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UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA
CAMILA HERNANDES
AVALIAÇÃO IN VITRO DE POTENCIAIS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE
JASMONATOS E DE EXTRATO E FRAÇÕES PRODUZIDOS POR
Botryosphaeria rhodina
Ribeirão Preto
2010
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2
Camila Hernandes
AVALIAÇÃO IN VITRO DE POTENCIAIS ATIVIDADES
BIOLÓGICAS DE JASMONATOS E DE EXTRATO E FRAÇÕES
PRODUZIDOS POR Botryosphaeria rhodina
Dissertação apresentada ao programa de Mestrado em
Biotecnologia-Universidade de Ribeirão Preto, como
requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia, área de concentração: Biotecnologia
Aplicada à Saúde
Orientadora: Profª. Drª. Miriam Verginia Lourenço
Ribeirão Preto
2010
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3
FICHA CATALOGRÁFICA
HERNANDES, C.
Avaliação in vitro de potenciais atividades biológicas de
Jasmonatos e de extrato e frações produzidos por Botryosphaeria
rhodina /Camila Hernandes- Ribeirão Preto: Universidade de Ribeirão
Preto, 2010.
85f.
Orientadora: Profa. Dra. Miriam Vergínia Lourenço
Co- orientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Fachin Saltoratto
Dissertação (Mestrado)- Programa de Pós Graduação em
Biotecnologia, área de concentração: Biotecnologia aplicada à saúde.
Ribeirão Preto, 2010.
1. Jasmonatos 2. Botryosphaeria rhodina 3. Antimicrobiano
4. Citotóxico
4
5
Dedico este trabalho aos meus pais
João Carlos Hernandes e Maria de Lourdes Q. Hernandes
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus, por me confortar nas horas mais difíceis, e por ser
minha fonte de sabedoria, e à Nossa Senhora por passar sempre á minha frente me
protegendo de todos os perigos;
Á Minha mãe, Maria de Lourdes, por ser a melhor mãe do mundo, por conseguir estar
sempre ao meu lado, mesmo as vezes estando fisicamente tão distante, rezando,
orando por mim, e me dando carinho e amor sempre;
Ao meu pai, João Carlos, por também ser o melhor pai do mundo, por se preocupar
comigo, cuidando sempre para que eu possa ser cada vez mais feliz;
Aos meus irmãos, Carlos e José Ricardo, pelo carinho e compreensão, e por
simplesmente fazerem parte da minha vida;
Ao meu amor, Dany Henrique Iwasaki, por existir na minha vida, me proporcionando
sempre amor, cuidado, dedicação, carinho, compreensão, e por ser meu ombro amigo
sempre, em todos os momentos;
À minha Professora e orientadora Dra. Miriam V. Lourenço, pela paciência, apoio,
dedicação, amizade, por permitir meu crescimento profissional, e principalmente por me
dar a oportunidade de realização deste trabalho;
À minha Professora e co- orientadora Dra. Ana Lúcia F. Saltoratto, pelos incentivos,
dedicação e amizade;
À Prof. Dra. Suzelei de Castro França, por sua dedicação e carinho à Unidade de
Biotecnologia;
7
Às minhas amigas de república Mayara Valdevite e Thais Alves, por serem a minha
família, e por estarem sempre por perto;
Aos meus amigos do Laboratório de Cultura de Células e Tecidos, Simone, Vanessa e
Walace pelo companheirismo;
Aos meus amigos do Laboratório de Fitoquímica, Joice Leoncini, Fernanda Suzano,
Bruno Borg, Maicon (Dálite), André Albano, Sarazete Pereira, e ao Prof. Dr. Paulo S.
Pereira, pelo carinho;
Às minhas amigas em especial Edieidia Pina e Giovana Cardozo por estarem sempre
comigo;
Ao Professor Dr. Mozart Marins, pela disposição, amizade, e apoio;
À Professora Dra. Silvia Contini pela realização das análises em CG/EM, além de seu
carinho e amizade;
Ao Professor Dr. Rene Beleboni, pela disposição, amizade e apoio,
Às alunas de Iniciação Científica Bianca Faccio e Danielli Cincotto, por serem meu
braço direito durante este trabalho, obrigada por tudo!
Aos funcionários da Unidade de Biotecnologia, Nice, Buscapé e China pelo apoio na
execução deste trabalho;
À CAPES, FAPESP e UNAERP pelo apoio financeiro e tecnológico para o
desenvolvimento deste trabalho;
E á todas as pessoas, que direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste
trabalho.
8
RESUMO
Jasmonatos são reguladores de crescimento vegetal, derivados do ácido linolênico,
presentes em um amplo número de espécies vegetais. Além de serem obtidos por
extração vegetal, os jasmonatos também são produzidos pelo microrganismo
Botryosphaeria rhodina, o qual se mostra uma alternativa na produção desses
compostos com rendimentos superiores ao das plantas, produzindo ainda outros
metabólitos secundários. A essa classe de substâncias vêm sendo atribuídas diversas
atividades biológicas, como atividade biofertilizante, antiparasitária e antitumoral. Estes
fatos fazem desta classe de compostos um alvo a ser perseguido tanto com vistas ao
aumento de produção dessas moléculas, como para a busca por novas atividades
biológicas. Neste trabalho objetivou-se a bioprodução de extrato, contendo jasmonatos,
a partir da linhagem Kifn 3.1 de B. rhodina, o fracionamento do mesmo, e posterior
avaliação in vitro das atividades antibacteriana, antifúngica e citotóxica do extrato e
frações visando ainda a identificação dos constituintes das frações mais ativas.
Substâncias padrão de AJ e MJ, obtidas comercialmente, foram utilizadas nos
experimentos de atividades biológicas como referência. Para os ensaios
antibacterianos foram usadas cepas de bactérias Gram positivas e Gram negativas e
isolados clínicos resistentes, utilizando-se o método de microdiluição, seguindo as
normas do CLSI, 2003, M27-A2. Para os ensaios de atividade antifúngica foram
utilizados linhagens de Trichophyton rubrum, utilizando-se o método de microdiluição
em meio RPMI, seguindo as normas M38-A do CLSI, 2002. Os experimentos de
citotoxicidade foram realizados sobre as linhagens cancerígenas de carcinoma de colo
de útero HeLa, adenocarcinoma de mama MCF-7, astrocitoma U343 MG-a, linhagem
de Melanoma murino B16-F10, macrófagos caninos DH82 e linhagem de Fibroblasto
3T3 utilizando-se ensaio de viabilidade celular. Com a fermentação de B. rhodina,
obteve-se 7g de extrato acetato de etila, o qual ao ser fracionado, gerou 8 frações.
Frente às linhagens bacterianas testadas, nenhuma das substâncias analisadas
apresentou atividade. Para as linhagens de T. rubrum, somente MJ apresentou, embora
baixa (750 µg.mL
-1
), atividade frente à linhagem H6. As frações exibiram uma aparente
especificidade citotóxica, de forma que Fr5 mostrou-se a mais promissora, seguida de
Fr2 e Fr6, em concentrações que variaram de 600 a 700 µg.mL
-1
. Para a linhagem
DH82 a substância que apresentou maior citotoxicidade foi MJ. Determinações
analíticas das frações evidenciaram ainda, a presença de jasmonatos e ácidos graxos
dentre os compostos identificados. A seletividade citotóxica evidenciada pelas frações
estudadas confirma a potencialidade do fermentado de Botryosphaeria rhodina como
possível fonte de agentes anticâncer.
Palavras chave: Jasmonatos. Botryosphaeria rhodina. Antimicrobiano. Citotóxico.
9
ABSTRACT
Jasmonates are plant growth regulators, derived from linolenic acid, present in a broad
number of plant species. In addition to being obtained by extraction plant, jasmonates
are also produced by the microorganism Botryosphaeria rhodina, which has shown an
alternative in the production of these compounds with incomes above the plant,
producing still other secondary metabolites. In this class of substances have been
assigned various biological activities, such as biofertilizer, antiparasitic and antitumoral
activity. These facts make this class of compounds a target to be pursued both in order
to increase production of these molecules, as for the search for new biological activities.
This work aimed to bioproduction extract containing jasmonate, from the strain of B.
rhodina, Kifn 3.1, the fractions thereof, and further evaluation in vitro of antibacterial,
antifungal and cytotoxic activities of extracts and fractions, with further identification of
the constituents of the most active fractions. Substances pattern of AJ and MJ, obtained
commercially, were used in the experiments of biological reference. For the antibacterial
tests were used strains of Gram positive and Gram negative and resistant clinical
isolates, using the microdilution method, following the standards of CLSI, 2003, M27-A2.
For antifungal activity assays were used strains of Trichophyton rubrum, using the
microdilution method in RPMI medium, following the standards of CLSI M38-A, 2002.
The cytotoxicity experiments were performed on the lines of cancerous cervical
carcinoma HeLa, breast adenocarcinoma MCF-7, astrocytoma U343 MG-a, line of
murine melanoma B16-F10, DH82 canine macrophage strain, and Fibroblast 3T3 using
cell viability assay. With the fermentation of B. rhodina, were obtained 7 g of ethyl
acetate extract, which to be fractionated, generated 8 fractions. Faced with the bacterial
strains tested, none of the studied compounds showed activity. To the strains of T.
rubrum, MJ just presented, although low (750 µg.mL
-1
) activity against the strain H6.
Fractions exhibited an apparent cytotoxic specificity, so that Fr5 proved to be the most
promising, followed by Fr2 and Fr6, in concentrations ranging from 600 to 700 µg.mL
-1
.
For strain DH82 the substance that showed higher cytotoxicity was MJ. Analytical
determinations of the fractions still showed the presence of jasmonate and fatty acids
among the compounds identified. The cytotoxic selectivity shown by the fractions
studied confirms the potential of fermented of Botryosphaeria rhodina as a possible
source of anticancer agents.
Key words: Jasmonates. Botryosphaeria rhodina. Antimicrobial. Cytotoxic.
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1
Estrutura molecular de AJ e MJ.................................................
19
Figura 2
Metabólitos isolados a partir da fermentação de
Botryosphaeria rhodina..............................................................
24
Figura 3
Metabólitos isolados de Botryosphaeria rhodina.......................
25
Figura 4
Coluna Cromatográfica- Fracionamento do extrato...................
35
Figura 5
Cromatoplaca das amostras fermentadas, constatando-se a
presença de AJ..........................................................................
48
Figura 6
Cromatoplaca das frações obtidas pelo fracionamento do
extrato bruto por CC..................................................................
50
Figura 7
% inibição do extrato e frações (700 µg.mL
-1
) frente à HeLa....
54
Figura 8
% Inibição substâncias controle MJ 672 µg.mL
-1
, AJ 630,9
µg.mL
-1
, Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
, Sulfato de Vincristina 4
µg.mL
-1
frente à HeLa...............................................................
55
Figura 9
% Inibição Fr2 e Fr5 frente à HeLa............................................
55
Figura 10
% inibição do extrato e frações (700 µg.mL
-1
) frente à MCF-7..
56
Figura 11
% Inibição substâncias controle MJ 672 µg.mL
-1
, AJ 630,9
µg.mL
-1
, Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
, Sulfato de Vincristina 4
µg.mL
-1
frente à MCF-7.............................................................
57
Figura 12
% Inibição Fr5 e Fr6 frente à MCF-7.........................................
57
Figura 13
% inibição do extrato e frações (700 µg.mL
-1
) frente à U343
MG-a..........................................................................................
58
Figura 14
% Inibição substâncias controle MJ 672 µg.mL
-1
, AJ 630,9
µg.mL
-1
, Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
, Sulfato de Vincristina 4
µg.mL
-1
frente à U343 MG-a.....................................................
58
Figura 15
% inibição do extrato e frações (700 µg.mL
-1
) frente à B16-
F10.............................................................................................
59
Figura 16
% Inibição substâncias controle MJ 672 µg.mL
-1
, AJ 630,9
µg.mL
-1
, Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
, Sulfato de Vincristina 4
11
µg.mL
-1
frente à B16-F10..........................................................
59
Figura 17
% Inibição Fr2 (p<0,0001), Fr3 (p<0,0001), Fr4 (p 0,0002),
Fr5 (p<0,0001) e Fr6 (p<0,0001)...............................................
60
Figura 18
Avaliação da citotoxicidade do extrato e frações em 3T3.........
61
Figura 19
% Inibição substâncias controle MJ 672 µg.mL
-1
, AJ 630,9
µg.mL
-1
, Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
, Sulfato de Vincristina 4
µg.mL
-1
frente à 3T3..................................................................
61
Figura 20
% Inibição substâncias MJ e AJ, frente à DH82........................
63
Figura 21
% Inibição substâncias MJ 3mM (672 µg.mL
-1
)
, AJ 3mM
(630,9 µg.mL
-1
), Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
, frente à DH82........
64
Figura 22
Perfil Cromatográfico da Fr2......................................................
65
Figura 23
Pefil Cromatográfico da Fr5.......................................................
66
Figura 24
Perfil Cromatográfico Fr6...........................................................
67
Figura 25
Perfil da Fr2.1 em CG/EM.........................................................
67
Figura 26
Espectro de massas referente ao pico em t=14,97min- Metil
palmitato....................................................................................
68
Figura 27
Espectro de massas referente ao pico em t=19,79min -Metil
oleato.........................................................................................
69
Figura 28
Perfil da Fr5.3 em CG/EM.........................................................
70
Figura 29
Espectro de massas referente ao pico em t=23,77 minutos......
71
Figura 30
Perfil da Fr6.1 em CG/EM.........................................................
72
Figura 31
Espectro de massas referente ao pico em t=14,17min -1H-
Indol-3-carboxaldeido................................................................
73
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Sensibilidade e resistência dos isolados de campo frente à
antibióticos comerciais.................................................................
36
Tabela 2
Rampa de temperatura- Análise CG/EM......................................
47
Tabela 3
Quantificação de jasmonatos presentes no extrato.....................
49
Tabela 4
Rendimento das frações...............................................................
50
Tabela 5
Inibição das substâncias testadas frente às linhagens
bacterianas...................................................................................
52
Tabela 6
Avaliação da atividade antifúngica de AJ, MJ, extrato e frações
53
Tabela 7
Relação atividade citotóxica e linhagens celulares......................
65
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AJ- Ácido Jasmônico
AS- Ácido Salicílico
ATCC- American Type Culture Collection
CC- Cromatografia em Coluna
CCDC- Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
CLAE- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
cm- Centímetro
cm
2
- Centímetro Quadrado
g- Grama
g.L
-1
- Grama por Litro
HCl- Ácido Clorhídrico
Kg- Kilograma
KH
2
PO
4
- Fosfato de Potásio Monobásico Anidro
M- Molar
mg.L
-1
- Miligramas por Litro
mg.mL
-1
- Miligramas por Mililitro
MJ- Metil Jasmonato
mL- Mililitros
mL.min
-1
- Mililitros por Minuto
mM- Milimolar
mm- Milímetro
nm- Nanômetro
NaOH- Hidróxido de Sódio
pH- Potencial Hidrogeniônico
Rf- Fator de retenção
rpm- Rotação por Minuto
v:v- Volume por Volume
U- Unidade
14
UFC- Unidade Formadora de Colônia
µg.mL
-1
- Micrograma por Mililitro
µL- Microlitro
µm- Micrômetro
15
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO................................................................................
19
1.1
OS JASMONATOS.........................................................................
19
1.2
PRODUÇÃO DE JASMONATOS E OUTROS METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS POR Botryosphaeria rhodina...............................
22
1.3
ATIVIDADE ANTIBACTERIANA.....................................................
25
1.4
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA............................................................
27
1.5
ATIVIDADE ANTICÂNCER.............................................................
29
2
OBJETIVOS GERAIS.....................................................................
32
2.1
OBJETIVOS ESPECÍFICOS...........................................................
32
3
MATERIAL E MÉTODOS...............................................................
33
3.1
PRODUÇÕES DE JASMONATOS, SEUS DERIVADOS E
OUTROS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS POR LINHAGEM DE
Botryosphaeria rhodina...................................................................
33
3.1.1
Manutenção da linhagem de Botryosphaeria rhodina e preparo
do inóculo........................................................................................
33
3.1.2
Fermentação submersa..................................................................
33
3.1.3
Extração de jasmonatos e metabólitos secundários dos
fermentados....................................................................................
34
3.2
PROCEDIMENTOS CROMATOGRÁFICOS..................................
34
3.2.1
Detecção e quantificação de jasmonatos presentes no extrato......
34
3.2.2
Fracionamento do extrato...............................................................
35
3.3
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE AJ, MJ E
DE EXTRATO E FRAÇÕES OBTIDOS DA FERMENTAÇÃO DE
B. rhodina........................................................................................
36
3.3.1
Linhagens bacterianas....................................................................
36
3.3.2
Isolados de campo..........................................................................
36
3.3.3
Estoque das linhagens bacterianas................................................
37
3.3.4
Preparo de AJ, MJ, extrato e frações..............................................
37
16
3.3.5
Preparo de Ampicilina.....................................................................
37
3.3.6
Preparo do inóculo..........................................................................
37
3.3.7
Testes de sensibilidade...................................................................
38
3.4
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE AJ, MJ E DE
EXTRATO E FRAÇÕES OBTIDOS DA FERMENTAÇÃO DE B.
rhodina............................................................................................
38
3.4.1
Linhagens fúngicas.........................................................................
38
3.4.2
Estoque das linhagens....................................................................
39
3.4.3
Preparo de meio RPMI....................................................................
39
3.4.4
Preparo de AJ, MJ, extrato e frações..............................................
39
3.4.5
Preparo de Anfotericina B...............................................................
39
3.4.6
Preparo de Terbinafina...................................................................
39
3.4.7
Preparo do inóculo..........................................................................
40
3.4.8
Testes de sensibilidade...................................................................
40
3.5
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE EXTRATO E
FRAÇÕES OBTIDOS DA FERMENTAÇÃO DE B. rhodina............
41
3.5.1
Linhagens celulares........................................................................
41
3.5.2
Preparo de solução de Hanks.........................................................
41
3.5.3
Preparo de solução de Tripsina......................................................
41
3.5.4
Preparo de extrato e frações...........................................................
41
3.5.5
Preparo de AJ e MJ........................................................................
42
3.5.6
Preparo de Doxorrubicina...............................................................
42
3.5.7
Preparo de Sulfato de Vincristina....................................................
42
3.5.8
Estoque e Cultura das linhagens HeLa, MCF-7, U343 MG-a, 3T3
e B16-F10.......................................................................................
42
3.5.9
Atividade citotóxica.........................................................................
43
3.5.10
Análise dos resultados....................................................................
44
3.6
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE AJ E MJ
FRENTE À LINHAGEM DE MACRÓFAGOS CANINOS DH82......
44
3.6.1
Linhagem celular.............................................................................
44
3.6.2
Preparo de AJ e MJ........................................................................
45
17
3.6.3
Preparo de Doxorrubicina...............................................................
45
3.6.4
Estoque e cultura da linhagem DH82.............................................
45
3.6.5
Atividade citotóxica.........................................................................
46
3.6.6
Análise dos resultados....................................................................
46
3.7
REFRACIONAMENTO DAS FRAÇÕES MAIS ATIVAS.................
46
3.7.1
Refracionamento de Fr2, Fr5 e Fr6.................................................
46
3.8
IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES DAS FRAÇÕES MAIS
ATIVAS...........................................................................................
47
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................
48
4.1
PRODUÇÕES DE JASMONATOS, SEUS DERIVADOS E
OUTROS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS POR LINHAGENS
DE Botryosphaeria rhodina.............................................................
48
4.2
PROCEDIMENTOS CROMATOGRÁFICOS..................................
48
4.2.1
Detecção e quantificação de jasmonatos presentes no extrato......
48
4.2.2
Fracionamento do extrato...............................................................
49
4.3
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE AJ, MJ E
DE EXTRATO E FRAÇÕES OBTIDOS DA FERMENTAÇÃO DE
B. rhodina........................................................................................
51
4.4
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE AJ, MJ E DE
EXTRATO E FRAÇÕES OBTIDOS DA FERMENTAÇÃO DE B.
rhodina............................................................................................
52
4.5
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE EXTRATO E
FRAÇÕES OBTIDOS DA FERMENTAÇÃO DE B. rhodina............
54
4.5.1
Carcinoma de colo de útero HeLa..................................................
54
4.5.2
Adenocarcinoma de mama MCF-7.................................................
56
4.5.3
Astrocitoma U343 MG-a..................................................................
58
4.5.4
Melanoma murino B16-F10.............................................................
59
4.5.5
Fibroblasto de camundongo 3T3 (normal)......................................
60
4.6
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE AJ E MJ
FRENTE À LINHAGEM DE MACRÓFAGOS CANINOS DH82
(ATCC: CRL-10389), ORIGINADA DE UM CASO DE
18
HISTIOCITOSE MALIGNO CANINO..............................................
63
4.7
REFRACIONAMENTO DAS FRAÇÕES MAIS ATIVAS.................
65
4.7.1
Refracionamento de Fr2.................................................................
65
4.7.2
Refracionamento de Fr5.................................................................
66
4.7.3
Refracionamento Fr6......................................................................
66
4.8
IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES DAS FRAÇÕES MAIS
ATIVAS...........................................................................................
67
4.8.1
Identificação dos constituintes de Fr2.............................................
67
4.8.2
Identificação dos constituintes de Fr5.............................................
69
4.8.3
Identificação dos constituintes de Fr6.............................................
71
4.8.3.1
Fr6.1................................................................................................
71
4.8.3.2
Fr6.2................................................................................................
73
5
CONCLUSÕES...............................................................................
75
6
CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................
76
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................
77
19
1 INTRODUÇÃO
1.1 OS JASMONATOS
As plantas respondem a diversos tipos de estresses ambientais tais como ataque
de patógenos, de herbívoros, ou ataques mecânicos, pela síntese de metabólitos
secundários, os quais mediam a comunicação para a resposta de defesa. Dentre esses
metabólitos estão os jasmonatos (DONG, 1998; GLAZEBROOK, 1999, apud ZADRA;
BORGOGNI; MARUCCHINI, 2006), derivados do ácido linolênico, pela via dos
octadecanóides (ou via Vick-Zimmermann) (SEMDNER; PARTHIER, 1993), cujos
representantes são o Ácido Jasmônico (AJ), seu éster Metil Jasmonato (MJ) (Figura 1),
seus isômeros e alguns dos seus precursores e metabólitos.
Figura 1. Estrutura molecular de AJ e MJ
Fonte: FLESCHER, 2007
Os jasmonatos são reguladores de crescimento vegetal endógenos, da classe
das abscisinas (MEYER, et al., 1984, SALISBURY; ROSS, 1992), envolvidos no
controle do metabolismo, desenvolvimento e processo de defesa dos vegetais
20
(WEBER; VICK; FARMER, 1997). Além de ser produzido pelas plantas (via
predominante destes compostos, onde, no entanto são necessários, por exemplo, 800
Kg de flores de Jasminum grandiflorum para produzir 1 Kg de jasmona contendo
apenas 0,25% de AJ), os jasmonatos também podem ser produzidos sinteticamente,
além de poderem ser encontrados em algas e fungos (DHANDHUKIA; TAKKAR, 2008).
Os fungos têm uma maior capacidade de produção destas moléculas, sendo que
alguns, tais como o Botryodiplodia theobromae (sin Botryosphaeria rhodina), da ordem
Dothideales, causador da podridão negra dos frutos (GOOS; COX; STOTZKY, 1961),
são capazes de acumular quantidades superiores a 500 mg. L
-1
de (-)-7-iso AJ durante
a fermentação (MIERSCH et al., 1989).
O éster metílico do AJ (MJ) foi isolado pela primeira vez, nos anos sessenta,
como um dos constituintes aromatizantes principais dos óleos essenciais das flores de
Jasminum grandiflorum (DEMOLE; MERER; MERCIER,1962), o que contribuiu para
seu reconhecimento entre os compostos com importante aplicação na indústria de
perfumaria e aromatizantes (KODA, 1992; HAMBERG; GARDNER,1992).
Após o isolamento do MJ de Artemisia absinthium, reconhecida como uma
sustância promotora da senescência (UEDA; KATO, 1980) e do ácido livre identificado
como inibidor do crescimento no pericarpo de Vicia faba (DATHE et al.,1981), esses
compostos começaram a atrair a atenção de muitos fisiologistas ao serem detectados
em diferentes partes das plantas, além de começarem a ter outras atividades biológicas
documentadas a partir da década de oitenta, quando foram demonstrados outros
efeitos como atividade biofertilizante induzindo aumento nas produções agrícolas de
morango (Fragaria spp), soja (Glycine max) e cana de açúcar (Saccharum ssp) ;
estimulação da formação de tubérculos em Dioscorea spp (KODA ; KIKUTA, 1991),
Helianthus tuberosus (KODA; TAKAHASHI; KIKUTA, 1994) e batata (Solanum
tuberosum) (KODA, 1992), maturação de frutos em tomates (Lycopersicon esculentum)
e maçãs (Malus domestica) (SEMBDNER ; PARTHIER, 1993), e um papel especial na
sinalização de mecanismos de defesa das plantas (KITAHARA et al., 1991).
A aplicação do AJ em plantas de tomate (Lycopersicon esculentum) e tubérculos
de batata (Solanum tuberosum) provocou o acúmulo de inibidores de proteases
(YAMAGASHI et al., 1993) e em plantas de arroz inibiu a germinação de esporos de
21
Pericularia orizae, fungo que provoca a enfermidade conhecida como “tizão do arroz”
(HAMBERG ; GARDER, 1992).
Já o MJ adicionado em diferentes concentrações a raízes de Catharanthus
roseus, induziu mudanças no acúmulo de alcalóides tais como serpentina, catarantina,
ajmalicina e ajmalina, induziu diferentes metabólitos nas raízes (RUIZ-MAY; GALAZ-
ÁVALOS; LOYOLA-VARGAS, 2008), além de aumentar a produção de terpenóides
nessa espécie e em Cinchona (AERTS et al., 1994). Outras culturas tiveram sua
produção de metabólitos aumentados após estimulação com MJ como Maackia
amurensis (aumento na produção de isoflavona) (LUO; XIA; SHEN, 2006), Ocimum
basillicium (aumento na produção de ácido rosmarínico e ácido cefeínico, além de
aumentar a concentração de eugenol em 56% e linalol em 43%) (KIM et al., 2006),
suspensões celulares de Arabidopsis e tabaco (aumento na síntese de ácido ascórbico)
(WOLUCKA; GOOSSENS; INZÉ, 2005).
Do ponto de vista nutricional, jasmonatos também são de alta importância para
as plantas, induzindo a produção de proteínas, compostos fenólicos, carboidratos
(aumentando a expressão de genes que codificam proteínas responsáveis pelo
transporte de açúcares) (SCHENK et al., 2000, apud KUBICKA; ZADERNOWSKI,
2007), alterando a qualidade dos alimentos, possibilitando sua implicação para a saúde
(KUBICKA; ZADERNOWSKI, 2007).
Além da ação em plantas, relatos recentes atribuíram ao AJ e seu éster MJ, a
capacidade de inibir o desenvolvimento de células humanas cancerígenas, tendo o MJ
induzido morte em células de carcinoma de mama, próstata, melanoma, linfoma e
células leucêmicas (FINGRUT; FLESCHER, 2002). Jasmonatos são capazes de
provocar morte celular nas células cancerígenas sem afetar linfócitos normais,
mostrando assim seletividade citotóxica.
Estudos realizados demonstraram ainda, que jasmonatos tem ação contra os
dois maiores parasitas sanguíneos humanos, Plasmmodium falciparum, parasita
unicelular, intraeritrócitos, agente causador de uma das mais severas formas de malária
e Schistosoma mansoni, parasita helminto multicelular (GOLD et al., 2003). Além disso,
MJ, apresentou ação citotóxica contra Trichomonas vaginalis, um parasita do trato
urogenital, que causa a Tricomoníase, doença sexualmente transmissível, que acomete
22
anualmente cerca de 170 milhões de pessoas, e que pode causar mudanças malignas
em células cervicais e pré disposição à HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana)
(OFER; GOLD; FLESCHER, 2008).
A diversidade de informações de atividades relacionadas ao AJ e seu éster MJ,
faz desta classe de compostos um alvo a ser perseguido tanto com vistas ao aumento
de produção dessas moléculas, como para a busca por novas atividades biológicas.
O fato de já existir um grupo de pesquisa da Unidade de Biotecnologia da
Universidade de Ribeirão Preto, trabalhando com a produção dos jasmonatos e outras
moléculas através da via fermentativa do fungo B. rhodina fez com que este trabalho
buscasse novas atividades biológicas dos jasmonatos e de outras moléculas
produzidas por este microrganismo.
1.2 PRODUÇÃO DE JASMONATOS E OUTROS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
POR Botryosphaeria rhodina
Os fungos, dentre outros microrganismos se destacam não somente pela
quantidade de espécies conhecidas, mas também pelas inúmeras aplicações, sejam
elas na área da saúde, nutrição, agricultura, e meio ambiente (AZEVEDO et al., 2002,
apud GALVÃO, 2008).
Dentre esses microrganismos que se destacam, está o Botryosphaeria rhodina,
fungo da ordem Dothideales (GUARRO et al., 1999, apud GALVÃO, 2008), fitopatógeno
de distribuição mundial, causador da podridão negra dos frutos em diversas plantas
(SWART et al., 2000, apud GALVÃO, 2008). A doença já foi relatada no Havaí, Índia,
Venezuela, México e Brasil, em plantas como Carica papaya, Hevea brasiliensis, Musa
paradisíaca, Passiflora edulis, Persea americana, Theobroma cacao, Theobroma
grandiflorum, Annona muricata, Annona squamosa, Bactris gasipaes dentre outras. B.
rhodina penetra nos frutos, aproveitando-se de ferimentos externos provocados por
injúrias mecânicas, ou mesmo por insetos, causando então o apodrecimento da polpa
(SWART, et al., 2000, apud GALVÃO, 2008).
23
Por ser um dos principais patógenos responsável por muitos danos em diversos
produtos agrícolas, interesses vêm surgindo, com foco na busca das toxinas envolvidas
nesse processo de deterioração (HE et al., 2004, apud ABDOU et al., 2010).
Na busca por estas moléculas, pesquisadores identificaram além de jasmonatos
e seus derivados, outras moléculas, como a toxina (3S, 4R)-3-carboxi-2-
methyleneheptan 4-olida, o ácido decúmbico, os quais foram isolados a partir da cultura
de filtrado de L. theobromae, proveniente de manga (HE et al., 2004, apud ABDOU et
al., 2010).
Além dessas, lasiodiplodina (VEIGA et al., 2007), botryosphaeranas e
laminarinas (GIESE et al., 2006 apud ABDOU et al., 2010) puderam ser isoladas e
identificadas a partir de B. rhodina (ABDOU et al., 2010).
Do estudo químico realizado por Silva et al. (2006), dois derivados de
lasiodiplodina, o (R) metillasiodiplodina e (S) des- O- metillasiodiplodina puderam ser
identificados, além de dois derivados do AJ, o (11S) hidroxijasmonico e (11R)
hidroxijasmonico.!!
Já em trabalho realizado por Abdou et al. (2010), 5 substâncias puderam ser
identificados a partir de fermentação com B. rhodina, Botryorhodina A (Figura 2.1) e
Botryorhodina B (Figura 2.2), as quais apresentaram atividade antifúngica,
antibacteriana e citostática, Botryorhodina C (Figura 2.3) e Botryorhodina D (Figura 2.4),
apresentando atividade antibacteriana, além de índole-β-carboxylic (Figura 2.5)
24
Figura 2- Metabólitos isolados a partir da fermentação de Botryosphaeria
rhodina
Fonte: ABDOU et al. (2010)
Rukachaisirikul et al. (2009), isolaram 19 compostos de Botryosphaeria
rhodina,sendo eles, Botryosphaerilactona A (Figura 3.1), B (Figura 3.2) e C (Figura 3.3),
Botryosphaeridiona (Figura 3.4), Botryosphaerihydrofuran (Figura 3.5),
Botryosphaerinona (Figura 3.6), Botryosphaeriodiplodina (Figura 3.7), dihydro-4-
(hydroxymethyl)-3,5-dimethyl-2(3H)-furanone (Figura 3.8), (3S, 4S)-(-)-4-acetyl-3-
methyl-2(3H)-dihydrofuranone (Figura 3.9), (3S)- lasiodiplodina (Figura 3.10), (5R)-
hydroxylasiodiplodina (Figura 3.11), (5S)- hydroxylasiodiplodina (Figura 3.12), (R)-(-)-
mellein (Figura 3.13), cis-(3R, 4R)-(-)-4-hidroxymellein (Figura 3.14), trans-(3R, 4R)-(-)-
4-hidroxymellein (Figura 3.15), (R)-(-)-5-hydroxymellein (Figura 3.16), (R)-(-)-2-octeno-δ-
lactone (Figura 3.17), tetrahydro-4-hydroxy-6-propylpyran-2-one (Figura 2.18) e 6-
methylsalicylic acid (Figura 3.19).
Ao analisar a atividade antibacteriana desses compostos isolados frente à
Staphylococcus aureus ATCC 27154, e S. aureus resistente á meticilina, os autores
puderam constatar a atividade de, (3S)- lasiodiplodina, (R)-(-)-mellein, trans-(3R, 4R)-(-
)-4-hidroxymellein e (R)-(-)-5-hydroxymellein.
25
Outro composto isolado deste microrganismo que apresentou atividade
biológica foi β- (1→3,1→6)-D-glucan (botryosphaerana), a qual apresentou em sua
forma derivatizada atividade anticoagulante (MENDES et al., 2009).
Figura 3. Metabólitos isolados de Botryosphaeria rhodina
Fonte: RUKACHAISIRIKUL et al. 2009.
1.3 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
Embora diversas atividades já tenham sido atribuídas aos jasmonatos, ainda não
existem relatos na literatura quanto à sua atividade antimicrobiana. Este fato torna esta
classe de compostos, um alvo para pesquisas nesta área, visando a descoberta de
novos agentes antimicrobianos, visto o aumento no índice de microrganismos
patogênicos resistentes à múltiplas drogas, devido principalmente ao uso indiscriminado
de antimicrobianos, aumentando portanto, a procura por novos agentes terapêuticos
(DA SILVA et al., 2007).
26
A procura por novas substâncias antimicrobianas é cada vez maior,
principalmente em países subdesenvolvidos, onde há um crescente aumento na
freqüência de doenças infecciosas de origem bacteriana ou fúngica, além do aumento
da resistência contra antibióticos comumente utilizados na terapia (ABEBE; DEBELLA;
URGA, 2003). Considerando o alto custo na produção de drogas sintéticas e seus
vários efeitos colaterais, além da resistência, a busca por produtos alternativos tem sido
cada vez mais justificada (BROOK, 1998).
Na década de 90, o problema de resistência à drogas tornou-se ainda mais
grave devido a doenças infecciosas, como o HIV, a tuberculose e outras infecções
bacterianas que afetam a saúde do homem (WHITE; MARR; BOWDEN, 1998).
Na atualidade, praticamente todas as espécies de bactérias apresentam
resistência adquirida (TAVARES, 2000). Os microrganismos estafilococos, as
enterobactérias, a Pseudomonas aeruginosa, o Acinetobacter baumannil e os
hemófilos, gonococos, enterococos e pneumococos estão dentre os microrganismos
que sofreram grandes modificações na sensibilidade aos antimicrobianos com o correr
dos anos, sendo motivo de grande preocupação visto que têm se tornado bactérias
problemas na terapêutica antiinfecciosa (TAVARES, 2000).
Atualmente a linhagem bacteriana Staphylococcus aureus é o principal patógeno
em infecções hospitalares sendo responsável pela inativação de vários antibióticos,
tornando a multiresistência um grande problema de saúde pública (STRATTON, 2000
apud DA SILVA, et al., 2007).
Pseudomonas também é um dos mais importantes patógenos humanos, sendo a
terceira maior causa de infecções, estando associada com infecções pulmonares
crônicas principalmente em pacientes com fibrose cística. Este patógeno tem a
capacidade de formação de biofilme, composto por alginato, formando uma barreira,
protegendo as células da ação de antibióticos, o que dificulta o tratamento (ABDI-ALI;
MOHAMMADI-MEHR; AGHA-ALAEI, 2006).
Outro patógeno relevante é a Escherichia coli, bactéria esta responsável por 70 a
75% das infecções do trato urinário, e também por outras doenças como a
gastroenterite, infecções biliares, peritoneais, infecções neonatais, além de infectar
úlceras e feridas (COTRAN et al., 2000).
27
O agravante da resistência bacteriana é que o homem e até mesmo os animais
são submetidos a diferentes tipos, concentrações e freqüência de agentes
antimicrobianos, levando a uma possível resistência. Por outro lado a pressão seletiva
seleciona bactérias resistentes que tem características específicas para os agentes
antimicrobianos que estão sendo usados (SAYAH et al., 2005).
1.4 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA
Ao mesmo tempo em que ocorre o problema de resistência bacteriana às drogas,
a incidência de infecções fúngicas tem aumentado drasticamente, variando desde
micoses superficiais provocadas por dermatófitos até micoses profundas e
disseminadas, tais como candidíase e aspergilose.
Nos últimos anos a incidência de infecções causadas pelos dermatófitos tem
aumentado consideravelmente, principalmente entre crianças, idosos e pacientes
imunocomprimidos (MUKKERJEE et al., 2003).
O grupo de fungos queratinofílicos, os chamados dermatófitos, apresentam cerca
de 40 espécies pertencentes a três gêneros: Microsporum, Trichophyton e
Epidermophyton. Estes são responsáveis por infecções denominadas dermatofitoses,
que figuram entre as mais prevalentes no mundo e, apesar de não serem
potencialmente fatais ou incapacitantes, são incômodas e recorrentes, sendo gastos
anualmente milhões de dólares em tratamentos com este tipo de infecção
(SENTAMILSELVI, 1998).
Muitos motivos podem explicar o aumento da incidência dessas infecções, dentre
eles o uso excessivo de antibióticos, drogas imunosupressoras e citostáticas, além do
surgimento de pacientes com AIDS, os quais são alvos de dermatofitoses (LACAZ et
al., 2002).
Um importante dermatófito é o Trichophyton rubrum, fungo filamentoso que
causa infecções superficiais em pele, sendo considerado o maior agente causador de
dermatomicoses (SANTOS; HAMDAN, 2007), em unhas humanas, além de
dermatofitose peniana (PIELOP; ROSEN, 2001). Este é reconhecidamente cosmopolita
28
e é um dos dermatófitos mais freqüentes (ANSTEY; LUCKE; PHILPOT, 1996; COLOE;
SCHER, 1999), inclusive no Brasil (FACHIN et al., 1996; COSTA et al., 1999; VILANI-
MORENO et al., 1999), sendo conhecido por ser responsável por 70% de infecções
dermatofíticas (WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995 apud SANTOS; HAMDAN, 2007).
Este organismo, que normalmente provoca micoses superficiais bem caracterizadas,
vem causando infecções em regiões não usuais do corpo, atuando de modo invasivo
principalmente em pacientes imunodeprimidos (GROSMAN et al., 1995).
Fachin; Maffei; Martinez (1996) descreveram a obtenção in vitro de um mutante
de T. rubrum (gri1) por irradiação ultravioleta que apresentou hiper-resistência à
griseofulvina e ao tioconazol. A dupla resistência deste mutante poderia ser explicada
pela possível existência de um mecanismo de múltipla-resistência a drogas em T.
rubrum. Como a griseofulvina atua nos microtúbulos (GULL; TRINCI, 1973) e o
tioconazol, como os outros azoles, atua na inibição da biossíntese do ergosterol
(GUPTA; SAUDER; SHEAR, 1994) estas duas drogas atuam diferentemente na célula
do fungo e podem, portanto ser substratos para MDR (mecanismo de múltipla
resistência a drogas). Estes dados foram consideravelmente importantes do ponto de
vista clínico devido ao alto nível de resistência à griseofulvina e ao tioconazol
apresentado pelo mutante gri1 e também porque estas drogas são algumas vezes
usadas em combinação na terapia (HAY; CLAYTON; MOORE, 1985).
Baseado nestes resultados prévios, primers degenerados desenhados a partir de
domínios de transportadores ABC envolvidos em MDR de vários organismos foram
utilizados para amplificar um fragmento de PCR a partir do DNA genômico de T.
rubrum. Após a clonagem, este fragmento foi utilizado no rastreamento do gene
TruMDR2, que codifica um transportador do tipo ABC. Pela análise da seqüência
deduzida de aminoácidos, foi observado que a proteína codificada por este gene é
altamente similar a proteínas transportadoras ABC, previamente caracterizadas em
outros organismos (FACHIN, 2001). Desta forma, mutantes com os genes ABC
nocauteados, sensíveis a drogas, podem ser utilizados como instrumentos para ensaiar
novos compostos com atividade antifúngica específica (ANDRADE; ZWIERS; WAARD,
1999).
29
1.5 ATIVIDADE ANTICÂNCER
Atualmente o câncer é considerado uma doença relativamente comum no
mundo, atingindo cerca de 20 milhões de pessoas e já assumiu, em alguns países, a
principal causa de óbito na população (WÜNSCH; MONCAU, 2002 apud
MONTAGNER, 2007). Só no Brasil, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA),
estimativa para 2010 é de quase meio milhão de novos casos da doença, sendo
49.240 novos casos de câncer de mama, 18.430 de colo de útero, e mais de 113.000
de câncer de pele entre homens e mulheres, além de outros tipos da doença (INCA,
2010).
A busca por novos agentes anticâncer a partir de produtos naturais tem
aumentado (CORDELL, 2000; MANS; ROCHA; SCHWARTSMANN, 2000 apud
MONTAGNER, 2007), sendo que mais de 60% dos anticâncer utilizados atualmente
são derivados de fontes naturais como plantas, organismos marinhos e microrganismos
(KIENLE et al., 2009).
Ultimamente uma nova classe de compostos vem sendo comprovada possuir
atividade anticâncer, são eles os hormônios de estresse vegetal, Ácido Salicílico (AS),
Ácido Jasmônico e Metil Jasmonato (GOLDIN et al., 2007).
Ácido Salicílico é um antiinflamatório não esteroidal, que é capaz de inibir a
proliferação de vários tipos de células cancerígenas como leucemia linfoblástica,
próstata, mama e melanoma, além de induzir apoptose em leucemia mielóide humana,
câncer de colo retal, câncer gástrico e glioblastoma (GOLDIN et al., 2007).
O AS foi testado em concentrações que alcançaram 3 mM (414 µg.mL
-1
), bem
acima dos valores recomendados pelo Instituto Nacional do Câncer dos Estados
Unidos, o qual considera ativo, compostos que são capazes de inibir 50% do
crescimento celular em concentrações menores ou iguais a 4 µg.mL
-1
(GERAN et al.,
1972 apud VILLARREAL et al., 1994).
Os autores responsáveis pelos estudos com AS justificam seu uso como agente
anticâncer nesta concentração, devido esta ser a máxima concentração farmacológica
não tóxica do salicilato em humanos (GOLDIN et al., 2007).
30
Devido ao fato dos jasmonatos AJ e MJ serem, assim como o AS, hormônios de
estresse vegetal, embora de estruturas diferentes, pesquisadores decidiram estudar os
efeitos desses compostos frente às linhagens cancerígenas (GOLDIN et al., 2007).
Com estes estudos, pesquisadores constataram que Jasmonatos foram capazes
de inibir o desenvolvimento de células humanas cancerígenas, tendo o MJ induzido
morte em células de carcinoma de mama, próstata, melanoma, linfoma, células
leucêmicas (FINGRUT; FLESCHER, 2002), pulmão (FLESCHER, 2005), sem, no
entanto atingir linfócitos normais.
Tal atividade pode ser explicada por três possíveis mecanismos de ação, os
quais incluem a habilidade dos jasmonatos em abrir o poro do complexo de transição
de permeabilidade da membrana (canal PCTP), resultando no deslocamento do
citocromo c, além do inchaço da membrana alterando suas atividades bioenergéticas,
fazendo com que ocorra uma depleção nos níveis de ATP, induzindo a apoptose; na
habilidade dos jasmonatos em induzir a rediferenciação de células leucêmicas, e na
habilidade desses compostos em induzir a produção de espécies reativas de oxigênio.
(FLESCHER et al., 2005; ROTEM et al., 2005; KIM et al., 2004). Assim, o MJ tem
efeitos mitocondriotóxicos diretos, sugerindo fortemente que as mitocôndrias são
organelas alvo dos jasmonatos (ROTEM, et al., 2005).
Jasmonatos não induziram inchaço em mitocôndrias isoladas de células de
fibroblasto humano, 3T3. O fato dessas células serem imortais, porém não
transformadas sugerem que jasmonatos atuem seletivamente em mitocôndrias de
células transformadas (ROTEM, et al., 2005).
Em células de melanoma (B16-F10) MJ suprimiu a mobilidade celular e inibiu o
desenvolvimento de metástase (REISCHER et al., 2007).
Além disso, MJ mostrou uma diminuição no potencial de resistência à apoptose,
apresentado por algumas células cancerígenas (YERUVA; ELEGBEDE; CARPER,
2008).
A atividade de jasmonatos não foi observada somente in vitro, sobre linhagens
celulares, eles também foram capazes de aumentar a sobrevida de camundongos
portadores de linfoma (FINGRUT; FLESCHER, 2002).
31
Jasmonatos também são capazes de matar células cancerígenas resistentes à
medicamentos, tanto pela resistência causada por mutação de p53 (gene de supressão
de tumores), a qual resulta na proliferação descontrolada e malignidade (FINGRUT et
al., 2005), quanto àquela mediada pela bomba de efluxo da glicoproteína-P (o PGP)
(FLESCHER et al., 2005).
Dados recentes revelaram ainda que o tratamento em células de sarcoma com
MJ e inibidores da via de PI3K/Akt (2-Deoxy-D-glucose) apresentaram efeito citotóxico
sinergístico (ELIA; FLESCHER, 2008).
Embora diversos estudos relatam a atividade anticâncer de jasmonatos, ainda
não há relatos quanto a atividade frente à câncer canino, cuja incidência, assim como
as do seres humanos aumentou nos últimos anos. Estima-se que 1 em cada 3-4 cães
desenvolverá algum tipo de câncer, duas vezes mais que o ser humano (HAFEMAN et
al., 2010).
32
2 OBJETIVOS GERAIS
Constituem-se objetivos deste projeto avaliar as atividades antibacteriana,
antifúngica e anticâncer de extrato e frações produzidos por Botryosphaeria rhodina,
através de via fermentativa, além da atividade de AJ e MJ obtidos comercialmente.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Realização de fermentações da linhagem Kifn 3.1 de B. rhodina isolada de
mogno para a produção de jasmonatos, e outras moléculas, bem como a extração,
identificação e quantificação dos jasmonatos presentes nos fermentados obtidos;
- Fracionamento do extrato obtido por fermentação de B. rhodina através de
Cromatografia em Coluna Clássica;
- Refracionamento e identificação dos constituintes das frações mais ativas;
- Avaliação da atividade antibacteriana de AJ, MJ e de extrato e frações sobre a
linhagem de bactéria gram positiva (Staphylococcus aureus ATCC 6538 e isolado de
campo) e duas linhagens de bactérias gram negativas (Escherichia coli ATCC 25922 e
isolado de campo) e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27873 e isolado de campo);
- Avaliação da atividade antifúngica de AJ, MJ e de extrato e frações sobre a
linhagem de dermatófito Trichophyton rubrum selvagem (ATCC MYA-3108)- H6, e T.
rubrum mutante ΔTruMDR2, com o gene de transportadores ABC nocauteado;
- Avaliação da atividade citotóxica de extrato e frações, frente às linhagens de
carcinoma de colo de útero HeLa, adenocarcinoma de mama MCF-7, linhagem tumoral
de cérebro humano (Astrocitoma) U343 MG-a, Melanoma murino B16-F10 e linhagem
de Fibroblasto de camundongo 3T3 (normal, não tumoral);
- Avaliação da atividade citotóxica de AJ e MJ frente à linhagem de macrófagos
caninos DH82 (ATCC: CRL-10389), originada de um caso de histiocitose maligno
canino.
33
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 PRODUÇÕES DE JASMONATOS, SEUS DERIVADOS E OUTROS
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS POR LINHAGEM DE Botryosphaeria rhodina
3.1.1 Manutenção da linhagem de Botryosphaeria rhodina e preparo do inóculo
Para a realização dos ensaios, utilizou-se linhagem de Botryosphaeria rhodina,
isolada de mogno.
Estoques da linhagem Kifn 3.1 estão sendo mantidos em tubos de ensaio de 2
mL contendo 1,5 mL de água destilada estéril, armazenados à 4º C, e em tubos de 10
mL, contendo 7 mL de meio BDA (Batata-Dextrose-Ágar- Oxoid) cobertos com óleo
mineral estéril, mantidos à temperatura ambiente.
Para a reativação da cultura, a mesma foi mantida em placas de Petri contendo
meio de cultura BDA, a 30°C, na ausência de luz, servindo posteriormente de inóculo
inicial para a fermentação.
3.1.2 Fermentação submersa
Para a fermentação utilizou-se o meio de cultura M
2
(Miersch modificado) líquido,
composto por 50 g. L
-1
de sacarose, 2 g. L
-1
de extrato de levedura, 2 g. L
-1
de KH
2
PO
4
e elementos traços; com pH fixado em 5,5. O material micelial da linhagem Kifn 3.1,
crescido em BDA por três dias, foi inoculado em reatores com volume útil de 250 mL,
contendo 50 mL de meio M
2
, e mantidos posteriormente sob condições estáticas, à
temperatura de 30°C e na ausência de luz durante 7 dias.
34
3.1.3 Extração de jasmonatos e metabólitos secundários dos fermentados
Após decorrido o período de fermentação, o material foi filtrado à vácuo em filtro
com poro 14µm, e o filtrado foi submetido à extração para obtenção de jasmonatos e
outros metabólitos secundários.
A extração ocorreu através de partição líquido-líquido utilizando-se como agente
extrator o acetato de etila. O filtrado coletado teve seu pH ajustado para 3,0 utilizando-
se HCl 4M. Em seguida o volume foi transferido para funil de separação e então
adicionado acetato de etila na proporção 1:1(v:v). A fase orgânica foi coletada e a fase
aquosa recebeu nova quantidade de acetato de etila e o procedimento foi repetido por
mais duas vezes, juntando-se as fases orgânicas coletadas. As fases orgânicas foram
então dessecadas utilizando-se Na
2
SO
4
anidro e em seguida rotaevaporadas.
3.2 PROCEDIMENTOS CROMATOGRÁFICOS
3.2.1 Detecção e quantificação de jasmonatos presentes no extrato
A detecção da presença de AJ e MJ no extrato foi feita através de CCDC
(Cromatografia em Camada Delgada Comparativa) utilizando-se cromatoplacas pré
revestidas com sílica gel G60 e fase móvel composta de clorofórmio: acetato de etila:
acetona: ácido acético (40:10:5:1). Após a eluição, para a visualização de jasmonatos,
as placas foram borrifadas com solução de vanilina sulfúrica e em seguida aquecidas a
temperatura de 100°C. Amostras padrões de AJ e MJ foram utilizadas como referência.
A quantificação de jasmonatos (AJ e MJ) nos extratos foi realizada através de
CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) utilizando-se um cromatógrafo
SHIMADZU (LC-10AD vp) acoplado a um detector de arranjo de diodo. Foi utilizada
uma coluna Supelcosil C
18
(25 cm x 4,6 mm id, 5µm) e um sistema solvente composto
de MeOH:ácido acético 0,1 % (40:60). O fluxo de solvente foi de 0,85 mL.min
-1
sendo a
análise monitorada a 210 nm. Para a quantificação utilizou-se o método do padrão
35
externo, através do traçado de uma curva de calibração utilizando-se soluções de
padrão autêntico de AJ e MJ (Sigma) em concentrações variando entre 0,1 – 1,0
mg.mL
-1
.
3.2.2 Fracionamento do extrato
O extrato seco obtido da partição do fermentado com acetato de etila, foi
liofilizado e então fracionado por Cromatografia em Coluna (CC) usando como fase
estacionária Sílica gel (Sigma - Aldrich, 70-230 mesh, 60 Å) e como fase móvel
clorofórmio, metanol e água na proporção 95: 4,5: 0,5 até 1012,5 mL gerando 135
frações, e posteriormente na proporção 90: 9,5: 0,5 até 262,5 mL gerando 54 frações.
Para a visualização do perfil das frações, as mesmas foram analisadas por
CCDC utilizando-se cromatoplacas de sílica gel G60 e fase móvel composta de
clorofórmio: acetato de etila: acetona: ácido acético (40:10:5:1). Após a eluição, para a
visualização de jasmonatos, as placas foram borrifadas com solução de vanilina
sulfúrica e em seguida aquecidas a temperatura de 100°C.
Em seguida, as amostras com perfis cromatográficos semelhantes foram
reunidas, e uma nova análise por CCDC foi realizada, nas mesmas condições descritas
acima.
A figura 4 ilustra a coluna e coleta das amostras no fracionamento do extrato
fermentado.
Figura 4. Coluna Cromatográfica- Fracionamento do extrato
36
3.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE AJ, MJ E DE EXTRATO E
FRAÇÕES OBTIDOS DA FERMENTAÇÃO DE B. rhodina
3.3.1 Linhagens bacterianas
Neste estudo foram utilizadas três linhagens de bactérias ATCC, sendo elas:
Escherichia coli ATCC 25922 (cepa utilizada como referência segundo as normas do
CLSI-M27-A2, 2003), Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27873.
3.3.2 Isolados de campo
Os isolados de campo, gentilmente cedidos pela Profª Drª Adriana Pelegrino
Pinho Ramos, Escherichia coli (isolada de urina), Staphylococcus aureus (isolada de
secreção de orofaringe), e Pseudomonas aeruginosa (isolada de urina), foram
coletados de pacientes atendidos no Laboratório de Análises Clínicas da UNAERP e
identificados pela farmacêutica Janine de Castilho Andrade. Os isolados apresentaram
sensibilidade e resistência aos seguintes antibióticos comerciais (Tabela 1).
Tabela 1-Sensibilidade e resistência dos isolados de campo frente à antibióticos
comerciais.
Ampicilina
Gentamicina
Vancomicina
Tetraciclina
E. coli
R
S
R
S
S. aureus
R
NT
S
R
P. aeruginosa
R
S
NT
R
(R) = Resistente acima de 30 µg.mL
-1
; (S) = Sensível; (NT) = Não Testado
37
3.3.3 Estoque de linhagens bacterianas
Estoques das linhagens de bactérias estão sendo mantidos em tubos de ensaio
de 2 mL contendo 1,5 mL de meio BHI (Brain Heart Infusion- Oxoid), com 15% de
glicerol, à temperatura de - 70°C.
3.3.4 Preparo de AJ. MJ, extrato e frações
O AJ, MJ, extrato e frações foram diluídos em Dimetilsulfóxido (DMSO- Sigma-
Aldrich), obtendo-se solução estoque de 100 mg.mL
-1
, com subseqüente diluição em
meio BHI, obtendo-se concentração final de 6 mg.mL
-1
(a concentração de DMSO não
ultrapassou 6%), sendo testadas concentrações de 1,5 mg.mL
-1
à 0,0058 mg.mL
-1
.
3.3.5 Preparo de Ampicilina
O antibiótico comercial Ampicilina (Sigma-Aldrich) foi diluído em água, obtendo-
se solução estoque de 1 mg.mL
-1
, com subseqüente diluições em meio BHI, obtendo-se
concentrações que variaram de 100 µg.mL
-1
, à 0,78 µg.mL
-1
.
3.3.6 Preparo do inóculo
Para a realização dos testes as linhagens bacterianas foram inoculadas em 5 mL
de meio BHI, e incubadas a 37°C, overnight.
38
3.3.7 Testes de sensibilidade
O efeito da atividade antibacteriana foi avaliado pelo método de microdiluição em
meio BHI em placas contendo 96 poços, segundo as normas do CLSI (Clinical
Laboratory Standards Institute) M27-A2 (2003), com pequenas modificações. A
concentração do inóculo foi ajustada com solução salina a 0,9%, a uma densidade
equivalente a uma solução Mac Farland 0,5 (1 a 2 x 10
8
UFC.mL
-1
). Realizou-se uma
diluição 1:100 deste inoculo em meio BHI, e em seguida utilizou-se 50 µL deste inóculo
por poço de cada linhagem de bactéria testada. A Ampicilina foi testada como
antibiótico padrão, juntamente com a linhagem de E. coli ATCC 25922, como
referências controle do método. Controles de esterilidade do meio de cultura e das
amostras foram realizados conjuntamente, assim como o controle do veículo. A CIM
(Concentração Inibitória Mínima) correspondendo à menor concentração inibitória do
extrato onde não houve crescimento macroscópico das linhagens de bactérias testadas
comparado com o crescimento do controle positivo foi determinada. Os resultados
foram obtidos de experimentos realizados em triplicata.
3.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE AJ, MJ E DE EXTRATO E
FRAÇÕES OBTIDOS DA FERMENTAÇÃO DE B. rhodina
3.4.1 Linhagens fúngicas
Neste estudo foram utilizados linhagens de dermatófito Trichophyton rubrum
selvagem (ATCC MYA-3108)- H6, e T. rubrum mutante ΔTruMDR2, com o gene de
transportadores ABC nocauteado.
39
3.4.2 Estoque das linhagens
Estoques das linhagens de fungos estão sendo mantidos em tubos de ensaio de
2 mL contendo 1,5 mL de água destilada autoclavada à temperatura ambiente.
3.4.3 Preparo de meio RPMI
O meio RPMI (Sigma-Aldrich) foi dissolvido em água miliQ e tamponado com 1,2
g de Bicarbonato de sódio (J.T.Baker) e 2,38 g de Hepes (Sigma-Aldrich) em pH 7.
3.4.4 Preparo de AJ, MJ, extrato e frações
O AJ, MJ, extrato e frações foram diluídos em DMSO obtendo-se soluções
estoque de 100 mg.mL
-1
, com subseqüente diluição em meio RPMI, obtendo-se uma
concentração final de 6 mg.mL
-1
(a concentração de DMSO não ultrapassou 6%), sendo
testadas concentrações de 1,5 mg.mL
-1
à 0,0058 mg.mL
-1
.
3.4.5 Preparo de Anfotericina B
O antifúngico comercial Anfotericina B (Sigma-Aldrich) foi diluído em meio RPMI
obtendo-se concentrações de 100 µg.mL
-1
à 0,195 µg.mL
-1
.
3.4.6 Preparo de Terbinafina
O antifúngico comercial Terbinafina (Sigma-Aldrich) foi diluído em DMSO,
obtendo-se solução estoque de 1 mg.mL
-1
, com subseqüente diluições em meio RPMI,
obtendo-se concentrações de 100 µg.mL
-1
à 0,78 µg.mL
-1
.
40
3.4.7 Preparo do inóculo
Para a realização dos testes a linhagem H6 foi cultivadas em meio BDA, e o
mutante ΔTruMDR2 em meio BDA acrescido de 400 µg.mL
-1
de Higromicina (Sigma-
Aldrich), permanecendo incubadas por 7 dias a 28°C.
3.4.8 Testes de sensibilidade
As colônias foram recolhidas com o auxílio de uma espátula estéril e então
colocadas em tubo cônico cobertas com aproximadamente 5 mL de solução salina a
0,9%. A mistura resultante foi filtrada com Whatman filter 40 (poro 8 µm) permitindo
somente a passagem de microconídeos, retendo fragmentos de hifas (SANTOS;
HAMDAN, 2007) e em seguida transferida para um tubo estéril e a densidade óptica foi
ajustada para 70 a 72 % de transmitância em espectrofotômetro, o que corresponde a
2x10
6
a 4x10
6
UFC.mL
-1
. Esta suspensão foi diluída 1:50 em meio RPMI, que
corresponde a duas vezes a densidade necessária para testar aproximadamente 2x10
4
a 4x10
4
UFC.mL
-1
. Os testes foram realizados em placas contendo 96 poços, de acordo
com o método referência M38-A, 2002 do CLSI, com pequenas modificações sugeridas
por Santos; Hamdan (2007). Cada placa de microdiluição continha 100 µL da
substância diluída no meio e mais 100 µL da suspensão diluída. Cada placa continha
controles de crescimento e esterilidade da substância. Os testes de microdiluição foram
incubados a 28°C e a CIM que inibe o crescimento macroscópico do fungo foi
determinada após 7 dias de crescimento comparado com o crescimento do controle.
41
3.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE EXTRATO E FRAÇÕES OBTIDOS
DA FERMENTAÇÃO DE B. rhodina.
3.5.1 Linhagens celulares
As linhagens tumorais de carcinoma de colo de útero HeLa, adenocarcinoma de
mama MCF-7, de Melanoma murino B16-F10 e Fibroblasto de camundongo 3T3 foram
gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Enilza Espreafico (Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto-SP) e a linhagem de astrocitoma U343 MG-a, foi gentilmente cedida pelo
Prof. Dr. Carlos Gilberto Carlotte Jr. (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-SP).
3.5.2 Preparo de solução de Hanks
Em 500 mL de água miliQ dissolveu-se 0,4 g de KCl; 0,06 g de KH
2
PO
4
; 0,04 g
de NaH
2
PO
4
; 0,35 g de NaHCO
3
e 8 g de NaCl. Em um recipiente separado dissolveu-
se 1 g de dextrose anidra em 500 mL de água miliQ. Em seguida autoclavou-se as
soluções por 15 minutos. Após o esfriamento, as soluções foram misturadas.
3.5.3 Preparo de solução de Tripsina
Em 100 mL de solução de Hanks, adicionou-se 0,125 g de tripsina e 0,02 g de
EDTA. A solução foi filtrada em membrana de 0,2 µm (Sartorius).
3.5.4 Preparo de extrato e frações
O extrato e frações foram diluídos em DMSO em solução estoque de 100 mg.mL
-
1
, com subseqüente diluição em meios DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) e
42
F10-Ham (Nutrient Mixture F10 Ham) (Sigma-Aldrich) , contendo 10% de SFB (Soro
Fetal Bovino- Cultilab) obtendo-se concentrações de 700, 600, 500, 400 e 300 µg.mL
-1
,
onde a maior concentração de DMSO não ultrapassou 0,6%.
3.5.5 Preparo de AJ e MJ
AJ e MJ foram diluídos em DMSO, obtendo-se solução estoque de 475,5 e 500
mM, respectivamente, com subseqüente diluição em meios DMEM e F10-Ham,
suplementados com 10% de SFB obtendo-se concentrações de 630,9 e 672 µg.mL
-1
respectivamente (3 mM), onde a concentração de DMSO não ultrapassou 0,6%.
3.5.6 Preparo de Doxorrubicina
Cloridrato de Doxorrubicina (Sigma-Aldrich) foi diluída em DMSO, obtendo-se
solução estoque de 10 mg.mL
-1
, com subseqüente diluição em meios DMEM, F10-Ham,
suplementados com 10% de SFB obtendo-se concentração de 4 µg.mL
-1
.
3.5.7 Preparo de Sulfato de Vincristina
Sulfato de Vincristina (Zoadiac) foi diluída em meios DMEM e F10-Ham,
suplementados com 10% de SFB obtendo-se concentração de 4 µg.mL
-1
.
3.5.8 Estoque e Cultura das linhagens HeLa, MCF-7, U343 MG-a, 3T3 e B16-F10.
As linhagens tumorais HeLa, MCF-7, U343 MG-a e 3T3 foram cultivadas em
garrafas de cultivo de 25cm
2
na concentração inicial de 3x10
4
células.mL
-1
em meio de
cultura DMEM, suplementado com SFB a 15% e solução de antibiótico estreptomicina e
penicilina (10000 U) (Sigma-Aldrich) em estufa a 37 °C contendo 5% de CO
2
por 3 a 5
43
dias. A Linhagem B16-F10 foi cultivada nas mesmas condições, entretanto com meio
F10-Ham.
Para o subcultivo (repique), o meio de cultura foi retirado, a garrafa foi lavada
com solução de Hanks por 5 minutos, em seguida retirou-se a solução de Hanks e
acrescentou-se 3 mL de solução de Tripsina por 1 ou 2 minutos, até que as células
estivessem soltas. O volume de células mais tripsina foi dividido igualmente e
transferidos para duas novas garrafas de 25 cm
2
contendo meio de cultura fresco.
Para o estoque das linhagens as mesmas foram cultivadas por 72 horas, então
as células foram destacadas, transferidas para um tubo cônico de 15 mL estéril
(Corning) e centrifugadas a 2400 rpm por 1 minuto. O sobrenadante foi aspirado e as
células ressuspendidas em 900 µL de SFB. O soro contendo as células foi transferido
para “vials” criogênicos (Corning), e adicionados 100 µL de DMSO os quais estão
sendo mantidos em nitrogênio líquido.
3.5.9 Atividade citotóxica
Para o estabelecimento dos ensaios citotóxicos, as linhagens foram cultivadas
em meio adequado em estufa a 37º C, contendo 5% de CO
2,
até atingir confluência de
mais de 80%. Em seguida as células foram lavadas com solução de Hanks,
tripsinizadas, centrifugadas a 1500 rpm por 1 minuto, e ressuspendidas em meio de
cultivo. Realizou-se a contagem de células em hematímetro, obtendo-se concentrações
de 2x 10
5
células. mL
-1
para todas as linhagens. O volume de 100 µL foi transferido para
placa de 96 poços, e então incubada por 24 horas em estufa a 37º C, contendo 5% de
CO
2
para aderência das células. Decorridas as 24 horas, adicionou-se as substâncias a
serem testadas. Utilizou-se poços contendo DMSO 0,6% para controle do veículo, e
poços somente com meio de cultura como controle de crescimento celular. A placa foi
incubada por mais 48 horas.
Após este período, adicionou-se 20µL de MTT (5 mg.mL
-1
em solução de Hanks,
filtrado em membrana milipore 0,22µm, Millex), inclusive nos poços controle. As placas
foram incubadas por mais 4 horas, centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos, e em
44
seguida retirados o meio de cultivo. Para a leitura adicionou-se aos poços 200µL de
DMSO. Após 1 hora de incubação, a placa foi lida em comprimento de onda de 550 nm,
em uma leitora de microplaca (TP-Reader, Thermo Plate).
O teste MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) desenvolvido por Mosmann
(1983) é um teste colorimétrico, o qual avalia o crescimento celular. Neste ensaio o anel
de tetrazolio é modificado em mitocôndrias ativas, tornando isso seletivo para células
vivas. O MTT [3-(4.d-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazolium bromide] reage,
portanto apenas com células vivas, e a absorbância do produto reacional pode ser
quantificada por leitora de ELISA.
Primeiramente testou-se a maior concentração (700 µg.mL
-1
), onde somente as
substâncias que apresentaram uma inibição maior ou igual a 50%, foram testadas nas
outras concentrações.
3.5.10 Análise dos resultados
A porcentagem de citotoxicidade foi calculada da seguinte maneira: ((DO
controle células - DO células tratadas com as substâncias teste)/ DO controle células)x
100, sendo DO = Densidade Óptica.
Os dados foram analisados utilizando-se teste de ANOVA de uma via seguido do
pós-teste de Tukey sendo considerados *p< 0,05, **p<0,01, ***p<0,001.!
3.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE AJ E MJ FRENTE À LINHAGEM DE
MACRÓFAGOS CANINOS DH82.
3.6.1 Linhagem celular
A linhagem tumoral de macrófagos caninos DH82 (ATCC: CRL-10389), originada
de um caso de Histiocitose maligno canino foi gentilmente cedida pelos Professores Dr.
45
Daniel Moura Aguiar (Universidade Federal de Cuiabá), e Dr. Marcelo Labruna
(Faculdade de Medicina veterinária e Zootecnia USP).
3.6.2 Preparo de AJ e MJ
AJ e MJ foram diluídos em DMSO, obtendo-se solução estoque de 475,5 e 500
mM, respectivamente, com subseqüente diluição em meio DMEM suplementado com
10% de soro de bezerro (Hyclone) obtendo-se concentrações de 1, 2 e 3 mM, sendo
que a maior concentração de DMSO não ultrapassou 0,6%.
3.6.3 Preparo de Doxorrubicina
Cloridrato de Doxorrubicina foi diluída em DMSO, obtendo-se solução estoque de
10 mg. mL
-1
, com subseqüente diluição em meios DMEM, suplementados com 10% de
soro de bezerro obtendo-se concentração de 4 µg.mL
-1
.
3.6.4 Estoque e cultura da linhagem DH82
Para a realização dos ensaios a linhagem DH82 foi crescida em meio de cultura
DMEM suplementado com soro de bezerro a 10% em estufa a 37°C contendo 5% de
CO
2
.
Para o subcultivo as células foram soltas com o auxílio de um rodinho, e o
volume dividido e transferido para duas novas garrafas de 25cm
2
contendo meio de
cultura fresco.
Para o estoque das linhagens as mesmas foram cultivadas por 72 horas, as
células foram destacadas, transferidas para um tubo cônico de 15 mL estéril (Corning) e
centrifugadas a 2400 rpm por 1 minuto. O sobrenadante foi aspirado e as células
ressuspendidas em 900 µL de SFB. O soro contendo as células foi transferido para
46
“vials” criogênicos (Corning), e adicionados 100µL de DMSO os quais estão sendo
mantidos em nitrogênio líquido.
3.6.5 Atividade citotóxica
Para o estabelecimento dos ensaios citotóxicos, as linhagens foram cultivadas
conforme descrito no item 3.5.9 e ensaiadas em concentrações de 2x 10
6
células. mL
-1
.
3.6.6 Análise dos resultados
A porcentagem de citotoxicidade, bem como a análise dos dados foram
analisados conforme já descrito no item 3.5.10.
3.7 REFRACIONAMENTO DAS FRAÇÕES MAIS ATIVAS.
3.7.1 Refracionamento de Fr2, Fr5 e Fr6
As frações Fr2, Fr5 e Fr6, obtidas a partir da Cromatografia em Coluna, por
apresentarem melhores atividades, foram refracionadas por CLAE, visando a
identificação dos constituintes das mesmas. Para o refracionamento, utilizou-se um
cromatógrafo SHIMADZU (LC-10AD vp) acoplado a um detector de arranjo de diodo.
Foi utilizada uma coluna Supelcosil C
18
(25 cm x 4,6 mm id, 5µm) e um sistema
solvente composto de MeOH:ácido acético 0,1 % (40:60). O fluxo de solvente foi de
0,85 mL.min
-1
sendo a análise monitorada a 210 nm. As frações foram injetadas e
durante as eluições os picos majoritários de cada uma das frações foram coletados
para serem posteriormente analisados por Cromatografia em Fase Gasosa acoplada à
Espectrometria de Massa.
47
3.8 IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES DAS FRAÇÕES MAIS ATIVAS.
As subfrações, obtidas do refracionamento, foram analisadas por Cromatografia
em Fase Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (CG/EM), utilizando-se aparelho
Varian 3900 com detector seletivo de massa, modelo Saturn 2100T, visando a
identificação de seus constituintes.
As condições de análise foram: Coluna capilar: DB-5 (30m x 0,25mm x 0,25µm);
temperatura do injetor: 260
0
C; temperatura do detector: 230
0
C; Impacto de Elétrons: 70
eV; Gás de arraste: He; Fluxo: 1,0 mL.min
-1
; Split: 1/10; Programa de temperatura
(Tabela 2). As análises foram realizadas pela professora Dra. Silvia Taleb Contini, no
Departamento de Biotecnologia, Universidade de Ribeirão Preto.
Tabela 2- Rampa de temperatura- Análise CG/EM
Temp (°C)
Rate (°C.min
-1
)
Hold (min)
Total (min)
100
-
5.00
5.00
200
20.0
10.0
20.0
230
10.0
0.0
23.0
320
5.0
0.0
41.0
A identificação das substâncias foi efetuada através da comparação dos seus
espectros de massas com o banco de dados do sistema CG-EM (NIST 62 lib).
48
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 PRODUÇÕES DE JASMONATOS, E OUTROS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
POR LINHAGEM DE Botryosphaeria rhodina
Após a fermentação, filtração e partição do filtrado, obteve-se 7 g do extrato
seco.
4.2 PROCEDIMENTOS CROMATOGRÁFICOS
4.2.1 Detecção e quantificação de jasmonatos presentes no extrato
A cromatografia do extrato mostra a presença de várias manchas referentes a
diferentes compostos.
A análise por CCDC do extrato acetato de etila obtido pela fermentação do fungo
B. rhodina evidencia também a presença de AJ, porém MJ não foi possível ser
detectado (Figura 5).
Resultado semelhante foi obtido pela quantificação através de CLAE (Tabela 3),
onde também não foi possível a quantificação de MJ.
Figura 5. Cromatoplaca das amostras fermentadas, constatando-se a presença de AJ.
Linha
Amostra
1
Padrão AJ
2
Padrão MJ
3
Extrato
AJ
MJ
AJ
1 2 3
49
Tabela 3- Quantificação de jasmonatos presentes no extrato
Amostra
AJ mg.L
-1
MJ mg.L
-1
Extrato
141,9
0
Dhandhukia & Thakkar (2007) obtiveram em fermentação de Lasiodiplodia
theobromae (forma anamórfica de B. theobromae, sin B. rhodina) concentrações de AJ
inferiores à encontrada neste trabalho (73,66 mg.L
-1
). Neste estudo somente foi
analisado a presença de AJ, entretanto sabe-se que este microrganismo cultivado nas
condições experimentais adotadas nesse trabalho, é capaz de produzir outros
derivados dos jasmonatos, além de outras classes de compostos (MIERSCH, et al.,
1987; MIERSCH, et al., 1991).
4.2.2 Fracionamento do extrato
A eficiência do fracionamento foi de 94,4% pois partiu-se de um extrato contendo
7 g e foram obtidos 189 frações gerando totais 6,6 g. As frações foram reunidas de
acordo com a similaridade de perfil cromatográfico, dando origem então a 8 frações
denominadas de Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5, Fr6, Fr7 e Fr8 e um resíduo, provavelmente
composto por meio de cultura proveniente da fermentação. Os rendimentos das frações
e resíduos estão apresentadas na tabela 4.
50
Tabela 4- Rendimentos das frações
Fração
Rendimento (g)
Fr1
0,006
Fr2
0,088
Fr3
0,03
Fr4
1,613
Fr5
0,24
Fr6
0,325
Fr7
0,435
Fr8
0,448
Resíduo
3,423
Na figura 6 observa-se o perfil cromatográfico das frações, verificando-se ainda a
presença de AJ nas frações Fr4, Fr5 e Fr6.
Figura 6. Cromatoplaca das frações obtidas pelo fracionamento do extrato bruto
por CC
Linha
Amostra
1
Padrão AJ
2
Padrão MJ
3
Fr1
4
Fr2
5
Fr3
6
Fr4
7
Fr5
8
Fr6
9
Fr7
10
Fr8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
AJ
Rf = 0,48
MJ
Rf = 0,81
51
A CCDC das frações obtidas pelo fracionamento do extrato acetato de etila
evidencia a separação parcial dos componentes presentes no extrato bruto.
Pela figura 6 é possível observar a Fr2 (linha 4) é composta por uma mancha
com Rf intermediário entre o AJ e o MJ.
É possível também observar que nas frações Fr4, Fr5 e Fr6 (linhas 6, 7 e 8)
existe a presença de mancha relativa ao AJ (Rf = 0,48), porém em nenhuma das
frações detectou-se MJ (Rf = 0,81).
As Fr 7 e Fr8 (linhas 9 e 10) são compostas por manchas com Rf inferiores ao do
AJ, portanto de maior polaridade.
A Fr1 (linha 3) foi descartada na continuidade dos experimentos, visto não
apresentar evidências de atividade em pré-testes.
4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE AJ, MJ E DE EXTRATO E
FRAÇÕES OBTIDOS DA FERMENTAÇÃO DE B. rhodina
Os resultados obtidos revelaram que AJ, MJ, extrato, e frações não
apresentaram atividade antibacteriana nas concentrações e frente às linhagens
testadas (Tabela 5). Os valores obtidos de Ampicilina para E. coli ATCC 25922
evidenciam que os ensaios foram eficazes, visto que para os três experimentos
isolados, os valores da CIM se repetiram.
Em relação à ausência de atividade do extrato, os resultados obtidos diferem dos
de Phongpaichit e colaboradores (2006) que ao testar extrato proveniente da
fermentação do microrganismo B. rhodina, obtiveram inibição de linhagens de S. aureus
ATCC25923 com CIM de 32 µg.mL
-1
, e S. aureus resistente a meticilina com CIM de 64
µg.mL
-1
. Porém o autor também não obteve resultados satisfatórios com E. coli ATCC
25922 . Essa diferença de resultados pode ser devido ao fato do meio utilizado para a
fermentação terem sido diferentes, visto que os autores fizeram uso do meio Batata-
Dextrose podendo o perfil de substâncias presentes nos extratos serem distintas, além
disso, a linhagem utilizada neste estudo foi isolada de mogno e a utilizada pelos autores
foi isolada de plantas da espécie de Garcinia, além de que as linhagens bacterianas
52
testadas também foram diferentes. Os autores não citaram a presença, nem a
concentração de qualquer substância alvo.
Tabela 5- Inibição das substâncias testadas frente às linhagens bacterianas
CIM µg.mL
-1
AJ
MJ
EXT
Fr2
Fr3
Fr4
Fr5
Fr6
Fr7
Fr8
Ampicilina
CV
E. coli ATCC
25922
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3,125
-
E. coli
isolado de
campo
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
S. aureus
ATCC 6538
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3,125
-
S. aureus
isolado de
campo
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
P.
aeruginosa
ATCC 27873
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
P aeruginosa
isolado de
campo
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
(-) = Não houve inibição de crescimento.
4.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE AJ, MJ E DE EXTRATO E
FRAÇÕES OBTIDOS DA FERMENTAÇÃO DE B. rhodina
Dentre todas as substâncias testadas, somente MJ apresentou, embora baixa,
atividade antifúngica, frente á linhagem H6 (Tabela 6) nas concentrações testadas.
Segundo Holets et al. (2002), substâncias cuja concentração não ultrapassa 100 µg.mL
-
1
, são consideradas com boa atividade antifúngica. Concentrações de 100 a 500 µg.mL
-
1
são consideradas de moderada atividade, de 500 a 1000 µg.mL
-1
, baixa atividade, e
acima de 1000 µg.mL
-1
, ausência de atividade.
53
Tabela 6- Avaliação da atividade antifúngica de AJ, MJ, extrato e frações
CIM
µg.mL
-1
AJ
MJ
EXT
Fr2
Fr3
Fr4
Fr5
Fr6
Fr7
Fr8
Anfotericina B
Terbinafina
H6
-
750
1500
-
-
-
-
-
-
-
0,39
1,56
Mutante
-
-
1500
-
-
-
-
-
-
-
-
0,78
Phogpaichit e colaboradores (2007) puderam observar a atividade de extrato
proveniente da fermentação de Botryosphaeria sp. isolado de espécie de Garcinia
frente a Microsporum gypseum (SH-UM-4) com concentração de 2 µg.mL
-1
.Abdou et
al. (2010) também puderam observar atividade antifúngica de extrato acetato de etila
proveniente de Botryosphaeria rhodina, frente á Sporobolomyces salmonicolor,
Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Penicillium notatum, penicillium avellania
e Aspergillus terreus. Entretanto a diferença na atividade apresentada pelos autores, e
a não atividade do extrato neste trabalho pode ser pela linhagem de Botryosphaeria, a
qual não provém do mesmo hospedeiro da linhagem utilizada neste trabalho, pelo fato
do meio para a fermentação ter sido também diferente, o que incorre em diferentes
composições químicas desses fermentados, pois essa é linhagem e substratos
dependentes, além das linhagens testadas também diferirem.
Para o extrato as linhagens selvagem e mutante apresentaram o mesmo valor de
CIM, o que sugere que o gene TrMDR2 não participa do efluxo das substâncias
presentes no extrato. A linhagem mutante ΔTruMDR2, apresenta o gene de
transportadores ABC nocauteado, acredita-se, portanto que o mesmo seja mais
sensível à algumas drogas. Entretanto, Fachin e colaboradores (2006) também
puderam constatar que não houve diferença na resposta à alguns antifúngicos em
relação ao H6, porém em contrapartida para o antifúngico Terbinafina, por exemplo, o
mesmo mostrou-se mais sensível, evidenciando portanto, que o gene TruMDR2 é
responsável pelo efluxo desta droga .
54
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE EXTRATO E FRAÇÕES OBTIDOS
DA FERMENTAÇÃO DE B. rhodina
4.5.1. Carcinoma de colo de útero HeLa
Para a linhagem HeLa os melhores resultados foram obtidos com as frações Fr2
e Fr5, as quais inibiram na concentração de 700 µg.mL
-1
, 80,0 e 74,4% do crescimento
celular, respectivamente, valores próximos ao do MJ (90,3%). As demais frações e
extrato não alcançaram os 50% de inibição, assim como as drogas controle
Doxorrubicina (40,0%), Sulfato de Vincristina (17,5%) e AJ (4,1%) (Figuras 7 e 8).
Figura 7. % inibição do extrato e frações (700 µg.mL
-1
) frente à HeLa
55
Figura 8. % Inibição substâncias controle MJ 672 µg.mL
-1
, AJ 630,9 µg.mL
-1
,
Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
, Sulfato de Vincristina 4 µg.mL
-1
frente à HeLa. Dados
foram analisados utilizando-se teste ANOVA de uma via seguido do pós-teste de
Tukey, com p<0,001.
As frações Fr2 e Fr5 quando ensaiadas com diferentes concentrações das
amostras inibiram o crescimento da linhagem HeLa em pelo menos 50%, em
concentrações superiores a 600 µg.mL
-1
(Figura 9).
Figura 9. % Inibição Fr2 e Fr5 frente à HeLa. Dados foram analisados utilizando-
se teste ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Tukey, com p<0,001.
56
Embora as drogas controle, Doxorrubicina e Sulfato de Vincristina, sejam
indicadas principalmente nos tratamentos de câncer de mama, vários outros
tratamentos quimioterápicos fazem uso dessas drogas. O tratamento de carcinoma de
colo de útero depende do estádio de desenvolvimento da doença, e embora essas
drogas sejam utilizadas como quimioterápicos, em procedimentos adjuvantes ao
tratamento adotado, as mesmas não tem apresentado resultados satisfatórios, pois
além da porcentagem de inibição celular ser baixa apresentam ainda efeitos colaterais.
4.5.2 Adenocarcinoma de mama MCF-7
As frações Fr5 e Fr6 ao serem ensaiadas frente à linhagem MCF-7, na
concentração de 700 µg.mL
-1
, foram capazes de inibir seu crescimento em 57,8% e
50,4% respectivamente (Figura 10).
Figura 10. % inibição do extrato e frações (700 µg.mL
-1
) frente à MCF-7
Esses valores foram menores daqueles encontrados para MJ (88,4%) e
Doxorrubicina (80,6%), e maiores dos encontrados para AJ (34,0%) e Sulfato de
Vincristina (42,4%) (Figura 11).
57
Figura 11. % Inibição substâncias controle MJ 672 µg.mL
-1
, AJ 630,9 µg.mL
-1
,
Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
, Sulfato de Vincristina 4 µg.mL
-1
-1
frente à MCF-7.
Dados foram analisados utilizando-se teste ANOVA de uma via seguido do pós-
teste de Tukey, com p<0,001.
Quando ensaiadas em diferentes concentrações, tanto para a Fr5, quanto para a
Fr6, foram necessárias concentrações de 700 µg.mL
-1
para atingir inibição de pelo
menos 50% (Figura 12).
Figura 12. % Inibição Fr5 e Fr6 frente à MCF-7. Dados foram analisados
utilizando-se teste ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Tukey, com
p<0,001 para Fr5, e p<0,004 para Fr6.
58
4.5.3 Astrocitoma U343 MG-a
O extrato e todas as frações testadas frente à linhagem de astrocitoma U343
MG-a, não apresentaram inibição de pelo menos 50% (Figura 13).
Figura 13. % inibição do extrato e frações (700 µg.mL
-1
) frente à U343 MG-a
Entretanto as drogas controle MJ e Doxorrubicina apresentaram inibições de
84,6 e 62,3, respectivamente (Figura 14).
Figura 14. % Inibição substâncias controle MJ 672 µg.mL
-1
, AJ 630,9 µg.mL
-1
,
Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
, Sulfato de Vincristina 4 µg.mL
-1
frente à U343 MG-a.
Dados foram analisados utilizando-se teste ANOVA de uma via seguido do pós-
teste de Tukey, sendo considerado *p< 0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
b,d*** c*
c*** d*
d**
59
4.5.4 Melanoma murino B16-F10
As frações Fr2, Fr3, Fr4, Fr5 e Fr6 apresentaram atividade citotóxica com
inibição acima de 50% frente á linhagem B16-F10 com valores de 77,8; 90,0; 75,9; 77,0
e 88,7% respectivamente. Baseado nesses resultados verifica-se que Fr3 e Fr6
apresentaram valores semelhantes à Doxorrubicina (87,6%) enquanto que as demais
frações mostraram valores semelhantes ao MJ (79,2%) e AJ (72,9%), sendo esses
valores superiores aos do Sulfato de Vincristina (9,3%) (Figuras 15 e 16).
Figura 15. % inibição do extrato e frações (700 µg.mL
-1
) frente à B16-F10
Figura 16. % Inibição substâncias controle MJ 672 µg.mL
-1
, AJ 630,9 µg.mL
-1
,
Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
, Sulfato de Vincristina 4 µg.mL
-1
frente à B16-F10.
Dados foram analisados utilizando-se teste ANOVA de uma via seguido do pós-
teste de Tukey, sendo considerado *p< 0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
b,c** d***
c, d***
d***
60
As frações Fr2, Fr3, Fr4, Fr5 e Fr6 quando ensaiadas contra as células B16-F10
nas demais concentrações, apresentaram inibição em diferentes proporções, sendo que
Fr3 e Fr5 necessitaram de ao menos 600 µg.mL
-1
, enquanto que Fr2 e Fr6
necessitaram de 500 µg.mL
-1
e Fr4 400 µg.mL
-1
(Figura 17).
Figura 17. % Inibição Fr2 (p<0,0001), Fr3 (p<0,0001), Fr4 (p 0,0002), Fr5
(p<0,0001) e Fr6 (p<0,0001). Dados foram analisados utilizando-se teste ANOVA
de uma via seguido do pós-teste de Tukey.
4.5.5 Fibroblasto de camundongo 3T3 (normal)
Para a linhagem normal 3T3, com exceção da Fr8 e da Doxorrubicina que não
apresentaram citotoxicidade, todas as frações e extrato geraram valores abaixo de 10%
assim como AJ e Sulfato de Vincristina (Figuras 18 e 19), porém a Fr4 apresentou
46,4% de citotoxicidade. Os resultados para MJ diferem dos encontrados por Fingrut e
Flescher (2002), onde MJ não inibiu o crescimento de células 3T3. Entretanto esta
diferença pode ser explicada pelo fato da linhagem utilizada pelos autores serem
oriundas de humanos, e a apresentada neste trabalho ser de camundongo.
61
Figura 18. Avaliação da citotoxicidade do extrato e frações em 3T3
Figura 19. % Inibição substâncias controle MJ 672 µg.mL
-1
, AJ 630,9 µg.mL
-1
,
Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
, Sulfato de Vincristina 4 µg.mL
-1
frente à 3T3. Dados
foram analisados utilizando-se teste ANOVA de uma via seguido do pós-teste de
Tukey, sendo considerado *p< 0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Esses resultados evidenciam que para a inibição do crescimento dessas células
são necessárias altas concentrações das frações, que embora impuras mostram
atividade.
Neste trabalho ressalta-se, portanto, a possibilidade de utilização de pelo menos
4 frações, bem como de seus constituintes em formulações anticâncer, visto que a
b,c,d***
c** d*
d***
62
única fração que apresentou elevada citotoxicidade frente à célula normal foi a Fr4,
sendo as demais, com exceção de Fr7 e Fr8, ativas frente às diferentes linhagens
tumorais, evidenciando, atividade citotóxica seletiva.
Vale-se ressaltar ainda que as frações atuam de maneira diferencial para cada
tipo de linhagem celular, sendo específicas para determinado tipo de câncer.
Com base no perfil cromatográfico das frações pode-se sugerir que com este
trabalho, sejam identificados pelo menos 3 compostos anticâncer, visto que a Fr2
possui uma mancha específica, assim como Fr3, e Fr5 e Fr6 possuem manchas em
comum, diferentes das de Fr2 e Fr3, além de outras manchas diferentes entre si.
Assim como no trabalho descrito por Fingrut e Flescher (2002) as concentrações
das amostras testadas nesse estudo foram superiores às recomendadas pelo Instituto
Nacional do Câncer (EUA). Entretanto a ausência de toxicidade do MJ frente às células
normais, e o fato desta droga ter sido testada in vivo, pelos autores, não apresentando
também toxicidade viabilizam a possibilidade do uso deste agente no tratamento de
câncer (ROTEM et al. 2005).
Baseado nos estudos desses autores acredita-se ser de maior importância a
realização de estudos sobre possíveis efeitos colaterais dessas drogas do que a
padronização de uma concentração limite, visto os efeitos colaterais causados pelas
drogas atualmente utilizadas na quimioterapia, mesmo em baixas concentrações, visto
que os quimioterápicos não atuam somente em células tumorais.
Drogas como Ciclofosfamida e MOPP (combinação de Mecloretamina, Sulfato de
Vincristina, Procarbazina e Prednisona) embora sejam comumente utilizadas no
tratamento de câncer, também são consideradas como carcinogênicas pela Agencia
Internacional de Pesquisa do Câncer (IARC) (IARC, 1990 apud STOLLEY; ZAHM,
1995). A Ciclofosfamida tem sido associada ao aparecimento de câncer de bexiga
(IARC, 1987 apud STOLLEY; ZAHM, 1995), e algumas outras drogas ainda são
suspeitas de serem cancerígenas, como a Doxorrubicina, a qual é suspeita de causar
Leucemia (STOLLEY; ZAHM, 1995).
Além disso, embora a cada dia surjam novos medicamentos, visando á redução
dos efeitos colaterais dos quimioterápicos, muitos desses não são acessíveis aos
pacientes, principalmente por seus custos (INCA, 2010).
63
4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE AJ e MJ FRENTE À LINHAGEM
DE MACRÓFAGOS CANINOS DH82 (ATCC: CRL-10389), ORIGINADA DE UM CASO
DE HISTIOCITOSE MALIGNO CANINO.
Quando avaliamos o efeito de AJ e MJ sobre a proliferação celular de
macrófagos caninos DH-82 a maior concentração do AJ foi capaz de inibir o
crescimento da linhagem tumoral em apenas 36.5%, entretanto quando submetidas ao
tratamento com MJ, as células tiveram seu crescimento inibido em 82.2% (Figura 20),
inibição esta maior que a encontrada para a Doxorrubicina (80.7%) (Figura 21).
Devido a sua agressividade, esta neoplasia apresenta tumores resistentes à
quimioterapia convencional de forma que a incidência de morte dos animais seja alta e
num curto espaço de tempo (HAFEMAN et al., 2010).
Figura 20. % Inibição substâncias MJ e AJ, frente à DH82. Dados foram
analisados utilizando-se teste ANOVA de uma via seguido do pós-teste de
Tukey, sendo considerado *p< 0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
b*c***
c***
c*
64
Figura 21. % Inibição substâncias MJ 3mM (672 µg.mL
-1
)
, AJ 3mM (630,9
µg.mL
-1
), Doxorrubicina 4 µg.mL
-1
1
, frente à DH82. Dados foram analisados
utilizando-se teste ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Tukey, sendo
considerado *p< 0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
O câncer ainda é uma das mais importantes causas de mortalidade em animais e
humanos, principalmente na área veterinária que dispõe, na maioria das vezes,
somente de tratamentos paliativos. A Doxorrubicina embora venha sendo muito
utilizada no tratamento de oncologias caninas, mesmo em doses terapêuticas acarreta
o desenvolvimento de cardiomiopatias, caracterizadas por insuficiência cardíaca
congestiva, hipotensão, arritmias e morte súbita (MAULDIN et al., 1992; JACOBS,
1996b; HANAI et al., 1996 apud SILVA; CAMACHO, 2005).
Frente às similaridades do câncer canino e humano, os estudos da atividade de
novas drogas antitumorais podem ser úteis para o estabelecimento de novas
quimioterapias para ambas as espécies. A histiocitose canina, por exemplo, é uma
doença análoga a histiocitose humana de células Langerhans, que acomete
principalmente crianças e jovens. Dessa forma, o MJ demonstra ser uma potencial
alternativa para o desenvolvimento de um quimioterápico, que poderá ser utilizado
como alternativa adicional aos tratamentos usualmente utilizados em cães.
b***c*
c***
65
4.7 REFRACIONAMENTO DAS FRAÇÕES MAIS ATIVAS
As frações Fr2, Fr5 e Fr6 por apresentarem as melhores atividades citotóxicas
frente ás linhagens celulares testadas, foram refracionadas, visando a identificação de
seus constituintes (Tabela 7).
Tabela 7- Relação atividade citotóxica e linhagens celulares
Linhagem
celular
Fr2
Fr5
Fr6
HeLa
X
X
MCF-7
X
X
B16-F10
X
X
X
4.7.1 Refracionamento de Fr2
Após o fracionamento, a Fr2 apresentou 3 picos majoritários, os quais foram
coletados, originando 3 novas frações, denominadas de Fr2.1, Fr2.2, e Fr2.3, com
massas de 39 mg, 40 mg, 46 mg respectivamente. Os picos foram coletados em
tempos de retenção de 7,2 a 8,1 minutos para a Fr2.1, 15,5 a 16,2 minutos para a
Fr2.2. e de 22 a 22,5 para a Fr2.3 (Figura 22).
Figura 22. Perfil Cromatográfico da Fr2
66
4.7.2 Refracionamento de Fr5
A Fr5 ao ser analisada por CLAE apresentou 3 picos majoritários os quais foram
coletados, gerando 3 novas frações, denominadas de Fr5.1, Fr5.2, e Fr5.3, com
massas de 5,8 mg, 17 mg e 23 mg respectivamente. Os picos foram coletados em
tempos de retenção de 4,698 minutos para a Fr5.1, 5,121 minutos para a Fr5.2. e de
7.635 para a Fr5.3 (Figura 23).
Figura 23. Pefil Cromatográfico da Fr5
4.7.3 Refracionamento Fr6
A análise de CLAE da Fr6 apresentou 2 picos majoritários, os quais também
foram coletados, gerando duas novas frações, denominadas de Fr6.1 e Fr6.2, com
massas de 4 mg e 11 mg, respectivamente. Os picos foram coletados em tempos de
retenção de 5,114 minutos para a Fr6.1, e 7, 575 para a Fr6.2 (Figura 24).
67
Figura 24. Perfil Cromatográfico Fr6
4.8 IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES DAS FRAÇÕES MAIS ATIVAS.
4.8.1 Identificação dos constituintes de Fr2
Das 3 sub frações, Fr2.1, Fr2.2 e Fr2.3 somente a Fr2.1 pôde ser analisada por
CG/EM, por apresentar substâncias voláteis (Figura 25).
Figura 25. Perfil da Fr2.1 em CG/EM
68
A Fr2.1 evidenciou a presença de derivados de ácidos graxos, como metil-
palmitato (Figura 26), e metil oleato (Figura 27), além de compostos esteroidais, dentre
outros. A presença de ácidos graxos nesse extrato era esperada, principalmente porque
os jasmonatos são derivados do ácido linolênico, um ácido graxo poliinsaturado.
Figura 26. Espectro de massas referente ao pico em t=14,97min- Metil palmitato
69
Figura 27. Espectro de massas referente ao pico em t=19,79min – Metil oleato
4.8.2 Identificação dos constituintes de Fr5
Das 3 sub frações de Fr5, somente Fr5.3, pôde ser analisada por CG/EM, por
apresentar substâncias voláteis (Figura 28).
O cromatograma obtido por CG/EM evidenciou um pico majoritário em t= 23,770
min, que após ser submetido à análise por espectrometria de massa gerou um espectro
de fragmentação característico de jasmonatos, com alguns fragmentos típicos (m/z 151
e m/z 83), referentes respectivamente à perda de [CH
2
CO
2
Me] e ao anel pentanona
(Figura 29), porém pelo tempo de retenção no CLAE sabe não se tratar de AJ nem MJ.
O espectro de fragmentação mostra também outros sinais devido à amostra não
estar totalmente pura e apresentar ainda uma contaminação por ftalato (pico t= 24,047
min. Essa contaminação é comum pois o ftalato é arrastado pelo solvente utilizado no
preparo das amostras.
70
Figura 28. Perfil da Fr5.3 em CG/EM
71
Figura 29. Espectro de massas referente ao pico em t=23,77 minutos.
4.8.3 Identificação dos constituintes de Fr6
4.8.3.1 Fr6.1
A subfração 6.1 apresentou um pico majoritário em t= 14,17 min (Figura 30), que
após fragmentação sugere se tratar de 1H-indol-3-carboxialdeido. Em experimentos
anteriores já havia sido evidenciado a presença do ácido indol-carboxílico nos extratos
de Botryosphaeria rhodina (Figura 31).
3-Oxo-2-pent-2-enylcyclopentyl)acetic
acid
Methyl jasmonate
72
Figura 30. Perfil da Fr6.1 em CG/EM
73
Figura 31. Espectro de massas referente ao pico em t=14,17min - 1H- Indol-3-
carboxaldeido.
Abdou et al. (2010) cita o isolamento do ácido indol-β-carboxílico em filtrados de
Botryosphaeria rhodina, sugerindo ter esse uma possível função na interação planta-
microrganismo, visto este fungo ser endofítico de algumas espécies vegetais. O ácido
indol-carboxílico possui atividade reguladora de crescimento vegetal, semelhante à
auxina ácido indol-acético (AIA).
4.8.3.2 Fr6.2
A Fr6.2 não pôde ser analisada por CG/EM.
Devido à quantidade de massa das frações obtidas terem sido insuficientes para
possibilitar uma identificação segura dos compostos majoritários presentes no extrato,
74
novas fermentações serão feitas visando acúmulo de material em quantidade que
permita a continuidade dos estudos.
Embora o estudo dos constituintes químicos presentes nas frações ainda não
esteja terminado, as análises cromatográficas sugerem não se tratarem todas de
jasmonatos, evidenciando a participação de outros compostos com diferentes
potenciais citotóxicos.
A identificação dos constituintes do extrato torna-se necessário para que seja
possível relacionar as atividades obtidas com as substâncias produzidas pelo fungo
Botryosphaeria rhodina.
75
5 CONCLUSÕES
- Conclui-se que o microrganismo B. rhodina através de fermentação em meio M
2
é capaz de produzir AJ e outros metabólitos secundários.
- Através da CC foi possível obter 8 frações com perfis cromatográficos distintos.
- As análises por CG/EM evidenciaram a presença de ácidos graxos e
jasmonatos nas frações analisadas.
- Nenhuma das amostras testadas apresentou atividade antibacteriana nas
condições avaliadas.
- Das amostras analisadas, somente MJ apresentou, embora baixa, atividade
antifúngica, evidenciando, portanto que AJ, extrato e frações não apresentaram
atividade.
- A citotoxicidade das frações testadas é linhagem dependente, de forma que Fr5
seguida de Fr2 e Fr6 foram as que apresentaram mais incidência de citotoxicidade
frente às linhagens testadas.
- As frações Fr2, Fr3, Fr5 e Fr6 apresentam compostos com seletividade
citotóxica, para as células cancerígenas quando comparadas às normais, além de
seletividade entre as linhagens cancerígenas.
- Com os ensaios cromatográficos e ensaios citotóxicos, conclui-se que com este
trabalho foi possível identificar pelo menos 3 compostos diferentes com atividade
citotóxica.
- Quanto à linhagem de macrófagos caninos DH82 MJ foi capaz de inibir o
crescimento celular, de forma semelhante às linhagens humanas testadas.
76
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Além das atividades biológicas citadas neste trabalho, outros estudos foram
realizados, como a avaliação da atividade inibitória de AJ, MJ e do extrato
proveniente da fermentação de Botryosphaeria rhodina frente à enzima
acetilcolinesterase (AchE), a qual está envolvida na doença de Alzheimer. Neste
estudo nenhuma das amostras testadas apresentou atividade.
Durante este período também avaliou-se a ação de jasmonatos em parasitas,
a qual não foi descrita neste trabalho, pois encontra-se em processo de patente.
As diversas atividades atribuídas aos jasmonatos, bem como aos metabólitos
produzidos por Botryosphaeria rhodina, evidenciam a necessidade da escala de
produção dessas moléculas, bem como a identificação dos metabólitos produzidos
por este microrganismo, visando seu uso em diversos setores industriais, como
agroindústria, indústria alimentícia e farmacêutica.
77
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