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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE FÍSICA DE SÃO CARLOS
ELIAS ANTONIO BERNI NETO
“Desenvolvimento de nanobiocompósitos contendo nanopartículas de prata
para aplicações bactericidas”
São Carlos
2010
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ELIAS ANTONIO BERNI NETO
“Desenvolvimento de nanobiocompósitos contendo nanopartículas de prata
para aplicações bactericidas”
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Física do Instituto de Física de São
Carlos da Universidade de São Paulo, para a obtenção
do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Física Aplicada
Orientador: Prof. Dr. Valtencir Zucolotto
São Carlos
2010
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço de Biblioteca e Informação IFSC/USP
Berni Neto, Elias Antonio.
Desenvolvimento de nanobiocompósitos contendo nanopartículas de
prata para aplicações bactericidas./ Elias Antonio Berni Neto; orientador Dr.
Valtencir Zucolotto.-- São Carlos, 2010.
112p.
Dissertação (Mestrado em Ciências - Área de concentração: Física
Aplicada) - Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo.
1. Nanopartículas de prata. 2. Quitosana. 3. Nanobiocompósitos. 4. Ação
bactericida. I. Título
“Society speaks and all men listen, mountains speaks and wise men listen.”
John Muir - American naturalist
(1838 - 1914)
Em homenagem à minha família,
companheira e amigos que em constante
sintonia me auxiliaram na realização
deste trabalho.
Agradecimentos
À CAPES, pelo auxílio financeiro, sem o qual a realização deste trabalho seria
impossível.
Ao meu orientador Dr. Valtencir Zucolotto e o Dr. Cauê Ribeiro pelas frutíferas
discussões científicas, ensinamentos e amizade construída durante este trabalho.
Aos alunos, técnicos e professores dos grupos de Polímeros Bernhard Gross -
IFSC/USP, Biofísica - IFSC/USP e Laboratório Nacional de Nanotecnologia para o
Agronegócio - Embrapa Instrumentação Agropecuária em especial: Debora, Gi, Bel, Luana,
Monise, Valerinha, Jú Cancino, Tania Giraldi, Fábio Plotegher, Wagner Moura, Henrique,
Andréa, Juliano, Leo, Jesus, e tantos outros que foram importantes em etapas decisivas deste
trabalho.
Ao pessoal do CUME que me proporcionaram um novo estilo de vida, em especial
Julia e Animal.
Aos colegas de graduação, Fabão, Renato, Sus, Victor e todos os demais.
Aos amigos de longa data, Fael e Miga.
À minha namorada Tatiana e sua família pelo companheirismo, apoio e compreensão.
Finalmente, agradeço a meus pais Rita e Ataliba, e meu irmão Jefferson pela excelente
convivência, apoio em todos os momentos e pelo aprendizado que obtive com eles durante
toda a minha vida, proporcionando minha escolha na carreira científica.
Resumo
BERNI, E. A. Desenvolvimento de nanobiocompósitos contendo nanopartículas de prata
para aplicações bactericidas. 2010 112 p. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Física de São
Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2010.
Neste trabalho de mestrado foram desenvolvidos nanobiocompósitos contendo quitosana (QS)
e nanopartículas de prata (AgNPs) para aplicação em matrizes poliméricas com propriedades
bactericidas. O trabalho foi conduzido em 4 etapas, sendo: i) a primeira referente ao estudo e
escolha do melhor modo de estabilização dos colóides de prata em solução, sendo escolhido o
modo de estabilização estérica com a quitosana (QS); ii) a segunda parte está relacionada com
um estudo detalhado da interação entre a QS e as nanopartículas de prata (AgNPs) além da
otimização da relação QS:AgNPs no nanocompósito para se obter maior ação bactericida; iii)
foi também proposta uma rota de síntese na qual não se utiliza-se o Boro Hidreto de Sódio
(NaBH
4
) como redutor, composto altamente reativo, sendo utilizados o citrato de sódio e QS
conjuntamente como redutores; iv) inserção do nanocompósito QS:AgNPs em uma matriz de
polivinil álcool (PVA). Foram utilizadas as técnicas de espectroscopia UV-vis e FT IR, DLS,
Potencial Zeta, MET, DR-X, ensaios microbiológicos de MIC, OD
595
e teste de halo de
inibição, TGA, DSC e ensaios mecânicos. Concluímos que o uso da QS como agente
estabilizante em comparação ao PVA é a mais indicada, devido ao maior número de grupos
funcionais interagindo com as nanopartículas de prata. O poder de ação bactericida do
nanocompósito QS:AgNPs pode ser aumentado numa certa relação entre ambos, a saber 4:1
em massa. A síntese utilizando citrato de sódio e QS como redutores mostrou a possibilidade
da obtenção de nanopartículas de prata pequenas, com tamanho de 2 - 5 nm com estrutura
esférica ou maiores. com tamanho de 300 nm, apresentando estruturas dendríticas,
dependendo apenas do tempo de reação e concentração de citrato de sódio. A última etapa
revelou a possibilidade da inserção do nanocompósito no polímero PVA sem perda
significativa das características térmicas e mecânicas do polímero.
Palvras-chaves: Nanopartículas de prata, quitosana, nanocompósitos e ação bactericida.
Abstract
BERNI, E. A. Development of novel silver nanoparticles-based nanocomposites for
bactericidal applications. 2010 112 p. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Física de São
Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2010.
The work reported here was aimed at developing chitosan/AgNPs based
nanobiocomposits for bactericidal applications. The studies were divided into four main steps,
viz.,: i) optimization of the silver colloids stabilition process, in which the use of chitosan
resulted in the best stability, ii) a detailed investigation on the interactions between chitosan
and AgNPs, as well as the optimization of the chitosan :AgNPs ratio to promote the best
bactericidal effect, iii) development of a new synthetic route without using NaBH
4
, in a search
for an environmentally-friendly route, and iv) incorporation of the chitosan:AgNps
nanobiocomposites in a PVA matrix for application as smart food packaging. The
nanobiocomposites were characterizaed via UV-vis and FT IR spectroscopies, DLS, Zeta
potential, TEM and DR-X. Biological essays had also been carried out, as well as tensile-
stress and thermo analyses (DSC and TGA). The best bactericidal effect was observed for a
nanobiocompostie comprising chitosan:AgNPs at a ratio of 4:1 (wt/wt). The synthetic route
employing sodium citrate as reducing agent resulted in AgNPs with average diameters of 2 –
5 nm, as well as bigger nanoparticles with diameters of ca. 300 nm, depending on the reaction
time and citrate concentration. The incorporation of the chitosan:AgNPs composites in the
PVA matrix resulted in the formation of a bactericidal composite with good mechanical and
thermal properties, suitable for applications as smart food packing.
Keywords: Silver nanoparticle, chitosan, nanocomposite and bactericidal action.
Lista de Figuras
Figura 1 - Artefatos da antiguidade que continham NPs em suas estruturas, como o
Cálice de Lycurgus (a) que apresentava diferentes colorações em função da
luz refletida ou transmitida devido à presença de NPs metálicas. Outro
exemplo são as esculturas Maias (b) que para a obtenção da coloração azul
utilizavam como pigmento NPs oxidas e metálicas. Figuras retiradas do
artigo The Lycurgus Cup - A Roman Nanotechnology
1
e da capa do livro De
Bonampak al Templo Mayor el azul Maya em mesoamérica
2
. ........................ - 23 -
Figura 2 - Representação das estruturas bases que as NPs podem formar, (a) estruturas
esféricas e de tamanho reduzido 0-D, (b) estruturas com simetria cilíndrica
com pelo menos o diâmetro na escala nano 1-D e (c) filmes ou discos de
diferentes formas são pertencentes às estruturas 2-D. ...................................... - 27 -
Figura 3 - Diagrama dos diferentes estágios do processo de formação de NPs em
função do tempo de reação. Também é mostrado o modo de crescimento dos
cluster devido as inúmeras colisões oriundas do movimento Browniano.
Figura retirada da Tese de Doutorado da Dr. Marcela Oliveira
67
..................... - 33 -
Figura 4 - Variação da energia livre de Gibbs no processo de nucleação homogênea. A
curva vermelha é referente à energia superficial dos núcleos, a curva azul
corresponde à diferença de energia das fases enquanto a curva verde é a
soma de ambas sendo a energia livre total relativa ao sistema. ........................ - 37 -
Figura 5 - Representação da influência da variação da temperatura próxima do ponto
de fusão. Quanto menor a temperatura menor é o tamanho do raio crítico do
núcleo bem como a barreira energética a ser superada para a formação do
cristal. ............................................................................................................... - 38 -
Figura 6 - Esquema ilustrativo mostrando as faces e conseguentemente o número de
átomos em cada face de uma estrutura cristalina cfc com os índices {100}
(a), {110} (b) e {111} (c). ................................................................................ - 40 -
Figura 7 - Diferentes formas de nanoparticulas (a) dependentes da relação dos planos
cristalográficos {100} e {111}, os números acima das figuras são referentes
a razão e (b) de estruturas não-cristalinas. Figura retirada da Tese
de Doutorado do Dr. Túlio Rocha
78
. ................................................................. - 41 -
Figura 8 - Representação dos mecanismos existentes para a estabilização das NPs, (a)
estabilização por forças eletrostáticas, partículas carregadas ou (b) por ação
do efeito estérico. Figura retirada do manual do equipamento ZetaSizer
Nano. ................................................................................................................. - 42 -
Figura 9 - Representação do monômero do polímero PVA. ............................................. - 43 -
Figura 10 - Estrutura química da (a) celulose, (b) quitina e (c) QS, respectivamente. Os
termos x e y na QS representam a relação entre os grupos com aminas
primárias e com acetoamidas respectivamente, x+y =100%. ........................... - 44 -
Figura 11 - Representação das possíveis interações que molécula de QS faz consigo
mesma por meio de pontes de Hidrogênio. Figura retirada do trabalho de
Molecular and Crystal Structure of Hydrated Chitosan
101
. ............................. - 45 -
Figura 12 - Esquema da possível forma de degradação da QS presente em um sistema
com íons de ouro e alta temperatura. Figura retirada do artigo Degradation
Behavior of Chitosan chains in the “Green” Synthesis of Gold
Nanoparticles
85
. ................................................................................................ - 48 -
Figura 13 - Esquema ilustrativo do aparato utilizado para a síntese dos
nanobiocompósitos. ........................................................................................... - 51 -
Figura 14 - Esquema representativo da oscilação da nuvem eletrônica da NP em
resposta à um campo eletromagnético, geralmente luz UV - vis. ..................... - 53 -
Figura 15 - Espectros de absorção no UV - vis das AgNPs, tanto estabilizada pelos
polímeros QS e PVA bem como na ausência de qualquer polímero. O
espectro dos íons de prata revela que realmente ocorreu a formação de NPs
na síntese adotada. O inset mostra a absorção de uma solução de QS cerca
de 10 vezes mais diluída do que a apresentada pelos nanocompósitos. ............ - 62 -
Figura 16 - Espectro de FTIR dos nanocompósitos de (a) QS:AgNPs e (b) PVA:AgNPs
e seus respectivos polímeros puros. No nanocompósito QS:AgNPs ocorre
principalmente o deslocamento e alargamento das bandas referentes as
aminas. O alargamento das bandas na região de 1500 cm
-1
e 750 cm
-1
demonstram a interação das AgNPs com o grupo OH do PVA. ....................... - 64 -
Figura 17 - Tamanho das partículas obtido pela técnica de espalhamento dinâmico da
luz (a), para os sistemas estabilizados e não estabilizado. Imagens de MET
para os nanocompósitos PVA:AgNPs (b) e QS:AgNPs (c). Ambos
apresentam a escala de 50 nm. .......................................................................... - 65 -
Figura 18 - Dependência do potencial Zeta em função do pH, das amostras contendo
estabilizantes (QS ou PVA) e sem a presença de qualquer estabilizante. O
gráfico em inset é com respeito à variação do tamanho das NPs em função
da mudança de pH. ............................................................................................ - 66 -
Figura 19 - Espectro de absorção da banda plasmônica da prata nos 4
nanobiocompósitos sintetizados e o espectro do sal de prata e QS apenas,
sem redução dos íons metálicos. O gráfico em inset diz respeito à cinética de
reação da síntese que mostra completa reação depois de 4 segundos. .............. - 67 -
Figura 20 - Difratograma dos nanocompósitos evidenciando a presença de prata
metálica com estrutura cfc. ............................................................................... - 68 -
Figura 21 - Análise da dispersão de tamanho das partículas de duas formas distintas, por
DLS (a) e imagens de MET dos 4 diferentes nanocompósitos
QS:AgNPs_4:1 (b), QS:AgNPs_6:1 (c), QS:AgNPs_9:1 (d) e
QS:AgNPs_11:1 (e). A escala de todas as imagens de MET são de 50 nm. .... - 69 -
Figura 22 - Variação do potencial Zeta (a) e do diâmetro normalizado (b) de todos os
nanobiocompósitos ambos em função do pH.................................................... - 70 -
Figura 23 - Espectro de FTIR para os diferentes nanobiocompósitos em função do
tempo de degradação. A banda de 1562 cm
-1
se refere ao grupo NH
2
da QS. .. - 71 -
Figura 24 - Absorção plasmônica em função do tempo, as amostras foram deixadas em
solução e temperatura ambiente para sofrer o processo de degradação
durante 25 dias. A menor absorção da banda plasmônica indica o processo
de oxidação e/ou liberação de íons das AgNPs. ................................................ - 72 -
Figura 25 - Análise da forma de degradação de duas maneiras diferentes pela absorção
do pico em 400 nm da banda plasmônica (a) e pelo fenômeno de
aglomeração monitorado pela técnica de DLS (b). .......................................... - 73 -
Figura 26 - Ensaio microbiológico da ação bactericida dos nanobiocompósitos sobre a
E. Coli em função do tempo. A ação tanto da QS pura como do
nanocompósito contendo PVA foram também analisadas. .............................. - 75 -
Figura 27 - Medidas da absorção da banda plasmônica para os nanobiocompósitos com
diferentes massas de citrato de sódio e tempo de reação. ................................. - 76 -
Figura 28 - Medidas de MET da amostra AM1 nas escalas de 100 nm (a) e 50 nm (b). O
inset em (b) diz respeito à difração de elétrons confirmando a presença das
Nps. ................................................................................................................... - 77 -
Figura 29 - Medidas de MET da amostra AM2 nas escalas de 500 nm (a) e 50 nm (b). A
difração de elétrons presente no inset em (a) foi realizado sobre a área mais
clara das dendritas confirmando a presença das AgNps nesta região. ............. - 77 -
Figura 30 - Medidas de MET da amostra AM3, ambas as imagens possuem a escala de
50 nm, são observados tanto aglomerados que possivelmente viriam a
evoluir em dendritas (a) como AgNps bem dispersas e com tamanho médio
de 10 nm (b). O inset em (b) mostra um dos estágios da formação de um
nanotriângulo de 100 nm. ................................................................................. - 78 -
Figura 31 - Medidas de MET da amostra AM4, ambas as imagens possuem a escala de
50 nm, são observadas AgNps esféricas e majoritariamente pequenas com o
tamanho de 2 a 5 nm (a) ocorrendo a presença de partículas de 10 nm (b).
Estruturas dendríticas são muito pouco usuais nesta amostra, sendo
mostrada a formação de uma delas no inset em (a). ......................................... - 78 -
Figura 32 - Tamanho das Nps medido por DLS em função da intensidade espalhada e o
inset diz respeito ao tamanho em função do número de Nps. .......................... - 79 -
Figura 33 - Variação do Potencial Zeta (a) e o diâmetro normalizado (b) de todos os
nanobiocompósitos ambos em função do pH. .................................................. - 81 -
Figura 34 - Difratogramas das amostras AM1, AM2, AM3 e AM4. Os asteriscos verdes
correspondem aos picos característicos da QS, 10º e 20º, de medidas feitas
com o pó do polímero. Os asteriscos vermelhos correspondem aos picos da
prata metálica de estrutura cfc, picos em 38,2º, 44,4º, 64,5º e 77,5º referente
aos seguintes planos respectivamente {111}, {200}, {220} e {311}. ............. - 82 -
Figura 35 - Medidas de FTIR das amostras AM1, AM2, AM3 e AM4 em função do
tempo de degradação. O espectro de FTIR mostra a degradação da QS na
amostra AM1 pelo aparecimento das bandas em 1740 cm
-1
e 1710 cm
-1
referentes ao grupo COOH. A perda de interação QS/AgNPs é evidenciada
pelo deslocamento da banda em 1100 cm
-1
para comprimento menores,
referente ao grupo NH
2
. .................................................................................... - 83 -
Figura 36 - Fotos das amostras solubilizadas na concentração de 6,5 g.L
-1
, logo após a
solubilização (a) e com 15 dias de degradação em luz e temperatura
ambiente (b). ..................................................................................................... - 84 -
Figura 37 - Curvas de TG e DTG da QS pura, obtidas sobre uma atmosfera de ar
sintético até a completa degradação do material em 600ºC. ............................ - 84 -
Figura 38 - Medidas de termogravimetria das amostras AM1 (a), AM2 (b), AM3 (c) e
AM4 (d). São mostradas tanto as curvas de TG com as de suas derivadas
DTG. ................................................................................................................. - 86 -
Figura 39 - Espectros UV-vis dos filmes de PVA contendo o nanocompósito AM4,
juntamente com os espectros do filme de PVA puro e do nanocompósito
AM4 em solução. .............................................................................................. - 87 -
Figura 40 - Curvas de TG e DTG do PVA puro, obtidas sobre uma atmosfera de ar
sintético até a completa degradação do material em 600ºC. No inset mostra-
se um ensaio de degradação do PVA em atmosfera de N
2
. .............................. - 88 -
Figura 41 - Curvas de TG e DTG dos filmes de PVA com o nanocompósito AM4,
obtidas sobre uma atmosfera de ar sintético até a completa degradação do
material. ............................................................................................................. - 89 -
Figura 42 - Análises de DSC do processo endotérmico de fusão (a) e do processo
exotérmico de cristalização (b). ........................................................................ - 91 -
Figura 43 - Curvas dos ensaios mecânicos realizados nos filmes de PVA e AM4. ............ - 91 -
Figura 44 - Fotos do filme PVA:AM4_100:0 evidenciando o crescimento do
microorganismo E. coli. .................................................................................... - 92 -
Figura 45 -Fotos do filme PVA:AM4_97,5:2,5 (a), PVA:AM4_95:5 (b),
PVA:AM4_92,5:7,5 (c) e PVA:AM4_90:10 (d) evidenciando a ação
bactericida de todos os filmes sobre o microorganismo E. coli. ....................... - 93 -
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Relação dos reagentes presentes em cada nanobiocompósito. .......................... - 50 -
Tabela 2 - Relação das massas de cada reagente bem como o tempo de síntese em cada
nanobiocompósito. ............................................................................................. - 51 -
Tabela 3 - Relação das massas de cada reagente para a produção dos filmes. ................... - 52 -
Tabela 4 - Dados da mínima concentração necessária para inibir completamente a
proliferação da E. Coli. ...................................................................................... - 74 -
Tabela 5 - Dados de TGA dos filmes de PVA contendo o nanocompósito AM4. ............. - 89 -
Tabela 6- Média dos dados obtidos no ensaio mecânico. .................................................. - 91 -
Tabela 7 - Porcentagem da área e diâmetro de inibição dos halos contra o
microorganismo E. coli. ..................................................................................... - 93 -
Abreviaturas
AgNO
3
nitrato de prata
AgNPs
nanopartículas de prata
AuNPs
nanopartículas de ouro
Cfc
cúbica de face centrada
CSP
Colloidal Sliver Protein
DLS
Dynamic Light Scattering
DR‐X
difração de raio-X
EM
Eletromagnética
EPA
Environmental Protection Agency
FTIR
Fourier Transform Infrared
LB
Luria Bertani
MCI
Mínima Concentração Inibitória
MET
Microscópia Eletrônica de Transmissão
MTP
Multi Twinned Particle
NaBH
4
boro hidreto de sódio
NH
2
amina primária
NPs
Nanopartículas
OD
595
densidade óptica
OH
Hidroxila
PdNPs
nanopartículas de paládio
PET
Polietileno
PtNPs
nanopartículas de platina
PVA
polivinil álcool
PVP
polivinil pirrolidona
QS
Quitosana
TGA
Termogravimetria
TiO
2
dioxide de titânio
UV
ultra violeta
UV‐vis
Ultravioleta - visível
Sumário
1. Introdução ........................................................................................................................ - 23 -
1.1 Introdução ............................................................................................................. - 23 -
2. Revisão Bibliográfica ...................................................................................................... - 27 -
2.1 Nanopartículas ............................................................................................................... - 27 -
2.1.1 Nanopartículas metálicas ............................................................................................ - 28 -
2.2 Síntese Coloidal ............................................................................................................. - 32 -
2.3 Estabilizantes ................................................................................................................. - 41 -
2.3.1 Polivinil álcool ............................................................................................................ - 42 -
2.3.2 Quitosana .................................................................................................................... - 43 -
2.4 Nanocompósitos ............................................................................................................ - 46 -
2.4.1 Nanocompósitos bactericidas ..................................................................................... - 46 -
3. Parte experimental ........................................................................................................... - 49 -
3.1 Materiais ........................................................................................................................ - 49 -
3.2 Rotas de sínteses ............................................................................................................ - 49 -
3.3 Preparação dos filmes .................................................................................................... - 52 -
3.4 Técnicas de Caracterização ........................................................................................... - 52 -
3.4.1 Espectroscopia UV - vis ............................................................................................. - 53 -
3.4.2 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (Fourier Transform
Infrared) FTIR ..................................................................................................................... - 54 -
3.4.3 Espalhamento Dinâmico da Luz (Dynamic Light Scattering) DLS ........................... - 55 -
3.4.4 Potencial Zeta ............................................................................................................. - 55 -
3.4.5 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ......................................................... - 56 -
3.4.6 Difração de raio X (DR-X) ......................................................................................... - 57 -
3.4.7 Ensaios microbiológicos ............................................................................................. - 57 -
3.4.8 Análise Termogravimétrica (TGA) ............................................................................ - 59 -
3.4.9 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)............................................................. - 59 -
3.4.10 Ensaios Tensão-Deformação .................................................................................... - 60 -
4. Resultados ........................................................................................................................ - 61 -
4.1 Síntese e Estudo da Estabilidade das Nanopartículas de Prata ...................................... - 61 -
4.2 Nanobiocompósito QS:AgNPs, estrutura e ação bactericida ........................................ - 67 -
4.3 Síntese de AgNPs utilizando um agente redutor mais brando ...................................... - 75 -
4.4 Caracterização de filmes de PVA contendo o nanocompósito AM4 ............................ - 86 -
5. Conclusões ....................................................................................................................... - 95 -
5.1 Conclusões ..................................................................................................................... - 95 -
6. Trabalhos futuros ............................................................................................................. - 97 -
Referências .......................................................................................................................... - 99 -
Apêndice ............................................................................................................................ - 111 -
‐23‐
1. Introdução
1.1 Introdução
A intrínseca relação do homem com os materiais remonta a sua própria existência,
evidenciada pelos registros históricos das primeiras tribos. Esta relação também aparece na
divisão e nomenclatura de distintas épocas históricas pelo nome de um material específico,
como Idade da Pedra, Idade do Bronze e Idade do Ferro, entre outras. Além do mais, o uso de
novos materiais revolucionou a humanidade como um todo, não só no campo tecnológico e
científico, mas impulsionando também as áreas econômicas e sociais. As ligas metálicas,
juntamente com o carvão, são ótimos exemplos dessa evolução, elementos chaves da
revolução industrial do século 18. Dessa forma, pode se entender que o estudo e busca por
novos materiais seja algo essencial para a contínua evolução da humanidade.
Dentre os inúmeros materiais, o estudo e principalmente o uso de materiais na escala
nanométrica (10
-9
m) vem ganhando cada vez mais destaque, entretanto tais materiais não são
tão novos assim. Pesquisas mostram que antigos artefatos já utilizavam nanomateriais, como
o cálice de Lycurgus feito pelos romanos
1
, esculturas e pinturas maias que continham
pigmentos azuis, provenientes de nanopartículas (NPs) de óxidos e metais
2
, ambos mostrados
nas figuras 1a e 1b, e também inúmeras cerâmicas chinesas que continham NPs de ouro
3
.
Figura 1 - Artefatos da antiguidade que continham NPs em suas estruturas, como o Cálice de Lycurgus (a) que
apresentava diferentes colorações em função da luz refletida ou transmitida devido à presença de
NPs metálicas. Outro exemplo são as esculturas Maias (b) que para a obtenção da coloração azul
utilizavam como pigmento NPs oxidas e metálicas. Figuras retiradas do artigo The Lycurgus Cup -
A Roman Nanotechnology
1
e da capa do livro De Bonampak al Templo Mayor el azul Maya em
mesoamérica
2
.
‐24‐
Um dos fatores que torna hoje a nanotecnologia e nanociência um campo promissor, é
a atual capacidade de estudo e caracterização dos materiais, e também a sua manipulação mais
fina, na escala nano, por meio de técnicas como a microscopia eletrônica, espectroscopias,
difração de raio X, entre outras. Atualmente, efeitos como superfície plasmônica em NPs
metálicas
4
, possibilidade de liberação controlada de fármacos
5
, aumento no poder de catálise
6
e ação bactericida e bacteriostática de nanomateriais
7
, são compreendidos de uma maneira
mais ampla tornando suas aplicações cada vez mais plausíveis. A descoberta de novas
propriedades, ou mesmo a melhora das propriedades já existentes abriram também um imenso
campo de aplicações, tanto industriais como tecnológicas e científicas. Tais possibilidades
estão chamando a atenção de mercados e governos. Pesquisas realizadas pelo instituto
americano Lux Research indicam que em 2014 a área de nanotecnologia movimentará cerca
de US$ 2,4 trilhões, transformando a nanotecnologia e nanociência uma das grandes
revoluções do século 21
8
.
Nanomateriais, por definição, se encontram na escala de tamanho de 1 a 100 nm
9
,
podendo variar quanto ao seu tamanho e forma, área superficial e composição química. Em
alguns nanomateriais, o número de átomos está compreendido no intervalo de 10
2
até 10
6
,
contribuindo consideravelmente para o aumento dos efeitos de superfície, que tem
porcentagem mínima nos materiais em bulk. Algumas NPs, por exemplo, chegam a ter 50%
dos átomos na superfície, transformando os fenômenos de superfície completamente
relevantes nestes sistemas, e fundamentais para o estudo e compreensão dos mesmos. Devido
ao tamanho reduzido, a razão superfície/volume aumenta muitas ordens de grandeza, em
comparação àquela observada nos materiais em bulk, aumentando dessa forma os efeitos que
ocorrem na superfície, em relação às estruturas em micro e macro escala. Utilizando a mesma
quantidade de material, as nanoestruturas se mostram mais reativas, motivando assim a
pesquisa destes materiais em escala nano. Outros efeitos que passam a ser relevantes são os
efeitos quânticos, como o confinamento de elétrons e fônons, que podem ser entendidos pelo
modelo de uma partícula presa em uma caixa, na qual ocorrem bandas discretas de energia.
Motivados pelo aumento da reatividade dos materiais em nanoescala e baseados no
conhecimento da prata como agente bactericida
10, 11, 12
inúmeros pesquisadores desenvolvem
nanopartículas de prata (AgNPs) para aplicações bactericidas
7, 13
. Colóides de prata
apresentam ação contra uma gama enorme de microorganismos
14
, como E. coli
10
, S. aureus
12,
13, 14
, E. fuecium
12
, Tuberculosis
12
, S. pneumoniae
12
, V. cholera
11
. Adicionalmente, os
microorganismos não apresentam aparentemente resistência às AgNPs, mesmo através de
mutações, método pelo qual ocorre a resistência contra a maioria dos antibióticos. Desta
‐25‐
forma, o uso de AgNPs se faz uma ótima alternativa para a manufatura de materiais com ação
bactericida.
As AgNPs podem ser obtidas através de rotas químicas simples, na presença ou não de
um polímero estabilizante. O uso da quitosana (QS), por exemplo, se faz interessante, pois ela
também apresenta ação bactericida
15
aumentando assim a ação do nanocompósito.
Nesse trabalho, apresentamos o desenvolvimento e estudo de nanocompósitos
formados por AgNPs estabilizadas por dois polímeros: o polivinil álcool (PVA), e a QS. Foi
realizado um estudo detalhado acerca da caracterização destes compósitos, especialmente com
vistas à sua estabilidade, o que é ainda um forte limitante para suas aplicações. Além disso, os
nanocompósitos foram avaliados contra o microorganismo E.coli, apresentando ótima ação
bactericida. A possibilidade de aplicação destes nanocompósitos como aditivos em materiais
de embalagem também foi avaliada, sugerindo possíveis aplicações destes nanocompósitos
em dispositivos bactericidas em embalagens inteligentes.
‐26‐
‐27‐
2. Revisão Bibliográfica
2.1 Nanopartículas
Mesmo com uma grande gama de nanomateriais existentes, ainda é possível, por meio
da manipulação de sua morfologia, alcançar novas aplicações e efeitos. De maneira geral
pode-se classificar os nanomateriais em relação às suas formas em três estruturas básicas i) 0-
D, ii) 1-D e iii) 2-D, como mostrado na figura 2.
Figura 2 - Representação das estruturas bases que as NPs podem formar, (a) estruturas esféricas e de tamanho
reduzido 0-D, (b) estruturas com simetria cilíndrica com pelo menos o diâmetro na escala nano 1-D e
(c) filmes ou discos de diferentes formas são pertencentes às estruturas 2-D.
As partículas com estrutura 0-D são isotrópicas, apresentando forma esférica ou com
múltiplas facetas, classificadas em NPs esféricas com o tamanho variando de 1 - 100 nm, ou
pontos quânticos. Ambas podem ser compostas por óxidos, polímeros, ou metais e suas ligas.
Dentre as NPs mais clássicas e estudadas estão as nanopartículas de ouro (AuNPs) usadas
como marcadores biológicos
16
, AgNPs, utilizadas como agente bactericida
12
, nano-óxidos
como o dióxido de titânio (TiO
2
) usados como fotocatalisadores
17, 18
e/ou as NPs
ferromagnéticas empregadas, por exemplo, no tratamento de células cancerígenas
19
. Os
pontos quânticos são nanocristais esféricos de 1 - 10 nm, geralmente possuindo um núcleo
semicondutor, como CdSe ou podem ser compostos também por metais e suas ligas
20
. Ambas
as classes acima possuem o efeito de confinamento quântico. Entretanto, os pontos quânticos
têm este fenômeno mais sobressalente, proporcionando assim características ópticas e
eletrônicas únicas
21
. Um exemplo é a absorção e florescência fortemente dependentes do
tamanho.
‐28‐
Os materiais 1-D são anisotrópicos, apresentando formas alongadas. Como exemplos
estão os nanotubos, de carbono ou metálicos, e os nanofios e nanobastões
22
. O comprimento
do eixo assimétrico pode atingir até micrometros, enquanto seu diâmetro deve se encontrar na
escala nanométrica. Tais estruturas propiciam características especiais. Os nanotubos de
carbono apresentam elevada condutividade elétrica e resistência elástica, diferentemente do
grafite, apesar de que em ambos, o carbono apresenta uma estrutura hexagonal. Os nanofios e
as NPs podem ser óxidos ou metálicos. Modificações na estrutura de AuNPs, que foram
transformadas em nanofios, propiciaram o surgimento de um pico de absorção adicional em
700 nm
23
, devido à estrutura anisotrópica que gera multipolos.
Os materiais 2-D são também anisotrópicos, entretanto com uma simetria planar,
podendo apresentar formas de nanodiscos
24
, nanoprismas triangulares ou hexagonais e filmes
finos. Tais materiais apresentam características bem específicas.
Com uma variedade tão grande de nanomateriais e estruturas, era de se esperar
também uma grande diversidade de métodos de obtenção dos mesmos, o que de fato ocorre.
São inúmeros os métodos de produção de nanomateriais, divididos em métodos físicos (top
down) como nanolitografia
25
, co-evaporação
26
, sonólise
27
, ablação a laser
28
entre outros, e
métodos químicos ou coloidais (bottom up), nos quais as NPs são formadas átomo a átomo,
ou molécula a molécula. Exemplos são os métodos com template
29
, sol-gel
30
, poliol
31
,
microemulsão
32
e a síntese química em sistema bifásico
33
. Nos métodos bottom up múltiplos
processos ocorrem simultaneamente, como nucleação, crescimento e aglomeração de
partículas, os quais serão discutidos mais detalhadamente, uma vez que o método de síntese
química foi adotado neste trabalho.
2.1.1 Nanopartículas metálicas
Dentre as NPs metálicas mais estudadas estão as AuNPs e AgNPs
34, 35, 36
. O interesse
por estes metais se encontra em suas características intrínsecas, como estabilidade química,
condutividade elétrica e alta atividade catalítica
6, 37, 38
e as características referentes às NPs,
como interação com a luz por meio da banda plasmônica, tendo assim um grande interesse de
seu uso em nanoeletrônica e área médica. Com relação às AuNPs, o interesse se concentra
principalmente na construção de biossensores
39
, por apresentar ótima interação com grupos
‐29‐
nitrila (-CN), tiol (-SH) e amina primária (-NH
2
)
40
, presentes em diversas biomoléculas, além
de uma estabilidade superior às outras NPs metálicas, como as de prata. Entretanto, apesar das
AgNPs sofrerem oxidação mais facilmente que as AuNPs
41
, seu estudo se faz tão intenso
quanto, motivado principalmente por seu efeito bactericida
11, 14, 42
e sua relativa facilidade em
formar estruturas pouco convencionais, como nanoprismas
43
, bem como a possibilidade de
controle de novas morfologias por meio de irradiação de ondas eletromagnéticas (EM) na
faixa do Ultravioleta - visível (UV - vis)
44
.
A primeira síntese documentada de NPs metálicas foi realizada por Faraday
45
. Desde
então, inúmeras rotas de síntese tem sido sugeridas e efetuadas
28, 46, 47
, para ambos os metais
prata e ouro, em busca de uma menor dispersão da morfologia, novas estruturas, ou o uso de
reagentes e rotas mais amigáveis ao meio ambiente. Nesta busca, em particular para as
AgNPs, foram utilizados inúmeros precursores como iodeto de prata (AgI)
47
, perclorato de
prata (AgClO
4
), tetrafluorborato de prata (AgBF
4
), hexafluorfosfato de prata (AgPF
6
) e nitrato
de prata (AgNO
3
)
25
. Em estudo realizado por Patakfalvi, Virányi e Dákány, foi visto que os
precursores AgClO
4
, AgBF
4
, AgPF
6
tinham uma rápida reação inicial para a formação das
NPs. Entretanto, depois de 10 min, a velocidade sofria considerável diminuição. Por outro
lado, o AgNO
3
possuía uma reação lenta e constante. Sendo assim, neste e em muitos outros
trabalhos o AgNO
3
é o sal adotado, já que com uma reação mais lenta e constante, a
morfologia pode ser melhor controlada por meio dos fenômenos de nucleação e crescimento
das partículas.
Dentre as inúmeras rotas de síntese existentes, a mais convencional e interessante é a
que usa água como meio reacional
49, 34, 50, 51, 52
. Nesta rota de síntese são obtidas NPs em
forma coloidal, contendo partículas com dispersão de tamanho entre 10
-9
m até 10
-6
m
12, 53
.
Basicamente, os colóides de prata são soluções contendo tanto AgNPs, quanto seus íons
53
,
com a presença ou não de algum estabilizante. Os colóides de prata foram muito utilizados no
período de 1910 - 1920, revelado pelo sucesso do livro de Alfred B. Searle de 1920 sobre tal
tema. Entretanto, há documentos que datam seu uso desde 1800
12
. O principal uso dos
colóides de prata estava ligado à área médica, principalmente na manufatura de medicamentos
como o Lunar Caustic, ministrado à pacientes com distúrbios nervosos, Silver Arsphenine
para sífilis, e até o uso de colóides de prata no combate a resfriados comuns
54
. Mesmo hoje,
inúmeros produtos que contém prata são comercializados, dentre eles podemos citar o tecido
Leggeríssimo® da Santaconstancia Tecelagem, o desodorante Nivea Silver Protect, a pomada
para queimaduras Silvadene, e até equipamentos da chamada linha branca, como máquinas e
‐30‐
geladeiras da Samsung, todas possuindo íons ou AgNPs em sua composição, e com o mesmo
intuito de inibir a proliferação de microorganismos.
Vislumbrando-se a potencial ação bactericida dos colóides de prata, outros colóides
foram estudados, resultando na seguinte escala de toxicidade contra microorganismos: Ag >
Hg > Cu > Cd > Pb > Co > Au > Zn > Fe > Mn > Mo > Sn
55
. O primeiro estudo registrado da
ação bactericida da prata foi conduzido pelo suíço Karl Wihelm Von Naegeli em 1893, sobre
células eucariotas e procariotas, com a prata na forma iônica
55
. Von Naegeli quantificou que
9,2 nM de íons de prata eram suficientemente tóxicos para algas. Conjuntamente, outro fator
interessante é a baixa toxicidade da prata em células animais
56
.
A ação bactericida da prata cobre uma ampla gama de microorganismos, como
bactétias Gram positivas/negativas
11
, exemplificando: E. coli
10
; S. aureus
12, 13, 14
; E. fuecium
12
;
Tuberculosis
12
; S. pneumoniae
12
e V. cholera
8
. Até mesmo a ação antiviral foi observada.
Wai-Yin Sun et al. mostraram recentemente que concentrações de 50 M de AgNPs são
suficientes para inibir a replicação do vírus HIV-1. Testes realizados pelo mesmo grupo
revelaram também a menor atividade das AuNPs para o mesmo fim, cerca de 6 a 20 % abaixo
das apresentadas pelas AgNPs. Outro ponto foi o estudo e comprovação da interação da
albumina humana com as AgNPs, contudo, mesmo com tal interação, a atividade antiviral foi
mantida
57
.
Contudo, existem alguns poucos organismos que são resistentes à ação da prata,
encontrados principalmente em minas deste mineral, como C. freundii, P. mirabilis, E.
cloacae e K. pneumoniae
58
. Possivelmente esta resistência seria proveniente da produção de
proteínas que agiriam como quelatos, complexando a prata ou outros metais pesados no
interior das células, diminuindo assim sua toxicidade
55
. Existem também organismos capazes
até mesmo de sintetizar AgNPs por ação enzimática (P. fungi
59
) ou por redução extracelular
(F. oxysporum), ou por outro lado, realizar a degradação das mesmas, como a bactéria C.
violaceum
14
.
Com base nesta ação bactericida, diversos estudos utilizando AgNPs como
antimicrobianos foram realizados
7, 10, 11, 12, 14, 42, 55, 57, 61, 62
e tantos outros estão em andamento.
Morones et al.
11
observaram que concentrações de 75 µg.mL
-1
de AgNPs são suficientes para
inibir o crescimento de P. aeruginosa, V. cholera, E. coli e S. typhus. Embora se conheça
muito bem o efeito bactericida da prata, seu modo de ação ainda permanece parcialmente
obscuro. Porém já se sabe que a ação da mesma está relacionada com a forma na qual ela se
encontra; bulk, NPs ou íons
11
.
‐31‐
Com relação às NPs, a ação está fortemente ligada ao seu tamanho, demonstrando
maior reatividade as NPs menores de 5 - 10 nm
11
, ou até mesmo clusters atômicos de 0,4 - 2
nm, os quais podem aumentar em muito a ação bactericida
42
. NPs de até 100 nm podem ser
encontradas tanto no interior das células como em suas membranas, sendo que a interação
com aglomerados maiores não foi observada
11
. A interação das AgNPs com as membranas se
dá pela grande afinidade de grupos que contenham nitrogênio, enxofre e fósforo
11, 63, 64
, e uma
interação mais branda com o grupo hidroxila (OH)
65
. Basicamente, as AgNPs na membrana
agem impedindo a respiração celular, e no interior da célula interagem com o DNA,
impedindo a sua replicação
11
. Além do tamanho das NPs, sua estrutura cristalina se faz
importante para a ação bactericida. Amostras com estrutura cristalina de {1,1,1} são mais
reativas que as demais, devido ao número maior de átomos de prata expostos
11
. A ação das
AgNPs se difere da ação de seus íons, que se caracteriza pelo desenvolvimento de uma região
de baixo peso molecular no centro da bactéria, a qual se acredita que seja formada por
proteínas produzidas pela bactéria, a fim de complexar os íons de prata
55
.
Ressalta-se, porém, que as biomoléculas que compõem os microorganismos são as
mesmas que compõem os organismos superiores, como os seres humanos.
Consequentemente, é de se esperar que também ocorra interação das NPs metálicas com
células humanas. A ingestão em altas concentrações de AgNPs pode gerar problemas
neurológicos, nos rins, indigestão, dores de cabeça e a Argyria, patologia que pode ocasionar
o azulamento da pele
66
. Contudo deve se verificar se a causa das patologias está relacionada
principalmente aos íons ou às AgNPs. No século 19, o uso intenso de colóides de prata se
dava por meio de um produto conhecido como Colloidal Silver Protein (CSP), existindo em
duas formas: i) o CSP mais brando, com uma concentração de 19 - 23 % (massa/volume) de
prata e baixa ionização, e ii) um tipo mais agressivo, com uma concentração de 7,5 - 8,5 % de
prata e alta ionização. O colóide brando causava mínima irritação e boa ação bactericida, já o
colóide agressivo causava uma maior irritação e ação antimicrobiana duvidosa
54
.
Adicionalmente, não pode ser generalizado que a ingestão e/ou contato com qualquer
quantidade de prata seja prejudicial, e deve ser evitado a todo custo. Segundo a Enviromental
Protection Agengy-USA (EPA), doses de 5 µg.Kg
-1
/dia de prata são aceitáveis com
improváveis riscos para a saúde, sendo a dose limite de 14 µg.Kg
-1
/dia. Uma pessoa com um
peso de 70 Kg em uma dieta regular pode consumir até 90 µg/dia de prata
54
, sendo que a prata
pode ser encontrada em inúmeros alimentos como trigo (0,3 µg.g
-1
), cogumelos (centenas
µg.g
-1
), e leite (27-54 µg.g
-1
)
54
.
‐32‐
Impulsionado com o descobrimento dos antibióticos e sua progressiva introdução no
uso medicinal, os colóides metálicos foram progressivamente descartados. Todavia, cada vez
mais as bactérias se tornam resistentes aos antibióticos disponíveis no mercado, forçando
assim a procura e síntese constante de novas drogas, que muitas vezes também apresentam
efeitos colaterais, e além do mais, na maioria dos casos não acompanham a velocidade de
imunogenicidade dos vírus e bactérias
12
. Na busca por novos medicamentos ou materiais
antimicrobianos, os colóides de prata voltam novamente a despertar o interesse da
comunidade científica. Nesta linha, inúmeros trabalhos sobre nanocompósitos contendo prata
têm sido publicados, sendo o foco principal a inibição de bactérias como a E. coli e S. aureus,
entre outras
60
, além de rotas de síntese mais brandas ao meio ambiente
46
e maneiras de se
obter uma maior estabilidade das AgNPs.
2.2 Síntese Coloidal
A síntese coloidal ocorre em meio líquido, sendo uma boa maneira de se produzir NPs,
ela também é conhecida como síntese de precipitação. Nesta rota de síntese ocorrem os
processos de nucleação, crescimento e aglomeração, sendo que nenhum destes ainda é
completamente elucidado, devido à dificuldade de se isolar cada um durante o processo. A
teoria envolvida nessa rota não serve apenas para explicar a formação de NPs, mas também a
transição de fase liquida para sólida de qualquer material, sejam eles metálicos, poliméricos
ou cerâmicos. A obtenção de NPs, bem como as propriedades de muitos materiais em bulk,
como dureza, ductilidade, resistência mecânica, entre outras, se dá por meio do controle
destes processos.
Para o entendimento da formação de NPs são usadas duas abordagens distintas, uma
relacionada à termodinâmica, e outra relacionada à cinética dos processos de nucleação e
crescimento. Na fase líquida, os átomos ou partículas, devido ao movimento Browniano,
sofrem inúmeras colisões uns com os outros, envolvendo simultaneamente milhares de
partículas, veja inset da figura 3. Tais colisões produzem agrupamentos momentâneos com
certo grau de ordenação. Dependendo do raio de tal agrupamento, conhecido como cluster,
este pode se re-dissolver, ou vir a evoluir em partículas, ou um sólido. Esta dependência é
determinada por fatores termodinâmicos, como temperatura de fusão e a energia livre de
‐33‐
Gibbs. A figura 3 ilustra os fenômenos de formação das NPs como nucleação, crescimento,
ripening de Ostwald e aglomeração em função do tempo de reação. Os clusters em escala
nanométrica aumentam de tamanho pelo incremento de novas partículas, enquanto a perda das
mesmas ocasiona sua dissolução. Tais clusters constituem os núcleos, nos quais a estrutura da
NP, ou nova fase, irá ser formada.
Figura 3 - Diagrama dos diferentes estágios do processo de formação de NPs em função do tempo de reação.
Também é mostrado o modo de crescimento dos cluster devido as inúmeras colisões oriundas do
movimento Browniano. Figura retirada da Tese de Doutorado da Dr. Marcela Oliveira
67
.
Os produtos gerados na síntese coloidal são geralmente espécies pouco solúveis,
formadas sobre condições de supersaturação. O maior controle sobre a solubilidade e
supersaturação resulta em um maior número de núcleos, e consequentemente NPs menores,
com uma menor dispersão de tamanho. Contudo, processos secundários podem se tornar
importantes como o ripening de Ostwald, que é o consumo das partículas menores pelas
maiores, e/ou a aglomeração, afetando drasticamente o tamanho final das NPs
68
. Na grande
parte das sínteses coloidais, a condição de supersaturação é atingida por meio de uma reação
química, como redução (NPs metálicas) ou hidrólise (NPs de óxidos), entre outras. Portanto,
variáveis de reação como molaridade entre reagentes, ordem da adição, temperatura e
velocidade das reações afetam diretamente a morfologia das NPs
69, 70
. Os processos de
nucleação e crescimento de cristais são os mecanismos que controlam o tamanho e
distribuição das NPs. A precipitação é iniciada pelos cristalitos formados na fase de
nucleação, subseqüentemente ocorre a agregação de tais cristalitos, etapa de crescimento.
‐34‐
Vale ressaltar que ambas as etapas podem coexistir, entretanto o crescimento só ocorre depois
da etapa de nucleação.
Na abordagem relacionada à cinética do processo de nucleação tomaremos a seguinte
reação de adição como exemplo:
ó
(1)
No equilíbrio teremos:
(2)
Que é o produto de solubilidade, K
ps
, e as respectivas atividades dos íons A
y+
e B
x-
em
solução. A supersaturação, S, nesta abordagem é dada por:
ou
(3)
No qual e
são as concentrações do soluto na saturação e no equilíbrio,
respectivamente. A diferença
é muitas vezes referida como driving force para a
precipitação, presente também na abordagem termodinâmica. O raio crítico dos núcleos
formados, segundo tal abordagem, é dado por:
(4)
No qual o termo é dado por
∞
, sendo
a tensão superficial
na interface sólido-líquido, o volume atômico do soluto, a constante de Boltzmann, T a
temperatura absoluta e
∞
a concentração do soluto na diluição infinita. A formação ou não
dos cristalitos é determinado pelo raio crítico, partículas com
são as partículas de raio
crítico, as com
são ditas embriões, e serão dissolvidas, já as partículas com
são
ditas núcleos, e continuarão a crescer
71
. A energia de ativação para a formação do núcleo é
dada por
72
:
çã
(5)
Neste caso, o número de núcleos, N*, formados com o tamanho do raio crítico na
condição estacionária é:
çã
(6)
Com sendo um fator pré-exponencial que geralmente assume valores entre 10
25
a
10
55
s
-1
.m
-3
. Outra forma de se escrever o número de núcleos é com respeito ao grau de
supersaturação, que neste caso é dado por:
(7)
Revelando a dependência de
com . A flutuação no número de núcleos é
negligenciável até certo valor de . Quando uma supersaturação crítica é atingida, a nucleação
‐35‐
passa a ser extremamente rápida. Dessa forma, para o aumento no número de núcleos deve-se
aumentar o grau de supersaturação
71
. A equação 7 revela também que o número de núcleos é
aumentado pelo aumento da temperatura, uma vez que com esse comportamento a energia de
ativação da reação química é diminuída.
Outro fator importante durante o processo de crescimento das partículas é a difusão,
podendo ser um fator limitante para todo o processo. Dessa forma, a presença de gradientes de
concentração e/ou temperatura são extremamente importantes na síntese de NPs.
Com base na abordagem termodinâmica, assim como na abordagem dinâmica, ambas
as etapas nucleação e crescimento de cristais coexistem, sendo que a nucleação é sempre a
precursora. Dependendo das condições, uma das etapas pode ser predominante sobre a outra,
sendo então obtidos cristais com tamanhos e formas distintas.
Numa abordagem termodinâmica para a nucleação, os núcleos de raios críticos
possuem mais energia que o seu próprio bulk com a mesma massa e fase, devido ao aumento
de sua relação superfície/volume. Uma vez que a única maneira de se obter NPs passa
necessariamente pela formação dos núcleos, a síntese das mesmas só ocorrerá em sistemas
supersaturados ou resfriados, devido à maior probabilidade de colisões e da diminuição da
energia do sistema respectivamente. De maneira geral, o equilíbrio entre os núcleos e todo o
sistema é instável, podendo, a partir de certo raio crítico, ocorrer o crescimento de uma nova
fase ou formação de NPs, ou sua dissolução. Em outras palavras, a diminuição ou aumento do
raio das partículas em torno do raio crítico dá início, ou não, ao processo de nucleação.
Portanto, mudanças termodinâmicas que alterem a energia interna geram também mudanças
no raio, e consequentemente levam à ocorrência de transformações. De modo geral, a energia
da formação das partículas é governada pela energia dos núcleos. Felizmente, a nucleação é
um dos raros exemplos de processos em que a energia de ativação pode ser calculada
completamente em base da termodinâmica fenomenológica. Esse tratamento foi feito por
Volmer e Weber em 1926, e será apresentado a seguir.
Para se melhor entender o núcleo crítico e o ambiente em que as fases estão em
equilíbrio, tomaremos um núcleo qualquer em um sistema supersaturado/resfriado. Seja o
número total de moles em todo o sistema dado por:
′
′′
′′′ (8)
No qual ′ e ′′ são os números de moles da fase inicial (íons) e nova fase (átomos no
interior das partículas) respectivamente e ′′′ é o excesso remanescente referente à superfície
do núcleo. Essa simples análise termodinâmica é possível, pois o sistema real da interface
núcleo/ambiente é tomado como uma geometria imaginária de superfície, chamada driving
‐36‐
surface. Nesta análise, a superfície do núcleo referente à ′′′ pode estar em qualquer posição,
dentro do bulk (interior das partículas formadas) da nova fase, ou dentro da fase atual, ou até
mesmo na interface das duas. Assim, pode assumir valores positivos, negativos ou nulo. Este
tratamento é somente válido para sistemas de uma componente. Para o valor nulo da driving
surface temos uma superfície equimolecular, sendo possível tomar o tratamento do sistema
como um sistema com 3 fases distintas. A partir da energia de Helmholtz, que é a soma de
todas as fases (fase inicial - nova fase - fase de superfície). Impondo o ponto de mínimo da
energia livre de Gibbs encontramos que as condições de equilíbrio são:
′ (9)
µ
′
′
µ
′′
′′
µ′′′ (10)
′′
′′
(11)
Concluindo que a pressão externa é igual à pressão da fase inicial, o potencial químico
é o mesmo para todas as fases, e a pressão da nova fase depende da energia superficial, .
Tomando os núcleos como esferas isotrópicas, temos que a energia superficial é dada
por:
, e o volume do núcleo dado por
′′
. Substituindo na equação
11 obtemos:
′′
(12)
Esta é uma generalização da conhecida equação de Kelvin. Quando
temos um caso particular chamado tensão de superfície. Este termo só se faz necessário
quando mudanças no raio de curvatura são introduzidas na teoria de nucleação, ou seja, os
núcleos não são mais esferas isotrópicas.
Sobre condições isobáricas e isotérmicas, a diferença de energia livre de Gibbs para a
formação do núcleo é dada por:
′′
(13)
Os índices 1 e 2 se referem aos estados inicial e final, respectivamente. Efetuando as
devidas substituições concluímos que:
′′
′′
′′ (14)
Substituindo pela equação 12 obtemos que:
′′
′′ (15)
Utilizando uma aproximação plana para a interface, na qual
é constante temos que:
′′
e
′′
′′
(16)
‐37‐
Assim temos finalmente que a energia livre para núcleos esféricos devido a sua
superfície é:
(17)
A energia referente à formação da partícula somente cresce. Entretanto, a variação
total de energia livre associada à formação de uma partícula não corresponde somente à parte
da tensão superficial, há também a componente devido à mudança de fase e potenciais
químicos de ambas as fases em análise, os quais geralmente são representados como energia
por volume,
. Portanto, podemos escrever que a energia livre de Gibbs para um sistema
em formação de núcleos em condições isobáricas e isotérmicas é dada por:
(18)
A figura 4 representa a variação da energia livre de Gibbs. Pela análise do gráfico
vemos que há um ponto de máxima energia. Neste ponto são determinados o raio e a energia
crítica que o núcleo pode assumir, dados por:
Δ
e Δ
í
Δ
(19)
Como na abordagem dinâmica, partículas com raio
são núcleos críticos,
partículas com
são embriões, e partículas com
são núcleos, que diminuirão sua
energia por meio da adesão de átomos, aumentando o seu tamanho. A barreira para a
formação do núcleo crítico é representada pela quantidade Δ
í
.
0 102030405060
r*
-
Energia Livre de Gibbs
Raio do núcleo (unidades arbitrárias)
Energia Total
Energia de superfície
Energia de volume
+
G*
Figura 4 - Variação da energia livre de Gibbs no processo de nucleação homogênea. A curva vermelha é
referente à energia superficial dos núcleos, a curva azul corresponde à diferença de energia das
fases enquanto a curva verde é a soma de ambas sendo a energia livre total relativa ao sistema.
Assumimos que na fase condensada
, na solidificação
, e
que em ambos a entropia e entalpia são independentes da temperatura próximo do ponto de
‐38‐
fusão,
. Desse modo
e podemos reescrever
que é uma boa
aproximação para esta faixa de temperatura em questão. Onde
. Com essa
simples aproximação conseguimos escrever tanto o raio como a barreira crítica do núcleo em
função da temperatura:
Δ
e Δ
í
Δ
(20)
Substituindo Δ
í
da equação 20 na equação 18 obtemos:
(21)
Ao plotarmos a equação 21 em função da temperatura, observamos que tanto o
tamanho do núcleo crítico, como a barreira crítica, aumentam (figura 5). O processo de
nucleação é favorecido em baixas temperaturas, efeito de super-resfriamento, a nucleação
pode ser desencadeada por alguns poucos átomos que se agregam formando clusters. O
núcleo de tamanho crítico, neste caso, é reduzido. Portanto, é mais provável a nucleação para
um grande super-resfriamento, pois o raio crítico é reduzido.
050100150
r*
r*
r*
Raio do núcleo (unidades arbitrárias)
T
f
-T/T
f
=99%
T
f
-T/T
f
=80%
T
f
-T/T
f
=50%
T
f
-T/T
f
=101%
-
Energia Livre de Gibbs
+
Figura 5 - Representação da influência da variação da temperatura próxima do ponto de fusão. Quanto menor
a temperatura menor é o tamanho do raio crítico do núcleo bem como a barreira energética a ser
superada para a formação do cristal.
Em uma primeira análise, as duas abordagens acima se mostram contraditórias, uma
vez que a abordagem dinâmica mostra que o número de núcleos irá crescer à medida que o
grau de saturação ou a temperatura aumentam. Enquanto que a teoria termodinâmica mostra
que a formação dos núcleos, bem como a diminuição de seu tamanho, serão beneficiados em
baixas temperaturas. Entretanto, deve-se notar que na teoria cinética estamos falando da
energia de ativação, enquanto que na teoria termodinâmica, a energia se refere à energia livre
‐39‐
de Gibbs. Experimentalmente, podemos ver ambos os casos, um no qual o aumento da
temperatura ajuda na ocorrência da síntese, e o outro no qual a diminuição da temperatura
leva à formação de NPs menores. Na síntese de NPs metálicas utilizando redutores fortes
como o boro hidreto de sódio (NaBH
4
), a melhor distribuição e tamanho reduzidos são
obtidos em temperaturas baixas, próximas de 4 ºC. Neste caso, a energia de ativação não é
uma barreira grande a ser quebrada, devido ao caráter de forte agente redutor que o NaBH
4
apresenta, sendo mais importante o controle dos parâmetros termodinâmicos. Já na síntese
utilizando redutores brandos como a QS ou o ácido cítrico, a reação só ocorre com o aumento
da temperatura, corroborando com a teoria dinâmica, uma vez que a energia de ativação a ser
quebrada é grande, comparada ao NaBH
4
. Para que os redutores brandos sejam ativados como
grupos doadores de elétrons na redução da prata, se faz necessário o aumento de
temperatura
35, 70
, ou a adição de outro composto químico, como NaOH
73
, ou ambos
60
. Vale
ressaltar também que as duas abordagens acima tratam apenas da etapa de nucleação, não
levando em conta a etapa de aglomeração a qual possui um papel tão importante quanto a
nucleação na formação das NPs
74
.
Outro processo importante que tem papel fundamental na obtenção das NPs é o
fenômeno de ripening de Ostwald, no qual as partículas menores são consumidas pelas
partículas maiores durante o crescimento. Este comportamento está previsto pela equação de
Gibbs-Thomson, na qual observamos que a solubilidade da partícula aumenta com a
diminuição do tamanho. Nesta etapa a distribuição de partículas é dada por:
(22)
Sendo
o número de partículas nucleadas,
e
a função
dependente do tempo, relacionada com a dimensão absoluta dos grãos, ρ. Para a síntese de
NPs pequenas e com uma baixa distribuição de tamanho, a etapa de nucleação deve ser
relativamente rápida e ampla, por outro lado, a etapa de crescimento deve ser lenta
42, 75
.
Assim como a termodinâmica é importante no processo de obtenção de NPs, ela
também está presente no processo de aglomeração destas. As NPs coloidais são
termodinamicamente muitos instáveis mesmo quando
, devido à minimização da
energia livre de Gibbs. A energia livre de Gibbs pode ser escrita também em função da tensão
superficial e da variação na área superficial .
(23)
De acordo com a equação acima, a variação da energia livre de Gibbs será negativa
quando for negativo. Logo, o sistema tende a minimizar a razão superfície/volume, ou
‐40‐
seja, favorece o fenômeno de aglomeração. Adicionalmente, as NPs reagem mutuamente
umas com as outras devido às forças de Coulomb, tendendo a formação de aglomerados.
A minimização de energia de superfície é também importante para se explicar a
formação de NPs metálicas quase-esféricas na maioria das rotas de sínteses adotadas. Para
NPs no vácuo, a termodinâmica estipula que deve ser alcançada a minimização de energia
superficial, que é atingida para formas quase-esféricas, uma vez que essa morfologia
apresenta a menor relação área/volume. Contudo, deve-se lembrar que os metais apresentam
uma estrutura cristalina bem definida, logo a energia de superfície é uma função da direção
cristalográfica. Para os metais com estrutura cúbica de face centrada (cfc), caso da prata, as
energias para as facetas de baixos índices seguem a seguinte sequência:
76
, já que a densidade de átomos é diferente em cada uma destas superfícies. A figura 6
exemplifica melhor cada superfície.
Figura 6 - Esquema ilustrativo mostrando as faces e conseguentemente o número de átomos em cada face de
uma estrutura cristalina cfc com os índices {100} (a), {110} (b) e {111} (c).
A formação de NPs esféricas pequenas requer a exposição de planos cristalinos de
altos índices na superfície, aumentando substancialmente a energia superficial. Pela
construção de Wulf podemos obter a forma de menor energia que as NPs irão assumir.
Tomando a energia de superfície como uma função cristalográfica, obteremos que a área de
uma determinada faceta será inversamente proporcional à sua energia de superfície. As
menores energias superficiais para metais com estrutura cfc são constituídas por uma
combinação de facetas {111} e {100}. Diferentes formas possíveis para NPs com tais facetas,
diferentes razões
são mostradas na figura 7. AgNPs apresentam a razão de
para a mínima energia de superfície, tendo como forma resultante um cubo-
octaedro, construído por facetas hexagonais {111} de maior área e facetas quadrangulares de
{100}. Entretanto, a construção de Wulf não considera as energias associadas a arestas e
‐41‐
vértices, e pode não fornecer a forma de equilíbrio para partículas muito pequenas (< 3nm).
Com o intuito de diminuição de energia, tendo apenas facetas {111}, pode ocorrer a formação
de estruturas não-cristalográficas para partículas pequenas que por transições estruturais
formam decaedros e/ou icosaedro, figura 7. Essas partículas são comumente chamadas de
Multiple Twinned Particles (MTP)
77
.
Figura 7 - Diferentes formas de nanoparticulas (a) dependentes da relação dos planos cristalográficos {100} e
{111}, os números acima das figuras são referentes a razão
e (b) de estruturas não-
cristalinas. Figura retirada da Tese de Doutorado do Dr. Túlio Rocha
78
.
2.3 Estabilizantes
A fim de se evitar o fenômeno de aglomeração, as NPs devem ser estabilizadas de
alguma forma, durante a síntese, ou em sua estocagem, para aumentar o seu tempo de uso. A
estabilidade das AgNPs pode ser atingida tanto por meio de interações eletrostáticas, na qual a
estabilização ocorre por meio de cargas na superfície da NP, quanto pela interação estérica, na
qual há a presença de grandes moléculas ligadas à NP, vide figura 8
79
. Grande parte dos
estudos nesta área se beneficia da estabilização estérica, utilizando para isso, algum tipo de
molécula orgânica como polímeros/biopolímeros
6, 35, 40, 48, 60, 73, 80-87
, biomoléculas como o
citrato
36, 69
ou até o uso de DNA e peptídeos
89, 90, 91
. Entretanto, outros trabalhos mostram a
possibilidade da síntese de NPs estabilizadas somente por interações eletrostáticas
37, 38, 42, 75, 92
93
. Ressalta-se que a utilização somente da interação eletrostática para inibir o processo de
‐42‐
aglomeração não é muito indicado, já que tal inibição não é resistente a mudanças em uma
ampla faixa de pH.
Figura 8 - Representação dos mecanismos existentes para a estabilização das NPs, (a) estabilização por forças
eletrostáticas, partículas carregadas ou (b) por ação do efeito estérico. Figura retirada do manual do
equipamento ZetaSizer Nano.
Motivados pela busca de processos e materiais mais amigáveis ao meio ambiente,
inúmeros grupos de pesquisas optam atualmente por inibir o fenômeno de aglomeração por
meio do uso de biopolímeros e polímeros biocombatíveis
6, 7, 13, 17, 35, 40, 46, 60, 65, 73, 80, 82-85, 87, 89,
90, 5, 94, 95
. Com o objetivo em comum, acerca do desenvolvimento de processos e materiais
menos agressivos, nosso trabalho optou pelo uso dos polímeros PVA e QS para a inibição do
efeito de aglomeração.
2.3.1 Polivinil álcool
O PVA é um polímero composto pela unidade repetitiva de fórmula [-CH
2
CHOH-],
figura 9, que possui risco nulo para saúde, podendo ter amplo contato com a pele e ser
ingerido sem problemas
96
, sendo solúvel em água a 60 ºC. O PVA é utilizado em indústrias
alimentícias, farmacêuticas e cosméticas, devido às suas propriedades de barreira contra
umidade, oxigênio e outros agentes externos
97
. Por tais características, e por ser tão pouco
reativo contra o organismo, o mesmo foi adotado como estabilizante neste, e em muitos
trabalhos
65
. Com a inserção de AgNPs ocorre um aumento das propriedades térmicas do
polímero, como o aumento do ponto de transição vítrea em 20 ºC, e mecânicas
65, 83
. A
interação das AgNPs com o PVA se dá por meio do grupo OH
65, 83
. Em vários casos, o agente
redutor utilizado para a obtenção das AgNPs em PVA é o NaBH
4
65
sendo geralmente obtidas
NPs com diâmetro de 20 nm.
‐43‐
Figura 9 - Representação do monômero do polímero PVA.
2.3.2 Quitosana
A QS é um biopolímero natural obtido por meio da desacetilização da quitina, que por
sua vez é obtida do exoesqueleto de artrópodes, principalmente de caranguejos, camarões e
lulas. Além de apresentar ótima biocompatibilidade, apresenta também ação bactericida,
sendo uma excelente alternativa no uso como estabilizante de NPs metálicas. Sua ação
fungicida foi descoberta por Henri Branconnet em 1811. A quitina, assim como a celulose, é
um polissacarídeo de cadeia linear e seus monômeros são compostos por unidades de 2-
acetamida-2-deoxi-D-glicopironase, sendo a ligação entre os mesmos do tipo β (14). A
quitina, junto com a celulose, são os polímeros mais abundantes encontrados na natureza,
ocupando o segundo e primeiro lugares, respectivamente. Além disso, suas estruturas são
muito semelhantes, tendo apenas um grupo funcional diferente acetoamido (NHCOCH
3
) para
a quitina e OH para a celulose, apresentando a mesma função estrutural nos organismos.
A QS, assim como a celulose e quitina, apresenta a mesma estrutura, exceto pela
presença de uma amina primaria (NH
2
) como grupo funcional, ao invés do grupo acetoamido
ou OH, como mostrado na figura 10. Mais precisamente, a QS é toda quitina que tem 50% ou
mais de grupos acetoamidos desacetilados, ou seja, pelo menos metade dos grupos
acetoamidos foram transformados em aminas primárias (NHCOCH
3
→ NH
2
)
99
. O grau de
desacetilação da QS pode variar de 50 % até 90 %, e o seu peso molecular de 50 a 1000 Da.
A solubilidade da QS está intrinsecamente relacionada com o número de grupos NH
2
,
assim como sua distribuição na cadeia, randômica ou em blocos. De maneira geral, a QS é
insolúvel em água pura, ácidos concentrados, álcool, acetona e solventes orgânicos, apresenta
um pKa em torno de 6,5
98
. Entretanto, ela é praticamente solúvel em soluções de ácidos
*
*
OH
n
‐44‐
orgânicos (acético, fórmico e cítrico) além de ácidos inorgânicos diluídos (clorídrico,
perclórico ou fosfórico e nítrico) em pH menor que 6
99
, uma vez que a solubilidade se dá pela
protonação do grupo NH
2
convertendo um polissacarídeo em polieletrólito
99
.
Figura 10 - Estrutura química da (a) celulose, (b) quitina e (c) QS, respectivamente. Os termos x e y na QS
representam a relação entre os grupos com aminas primárias e com acetoamidas respectivamente,
x+y =100%.
A QS é um polímero pseudonatural catiônico, sendo assim desejado em diversas
aplicações
99
. As proteínas, por exemplo, podem também apresentar caráter catiônico,
entretanto, não apresentam somente carga positiva por toda a sua cadeia. Assim como a
quitina, a QS pode apresentar estrutura cristalina α ou β, ambas mantidas por pontes de
hidrogênio, sendo que a estrutura α possui interações com as cadeias adjacentes, enquanto a
estrutura β apresenta interações somente entre os grupos de uma mesma cadeia
99
. Ogawa, Yui
e Okuyama determinaram que nos cristais de QS, os monômeros interligados por ligações
glicosídicas possuem uma rotação de 180
0
entre si, sendo estabilizados por pontes de
OHOH
OH
O
*
O
*
n
(a)
NHCOCH
3
OH
OH
O
*
O
*
n
(b)
OH
NH
2
NHCOCH
3
OH
O
OH
OH
O
*
O
O
*
x
y
(c)
‐45‐
hidrogênio entre o grupo OH do carbono 3 e o oxigênio da posição 5, como ilustrado na
figura 11. Moléculas de água podem ou não ser encontradas estabilizando cristais de QS,
sendo mais abundante moléculas com a presença de água
100, 101
.
Figura 11 - Representação das possíveis interações que molécula de QS faz consigo mesma por meio de pontes
de Hidrogênio. Figura retirada do trabalho de Molecular and Crystal Structure of Hydrated
Chitosan
101
.
Dentre as características mais importantes apresentadas pela QS estão:
biocompatibilidade e atoxicidade, biodegrabilidade (pela ação de enzimas como lisoenzimas
ou quitosanase), adesividade, capacidade de acelerar a formação de osteoblastos para a
formação do osso, ação homeostática e imunoadjuvante, aceleradora no processo de
cicatrização, formação de complexos, tanto com proteínas, como com metais, e sua ação
bactericida e bacterisotática
102, 103, 104
. Em sua ação como quelante em íons de cobre, a
complexação chega à [Cu]/[-NH
2
]=0,5 mol/mol
99
.
Neste trabalho, em particular, o uso da QS se deve à sua capacidade de quelante, bem
como na ação bactericida contra uma grande gama de microorganismos. Inúmeros estudos
estão sendo realizados para a melhor compreensão da ação da QS contra microorganismos
15,
105, 106
, apresentando tanto ação contra bactérias Gram positivas e Gram negativas, como S.
aureas e E. coli, fungos e mesmo alguns vírus
15
. Especula-se que sua ação ocorra somente na
membrana plasmática, por interações com os componentes aniônicos da mesma, por meio de
grupos fosfolipídicos, ocasionando mudanças na permeabilidade da membrana
105
. A Mínima
‐46‐
Concentração Inibitória (MCI) para os seguintes fungos B. cinérea, F. oxysporum, D.
sorokiana, M. nivalis, P. oryzae, R. solani e T. equinum variou de 10 a 5000 ppm
15
, resultados
dependentes tanto do tipo de QS, bem como do meio no qual o ensaio foi efetuado. Contra o
R. solani, por exemplo, mostrou ação mesmo em temperaturas de estocagem de 13 ºC
15
. A
faixa de MCI contra bactérias é mais estreita, A. tumefaciens, B. cereus, C. michiganence, E.
sp., E. carotovora subsp., E. coli, K. pneumoniae, M. luteus, P. fluorescens, S. aureus e X.
campestris com o MCI variando de 10 a 1000 ppm
15
.
2.4 Nanocompósitos
2.4.1 Nanocompósitos bactericidas
A aplicabilidade dos nanocompósitos varre praticamente todos os campos da ciência e
tecnologia, proporcionando aos materiais características como maior resistência térmica e
mecânica
65, 108
, efeito lótus
88
, catálise
114
, e propriedades bactericidas
11, 13, 55, 60
.
A pesquisa em nanocompósitos bactericidas se baseia principalmente no uso de uma
matriz polimérica e NPs metálicas e/ou cerâmicas. Dentre estas, as AgNPs são as mais
útilizadas devido à sua ampla faixa de ação contra microorganismos
10, 11
e principalmente aos
microorganismos mais resistentes como S. aureus, E. fuecium, Tuberculosis, S. pneumoniae
12
,
fungos como a C. albicans
61
e também contra o vírus HIV
57
. Entretanto, alguns trabalhos
relatam o uso de AuNPs
115
, porém sua ação é menos eficaz que a das AgNPs
57
. Alguns
trabalhos relatam que se as partículas forem suficientemente pequenas, < 500 átomos, muitos
outros metais, além da prata e do ouro, terão efeito bactericida, a saber: Co, Cu, Pt, Fe, Cr, Pd,
Ni, Rh e Pb
42
. Já para as NPs cerâmicas tem-se como destaque o uso do TiO
2
7, 114
. Entretanto
seu modo de ação se diferencia do da prata, uma vez que o TiO
2
possui uma ação
bacteriostática e não bactericida, ou seja, ele apenas impede que colônias de bactérias cresçam
sobre a superfície na qual ele está depositado
7
. Na presença de luz, no entanto, o TiO
2
fica
mais reativo gerando radicais livres na solução, os quais podem agir sobre as bactérias.
Assim, na presença de luz, o TiO
2
também se mostra bactericida. Tal reatividade se dá pela
excitação dos elétrons da banda de valência (geração de buracos) para a banda de condução,
‐47‐
uma vez que o band gap é da ordem de 3 a 4 eV, suficiente para ser excitado pelo
comprimento de onda da luz ultra violeta (UV)
116
.
Por sua conhecida atividade bactericida, a QS é muito utilizada em combinação com
inúmeras NPs
82
, ou com Na-Montmorillonite, Cloisite 30B e íons de prata
13
. A presença das
aminas na cadeia da QS confere propriedades de policátion em soluções ácidas, pH < 6,5,
favorecendo tanto a sua ação bactericida, quanto de quelante, complexando diversos metais
35,
40, 60
. A simples adição de 2,15% (massa) de AgNPs na matriz de QS aumenta
significativamente sua ação contra a E. coli , comparada à QS pura
60
, através de uma menor
concentração e maior velocidade de ação. Com o intuito de aumentar ainda mais a atividade
bactericida, grupos de pesquisa desenvolveram filmes multicamadas TiO
2
/ QS e heparin, os
filmes foram deixados em uma solução de AgNO
3
por 8 h e depois mantidos na temperatura
de 150ºC por 2 horas para a redução da prata, apresentando uma ótima ação sobre a radiação
UV, devido à ação conjunta do TiO
2
e da prata. Na ausência de luz a ação bactericida ainda é
mantida pela liberação dos íons de prata
7
.
Uma vez que os nanocompósitos bactericidas são desenvolvidos para aplicações em
utensílios, como embalagens de alimentos, cateter urinários
55
, tecidos
73
, tintas
110
medicamentos (uso tópico), a troca de redutores fortes como o NaBH
4
, dimetilformaldeido
que são muito reativos, por redutores mais brandos como açucares, citrato entre outros
46, 85
se
faz cada vez mais necessária. Esta busca tem sido chamada de nanotecnologia “verde”. Nesta
linha, alguns grupos utilizam a QS tanto como surfactante, como redutor brando, em rotas de
síntese em meios levemente básicos ou básicos, e temperaturas relativamente altas, 60ºC -
100ºC
6, 60, 84, 73
. Entretanto, altas concentrações de NaOH causam a degradação do
biopolímero QS
35
. Nestas rotas são geralmente obtidas AgNPs de 1 - 20 nm, estáveis de 1 a 2
meses
6, 60, 73
. Para concentrações baixas de QS, agindo como redutor e estabilizante, a reação é
mais rápida, sendo proposta a ação do grupo CH
2
OH da QS como agente redutor
84
. Contudo,
estudos mostram que quando a QS sofre auto-hidrólise, em altas temperaturas, gera a abertura
irreversível de seu anel, fenômeno de degradação da mesma, tal fato ocorre pela oxidação do
grupo CHO em COOH, figura 12
85
.
‐48‐
Figura 12 - Esquema da possível forma de degradação da QS presente em um sistema com íons de ouro e alta
temperatura. Figura retirada do artigo Degradation Behavior of Chitosan chains in the “Green”
Synthesis of Gold Nanoparticles
85
.
‐49‐
3. Parte experimental
3.1 Materiais
Os materiais utilizados referem-se aos reagentes das sínteses das AgNPs. A seguir são
descritos os materiais e suas origens:
-Nitrato de prata (AgNO
3
) adquirido da Sigma Aldrich.
-Polivinil álcool - PVA, 99% hidrolisado adquirido da Sigma Aldrich.
-Boro hidreto de sódio (NaBH
4
) adquirido da Sigma Aldrich.
-Quitosana de alto peso molecular adquirido da Sigma Aldrich.
-Citrato de sódio adquirido da LabSynth.
3.2 Rotas de sínteses
Neste trabalho, utilizamos síntese coloidal em meio aquoso, sendo utilizadas duas
rotas distintas: i) utilizando o NaBH
4
como redutor; ii) utilizando tanto a QS como o citrato de
sódio como redutores.
Antes das sínteses utilizando o NaBH
4
, todas as soluções eram resfriadas em banho de
gelo por 30 minutos e a mistura era realizada em agitadores magnéticos, sendo o agente
redutor o último a ser adicionado. Para a dissolução da QS é necessário um meio ácido, assim
era preparada uma solução 1 % de ácido acético e deixada sobre agitação overnight para
completa solubilização. Para solubilizar o PVA foi necessário o aquecimento da solução a
60ºC. A relação entre AgNO
3
e o NaBH
4
foi mantida em 1:3 em massa para garantir que a
quantidade de redutor seria sempre maior que a do precursor. A equação que descreve a
redução dos íons de prata por meio do NaBH
4
é dada por:
(23)
Na primeira etapa do trabalho foram realizadas as seguintes sínteses:
Síntese 1) Inicialmente foram preparadas soluções de QS e PVA (230 mg.mL
-1
),
AgNO
3
(90 mg.mL
-1
) e NaBH
4
(540 mg.mL
-1
). Posteriormente foram adicionadas alíquotas
‐50‐
de 80 mL das soluções de QS ou PVA e AgNO
3
em um béquer sob agitação, e em seguida 40
mL de NaBH
4
. Ambos os nanocompósitos formados, QS:AgNPs e PVA:AgNPs, tem a
relação em massa de 4:1, polímero:AgNPs.
Síntese 2) Foi preparada uma solução de AgNO
3
, a 0,0375 mg.mL
-1
. Em seguida, em
uma alíquota de 60 mL desta solução em banho de gelo, foi adicionado 6,75 mg de NaBH
4
. A
concentração limite na síntese sem a presença de polímero foi de 0,2 mg.mL
-1
, sendo que em
concentrações maiores ocorria precipitação de prata micrométrica, a solução apresentava
pontos negros e um filme prateado na interface ar/líquido. Assim, para evitar possíveis
fenômenos de aglomeração durante as medidas foi adotada a concentração de 0,0375 mg.mL
-
1
. Logo após a síntese, todas as amostras foram armazenadas em freezer em frascos protegidos
com papel alumínio.
Na segunda etapa do trabalho foram realizadas sínteses
similarmente à etapa 1,
entretanto, variou-se a relação polímero:AgNPs. Foram realizadas 4 sínteses com QS, e uma
com PVA, para comparação. Em todas as sínteses foram utilizadas soluções de 85 mg/L de
AgNO
3
e 1 g/L de NaBH
4
. O objetivo foi o estudo do nanobiocompósito QS:AgNPs. A tabela
1 relaciona a concentração de cada reagente, sendo adicionadas alíquotas de 5 mL de
estabilizante (QS ou PVA) e AgNO
3
, e de 1,2 mL de NaBH
4
. Como antes, todas as soluções
ficaram mantidas em banho de gelo por no mínimo 30 min., para minimizar os efeitos de
aglomeração.
Tabela 1 - Relação dos reagentes presentes em cada nanobiocompósito.
Amostra
QS (g.
.L
-1
)
QS:AgNPs_11:1 0,62
QS:AgNPs_9:1 0,48
QS:AgNPs_6:1 0,34
QS:AgNPs_4:1 0,21
PVA:AgNPs_11:1 0,62
Na terceira etapa deste trabalho foram também produzidos nanocompósitos de
QS:AgNPs. Nesse caso, desejamos realizar uma síntese mais amigável ao meio ambiente, sem
adição de NaBH
4.
Necessitou-se de uma montagem experimental um pouco mais complexa,
figura 13. As reações ocorreram em um balão de três bocas acoplado a um condensador, para
evitar evaporação da água. Inicialmente, foram preparadas 3 soluções de citrato, nas
concentrações de 0,0 mg.mL
-1
, 0,5 mg.mL
-1
e 1 mg.mL
-1
, que tiveram o pH corrigido para 7,2
e aquecidas até a ebulição. Em seguida, em alíquotas de 100 mL dessas soluções, adicionou-
‐51‐
se 200 mg de QS e 80 mg de AgNO
3
, variando-se a massa e o tempo de reação (90 ou 600
segundos). Todos os nanocompósitos apresentavam uma proporção de 4:1 em massa de
QS:AgNPs. Todas as sínteses foram realizadas em 100 mL das soluções aquosas de citrato
com diferentes tempos de reação, como ilustrado na tabela 2. Em todas as síntese foram
utilizadas 200 mg de QS e 79 mg de AgNO
3.
Figura 13 - Esquema ilustrativo do aparato utilizado para a síntese dos nanobiocompósitos.
Tabela 2 - Relação das massas de cada reagente bem como o tempo de síntese em cada nanobiocompósito.
Amostra
Citrato de Sódio
(mg
mL
-1
)
Tempo de reação
(seg)
AM1 0,00 600
AM2 0,50 600
AM3 1,00 90
AM4 0,50 90
Após a síntese, as soluções foram filtradas com filtro de 0,45 µm, depois os filtrados
foram secos em estufa por 4 horas a 60ºC. Para as caracterizações espectroscópicas e
morfológicas, os nanocompósitos em pó foram re-dissolvidos em uma solução de 1 % de
ácido acético, já as demais medidas como difração de raio-X (DR-X) e análise térmica de
Termogravimetria (TGA) foram realizadas diretamente com o pó.
‐52‐
3.3 Preparação dos filmes
A última etapa do trabalho consistia na preparação de filmes de PVA com o
nanocompósito que apresentasse as melhores características, neste caso o AM4, sintetizado
exatamente como especificado acima. Os filmes foram preparados com diferentes relações de
PVA e AM4 em massa, sendo preparados 5 filmes diferentes. Após a imediata síntese do
nanocompósito AM4 o pó presente na solução foi dissolvido na própria solução pela adição
de ácido acético, atingindo a concentração de 1%, não sendo filtrado como antes. Com o
intuito de se obter a mesma concentração final em massa em todos os filmes, diferentes
massas de PVA foram dissolvidas em suas respectivas quantidades de água MilliQ e
posteriormente misturadas em alíquotas da solução de AM4, dados presentes na tabela 3.
Somente o filme com a maior quantidade de AM4 teve o PVA dissolvido diretamente na em
sua solução.
Tabela 3 - Relação das massas de cada reagente para a produção dos filmes.
Filme PVA (g) Água MilliQ (ml) AM4 (ml)
PVA:AM4_100:0 1,5000 60 0
PVA:AM4_97,5:2,5
1,4625 45 15
PVA:AM4_95:5
1,4250 30 30
PVA:AM4_92,5:7,5
1,3875 15 45
PVA:AM4_90:10
1,3500 0 60
Depois de misturados as soluções dos filmes foram colocadas sobre placas de Petri e
estas acondicionadas, somente elas, em uma estufa à 40ºC por 3 dias. Depois de secos os
filmes descolaram facilmente das placas e foram armazenados em sacos do tipo ZipLoc® até
os ensaios térmicos, de resistência mecânica e teste de halo de inibição, os quais foram
realizados com no máximo 1 semana após a manufatura dos mesmos.
3.4 Técnicas de Caracterização
‐53‐
3.4.1 Espectroscopia UV - vis
As propriedades ópticas das NPs metálicas são basicamente tratadas com base na
eletrodinâmica clássica, pelas teorias de Rayleigh e Mie, e pela teoria quântica utilizada
principalmente para explicar partículas com tamanhos inferiores a 4 nm. A mudança de cores
nas NPs se origina pelo fenômeno conhecido como ressonância plasmônica de superfície, que
é a excitação coletiva dos elétrons na interface entre um condutor e um isolante. O efeito de
superfície plasmônica é muito sobressalente nas NPs metálicas, devido à sua razão
superfície/volume. Essa excitação é gerada quando uma onda EM incide sobre uma NP
metálica fazendo sua nuvem eletrônica oscilar, gerando uma freqüência de oscilação entre o
núcleo e a nuvem por meio das interações de Coulomb, figura 14. Para NPs esféricas ocorre a
formação de dipolos, já as NPs anisotrópicas são capazes de gerar quadrupolos ou
multipolos
17
. O momento de dipolo induzido é provocado pela movimentação da nuvem
eletrônica dentro da partícula na mesma freqüência que o comprimento de onda incidente, tal
movimentação é gerada pela interação da onda EM com a partícula. A oscilação do dipolo
induzido tem como origem a onda EM incidente, sendo que grande parte da luz espalhada
possui a mesma freqüência
que a onda incidente, conhecida como espalhamento elástico.
Cada comprimento de onda produz uma oscilação diferente na nuvem eletrônica, podendo ser
ressonante ou não. Oscilações ressonantes transformam a energia da radiação EM incidente
em energia térmica
4
. Alguns dos fatores que determinam a faixa espectral de absorção, ou
seja, onde ocorre à ressonância, são: densidade eletrônica, massa efetiva e principalmente o
tamanho e formato das NPs, além da sua interação com seus estabilizantes, e o meio no qual
se encontram
117
.
Figura 14 - Esquema representativo da oscilação da nuvem eletrônica da NP em resposta à um campo
eletromagnético, geralmente luz UV - vis.
‐54‐
Sendo possível, em princípio a produção de qualquer forma de partícula, NPs
metálicas como as de prata podem apresentar absorção por praticamente todo o espectro
visível
4
. Outro ponto interessante é a possibilidade de inferir características importantes das
NPs como tamanho, forma e distribuição das mesmas em solução, por meio da espectroscopia
no UV-vis. Dessa forma, a espectroscopia no UV-vis é uma das técnicas utilizadas neste
trabalho para identificar a existência de AgNPs, e sua estrutura básica. O equipamento
utilizado foi espectrofotômetro de modelo U2800 Spectrophotometer da empresa Hitachi.
Este equipamento também foi utilizado na medida de Densidade Óptica (OD
595
) utilizada nos
ensaios microbiológicos, os quais serão detalhados posteriormente. A medida de OD
595
consistia em medir a absorbância do meio de cultura que continha tanto a bactéria E. coli em
função do tempo, intervalos de 1 hora. A medida de absorbância era realizada no
comprimento de onda específico de 595 nm, comprimento este que a E. coli possui uma ótima
absorção.
3.4.2 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier
(Fourier Transform Infrared) FTIR
A espectroscopia no infravermelho investiga a interação da luz com a matéria, pela
absorção dos fótons com mesma energia de vibração das moléculas. A intensidade da
absorção depende de quão eficiente é a transferência da energia do fóton para a molécula. As
moléculas que são sensíveis à esta técnica devem ter dipolos, moléculas que não possuem
mudança de dipolo devido ao campo EM aplicado são ditas inativas, exemplo de tais
moléculas são N
2
, H
2
entre outras, que apresentem ligações simétricas. O número de onda,
utilizado nas medidas de espectroscopia no infravermelho, é dado em cm
-1
(cm
-1
=1/) que
geralmente vai de 4000 cm
-1
até 600 cm
-1
. A região entre 4000 cm
-1
e 1000 cm
-1
é responsável
pelas assinaturas dos grupos funcionais presentes na molécula, vibrações mais energéticas. As
vibrações entre 1000 cm
-1
até 600 cm
-1
referem-se àquelas com mudança nos ângulos entre os
átomos. A espectroscopia no infravermelho neste trabalho será utilizada com dois enfoques
principais, o primeiro é na determinação das interações das AgNPs com o polímero, por meio
‐55‐
do deslocamento de bandas de grupos funcionais específicos, e também da investigação da
degradação dos polímeros por meio do surgimento de novas bandas.
O equipamento utilizado foi o espectrofotômetro Thermo Nicolet Nexus 470 FTIR.
3.4.3 Espalhamento Dinâmico da Luz (Dynamic Light Scattering) DLS
Esta técnica mede o tamanho das partículas por meio do espalhamento de luz em um
modelo de uma esfera difusa que se movimenta em meio aquoso devido ao movimento
Browniano, de maneira que a velocidade da partícula no meio determina o seu tamanho. Uma
fonte laser incide sobre a amostra que espalha a luz. Esse padrão de espalhamento é projetado
em um anteparo e a aquisição dos dados é tomada em função do tempo. Dessa forma são
analisadas as flutuações devido ao espalhamento da luz, estimando assim a velocidade das
partículas em solução. Com estes dados, e utilizando a equação de Stokes-Einstein é possível
estimar o raio hidrodinâmico das partículas.
O equipamento utilizado foi o Zeta Sizer Nano ZS da Malvern Instruments, capaz de
determinar tamanhos de partículas desde 0,6 nm até 6 µm.
3.4.4 Potencial Zeta
Todas as partículas em suspensão apresentam um determinado valor para o potencial
Zeta, e com o conhecimento deste, é possível caracterizar se um colóide é estável ou não. A
estabilidade total de uma suspensão depende do seu potencial total, que é a soma do potencial
devido ao solvente, do potencial atrativo e do potencial repulsivo, que contém o termo de
potencial Zeta (), de acordo com a teoria DVLO (oriundo do nome dos cientistas Derjaguin,
Verwey, Landau e Overbeek). Para não ocorrer o fenômeno de aglomeração o potencial
repulsivo deve ser maior que o potencial atrativo. A estabilidade de partículas em soluções
ocorre quando o valor do potencial Zeta é de ou , caso contrário,
a aglomeração das partículas irá ocorrer, sendo a velocidade de
aglomeração aumentada quanto mais próximo de zero for o potencial Zeta. Conhecendo o
‐56‐
valor do potencial Zeta em função do pH é possível determinar qual a faixa ideal de trabalho
do colóide.
A medida de potencial Zeta também ocorre pelo espalhamento dinâmico da luz,
contudo neste caso a cela na qual se encontra a solução a ser determinada o potencial Zeta é
composta por dois eletrodos, nos quais uma diferença de potencial (ddp) é aplicada, a qual
gera uma movimentação das partículas em solução. Com o espalhamento de luz determina-se
a velocidade das partículas em função da ddp, e conhecendo a viscosidade e a constante
dielétrica do material se obtem o valor do potencial Zeta. O equipamento utilizado na medida
do potencial Zeta é o mesmo utilizado nas medidas de DLS, o Zeta Sizer Nano ZS da Malvern
Instruments.
3.4.5 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
As imagens de MET são formadas por elétrons que atravessam a amostra carregando
toda a informação do volume analisado. O contraste presente nas imagens (contraste entre
claro e escuro) é majoritariamente proveniente de três mecanismos: i) contraste de massa e
espessura, que esta relacionado com a seção de choque de espalhamento elástico. Esta seção
de choque depende do número atômico do átomo espalhador (proporcional à Z
2
) assim,
regiões com átomos de maior numero atômico aparecem mais escuras, ii) contraste de
difração causado por orientações cristalográficas ou por perturbações locais da estrutura
cristalina da amostra, e iii) contraste de fase produzido pela modulação em fase do elétron,
visto como onda quando é refratado pelo material. Este último mecanismo é o predominante
na MET de Alta Resolução.
As amostras utilizadas neste trabalho foram depositadas em uma grade de cobre
revestida de carbono, com posterior evaporação do solvente. Contudo, no caso de soluções
aquosas, a hidrofibicidade do filme de carbono sobre a grade juntamente com a alta tensão
superficial da água geram um menisco que se movimenta à medida que a amostra vai
evaporando ocasionando assim uma possível aglomeração das NPs.
O equipamento utilizado é um CM 120 da Philips, pertencente ao CCDM da UFSCar.
‐57‐
3.4.6 Difração de raio X (DR-X)
O uso da técnica de DR X permite o conhecimento da estrutura cristalina das NPs,
sendo importante para confirmação da existência de NPs, e também para o estudo da
dependência da estrutura cristalográfica com a síntese. Ressalta-se que a análise de
difratogramas para partículas muito pequenas não é de fácil interpretação, uma vez que os
padrões de DR-X são dependentes do tamanho das NPs, e que pode ocorrer a contração da
rede pela alta pressão superficial, levando à posição e largura de picos anômalas. NPs muito
pequenas podem apresentar inúmeras facetas, sendo chamadas de Multi Twinned Particle
(MTP), apresentando assim formas externas diferentes. Há 4 explicações primárias para tais
partículas: i) erros durante o processo de crescimento; ii) equilíbrio intrínseco de estruturas
com menor energia em cristais muito pequenos; iii) transformação de fase para rômbica ou
ortorrômbica; iv) fenômenos cinéticos, crescimento do cristal ao redor de um eixo de simetria.
Adicionalmente pode ocorrer a presença de estruturas não-cristalinas estáveis para as NPs,
como dodecaédricas e/ou icosaédricas. O surgimento de picos anômalos está também ligado à
heterogeneidade estrutural.
O equipamento utilizado nestas análises foi o LABX XRD-6000 da empresa
Shimadzu.
As medidas foram realizadas tanto em filmes do tipo cast depositados em substratos
de vidro e depois fixados no porta-amostra, como pela compactação do pó em um porta-
amostra específico.
3.4.7 Ensaios microbiológicos
Nos ensaios microbiológicos, realizamos inicialmente o teste de Mínima Concentração
Inibitória (MCI), no qual concentrações de 10 µg.mL
-1
até 150 µg.mL
-1
do nanocompósito
foram testadas. Este teste consistia em adicionar 20 µL de uma solução de E. coli (na qual o
número de colônias da bactéria estava saturado) juntamente com até 300 µL da solução a ser
testada, partindo de uma solução inicial de 4g.L
-1
, em tubos de ensaios contendo 10 mL de
‐58‐
uma solução com o meio de cultura específico do microorganismo, Luria Bertani (LB). Estes
tubos de ensaios foram deixados a 37ºC, por um período de pelo menos 10 horas. Pela
turbidez das soluções determinava-se a ocorrência ou não da proliferação da bactéria. Tubos
de ensaios turvos continham inúmeras colônias de microorganismos, significando a
ocorrência da proliferação. O segundo ensaio foi o monitoramento do crescimento das
bactérias em concentrações específicas do nanocompósito, teste de Densidade Óptica,
monitorando a absorção no comprimento de onda de 595 nm (DO
595
), faixa que a E. Coli
possui uma ótima absorção. As concentrações foram estipuladas com base nos dados
encontradas pelo teste MCI. Para a comparação do aumento da ação da QS e AgNPs em
conjunto, foram também testadas soluções de PVA:AgNPs e QS pura. Em ambos os testes foi
utilizado o meio de cultura LB e a incubação foi a 37ºC.
Todas as amostras partiram de soluções iniciais com concentração de 4 g.L
-1
, para que,
através de alíquotas de no máximo 300 µL de amostra, fosse possível atingir uma
concentração final de 150 µg.mL
-1
. O estudo de AgNPs puras não foi realizado devido a
impossibilidade de sintetizar AgNPs sem estabilizantes em alta concentrações. A máxima
concentração de AgNPs sem estabilizantes alcançada neste trabalho foi de 200 µg.mL
-1
.
Assim, para a concentração mais baixa, 10 µg.mL
-1
, necessitaríamos de 500 µL de solução.
Infelizmente o meio LB não poderia ser dissolvido na solução de AgNPs, pois este necessita
ser esterilizado a uma temperatura de 120
0
e a uma pressão de 1 kgf.cm
-2
, e nestas condições
as AgNPs livres seriam severamente modificadas.
Um terceiro ensaio microbiológico investigou a ação das AgNPs incorporadas como
aditivos em filmes de PVA. Nesse caso, utilizou-se o teste de halo de inibição. Foram
cortados 3 círculos de cada filme com diâmetros de 12 mm. É necessário que os filmes sejam
esterilizados, contudo nas condições de esterilização da auto-clave, temperatura de 120
0
e
uma pressão de 1 kgf.cm
-2
em atmosfera úmida, os filmes de PVA provavelmente
solubilizariam. Assim cada amostra circular de filme foi colocada em tubos eppendorf e
lacrados com parafilm. Devido a alta temperatura ocorreram modificações no filme como a
sua coloração, que passou a ser mais sobressalente para o amarelo, possivelmente tanto o
número, quanto o tamanho das AgNPs aumentaram, devido ao aumento de temperatura.
‐59‐
3.4.8 Análise Termogravimétrica (TGA)
A análise TGA consiste no monitoramento da variação da massa de um material em
função da temperatura, em uma atmosfera controlada, geralmente de Nitrogênio ou Ar. Neste
trabalho, análises de TGA foram realizadas para determinar a influência das AgNPs na
temperatura de degradação da QS, além de ser possível estimar-se a quantidade de material
inorgânico, no caso AgNPs, que foi incorporado na matriz polimérica.
O equipamento utilizado foi uma balança termograviométrica modelo TGA Q500, TA
Instruments-USA, com taxa de variação da temperatura de 10ºC.min
-1
, razão de aquecimento
mais adequada no estuda de QS
119
, desde temperatura ambiente até 600ºC. A atmosfera
utilizada foi de Ar sintético na amostra, e de nitrogênio na balança, ambas com vazão de 60
mL.min
-1
.
3.4.9 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
A análise DSC utilizada neste trabalho está baseada no fluxo de calor, na qual é
medida a diferença de temperatura entre a amostra e a referência, enquanto ambos são
submetidos a um ambiente com a temperatura rigorosamente controlada. Neste ensaio a
amostra foi acondicionada em uma panelinha de alumínio e a referencia consistia de uma
mesma panelinha só que vazia. Cada uma das capsulas foi posicionada sobre discos
termoelétricos e aquecidas por uma única fonte de calor, de uma temperatura de 10ºC até
240ºC, o fluxo de calor diferencial sobre as amostras é controlado por meio de termopares. A
diferença de temperatura entre os discos é proporcional a variação de entalpia. Com o uso
desta técnica foi possível realizar o estudo da mudança sobre os processos de fusão e
cristalização dos filmes de PVA após a adição do nanocompósito AM4, o qual continha
QS:AgNPs na proporção de 4:1.
O equipamento utilizado foi o calorímetro modelo Q200, TA Instruments-USA, com
taxa de variação da temperatura de 10ºC.min
-1
, começando em uma isoterma de 2 min em
10ºC, depois a atingindo a temperatura de 240ºC, e outra isoterma de 3 min na maior
‐60‐
temperatura e voltando novamente para 10ºC. A atmosfera utilizada foi de Ar sintético na
amostra, e de nitrogênio na balança, ambas com vazão de 60 mL.min
-1
.
3.4.10 Ensaios Tensão-Deformação
As propriedades mecânicas dos polímeros, como tensão de ruptura, módulo de
eslaticidade, elongação, entre outras, possuem um grande interesse científico - tecnológico,
devido as diversas exigências que os mesmos devem atender para determinados usos. O
conhecimento dessas propriedades permite a comparação entre os diversos polímeros
exitentes, bem como o efeito que cargas, como no caso deste trabalho, nanocompósito de QS
e prata, podem gerar no polímero, afetando de maneira positiva ou não o material. Neste tipo
de análise os resultados são expressos em curvas do tipo Tensão (MPa) versus
Deformação(%). Sobre os corpos de prova são aplicadas forças controladas de tração, flexão
ou compressão, até um valor pré - determinado, ou ruptura do mesmo. O ensaio mecânico
apresentado neste trabalho consistiu no estudo do comportamento dos filmes quando estes
eram submetidos a trações mecânicas, para verificar o efeito da inserção do nanocompósito na
matriz polimérica. Para o ensaio, foram cortados 5 corpos de prova no modelo de gravata,
com dimensões de 3,16 mm x 12,60 mm. A espessura de cada filme foi medida
individualmente por meio de um micrometro analógico. A velocidade de tração dos ensaios
foi de 5 mm/min e a cela de carga utilizada foi a Tr21 (50 kgf). O equipamento utilizado foi a
máquina de ensaio EMIC, linha DL2000.
‐61‐
4. Resultados
4.1 Síntese e Estudo da Estabilidade das Nanopartículas de Prata
A primeira etapa do trabalho consistia na síntese de AgNPs estabilizadas com QS,
PVA, ou sem estabilizantes, com o objetivo de investigarmos principalmente suas
estabilidades. Os espectros UV-vis das três soluções são apresentados na figura 15. Como a
QS apresentou uma grande absorção na faixa de 190 nm a 230 nm, inset da figura 15, as
medidas foram realizadas em uma faixa de 230 nm a 800 nm, pois na região de 200 nm,
mesmo com os recursos de linhas de base do equipamento, as medidas nesta faixa não foram
totalmente confiáveis. Todos os espectros mostraram uma única banda centrada em 400 nm,
característica de AgNPs com formato esférico. O espectro de ambas as solução mostram-se
semelhantes, com uma largura de banda relativamente estreita, sendo a mais estreita
apresentada pelas AgNPs estabilizadas com QS. O espectro da solução de íons de prata
também é mostrado na figura 15. Na comparação entre os espectros, observa-se um leve
deslocamento da banda plasmônica das NPs recobertas com PVA e QS, para maiores
comprimentos de onda, em relação à solução que apresenta somente AgNPs, sem
estabilizante. Tal fato pode estar associado tanto à interação polímero:NPs, que gera
mudanças na banda plasmônica ressonante, ou à diferença de tamanho das NPs entre os
sistemas, revelando que possivelmente as NPs estabilizadas mostraram um maior tamanho
que as AgNPs livres.
No trabalho de Mbhele et. al
65
, foi observado o aumento no diâmetro de 5 nm para 20
nm das AgNPs, depois de incorporadas no polímero PVA, sendo feita primeiramente a síntese
do colóide sem a presença de nenhum estabilizante, para depois incorporar as NPs na matriz
de PVA. A presença do ombro por volta de 260 nm se refere a clusters quânticos (partículas
de 1 - 2 nm); tais estruturas apresentam também picos em 211 nm e 227nm
42
.
Levando-se em conta que a primeira etapa da síntese utilizando o NaBH
4
leva a
formação de NPs de 2 a 3 nm
74
, é de se esperar NPs com esse tamanho em todos os
nanocompósitos, o que de fato ocorreu, figura 17b e 17c. Mesmo para uma maior
concentração de AgNO
3
nas amostras contendo estabilizantes (410 µg.mL
-1
c/ QS e PVA) e
37,5 µg.mL
-1
(s/ estabilizante), observamos nos espectros apenas um pequeno deslocamento
‐62‐
para o vermelho, para as amostras com estabilizantes, em relação à amostra sem
estabilizantes, figura 15. Levando em consideração que quanto maior o número de
precursores, maior é o grau de saturação, e consequentemente, maior serão as NPs e o
deslocamento da banda plasmônica para o vermelho, pode se inferir que o tamanho das
partículas nas três amostras foi relativamente próximo, fato confirmado pelo DLS, figura 17.
300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
200 300 400 500 600 700 800
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Absorbância (u. a.)
Comprimento de Onda (nm)
Quitosana Pura
Absorção (u. a.)
Comprimento de Onda (nm)
Estabilização estérica com PVA
Estabilização estérica com quitosana
Estabilização eletrostática sem polímero
Íons de prata livres
Figura 15 - Espectros de absorção no UV - vis das AgNPs, tanto estabilizada pelos polímeros QS e PVA bem
como na ausência de qualquer polímero. O espectro dos íons de prata revela que realmente
ocorreu a formação de NPs na síntese adotada. O inset mostra a absorção de uma solução de QS
cerca de 10 vezes mais diluída do que a apresentada pelos nanocompósitos.
O estudo das interações entre AgNPs e os polímeros estabilizantes foi realizado
utilizando-se espectroscopia FTIR, através da comparação entre o polímero puro e o
nanocompósito. Para a análise foram produzidos filmes do tipo cast sobre lâminas de vidro
recobertas com ouro, para medidas no modo refletância. Os espectros dos nanocompósitos de
QS:AgNPs e PVA:AgNPs estão plotados nas figuras 16a e 16b, respectivamente.
A QS pura mostrou uma banda larga centrada em 3390 cm
-1
e um ombro em 3310 cm
-
1
referentes aos grupamentos amina primária (NH
2
) e secundária (NHR), sendo que o ombro
em 3310 cm
-1
também pode ser atribuído ao grupamanento OH.
O nanocompósito QS:AgNPs apresentou uma única banda em 3350 cm
-1
, sugerindo a
interação das AgNPs com algum desses grupos. A banda em 1560 cm
-1
sofre também um
alargamento quando as AgNPs estão presentes. Esta banda é referente aos grupos NHR, e
também às aminas carregadas (R’NH
2
R X
-
)
. A banda em 1070 cm
-1
referente à NH
2
, presente
em grupos alifáticos, sofreu um deslocamento de cerca de 30 cm
-1
para números de ondas
maiores (1100 cm
-1
), na presença das AgNPs. Dessa forma podemos inferir que a interação
entre a QS e as AgNPs ocorre principalmente via aminas, preferência para as aminas
‐63‐
primárias. Também espera-se algum tipo de interação com o grupo OH. Observamos ainda o
aparecimento de uma banda bem estreita em 826 cm
-1
. Bandas nessa faixa de freqüências
fornecem informações sobre estrutura das macromoléculas, com respeito ao ângulo entre os
átomos. Dessa forma, é de esperar que a presença das AgNPs modifique, mesmo que de
forma branda, a estrutura da QS. Este fato já foi descrito em outros trabalhos para NPs tanto
de prata como de ouro
40, 82
.
Os espectros referentes aos nanocompósitos contendo PVA são mostrados na figura
16b. O PVA puro apresenta bandas bem definidas na faixa de 3440 cm
-1
, referente ao
estiramento do grupo OH, e bandas na faixa de 2900 cm
-1
(estiramento anti-simétrico e
simétrico do CH
2
alifático). A região entre 550 cm
-1
e 750 cm
-1
corresponde às vibrações fora
do plano do grupo OH
65
. A banda em 1375 cm
-1
é referente ao acoplamento entre os grupos
OH, e a banda em 1420 cm
-1
corresponde à vibração do CH. O alargamento da banda de 3440
cm
-1
sugere a interação das AgNPs com o grupo OH. Por outro lado, as bandas de 2910 cm
-1
e
2940 cm
-1
referentes ao estiramento do grupo CH
2
não sofrem deslocamento ou alargamento,
sugerindo a ausência de interação das NPs com tal grupo. O alargamento das bandas entre
1500 cm
-1
e 750 cm
-1
no nanocompósito sugere também a interação das AgNPs com o grupo
OH
65, 83
. O desaparecimento da banda 840 cm
-1
referente à vibração fora do plano do grupo
CH é devido à interação OH/Ag, que inibe tais oscilações
65, 83
. Ocorreu também um aumento
na intensidade das bandas em 1662 cm
-1
e 1573 cm
-1
após a inserção das NPs.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
1070 cm
-1
Número de Onda (cm
-1
)
Absorbância (u. a.)
QS pura
Nanocompósito de QS:AgNps
(a)
1410 cm
-1
‐64‐
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
Número de Onda (cm
-1
)
Absorbância (u. a.)
PVA puro
Nanocompósito de PVA:AgNps
(b)
3440 cm
-1
Figura 16 - Espectro de FTIR dos nanocompósitos de (a) QS:AgNPs e (b) PVA:AgNPs e seus respectivos
polímeros puros. No nanocompósito QS:AgNPs ocorre principalmente o deslocamento e
alargamento das bandas referentes as aminas. O alargamento das bandas na região de 1500 cm
-1
e 750 cm
-1
demonstram a interação das AgNPs com o grupo OH do PVA.
O tamanho das NPs foi avaliado utilizando-se a técnica de DLS. As NPs presentes nos
nanocompósitos contendo QS apresentaram o tamanho entre 12 - 14 nm, ao passo que nos
compósitos com PVA o tamanho observado foi de 8 - 10 nm. As NPs na solução sem
polímero apresentaram diâmetros entre 2 a 3 nm. Esses dados estão ilustrados na figura 17a.
O aumento no tamanho das partículas pelo uso do estabilizante PVA, em comparação à
solução sem estabilizante, já foi relatado na literatura
65
. Adicionalmente, podemos esperar um
aumento no tamanho das AgNPs estabilizadas com QS. Além disso, a concentração de
precursor na rota utilizando tanto QS como PVA é cerca de 11 vezes maior que a rota sem
estabilizante. Em ambas as amostras também foram detectados aglomerados e/ou NPs
maiores. Contudo, estes estão em um número muito reduzido. Imagens de MET comprovam o
tamanho em torno de 10 nm das NPs estabilizadas com PVA e de 13 nm para a QS, além da
presença de NPs de 2 - 3 nm devido a primeira etapa da síntese utilizando o NaBH
4
que leva a
formação de NPs pequenas
74
, figuras 17b e 17c, respectivamente.
‐65‐
0 1020304050
0
5
10
15
20
25
30
Estabilização estérica com PVA
Estabilização estérica com quitosana
Estabilização eletrostática sem polímero
Número de partículas (%)
Diâmetro (nm)
(a)
Figura 17 - Tamanho das partículas obtido pela técnica de espalhamento dinâmico da luz (a), para os sistemas
estabilizados e não estabilizado. Imagens de MET para os nanocompósitos PVA:AgNPs (b) e
QS:AgNPs (c). Ambos apresentam a escala de 50 nm.
A estabilidade dos nanocompósitos (em relação à agregação) foi avaliada analisando-
se o potencial Zeta ( ). Os resultados são mostrados na figura 18. Pela análise do gráfico,
observa-se que as soluções contendo estabilizantes, QS ou PVA, apresentaram um maior
valor do potencial Zeta, sendo desta forma, sistemas mais estáveis para as NPs,
principalmente para valores de pH de 4 - 6,5. Por outro lado, o sistema sem estabilizante
possui o valor em módulo do potencial Zeta sempre menor que 30 mV, revelando a
vulnerabilidade do mesmo com relação à agregação. Juntamente com as medidas do potencial
Zeta foram realizadas medidas do diâmetro das AgNPs. Ambas as análises foram realizadas
variando-se o pH da solução de 4 - 10. Foi possível observar que a solução sem estabilizante
tem o início da aglomeração mais prematuro, em pH 6, porém seu tamanho final em pH 10 é
menor, em torno de 500 nm. A solução contendo PVA começa a mostrar agregação em pHs
mais altos, mas seu tamanho final é maior cerca de 600 nm. O nanocompósito contendo QS
tem o início da agregação para pH maiores que 7, entretanto neste sistema ocorre
‐66‐
aglomeramento catastrófico, cerca de 6 µm, como mostrado no inset da figura 18. Entretanto
deve se ressaltar que a própria QS forma glóbulos em pH acima de 7, assim pode ser que o
tamanho medido não seja o tamanho real das NPs, mas sim o tamanho de um aglomerado de
QS:AgNPs, uma vez que a técnica de DLS utiliza o raio hidrodinâmico para determinar o
tamanho da partícula.
4567891011
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
46810
2,0x10
3
4,0x10
3
6,0x10
3
pH
Diâmetro médio (nm)
Estabilização estérica com QS
Estabilização estérica com PVA
Estabilização eletrostática sem polímero
Potencial Zeta (mV)
pH
Figura 18 - Dependência do potencial Zeta em função do pH, das amostras contendo estabilizantes (QS ou
PVA) e sem a presença de qualquer estabilizante. O gráfico em inset é com respeito à variação do
tamanho das NPs em função da mudança de pH.
Podemos concluir que o uso de estabilizantes na síntese de AgNPs se faz viável e útil.
Apesar do tamanho das NPs aumentar com o uso dos estabilizantes, tanto QS como PVA, em
comparação aos sistemas sem estabilizantes, o aumento não é prejudicial em termos da ação
bactericida, na qual geralmente NPs de até 100 nm apresentam uma ação satisfatória.
Os tamanhos das NPs para os nanocompósitos contendo QS e PVA foram próximos,
de 12 - 14 nm, e de 8 - 10 nm, respectivamente. O uso do estabilizante é vantajoso, uma vez
que se pode produzir soluções mais concentradas, por exemplo, até cerca de 4 g.L
-1
utilizando
QS, e cerca de 3 g.L
-1
, utilizando o PVA. Em ambos os casos, os polímeros foram usados na
razão de 4:1 em massa de polímero:AgNPs. Pela comparação entre os dois sistemas com
estabilizantes, foi possível concluir que a QS possui mais grupos possíveis de interagir com as
NPs. Além disso, a concentração limite da QS é maior. Outro fator vantajoso à QS
evidenciado neste estudo foi a estreita banda no espectro UV-vis (revelando uma distribuição
de tamanho de partículas menor).
Devido a estas características, e também devido ao fato da conhecida ação bactericida
da QS
15, 99, 105, 106
, os nanocompósitos a base de QS:AgNPs foram utilizados na realização de
‐67‐
um estudo mais profundo acerca de sua estrutura e ação bactericida. Estes estudos são
detalhados a seguir.
4.2 Nanobiocompósito QS:AgNPs, estrutura e ação bactericida
Esta etapa do trabalho refere-se ao estudo de nanocompósitos utilizando QS como
estabilizante. O intuito foi de investigarmos mais detalhadamente os processos de
degradação/agregação (estabilidade) do nanocompósito e os tipos de interação entre
AgNPs/QS. Tivemos por objetivo também averiguar se ocorreria algum efeito sinérgico na
ação bactericida, uma vez que dois materiais que apresentem tal ação foram combinados.
Foram sintetizados nanocompósitos em quatro formulações, com diferentes relações
polímero/AgNPs em massa, para estimarmos qual é a melhor relação QS:AgNPs na ação
bactericida contra a E.Coli.
Os espectros de UV-vis referentes às quatro formulações de AgNPs/QS são mostrados
na figura 19. Podem ser observadas bandas de absorção relativamente estreitas, centradas em
400 nm, características de AgNPs isotrópicas. A velocidade de reação foi monitorada pela
absorção em 400 nm, sendo atingida completa reação depois de 4 segundos de síntese, como
mostrado no inset da figura 19. Os espectros de todas as amostras foram normalizados.
300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Absorbância (u. a.)
Comprimento de onda (nm)
QS:AgNps 11:1 QS:AgNps 9:1
QS:AgNps 6:1 QS:AgNps 4:1
QS pura com íons de prata
01234
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
Absorção @ 400 nm
Tempo (s)
Velocidade de reação
(QS:AgNps 4:1)
Figura 19 - Espectro de absorção da banda plasmônica da prata nos 4 nanobiocompósitos sintetizados e o
espectro do sal de prata e QS apenas, sem redução dos íons metálicos. O gráfico em inset diz
respeito à cinética de reação da síntese que mostra completa reação depois de 4 segundos.
‐68‐
Não são observados deslocamentos da banda de absorção, o que indica que todas as
NPs possuem aproximadamente a mesma distribuição de tamanhos.
Após a análise espectrofotométrica, as soluções com os nanocompósitos foram
analisadas por DR-X. As análises foram realizadas com amostras na forma de filmes cast
depositados sobre lâminas de vidro, e os difratogramas são mostrados na figura 20.
Observamos que todas as amostras apresentaram os mesmos picos (38,2º; 44,4º; 64,5º e 77,5º)
referentes aos respectivos índices {111}, {200}, {220} e {311} que caracterizam todas as
amostras como prata de estrutura cfc
83
.
40 50 60 70 80
Intensidade (unid. arb.)
QS:AgNPs_11:1 QS:AgNPs_9:1
QS:AgNPs_6:1 QS:AgNPs_4:1
2
Figura 20 - Difratograma dos nanocompósitos evidenciando a presença de prata metálica com estrutura cfc.
Os tamanhos dos nanocompósitos QS:AgNPs foram investigados por medidas de
DLS, e comparados com imagens obtidas por MET. A figura 21a mostra as distribuições de
tamanhos das NPs obtidas por DLS. São apresentadas também na figura 21, as imagens de
MET referentes a todos os nanocompósitos sintetizados. Os tamanhos médios obtidos pela
técnica de DLS foram de 25 nm, 25 nm, 15 nm e 13 nm para os nanocompósitos de
QS:AgNPs_11:1, QS:AgNPs_9:1, QS:AgNPs_6:1 e QS:AgNPs_4:1, respectivamente. Ambas
as técnicas (DLS e MET) detectaram a presença de poucos aglomerados. Partículas menores,
de 1 a 5 nm, observadas nas imagens de MET não foram detectadas por DLS. As imagens de
MET revelaram similaridade na distribuição de tamanho entre as amostras QS:AgNPs_6:1,
QS:AgNPs_9:1 e QS:AgNPs_11:1, com NPs variando de 5 a 15 nm, mostradas nas figuras
21c, 21d e 21e, respectivamente. Já a amostra QS:AgNPs_4:1, figura 21b, apresentou duas
distribuições de tamanho, tanto NPs menores, com tamanhos variando de 1 a 3 nm, como NPs
maiores com tamanhos de 15 a 25 nm.
‐69‐
0 102030405060
0
20
40
60
80
QS:AgNPs_4:1
QS:AgNPs_6:1
QS:AgNPs_9:1
QS:AgNPs_11:1
Número de partículas (%)
(a)
Diâmetro (nm)
Figura 21 - Análise da dispersão de tamanho das partículas de duas formas distintas, por DLS (a) e imagens
de MET dos 4 diferentes nanocompósitos QS:AgNPs_4:1 (b), QS:AgNPs_6:1 (c), QS:AgNPs_9:1
(d) e QS:AgNPs_11:1 (e). A escala de todas as imagens de MET são de 50 nm.
O potencial Zeta de todas as amostras foi medido em função do pH. O ponto
isoelétrico de todas as amostras foi praticamente o mesmo, em torno do pH 10, como
ilustrado na figura 22a. Ocorreram pequenas diferenças somente para pHs ácidos, sendo que a
amostra QS:AgNPs_4:1 possui o potencial Zeta mais alto, seguida das amostras
QS:AgNPs_6:1, QS:AgNPs_9:1 e QS:AgNPs_11:1, respectivamente. Esta diferença pode ter
‐70‐
ocorrido devido ao grau de exposição das AgNPs presente em cada nanocompósito, ou seja,
mais expostas quanto menor a concentração de QS, e/ou ao caráter catiônico que as AgNPs
livres apresentam em pHs ácidos, figura 18. Este fenômeno ocorre somente para pHs ácidos,
sendo que em pHs básicos o potencial Zeta passa a apresentar o mesmo valor para todas as
amostras, fato confirmado pela gráfico de potencial Zeta apresentado na figura 22a.
24681012
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
QS:AgNPs_4:1
QS:AgNPs_6:1
QS:AgNPs_9:1
QS:AgNPs_11:1
Ponto isoelétrico
(a)
Potencial Zeta (mV)
pH
4681012
1
10
100
QS:AgNPs_4:1
QS:AgNPs_6:1
QS:AgNPs_9:1
QS:AgNPs_11:1
Diâmetro Normalizado
pH
(b)
Figura 22 - Variação do potencial Zeta (a) e do diâmetro normalizado (b) de todos os nanobiocompósitos ambos
em função do pH.
Podemos observar que a melhor faixa do uso do nanocompósitos se encontra entre os
pHs de 4 - 7, referente ao valor do potencial Zeta acima de 30 mV (figura 22a).
Conjuntamente com as medidas de potencial Zeta, foram estimadas as distribuições de
tamanho das NPs em função do pH, na qual foi observada a agregação apenas da amostra com
a menor quantidade de QS, ou seja, QS:AgNPs_4:1. No sistema de QS:AgNPs_4:1, as NPs
‐71‐
estão mais expostas que nos outros sistemas, podendo assim ocorrer o contato entre as NPs, e
consequentemente a agregação, resultando no aumento do tamanho das NPs. Esses dados são
ilustrados na figura 22b.
A figura 23 mostra as análises obtidas por espectroscopia FTIR, para nanocompósitos
contendo diferentes proporções de QS e AgNPs. A fim de verificarmos se ocorreriam
mudanças nas interações entre AgNPs e QS, em função do tempo, os espectros foram
coletados imediatamente após o preparo, e após 24 hs, com armazenamento em condições
ambiente. As medidas foram realizadas em amostras depositadas sobre lâminas de vidro
recoberto com ouro, como detalhado na seção experimental.
Podemos observar que em todos nanocompósitos ocorreu um deslocamento da banda
de 1567 cm
-1
, atribuída à NH
2
, para números de ondas maiores, em relação à QS pura. Esse
deslocamento é atribuído ao acoplamento da AgNP com o grupo amina da QS, após a síntese
os valores desta banda para as amostras QS:AgNPs_11:1, QS:AgNPs_9:1, QS:AgNPs_6:1 e
QS:AgNPs_4:1 são respectivamente 1576 cm
-1
, 1577 cm
-1
, 1579 cm
-1
e 1576 cm
-1
.
Após 24 h, foi observado que a banda em 1567 cm
-1
desloca novamente para números
de ondas menores. Por exemplo, para a amostra de QS:AgNPs11:1 imediatamente após a
síntese, a banda referente à amina é centrada em 1576 cm
-1
, e depois de 24 h, observa-se seu
deslocamento para 1568 cm
-1
. Este comportamento é observado para todas as amostras, e
ilustrado na figura 23.
QS:AgNps_4:1
QS:AgNps_6:1
QS:AgNps_9:1
QS:AgNps_11:1
Quitosana pura
Após a síntese
Após 24 h
1
5
6
7
c
m
-
1
1
5
6
7
c
m
-
1
1700 1600 1500 1400 1300
Refletância (u. a.)
Número de onda (cm
-1
)
1
5
6
7
c
m
-
1
1700 1600 1500 1400 1300 1200
1
5
6
7
c
m
-
1
Figura 23 - Espectro de FTIR para os diferentes nanobiocompósitos em função do tempo de degradação. A
banda de 1562 cm
-1
se refere ao grupo NH
2
da QS.
‐72‐
A estabilidade das soluções de AgNPs foi investigada mais detalhadamente
monitorando-se sua absorção eletrônica em função do tempo, uma vez que a diminuição da
banda plasmônica pode indicar oxidação, ou liberação de íons das NPs
63
. Foram avaliados
nanocompósitos com até 25 dias após o preparo. Os espectros são mostrados na figura 24. A
semelhança na forma e posição das bandas revela que os tamanhos das NPs nos diferentes
nanocompósitos estavam relativamente próximos, mesmo nos diferentes tempos da aquisição
dos espectros. Pode-se inferir também que os nanocompósitos continham NPs isotrópicas, e
com uma baixa dispersão, devidos aos espectros relativamente estreitos. Podemos inferir
também que um possível processo de degradação tenha ocorrido, mas sem implicar em
mudanças estruturais drásticas nas NPs, uma vez que nenhuma banda adicional ou
deslocamentos foram observados em função do tempo.
0,0
0,5
1,0
1,5
300 400 500
0,0
0,5
1,0
1,5
300 400 500 600
QS:AgNPs_11:1
Absorbância (u. a.)
QS:AgNPs_6:1
Após a síntese
Após 24 h
Após 100 h
Após 25 dias
QS:AgNPs_9:1 QS:AgNPs_4:1
Comprimeto de Onda (nm)
Figura 24 - Absorção plasmônica em função do tempo, as amostras foram deixadas em solução e temperatura
ambiente para sofrer o processo de degradação durante 25 dias. A menor absorção da banda
plasmônica indica o processo de oxidação e/ou liberação de íons das AgNPs.
Assumindo que a degradação (neste caso, referente à falta de estabilidade) do
nanocompósito ocorra apenas nas AgNPs, os possíveis mecanismos podem ser oxidação ou
liberação de íons de prata. Não houve deslocamento de banda significativo em nenhum dos
casos analisados. Na figura 25a são mostradas as variações da intensidade no máximo de
absorbância, em função do tempo. As curvas estão normalizadas em relação ao máximo de
absorção de cada amostra.
‐73‐
0 100 200 300 400 500 600
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
QS:AgNPs_11:1
QS:AgNPs_9:1
QS:AgNPs_6:1
QS:AgNPs_4:1
Absorbância
normalizada @ 400 nm
Tempo de degradação (h)
(a)
0 20406080100
20
40
60
80
100
120
140
QS:AgNPs_11:1
QS:AgNPs_9:1
QS:AgNPs_6:1
QS:AgNPs_4:1
Tempo de degradação (h)
Diâmetro (nm)
(b)
Figura 25 - Análise da forma de degradação de duas maneiras diferentes pela absorção do pico em 400 nm da
banda plasmônica (a) e pelo fenômeno de aglomeração monitorado pela técnica de DLS (b).
Pela figura 25a, observamos que mesmo em diferentes proporções de QS:AgNPs, o
processo de degradação das partículas, em termos de intensidade da absorção, é semelhante:
um decaimento praticamente exponencial, extremamente rápido no início, e tendendo a um
patamar final, que provavelmente seria o equilíbrio entre NPs e os íons de prata,
. Também foram realizadas medidas referentes ao aumento de tamanho em função do
tempo, ocorrendo uma maior aglomeração/agregação no nanocompósito QS:AgNPs_4:1,
motivado pela maior exposição que estas partículas apresentavam no nanocompósito em
solução. Provavelmente nem todas estavam completamente protegidas estericamente pelo
polímero QS, figura 25b.
Os nanocompósitos foram então submetidos a diferentes ensaios biológicos contra a
bactéria E. Coli, incluindo o teste de MCI e o teste de densidade óptica (OD
595
). Os resultados
‐74‐
referentes ao MCI são mostrados na tabela 3. Observamos que ocorre um aumento da ação do
nanocompósito em comparação aos componentes, QS e AgNPs puras, uma vez que na mesma
relação de 11:1 (polímero/NP) a concentração necessária para o nanocompósito de
PVA:AgNPs é de 150 µg.mL
-1
, e de 75 µg.mL
-1
para o nanocompósito de QS:AgNPs, ao
passo que para a QS pura, esse valor é de 150 µg.mL
-1
.
Na proporção de 4:1, a concentração do nanocompósito pode ser diminuída
consideravelmente, e um valor de MCI de 20 µg.mL
-1
foi observado. Dentre todas as
condições estudadas, a condição de 4:1 foi estipulada como a ideal, para produção de
nanocompósitos bactericidas. Outro dado interessante refere-se ao valor de MCI do
nanocompósito QS:AgNPs11:1, que é a mesma para o nanocompósito QS:AgNPs9:1.
Tabela 4 - Dados da mínima concentração necessária para inibir completamente a proliferação da E. Coli.
Amostras
Concentração do Nanocompósito
150 g.mL
-1
100 g.mL
-1
75 g.mL
-1
50 g.mL
-1
30 g.mL
-1
20 g.mL
-1
10 g.mL
-1
QS:AgNPs_11:1
Inibição
Inibição Inibição Proliferação Proliferação Proliferação Proliferação
QS:AgNPs_9:1
Inibição Inibição Inibição
Proliferação
Proliferação
Proliferação Proliferação
QS:AgNPs_6:1
Inibição Inibição Inibição Inibição Proliferação Proliferação Proliferação
QS:AgNPs_4:1
Inibição Inibição Inibição Inibição Inibição Inibição
Proliferação
QS Pura
Inibição Proliferação Proliferação Proliferação Proliferação Proliferação Proliferação
PVA:AgNPs_11:1
Inibição Proliferação Proliferação Proliferação Proliferação Proliferação Proliferação
Com base nos dados da tabela acima, algumas concentrações foram escolhidas para
estudos da ação bactericida em função do tempo, cujos resultados são mostrados na figura 26.
Pela análise das curvas, observamos a eficácia dos nanocompósitos, em especial os que
apresentam relações de 4:1 e 6:1, em relação à atividade bactericida. Ressaltamos ainda a
atividade bactericida do nanocompósito com PVA.
Apesar de estar abaixo da concentração de MCI, 150 µg.mL
-1
, a QS com concentração
de 100 µg.mL
-1
inibe o crescimento da bactéria por um período de 5 h, aproximadamente, mas
não é suficiente para a completa eliminação dos microorganismos.
‐75‐
012345678
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
OD
595
Tempo (h)
Controle do Microorganismo
100 g/ml quitosana Pura
100 g/ml 4:1 (PVA:AgNps)
50 g/ml (quit:AgNps6:1)
20 g/ml (quit:AgNps4:1)
Figura 26 - Ensaio microbiológico da ação bactericida dos nanobiocompósitos sobre a E. Coli em função do
tempo. A ação tanto da QS pura como do nanocompósito contendo PVA foram também analisadas.
Em resumo, podemos deduzir que a melhor relação entre QS e prata a ser utilizada é a
de 4:1, já que são obtidas NPs menores, e sua estabilidade é bastante satisfatória até o valor de
pH de 7,4. Além disso, esta proporção apresentou os menores valores de MCI contra o
microorganismo E. coli. O uso de proporções menores de QS:AgNPs não se mostrou viável
devido a problemas de aglomeração catastrófica na concentração de AgNO
3
utilizada, 7,6
mg/ml.
4.3 Síntese de AgNPs utilizando um agente redutor mais brando
Depois de comprovada a ação do nanobiocompósito QS/AgNPs e a melhor relação
entre os mesmos, focalizamos esforços no desenvolvimento de uma rota de síntese amigável
ao meio ambiente, com uso de redutores brandos, ao invés do NaBH
4
, que é extremamente
reativo e nocivo ao ambiente. Baseado em trabalhos que utilizavam QS, tanto como
estabilizante, quanto agente redutor
6, 60
foi adotada uma rota de síntese similar. Contudo
nessas rotas referenciadas acima, que utilizam açucares como redutores, a síntese só ocorre
em duas condições: i) os sistemas necessitam de altas temperaturas, próximas da ebulição da
água, juntamente com
, ou ii) são utilizadas temperaturas mais baixas entre 40 -
60ºC, porém em tempos muito longos de síntese, por exemplo, 20 h
46
. Infelizmente, a QS
‐76‐
num meio com alta temperatura e na presença de íons metálicos sofre quebra de cadeia,
ocorrendo assim sua degradação
85
. Para contornar este problema, propusemos uma rota
empregando QS e citrato de sódio, ambos agindo como estabilizantes e agentes redutores,
amplificando a ação de ambos, a fim de diminuir o tempo de reação, minimizando a
degradação da QS.
Após a síntese, as AgNPs foram analisadas por espectroscopia UV-Vis, e os espectros
são mostrados na figura 27. Todas as amostras analisadas possuíam a mesma concentração de
AgNO
3
, e a absorção está intimamente ligada às NPs metálicas na solução.
A identificação das amostras utilizadas nesse estudo é descrita na seção experimental.
Na amostra AM1 observa-se uma menor absorção, devido ao baixo poder de redução da QS
sozinha, mas é notada a presença de NPs. Na amostra AM2, como esperado, observa-se uma
maior absorção, devido à adição do citrato de sódio, e a amostra AM3, por sua vez, apresenta
uma absorção menor que a AM2, e maior que a AM1, mesmo com um tempo de reação
menor, 90 segundos. Com o mesmo tempo de reação, mas com metade da quantidade de
citrato de sódio em relação à amostra AM3, a amostra AM4 apresentou uma menor
intensidade de absorção. Dessa forma, podemos inferir que a adição do citrato de sódio
favorece a diminuição do tempo de reação, e promove um maior número de íons de prata
reduzidos, para um mesmo tempo de reação, como era esperado. Outro fator a ser considerado
é que o espectro da amostra AM2 aparece bem mais alargado, e com duas bandas,
provenientes provavelmente de multipolos gerados por estruturas mais complexas, como
cilindricas, prismáticas, e/ou dendriticas. Nesta rota de síntese também são observados a
banda em 260 nm, revelando a presença de partículas muito pequenas, menores que 3 nm
42
.
300 400 500 600 700 800
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Absorbância (u. a.)
Comprimento de Onda (nm)
AM1 AM2
AM3 AM4
Quitosana Pura
Figura 27 - Medidas da absorção da banda plasmônica para os nanobiocompósitos com diferentes massas de
citrato de sódio e tempo de reação.
‐77‐
Os nanocompósitos QS/AgNPs referentes às amostras AM1 a AM4 foram analisados
por MET, e as imagens são mostradas nas figuras 28, 29, 30 e 31. Para a amostra AM1 foram
observadas apenas partículas circulares, com o tamanho entre 10 e 50 nm, com poucos
aglomerados e uma distribuição pouco homogênea, figura 28a e 28b.
Figura 28 - Medidas de MET da amostra AM1 nas escalas de 100 nm (a) e 50 nm (b). O inset em (b) diz respeito
à difração de elétrons confirmando a presença das Nps.
A amostra AM2 apresentou estruturas lamelares, ilustradas na figura 29a. Estas
estruturas possuem tamanhos de aproximadamente 500 a 600 nm, e explicam os dois picos e a
banda alargada no espectro UV-vis da figura 27. As dendritas são a forma predominante na
amostra AM2, porém ocorrem também formas esféricas de tamanhos menores como
apresentado na figura 29b, com tamanho de 20 a 40 nm.
Figura 29 - Medidas de MET da amostra AM2 nas escalas de 500 nm (a) e 50 nm (b). A difração de elétrons
presente no inset em (a) foi realizado sobre a área mais clara das dendritas confirmando a presença
das AgNps nesta região.
Na amostra AM3, as mesmas estruturas dendríticas descritas acima foram observadas,
mas não de maneira majoritária. Pelo contrário, eram exceções. Estas estruturas apresentavam
‐78‐
um tamanho menor, de aproximadamente 150 nm, como mostra a figura 30a. A grande
maioria das NPs era composta por esferas de diâmetro menor que 10 nm, e com uma boa
dispersão sobre toda a matriz polimérica, figura 30b. Isto leva a crer que a estrutura dendrítica
é devido à ação conjunta da QS e do citrato de sódio, sendo que o tempo de síntese atua no
crescimento das mesmas. Uma única estrutura de triângulo comumente observada em sínteses
contendo citrato também foi observada, inset da figura 30b, entretanto parece que a mesma
ainda não estava completamente formada, mas sim em processo de formação, devido aos
contornos de grão das AgNPs bem sobressalentes.
Figura 30 - Medidas de MET da amostra AM3, ambas as imagens possuem a escala de 50 nm, são observados
tanto aglomerados que possivelmente viriam a evoluir em dendritas (a) como AgNps bem dispersas
e com tamanho médio de 10 nm (b). O inset em (b) mostra um dos estágios da formação de um
nanotriângulo de 100 nm.
Na amostra AM4, foram observadas AgNPs relativamente menores, com diâmetros
variando de 2 a 5 nm, mas também ocorre a presença de partículas maiores como nas demais
amostras, com um diâmetro de 10 nm, figuras 31a e 31b. Uma única partícula com estrutura
dendrítica foi observada, inset da figura 31a, com um tamanho em torno de 350 nm.
Figura 31 - Medidas de MET da amostra AM4, ambas as imagens possuem a escala de 50 nm, são observadas
‐79‐
AgNps esféricas e majoritariamente pequenas com o tamanho de 2 a 5 nm (a) ocorrendo a presença
de partículas de 10 nm (b). Estruturas dendríticas são muito pouco usuais nesta amostra, sendo
mostrada a formação de uma delas no inset em (a).
Medidas do tamanho das AgNps realizadas por DLS, em função da intensidade de luz
espalhada, indicam a presença de grandes aglomerados em torno de 1 µm para as amostras
AM2 e AM3, e de 0,5 µm para as amostras AM1 e AM4, como mostra a figura 32. Como
aglomerados tão grandes não foram observados em nenhuma das imagens de MET, tais
medidas são atribuídas à junção de partículas menores em uma mesma molécula de QS
movimentando conjuntamente, e gerando assim um padrão de espalhamento de uma partícula
maior do que realmente é.
Na figura 32 ainda visualizamos partículas menores, apresentando diâmetros de 140
nm (AM2), 90 nm (AM3) e 60 nm (AM4). A amostra AM1 apresentou o pico da distribuição
de tamanho somente em 0,5 µm, contudo a distribuição de tamanho da amostra AM1 é bem
mais ampla comparada com as demais (AM2, AM3 e AM4). Acreditamos que essa
distribuição de tamanhos menores das AgNPs apresentadas pelas amostras AM2, AM3 e
AM4 esteja relacionada às estruturas dendríticas, observadas pelas imagens de MET.
0 1000 2000 3000
0 20406080100
0
5
10
15
20
25
30
Número de Partículas (%)
Diâmetro (nm)
AM1
AM2
AM3
AM4
Intensidade de luz
espalhada (u. a.)
Diâmetro (nm)
Figura 32 - Tamanho das Nps medido por DLS em função da intensidade espalhada e o inset diz respeito ao
tamanho em função do número de Nps.
Ao se analisar o tamanho das partículas em função não mais da luz espalhada, mas sim
do número de partículas presentes, inset da figura 32, vemos que todas apresentam
majoritariamente partículas de até 20 nm, exceto a amostra AM3 que apresenta partículas de
40 nm. Neste modo de análise todas as amostras apresentaram somente uma distribuição de
tamanho, diferentemente do observado utilizando a análise em função da intensidade de luz
‐80‐
espalhada. Considerando o modo de funcionamento do equipamento, que faz toda a análise
baseada no espalhamento da luz, e sendo o mesmo proporcional ao diâmetro da partícula
elevado à sexta potência, espalhamento Rayleigh, as NPs menores, de 10 nm da amostra AM3
e de 2 nm a 5 nm da amostra AM4, observadas pela técnica de MET foram possivelmente
mascaradas pelas maiores.
As amostras AM1 a AM4 também foram analisadas em função do seu potencial Zeta,
ilustrados na figura 33a. A adição de citrato de sódio não gerou mudanças significativas,
sendo a melhor faixa de pH entre 4 - 6 (
). O ponto isoelétrico foi praticamente o
mesmo para todos os nanocompósitos, já que acima do pH 8 todos tendem a um potencial
nulo. Nas medidas do diâmetro das Nps em função do pH ocorreu uma diferença entre os
nanocompósitos devido à adição de citrato, quanto maior a quantidade do memso, menores as
AgNPs, como ilustra a figura 33b. Entretanto, deve ser levado em conta que o tamanho
observado não é devido ao aumento das AgNps, mas sim da aglomeração/agregação da
própria QS. Antes da solução de qualquer uma das amostras ser tratada com um pH básico e
sofrer o fenômeno de aglomeração, cada uma apresentava um tamanho específico de AgNPs e
depois de ocorrer a aglomeração e o posterior tratamento com 1% de ácido acético ocasionado
a re-dissolução de todas as amostras (AM1 - AM4), o tamanho das AgNPs foi o tamanho
medido inicialmente, sendo que todos os nanocompósitos apresentaram uma ótima proteção
estérica para as AgNPs. Assim sugerimos que o citrato deixa a molécula de QS mais
compacta na aglomeração, por meio de interações eletrostáticas entre os grupos OH e NH
3
+
do citrato e QS respectivamente. O citrato atua blindando as cargas da QS, diminuindo a
repulsão eletrostática, e a molécula fica mais enovelada.
46810
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Potencial Zeta (mV)
pH
Ponto isoelétrico
(a)
AM1
AM2
AM3
AM4
‐81‐
345678910
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
(b)
AM1
AM2
AM3
AM4
pH
Diâmetro (nm)
Figura 33 - Variação do Potencial Zeta (a) e o diâmetro normalizado (b) de todos os nanobiocompósitos ambos
em função do pH.
Para a análise de DR-X foi utilizado o pó dos nanocompósitos, ambos apresentaram os
picos característicos da QS, em 10º e 20º
118
, ilustrados pelos asteriscos verdes na figura 34.
Entretanto, os picos referentes à prata, principalmente para os ângulos menores, não foram tão
sobressalentes, quanto antes. Possivelmente devido à característica da medida de DR-X em
amostras em pó de polímeros, material amorfo. Essas bandas características de medidas de
polímeros em pó podem ter mascarado os picos em 38,2º e 44,4º da prata. Outro fator foi
provavelmente a presença de MTP discutidas anteriormente. Mas em todas as amostras foram
observados os picos em 64,5º e 77,5º que dizem respeito à estrutura cristalina {220} e {311}
respectivamente, representados pelos asteriscos vermelhos na figura 34. As amostras AM2 e
AM3 mostram todos os picos referentes à prata metálica de estrutura cfc, picos em 38,2º,
44,4º, 64,5º e 77,5º referente aos seguintes planos respectivamente {111}, {200}, {220} e
{311}, asteriscos vermelhos da figura 34. Podemos concluir que as AgNPs apresentam
estrutura metálica cfc, mesmo com as amostras não apresentando todos os picos da prata
metálica tão sobressalentes.
‐82‐
10 20 30 40 50 60 70 80 10 20 30 40 50 60 70 80
10 20 30 40 50 60 70 80 10 20 30 40 50 60 70 80
*
AM4
AM3
AM2
AM1
*
*
*
*
*
Intensidade (unid. arb.)
2
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
2
*
Figura 34 - Difratogramas das amostras AM1, AM2, AM3 e AM4. Os asteriscos verdes correspondem aos picos
característicos da QS, 10
0
e 20
0
, de medidas feitas com o pó do polímero. Os asteriscos vermelhos
correspondem aos picos da prata metálica de estrutura cfc, picos em 38,2
0
, 44,4
0
, 64,5
0
e 77,5
0
referente aos seguintes planos respectivamente {111}, {200}, {220} e {311}.
Novamente foi utilizada a técnica de FTIR para o estudo da degradação do
nanocompósito, entretanto desta vez o foco de interesse era a degradação da própria QS
evidência pelas bandas em 1740 cm
-1
e 1710 cm
-1
referente ao grupo COOH, que é o grupo
formado pela quebra de cadeia da QS. As medidas foram realizadas logo após a síntese, e
após 15 dias, com as amostras armazenadas sobre luz e temperatura ambientes. Foi realizado
a deconvolução de Fourier em todas as amostras. Após a deconvolução, apenas na amostra
AM1 tais bandas foram claramente observadas.
A amostra AM1 não mostrou indícios de mudanças das bandas de 1740 cm
-1
e 1710
cm
-1
em função do tempo de degradação, que foi de 15 dias. A banda em 1110 cm
-1
sofre
deslocamento para comprimento de ondas menores somente na amostra AM1. Todas as outras
amostras mantiveram essa banda inalterada em função do tempo de degradação. O grupo NH
2
apresenta vibração na banda em 1110 cm
-1
, assim é de se esperar que a amostra AM1 vai
perdendo a interação QS/prata em comparação as demais amostras, figura 35.
‐83‐
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
Refletância (u. a.)
Número de Onda (cm
-1
)
AM1
Após a síntese
Após 15 dias
1100 cm
-1
Deconvolução
1740 cm
-1
1710 cm
-1
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
AM2
Após a síntese
Após 15 dias
1100 cm
-1
Sem deslocamento de
banda e degradação
Refletância (u. a.)
Número de Onda (cm
-1
)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
Sem deslocamento de
banda e degradação
AM3
Após a síntese
Após 15 dias
1100 cm
-1
Refletância (u. a.)
Número de Onda (cm
-1
)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
AM4
Após a síntese
Após 15 dias
Sem deslocamento de
banda e degradação
1100 cm
-1
Refletância (u. a.)
Número de Onda (cm
-1
)
Figura 35 - Medidas de FTIR das amostras AM1, AM2, AM3 e AM4 em função do tempo de degradação. O
espectro de FTIR mostra a degradação da QS na amostra AM1 pelo aparecimento das bandas em
1740 cm
-1
e 1710 cm
-1
referentes ao grupo COOH. A perda de interação QS/AgNPs é evidenciada
pelo deslocamento da banda em 1100 cm
-1
para comprimento menores, referente ao grupo NH
2
.
Juntamente com as análises de FTIR foram tiradas fotografias das soluções no
intervalo de 15 dias, contudo nenhuma mudança visual foi observada. As fotografias são
mostradas na figura 36.
‐84‐
Figura 36 - Fotos das amostras solubilizadas na concentração de 6,5 g.L
-1
, logo após a solubilização (a) e com
15 dias de degradação em luz e temperatura ambiente (b).
Após a caracterização estrutural, morfológica, e o estudo de degradação, realizamos
um estudo das propriedades térmicas dos nanocompósitos, por TGA. A figura 37 contém a
curva termogravimétrica (TG) da QS pura. Pela análise da derivada da curva
termograviométrica (DTG) vemos que a amostra apresenta uma perda de massa em três
estágios: i) primeiro estágio que vai da temperatura ambiente até 110ºC que está relacionado à
perda de água adsorvida, e aquela presente em sua estrutura
100, 101
com uma velocidade de
perda menor ( ) na temperatura de 54ºC; ii) segundo estágio de 210ºC até
380ºC, referente à primeira etapa de degradação da QS, apresentando a velocidade máxima de
perda ( ) na temperatura de 290ºC e; iii) terceiro estágio de 380ºC a 600ºC. Esta
etapa é referente à degradação da QS, sua velocidade máxima de perda de massa é de
na temperatura de 520ºC.
100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
Massa (%)
Temperatura (C
0
)
Derivada da Massa (%/C
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Figura 37 - Curvas de TG e DTG da QS pura, obtidas sobre uma atmosfera de ar sintético até a completa
degradação do material em 600ºC.
‐85‐
Com a introdução das AgNps no sistema, ocorrem mudanças significativas nas
características térmicas da QS, como ilustrado na figura 38. A amostra AM1, apresenta uma
etapa a mais na perda de massa. A etapa de perda de água é similar. A segunda etapa começa
em 190ºC, mas continua até 270ºC, com uma velocidade máxima de perda
na
temperatura de 250ºC. Uma nova etapa surge em 270ºC até 380ºC com uma velocidade
máxima de perda de
na temperatura de 290ºC. Esta nova etapa é
possivelmente oriunda da dissociação das AgNps com a QS. A última etapa de degradação
começa para temperaturas mais baixas, em relação à QS pura. O início da ultima etapa de
degradação ocorre em 380ºC e termina em 490ºC, com a completa degradação da QS, e com
um resíduo de prata de 8,56% em massa.
A inserção do citrato de sódio também gera modificações nas características térmicas
do sistema (figura 38). As amostras AM2, AM3 e AM4 (que contém citrato) mostram
praticamente os mesmos valores de temperatura e velocidades máximas de perda de massa. A
evaporação da água ocorre até 150ºC com uma velocidade de
na temperatura
de 58ºC. A eliminação das moléculas de água presentes na estrutura da QS ocorre na faixa de
150ºC a 240ºC, com uma velocidade máxima de perda de massa de
na
temperatura de 190ºC. A degradação do nanocompósito ocorre em duas etapas: i) a primeira
de 245ºC a 360ºC com velocidade máxima de perda de
na temperatura de
296ºC, e a outra de 360ºC a 440ºC com uma velocidade máxima de perda de
na temperatura de 397ºC, resultando na completa degradação dos materiais orgânicos.
Outro dado importante que podemos obter das análises de TG refere-se à quantidade
de resíduo, neste caso, devido às AgNps presentes em cada nanocompósito. A QS pura teve
um resíduo de 0,53% com relação à massa inicial. Em todos os nanocompósitos (AM1, AM2,
AM3 e AM4) a quantidade inicial de prata utilizada na síntese era de 20% da massa de QS,
contudo, nas amostras AM2, AM3 e AM4 foram adicionadas diferentes massas de citrato de
sódio, mudando assim a percentagem de massa de prata em relação à massa orgânica total do
nanocompósito. Na amostra AM1, dos 20% da massa inicial de prata, foram obtidos 9,11% de
resíduo, atribuído a prata metálica. Já na amostra AM2 a quantidade de prata inicial relativa às
quantidades de QS e citrato de sódio foi de 16,7%, e a de sódio de 3,9%. Tomando o caso
extremo de que todo o sódio fosse incorporado ao pó, 3,9% do resíduo seria de sódio, e o
restante seria de prata. Como o resíduo final da amostra AM2 foi de 14,56% teríamos que
10,66% do resíduo seriam de prata. Contudo, a fixação de sódio pelo sistema não é tão grande
assim, como pode ser confirmado pela comparação dos resíduos das amostras AM3 e AM4: a
primeira tem o dobro de citrato de sódio que a segunda, mas o resíduo final de ambas é
‐86‐
respectivamente de 15,57% e 14,01%, e, portanto, o sódio não apresenta uma incorporação
tão grande ao sistema.
0
20
40
60
80
100
100 200 300 400 500
0
20
40
60
80
100
100 200 300 400 500
AM4
AM3
AM2
AM1
Derivada da Massa (%/
0
C)
Massa (%)
Temperatura (
0
C)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Figura 38 - Medidas de termogravimetria das amostras AM1 (a), AM2 (b), AM3 (c) e AM4 (d). São mostradas
tanto as curvas de TG com as de suas derivadas DTG.
Podemos concluir que o uso do citrato de sódio neste tipo de síntese, é vantajoso, pois
impede a degradação da QS devido à diminuição do tempo de reação, e também pela
formação de um maior número de núcleos no processo de síntese.
4.4 Caracterização de filmes de PVA contendo o nanocompósito
AM4
Após encontrar a melhor proporção de QS/AgNPs a ser utilizada na preparação do
nanocompósito, assim como a melhor rota de síntese para a produção do mesmo, este
nanocompósito foi incorporado em uma matriz polimérica, visando-se futuras aplicações
como materiais de embalagens inteligentes. A matriz escolhida foi o PVA, e o nanocompósito
‐87‐
o AM4, devido as melhores características apresentadas, como melhor relação QS:AgNPs,
menor tempo de síntese, e a melhor distribuição de tamanho entre os nanocompósitos
sintetizados. Os filmes foram confeccionados com diferentes quantidades do nanocompósito
AM4, como descrito na seção experimental.
Os filmes foram analisados por espectroscopia UV-vis. Devido a não homogeneidade
de espessura por todo o filme, e a dificuldade de se determinar o exato local no qual foi
incidido o feixe de luz, o espectro de todos os filmes foram normalizados. Os espectros
normalizados estão presentes na figura 39, juntamente com o espectro da solução pura do
nanocompósito AM4. Pela análise do gráfico pode ser observado que todos os filmes
confeccionados apresentam AgNPs e que o alargamento em relação ao espectro da amostra
pura ocorreu, sugerindo que a incorporação das AgNPs na matriz polimérica gera uma maior
distribuição de tamanho das mesmas.
400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
PVA:AM4_100:0
PVA:AM4_97,5:2,5
PVA:AM4_95:5
PVA:AM4_92,5:7,5
PVA:AM4_90:10
Solução de AM4
Comprimento de Onda (nm)
Absorbância (u. a.)
Figura 39 - Espectros UV-vis dos filmes de PVA contendo o nanocompósito AM4, juntamente com os
espectros do filme de PVA puro e do nanocompósito AM4 em solução.
Depois de comprovado a presença das AgNPs nos filmes, foram efetuados ensaios de
TGA e DSC. Os ensaios de TGA foram realizados em atmosfera de Ar sintético. A figura 40
contém a curva TG do PVA puro e sua derivada. Pela análise da derivada da curva, DTG, em
amostra de Ar sintético vemos que a amostra apresenta uma perda de massa em cinco
estágios: i) primeiro estágio que vai da temperatura ambiente até 180ºC que está relacionado à
perda de água adsorvida, com uma velocidade máxima de perda (
) na
temperatura de 99ºC; ii) segundo estágio de 180ºC até 318ºC, primeira etapa de degradação
do PVA, apresentando a velocidade máxima de perda maior (
) na temperatura
de 275ºC; iii) terceiro estágio de 318ºC a 340ºC com velocidade máxima de perda de massa
‐88‐
de
na temperatura de 388ºC; iv) quarto estágio de 387ºC a 470ºC com
velocidade de perda de massa de
na temperatura de 436ºC; e v) último estágio
de 470ºC a 575ºC com velocidade máxima de perda de massa de
na
temperatura de 495ºC. Em atmosfera de N
2
o PVA apresenta apenas 3 estágios de perda de
massa, como mostrado inset da figura 40.
0 100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
Massa (%)
Tem
p
eratura
(
C
0
)
Derivada da Massa (%/C
0
)
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Figura 40 - Curvas de TG e DTG do PVA puro, obtidas sobre uma atmosfera de ar sintético até a completa
degradação do material em 600ºC. No inset mostra-se um ensaio de degradação do PVA em
atmosfera de N
2
.
A não homogeneidade das curvas de TGA obtidas nos filmes contendo os
nanocompósitos, figura 41, se deve possivelmente ao fato de que a análise foi feita sobre
amostras cortadas de diferentes locais dos filmes. Contudo, o intuito das medidas de TGA,
nesse caso, foi verificar se a inserção do nanocompósito AM4 afetaria (diminuiria) a
temperatura de degradação do polímero PVA inviabilizando o uso do nanocompósito AM4 na
matriz de PVA. Como foi observado, a inserção do nanocompósito AM4 não modificou de
maneira significativa as características térmicas do PVA, dando perspectivas do uso deste tipo
de combinação, PVA:AM4. As mudanças geradas pela introdução do nanocompósito AM4 no
filme de PVA são ilustradas na figura 41. Todos os filmes produzidos tiveram a omissão de
alguns estágios da perda de massa. A perda de água em todos os filmes parece ocorrer em
duas etapas. A primeira, provavelmente é relacionada à água presente na cadeia de PVA, e a
segunda, à água presente na cadeia de QS. A primeira etapa de degradação de todos os filmes
ocorre para a mesma faixa de temperatura, tendo início em 210ºC e término em 380ºC, com
velocidade máxima de perda ocorrendo em cerca de 280ºC. A completa degradação dos
‐89‐
filmes ocorre em 500ºC. Com o aumento do número de AgNPs temos um aumento da
velocidade máxima de perda de massa do segundo pico de degradação (figura 41). Neste caso,
acredita-se que as AgNPs funcionem como ilhas de calor, aumentando a condutividade
térmica do sistema e acelerando assim a sua degradação.
PVA:AM4 95:5
0
20
40
60
80
100
PVA:AM4 90:10
PVA:AM4 92,5:7,5
PVA:AM4 97,5:2,5
Derivada da Massa (%/
0
C)
Temperatura (
0
C)
100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
100 200 300 400 500 600
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Massa (%)
Figura 41 - Curvas de TG e DTG dos filmes de PVA com o nanocompósito AM4, obtidas sobre uma atmosfera
de ar sintético até a completa degradação do material.
Outras evidências de que as AgNPs atuam como ilhas de calor nos filmes são o
resíduo e temperatura final de degradação, presentes na tabela 5.
Tabela 5 - Dados de TGA dos filmes de PVA contendo o nanocompósito AM4.
Filme Resíduo (%) AgNPs (%)
Temperatura final (
ºC)
PVA:AM4_90:10
2,33 2 505
PVA:AM4_92,5:7,5
5,63 1,5 514
PVA:AM4_95:5
5,33 1 490
PVA:AM4_97,5:2,5
5,53 0,5 540
Pela a análise dos dados da tabela 5, vemos que quando é inserida uma maior
quantidade de prata no sistema, o resíduo é menor, já para as demais amostras
‐90‐
(PVA:AM4_92,7:2,5 a PVA:AM4_97,5:2,5) o resíduo se mantem praticamente o mesmo.
Assim, podemos inferir que para certa concentração limite de AgNPs o processo de
degradação da fase orgânica é aumentado. Adicionalmente, a temperatura final de degradação
do filme vai diminuindo com relação ao aumento da quantidade de AgNPs, exceto para a
amostra PVA:AM4_95:5. Tais dados corroboram com a hipótese de que as AgNPs atuam
como ilhas de calor na matriz polimérica, catalisando o processo de degradação, pelo aumento
da difusidade térmica do material.
Os ensaios de DSC dos filmes são mostrados nas figuras 42a e 42b. Observamos que a
incorporação de AgNPs afetou a temperatura de fusão dos filmes (figura 42a). A temperatura
de fusão dos filmes diminuiu com o aumento da quantidade de AgNPs. Novamente, é
provável que as AgNPs atuem como ilhas propagadoras de calor favorecendo a difusão
térmica no material, outro mecanismo a ser proposto é que as AgNPs afetam a formação dos
esferulitos. Quanto maiores e mais espessas as lamelas que compõem os esferulitos, mais
perfeitos os cristais, e maior a Tm. Dessa forma, é provável que as AgNPs afetam o processo
de cristalização do PVA, levando a formação de esferulitos com lamelas menos espessas e
cristais imperfeitos, diminuindo a temperatura de fusão. Este fato é evidenciado também pelas
curvas de resfriamento da figura 42b, onde se observam as variações do pico exotérmico
referente à cristalização.
190 200 210 220 230
Fluxo de Calor (J/g)
Temperatura (
0
C)
PVA:AM4_100:0
PVA:AM4_97,5:2,5
PVA:AM4_95:5
PVA:AM4_92,5:7,5
PVA:AM4_90:10
exo
endo
(a)
‐91‐
170 180 190 200 210
Fluxo de Calor (J/g)
Temperatura (
0
C)
PVA:AM4_100:0
PVA:AM4_97,5:2,5
PVA:AM4_95:5
PVA:AM4_92,5:7,5
PVA:AM4_90:10
exo
endo
(b)
Figura 42 - Análises de DSC do processo endotérmico de fusão (a) e do processo exotérmico de cristalização (b).
Após a análise térmica, foram analisadas as propriedades mecânicas dos filmes,
através de curvas de tensão-deformação. O ensaio foi realizado como descrito na parte
experimental. Foram realizadas 5 medidas de tração de cada filme, sendo as mais
significativas de cada amostra mostradas na figura 43. Os dados referentes aos ensaios
mecânico estão presentes na tabela 6.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tensão (MPa)
Deformação (%)
PVA:AM4_100:0
PVA:AM4_97,5:2,5
PVA:AM4_95:5
PVA:AM4_92,5:7,5
PVA:AM4_90:10
Figura 43 - Curvas dos ensaios mecânicos realizados nos filmes de PVA e AM4.
Tabela 6- Média dos valores obtidos no ensaio de tensão-deformação.
Filme
Tensão @máx Módulo de Young Deformação na força
PVA:AM4_90:10
35,67 250 180
PVA:AM4_92,5:7,5
25,96 175 170
PVA:AM4_95:5
31,21 230 220
‐92‐
PVA:AM4_97,5:2,5
31,69 170 220
PVA _100:0
25,18 220 180
Os ensaios mecânicos permitiram observar que a inserção do nanocompósito AM4 na
matriz polimérica de PVA aumentou a tensão de ruptura para os filmes PVA:AM4_90:10;
PVA:AM4_95:5 e PVA:AM4_97,5:2,5, assim como a deformação na tensão máxima para os
filmes PVA:AM4_97,5:2,5 e PVA:AM4_95:5.
Os filmes de PVA:AM4 foram submetidos a testes de atividade antimicrobiana,
através de ensaios microbiológicos, nesse caso, o teste de halo de inibição. Todos os testes
foram realizados em triplicata. A figura 44 mostra o ensaio realizado sobre o filme
PVA:AM4_100:0, o qual era constituído somente do polímero puro PVA.
Figura 44 - Fotos do filme PVA:AM4_100:0 evidenciando o crescimento do microorganismo E. coli.
Todos os filmes que continham o nanocompósito AM4 (PVA:AM4_97,5:2,5;
PVA:AM4_95:5; PVA:AM4_92,5:7,5 e PVA:AM4_90:10) apresentaram ação bactericida
contra o microorganismo estudado a bactéria E. coli, como mostra a figura 45. As porcetagens
das áreas dos halos de inibição de cada filme estão contidas na tabela 7.
‐93‐
Figura 45 - Fotos do filme PVA:AM4_97,5:2,5 (a), PVA:AM4_95:5 (b), PVA:AM4_92,5:7,5 (c) e
PVA:AM4_90:10 (d) evidenciando a ação bactericida de todos os filmes sobre o
microorganismo E. coli.
Tabela 7 - Porcentagem da área e diâmetro de inibição dos halos contra o microorganismo E. coli.
Filme Área de inibição (%) Diâmetro de inibição (%)
PVA:AM4_90:10
145 120
PVA:AM4_92,5:7,5
142 119
PVA:AM4_95:5
140 118
PVA:AM4_97,5:2,5
137 117
PVA:AM4_100:0
0 0
Pela tabela 7, verificamos que áreas de inibição maiores foram obtidas para filmes
contendo maiores quantidades de AM4, evidenciando a atividade bactericida desta
composição.
Dessa forma, verificamos que a incorporação de um nanocompósito na matriz
polimérica de PVA proporciona características bactericidas ao sistema, sugerindo assim a
possibilidade da produção de embalagens inteligentes com ação bactericida.
‐94‐
‐95‐
5. Conclusões
5.1 Conclusões
Na primeira etapa do trabalho foi observado que a estabilidade dos colóides de prata
pode ser obtida tanto estérica, como eletrostaticamente, sendo que a estabilização estérica
permite o uso dos colóides em uma concentração mais alta e maior estabilidade (com base nos
valores de potencial Zeta). Foi mostrado também que materiais como a QS, que contém
grupos amina, possuem uma maior interação com as AgNPs, do que aqueles que possuem
apenas grupos OH como o PVA. Assim a escolha de estabilizantes que possuam um maior
número de grupos funcionais, principalmente grupos que contenham nitrogênio, enxofre e
fósforo
11, 63, 64
, se faz uma melhor opção do que o uso de estabilizantes que contenham apenas
grupos hidroxilas, grupo que apresenta uma interação mais branda com as AgNPs
65
Ao utilizarmos somente a QS na síntese, mas modificando a relação QS:AgNPs em
massa, não foram observadas mudanças drásticas no sistema, em relação à posição da banda
plasmônica ou forma da estrutura cristalina. Entretanto, a relação QS:AgNPs se mostrou de
extrema importância no aumento da atividade bactericida do nanocompósito final contra a
bactéria E. coli em solução. Assim, buscou-se o limite no qual a relação QS:AgNPs tivesse
uma boa estabilidade e a melhor ação bactericida, sendo estabelecida em 4:1 de QS:AgNPs
em massa.
Foi também observado a possibiliade do uso de redutores mais brandos na obtenção de
AgNPs, como citrato de sódio e QS, em um rota de síntese alternativa àquela utilizada com
NaBH
4
. Nesse caso, verificou-se que os parâmetros de reação, como tempo e concetração de
citrato de sódio, influênciam a morfologia final das NPs. Observou-se também que na rota de
síntese utilizada sem o NaBH
4
o uso do citrato de sódio inibe a degradação da QS, em
comparação da síntese utilizando somente a QS como redutor.
Na última parte do trabalho, verificamos o efeito da incorporação do nanocompósito
AM4 (QS:AgNPs) na matriz de PVA. Através de análises térmicas, verificou-se que as
AgNPs atuavam como ilhas de calor, aumentando a difusidade térmica dos sistemas,
contribuindo para o aumento de perda de massa no segundo pico de degradação, além de
inflênciarem da má formação dos esferulitos. Verificou-se também a diminuição da
‐96‐
temperatura de fusão do PVA em função do aumento da quantidade de carga de AgNPs. Já as
características mecânicas dos filmes não foram modificadas de maneira significativas, com a
adição de AM4, em relação ao PVA puro. Os testes de halo de inibição dos filmes revelaram
um aumento da ação bactericida dos compósitos, com o aumento da quantidade de AM4,
como esperado. Dessa forma, as análises térmicas, mecânicas e bactericidas dos compósitos
revelam o grande potencial de aplicação destes materiais em embalagens inteligentes
bactericidas, uma vez que são preservadas muitas das características do polímero da matriz, o
que é de grande importância para o seu processamento.
‐97‐
6. Trabalhos futuros
Como continuação deste trabalho, propomos:
i) Sintese de nanoesferas do nanocompósito QS:AgNPs, permitindo assim uma liberação
controlada das AgNPs.
ii) Inserção dos nanobiocompósitos de QS:AgNPs em polímeros/materiais utilizados em
medicina para o desenvolvimento de curativos, pomadas de uso tópico ou instrumentos
incisivos como cateters, diminuindo os riscos de infecções hospitalares.
iii) Uso do nanocompósito AM4 no tratamento de efluentes contaminados com patogênicos,
por meio da mudança de pH. Em pH ácido (em torno de 4 a 5) o nanocompósito teria sua
máxima ação bactericida, depois o efluente seria tratado até retornar ao pH 7 a 7,5, resultando
na floculação do nanocompósito, sendo o mesmo filtrado e reaproveitado posteriormente.
‐98‐
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2008.
1. 111 SUÁREZ, A. L.; RIVAS, J.; RODRÍGUEZ-ABREU, C. F.; RODRÍGUEZ, M. J.;
PASTOR, E.; CREUS, A. H.; OSEROFF, S. B.; QUINTELA, M. A. Q. Facile synthesis of
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chitosan: the influence of analytical methods. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical
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nanoparticles. Journal American Chemical Society, v. 130, n. 22, p. 6896-6897, 2008.
116 SAKKA, S. Sol-gel science and technology - topics in fundamental research and
applications. Norwell, Massachuusetts: Kluwer Academic Publishers, 1991. Disponível em:<
http://books.google.com/books?id=5DHlax4eo8C&pg=PA154&dq=TiO2+band+gap&lr=&hl
=pt-BR&cd=17#v=onepage&q=TiO2%20band%20gap&f=false >. Acesso em:15 jan. 2010.
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117 NOGUEZ, C. Surface plasmons on metal nanoparticles: the influence of shape and
physical environment. Journal of Physical Chemistry C, v. 111, n. 10, p. 3806-3819, 2007.
118 BHUMKAR, D. R.; POKHARKAR, V. B. Studies on effect of ph on cross-linking of
chitosan with sodium tripolyphosphate: a technical note. AAPS PharmSciTech, v. 7, n. 2, p. 1-
6, 2006.
119 SANTOS, J. E.; SOARES, J. P.; DOCKAL, E. R.; CAMPANA FILHO, S. P.;
CAVALHEIRO, E. T. G. Caracterização de quitosanas comerciais de diferentes origens.
Polímeros: Ciência e Tecnologia, v. 13, n. 4, p. 242-249, 2003.
‐111‐
Apêndice
Trabalhos resultantes desta Dissertação
Resumos publicados em anais de congressos
BERNI, E.; RIBEIRO, C.; ZUCOLOTTO, V. Investigation on the bactericidal effects of
silver-chitosan nanobiocomposites. In: ICAM - INTERNATIONAL CONFERENCE ON
MATERIALS, 11th, 2009, Rio de Janeiro - RJ. Resumo... Rio de Janeiro - RJ: [s/l], 2009. p.
75.
BERNI, E.; RIBEIRO, C.; ZUCOLOTTO, V. Interaction and bactericidal effect study of
silver chitosan nanocomposite. In: INTERNACIONAL SOL GEL CONFERENCE, 2009,
Porto de Galinhas - PE. Resumo... Porto de Galinhas – PE: [s/l], 2009, p. 37.
BERNI, E.; ZUCOLOTTO, V. Study of silver chitosan nanocomposite interaction. In:
INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON ADVENCED MATERIALS AND
NANOSTRUCTURES, 2009, Santo André - SP. Resumo... Santo André – SP:[s/l], 2009, p.
28.
TSUTAE, F.; BERNI, E.; GUIMARAES, F. Improving optical processes responsible for
subcutaneous pigment removal by using noble metal nanoparticles. In: INTERNATIONAL
SYMPOSIUM ON ADVENCED MATERIALS AND NANOSTRUCTURES, 2009, Santo
André - SP. Resumo... Santo André - SP:[s/l], 2009, p. 33.
BERNI, E.; ZUCOLOTTO, V. Development of silver chitosan/nanocomposites for
bactericidal applications. In: WORKSHOP DO INSTITUTO NACIONAL DE
ELETRÔNICA ORGÂNICA, 2009, Atibaia - SP. Resumo... Atibaia - SP: [s/l], 2009, p. 14.
‐112‐
Artigos
BERNI, E.; RIBEIRO, C.; ZUCOLOTTO, V. Síntese de nanopartículas de prata para
aplicação na sanitização de embalagens. Comunicado Técnico. Embrapa Instrumentação
Agropecuária, v. 99, p. 1-4, 2008.
BERNI, E.; MATTOSO, L. H. C.; RIBEIRO, C. ZUCOLOTTO, V. Interaction and
bactericidal effect of silver-chitosan nanobiocomposite. (em preparação).
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