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FÁBIO BAGNOLI
ANÁLISE DAS EXPRESSÕES DA AROMATASE,
METALOPROTEINASES 2 E 9 E CD44 NOS CARCINOMAS
DUCTAIS IN SITU E INFILTRATIVO PRESENTES NA
MESMA MAMA
Dissertação apresentada ao curso de Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo para
obtenção de título de Mestre em Medicina
São Paulo
2010
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Livros Grátis
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FÁBIO BAGNOLI
ANÁLISE DAS EXPRESSÕES DA AROMATASE,
METALOPROTEINASES 2 E 9 E CD44 NOS CARCINOMAS
DUCTAIS IN SITU E INFILTRATIVO PRESENTES NA
MESMA MAMA
Dissertação apresentada ao curso de Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências Médicas
da Santa Casa de São Paulo para obtenção
de título de Mestre em Medicina
Área de Concentração: Tocoginecologia
Orientador: Prof. Dr. Vilmar Marques de Oliveira
Co-Orientadora: Profa. Dra. Maria Antonieta Longo Galvão da Silva
São Paulo
2010
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Bagnoli, Fábio
Análise das expressões da aromatase, metoloproteinases 2 e 9 e
CD44 no carcinomas ductais in situ e infiltrativo presentes na mesma
mama./ Fábio Bagnoli. São Paulo, 2010.
Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Medicina.
Área de Concentração: Tocoginecologia
Orientador: Vilmar Marques de Oliveira
Co-Orientador: Maria Antonieta Longo Galvão da Silva
1. Aromatase 2. Metaloproteinase 2 da matriz 3. Metaloproteinase
9 da matriz 4. Antígenos CD44 5. Carcinoma in situ 6. Carcinoma
intraductal não infiltrante 7. Carcinoma ductal de mama
BC-FCMSCSP/57-10
DEDICATÓRIA
À Marcela, minha amada esposa, que em um momento tão especial de
nossas vidas foi paciente e compreensiva durante todos os momentos
da realização deste trabalho.
À Luiza, minha filha, que veio para nos trazer alegrias.
A Vicente, meu pai, exemplo de médico, professor e pesquisador.
À Eliana, minha mãe, pelo afeto, carinho e zelo sempre dedicado.
A Vicente, meu irmão, amigo e companheiro.
A Antônio e Wanda, meus avós, pelo exemplo de vida.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A Deus, por ter me dado fé, serenidade e perseverança durante esta jornada.
Ao Prof. Dr. Vilmar Marques de Oliveira, verdadeiro professor e orientador,
pelos seus ensinamentos e pelo empenho não só neste trabalho, mas também em
minha formação como médico mastologista.
À Profa. Dra. Maria Antonieta Longo Galvão da Silva, por todo carinho e
dedicação prestada para realização deste estudo.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Tsutomu Aoki, pela confiança em mim depositada e pela
forma sábia como conduz o Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa
Casa de Misericórdia de São Paulo.
Ao Prof. Dr. Antônio Pedro Flores Auge, pelo incentivo à pós graduação
através da coordenação do Programa de Pós Graduação em Tocoginecologia da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo.
Ao Prof. Dr. Sebastião Piato, pela oportunidade dada de iniciar a
atividade didática e pelas estimadas e valorosas considerações em meu exame de
qualificação.
Ao Prof. Dr. José Francisco Rinaldi, pelos ensinamentos em mastologia e
pela análise crítica e construtiva deste trabalho.
Aos Professores Dr. Afonso Celso Pinto Nazário e Dr. Carlos Alberto Ruiz,
pelas contribuições para o engrandecimento deste estudo em meu exame de
qualificação.
Ao Dr. João Ricardo Nicesio, Dra. Lectícia de Siqueira Ribeiro Rios, Dra.
Giuliana Cássia Morrone Taromaru e Dra. Priscila Capel, pela amizade e
companheirismo no dia-dia da Clínica de Mastologia da
Santa Casa de São Paulo.
À Marta, Cinthia e Tatiana pela assessoria prestada na realização deste
trabalho.
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e a
Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo por ter viabilizado o meu
ingresso na vida acadêmica.
LISTA DE ABREVIATURAS
AH: Ácido Hialurônico
BRCA-1: breast cancer type 1
CDI: Carcinoma ductal invasivo
CDIS: Carcinoma ductal in situ
DOGI: Departamento de Obstetrícia e Ginecologia
E1: estrona
E2: estradiol
E1S: Sulfato de Estrona
EMMPRIN: extracellular matrix metalloproteinase inducer
IA: Inibidor de Aromatase
ISCMSP: Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo
MEC: Matriz extracelular
MMP-2: Metaloproteinase 2 da Matriz
MMP-9: Metaloproteinase 9 da Matriz
MMPs: Metaloproteinases da Matriz
PCR: Polimerase Chain Reaction
RNAm: messenger Ribonucleic Acid
STS: Esteróide Sulfatase
TMA: Tissue Microarray
TIMPs: inhibitors of metalloproteinases
TGF-ß :Transforming growth factor ß
17 ßHSD1: 17-ß-hidroxiesteróide tipo 1
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO ........................................................................................ 1
1.1 Aromatase ........................................................................................
6
1.2 Metaloproteinase 2 e 9 .................................................................... 10
1.3 CD44 ................................................................................................
1.4 Correlação entre Aromatase e Metaloproteinase 2 e 9 ...................
1.5 Correlação entre Aromatase e CD44 ..............................................
1.6 Correlação entre CD44 e Metaloproteinases 2 e 9 ..........................
14
17
18
18
2.
OBJETIVOS ..............................................................................................
20
3.
CASUÍSTICA E MÉTODO ........................................................................
22
3.1 Casuística. .......................................................................................
23
3.2 Método ............................................................................................. 24
3.3 Análise Estatística ...........................................................................
32
4.
RESULTADOS............................................................................................ 34
5.
DISCUSSÃO...............................................................................................
9
6.
CONCLUSÕES............................................................................................
46
7.
ANEXOS .....................................................................................................
48
7.1 Reação imunoistoquímica ................................................................
49
7.2 Figuras das expressões imunoistoquímicas
.....................................
52
7.3 Relação entre os diversos biomarcadores ....................................... 56
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................
63
FONTES CONSULTADAS .........................................................................
74
RESUMO ................................................................................................
76
ABSTRACT .............................................................................................
78
LISTAS E APÊNDICES ...........................................................................
80
1. INTRODUÇÃO
2
O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo
entre as mulheres. A cada ano, cerca de 22% dos novos casos de câncer
diagnosticados em mulheres são de mama. Nos Estados Unidos da América, em
2009 foram estimados 192.370 novos casos de câncer de mama e as evidências
sugerem que uma em cada oito mulheres que viva até 80 anos de idade irá
desenvolver câncer de mama (National Cancer Institute 2009).
Dados publicados pelo INCA (Instituto Nacional do Câncer) estimam 49.240
novos casos de câncer de mama no Brasil em 2010, com um risco estimado de 49
casos a cada 100 mil mulheres, sendo este, o segundo tipo mais frequente de
câncer entre as brasileiras, atrás apenas dos de pele não melanomas, e o maior
causador de óbitos. Na Região Sudeste, o câncer de mama é o mais prevalente
entre as mulheres, com um risco estimado de 65 casos novos por 100 mil mulheres
em 2010 (INCA – 2009).
A detecção do carcinoma ductal in situ (CDIS) ou preferencialmente
denominado por Tavassoli et al (2005) como neoplasia ductal in situ, aumentou
consideravelmente nas duas últimas décadas, graças aos avanços na detecção
dessas lesões pelo rastreamento mamográfico (Li et al, 2005). Atualmente os CDIS
3
representam cerca de 20% de todos os carcinomas mamários diagnosticados nos
Estados Unidos (Kepple et al, 2006; Tsikitis, Chung, 2006).
Deve-se considerar que a prevalência do câncer de mama, de acordo com a
faixa etária, tanto nos países desenvolvidos quanto nos países em desenvolvimento
é maior nas mulheres na pós-menopausa, com cerca de 70% (American Cancer
Society 2007).
Há uma série de evidências experimentais e epidemiológicas de que os
estrogênios desempenham papel importante na gênese do câncer de mama, com
alguns carcinomas necessitando estrogênios para continuar crescendo e
progredindo. Três mecanismos são considerados responsáveis pelos efeitos
carcinogênicos dos estrogênios: estimulação da proliferação celular através da
ligação aos receptores hormonais, aumento das taxas de mutação gênica pela
ativação metabólica mediada pelo citocromo P-450 e indução de aneuploidias (Page
et al, 1985; Henderson et al, 1988; Henderson, Canellos, 1990; Russo, Russo,
2006).
A progressão de uma doença proliferativa sem atipias para hiperplasia com
atipias, para CDIS, e desta para carcinoma invasivo, tem sido proposta como um
possível modelo do desenvolvimento de parte dos carcinomas invasivos (Chen,
1998; Singletary, 2002). Outros carcinomas parecem não seguir essas etapas,
tendo patrimônio genético capaz de formar, desde o início, carcinomas in situ ou
4
invasores (van de Vijver et al, 2002; Weigelt et al, 2005). O CDIS é considerado
lesão precursora do carcinoma ductal invasivo (CDI) e o risco de uma mulher com
diagnóstico de CDIS desenvolver CDI é quatro a 10 vezes maior do que uma mulher
sem CDIS (Warnberg et al, 2000).
Nos estágios iniciais desta proposta cascata do desenvolvimento do câncer
de mama, os estrogênios, especialmente o estradiol (E2), são considerados como
um dos fatores etiológicos mais importantes (Shekhar et al, 1997).
Aproximadamente 60% dos casos de câncer de mama em pacientes na pré-
menopausa e 75% na pós-menopausa são estrogênio dependentes (Russo et al,
2003).
Nas mulheres, no menacme e na pré-menopausa o estradiol (E2) é o principal
estrogênio formado, sendo o folículo dominante e o corpo lúteo ovarianos
responsáveis por mais de 95% do E2 circulante, sendo que a conversão periférica
da estrona (E1) para E2, é responsável pela maior parte do E2 restante (Levrant,
Barnes, 1993; Bulun et al,1993; Brueggemeir et al, 2005). Na pós-menopausa, fase
da vida em que ocorre falência ovariana, o estrogênio é produzido através da
conversão periférica de androgênios, produzidos no córtex da adrenal ou gônadas,
pelo complexo da enzima aromatase (Henderson, Canellos, 1990; Sasano et al,
2006).
5
Fatores prognósticos para avaliação das pacientes com câncer de mama são
definidos como dados disponíveis no tempo do diagnóstico ou da cirurgia, na
ausência de terapia sistêmica adjuvante, que determinam ou se correlacionam com
a história natural da doença e que refletem a agressividade inerente ao tumor.
Apresentam, dessa forma, a propriedade da predição do intervalo livre da doença ou
da sobrevida global (Clark, 2000; Chang, Hilsenbeck, 2004).
Dentre os fatores prognósticos estão aqueles já bem estabelecidos e que de
rotina são pesquisados como: linfonodos axilares, tamanho tumoral, graduação
histológica e nuclear, tipo histológico, receptores hormonais; e aqueles que apesar
de terem sua importância, não são estudados rotineiramente, como por exemplo a
aromatase e os marcadores de invasão celular. Dentre os marcadores de invasão
celular estão as metaloproteinases de matriz (MMPs), endopepitídios que promovem
a progressão tumoral e a facilitação da angiogênese, esta diretamente vinculada à
ativação do receptor de membrana CD44 (Tang et al, 2005).
Para ocorrer metástase tumoral à distância é essencial que ocorra
degradação da matriz protéica extracelular, a qual funciona como uma barreira à
passagem celular. Com a degradação da matriz extracelular ocorrerá invasão dos
tecidos locais pelas células tumorais, invasão de vasos sanguíneos e,
consequentemente, metastatização tumoral. Este processo é primeiramente
influenciado pela atividade das proteinases produzidas pelas células tumorais. Há
pelo menos quatro classes de proteinases conhecidas: proteinases de serina,
6
proteinases de cisteína, proteinases de ácido aspártico e metaloproteinases de
matriz. (Nagase et al 2006; Page-McCaw et al, 2007).
Muitos investigadores se dedicaram ao estudo do perfil de expressão das
MMPs (Iwasaki et al, 2002; Hou et al, 2005). Dentre as MMPs merecem destaque a
metaloproteinase de matriz tipo 2 (MMP-2) e a metaloproteinase de matriz tipo 9
(MMP-9), as quais geralmente estão presentes no câncer de mama, caracterizando
prognóstico
mais desfavorável
(Paquette et al, 2003; Hou et al, 2005; Sprague et al,
2006).
Outro marcador de invasão tumoral é a CD44, glicoproteína que envolve a
superfície celular, e pode ser liberada para a circulação por enzimas proteolíticas.
Estudos revelam que pacientes com alta concentração de CD44 apresentam
maiores índices de metástases linfonodais
(Looi et al 2006; Mayer et al 2008). Há
vários estudos que relacionam a alta expressão de CD44 com maior índice de
metástase à distância, contribuindo assim, para um pior prognóstico
(Sheen-Chen et
al, 1999).
1.1 Aromatase
A aromatase, enzima da família do citocromo P-450 é codificada pelo gene
CYP19 localizado no braço longo do cromossomo 15, e se localiza no retículo
endoplasmático das células produtoras de estrogênio. É composta por dois
7
polipeptídeos, sendo responsável pela aromatização da androstenediona em estrona
e testosterona em estradiol, por meio da hidroxilação, oxidação e remoção do
carbono C-19 e aromatização do anel A do esteróide (Subramanian et al, 2008).
O processo da esteroidogênese é complexo, e a enzima aromatase cataliza a
conversão de androstenediona em estrona (E1), enquanto a esteróide sulfatase
(STS) hidroliza sulfato de estrona (E1S) em E1. Posteriormente E1 é convertida em
E2 pela 17-ß-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 1 (17bHSD1). A testosterona, por
sua vez é convertida em E2 pela enzima aromatase (Sasano, Harada, 1998;
Subramanian et al, 2008; Hudelist et al, 2008).
As fontes predominantes de aromatase em mulheres na pós-menopausa são
os tecidos periféricos como músculo, pele e principalmente o tecido adiposo. O
tecido adiposo mamário também apresenta capacidade para formar estrogênios a
partir da aromatização de androgênios circulantes. A aromatase já foi demonstrada
estar presente no interior das células do carcinoma mamário, com evidências de
estar relacionada com vias metabólicas que determinam o incremento na taxa de
proliferação deste tumor (Prichard et al, 2003; Susuki et al, 2005).
Em mulheres na pós-menopausa, o estrogênio pode atuar de maneira
autócrina, na qual este é sintetizado nas próprias células epiteliais tumorais, é
secretado e recaptado. As células estromais vizinhas ao tumor podem produzir
estrogênio o qual é transportado para as células tumorais com liberação para o
8
espaço extracelular de uma maneira parácrina. Além disso, a produção local bioativa
de estrogênios exerce sua ação nas células nas quais a síntese de estrogênio
ocorre sem liberação para o espaço extracelular. Este fenômeno é chamado de
intrácrino. Neste, mínimas quantidades de hormônios bioativos produzem efeito
máximo, tendo importante desempenho no desenvolvimento das neoplasias
hormônio dependentes (Chedrese J, 2003; Subramanian et al, 2008).
Suzuki et al (2005) demonstraram que o E2 é localmente sintetizado nos
tecidos com câncer de mama pela enzima aromatase. Chetrite et al (2000) e Geisler
et al
(2000) demonstraram que a quantidade de 17β-estradiol em fragmentos de
tecido mamário em pacientes na pós-menopausa portadoras de câncer de mama é
maior do que no plasma dessas pacientes. Este fato pode ser explicado através dos
resultados de estudos que mostraram que a atividade da aromatase é mais
expressiva no tecido mamário de pacientes com câncer de mama do que em outros
tecidos (Silva et al, 1989; Miller et al, 1990). Em adição, O`Neill et al
(1988) e Bulun
et al
(1993) demonstraram em seus estudos que a atividade da aromatase e sua
expressão são muito maiores nas regiões de tecidos mamários próximas aos
tumores, e assim podendo ser marcador prognóstico importante.
A grande atuação da aromatase no tecido mamário também foi confirmada
por Yue et al
(1998) que concluíram com seus estudos que a produção de estrogênio
no próprio tecido mamário pela ação da aromatase garante a manutenção dos níveis
do hormônio elevados.
9
De Jong et al (2003) avaliaram a expressão da aromatase em 102 casos de
câncer de mama estádios clínicos III e IV, através do emprego de anticorpos
monoclonais. A expressão foi considerada positiva em 58 (57%) dos 102 casos
avaliados. Em estudo imunoistoquímico de 83 casos de CDI, para investigar a
expressão da aromatase no tecido tumoral, Yamamoto et al (2003), através do
emprego de anticorpos policlonais, observaram que esta estava presente em 47%
dos casos e que ocorria principalmente no componente estromal. Dados
semelhantes foram observados por outros pesquisadores que constataram atividade
significativa da aromatase desde 52% até 72% em amostras de carcinoma invasor
(Díaz-Cruz et al, 2005; Shibuya et al, 2008).
Hudelist et al (2008) encontraram menor expressão da aromatase no
componente estromal do carcinoma ductal in situ quando comparados com
componente invasivo (34% vs. 59,6%; p=0.034) mas sem correlação com a
expressão da aromatase no epitélio. Em estudo de Shibuya et al (2008) a
concentração intratumoral de estradiol foi quatro vezes maior no CDI do que no
CDIS. No mesmo estudo, a expressão de Ácido Ribonucléico mensageiro (RNAm)
de aromatase foi significativamente maior no CDI em relação ao CDIS, porém esta
foi maior do que no tecido mamário não neoplásico por avaliação de Reação em
Cadeia de Polimerase (PCR). A expressão maior da aromatase no CDI quando
comparado ao CDIS foi demonstrada também em estudo prévio por Suzuki et al
(2007).
10
Em contraste, Zhang et al
(2002), em trabalho anterior, avaliando por análise
imunoistoquímica semi-quantitativa a expressão da aromatase em 61 casos de CDIS
e em 101 casos de CDI, encontraram expressão da aromatase tanto nas células
tumorais como nas estromais adjacentes, sendo que a positividade no CDIS foi
significativamente maior quando comparada com aquela observada no CDI.
Entretanto neste estudo os espécimes de carcinoma invasivos e in situ não se
encontravam na mesma amostra, e por isso, seus achados podem não refletir a
progressão da doença como a comparação feita em amostras do mesmo tumor. Já,
Oliveira et al (2006), avaliando a expressão da enzima aromatase em tecidos
contendo na mesma amostra CDI e CDIS, encontraram níveis semelhantes tanto no
CDI quanto no CDIS em 70% dos casos.
1.2 Metaloproteinase 2 e 9
O microambiente do tecido mamário, composto por elementos estruturais,
bioquímicos e celulares, é conhecido por participar no desenvolvimento tumoral. A
matriz extracelular (MEC) atua como uma junção através da qual esses elementos
interagem e, a membrana basal, atua como uma impedidora da transposição das
células epiteliais durante a remodelação mamária e gênese tumoral (Wiseman,
Werb, 2002; Fata et al, 2004).
Em condições fisiológicas (remodelamento tecidual, angiogênese, período
ovulatório, cicatrização) há um preciso equilíbrio entre a degradação proteolítica e
11
inibição proteolítica (Garbett et al, 2000). Esse balanço fisiológico parece estar
alterado no câncer. Alguns estudos têm observado que as MMPs apresentam níveis
aumentados na maioria dos tipos de câncer e as suas expressões estão geralmente
associadas à pior prognóstico das pacientes (Curran et al, 2004; Li et al, 2004;
Pellikainen et al, 2004). Estudo prévio demonstrou que a expressão e atividade das
MMPs estão relacionadas a estágios avançados do câncer de mama, aumento da
invasão de células tumorais e de novos focos de metástase (Duffy et al, 2000).
As MMPs são enzimas com estrutura e função semelhantes às
endopeptidases, são secretadas como enzimas inativas e ativadas fora das células
por outras MMPs ativas ou outras proteases (Nagase et al, 2006; Page-McCaw et al,
2007). A produção das MMPs é o resultado de uma atuação conjunta entre o tumor
e as células estromais. De fato, sabe-se que a expressão de MMPs pelas células
estromais é regulada por muitos fatores solúveis ou ligantes celulares. Dentre elas,
os indutores de metaloproteinases de matriz extra celulares (EMMPRIN),
glicoproteínas de membrana identificadas como membros da super-família de
imunoglobulinas, e que atuam como indutores das MMPs e que são produzidos
pelas células estromais (Biswas et al, 1995; Guo et al, 1997).
Estudos imunoistoquímicos têm demonstrado que os EMMPRIN estão
presentes em diversos tumores malignos incluindo os carcinomas de mama
(Kanekura et al, 2002; Nabeshima et al, 2004). Também tem sido observado a
super-expressão de RNAm dos EMMPRIN em muitos carcinomas, quando
comparados a tecidos mamários benignos e normais, sugerindo assim um
12
importante papel na invasão tumoral e no processo de metástase (Polette et al,
1996; Davidson et al, 2003). Caudroy et al (2002) observaram que os EMMPRIN
atuam estimulando a produção de MMPs nas células tumorais metastáticas,
facilitando a disseminação celular em sítios secundários.
Aspecto a ser considerado é de que a atuação das proteases também seja
regulada por inibidores específicos endógenos, conhecidos como inibidores de
metaloproteinases teciduais (TIMPs), como sugerem alguns estudos (Visse, Nagase,
2003; Lambert et al, 2004). Níveis alterados de MMPs e TIMPs têm sido
relacionados a processos celulares associados à progressão tumoral, incluindo
aumento da proliferação, inibição da diferenciação tumoral, apoptose, migração,
invasão, angiogênese e respostas imunes (Egeblad, Werb, 2002; Overall, Kleifeld,
2006). Estudos mostram que níveis elevados de TIMPs também predizem
prognóstico adverso relacionado com a agressividade tumoral em diferentes tipos de
câncer, inclusive o de mama (Schrohl et al 2003; Schrohl et al 2004).
As MMPs apresentam grande influência na invasão tumoral através do
remodelamento da matriz extracelular, liberação de fatores de crescimento e
citoquinas, e degradando inibidores de proteases séricos, facilitando por este
processo a invasão da célula tumoral (Ellerbroek & Stack, 1999) .
Há 23 membros da família das MMPs conhecidos em humanos. De acordo
com seus substratos específicos, elas são subdivididas em subclasses:
13
colagenases, gelatinases, estromelisinas , matrilisina, MMP tipo de membrana e
outras (Nagase et al, 2006).
Pesquisadores tem se dedicado ao estudo do perfil de expressão de duas
gelatinases, MMP-2 e a MMP-9, as quais são capazes de degradar o colágeno tipo
IV (Iwasaki et al, 2002; Kato et al 2002). O colágeno tipo IV está presente de forma
abundante nas membranas basais separando células epiteliais do estroma
subjacente. O aumento da expressão e atividade das MMP-2 e MMP-9 em tumores
levam à degradação da membrana basal, etapa essencial da invasão tumoral.
Dessa forma, é descrita relação entre a alta expressão de MMP-2 no tumor, com
menor sobrevida de pacientes com câncer de mama, assim como associação entre
o grau de diferenciação tumoral com aumento nos níveis de MMP-9 (Li et al, 2004).
Vizoso et al (2007) , em estudo imunoistoquímico, demonstraram relação
entre a alta expressão de MMP-9 e maior taxa de metástase à distância cinco anos
após a ressecção cirúrgica por câncer de mama. No mesmo ano, Decock et al
(2007) através de estudo por PCR, verificaram a presença de RNAm de MMP-2 e
MMP-9 em tecidos com câncer de mama. Por análise Northern Blot, alta expressão
de MMP-2 e MMP-9 foi observada por Pacheco et al (1998) em tecidos com câncer
de mama em comparação com tecidos mamários normais. Adicionando-se a estes
trabalhos, Przybylowska et al (2006), utilizando técnica de ELISA, detectaram alta
concentração de proteínas de MMP-2 e MMP-9 em tecidos com câncer de mama
comparados a
tecidos mamários normais.
14
Em estudo de PCR, Figueira et al (2009) utilizaram modelo celular para
analizar as MMP-2 e MMP-9, e constataram que na maioria dos casos, as MMPs
estavam aumentadas nos grupos celulares com maior capacidade de invasão e
metástase. Este estudo vem corroborar resultados de estudos anteriores, nos quais
a expressão de MMPs em modelos celulares de câncer de mama apresentavam
correlação positiva com um fenótipo mais agressivo (Balduyck et al, 2000; Kousidou
et al, 2004).
1.3 CD44
A proteína CD44 é uma glicoproteína de superfície celular envolvida na
interação célula-célula e célula-matriz em grande parte através de sua afinidade pelo
ácido hialurônico (AH), um glicosaminoglicano constituinte da matriz extracelular.
Essa interação também pode ocorrer através de sua afinidade por outros ligantes,
tais como osteopontin, colágenos e MMPs. A CD44 desempenha importante papel
no comportamento celular, incluindo adesão, migração, invasão e sobrevivência
(Cichy, Puré, 2003).
A CD44 é codificada por um único gene, mas múltiplas isoformas de CD44
são geradas por RNA diversos. O gene CD44 contém 20 éxons, dos quais 12 são
responsáveis pela síntese da forma mais comum de CD44 (Ponta et al, 2003; Khan
et al, 2005). A afinidade das moléculas de adesão celular é um pré-requisito para a
regulação da interação célula-célula e célula-matriz, que são mediadas pela ampla
15
expressão de receptores que estão expostos continuamente aos seus ligantes.
Muitas células expressam CD44 em um estado de baixa afinidade, as quais não
conseguem se ligar ao AH. A variação em um éxon habitual, a oligomerização,
glicozilação ou sulfatação de um receptor, podem induzir a transição de estado de
baixa afinidade para um estado de alta afinidade o qual garante a ligação ao AH
(Cichy, Puré, 2000; Ponta et al, 2003).
A CD44 transmembrana apresenta diversas funções, incluindo a mediação do
metabolismo de AH, regulação de fatores de invasão tumoral e modulação da
função inflamatória celular. Alterações na expressão e estrutura do CD44 têm sido
documentadas em muitos tipos de câncer e também são relacionadas à
disseminação tumoral (Naor et al, 1997; Ponta et al, 2003).
Tem sido demonstrado que populações de células com genótipo CD44
+
apresentam propriedades de iniciação tumoral no câncer de mama. Este fenótipo
oncogênico tem sido associado à característica de células progenitoras, com
propriedades aumentadas de invasão, resistência à radiação e com perfil genético
relacionado a prognóstico adverso (Ponti et al, 2005; Phillips et al, 2006; Shipitsin et
al, 2007).
Okamoto et al (2002) encontraram aumento dos níveis solúveis de CD44 no
plasma de pacientes com câncer, refletindo aumento da atividade proteolítica e de
16
remodelamento da matriz, os quais estão associados com crescimento tumoral e
metástase.
Em estudo utilizando Northen blot e PCR, Sheridan et al (2006)
demonstraram a presença de genes pró-invasão predominantemente em linhas
celulares com aumento de CD44. Estes resultados mostram que o fenótipo CD44 de
células de câncer de mama está associado à capacidade de invasão celular.
Abraham et al (2005) relataram a relação entre a presença de células de
câncer de mama que apresentavam CD44 com a maior incidência de metástase à
distância. Hill et al (2006) observaram mediação da invasão das células do câncer
de mama pelo CD44. Já Harrel et al (2006) encontraram maior expressão de CD44
em células tumorais de câncer de mama que acometiam linfonodos axilares do que
a expressão de CD44 nas células do próprio tumor na glândula mamária.
Em estudo caso-controle Mayer et al (2008) compararam o nível sérico de
CD44 em mulheres acometidas por câncer de mama e mulheres sem a doença. Os
resultados revelaram concentração maior de CD44 nas que apresentavam a doença.
Pacientes com concentração de CD44 acima de 75% apresentavam tamanho
tumoral maior (2,9 cm vs. 1,8 cm), assim como maior risco de metástase linfonodal
(55% vs. 35%).
Honeth et al (2008) em avaliação imunoistoquímica de 240 tumores de mama
verificaram expressão de CD44 em 63% de tumores do tipo basal em comparação
17
com 32% de outros tipos tumorais. Dos 240 tumores estudados 23 apresentavam
mutação de BRCA-1 e destes 17 tinham alta expressão de CD44 (70%).
Em estudo in vitro realizado por Buess et al (2009) onde foram comparadas
amostras teciduais de câncer de mama CD44
+
/CD24
-
, com ou sem a associação de
células endoteliais, observou-se que a presença de células endoteliais é importante
para a alta expressão de genes envolvidos na proliferação celular com consequente
aumento na taxa de proliferação tumoral.
1.4 Correlação entre Aromatase e Metaloproteinase 2 e 9
Poucos estudos analisaram a correlação entre aromatase e as MMPs. Em
nossa revisão da literatura encontramos apenas os artigos que seguem abaixo.
Di et al (2005) em avaliação por PCR de 244 amostras de tecido mamário
com câncer verificaram a expressão de RNAm de aromatase, MMP-2 e MMP-9. No
mesmo estudo a avaliação imunoistoquímica confirmou os achados pelo PCR. A
correlação imunoistoquímica entre a expressão de aromatase foi positivamente
associada com MMP-2 (p<0,01) e MMP-9 (p<0,01).
Lu et al (2007) em estudo imunoistoquímico de 244 pacientes com câncer de
mama sem comprometimento axilar demonstraram correlação positiva entre as
18
expressões de aromatase, MMP-2 e MMP-9 nas pacientes que apresentavam
tumores receptores hormonais (estrogênio / progesterona) positivos (p<0,05).
1.5 Correlação entre Aromatase e CD44
Não foram encontrados estudos na literatura que abordassem a correlação
entre aromatase e CD44.
1.6 Correlação entre CD44 e Metaloproteinases 2 e 9
Estudos têm demonstrado que a glicoproteína CD44 funciona como um sítio
ou molécula de ligação para MMP-9 na superfície celular (Karadag et al, 2005; Desai
et al, 2007; Samanna et al, 2007). Yu, Stamenkovic (1999) em estudo com células
de melanoma, já haviam sugerido que a CD44 serviria como um sítio de ligação para
MMP-9 e, dessa forma, contribuiria indiretamente com a proteólise peri-celular para
regular a motilidade celular, ativaria fatores de crescimento, atuaria na angiogênese,
bem como em mecanismos de sobrevivência. Os mesmos autores em outro estudo
demonstraram que a CD44 atuaria fazendo com que a MMP-2 e MMP-9 se
localizassem na superfície de linhagens celulares de alguns tumores de mama
malignos resultando na ativação de Transforming growth factor (TGF-ß) e
promovendo invasão tumoral e angiogênese (Yu, Stamenkovic, 2000).
19
Lou et al, 2005 em estudo imunoistoquímico comparando tecidos ovarianos
sem neoplasia com tecidos ovarianos com neoplasia maligna e tumor de Krukenberg
verificaram que nos dois últimos havia expressão de CD44, MMP-2 e MMP- 9, e
estas apresentavam correlação positiva (p=0,001).
Dessai et al, 2009 em estudo de tecidos com câncer de próstata verificaram
aumento da expressão de CD44 de superfície e interação de CD44 com MMP-9,
mostrando que esta interação é considerada evento importante na ativação e
secreção de MMP-9, contribuindo, assim, com a migração das células tumorais.
Peng et al (2007) em estudo com culturas celulares de câncer de mama
evidenciaram uma conexão entre CD44 e nível celular elevado de MMP-9. Notaram
aumento da expressão de MMP-9 na membrana celular após estímulo pela CD44.
Após revisão bibliográfica na literatura, verificamos a importância da enzima
aromatase na etiologia do câncer de mama através da esteroidogênese periférica.
Vimos também o papel fundamental das MMP-2 e MMP-9 no processo de invasão
tumoral e consequentemente de progressão da doença, assim como a integração
entre a aromatase e as MMPs que, por conseguinte, parece desempenhar papel
preponderante na ativação da glicoproteína CD44. Desta forma objetivamos em
nosso estudo verificar a correlação entre esses biomarcadores.
20
2. OBJETIVOS
21
Os objetivos deste estudo são:
1. Avaliar a correlação entre a expressão da enzima aromatase e os
marcadores de invasão celular: metaloproteinase 2, metaloproteinase 9 e CD44 nos
carcinomas ductais de mama in situ e infiltrativo presentes no mesmo espécime
cirúrgico.
2. Avaliar a correlação entre as expressões das metaloproteinases 2 e 9 e a
expressão da CD44 nos carcinomas de mama ductais in situ e infiltrativo presentes
no mesmo espécime cirúrgico.
3. Avaliar a expressão destes marcadores em relação à idade, tamanho do
tumor, grau nuclear, grau histológico, estado hormonal e estadiamento axilar.
22
3. CASUÍSTICA E MÉTODO
23
3.1. Casuística
O Comitê de Ética e Pesquisa da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia
de São Paulo (ISCMSP), aprovou em 18 de fevereiro de 2009 (Apêndice 1) o
presente estudo transversal, o qual constou com a revisão de casos atendidos na
instituição entre agosto de 2002 e janeiro de 2008.
Os serviços que participaram do estudo foram: Clínica de Mastologia do
Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da ISCMSP e Serviço de Anatomia
Patológica do Departamento de Ciências Patológicas da mesma instituição.
Entre 885 pacientes diagnosticadas e tratadas por câncer de mama, 110
satisfizeram os critérios de inclusão e exclusão. As cirurgias realizadas nestas
mulheres foram: 46 cirurgias conservadoras e 64 mastectomias. As pacientes que
consentiram em participar do estudo assinaram termo de consentimento livre e
esclarecido (Apêndice 2).
3.1.1 Critérios de Inclusão
Pacientes com câncer de mama estádio clínico I, II e III; presença de
carcinoma ductal invasivo (CDI) e carcinoma ductal in situ (CDIS) concomitantes;
pacientes assistidas no Complexo Hospitalar da ISCMSP.
24
3.1.2 Critérios de Exclusão
Pacientes que apresentavam as seguintes condições: uso de qualquer terapia
adjuvante prévia, uso de tamoxifeno ou raloxifeno para quimioprevenção, utilização
de terapia hormonal nas últimas oito semanas, grávidas ou que estejam
amamentando, uso de antiinflamatórios nos últimos 15 dias, submetidas à biópsia
prévia com intervalo inferior a um mês da obtenção do espécime cirúrgico, pacientes
que apresentavam obesidade mórbida, pacientes com doenças metabólicas.
3.2 Métodos
3.2.1 Análise Histopatológica
Realizada a ressecção cirúrgica e colocação do material em recipiente
contendo formaldeído a 10% no centro cirúrgico do Departamento de Obstetrícia e
Ginecologia da ISCMSP, o mesmo foi encaminhado para o Serviço de Anatomia
Patológica do Departamento de Ciências Patológicas da ISCMSP para estudo
histopatológico.
Conforme rotina deste Departamento, foi realizado estudo macroscópico do
material proveniente da cirurgia, seleção e fragmentação do mesmo. Estes
fragmentos foram desidratados em álcool etílico, diafanizados em xilol e, por último,
embebidos com parafina para confecção dos blocos.
Os blocos de parafina foram seccionados com micrótomo calibrado para
cortes de 4mm de espessura, confeccionando-se lâminas, as quais foram coradas
25
pelo método de hematoxilina e eosina (HE). A leitura foi realizada em microscópio
óptico comum em campos de 400 aumentos.
Os casos foram sempre avaliados por dois examinadores e todos os laudos
emitidos, de acordo com a padronização da Organização Mundial de Saúde, pelo
Serviço de Anatomia Patológica da ISCMSP. Os casos selecionados foram os que
ao exame histológico apresentavam CDI e CDIS adjacentes e com os quais se
confeccionou o Arranjo Tecidual em Matriz ou Tissue Microarray (TMA), constando a
marcação de dois locais nas lâminas de cada um dos tipos histológicos a serem
estudados e os locais correspondentes a estas marcações nos blocos de parafina.
Desta forma, para cada caso foram obtidas quatro áreas marcadas, sendo duas com
a presença de CDI e duas com CDIS, totalizando 440 áreas, com o objetivo de
confeccionar o Tissue Microarray.
Os CDIS foram classificados de acordo com a presença ou ausência de
comedonecrose. Utilizou-se os critérios propostos por Dabbs et al (1993) para a
classificação dos CDIS quanto ao grau nuclear, que são os presentes na tabela 1.
TABELA 1: Critérios propostos por Dabbs (1993) para avaliação do grau
Nuclear
Grau nuclear Critérios avaliados
Grau I Núcleos discretamente hipercromáticos, com diâmetro menor que
1,5 hemácia.
Grau II
Formas intermediárias.
Grau III
Núcleos volumosos, maiores que três hemácias, pleomórficos,
geralmente vesiculosos, com macronucléolo eosinófilo de contornos
irregulares.
26
Os CDIs foram classificados de acordo com a graduação histológica proposta
por Elston, Ellis (1991), em Nottingham, os quais atribuíram índices de um a três a
cada uma das características estudadas: arranjo tubular, pleomorfismo nuclear e
contagem de figuras de mitose. O arranjo tubular é avaliado de acordo com a
presença de estruturas tubulares na lesão. Assim, teremos índice um, quando da
presença de mais de 75% de estruturas tubulares presentes, índice dois, de 10% a
75% e índice três, quando observarmos menos de 10% de estruturas tubulares. A
avaliação do pleomorfismo nuclear é feita pela análise do tamanho, forma e
contornos do núcleo, e pela uniformidade da cromatina. A atividade mitótica é
avaliada através da contagem do número de figuras de mitose na periferia da
neoplasia, em dez campos contíguos de grande aumento. O índice um é atribuído
na presença de até cinco figuras de mitose, o dois na presença de seis a dez e o
índice três quando observa-se mais de dez figuras de mitose. Assim, da somatória
dos índices, teremos escore variando de três a nove e a graduação realizada desta
forma: Grau I, de três a cinco pontos; Grau II, seis ou sete pontos e Grau III, oito ou
nove pontos. A avaliação do grau nuclear seguiu os mesmos critérios adotados para
o CDIS (Dabbs, 1993).
3.2.2 Tissue Microarray (TMA)
Os cortes histológicos destinados à técnica imunoistoquímica para avaliar a
expressão da aromatase e expressão da MMP-2, MMP-9 e CD44 foram obtidos pelo
método TMA.
Inicialmente foram denominadas por Battifora em 1986, como blocos de
multi-tecidos. Com o decorrer dos anos sofreu aprimoramentos e em 1998, Kononen
27
e colaboradores desenvolveram a técnica atual de Tissue Microarray (TMA) ou
Arranjo Tecidual em Matriz que hoje é empregada (Battifora, 1986; Kononen et al,
1998).
O TMA é um método que permite avaliação de expressões protéicas diversas
através de inúmeros fragmentos teciduais em uma mesma lâmina (Kononen et al,
1998). Com esta tecnologia, múltiplas amostras teciduais podem ser analizadas
simultaneamente utilizando-se técnica imunoistoquímica, FISH (fluorescence in situ
hybridization) ou hibridização in situ de RNA (Kallioniemi et al, 2001). A tecnologia
aumenta a eficiência da pesquisa, uma vez que além de incluir múltiplos casos em
um único bloco, homogeneíza as reações. Outras vantagens são: potenciais
aplicações no perfil molecular dos tumores, facilitarem a criação de bancos de tecido
e a otimização de anticorpos e sondas (Moch et al, 2001; Parker et al, 2002; Hassan
et al, 2008).
Conforme especificações do fabricante e avaliação pormenorizada dos
relatos da literatura, a técnica empregada para obtenção dos blocos segue as
etapas abaixo discriminadas (Packeisen et al, 2003; van de Rijn, Gilks, 2004) (Fig. 1
e 2):
1. Separação dos blocos de parafina previamente marcados com 4 pontos
(blocos doadores) descritos anteriormente, correspondentes às áreas de interesse
ao estudo imunoistoquímico;
2. Utilização do aparelho para criar espaço vasado (“casela”) no bloco
receptor;
28
3. Extração, do bloco doador, de um cilindro tecidual de 1mm de diâmetro da
respectiva área de interesse previamente selecionada;
4. Transferência do cilindro tecidual obtido do bloco doador para a “casela”
previamente criada no bloco receptor;
5. Progressão, em frações de milímetros, a novas posições dentro do bloco
receptor, de modo a criar coletânea de amostras teciduais seguindo disposição
matricial;
6. Avaliação da qualidade do bloco final para armazenamento.
FIGURA 1. Esquema da confecção do TMA
29
FIGURA 2. A- 3 blocos de TMA com os pontos referentes aos 110 casos.
B- CDI/ CDIS com comedonecrose corados pelo HE em cortes de TMA -
20X AO (aumento original).
As lâminas foram confeccionadas através de corte em micrótomo
convencional calibrados para cortes de 4mm e o material depositado em lâminas
silanizadas a 10% para a reação imunoistoquímica.
3.2.3 Estudo Imunoistoquímico
O estudo imunoistoquímico utilizado neste trabalho foi realizado no Serviço
de Anatomia Patológica do Departamento de Ciências Patológicas da ISCMSP,
obedecendo aos protocolos para as reações realizadas (Boenisch T, 2001) (Anexo
1).
A análise da expressão da enzima aromatase foi realizada através da
utilização de anticorpos policlonais anti-aromatase, obtidos a partir do soro de
coelhos (MCA2077, Serotec Inc.) na diluição de 1/70. A análise da expressão da
MMP-2 foi realizada através da utilização de anticorpos monoclonais anti-MMP2,
A
B
30
obtidos a partir de soro de camundongos (Mob312, DBS) na diluição de 1/150. A
análise da expressão da MMP-9 foi realizada através da utilização de anticorpos
policlonais anti-MMP9, obtidos a partir de soro de coelhos (A0150, Dako) na diluição
de 1/600. A análise da expressão da CD44 foi realizada através da utilização de
anticorpos monoclonais anti-CD44, obtidos a partir de soro de camundongos
(M7082, Dako) na diluição de 1/200.
As lâminas foram incubadas com os respectivos anticorpos primários
preparados em solução previamente descrita. Para visualização da reação, lâminas
foram tratadas com substrato cromogênico (diaminobenzidina a 60mg% em PBS
associado a 1,5ml de peróxido de hidrogênio a 20 volumes), por cinco minutos, a
37°C. As lâminas foram contra-coradas com hematoxil ina de Harris, seguiu-se
desidratação e montagem em entellan com lamínula.
A positividade da reação para identificação das células tumorais e os
marcadores analisados foram sinalizados pela cor sépia (substrato cromogênico).
A expressão do complexo antígeno-anticorpo determinou a presença de
coloração sépia nas áreas de positividade, podendo ser esta nuclear, citoplasmática
ou de membrana a depender do marcador avaliado. As lâminas foram também
coradas em hematoxilina e eosina e a análise foi realizada pelo método semi
quantitativo, de acordo com os escores abaixo especificados.
Os critérios utilizados, para a avaliação em escore das expressões
imunoistoquímicas da enzima aromatase foram os mesmos empregados por
31
Ristimaki et al (2002) para avaliação da COX-2 e Oliveira et al (2006) para avaliação
da aromatase. (Tab.2)
TABELA 2. Escore utilizado para avaliação da expressão da aromatase.
Utilizamos os mesmos critérios adotados por Ristimäki et al (2002) e Oliveira
et al (2006) para classificarmos a expressão imunoistoquímica em positiva ou
negativa; desta forma, foram classificadas como negativas as pacientes com
escores zero ou um e positivas as com escores dois ou três.
Os critérios utilizados para a classificação da expressão imunoistoquímica da
MMP-2, MMP-9 e CD44 seguem os escores da tabela à baixo (Tabela 3). As células
e núcleos positivos foram identificados pela coloração sépia (Ellis et al, 2006).
Escore Critérios avaliados para determinação do escore
Escore 0 Não se observam células coradas
Escore 1
Citoplasma e membrana celular corados difusa e fracamente (deve
apresentar, pelo menos, 10% das células coradas com intensidade forte).
Escore 2
Coloração citoplasmática granular e da membrana celular de moderada a
forte em 10-90% das células.
Escore 3 Mais de 90% das células coradas com intensidade forte.
32
TABELA 3. Escore utilizado para avaliação das expressões de MMP-2, MMP-9
CD44
A análise de subgrupos foi realizada utilizando os seguintes critérios: grupo
etário (menor que 50 anos de idade e igual ou maior que 50 anos de idade);
tamanho do tumor (menor ou igual a 2cm ou maior que 2 cm), grau histológico (I, II
ou III), grau nuclear (1,2 e 3), estadiamento linfonodal (linfonodos positivos ou
negativos) e receptores hormonais (receptores positivos ou negativos para
estrogênio e/ou progesterona). Para realizar estas análises utilizamos os mesmos
critérios adotados por Ristimaki et al (2002) para classificarmos a expressão
imunoistoquímica em positiva ou negativa; desta forma, foram classificadas como
negativas as pacientes com escore zero ou um e positivas as pacientes com escores
dois ou três (Anexo 2).
3.3 Análise estatística
Procedemos à análise descritiva dos dados encontrados que foram
tabulados, para realização de testes paramétricos e não paramétricos (Lista 3).
Escore Critérios avaliados para determinação do escore
Escore 0
Não há coloração ou esta é inferior a 10% das células
neoplásicas
Escore 1
Coloração fraca e parcial em membranas de mais de 10%
das células neoplásicas
Escore 2
Coloração é fraca a moderada, completa em mais de 10%
das células neoplásicas
Escore 3
Coloração forte e completa em mais de 10% das células
neoplásicas
33
Os dados foram dispostos em tabelas explicativas, com objetivo de tornar
mais fácil sua avaliação e interpretação.
Todos os dados foram avaliados pelo programa de estatística SPSS
®
(Statistical Package for Social Sciences) versão 17.0, para microsoft windows. A
única variável paramétrica avaliada foi a idade, sendo calculada sua mediana,
variação média e desvio-padrão.
A análise correlativa entre as variáveis não paramétricas: expressão
imunoistoquímica da aromatase, MMP-2, MMP-9 e CD44 no CDI e CDIS presentes
nos mesmos espécimes cirúrgicos, foi realizada pela análise de correlação de
Spearman. Avaliou-se ainda, a relação destas expressões quanto ao grau nuclear,
grau histológico, tamanho tumoral (tumores menores ou iguais a 2cm e tumores
maiores de 2cm), linfonodos axilares, estado hormonal e a idade das pacientes
(pacientes com menos de 50 anos de idade e aquelas com 50 anos ou mais de
idade), sendo aqui Utilizado o Teste de Qui-quadrado, com o intuito de verificar
possíveis diferenças
Fixou-se 5% (p<0,05) como nível de rejeição da hipótese de nulidade para
todos os parâmetros avaliados (Bernard, 1986).
34
4. RESULTADOS
35
A análise estatística relativa à expressão da aromatase, MMP-2, MMP-9 e
CD44 nos CDI e CDIS presentes no mesmo espécime cirúrgico dos casos avaliados,
bem como de suas correlações com os resultados obtidos são a seguir relatados de
forma descritiva e através de tabelas.
As pacientes do estudo encontravam-se entre 26 e 90 anos de idade, com
média etária de 56,4 anos, apresentando desvio padrão de 12,81, e idade mediana
de 55 anos.
Em relação à expressão da aromatase, em números absolutos e
porcentagens, dos 110 espécimes cirúrgicos avaliados correspondentes as 110
pacientes foram encontradas os seguintes resultados: no CDI, 63 casos estavam
positivos (57,30%) e no CDIS, 67 casos estavam positivos (60%). A expressão da
MMP-2 se mostrou positiva em 15 casos de CDI (13,60%) e positiva em 15 casos de
CDIS (13,60%). A MMP-9 estava positiva no CDI em 83 casos (75,50%) e estava
positiva no CDIS em 82 casos (74,50%). CD44 apresentou positividade em 49 casos
de CDI (44,50%) e positividade em 48 casos de CDIS (43,60%) (Tab.4).
36
TABELA 4. Expressão imunoistoquímica da aromatase, MMP-2, MMP-9 eCD44 no
carcinoma ductal invasivo (cdi) e carcinoma ductal in situ (cdis) nos 110
casos.
A análise estatística dos dados a cima mostrou alta correlação,
estatisticamente significante, entre a expressão da aromatase presente no CDI e no
CDIS, da MMP-2 presente no CDI e CDIS, da MMP-9 presente no CDI e CDIS e do
CD44 presente no CDI e CDIS (p<0,05). (Tab.5)
Quando se avaliou apenas o CDI a análise estatística mostrou correlação
positiva estatisticamente significante entre aromatase e MMP-2 (p=0,01) e
aromatase e MMP-9 (p=0,034). Avaliando-se apenas o CDIS a análise estatística
monstrou correlação positiva estatisticamente significante entre aromatase e MMP-2
(p=0,001) e MMP-9 e CD44 (p=0,03). (Tab.5)
Biomarcador
Número absoluto (%)
Aromatase
cdi 63 (57,3%)
cdis 67 (60%)
MMP-2
cdi 15 (13,60%)
cdis 15 (13,60%)
MMP-9
cdi 83 (75,50%)
cdis 82 (74,50%)
CD44
cdi 49 (44,50%)
cdis 48 (42,60%)
37
TABELA 5. Correlação entre as expressões de aromatase, MMP-2, MMP-9, CD44
nos 110 casos de CDI e CDIS.
(*) Correlação estatisticamente significante com p<0,05. Teste estatístico: correlação de Spearman; r
= coeficiente de correlação; cdi = carcinoma ductal invasivo; cdis = carcinoma ductal in situ; MMP-2 =
metaloproteinase 2; MMP-9 = metaloproteinase 9
Aromatase
cdi
Aromatase
cdis
CD44
cdi
CD44
cdis
MMP-2
cdi
MMP-2
cdis
MMP-9
cdi
MMP-
9
cdis
Aromatase
cdi
r
1,000 ,906(*) ,059 ,082 ,318(*) ,318(*) ,203(*) ,170
p
,000 ,542 ,397 ,001 ,001 ,034 ,076
Aromatase
cdis
r ,906(*) 1,000 ,034 ,048 ,318(*) ,318(*) ,210(*) ,170
p
,000 . ,728 ,617 ,001 ,001 ,028 ,076
CD44
cdi
r
,059 ,034 1,000 ,989(*) -,128 -,128 ,184 ,200(*)
p
,542 ,728 . ,000 ,182 ,182 ,055 ,036
CD44
cdis
r ,082 ,048 ,989(*) 1,000 -,105 -,105 ,191(*) ,207(*)
p
,397 ,617 ,000 . ,273 ,273 ,046 ,030
MMP-2
cdi
r
,318(*) ,318(*) -,128 -,105 1,000 1,000(*) ,019 ,023
p
,001 ,001 ,182 ,273 . . ,843 ,815
MMP-2
cdis
r ,318(*) ,318(*) -,128 -,105 1,000(*) 1,000 ,019 ,023
p
,001 ,001 ,182 ,273 . . ,843 ,815
MMP-9
cdi
r
,203(*) ,210(*) ,184 ,191(*) ,019 ,019 1,000 ,978(*)
p
,034 ,028 ,055 ,046 ,843 ,843 . ,000
MMP-9
cdis
r ,170 ,170 ,200(*) ,207(*) ,023 ,023 ,978(*) 1,000
p
,076 ,076 ,036 ,030 ,815 ,815 ,000 .
38
Avaliando-se as expressões da aromatase, MMP-2, MMP-9 e CD44 no CDI e
CDIS em subgrupos de acordo com o grau nuclear, grau histológico, grupo etário,
tamanho do tumor, estadiamento axilar e receptores hormonais, não encontramos
diferenças nas expressões das variáveis analisadas. (Tabelas de 6 a 12 encontram-
se no Anexo 3)
39
5. DISCUSSÃO
40
O papel do estrogênio na carcinogênese mamária já está bem estabelecido,
sendo que este hormônio desempenha papel preponderante nas três fases deste
processo: indução, promoção e progressão. Isto é verificado tanto nas pacientes no
menacme quanto nas pacientes na pós-menopausa (Henderson, Canellos, 1990;
Russo, Russo, 2006). Grande diferença entre estas duas fases da vida é que nas
mulheres na pós-menopausa, com perda de função ovariana, a atuação da enzima
aromatase extra-ovariana exerce papel fundamental na produção estrogênica.
(Subramanian et al, 2008; Hudelist et al, 2008).
A conversão periférica de androgênios em estrogênios ocorre principalmente
no tecido adiposo, além de músculo, pele entre outros. A síntese estrogênica via
aromatase ocorre também no tecido mamário e, neste verifica-se grande aumento
desta produção hormonal quando associado à neoplasia maligna, graças à maior
expressão da enzima aromatase (Susuki et al, 2005; Shibuya et al, 2008).
Os resultados do nosso estudo mostraram que em relação à expressão de
aromatase no CDI, 63 casos estavam positivos (57,30%) e no CDIS, 67 casos
estavam positivos (60%), apresentando alta correlação (p<0,01). Estes dados falam
a favor da teoria de que a alta expressão da enzima aromatase no epitélio tumoral
favorece a proliferação e crescimento do carcinoma mamário, principalmente
quando vemos que a expressão da aromatase esteve mais presente no CDIS
quando comparado ao CDI, podendo denotar papel preponderante nas fases iniciais
41
da carcinogênese por esta enzima. Esses resultados vêm ao encontro aos
publicados anteriormente por outros autores (Díaz-Cruz et al, 2005; Oliveira et al,
2006; Shibuya et al, 2008).
A região codificadora do gene CYP19, responsável pela codificação da
enzima aromatase, se estende por nove éxons (II – X); o primeiro éxon apresenta
regiões de transcrição tecíduo-específicas. Todavia, a enzima sintetizada é idêntica,
a despeito da região promotora utilizada (Haiman, 2003).
A alta expressão da enzima aromatase encontrada em nosso estudo vêm
corroborar os achados de Bulun et al (2004), os quais descreveram que enquanto no
tecido mamário normal observa-se a ação do promotor I.4 e minimamente dos
promotores I.3 e II, no câncer de mama nota-se a atuação do promotor I.4, a ação
extremamente aumentada dos promotores I.3 e II, além da atuação do promotor I.7,
acarretando em concentrações muito elevadas de estrogênio no tecido mamário
Quando se avaliou a expressão da enzima aromatase em relação ao grau
histológico, grau nuclear, faixa etária, receptores hormonais, comprometimento
linfonodal e tamanho tumoral, não encontramos diferenças estatisticamente
significante nos subgrupos avaliados tanto no CDI quanto no CDIS.
Em relação ao grau nuclear no CDIS nossos resultados são semelhantes aos
encontrados por Hudelist et al (2008) que avaliaram 96 amostras teciduais
compostas apenas de CDIS e 104 amostras compostas de CDIS e CDI e
evidenciaram que nas amostras de CDIS não houve diferença estatisticamente
42
significante, quanto à expressão da aromatase, entre tumores de alto, moderado ou
baixo grau, com valores de positividade muito próximos. Silva et al (1989), por sua
vez observaram maior expressão da aromatase nos casos onde os CDIS avaliados
eram de grau nuclear III (p=0,03).
Alguns trabalhos avaliaram o prognóstico das pacientes que apresentam
tumores com alta expressão de aromatase; Silva et al (1989) demonstraram que
quanto maior a expressão de aromatase menor a sobrevida livre de doença
(p<0,05). Eppenberger et al (2001) encontraram que mulheres que apresentam
câncer de mama com alta expressão de aromatase possuem maior risco de recidiva
local e morte (p<0,05). Lu et al (2007) observaram que em subgrupos de pacientes
que apresentavam receptores de estrogênio e progesterona positivos, a sobrevida
global das pacientes com expressão positiva de aromatase é pior do que das
pacientes com expressão negativa de aromatase (p<0,05). Ao contrário, nos
subgrupos de pacientes com receptores de estrogênio e progesterona negativos,
não há relação entre a expressão de aromatase e queda da sobrevida global
(p>0,05).
Para ocorrer invasão celular pela células tumorais é necessário que ocorra
invasão da membrana basal. As MMPs são enzimas proteolíticas que podem
degradar elementos estruturais da matriz extracelular. Apresentam grande influência
na invasão tumoral através do remodelamento da matriz extracelular, liberação de
fatores de crescimento e citoquinas, e degradando inibidores de proteases séricos,
facilitando por este processo a invasão da célula tumoral (Ellerbroek, Stack, 1999;
Sternlicht, Werb, 2001). Estudos têm demonstrado que na maioria dos tipos de
43
câncer a expressão das MMPs estão aumentadas e, dessa forma associada a pior
prognóstico das pacientes (Curran et al, 2004; Li et al, 2004; Pellikainen et al, 2004).
No câncer de mama as MMPs que apresentam maior relação com a doença são as
MMP-2 e MMP-9 (Li et al, 2004).
Em nosso estudo a expressão da MMP-2 se mostrou positiva em 15 casos
(13,60%) tanto no CDI quanto no CDIS com correlação positiva perfeita (coeficiente
correlação = 1). Já a expressão de MMP-9 se mostrou positiva no CDI em 83 casos
(75,50%) e positiva no CDIS em 82 casos (74,50%), com correlação estatisticamente
significante (p<0,01). Di et al (2005) e Lu et al (2007), em análise imunoistoquímica
apenas de CDI, através de anticorpos policlonais, encontraram valores de
positividade próximos aos encontrados por nós para a MMP-9, 72,3% e 62,7%,
respectivamente. Já em relação à MMP-2 ambas encontraram valores superiores de
positividade, 68,7% e 58,6%, respectivamente. Kohrmann et al (2009) em
comparação entre tecido mamário normal e tecido mamário com CDI demonstraram
forte expressão de MMP-2 e MMP-9 no tecido com CDI.
Avaliando apenas o CDI encontramos em nosso estudo correlação positiva
estatisticamente significante entre aromatase e MMP-2 (p=0,001) e entre aromatase
e MMP-9 (p=0,034). Resultados esses semelhantes aos encontrados por Di et al
(2005) com p<0,01 e por Lu et al (2007) com p<0,001.
Nosso estudo vem confirmar o encontrado por outros que mostram
correlação positiva entre a aromatase e as MMP-2 e MMP-9, o que eleva a
possibilidade de que a aromatase pode aumentar a capacidade de invasão celular
através do aumento da atividade da MMP-2 e MMP-9. Entende-se assim que quanto
44
maior a expressão da aromatase maior a expressão, ou seja, maior a atividade e
atuação das MMPs em prol da degradação da membrana basal e invasão pelas
células tumorais, favorecendo, a progressão da doença.
Quando avaliamos apenas CDIS encontramos em nosso estudo correlação
positiva estatisticamente significante entre aromatase e MMP-2 (p=0,01) e entre
MMP-9 e CD44 (p=0,030).
A correlação positiva entre aromatase e MMP-2 no CDIS confirma a
tendência de que as neoplasias que apresentam expressão de aromatase,
apresentam potencial de invasão.
Estudos de Yu, Stamenkovic, 2000 com melanoma e Desai et al, 2007 com
câncer de próstata, mostraram a importância da conexão entre CD44 e MMP-9 para
esta última desempenhar papel na degradação da membrana basal e iniciar, assim,
a invasão das células tumorais. O resultado de nosso estudo, mostrando a
correlação positiva entre MMP-9 e CD44 (p=0,030), vem corroborar os achados por
esses autores em relação a outras neoplasias e principalmente ao achado de Peng
et al, 2007, que observaram a ligação entre CD44 e MMP-9 em células de câncer de
mama. Estes resultados vêm confirmar que a CD44 atua como um sítio de ligação
para a MMP-9 e a formação do complexo CD44/MMP-9 na superfície celular é
indispensável para a atividade da MMP9.
Após analisarmos os resultados de nosso estudo podemos concluir que a
aromatase, através da síntese de estrogênio local no tecido mamário, desempenha
45
importante papel na carcinogênese mamária, principalmente influenciando a atuação
da MMP-2 e, de sobremaneira a MMP-9, grandes responsáveis pela invasão celular
tumoral que, por sua vez, dependem de sua ligação a CD44 para poderem
desempenhar suas funções.
Estes resultados vêm reforçar os achados de outros estudos em que o uso
de inibidores de aromatase (IA) atuam na prevenção e tratamento do câncer de
mama não só pela diminuição na concentração dos níveis séricos e locais de
estrogênio, mas também por atuar em vias metabólicas importantes para progressão
tumoral, onde o complexo CD44/MMP desempenha papel preponderante.
Outrossim, nos é possível supor que o uso de substâncias que inibam a ação de
determinadas metaloproteinases, usadas isoladamente ou em associação com IA,
constitui um campo promissor para novas pesquisas visando o tratamento do câncer
de mama.
46
6. CONCLUSÕES
47
A análise dos dados e interpretação dos resultados do nosso trabalho nos
permite chegar às seguintes conclusões:
1. Há correlação positiva entre as expressões de aromatase e MMP-2 e
entre as expressões de aromatase e MMP-9 no CDI. No CDIS há correlação positiva
entre as expressões de aromatase e MMP-2.
2. Há correlação positiva entre as expressões de MMP-9 e CD44 no CDIS.
3.
Não há diferença nas expressões da aromatase, MMP-2, MMP-9 e CD44
no CDI e CDIS em relação
à idade, tamanho do tumor, grau nuclear, grau
histológico, estado hormonal e estadiamento axilar.
48
7. ANEXOS
49
7.1 Reação imunoistoquímica
1. Cortes histológicos dos tecidos, com 3µm de espessura. Montagem dos
cortes em lâminas silanizadas, com retirada da parafina em estufa a 55
o
C, e
manutenção dos mesmos em temperatura ambiente.
2. Desparafinização dos cortes com xilol a 60
o
C, durante 30 minutos,
seguida por mais dois banhos em xilol à temperatura ambiente, durando quinze
minutos cada.
3. Reidratação dos cortes com etanol absoluto (etanol absoluto I, etanol
absoluto II, etanol absoluto III, etanol 95ºGL e etanol 80ºGL [Gay-Lussac]), cada
banho durando dois minutos, seguida por lavagem em água corrente e finalizada em
passagem por água destilada.
4. Adição de 1.600 ml do tampão citrato de sódio 0,1 M (pH 6,0) aos cortes,
com exposição ao vapor durante 30 minutos, com a finalidade de recuperação do
epítopo antigênico, com a finalidade de restituir antigenicidade à proteína afetada
pela fixação dos tecidos em formalina. Manutenção das lâminas em vapor, por 30
minutos. Após a retirada das lâminas, conservação das mesmas em solução
tamponada, à temperatura ambiente, durante 20 minutos.
50
5. Reação de inibição da peroxidase endógena, através de lavagem das
lâminas em peróxido de hidrogênio a 3%, por quatro vezes, por dez minutos cada, e
lavagem em água parada, por cinco minutos.
6. Lavagem das lâminas no tampão salino PBS (pH 7.4), por duas vezes, por
15 minutos.
7. Incubação das lâminas com os anticorpos primários citados
anteriormente, nas diluições especificadas pelo fabricante (aromatase: 1/70, MMP-2:
1/150, MMP-9: 1/600 e CD44: 1/200), em geladeira, por 18 horas.
8. Lavagem das lâminas, por duas vezes, em tampão PBS (pH: 7,4), por dez
minutos.
9. Incubação dos cortes teciduais com anticorpos secundários (anticorpos de
ligação), por 30 minutos em estufa a 37ºC. No estudo foi utilizado anticorpo
secundário biotinilado universal [Kit DAKO LSAB Systems, Peroxidase (DakoCorp.,
Carpinteria, CA, USA)].
10. Lavagem das lâminas em tampão PBS, duas vezes, por dez minutos.
11. Incubação das lâminas em anticorpo terciário, estreptavidina–biotina-
peroxidase (Kit DAKO LSAB Systems, Peroxidase-universal), em câmara úmida, por
30 minutos, em estufa a 37ºC.
12. Lavagem das lâminas em solução tampão, duas vezes, por dez
minutos.
51
13. Colocação das lâminas para reação cromógena em 3,3’,5,5’
tetrahidrocloreto de diaminobenzidina (DAB), por três a cinco minutos, ocorrendo a
reação que resulta no aparecimento da cor sépia, característica do anticorpo fixado
à proteína.
14. Lavagem em água corrente, duas vezes, por dez minutos.
15. Contra-coloração rotineira com hematoxilina de Mayer, por três minutos,
em temperatura ambiente, para obtenção de coloração azulada do citoplasma e do
núcleo.
16. Desidratação dos cortes com série de etanol (50-70-100º. GL) e xilol.
17. Montagem das lâminas através de sua fixação sobre Entellan Merck, a
fim de que a preparação passe a ter conservação permanente.
52
7.2. Figuras das expressões imunoistoquímicas em 400 X aumento original.
Figura 1: CDIS com expressão negativa para aromatase (escore 1). Figura 2:
CDI com expressão negativa para aromatase (escore 1).
Figura 3: CDIS com expressão positiva para aromatase (escore 2) (seta).
Figura 4: CDI com expressão positiva para aromatase (escore 2) (seta).
Figura 5: CDIS com expressão positiva para aromatase (escore 3) (seta).
Figura 6: CDI com expressão positiva para aromatase (escore 3) (seta).
1
2
3
4
5
6
53
Figura 7: CDIS com expressão negativa para MMP-2 (escore 1). Figura 8: CDI com
expressão negativa para MMP-2 (escore 1).
Figura 9: CDIS com expressão positiva para MMP-2 (escore 2) (seta).
Figura 10: CDI com expressão positiva para MMP-2 (escore 2) (setas).
7
8
9
10
54
Figura 11: CDIS com expressão negativa para MMP-9 (escore 1). Figura 12: CDI com
expressão negativa para MMP-9 (escore 1).
Figura 13: CDIS com expressão positiva para MMP-9 (escore 2) (seta). Figura 14: CDI
com expressão positiva para MMP-9 (escore 2).
Figura 15: CDIS com expressão positiva para MMP-9 (escore 3) (seta). Figura 16: CDI
com expressão positiva para MMP-9 (escore 3) (seta).
11
12
13
14
15
16
55
Figura 17: CDIS com expressão negativa para CD44 (escore 1). Figura 18:
CDI com
expressão negativa para CD44 (escore 1).
Figura 19: CDIS com expressão positiva para CD44 (escore 2) (seta). Figura 20: CDI
com expressão positiva para CD44 (escore 2) (seta).
Figura 21: CDIS com expressão positiva para CD44 (escore 3) (seta). Figura 22: CDI
com expressão positiva para CD44 (escore 3) (seta).
17
18
19
20
21
22
56
7.3 Tabelas de relações entre CDI e CDIS nos diversos biomarcadores.
TABELA 6. Expressão imunoistoquímica da aromatase, metaloproteinase 2,
metaloproteinase 9 e CD44 nos 110 casos de carcinoma ductal
invasivo (cdi) em relação ao Grau Nuclear.
Grau Nuclear
Variável Categoria
I II III
Total Sig. (p)
2 34 11 47
negativo
40,00% 46,60% 34,40% 42,70%
3 39 21 63
Aromatase
cdi
positivo
60,00% 53,40% 65,60% 57,30%
0,504
2 40 19 61
negativo
40,00% 54,80% 59,40% 55,50%
3 33 13 49
CD44 cdi
positivo
60,00% 45,20% 40,60% 44,50%
0,706
4 63 28 95
negativo
80,00% 86,30% 87,50% 86,40%
1 10 4 15
MM2 cdi
positivo
20,00% 13,70% 12,50% 13,60%
0,902
0 21 6 27
negativo
0,00% 28,80% 18,80% 24,50%
5 52 26 83
MM9 cdi
positivo
100,00% 71,20% 81,30% 75,50%
0,233
Teste estatístico: Qui-quadrado.
57
TABELA 7. Expressão imunoistoquímica da aromatase, metaloproteinase 2,
metaloproteinase 9 e CD44 nos 110 casos de carcinoma ductal
invasivo (cdi) em relação ao Grau Histológico.
Grau Histológico
Variável
Categoria
I II III
Total Sig. (p)
3 33 11 47
negativo
33,30% 44,60% 40,70% 42,70%
6 41 16 63
Aro cdi
positivo
66,70% 55,40% 59,30% 57,30%
0,789
2 43 16 61
negativo
22,20% 58,10% 59,30% 55,50%
7 31 11 49
CD44 cdi
positivo
77,80% 41,90% 40,70% 44,50%
0,111
8 63 24 95
negativo
88,90% 85,10% 88,90% 86,40%
1 11 3 15
MM2 cdi
positivo
11,10% 14,90% 11,10% 13,60%
0,865
1 17 9 27
negativo
11,10% 23,00% 33,30% 24,50%
8 57 18 83
MM9 cdi
positivo
88,90% 77,00% 66,70% 75,50%
0,350
Teste estatístico: Qui-quadrado.
58
TABELA 8. Expressão imunoistoquímica da aromatase, metaloproteinase 2,
metaloproteinase 9 e CD44 nos 110 casos de carcinoma ductal in situ
(cdis) em relação ao Grau Nuclear .
Grau Nuclear
Variável Categoria
I II III
Total Sig. (p)
2
31
11
43
negativo
40,00%
42,50%
34,40%
40,00%
3
42
21
67
Aro cdis
positivo
60,00%
57,50%
65,60%
60,00%
0,738
2
41
19
62
negativo
40,00%
56,20%
59,40%
56,40%
3
32
13
48
CD44 cdis
positivo
60,00%
43,80%
40,60%
43,60%
0,718
4
63
28
95
negativo
80,00%
86,30%
87,50%
86,40%
1
10
4
15
MM2 cdis
positivo
20,00%
13,70%
12,50%
13,60%
0,902
0
22
6
28
negativo
0,00%
30,10%
18,80%
25,50%
5
51
26
82
MM9 cdis
positivo
100,00%
69,90%
81,30%
74,50%
0,191
Teste estatístico: Qui-quadrado
.
59
TABELA 9. Expressão da aromatase, MMP-2, MMP-9 e CD44 de acordo com o
tamanho do tumor nos 110 casos de carcinoma ductal invasivo (cdi).
Tamanho doTumor
Variável Categoria
<=2 cm >2 cm
Total Sig. (p)
19 27 46
negativo
47,50% 39,70% 42,60%
21 41 62
Aro cdi
positivo
52,50% 60,30% 57,40%
0,429
23 36 59
negativo
57,50% 52,90% 54,60%
17 32 49
CD44 cdi
positivo
42,50% 47,10% 45,40%
0,646
35 58 93
negativo
87,50% 85,30% 86,10%
5 10 15
MM2 cdi
positivo
12,50% 14,70% 13,90%
0,749
9 18 27
negativo
22,50% 26,50% 25,00%
31 50 81
MM9 cdi
positivo
77,50% 73,50% 75,00%
0,645
Teste estatístico: Qui-quadrado.
60
TABELA 10. Expressão da aromatase, MMP-2, MMP-9 e CD44 de acordo com o
tamanho do tumor nos 110 casos de carcinoma ductal in situ (cdis).
Tamanho doTumor
Variável Categoria
<=2cm >2cm
Total Sig. (p)
18 26 44
negativo
45,00% 38,20% 40,70%
22 42 64
Aro cdis
positivo
55,00% 61,80% 59,30%
0,490
24 36 60
negativo
60,00% 52,90% 55,60%
16 32 48
CD44 cdis
positivo
40,00% 47,10% 44,40%
0,476
35 58 93
negativo
87,50% 85,30% 86,10%
5 10 15
MM2 cdis
positivo
12,50% 14,70% 13,90%
0,749
10 18 28
negativo
25,00% 26,50% 25,90%
30 50 80
MM9 cdis
positivo
75,00% 73,50% 74,10%
0,866
Teste estatístico: Qui-quadrado.
61
TABELA 11. Expressão da aromatase, MMP-2, MMP-9 e CD44 de acordo com a
faixa etária nos 110 casos de carcinoma ductal invasivo (cdi).
Faixa etária
Variável Categoria
<50 anos >=50 anos
Total Sig. (p)
17 30 47
negativo
50,00% 39,50% 42,70%
17 46 63
Aro cdi
positivo
50,00% 60,50% 57,30%
0,302
16 45 61
negativo
47,10% 59,20% 55,50%
18 31 49
CD44 cdi
positivo
52,90% 40,80% 44,50%
0,236
31 64 95
negativo
91,20% 84,20% 86,40%
3 12 15
MM2 cdi
positivo
8,80% 15,80% 13,60%
0,325
7 20 27
negativo
20,60% 26,30% 24,50%
27 56 83
MM9 cdi
positivo
79,40% 73,70% 75,50%
0,519
Teste estatístico: Qui-quadrado.
62
TABELA 12. Expressão da aromatase, MMP-2, MMP-9 e CD44 de acordo com a
faixa etária nos 110 casos de carcinoma ductal in situ (CDIS).
Faixa etária
Variável Categoria
<50 anos >=50 anos
Total Sig. (p)
17 27 44
negativo
50,00% 35,50% 40,00%
17 49 66
Aro cdis
positivo
50,00% 64,50% 60,00%
0,152
17 45 62
negativo
50,00% 59,20% 56,40%
17 31 48
CD44 cdis
positivo
50,00% 40,80% 43,60%
0,368
31 64 95
negativo
91,20% 84,20% 86,40%
3 12 15
MM2 cdis
positivo
8,80% 15,80% 13,60%
0,325
7 21 28
negativo
20,60% 27,60% 25,50%
27 55 82
MM9 cdis
positivo
79,40% 72,40% 74,50%
0,433
Teste estatístico: Qui-quadrado.
63
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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76
RESUMO
77
Palavras chave: Aromatase; Metaloproteinase 2 da matriz; Metaloproteinase 9 da
matriz; Antígenos CD44; Carcinoma in situ; Carcinoma intraductal não infiltrante;
Carcinoma ductal de mama.
OBJETIVO: O objetivo de nosso estudo foi avaliar a correlação entre a expressão
imunoistoquímica da aromatase e marcadores de invasão celular (metaloproteinase
2 – MMP2, metaloproteinase 9 – MMP-9 e CD44) no carcinoma ductal in situ (CDIS)
e carcinoma ductal infiltrativo (CDI) presentes na mesma mama. CASUÍSTICA E
MÉTODOS: Foram avaliados 110 casos pelo método de tissue microarray (TMA) e
através da utilização de anticorpos policlonais anti aromatase, anticorpos
monoclonais anti MMP-2, anticorpos policlonais anti MMP-9 e anticorpos
monoclonais anti CD44. Os casos foram classificados em escores de zero a três de
acordo com a intensidade e o número de células coradas. Os escores zero e um
foram considerados negativos e os escores dois e três positivos. RESULTADO: A
aromatase estava expressa de forma positiva no CDI e CDIS em 63 (57.3%) e 60
(67%) casos respectivamente, existindo alta correlação entre suas expressões (p<
0,001). A expressão de MMP-2 estava expressa de forma positiva em 15 (13.60%)
casos tanto no CDI, quanto no CIDS existindo alta correlação entre suas expressões
(p< 0,001). A expressão da MMP-9 estava expressa de forma positiva em 83
(75.50%) e 82 (74.50%) casos de CDI e CDIS respectivamente, existindo alta
correlação entre suas expressões (p< 0,001). A expressão de CD44 estava expressa
de forma positiva em 49 (44.50%)
e 48 (42.60%) casos de CDI e CDIS
respectivamente, existindo alta correlação entre suas expressões (p< 0,001). Na
avaliação de correlação foi encontrado correlação positiva estatisticamente
significante no CDI entre aromatase e MMP-2 (p<0,01) e entre aromatase e MMP-9
(p=0,034). Nos casos de CDIS houve correlação positiva estatisticamente
significante entre aromatase e MMP-2 (p<0,001) e entre CD44 e MMP-9 (p=0,030).
Quando se avaliou a relação de expressão dos biomarcadores quando da análise do
grau nuclear, grau histológico, estadiamento axilar, receptores hormonais, grupo
etário e tamanho do tumor não foi encontrado diferenças nas expressões das
variáveis analisada. CONCLUSÃO: Após analisarmos os resultados de nosso estudo
podemos supor que a aromatase, através da síntese de estrogênio local no tecido
mamário, desempenha importante papel na carcinogênese mamária, principalmente
influenciando a atuação da MMP-2 e, de sobremaneira a MMP-9, grandes
responsáveis pela invasão celular tumoral que, por sua vez, dependem de sua
ligação a CD44 para poderem desempenhar suas funções.
78
ABSTRACT
79
Key words: Aromatase; Matrix metalloproteinase 2; Matrix metalloproteinase 9;
Antigens CD44; Carcinoma in situ; no infiltrating intraductal Carcinoma; Ductal
breast carcinoma
OBJECTIVE: The objective of our study was to evaluate the correlation between
immunohistochemical expression of aromatase and invasion factor cells: matriz
metalloproteinase 2 (MMP-2), matriz metalloproteinase 9 (MMP-9) and CD44 in
ductal carcinoma in situ (DCIS) and invasive ductal carcinoma (IDC) from the same
breast. CASUISTIC AND METHODS: 110 cases were evaluated by tissue microarray
(TMA) and immunohistochemically screened with anti-aromatase polyclonal
antibodies, anti-MMP-2 monoclonal antibodies, anti-MMP-9 policlonal antibodies and
anti-CD44 monoclonal antibodies. Specimens were assigned scores on a scale from
zero to three according to intensity of staining and number of stained cells. Scores
zero and one were considered negative results and scores two and three indicated
positive enzyme expression. RESULTS: Aromatase was expressed in IDC and DCIS
in 63 (57.3%) and 60 (67%) cases respectively; these data were highly correlated
(p<0,001). MMP-2 was similarly expressed in IDC and DCIS in 15 (13.60%) cases;
these data were highly correlated (p<0,001). MMP-9 was positively expressed in IDC
and DCIS in 83 (75.50%) and 82 (74.50%) cases, respectively; these data were
highly correlated (p<0,001). CD44 was positively expressed in IDC and DCIS in 49
(44.50%) and 48 (42.60%) cases, respectively; these data were highly correlated
(p<0,001). The correlation analysis found positive correlation statistically significant in
IDC between aromatase and MMP-2 (p<0,001) and between aromatase and MMP-9
(p=0,034). In DCIS were found positive correlation between aromatase and MMP-2
(p<0,001) and between MMP-9 and CD44 (p=0,030). When we did the avaliation of
the biomarkers expression in IDC and DCIS did not present statistically significant
differences with respect to nuclear grade, histologic grade, axilar state, hormonal
receptor, age group and tumor size. CONCLUSION: Our results allow us to conclude
that local mammary estrogen production by aromatase play an important role on
breast carcinogenesis mainly by influencing the action of MMP-2 and MMP-9, the
great responsible for tumor invasion cell with depends of its interaction with CD44 to
act.
80
APÊNDICES E LISTAS
81
Apêndice 1. Aprovação Comitê de Ética e Pesquisa
82
Apêndice 2. Termo de consentimento livre e esclarecido
83
Caso Idade Aromatase CD44 MMP-2 MMP-9 CDIS CDI Tamanho
TNM
CDI CDIS CDI CDIS CDI CDIS CDI CDIS GN TIPO GH GN
1 51 0 1 0 0 0 0 2 2 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T3N0M0
2 47 2 2 0 0 1 1 2 2 II
n-comedo
II II < 2 cm
T1N1M0
3 51 2 2 1 1 2 2 3 3 III
n-comedo
III III ≥ 2 cm
T2N1M0
4 43 3 3 0 0 2 2 1 1 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
5 37 3 3 0 0 2 2 3 3 III
comedo
III III ≥ 2 cm
T2N0M0
6 85 2 2 3 3 0 0 2 2 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T4N1M0
7 66 2 3 1 1 1 1 2 1 II n-comedo I II
< 2 cm T1N0M0
8 77 2 2 2 2 1 1 2 2 III n-comedo II III
< 2 cm T1N1M0
9 42 0 1 2 1 0 0 2 2 II n-comedo II II
< 2 cm T1N0M0
10 67 2 2 1 1 1 1 2 2 III
comedo
II III ≥ 2 cm
T2N0M0
11 46 3 3 1 1 1 1 3 3 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T4N3M0
12 71 1 1 1 1 1 1 2 2 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T3N0M0
13 47 1 1 1 1 1 1 2 2 II
comedo
II II < 2 cm
T1N0M0
14 50 2 2 1 1 1 1 1 1 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T2N1M0
15 79 2 2 3 3 1 1 3 3 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
16 35 1 1 1 1 1 1 3 3 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T3N1M0
17 60 2 2 1 1 1 1 3 2 II
comedo
II II
< 2 cm T1N0M0
18 81 1 1 1 1 2 2 2 2 I n-comedo I I
< 2 cm T1N0M0
19 65 1 2 1 1 1 1 2 2 III n-comedo II III
< 2 cm T1N2M0
20 72 3 3 1 1 1 1 3 2 III comedo III III
< 2 cm T4N1M0
21 52 3 3 3 3 1 1 3 3 III n-comedo II III
< 2 cm T1N1M0
22 52 2 2 3 3 1 1 3 3 II comedo II II ≥ 2 cm
T2N0M0
23 79 2 2 2 3 1 1 3 3 I n-comedo I I < 2 cm
T1N0M0
24 55 2 2 1 1 1 1 3 3 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
25 45 2 2 2 2 1 1 3 3 II
comedo
II II
< 2 cm T1N0M0
26 68 2 2 2 2 1 1 3 3 I n-comedo I I
< 2 cm T1N0M0
27 59 2 2 2 3 1 1 2 2 II n-comedo III II ≥ 2 cm
T4N0M0
28 46 1 1 0 0 1 1 3 3 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
29 49 3 3 3 3 1 1 2 2 II
comedo
I II ≥ 2 cm
T3N2M0
30 53 2 2 0 0 1 1 3 3 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
31 51 1 1 3 3 1 1 3 3 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T4N2M0
32 66 2 2 2 2 2 2 3 3 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T3N0M0
33 50 2 2 1 1 1 1 3 3 III n-comedo II III ≥ 2 cm
T3N3M0
34 70 2 2 1 1 2 2 3 3 III
comedo
II III ≥ 2 cm
T4N0M0
35 48 2 2 1 1 1 1 3 3 III
comedo
III III ≥ 2 cm
T3N1M0
36 31 2 2 3 3 1 1 2 2 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T4N0M0
37 50 2 2 3 3 1 1 3 3 II
comedo
I II ≥ 2 cm
T3N1M0
38 37 2 2 2 2 1 1 3 3 III n-comedo II III ≥ 2 cm
T2N0M0
39 65 2 1 3 3 1 1 3 3 III
n-comedo
III III ≥ 2 cm
T4N1M0
40 63 2 2 3 3 2 2 3 3 II
n-comedo
II II < 2 cm
T1N0M0
41 46 1 1 3 3 1 1 3 3 II
n-comedo
I II ≥ 2 cm
T3N0M0
42 51 2 2 2 2 2 2 3 3 II comedo II II ≥ 2 cm
T2N0M0
43 55 2 2 1 1 1 1 3 3 I n-comedo I I ≥ 2 cm
T2N0M0
44 52 2 2 1 1 2 2 3 3 III
comedo
II III ≥ 2 cm
T2N1M0
45 70 2 2 1 1 1 1 3 3 II
comedo
II II < 2 cm
T1N0M0
46 44 2 2 3 3 1 1 2 2 III
comedo
III III ≥ 2 cm
T2N0M0
Lista
1
.
Relação dos 110 casos avaliados
84
47 36 2 2 3 3 1 1 3 3 III
comedo
II III ≥ 2 cm
T2N0M0
48 71 2 2 2 2 1 1 3 3 II n-comedo III II ≥ 2 cm
T2N2M0
49 51 2 1 3 3 1 1 3 3 III comedo III III ≥ 2 cm
T2N0M0
50 74 2 2 3 3 2 2 3 3 II n-comedo II II < 2 cm
T1N1M0
51 54 1 1 3 3 1 1 3 3 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T3N3M0
52 58 1 1 0 0 2 2 1 1 II n-comedo II II < 2 cm
T1N0M0
53 49 0 0 0 0 1 1 2 2 III
comedo
III III ≥ 2 cm
T2N3M0
54 50 2 2 2 2 1 1 3 3 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
55 78 2 2 3 3 1 1 2 2 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T4N3M0
56 68 1 2 1 1 1 1 2 2 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T2N3M0
57 50 0 0 0 0 1 1 2 2 II n-comedo II II < 2 cm
T1N3M0
58 55 2 2 0 0 1 1 0 0 III n-comedo III III ≥ 2 cm
T4N2M0
59 57 1 2 1 1 1 1 3 3 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
60 64 2 2 0 0 1 1 2 2 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
61 66 3 3 0 0 1 1 1 1 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T2N0M0
62 63 1 2 2 2 2 2 2 2 II comedo II II ≥ 2 cm
T2N1M0
63 61 1 2 0 0 1 1 3 3 III comedo II III ≥ 2 cm
T2N1M0
64 63 3 3 1 1 2 2 1 1 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T3N1M0
65 62 2 2 1 1 1 1 2 2 III n-comedo II III ≥ 2 cm
T4N2M0
66 58 0 0 1 1 0 0 2 2 I comedo II I ≥ 2 cm
T4N2M0
67 67 0 0 1 1 1 1 2 2 II n-comedo III II ≥ 2 cm
T2N0M0
68 32 1 1 1 1 1 1 1 1 III comedo III III ≥ 2 cm
T2N3M0
69 44 0 0 2 2 1 1 1 1 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T3N0M0
70 63 1 1 0 0 1 1 3 3 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T3N3M0
71 57 2 2 0 0 1 1 2 2 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T4N2M0
72 56 0 0 1 1 1 1 1 1 III n-comedo II III ≥ 2 cm
T2N2M0
73 73 1 1 0 0 1 1 2 2 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T4N1M0
74 52 0
0 2 2 1 1 1 1 II
comedo
II II < 2 cm
T1N0M0
75 51 1 0 0 0 1 1 0 0 III
comedo
III III ≥ 2 cm
T2N1M0
76 43 3 3 0 0 1 1 1 1 III
comedo
III III ≥ 2 cm
T2N2M0
77 70 1 2 2 2 1 1 1 1 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
78 49 1 1 2 2 1 1 2 2 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T2N1M0
79 55 2 2 1 1 1 1 1 1 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T2N0M0
80 39 1 1 1 1 1 1 3 3 II comedo III II ≥ 2 cm
T2N1M0
81 48 2 2 0 0 1 1 2 2 II n-comedo II II < 2 cm
T1N0M0
82 59 2 2 2 2 1 1 2 2 III
comedo
III III ≥ 2 cm
T4N2M0
83 68 3 3 1 1 1 1 3 3 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
84 67 1 0 2 2 0 0 1 1 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T4N1M0
85 63 0 0 2 2 0 0 1 1 II n-comedo III II ≥ 2 cm
T2N0M0
86 71 1 1 1 1 2 2 1 1 II n-comedo II II
< 2 cm T1N1M0
87 59 1 1 2 2 1 1 1 1 II n-comedo I II
< 2 cm T1N0M0
88 39 1 1 0 0 1 1 0 0 II n-comedo III II ≥ 2 cm
T2N3M0
89 61 2 2 2 2 1 1 2 2 III
comedo
II III ≥ 2 cm
T2N3M0
90 26 1 1 3 3 1 1 2 2 III
comedo
III III ≥ 2 cm
T2N1M0
91 59 2 2 3 3 1 1 2 2 II
comedo
II II ≥ 2 cm
T4N3M0
92 43 3 3 2 2 2 2 1 1 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T3N0M0
93 70 2 2 0 0 2 2 1 1 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T2N1M0
94 34 2 2 2 2 1 1 2 2 II Comedo II II < 2 cm
T1N0M0
85
95 42 2 2 2 2 0 0 2 2 II Comedo III II ≥ 2 cm
T4N2M0
96 51 2 2 1 1 2 2 1 1 II n-comedo III II ≥ 2 cm
T2N0M0
97 55 0 0 3 3 1 1 1 1 II Comedo II II ≥ 2 cm
T2N0M0
98 72 2 2 2 2 1 1 3 3 II n-comedo II II < 2 cm
T2N0M0
99 48 0 0 2 2 0 0 0 0 II
Comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
100 55 1 1 3 3 1 1 2 2 II
Comedo
II II ≥ 2 cm
T2N0M0
101 90 0 0 1 1 1 1 2 2 II n-comedo II II
< 2 cm T1N0M0
102 77 0 0 1 1 1 1 0 0 II
Comedo
II II
< 2 cm T1N0M0
103 79 0 0 1 1 1 1 3 3 III
Comedo
III III ≥ 2 cm
T4N1M0
104 44 1 1 2 2 1 1 3 3 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T2N2M0
105 46 0 0 3 3 1 1 3 3 III comedo III III ≥ 2 cm
T2N2M0
106 44 2 2 1 1 1 1 2 2 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T2N1M0
107 68 2 2 2 2 1 1 1 1 III n-comedo III III < 2 cm
T1N0M0
108 46 1 1 2 2 1 1 3 3 III comedo III III ≥ 2 cm
T4N1M0
109 51 1 1 0 0 1 1 3 3 II n-comedo II II ≥ 2 cm
T2N1M0
110 46 2 2 3 3 1 1 3 3 III comedo III III ≥ 2 cm
T2N0M0
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