados por HCTZ e o aumento dos níveis de colesterol e triglicerídios

causados pela ingestão da dieta hiperglicídica.

É importante enfatizar que a HCTZ causou uma diminuição nos níveis de magnésio

(manuscritos 1 e 2) e que a associação entre a dieta hiperglicídica e a HCTZ agravou a

condição de hipomagnesemia (manuscrito 2). Esse resultado sugere que os pacientes

hipertensos que usam HCTZ e ingerem dietas hiperlipídicas e hiperglicídicas podem

apresentar perda de magnésio, fato que pode contribuir para o desenvolvimento de

distúrbios metabólicos e dano oxidativo. Além disso, pode-se sugerir que o uso de HCTZ

por esses pacientes pode ainda precipitar o aparecimento do diabetes e suas complicações.

Os resultados dos manuscritos 1 e 2 mostram que a redução nos níveis de potássio

foi, significativamente, associada com o aumento da hiperglicemia e da hipomagnesemia,

fato que indica que os modelos experimentais desenvolvido neste trabalho podem ser usado

para o estudo dos efeitos adversos da HCTZ e para esclarecer o papel do magnésio e do

potássio na resistência à insulina associada com a ingestão de dietas hiperlipídicas ou

hiperglicídicas associadas à HCTZ. Além disso, com o uso deste modelo pode-se também

investigar se a incidência de distúrbios metabólicos como DM tipo 2, pelo uso de HCTZ é

mais freqüente em pacientes hipertensos que consomem esses tipos de dieta.

Os resultados obtidos no manuscrito 2 sugerem que algumas alterações bioquímicas

induzidas pela ingestão de dietas hiperglicídicas pode ser agravada pelo uso simultâneo de

HCTZ. Além disso, outro aspecto muito importante desse estudo foi evidenciado pela

capacidade do (PhSe)

contribuir para a prevenção das alterações metabólicas relacionadas

ao estresse oxidativo. Assim, sugere-se que este composto pode ser considerado um agente

117

promissor para o tratamento de distúrbios metabólicos pela terapia antioxidante. Baseado

nessas considerações, os resultados obtidos neste estudo contribuem para um melhor

entendimento das bases toxicológicas e farmacológicas da aplicabilidade clínica do

(PhSe)

. Neste contexto pode-se inferir que o (PhSe)

é um composto com atrativas

propriedades farmacológicas relacionada à atividade anti-diabetogênica.

118

CONCLUSÕES

De acordo com os resultados apresentados nesse trabalho pode-se concluir que:

Capítulo 1

A ingestão crônica de doses altas de HCTZ ou de uma dieta hiperlipídica altera os

índices bioquímicos de estresse oxidativo, fato que demonstra a possível contribuição do

aumento da glicemia para o dano cerebral. Além disso, o consumo de dietas hiperlipídicas e

o tratamento com HCTZ apresentam efeitos interativos no cérebro, indicando que, à longo

prazo, a ingestão crônica dessas dietas pode acentuar a toxicidade da HCTZ.

Capítulo 2

A ingestão crônica de HCTZ ou dieta hiperlipídica causa alterações metabólicas

relacionadas à homeostase da glicose e a associação entre a dieta hiperlipídica e o

tratamento com HCTZ pode exacerbar algumas dessas alterações bioquímicas. Portanto,

pode-se sugerir que este modelo experimental pode ser usado para estudos dos efeitos

toxicológicos da HCTZ.

Capítulo 3

A ingestão crônica de uma dieta hiperglicídica exacerbou algumas alterações

bioquímicas causadas pela HCTZ, nesse modelo experimental. Portanto, esse trabalho foi

validado como modelo viável para o estudo das interações entre desordens metabólicas e o

tratamento com HCTZ, droga usada para a terapia anti-hipertensiva, mas que em

determinadas concentrações e condições patológicas individuais pode causar sérios danos

119

aos pacientes. Assim, esse estudo é também importante para auxiliar a saúde e bem estar

desses pacientes. Além disso, os resultados deste trabalho sugerem que a suplementação

com (PhSe)

contribui para a prevenção e/ou redução de alterações metabólicas

relacionadas ao estresse oxidativo e, que este composto pode ser considerado um agente

promissor para o tratamento de distúrbios metabólicos pela terapia antioxidante.

120

PERSPECTIVAS

A partir dos promissores resultados obtidos nesta tese, poderíamos aprofundar ainda

mais esses estudos pela concretização dos seguintes objetivos:

- Investigar o mecanismo envolvido nos efeitos interativos das dietas hiperlipídicas

ou hiperglicídicas associadas à HCTZ nos parâmetros bioquímicos relacionados ao estresse

oxidativo.

- Investigar se a incidência de DM tipo 2, pelo uso de HCTZ é mais freqüente em

pacientes hipertensos que consomem dietas hiperlipídicas e/ou hiperglicídicas.

- Testar a HCTZ em via de administração e tempo de tratamento diferente associada

com dietas hiperlipídicas ou hiperglicídicas, a fim de investigar os efeitos toxicológicos

desse anti-hipertensivo.

- Investigar os efeitos de dietas hiperlipídicas e/ou hiperglicídicas associadas ao

tratamento com a HCTZ na população humana.

- Testar o (PhSe)

em concentrações, via de administração e tempo de tratamento

diferentes, a fim de comparar a sua efetividade e estabelecer uma dose/resposta.

- Procurar identificar o metabólito responsável pelo efeito farmacológico do

(PhSe)

, uma vez que a via de administração modifica a eficácia do tratamento.

- Testar outros compostos orgânicos de selênio com o propósito de desenvolvimento

de novos fármacos com ação antioxidantes para o uso na terapêutica de alterações

metabólicas relacionadas à DM (e talvez de outras doenças que envolvam espécies reativas

de oxigênio e nitrogênio).

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148

LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO

Figura 1: Estrutura química da hidroclorotiazida.

Figura 2: Estrutura química do disseleneto de difenila.

ARTIGO 1

Figura 1: Effect of co-treatment with hydrochlorothiazide and control or high fat diet on

glucose blood levels.

Figura 2: Thiobarbituric acid reactive substance levels in rats co-treated with

hydrochlorothiazide and with control or high fat diets.

Figura 3: Vitamin C levels in rats co-treated with hydrochlorothiazide and with control or

high fat diets.

Figura 4: Non-protein thiol groups levels in rats co-treated with hydrochlorothiazide and

with control or high fat diets.

Figura 5: Effect of co-treatment with hydrochlorothiazide and with control or high fat diet

on Na

-K

-ATPase activity.

MANUSCRITO 1

Figura 1A: Effect of control diet supplemented with hydrochlorothiazide on body weight.

Figura 1B: Effect of high fat diet supplemented with hydrochlorothiazide on body weight.

149

MANUSCRITO 2

Figura 1: Thiobarbituric acid-reactive species content in the liver (A) and kidney (B) of

diphenyl diselenide-fed rats associated to fructose and HCTZ intake.

Figura 2: Protein carbonylation levels in the liver (A) and kidney (B) of diphenyl

diselenide-fed rats associated to fructose and HCTZ intake.

Figura 3: Vitamin C levels in the liver (A) and kidney (B) of diphenyl diselenide-fed rats

associated to fructose and HCTZ intake.

Figura 4. Catalase activity in the liver (A) and kidney (B) of diphenyl diselenide-fed rats

associated to fructose and HCTZ intake.

Figura 5. Superoxide dismutase activity in the liver (A) and kidney (B) of diphenyl

diselenide-fed rats associated to fructose and HCTZ intake.

150

LISTA DE TABELAS

ARTIGO 1

Tabela 1: Composition of the diets (g/kg).

MANUSCRITO 1

Tabela 1: Composition of the diets (g/kg).

Tabela 2: Effect of hydrochlorothiazide associated with control or high fat diet on body

weight, organ weight and total adipose tissue deposits weight.

Tabela 3: Effect of hydrochlorothiazide associated with control or high fat diet on

biochemical parameters.

Tabela 4: Effect of hydrochlorothiazide associated with control or high fat diet on TBARS,

PCO and vitamin C levels.

MANUSCRITO 2

Tabela 1: Composition of the diets (g/kg).

Tabela 2: Effect of hydrochlorothiazide associated with control or high fructose diet on

body weight, organ weight and total adipose tissue deposits weight.

Tabela 3: Effect of hydrochlorothiazide associated with control or high fructose diet on

biochemical parameters.

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