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L
ÍRIO
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ESCO
C
ULTURAS
N
ODULARES E
M
ICROPROPAGAÇÃO DE
B
ROMÉLIAS
N
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ATA
A
TLÂNTICA
(Billbergia zebrina e
Vriesea reitzii):
B
ASES PARA A
C
ONSERVAÇÃO E
P
ROPAGAÇÃO
M
ASSAL
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Recursos Genéticos Vegetais
da Universidade Federal de Santa Catarina
como parte dos requisitos necessários para
obtenção do título de Doutor em Ciências,
área de concentração em Recursos
Genéticos Vegetais.
Orientador: Prof. Dr. Miguel Pedro Guerra
Florianópolis
2010
U
NIVERSIDADE
F
EDERAL DE
S
ANTA
C
ATARINA
P
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EITORIA DE
P
ESQUISA E
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RADUACÃO
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C
IÊNCIAS
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GRÁRIAS
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ROGRAMA DE
P
ÓS
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RADUAÇÃO EM
R
ECURSOS
G
ENÉTICOS
V
EGETAIS
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ii
Catalogação na fonte elaborada pela biblioteca
da Universidade Federal de Santa Catarina
D136c Dal Vesco, Lirio Luiz
Culturas nodulares e micropropagação de
bromélias nativas da Mata Atlântica (Billbergia
zebrina e Vriesea reitzii): Bases para a conservação
e propagação massal
/Lirio Luiz Dal Vesco; orientador Miguel Pedro
Guerra.- Florianópolis, 2010.
91 p.: il., grafs, tabs.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Santa
Catarina, Centro de Ciencias Agrárias, Programa de
Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais
Inclui bibliografia.
1. Bromeliaceae – Micropropagação e Conservação.
2. Brotos adventícios. 3. Cultura nodular. 4.
Diversidade (Genética). 5. Histologia. 6.
Microscopia Eletrônica de Varredura. 7. TM - 1998.
I. Guerra, Miguel Pedro. II. Universidade Federal de
Santa Catarina – Programa de Pós-Graduação em
Recursos Genéticos Vegetais. III.Título.
CDU: 635.9
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iii
CULTURAS NODULARES E MICROPROPAGAÇÃO DE BROMÉLIAS
NATIVAS DA MATA ATLÂNTICA (Billbergia zebrina e Vriesea reitzii):
BASES PARA A CONSERVAÇÃO E PROPAGAÇÃO MASSAL
por
Lírio Luiz Dal Vesco
Tese julgada e aprovada em 23/04/2010. em sua forma final, pelo
Orientador e Membros da Comissão Examinadora, para obtenção do
título de Doutor em Ciências, Área de Concentração Recursos Genéticos
Vegetais, no Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos
Vegetais, CC/UFSC
BANCA EXAMINADORA:
____________________________ ____________________________
Prof. Dr. Miguel Pedro Guerra Dr. Gilmar Roberto Zaffari
Presidente e Orientador (CCA/UFSC) Membro (EPAGRI )
___________________________ __________________________
Profa. Dra. Rosete Pescador Prof. Dr. Aparecido Lima da Silva
Membro (FURB ) Membro (CCA/UFSC)
___________________________ __________________________
Prof. Dr. Rubens Onofre Nodari Prof. Dr. Maurício Sedrez dos Reis
Membro (CCA/UFSC) Coordenador do Programa
Florianópolis, abril de 2010
iv
“Vivemos neste mundo para nos esforçarmos em
aprender sempre, para nos esclarecermos uns aos outros por
meio das trocas de idéias, e para nos aplicarmos a ir sempre
mais longe às ciências e nas artes.”
WOLFGANG AMADEUS MOZART
(1756-1791)
À
CATARINA,
EMANUELA,
ANDRÉ LUIZ E
AMADEUS.
Dedico
v
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais
(PG-RGV) da Universidade Federal de Santa Catarina, pela oportunidade de
realização do Doutorado.
Ao Prof. Dr. Miguel Pedro Guerra pela orientação, pela oportunidade
e confiança na realização deste trabalho, por sua compreensão, paciência e
amizade desfrutada por todo esse período.
Aos pesquisadores e atualmente professores da UNIPAMPA Dr.
Valdir M. Stefenon (São Gabriel-RS) e Dr. Leocir Welter (Itaqui-RS) pelas
orientações e apoio no desenvolvimento das técnicas do marcador AFLP e
na realização das análises MegaBACE.
Aos professores e amigos do Depto. de Fitotecnia, especialmente os
Professores Aparecido Lima da Silva, Rubens O. Nodari e Maurício Sedrez
dos Reis pela oportunidade da formação.
A Professora. Dra. Marisa Santos do Depto. de Botânica pelos
ensinamentos e apoio as análises histológicas.
Aos técnicos do LFDGV Maria Luisa e Marcelo (anteriores) e a
recém chegada no LFDGV Bióloga Camila Martins.
Aos meus colegas de laboratório LFDGV, Aline, Ana, Camila
Cordeiro, Carol, Clarissa, Cristina, Francine, Gustavo, Josiane, Leila, Lin,
Maria Luiza, Paulo, Ramon, Sarah, Vitor e Yohan.
A técnica Eliana Medeiros do LCME da UFSC pelo auxílio às
análises no MEV.
A Bernadete Ribas, secretaria do Programa de Pós-Graduação em
Recursos Genéticos Vegetais/UFSC, pela paciência e pelo apoio constante.
A CAPES e ao CNPq, pelos apoios financeiros nas concessões das
bolsas, permitindo o desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus familiares, pelo apoio e incentivo constantes durante o
curso: de coração, à minha esposa Cati, eterna amiga e companheira,
zelando da família e apoiando de múltiplas formas; a minha filha Emanuela
e meus filhos André Luiz e Amadeus, por existirem e oportunidade de
participarem desta família, ser minha alegria, minha luz e que nela devo
caminhar; à minha Sogra Terezinha e meus cunhados Cleide e Minga pelo
acolhimento, dedicação, orientação e constante apoio na manutenção da
harmonia e bom convívio da vida familiar; aos meus pais, pela oportunidade
de estar aqui e pela educação e formação.
A Deus e aos bons espíritos, pela inspiração, oportunidade e
proteção. Pela saúde, excelente família e amigos que tive a felicidade
conviver e de encontrar nesse período.
Por fim, a todos que participaram direta ou indiretamente para a
realização desse trabalho.
vi
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas ......................................................................vii
RESUMO...........................................................................................viii
1. INTRODUÇÃO ...............................................................................1
2. HIPÓTESE.....................................................................................9
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................10
5. CAPÍTULO 1..................................................................................15
Indução de brotos adventícios em larga escala de Billbergia zebrina a
partir de culturas nodulares: implicações na propagação massal e
conservação.....................................................................................15
RESUMO....................................................................................15
ABSTRACT ................................................................................16
INTRODUÇÃO ............................................................................17
MATERIAL E MÉTODOS.............................................................18
RESULTADOS ............................................................................22
DISCUSSÃO ...............................................................................30
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................37
6. CAPÍTULO 2..................................................................................41
Indução de culturas nodulares e regeneração in vitro de microbrotos em
Vriesea reitzii a partir de explantes foliares e sementes..................41
RESUMO....................................................................................41
ABSTRACT ................................................................................42
INTRODUÇÃO ............................................................................43
MATERIAL E MÉTODOS.............................................................45
RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................48
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................64
7. CAPÍTULO 3 .................................................................................68
Morfogênese in vitro e regeneração de brotos adventícios em grande
escala a partir de culturas nodulares de Vriesea reitzii....................68
RESUMO....................................................................................68
INTRODUÇÃO ............................................................................69
MATERIAL E MÉTODOS.............................................................71
RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................74
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................85
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ..............................................................89
9. LISTA DE PUBLICAÇÕES NO PERÍODO DO DOUTORADO ...............91
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
AIA - ácido indolil-3-acético
AIB - ácido indolil-3-butírico
AFLP = polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado
(Amplified Fragment Length Polymorphism)
ANA - ácido α-naftalenoacético
ANOVA = Análise da Variância
BAP - 6-benzilaminopurina
CNs - Culturas Nodulares
CTAB – Brometo de Cetiltrimetilamônio
2-iP - N
6
(2-isopentenil) adenina
2,4-D - 2.4-ácido diclorofenoxiacético;
AG
3
- ácido Giberélico;
MS - formulação salina de Murashige & Skoog (1962);
MSB - meio MS básico
MEV - Microscopia Eletrônica de Varredura
SNK = teste Student-Newman-Keuls
TDZ - thidiazuron (N-phenyl-N'-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)
viii
RESUMO
As bromélias representam um grupo taxonômico importante sob
os prismas ecológico e econômico, ocorrendo majoritariamente no
bioma Mata Atlântica, o qual se encontra entre os mais ameaçados do
planeta. Assim, o desenvolvimento das tecnologias que utilizam
sistemas regenerativos de alta eficiência de cultivo ou de conservação de
germoplasma vegetal apresenta alto potencial de aplicação. No presente
trabalho o sistema de micropropagação baseado na indução e
desenvolvimento de culturas nodulares (CNs) foi estudado e
caracterizado a partir de segmentos nodais extraídos de brotos estiolados
em Billbergia zebrina, e a partir de sementes e de bases foliares em
Vriesea reitzi. Foi também testada à suplementação ao meio de cultura
MSB de diferentes tipos, concentrações, balanços de fitorreguladores e
submetidos a diferentes condições de cultivo, durante a indução,
regeneração e alongamento de microbrotos. Em B. zebrina, segmentos
nodais, extraídos de brotos estiolados foram cultivados em meios de
cultura MS liquido, suplementados com diferentes concentrações de
TDZ, ANA e BAP. CNs e folhas de brotações foram empregadas para
análises moleculares por meio de marcadores AFLP. O uso do meio de
cultura MS com diferentes concentrações de TDZ resultou em CNs com
diferentes morfologias e potenciais regenerativos. CNs induzidas com
TDZ (0,01 µM) e subcultivadas em meio de cultura MSB isento de
fitorreguladores apresentam alta freqüência regenerativa. CNs
originadas em meio com TDZ, (0,1 µM) quando foram subcultivadas
em MSB com ANA (2 µM) e 2-iP (4 µM) resultaram em maior número
médio de brotos adventícios por grama de CN inoculada. Brotos
alongados (>3 cm) foram aclimatizados com sucesso em ambiente in
vivo e mudas transplantadas para vasos apresentaram padrão normal da
espécie. Análises histológicas e em MEV revelaram que a indução de
CNs ocorreu a partir da região da gema do segmento nodal e
confirmaram características morfogenéticas intermediárias entre
organogênese e embriogênese somática, típico de CNs. A análise
molecular com base na técnica de AFLP revelou 88% de similaridade
dos regenerantes em relação à planta mãe, sugerindo a ocorrência de alta
diversidade. Esta diversidade pode ter aplicação em programas de
melhoramento genético ou como ferramenta eficaz em programas de
conservação desta espécie. Em V. reitzii
foram estudados os fatores
determinantes do controle da morfogênese in vitro das CNs. Os
fitorreguladores suplementados ao meio MSB inibiram a germinação
das sementes e promoveram a indução de CNs após duas semanas em
ix
cultivo. CNs induzidas em meio suplementado com ANA (4 µM) e
subcultivadas em meio MSB com ANA e 2-iP (2 µM cada)
apresentaram textura granular e alta taxa de proliferação. O cultivo
destas CNs em meio MSB suplementado com AIA (4 µM) resultou em
alto número médio de microbrotos (1.468 brotos/g de CNs). A partir do
modelo de regressão foi possível inferir que o número máximo de brotos
alongados (66,3 brotos/g) pode ser obtido com o subcultivo dos
microbrotos em meio MSB suplementado com AIA (2 µM) e AG
3
(10
µM). Em explantes foliares, em todos os meios de cultura testados
observou-se a indução de CNs a partir da região basal. Estas CNs
responderam de forma diferencial aos tratamentos em termos de
características morfogenéticas e potencial regenerativo. CNs mantidas
na presença de luz resultaram em maior produção de massa fresca e de
microbrotos em comparação com aquelas mantidas na ausência de luz.
CNs subcultivadas em meio MSB líquido e suplementado com ANA (4
µM) e 2-iP (2 µM) revelaram elevada eficiência regenerativa. A maior
eficiência regenerativa e proliferação de microbrotos foram obtidas com
o uso do meio MSB suplementado com ANA e 2-iP (2 µM cada). O
subcultivo em meio MSB suplementado com AG
3
(10 µM) promoveu
um maior alongamento de brotos e de forma sincronizada. A utilização
destes meios de cultura resultou em uma eficiência regenerativa de 12,4
g/g de CN inoculada. Estima-se, a partir disto, uma regeneração de mais
de 5.300 novos microbrotos e na fase de alongamento, uma taxa efetiva
de 75% destes microbrotos podem ser convertidos em brotos completos
a cada 10 semanas de cultivo. As análises estruturais das CNs revelaram
que os processos de indução da morfogênese e da regeneração de
microbrotos ocorrem a partir da proliferação de grupos de células
meristemáticas e que desenvolvem a formação de múltiplos meristemas
caulinares. Estas estruturas regenerativas sustentam a classificação de
CNs organogênicas. Brotos maiores do que 3,0 cm resultaram em mais
de 95% de sobrevivência ex vitro. Os resultados obtidos com as CNs de
V. reizii se configuram, com base em estudos morfohistológicos, em
uma rota regenerativa in vitro intermediária entre a organogênese e a
embriogênese somática. Esta rota apresenta elevado potencial
regenerativo para a propagação em larga escala de bromélias
ornamentais e/ou ameaçadas de extinção, como são o caso de V. reitzii e
B. zebrina.
Palavras chaves: AFLP; Bromeliaceae; Brotos adventícios; Conservação; Cultura
nodular; Diversidade Genética. Histologia; Microbrotos; Micropropagação;
Microscopia Eletrônica de Varredura; Propagação clonal.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Bioma Mata Atlântica e Importância Ecológica das bromélias
A floresta neotropical atlântica é um bioma que se estende desde
Rio Grande do Norte à 3ºS até o Rio Grande do Sul à 31ºS corresponde
a 17,4 % (1.481.946 km
2
) da superfície do Brasil (Ribeiro et al., 2009).
Este bioma é considerado de alta biodiversidade e endemismo de
espécies e está entre os 25 hotspots em riqueza e em número de espécies
do planeta, estimando-se nele a existencia de 20.000 espécies de plantas,
das quais 8.000 (40%) são endêmicas (Myers et al., 2000). Este bioma
apresenta também índices elevados de diversidade de mamíferos,
anfíbios, répteis e aves (Heywood, 1995). A magnitude e riqueza deste
bioma brasileiro são decorrentes, entre outros, da amplitude climática
incluindo regiões heterogêneas de diferente fisionomia e composição
florística (Metzger, 2009). Entretanto, é preocupante o empobrecimento
gradativo de espécies arbóreas (Silva & Tabarelli, 2000) e à persistência
da perda destes habitats e suas conexões leva em efeito cascata e numa
amplitude maior na perda da biodiversidade, sabendo que, a extensão
destes efeitos ainda é pouco compreendida (Lopes et al., 2009).
O bioma Mata Atlântica é um dos mais ameaçados do planeta.
Decorrente do avanço dos maiores centros urbanos e rurais do país este
bioma foi o que mais sofreu com perdas florestais (Silva & Tabarelli,
2000, Metzger, 2009). Na forma de fragmentos, restam apenas em torno
de 7-8 % dos remanescentes primários e menores de 100 ha (Galindo-
Leal & Câmara, 2003). Quando são incluídas as florestas secundárias as
estimativas apontam para 11,4 % a 16 % de cobertura e a atual
fragmentação deste ecossistema revela que mais de 80% dos fragmentos
de cobertura primária são inferiores a <50 ha (Ribeiro et al., 2009). Na
tentativa preservar este bioma, nas duas últimas décadas, cientistas têm
concentrado esforços para o entendimento das relações ecológicas entre
as espécies, visando à proteção dos remanescentes florestais ainda
existentes ou de sua restauração (Ribeiro et al., 2009, Rodrigues et al.,
2009).
Este bioma oferece também refúgio para muitas espécies da
família Bromeliaceae que, além da maior riqueza de espécie, abriga
populações de espécies com acentuado endemismo nas Regiões Sul e no
Sudeste do Brasil (Reitz, 1983, Martinelli, 2000). No Estado de Santa
Catarina 31 espécies de bromélias são endêmicas de um total de 137
espécies citadas por Reitz (1983), sendo, portanto, um
grupo
taxonômico de alta riqueza em diversidade genérica e específica
(Martinelli et al., 2008). A ameaça continua pela destruição e
2
fragmentação dos habitats naturais em que às mesmas ocorrem é
agravada pelo fato de a maioria delas serem epífitas.
As bromélias consistem em um subsistema ecológico complexo
que contribui para a manutenção da estabilidade dos ecossistemas
florestais em função do seu alto grau de especialização e de sua
adaptação às condições climáticas e oligotróficas extremas (Benzing,
2000; Aranda-Peres & Rodriguez, 2006). Em função de seus efeitos
ornamentais e paisagísticos, elas têm sido extraídas desordenadamente
de seus habitats naturais e comercializadas em todo o país (Coffani
Nunes, 2002).
1.2. Descrição Botânica e ocorrência
A família Bromeliaceae contém 58 gêneros e 3172 espécies e
subespécies (Luther, 2008) e mais de 50% das espécies são epífitas
(Martinelli, 2000). Todas elas são nativas do Continente Americano,
com exceção da espécie Pitcairnia feliciana, que habita a costa
ocidental da África (Reitz, 1983). Taxonomicamente as bromélias estão
divididas em três subfamílias: Pitcairnioidae, Bromelioideae e
Tillandsioidae, baseando-se em análises comparativas entre as estruturas
reprodutivas, as quais são consideradas conservativas, porque as
alterações são poucas influenciadas pelo meio ambientes,
comparativamente às estruturas vegetativas (Reitz, 1983).
Dentro da subfamília Bromelioideae encontra-se o gênero
Billbergia Thunb., com 64 espécies e 26 variedades e formas (Luther,
2008) distribuídas desde a América Central até o sul da América
Meridional (Smith & Downs 1979), sendo a Mata Atlântica o centro de
diversidade deste gênero (Barros e Costa, 2008). Já, o gênero Vriesea
pertence à subfamília Tillandsioidae contém 261 espécies e 44
variedades e formas (Luther, 2008), distribuídas nas Américas a partir
do México e Cuba até o sul do Brasil e Norte da Argentina (Smith &
Downs, 1977).
A distribuição das bromélias depende essencialmente de fatores
climáticos. Das 137 espécies de ocorrência no Estado de Santa Catarina
(Fig. 1A), Reitz (1983) observou a presença de 117 espécies (85%) na
Floresta Ombrófila Densa e Encosta Atlântica, 37 espécies (27%) no
domínio da Floresta de Ombrófila Mista (Mata de Araucária) e 11
espécies (8%) na Floresta Estacional Decidual (Floresta Decidual do Rio
Uruguai). Ao longo do litoral do Estado de Santa Catarina, dominado
pela Mata de Encosta Atlântica a temperatura e a precipitação média
anual caem 2ºC e 500 mm, respectivamente, no sentido norte-sul. Sendo
influenciados pelo macroclima, os gêneros de caráter mais tropical vão
desaparecendo do norte para o sul, à medida que a temperatura e o nível
3
de precipitação declinam. Das 117 espécies e variedades que se
encontram na região da encosta atlântica (Fig. 1B), 94 (80%) espécies
ocorrem no norte do Estado e chegam à serra de Tijucas, 62 (53%) vão
até a serra do Tabuleiro e somente 41 (35%) espécies chegam à fronteira
sul (Reitz, 1983).
Figura 1. A) Distribuição das 137 espécies de bromélias nas três diferentes regiões
fitogeográficas de SC e B) Distribuição e quantificação de bromélias no sentido
norte-sul até cada barreira geográfica da Floresta de Encosta Atlântica de SC. Fonte:
Reitz (1983).
No entanto, muitas destas espécies estão ameaçadas de extinção
em Santa Catarina, tal como, Aechmea apocalyptica Reitz, Aechmea
blumenavii Reitz, Aechmea kleinii Reitz, Aechmea pimenti-velosoi
Reitz, Billbergia alfonsi-joannis Reitz, Dyckia cabrerae L.B.Smith et
Reitz, Dyckia distachya Hassl., Dyckia ibiramensis Reitz, Vriesea
biguassuensis Reitz, Vriesea brusquensis Reitz, Vriesea muelleri Mez,
Vriesea pinottii Reitz, Vriesea triangularis Reitz (Brasil-MMA, 2008).
1.3. Conservação in vitro e sistemas de micropropagação de
Bromélias
Na conservação de germoplasma de bromélias podem ser
utilizadas diferentes estratégias que se amparam em estudos de
diversidade genética (Barbará et al., 2007, 2009), de evolução e posição
filogenética (Schulte et al., 2009), de ecologia, levantamento e
caracterização em habitat naturais (Bonnet & Queiroz, 2006; Barbará et
al., 2008), bem como, em sistemas de conservação in situ (Alves et al.,
2004, Martinelli et al., 2008) e ex situ (Pompelli & Guerra, 2004).
Técnicas de cultura de tecidos vegetais compreendem ferramentas
que podem ser empregadas para a conservação destas espécies,
notadamente aquelas ameaçadas de extinção (Guerra & Dal Vesco,
2010). Vários estudos neste sentido foram realizados com várias
espécies, entre as quais Vriesea fosteriana (Mercier & Kerbauy, 1992),
4
Vriesea hieroglyphica (Mercier & Kerbauy, 1994), Cryptanthus
sinuosus (Carneiro et al., l998 e Arrabal et al., 2002), Vriesea
friburgensis var. paludosa (Alves & Guerra, 2001), Dyckia distachia
(Pompelli & Guerra, 2004), V. gigantea e V. philippocoburgii (Droste et
al., 2005), V. Reitzii (Rech Filho et al., 2005, Alves et al., 2006) e
Tillandsia eizii (Pickens et al., 2006). Estas técnicas podem, também,
ainda possibilitar a propagação massal de bromélias com importância e
interesse ornamental, visando reduzir a pressão de coleta nos ambientes
naturais. Neste caso o emprego das técnicas de cultivo in vitro em
bromélias aumenta a taxa de multiplicação das espécies de interesse
(Aranda-Peres & Rodriguez, 2006, Guerra & Dal Vesco, 2010), quando
comparado ao sistema convencional de propagação por divisão natural
de brotações.
Como mencionado anteriormente, técnicas de cultura de tecidos
vegetais são ferramentas importantes para a conservação de
germoplasma vegetal, evidenciado pelas oportunidades que se criam
para compreender, utilizar e conservar recursos genéticos de plantas
(Withers & Williams, 1998). Métodos de conservação in vitro de plantas
baseiam-se, grosso modo, nas técnicas empregadas para a
micropropagação de plantas. As sementes são os materiais vegetais
preferidos para a propagação por permitirem a manutenção da base
genética da população original (Fay, 1992, Winkler et al., 2005, Pickens
et al., 2006, Aranda-Peres & Rodriguez, 2006, Guerra & Dal Vesco,
2010). As técnicas in vitro podem contribuir em todas as etapas do
processo de conservação de germoplasma, incluindo coleta, indexação
de doenças, quarentena, multiplicação, caracterização e avaliação,
armazenamento e distribuição de germoplasma (Withers & Williams,
1998).
O estabelecimento de protocolos e sistemas regenerativos in vitro
que podem ser aplicados tanto para a conservação quanto para a
propagação em grande escala compõem estratégias importantes em
bromélias. Alguns padrões de respostas da morfogênese in vitro, como
os observados em bromeliáceas apresentam características diferenciadas
aos sistemas regenerativos tradicionais (Guerra & Dal Vesco, 2009).
Assim, as rotas regenerativas in vitro a partir de diferentes fontes de
explantes podem ser associadas com a organogênese (Mercier &
Kerbauy, 1992), embriogênese somática (Pompelli et al., 2005), ou
culturas nodulares (Rech Filho et al., 2005, 2009; Alves et al., 2006).
Independente da rota o objetivo é a regeneração em larga escala de
brotos adventícios de bromélias (Guerra & Dal Vesco, 2010).
5
1.4. Análise da fidelidade e diversidade genética na
micropropagação
A propagação in vitro em larga escala de bromélias requer o
desenvolvimento de protocolos regenerativos associados à manutenção
da fidelidade genética dos indivíduos regenerados quando se trata de
propagação clonal. No entanto, programas de conservação ou de
melhoramento, requerem a manutenção ou obtenção de variabilidade
genética adicional, respectivamente. Independente disto, as respostas
morfogenéticas in vitro ocorrem em resposta à composição do meio de
cultura, ao adequado suprimento de fontes de carbono, ao tipo e balanço
de fitorreguladores (Ziv & Chen, 2008, Preece, 2008). O balanço
adequado dos nutrientes minerais, por exemplo, possibilita reduzir os
teores de fitorreguladores nos meios de cultura, aspecto este que
favorece a manutenção da fidelidade genética das plantas regeneradas
com a planta mãe, quando o objetivo for à multiplicação clonal (Preece,
2008).
Variação somaclonal é o termo geral utilizado para descrever as
variações geradas na cultura de tecido (Larkin & Scowcroft, 1981),
principalmente, para o sistema propagação clonal massal (biofábricas).
Convencionou-se que a propagação em sistema de biofábrica pode ser
interrompida quando forem detectados mais de 5 % de ocorrência de
variantes somaclonais (Jaligot et al., 2000). Este evento é um fenômeno
comum em culturas de tecidos de plantas in vitro, e requer um
monitoramento constante para identificar os fatores geradores de
variação. Esta fonte de variação, contudo, pode ser incorporada em
programas de melhoramento (Jain, 2001). Os principais fatores
associados com a possibilidade de variação parecem estar relacionados
com a fonte de explantes e com o tipo e a concentração dos
fitorreguladores utilizados no meio de cultura (Matthes et al., 2001). O
número de subcultivos e a idade das culturas e o genótipo de origem
também podem afetar a ocorrência da variação somaclonal (Jain, 2001).
Alem disto, para cada espécie ou variedade é necessário o
desenvolvimento de um protocolo específico para cada sistema de
cultivo in vitro (Sahijram et al., 2003).
A propagação de plantas pelos métodos indiretos, ou seja, aqueles
mediados por calos ou suspensões celulares, tanto na organogênese
quanto na embriogênese, pode resultar em maior incidência de variações
em relação à planta mãe (George & Debergh, 2008). No entanto, muitas
destas variações observadas podem ser do tipo epigenética (Peredo et
al., 2006, Preece, 2008). Entretanto, como mencionado anteriormente,
estas variações podem ser vantajosas ou desvantajosas dependendo do
6
objetivo a ser alcançado. O uso bem-sucedido dos somaclones
dependente de sua estabilidade genética nas gerações subseqüentes, para
os quais, o uso de marcadores moleculares pode ser útil como
ferramenta de monitoramento destes índices, tanto nos programas de
conservação, melhoramento ou de propagação clonal (Jain, 2001,
Stefenon et al., 2009).
As variações, normalmente identificadas em sistemas in vitro,
incluem as variações de origem: 1) epigenética, a qual envolve
mecanismos de silenciamento ou ativação de genes que não estão
relacionados às aberrações ou mudanças de seqüências gênicas (Kaepple
et al., 2000, Sahijram, et al., 2003); 2) genética, associada a mudanças
estáveis e raramente revertidas, referentes as variações na constituição
genética herdáveis ou de ploidia (Holliday, 2006), e; 3) fenotípicas, as
quais são alterações na performance e na produtividade agronômica
(Kaeppler et al., 2000) como a formação de internós curtos em
Saccharum sp. (Zucchi et al., 2002), ou morfológicas, tais como, as
variegações foliares de coloração ou quiméricas que, por exemplo,
resultam em crescimento anormal dos meristemas caulinares de Musa
spp (Sahijram, et al., 2003)
Atualmente, a biologia molecular disponibiliza ferramentas
robustas para medir a quantidade de variação genética presente na
maioria das espécies. O uso de técnicas moleculares, tal como, AFLPs,
SSRs ou microssatélite e RAPDs estão entre os métodos mais apurados
de avaliação da estabilidade genética (Jain, 2001).
O uso do marcador AFLP se baseia na amplificação de um
conjunto de fragmentos gerados pela digestão do DNA genômico por
meio das enzimas de restrição, tal como, as de corte rasos, como a
EcoRI, a qual cliva sítios específicos do DNA com 6-8 bases, e a MseI
de corte freqüente onde reconhece sítios de quatro bases. Seu potencial
de uso está relacionado ao grande número de marcadores de avaliação,
pela produção de um número elevado de fragmentos que compõe na
formação da banda. Este fator tornou o uso de AFLP um dos
procedimentos moleculares mais recomendados para a genotipagem
com vistas à estimativa da diversidade genética e à determinação de uma
identificação digital (barcode) das espécies (Vos et al., 1995, Mueller &
Wolfenbarger, 1999). Além disto, esta análise permite uma abordagem
multilocos do DNA genômico, sendo também de alta sensibilidade e
reprodutibilidade (Meudt & Clarke, 2007). Tal técnica é promissora para
estimar a diversidade genética em plantas e para uso em programas de
melhoramento quando comparado com análise de SSRs ou RFLPs
(Garcia et al., 2004) ou com RAPD (Barracosa et al., 2008). Além disto,
7
permite a obtenção de forma precoce, tal como empregado no presente
estudo, o monitoramento da estabilidade ou diversidade genética das
culturas originadas do cultivo de in vitro, bem como da identificação de
variação somaclonal (Jain, 2001, Carolan et al., 2002, Polanco & Ruiz,
2002, Garcia et al., 2004, Peredo et al., 2006, Steinmacher et al., 2007,
Chuang et al., 2009, Gao et al., 2009, Mo et al., 2009).
1.5. Análise estrutural de culturas in vitro
A caracterização estrutural nas diferentes fases do
desenvolvimento das culturas in vitro é determinante para o
entendimento das rotas da morfogênese. Os estudos de análises
histológicas revelam a seqüência dos processos e o acompanhamento da
formação dos principais estádios de desenvolvimento das culturas in
vitro. Para estes estudos, geralmente, se utuliza a microscopia óptica
(MO) e eletrônica (ME). A microscopia óptica apresenta limitações
quanto ao aumento máximo atingido que fica em torno de 2.000 vezes
(Maliska, 2009.). Quando o interesse maior é obter informações
topográficas, a microscopia eletrônica de varredura (MEV) é o
instrumento mais versátil para avaliação, exame e análise das
características microestruturais de amostras biológicas e não-biológicas
(Castro et al., 2002). Além disto, a MEV, dependendo do material pode
atingir aumentos de até 900 000 vezes, mas normalmente atinge
aumentos na ordem de 10.000 vezes. Quando adaptados com detectores
de raios-X permite também, a realização de análise química na amostra
em observação (Maliska, 2009). Basicamente, as amostras devem
possuir a dimensão mínima necessária para o estudo, isto é importante,
para obter uma boa imagem (Castro et al., 2002; Maliska, 2009).
Os estudos atuais da morfogênse na cultura de tecidos que
utilizam o MEV para análises estruturais, abordam as diferentes fases de
desenvolvimento das plantas. Entre estes são registrados desde a
germinação e desenvolvimento de plântulas in vitro de Cajanus cajan
(Chandra et al., 2003), imagens das diferentes formas de emergência da
radícula durante a germinação in vitro das espécies de bromélias
Aechmea bromelifolia, A. distichantha, Vriesea hieroglyphica, V.
unilateralis, V. friburguensis e V. incurvada várias (Aranda-Peres &
Rodriguez, 2006). No desenvolvimento de gemas adventícias de T. eizii
(Pickens et al., 2006). Em Pelargonium x hortorum observou-se o
modelo regenerativo de formação de estruturas embrionárias e
formações meristemáticas a partir de explantes de hipocótilo (Madden et
al., 2005). A formação e a regeneração múltipla de gemas foram
observadas a partir de nódulos organogênicos induzidos a explantes
internodais em Humulus lupulus var. Nugget. (Fortes & Pais, 2000,
8
2001) e estudos de deposição de calose durante a formação dos nódulos
(Forte et al., 2002). Na adequação dos processos de indução da
morfogênese revelando a formação de nódulos foram registrados a partir
de explantes de hipocótilo em Eucalyptus globulus (Trindade & Pais,
2003). A partir de embriões de Pinus banksiana foi descrita uma
seqüência de desenvolvimento que culmina na formação de brotos
adventícios (Pelletier & Laliberté, 2000). Já, Giridhar et al. (2004)
registraram em imagem MEV a formação de ES no estádio lobular a
partir de explantes foliares de Decalepis hamiltonii. Estes estudos,
portanto, buscam estudar os fatores que modulam os processos
mofogenéticos das difentes culturas estabelecidas in vitro, tendo como
base para a manipulação das condições de cultivo (Ziv & Chen, 2008).
9
2. HIPÓTESE
A rota regenerativa in vitro baseada na indução, multiplicação e
desenvolvimento de culturas nodulares (CNs) de bromélias nativas da
Mata atlântica se configura em uma técnica de micropropagação de alta
eficiência para a micropropagação em larga escala de bromélias
ameaçadas de extinção e/ou de interesse ornamental.
3. Objetivos
O presente trabalho objetivou avaliar e estudar processos
alternativos de cultivo in vitro com base na indução e regeneração de
brotos adventícios a partir de culturas nodulares (CNs) de Billbergia
zebrina e Vriesea reitzii. Análises histológicas e ultraestruturais e com
marcadores AFLPs foram utilizadas, respectivamente, para caracterizar
esta rota morfogenética e para avaliar a fidelidade clonal ou não das
CNs.
3.1. Objetivos específicos
1. Avaliar o efeito do thidiazuron na indução e desenvolvimento de
CN de Billbergia zebrina e do potencial de regeneração massal de
brotos adventícios;
2. Descrever as características morfogenéticas dos sistemas de indução
de CN a partir de base foliar e de sementes de V. reitzii, e na
regeneração de brotos adventícios cultivados em diferentes meios de
cultura e combinações de fitorreguladores associados aos diferentes
ambientes de cultivo;
3. Caracterizar através de análises histológicas e de imagens em MEV
para identificar os processos da morfogênese in vitro em B. zebrina
e em V. reitzii;
4. Avaliar a similaridades das plantas do sistema regenerativo de CN
através do marcador AFLP para fins de propagação massal e de
conservação.
5. Determinar os fatores limitantes para a produção de mudas
micropropagadas em grande escala.
Os resultados referentes aos objetivos propostos são apresentados
nesta tese sob o formato de artigos científicos.
10
4.
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15
5. CAPÍTULO 1
Indução de brotos adventícios em larga escala de Billbergia zebrina a
partir de culturas nodulares: implicações na propagação massal e
conservação.
Lirio Luiz Dal Vesco
1
, Valdir Marcos Stefenon
12
, Leocir José
Welter
13
, Miguel Pedro Guerra
1
*
RESUMO
A floresta tropical atlântica é um bioma de alta diversidade de
espécies de bromélias, com alto endemismo e megadiversidade. A
exploração e ocupação desordenada deste ecossistema ameaçam parte
significativa de seus componentes. Segmentos nodais, extraídos de
brotos estiolados na ausência de luz, foram cultivados em meios MSB
liquido, suplementados com diferentes concentrações de TDZ e a
associação de ANA e BAP. Culturas nodulares induzidas em todos os
tratamentos e folhas de brotações foram empregadas como fonte de
explantes para a extração do DNA e o marcador AFLP foi utilizado para
a análise de diversidade genética. A suplementação ao meio de cultura
MS com diferentes concentrações de TDZ resultou em CNs com
diferentes morfologias e potenciais regenerativos. CNs induzidas com
0,01 µM de TDZ e subcultivadas em meio de cultura MS isento de
fitorreguladores apresentam alta freqüência regenerativa. CNs
originadas de 0,1 µM de TDZ, quando foram subcultivadas em 2 µM de
ANA e 4 µM de 2-iP promoveram maior número médio de brotos
adventícios por grama de inóculo. O subcultivo em meio de cultura
basal MS suplementado com 1 µM de ANA e 2 µM de 2-iP promoveu
uma maior altura de brotos. Brotos alongados (>3 cm) foram
aclimatizados com sucesso em ambiente in vivo e mudas transplantadas
para vasos apresentaram padrão normal da espécie. Imagens em MEV
revelaram que a indução de CN ocorre a partir da região da gema do
segmento nodal. Durante a indução, a análise histológica revelou um
processo morfológico regenerativo classificado como culturas
nodulares. Plantas regeneradas apresentaram similaridade genética
maior que 90% na análise AFLP, quando comparadas às plantas-mães,
usando o índice de Jaccard. Os resultados deste trabalho mostram que o
sistema regenerativo de brotos a partir de CN de B. zebrina apresenta-se
1
Programa de Pós- graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de
Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil.
E-mails: [email protected]; [email protected] *
Autor Correspondente.
2
Endereço Atual: Universidade Federal do Pampa/Campus São Gabriel, São Gabriel, RS,
Brasil. E-mail: valdirstefe[email protected]..
3
Endereço Atual: Universidade Federal do Pampa/Campus Itaquí, RS.
16
como modelo de estudo e pode ser empregado na conservação ou
propagação clonal. O sistema de micropropagação com base na indução
de culturas nodulares a partir de segmentos nodais de Billbergia zebrina
foi caracterizado como um sistema alternativo de cultivo in vitro.
Palavras chaves: AFLP, Bromeliáceas, brotos adventícios, cultura de tecidos,
diversidade genética, Histologia, microbrotos, propagação clonal.
Abreviatuas: AFLP - Polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado,
ANA-ácidonaftalenoacético; BAP - 6-benzilaminopurina; CNs - Culturas nodulares;
MSB – meio básico MS; 2-iP - N6 (2-isopentenil) adenina; AG
3
– acido giberélico;
MS – Murashige & Skoog (1962); MEV- microscopia eletrônica de varredura, TDZ-
thidiazuron (N-phenyl-N'-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea).
ABSTRACT
Induction of adventitious shoots in scale-up of Billbergia zebrina
derived from nodule cluster cultures: implications for mass
propagation and conservation
The Tropical Atlantic Rain Forest is a biome of high diversity and
endemism of bromeliad species. The micropropagation system based on
the induction of NCs from nodal segments of Billbergia zebrina was
characterized as an alternative system of in vitro culture. Nodal
segments extracted from etiolated shoots were cultured in liquid BM
supplemented with different PGR. Different concentrations of TDZ and
the subculture in culture medium supplemented with different levels of
NAA and 2-iP resulted in NCs with different morphologies and
regenerative potential. NCs induced with 0.01 µM of TDZ and
subcultured in BM free of PGR showed high-frequency of regeneration.
NCs originated from 0.1 µM of TDZ, when subcultured in 2 µM of
NAA and 4 µM of 2-iP promoted higher mean number of adventitious
shoots. Elongated shoots were successfully acclimatized in in vivo
environment and plantlets transferred to vases presented normal
phenotype. Hystological analyses revealed the main features of the NCs.
SEM showed that the induction of CN occured from the basal shoot
region of the nodal segment. The results of this study show that the
regenerative system of shoots from NCs of B. zebrina can be viewed as
a system model for morphogenetic studies and regenerative potential.
Molecular genetic analysis based on the AFLP technique revealed
similarity lower than 90% among regenerated plants and the “mother-
plants” suggesting the occurrence high diversity. Such diversity can be
used in breeding programs and the AFLP technique revealed to be a
powerful tool in genetic conservation programs of the species.
17
Keywords: AFLP, bromeliads, clonal propagation, genetic diversity, microshoots,
regeneration, histology, Shoot-buds, somaclonal variation, tissue culture
Abbreviations: BAP – 6- benzylaminopurine; BM – basal medium; 2-iP - N
6
(2-
isopentyl) adenine; GA
3
- Gibberellic acid; NAA - α-naphthaleneacetic acid; NCs -
nodular cultures; PGR - plant growth regulators, SEM - Scanning electron
microscopy, TDZ - thidiazuron, AFLP - amplified fragment length polymorphism.
INTRODUÇÃO
A floresta tropical atlântica é um bioma de alta biodiversidade e
endemismo, estimando-se a presença de 20.000 espécies de plantas, das
quais 8.000 (40%) são endêmicas (Myers et al., 2000). Esta floresta
apresenta também índices elevados de diversidade de mamíferos,
anfíbios, répteis e aves (Heywood, 1995). Entre os componentes de
grande importância ecológica e econômica deste bioma encontram-se as
bromélias, as quais, pela fragmentação deste ecossistema e em função de
seu valor ornamental foram, ao longo do tempo, extraídas
desordenadamente de seus habitats naturais.
As bromélias consistem em um subsistema ecológico complexo
que contribui para a manutenção da estabilidade dos ecossistemas
florestais, por apresentarem alto grau de especialização em função de
sua adaptação às condições climáticas e oligotróficas extremas (Padilha
1978; Benzing, 2000; Aranda-Peres & Rodriguez, 2006).
A família Bromeliaceae é composta por 58 gêneros e 3172
espécies e subespécies (Luther, 2008) e mais da metade delas são
epífitas (Martinelli, 2000). O gênero Billbergia Thunb., pertence a
subfamília Bromelioideae a qual compreende 64 espécies e 26
variedades e formas (Luther, 2008) distribuídas desde a América Central
até o sul da América Meridional (Smith & Downs, 1979), sendo a Mata
Atlântica o centro de diversidade deste gênero (Barros & Costa, 2008).
Billbergia zebrina (Herbert) Lindley é uma bromélia epífita e
heliófila nativa na Mata Atlântica, ocorrendo também sob condições de
luz difusa (Reitz, 1983). É considerada uma espécie vulnerável no
Estado do Rio Grande do Sul, Sul do Brazil (RS Biodiversidade, 2009).
Esta espécie, além de sua importância ecológica, se destaca também
pelo seu valor comercial por sua aptidão ornamental por conta das suas
exuberantes folhas e flores (Fig. 1 A). Seu tanque tubular tem
capacidade de armazenar uma grande quantidade de água, característica
esta importante para a manutenção da diversidade de animais. Em
muitos casos, as bromélias com seus microhabitats e seus habitantes
parecem ter co-evoluídos, como é o caso da espécie de sapo (Hyla
venulosa), que hiberna ao longo da estação seca no norte do Brasil no
interior da folhagem de plantas de Billbergia zebrina (Martinelli, 2000).
18
A cultura de tecidos vegetais compreende um conjunto de
ferramentas que podem ser aplicadas para a conservação e para a
propagação massal de bromélias de interesse. Recentemente foi descrita
uma rota regenerativa in vitro de bromélias baseada na indução de
culturas nodulares (CNs) (Rech Filho et al., 2005, Alves et al., 2006,
Rech Filho et al., 2009). CNs são definidas como grupos de nódulos
organogênicos de forma globular, de coloração verde amareladas a
translúcidas, apresentando textura friável a levemente compacta e
compostas basicamente por aglomerados meristemáticos que, e em
condições de cultivo adequado, resultam na regeneração múltipla de
brotos. Sistemas regenerativos similares foram descritos para Vriesea
fosteriana (Mercier & Kerbauy, 1995), Cryptanthus (Koh & Davies Jr,
1997), Vriesea friburgensis var. Paludosa (Alves & Guerra, 2001), e V.
Reitzii (Rech Filho et al., 2005, Alves et al., 2006, Rech Filho, 2009).
Este padrão morfogenético parece ser afetado pela competência e
diferenciação celular do explante e pelo tipo e concentração dos
fitorreguladores empregados (Gahan & George, 2008).
O presente trabalho objetivou avaliar o efeito do thidiazuron na
indução e estabelecimento de culturas nodulares e o potencial de
regeneração de brotos adventícios em larga escala. Analises estrutural e
histológica foram utilizadas para avaliar a origem dos processos
morfogenéticos de regeneração in vitro e análise de genética molecular,
baseadas na técnica AFLP, foram efetuadas para estudar a correlação
entre as plantas matrizes e as culturas regeneradas.
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal - Frutos em maturação fisiológica foram
coletados de plantas matrizes de Billbergia zebrina (Fig. 1A– detalhes)
mantidas na coleção de bromélias do CCA/UFSC foram desinfestados
durante 2 min em álcool 70%, 25 min em solução de água sanitária
comercial a 40% (2,0-2,5% de cloro ativo) mais um gota de Tween 20
em cada 100 ml de solução. As sementes foram inoculadas em frascos
de vidro tipo conserva (340 ml) contendo 25 ml de meio de cultura MS
básico [MSB – macro e microsais de MS (Murashige and Skoog, 1962)
mais vitaminas de Morel (Morel and Wetmore, 1951), 30 g L
-1
sacarose]
e geleificado com 7,5 g L
-1
agar (Acros
®
) e 1.0 g L
-1
carvão ativo. O pH
dos meios de cultura foram ajustados para 5,5, adicionados ou não de
agente geleificante e autoclavados por 15 min a 1,3
kgf cm
-2
. Todas as
culturas foram incubadas em ambiente com 25 ±2 ºC e quando na
presença de luz com 40-50 µmol m
-2
s
-1
de intensidade luminosa obtidas
com lâmpadas fluorescentes Sylvania® branca fria e 16 h fotoperíodo,
19
com uma distância de 10-12 cm de altura das culturas (Guerra & Dal
Vesco, 2010).
Indução de culturas nodulares – Segmentos nodais com 1,0 ±
0,3 cm foram excisados de aproximadamente 100 brotos jovens
cultivados por 12 semanas (cinco e sete semanas na ausência e presença
de luz, respectivamente) em MSB descrito anteriormente. Os explantes
foram inoculados em tubo de ensaio (25 x 150 mm) sobre ponte de
papel filtro (3M), contendo 15 mL de MSB líquido, suplementado com
diferentes concentrações de fitorreguladores para avaliar o efeito na
indução de CN e regeneração de brotos.
O delineamento do experimento foi em blocos completamente
casualizado (BCC) com cinco tratamentos: quatro concentrações de
thidiazuron (1-fenil-3-(1,2,3-thiadiazol) 5- uréia) - TDZ (0; 0,01; 0,1 e
1,0 µM) e a combinação de ácido α-naftalenoacetico - ANA (2 µM)
mais 6-benzilaminopurina - BAP (4 µM) meio de cultura comumente
utilizado em bromeliáceas (Guerra & Dal Vesco, 2010). Cada unidade
experimental foi constituída de dez tubos de ensaios contendo um
segmento de nó com uma gema por tubo e repetidas quatro vezes. Dados
de porcentagem de indução de cultura nodulares, número de brotos por
classe de altura de brotos e altura (cm) dos brotos foram coletados em
nove semanas de cultivo.
Multiplicação e Regeneração de brotos - CNs previamente
induzidas em meio de cultura suplementado com TDZ foram
subcultivadas em um segundo ensaio, em MSB suplementado com a
combinação com os fitorreguladores ANA e N6 (2-isopentenil) adenina
(2-iP).
O delineamento do experimento constou de um fatorial de 3x4,
com 12 tratamentos: três diferentes meios de cultura: 1) MSB isento de
fitorreguladores; 2) MSB + ANA (1 µM) + 2-iP (2 µM); 3) MSB +
ANA (2 µM) + 2-iP (4 µM) e combinado com quatro tratamentos da
indução das culturas nodulares do experimento 1: TDZ (0,01; 0,1 e 1
µM) e a combinação de ANA (2 µM) e BAP (4 µM). Cada unidade
experimental foi constituída de dez tubos de ensaios contendo 0,14g
±0,03g de CN por tubo e repetidas quatro vezes em forma de BCC. As
culturas foram mantidas sobre ponte de papel filtro (3M) contendo 15
ml MSB líquido. Dados de peso fresco (g) das CNs, número de brotos
por classe de altura de brotos e altura (cm) dos brotos foram coletados
em 14 semanas de cultivo. A eficiência regenerativa foi calculada pelo
peso fresco final das CNs em relação ao peso inicial (inoculo), com base
na fórmula: Eficiência regenerativa = (Peso final – Peso inicial)/Peso
inicial.
20
Manutenção das CNs – CNs foram subcultivadas em tubos de
ensaios contendo 15ml de MSB geleificado ou líquido, suplementado
com quatro diferentes combinações de fitorregulador: 1) MSB isento de
fitorreguladores; 2) MSB +ANA (4 µM) + 2-iP (2 µM); 3) MSB + TDZ
(0,01 µM).e; 4) MS + TDZ (0,01 µM) + 2-iP (2 µM). Em cada frasco foi
transferido de 1,5-2,0g de CN e os brotos regenerados foram
transferidos para meio de cultura MSB para o alongamento. Foram
efetuados subcultivos sucessivos e intercalados entre MSB geleificado e
líquido. Avaliações da morfologia das culturas foram efetuadas para
permitir a manutenção das CN por longo período em cultivo.
Aclimatização – Brotos alongados, obtidos no segundo ensaio,
foram transferidos para substratos compostos por uma mistura de
substrato comercial Plantmax
®
, casca de arroz carbonizada e casca
composta de arvores (1:1:1 v/v) dispostas em bandejas de isopor com
128 células. As mudas foram mantidas em ambiente de túnel de
nebulização com irrigação intermitente. Para permitir o
desenvolvimento as mudas foram transplante para vasos de 450 cm
3
e
1800 cm
3
após três e seis meses respectivamente.
Análise estatística – Porcentagem de explantes com CN, número
de brotos por explantes, altura e eficiência regenerativa foram
submetidos ao teste F
max
para verificar heterogeneidade das variâncias
(S
2
). Quando necessário os dados originais foram transformados em log
(x+2) ou (x+0,5)
0,5
. Estes dados foram submetidos a análise da variância
(ANOVA) e ao teste Student-Newman-Keuls (SNK-5%) de separação
de médias usando Statgraphics software, versão 7.0. Dados quantitativos
foram avaliados pela análise de regressão de acordo com Compton
(1994) e Sokal and Rohfl (1995).
Procedimentos Histológicos – Amostras representativas das
culturas in vitro foram coletadas em diferentes períodos e fixadas
glutaraldeido (2.5 %) em tampão fosfato de sódio 0,2 M (pH 7,2) por
16-18 h a 25 ºC. Em seguida as amostras foram lavadas por três vezes
em tampão sem fixativo e desidratada em série em série etílica (etanol)
gradual (10–96 %), for 30 min cada. As amostras foram imersas em
solução de pré-infiltração, compostos pela solução de infiltração do Kit
de historesina Leica® [50 mL de resina básica e 0,5 g de peróxido de
benzoila (ativador)] com etanol 96% (1:1, v/v) por 16-18 h a 25 ºC. Em
seguida as amostras foram imersas em
de solução de infiltração pura
durante 24h e incluídas em solução de infiltração com Endurecedor
Leica® (dimetil sulfóxido) na proporção de 15:1 (v/v) e orientadas em
moldes plásticos. Secções (5-7 µm) foram obtidas usando microtomo de
rotação Slee Technik®, distendidas em lâminas com uma gota de água e
21
mantidas por 1-2h a temperatura de 42 ±2 ºC. Após a evaporação da
água foram coradas com azul de toluidina O a 0.05% em H
2
O e os
aspectos relevantes foram identificados e fotografados usando câmara
DP 71 acoplada a microscópio BX-40 da Olympus®.
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) - Amostras
representativas fixadas de acordo com o item procedimentos
histológicos foram desidratadas em série etílicas (10-100
%) por 30 min
cada. Em seguida foram colocar em éter etílico (PA) e mantidas em
freezer (-20 ºC) por 24 horas, procedimento utilizado para substituir o
ponto crítico de CO
2
. Após evaporar o éter, as amostras foram montadas
sobre suporte de alumínio (stub) com dimensões de 9,5 de Ø x 10 mm
de altura coladas com fita carbono dupla face. Anteriormente as análises
as amostras foram mantidas em sílica e metalizadas com uma fina
camada de ouro. Imagens relevantes foram obtidas em microscópio
JEOL® modelo JSM-6390LV a 10 kV.
Análises de Genética Molecular - O DNA foi extraído
utilizando-se o método CTAB, conforme descrito por Stefenon et al.
(2004) a partir de amostra foliar (±2,5cm
2
) excisadas de plantas matrizes
(Bz1, Bz2 e Bz3, Fig. 1A) e de três amostras aleatórias com 0,85 ±0,2 g
de CN dos 12 tratamentos do ensaio de multiplicação. Deste modo, os
tratamentos B1.1, B1.2 e B1.3 são três replicatas do tratamento 1, das
amostras B2.1, B2.2 e B2.3 são três duplica do tratamento 2 e assim por
diante, como amostras representativas das 100 plântulas empregadas na
indução. Plantas Bz2 e Bz3 são matrizes para a regeneração das
culturas, enquanto a planta Bz1 foi usada como um controle da variação
genética natural dentro da espécie. O DNA isolado foi re-suspenso em
75 µL tampão TE e mantidos freezer - 20 ºC até o uso. A análise de
genética molecular foi executada pela técnica de AFLP (Vos et al.,
1995), como descrito por Stefenon et al (2007).
Para a reação de restrição/ligação, cerca de 150 µg de DNA
genômico foram incubados com as enzimas de restrição Eco RI e MseI
(Fermentas
®
) e o correspondente adaptadores EcoRI e MseI numa
simples reação (1X tampão de reação T4 DNA ligase, 2,5µg de BSA,
0,25 pmol/µL de cada adaptador, 0,07U de MseI, 0,.4 U de EcoRI, 0,08
U de T4 DNA ligase, 0,05 µg/µL de BSA, e 0,05mM de MgCl
2
), onde
foram mantidas em temperatura ambiente de 37 ºC por 16 h. O produto
desta reação foi diluído
com água ultra pura na proporção de 1:3 (v/v) e
desta diluição foi utilizado nas reações de pré-amplificação (5 µL de
DNA, 1X tampão da Taq, 0,08 U Taq DNA-polimerase (Fermentas
®
),
0,.25mM de cada dNTP, 0,05 pmol de cada primer e 0,05mM de
MgCl
2
). A pré-amplificação foi executada com os pares de primers com
22
uma base seletiva (Eco+A e Mse+C a 50ng/µL). O programa de PCR
constou de uma etapa de 2 min a 94 ºC seguido de 26 ciclos de 1 min a
94 ºC, 1 min a 65 ºC e 1 min a 72 ºC e finalizando com 5 min a 72 ºC. O
DNA pré-amplificado foi diluído com água ultra pura na proporção de
1:9 (v/v) e utilizando nas reações três bases seletivas com a combinação
de primer EcoRI -AAT + MseI-CAA, CTG, CTC, CAG, CTT e CAT [5
µL de DNA pré-amplificado, 1X de tampão da Taq, 0,07 U Taq
polymerase (Fermentas
®
), 0,25mM de cada dNTP, 0,08 pmol de primer
EcoRI-AAT marcado com fluorescência HEX mais 0,16 pmol do primer
MseI e 0,05 mM de MgCl
2
]. O programa de amplificação seletiva
constou de uma etapa inicial de desnaturação por 2min a 94 ºC seguido
de 12 Ciclos de 1 min a 94 ºC, 1 min a 65 ºC para anelamento e
1min:30s a 72 ºC para extensão, reduzindo 1°C a cada ciclo. A estes
ciclos, seguiram-se mais 23 ciclos de 30s a 94 ºC, 30s a 56 ºC e 1 min a
72 ºC, finalizando com 2 min a 72 ºC. Todas as reações de PCR foram
realizadas em termociclador C1000™ Thermal Cycler (BIO-RAD).
O produto da PCR foi combinado com o padrão ET-ROX
(ET550-R), tween 20 (0,1%), and 1,0 µl de DNA amplificado.
Fragmentos de AFLP foram separados por eletroforese em capilares de
genotipagem MegaBACE 1000 (GE Healthcare). Os fragmentos foram
automaticamente registrados e transformados em uma matriz binária
para análise de dados (0 para ausência e 1 para presença do fragmento)
usando o Software Fragment Profiler v1.2. Apenas fragmentos entre 50
e 600 bp (picos de altura > 100) foram selecionados para comparação
entre os tratamentos. A matriz binária foi analisada em software
NTSYSpc 2.0 (Rolf, 1998), para construção da matriz de similaridade
utilizando-se do índice do Jaccard como J
12
= a/(a+b+c), onde a é o nº.
de fragmentos de AFLP presentes em ambas as plantas, o b é nº. de
fragmentos presentes na planta um, mas não na planta dois e o c b é nº.
de fragmentos presentes na planta dois, mas não na planta um. Em
análise de grupo usando o algoritmo UPGMA e análise de ordenação
(PCO) foram avaliadas pelo mesmo software para visualizar a
correlação entre as plantas.
RESULTADOS
Indução das CNs - Brotos de Billbergia zebrina, quando
cultivados in vitro por sete semanas na ausência e mais cinco semanas
na presença de luz, permitiu o alongamento dos entrenós e favoreceu a
excisão dos segmentos nodais contendo uma gema axilar (Fig. 1B). O
uso do MSB isento de fitorreguladores resultou em baixa taxa de
proliferação de CN (Fig. 2A) e promoveu o desenvolvimento de um
23
broto por segmento nodal (Fig. 1C). A diferenciação para CN com
coloração verde amarelada foi observada a partir das gemas axilares
quando cultivadas na presença de TDZ, após cinco semanas de cultivo
(Fig. 1D). A proliferação dos clusters de CN com a indução e
regeneração múltipla de pequenos brotos adventícios foi observada após
nove semanas de cultivo (Fig. 1E).
A taxa de indução de CN aumenta linear e significativamente
(P<0,01), em relação ao aumento dos níveis de TDZ ao MSB e,
consequentemente, o uso de 1,0 µM de TDZ promoveu as maiores taxas
de indução de CN (95%), após nove semanas de cultivo (Fig. 2A). No
entanto, a maior número de brotos por gemas foi observada com o uso
de 0,1 µM de TDZ (Fig. 2B). Por outro lado, a altura dos brotos foi
inversamente proporcional ao aumento da concentração deste
fitorregulador, revelando, portanto, o cultivo em MSB isento de
fitorreguladores um maior e significativo (p<0,01) alongamento de
brotos (2,8cm) em relação aos meios suplementados com TDZ. Para
estes dois parâmetros o modelo quadrático da análise de regressão foi
que melhor descreveu a evolução dos dados (Fig. 2B). Alta freqüência
(>97%) de formação de brotos, da classe de menor de altura (0,5cm)
ocorreu quando foi suplementado ao MSB, 0,1 e 1,0 µM de TDZ (Fig.
2C). O uso BM suplementado com 2 µM de ANA e 4 µM de BAP
resultou também em altas taxas de indução (75%), número de brotos
(6,2 brotos/gemas) e altura média de 0,5 cm (dados não mostrados).
Multiplicação e Regeneração de brotos - O subcultivo para
novos meios de cultura, no segundo ensaio, favoreceu a diferenciação
celular e o desenvolvimento das CN em diferentes padrões morfológicos
quanto ao desenvolvimento, proliferação e regeneração de brotos (Fig.
1F-I). O estabelecimento de CN em ciclos repetitivos de proliferação,
com textura friável, de coloração marrom a amareladas foram
observadas somente nas culturas originadas de 0,01 µM de TDZ (Fig.
1F-G). O subcultivo das CNs, por mais de 6 semanas, em MSB isento
de fitorreguladores favoreceu a indução clusters meristemáticos (Fig.
1F). Após duas a três semanas de cultivo em MSB suplementado com 1
µM de ANA e 2 µM de 2-iP observou-se a regeneração de microbrotos
(Fig. 1G), padrão de resposta para esta rota de indução. Enquanto que,
CN induzida com 0,1 µM de TDZ e subcultivadas em 2 µM de ANA e 4
µM de 2-iP diferenciaram-se pelas característica morfológicas de
coloração verde, textura mais compacta e com o desenvolvimento de
múltiplos primórdios foliares, após 8 semanas de cultivo (Fig. 1H). CN
originada de MSB suplementado com 1,0 µM de TDZ e subcultivadas
24
em MSB suplementado com (1-2µM) ANA e (2-4µM) 2-iP,
apresentavam característica morfológica mais compacta que a anterior,
porém, foram observados a regeneração múltipla de brotos (Fig. 1I).
As maiores e significativa p<0,01) eficiências regenerativas das
culturas nodulares em aumento de peso fresco ocorreram quando estas
culturas foram originadas do MSB contendo 0,01 µM de TDZ quando
subcultivadas em MSB isento de fitorreguladores (MS - 12,3 vezes) e
com 1 µM de ANA e 2 µM de 2-iP (A1I2 - 11,8 vezes), após 14
semanas em cultivo (Fig. 3A). Por outro lado, CN originadas de 0,1 e
1µM de TDZ, quando subcultivadas em 2 µM de ANA e 4 µM de 2-iP
(A2I4) resultaram em maior e significativo (p<0,01) número médio de
brotos adventícios (446 e 412brotos/g de inóculo, respectivamente),
após 8 semanas de cultivo (Fig. 3B). No entanto, o subcultivo das CNs
originadas do meio de cultura contendo 2 µM de ANA e 4 µM de BAP
para meio contendo 1 µM de ANA e 2 µM de 2-iP resultou em baixas
taxas regenerativas, observando-se porém, um aumento significativo
(p<0,01) no alongamento de brotos (Fig. 3C). Observou-se também que,
o subcultivo em MSB isento de fitorreguladores promoveu uma alta
freqüência de brotos nas classes 0,5 cm de altura (Fig. 3D). Enquanto
que, o subcultivo das culturas em meio MS suplementado com ANA e
2-iP resultou em maior freqüências de brotos das classes superiores a
1,5cm de altura (Fig.3 E-F)
Manutenção das CNs - CN com alta capacidade regenerativa, de
textura friável a compacta e em ciclos repetitivos de proliferação (Fig.
1J), foram estabelecidas e mantidas por longo período com o uso de
MSB geleificado e suplementado com TDZ (0,01 µM) + 2-iP (2 µM).
Enquanto que, o uso de meio líquido resulta na regeneração dos brotos
(Fig. 1K) e o subcultivo em MSB líquido e isento de fitorreguladores
resulta no alongamento dos brotos.
Aclimatização - Brotos alongados e obtidos nos diferentes meios
de cultura de multiplicação e regeneração de brotos resultou em mais de
80% de sobrevivência, após seis semanas em ambiente de túnel de
nebulização com irrigação intermitente (dados não mostrados).
Enquanto que, brotos originados do MSB e isento de fitorreguladores
resultaram em 100% de sobrevivência. Mudas aclimatizadas quando
transplantadas para vasos com volume 450cm
3
e mantidas em ambiente
de viveiro com 50% de sombreamento apresentavam desenvolvimento
normal e uma altura média de 12 cm, após três meses in vivo (Fig. 1L).
O transplante para vasos de maior volume (1800cm
3
) observou-se após
6 meses, o padrão fenotípico da espécie e com 25 a 30 cm de altura (Fig.
1M).
25
Figura 1. Indução de culturas nodulares (CN) e a regeneração de brotos adventícios em
Billbergia zebrina. A) Planta matriz, detalhe - flor e fruto; B) Segmento de nodal de brotos
estiolados com uma gema axilar (seta); C) Desenvolvimento do broto em meio de cultura
MSB, 5 semanas de cultivo; D) Indução e desenvolvimento de CN a partir da gema axilar; E)
Proliferação de CN e regeneração de brotos em 9 semanas de cultivo; F-G) CN induzidas com
0,01 µM de TDZ e subcultivadas por mais 6 semanas: F) Em MSB ocorre à indução de novas
regiões meristemáticas (setas) e; G) em MSB com 1 µM de ANA e 2 µM de 2-iP ocorre a
regeneração de microbrotos (setas); H-I) Padrão de CN compacta e de coloração verde com o
subcultivo em MSB com 2 µM de ANA e 4 µM de 2-iP por 8 semanas e quando induzidas em:
H) 0,1 µM de TDZ com primórdios foliares e; I) Regeneração múltipla de brotos com 1µM de
TDZ; J); Manutenção em MSB geleificado com TDZ (0,01 µM) + 2-iP (2 µM); k) regeneração
e alongamento de brotos em MSB líquido e isento de fitorreguladores; L-M) mudas
aclimatizadas em ambiente in vivo: L) Após 3 meses e; M) Após 6 meses com padrão normal.
Barra: B,C,F,G,H = 5mm; E,I,J,K = 10mm.
26
Figura 2. A) Evolução da indução de culturas nodulares (%); B) número médio de
brotos regenerados por gemas e altura média dos brotos; C) Freqüência média de
brotos regenerados por gemas a partir de brotos estiolados de Billbergia zebrina em
resposta a suplementação ao meio de cultura MS com TDZ (0; 0,01; 0,1 e 1,0 µM)
após 9 semanas de cultivo. * Média de quatro repetições. CV (%) = A
1
20.3%; B):
Número de brotos
2
15.6%; Altura (cm)
2
13.3% . Dados transformados em
1
= log
(x+2) e
2
= (x+0,5)
½
.
Estudos Morfo-histológicos – Imagens obtidas em MEV
mostram claramente que a desenvolvimento das CNs ocorrem a partir
do segmento nodal em B. zebrina e observa-se uma organizada
proliferação de calo sobre a região da gema (Fig. 4A), quando
comparado com a região entrenós do explante. Após seis a sete semanas
de cultivo observa-se CN em proliferação com o início da indução de
gemas (Fig. 4B) e em detalhe a formação de doma apical do broto (Fig.
4C). Em secção longitudinal do segmento nodal, coradas com azul de
Toluidina O, podem ser observadas estruturas específicas de
desenvolvimento, mostrando também uma intensa proliferação de
células organizadas na zona nodal (Fig.4D - seta) e em secção
transversal pode-se visualizar o centro inicial de proliferação das células
competentes (Fig.4E - seta). Neste período, observa-se também a
formação zona meristemática na região subepiderme, compostas de
camadas organizadas com células pequenas e isodiamétricas (Fig.4F –
seta branca). Simultaneamente observa-se o início dos eventos de
divisão celular, a partir da cultura primária, que desenvolvem a
formação de estruturas nodulares (Fig.4F – seta preta).
Subsequentemente foi observado o desenvolvimento de culturas
nodulares em forma de aglomerados nodulares e por análise histológica
revelou que estas estruturas surgiram da zona meristemática e
apresentam protoderme bem definida em seis semanas de cultivo em
MSB com 0,01 de TDZ (Fig. 4G).
0 0,01 0,1
1,0
Y= -0,313x
2
+ 30,437x - 17,812 r
2
= 0,931
0
20
40
60
80
100
TDZ (µM)
Culturas Nodulares (%)
A
0
20
40
60
80
100
0,25 0,75 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5
Classe de Altura de Brotos (cm)
Freqüência
T0 T0,01 T0,1 T1
C
0 0,01
0,1
1,0
Y (Altura) = 0,462x
2
- 3,093x + 5,35 r
2
= 0,992
Y (N. brotos) = -0,73x
2
+ 4,81x - 2,28r
2
= 0,966
0
2
4
6
8
10
TDZ (µM)
No. de brotos e Altura (cm)
Altura (cm) No. de Brotos
B
0 0,01 0,1
1,0
Y= -0,313x
2
+ 30,437x - 17,812 r
2
= 0,931
0
20
40
60
80
100
TDZ (µM)
Culturas Nodulares (%)
A
0
20
40
60
80
100
0,25 0,75 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5
Classe de Altura de Brotos (cm)
Freqüência
T0 T0,01 T0,1 T1
C
0 0,01
0,1
1,0
Y (Altura) = 0,462x
2
- 3,093x + 5,35 r
2
= 0,992
Y (N. brotos) = -0,73x
2
+ 4,81x - 2,28r
2
= 0,966
0
2
4
6
8
10
TDZ (µM)
No. de brotos e Altura (cm)
Altura (cm) No. de Brotos
B
27
Figura 3. A) Eficiência regenerativa das culturas nodulares (CNs) de Billbergia
zebrina B) Número médio de brotos regenerados por grama; C) Altura (cm) dos
brotos e; D-F) freqüência por classe de altura de brotos em relação ao subcultivo em
meio de cultura MS isento de fitorreguladores (MS); A1I2 = MS + ANA (1 µM) +
2-iP (2 µM) e A2I4 = MS + ANA (2 µM) + 2-iP (4 µM) em relação os tratamentos
de origem: MS suplementado com TDZ (0,001; 0,01 e 1 µM) e a combinação de
ANA (2 µM) e BAP (4 µM), após 14 semanas de cultivo. * Média de três repetições.
Médias seguidas de letras diferentes indicam valores que diferem para o teste SNK
(5%). Eficiência regenerativa = (Peso final – Peso inicial)/Peso inicial. CV%=
A)
1
7.9; B)
2
10.0; C)
2
6.5. Dados transformados em
1
= log (x+2) e
2
= (x+0,5)
0,5
.
Em secção longitudinal observou-se que o inicio da regeneração
de microbrotos ocorreu após 8 semanas e destacou-se pela formação do
meristema caulinar e primórdios foliares alongados (Fig.4H– setas).
Este evento também foi visualizado por análise morfológica quando as
culturas foram cultivadas MSB suplementado com 0,1 µM de TDZ e
subcultivadas em 2 µM de ANA e 4 µM de 2-iP (Fig. 1H). Em imagens
em MEV pode-se observar também o desenvolvimento de CNs
primárias em proliferação a partir do segmento nodal com a formação e
incremento de tamanho das estruturas pré-nodulares quando induzidas
em MSB com 0,1 µM de TDZ e subcultivadas por 6 semanas em MSB
(Fig. 4I). Por outro lado, em resposta ao cultivo com 1 µM de TDZ
observou-se a formação de CN compacta, com superfície da cultura lisa
(Fig. 4J).
1
2
,
3
a
7
,
8
a
b
4
,
1
d
4
,
4
c
d
5
,
7
b
c
1
1
,
8
a
8
,
3
a
b
7
,
3
a
b
c
6
,
5
b
c
9
,
6
a
b
1
0
,
2
a
b
9
,
9
a
b
0
5
10
15
TDZ 0,01 TDZ 0,1 TDZ 1 ANA2
+BAP4
Eficiência regenerativa
MS A1I2 A2I4
A
1
2
4
e
1
5
1
d
e
1
6
5
d
e
2
0
9
c
d
e
2
3
9
c
d
2
5
8
c
d
3
1
8
b
c
2
3
0
c
d
2
7
5
c
d
4
1
2
a
b
2
4
6
c
d
4
4
6
a
0
100
200
300
400
500
TDZ 0,01 TDZ 0,1 TDZ 1 ANA2 +BAP4
Número de brotos/g
B
0
,
5
d
0
,
5
d
1
,
4
b
1
,
2
b
c
0
,
8
b
c
d
1
,
2
b
c
0
,
9
b
c
d
2
,
0
a
0
,
7
c
d
1
,
0
b
c
1
,
1
b
c
1
,
4
b
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
TDZ 0,01 TDZ 0,1 TDZ 1 ANA2 +BAP4
Altura (cm)
C
0
20
40
60
80
100
0,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5
Classe de Altura de Brotos (cm)
Freqüência
T0,01 T0,1 T1 A2B4
MS
D
0
20
40
60
80
100
0,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5
Classe de Altura de Brotos (cm)
Freqüência
T0,01 T0,1 T1 A2B4
ANA (1µM) + 2-iP (2µM)
E
0
20
40
60
80
100
0,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5
Classe de Altura de Brotos (cm)
Freqüência
T0,01 T0,1 T1 A2B4
ANA (2µM) + 2-iP (4µM)
F
1
2
,
3
a
7
,
8
a
b
4
,
1
d
4
,
4
c
d
5
,
7
b
c
1
1
,
8
a
8
,
3
a
b
7
,
3
a
b
c
6
,
5
b
c
9
,
6
a
b
1
0
,
2
a
b
9
,
9
a
b
0
5
10
15
TDZ 0,01 TDZ 0,1 TDZ 1 ANA2
+BAP4
Eficiência regenerativa
MS A1I2 A2I4
A
1
2
4
e
1
5
1
d
e
1
6
5
d
e
2
0
9
c
d
e
2
3
9
c
d
2
5
8
c
d
3
1
8
b
c
2
3
0
c
d
2
7
5
c
d
4
1
2
a
b
2
4
6
c
d
4
4
6
a
0
100
200
300
400
500
TDZ 0,01 TDZ 0,1 TDZ 1 ANA2 +BAP4
Número de brotos/g
B
0
,
5
d
0
,
5
d
1
,
4
b
1
,
2
b
c
0
,
8
b
c
d
1
,
2
b
c
0
,
9
b
c
d
2
,
0
a
0
,
7
c
d
1
,
0
b
c
1
,
1
b
c
1
,
4
b
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
TDZ 0,01 TDZ 0,1 TDZ 1 ANA2 +BAP4
Altura (cm)
C
0
20
40
60
80
100
0,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5
Classe de Altura de Brotos (cm)
Freqüência
T0,01 T0,1 T1 A2B4
MS
D
0
20
40
60
80
100
0,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5
Classe de Altura de Brotos (cm)
Freqüência
T0,01 T0,1 T1 A2B4
ANA (1µM) + 2-iP (2µM)
E
0
20
40
60
80
100
0,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5
Classe de Altura de Brotos (cm)
Freqüência
T0,01 T0,1 T1 A2B4
ANA (2µM) + 2-iP (4µM)
F
0
20
40
60
80
100
0,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5
Classe de Altura de Brotos (cm)
Freqüência
T0,01 T0,1 T1 A2B4
MS
D
0
20
40
60
80
100
0,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5
Classe de Altura de Brotos (cm)
Freqüência
T0,01 T0,1 T1 A2B4
ANA (1µM) + 2-iP (2µM)
E
0
20
40
60
80
100
0,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5
Classe de Altura de Brotos (cm)
Freqüência
T0,01 T0,1 T1 A2B4
ANA (2µM) + 2-iP (4µM)
F
28
29
Figura 4. Estrutura e análise histológica de culturas nodulares (CNs) de Billbergia
zebrina: A-C) Imagens em MEV mostrando: A) Indução e desenvolvimento de CN
a partir da região da gema do segmento nodal, cinco semanas de cultivo; B)
Segmento nodal com CN em proliferação com indução de gemas após 6-7 semanas;
C) Detalhe da indução doma apical; D) Secção histológica longitudinal de segmento
nodal com inicio da proliferação de CN a partir da região da gema; E) Secção
transversal da região da gema, centro proliferação das células (detalhe); F) Detalhe
da zona meristemática (seta) com início da formação dos nódulos, cinco semanas de
cultivo; G) Indução de aglomerados de nódulos após 6 semanas em MSB com 0,01
de TDZ; H) inicio da regeneração de microbrotos com a formação de primórdios
foliares (setas); I) CN em proliferação induzidas em BM com 0.1 µM de TDZ em
oito semanas de cultivo (MEV); J) Indução de CN compacta em BM com 1 µM de
TDZ; K) Seção histológica de CN em proliferação com a indução de gemas
múltiplas com 0.1 µM de TDZ; L) Regeneração de brotos em BM com 1 µM de
TDZ em oito semanas de cultivo. Abreviaturas: mc - meristema caulinar; ep-
epiderme; pf- primórdio foliar; zm- zona meristemática, zi- zona internodal; nz- zona
nodal; pt-protoderme; tv- tecido.vascular.
Em secção longitudinal pode-se observar a formação de nódulos e
o desenvolvimento de meristemas caulinares múltiplos com primórdios
foliares, nos quais, detectou-se o estabelecimento de conexões
vasculares nos primórdios foliares originados a partir do tecido nodular
(Fig. 4K). Após oito semanas de cultivo em MSB com 1 µM de TDZ
foram identificadas gemas adventícias e a regeneração de brotos a partir
de CN, destacados pelo alongamento de forma precocemente das folhas
(Fig. 4L).
Analise de Genética Molecular – A genotipagem por
eletroforese em capilares de MegaBACE 1000 e de acordo com a
determinação dos parâmetros quanto aos tamanhos de fragmentos
utilizando o software Fragment Profiler, permitiu a separação com
confiança de um total de 337 fragmentos de AFLP. A planta matriz Bz1,
mantida no bromeliário e não utilizada como fonte de explante, revelou
baixa similaridade com as outras plantas adultas (Bz2 e Bz3), que estão
em condições epifíticas em árvores no CCA/UFSC, bem como, com as
culturas regeneradas (Fig. 5).
A análise de ordenação revelou outras dez plantas regeneradas
além da plantas matriz Bz1 (Fig. 5A). Todas as outras plantas revelaram
alta similaridade, área aglomerada do gráfico, quando comparadas com
as plantas adultas Bz2 e Bz3 e entre todas outras plantas regeneradas
(Fig. 5B). O fenograma UPGA demonstrou o grau de semelhança entre
as plantas, que foi de 88 % entre as plantas B2.3 e B6.3, ambos
originadas de 0,01 µM de TDZ. A semelhança mais baixa foi revelada
pela plantas B3.2 (do tratamento 0,1 µM de TDZ), com somente 22 %
30
da semelhança com as outras plantas do grupo (Fig. 5C). Com base no
coeficiente de similaridade de Jaccard, as plantas aglomerados (ver Fig.
5A) apresentou cerca de 60% de similaridade genética e mais duas
plantas relacionadas têm 88% de similaridade (Fig. 5C).
Figura 5. Ordenação e análises de três grupos de plantas adultas e de 36 amostras
regeneradas a partir de CN: A) Análise coordenada principal de todas as plantas. B)
Detalhe das plantas marcadas pela linha tracejadas em A. C) Dendrograma UPGMA
das 39 plantas, baseadas no índice de semelhança de Jaccard.
DISCUSSÃO
Segmentos nodais de brotos estiolados de B. zebrina cultivados
em MSB com diferentes níveis de TDZ, iniciaram um programa
específico de desenvolvimento da morfogênese. Este sistema apresentou
alta competência e determinação para a formação de aglomerados de
pequenos nódulos. O subcultivo destas culturas para meios de cultura
contendo diferentes níveis e tipos de fitorreguladores resultou na para a
formação de aglometados nodulares que, neste trabalho, foram
caracterizadas como culturas nodulares (CNs). A indução de CN
morfologicamente variáveis com característica friável ou compacta com
diferentes colorações, todas apresentaram alto potencial regenerativo.
Além disto, em todos os níveis de fitorreguladores utilizados, observou-
B
C
A
31
se a formação de CNs competentes que evoluíram para a formação de
brotos adventícios.
Forte et al. (2002) observaram que, anteriormente a formação dos
nódulos ocorria à deposição de caloses sobre os entrenós de Humulus
lupulus var. Nugget. Segundo estes autores, este evento iniciou com o
intumescimento do tecido dos entrenós, resultando na formação de
nódulos deonominados organogênicos.
A competência dos tecidos vegetais, como os utilizados neste
trabalho, está relacionada com a habilidade das células competentes em
reconhecer aos sinais externos indutivos, tal como as fontes exógenas de
fitorreguladores utilizadas nos meios de cultura (Hicks, 1994). Por sua
vez, a determinação está relacionada ao caminho de diferenciação capaz
de formar, por exemplo, brotos adventícios, na organogênese ou,
embriões somáticos na embriogênese (Gahan & George, 2008).
No presente trabalho, observou-se que a manutenção das CNs em
processo repetitivo de multiplicação foi favorecida quando as CNs
foram induzidas em MSB com 0,01 µM de TDZ. Contudo, o aumento
nos níveis de TDZ nos meios de cultura de indução requer um aumento
nas concentrações de ANA e 2-iP nos meios de subcultivo. Este fator
incrementou, significativamente, a eficiência regenerativa e a freqüência
de regeneração de brotos, quando foi utilizado na indução concentrações
de 0,1 ou 1 µM de TDZ.
O thidiazuron (TDZ) é um fitorregulador que apresenta ação
semelhante às citocininas sendo é amplamente utilizado para o controle
da morfogênese in vitro de muitas espécies. O uso de TDZ em meio de
cultura em níveis mais reduzidos estimula a produção de um maior
número de gemas ou brotos adventícios e, também, promove a
proliferação de brotos a partir de gemas axilares e várias espécies (Lu,
1993). O potencial de indução da morfogênse com o uso de TDZ, como
comprovam os resultados do neste trabalho, tem sido relatado também
em várias outras espécies e tipos de explantes. O uso de 1,36 µM de
TDZ e o subcultivo em 1,33 µM de BAP mais 0,49 µM de AIB,
promoveu maior porcentagem de formação e alongamento de brotos a
partir de explantes foliares de Nothapodytes foetida (Thengane et al.,
2001). O uso de 4,5 µM de TDZ combinado ou não com 4,4 µM de BAP
no cultivo de embriões de cereais de inverno (aveia, trigo, cevada e
triticale), produziu elevado número de brotos por explante (Ganeshan et
al., 2006). A combinação de 11,35 µM TDZ e 4,54 µM de zeatina,
resultou em 100% de indução e maior produção de brotos adventícios
por explante a partir de entrenós de Mentha x piperita (Wang et al.,
2009).
32
Em bromeliáceas, a indução de estruturas morfogênicas,
caracterizadas como CN apresenta alto potencial regenerativo de brotos
adventícios, podendo ser utilizada para a produção de plantas em grande
escala. Em espécies do gênero Vriesea, bromélias endêmicas da Mata
Atlântica do Brasil ocorrem um padrão comum de desenvolvimento
destas estruturas regenerativas, tal como observado em V. fosteriana
(Mercier & Kerbauy, 1997), V. friburgensis var. paludosa (Alves &
Guerra, 2001) e em V. reitzii (Rech Filho et al., 2005; Alves et al., 2006;
Rech Filho et al., 2009). Para outras espécies de bromélias estes padrões
regenerativos foram também observados em Cryptanthus sinuosus
(Carneiro et al., l998) e Dyckia distachia (Pompelli & Guerra, 2004).
Em Aechmea bromelifolia, Aranda-Peres & Rodriguez (2006) obtiveram
a indução de calos com o uso de 10 µM de TDZ mais 1 µM de ANA,
quando os explantes foliares foram mantidos por 15 dias no escuro.
Além disto, em V. splendens a multiplicação de culturas nodulares em
forma de “clusters” é favorecida com o uso de MSB com 0,1 µM de
TDZ e em V. fosteriana podem ser obtidas taxas de multiplicação de
brotos de 14:1 quando utilizados este mesmo nível de TDZ (Guerra &
Dal Vesco, 2010).
Na fase de indução, do presente trabalho, a maior freqüência de
formação de brotos, da classe de menor de altura (0,5cm) ocorreu em
resposta ao uso de 1,0 µM de TDZ. Já, na fase de estabelecimento das
culturas, a maior freqüência de brotos de menor tamanho está
relacionada ao uso de 0,01 µM de TDZ (Fig. 3D-F). Para estes tipos de
CN e o pequeno tamanho de brotos observados neste trabalho revelam
um alto potencial para os estudos de criopreservação in vitro e se
enquadram adequadamente na tecnologia de unidades encapsuláveis
proposta para bromélias por Guerra & Dal Vesco (2010). Quando
comparadas às taxas regenerativas, os resultados deste trabalho são
efetivamente superiores aos relatados em outras espécies. Como por
exemplo, a indução em meio de cultura MS suplementado com 0,01 µM
de TDZ e posterior subcultivo, para a regeneração, em meio MS isento
de fitorreguladores podem ser obtidas, em 23 semanas de cultivos, em
média 12,3g de novas culturas para cada grama de CN inoculada (Fig.
3A). A partir disto, permite-nos inferir que a indução de CN nesta
espécie apresenta grande potencial regenerativo para produção de brotos
em grande escala.
Neste contexto, e por estimativas, pode-se inferir, a partir do
resultados obtidos no presente trabalho que quando se associa uma
eficiência regenerativa de 10,2 vezes no incremento médio de peso
33
fresco em resposta ao cultivo em meio MSB suplementado com 0,1µM
de TDZ (Fig. 3A) e a produção de 446 novos brotos/g de CN com o
subcultivo em MSB com 2 µM de ANA e 4 µM de 2-iP (Fig. 3B) podem
ser obtidos 4.500 novos brotos regenerados em 28 semanas de cultivo.
Estas taxas regenerativas, portanto, são efetivamente superiores as
observadas em outras bromeliáceas. Em Ananas comosus, a regeneração
de brotos a partir de CNs cultivadas em meio MS suplementado com
0,54 µM de ANA e 0,44 µM de BAP, resultou em mais de 128 novos
brotos por grama de inoculo (Teng, 1997). O uso de brotos estiolados,
também em A. comosus, resultou em taxas regenerativas de 13 e 15
brotos por segmento nodal (Kiss et al., 1995). Em Neoregelia cruenta
observou-se a taxa de regeneração foi de 21,7 brotos por explantes
(Carneiro et al., 1999). Em V. reitzii estimou-se a produção de 60 novos
brotos por grama de cultura nodular (Alves et al., 2006). Nesta mesma
espécie, Rech Filho et al. (2009) estimaram taxas regenerativas de 39
brotos para cada 0,03g de cultura.i
Em outras espécies foram relatados sistemas regenerativos
similares ao descrito no presente trabalho. Nódulos organogênicos, em
foram obtidos a partir de segmentos de pecíolos de Humulus lupulus
var. Eroica (Batista et al., 2000) e a partir de segmentos de entrenós da
var. Nugget (Fortes & Pais, 2000). Calos nodulares a partir de
segmentos foliares de Decalepis hamiltonii resultaram na formação de
embriões somáticos ou da regeneração de brotos adventícios
dependendo da combinação e da concentração dos fitorreguladores
utilizada no meio de cultura (Giridhar et al., 2004). Nódulos
organogênicos, brancos e compactos, induzidos a partir de segmentação
das foliares de Populus euphratica resultaram na regeneração de brotos
adventícios em meio MS suplementado de ANA e BAP (Ferreira et al.,
2009).
Análises em MEV e Histológica - A formação de calo observada
somente na região da gema axilar do segmento nodal de B. zebrina
revelou ser essa uma região de convergência e alta vascularização. Estes
aspectos podem estar associados a uma maior competência celular
quando se compara com a região dos entrenós. O desenvolvimento e
progressão deste processo da morfogênese foram monitorados por meio
de análises histológicas. Estas observações revelaram que a indução de
CN ocorreu a partir de divisões celulares na
região subepidermica,
denominada de zona meristemática. Nesta rota morfogenética observou-
se a formação de estruturas pré-nodulares que evoluiram para a
formação de meristemas caulinares. Estas características específicas
34
podem ser comparadas à análise morfológica da formação de múltiplas
regiões meristemáticas (Fig. 1F) com primórdios foliares alongados
(Fig. 1H) e a formação de múltiplos brotos (Fig. 1I) pode ser observada
quando as CNs foram induzidas com a suplementação de 0,01; 0,1 e 1
µM de TDZ, respectivamente.
Estudos histológicos a partir de folhas de Cichorium intybus,
mostram que a iniciação das CNs ocorreu a partir de células
competentes dos feixes vasculares (Piéron et al., 1998). A partir de
segmentos pecíolo de H. lupulus observou-se que na indução de nódulos
organogênicos, a seqüência de desenvolvimento levou à formação de
nódulos a partir de centros organizados de cinco camadas de células
meristemáticas da área central de vascularização (Batista et al. 2000).
Nesta mesma espécie, Forte & Pais (2000), por meio de análises de
imagens em MEV e histológicas, observaram que a partir das divisões
de células da epiderme e da subepiderme dos entrenós ocorria a
formação de nódulos organogênicos e a regeneração múltipla de novas
gemas. Também em H. lupulus a análise por MEV revelou que o
processo morfogenético da formação dos pré-nódulos, nódulos e a
regeneração de gemas ocorreram a partir de uma pequena camada de
calose na região de incisões dos entrenós (Forte et al., 2002). Segundo
estes autores, esta camada de calose pode prevenir a perda de água e
deste modo influenciar na capacidade de regeneração dos pré-nódulos.
Na bromélia Tillandsia eizii por meio de análise de secções
histológicas detectaram-se atividades mitóticas nas camadas
subepidérmicas que se organizam em regiões meristemáticas globulares
e as análises de imagens em MEV confirmaram esta origem bem como
o desenvolvimento de gemas (Pickens et al., 2006). A diferenciação de
nódulos organogênicos a partir de explantes foliares em Populus
euphratica inicia a partir da divisão das células do câmbio, onde ocorre
à formação de centros organizados, seguidos da regeneração dos
primórdios e a organização de meristemas caulinares (Ferreira et al.,
2009).
Análise genética e conservação – A origem das plântulas
regeneradas neste estudo não foi necessariamente de uma planta-mãe em
particular, mas de uma mistura de plântulas de diferentes
recombinações. Portanto, não se justifica realizar uma análise da
variação somaclonal. Considerando que as amostras analisadas neste
estudo foram culturas regeneradas a partir uma mistura de sementes,
incluindo as repetições de cada tratamento, não é esperada alta
similaridade entre elas. Por outro lado, culturas in vitro que utilizam
fitorreguladores podem gerar variação somaclonal, revelando, portanto
35
que, os clones regenerados não são geneticamente iguais devido à
ocorrência de algum tipo de variação. No entanto, a variabilidade por
recombinação, por mutações induzidas ou naturais é uma fonte
importante da diversidade necessária nos programas de conservação e
melhoramento de plantas. Assim, as variantes somaclonais geradas
podem ser úteis em um programa de avaliação e seleção, resultando, por
exemplo, no desenvolvimento de novas cultivares. Chen et al. (2006),
também utilizaram marcadores AFLP para analisar a diversidade
genética e selecionar os variantes somaclonais das cultivares de
Syngonium podophyllum. Estes autores concluíram que as cultivares
desta espécie atualmente cultivadas são geneticamente muito
semelhantes. Portanto, é necessário aumentar a diversidade genética
para prevenir doença e/ou potenciais epidemias fitossanitárias. Análises
de genética molecular, tal como utilizada em B. zebrina podem ser
utilizadas em diagnósticos, objetivando a redução de perdas econômicas
e comerciais, tal como ocorre na produção de mudas em sistemas
biofábricas. Além disso, análise de genética molecular pode acelerar o
processo de seleção em programas de melhoramento genético. Por
exemplo, neste estudo, a análise de AFLP sugeriu a ocorrência de
variação somaclonal nas plantas regeneradas. Apesar disso, as plântulas
aclimatizadas revelaram fenótipo normal (Fig. 1M). Isto significa que,
as variações ou mutações podem ser expressas nas novas fases de
desenvolvimento da planta ou em outros órgãos, como na inflorescência.
Tais mutações podem apresentar importância econômica desde que, por
exemplo, a B. zebrina seja comercializada como planta ornamental.
Mutações de origem induzidas ou naturais são importantes e
necessárias para a manutenção da diversidade genética em programas de
conservação e de melhoramento de plantas. Assim, os variantes
somaclonais podem ser avaliados e selecionados, resultando no
desenvolvimento de novas cultivaes. Estes resultados mostraram
também que, a integração entre cultura de tecidos e análises genéticas
pode ser uma ferramenta robusta para o planejamento de estratégias de
conservação (Stefenon & Welter, 2009; Stefenon et al., 2009). Apesar
de o marcador AFLP estar sendo amplamente utilizado em estudos de
diversidade genética em diferentes espécies de plantas, este é de acordo
o levantamento atual das literaturas, o primeiro estudo utilizando
marcadores AFLP em B. zebrina. Esta espécie é considerada ameaçada
de extinção no bioma Mata Atlântica no Estado do Rio Grande do Sul.
A reprodutibilidade e o elevado nível de polimorfismo detectado nos
fragmentos distribuídos no genoma fazem da técnica de AFLP uma
36
poderosa ferramenta para a análise da diversidade genética visando
conservação genética in situ ou ex situ.
Os resultados da análise genética molecular realizada neste estudo
não são conclusivos sobre a fidelidade clonal do protocolo de
propagação, por apresentar um elevado polimorfismo dos marcadores
AFLP. Além disto, a B. zebrina apresenta potencial para estudos de
diversidade genética por não ser genótipo específico. Estes resultados
permitem inferir que o presente sistema regenerativo pode ser utilizado
para manter o nível de diversidade genética das culturas regenerada. No
entanto, se nas próximas fases de desenvolvimento, não houver variação
fenotípica a ser expressa, isso significa que a ocorrência de diversidade
observada refere-se a amplificação de regiões não codificantes, ou
variação transientes ou ainda epigenéticas que também são abrangidas
por marcadores AFLP.
Conclusão - O sistema regenerativo in vitro baseado na indução,
proliferação e desenvolvimento de CN de B. zebrina é o primeiro
realizado com esta espécie de bromeliácea. O uso deste sistema
possibilitou a manutenção das culturas com baixo nível de diferenciação
por longo tempo. Este sistema apresenta também alto potencial para
servir como modelo de estudo de desenvolvimento e regeneração dos
brotos, associados à histodiferenciação, a conservação in vitro e/ou a
criopreservação da espécie. Foram identificadas e caracterizadas
também que, as diferenças morfológicas das culturas nodulares estão
associadas, especificamente, a cada concentração e combinação de
fitorregulador utilizado no meio de cultura. Este padrão da morfogênese
in vitro, para a B. zebrina, pode também ser explorado com sucesso para
a propagação em grande escala, devido à alta taxa regenerativa de
brotos. Além disto, pode ser mantido o controle de todas as etapas da
micropropagação, até o estabelecimento das mudas em ambiente in vivo.
Este protocolo pode ser comparável as demais espécies de bromélias
ornamentais. Além disto, esta espécie apresenta grande potencial
ornamental e de conservação, pela exuberância das suas inflorescências
(Fig. 1A) e, principalmente, pela importância ecológica que exerce as
bromeliáceas dentro do bioma Mata Atlântica. A integração do sistema
de regeneração in vitro, apresentada aqui com a análise da genética
molecular usando a técnica de AFLP é uma alternativa atraente. A
reprodutibilidade, o elevado nível de polimorfismo detectado e a grande
quantidade de fragmentos do genoma fazem desta técnica AFLP uma
poderosa ferramenta de análise da diversidade genética visando à
conservação in sit e ex situ. Embora os resultados da análise genética
molecular, pelo marcador AFLP, realizada neste trabalho, não são
37
conclusivos sobre a fidelidade clonal do protocolo de propagação, por
demonstrar elevado polimorfismo, pode ser importante, portanto, para
estudos de diversidade genética da espécie.
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41
6. CAPÍTULO 2
Indução de culturas nodulares e regeneração in vitro de
microbrotos em Vriesea reitzii a partir de explantes foliares e
sementes
Lirio Luiz Dal Vesco
4
, Miguel Pedro Guerra
1
RESUMO
A indução de culturas nodulares (CNs) e a subseqüente
regeneração de microbrotos em V. reitzii parecem se configurar em um
sistema de alta performance regenerativa in vitro em bromélias. No
presente trabalho foram estudados os fatores determinantes do controle
da morfogênese in vitro destas culturas. Sementes excisadas de cápsulas
maduras e segmentos foliares de brotos cultivados in vitro foram
cultivados em meio MSB líquido ou geleificado e suplementado com
diferentes tipos, concentrações e balanços de fitorreguladores e
submetidos a diferentes condições de cultivo. CNs originadas de
explantes de sementes foram subcultivadas em meios de cultura
suplementados com diferentes concentrações de AIA e AG
3
.
Microbrotos resultantes das CNs originadas de explantes foliares foram
subcultivados em meio de cultura líquido e geleificado. Os
fitorreguladores suplementados ao meio MSB inibiram o a germinação
das sementes e promoveram a indução de CN após 2 semanas em
cultivo. CNs induzidas em meio suplementado com ANA (4 µM) e
subcultivadas em meio MSB suplementado com ANA e 2-iP (2 µM
cada) apresentaram textura granular e alta taxa de proliferação. O
cultivo destas CNs em meio MSB suplementado com AIA (4 µM)
resultou no maior número médio de microbrotos (1.468 brotos/g de
CN). A partir do modelo de regressão foi possível inferir que o número
máximo de brotos alongados (66,3 brotos) pode ser obtido com o
subcultivo dos microbrotos em meio MSB suplementado com AIA (2
µM) e AG
3
(10 µM). Em todos os meios de cultura testados observou-se
a formação de CN cuja indução ocorreu a partir da região basal do
explante foliar, após 4 semanas em cultura. Estas CNs responderam de
forma diferencial aos tratamentos em termos de características
morfogenéticas e potencial regenerativo. CNs mantidas na presença de
luz resultaram em maior produção de massa fresca e de microbrotos em
comparação com aquelas mantidas na ausência de luz. CNs
4
Programa de Pós- graduação em Recursos Genéticos Genéticos Vegetais, Universidade
Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil.
E-mails: [email protected];
42
subcultivadas em meio MSB líquido e suplementado com ANA (4 µM)
e 2-iP (2 µM) revelaram elevada eficiência regenerativa. Brotos maiores
do que 3,0 cm resultaram em mais de 95% de sobrevivência ex vitro.
Palavras chaves: Bromeliáceas, micropropagação, Cultura nodular, microbrotos,
taxa regenerativa, propagação clonal, conservação.
Abreviaturas: AIA - ácido indolil 3-acético; AIB – ácido indolil-3-butírico; ANA-
ácidonaftalenoacético; BAP - 6-benzilaminopurina; CNs - Culturas nodulares; 2,4-D
- 2.4-ácido diclorofenoxiacético; MSB – meio básico MS; 2-iP - N6 (2-isopentenil)
adenina; MS – Murashige & Skoog (1962); TDZ- thidiazuron (N-phenyl-N'-1,2,3-
thiadiazol-5-ylurea).
ABSTRACT
Induction of nodular cultures and in vitro regeneration of
microshoots of Vriesea reitzii from leaf and seed explants
The induction of nodular cultures (NCs) and the subsequent
regeneration of microshoots in V. reitzii comprise a high performance
system for the mass propagation in bromeliads. In the present work it
was studied the factor determining the in vitro morphogenesis of this
bromeliad. Seeds excised from mature capsules and leaf segments from
in vitro grown shoots were cultivated in MSB liquid or gelled culture
medium supplemented with different types, levels and balances of plant
growth regulators (PGRs) and submitted to different culture conditions.
NCs originated from seeds were subcultured to culture media with
different levels of IAA and GA
3
. Microshoots resulting from NCs of
leaf explants were subcultured to liquid and gelled culture media. PGRs
supplemented to MSB medium inhibithed the germination of seeds and
promoted the induction of NCs in culture medium suplemented with
NAA (4 µM), then subcultured to MSB medium supplemented with
NAA and 2-iP (2 µM each) presented friable texture and high
proliferative capacity. The subculture of these NCs to MSB medium
supplemented with IAA (4 µM) resulted in the highest number of
microshoots (1, 468 /g of NCs). From the regression analysis it was
possible to infer that the highest number of elongated shoots (66.3) can
be obtained in response to the MSB medium supplemented with IAA (2
µM) and GA
3
(10 µM). All the tested culture media allowed the
induction of NCs arising from the basal region of the leaf explant after 4
weeks in culture. However these NCs showed differential responses to
the different treatments in terms of morphogenetic features and
regenerative potential. As compared to the absence of light NCs
cultivated in the presence of light showed higher fresh mass yield and
microsshoot production. NCs subcultured to MSB medium
43
supplemented with NAA (4 µM) and 2-iP (2 µM) revealed high
regenerative eficiency. Shoots longer that 3 cm showed more than 95%
ex vitro survival rate.
Keywords: Bromelids, nodular cultures, microshoots, mass propagation.
Abbreviations: 2,4-D – 2,4-dichlorophenoxyacetic acid; 2-iP - 2-isopenteniladenine;
BAP-6-benzylaminopurine; IAA- Indole-3-acetic acid IBA - Indole-3-Butyric acid
NAA-α-naphthaleneacetic acid; NCs – nodular cultures; MSB – MS basal medium;
2-iP - N
6
(2-isopentenyl) adenine; GA
3
– gibberellic acid; MS – Murashige and
Skoog (1962); TDZ- thidiazuron (N-phenyl-N'-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea).
INTRODUÇÃO
A floresta tropical atlântica é um dos 25 hotspots de
biodiversidade do mundo, aliando endemismo e ameaça critica (Myers
et al., 2000; Metzger, 2009). A fragmentação deste bioma demonstra
que o mesmo foi o que mais sofreu com perdas florestais (Ribeiro et al.,
2009), decorrente do avanço dos maiores centros urbanos e rurais no
país (Metzger, 2009). Este fator promoveu perdas gradativas de espécies
arbóreas (Silva & Tabarelli, 2000), o que promoveu um efeito cascata na
perda da biodiversidade numa amplitude incalculável (Lopes et al.,
2009). Este cenário crítico de conservação deste bioma tem despertado
na comunidade científica esforços para o entendimento das relações
ecológicas entre as espécies, bem como, recomendações para a
implementação de ações urgentes de conservação e restauração para
mitigar essa situação (Lopes et al., 2009; Metzger, 2009; Ribeiro et al.,
2009; Rodrigues et al., 2009).
As bromélias são componentes comuns a este bioma e pertencem
a grupos taxonômicos de alta riqueza e diversidade genérica e específica
(Martinelli et al., 2008). A ameaça que este grupo sofre deriva da
fragmentação dos ecossistemas florestais e da extração ilegal da floresta
decorrente do seu alto valor ornamental, paisagístico ou de interesse
farmacológico (Aranda-Peres & Rodriguez, 2006; Martinelli et al.,
2008). Os microhabitats formados pelas bromélias contribuem para
estabilidade deste ecossistema florestal e este subsistema ecológico
complexo cria uma relação de interação entre as espécies que co-
habitam ou delas são beneficiadas e cada uma contribui para a
manutenção da diversidade em função das adaptações e especializações
do ambiente (Benzing, 2000; Martinelli, 2000).
A família Bromeliaceae abrange 58 gêneros e 3.172 espécies e
subespécies (Luther, 2008) e mais de 50% das espécies são epífitas
(Martinelli, 2000). O gênero Vriesea da subfamília Tillandsioideae
engloba 261 espécies e 44 variedades e formas (Luther, 2008),
44
distribuídas nas Américas desde o o sul do Brasil e Norte da Argentina
até o México e Cuba (Smith & Downs, 1977). No Estado de Santa
Catarina, das 137 espécies ocorrentes, 31 são endêmicas (Reitz, 1983).
Vriesea reitzii Leme & Costa (Fig. 1A), pertence à subfamília
Tillandsioideae (Bromeliaceae) é uma bromélia epífita nativa da floresta
neotropical Atlântica e ocorre nos três Estados do Sul do Brasil. Adapta-
se a temperaturas mais frias e se distribui em altitudes de 750 a 1200 m
no domínio da Floresta Ombrófila Mista. Apresenta aspectos
morfológicos que se diferenciam daqueles ocorrentes em V.
philippocuburgii pelas lâminas de folhas verdes- amareladas, com linhas
verdes transversais mais escuras e pelo fato de que esta última ocorre em
regiões com altitudes de até 400m (Leme & Costa, 1991; Baensch &
Baensch, 1994). A semelhança entre estas duas espécies é tanta que
Reitz (1983) considerou uma única espécie. Além disto, V. reitzii é
considerada como vulnerável porque seu habitat epifítico primário a
Araucaria angustifolia tem suas populações naturais extremamente
reduzidas (Klein, 1990; Leme & Costa, 1991).
Técnicas de cultura de tecidos vegetais compreendem um
conjunto de ferramentas aplicáveis à propagação em larga escala
visando à captura e fixação de ganhos genéticos ou à conservação. No
caso de bromélias foram reportados sistemas regenerativos in vitro
baseados em padrões morfogenéticos associados à indução de CNs, as
quais foram definidas como grupos ou aglomerados de nódulos
organogênicos com alta competência regenerativa (George, 1993). A
elevada competência deste sistema morfogenético in vitro culmina na
produção múltipla de brotos adventícios em condições de cultura
adequadas (Gahan & George, 2008).
Uma das estratégias para a indução de CN em bromélias se baseia
no uso de bases foliares, como descrito para a regeneração de brotos
adventícios em Ananas comosus (Teng, 1997; Firoozabady & Moy,
2004), e V. reitzii (Alves et al., 2006; Rech Filho et al., 2009). Esta
técnica é uma ferramenta importante e pode ser empregada para a
propagação em larga escala para as bromélias de interesse ornamental,
bem como para a conservação in vitro de bromélias ameaçadas de
extinção (Aranda-Peres & Rodriguez, 2006; Guerra & Dal Vesco,
2010). Estas técnicas já vêm sendo aplicadas para várias espécies de
bromélias nativas de Santa Catarina, tais como V. friburgensis var.
paludosa (Alves & Guerra, 2001), Dyckia distachia (Pompelli &
Guerra, 2004, Pompelli et al., 2005), V. Reitzii (Rech Filho et al., 2005,
2009 e Alves et al., 2006), V. gigantea e V. philippocoburgii (Droste et
al., 2005).
45
No presente trabalho objetivou-se estabelecer um sistema de
indução de culturas nodulares e regeneração dos microbrotos a partir de
explantes foliares e de sementes de V. reitzii, cultivados em diferentes
tipos e combinações de fitorreguladores e condições de cultivo.
MATERIAL E MÉTODOS
Condições de cultivo - O meio de cultura básico utilizado foi
composto pela formulação salina MS (Murashige & Skoog, 1962),
adicionado de vitaminas de Morel (Morel & Wetmore, 1951), sacarose
(30g L
-1
), doravante denominado de meio MS básico (MSB), líquido ou
geleificado com 7,5g L
-1
de Agar-agar (Sigma
®
). O pH dos meios de
cultura foi ajustado para 5,5 antes da autoclavagem por 15 min a 121 ºC
e 1,3 atm. Quando as culturas foram mantidas na presença de luz, as
mesmas foram mantidas em sala de cultura com temperatura de 25 ºC ±
2 ºC, fotoperíodo de 16 horas a uma intensidade luminosa de 50-60
µmol m
-2
s
-1
, por meio de luz fluorescente clara de lâmpadas Sylvana®
(40-60 W).
Indução de CN a partir de explantes de Sementes
Indução - Sementes extraídas de cápsulas maduras foram
excisadas de plantas matrizes de V. reitzii mantidas no Centro de
Treinamento da Epagri de São Joaquim, S. Joaquim, SC, localizado a
1470m de altitude (Fig. 1A), foram utilizadas como fontes de explantes.
O processo de desinfestação e as condições de incubação das culturas
seguiram os procedimentos descritos por Alves et al. (2006).
O desenho experimental foi um esquema fatorial (4x2) com oito
tratamentos: quatro meios de cultura: 1) MSB isento de fitorreguladores;
2) MSB + ANA (4 µM); 3) MSB + BAP (4 µM); 4) MSB + TDZ (0,1
µM), em combinação com duas condições de cultivo: 1) Em tubo de
ensaio (22x150 mm) contendo 15 ml de meio de cultura líquido, sobre
ponte de papel filtro e; 2) Em frasco de vidro (340 ml) contendo 25 ml
de meio de cultura geleificado. Cada unidade experimental foi
constituída de 8 tubos de ensaios contendo 2-3 sementes/tubo e 3 frascos
de vidro (340 ml) contendo 6-7 sementes, totalizando 20 ±1 sementes
por unidade experimental, arranjados em forma de BCC, com três
repetições. Dados de porcentagem de indução de CN, e germinação
foram coletados após seis semanas em cultivo.
Manutenção das CNs - Culturas nodulares e microbrotos
regenerados foram subcultivados em meio MSB isento de
fitorreguladores e suplementado com 2µM de ANA e de 2-iP. Para a
manutenção das culturas foram utilizados meios gelificados em tubo de
ensaio e em frascos de vidro (340 ml), contendo 15 ml e 25 ml de meio
46
de cultura, respectivamente. O registro dos dados foi através de
fotomicrografia e coletados ao longo do período de manutenção das
culturas por mais de 2,5 anos.
Regeneração de microbrotos - CNs e culturas de microbrotos
mantidos em meio de cultura MSB foram empregadas como fontes de
explantes para avaliar a eficiência regenerativa de diferentes
combinações de fitoreguladores. Foi testada a suplementação ao meio
MSB com cinco diferentes combinações de fitorreguladortes: 1) MSB
isento de fitorreguladores; 2) AIA (4 µM); 3) AIA (4 µM) e AG
3
- ácido
giberélico (4 µM); 4) AG
3
(4 µM) e; 5) ANA (1 µM) e BAP (2 µM).
Cada unidade experimental foi constituída de cinco tubos de ensaios
(22x150mm) contendo 15 ml de meio de cultura líquido e inoculados
com 0,27g ±0,004g de massa fresca de CN por tubo, sobre ponte de
papel filtro, com quatro repetições em um delineamento experimental
em forma de BCC. Dados de massa fresca (g) das culturas nodulares e
número de microbrotos regenerados foram coletados após nove semanas
de cultivo.
Alongamento - CN proveniente do meio de cultura MSB foram
empregadas como fonte de explantes. O delineamento experimental
constou de um esquema bifatorial (4x3) com 12 tratamentos: quatro
concentrações de AIA (0, 4, 8 e 12 µM) em combinação com três de
AG
3
(0, 5 e 10 µM) suplementados ao meio de cultura MSB. Cada
unidade experimental foi constituída de três frascos de vidro contendo
18 ml de meio de cultura líquido. Cada frasco foi inoculado com 2,0g
±0,04g de massa fresca de CN e, dispostos em BCC e três repetições.
Dados de número de brotos alongados por classe de altura de brotos e a
massa fresca (g) das culturas não alongadas foram coletados após 20
semanas de cultivo.
Indução de CN a partir de explantes foliares
Indução de CN - Segmentos de bases foliares (0,4- 0,6 mm),
excisados a partir de brotos jovens (1,5-2,5 cm) de V. reitzii foram
cultivados em frascos de vidro (340 ml) contendo 25 ml do meio de
cultura MSB líquido foram utilizados como explantes. Empregou-se um
delineamento experimental fatorial (8x2) com 16 tratamentos: oito
meios de cultura MSB suplementados com 20 µM de: 1) 2,4-D (2.4-
ácido diclorofenoxiacético); 2) ANA (ácido α-naftalenoacético); 3) AIB
(ácido indol-3-butírico), e; 4) AIA – (ácido indol-3-acético),
combinados com 2 µM de 2-iP [N
6
(2-isopentenil) adenina]; 5) 1 µM de
TDZ (thidiazuron) + 2 µM de 2-iP; 6) ANA (4 µM) + 2-iP (2 µM); 7)
ANA (4 µM) + 2µM de BAP (6-benzilaminopurina) e 8) ANA (2 µM) +
BAP (4 µM). A estes tratamentos foram associadas duas condições de
47
cultivo: 1) ausência e; 2) presença de luz. Cada unidade experimental foi
constituída de 5 tubos de ensaios (22 x 150 mm) contendo 2-3 explantes
inoculados em tubos de ensaio sobre ponte de papel filtro, contendo 15
ml de meio de cultura, em forma de blocos completos casualizados
(BCC), com três repetições.
Estabelecimento das CNs - As culturas provenientes do ensaio
de indução foram mantidas nos mesmos meios de cultura e ambiente de
cultivos utilizados na indução. Após 13 semanas em cultivo foram
coletados dados de massa fresca (g) das CNs, número de microbrotos
regenerados e comprimento dos microbrotos. Após 18 semanas em
cultivo, as culturas mantidas na ausência de luz foram transferidas para
condições de fotoperíodo de 16 horas de luz.
Multiplicação - CN e microbrotos regenerados no meio de
estabelecimento foram subcultivadas após 22 semanas para frascos de
vidro (340 ml) contendo 20 ml de meio MSB, isento de fitorreguladores.
O delineamento experimental constou de um esquema fatorial com 16
tratamentos (8x2): os oito meios de cultura utilizados no ensaio de
indução, combinados com duas consistências do meio de cultura: 1)
líquido e; 2) geleificado com Agar-agar Sigma
®
(7,5g L
-1
). Utilizou-se
um delineamento de BCC com três repetições e cada unidade
experimental foi constituída de três frascos contendo três aglomerados
de CN, o que correspondeu, em média, a 0,38 ±0,08g de CN por frasco.
Dados de eficiência regenerativa, calculado a partir da massa fresca
inicial e final, de acordo com a fórmula: [Eficiência = (massa fresca
final – massa fresca inicial)/ massa fresca inicial] e dados de número
médio de brotos regenerados e altura média (cm) dos brotos foram
coletados após 13 semanas de cultivo em frascos de 340 ml.
Aclimatização - Brotos alongados e com mais de 3,0 cm de altura
foram transferidos para substratos compostos por uma mistura de casca
composta de Pinus, casca de arroz carbonizada e o substrato comercial
Plantmax
®
(2:2:1 v/v) sobre bandejas de isopor com 128 células. As
mudas foram mantidas em túnel de nebulização com irrigação
intermitente. Dados de porcentagem de sobrevivência foram coletados
após 5 semanas e após 15 semanas nas condições in vivo as plântulas
foram transplantadas para vasos de 350 ml utilizando o mesmo
substrato.
Análise Estatística - Os dados coletados foram submetidos à
Análise de Variância (ANOVA) e ao teste Student-Newman-Keuls
(SNK-5%) de separação de médias. Quando necessário os dados
originais foram transformados em (x+0,5)
0,5
ou em log (x+1) segundo as
recomendações de Steel & Torrie (1980) e Compton (1994).
48
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Indução de CN a partir de sementes
Indução - Sementes de V. reitzii cultivadas em meio de cultura
MSB suplementado com os diferentes tipos e concentrações de
fitorreguladores foram induzidas à formação de CN, com coloração
verde amarelada, após duas semanas em cultivo (Fig. 1B). Por sua vez,
sementes cultivadas em meio MSB isentos de fitorreguladores
germinaram e formaram plântulas (Fig. 1C). A inibição da germinação
normal das sementes e a proliferação de calos e indução de gemas
adventícias foram também observadas a partir de sementes de Tillandsia
eizii (Pickens et al., 2006). Assim, este tipo de explantes é constituído
por células competentes capazes de reconhecer aos sinais indutivos
(Hicks, 1994) e podem ser redirecionados para novas rotas regenerativas
(Gahan & George, 2008).
As maiores e significativas (p<0,001) porcentagens de indução de
CN resultaram do cultivo em meio MSB liquido suplementado com 4
µM de ANA (81,8%) e com 0,1 µM de TDZ (80,9%), após seis semanas
em tubos de ensaio, sobre ponte de papel filtro (Fig. 2). No entanto,
foram observadas diferentes características morfológicas associadas aos
diferentes fitorreguladores utilizados (Fig. 1D-G). Assim, quando as
CNs foram induzidas a partir de meios de cultura suplementados com
ANA, elas apresentavam textura granular e alta capacidade de
proliferação (Fig. 1D), quando comparado às culturas mais compactas
que se originaram em MSB suplementado com TDZ (Fig. 1E), e que
evoluíram para a formação de CN (Fig. 1F). Por sua vez meios de
cultura suplementados 4 µM de BAP promoveram a indução simultânea
de CN e de microbrotos (Fig. 1G).
Estruturas nodulares globulares obtidas a partir de tecido foliar de
Ananas comosus foram induzidas em meios de cultura suplementados
com TDZ e AIB (Firoozabady & Moy, 2004). Em Tillandsia eizii a
maior porcentagem de indução de gemas e o maior número de
gemas/explantes ocorreram em resposta ao meio de cultura
suplementado com BAP e ANA (Pickens et al., 2006). O uso de TDZ e
ANA também induziu a formação de calos a partir de explantes foliares
de Aechmea bromelifolia (Aranda-Peres & Rodriguez, 2006).
49
Figura 1. Indução e caracterização morfológica das CNs obtidas a partir de
sementes de V. reitzii. A) Planta matriz com frutos maduros; B) Indução de CN após
duas semanas em cultivo e; C) Germinação da semente em meio de cultura MSB ;D-
G) Início da proliferação das CNs (seta) após 6 semanas de cultivo: D) Em MSB
com 4 µM de ANA; E-F) Em MSB com 0,1 µM de TDZ: E) Indução de CNs
compactas e; F) Com a formação de nódulos; G) CN de coloração verde em MSB
com 4 µM de BAP; H) CN em MSB + 4 µM de ANA e geleificado, observando-se
também a germinação (seta) e; I) CNs granulares em meio MSB com 4 µM de BAP
e a indução de brotos múltiplos (seta); J-L) Manutenção das CNs em meios
geleificados quando originadas de: J) MSB com 4 µM de ANA de coloração verde;
K) MSB com 4 µM de BAP de coloração verde amarelada e; L) MSB, regeneração
de CNs amareladas; M) CN de baixa proliferação e com textura compacta (seta)
quando originadas de 0,1 µM de TDZ . Barra: B-G; J-M = 3 mm e H, I barra = 1 cm
50
14,9c
52,8b
80,9a
81,7a
15,2c
29,7c
25,4c
63,9b
78,1a
39,7b
16,6cd
7,1d
79,6a
65,0a
60,4a
30,5bc
0
20
40
60
80
100
% de indução
Líquido Geleificado Líquido Geleificado
Cultura Nodulares Germinação
MSB BAP 4 TDZ 0,1 ANA 4
Figura 2. Indução de culturas nodulares
1
e germinação
2
a partir de sementes de V.
reitzii cultivadas em diferentes meios de cultura: 1) MSB; 2) MSB + BAP (4 µM);
3) MSB com TDZ (0,1 µM) e 4) MSB com ANA (4 µM) em combinação com o
meio de cultura líquido, sobre ponte de papel filtro ou geleificado, após 6 semanas
em cultura. * Média de três repetições. Médias seguidas de letras diferentes indicam
valores que diferem para o teste SNK (5%).
1
CV(%) = 17,6;
2
CV(%) = 18,3.
Por outro lado, em outras espécies que não bromélias, como é o
caso de Nothapodytes foetida, o uso do TDZ induziu a formação de
aglomerados de gemas e o subcultivo em meio BAP mais AIB
promoveu o alongamento dos brotos (Thengane et al., 2001). Rajeswari
& Paliwal (2008) obtiveram taxas mais elevadas de indução de calo em
resposta ao BAP a partir de explantes de epicótilo de Albizia
odoratissima e o maior número de brotos adventícios regenerados foi
obtido com a combinação de ANA com BAP. Alta freqüência de
regeneração de brotos foi obtida a partir de nódulos organogênicos
induzidos a partir de segmentos de folhas ou de pecíolos de Melothria
maderaspatana em resposta ao cultivo sucessivo em meio de cultura
suplementado com 2,4-D mais TDZ ou BAP e, posteriormente, em
meios de cultura suplementados com BAP e TDZ (Baskaran et al.,
2009).
No presente trabalho, a maior (p<0,01) porcentagem de
germinação de sementes ocorreu em resposta ao meio de cultura MSB
(Fig. 2), tanto líquido (78,1%), quanto geleificado (79,6%). O cultivo
em frascos de vidro de 340 ml com meio geleificado resultou em maior
51
porcentagem média de germinação, quando comparados com o uso de
meio líquido. Neste contexto, a germinação e o desenvolvimento das
plântulas foram inversamente proporcionais à indução de CN. Assim, a
suplementação de ANA ao MSB inibiu a germinação das sementes (Fig.
2). Em T.reizii, o aumento das concentrações de ANA suplementada ao
meio de cultura Knudson inibiu o crescimento das plântulas, porém não
reduziu a taxa de germinação das sementes (Pickens et al., 2003).
O cultivo em frascos de vidro de 340 ml com meio geleificado
promoveu a indução e proliferação intensa de CN com maior freqüência
de germinação, mesmo na presença de fitorreguladores, após 17
semanas em cultivo (Fig. 1H, I - setas). Estas culturas apresentavam
textura granular com diferenciação incipiente e coloração verde quando
cultivadas na presença de 4 µM de ANA (Fig. 1H) e coloração verde
amarelada com inicio de desenvolvimento múltiplo de microbrotos
quando cultivadas em meio de cultura suplementado com 4 µM de BAP
(Fig. 1I). Rech Filho et al. (2005) observou a formação de culturas de
microbrotos de V. reitzii a partir da região basal de brotos em intensa
proliferação em resposta ao meio de cultura MS suplementado com
ANA e BAP.
Manutenção - O subcultivo a cada 15 semanas das CNs para
MSB geleificado e suplementado com ANA e 2-iP (2 µM cada) permitiu
a manutenção das CNs em ciclos repetitivos de proliferação por mais de
2,5 anos em cultivo (Fig. 1J). As diferentes características morfológicas
observadas nestas culturas estiveram também relacionadas ao meio de
origem. Desta foram, CNs originadas de MSB com ANA (4 µM)
mantiveram a formação de aglomerados de nódulos organogênicos
friáveis com diferenciação incipiente e de coloração verde-amarelada a
translúcida (Fig. 1J). No entanto, CNs originadas de MSB com BAP (4
µM), mantiveram a textura friável e granular (Fig. 1K). Já, CNs
originadas de MSB e subcultivadas em meios suplementados com ANA
e 2-iP (2 µM cada) induziram a formação de novas CNs, de textura
friável, coloração amarela a translúcida, assemelhando-se a culturas
embriogênicas (Fig. 1L).
Por outro lado, CNs originadas do meio de cultura com TDZ (0,1
µM) e subcultivadas tanto em MSB isento de fitorreguladores, quanto
em meio suplementado com ANA e 2-iP revelaram baixa capacidade
proliferativa e textura mais compacta (Fig. 1M). Em outros trabalhos
com bromélias foi também reportada à proliferação de nódulos
globulares com textura compacta, os quais resultaram na regeneração de
brotos. Isto foi observado em A. comosus ‘varigatus’ em resposta ao
meio de cultura suplementado com ANA mais BAP (Teng, 1997) e
52
também em duas cultivares de Smooth Cayenne em resposta ao meio de
cultura suplementado com TDZ e AIB (Firoozabady & Moy, 2004).
Regeneração de microbrotos - O cultivo de CN em meio MSB
suplementado com AIA (4 µM) resultou em um maior número médio de
microbrotos (1.468 brotos/g de CN), após nove semanas em cultivo
(Tabela 1). Neste período, foi observada que a intensa proliferação e a
regeneração de microbrotos ocorriam de forma repetitiva (Fig. 3A). A
suplementação do meio de cultura com AIA e AG
3
(4 µM cada),
promoveu um maior alongamento dos microbrotos, permitindo a
individualização dos mesmos (Fig. 3B).
Tabela 1. Eficiência regenerativa* em relação à massa fresca (g) inicial e final a
partir de CN de Vriesea reitzii e o número estimado de microbrotos/g** de CN em
relação ao número de microbrotos produzidos, em resposta aos meios de culturas
MSB suplementados ou não com diferentes fitorreguladores, após nove semanas de
cultivo.
Massa fresca (g)Fitorregulador
(µM)
Inicial
Final
Eficiência
regenerativa
Microbrotos
produzidos
Estimativa de
produção de
microbrotos/g
AIA (4)
0,27 1,55 4,8 A (±0,47) 391 A (±49) 1.468 A (±202)
AG
3
(4)
0,28 1,32 3,8 A (±0,48) 318 B (±42) 1.150 B (±170)
AIA(4)+ AG
3
(4)
0,27 1,24 3,6 A (±0,71) 292 B (±70) 1.084 B (±226)
ANA(1)+BAP(2)
0,27 1,27 3,7 A (±0,58) 266 B (±24) 993 B (±111)
MS
0,27 1,29 3,8 A (±0,19) 265 B (±28) 988 B (±131)
Média 0,27 1,33
4,0 (±0,49) 305 (±43) 1.137 (±168)
CV (%)
14,2 14,7 14,4
Média de quatro repetições. Médias seguidas de letras diferentes, na coluna, indicam valores
que diferem para o teste SNK (5%).
Média (± desvio padrão).
* Eficiência regenerativa =
(Massa final – Massa inicial)/Massa inicial. ** Estimativa de microbrotos/g = Nº de
microbrotos produzidos/massa inicial (g).
Alves et al. (2006) relataram uma taxa regenerativa de 60 brotos/g
de CN de V. reitzii originadas da base foliar de brotos cultivados em
meio de cultura MS suplementado com BAP, Kin e 2-iP. Com esta
mesma espécie, Rech Filho et al. (2005) obtiveram maior incremento de
massa fresca e maior número de brotos regenerados em resposta ao uso
de ANA e BAP. Amin et al. (2005) também obtiveram maior
regeneração de brotos de A. comosus cv. Giant Kew com a
suplementação de BAP e ANA ao meio MS. Em V. splendens a
suplementação de TDZ ao meio de cultura MS resultou na maior
produção de microbrotos (Dal Vesco et al., 2007). Explantes a partir de
semente de Emblica officinalis, também revelaram a produção de brotos
de adventícios em alta freqüência quando cultivados com a
53
suplementação ao meio de cultura MS com BAP e AIA (Nayak et al.,
2010).
Alongamento – O uso de 10 µM de AG
3
combinado ou não com
todos os quatro níveis de AIA testados, promoveu um alongamento
sincrônico dos microbrotos após 20 semanas em cultivo (Fig. 4). Neste
caso, o modelo quadrático da análise de regressão foi o que melhor
descreveu a evolução do número médio de brotos alongados por grama
de CN em resposta a combinação de AIA com AG
3
e expressou valores
de r
2
e T-valor (p<0.05) significativos. Estes índices indicam a
confiabilidade nas trajetórias quadráticas que, no caso de sistemas
biológicos, consideram-se altos aqueles valores de r
2
que ocorrem entre
0,5 e 0,9 (Compton, 1994). A partir das derivações dos modelos de
regressão propostos (Fig. 4) pode-se inferir que o número máximo de
brotos alongados pode ser obtido em resposta ao uso de 2; 5 e 4,7 µM de
AIA combinados com 10; 5 e 0 µM de AG
3
, resultando em 66,3; 52,1 e
37,6 por grama de CN respectivamente.
O subcultivo em frascos de 340 ml revelou intensa proliferação
das CNs, porém, baixa taxa de alongamento dos microbrotos (Fig. 3D).
Observou-se também que, o uso isolado de 4 µM de AIA ou de 10 µM
de AG
3
resultou em maior número médio de brotos por grama de cultura
inoculada (51,5 e 63,5 brotos/g, respectivamente). Não foram
observadas diferenças significativas em resposta às diferentes
concentrações de AIA e AG
3
testados, para a altura média dos
microbrotos e para a eficiência regenerativa das culturas (Tabela 2).
Neste contexto, para ocorrer o alongamento sincronizado dos
microbrotos de V. splendens híbrida foram necessários 2-3 subcultivos
em meio MS com AG
3
(Dal Vesco et al., 2007). Da mesma forma, dois
subcultivos sucessivos em meios de cultura MS com AG
3
foram
necessários para promover o alongamento de microbrotos de V. reitzii
(Rech Filho et al., 2005). Nesta mesma espécie, o alongamento dos
brotos ocorreu com o cultivo alternado entre o uso de AG
3
e isentos de
fitorreguladores (Rech Filho et al., 2009).
Em Nothapodytes foetida, o subcultivo dos aglomerados de brotos
em meio de cultura suplementado com BAP e AIB promoveu maior
alongamento dos brotos (Thengane et al., 2001). Em A. comosus cv.
Phuket o maior número de brotos (27,8 brotos) regenerados ocorreu em
resposta ao uso de BAP em meio basal geleificado (Sripaoraya et al.,
2003). Para a cv. Smooth Cayenne o subcultivo dos brotos adventícios
em meio de cultura suplementado com BAP e AG
3
promoveu a
regeneração múltipla de gemas e, concomitantemente, o alongamento
dos brotos (Firoozabady & Moy, 2004).
54
Figura 3. Regeneração e alongamento de microbrotos a partir de culturas nodulares
(CN) de Vriesea reitzii, A) Microbrotos em meio MSB suplementado com 4 µM de
AIA após 9 semanas em cultivo; B) Alongamento e individualização de microbrotos
cultivados em meio suplementado com 4 µM de AIA e AG
3
; C) Alongamento de
microbrotos e regeneração de CN em meio MSB líquido suplementado com AG
3
; D)
Proliferação de CN e alongamento de microbrotos em meio de cultura
suplementados com AIA e AG
3
; E) Aclimatização dos brotos, e; F)
desenvolvimento das mudas após 3 meses. Barra = 1 cm.
Y (AG
3
0 µM)= -0,69x
2
+ 6,53x + 22,17 r
2
= 0,779
Y (AG
3
5 µM)= -0,877x
2
+8,7x + 30,5 r
2
= 0,850
Y (AG
3
10 µM) = -0,15x
2
+ 0,6x + 66,67 r
2
= 0,854
0
10
20
30
40
50
60
70
0 4 8 12
AIA (µM)
No. Brotos/g
AG3 (0 µM) AG3 (5 µM) AG3 (10 µM)
Figura 4. Evolução do número médio de microbrotos alongados por grama de CN
de V. reitzii em resposta aos meios de cultura MSB suplementados com AIA (0, 4, 8
e 12 µM) e AG
3
(0, 5 e 10 µM), após 20 semanas de cultivo. * Média de três
repetições.
55
Tabela 2. Eficiência regenerativa e o número médio estimado de microbrotos/g de
culturas nodulares (CNs) de Vriesea reitzii e comprimento médio dos brotos a partir
de CN em resposta ao meio de cultura MSB suplementado com AIA e AG
3
após 20
semanas em cultivo.
Fitorregulador
AIA (
µ
M)
Inicial Final
0 2,09 10,36 3,96A (±0,39) 39,4B (±23) 0,3A (±0,07)
4 2,08 10,81 4,20A (±0,46) 51,5A (±14) 0,4A (±0,16)
8 2,12 10,82 4,10A (±0,20) 47,3AB (±14) 0,5A (±0,08)
12 2,11 10,43 3,94A (±0,14) 46,4AB (±15) 0,3A (±0,07)
Média 2,10 (±0,03) 10,60 (±0,27) 4,05 (±0,29) 46,1 (±17) 0,4 (±0,09)
AG
3
(
µ
M)
0 2,12 10,48 3,94A (±0,14) 31,0C (±6) 0,3A (±0,09)
5 2,08 10,72 4,15A (±0,10) 44,0B (±9) 0,5A (±0,15)
10 2,1 10,61 4,06A (±0,29) 63,5A (±3) 0,4A (±0,08)
Média 2,1 (±0,02) 10,6 (±0,33) 4,05 (±0,18) 46,1 (±6) 0,4 (±0,11)
8,6% *11% 35,9%
CV (%)
Massa fresca (g) Eficiência
regenerativa
Número de
brotos/g
Comprimento
(cm)
Média de três repetições. Médias seguidas de letras diferentes, na coluna, indicam
valores que diferem para o teste SNK (5%). Média (±) = desvio padrão.
*
Dados
transformados em (x+0,5)
0,5
. Eficiência regenerativa = (Peso final – Peso
inicial)/Peso inicial.
3.2. Indução de CN a partir explantes foliares
Indução - Todos os fitorreguladores e condições de cultivo
testado induziram a formação de CN após quatro semanas em cultivo
(Tabela 3). Estas CNs apresentaram estrutura globular e textura friável,
eram translúcidas e revelaram alto potencial regenerativo (Fig. 5). A
indução das CNs iniciou, em todos os tratamentos testados, a partir da
região basal do segmento de folha empregado como explante (Fig. 5B-D
e F-G) e revelou distintos padrões morfológicos em resposta aos
diferentes meios de cultura, na presença e ausência de luz. Distintas
características morfológicas também foram observadas na indução de
calos organogênicos em Helicteres isora em resposta a diferentes tipos e
níveis de fitorreguladores (Shriram et al., 2008).
Bases foliares cultivadas em meio MSB suplementado com ANA
(2 µM) e BAP (4 µM) resultaram em taxas médias de 77,1% de indução
de CN (Tabela 3). O uso de MSB suplementado com TDZ (1,0 µM) e 2-
iP (2,0 µM) revelou taxas menores de indução de CN em relação aos
56
demais. Observou-se, também, que, tanto a presença quanto a ausência
de luz resultaram em taxas similares de indução de CN (Tabela 3).
Tabela 3. Porcentagem de indução de culturas nodulares (CNs) a partir de base
foliar de Vriesea reitzii, em resposta ao meio MSB suplementado com diferentes
tipos e níveis de fitorreguladores e à presença ou ausência de luz, após quatro
semanas em cultivo.
Fitorregulador (µM) Presença (%) Ausência (%)
Média
ANA (2,0) + BAP (4,0)
73,3 80,8
77,1a
ANA (4,0) + BAP (2,0)
84,7 66,1
75,4a
ANA (4,0) + 2-iP (2,0)
76,7 55,6
66,1a
ANA (20,0) + 2-iP (2,0)
61,1 65,3
63,2a
AIA (20,0) + 2-iP (2,0)
73,6 48,1
60,9a
AIB (20,0) + 2-iP (2,0)
60 53,7
56,9a
2,4-D (20,0) + 2-iP (2,0)
59,7 55
57,4a
TDZ (1,0) + 2-iP (2,0)
33,3 27
30,2 b
Média 65,3 A 56,5 A 60,9
Luz
* Média de três repetições. Médias seguidas de letras diferentes, na coluna, indicam
valores que diferem para o teste SNK (5%). CV(%) = 15,8. Dados originais
transformados em (log x+2).
Diferenças morfológicas expressivas foram observadas quanto à
presença ou ausência de luz (Fig. 5). Culturas mantidas em fotoperiodo
de 16h. apresentaram coloração esverdeada, consistência friável e
elevado potencial de regeneração após 4 semanas de cultivo em MSB
suplementado com ANA (4 µM) e BAP (2 µM) (Fig. 5B). Neste caso,
observou-se também a indução de microbrotos diretamente dos
explantes (Fig. 5C). Na ausência de luz as CNs eram branco-amareladas
e progrediam rapidamente para microbrotos (Fig. 5D), em resposta ao
meio de cultura suplementado com AIA (20 µM) e 2-iP (2 µM).
Nódulos organogênicos com diferentes níveis de organização
foram descritos em outros sistemas in vitro, incluindo Cichorium
intybus (Piéron et al., 1998), Humulus lupulus var. Eroica (Batista et al.,
2000) e var. Nugget (Fortes & Pais, 2000), Charybdis numidica
(Wawrosch et al., 2005) e Populus euphratica (Ferreira et al., 2009).
57
Figura 5. Indução e caracterização morfológica de CN a partir de explante foliar V. reitzii,
cultivadas em MSB líquido e suplementados com diferentes fitorreguladores: A) Planta matriz;
B-D) Indução de CN na base do explante após 4 semanas em cultura: B) CN verdes em meio
de cultura suplementado com ANA (4µM) e BAP (2µM) na presença de luz; C-D) indução de
microbrotos (ver setas) em meio de cultura com AIA (20 µM) e 2-iP (2 µM): C) Microbrotos
originados diretamente do explante na presença de luz; D) Microbrotos diferenciados na
ausência de luz; E-H) CN após 13 semanas de cultivo em: E) MSB suplementado com ANA (4
µM) e 2-iP (2 µM) e; F) MSB suplementado com ANA (2 µM) e BAP (4 µM); G) CN de
coloração amarelada cultivada em MSB suplementado com de 2,4-D (20 µM) e 2-iP (2 µM) e;
H) CN após 13 semanas em MSB suplementado com ANA (4 µM) e BAP (2 µM); I-J)
Indução de novas CNs a partir das folhas dos microbrotos regenerados na ausência de luz (ver
seta), após 18 semanas de cultivo em: I) MSB suplementado com de ANA (2 µM) e BAP (4
µM), e; J) MSB suplementado com de AIB (20 µM) e 2-iP (2 µM); K) indução de raízes em
MSB suplementado com de ANA (20 µM) e 2-iP (2 µM) na ausência de luz; L-M) Indução de
CN com textura compacta (ver setas) em MSB suplementado com de TDZ (1 µM) e 2-iP (2
µM): L) Na presença de luz e; M) Na ausência de luz; N-O) Novas CNs (ver seta) após 22
semanas em cultivo em: N) MSB suplementado com de AIA (20 µM) e 2-iP (2 µM), e; O)
CNs friáveis em MSB suplementado com ANA (4 µM) e 2-iP (2 µM). Barra = 3 mm.
58
CNs foram relatadas nas bromeliáceas V. friburgensis var.
paludosa (Alves & Guerra, 2001) em V. reitzii (Alves et al., 2006 e
Rech Filho et al., 2009), e em V. splendens Hibrida (Guerra & Dal
Vesco, 2010). De forma similar ao presente trabalho, a região basal do
segmento de folha de A. comosus também mostrou competência e foi
responsiva tanto para a organogênese quanto para embriogênese
somática (Firoozabady & Moy, 2004). Da mesma forma, bainhas
foliares na região mais próxima do meristema apical de Bactris gasipaes
revelaram maior competência embriogenética (Steinmacher et al., 2007).
Multiplicação – A multiplicação das CNs em ciclos repetitivos
de proliferação ocorreu após 13 semanas em cultivo nos mesmos meios
de cultura empregados para a indução e o padrão morfogênico manteve-
se de acordo com o meio de cultura e ambiente de cultivo utilizado (Fig.
5E-M). Observou-se também que a maior regeneração de CN (Fig. 6A)
e o maior número médio de microbrotos por explantes (Fig. 6B)
ocorreram em resposta aos meios de cultura suplementados com ANA
(2 ou 4 µM) combinado com 2-iP (2 µM) ou com AIA (20 µM) e 2-iP
(2 µM) e quando as culturas eram mantidas na luz.
CNs mantidas na presença de luz caracterizaram-se por serem
friáveis e, apresentarem cor verde e resultaram em ciclos repetitivos de
proliferação de novas CNS e com diferenciação incipiente de
microbrotos (Fig. 5E, F, H). Estas respostas estiveram preferencialmente
associadas aos meios de cultura suplementados com ANA (4 µM)
combinados com 2-iP (2 µM) ou com BAP (2 µM) (Fig. 5E, H). Porém,
quando a proporção foi de 1:2 nos teores de ANA (2 µM) em relação ao
BAP (4 µM), ocorreu, inicialmente, uma maior proliferação de
microbrotos (Fig. 5F), seguido da indução de novas CNS e microbrotos
sucessivamente. A proporção de 2:1 de ANA e BAP também favoreceu
a indução de nódulos organogênicos a partir de explantes foliares de
Populus euphratica e o subcultivo na proporção de 1:10 destes
fitorreguladores promoveu a multiplicação e alongamento de brotos
adventícios (Ferreira et al., 2009).
CNs cultivadas na presença de luz resultaram em maior e
significativa (p<0,01) produção de massa fresca (0,21g) e maior número
médio de microbrotos (11,6 brotos) em comparação aos valores obtidos
na ausência de luz (0,08g e 4,3 brotos, respectivamente). Porém, para
estas duas condições de cultivo, não foram observadas diferenças
significativas no comprimento médio dos microbrotos regenerados após
13 semanas de cultivo (Tabela 4).
Em todos os tratamentos observou-se o desenvolvimento das
CNs, exceto para o meio de culturas suplementado com 2,4-D (20 µM) e
59
2-iP (2 µM). Este meio de cultura resultou na indução de nódulos de cor
amarelo-laranja (Fig. 5G), com baixa capacidade de proliferação e
baixos valores médios de produção de massa fresca (Fig. 6A), não sendo
observada a regeneração de microbrotos (Fig. 6B).
A proliferação das CNs e a produção de microbrotos de V.
friburguensis var. paludosa ocorreram em resposta à combinação de
2,4-D (5 µM) e Kin (1 µM) (Alves & Guerra, 2001). Em A. comosus a
indução de brotos adventícios a partir de bases foliares ocorreu em
resposta ao 2,4-D e BAP (Sripaoraya et al., 2003). Em Dyckia
distachya, Picloram ou 2,4-D resultaram na indução de culturas
embriogênicas e o subcultivo subseqüente em meios com ANA e 2-iP
resultou na regeneração de plântulas (Pompelli et al., 2005). Já, a
indução de culturas nodulares a partir de bases foliares de V. reitzii
ocorreu em resposta ao meio de cultura suplementado com 2,4-D (20
µM) de e Kin (1µM) (Alves et al., 2006) ,e também, a combinação de
Dicamba e Kin induziu a formação de cultura nodulares (Rech Filho et
al., 2009).
Tabela 4. Massa fresca (g) de culturas nodulares (CNs), número médio de
microbrotos e comprimento médio (cm) dos brotos a partir de base foliar de V.
reitzii, em resposta ao meio de cultura MSB suplementado com diferentes tipos e
níveis de fitorreguladores, na presença e ausência de luz após 13 semanas em
cultivo.
Luz
Massa Fresca das
CNs (g)
Número de
brotos/explante
Comprimento (cm)
Presença
0,21 A 11,6 A 0,2 A
Ausência
0,08 B 4,3 B 0,2 A
Média 0,15 8,0 0,2
CV (%) 5,5 21,5 5,4
* Média de três repetições. Médias seguidas de letras diferentes, na coluna, indicam
valores que diferem para o teste SNK (5%). Dados originais transformados em (x +
0,5)
0,5
.
No presente trabalho, quando as culturas foram mantidas na
ausência de luz por 18 semanas observou-se também a proliferação de
novas CNs sobre os microbrotos regenerados. Esta rota morfogenética
iniciou com o intumescimento dos microbrotos (Fig. 5I), ou a formação
de novas CNs diretamente das folhas jovens (Fig. 5J). Estes eventos
caracterizam-se pela indução de ciclos repetitivos de proliferação, entre
CN e microbrotos, confirmando a ocorrência simultânea da regeneração
de ambos. Porém, culturas mantidas na presença de ANA (4 ou 20 µM)
e cultivadas na ausência de luz, além da baixa produção de CN,
60
formaram raízes (Fig. 5K). Por outro lado o meio MSB suplementado
com de TDZ (1 µM) E 2-iP (2 µM) resultou na indução de CN com
textura compacta tanto na presença (Fig. 5L), quanto na ausência de luz
(Fig. 5M).
0
,
0
2
c
0
,
1
0
b
c
0
,
1
6
a
b
c
0
,
3
0
a
0
,
3
5
a
0
,
2
8
a
b
0
,
3
1
a
0
,
1
6
a
b
c
0
,
1
0
b
c
0
,
0
9
b
c
0
,
1
2
b
c
0
,
0
2
c
0
,
1
0
b
c
0
,
0
8
b
c
0
,
0
1
c
0
,
1
1
b
c
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Produção de CN (g)
Presença de Luz Ausência de Luz
A
0
,
0
e
8
,
2
c
6
,
1
c
d
1
9
,
7
a
1
4
,
1
a
b
c
1
6
,
8
a
b
2
0
,
4
a
7
,
6
c
5
,
0
c
d
5
,
1
c
d
7
,
1
c
1
,
4
d
e
9
,
6
b
c
6
,
4
c
d
0
,
0
e
0
,
3
e
0
10
20
30
ANA 20+2
i
P 2
2,4-
D 20+2
i
P
2
A
I
B 20+2i
P
2
AIA 20+1iP
2
TDZ 1+2iP 2
AN
A 2
+BAP
4
ANA
4
+BAP
2
A
NA 4
+2
iP I2
Fitorregulador (µM)
No. de microbrotos
por explantes
B
Figura 6. Produção de culturas nodulares (CNs) a partir de base foliar de V. reitzii:
A)
1
Massa fresca (g) das CNs e; B)
2
Número de microbrotos/explantes em resposta
ao meio de cultura MSB suplementado com diferentes tipos e níveis de
fitorreguladores após 13 semanas em cultivo. Média de três repetições. Médias
seguidas de letras diferentes indicam valores que diferem para o teste SNK (5%).
1
CV(%) = 5,5;
2
CV(%) = 21,5. Dados originais transformados em (x + 0,5)
0,5
.
Em explantes foliares de Decalepis hamiltonii, calos nodulares
friáveis foram induzidos em meios de cultura suplementados com 2,4-D
e BAP e o uso de ANA e BAP resultaram na indução de calos
compactos. Quando estes calos foram subcultivados em meios com BAP
e Zeatina observou-se a formação de embriões somáticos e brotos
adventícios, respectivamente (Giridhar et al., 2004). Nódulos globulares
induzidos em meios de cultura suplementados com TDZ mais AIB e
com posterior subcultivo para meios com BAP e AG
3
, resultaram na
regeneração múltipla e no alongamento de brotos a partir de tecidos
61
foliares de A. comosus (Firoozabady & Moy, 2004). Em Melothria
maderaspatana, tanto explantes foliares quanto de pecíolos cultivados
em meio com 2,4-D combinado com TDZ ou BAP, respectivamente,
produziram nódulos organogênicos, os quais, quando subcultivados em
meio contendo BAP mais TDZ, resultaram em altas freqüências de
regeneração de brotos (Baskaran et al., 2009).
CNs mantidas por 22 semanas sem subcultivo no mesmo meio de
cultura e na presença de luz produziram novas CNs a partir de
microbrotos (Fig. 5N) e a partir delas mesmas, configurando ciclos
repetitivos de regeneração de CN (Fig. 5O). Este padrão de resposta
morfogenética in vitro parece ser recorrente no gênero Vriesea (Alves &
Guerra, 2001; Rech Filho et al., 2005, 2009; Guerra & Dal Vesco,
2010).
Multiplicação - A taxa de multiplicação das CNs observada no
presente trabalho esteve associada à composição do meio de indução e
estabelecimento (Fig. 7). A maior (p<0,05) eficiência regenerativa
(8,6g/g de CN) foi obtida quando as culturas foram originadas em MSB
suplementado com 4 µM de ANA + 2 µM 2-iP e posteriormente
subcultivadas em meio de cultura MSB líquido e isento de
fitorreguladores (Fig. 7). Por sua vez, o maior (p<0,01) número de
microbrotos regenerados ocorreu em resposta ao meio de cultura MSB
suplementado com 2 µM de ANA e 4 µM de BAP (140,0
microbrotos/g), seguido do meio de cultura suplementado com 4 µM de
ANA e 2 µM de BAP com 124,3 microbrotos/g de CN (Tabela 5).
O comprimento médio dos microbrotos ultrapassou a 1,0 cm. E,
em relação à consistência física dos meios de cultura não foram
observadas diferenças significativas para os parâmetros avaliados
(Tabela 5). Porém, o uso do meio geleificado permitiu a manutenção das
CNs em ciclos repetitivos e, principalmente, promoveu a multiplicação
das culturas originadas do meio de cultura suplementado com ANA ou
de 2,4-D (20 µM cada) que, revelaram baixa proliferação (Fig. 7). O uso
do meio geleificado promoveu maior taxa de regeneração de brotos/g a
partir de nódulos de Charybdis numidica (Wawrosch et al., 2005). Tanto
o meio líquido quanto o geleificado foram eficientes para a indução de
nódulos organogênicos e a regeneração de brotos in vitro de M.
maderaspatana (Baskaran et al., 2008). Segundo Ziv (2000) a
consistência física do meio de cultura afeta a rota morfogenética das
culturas in vitro.
62
3
,
1
c
d
e
4
,
6
c
d
5
,
5
b
c
5
,
8
b
8
,
6
a
4
,
3
c
d
0
,
4
f
0
,
6
f
1
,
2
d
f
1
,
9
d
e
f
3
,
3
c
d
e
2
,
5
c
d
e
4
,
3
c
d
4
,
5
c
d
5
,
7
b
5
,
3
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A
N
A
2
0
+
2iP 2
2,4-D 20+2iP 2
AIB 20+2iP 2
A
IA
20
+1iP 2
TD
Z
1+
2iP 2
A
N
A
2
+BA
P 4
A
NA 4
+
B
A
P 2
A
NA 4
+
2iP I
2
Fitorrregulador (µM)
Eficiência Regenerativa
Líquido Geleificado
Figura 7. Eficiência regenerativa* das CNs a partir de base foliar de Vriesea reitzii
em relação à combinação e concentração dos fitoreguladores do meio de origem e o
subcultivo em meio de cultura MSB líquido ou geleificado, 13 semanas de cultivo.
Média de três repetições. Médias seguidas de letras diferentes indicam valores que
diferem para o teste SNK (5%). CV(%) = 14,7. Dados originais transformados em (x
+ 0,5)
0,5
. * Eficiência regenerativa = (Massa final – Massa inicial)/Massa inicial.
Protocolos regenerativos in vitro baseados em CNs podem ser
empregados como estratégia eficiente para a micropropagação de
bromélias em grande escala. A competência deste tipo de cultura por
promover elevadas taxas regenerativas está relacionada ao tipo de tecido
utilizado e sua determinação em resposta aos estímulos aplicados.
Modificações podem ser requeridas durante o processo de cultivo para a
aquisição desta competência (Hicks, 1994). Esta rota morfogenética
pode seguir um caminho de diferenciação que culmina na produção
múltipla de brotos adventícios em resposta aos meios de cultura
apropriados (Gahan & George, 2008).
A manutenção das CNs em ciclos repetitivos, observada neste
trabalho, apresentou a seguinte seqüência de eventos: i) indução de CN;
ii) regeneração de microbrotos; iii) indução de novas CNs a partir de
microbrotos ou; iv) a regeneração de microbrotos e CN de forma
contínua. No entanto, estes eventos foram dependentes do ambiente de
cultivo, do tipo, concentração e balanço dos fitorreguladores
suplementados ao meio de cultura.
Aclimatização - Brotos alongados com altura superior 3,0 cm
resultou em mais de 95% de sobrevivência, após 30 dias da transferência
para bandejas (Fig. 3E). O transplante das mudas aclimatizadas para
63
vasos de 350 ml resultou no pleno desenvolvimento das plantas após
três meses (Fig. 3F).
Tabela 5. Eficiência regenerativa* das CNs, número médio estimado de
microbrotos/g de CN e comprimento (cm) dos brotos Vriesea reitzii em resposta à
combinação e concentração dos fitoreguladores do meio de origem, após 13 semanas
com o subcultivo em meio de cultura MSB isento de fitorreguladores.
Meio de origem
(µM) Inicial Final
ANA (4,0) + 2-iP (2,0) 0,39 3,21 7,2 a 88,1 bc 0,6 ab
ANA (4,0) + BAP (2,0) 0,41 2,49 5,1 b 124,3 ab 0,8 a
ANA (2,0) + BAP (4,0) 0,42 2,37 4,7 b 140,0 a 0,6 ab
AIB (20,0) + 2-iP (2,0) 0,44 2,58 4,8 b 77,3 cd 0,8 a
AIA (20,0) + 2-iP (2,0) 0,42 2,24 4,4 b 67,1 cd 0,9 a
TDZ (1,0) + 2-iP (2,0) 0,42 1,61 2,8 c 86,0 bc 0,4 c
2,4-D (20,0) + 2-iP (2,0) 0,21 0,46 1,2 d 0,0 e 0,0 c
ANA (20,0) + 2-iP (2,0) 0,32 0,61 0,9 d 49,2 d 0,9 a
Média 0,38 1,95 3,9 79 0,6
4,1 A 78,7 A 0,6 A
3,6 A 79,3 A 0,7 A
14,7 17,2 10,5
Líquido
Geleificado
CV (%)
Comprimento
(cm)
Massa fresco (g) Eficiência
regenerativa
Nº estimado de
microbrotos/g
CNs
Consistência física do meio
Média de três repetições. Médias seguidas de letras diferentes, na coluna, indicam
valores que diferem para o teste SNK (5%). Dados originais transformados em (x +
0,5)
0,5
.* Eficiência regenerativa = (Massa final – Massa inicial)/Massa inicial.
Em conclusão, no presente trabalho, os diferentes padrões
morfogenéticos e taxas de indução e proliferação das CNs observados a
partir de sementes e bases foliares de V. reitzii estão associados,
especificamente, as concentrações e combinações de cada fitorregulador
testado, bem como às condições de cultivo. Nestas condições o modelo
regenerativo baseado na indução, multiplicação e desenvolvimento de
CN de V. reitzii aqui descrito se configuram como um sistema de
micropropagação de alta eficiência regenerativa para esta e outras
bromélias do mesmo gênero que apresentam potencial ornamental ou se
encontrem ameaçadas de extinção.
64
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68
7. CAPÍTULO 3
Morfogênese in vitro e regeneração de brotos adventícios em
grande escala a partir de culturas nodulares de Vriesea reitzii
[Artigo aceito para publicação no Periódico Scientia Horticulturae]
Lirio Luiz Dal Vesco
5
, Miguel Pedro Guerra
1
*
RESUMO
O sistema de micropropagação baseado em culturas nodulares
(CNs) diferencia-se dos sistemas regenerativas tradicionais. Esta rota da
morfogênese in vitro, tal como observada em V. reitzii, não se enquadra
tanto da organogênese tradicional quanto da embriogênese somática, por
apresentar elevadas taxas regenerativas e, por isto, pode ser definida
como uma via intermediária. CN de coloração verde-amareladas
mantidas em meios de cultura MSB liquido e isento de fitorreguladores,
foi à fonte de explantes para os ensaios de regeneração e alongamento
de brotos. Para o ensaio de regeneração das CNs foram testados quatro
concentrações de ANA (0, 2, 4 e 6 µM) em combinação com duas de 2-
iP (0 e 2 µM). Dois ensaios de alongamento foram testados o meio de
cultura MSB suplementado com AG
3
(0; 5; 10 e 15 µM) utilizando
tubos de ensaio, sobre ponte de papel e frascos de 340ml. A maior
eficiência regenerativa e a proliferação de micro brotos em grande
escala foram obtidos com o uso do meio MSB suplementado com 2 µM
de ANA e 2 µM de 2-iP. O subcultivo em meio MSB suplementado com
10 µM de AG
3
promoveu um maior alongamento de brotos e de forma
sincronizada. A utilização destes meios de cultura pode ser obtida uma
eficiência regenerativa de 12,4 g/g de CN inoculada. Estima-se, a partir
disto, uma regeneração de mais de 5.300 novos microbrotos e na fase de
alongamento, uma taxa efetiva de 75% destes microbrotos podem ser
convertidos em brotos completos a cada 10 semanas de cultivo. As
análises estruturais das CNs revelaram que o processo morfológico
regenerativo de microbrotos ocorre a partir da proliferação de grupos de
células meristemáticas e que desenvolvem a formação de múltiplos
meristemas caulinares e com o desenvolvimento dos primórdios foliares
resulta na formação de estruturas monopolares denominadas de
microbrotos. Estas estruturas regenerativas sustentam a classificação de
CNs organogênicas.
5
Programa de Pós- graduação em Recursos Genéticos Genéticos Vegetais, Universidade
Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil.
Correspondente: mpgu[email protected].br
69
Palavras chaves: Bromeliáceas, cultura nodular, eficiência regenerativa, histologia,
MEV, microbrotos, propagação massal.
Abreviaturas: ANA-ácidonaftalenoacético; BAP-6-benzilaminopurina; CNs -
Culturas nodulares; MSB – meio básico MS; 2-iP - N6 (2-isopentenil) adenina; AG
3
– acido giberélico; MS – Murashige & Skoog (1962); MEV- microscopia eletrônica
de varredura.
ABSTRACT
In vitro morphogenesis and adventitious shoot mass
regeneration of Vriesea reitzii from nodular cultures
The micropropagation system based on nodular cultures (NCs)
diverges from the in vitro regenerative systems based on organogenesis
and somatic embryogenesis, being considered as an intermediary route.
The aim of this study was to establish a regenerative protocol based on
the induction and development of NCs in Vriesea reitzii, an endangered
bromeliad from the Atlantic Forest which also shows ornamental
features. Additionally structural analyses were performed in order to
better understand this in vitro morphogenetic route. NCs were
regenerated in MSB culture medium free of PGR or supplemented with
different levels of NAA in combination or not with 2-iP. The subculture
of these NCs to MSB medium supplemented with 10 µM of GA
3
promoted the synchronized shoot elongation. A regenerative efficiency
of 12.4 g g
-1
of NCs was obtained, and this results in 5,300 microshoots
after 10 weeks in culture. The structural analyses of the NCs revealed
that the regenerative process occurs from the proliferation of
meristematic cell groups resulting in the development of multiple shoot
meristems and buds. The development of NCs lead to the formation of
monopolar structures called microshoots, which evolves to elongated
shoots. Intermediary features shown in NCs are consistent with their
classification as an intermediary system among organogenesis and
somatic embryogenesis.
Keywords: Bromelids, nodular cultures, histology, microshoots, mass propagation.
Abbreviations: BAP-6-benzylaminopurine; NAA-α-naphthaleneacetic acid; NCs –
nodular cultures; MSB – MS basal medium; 2-iP - N
6
(2-isopentenyl) adenine; GA
3
– gibberellic acid; MS – Murashige and Skoog (1962); SEM - scanning electron
microscopy.
INTRODUÇÃO
As bromélias estão entre as espécies de maior importância
ecológica e econômica associadas ao Bioma Mata Atlântica, em razão
da fragmentação deste ecossistema e do interesse da utilização destas
70
espécies como ornamentais. Este bioma apresenta alta biodiversidade e
endemismo, sendo considerado um hotspot de biodiversidade, com mais
20.000 espécies de plantas, 40% das quais são endêmicas (Myers et al.
2000). Estima-se que seus remanescentes primários apresentam apenas
de 7-8% da estrutura original (Galindo-Leal & Câmara, 2003), sendo
que estes se apresentam na forma de fragmentos, na maior parte das
vezes com áreas inferiores a 50 ha (Ribeiro et al., 2009). Este bioma
apresenta, também, índices elevados de diversidade de mamíferos,
anfíbios, répteis e aves (Heywood, 1995), que estão associados direta ou
indiretamente ao complexo subsistema ecológico das bromélias. Nestes
microhabitats, formados, por exemplo, pelos verdadeiros aquários das
bromélias, encontram-se as espécies que coabitam criando entre si
relações de co-evolução. Cada uma destas espécies contribui, portanto,
com sua parcela para a manutenção da estabilidade destes ecossistemas
florestais, em função das especializações e adaptações climáticas
(Benzing, 2000; Martinelli, 2000, Aranda-Peres & Rodriguez, 2006).
A família Bromeliaceae é composta por 58 gêneros e 3172
espécies e subespécies (Luther, 2008) e mais da metade delas são
epífitas (Martinelli, 2000). O gênero Vriesea Lindley pertence à
subfamília Tillandsioideae, que compreende 261 espécies e 44
variedades e formas (Luther, 2008), sendo que 31 destas espécies são
endêmicas do Estado de Santa Catarina (Reitz, 1983). Entre elas,
Vriesea reitzii Leme & Costa é uma bromélia nativa e ameaçada da
Mata Atlântica de Santa Catarina (Figura 1A), ocorrendo em altitudes
entre 750m e 1200m (Baensch & Baensch, 1994) e predominando nos
ecossistemas da Floresta Ombrófila Mista (Leme & Costa, 1991).
Em bromélias, estratégias baseadas nas técnicas de cultura de
tecidos vegetais podem possibilitar a propagação em larga escala, tanto
para a captura e fixação de ganhos genéticos para efeitos ornamentais,
quanto para a sua conservação. Alguns padrões de respostas
morfogenéticas in vitro, observados e descritos em bromélias revelam
características diferenciadas dos sistemas regenerativos tradicionais
baseados na organogênese e embriogênese somática (Alves et al., 2006,
Guerra e Dal Vesco, 2010). Estes sistemas regenerativos foram
definidos como culturas nodulares (CNs), as quais apresentam alto
potencial regenerativo, sendo já descritos para o gêneros Vriesea (Alves
& Guerra, 2001, Rech Filho et al., 2005: Alves et al., 2006 e Guerra &
Dal Vesco, 2010) e em Ananas (Teng, 1997 e Firoozabady & Moy,
2004). Esta rota morfogenética, ao revelar características distintas tanto
da organogênese quanto da embriogênese somática, pode ser definida
como uma terceira rota da morfogênese in vitro (George, 1993).
71
Sistemas similares às CNs descritas em bromélias foram
reportados em Humulus lupulus, sendo denominados de culturas
nodulares organogênicas (Batista et al., 2000) ou nódulos organogênicos
(Fortes & Pais, 2000; Forte et al., 2002). Por nódulos organogênicos
foram também descritos para Populus euphratica (Ferreira et al., 2009).
Porém, em Decalepis hamiltonii foram denominadas de calos nodulares
(Giridhar et al., 2004) e em Sclerocarya birrea foram descritos como
nódulos meristemáticos (Moyo et al., 2009).
A competência celular do explante em induzir estas rotas
regenerativas depende da sua capacidade de resposta aos sinais
extracelulares, entre eles a composição basal do meio de cultura, o tipo e
balanço dos fitorreguladores utilizados e ao ambiente de cultivo (Preece,
2008). Esta competência está também associada juvenilidade dos tecidos
e órgãos dos explantes (Gahan & George, 2008).
O objetivo deste trabalho foi estabelecer e descrever as
características morfogenéticas de um sistema regenerativo baseado na
indução, proliferação e desenvolvimento de CN de V. reitzii em
diferentes meios de cultura e combinações de fitorreguladores.
MATERIAL E MÉTODOS
Culturas nodulares (CNs) foram induzidas a partir de bases
foliares de brotos de V. reitzii cultivados in vitro. Para isto, CNs foram
inoculadas em tubos de ensaio (22 x 150 mm) contendo 15 ml de meio
de cultura composto pela formulação salina MS (Murashige & Skoog,
1962), vitaminas de Morel (Morel & Wetmore, 1951), sacarose (30g L
-
1
) denominado doravante de meio MS básico (MSB). Este meio de
cultura foi suplementado com 4 µM de ANA-ácido α-naftalenoacético e
2 µM de 2-iP-N
6
(2-isopentenil) adenina. Em seguida, CNs foram
multiplicadas e mantidas em meio MSB geleificado e isento de
fitorreguladores, por dois subcultivos de 13 semanas cada, utilizadas
como fonte de explantes para este trabalho (Fig. 1B). As condições de
cultivo seguiram os procedimentos descritos por Alves et al. (2006). O
pH dos meios de cultura foi ajustado para 5,5 antes da autoclavagem a
1,3 atm durante 16 min.
Regeneração de microbrotos – Avaliaram-se os efeitos de
diferentes combinações e concentrações de fitorreguladores
suplementados ao meio de cultura MS básico líquido. O desenho
experimental seguiu um esquema fatorial (4x2) com oito tratamentos:
quatro concentrações de ANA (0, 2, 4 e 6 µM) em combinação com
duas de 2-iP (0 e 2 µM) na forma de blocos completos casualizados
(BCC). Cada unidade experimental foi constituída de cinco tubos de
72
ensaios (25 x 150 mm), contendo 15 ml de meio de cultura e inoculados
com aglomerados de CN com 0,132g ±0,005g de massa fresca por tubo,
sobre ponte de papel filtro com quatro repetições. Dados de massa fresca
das CNs, bem como o número de microbrotos regenerados foram
coletados após 10 semanas de cultivo.
Alongamento de microbrotos - Experimento 1 – Avaliou-se a
suplementação ao MSB líquido de diferentes concentrações de AG
3
-
ácido giberélico. O desenho experimental foi um esquema fatorial com
32 tratamentos: quatro concentrações de AG
3
(0, 5, 10, 15 µM) em
combinação com os oito meios de cultura de origem (ensaio de
regeneração), na combinação de quatro concentrações de ANA (0, 2, 4 e
6 µM) com duas de 2-iP (0 e 2 µM). Cada unidade experimental foi
constituída de cinco tubos de ensaios (22 x 150 mm) contendo 15 ml dos
meios de cultura liquido e inoculados com 0,2g ±0,02g de massa fresca
de CN por tubo, sobre ponte de papel filtro, disposto em BCC com
quatro repetições. Dados de número de brotos alongados por classe de
altura de brotos e massa fresca das culturas nodulares, bem como
microbrotos não alongados foram coletados após 10 semanas de cultivo.
Experimento 2 – Foram utilizados como fonte de explantes os
microbrotos não alongados (3-5 mm) do ensaio 1 e subcultivados em
frascos de vidro com capacidade de 340 ml, contendo 18 ml de meio de
cultura líquido. O desenho experimental foi um esquema fatorial com 32
tratamentos, os mesmos utilizados no ensaio 1. Cada unidade
experimental foi constituída de cinco frascos inoculados com
aglomerados de CN com 1,0g ±0,01g de massa fresca por frasco,
distribuídas em forma de BCC com três repetições. Dados de número de
brotos alongados por classe de altura de brotos e massa fresca foram
coletados após 10 semanas de cultivo.
Aclimatização – Brotos alongados foram transferidos para
substratos compostos por uma mistura de substrato comercial
Plantmax
®
, casca de arroz carbonizada e casca composta de arvores
(1:1:1 v/v) dispostos em bandejas de isopor com 128 células. As mudas
foram mantidas em túnel de nebulização com irrigação intermitente. O
delineamento do experimento foi em BCC com 32 tratamentos,
mantendo os meios de cultura de origem descritos nos ensaios de
alongamento. Cada unidade experimental foi constituída de 8
aglomerados de brotos (media de 6-7 brotos/aglomerado) e três
repetições. Dados de porcentagens de sobrevivência foram coletados
após 10 semanas.
Procedimentos Histológicos - Amostras representativas das
culturas nodulares foram coletadas em diferentes períodos de cultivo e
73
fixadas por 24 horas em solução FAA 70%, (5% de formaldeído: 90%
álcool 70 ºGL: 5% ácido acético) (v:v:v). Durante o processo de fixação
o material foi colocado em câmara de vácuo. Em seguida as amostras
foram desidratadas em série em série etílicas (etanol) gradual (70–96 %)
por 30 min cada. As amostras foram imersas em solução de pré-
infiltração do Kit de historesina Leica® [50 mL de resina básica e 0,5 g
de peróxido de benzoila (ativador)] com etanol 96% (1:1, v/v) por 16-18
h a 25 ºC. Em seguida as amostras foram imersas em de solução de
infiltração pura durante 24h e incluídas em solução de infiltração com
Endurecedor Leica® (dimetil sulfóxido) na proporção de 15:1 (v/v) e
orientadas em cápsulas gelatinosas. Secções (5-7 µm) foram obtidas
usando microtomo de rotação Slee Technik®, distendidas em lâminas
com uma gota de água e mantidas por 1-2h a temperatura de 42 ±2 ºC.
Após a evaporação da água foram coradas com azul de toluidina O a
0.05% em H
2
O e os aspectos relevantes foram identificados e
fotografados usando câmara DP 71 acoplada a microscópio BX-40 da
Olympus®.
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) - Amostras
representativas das culturas in vitro foram coletadas em diferentes
períodos e fixadas glutaraldeido (2.5 %) em tampão fosfato de sódio 0,2
M (pH 7,2) por 16-18 h a 25 ºC. Em seguida as amostras foram lavadas
por três vezes em tampão sem fixativo e desidratada em série em série
etílica (etanol) gradual (10–100%), por 30 min cada. Em seguida foram
colocar em éter etílico (PA) e mantidas em freezer (-20 ºC) por 24 horas,
procedimento utilizado para substituir o ponto crítico de CO
2
. Após
evaporar o éter, as amostras foram montadas sobre suporte de alumínio
(stub) com dimensões de 9,5 de Ø x 10 mm de altura coladas com fita
carbono dupla face. Anteriormente as análises as amostras foram
mantidas em sílica e metalizadas com uma fina camada de ouro.
Imagens relevantes foram obtidas em microscópio JEOL® modelo JSM-
6390LV a 10 kV.
Análise estatística – Dados de cada parâmetro foram submetidos
ao teste F
max
para verificar heterogeneidade das variâncias (S
2
). Quando
necessário os dados originais foram transformados em log (x+1) ou
(x+0,5)
0,5
. Estes dados foram submetidos à análise da variância
(ANOVA) e ao teste Student-Newman-Keuls (SNK-5%) de separação
de médias usando Statgraphics software, versão 7.0. Dados quantitativos
foram avaliados pela análise de regressão de acordo com Compton
(1994).
74
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Estabelecimento e manutenção - CNs são definidas, neste
trabalho, como aglomerados de nódulos organogênicos friáveis com
diferenciação incipiente, coloração verde-amarelada a translúcida, (Fig.
1B). Eventualmente as culturas revelam o desenvolvimento incipiente
de microbrotos (Fig. 1C). Estas culturas foram mantidas por subcultivos
sucessivos por mais de dois anos em meio MSB geleificado e isento de
fitorreguladores e intercalados com a suplementação de ANA (2 ou 4
µM e 2-iP (0 ou 2 µM). No entanto, o subcultivo de ± 0,132g destas
CNs para meios de cultura MSB líquidos, suplementados ou não com
ANA e 2-iP e sobre ponte de papel filtro (Fig. 1D), resultou na
proliferação de novas CNs (Fig. 1E). Estas culturas, após seis semanas
em cultivo, apresentavam intensa proliferação, textura friável e
diferenciação incipiente de microbrotos (Fig. 1F).
Rotas morfogenéticas semelhantes a do presente estudo, também
foram obtidas para outra bromélia (Tillandsia eizii), para a qual, culturas
com numerosas gemas adventícias e com alta capacidade de proliferação
foram mantidas em meio basal por mais de seis meses (Pickens et al.,
2006). Em Humulus lupulus pequenos aglomerados diferenciaram-se em
nódulos organogênicos de coloração verde-amarelados e, quando
transferidos para meios de cultura líquido desenvolveram-se em
pequenos brotos (Batista et al., 2000). A indução de nódulos a partir de
explantes foliares de Charybdis numidica foi favorecida com o uso do
meio MS líquido suplementado com BAP (Kongbangkerd et al., 2005).
Em Amorphophallus albus calos friáveis foram obtidos a partir de
segmentos de pecíolo após duas semanas em cultura em resposta ao
meio MS suplementado com ANA e BAP (Hu & Li, 2008). Já, em
Helicteres isora a indução de brotos adventícios ocorreu a partir de
calos morfologicamente distintos apresentando textura granular em meio
de cultura suplementado com BAP e Kin (Shriram et al., 2008). Em
Populus euphratica a diferenciação de brotos adventícios foi obtida a
partir de nódulos organogênicos em meio MS suplementado com ANA
e BAP (Ferreira et al., 2009). O uso de ANA e BAP também induziu
aglomerados de nódulos meristemáticos a partir de explantes foliares de
Sclerocarya birrea (Moyo et al., 2009).
Regeneração – Culturas com expressiva regeneração em
microbrotos foram observadas a partir da oitava semana em cultivo. Isto
foi observado principalmente em resposta ao uso do meio de cultura
MSB liquido suplementado com ANA (2 µM) e 2-iP (2 µM) após 10
semanas em cultivo (Fig. 1G). Após 21 semanas no mesmo meio de
cultura observou-se uma intensa e sincrônica proliferação de
75
microbrotos (Fig. 1H), os quais apresentavam tamanho médio entre 3 a
5 mm (Fig. 1I).
O padrão morfogenético associado à indução e proliferação de
CN observado no presente trabalho culmina com o desenvolvimento e
regeneração em grande escala de microbrotos que evoluem para brotos
completos. Estas características parecem ser recorrentes na cultura in
vitro de V. reitzii. e foram descritas também para este mesmo gênero em
outros trabalhos (Rech Filho et al., 2005 e 2009, Alves et al., 2006,
Guerra & Dal Vesco, 2010). Ainda de acordo estes autores, o padrão de
coloração e textura é modulado pela composição do meio de cultura
utilizado na fase de indução. Com base na competência regenerativa
destas CNs elas se configuram em excelente fonte para a produção
massal de mudas em larga escala e a baixo custo, principalmente,
quando associado ao uso de biorretores (Paek et al., 2005).
CNs com expressivas taxas regenerativas médias de 10,3 vezes
em relação ao inoculo inicial foram observadas em resposta ao meio de
cultura MSB líquido, suplementado com diferentes concentrações de
ANA em combinação com 2-iP (Tabela 1). Com base no número médio
total de microbrotos regenerados neste ensaio, as projeções médias
estimadas permitem inferir uma produção de 3.300 novos microbrotos/g
de CN após 10 semanas em cultivo. Observou-se também que a maior
eficiência regenerativa (12,4 vezes) e o maior número estimado de
microbrotos (5.329 microbrotos/g de CN) ocorreram em resposta ao
emprego do meio de cultura MSB suplementado com de ANA e 2-iP (2
µM cada).
Alta eficiência regenerativa (11,3 vezes) e elevado número médio
de brotos regenerados por grama de CN inoculada (322,6 brotos/g)
também ocorreram em resposta ao emprego do meio de cultura MSB
suplementado com 2 µM de 2-iP (Tabela 2). O modelo quadrático da
análise de regressão foi o que melhor descreveu a evolução da eficiência
regenerativa e do número médio de microbrotos em resposta ao uso de
2-iP combinado com ANA (Fig. 2A e B). Observou-se também que o 2-
iP (2 µM) suplementado ao meio MSB proporcionou alta taxa
regenerativa e maior número de microbrotos, quando comparado com o
meio de cultura isento deste fitorregulador (Fig. 2B). Para o fator
suplementação de ANA ao meio MSB, o uso de 4 ou 2 µM deste
fitorregulador resultou em maiores taxas médias de regeneração de
microbrotos (339,4 e 327,9 brotos/g, respectivamente). Estas taxas
regenerativas diferenciam-se significativamente (p<0,01) em relação ao
uso do meio de cultura MSB isento ou suplementado com 6 µM de
ANA, após 10 semanas em cultivo (Tabela 3)
76
Figura 1. Estabelecimento e multiplicação de culturas nodulares (CNs) e
regeneração de microbrotos de Vriesea reitzii em meio de cultura MS líquido
suplementado com ANA e 2-iP: A) Planta matriz, detalhe da inflorescência; B) CN
de coloração verde amarelada cultivadas em meio de cultura MSB geleificado e
isento de fitorreguladores e; C) CN com indução de microbrotos; D) CNs utilizadas
como inóculo para a multiplicação; E) Proliferação das CNs após três semanas de
cultivo; F) Após seis semanas em cultivo, com as CNs de coloração verde e início
da indução de microbrotos (setas); H) Regeneração múltipla de microbrotos em
meios de cultura com ANA e 2-iP (2 µM cada): G) Após 10 semanas em cultivo; H)
Desenvolvimento de microbrotos em grande escala após 21 semanas em cultivo, e;
I) Detalhe dos microbrotos regenerados com tamanho médio entre 3 a 5mm Barra: =
5mm.
77
Tabela 1. Eficiência regenerativa de CN de Vriesea reitzii em relação à massa fresca
inicial e final (g) e o número médio estimado de microbrotos/g de CN inoculada em
meio de cultura MS suplementado com ANA (0, 2, 4 e 6 µM) e combinados com de
2-iP (0 e 2 µM), após10 semanas em cultivo.
ANA (µM) 2-iP (µM)
Inicial Final
0
0
0,129
1,407
9,9 (±1,7)
306,5 (±25)
2.376 (±151)
2
0
0,131
1,336
9,2 (±1,3)
345,8 (±42)
2.640 (±267)
4
0
0,132
1,439
9,9 (±0,4)
425,2 (±38)
3.221 (±295)
6
0
0,132
1,298
8,8 (±0,8)
284,7 (±92)
2.156 (±617)
0
2
0,134
1,437
9,7 (±2,1)
342,8 (±74)
2.558 (±547)
2
2
0,133
1,781
12,4 (±1,8)
708,7 (±82)
5.329 (±506)
4
2
0,131
1,649
11,6 (±1,5)
632,0 (±32)
4.824 (±288)
6
2
0,131
1,598
11,2 (±2,7)
427,5 (±88)
3.263 (±751)
0,132 (±0,005) 1,493 (±0,21) 10,3 (±1,5) 434,1 (±59) 3.289 (±428)
Nº estimado de
microbrotos/g
CN
Média
Fitorregulador Massa fresca (g) Eficiência
regenerativa
Total de
micro brotos
regenerados
* Média de quatro repetições. Valores não significativos segundo a ANOVA.
Eficiência regenerativa = (Massa final – Massa inicial)/Massa inicial. Média (±
desvio padrão).
Tabela 2. Eficiência regenerativa das CNs e número médio de microbrotos
regenerados/g de CN de Vriesea reitzii em resposta ao meio de cultura MS
suplementado com 2-iP (0 e 2 µM) após 10 semanas em cultivo.
2-iP (µM) Eficiência regenerativa Nº. de microbrotos/g
2 11,3 A 322,6 A
0 9,7 B 247,8 B
Média 10,5 285,2
CV (%) 16,7% 23,4%
Média de quatro repetições. Médias seguidas de letras diferentes indicam valores
que diferem para o teste SNK (5%). Eficiência regenerativa = (Massa final – Massa
inicial)/Massa inicial.
Os diferentes potenciais de regeneração de brotos adventícios in
vitro estão relacionados às características da espécie, ao sistema
regenerativo e à composição do meio de cultura (George & Debergh,
2008, Preece, 2008). Assim, considerando a produção de brotos
adventícios de Charybdis numidica, o maior número de brotos
adventícios regenerados/g de CN foi obtido em meio de cultura MS com
ANA e BAP (Kongbangkerd et al., 2005). Em Hovenia dulcis, altas
taxas regenerativas de primórdios caulinares a partir de calos nodulares
foram obtidas em meio de cultura MS suplementado com 2-iP. O
subseqüente desenvolvimento dos microbrotos foi obtido com a
78
transferência dos mesmos para meio isento de fitorreguladores (Jeong et
al., 2009). Em Sclerocarya birrea a alta freqüência de regeneração de
brotos adventícios foi observada a partir de nódulos meristemáticos em
resposta ao meio de cultura WPM suplementado com BAP em
combinação com ANA, AIB ou AIA (Moyo et al., 2009). Entretanto, em
Daucus carota subsp. halophilus, o incremento do número de brotos
regenerados ocorre com o aumento dos níveis de BAP no meio de
cultura a partir de calos organogênicos em dois ciclos de cultivo
(Tavares et al., 2010).
Figura 2. A) Evolução da eficiência regenerativa
1
e; B) Número médio de brotos
regenerados/g de CN de Vriesea reitzii em resposta ao ANA (0, 2, 4 e 6 µM),
suplementado ao meio de cultura MS após 10 semanas de cultivo. Média de quatro
repetições.
1
Eficiência regenerativa = (Massa final – Massa inicial)/Massa inicial.
Alongamento de microbrotos - O alongamento dos microbrotos
ocorreu em resposta ao subcultivo para meio de cultura MSB líquido,
suplementado com AG
3
(Fig. 3A). O uso de ± 0,2g de CN por tubo de
ensaio, sobre ponte de papel filtro, resultou no alongamento sincrônico
de brotos após 10 semanas de cultivo (Fig.3A -5, 10 e 15 µM). Por outro
lado, o uso do meio MSB isento de AG
3
promoveu uma contínua e
sincrônica regeneração de novos microbrotos (Fig. 3A).
Y
(2 µM 2 -iP )
= -0,196x
2
+ 1,372x + 9,932 r
2
= 0,864
Y
(0 µM 2 - iP )
= - 0,077x
2
+ 0,288x + 9,964 r
2
= 0,998
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
0 2 4 6
Eficiência Regenerativa
2-iP (2 µM) 2-iP (0 µM)A
Y
(0 µM 2 -iP )
= -7,21x
2
+ 45,49x + 212,27 r
2
= 0,849
Y
(2 µM 2- iP )
= -17,01x
2
+ 106,1x + 242,4 r
2
= 0,985
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 2 4 6
ANA (µM)
Número micro Brotos/g
0 µM de 2-iP 2 µM de 2-iPB
Y
(2 µM 2 -iP )
= -0,196x
2
+ 1,372x + 9,932 r
2
= 0,864
Y
(0 µM 2 - iP )
= - 0,077x
2
+ 0,288x + 9,964 r
2
= 0,998
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
0 2 4 6
Eficiência Regenerativa
2-iP (2 µM) 2-iP (0 µM)A
Y
(0 µM 2 -iP )
= -7,21x
2
+ 45,49x + 212,27 r
2
= 0,849
Y
(2 µM 2- iP )
= -17,01x
2
+ 106,1x + 242,4 r
2
= 0,985
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 2 4 6
ANA (µM)
Número micro Brotos/g
0 µM de 2-iP 2 µM de 2-iPB
79
Figura 3. Desenvolvimento de brotos a partir de culturas nodulares (CNs) de
Vriesea reitzii cultivados em meio MSB líquido suplementado ou não com AG
3
: A)
Regeneração de microbrotos em tubo de ensaio, sobre ponte de papel filtro, em meio
MSB liquido isento de AG
3
e alongamento sincronizado de brotos em meio
suplementado com 5, 10 e 15 µM de AG
3
; B-C) Brotos cultivados em frascos de
vidro (340 ml) contendo meio líquido: B) Alongamento sincrônico dos brotos em
meio MSB com 10 µM de AG
3
. Observar também a regeneração repetitiva de
microbrotos e; C) Mortalidade das culturas em meio suplementado com 15 µM de
AG
3
; D) aclimatização das mudas em substrato em bandeja de isopor de 128 células,
após cinco semanas e; E) Desenvolvimento das mudas em vasos após 20 semanas
em ambiente ex vitro. Barra: 1 cm.
80
No ensaio 2 o cultivo em frascos de vidro de 340 ml com uma
quantidade de inóculo maior (± 1g de CN/frasco) resultaram em um
intenso desenvolvimento dos microbrotos (Fig. 3B-C). O meio MSB e
isento de AG
3
resultou no alongamento dos microbrotos, quando
comparado aos resultados obtidos com o uso de tubos de ensaio. Um
intenso e sincrônico desenvolvimento de brotos ocorreu em resposta à
suplementação ao meio MSB com 10 µM de AG
3
(Fig. 3B). Por outro
lado, o cultivo dos microbrotos em MSB suplementado com 15 µM de
AG
3
promoveu maior mortalidade das culturas (Fig. 3C). Além disto,
em frascos de vidro e reduzidas quantidades de inóculo parecem ser
mais sensíveis as oscilações térmicas da sala de cultivo. Associados a
estes eventos, o fator concentração dos fitorreguladores pode
potencializar a mortalidade das culturas, tal como foi observada em
resposta ao uso de 15 µM de AG
3
.
Tabela 3. Taxa de eficiência regenerativa, número médio de microbrotos
regenerados/g de CN de Vriesea reitzii em resposta ao ANA (0, 2, 4 e 6 µM),
suplementado ao meio de cultura MS após 10 semanas em cultivo.
ANA (µM) Eficiência
Regenerativa
Nº. de
microbrotos/g
4 10,8 A 339,4 A
2 11,3 A 327,9 A
6 10,1 A 245,3 B
0 9,9 A 228,2 B
Média 10,5 285,2
CV (%) 16,7% 23,4%
Média de quatro repetições. Médias seguidas de letras diferentes indicam valores
que diferem para o teste SNK (5%). Eficiência regenerativa = (Massa final – Massa
inicial)/Massa inicial.
A evolução do número médio de brotos alongados, da eficiência
regenerativa e da altura média dos brotos dos dois ensaios expressou
valores de r
2
significativos. O modelo quadrático foi o mais adequado
para explicar a evolução destes dados em respostas aos diferentes níveis
de AG
3
, suplementado ao meio MSB (Fig. 4A-B), bem como, das
combinações dos diferentes níveis de ANA e de 2-iP suplementados ao
meios MSB (Fig. 4C-D).
Observou-se também que o número médio de microbrotos
alongados aumentou concomitantemente ao aumento na concentração de
AG
3
até 10 µM (Fig. 4A). Por outro lado, a eficiência regenerativa
medida em massa fresca das CNs diferenciadas somada à massa fresca
dos microbrotos regenerados e não alongados, decresceu com o aumento
da concentração de AG
3
. Assim, o meio de cultura MSB isento de AG
3
81
foi o que resultou em eficiência média regenerativa mais elevada (7,3
vezes) (Fig. 4B).
Neste sentido, as derivações das equações e suas projeções
teóricas (Fig. 4A) revelam que a produção máxima esperada é de 319
brotos alongados/g de CN em resposta à concentração de 9,8 µM de
AG
3
. Portanto, quando os 12,4 g das CNs, obtidas no meio de
regeneração são subcultivados neste meio de cultura, podem ser obtidos
3.956 novos brotos alongados após 10 semanas em cultivo. Isto
representa uma taxa efetiva de aproximadamente 75% dos microbrotos
inicialmente obtidos no meio de cultura de regeneração (5.329 brotos),
que podem ser convertidos em brotos, para cada intervalo de 10 semanas
de cultivo. Considera-se também que, a partir dos 3.956 brotos
alongados e a possibilidade de serem feitas, em média 5,2,
subcultivos/ano, isto representa mais de 20.000 brotos/ano para cada
gramas de CN inoculada. Um subseqüente subcultivo destes brotos em
MSB isento de fitorreguladores ou suplementado com AG
3
(5 a 10 µM)
resulta em brotos aptos a serem aclimatizados em mais 7 a 8 semanas de
cultivo.
Figura 4. A-B) Evolução da taxa média regenerativa de dois subcultivo a partir de
clusters de microbrotos de Vriesea reitzii em resposta ao meio de cultura MS
suplementado com AG
3
(0, 5, 10 e 15 µM):; A) Número médio de brotos
alongados/g de CN e; B) Eficiência regenerativa das culturas nodulares e altura
(cm); C-D) Evolução da taxa regenerativa de CN em resposta ao meio de cultura de
origem, MS suplementado com ANA (0, 2, 4 e 6 µM) combinado com 2-iP (0 e 2
µM), C) Evolução do número médio de brotos alongados/g de CN e; D) Eficiência
regenerativa, 10 semanas em cultivo. * Média de quatro repetições. Eficiência
regenerativa = (Massa final – Massa inicial)/Massa inicial.
4,9
6,8
8,1
3,3
6,6
7,2
7,6
5,7
Y (0µM 2-iP) = -0,412x
2
+ 2,643x + 3,616 r
2
= 0,885
Y (2µM 2-iP) = -0,158x
2
+ 1,051x + 5,832 r
2
= 0,896
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6
Eficiência Regenerativa
2-iP (0 µM) 2-iP (2 µM)
D
ANA
(µM)
214
258
296
250
268
335
329
211
Y(0µM 2-iP) = -5,61x
2
+ 26,42x + 253,65 r
2
= 0,906
Y (2µM 2-iP) = -11,51x
2
+ 77,9x + 213,22 r
2
= 0,993
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 2 4 6
No. Brotos Alongados/g
2-iP (0 µM) 2-iP (2 µM)
C
0,7
1,1
1,2
1,0
7,3
6,4
5,7
5,4
Y(altura)= 0,006x
2
-0,219x +7,327 r
2
= 0,997
Y(eficiência)=0,006x
2
-0,22x +7,33 r
2
= 0,997
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15
Eficiência e altura (cm)
GA
3
(µM)
B
282
321
285
192
Y = -1,319x
2
+ 25,93x +191,04 r
2
= 0,998
0
50
100
150
200
250
300
350
0 5 10 15
No. Brotos Alongados/g
A
4,9
6,8
8,1
3,3
6,6
7,2
7,6
5,7
Y (0µM 2-iP) = -0,412x
2
+ 2,643x + 3,616 r
2
= 0,885
Y (2µM 2-iP) = -0,158x
2
+ 1,051x + 5,832 r
2
= 0,896
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6
Eficiência Regenerativa
2-iP (0 µM) 2-iP (2 µM)
D
ANA
(µM)
214
258
296
250
268
335
329
211
Y(0µM 2-iP) = -5,61x
2
+ 26,42x + 253,65 r
2
= 0,906
Y (2µM 2-iP) = -11,51x
2
+ 77,9x + 213,22 r
2
= 0,993
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 2 4 6
No. Brotos Alongados/g
2-iP (0 µM) 2-iP (2 µM)
C
0,7
1,1
1,2
1,0
7,3
6,4
5,7
5,4
Y(altura)= 0,006x
2
-0,219x +7,327 r
2
= 0,997
Y(eficiência)=0,006x
2
-0,22x +7,33 r
2
= 0,997
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15
Eficiência e altura (cm)
GA
3
(µM)
B
282
321
285
192
Y = -1,319x
2
+ 25,93x +191,04 r
2
= 0,998
0
50
100
150
200
250
300
350
0 5 10 15
No. Brotos Alongados/g
A
82
O alongamento dos brotos produzidos in vitro varia
consideravelmente para cada espécie de planta. Algumas apresentam
brotações que permitem individualizar as microestacas durante os
subcultivos ou enraizamento e em outras espécies pelo excesso de
ramificações ou dominância, por exemplo, podem apresentar
dificuldades de alongamento (George & Debergh, 2008). No presente
trabalho, as altas taxas regenerativas e o modelo com base em
microbrotos têm demonstrado que o uso de AG
3
nos subcultivos
incrementa a taxa de alongamento e reduz o tempo em cultivo. Da
mesma forma o uso de AG
3
em meio de cultura MS favoreceu o
alongamento dos brotos adventícios de Melothria maderaspatana após
uma semana de cultivo (Baskaran et al., 2009). A substituição dos
fitorreguladores de indução e multiplicação por AG
3
(10 µM) foram
necessários para promover o alongamento sincronizado dos microbrotos
de V. splendens híbrida originados de meios de cultura contendo TDZ
(Guerra & Dal Vesco, 2010).
Aclimatização - Brotos alongados e originados dos diferentes
meios de cultura MSB suplementados com AG
3
foram aclimatizados
com sucesso. Brotos maiores do que 3,5 cm, quando transplantados para
uma mistura de substratos comerciais em bandejas de isopor com 128
células, mantidas em túnel com nebulização intermitente mostraram
100% de sobrevivência, independente do tratamento de origem (Fig 3D,
dados não mostrados). Mudas aclimatizadas, quando transplantadas para
vasos com o mesmo substrato e mantidas em viveiro com 50% de
sombreamento apresentaram um bom desenvolvimento após 20 semanas
(Fig. 3E).
Análises histológicas e estruturais – Análises de imagens
obtidas em MEV mostraram que as CNs de V. reitzii apresentavam-se
menos diferenciadas, mantendo, porém alta capacidade regenerativa
(Fig. 5A). Observou-se também nestas culturas a indução de nódulos
que se aglomeravam em pequenos maciços (Fig. 5B), com
características de textura friável, de forma globular e de intensa
proliferação conforme descrita na análise morfológica (Fig. 1B-F).
Secções destas CNs coradas com azul de Toluidina O revelaram uma
intensa proliferação celular, com formação de estruturas nodulares
múltiplas (Fig. 5C). Estas estruturas originavam-se a partir de zonas
meristemáticas, que evoluíram para nódulos com protoderme definida,
após três semanas de cultivo (Fig. 5D).
A permanência destas culturas por seis semanas em cultivos
revelou em imagens de MEV, a proliferação de culturas secundárias
com textura granular (Fig. 5E). Em outras culturas observou-se também
83
a formação de nódulos meristemáticos (Fig. 5F) e a formação múltipla
de nódulos, diferenciando-se pela organização mais compacta (Fig. 5G).
A partir destes nódulos observou-se o desenvolvimento de primórdios
foliares (Fig. 5H). Em secções histológicas são observados também
neste mesmo estádio de desenvolvimento a organização de meristemas
caulinares (Fig. 5I), formando novos aglomerados celulares compostos
de células pequenas e isodiamétricas. Subseqüentemente foi observado
também o desenvolvimento de meristemas múltiplos evidenciando a
diferenciação dos primórdios foliares, após seis semanas em cultivo
(Fig. 5J).
Por outro lado, o subcultivo destas CNs em MSB líquido sobre
ponte de papel, revelou características específicas de desenvolvimento
que determinam a proliferação das CNs até a regeneração de
microbrotos. Nas primeiras três semanas de cultivo observa-se em
secções histológicas a existência de três diferentes camadas de células:
1) camada central é composta por um grupo maior de células de
diferentes tamanhos e não organizadas; 2) na região mais externa um
grupo de pequenas células mais adensadas e isodiamétricas, denominado
de zona meristemática e; 3) região externa com a formação da
protoderme e a organização de estruturas globulares caracterizada neste
trabalho como CN (Fig. 5D). Subseqüentemente, estes processos
evoluem para a formação de estruturas globulares múltiplas, seguido da
formação de meristemas caulinares e o desenvolvimento da parte aérea,
denominadas neste trabalho de microbrotos ou brotos adventícios (Fig.
5K, L). Através de imagem em MEV pode-se observar o inicio de
alongamento dos microbrotos com 8-10 semanas de cultivo (Fig. 5M).
Os eventos estruturais descritos no presente trabalho, também
foram observados a partir de análises histológicas em V. friburguensis
var paludosa (Alves & Guerra, 2001), em V. reitzii (Alves et al., 2006).
Estas características, portanto, se configuram como padrão no gênero
Vriesea (Guerra & Dal Vesco, 2010). Contudo, no presente trabalho
foram utilizados de forma inédita técnicas de MEV para estudar a
histodiferenciação das CNs em V. reitzii. Neste contexto, os eventos da
morfogênese in vitro observados nas CNs de V. reitzii se assemelham
aos observados nos primeiros estádios da embriogênese somática.
Assim, no presente trabalho foi possível observar a formação de uma
estrutura alongada (Fig. 5I), morfologicamente similar ao coleóptilo
característico de monocotiledôneas (Gahan & George, 2008).
84
Figura 5. Análise histológica e estrutural de CN de Vriesea reitzii: A-B) Imagens
em MEV mostrando CN em proliferação: A) CN pouco diferenciada; B) Detalhe do
início da formação de nódulos meristemáticos na periferia das CNs; C) Seção de CN
friável em proliferação após três semanas em cultivo e; D) Detalhe do grupo de
células em proliferação (zona meristemática-seta) e formação nódulos com
protoderme definida (setas); E-G) Imagens geradas em MEV mostrando: E) CN em
proliferação secundária; F) CN com inicio de organização de nódulos
meristemáticos; G) Detalhe da indução de nódulos múltiplos e; H) Desenvolvimento
de primórdios foliares; I-L) Seção histológica mostrando: I) Detalhe da organização
de meristemas; J) Desenvolvimento de meristemas múltiplos e diferenciação dos
primórdios foliares; K) Desenvolvimento de microbrotos e; L) Diferenciação de
microbrotos com 4-5 par de pequenas folhas (setas) e; M) Imagem em MEV
mostrando inicio de alongamento dos microbrotos.
Abreviaturas: mc - meristema
caulinar; pf- primórdio foliar; zm- zona meristemática, pt-protoderme; tv- tecido.vascular.
85
Contudo, este padrão morfogenético originado das CNs de V.
reitzii se relaciona com a formação de eixos caulinares monopolares em
contraste com o padrão bipolar de formação em embriões somáticos
(von Arnold, 2008). Da mesma forma em Pelargonium x hortorum a
indução de estruturas semelhantes a embriões somáticos de forma
globular, porém, em análise histológica não foi observada a
característica bipolar e sim somente a formação de meristemas
caulinares (Haensch, 2004). Por outro lado, em D. carota subsp.
halophilus, a rota da morfogênese in vitro é modificada da organogênese
para a embriogênese somáticas, com a indução de calo organogênicos
originados a partir da base dos brotos e, de calos induzidos a partir de
segmentes de cotilédones quando cultivados em meio de cultura
suplementado com BAP e 2,4-D, respectivamente (Tavares et al., 2010).
Os eventos morfogenéticos associados às CNs para outras
espécies foram também caracterizados tanto por MEV, quanto por
análises histológicas. Tais eventos foram observados em H. lupulus
(Batista et al., 2000, Forte & Pais, 2000, Forte et al., 2002, 2004), em
Pinus banksiana (Pelletier & Laliberté, 2000), em Eucalyptus globulus
(Trindade & Pais, 2003), na bromélia Tillandsia eizii (Pickens et al.,
2006), em Amorphophallus albus (Hu & Li, 2008), em Populus
euphratica (Ferreira et al., 2009) e em Sclerocarya birrea (Moyo et al.,
2009).
Em conclusão, os resultados obtidos no presente trabalho
evidenciam que as CNs de V. reizii se configuram morfogenéticamente
em uma rota regenerativa in vitro intermediária entre a organogênese e a
embriogênese somática. Este modelo in vitro apresenta elevado
potencial regenerativo para a propagação em larga escala de bromélias
ornamentais e/ou ameaçadas de extinção, como é o caso de V. reitzii.
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89
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Sistema regenerativo em B. zebrina - Os resultados obtidos com
esta espécie mostram que o sistema regenerativo in vitro baseado na
indução, proliferação e desenvolvimento de CN é o primeiro descrito
para esta bromélia. Esta espécie, ademais de sua importância ecológica
no seu ecossistema natural, apresenta grande potencial ornamental.
O sistema regenerativo in vitro baseado na indução e
desenvolvimento de culturas nodulares possibilitou a manutenção das
culturas com baixo nível de diferenciação por longo tempo e mostra
elevada eficiência regenerativa com vistas à propagação massal. Este
sistema apresenta também alto potencial para servir como modelo de
estudo de histodiferenciação, desenvolvimento e regeneração de brotos e
para a conservação in vitro e/ou criopreservação da espécie.
As diferenças morfológicas das culturas nodulares estão
associadas, especificamente, a cada tipo, concentração e combinação de
fitorregulador utilizado no meio de cultura.
A integração do sistema de regeneração in vitro baseado em
culturas nodulares com a análise da genética molecular usando a técnica
de AFLP mostrou-se eficaz. A reprodutibilidade, o elevado nível de
polimorfismo detectado e a grande quantidade de fragmentos do genoma
fazem desta técnica uma ferramenta robusta para a análise da
diversidade genética visando à conservação in situ e ex situ e/ou a
comprovação da fidelidade clonal, dependendo dos objetivos a serem
alcançados.
Sistema regenerativo em V. reitzii - O sistema regenerativo
desta espécie mostrou ser de alta eficiência. Pode ser aplicado para a
regeneração in vitro de bromélias em larga escala ou para a conservação
in vitro desta bromélia ameaçada de extinção e com alto potencial
ornamental. Além disto, é um modelo para estudos histológicos e
anatômicos da histodiferenciação de cultura nodulares.
Os diferentes padrões morfogenéticos e taxas de indução e
proliferação das CNs observados a partir de sementes e bases foliares de
V. reitzii estão associados, especificamente, aos tipos, concentrações e
combinações de cada fitorregulador testado, bem como às condições de
cultivo.
Um processo regenerativo de CN eficiente para V. reitzii
associados ao uso do meio de cultura MSB suplementado com ANA e
2-iP (2 µM cada) resulta em 12,4 g/g de CN. Através de projeções desta
eficiência associadas ao subcultivo destas 12,4 g de CN em MSB
suplementado com AG
3
(10 µM), podem ser obtidos mais 3.900 brotos
alongados após 10 semanas de cultivo. Isto representa uma eficiência de
90
75% de brotos alongados dos mais de 5.300 microbrotos/g de CN
obtidas na etapa de regeneração. Considerando também a ocorrência de
5,2 subcultivos/ano, podem ser obtidos mais de 20.000 brotos
alongados/ano por grama de CN inoculada.
Com base nas avaliações estruturais pode-se comprovar que as
CNs se configuram em uma rota regenerativa in vitro intermediária entre
a organogênese e a embriogênese somática. Este sistema apresenta alta
eficiência regenerativa e baixo custo.
Portanto, este modelo morfogenéfico, associado as ferramentas
moleculares, tal como, o uso de marcador AFLP para a comprovação da
fidelidade clonal, pode ser empregado em sistema biofábricas para a
produção de mudas em grande escala de bromélias de interesse
ornamental ou de conservação.
91
9. LISTA DE PUBLICAÇÕES NO PERÍODO DO DOUTORADO
Ao longo do período de doutorado o autor desta tese participou da
co-autoria de várias publicações na temática esepecífica da tese ou em
temas correlatos, conforme a lista abaixo:
Guerra, M. P.; Dal Vesco, L. L. Strategies for the Micropropagation of
Bromeliads. In.: Jain, S. M. & Ochatt, S.J. (eds.) Protocols for in
vitro propagation of ornamental plants: Methods in Molecular
Biology. New York: Humana Press-Springer, 2010. v.589, pp.47-66,
400p. doi:10.1007/978-1-60327-114-1_6.
Rech Filho, A.; Dal Vesco, L.L.; Guerra, M. P. Adventitious shoots
from nodule cluster cultures of Vriesea reitzii: an endemic and
endangered bromeliad from Atlantic forest. Ciência Rural v.39, n.3,
p.909-912, 2009. doi:10.1590/S0103-84782009005000024.
Sandoval-Yugar, E.W., Dal Vesco, L.L.. Steinmacher, D.A., Stolf, E.C.,
Guerra, M. P. Microshoots encapsulation and plant conversion of
Musa sp. cv. ‘Grand Naine’. Ciência Rural. v.39, n.4, p.998-1004,
2009. doi:10.1590/S0103-84782009005000024.
Cangahuala-Inocente, G. C.; Dal Vesco, L. L.; Steinmacher D.A.,
Guerra, M. P. Somatic embryogenesis in pineapple guava (Feijoa
sellowiana Berg): Induction, Conversion and Artificial Seeds.
Scientia Horticulturae v.111, p. 228–234, 2007.
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p.725-728, 2007.
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(Lavandula x intermedia Emeric ex Loiseleur). Rev. Brasileira de
Horticultura Ornamental, v.13, Suplemento, p.716-720. 2007.
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