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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
RIZÓBIOS, PARA Lotus spp, RESISTENTES À ACIDEZ
E À SALINIDADE DO SOLO
Adriana Ferreira Martins
(Dissertação)
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
RIZÓBIOS, PARA Lotus spp, RESISTENTES À ACIDEZ
E À SALINIDADE DO SOLO
ADRIANA FERREIRA MARTINS
Bióloga (PUCRS)
Dissertação apresentada como
um dos requisitos para obtenção do
Grau de Mestre em Ciência do Solo
Porto Alegre (RS) Brasil
Abril de 2010
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i
ii
Aos meus pais, Ary e Fátima, pelos
ensinamentos de respeito e justiça, e
aos meus irmãos, Alexandre e
Adriano, companhias incondicionais
na jornada da vida, dedico essa
conquista.
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus por me conceder serenidade, saúde e a possibilidade de
realizar tudo o que desejo, sempre em direção à paz.
Ao meu orientador Enilson Luiz Saccol de Sá meu agradecimento
pela oportunidade, ensinamentos, dedicação e empenho na orientação deste
trabalho.
Ao colega da FEPAGRO, Luciano Kayser Vargas pelos
ensinamentos, paciência, amizade, colaboração na realização deste trabalho e
confiança a mim dedicados.
Aos colegas, professores e funcionários do Departamento de Solos
da UFRGS pelo auxílio e amizade.
Aos colegas Bruno Brito Lisboa e Gilson Schlindwein, da FEPAGRO,
e aos estagiários do Laboratório de Fitopatologia e Ecologia Microbiana da
FEPAGRO pela colaboração e amizade.
Aos meus pais Ary e Fátima pelo apoio e incentivo que sempre
recebi, tendo sempre como conselho, a calma necessária e a obstinação por
aquilo que deseja.
Aos meus irmãos Alexandre e Adriano pela amizade incondicional,
pelo amor, carinho, apoio, pela ajuda em todos os momentos da minha vida, e
também pelas longas conversas e desabafos.
A minha sobrinha-afilhada Giovanna pelos momentos de alegria e
descontração.
Ao Flávio Pereira de Oliveira pelo amor, compreensão e apoio.
A todos os meus amigos que sempre acreditaram em mim e
torceram mesmo de longe para a realização deste trabalho.
iv
RIZÓBIOS, PARA Lotus spp, RESISTENTES À ACIDEZ
E À SALINIDADE DO SOLO
(1)
Autora: Adriana Ferreira Martins
Orientador: Enilson Luiz Saccol de Sá
RESUMO
Espécies com potencial forrageiro adaptadas aos solos do Rio Grande do Sul,
como L.corniculatus, L.glaber, L.subbiflorus e L.uliginosus, se destacam pela
capacidade de fixação simbiótica de nitrogênio, boa produção e tolerância à
acidez e baixa fertilidade dos solos. A seleção de rizóbios para Lotus,
resistentes a baixo pH, a alumínio tóxico e à salinidade é fundamental para a
implantação e aumento da produção destas leguminosas no estado. Foram
avaliados 52 rizóbios da coleção de culturas da UFRGS quanto à resistência a
pH 4,2 e a 50µM de alumínio tóxico em meio mínimo de Wood e Cooper
(MWC) modificado e quanto à resistência a diferentes concentrações de NaCl e
KCl em meio Levedura-Manitol (LM) a pH 6,8. A diversidade genética de
rizóbios de Lotus spp foi avaliada usando-se PCR com os oligonucleotídeos
iniciadores BOX A1-R, ERIC e RISA, sendo o perfil eletroforético dos produtos
da amplificação do DNA genômico de cada rizóbio analisado e construído um
dendrograma de similaridade. Entre os isolados resistentes a pH 4,2 e a 50µM
de Al
3+
, sete foram avaliados quanto à eficiência simbiótica com plantas em
casa de vegetação. Entre os rizóbios estudados, 16 foram resistentes a pH 4,2
e a 50µM de alumínio, 11 foram resistentes até concentrações de 12gL
-1
de
NaCl e seis foram resistentes até a 20gL
-1
de KCl. Foram selecionados rizóbios
para Lotus spp resistentes à acidez e ao estresse salino. Observou-se alta
diversidade genética, indicando que os rizóbios estudados não são
reisolamentos de estirpes utilizadas em inoculantes para as espécies de Lotus
estudadas.
(1)
Dissertação de Mestrado em Ciência do Solo, Programa de Pós-Graduação em Ciência do
Solo, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre.
(81p.) abril, 2010.
v
RHIZOBIA, FOR Lotus spp, RESISTANT ACID AND SALINITY SOIL
(1)
Author: Adriana Ferreira Martins
Adviser: Enilson Luiz Saccol de Sá
ABSTRACT
Species with forage potential adapted to the soils from the state of Rio Grande
do Sul, such as L.corniculatus, L.glaber, L.subbiflorus and L.uliginosus, stand
out for their capacity of symbiotic nitrogen fixation, good production and
tolerance to acid and low-fertility soils. Selection of rhizobia that are resistant a
low pH, aluminum toxicity and salinity, is fundamental to establishing and
increasing the production of to Lotus legumes in this state. In the present
research, 52 rhizobia, from the culture collection of UFRGS, were assessed for
resistance to pH 4.2 and 50µM of aluminum in modified minimal Wood and
Cooper medium (MWC), and for resistance to different concentrations of NaCl
and KCl in yeast mannitol medium (LM) at pH 6.8. The genetic diversity of Lotus
spp rhizobia was assessed by using PCR with the primers BOX-A1 R, ERIC
and RISA. The electrophoretic profile of the PCR products from each rhizobium
was analyzed and a dendrogram of similarity was built. Among the isolates that
were resistant to pH 4.2 and 50µM of Al
3+
, seven were assessed for symbiotic
efficiency with plants in the greenhouse. Among the studied rhizobia, 16 were
resistant to pH 4.2 and 50µM of aluminum, 11 were resistant to concentrations
of 12gL
-1
NaCl and six were resistant to the 20gL
-1
KCl. It was possible to select
Lotus spp rhizobia resistant to acidity and salinity stress. A high genetic
diversity was observed, indicating that the studied rhizobia were not reisolations
of strains used in inoculants for Lotus species.
(1)
M. Sc. Dissertation in Soil Science, Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo,
Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre. (81p.)
april, 2010.
vi
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO....................................................................................
01
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...............................................................
03
2.1. Simbiose entre rizóbios e leguminosas............................................
03
2.2. Características do gênero Lotus.......................................................
05
2.3. Fatores que interferem na nodulação e na fixação do N
2.........................
07
2.3.1. Acidez do solo............................................................................... 08
2.3.2. Salinidade do solo......................................................................... 09
2.4. Produção de melanina......................................................................
11
2.5. Produção de sideróforos.................................................................. 12
2.6. Germinação e desenvolvimento de plântulas...................................
15
2.7. Variabilidade genética dos isolados de rizóbios...............................
16
3. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................
18
3.1. Resistência dos rizóbios a pH 4,2.................................................... 19
3.2. Resistência dos rizóbios a alumínio tóxico.......................................
20
3.3. Resistência dos rizóbios a estresse salino por alta concentração
de cloreto de sódio e de cloreto de potássio...........................................
21
3.4. Produção de melanina......................................................................
22
3.5. Produção de sideróforos.................................................................. 23
3.6. Avaliação da eficiência dos rizóbios na fixação simbiótica de
nitrogênio.................................................................................................
24
3.7. Avaliação da influência dos rizóbios na germinação e no vigor de
plântulas.................................................................................................. 25
3.8. Caracterização genética dos isolados de rizóbios........................... 26
3.8.1. Extração do DNA genômico dos rizóbios...................................... 27
3.8.2.Amplificação do DNA genômico por oligonucleotídeos iniciadores
BOX A1-R, ERIC e RISA.........................................................................
27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................
30
4.1. Resistência dos rizóbios a pH 4,2 e a alumínio tóxico..................... 30
4.2. Resistência dos rizóbios ao estresse salino por alta concentração
de cloreto de sódio e de cloreto de potássio..........................................
34
4.3. Produção de melanina......................................................................
43
4.4. Produção de sideróforos.................................................................. 44
4.5. Avaliação da eficiência dos rizóbios na fixação simbiótica de
nitrogênio.................................................................................................
45
4.6. Avaliação dos rizóbios na germinação e no desenvolvimento de
plântulas..................................................................................................
49
4.7. Caracterização genética dos isolados de rizóbios........................... 51
5. CONCLUSÕES...................................................................................
56
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................
57
7. APÊNDICES........................................................................................
74
vii
RELAÇÃO DE TABELAS
Página
1.
Isolados de rizóbios nativos para Lotus spp da coleção de
culturas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
estudados e localidades das amostras de solo de onde foram
obtidos.........................................................................................
19
2.
Condutividade elétrica das diferentes concentrações de NaCl
por litro de meio LM líquido......................................................... 22
3.
Condutividade elétrica das diferentes concentrações de KCl
por litro de meio LM líquido.........................................................
22
4.
Características químicas do solo Argissolo Vermelho-Amarelo
distrófico típico coletado na Unidade de Viamão da
FEPAGRO................................................................................... 25
5.
Crescimento de rizóbios de Lotus
spp em meio com pH 4,2 e
com 50µM de alumínio tóxico, após sete dias de incubação em
meio MWC modificado................................................................ 31
6.
Valores do pH do caldo por rizóbios de Lotus spp ao final do
período de incubação (7 dias)..................................................... 35
7.
Crescimento de rizóbios de Lotus spp em meio levedura-
manitol com diferentes concentrações de NaCl, após sete dias
de incubação............................................................................... 37
8.
Crescimento de rizóbios de Lotus spp em meio levedura-
manitol com diferentes concentrações de KCl, após sete dias
de incubação............................................................................... 40
9.
Número de nódulos e da massa seca de nódulos, e produção
de massa seca e nitrogênio total da parte aérea de plantas de
Lotus corniculatus L. cv. São Gabriel inoculados com isolados
de rizóbios e estirpes liberadas para produção de inoculantes...
46
10.
Efeito da inoculação com rizóbios sobre a germinação e o
desenvolvimento de plântulas de Lotus corniculatus L. cv. São
Gabriel......................................................................................... 50
viii
RELAÇÃO DE FIGURAS
Página
1.
Regressão linear das diferentes concentrações de NaCl e de
KCl, em meio levedura e manitol, sobre os isolados e estirpes
de rizóbios de Lotus spp...............................................................
43
2.
Índice de eficiência relativa na fixação simbiótica de nitrogênio
em plantas de Lotus corniculatus inoculadas com isolados de
rizóbios e estirpes SEMIA 806 e SEMIA 816 (Médias
comparadas pelo teste de Scott Knott, ao nível de 5% de
probabilidade)............................................................................... 48
3.
Exemplos de géis contendo o perfil eletroforético de bandas do
produto da amplificação do DNA genômico por PCR com o
oligonucleotídeo iniciador BOX A 1-R.......................................... 51
4.
Exemplos de géis contendo o perfil eletroforético de bandas do
produto da amplificação do DNA genômico por PCR com os
oligonucleotídeos iniciadores ERIC (ERIC1-R e ERIC-2)............ 52
5.
Exemplos de géis contendo o perfil eletroforético de bandas do
produto da amplificação do DNA genômico por PCR com os
oligonucleotídeos iniciadores RISA (SD-Bact-1522-bS-20 e LD-
Bact-132-aA-18)...........................................................................
53
6.
Dendrograma de genotipagem de estirpes e isolados de
rizóbios, autóctones em solos do Rio Grande do Sul, simbiotes
em quatro espécies de Lotus. Agrupamento obtido pelo
coeficiente de Jaccard, para perfil de bandas obtido a partir da
PCR com os oligonucleotídeos iniciadores BOX A1-R, ERIC e
RISA............................................................................................. 54
ix
RELAÇÃO DE APÊNDICES
Página
1.
Meio extrato de levedura, manitol, ágar – LMA (Vincent, 1970).....
75
2.
Composição do meio de cultura MWC........................................... 76
3.
Meio triptona levedura – TY (Somasegaram e Hoben, 1994)........ 77
4.
Meio extrato de levedura e manitol – LM (Vincent, 1970).............. 78
5.
Solução de brometo hexadeciltrimetilamonio (HDTMA) 10mM...... 79
6.
Solução Férrica (FeCl
3
.6H
2
O 1mM e HCl 0,01N)........................... 79
7.
Meio de King B – KMB (King et al., 1954)....................…………… 80
8.
Meio de Murashige e Skoog (1962) – MS...................................... 81
1. INTRODUÇÃO
No Rio Grande do Sul, a produção estacional de plantas forrageiras
impõe aos pecuaristas uma considerável redução na produtividade, já que a
carga animal é regulada pela situação predominante no verão, época de maior
pico de desenvolvimento das pastagens nativas. Uma das alternativas
utilizadas pelos produtores para assegurar a produção animal, sem
desconsiderar a importância das espécies nativas, é a introdução de
leguminosas exóticas hibernais que, além de produzirem forragem de boa
qualidade, atuam como melhoradoras do solo, pela sua capacidade de fixação
biológica de nitrogênio.
Entre as leguminosas com grande potencial forrageiro encontram-se
algumas espécies do gênero Lotus, como L. corniculatus, L. glaber, L.
subbiflorus e L. uliginosus. Estas espécies apresentam uma série de
vantagens, como a boa produção de forragem, boa adaptação a solos de baixa
fertilidade, tolerância a solos ácidos e capacidade de fixação simbiótica de
nitrogênio, além de não provocar o timpanismo em animais ruminantes, o que
tornam estas leguminosas importantes para o estudo e introdução em áreas de
pecuária do Rio Grande do Sul.
A simbiose entre as leguminosas e rizóbios pode suprir grande parte
ou a totalidade do nitrogênio necessário ao desenvolvimento e produtividade
das leguminosas. Entretanto, para que isto ocorra, a leguminosa deve estar
eficientemente nodulada pelo rizóbio específico. A nodulação é dependente de
uma série de fatores envolvendo a leguminosa, o rizóbio, o solo e a interação
dos três. A ação conjunta desses fatores poderá limitar ou estimular a
nodulação o que irá se refletir sobre a quantidade de N
2
fixado e sobre a
2
produtividade da leguminosa. Dentre os principais fatores abióticos que afetam
o potencial da fixação biológica de nitrogênio encontram-se a acidez e toxidez
de alumínio, a salinidade e a baixa fertilidade do solo.
O pH do solo constitui um dos principais fatores limitantes na fixação
de nitrogênio pelas leguminosas, devido ao retardamento ou supressão da
formação de nódulos. A acidez do solo vem normalmente associada com
toxidez de alumínio e baixa disponibilidade de nutrientes essenciais para a
simbiose. A acidez dos solos do Sul do Brasil, associada a uma grande
concentração de alumínio, representa um sério problema para adaptação de
diferentes vegetais e microrganismos.
Alguns solos que apresentam risco de desertificação, são
ameaçados por uma possível salinização. Nos casos que está prevista a
utilização de leguminosas forrageiras em locais afetados por este problema,
torna-se necessário avaliar os efeitos da salinidade nos rizóbios a introduzir,
dado que, nestas condições, a produtividade agrícola vai depender da
capacidade do sistema simbiótico rizóbio-leguminosa tolerar os aumentos da
salinidade do solo.
Logo, os rizóbios precisam lidar com os estresses ambientais e,
entre muitas características, conseguir apresentar resistência a baixo pH e
alumínio tóxico, assim como a salinidade, conseguindo, portanto, induzir a
nodulação e realizar a fixação do nitrogênio atmosférico. Assim, a seleção de
isolados de rizóbios, para Lotus, que possuam alta capacidade fixadora de
nitrogênio, resistência à acidez e ao alumínio tóxico, e resistência à salinidade,
é fundamental para a produção e utilização de inoculantes pelos agricultores
para o incremento na produção desta leguminosa no Estado.
Este trabalho se baseou na hipótese de que rizóbios, para Lotus
spp, resistentes à acidez e à salinidade do solo podem ser isolados de solos do
Rio Grande do Sul e ser capazes de induzir nodulação e fixar nitrogênio em
simbiose mesmo em solos ácidos.
Os objetivos deste trabalho foram selecionar e avaliar, entre os
isolados de rizóbios nativos para plantas de Lotus spp, da coleção de culturas
da UFRGS, aqueles resistentes a pH baixo, elevados teores de Al
3+
tóxico e à
alta salinidade; e avaliar a eficiência na fixação simbiótica de nitrogênio destes
rizóbios ourindos de solos agrícolas do Rio Grande do Sul.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Simbiose entre rizóbios e leguminosas
O nitrogênio é considerado um dos nutrientes mais limitantes para o
crescimento de plantas no seu ambiente natural. Mesmo este sendo
extremamente abundante na atmosfera terrestre, com cerca de 79% de gás
dinitrogênio (N
2
) (Simms e Taylor, 2002). Assim, a introdução do nitrogênio
atmosférico, via fixação biológica do nitrogênio, tem efeitos positivos no
ambiente e na economia (Silva, 2006).
Na natureza, bactérias fixadoras de nitrogênio são capazes de
reduzir nitrogênio atmosférico à amônia. Esse processo, chamado de fixação
biológica do nitrogênio, é realizado pela enzima nitrogenase, um complexo
protéico que catalisa a reação (Simms e Taylor, 2002; Silva, 2006; Silva et al.,
2006). A enzima nitrogenase é composta por duas unidades básicas: uma
ferro-proteína que coleta a força redutora e energia e outra ferro-molibdênio,
proteína que coleta e reduz o substrato (Moreira e Siqueira, 2006; Fagan et al.,
2007).
Dentre as associações entre bactérias fixadoras de nitrogênio e
plantas, a que ocorre entre bactérias denominadas rizóbios e leguminosas é a
mais conhecida. Os gêneros como Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium,
Mesorhizobium e Azorhizobium, fazem parte do grupo dos rizóbios capazes de
induzir a formação de nódulos em diversas espécies de leguminosas. As
leguminosas quando em associação com os rizóbios formam estruturas em
suas raízes, denominadas nódulos, nos quais ocorre o processo de fixação do
nitrogênio atmosférico que é utilizado pela planta para o seu desenvolvimento.
4
A formação dos nódulos é um processo complexo que ocorre em
várias etapas e envolve mudanças fisiológicas e morfológicas, tanto na célula
hospedeira, quanto na bactéria. As mudanças na bactéria visam o recebimento
de fontes de carbono da planta hospedeira, para prover o ATP e poder redutor
necessários para o processo de fixação biológica do nitrogênio, enquanto que
as mudanças na planta hospedeira visam assimilar a amônia produzida pelas
bactérias (Hungria e Campo, 2005; Silva, 2006).
O estabelecimento da simbiose depende das seguintes etapas
fundamentais: pré-infecção – reconhecimento dos simbiontes e interações
entre superfícies das bactérias e da planta; infecção da planta pela bactéria e
formação do nódulo; funcionamento dos nódulos – fixação de nitrogênio. Essas
etapas podem variar em função dos genótipos da planta e do rizóbio envolvido,
bem como de fatores ambientais.
O reconhecimento inicial dos simbiontes é realizado por meio de
moléculas exsudadas pela planta que ativam os genes de nodulação (genes
nod) da bactéria. Uma vez ativados, começa a ocorrer à síntese dos chamados
fatores nod que induzem o início do processo de infecção no hospedeiro o qual
leva à nodulação, desempenhando papel importante na especificidade
hospedeira. No processo de aderência estão envolvidos diferentes tipos de
polissacarídeos extracelulares e moléculas com propriedades antigênicas de
reação cruzada, capazes de promover o reconhecimento dos parceiros da
simbiose, garantindo a interação física entre si. Muitas espécies de rizóbio
produzem microfibrilas celulósicas que servem para ancorar a bactéria à
superfície radicular, permitindo reações bioquímicas que desencadeiam
encurvamento do pêlo radicular e a penetração. O processo de infecção pode
ser através da epiderme ou de pêlos radiculares, sendo com ou sem cordão de
infecção, ocasionando multiplicação das bactérias ao redor do pêlo, ligação das
bactérias ao pêlo, encurvamento dos pêlos, infecção seletiva do hospedeiro,
formação e crescimento do cordão de infecção e liberação das bactérias nas
células do córtex (Freire, 1992; Simms e Taylor, 2002; Haynes et al., 2004;
Matiru e Dakora, 2004; Moreira e Siqueira, 2006).
Genes do hospedeiro, especificamente expressos durante a
formação e funcionamento dos nódulos, denominados “genes de nodulinas”
levam à produção de nodulinas, proteínas vegetais que se acumulam nos
5
nódulos e têm funções especificas no processo de fixação biológica do
nitrogênio. Neste processo estão envolvidas as nodulinas mais conhecidas
como a leghemoglobina e enzimas envolvidas no processo de assimilação do
nitrogênio fixado como a glutamina sintetase e o glutamato sintase. A
leghemoglobina tem a importante função de transportar oxigênio em taxas
suficientes para o metabolismo aeróbio dos bacteróides, sem excessos que
possam inibir a atividade da nitrogenase (Simms e Taylor, 2002; Moreira e
Siqueira, 2006).
O rizóbio, sob a forma de bacteróide, presente no interior de células
infectadas dos nódulos radiculares de leguminosas, possui as enzimas
assimilativas para a amônia; essas estão presentes em concentrações muito
baixas, de modo que a amônia produzida é exportada pelo bacteróide para a
célula vegetal infectada que contém grandes quantidades de enzimas
assimilatórias da amônia, principalmente glutamina sintetase e glutamato
sintase (Freire, 1992).
As espécies de rizóbios não produzem nodulação e fixação do
nitrogênio com qualquer leguminosa, é necessário que haja um certo grau de
especificidade entre os dois componentes da associação. Consequentemente,
a nodulação é dependente de uma série de fatores envolvendo a leguminosa, o
rizóbio, o solo e a interação dos três. A ação conjunta desses fatores poderá
limitar ou estimular a nodulação o que irá se refletir sobre a quantidade de N
2
fixado e sobre a produtividade da leguminosa.
2.2. Características do gênero Lotus
Algumas espécies do gênero Lotus, como L. corniculatus, L. glaber,
L. subbiflorus e L. uliginosus, apresentam uma série de vantagens que podem
permitir o seu uso com sucesso na região sul do Brasil, como: a boa produção
de forragem; o crescimento sob baixa disponibilidade de fósforo; a boa
adaptabilidade a solos ácidos, além do conteúdo de tanino, que beneficia o
comportamento animal, atuando como regulador do consumo, permitindo uma
maior persistência da espécie. Os dados agronômicos indicam diferenças no
desempenho entre e dentro de espécies, indicando a existência de
variabilidade disponível para os melhoristas atuarem no sentido de buscar
6
adaptação a ambientes adversos. Vários mecanismos levam a planta a
sobreviver e produzir sob condições adversas. No entanto, o melhoramento
convencional para tolerância a estresses abióticos é uma tarefa desafiadora e
lenta. Este usualmente envolve características complexas e de difícil avaliação.
Como uma alternativa, a caracterização de genótipos para tolerância a
determinado estresse, seguida da formação de linhas parentais contrastantes e
uso de seleção assistida, pode auxiliar no desenvolvimento de genótipos
tolerantes de maneira mais consistente (Santos et al., 2006).
O gênero Lotus L. pertence à família Fabaceae, subfamília
Papilionoideae, tribo Loteae (Izaguirre e Beyhaut, 1998) e compreende de 125
a 180 espécies (Santos, 2007). Este é composto por espécies perenes e
anuais, cultivadas como pastagens e para produção de feno em várias partes
do mundo, sendo que muitas são citadas como espécies pioneiras, uma vez
que se adaptam em solos ácidos, com baixa fertilidade e sob condições de
pastejo (Maroso, 2006). As espécies do gênero estão distribuídas no mundo
inteiro, com exceção das regiões árticas muito frias e áreas tropicais baixas do
sudeste da Ásia, das Américas do Sul e Central (Allen e Allen, 1981; Maroso,
2006). Quatro espécies têm sido mais difundidas como forrageiras, pela sua
grande representação nas regiões temperadas: Lotus uliginosus Schkuhr
(cornichão-dos-banhados), L. corniculatus L. (cornichão), L. subbiflorus Lag. (el
Rincón) e L. glaber Mill. (=Lotus tenuis Waldst. et. Kit. ex Wild.).
O cornichão (L. corniculatus L.) se destaca pela sua boa produção,
tolerância a solos ácidos e de baixa fertilidade e por não provocar timpanismo
(Maroso, 2006), e por possuir características incomuns à maioria das
leguminosas forrageiras, como pronta formação de gemas adventícias de
raízes quando a coroa é removida e a versatilidade de uso tanto para pastejo
quanto para feno (Scheffer-Basso et al., 2005). No Brasil, o único cultivar
disponível é o São Gabriel, desenvolvido pela Estação Experimental de São
Gabriel, atual Fepagro Forrageiras, no Rio Grande do Sul, a partir de pesquisas
realizadas entre 1955 e 1965, tendo seu cultivo se expandido para outros
países da América do Sul (Paim, 1988; Soster et al., 2004).
Quanto ao L. uliginosus Schkuhr, de hábito rizomatoso, os trabalhos
na região sul são mais recentes. O cv. Maku tem mostrado problemas relativos
ao florescimento, restringindo seu cultivo no sul do Brasil, em razão da baixa
7
produção de sementes. Essa característica parece estar aliada ao
florescimento esparso ou, até mesmo, à ausência de florescimento no ano de
estabelecimento. Na Austrália, o interesse por essa leguminosa aumentou com
o reconhecimento de suas características, como não provocar timpanismo;
aumentar a absorção de aminoácidos no rúmen; ser resistente a insetos;
possuir habilidade de superar as produções de trevo branco (Trifolium repens
L.) em solos com pH inferior a 5,2; tolerar solos alagados e ser eficiente na
absorção de fósforo (Scheffer-Basso et al., 2005).
Lotus glaber Mill. é uma forrageira perene, de crescimento prostado
que se ajusta a ambientes úmidos de clima temperado (Blumenthal e McGraw,
1999). Mendoza et al. (2005) citam que essa leguminosa tem grande
importância na pastagem de campo inundado na região centro-oeste da
Argentina. E essa é valorizada pelos agricultores, devido à sua capacidade de
produzir forragem nutricional para bovinos em solos deficientes em nutrientes.
A espécie Lotus subbiflorus Lag. possui hábito semi-ereto, mas sob
pastejo freqüente adota porte prostrado (Carámbula et al., 1994), é uma planta
herbácea anual ou bianual (Izaguirre e Beyhaut, 1998). Adapta-se a uma ampla
classe de solos (Risso e Carámbula, 1998; Ayala e Bermúdez, 2001), inclusive
superficiais ácidos e de baixa fertilidade; também apresenta boa persistência
sobre solos rasos (Ayala e Bermúdez, 2001). No Rio Grande do Sul tem
aparecido espontaneamente em pastagens nativas, provavelmente como
impureza de lotes de sementes de outras espécies importadas do Uruguai
(Scheffer-Basso et al., 2002).
As espécies como Lotus corniculatus e L. glaber geralmente
estabelecem associações efetivas com rizóbios das espécies do gênero
Mesorhizobium sp. (Baraibar et al., 1999; Labandera, 2007), enquanto que
espécies como L. subbiflorus e L. uliginosus o fazem preferencialmente com
Bradyrhizobium sp. (Irisarri et al., 1996).
2.3. Fatores que interferem na nodulação e na fixação do N
2
Na simbiose das leguminosas com o rizóbio, o nódulo representa um
abrigo para a bactéria. Porém, ao se tornar parte do sistema simbiótico, o
rizóbio passa a ser afetado por qualquer fator que diminua o vigor da planta,
8
como deficiências nutricionais, condições ambientais sub-ótimas, entre
diversos outros fatores que podem interferir no processo de nodulação e
fixação do nitrogênio.
2.3.1. Acidez do solo
Mais de um quarto dos solos cultiváveis do mundo são ácidos, o que
torna o estudo dos mecanismos implicados na sobrevivência ao estresse ácido
de grande importância para a agricultura (Muglia, 2007). Fatores da acidez do
solo, como pH baixo e concentrações elevadas de alumínio tóxico,
frequentemente, limitam todas as etapas do processo de infecção das raízes,
formação de nódulos e assimilação do N pela planta (Pelegrin et al., 2009).
Sendo assim, a capacidade dos rizóbios de se adaptarem a estas condições
adversas é fundamental para o estabelecimento de uma simbiose eficiente.
O pH do solo constitui um dos principais fatores limitantes na fixação
de nitrogênio pelas leguminosas, devido ao retardamento ou supressão da
formação de nódulos. Seus efeitos podem ser diretos, através da influência
sobre a sobrevivência da bactéria, ou indiretamente pela maior ou menor
disponibilidade de nutrientes e presença de elementos tóxicos. A acidez do
solo vem normalmente associada com toxidez de alumínio e manganês, baixa
disponibilidade de nutrientes como cálcio, magnésio e molibdênio, essenciais
para a simbiose (Vidor et al., 1983; Tsai et al., 1992).
A exposição de isolados de rizóbio à acidez diminui o crescimento,
sugerindo que alguns processos citoplasmáticos da bactéria são sensíveis a
esse fator. Em meio ácido ocorre uma diminuição da síntese de proteínas pelas
bactérias, o que também pode afetar o crescimento bacteriano (Hara e Oliveira,
2004). O número de rizóbios em solos corrigidos chega a 10
5
unidades
formadoras de colônia (UFC)g
-1
, enquanto que em solos ácidos esse valor não
ultrapassa 10
2
UFC.g
-1
(Brockwell et al., 1991).
Em solos muito ácidos ocorre dissolução de alumínio, que passa a
ser um componente de acidez potencial. O alumínio é, assim, causa da acidez
excessiva de solos (Bohnen, 1995; Silva et al., 2006). Na maioria dos solos
brasileiros, o teor de alumínio livre frequentemente atinge níveis tóxicos para as
plantas, sendo muitas vezes, fator limitante ao aumento da produtividade das
9
culturas (Bertan et al., 2005). Nesses solos, ocorre a diminuição na
disponibilidade de alguns nutrientes, como o fósforo, e aumento da
disponibilidade do manganês e alumínio, os quais, dependendo do manejo do
solo e da adubação utilizada, podem atingir níveis tóxicos às plantas. O
alumínio determina pequeno crescimento de raízes, menor volume de solo
explorado e prejuízos na absorção de água e nutrientes, o que promove
redução no tamanho de folhas e na matéria seca acumulada na parte aérea
(Sangoi et al., 2008). O alumínio em solos com pH baixo, geralmente menor
que 5,0, provoca decomposição nas estruturas minerais da argila migrando
para a fração trocável ou para a solução do solo (Bertan et al., 2005).
Os efeitos do excesso de alumínio no solo, sobre a disponibilidade
do nitrogênio simbiótico para as leguminosas, podem ser divididos em: efeito
inibitório sobre a formação de nódulos devido aos prejuízos físicos sobre o
sistema radicular; efeito inibitório sobre a formação e funcionamento dos
nódulos, devido à restrição na absorção e/ou translocação de nutrientes (Vidor
et al., 1983). A tolerância de rizóbios ao pH baixo depende da habilidade em
manter o pH intracelular entre 7,2 e 7,5 quando o pH externo é ácido. E em
relação à tolerância ao alumínio, os mecanismos encontrados em isolados de
rizóbios são: diminuição da quantidade de cargas negativas na superfície
celular diminuindo a ligação com o alumínio (Bushby, 1990); elevação do pH
interno da célula (O’hara et al., 1989); complexação do alumínio por
polissacarídeos (Flis et al., 1993); acumulação de fosfato inorgânico no interior
da célula (Mukherjee e Asanuma, 1998) neutralizando o efeito do alumínio pela
formação de complexo insolúvel biologicamente não tóxico (Blamey et al.,
1983).
2.3.2. Salinidade do solo
A salinização do solo constitui uma das mais sérias formas de
degradação dos recursos edáficos e, em áreas secas, caracteriza-se como um
fenômeno complexo causado pela interação entre fatores biofísicos e sócio-
econômicos (Nóbrega et al., 2004). Excessos de sais solúveis afetam mais de
4x10
6
km
2
de terras potencialmente aráveis do mundo (Singleton et al., 1982).
O excesso de sais solúveis provoca uma redução do potencial
10
hídrico do solo (Nóbrega et al., 2004). Em geral, solos salinos contêm valores
muito baixos de nitrogênio, não adequados para o cultivo da maioria das
plantas (Raij, 1991; Freitas et al., 2007), comprometendo o crescimento e
distribuição das raízes assim como a absorção de água e nutrientes, porque a
salinidade diminui o potencial osmótico próximo à rizosfera, dificultando o fluxo
dos íons até as raízes (Silva et al., 2001).
Uma solução apropriada para a situação é o cultivo da plantas
capazes de fixar nitrogênio através da simbiose rizóbio-leguminosa, como por
exemplo Acacia spp, Vicia faba, Stylosanthes guianensis, entre outras
leguminosas. Entretanto, não somente a maioria das plantas, mas também os
rizóbios são sensíveis à salinidade (Nogales et al., 2002; Freitas et al., 2007)
tanto na fase de vida livre quanto durante o processo simbiótico (Domínguez-
Ferreras et al., 2009).
Os íons tóxicos mais proeminentes em solos salinos são Na
+
, K
+
,
Ca
2+
, Cl
-
, SO
4
2+
, BO
3
3-
e HCO
3-
, sendo que NaCl e KCl apresentam toxicidades
semelhantes em diferentes espécies de rizóbios (Elsheikh, 1998).
Condições salinas podem limitar a simbiose afetando a
sobrevivência e proliferação de rizóbios no solo e na rizosfera, inibindo o
processo de infecção, afetando diretamente a função do nódulo nas raízes ou
reduzindo o crescimento das plantas (Singleton et al., 1982; Singh et al., 2008).
O excesso de sais podem ter um efeito negativo sobre as populações de
rizóbios como resultado de toxicidade direta, bem como através de estresse
tanto osmótico quanto iônico (Nogales et al., 2002; Mahmood et al., 2008). A
salinidade induz efeitos depressivos sobre a nodulação, leghemoglobina e
nitrogenase (Manchanda e Garg, 2008).
O isolamento e a seleção de rizóbios com características de
tolerância ao estresse salino vêm revelando alto grau de diversidade nas
populações deste grupo de microrganismos nos solos, principalmente em
regiões tropicais. O estudo da biodiversidade de rizóbio busca entender suas
relações ecológicas e evolutivas, visando encontrar genótipos tolerantes aos
distintos estresses ambientais que vão limitar a simbiose, levando a um manejo
mais eficiente dessa interação (Freitas et al., 2007).
11
2.4. Produção de melanina
Melaninas são pigmentos de alto peso molecular formados pela
polimerização oxidativa de compostos fenólicos e geralmente de coloração
marrom escura ou preta (Jacobson, 2000). Esse pigmento é sintetizado pela
enzima tirosinase (Mercado-Blanco et al., 1993). As melaninas são
amplamente distribuídas no mundo vivo, presente em tecidos animais, vegetais
e em microrganismos.
A melanina, embora não seja essencial ao crescimento dos
microrganismos, é formada durante um período de estresse biótico ou abiótico
ao qual estão expostos, servindo como uma ferramenta de auxílio no aumento
da capacidade de sobrevivência no ambiente e competição em situações
particulares (Romero-Martinez et al., 2000). Culturas de várias espécies de
rizóbios apresentam a capacidade de produção de melanina após longos
períodos de incubação em meio TY sólido (Lamb et al., 1982; Borthakur et al.,
1987; Hynes et al., 1988; Cubo et al., 1988; Hawhins et al., 1991; Sá, 2001), e
a produção desse pigmento é aumentada quando o meio TY é suplementado
com L-tirosina – substrato para a tirosinase, uma enzima que catalisa vários
passos da produção de melanina, e CuSO
4
– cofator da tirosinase (Alves,
2005). A produção de melanina em meio de cultura acontece quando ocorre o
rompimento de células velhas, liberando assim a tirosinase, que entra em
contato com o substrato, a L-tirosina. Acrescentando-se SDS (dodecil sulfato
de sódio) nas culturas, acelera-se a detecção da produção do pigmento,
mesmo em colônias jovens, pois a ação detergente do SDS resulta em um
rompimento imediato de células (Cubo et al., 1988).
A função da melanina em rizóbios não é clara. Talvez ela seja usada
para polimerizar moléculas fenólicas que surjam por ocasião da senescência
de nódulos, destoxificando esses compostos que normalmente são letais para
a bactéria (Borthakur et al., 1987; Hawkins e Johnston, 1988). Também não
foram observadas correlações entre a produção de melanina, competitividade
por sítios de nodulação ou especificidade hospedeira (Gao e Borthakur, 1995;
Sá, 2001) e fixação de nitrogênio (Lamb et al., 1982; Cubo et al., 1997) embora
os genes mel, responsáveis pela produção de melanina estejam no plasmídeo
simbiótico sym (Hawskins et al., 1991).
12
2.5. Produção de sideróforos
O ferro é o segundo metal, após o alumínio, e o quarto elemento
mais abundante da crosta terrestre, sendo que apenas uma pequena fração
está disponível para ser utilizada pelos seres vivos (Giongo, 2003; Silveira,
2009).
Devido à alta capacidade de aceitar e doar elétrons prontamente,
interconvertendo-se entre a forma férrica e ferrosa, o ferro integra diversas
metaloproteínas atuando como centro catalítico ou carreador de elétrons
(Krewulak e Vogel, 2007). Diversos processos celulares vitais como o
transporte de elétrons, a redução de oxigênio durante a síntese de ATP, a
fotossíntese e a síntese de aminoácidos, nucleosídeos e DNA, são
dependentes de ferro (Ratledge e Dover, 2000; Benite et al., 2002). Sendo
assim, o ferro é um elemento limitante para o crescimento de praticamente
todas as formas de vida.
Os microrganismos podem empregar uma variedade de estratégias
para a aquisição direta de ferro em ambientes com baixa disponibilidade desse
elemento. Bactérias são capazes de reduzir o íon férrico a íon ferroso por
redutases extracelulares e transportar Fe
2+
pela membrana externa através de
porinas; o transporte de Fe
2+
através da membrana citoplasmática ocorre pelo
chamado sistema Feo – dependente de ATP (Andrews et al., 2003).
Outro recurso para assimilação de ferro é a utilização direta de
moléculas contendo grupamentos heme, os quais possuem um átomo de ferro
contido no centro de um grande anel orgânico heterocíclico chamado porfirina.
Heme é um grupo prostético constituinte de diversas enzimas tais como
hemoglobina (localizada nas células sanguíneas vermelhas) e leg-hemoglobina
(encontrada na zona central dos nódulos em leguminosas), ambas
relacionadas ao transporte e difusão de oxigênio. O heme é altamente tóxico
por ser uma molécula hidrofóbica capaz de realizar reações redox não
enzimáticas, sendo, portanto, raramente dissociado das proteínas das quais ele
faz parte. A capacidade do uso da leg-hemoglobina como fonte de ferro em
condições de baixa concentração desse metal já foi descrita entre alguns
gêneros de rizóbios, como Rhizobium, Mesorhizobium e Bradyrhizobium (Noya
et al., 1997; Nienaber et al. 2001).
13
Contudo, entre as estratégias utilizadas para a aquisição de ferro, a
produção de sideróforos aparece como a mais comumente empregada
(Ferguson e Deisenhofer, 2002). Sideróforos são metabólitos secundários
altamente eletronegativos e de alta afinidade por Fe
3+
, sendo produzidos por
diversos microrganismos sob condições de indisponibilidade de ferro no
ambiente. A maioria das bactérias aeróbias, anaeróbias facultativas e fungos
produzem sideróforos quando se multiplicam em ambientes com baixa
concentração de ferro (Carrilo e Vazquez, 1992; Neilands, 1993).
A caracterização do tipo de sideróforo utilizado pode ser feita por
identificação do grupo funcional utilizado como ferro-ligante: hidroxamatos,
catecolatos e hidroxicarboxilatos (Wandersman e Delepelaire, 2004; Krewulak
e Vogel, 2007). Após ser secretado para o ambiente externo, o sideróforo
solubiliza o íon férrico formando o complexo Fe
3+
-sideróforo, que é
transportado de volta à célula para disponibilização do metal ao microrganismo.
Algumas vezes o sideróforo é reciclado, podendo ser reutilizado para a mesma
função (Dobbelaere et al., 2003).
Um microrganismo, para utilizar um determinado sideróforo, deve
possuir um sistema de absorção de ferro específico para o sideróforo,
composto por quatro componentes: um receptor de membrana externa de alta
afinidade (Reigh e O’Connell, 1993), a proteína TonB ancorada na face interna
da membrana externa, uma proteína periplásmica de ligação e várias proteínas
associadas à membrana interna (Braun, 1995).
Não existe um procedimento único para determinar-se identificação
e produção de sideróforos entre os microrganismos, e estes variam muito em
estrutura (Silveira, 2009). Podem-se utilizar métodos químicos, microbiológicos
e moleculares para a detecção e caracterização dessas moléculas. Entretanto,
o método mais empregado é a utilização de CAS em meio de cultura (Schwyn
e Neilands, 1987). O complexo ternário CAS, formado por cromo azurol S, ferro
III e brometo de hexadecil trimetil amônio (CTAB), constitui-se em um corante
de coloração azulada. Na presença de CAS adicionado a um meio de cultura
adequado, bactérias que produzam fortes quelantes (sideróforos) são capazes
de se multiplicar devido à remoção do ferro complexado ao corante. O
processo de transferência é verificado através da mudança de coloração do
meio, observada pela formação de um halo amarelado ao redor das colônias
14
capazes de produzir sideróforos. A adição do complexo CAS ao meio de
cultura é um método eficiente, uma vez que somente sob a produção de
sideróforos, o íon férrico poderá ser utilizado pela bactéria (Neilands, 1993;
LeVier e Guerinot, 1996).
Uma vez que os sideróforos não são produzidos por todos rizóbios,
tal característica pode ser um critério de seleção para a subsistência de
linhagens em solos com limitada disponibilidade de ferro (Carson et al., 1992;
Derylo e Skorupska, 1992). A capacidade de produzir sideróforos parece ser
mais difundida entre as espécies do gênero Rhizobium do que as do gênero
Bradyrhizobium, pois esse gênero evoluiu em solos ácidos, onde o ferro está
normalmente mais disponível (LeVier e Guerinot, 1996).
O ferro é indispensável na síntese de um grande número de
componentes envolvidos diretamente na fixação biológica de nitrogênio, como
por exemplo, as enzimas-chave dinitrogenase e dinitrogênioredutase, e a
molécula de leghemoglobina, essencial para o controle da tensão de oxigênio
dentro do nódulo. Os nódulos possuem uma concentração de ferro maior do
que qualquer tecido da planta, e tanto o início quanto o desenvolvimento da
nodulação dependem de um aumento na aquisição desse elemento. Assim,
mais ferro é requerido por plantas inoculadas com rizóbios, do que aquelas
supridas com adubação nitrogenada (Derylo e Skorupska, 1992; Ragland e
Theil, 1993; Yeoman et al., 2000).
Também rizóbios de vida livre formam sideróforos, que
desempenham um papel fundamental na competição por ferro desses
microrganismos quando na rizosfera (Reigh e O’Connell, 1993; Jurkevitch et
al., 1992; Fabiano et al., 1994). Os rizóbios, além disso, podem utilizar
sideróforos produzidos por outras estirpes de rizóbios, chamado de sinergismo
inter-estirpe, desde que este possua proteínas receptoras na membrana
externa específica para o sideróforo em questão (Giongo, 2003).
Embora os sideróforos tenham como papel principal a captação de
ferro, é possível que eles desempenhem outras funções. É sabido que
sideróforos aumentam a virulência de microrganismos patogênicos e também
são capazes de quelar outros íons metálicos, como manganês, níquel, zinco e
alumínio, porém, com menor afinidade quando comparados ao íon férrico
(Neilands, 1995; Dilworth et al., 1998; Roy e Chakrabartty, 2000). Além disso, a
15
síntese de sideróforos pelos organismos do solo tem um efeito benéfico nas
plantações, embora isso ainda não tenha sido totalmente esclarecido. Como
benefício aos vegetais, a capacidade de captar complexos Fe
3+
-sideróforo por
determinados microrganismos pode impedir a proliferação de patógenos ao
redor das raízes, devido ao sequestro de ferro do ambiente rizosférico.
2.6. Germinação e desenvolvimento de plântulas
A necessidade crescente de utilização de espécies forrageiras de
estação fria na região sul do país vem determinando um grande volume de
importação de sementes (Infantini et al., 1992). Sendo assim, as espécies
leguminosas com potencial forrageiro vêm sendo utilizadas em diversas
regiões pecuárias do Brasil, visando maior produção de forragem e aumento no
teor protéico da pastagem (Junior et al., 2004). Dentre as leguminosas
forrageiras, o cornichão apresenta vantagens na produção de forragens de
inverno-primavera-verão devido a sua resistência à seca e ao encharcamento
temporário do solo (Carambula, 1977; Infantini et al., 1992; Junior et al., 2004).
Nas leguminosas, quando há dormência das sementes, esta é
causada por um bloqueio físico representado pelo tegumento resistente e
impermeável que, ao impedir o trânsito da água e as trocas gasosas, não
permite a embebição da semente nem a oxigenação do embrião, que por isso
permanece latente (Jacob Junior et al., 2004; Deminicis et al., 2006; Melo e
Rodolfo Júnior, 2006). Essas sementes, denominadas duras, alcançam grande
longevidade (Valentim e Carneiro, 1998), e qualquer procedimento que permita
romper o tegumento das sementes, fazendo-as absorver água, promove sua
germinação e emergência de plântulas geralmente vigorosas (Grus, 1990). Há
vários tratamentos pré-germinativos que permitem a superação da dormência
das sementes de leguminosas. Como exemplos, a literatura cita tratamentos
com ácidos fortes, imersão em solventes (água, álcool, etc), escarificação
mecânica e choque térmico (Mott, 1979; Brasil, 1992; Popinigis, 1985;
Copeland e Mc Donald, 1995).
O poder germinativo de um lote de sementes é avaliado pelo teste
de germinação, conforme especificações das Regras para Análise de
Sementes (Brasil, 1992). Os testes são realizados em condições adequadas de
16
umidade e temperatura, favorecendo assim a expressão da capacidade
germinativa das sementes. As fases iniciais do desenvolvimento no ciclo de
vida de uma planta são consideradas cruciais, uma vez que, entre a
germinação da semente e o estabelecimento da plântula, ocorrem as maiores
taxas de mortalidade (Harper, 1977). Além disso, o vigor da plântula é um fator
crítico quando a competição por luz, nutrientes, ar e água começa a se tornar
mais acentuada (Biswas et al., 2000).
O vigor das plântulas e a taxa de germinação dependem tanto de
fatores genéticos inerentes à semente, quanto de práticas culturais que podem
alterá-las. E dentre as práticas culturais, a inoculação com microrganismos,
principalmente rizóbios, tem recebido especial atenção nos últimos tempos por
se tratar de uma alternativa de baixo custo e ambientalmente favorável,
constituindo-se em uma ferramenta importante para o estabelecimento de
sistemas agrícolas sustentáveis (Schlindwein et al., 2008). Os microrganismos
podem alterar a taxa de germinação por meio da produção de reguladores de
crescimento vegetal, tais como auxinas, giberelinas e citocininas (Bialek et al.,
1992; Cattelan, 1999; Reis, 2007). Tais efeitos podem ser tanto positivos,
resultando em aumento na taxa de germinação e no vigor das plântulas, quanto
negativos, diminuindo a taxa de germinação (Schlindwein et al., 2008).
2.7. Variabilidade genética dos isolados de rizóbios
A reação em cadeia de polimerase (PCR, do inglês “polymerase
chain reaction”) é uma técnica que possibilita a amplificação in vitro de ácidos
nucléicos (Mullis et al., 1986). O advento da PCR acelerou os estudos de
genomas de vários organismos, pois facilitou a clonagem e o sequenciamento
de DNA; a combinação de alta especificidade e sensibilidade tornou a PCR a
principal técnica de diagnóstico molecular e ferramenta essencial nos mais
diversos campos da investigação genética (Lunge et al., 2003).
A especificidade do teste é obtida a partir da utilização de
oligonucleotídeos que funcionam como iniciadores (primers) da síntese e são
complementares ao gene ou região de ácido nucléico de interesse. No ensaio
de PCR ocorre a hibridização entre os iniciadores e o DNA alvo, seguida da
reação de síntese de DNA in vitro pela enzima DNA polimerase. A utilização de
17
dois iniciadores que delimitam uma região do DNA alvo e a repetição da reação
de síntese por várias vezes (ciclos) dá origem a bilhões de cópias do alvo, num
processo de amplificação (Mullis, 1987; Saiki et al., 1985).
O uso de técnicas moleculares tem estimulado o desenvolvimento
de métodos simples e rápidos para a caracterização de populações
microbianas. Vários são os estudos relatando a utilização da tecnologia da
PCR nos estudos filogenéticos (Eardly et al., 1992; Ueda et al., 1995) e na
detecção, identificação e caracterização de rizóbios (Harrison et al., 1992;
Laguerre et al., 1994; Giongo et al., 2007).
A amplificação de sequências repetitivas intergênicas conhecidas
como ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) e elementos
BOX (sequências repetitivas espalhadas no genoma), geram padrões
altamente característicos quando separadas em gel de agarose (Selenska-
Pobell, 1995). Essas sequências são altamente conservadas entre os rizóbios
e já foram utilizadas em pesquisas para distinguir e classificar diferentes
estirpes em estudos de diversidade da população de Bradyrhizobium em solos
na Polônia (Madrzak et al., 1995), para avaliar impacto de parâmetros
ambientais em população de Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Labes et al.,
1996) e em diversos outros estudos populacionais de rizóbios (de Bruijin, 1992;
Selenska-Pobell, 1995; Laguerre et al., 1997; Sikora et al., 2002; Giongo et al.,
2007).
Outra técnica utilizada para diferenciação de estirpes de rizóbios é o
estudo por RISA (Análise do Espaço Intergênico Ribossomal). O método
envolve a amplificação do DNA total da comunidade bacteriana da região
intergênica entre a pequena (16S) e grande (23S) subunidades de genes rRNA
(Fisher e Triplett, 1999; Straliotto e Rumjanek, 1999; Ranjard et al., 2000). A
região intergênica 16S-23S, que pode codificar tRNAs dependendo da espécie
bacteriana, apresenta heterogeneidade significativa no comprimento e na
sequência de nucleotídeos. Ambos os tipos de variações têm sido amplamente
utilizados para diferenciar estirpes e espécies aparentadas de bactérias
(Navarro et al., 1992; Jensen et al., 1993; Scheinert et al., 1996; Aubel et al.,
1997; Maes et al., 1997).
3. MATERIAL E MÉTODOS
Neste trabalho foram estudados 52 isolados de rizóbios nativos
(Tabela 1) para Lotus spp da coleção de culturas do Laboratório de
Microbiologia do Solo da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS),
que foram isolados por Fontoura (2007) e Frizzo (2007). Entre os isolados
estudados 31 eram rizóbios de Lotus corniculatus, 3 de L. glaber, 6 de L.
subbiflorus e 12 de L. uliginosus. Os rizóbios foram obtidos de isolamentos de
amostras de solo de cinco municípios do Rio Grande do Sul: Bagé
[31º17’53,7”S, 54º03’07,4”W], Encruzilhada do Sul [30º33’40,4”S,
52º22’22,4”W], Hulha Negra [31º24’20”S, 53º45’13,6”W], Mostardas
[31º05’42”S, 50º55’44”W] e Piratini [31º18’58,8”S, 53º00’03,9”].
Os isolados de rizóbios foram inoculados em placas contendo meio
extrato de levedura, manitol e ágar (meio LMA – Apêndice 1) (Vincent, 1970),
utilizando-se a técnica de esgotamento de inóculo por estriamento, para
obtenção de colônias isoladas. Posteriormente, as culturas obtidas foram
inoculadas em placas contendo meio LMA com vermelho congo.
Os estudos microbiológicos de resistência à acidez (baixo pH e
alumínio tóxico), estresse salino (concentrações de cloreto de sódio e cloreto
de potássio), produção de melanina, produção de sideróforos e a
caracterização genética foram realizados no Laboratório de Fitopatologia,
localizado na Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do
Sul (FEPAGRO). Os experimentos com inoculação de plantas foram
conduzidos em casa de vegetação da FEPAGRO.
19
Nos estudos microbiológicos de resistência a acidez e estresse
salino utilizou-se como padrão a estirpe de Rhizobium tropici SEMIA 4077
(CIAT 899), por ser resistente a estes fatores (Sá, 2001; Nogales et al., 2002).
Tabela 1 – Isolados de rizóbios nativos para Lotus spp da coleção de culturas
da Universidade Federal do Rio Grande do Sul estudados e localidades das
amostras de solo de onde foram obtidos.
Isolado Origem Isolado Origem
UFRGS Lc 2 Hulha Negra UFRGS Lc 605 Bagé
UFRGS Lc 3 Hulha Negra UFRGS Lc 607 Bagé
UFRGS Lc 4 Hulha Negra UFRGS Lc 609 Bagé
UFRGS Lc 5 Hulha Negra UFRGS Lc 610 Bagé
UFRGS Lc 7 Hulha Negra UFRGS Lc 614 Bagé
UFRGS Lc 8 Hulha Negra UFRGS Lg 74 Bagé
UFRGS Lc 9 Hulha Negra UFRGS Lg 85 Bagé
UFRGS Lc 11 Hulha Negra UFRGS Lg 88 Bagé
UFRGS Lc 322 Hulha Negra UFRGS Ls 1 Mostardas
UFRGS Lc 329 Hulha Negra UFRGS Ls 5 Mostardas
UFRGS Lc 336 Hulha Negra UFRGS Ls 33 Mostardas
UFRGS Lc 340 Hulha Negra UFRGS Ls 36 Mostardas
UFRGS Lc 348 Hulha Negra UFRGS Ls 45 Mostardas
UFRGS Lc 356 Hulha Negra UFRGS Ls 46 Mostardas
UFRGS Lc 372 Hulha Negra UFRGS Lu 9 Mostardas
UFRGS Lc 516 Bagé UFRGS Lu 14 Mostardas
UFRGS Lc 517 Bagé UFRGS Lu 16 Mostardas
UFRGS Lc 520 Bagé UFRGS Lu 19 Mostardas
UFRGS Lc 523 Bagé UFRGS Lu 21 Mostardas
UFRGS Lc 547 Encruzilhada do Sul UFRGS Lu 25 Mostardas
UFRGS Lc 586 Bagé UFRGS Lu 26 Mostardas
UFRGS Lc 594 Bagé UFRGS Lu 56 Hulha Negra
UFRGS Lc 596 Bagé UFRGS Lu 57 Hulha Negra
UFRGS Lc 597 Bagé UFRGS Lu 59 Hulha Negra
UFRGS Lc 601 Bagé UFRGS Lu 67 Piratini
UFRGS Lc 602 Bagé UFRGS Lu 71 Bagé
Legenda: UFRGS = Universidade Federal do Rio Grande do Sul; Lc = Lotus corniculatus; Lg =
Lotus glaber (sm L.tenuis) ; Ls = Lotus subbiflorus; Lu = Lotus uliginosus.
3.1. Resistência dos rizóbios a pH 4,2
A resistência dos rizóbios a pH 4,2 foi avaliada pela quantificação do
crescimento em meio líquido utilizando-se o meio mínimo de Wood e Cooper
(1985) modificado (meio MWC) (Sá, 2001). A composição do meio foi
modificada substituindo-se a fonte de Fe na forma de Fe-EDTA por FeCl
3
20
(Apêndice 2). O crescimento dos rizóbios foi avaliado a pH 4,2 e pH 6,8. O
inóculo foi preparado com culturas crescidas em meio líquido triptona levedura
(meio TY – Apêndice 3) (Somasegaran e Hoben, 1994), em agitador orbital por
sete dias a 28ºC. Uma curva de padronização do inóculo foi construída
determinando-se o número de células viáveis, por diluição sucessiva e
inoculação em placas com meio LMA corado com vermelho congo, e a leitura
da absorbância da suspensão de células em espectrofotômetro a 540nm, com
o objetivo de padronizar o inóculo em torno do valor da absorbância 0,013nm,
que correspondia a cerca de 10
4
células viáveis/mL de meio. As culturas foram
inoculadas em frascos contendo meio MWC líquido, previamente esterilizados
em autoclave a 120ºC por quinze minutos, e incubadas em agitação orbital
constante de 100rpm durante sete dias a 28ºC. Após, determinou-se o número
de células viáveis usando-se o método de diluição sucessiva e inoculação em
placas com meio LMA com vermelho congo, utilizando-se o método de gotas
de Milles e Misra (1938). A contagem do número de colônias formadas foi
realizada após 2 dias de incubação em estufa 28ºC para os rizóbios de
crescimento rápido, e após 7 dias para os de crescimento lento. Foram
realizadas três repetições por tratamento e considerados como resistentes à
acidez as culturas dos rizóbios que apresentaram número de células viáveis,
no mínimo, mil vezes maior do que o inóculo. Determinou-se também o pH do
caldo de cultura ao final da incubação, para verificar a possível alteração
durante o crescimento bacteriano.
3.2. Resistência dos rizóbios a alumínio tóxico
Esta avaliação foi realizada utilizando-se a mesma metodologia
empregada para a avaliação da resistência a baixo pH, descrita no item 3.1. O
meio MWC foi preparado a pH 4,2 com posterior adição da solução de
AlK(SO
4
)
2
.12H
2
O 5mM para manter uma concentração final de 50µM de Al
3+
.
A solução de AlK(SO
4
)
2
.12H
2
O foi preparada em água ultra pura, previamente
acidificada a pH 3,0 com HCl, e esterilizada por filtração em membrana
0,22µm. Foram empregados três tratamentos: um com meio MWC líquido a pH
4,2 sem Al
3+
, com meio MWC líquido a pH 4,2 e 50µM de Al
3+
e outro com
meio MWC líquido a pH 6,8 sem Al
3+
. Assim como na avaliação anterior, foram
21
realizadas três repetições por tratamento e considerados como resistentes à
alumínio tóxico os rizóbios que apresentaram número de células viáveis, no
mínimo, mil vezes maior do que o inóculo. Também, determinou-se o pH do
caldo de cultura ao final da incubação.
3.3. Resistência dos rizóbios a estresse salino por alta
concentração de cloreto de sódio e de cloreto de potássio
A avaliação da resistência dos rizóbios a estresse salino foi realizada
pela quantificação do crescimento em meio extrato de levedura e manitol (meio
LM – Apêndice 4) líquido. Os experimentos de resistência a salinidade foram
conduzidos utilizando-se dois sais: sódio e potássio. Em que, na composição
do meio LM líquido adicionou-se 4, 8, 12, 16 e 20g de NaCl por litro, ajustando-
se o pH para 6,8 (Freitas et al., 2007), para avaliar a resistência dos rizóbios a
estresse salino por alta concentração de cloreto de sódio. Na avaliação da
resistência por alta concentração de cloreto de potássio, utilizaram as mesmas
concentrações, 4, 8, 12, 16 e 20g de KCl por litro de meio LM líquido,
ajustando-se o pH para 6,8. Tendo em vista que as medidas de salinidade do
solo são comumente feitas determinando-se a condutividade elétrica ou a
pressão osmótica equivalente na solução de saturação do solo (Cardoso,
1992), determinou-se também a condutividade elétrica (CE) em dSm
-1
de cada
concentração de NaCl em meio LM líquido (Tabela 2) e de KCl (Tabela 3). O
inóculo foi preparado com culturas crescidas em meio líquido TY, em agitador
orbital por sete dias a 28ºC. Assim como na avaliação de resistência à acidez
(baixo pH e alumínio tóxico), uma curva de padronização do inóculo foi
construída, através de leitura da absorbância da suspensão de células em
espectrofotômetro a 540nm, com o objetivo de padronizar o inóculo em torno
do valor de absorbância 0,013nm, que corresponde a cerca de 10
4
células
viáveis/mL de meio. As culturas foram, então, inoculadas em frascos estéreis
com meio LM líquido com os diferentes sais e concentrações, e incubadas em
agitação orbital constante de 100rpm durante sete dias a 28ºC. Após,
determinou-se o número de células viáveis usando-se o método de diluição
sucessiva e inoculação em placas com meio LMA com vermelho congo,
utilizando-se o método de gotas de Milles e Misra (1938). Após 2 a 7 dias de
22
incubação em estufa 28ºC realizou-se a contagem do número de colônias
formadas. Foram realizadas três repetições por tratamento e considerados
como resistentes os rizóbios que apresentaram número de células viáveis, no
mínimo, mil vezes maior do que o inóculo.
Tabela 2 – Condutividade elétrica das diferentes concentrações de NaCl por
litro de meio LM líquido.
Concentração de NaCl Condutividade elétrica
---- gL
-1
--- --- dSm
-1
---
0,1 1,04
4,0 5,66
8,0 9,29
12,0 11,97
16,0 13,58
20,0 15,73
Legenda: NaCl = cloreto de sódio; gL
-1
= grama por litro; dSm
-1
= deciSiemens por metro.
Tabela 3 – Condutividade elétrica das diferentes concentrações de KCl por litro
de meio LM líquido.
Concentração de KCl Condutividade elétrica
---- gL
-1
--- --- dSm
-1
---
0* 0,74
4,0 6,09
8,0 10,60
12,0 14,73
16,0 17,42
20,0 19,68
Legenda: KCl = cloreto de potássio; 0* = sem adição de Cloreto de Potássio (concentração de
potássio no meio levedura-manitol igual 0,22 gL
-1
); gL
-1
= grama por litro; dSm
-1
= deciSiemens
por metro.
3.4. Produção de melanina
A produção de melanina foi avaliada utilizando-se a metodologia
proposta por Cubo et al. (1988). Os isolados foram inoculados em meio TY
líquido e incubados a 28°C, sob agitação constante a 100 rpm, durante sete
dias. Após, foram inoculados em placas de Petri contendo meio TY sólido,
acrescido de L-tirosina (600 µg.mL
-1
) e sulfato de cobre (40 µg.mL
-1
), e
incubados a 28°C, durante dois (para rizóbios de crescimento rápido) a sete
(para de crescimento lento) dias. Em seguida, as colônias foram tratadas com
50µL de SDS (dodecil sulfato de sódio) 10% (peso/volume) em tampão TBE.
Como controle negativo foi utilizada a estirpe de Rhizobium tropici SEMIA 4077
23
(CIAT 899), conhecida como não produtora de melanina (Cubo et al., 1988;
Gao e Borthakur, 1995) e como padrão positivo, os isolados UFRGS Lg 111 e
UFRGS Lg 121, rizóbios isolados de Lotus glaber (Fontoura, 2007), cedidas
pela Coleção de Culturas do Laboratório de Microbiologia do Solo da UFRGS.
Após 24 horas de incubação à temperatura ambiente, as colônias que
apresentaram um pigmento escuro difuso foram registradas como produtoras
de melanina.
3.5. Produção de sideróforos
A produção de sideróforos foi avaliada usando-se o corante
proposto por Schwyn e Neilands (1987) modificado, que utiliza um complexo
corante-ferro. Para o preparo da solução indicadora de Cromoazurol S (CAS),
utilizou-se um balão volumétrico de 100mL, em que adicionou-se 6mL da
solução de brometo hexadeciltrimetilamonio (HDTMA) 10mM (Apêndice 5) e
um pouco de água destilada estéril. Em seguida, sob agitação, adicionou-se
lentamente 1,5mL da solução férrica (FeCl
3
.6H
2
O 1mM e HCl 0,01N) (Apêndice
6) e 7,5mL de uma solução aquosa de cromo azurol S 2mM. Após, adicionou-
se a solução contendo 4,307g de piperazina anidra dissolvida em 20mL de
água destilada estéril e 6,25mL de HCl concentrado, completou-se, então, o
volume do balão volumétrico com água destilada estéril. Os rizóbios em estudo
foram inoculados em meio de King B (meio KMB – Apêndice 7) (King et al.,
1954), que apresenta deficiência de ferro (Mariano et al., 2000), e incubados a
28ºC em agitador orbital por sete dias. Após esse período de incubação,
centrifugou-se 1mL da suspensão de células bacterianas a 13.000rpm por
5min. Transferiu-se 100µL do sobrenadante para placas de Elisa, e adicionou-
se 100µL da solução indicadora de CAS. Os rizóbios que converteram a cor
azul da solução indicadora de CAS para amarelo-avermelhado, dentro de 15
min, foram considerados produtores de sideróforos. Tendo em vista que a
maioria das espécies de Pseudomonas produz sideróforos (Peixoto, 1997;
Zago et al., 2000; Diaz de et al., 2002) utilizou-se como controles positivos
duas estirpes de Pseudomonas sp. – PSII e PSIII, da coleção do Laboratório de
Fitopatologia da FEPAGRO, conhecidas como produtoras de sideróforos.
24
3.6. Avaliação da eficiência dos rizóbios na fixação simbiótica
de nitrogênio
Para a avaliação quanto à eficiência na fixação simbiótica de
nitrogênio em experimento realizado em casa de vegetação, foram
selecionados os isolados UFRGS Lc 5, UFRGS Lc 607, UFRGS Lc 609,
UFRGS Lc 614, UFRGS Lu 56, UFRGS Lu 57 e UFRGS Lu 59 que
apresentaram resistência aos fatores de acidez (baixo pH e alumínio tóxico) e
que produziram nódulos, quando avaliados in vitro com o meio de Murashige e
Skoog (1962) (meio de MS – Apêndice 8) modificado. A composição do meio
foi modificada substituindo a fonte de nitrogênio nas formas de NH
4
NO
3
e KNO
3
por KCl.
Os vasos foram preenchidos com solo Argissolo Vermelho-Amarelo
distrófico típico, solo arenoso e com baixo teor de matéria orgânica, baixo pH,
coletado na Unidade Viamão da FEPAGRO (Tabela 4). As sementes de Lotus
corniculatus L. cv. São Gabriel, utilizadas no experimento, foram previamente
submetidas à desinfestação com álcool 70% (1min) e hipoclorito de sódio
(2min), seguida de cinco lavagens com água esterilizada, e, após, inoculadas
com 10mL do caldo de culturas de cada estirpe e isolado estudado, crescidos
em meio extrato de levedura e manitol (LM), incubado por sete dias a 28°C,
sob agitação constante a 100rpm e com cerca de 10
8
UFC.mL
-1
. Em cada vaso,
foram colocadas seis sementes pré-germinadas, utilizando-se cinco vasos por
tratamento.
Neste experimento, foram utilizadas para comparação as estirpes de
Mesorhizobium loti SEMIA 806 e SEMIA 816, liberadas para produção de
inoculantes para Lotus corniculatus, cedidas pela Coleção de Culturas de
Rizóbios da Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do
Sul (FEPAGRO). Além dos tratamentos inoculados, foram conduzidos dois
tratamentos controle, um sem adição de nitrogênio e outro com adição de
solução de NH
4
NO
3
(27,7 g L
-1
), adicionando 1 mL da solução em cada vaso,
aplicados parceladamente a cada quinze dias, ao longo do experimento. Após
20 dias de desenvolvimento, realizou-se o desbaste das plantas, deixando-se
duas por vaso. O experimento foi conduzido por 180 dias.
25
Ao final do período, a parte aérea foi separada do sistema radicular,
acondicionada em sacos de papel e submetida à secagem em estufa a 65°C,
durante três dias. Uma vez seca, a parte aérea foi pesada, sendo em seguida
moída para a determinação química do acúmulo de nitrogênio no tecido,
segundo metodologia descrita por Tedesco et al. (1995). Os nódulos foram
destacados das raízes, contados e secos em estufa a 65°C por três dias para
determinação da massa de nódulos secos. A análise estatística dos dados foi
realizada pela análise de variância (ANOVA) e a comparação de médias pelo
teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade de erro, utilizando o
programa SISVAR (Sistema de Análise de Variância). Para avaliação da
eficiência relativa dos isolados foi utilizado o índice de eficiência relativa de
fixação de nitrogênio (EFR), proposto por Brockwell et. al. (1966), através da
fórmula descrita abaixo.
EFR = __Ntotal tratamento – Ntotal T-N_ x 100
Ntotal T+N – Ntotal T-N
Na qual:
Ntotal tratamento = nitrogênio total da planta do tratamento inoculado;
Ntotal T-N = nitrogênio total do controle não inoculado e sem nitrogênio;
Ntotal T+N = nitrogênio total do controle não inoculado e que recebeu
suplementação nitrogenada.
Tabela 4 – Características químicas do solo Argissolo Vermelho-Amarelo
distrófico típico coletado na Unidade de Viamão da FEPAGRO.
CTC
P K Arg
MO
pH SMP
Al Ca
Mg
pH7,0
Efet.
Sat.
Al
CTC
Bases
mg/dm
3
-----%----- ---------cmol
c
/dm
3
--------- ----%----
8,2 75
19 1,3 5,4
6,7 0,0
1,9
1,0
5,0 3,1 0,0 61,4
Obs.: Análise realizada no Laboratório de Química Agrícola da FEPAGRO/Sede – Porto Alegre.
3.7. Avaliação da influência dos rizóbios na germinação e no
vigor de plântulas
Neste experimento, foram utilizados os isolados UFRGS Lc 5,
UFRGS Lc 607, UFRGS Lc 609, UFRGS Lc 614, UFRGS Lu 56, UFRGS Lu 57
26
e UFRGS Lu 59, as estirpes de Mesorhizobium loti liberadas para a produção
de inoculantes para cornichão, SEMIA 806 e SEMIA 816, e dois tratamentos
controle. As culturas foram crescidas em meio líquido extrato de levedura e
manitol (LM) em incubadora com agitação orbital a 100rpm por sete dias à
28ºC. Na avaliação do efeito dos isolados de rizóbios sobre a germinação,
foram utilizadas sementes de cornichão (Lotus corniculatus L. cv. São Gabriel)
submetidas previamente a desinfestação com álcool 70% (1min) e hipoclorito
de sódio (2min), seguida de cinco lavagens com água esterilizada. Os testes
foram conduzidos em gerboxes com quatro repetições com 50 sementes cada,
colocadas em papel substrato germitest estéril umedecido com 16mL de água
destilada estéril, de meio de cultura LM estéril ou contendo um dos rizóbios
testados. Após a montagem dos testes, as sementes foram colocadas em
germinadores com luz constante e temperatura de 20°C, conforme regras
internacionais para análise de sementes (ISTA, 1996). De modo a avaliar a
influência da inoculação de rizóbios sobre a germinação, foram utilizados como
parâmetros a porcentagem final de sementes germinadas e o índice de
velocidade de germinação com base nas sementes germinadas (IVG%),
calculado pela soma do número de sementes germinadas a cada dia, e dividido
pelo respectivo número de dias transcorridos a partir da semeadura, conforme
Maguire (1962). Os dados foram obtidos a partir de contagens diárias após a
emergência da plântula. Ao final de doze dias, o teste de germinação foi
concluído. Então, de cada unidade experimental, foram avaliadas 10 plântulas
quanto à massa seca e ao comprimento, em cm, da raiz e da parte aérea, com
o objetivo de avaliar a influência dos rizóbios sobre o vigor de plântulas. A
análise estatística dos dados foi realizada pela análise de variância (ANOVA) e
a comparação de médias pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de
probabilidade de erro, utilizando o programa SISVAR (Sistema de Análise de
Variância).
3.8. Caracterização genética dos isolados de rizóbios
Para a determinação da caracterização genética dos isolados de
rizóbios e das estirpes liberadas para produção de inoculantes, realizou-se a
análise do perfil eletroforético da amplificação dos fragmentos de DNA pela
27
reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando-se os oligonucleotídeos
iniciadores BOX A1-R, ERIC e RISA.
3.8.1. Extração do DNA genômico dos rizóbios
Os 52 isolados de rizóbios e as estirpes de Rhizobium tropici SEMIA
4077 e de Mesorhizobium loti SEMIA 806, SEMIA 816, SEMIA 830, SEMIA 839
e SEMIA 849, recomendadas para produção de inoculantes das espécies de
Lotus foram inoculados em meio TY líquido e incubados sob agitação
constante a 100rpm por 48 horas a 28ºC. Posteriormente, efetuou-se a
extração e purificação do DNA, utilizando-se o protocolo de extração com kit de
colunas da Genomic DNA Extraction Bioamerica.
Para avaliação da qualidade do DNA extraído, as amostras de DNA
foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% em tampão TBE 1X
em voltagem constante (70V). O carregamento do gel foi realizado preparando-
se uma mistura de 6µL de amostra de DNA mais 1µL de tampão de
carregamento (Blue Green Loading Dye I).
3.8.2. Amplificação do DNA genômico por oligonucleotídeos
iniciadores BOX A1-R, ERIC e RISA
Após a verificação do produto da extração, foram realizadas as
amplificações dos fragmentos de DNA, utilizando-se os oligonucleotídeos
iniciadores BOX A1-R (5’ – CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G – 3’) e
ERIC1-R (5’ – ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C – 3’), ERIC-2 (5’ – AAG
TAA GTG ACT GGG GTG AGC G – 3’) e SD-Bact-1522-bS-20 (5’ – TGC GGC
TGG ATC CCC TCC TT – 3’), LD-Bact-132-aA-18 (5’ – CCG GGT TTC CCC
ATT CGG – 3’).
A reação de amplificação para PCR-BOX A1-R utilizada continha:
2µL de DNA molde, 2,5µL de tampão de PCR 10X, 0,25µL de uma solução
com 0,25mmol L
-1
de cada DNTP, 1,5 de MgCl
2
, 1µL de DMSO, 1,25µL de
oligonucleotídeo BOX A1-R 20mmol L
-1
, 0,2µL de Taq polimerase, e água ultra
pura estéril para o volume final de 25µL. A amplificação foi realizada com um
ciclo inicial de desnaturação a 94ºC por sete minutos, seguido por 34 ciclos de
28
amplificação, sendo cada ciclo composto por uma fase com duração de um
minuto a 94ºC, uma fase de um minuto a 53ºC e uma fase de oito minutos a
65ºC; para extensão final procedeu-se a um ciclo extra a 65ºC por quinze
minutos (Vargas et al., 2007).
Para PCR-ERIC, a reação de amplificação utilizada continha: 2µL de
DNA molde, 2,5µL de tampão de PCR 10X, 0,25µL de uma solução com
0,25mmol L
-1
de cada DNTP, 1,5 de MgCl
2
, 1µL de DMSO, 1,25µL de
oligonucleotídeo ERIC1-R 20mmol L
-1
, 1,25µL de oligonucleotídeo ERIC-2
20mmol L
-1
, 0,2µL de Taq polimerase, e água ultra pura estéril para o volume
final de 25µL. A amplificação foi realizada com um ciclo inicial de desnaturação
a 95ºC por sete minutos, seguido por 30 ciclos de amplificação, sendo cada
ciclo composto por uma fase com duração de um minuto a 94ºC, uma fase de
um minuto a 52ºC e uma fase de oito minutos a 65ºC; para extensão final
procedeu-se a um ciclo extra a 65ºC por dezesseis minutos (Sá, 2001; Giongo,
2007).
A reação de amplificação para PCR-RISA continha: 2µL de DNA
molde, 2,5µL de tampão de PCR 10X, 0,25µL de uma solução com 0,25mmol
L
-1
de cada DNTP, 1,5 de MgCl
2
, 1µL de DMSO, 1,25µL de oligonucleotídeo
SD-Bact-1522-bS-20 20mmol L
-1
, 1,25µL de oligonucleotídeo LD-Bact-132-aA-
18 20mmol L
-1
, 0,2µL de Taq polimerase, e água ultra pura estéril para o
volume final de 25µL. A amplificação foi realizada com um ciclo inicial de
desnaturação a 94ºC por dois minutos, seguido por 30 ciclos de amplificação,
sendo cada ciclo composto por uma fase com duração de quinze segundos a
94ºC, uma fase de quinze segundos a 55ºC e uma fase de quarenta e cinco
segundos a 72ºC; para extensão final procedeu-se a um ciclo extra a 72ºC por
dois minutos (Fisher e Triplett, 1999).
Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel
de agarose 1,5% em tampão TBE 1X em voltagem constante (70V). O perfil de
bandas no gel foi transformado em uma matriz binária bidimensional, pelo
programa Gel-Pro Analyser 3.1, onde 0 (zero) indicava a ausência de banda e
1 (um) à presença. A similaridade/dissimilaridade genética entre os isolados foi
medida pelo coeficiente de Jaccard. As matrizes foram analisadas em conjunto
pelo programa PAST – Palaeontological STatistic ver.1,96 e o dendrograma
29
obtido pelo método de agrupamento Unweighted Pair-Group Average (UPGMA)
pelo programa Multivar Cluster Analysis do PAST (Hammer et al., 2007).
Foi calculado o índice de Shannon para a diversidade dos isolados
usando-se a fórmula H = C / N (N x log N – Σni x log ni), onde o ni corresponde
ao número dos isolados com o mesmo perfil para o PCR dos dois
oligonucleotídeos, N corresponde ao número total dos isolados e C é uma
constante igual a 2,3 (Shannon, 1948).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Resistência dos rizóbios a pH 4,2 e a alumínio tóxico
Entre os 52 isolados de Lotus estudados, 20 deles (UFRGS Lc 2, Lc
3, Lc 4, Lc 5, Lc 9, Lc 11, Lc 322, Lc 329, Lc 356, Lc 372, Lc 596, Lc 601, Lc
605, Lc 607, Lc 609, Lc 614, Lu 56, Lu 57, Lu 59 e Lu 67) foram resistentes a
pH 4,2 em meio de cultura. Sendo que 16 (31%) desses vinte isolados (UFRGS
Lc 2, Lc 4, Lc 5, Lc 9, Lc 322, Lc 329, Lc 356, Lc 372, Lc 596, Lc 601, Lc 607,
Lc 609, Lc 614, Lu 56, Lu 57 e Lu 59) foram também resistentes à
concentração de 50M de alumínio em meio de cultura, produzindo
populações, ao final do período de incubação de sete dias, da ordem de 10
7
até 10
8
UFC.mL
-1
(Tabela 5) enquanto que, 4 isolados (8%) (UFRGS Lc 3, Lc
11, Lc 605 e Lu 67) foram resistentes, somente, a pH 4,2 em meio de cultura,
com populações da ordem de 10
7
UFC.mL
-1
, mas não foram resistentes à
50M de Al
3+
. Os outros 32 isolados estudados, 61% do total, mostraram-se
sensíveis a pH 4,2. Resultados semelhantes foram obtidos por Marriel (1984),
Hara e Oliveira (2004) e Vargas et al. (2007), em estudos com rizóbios, bem
como no trabalho de Wood e Cooper (1985), em que relatam que estirpes de
rizóbios para Lotus foram tolerantes com 20 e 50M de alumínio a pH 5,5.
Entretanto, nos estudos de Räsänen e Lindström (1997) 20M de alumínio em
meio de cultura inibiu a multiplicação de células de Rhizobium galegae em pH
baixo e segundo Wood e Cooper (1988) 50M de alumínio causou inibição da
multiplicação de R. leguminosarum bv. trifoli na faixa de pH 4,6 – 5,6.
Thornton e Davey (1983) relataram que estirpes de R. phaseoli mostraram-se
sensíveis para 5M de alumínio em pH 4,4.
31
Tabela 5 – Crescimento de rizóbios de Lotus spp em meio com pH 4,2 e com
50µM de alumínio tóxico, após sete dias de incubação em meio MWC
modificado.
Tratamentos
Rizóbio
pH 6,8 pH 4,2 pH 4,2 + Al
3+
Estirpes
------------------------UFC.mL
-1
------------------------
SEMIA 4077 1,3.10
7
1,2.10
7
1,2.10
7
SEMIA 806 1,5.10
8
1,2.10
6
9,5.10
4
SEMIA 816 1,6.10
7
7,2.10
5
8,7.10
5
SEMIA 830 1,6.10
7
- -
SEMIA 839 3,5.10
7
- -
SEMIA 849 8,8.10
7
8,2.10
7
6,5.10
3
Isolados
UFRGS Lc 2 6,2.10
8
7,2.10
7
7,2.10
7
UFRGS Lc 3 5,7.10
7
8,6.10
7
6,9.10
4
UFRGS Lc 4 2,8.10
7
2,9.10
7
1,5.10
7
UFRGS Lc 5 1,4.10
8
3,1.10
7
3,1.10
7
UFRGS Lc 7 7,8.10
7
1,4.10
4
-
UFRGS Lc 8 2,2.10
7
1,9.10
5
1,3.10
4
UFRGS Lc 9 2,5.10
8
1,2.10
8
9,8.10
7
UFRGS Lc 11 2,2.10
8
1,0.10
7
8,4.10
6
UFRGS Lc 322 2,5.10
7
1,4.10
7
2,0.10
7
UFRGS Lc 329 2,4.10
8
1,4.10
8
2,3.10
7
UFRGS Lc 336 3,7.10
7
- -
UFRGS Lc 340 8,3.10
7
2,2.10
5
3,1.10
5
UFRGS Lc 348 6,3.10
7
- -
UFRGS Lc 356 9,7.10
7
6,9.10
7
1,3.10
7
UFRGS Lc 372 1,2.10
8
1,6.10
8
1,8.10
8
UFRGS Lc 516 1,5.10
8
1,8.10
4
-
UFRGS Lc 517 7,9.10
7
2,3.10
4
-
UFRGS Lc 520 6,5.10
7
6,7.10
6
7,1.10
4
UFRGS Lc 523 8,4.10
7
8,7.10
3
-
UFRGS Lc 547 8,7.10
7
9,8.10
5
2,5.10
4
UFRGS Lc 586 1,2.10
7
- -
UFRGS Lc 594 2,2.10
7
8,3.10
4
-
UFRGS Lc 596 6,9.10
7
3,0.10
7
2,2.10
7
UFRGS Lc 597 9,6.10
6
6,7.10
4
-
UFRGS Lc 601 1,5.10
8
6,9.10
7
1,6.10
7
32
Tabela 5 – Continuação.
Tratamentos
Rizóbio
pH 6,8 pH 4,2 pH 4,2 + Al
3+
Isolados
------------------------UFC.mL
-1
------------------------
UFRGS Lc 602 9,0.10
7
2,1.10
5
1,4.10
5
UFRGS Lc 605 1,4.10
8
6,6.10
7
1,3.10
6
UFRGS Lc 607 1,0.10
8
7,0.10
7
6,9.10
7
UFGRS Lc 609 1,9.10
8
9,3.10
7
8,9.10
7
UFRGS Lc 610 9,5.10
7
- -
UFRGS Lc 614 1,0.10
8
8,7.10
7
7,1.10
7
UFRGS Lg 74 7,2.10
7
1,4.10
6
8,7.10
3
UFRGS Lg 85 7,5.10
7
8,6.10
3
7,9.10
3
UFRGS Lg 88 6,8.10
7
9,4.10
5
6,9.10
4
UFRGS Ls 1 2,2.10
7
- -
UFRGS Ls 5 1,8.10
7
- -
UFRGS Ls 33 1,6.10
7
- -
UFRGS Ls 36 1,2.10
7
- -
UFRGS Ls 45 1,8.10
7
- -
UFGRS Ls 46 8,1.10
7
- -
UFRGS Lu 9 1,5.10
7
- -
UFRGS Lu 14 1,7.10
7
- -
UFRGS Lu 16 1,7.10
7
- -
UFRGS Lu 19 1,8.10
7
- -
UFRGS Lu 21 1,4.10
7
- -
UFRGS Lu 25 1,3.10
7
1,9.10
6
1,0.10
6
UFRGS Lu 26 7,1.10
7
- -
UFRGS Lu 56 6,8.10
8
7,4.10
7
7,7.10
7
UFRGS Lu 57 6,7.10
8
6,9.10
7
5,2.10
7
UFRGS Lu 59 7,0.10
7
7,0.10
7
7,6.10
7
UFRGS Lu 67 1,9.10
7
2,0.10
7
6,5.10
6
UFRGS Lu 71 7,3.10
7
- -
Legenda: MWC = Meio de Wood e Cooper; UFC = Unidades formadoras de colônias; mL =
mililitros; SEMIA = Sessão de Microbiologia Agrícola (Coleção Brasileira Oficial de rizóbios);
UFRGS = Universidade Federal do Rio Grande do Sul; Lc = Lotus corniculatus; Lg = Lotus
glaber (sm L.tenuis) ; Ls = Lotus subbiflorus; Lu = Lotus uliginosus.
Tendo em vista, os resultados obtidos neste experimento, em que 20
dos 52 isolados estudados foram resistentes a pH 4,2 e, dentre os resistentes,
16 foram também resistentes a 50M de alumínio tóxico, pode-se observar que
33
a resistência dos rizóbios a baixo pH é indicativo de resistência a alumínio.
Resultados semelhantes foram obtidos por Thornton e Davey (1983) e Marriel
(1984), mas, no entanto, é necessário que o organismo seja resistente e cresça
em pH baixo antes de se avaliar sua resistência ao alumínio tóxico (Sá, 2001).
Diferentes mecanismos de resistência à acidez e ao alumínio tóxico têm sido
encontrados em isolados de rizóbio (Cummingham e Munns, 1984; Bushby,
1990; Mukherjee e Asanuma, 1998; Maccío et al., 2002; Watkin et al., 2003 e
Barberi et al., 2004), como a diminuição da quantidade de carga negativa na
superfície celular, diminuindo a ligação com o alumínio; a acumulação de
fosfato inorgânico no interior da célula, neutralizando o efeito do alumínio pela
formação de complexos insolúveis biologicamente não tóxicos; o aumento dos
níveis de potássio e fósforo ligados à manutenção do pH interno e maior
produção de exopolissacarídeos.
A ausência de crescimento de 32 dos isolados de rizóbios
estudados, pode ter sido causada por diversos fatores, como, por exemplo, a
diminuição da síntese de proteínas pelas bactérias, o que, segundo Aarons e
Graham (1991), pode afetar o crescimento bacteriano. Esta ausência do
crescimento de rizóbio perante a exposição à acidez sugere que alguns
processos citoplasmáticos da bactéria são sensíveis a esse fator (Hungria e
Vargas, 2000). Peick et al. (1999) mostraram que a redução do pH afetou a
síntese de diferentes proteínas em estirpes de Rhizobium tropici e R. etli. Por
outro lado, para Correa e Barneix (1997) a resistência à acidez, por estirpes de
R. loti é um fenômeno complexo que envolve mecanismos constitutivos tais
como permeabilidade da membrana externa como resposta adaptativa ao pH
do meio, incluindo o estádio de crescimento do rizóbio e mudanças na
expressão de proteínas.
Entre as estirpes liberadas para produção de inoculantes para Lotus
spp, as cincos estudadas – SEMIA 806, SEMIA 816, SEMIA 830, SEMIA 839 e
SEMIA 849 – foram sensíveis à concentração de 50M de alumínio tóxico, e
somente a estirpe de Mesorhizobium loti, SEMIA 849, apresentou resistência a
pH 4,2. A estirpe de Rhizobium tropici SEMIA 4077 (CIAT 899), utilizada como
padrão, se mostrou resistente tanto ao pH ácido como ao alumínio tóxico.
Resultado semelhante foi obtido por Sá (2001), no estudo de isolados de
feijoeiros em solos ácidos do Cunha (SP), em que observou que a SEMIA 4077
34
apresenta resistência à acidez e ao alumínio. Graham et al. (1982), Graham et
al. (1994) e Riccillo et al. (2000 a, b), também, relataram que em seus estudos
a estirpe de R. tropici tolera vários estresses abióticos, incluindo baixo pH e
alumínio tóxico.
Ao final do período de incubação, observou-se que o pH do caldo
(Tabela 6) de todas as culturas se manteve entre 4,2 a 4,8. Estes resultados
mostram que a resistência ao pH baixo das bacterias estudadas parece não
envolver mecanismos relacionados ao aumento do pH do meio, que pode ser
um mecanismo de resistência ao alumínio de alguns rizóbios (Wood,1995).
Ribeiro Júnior et al. (1988), durante o estudo da tolerância de Bradyrhizobium
sp. de Mimosoideae à acidez em meio de cultura, observaram que as estirpes
tolerantes cresceram em meio ácido com ou sem alumínio, sem induzir
modificações iniciais ou posteriores no pH do meio, obtendo assim resultados
semelhantes ao do presente estudo. Segundo Graham et al. (1994), a
tolerância ao pH ácido em rizóbio depende da habilidade em manter o pH
intracelular entre 7,2 e 7,5 quando o pH externo é ácido.
4.2. Resistência dos rizóbios ao estresse salino por alta
concentração de cloreto de sódio e de cloreto de potássio
No experimento para avaliação da resistência dos 52 isolados de
rizóbios para Lotus spp ao estresse salino por diferentes concentrações de
sódio, na forma de NaCl (cloreto de sódio), em meio LM, observou-se que
alguns dos isolados de rizóbios estudados apresentaram resistência na faixa
de 4 a 12 gL
-1
de NaCl (Tabela 7), com condutividade elétrica entre 5,66 a
11,97 dSm
-1
. Por outro lado, ao se avaliar o crescimento dos rizóbios nas
concentrações de 16 a 20 gL
-1
de NaCl (condutividade elétrica de 13,56 e
15,73 dSm
-1
, respectivamente) no meio de cultura, observou-se que alguns
isolados não apresentaram crescimento, enquanto que outros obtiveram
crescimento de populações da ordem de 10
3
até 10
6
UFC.mL
-1
, mostrando-se
assim não resistentes. De modo geral, muitos dos rizóbios diminuíram o
crescimento de 10
9
para até 10
3
UFC.mL
-1
conforme a concentração de NaCl
no meio de cultura. Entre os 52 isolados de rizóbios para Lotus sp., 39
cresceram até a concentração de 4 gL
-1
de NaCl. Destes, 27 cresceram até 8
35
Tabela 6 – Valores do pH do caldo por rizóbios de Lotus spp ao final do
período de incubação (7 dias).
Rizóbios Meio pH 6,8 Meio pH 4,2 Meio pH 4,2 + 50µM Al
3+
Estirpes
SEMIA 4077 7,8 4,7 4,8
SEMIA 806 7,1 4,3 4,3
SEMIA 816 7,6 4,4 4,4
SEMIA 830 7,0 4,3 4,3
SEMIA 839 6,7 4,4 4,3
SEMIA 849 8,0 4,3 4,4
Isolados
UFRGS Lc 2 7,5 4,5 4,4
UFRGS Lc 3 7,3 4,6 4,4
UFRGS Lc 4 6,6 4,3 4,3
UFRGS Lc 5 7,4 4,3 4,3
UFRGS Lc 7 7,4 4,3 4,2
UFRGS Lc 8 7,0 4,3 4,3
UFRGS Lc 9 6,8 4,3 4,3
UFRGS Lc 11 7,1 4,6 4,5
UFRGS Lc 322 7,5 4,3 4,3
UFRGS Lc 329 7,2 4,3 4,3
UFRGS Lc 336 6,6 4,1 4,0
UFRGS Lc 340 7,3 4,3 4,3
UFRGS Lc 348 7,1 4,3 4,3
UFRGS Lc 356 7,6 4,3 4,3
UFRGS Lc 372 7,4 4,4 4,4
UFRGS Lc 516 7,3 4,3 4,2
UFRGS Lc 517 7,4 4,2 4,2
UFRGS Lc 520 7,5 4,2 4,2
UFRGS Lc 523 7,1 4,2 4,2
UFRGS Lc 547 7,3 4,9 4,3
UFRGS Lc 586 7,4 4,2 4,2
UFRGS Lc 594 7,1 4,2 4,2
UFRGS Lc 596 7,4 4,3 4,3
UFRGS Lc 597 7,0 4,3 4,2
UFRGS Lc 601 7,3 4,3 4,2
UFRGS Lc 602 7,3 4,3 4,3
UFRGS Lc 605 7,3 4,3 4,2
UFRGS Lc 607 7,7 4,4 4,4
UFRGS Lc 609 7,2 4,3 4,3
UFRGS Lc 610 7,0 4,3 4,2
UFRGS Lc 614 7,2 4,4 4,3
36
Tabela 6 – Continuação.
Rizóbios Meio pH 6,8 Meio pH 4,2 Meio pH 4,2 + 50µM Al
3+
Isolados
UFRGS Lg 74 7,3 4,3 4,2
UFRGS Lg 85 7,0 4,3 4,3
UFRGS Lg 88 7,0 4,3 4,3
UFRGS Ls 1 7,2 4,3 4,2
UFRGS Ls 5 7,2 4,2 4,2
UFRGS Ls 33 6,9 4,3 4,2
UFRGS Ls 36 7,0 4,2 4,2
UFRGS Ls 45 7,2 4,2 4,0
UFRGS Ls 46 7,5 4,2 4,2
UFRGS Lu 9 6,6 4,2 4,1
UFRGS Lu 14 6,5 4,2 4,0
UFRGS Lu 16 6,3 4,2 4,2
UFRGS Lu 19 7,1 4,2 4,2
UFRGS Lu 21 7,0 4,3 4,2
UFRGS Lu 25 6,4 4,2 4,2
UFRGS Lu 26 7,1 4,2 4,2
UFRGS Lu 56 7,5 4,5 4,4
UFRGS Lu 57 7,4 4,5 4,4
UFRGS Lu 59 7,6 4,6 4,5
UFRGS Lu 67 6,8 4,3 4,2
UFRGS Lu 71 7,2 4,2 4,2
Legenda: SEMIA = Sessão de Microbiologia Agrícola (Coleção Brasileira Oficial de rizóbios);
UFRGS = Universidade Federal do Rio Grande do Sul; Lc = Lotus corniculatus; Lg = Lotus
glaber (sm L. tenuis); Ls = Lotus subbiflorus; Lu = Lotus uliginosus.
gL
-1
, e apenas 11 (UFRGS Lc 7, Lc 11, Lc 340, Lc 348, Lc 372, Lc 516, Lc 520,
Lc 523, Lc 547, Lu 56 e Lu 59) cresceram até a concentração de 12 gL
-1
de
NaCl, com populações da ordem de 10
7
UFC.mL
-1
. Nesta avaliação, 12 rizóbios
(UFRGS Lc 2, Lc 3, Lc 4, Lc 596, Lc 602, Lc 614, Lg 88, Ls 45, Ls 46, Lu 25 e
Lu 67) foram considerados sensíveis, pois não apresentaram crescimento
bacteriano a partir da concentração de 4 gL
-1
de NaCl em meio de cultura.
Resultados semelhantes foram obtidos por Freitas et al. (2007), em que nos
testes de resistência à salinidade com sódio, observaram que os isolados de
rizóbios apresentavam crescimentos até o nível de 12 gL
-1
de NaCl nos meios
ajustados para pH 6,8, e a sensibilidade ao sal foi verificada a partir da adição
de 16 gL
-1
. Por outro lado, Medeiros et al. (2007) obtiveram, no estudo de
tolerância de rizóbios à salinidade do município de Mossoró (RN), isolados que
37
Tabela 7 – Crescimento de rizóbios de Lotus spp em meio levedura-manitol
com diferentes concentrações de NaCl, após sete dias de incubação.
Concentrações de NaCl (gL
-1
)
Rizóbios
0,1 4 8 12 16 20
Estirpes
-------------------------UFC.mL
-1
-------------------------
SEMIA 4077 7,9.10
8
6,0.10
8
7,6.10
8
8,8.10
7
8,2.10
7
7,2.10
7
SEMIA 806 2,1.10
8
2,1.10
8
1,8.10
8
- - -
SEMIA 816 9,7.10
7
9,2.10
7
8,4.10
7
6,4.10
7
8,8.10
5
9,0.10
4
SEMIA 830 8,7.10
8
1,3.10
9
1,0.10
9
8,9.10
7
- -
SEMIA 839 2,1.10
7
4,8.10
3
- - - -
SEMIA 849 8,5.10
7
8,0.10
7
8,7.10
7
8,3.10
7
6,7.10
8
3,4.10
7
Isolados
UFRGS Lc 2 6,2.10
8
6,9.10
3
5,5.10
3
- - -
UFRGS Lc 3 7,5.10
7
6,4.10
4
7,0.10
6
8,4.10
6
- -
UFRGS Lc 4 7,3.10
8
2,9.10
6
8,7.10
6
6,8.10
4
- -
UFRGS Lc 5 7,8.10
7
6,1.10
7
1,1.10
7
6,5.10
4
- -
UFRGS Lc 7 8,7.10
8
6,3.10
8
6,1.10
8
6,0.10
7
7,9.10
5
1,7.10
5
UFRGS Lc 8 5,8.10
7
5,8.10
6
5,7.10
7
6,7.10
5
7,8.10
3
3,7.10
3
UFRGS Lc 9 8,0.10
8
7,6.10
8
6,2.10
8
7,6.10
6
- -
UFRGS Lc 11 2,2.10
8
7,5.10
8
5,7.10
8
6,7.10
7
2,4.10
5
1,6.10
4
UFRGS Lc 322
3,7.10
7
2,4.10
8
2,1.10
8
1,3.10
6
9,6.10
5
1,2.10
5
UFRGS Lc 329
2,6.10
8
1,2.10
8
3,4.10
6
8,1.10
6
- -
UFRGS Lc 336
1,6.10
8
2,0.10
8
3,3.10
6
2,2.10
6
- -
UFRGS Lc 340
6,3.10
8
7,1.10
8
7,2.10
8
5,5.10
7
1,5.10
5
1,5.10
5
UFRGS Lc 348
8,4.10
8
8,0.10
8
1,1.10
8
6,4.10
7
- -
UFRGS Lc 356
8,3.10
7
8,7.10
7
8,1.10
7
1,4.10
4
- -
UFRGS Lc 372
6,1.10
8
6,4.10
8
1,0.10
8
9,7.10
7
1,1.10
5
-
UFRGS Lc 516
9,3.10
8
7,1.10
8
6,2.10
8
9,4.10
7
1,4.10
5
-
UFRGS Lc 517
7,4.10
8
6,7.10
8
5,8.10
8
9,1.10
7
- -
UFRGS Lc 520
6,4.10
8
8,8.10
7
1,4.10
7
9,9.10
7
- -
UFRGS Lc 523
2,0.10
8
8,9.10
7
1,0.10
8
8,3.10
7
- -
UFRGS Lc 547
1,0.10
9
8,4.10
8
6,9.10
8
1,0.10
7
- -
UFRGS Lc 586
9,0.10
8
1,5.10
8
1,2.10
8
8,0.10
5
2,1.10
5
1,6.10
5
UFRGS Lc 594
1,3.10
9
1,1.10
9
1,0.10
9
1,5.10
6
1,3.10
6
-
UFRGS Lc 596
7,5.10
7
- - - - -
UFRGS Lc 597
1,3.10
9
1,2.10
9
7,8.10
8
1,6.10
6
2,2.10
6
8,8.10
5
UFRGS Lc 601
1,3.10
9
8,1.10
8
1,5.10
8
1,5.10
6
1,9.10
6
1,6.10
5
38
Tabela 7 – Continuação.
Concentrações de NaCl (gL
-1
)
Rizóbios
0,1 4 8 12 16 20
Isolados
-----------------------------UFC.mL
-1
-----------------------------
UFRGS Lc 602
6,1.10
7
6,5.10
5
- - - -
UFRGS Lc 605
9,5.10
7
9,0.10
4
8,1.10
4
- - -
UFRGS Lc 607
1,2.10
9
8,8.10
8
6,7.10
7
8,2.10
5
1,8.10
5
1,1.10
4
UFGRS Lc 609
1,1.10
8
1,3.10
7
1,1.10
7
9,2.10
6
8,6.10
5
7,6.10
5
UFRGS Lc 610
2,2.10
8
9,6.10
8
6,0.10
8
1,2.10
6
1,5.10
5
-
UFRGS Lc 614
7,5.10
7
6,5.10
3
4,9.10
3
- - -
UFRGS Lg 74 1,1.10
8
8,7.10
7
1,0.10
8
6,5.10
5
- -
UFRGS Lg 85 1,4.10
8
9,5.10
7
1,2.10
7
- - -
UFRGS Lg 88 1,1.10
7
8,6.10
6
- - - -
UFRGS Ls 1 1,3.10
8
9,8.10
7
- - - -
UFRGS Ls 5 6,1.10
8
5,5.10
8
- - - -
UFRGS Ls 33 9,0.10
8
2,5.10
8
- - - -
UFRGS Ls 36 2,7.10
8
2,5.10
8
- - - -
UFRGS Ls 45 1,3.10
7
2,1.10
4
1,0.10
4
1,6.10
4
- -
UFGRS Ls 46 8,1.10
7
8,2.10
4
- - - -
UFRGS Lu 9 2,8.10
8
3,0.10
8
- - - -
UFRGS Lu 14 2,6.10
8
2,2.10
8
- - - -
UFRGS Lu 16 6,8.10
8
2,6.10
8
- - - -
UFRGS Lu 19 3,2.10
8
3,1.10
8
- - - -
UFRGS Lu 21 2,9.10
8
2,8.10
8
- - - -
UFRGS Lu 25 1,7.10
7
1,4.10
5
- - - -
UFRGS Lu 26 8,1.10
8
6,0.10
8
- - - -
UFRGS Lu 56 7,1.10
7
7,6.10
7
7,8.10
7
6,3.10
7
- -
UFRGS Lu 57 1,3.10
9
7,4.10
7
6,4.10
7
6,4.10
6
- -
UFRGS Lu 59 1,1.10
9
8,4.10
8
5,3.10
8
7,5.10
7
5,9.10
3
4,7.10
3
UFRGS Lu 67 7,1.10
7
- - - - -
UFRGS Lu 71 7,4.10
8
1,1.10
8
1,1.10
6
- - -
Legenda: NaCl = Cloreto de Sódio; gL
-1
= grama por litro; UFC = Unidades formadoras de
colônias; mL = mililitros; SEMIA = Sessão de Microbiologia Agrícola (Coleção Brasileira Oficial
de rizóbios); UFRGS = Universidade Federal do Rio Grande do Sul; Lc = Lotus corniculatus; Lg
= Lotus glaber (sm L. tenuis); Ls = Lotus subbiflorus; Lu = Lotus uliginosus.
apresentaram crescimento na concentração 15,47 gL
-1
de NaCl, em 28ºC,
enquanto que os isolados de rizóbios dos municípios de Alto do Rodrigues
(RN) e Ceará-Mirim (RN) obtiveram crescimento na concentração 12,84 e 7,28
39
gL
-1
de NaCl, respectivamente, sendo portanto, menos tolerantes à salinidade.
Singh et al. (2008), relatam que estirpes de Rhizobium para a espécie de
Trigonella foenumgraecum foram capazes de crescer em meio de cultura
contendo 1% de NaCl, mas foram incapazes de crescer em concentrações
mais altas, mostrando assim que os isolados eram sensíveis ao sal, enquanto
que, as concentrações toleradas de NaCl pelas estirpes, de estudo dos autores
Nóbrega et al. (2004), variaram de 2 até 30 gL
-1
. Assim é possível observar que
existem resultados bem diversificados quanto a informações sobre as
diferentes capacidades de bactérias diazotróficas em tolerar salinidade (Chen
et al., 1995; Sherebn et al., 1998; Rasa et al., 2001; Tamimi, 2001; Hungria et
al., 2001), e as faixas de tolerância das espécies diazotróficas simbióticas
variaram de 0 a 60 gL
-1
de NaCl.
Entre as estirpes de Mesorhizobium loti liberadas para a produção
de inoculantes, somente a SEMIA 849 apresentou resistência em todas as
concentrações testadas (4 a 20 gL
-1
), enquanto que, as SEMIA 816 e SEMIA
830 apresentaram crescimento nas concentrações de 4 a 12 gL
-1
de NaCl, a
SEMIA 806 com crescimento até a concentração de 8 gL
-1
de NaCl, e a SEMIA
839 foi considerada sensível ao estresse salino por NaCl, pois apresentou
populações da ordem de 10
3
UFC.mL
-1
na concentração de 4 gL
-1
de NaCl e
não desenvolveu crescimento bacteriano nas concentrações de 8 a 20 gL
-1
de
NaCl.
Em relação ao estresse salino por diferentes concentrações de
potássio, na forma de KCl (cloreto de potássio), em meio LM, observou-se que
os 52 isolados de rizóbios para Lotus sp., variaram seu crescimento entre as
concentrações de 4 a 20 gL
-1
(Tabela 8). Sendo que, assim como, no estudo
de resistência ao estresse salino por sódio, o crescimento bacteriano das
células viáveis dos isolados de rizóbios apresentou diminuição com o aumento
da concentração de KCl no meio de cultura, produzindo populações da
ordem de 10
9
para até 10
3
UFC.mL
-1
. Dos 52 isolados para Lotus sp., 46
cresceram na concentração de 4 gL
-1
. Destes, 28 cresceram em 8 gL
-1
, 19 em
12 gL
-1
, 12 em 16 gL
-1
e 6 cresceram na concentração de 20 gL
-1
de KCl, sendo
UFRGS Lc 2, Lc 3, Lc 372, Lc 516, Lc 517, Lc 520. E, ainda, 6 isolados foram
considerados sensíveis, UFRGS Lu 21, Lu 26, Lu 56, Lu 67, Lc 348, Lc 602.
40
Tabela 8 – Crescimento de rizóbios de Lotus spp em meio levedura-manitol
com diferentes concentrações de KCl, após sete dias de incubação.
Concentrações de KCl (gL
-1
)
Rizóbios
0* 4 8 12 16 20
Estirpes
-------------------------UFC.mL
-1
-------------------------
SEMIA 4077 1,1.10
9
1,3.10
9
9,4.10
8
8,1.10
8
3,2.10
8
1,4.10
8
SEMIA 806 1,5.10
9
1,0.10
9
6,8.10
8
1,4.10
8
8,8.10
6
1,3.10
5
SEMIA 816 1,1.10
9
2,1.10
9
1,6.10
9
1,6.10
9
1,5.10
6
-
SEMIA 830 5,3.10
8
1,4.10
9
1,6.10
9
1,7.10
9
9,6.10
8
1,0.10
5
SEMIA 839 7,8.10
8
1,2.10
8
2,0.10
4
1,3.10
4
- -
SEMIA 849 1,3.10
9
1,4.10
9
9,5.10
8
1,1.10
9
8,6.10
8
1,3.10
8
Isolados
UFRGS Lc 2 1,2.10
9
1,1.10
9
1,2.10
9
9,2.10
8
9,6.10
8
7,5.10
8
UFRGS Lc 3 1,2.10
9
8,7.10
8
7,9.10
8
6,8.10
8
6,2.10
8
2,5.10
7
UFRGS Lc 4 1,5.10
9
1,2.10
9
6,8.10
8
1,0.10
7
7,2.10
6
-
UFRGS Lc 5 1,0.10
9
1,1.10
9
1,2.10
9
2,2.10
7
3,8.10
6
9,4.10
5
UFRGS Lc 7 1,2.10
9
9,1.10
8
1,3.10
9
1,9.10
7
1,4.10
6
1,4.10
6
UFRGS Lc 8 1,5.10
9
1,2.10
9
1,7.10
9
2,4.10
8
1,0.10
7
1,3.10
6
UFRGS Lc 9 1,5.10
9
1,2.10
9
9,2.10
8
2,3.10
6
9,7.10
6
2,3.10
6
UFRGS Lc 11 1,9.10
9
1,1.10
9
1,1.10
9
8,2.10
8
2,2.10
6
2,4.10
5
UFRGS Lc 322
1,5.10
9
8,8.10
8
1,4.10
9
8,2.10
8
9,6.10
8
7,2.10
6
UFRGS Lc 329
1,2.10
9
7,3.10
8
8,1.10
7
7,2.10
7
1,4.10
8
2,3.10
6
UFRGS Lc 336
3,3.10
8
5,9.10
8
1,0.10
5
1,6.10
4
6,2.10
8
8,1.10
5
UFRGS Lc 340
9,9.10
8
6,6.10
8
8,1.10
7
6,7.10
5
1,0.10
6
1,2.10
5
UFRGS Lc 348
7,4.10
7
1,2.10
5
1,0.10
4
- - -
UFRGS Lc 356
8,2.10
8
8,2.10
7
6,1.10
8
6,5.10
6
8,6.10
5
1,2.10
5
UFRGS Lc 372
1,6.10
9
1,2.10
9
1,0.10
9
8,2.10
8
9,4.10
7
7,2.10
7
UFRGS Lc 516
1,9.10
9
1,5.10
9
1,0.10
9
1,5.10
9
1,2.10
9
8,3.10
7
UFRGS Lc 517
1,4.10
9
1,6.10
9
1,3.10
9
1,1.10
9
9,9.10
8
8,1.10
8
UFRGS Lc 520
1,2.10
9
1,2.10
9
1,1.10
9
1,1.10
9
7,7.10
8
8,7.10
7
UFRGS Lc 523
1,5.10
9
8,2.10
8
2,2.10
8
1,6.10
8
7,2.10
6
7,0.10
4
UFRGS Lc 547
9,1.10
8
7,9.10
8
1,2.10
8
8,9.10
4
3,8.10
4
9,5.10
3
UFRGS Lc 586
1,2.10
9
8,1.10
8
1,1.10
8
1,0.10
6
- -
UFRGS Lc 594
1,0.10
9
1,6.10
8
8,1.10
6
2,5.10
5
7,7.10
4
1,9.10
4
UFRGS Lc 596
1,4.10
9
2,3.10
8
1,1.10
7
7,4.10
4
- -
UFRGS Lc 597
1,7.109 7,3.107 1,4.106 - - -
UFRGS Lc 601
1,1.109 8,5.108 1,2.106 1,1.104 2,5.104 -
41
Tabela 8 – Continuação.
Concentrações de KCl (gL
-1
)
Rizóbios
0* 4 8 12 16 20
Isolados
-------------------------UFC.mL
-1
-------------------------
UFRGS Lc 602 6,3.10
8
7,5.10
6
9,1.10
4
- - -
UFRGS Lc 605 8,2.10
8
7,2.10
8
9,6.10
6
6,9.10
4
1,2.10
5
9,4.10
4
UFRGS Lc 607 7,6.10
8
7,2.10
8
6,9.10
5
- - -
UFGRS Lc 609 1,4.10
9
7,7.10
8
2,5.10
7
7,9.10
3
1,2.10
5
2,9.10
4
UFRGS Lc 610 1,8.10
9
1,3.10
9
1,5.10
9
9,6.10
5
2,5.10
5
-
UFRGS Lc 614 2,4.10
9
1,3.10
9
1,5.10
8
4,2.10
5
8,0.10
5
-
UFRGS Lg 74 1,7.10
9
2,0.10
9
1,8.10
9
1,4.10
9
1,6.10
8
6,5.10
6
UFRGS Lg 85 9,8.10
8
6,3.10
8
7,6.10
7
6,9.10
7
8,7.10
4
-
UFRGS Lg 88 4,7.10
8
7,6.10
7
6,5.10
7
7,6.10
7
- -
UFRGS Ls 1 5,5.10
8
2,4.10
8
3,7.10
3
- - -
UFRGS Ls 5 3,4.10
8
2,1.10
8
2,3.10
4
5,9.10
3
- -
UFRGS Ls 33 8,9.10
8
8,5.10
8
2,5.10
5
4,9.10
5
- -
UFRGS Ls 36 9,9.10
8
8,7.10
8
2,6.10
5
9,5.10
3
- -
UFRGS Ls 45 6,9.10
8
3,2.10
8
9,0.10
4
2,0.10
4
- -
UFGRS Ls 46 7,8.10
8
6,9.10
8
3,4.10
5
- - -
UFRGS Lu 9 1,1.10
9
1,6.10
8
2,1.10
5
1,8.10
5
- -
UFRGS Lu 14 2,3.10
8
1,6.10
8
1,2.10
5
1,1.10
4
- -
UFRGS Lu 16 3,3.10
8
1,7.10
8
1,7.10
5
2,2.10
4
- -
UFRGS Lu 19 2,4.10
8
1,3.10
8
8,2.10
4
- - -
UFRGS Lu 21 3,2.10
7
2,6.10
6
- - - -
UFRGS Lu 25 2,0.10
8
1,3.10
8
- - - -
UFRGS Lu 26 6,4.10
8
4,9.10
6
6,2.10
5
2,6.10
3
- -
UFRGS Lu 56 9,7.10
7
9,4.10
6
7,1.10
5
8,5.10
3
8,1.10
3
7,9.10
3
UFRGS Lu 57 5,1.10
8
6,7.10
8
6,6.10
8
8,6.10
7
7,6.10
7
7,7.10
4
UFRGS Lu 59 1,4.10
9
1,0.10
9
8,4.10
8
5,8.10
8
8,1.10
6
9,2.10
5
UFRGS Lu 67 9,3.10
7
1,2.10
4
1,4.10
4
- - -
UFRGS Lu 71 1,1.10
9
8,3.10
8
1,9.10
6
2,2.10
4
2,2.10
4
7,7.10
3
Legenda: KCl = Cloreto de Potássio; gL
-1
= grama por litro; 0* = sem adição de Cloreto de
Potássio (concentração de potássio no meio levedura-manitol igual 0,22 gL
-1
); UFC = Unidades
formadoras de colônias; mL = mililitros; SEMIA = Sessão de Microbiologia Agrícola (Coleção
Brasileira Oficial de rizóbios); UFRGS = Universidade Federal do Rio Grande do Sul; Lc = Lotus
corniculatus; Lg = Lotus glaber (sm L. tenuis); Ls = Lotus subbiflorus; Lu = Lotus uliginosus.
42
Em relação às estirpes liberadas para a produção de inoculantes de
Lotus spp, assim como observado no estudo com NaCl, somente a SEMIA 849
apresentou crescimento de células viáveis em todas as concentrações testadas
(4 a 20 gL
-1
) SEMIA 830 obteve crescimento nas concentrações de 4 a 16 gL
-1
de KCl, enquanto que SEMIA 806 e SEMIA 816 apresentaram semelhante
crescimento bacteriano entre si nas concentrações de 4 a 12 gL
-1
, com
populações na ordem de 10
9
e 10
8
UFC.mL
-1
, e SEMIA 839 demonstrou ser
resistente somente na concentração de 4 gL
-1
, obtendo populações na ordem
de 10
8
UFC.mL
-1
.
Os isolados de rizóbios UFRGS Lc 602 e Lu 67 foram sensíveis ao
estresse salino tanto em concentrações altas de NaCl quanto de KCl. Segundo
Mary et al. (1986), tanto o NaCl quanto o KCl apresentam toxicidade similar em
diferentes espécies de rizóbios, o que foi observado nos resultados de 18
isolados de rizóbios para Lotus spp neste estudo, sendo eles UFRGS Lc 7, Lc
9, Lc 11, Lc 356, Lc 523, Lc 586, Lc 609, Lc 610, Ls 1, Ls 5, Ls 33, Ls 36, Lu 9,
Lu 14, Lu 16, Lu 19, Lu 59, Lu 71. Upchurch e Elkan (1977), relataram, em seu
estudo, que KCl apresentou efeito mais inibitório de que NaCl em mesmas
concentrações para quatro estirpes de Rhizobium japonicum, atualmente
denominado Bradyrhizobium japonicum, mas, esse efeito não foi observado
neste trabalho (Figura 1). Pelo contrário, dentre os 52 isolados de rizóbios para
Lotus sp. estudados, 21 (40%) rizóbios (UFRGS Lc 2, Lc 3, Lc 4, Lc 5, Lc 8, Lc
322, Lc 329, Lc 372, Lc 516, Lc 517, Lc 520, Lc 596, Lc 602, Lc 614, Lg 74, Lg
85, Lg 88, Ls 45, Ls 46, Lu 25, Lu 57) demonstraram que o NaCl apresentou
efeito inibitório mais significativo que o KCl sobre o crescimento de células
viáveis. Resultados semelhantes foram obtidos pelos autores Elsheikh e Wood
(1990), estudando o efeito de diferentes concentrações de sódio e potássio na
forma de NaCl e KCl, respectivamente, no crescimento de Rhizobium sp. para
grão-de-bico, estirpe Ch192 e R. fredii para soja, estirpe USDA 201 os autores
observaram, também, que no meio salino contendo potássio, na forma de KCl,
ocorreu crescimento maior das estirpes do que no meio salino com sódio, na
forma de NaCl, em que as estirpes foram resistentes em concentração de 2,5%
de KCl enquanto que em NaCl na concentração de 2,0%.
43
Figura 1 – Regressão linear das diferentes concentrações de NaCl e de KCl,
em meio levedura e manitol, sobre os isolados e estirpes de rizóbios de Lotus
spp.
4.3. Produção de melanina
A formação de melanina em placas contendo meio TY suplementado
com L-tirosina e CuSO
4
não foi observada em nenhum dos 52 isolados de
rizóbios para Lotus spp, assim como, em nenhuma das estirpes de
Mesorhizobium loti liberadas para a produção de inoculantes de espécies de
Lotus, nem no controle negativo, a estirpe de Rhizobium tropici SEMIA 4077
(CIAT 899), conhecida por não produzir melanina (Cubo et al., 1988; Gao e
Borthakur, 1995; Sá, 2001). Foi observada apenas nos controles positivos os
isolados UFRGS Lg 111 e UFRGS Lg 121, rizóbios isolados de Lotus glaber,
como havia sido demonstrado por Fontoura (2007). Wang et al. (1999),
obtiveram resultados similares, em solos do México, em que 50 rizóbios
isolados de Mimosa affinis, selecionados aleatoriamente entre 140 isolados,
não foram capazes de produzir melanina. Giongo (2003) também observou que
nenhum dos 86 rizóbios isolados de Phaseolus vulgaris foram capazes de
produzir melanina em meio sólido. Aparentemente estes rizóbios ou não
apresentam o gene mel (Cubo et al., 1997) ou falharam na expressão do
mesmo.
44
A produção de melanina pôde ser visualizada em torno de uma hora
após o tratamento das colônias com SDS 10% para os controles positivos
UFRGS Lg 111 e UFRGS Lg 121. Esse comportamento também foi observado
por Cubo et al. (1988) avaliando a capacidade de produção de melanina por
diferentes espécies do gênero Rhizobium.
4.4. Produção de sideróforos
A produção de sideróforos foi verificada pelo cultivo dos isolados em
meio de cultura deficiente em ferro, meio King B (King et al., 1954), e o
complexo CAS (Schwyn e Neilands, 1987). A produção de sideróforos foi
considerada positiva para aqueles isolados de rizóbios e estirpes que
converteram a cor azul da solução indicadora de CAS para amarelo-
avermelhado, denominado cor ocre. Isso acontece quando um ligante forte
seqüestra e complexa o Fe. O corante assim é liberado, o que causa mudança
de cor (Cattelan, 1999). A produção de sideróforo não foi observada em
nenhum dos 52 isolados de rizóbios para Lotus spp, o que possivelmente pode
ser atribuído a incapacidade de retirarem ferro do meio de cultura. Resultado
semelhante foi obtido no trabalho de Giongo (2003), em que nenhum dos
rizóbios isolados de Phaseolus vulgaris, foram capazes de produzir sideróforos.
Assim como no estudo de Singh et al. (2008), em que células de Rhizobium
cultivados em meio King B, também não apresentaram produção de
sideróforos. Entretanto, Silveira (2009) analisando a produção de sideróforos
em Bradyrhizobium, verificou que todas as sete estirpes de B. elkanii avaliadas
apresentaram-se como produtoras de sideróforos, e que ao contrário, dentre
dez linhagens de B. japonicum, apenas duas tiveram produção positiva.
Entre as estirpes, liberadas para produção de inoculantes de Lotus,
também não foi observada a produção de sideróforos. As estirpes de
Pseudomonas sp., PSII e PSIII, utilizadas como controle positivo, converteram
a cor azul da solução indicadora de CAS para amarelo-avermelhado, indicando
assim produção de sideróforos; também, observou-se que a estirpe de
Rhizobium tropici SEMIA 4077 (CIAT 899) converteu a cor azul da solução
indicadora de CAS para amarelado, confirmando a característica já conhecida
(Sá, 2001).
45
4.5. Avaliação da eficiência dos rizóbios na fixação simbiótica
de nitrogênio
Os sete isolados (UFRGS Lc 5, Lc 607, Lc 609, Lc 614, Lu 56, Lu 57
e Lu 59) de rizóbios testados em plantas de Lotus corniculatus L. cv São
Gabriel quanto à sua eficiência de fixação biológica de nitrogênio foram
selecionados entre os 16 isolados resistentes tanto a pH 4,2 quanto a alumínio
tóxico. Estes foram os que formaram nódulos nas plântulas quando avaliados
in vitro com o meio de Murashige e Skoog (1962) modificado, com formação de
nódulos vermelhos, indicando a presença de leghemoglobina que é sintetizada
nos nódulos de raiz de plantas leguminosas durante a fixação simbiótica de
nitrogênio. Os rizóbios selecionados para ensaio de eficiência, bem como as
estirpes liberadas para produção de inoculantes SEMIA 806 e SEMIA 816,
induziram nodulação e fixaram nitrogênio em simbiose com plantas de Lotus
corniculatus L. cv. São Gabriel em condições de casa de vegetação, utilizando
o solo Argissolo Vermelho-Amarelo distrófico típico, coletado na Unidade
Viamão da FEPAGRO (Tabela 9).
As plantas inoculadas com o isolado UFRGS Lu 59 produziram o
maior número médio de nódulos por vaso (316), seguido dos isolados UFRGS
Lu 56 e UFRGS Lc 614, com 281 e 215 de nódulos por vaso. Esses valores
foram superiores aos produzidos pelas inoculadas com as estirpes
recomendadas SEMIA 806 e SEMIA 816, enquanto que plantas inoculadas
com o isolado UFRGS Lu 57 apresentaram o menor número médio de nódulos,
52 nódulos por vaso. Nos tratamentos controles, com e sem adição de
nitrogênio, não foi observada a formação de nódulos radiculares, o que
demonstra que o solo utilizado no estudo não apresentava população de
rizóbios noduladores de cornichão. Dessa forma, não houve competição dos
isolados e estirpes com a população nativa do solo no processo de formação
do nódulo. De acordo com Herridge e Bergensen (1988), quando existe no solo
população naturalizada de rizóbio, os mesmos competem com os rizóbios que
estão sendo introduzidos.
46
Tabela 9 – Número de nódulos e da massa seca de nódulos, e produção de
massa seca e nitrogênio total da parte aérea de plantas de Lotus corniculatus
L. cv. São Gabriel inoculados com isolados de rizóbios e estirpes liberadas
para produção de inoculantes.
Tratamentos
Nº de
nódulos
Massa seca
de nódulos
Massa seca da
parte aérea Nitrogênio Total
----------------mg.vaso
-1
------------------
T+N - - 900,8 a 47,5 a
Lu 56 281 b 72,7 a 829,0 a 21,8 b
Lc 5 98 e 35,8 b 917,6 a 20,9 b
Lu 57 52 f 10,7 c 827,0 a 20,6 b
Lc 614 215 c 54,8 b 727,2 a 19,5 b
Lc 607 131 d 60,8 b 709,6 a 18,9 b
Lu 59 316 a 51,2 b 675,0 a 18,3 b
Lc 609 145 d 81,4 a 684,8 a 18,3 b
SEMIA 806 113 e 57,8 b 466,7 b 11,2 c
SEMIA 816 141 d 52,4 b 590,0 b 13,1 c
T-N - - 288,4 c 3,8 d
Média 136 43,4 696,5 19,6
C.V.(%) 13,65 41,45 24,77 28,37
Médias seguida de mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Scott Knott, ao
nível de 5% de probabilidade. Legenda: T+N = controle com adição de nitrogênio; T-N = sem
adição de nitrogênio.
Os isolados neste trabalho, apresentaram grande capacidade de
induzir nodulação em Lotus corniculatus, quando comparado com os resultados
obtidos por Frizzo (2007), que observou a formação de até 81 nódulos, e pelos
obtidos por Barrientos et al. (2002) com isolados autóctones de regiões do
Chile, cuja maior nodulação foi de dois nódulos por planta. O isolado que
apresentou o maior número médio de nódulos por vaso, UFRGS Lu 59, foi
isolado de uma planta de Lotus uliginosus, o que demonstra que rizóbios de L.
uliginosus podem nodular plantas de L. corniculatus. Situação essa que
também foi observada por Tonon (2008), no estudo de compatibilidade
simbiótica de rizóbios de Lotus spp, em que foram inoculados isolados de
rizóbios obtidos de L. uliginosus em plantas de L. corniculatus, e estes
induziram a formação de nódulos e dos 35 isolados estudados, 12
apresentaram capacidade de fixar nitrogênio simbioticamente.
Em relação à massa seca de nódulos observou-se que, na maioria,
não houve correlação com o número de nódulos. O isolado UFRGS Lc 609, por
47
exemplo, foi o que apresentou o maior valor de massa seca de nódulos, 81,4
mg.vaso
-1
, contendo menos da metade do número médio de nódulos que o
isolado UFRGS Lu 59, o qual apresentou uma massa de nódulos equivalente a
51,2 mg.vaso
-1
, indicando a formação de nódulos maiores e mais pesados pelo
isolado UFRGS Lc 609. Entretanto, o isolado UFRGS Lu 57 além do menor
número médio de nódulos por vaso (52 nódulos) entre os isolados e estirpes,
também apresentou a menor massa seca de nódulos, correspondente a 10,7
mg.vaso
-1
.
Não se observou também correlação entre a massa seca de nódulos
com a massa seca da parte aérea das plantas. Observação semelhante foi
realizada por Frizzo (2007) no estudo de 15 isolados de rizóbios em plantas de
Lotus corniculatus em casa de vegetação. Fato também constatado por Brose
(1992) em um trabalho com 16 estirpes de Rhizobium loti, denominado
atualmente de Mesorhizobium loti, inoculadas em plantas de L. corniculatus,
cultivadas em vasos contendo solo da Unidade de Mapeamento Vacaria
(Latossolo Bruno), em condições de casa de vegetação.
A massa seca da parte aérea não diferiu entre os isolados testados
neste experimento, que se igualaram ao tratamento controle com adubação
nitrogenada e superaram as estirpes recomendadas SEMIA 806 e SEMIA 816.
Estas, por sua vez, não diferiram entre si, mas superaram o tratamento sem
inoculação e sem adubação nitrogenada. Estes resultados mostram que as
estirpes SEMIA 806 e SEMIA 816, nas condições do experimento, foram
ineficientes em suprir nitrogênio para o crescimento da parte aérea da planta.
Resultado semelhante foi encontrado por Frizzo (2007) que também constatou
a ineficiência da estirpe SEMIA 806.
Avaliando-se os valores de acúmulo de nitrogênio total na parte
aérea das plantas, observa-se que o tratamento controle com adição de
nitrogênio acumulou teor de nitrogênio superior ao dos demais tratamentos. Os
tratamentos inoculados com os isolados de rizóbios não diferiram entre si,
sendo superiores aos tratamentos inoculados com as estirpes liberadas para a
produção de inoculantes de L. corniculatus e ao tratamento controle sem
adição de nitrogênio. Cabe ressaltar que o tratamento controle com adição de
nitrogênio, mesmo apresentando nitrogênio total na parte aérea superior aos
demais tratamentos, não diferiu dos tratamentos inoculados na massa seca da
48
parte aérea, o que pode indicar que nem sempre uma maior absorção de
nutriente vai resultar em maior acúmulo de massa, porque isto depende
também da maneira de como será utilizado essa fonte pela planta. De acordo
com Epstein (1972), pode haver consumo de luxo, em que a planta absorve o
nutriente e isto não é traduzido em aumento de rendimento. No caso do
experimento, o solo utilizado não foi corrigido, o que pode ter ocasionado falta
de nutrientes e, assim, ter feito com que o nitrogênio a mais não se
convertesse em massa seca.
Os índices de eficiência relativa na fixação simbiótica de nitrogênio,
apresentados na Figura 2, indicam a percentagem da contribuição, em termos
de nitrogênio fixado, do tratamento inoculado em relação aos tratamentos
controle com adição de nitrogênio, de acordo com a fórmula empregada por
Brockwell et al. (1966). Os índices de eficiência relativa calculados para os
tratamentos inoculados variaram de 45% a 19%. Na Figura 2, observa-se que
os tratamentos inoculados com os isolados UFRGS Lc 5 apresentaram índice
de eficiência relativa de 44,8%, com UFRGS Lu 56 de 44,6% e com Lu 57 de
40,8%. Os demais apresentaram índice de eficiência relativa abaixo de 40%,
sendo que os inoculados com as estirpes SEMIA 816 e SEMIA 806
apresentaram índice em torno de 20%.
36 a
36 a
38 a
39 a
41 a
45 a
23 b
45 a
19 b
0
10
20
30
40
50
SEMIA 806
SEMIA 816
Lc 5
Lu 56
Lu 57
Lc 614
Lc 607
Lu 59
Lc 609
Tratamentos
Eficiênica Relativa (%)
Figura 2 – Índice de eficiência relativa na fixação simbiótica de nitrogênio em
plantas de Lotus corniculatus inoculadas com isolados de rizóbios e estirpes
SEMIA 806 e SEMIA 816 (Médias comparadas pelo teste de Scott Knott, ao
nível de 5% de probabilidade).
49
As estirpes SEMIA 816 e SEMIA 806, liberadas para produção de
inoculantes para L. corniculatus, apresentaram desempenho insatisfatório no
experimento. SEMIA 806 que teve a menor contribuição em termos de matéria
seca e nitrogênio total na parte aérea, não diferindo do tratamento controle sem
nitrogênio, evidenciando uma provável perda de eficiência desta estirpe.
Resultado semelhante foi encontrado por Frizzo (2007), que verificou que a
estirpe SEMIA 806 apresentou menor contribuição em termos de acúmulo de
matéria seca e teor de nitrogênio total na parte aérea, assim como baixo índice
de eficiência relativa e baixo número de nódulos e massa seca de nódulos.
Alguns autores, como Date (1982) e Barrientos et al. (2002) já relataram a
perda de eficiência de estirpes devido a mutações espontâneas.
4.6. Avaliação dos rizóbios na germinação e no
desenvolvimento de plântulas
Os rizóbios que foram testados em sementes de Lotus corniculatus
L. cv. São Gabriel quanto o seu efeito na germinação e o desenvolvimento de
plântulas foram os mesmos que haviam sido selecionados para a avaliação de
eficiência na fixação simbiótica de nitrogênio em casa de vegetação. Na Tabela
10, se pode observar que, em relação à germinação inicial, os isolados UFRGS
Lc 5 e Lu 56 apresentaram valores acima de 80%, sendo semelhantes ao valor
de germinação inicial do tratamento controle não inoculado que somente
recebeu água destilada estéril, diferindo do tratamento controle não inoculado
que somente recebeu meio de cultura líquido LM, com valor abaixo de 70%.
Entretanto, no que se refere à germinação final e ao índice de velocidade de
germinação (IVG%), não se verificou diferença entre os tratamentos inoculados
com rizóbios e os tratamentos não inoculados demonstrando que os
microrganismos não ocasionaram interferência direta na germinação das
sementes de cornichão.
50
Tabela 10 – Efeito da inoculação com rizóbios sobre a germinação e o
desenvolvimento de plântulas de Lotus corniculatus L. cv. São Gabriel.
Germinação Comprimento
Tratamentos
Inicial Final IVG Parte Aérea
Raiz
Massa Seca
Parte Aérea
----------%---------- -------cm------- mg
T+Água 84,0 a 86,5 a
21,3 a
1,70 d 1,69 a
25,5 b
Lc 5 82,0 a 88,5 a 21,3 a 2,93 a 0,90 b
28,5 b
Lu 57 81,0 a 84,5 a 20,8 a
2,47 c 0,58 c
35,2 a
Lu 56 75,0 b
83,0 a
20,3 a
2,55 b 0,68 c
33,7 a
Lc 609 75,0 b
79,5 a 19,3 a 2,33 c 0,86 b
26,5 b
Lu 59 75,0 b
89,0 a 21,2 a 2,95 a 0,76 b
28,7 b
Lc 614 74,0 b 83,0 a
19,8 a 2,14 c 0,58 c
31,0 a
Lc 607 71,0 b 85,0 a
20,4 a 2,31 c 0,84 b
26,5 b
SEMIA 806 78,0 a 89,0 a
21,3 a 2,05 c 0,50 c
30,7 a
SEMIA 816 71,0 b 84,5 a 20,2 a 2,42 c 0,62 c
27,5 b
T+LM 64,5 b 72,5 a
17,4 a 2,19 c 0,57 c
27,7 b
Média 75,5 84,1 20,3 2,37 0,78 29,2
C.V. (%) 8,74 7,87 7,62 9,72 18,02
14,39
Médias seguidas de mesma letra minúscula não diferem pelo teste de Scott Knott, ao nível de
5% de probabilidade. Legenda: T+Água = tratamento controle não inoculado que somente
recebeu água destilada estéril; T+LM = tratamento controle não inoculado que somente
recebeu meio de cultura líquido LM.
A avaliação dos parâmetros de desenvolvimento de plântulas
mostrou diferenças significativas entres os tratamentos testados. As plantas
inoculadas com os isolados de rizóbios UFRGS Lc 5 e Lu 59 apresentaram
maior crescimento da parte aérea, seguido do tratamento com o isolado
UFRGS Lu 56. Já as plantas do tratamento controle sem inoculação que
somente recebeu água destilada estéril apresentaram menor crescimento da
parte aérea. A influência no desenvolvimento de plântulas, observada neste
trabalho poderia ser atribuída a mecanismos de promoção de crescimento
vegetal por microrganismos (Marchioro, 2005), através da síntese de
fitohormônios, como auxina, citocinina, giberelina e etileno. Em que, as
giberelinas atuam estimulando o crescimento da parte aérea, tendo pouco
efeito sobre o crescimento das raízes, enquanto que a auxina tem como
principal efeito promover o crescimento de raízes (Marchioro, 2005).
Entretanto, a ação dos hormônios depende de outros mecanismos que regulam
sua liberação da forma conjugada para livre entre os tecidos de reserva e as
demais partes da planta.
51
4.7. Caracterização genética dos isolados de rizóbios
As amplificações do DNA genômico com oligonucleotídeos
iniciadores BOX A 1-R, ERIC (ERIC1-R e ERIC-2) e RISA (SD-Bact-1522-bS-
20 e LD-Bact-132-aA-18), submetidas à eletroforese em gel de agarose 1,5%,
permitiu a obtenção de perfis característicos para as estirpes e isolados
estudados neste trabalho. A análise dos padrões de bandas, formadas a partir
da amplificação com BOX A 1-R (Figura 3), revelou a inexistência de bandas
comuns a todos os 52 isolados de rizóbios para Lotus sp. e estirpes. O
tamanho das bandas de ocorrência mais frequente foi em torno de 6.500 pares
de base (pb), observada em 22 rizóbios, 1.650 pb (observada em 17 rizóbios) e
1.200 pb (observada em 17 rizóbios). Alguns rizóbios apresentaram perfis de
bandas semelhantes: UFRGS Lc 8 e UFRGS Lc 9; UFRGS Ls 46 e UFRGS Lu
14; UFRGS Lc 322 e UFRGS Lc 329; UFRGS Lc 597, UFRGS Lc 602, UFRGS
Lc 605, UFRGS Lc 607 e UFRGS Lc 609.
Figura 3 – Exemplos de géis contendo o perfil eletroforético de bandas do
produto da amplificação do DNA genômico por PCR com o oligonucleotídeo
iniciador BOX A 1-R. Legenda: 1Kb = padrão 1Kb plus DNA ladder (Invitrogen).
52
Analisando-se os padrões de bandas formadas pela amplificação
com ERIC (Figura 4), também se observa, assim como no PCR-BOX, a
inexistência de bandas comuns a todos os isolados de rizóbios e estirpes. As
bandas de ocorrência mais freqüente foram 1.200 pb (presente em 20 rizóbios)
e 1.000 pb (presente em 19 rizóbios). Os isolados UFRGS Lc 597 e UFRGS Lc
601 apresentaram perfis de bandas semelhantes entre si.
Figura 4 – Exemplos de géis contendo o perfil eletroforético de bandas do
produto da amplificação do DNA genômico por PCR com os oligonucleotídeos
iniciadores ERIC (ERIC1-R e ERIC-2). Legenda: 1Kb = padrão 1Kb plus DNA
ladder (Invitrogen).
Na análise do padrão de bandas, formadas a partir da amplificação
do DNA genômico com RISA (Figura 5) observa-se a formação de uma única
banda em cada isolado e estirpe. O tamanho dos fragmentos variou de 1.500
pb até 600 pb, dependendo do rizóbio avaliado.
53
Figura 5 – Exemplos de géis contendo o perfil eletroforético de bandas do
produto da amplificação do DNA genômico por PCR com os oligonucleotídeos
iniciadores RISA (SD-Bact-1522-bS-20 e LD-Bact-132-aA-18). Legenda: 1Kb =
padrão 1Kb plus DNA ladder (Invitrogen).
Da análise da matriz binária conjunta dos perfis eletroforéticos dos
produtos da amplificação com os oligonucleotídeos iniciadores BOX A 1-R,
ERIC e RISA, foi elaborado um dendrograma de similaridade/dissimilaridade
(Figura 6), utilizando-se o coeficiente de Jaccard. No dendrograma observa-se
que apenas dois isolados, UFRGS Lc 597 e UFRGS Lc 601, apresentaram
grau de similaridade acima de 70%. Não foram encontrados isolados com
100% de similaridade com qualquer das estirpes liberadas para a produção de
inoculantes, indicando que os isolados obtidos de amostras de solos de
diversas localidades do Rio Grande do Sul não são reisolamentos das estirpes
utilizadas nos inoculantes. O grau máximo de similaridade entre as estirpes
liberadas para a produção de inoculantes para Lotus spp e um isolado foi de
38%, entre a estirpe SEMIA 830 e isolado UFRGS Lc 586. Outros três grupos
envolvendo as estirpes recomendadas para Lotus sp. foram formados, como
SEMIA 806 e SEMIA 816, SEMIA 839 e UFRGS Lu 9, SEMIA 849 e UFRGS Lc
596, apresentado grau de similaridade menor do que 30%. A formação dos
grupos não esteve ligada diretamente aos locais de origem dos isolados, bem
como as espécies de Lotus de cujos nódulos se obtiveram os isolados.
54
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Similaridade (Jaccard)
SEMIA 816
SEMIA 806
Ls 5
Lc 372
SEMIA 839
Lu 9
Lc 516
SEMIA 830
Lc 586
Lc 520
Ls 45
Ls 1
Lu 71
Ls 36
Lg 74
Lg 88
Lg 85
Lc 523
Lc 547
Lc 2
Lc 4
Lc 3
Lc5
Lc 605
Lc 607
Lc 609
Lc 597
Lc 601
SEMIA 849
Lc 596
Lc 602
Lc 610
Lc 517
Lu 16
Lu 19
Lu 21
Lu 25
Lu 26
Lu56
Lu 57
Lu 59
Lu 67
Ls 33
Lc 336
Lc 340
Lc 7
Lc 8
Lc 9
Lc 11
Ls 46
Lu 14
Lc 322
Lc 329
SEMIA 4077
Lc 348
Lc 356
Lc 614
Lc 594
Figura 6 – Dendrograma de genotipagem de estirpes e isolados de rizóbios,
autóctones em solos do Rio Grande do Sul, simbiotes em quatro espécies de
Lotus. Agrupamento obtido pelo coeficiente de Jaccard, para perfil de bandas
obtido a partir da PCR com os oligonucleotídeos iniciadores BOX A1-R, ERIC e
RISA.
55
O índice de diversidade de Shannon, calculado a partir do número
de grupos e número de indivíduos por grupo, foi de 4,05. Resultados
semelhantes foram obtidos por Vargas et al. (2007) que encontrou um índice
de 4,3 estudando a diversidade genética de rizóbios noduladores de acácia-
negra no Rio Grande do Sul. Lõhmus et al. (2006) também obtiveram índices
de Shannon de 4,63 e de 4,56 entre as comunidades bacterianas extraídas de
solos cultiváveis. Giongo (2007) encontrou índices entre 4,41 e 6,17 estudando
a diversidade de Bradyrhizobium elkanii e B. japonicum que nodulam soja em
solos do Rio Grande do Sul. Entretanto, Andrade et al. (2002), Borges et al.
(2003) e Dilly et al. (2004) encontraram índices de diversidade menores
avaliando a diversidade de isolados de rizóbios noduladores de feijão, de
Escherichia coli em águas ambientais e de populações bacterianas em solos,
respectivamente. Fontoura (2007) obteve índices de Shannon 2,098 e 2,053
estudando a diversidade dos rizóbios isolados de Lotus glaber e L. subbiflorus.
Frizzo (2007), estudando a diversidade dos rizóbios isolados de L. corniculatus
e L. uliginosus, obteve índices de diversidades de 2,56 e 2,79. O alto índice de
Shannon encontrado neste estudo indica elevada diversidade entre os isolados
de rizóbios de Lotus spp em solos do Rio Grande do Sul, demonstrando ser
essa uma fonte potencial para a seleção de novas estirpes mais eficientes do
que as atualmente liberadas para a produção de inoculantes.
5. CONCLUSÕES
a) Entre os isolados e estirpes estudados, é possível a seleção de rizóbios
para Lotus spp autóctones em solos do Rio Grande do Sul resistentes a
acidez e salinidade do solo;
b) Os rizóbios estudados não apresentam produção de melanina nem
produção de sideróforos;
c) Os rizóbios selecionados, para ensaio de eficiência na fixação simbiótica
de nitrogênio sob condição de casa de vegetação, induzem nodulação e
fixam nitrogênio em simbiose com plantas de Lotus corniculatus;
d) Existe uma alta diversidade entre os rizóbios autóctones em solos do
Rio Grande do Sul simbiontes em L. corniculatus, L. glaber, L.
subbiflorus e L. uliginosus indicando que os rizóbios estudados não são
reisolamentos de estirpes utilizadas em inoculantes para as espécies de
Lotus estudadas.
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7. APÊNDICES
75
Apêndice 1 – Meio extrato de levedura, manitol, ágar – LMA (Vincent, 1970)
Composição Concentração (gL
-1
)
Manitol 10,0
K
2
HPO
4
0,5
MgSO
4
.7H
2
O 0,2
NaCl 0,1
Extrato de levedura 0,4
Ágar 15,0
Água destilada 1000mL
Obs.: Ajustar pH em 6,8;
Se necessário, acrescentar 5mL de corante Azul de Bromotinol (0,5g
azul de bromotinol e 100mL etanol) ou Vermelho Congo (0,5g vermelho congo
e 100mL água destilada) por litro de meio LMA antes da medição de pH.
76
Apêndice 2 – Composição do meio de cultura MWC*
Composição Concentração (µM)
CaCl
2
.6H
2
O 1000
MgSO
4
.7H
2
O 500
KCl 50
FeEDTA** 25
K
2
HPO
4
10
H
3
BO
3
10
MnSO
4
.4H
2
O 1
ZnSO
4
.7H
2
O 5
CuSO
4
.5H
2
O 1
NaMoO
4
.2H
2
O 25
CoCl
2
.6H
2
O 5
Glutamato de sódio*** 1,8g/L
Arabinose*** 0,3g/L
Galactose*** 0,3g/L
Tiamina HCl*** 100µg/L
Biotina*** 250µg/L
*Ajustou-se o pH do meio após autoclavagem com HCl ou NaOH 10%
esterilizados por filtração; **FeEDTA foi substituído por FeCl
3
; ***Soluções
esterilizadas por filtração e adicionadas ao meio após autoclavagem.
77
Apêndice 3 – Meio triptona levedura – TY (Somasegaram e Hoben, 1994)
Composição Concentração (gL
-1
)
Triptona 5,0
Extrato de levedura 3,0
Cloreto de Cálcio 0,87
Água destilada 1000mL
Obs.: Ajustar pH em 6,8;
Para elaboração de meio sólido, acrescentar 15g de ágar por litro de
meio.
78
Apêndice 4 – Meio extrato de levedura e manitol – LM (Vincent, 1970)
Composição Concentração (gL
-1
)
Manitol 10,0
K
2
HPO
4
0,5
MgSO
4
.7H
2
O 0,2
NaCl 0,1
Extrato de levedura 0,4
Água destilada 1000mL
Obs.: Ajustar pH em 6,8.
79
Apêndice 5 – Solução de brometo hexadeciltrimetilamonio (HDTMA) 10mM
Em um balão volumétrico de 1000mL dissolver 3,645g de HDTMA em
um pouco de água destilada estéril, agitar e completar o volume.
Apêndice 6 – Solução Férrica (FeCl
3
.6H
2
O 1mM e HCl 0,01N)
Solução de FeCl
3
.6H
2
O 1mM: em um balão volumétrico de 1000mL,
dissolver 0,270g de FeCl
3
.6H
2
O em um pouco de água destilada estéril, agitar
e completar o volume;
Solução de HCl 0,01N: em um balão voumétrico de 1000mL, adicionar
um pouco de água destilada estéril, em seguida, adicionar 0,82mL de HCl
concentrado (36,5% a 38%), agitar e completar o volume com água destilada
estéril.
80
Apêndice 7 – Meio de King B – KMB (King et al., 1954)
Composição Concentração (gL
-1
)
Proteose petona #3 20,0
Glicerol 10,0
K
2
HPO
4
1,5
MgSO
4
.7H
2
O 1,5
Água destilada 1000mL
Obs.: Ajustar pH em 7,2;
Para elaboração de meio sólido, acrescentar 15g de Bacto Ágar por litro
de meio.
81
Apêndice 8 – Meio de Murashige e Skoog (1962) – MS
Composição Concentração (mgL
-1
)
NH
4
NO
3
* 1650
KNO
3
* 1900
CaCl
2
.2H
2
O 440
MgSO
4
.7H
2
O 370
KH
2
PO
4
170
MnSO
4
.7H
2
O 22,3
H
3
BO
3
6,2
ZnSO
4
.7H
2
O 8,6
KI 0,83
NaMoO
4
.2H
2
O 0,25
CuSO
4
.5H
2
O 0,025
CoCl.6H
2
O 0,025
Na
2
EDTA.2H
2
O 37,25
FeSO
4
.7H
2
O 27,85
Tiamina HCl 0,1
Ácido Nicotínico 0,5
Piridoxina HCl 0,5
Glicina 2,0
Mio-Inositol 100
Sacarose 30
Ágar 7,0
Água destilada 1000mL
* **Foram substituído por KCl.
Obs.: Ajustar pH em 5,8.
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