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COPPE/UFRJCOPPE/UFRJ
SELEÇÃO, CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA PROTEÍNA ASSOCIADA À
VIRULÊNCIA DE Streptococcus pneumoniae
Karen Einsfeldt
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Engenharia
Química, COPPE, da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre em
Engenharia Química.
Orientadores: Tito Lívio Moitinho Alves
Ariane Leites Larentis
Rodrigo Volcan Almeida
Rio de Janeiro
Março de 2010
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SELEÇÃO, CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA PROTEÍNA ASSOCIADA À
VIRULÊNCIA DE Streptococcus pneumoniae
Karen Einsfeldt
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DO INSTITUTO ALBERTO
LUIZ COIMBRA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA DE ENGENHARIA
(COPPE) DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE
DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE
EM CIÊNCIAS EM ENGENHARIA QUÍMICA.
Examinada por:
________________________________________________
Prof. Tito Lívio Moitinho Alves, D.Sc.
________________________________________________
Drª. Ariane Leites Larentis, D.Sc.
________________________________________________
Profª. Leda dos Reis Castilho, Dr.Ing.
________________________________________________
Profª. Bianca Cruz Neves, Ph.D.
________________________________________________
Dr. Marco Alberto Medeiros, D.Sc.
RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL
MARÇO DE 2010
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iii
Einsfeldt, Karen
Seleção, Clonagem e Expressão de uma Proteína
Associada à Virulência de Streptococcus pneumoniae/
Karen Einsfeldt. – Rio de Janeiro: UFRJ/COPPE, 2010.
XXIII, 127 p.: il.; 29,7 cm.
Orientadores: Tito Lívio Moitinho Alves
Ariane Leites Larentis
Rodrigo Volcan Almeida
Dissertação (mestrado) – UFRJ/ COPPE/ Programa de
Engenharia Química, 2010.
Referencias Bibliográficas: p. 118-127.
1. Expressão de proteína recombinante. 2. ClpP 3.
Escherichia coli. 4. Bacillus subtilis. 5. Planejamento de
Experimentos. 6. Estabilidade Plasmidial. I. Alves, Tito
Lívio Moitinho et al. II. Universidade Federal do Rio de
Janeiro, COPPE, Programa de Engenharia Química. III.
Titulo.
iv
Aos meus pais
v
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original”
(Albert Einstein)
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus orientadores, Tito, Ariane e Rodrigo, pelos ensinamentos,
discussões e principalmente pela inspiração e motivação.
Ao Prof. Tito Lívio Moitinho Alves e ao Programa de Engenharia
Química/COPPE pela formação acadêmica, estrutura disponibilizada, e suporte para a
realização deste trabalho.
A D.Sc. Ariane Leites Larentis pela dedicação, atenção e ensinamentos neste
período do mestrado. Ao D.Sc. Marco Alberto Medeiros por ter disponibilizado a
estrutura do Laboratório de Tecnologia Recombinante
(LATER)/BioManguinhos/Fiocruz e fornecido todo o suporte para a realização de parte
deste trabalho. Agradeço também ao pessoal do LATER pelo auxílio neste trabalho, em
especial, a Ana Paula, pelos ensinamentos, e a Júlia, pela ajuda em vários experimentos.
Ao Prof. Rodrigo Volcan Almeida pelos ensinamentos, atenção e por ter
disponibilização o laboratório e todo o suporte para a realização deste trabalho. Ao
pessoal do LAMMP pelas conversas e pelo auxílio em parte deste trabalho.
Ao D.Sc. Leon Rabinovitch e a
M.Sc. Sônia E. Alves da Silva pelo treinamento
fornecido em B. subtilis e por terem aberto as portas do Laboratório de Fisiologia
Bacteriana e Coleção de Culturas do Gênero Bacillus e Gêneros Correlatos.
Ao Laboratório de Produtos Biológicos – INCQS/Fiocruz, por disponibilizar os
equipamentos e o espaço para realização das análises de densitometria. Ao Laboratório
de AIDS & Imunologia Molecular – IOC/Fiocruz por disponibilizar o uso do
seqüenciador e ao Alfredo Jabor pelo auxílio nas análises do seqüenciamento.
Aos grandes amigos que fiz aqui no Rio de Janeiro, em especial ao Aldo, Elis,
Felipe, Gisele, Guillermo e Lívia, pelas conversas, risadas, festas, emails engraçados, e
pelo apoio nos momentos difíceis no mestrado e no Rio. Ao Guillermo “boludo”, pela
preciosa ajuda nos experimentos finais deste trabalho.
vii
A minha família que de alguma forma sempre esteve presente. Aos meus pais
por toda a força, dedicação e pelo incentivo para que eu nunca desista dos meus sonhos,
por mais difíceis que estes possam parecer. A mudança para o Rio de Janeiro foi difícil
não só para mim, mas para eles também, por isso muito obrigada por tudo, sei que todo
o esforço será recompensado.
Em especial ao meu namorado, minha família no Rio de Janeiro, que me deu
forças para continuar meus estudos, que sempre me encorajou a “querer mais” e a “fazer
melhor” e que sempre esteve ao meu lado, suportando meu nervosismo, mau humor e
ansiedade principalmente na parte final deste trabalho.
viii
Resumo da Dissertação apresentada à COPPE/UFRJ como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências (M.Sc.)
SELEÇÃO, CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA PROTEÍNA ASSOCIADA À
VIRULÊNCIA DE Streptococcus pneumoniae
Karen Einsfeldt
Março/2010
Orientadores: Tito Lívio Moitinho Alves
Ariane Leites Larentis
Rodrigo Volcan Almeida
Programa: Engenharia Química
Infecções causadas por S. pneumoniae são uma das principais causas de morte
no mundo e o desenvolvimento de uma vacina composta por proteínas é uma alternativa
para resolver este problema. Neste trabalho objetivou-se selecionar, clonar e expressar,
utilizando E. coli e B. subtilis como sistemas de expressão, um fator de virulência de
S. pneumoniae, sorotipo 14, com alta prevalência e conservação entre os sorotipos, bem
como otimizar a expressão da proteína empregando planejamento experimental e
estudar a segregação plasmidial do sistema. A proteína selecionada, ClpP, foi clonada
em E. coli e sua expressão foi otimizada através de planejamento fatorial 2², variando a
concentração de indutor e de canamicina e analisando, como respostas, concentração de
proteína heteróloga, crescimento celular e fração de células com plasmídeo. Em todos
os experimentos, a proteína ClpP foi expressa em concentrações similares e de forma
solúvel, com média no ponto central de 240,4 mg/L. Pode-se concluir que é possível
diminuir em 10 vezes a concentração de indutor e retirar o antibiótico do sistema,
reduzindo custos e mantendo a expressão em níveis similares. O sistema apresentou
segregação plasmidial mesmo nas concentrações habituais de antibiótico. Não foram
obtidas células recombinantes utilizando B. subtilis como hospedeiro, provavelmente
devido à instabilidade do vetor, reforçando a ideia que as ferramentas para a utilização
deste sistema de expressão precisam ser melhor estudadas e desenvolvidas.
ix
Abstract of Dissertation presented to COPPE/UFRJ as a partial fulfillment of the
requirements for the degree of Master of Science (M.Sc.)
SELECTION, CLONING AND EXPRESSION OF A PROTEIN ASSOCIATED
WITH VIRULENCE OF Streptococcus pneumoniae
Karen Einsfeldt
March/2010
Advisors: Tito Lívio Moitinho Alves
Ariane Leites Larentis
Rodrigo Volcan Almeida
Department: Chemical Engineering
Infections caused by S. pneumoniae are one of the main causes of death in the
world and the development of a vaccine composed of proteins is an alternative to tackle
this problem. This work aimed to select, clone and express, using E. coli and B. subtilis
as expression systems, a virulence factor of S. pneumoniae, serotype 14, with high
prevalence and conservation among the serotypes, as well to optimize the protein
expression using experimental design and to study the plasmid segregation of the
system. The selected protein, ClpP, was cloned in E. coli and its expression was
optimized by a 2² factorial design, varying the inducer and kanamycin
concentrations
and evaluating as responses the concentration of heterologous protein, cell growth and
fraction of cells with plasmid. In all experiments, the ClpP protein was expressed at
similar concentrations and in soluble form, with an average concentration of 240,4mg/L
in the central point. It can be concluded that it is possible to decrease 10 times the
concentration of inducer and remove the antibiotic from the system, reducing costs and
keeping the expression at similar levels. The system showed plasmid segregation even
in normal concentrations of antibiotics. When B. subtilis was used as host, no
recombinant cells were obtained, probably due to vector instability, reinforcing the idea
that the tools for using this expression system must be better studied and developed.
x
SUMÁRIO
RESUMO
viii
ABSTRACT
ix
LISTA DE FIGURAS
xiii
LISTA DE TABELAS
xx
LISTA DE ABREVIAÇÕES
xxii
1 INTRODUÇÃO
1
2 REVISÃO DA LITERATURA
5
2.1 Fatores de virulência
5
2.1.1 Cápsula polissacarídica 5
2.1.2 Proteínas 6
2.1.2.1 ClpP 9
2.1.2.2 IgA1 protease 12
2.1.2.3 Hialuronato liase (Hyl) 13
2.2 Sistemas de expressão de proteínas recombinantes
16
2.2.1 Escherichia coli como sistema de expressão de proteínas recombinantes 18
2.2.2 Bacillus subtilis como sistema de expressão de proteínas recombinantes 21
2.2.3 Estabilidade plasmidial 23
2.3 Planejamento de experimentos em sistemas recombinantes
25
3 METODOLOGIA
27
3.1 Seleção da proteína
27
3.2 Clonagem e expressão do gene clpP de S. pneumoniae em Escherichia coli
28
xi
3.2.1 Extração de DNA genômico de Streptococcus pneumoniae 28
3.2.2 Amplificação do gene através da técnica de PCR 30
3.2.2.1 Oligonucleotídeos iniciadores 30
3.2.2.2 Reação de PCR 32
3.2.2.3 Purificação do gene clpP amplificado 33
3.2.3 Clonagem 34
3.2.4 Preparação de células eletrocompetentes 37
3.2.5 Transformação de Escherichia coli 38
3.2.6 Seleção de clones e preparação de estoques em glicerol 39
3.2.7 Extração de DNA plasmidial 40
3.2.8 Confirmação dos clones 41
3.2.8.1 Digestão com enzimas de restrição 41
3.2.8.2 Seqüenciamento 42
3.2.9 Preparação de lote de trabalho e viabilidade celular 42
3.2.10 Crescimento celular e curva de massa seca de células 44
3.2.11 Expressão e preparação dos extratos protéicos para análise de solubilidade 44
3.2.12 Otimização da expressão por planejamento de experimentos 46
3.2.13 Avaliação do crescimento celular e quantificação da proteína expressa em
SDS-PAGE
48
3.2.14 Análise da segregação plasmidial 49
3.2.15 Validação da condição otimizada no planejamento fatorial 50
3.2.16 Purificação 50
3.3 Clonagem utilizando Bacillus subtilis como sistema de expressão
51
3.3.1 Caracterização da cepa de Bacillus subtilis WB600 51
3.3.2 Desenho do gene clpP sintético e vetores utilizados 52
3.3.3 Preparo de células competentes para transformação por choque térmico
54
3.3.4 Clonagem
55
3.3.5 Transformação por choque térmico 57
xii
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
58
4.1 Seleção da proteína
58
4.1.1 Comparação das proteínas: ClpP, IgA1 protease e Hialuronato liase
66
4.2 Amplificação do gene clpP de S. pneumoniae
67
4.2.1 Extração de DNA genômico de S. pneumoniae
67
4.2.2 Amplificação do gene clpP por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) 68
4.3 Clonagem e expressão utilizando Escherichia coli como sistema de
expressão
69
4.3.2 Clonagem utilizando o vetor pET28b
69
4.3.3 Seqüenciamento
71
4.3.4 Expressão da proteína recombinante ClpP 72
4.3.5 Otimização da expressão e estudos de segregação plasmidial
74
4.3.5.1 Validação da condição otimizada pelo planejamento de experimentos -
Estudo da cinética de produção da proteína e segregação plasmidial
82
4.3.6 Purificação
90
4.4 Clonagem e expressão utilizando Bacillus subtilis como sistema de
expressão
93
4.4.1 Caracterização da cepa Bacillus subtilis WB600 93
4.4.2 Clonagem 94
5 CONCLUSÕES
98
APÊNDICE A
101
APÊNDICE B
103
APÊNDICE C
114
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
118
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Representação do monômero de ClpP de S. penumoniae. Adaptado de
GRIBUN et al. (2005)
9
Figura 2.2 (A) Estrutura da proteína ClpP de S. pneumoniae depositada no PDB
(Protein Data Bank) sob o número de identificação 1Y7O (GRIBUN et al., 2005).
(B) Representação esquemática da estrutura da molécula tetradecamérica de ClpP
de Helicobacter pilory, a qual apresenta seqüências e estrutura razoavelmente bem
conservadas. Composição da molécula semelhante a de ClpP de S. pneumoniae
(KIM E KIM, 2008)
10
Figura 2.3 Desenho esquemático da região próxima ao sítio catalítico da proteína
ClpP de seis diferentes microrganismos. Os desenhos em verde e lilás representam
duas cepas de H. pilory, em marrom E. coli, em azul S. pneumoniae, em laranja
P.falciparum e em amarelo M. tuberculosis (KIM E KIM, 2008)
10
Figura 2.4 Representação esquemática de IgA1 protease típica de Streptococcus.
Adaptado de PAOLIS et al. (2007)
13
Figura 2.5 Degradação do ácido hialurônico e formação da unidade dissacarídica
(principal produto da ação da Hyl bacteriana sobre o ácido hialurônico). Adaptado
de AKHTAR E BHAKUNI (2004).
14
Figura 2.6 Estrutura da Hyl de Streptococcus pneumoniae complexada com
dissacarídeo de ácido hialurônico, depositada no PDB (Protein Data Bank) sob o
número de identificação 1C82 (PONNURAJ E JEDRZEJAS, 2000)
15
Figura 3.1 Sítio de clonagem e expressão do vetor pET28b (Novagen). Os
círculos vermelhos indicam os sítios das enzimas de restrição, também
adicionados aos oligonucleotídeos iniciadores, onde o gene clpP amplificado irá se
ligar. O círculo verde indica o códon de terminação, ou seja, a sinalização para o
xiv
termino da tradução, possibilitando assim a expressão da proteína fusionada a
cauda de histidina.
32
Figura 3.2 Desenho esquemático das etapas realizadas na clonagem (construção
do vetor pET28b/clpP).
35
Figura 3.3 Mapa do vetor pET28a, igual ao pET28b (Novagen). O mapa mostra a
origem de replicação (ori), o repressor lac (lacl), o gene de resistência à
canamicina (Kan) e o sítio de múltipla clonagem (seta em preto sólido).
35
Figura 3.4 Desenho esquemático dos procedimentos realizados para a análise de
viabilidade celular.
43
Figura 3.5 Esquema dos procedimentos realizados nos experimentos de expressão
e análise de solubilidade da proteína.
45
Figura 3.6 Desenho esquemático das etapas realizadas na análise de segregação
plasmidial.
49
Figura 3.7 Fotos das placas de LB ágar, com e sem canamicina, das análises de
segregação plasmidial do experimento PC8 do planejamento fatorial.
50
Figura 3.8 Mapa do plasmídeo pBSK ClpP717.
53
Figura 3.9 Mapa do plasmídeo pHCMC03 (NGUYEN et al.,2005)
54
Figura 3.10 Desenho esquemático das etapas realizadas para a construção do
vetor utilizada na clonagem em B. subtilis.
55
Figura 4.1. Comparação da seqüência de aminoácidos da proteína ClpP de S.
pneumoniae CGSP14, depositada no GenBank sob o código GI: 182629000, com
outras sequências depositadas no banco de dados de proteínas, através da
ferramenta Blastp. A seta indica onde a análise avalia que além das três seqüências
xv
demonstradas existem mais 52 seqüências com 100% de identidade.
59
Figura 4.2. Alinhamento múltiplo, realizado com o auxílio do programa
CLUSTAL W, de oito seqüências da proteína ClpP, de diferentes cepas de S.
pneumoniae, depositadas no GenBank. O alinhamento foi realizado com as
seguintes cepas de S. pneumoniae: 70585 (GI: 225858557), TIGR4 (GI: 930696),
R6 (GI: 934194), CGSP14 (GI:182629000), Hungary19A-6 (GI:168994986), D39
(GI: 116076792), P1031 (GI: 225856422), G54 (GI:194358110).
60
Figura 4.3. Regiões transmembranares presentes na proteína IgA1 protease de S.
pneumoniae CGSP14, segundo predição do programa CLC Workbench 4. (A)
Desenho esquemático da região amino terminal de IgA1 protease, apresentando as
regiões transmembranares e o peptídeo sinal. (B) Esquema da disposição da
proteína na membrana celular, apresentando as três regiões que atravessam a
membrana.
63
Figura 4.4. Análise da região amino terminal da proteína IgA1 protease de S.
pneumoniae CGSP14. Predição do peptídeo sinal através do programa SignalP
3.0. S score (linha verde) mostra a probabilidade de um aminoácido estar presente
no peptídeo sinal, C score (linha vermelha) e Y score (linha azul) mostram onde
seja o provável começo da proteína.
64
Figura 4.5. Esquema da disposição da Hyl na membrana celular, de acordo com o
programa CLC Workbench 4. As duas regiões da proteína que atravessam a
membrana (transmembranares) são representadas no esquema.
65
Figura 4.6. Análise da região amino terminal da proteína Hyl de S. pneumoniae
CGSP14. Predição do peptídeo sinal através do programa SignalP 3.0. S score
(linha verde) mostra a probabilidade de um aminoácido estar presente no peptídeo
sinal, C score (linha vermelha) e Y score (linha azul) mostram onde seja o
provável começo da proteína.
66
Figura 4.7 Gel de agorose 0,8% em TAE mostrando o perfil eletroforético da
xvi
solução resultante da extração de DNA genômico de S. pneumoniae. 1 e 2, DNA
genômico extraído de S. pneumoniae (amostras 3 e 4 respectivamente); 3 e 4,
DNA genômico extraído de S. pneumoniae diluído 10 vezes (amostras 3 e 4
respectivamente); 5 e 6, DNA genômico extraído de S. pneumoniae diluído 100
vezes (amostras 3 e 4 respectivamente); M, padrão de tamanho de fragmento
(DNA λ digerido com Hind III). A seta indica a banda do marcador com 23130bp.
68
Figura 4.8 (A) Gel de agorose 0,8% em TAE da amplificação do gene clpP
utilizando diferentes temperaturas de anelamento no programa do PCR. M, padrão
de tamanho de fragmento (ΦX174 DNA digerido com Hae III); Gene clpP
amplificado por PCR utilizando temperatura de anelamento dos oligonucleotídeos
iniciadores igual a 54ºC (1), 55,1ºC (2), 56ºC (3), 55,9ºC (4); Controle negativo da
reação de PCR (5); A seta indica o banda do marcador com 603bp, próximo ao
tamanho esperado do gene clpP amplificado. (B) Gel de agarose 1,5% em TAE do
produto de PCR purificado. M, padrão de tamanho de fragmento (ΦX174 DNA
digerido com Hae III); 1, Purificação do gene clpP amplificado; A seta indica o
banda do marcador com 603bp, próximo ao tamanho esperado do gene clpP
amplificado.
69
Figura 4.9 Confirmação dos clones - Digestão dos plasmídeos extraídos das cepas
transformadas E. coli TOP 10 com o vetor construído. M, padrão de tamanho de
fragmento 1 kb DNA Ladder (Invitrogen); 1, 3, 5 e 7, plasmídeos extraídos dos
clones C1N, C8N, C2P e C4P, respectivamente; 2, 4, 6 e 8, plasmídeos digeridos
extraídos dos clones C1N, C8N, C2P e C4P, respectivamente; 9 e 11, clpP e
pET28b, respectivamente; 10 digestão do gene clpP com PstI (controle positivo);
12, digestão do vetor pET28b com EcoRV (controle positivo). As setas indicam as
bandas do padrão de tamanho de fragmento mais próximas as bandas esperadas na
digestão de clones positivos.
70
Figura 4.10 Digestão dos plasmídeos extraídos das cepas transformadas E. coli
BL21 Star (DE3). M, padrão de tamanho de fragmento 1 kb DNA Ladder
(Invitrogen); 1, 3, 5 e 7, plasmídeos extraídos dos clones C2P/1, C2P/2, C2P/3,
C2P/4, respectivamente; 2, 4, 6 e 8, plasmídeos digeridos extraídos dos clones
xvii
C2P/1, C2P/2, C2P/3, C2P/4, respectivamente; 9 e 11, clpP e pET28b,
respectivamente; 10 digestão do gene clpP com PstI (controle positivo); 12,
digestão do vetor pET28b com EcoRV (controle positivo). As setas indicam as
bandas do padrão de tamanho de fragmento mais próximas as bandas esperadas na
digestão de clones positivos.
71
Figura 4.11 Seqüenciamento do Plasmídeo pET28b/clpP-C2P. A figura mostra a
seqüência de nucleotídeos do gene clpP (preto), o sítio de restrição da enzima
XhoI (rosa), a seqüência da cauda de histidina (azul) e o códon de terminação
(vermelho), presentes no plasmídeo construído e seqüenciado.
71
Figura 4.12 Gel de SDS-PAGE 12,5% dos extratos protéicos totais e de suas
frações, solúvel e insolúvel, obtidos através da expressão da proteína ClpP por E.
coli BL21 Star (DE3). M1 e M2, padrão de massa molar; 1 e 5, amostras do
cultivo não induzido dos clones C2P/2 e C2P/4, respectivamente; 2 e 6, extratos
protéicos totais dos clones C2P/2 e C2P/4, respectivamente; 3 e 7, frações
insolúveis dos clones C2P/2 e C2P/4, respectivamente; 4 e 8, frações solúveis dos
clones C2P/2 e C2P/4, respectivamente. As amostras aplicadas no gel foram
normalizadas por Abs
600nm
.
74
Figura 4.13 Gel de SDS-PAGE 12,5% com o extrato total das proteínas dos
experimentos do planejamento fatorial. (A) M, padrão de massa molar LMW
(Amersham Bioscience); 1, 3, 5, e 7, extrato total sem indução dos experimentos
1, 2, 5(PC) e 7(PC), respectivamente; 2, 4, 6 e 8, extrato total com 4h de indução
dos experimentos 1, 2, 5(PC) e 7(PC), respectivamente. (B) M, padrão de massa
molar LMW (Amersham bioscience); 1, 3, 5, e 7, extrato total sem indução dos
experimentos 3, 4, 6(PC) e 8(PC), respectivamente; 2, 4, 6 e 8 extrato total com 4h
de indução dos experimentos 3, 4, 6(PC) e 8(PC), respectivamente. As amostras
foram normalizadas pela Abs
600nm
.
78
Figura 4.14 Gráfico de F (fração de células com plasmídeo) em função da
concentração de IPTG, mostrando o efeito não linear do sistema.
81
xviii
Figura 4.15 Cinética de crescimento celular das réplicas da condição otimizada,
experimentos A, B, C, D e E, e do experimento N (controle negativo). A seta
mostra o ponto em que foi adicionado o indutor IPTG.
83
Figura 4.16 Ajuste linear dos pontos durante a fase exponencial de crescimento
celular a partir da indução da expressão. Cálculo da velocidade específica de
crescimento de E. coli durante a expressão da proteína ClpP.
84
Figura 4.17 Cinética da produção de proteína. Os quadrados representam a
concentração média de ClpP ao longo do tempo utilizando a condição otimizada
pelo planejamento de experimentos (0,1mM IPTG e 0µg/mL). As barras
representam os desvios padrões nos pontos do experimento na condição otimizada.
86
Figura 4.18 Gráfico da variável F (fração de células com plasmídeo) em função
do tempo.
87
Figura 4.19 Gráfico do Fator de rendimento de massa de ClpP produzida por
massa de célula (Y
P/X
) e da Fração de células com plasmídeo (F) em função do
tempo.
90
Figura 4.20 Gel de SDS-PAGE 12,5% da purificação da proteína ClpP. M, padrão
de massa molar LMW (Amersham Bioscience); 1, extrato celular total lisado; 2,
fração não adsorvida (amostra sem imidazol); 3; eluído com a primeira
concentração de imidazol (amostra sem imidazol), 4, eluído com 220 mM de
imidazol (amostra sem imidazol); 5, eluído com 300 mM de imidazol (amostra
sem imidazol); 6, fração não adsorvida (amostra com 1mM de imidazol); 7, eluído
com a primeira concentração de imidazol (amostra com 1 mM de imidazol); 8,
eluído com 220 mM de imidazol (amostra com 1mM de imidazol); 9, eluído com
300 mM de imidazol (amostra com 1 mM de imidazol).
91
Figura 4.21 Gel de SDS-PAGE 12,5% do teste de estabilidade da proteína. (A)
gel das amostras logo após a purificação; M, padrão de massa molar LMW
xix
(Amersham Bioscience); 1 e 2, amostras de ClpP purificada. (B) gel das amostras
armazenadas a -20ºC durante 7 meses após a purificação; M, padrão de massa
molar LMW (Amersham Bioscience); 1, 2, e 3, amostras de ClpP purificadas e
armazenadas a -20ºC por 7 meses.
92
Figura 4.22 Alinhamento múltiplo do gene clpP sintético utilizado para a
clonagem em B. subtilis, sem a otimização de códons (submetido) e otimizado.
Em verde são mostrados os nucleotídeos que sofreram alterações no gene
otimizado. A seqüência do peptídeo sinal está realçada em amarelo. A seqüência
do sítio de clivagem está sublinhada.
95
Figura 4.23 (A) gel de agarose 1% das digestão dos vetores pBSKClpP717 e
pHCMC03. M, marcador padrão de tamanho de fragmento 1kb DNA ladder; 1,
vetor pBSKclpP717; 2 e 3, vetor pBSKclpP717 digerido com as enzimas BamHI e
XbaI; 4, vetor pHCMC03; 5 e 6, vetor pHCMC03 digerido com as enzimas
BamHI e XbaI. (B) gel de agarose 1% das purificações das digestões. M, marcador
padrão de tamanho de fragmento 1kb DNA ladder; 1, vetor pBSKclpP717; 2,
inserto (clpP) digerido e purificado; 3, vetor pHCMC03; 4, 5 e 6 vetor pHCMC03
linearizado e purificado.
96
xx
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de PCR para
amplificação do gene clpP a partir de DNA de S. pneumoniae CGSP14. Os sítios
de clivagem das enzimas de restrição são mostrados sublinhados nas seqüências,
sítio de NcoI na seqüência senso e XhoI na anti-senso.
31
Tabela 3.2 Tabela com as condições dos experimentos do planejamento fatorial
2². Os números entre parênteses são os valores das variáveis independentes
normalizados.
47
Tabela 4.1. Dados gerados pelo alinhamento múltiplo, realizado no programa
CLUSTAL W, de oito sequências de aminoácidos da proteína IgA1 protease de
S. pneumoniae depositadas no GenBank.
62
Tabela 4.2. Dados gerados pelo alinhamento múltiplo, realizado no programa
CLUSTAL W, de nove seqüências de aminoácidos da proteína Hyl de S.
pneumoniae depositadas no GenBank.
65
Tabela 4.3 Mutações detectadas no seqüenciamento do plasmídeo pET28b/clpP-
C2P quando comparada a seqüência obtida pelo seqüenciamento e a seqüência
de S. pneumoniae CGSP14 depositada no GenBank.
72
Tabela 4.4 Experimentos do planejamento fatorial e suas variáveis de resposta
75
Tabela 4.5 Efeitos das variáveis sobre o crescimento celular (mg/mL de massa
seca de células)
77
Tabela 4.6 Efeitos das variáveis sobre concentração de ClpP (mg/L)
79
Tabela 4.7 Efeitos das variáveis sobre o valor de F (fração de células com
plasmídeo), desconsiderando o valor de F do experimento PC6.
79
xxi
Tabela 4.8 Efeitos das variáveis sobre o valor de F (fração de células com
plasmídeo), considerando o valor de F do experimento PC6.
80
Tabela 4.9 Crescimento celular dos experimentos de validação do planejamento
fatorial
82
Tabela 4.10 Concentração de ClpP recombinante produzida ao longo das 4 horas
de expressão nos experimentos da validação.
85
Tabela 4.11 Fatores de rendimento (Y
P/X
) ao longo do tempo de indução
86
Tabela 4.12 Valores da variável F (fração de células com plasmídeo) ao longo
do tempo nas réplicas dos experimentos da validação
88
Tabela 4.13 Resultado dos testes bioquímicos realizados com as cepas Bacillus
subtilis WB600 e Bacillus subtilis LFB732 (utilizada para comparação).
94
xxii
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS
aa Aminoácido
Abs
600nm
Absorbância a 600nm
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
DNA Ácido desoxirribonucléico
DTT Ditiotreitol
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
F Fração de células com plasmídeo
GI Número de identificação do gene no GenBank
GRAS generally recognized as safe
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
HPLC Cromatografia líquida de alta performance
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactosídeo
LB Luria-Bertani
LMW Low Molecular Weight
LPS Lipopolissacarídeo
Mops Morfolinopropanosulfônico
mRNA
Ácido ribonucléico mensageiro
NCBI National Center for Biotechnology
p p-valor
pb Pares de base
PBS Tampão fosfato salina
PC Ponto Central
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PDB Protein Data Bank
PCV-7 Vacina conjugada heptavalente
RNA Ácido ribonucléico
SDS Dodecil sulfato de sódio
xxiii
SDS-PAGE Gel de Eletroforese Desnaturante de Poliacrilamida
TAE Tampão Tris-Acetato-EDTA
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
TSB Tryptic Soy Broth
UFC Unidade Formadora de Colônia
Y
P/X
Fator de Rendimento (produto por célula)
1
1 INTRODUÇÃO
Uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo,
principalmente em países em desenvolvimento, são infecções causadas por
Streptococcus pneumoniae (GARCÍA-SUÁREZ et al., 2006; OMS, 2007; BRAIDO et
al., 2008). Este microrganismo é uma bactéria encapsulada, gram-positiva, anaeróbia
facultativa, que coloniza o trato respiratório superior de seres humanos sadios e é
transmitido por aerosol. O exterior da superfície bacteriana é coberto por uma cápsula
polissacarídica. Existem mais de 90 diferentes tipos de polissacarídeos capsulares,
indentificando pelo menos 90 diferentes sorotipos (BRAIDO et al., 2008; PLETZ et al.,
2008).
A virulência de S. pneumoniae é largamente dependente da sua cápsula de
polissacarídeo, que é muito heterogênea entre os sorotipos existentes e representa um
sério obstáculo para a concepção de uma vacina com alta eficiência (BAROCCHI et al.
2007). No entanto, inúmeras proteínas da bactéria também têm sido consideradas
fatores de virulência, sendo envolvidas na patogenicidade das doenças pneumocócicas
(JEDRZEJAS, 2001; GARCÍA-SUÁREZ et al., 2006; BRAIDO et al., 2008).
A espécie S. pneumoniae coloniza assintomaticamente aproximadamente 30-
70% das crianças saudáveis e 6 % dos adultos saudáveis, aumentando para 18-30% dos
adultos quando estes convivem com crianças (BRAIDO et al., 2008). Esta bactéria é a
principal causadora de pneumonia bacteriana e é freqüentemente envolvida em doenças
como otite, sinusite e meningite, além de quadros clínicos de septicemia e bacteremia
(JEDRZEJAS, 2001; BOGAERT, 2004; BRAIDO et al., 2008). Dentre todas as
infecções invasivas causadas por este microrganismo, cerca de 90% são representadas
por pneumonia e 5% por meningite (BRAIDO et al., 2008).
Nos países desenvolvidos, a incidência das doenças pneumocócicas é maior
entre crianças com menos de 2 anos e idosos. Condições associadas à deficiência imune,
como infecção pelo vírus do HIV, aumentam significativamente a probabilidade de
contrair doenças causadas por S. pneumoniae. Ou seja, as taxas mundiais de doenças
pneumocócicas são muito altas, porém são ainda mais preocupantes em grupos de risco,
como crianças, idosos e imunocomprometidos. Dados da Organização Mundial da
2
Saúde (OMS) estimam que 1,6 milhões de pessoas morrem todo o ano no mundo devido
a doenças pneumocócicas, sendo que destas, em torno de 1 milhão são crianças com
menos de 5 anos, e a maioria dos casos ocorre em países em desenvolvimento (OMS,
2007).
Outro fato que preocupa é que nos últimos anos vem aumentando o número de
cepas resistentes aos mais diversos tipos de antibióticos, sendo encontradas cepas
resistentes até mesmo à Vancomicina, o que torna o tratamento das infecções
pneumocócicas um grave problema de saúde pública (NOVAK et al., 1999;
JEDRZEJAS, 2001; BRAIDO et al., 2008).
Atualmente existem dois tipos de vacinas contra S. pneumoniae disponíveis no
mercado mundial: vacinas polissacarídicas e vacinas conjugadas. Ambas utilizam como
antígenos polissacarídeos capsulares. A vacina polissacarídica é composta por 23
polissacarídeos capsulares purificados de diferentes sorotipos de S. pneumoniae
(sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F,
20, 22F, 23F e 33F) (BRAIDO et al., 2008; PLETZ et al., 2008). Esta vacina é eficaz
em adultos e crianças maiores de 2 anos, no entanto, tem baixa eficácia em crianças
com menos de 2 anos, imunocomprometidos e idosos. Além disso, tem seu período de
proteção limitado (BOGAERT et al., 2004; GARCÍA-SUÁREZ et al., 2006; PLETZ et
al., 2008). A vacina polissacarídica não é eficiente em menores de 2 anos, devido à
ausência de linfócitos B maduros que induzem uma melhor resposta contra
carboidratos. Em adultos é preciso fazer a re-vacinação depois de 5-6 anos. A vantagem
desta vacina é o alto número de sorotipos abrangidos (PLETZ et al., 2008).
Atualmente é comercializada a vacina conjugada heptavalente (PCV-7),
composta por polissacarídeos capsulares de 7 sorotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F)
os quais representam os mais freqüentemente envolvidos em infecções invasivas
(PLETZ et al., 2008). Os polissacarídios presentes são conjugados ao toxóide diftérico
CRM 197 (detoxificado geneticamente) (BRAIDO et al., 2008). Esta vacina tem se
mostrado eficaz em crianças, no entanto, ela possui cobertura limitada de sorotipos e
custo elevado, o que torna seu uso proibitivo para um programa nacional de vacinação
em países em desenvolvimento (BOGAERT et al., 2004; BAROCCHI et al, 2007). A
PCV-7 pode alcançar uma cobertura de 65-80% dos sorotipos relacionados as doenças
3
pneumocócicas invasivas em crianças nos países industrializados ocidentais, nos quais
os sorotipos presentes nesta vacina são os mais prevalentes. No entanto, esta cobertura
pode chegar a níveis muito mais baixos em alguns países em desenvolvimento (OMS,
2007).
Além da vacina conjugada heptavalente já comercializada, no ano de 2009
estavam em fase final dos testes clínicos as vacinas conjugadas 10-valente e 13-valente
(DAGAN E FRASCH, 2009). A vacina 13-valente, desenvolvida pela empresa Wyeth,
além dos 7 sorotipos presentes na PCV-7, apresenta também os sorotipos 1, 3, 5, 6A, 7F
e 19A. Os polissacarídios presentes nesta vacina também são conjugados ao toxóide
diftérico CRM 197 (detoxificado geneticamente). É estimado que esta vacina aumente a
cobertura das doenças pneumocócicas invasivas em 89% na Europa, 92% nos Estados
Unidos e Canadá, 86% na Oceania, 87% na África e América Latina e 73% na Ásia
(GRIMPREL, 2009). A vacina 10-valente, desenvolvida pela empresa GlaxoSmithKline
Biologicals (GSK), apresenta mais 3 sorotipos (1, 5 e 7F) além daqueles presentes na
PCV-7. Esta vacina possui 8 polissacarídeos capsulares conjugados com a proteína D de
H. influenzae (WYSOCKI et al., 2009). Através de acordo de transferência de
tecnologia entre o Ministério da Saúde brasileiro e a empresa GSK, a vacina 10-valente
fará parte do Calendário Básico de Vacinação do Programa Nacional de Imunização
(PNI) a partir de março deste ano (LOBATO, 2010).
Diante dos problemas apresentados, o desenvolvimento de uma vacina anti-
pneumocócica eficaz contra uma ampla gama de sorotipos tornou-se uma das
prioridades no mundo inteiro (JEDRZEJAS, 2001). Como alternativa para a obtenção
de uma vacina que apresente maior cobertura e menor custo, nas últimas décadas, vários
grupos vêm investigando diversas proteínas associadas à virulência, como candidatas à
formulação de uma vacina protéica (PATON, 1998; JEDRZEJAS, 2001; DI GUILMI E
DESSEN, 2002; BOGAERT et al., 2004; GARCIA-SUÁREZ et al., 2006; OGUNNIYI
et al., 2007; BAROCCHI et al., 2007). Uma futura vacina protéica provavelmente será
uma combinação de proteínas recombinantes que apresentem alta imunogenicidade e
sejam protetoras, alta conservação e estejam presentes em todas as cepas de
Streptococcus pneumoniae (GARCIA-SUÁREZ et al., 2006).
4
Em face do exposto acima, um dos objetivos deste trabalho foi selecionar, clonar
e expressar, utilizando Escherichia coli e Bacillus subtilis como sistemas de expressão,
uma proteína de Streptococcus pneumoniae, diretamente associada à sua virulência,
com elevado nível de prevalência e conservação entre os vários sorotipos. Além disso,
objetivou-se otimizar a expressão da proteína recombinante empregando ferramentas de
planejamento experimental, bem como estudar a segregação plasmidial do sistema.
Deste modo, buscou-se contribuir para o estudo desta proteína recombinante como
possível antígeno para a composição de uma vacina contra Streptococcus pneumoniae,
além de auxiliar na compreensão do sistema de produção em nível industrial.
5
2 REVISÃO DA LITERATURA
Para subsidiar a discussão sobre a seleção, clonagem e expressão da proteína,
bem como sobre a otimização da expressão e os estudos do comportamento do sistema,
este capítulo apresentará uma revisão abordando os fatores de virulência de
S. pneumoniae e os sistemas de expressão utilizados neste trabalho.
2.1 Fatores de virulência
Nesta seção serão apresentados alguns dos fatores de virulência de
S. pneumoniae, em especial as proteínas ClpP protease, IgA1 protease e Hialuronato
liase (Hyl). São descritos como fatores de virulência componentes celulares que atuam
na invasão, aderência e colonização ou que são capazes de produzir uma resposta
inflamatória (SALYERS E WHITT apud SILVA, 2005, p.26).
O principal fator de virulência de S. pneumoniae é a cápsula polissacarídica,
sendo que cepas que não possuem a cápsula têm sua patogenicidade diminuída
drasticamente quando comparadas com cepas encapsuladas. Além da cápsula
polissacarídica, algumas proteínas têm sido sugeridas como fatores de virulência do
microrganismo. Sabe-se ainda que os fatores de virulência que seriam os melhores
antígenos para composição de uma vacina são aqueles que, quando retirados de
S. pneumoniae (cepas mutantes), fazem com que sua virulência seja atenuada
(JEDRZEJAS, 2001).
2.1.1 Cápsula polissacarídica
A camada mais externa de S. pneumoniae é formada pela cápsula
polissacarídica, a qual possui em torno de 200 a 400 nm de espessura (KADIOGLU et
al., 2008). A cápsula é importantíssima para a virulência do microrganismo, sendo
considerado seu principal fator de virulência (KADIOGLU et al., 2008, GARCIA-
SUÁREZ et al., 2006, BOGAERT et al., 2004).
6
Durante a colonização das vias aéreas superiores, a cápsula evita o
aprisionamento no muco nasal, permitindo o acesso do microrganismo às superfícies
epiteliais (KADIOGLU et al., 2008). A cápsula polissacarídica é fortemente anti-
fagocitária, formando uma espécie de escudo, evitando a fagocitose por macrófagos
(KADIOGLU et al., 2008, BOGAERT et al., 2004). Além disso, ela é capaz de
proporcionar resistência à autólise espontânea ou induzida por antibióticos,
contribuindo assim para a tolerância das cepas aos antibióticos. A capacidade infecciosa
de S. pneumoniae difere entre os diferentes sorotipos capsulares, os quais possuem
diferentes composições de polissacarídeos capsulares (KADIOGLU et al., 2008).
2.1.2 Proteínas
Algumas proteínas ou enzimas, que são de alguma forma expostas na superfície
do microrganismo, podem contribuir para a patogenicidade e estar envolvidas no
processo de infecção da doença (JEDRZEJAS, 2001; BOGAERT et al., 2004). Muitas
vezes, estas proteínas estão envolvidas diretamente nas interações com o tecido do
hospedeiro ou nos mecanismos para encobrir a superfície bacteriana do sistema de
defesa do hospedeiro (JEDRZEJAS, 2001). No caso de S. pneumoniae, estima-se que
este possua mais de 100 proteínas de superfície, sendo que muitas destas têm algum tipo
de função que contribui para a patogenicidade do microrganismo (BAROCCHI et al.,
2007).
Nos últimos anos, estudos têm sugerido diversas proteínas associadas à
virulência como candidatos a antígenos para formulação de uma vacina protéica
(PATON, 1998; JEDRZEJAS, 2001; DI GUILMI E DESSEN, 2002; BOGAERT et al.,
2004; GARCIA-SUÁREZ et al., 2006; OGUNNIYI et al., 2007; BAROCCHI et al.,
2007), sendo provável que uma futura vacina seja uma combinação de proteínas
recombinantes que apresentem alta imunogenicidade e sejam prevalentes em todas as
cepas de S. pneumoniae (GARCIA-SUÁREZ et al., 2006). Algumas destas proteínas
são pneumolisina, neuromidases, autolisinas, proteínas de superfície ligantes à colina
(como a PspA), lipoproteínas (como a PsaA), hialuronidases, entre outras.
7
A pneumolisina, pertencente ao grupo conhecido como citolisinas colesterol-
dependentes, é uma enzima citoplasmática que é liberada devido à ação de outra enzima
de S. pneumoniae, a autolisina. A pneumolisina inibe o movimento ciliar nos brônquios
e desorganiza a monocamada epitelial bronquial, dificultando a retirada de muco e
facilitando o espalhamento da infecção (JEDRZEJAS, 2001; BOGAERT et al., 2004).
Além disso, ela também inibe a função fagocítica sendo, portanto, importante na
patogênese da doença (BOGAERT et al., 2004). A pneumolisina é uma proteína
altamente conservada e é um antígeno capaz de estimular a proteção imunológica
(GARCIA-SUÁREZ et al., 2006).
Outro fator de virulência de S. pneumoniae é a proteína Neuromidase,
amplamente presente nas cepas do microrganismo, que se apresenta pelo menos em
duas formas, NanA e NanB. Estas proteínas mudam o padrão de glicosilação da célula
do hospedeiro, deixando as superfícies da célula mais expostas (JEDRZEJAS, 2001), e
diminuem a viscosidade das superfícies mucosas, facilitando a adesão (BOGAERT et
al., 2004).
Outra proteína estudada como fator de virulência de S. pneumoniae é a PspA
(Pneumococcal surface protein A), pertencente a um grupo de proteínas de superfície
ligantes à colina (JEDRZEJAS, 2001; BOGAERT et al., 2004). Ela situa-se ancorada na
parede celular de S. pneumoniae, sendo que os domínios ligadores de colina são os
responsáveis pela ligação da proteína na superfície da bactéria. A PspA é amplamente
presente nas cepas de S. pneumoniae (JEDRZEJAS, 2001), no entanto, apresenta um
elevado polimorfismo devido à seleção imunológica, já que sua localização é de fácil
acesso para os anticorpos (GARCIA-SUÁREZ et al., 2006). Esta proteína tem a
capacidade de reduzir os níveis de fagocitose do microrganismo (JEDRZEJAS, 2001) e
tem sido uma das proteínas mais estudas como antígeno para composição de uma vacina
(BOGAERT et al., 2004), demonstrando bons resultados em modelo animal
(JEDRZEJAS, 2001; BOGAERT et al., 2004; GARCIA-SUÁREZ et al., 2006).
As autolisinas são capazes de degradar peptideoglicanos, ou seja, estas enzimas
degradam a parede celular. Um exemplo destas autolisinas é a enzima conhecida como
8
LytA amidase (N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase), também pertencente ao grupo de
proteínas de superfície ligantes à colina, que está envolvida na patogenicidade do
microrganismo e já mostrou bons resultados quando utilizada como antígeno em
modelo animal (JEDRZEJAS, 2001). No entanto, o papel exato das autolisinas na
patogênese ainda precisa ser melhor estudado assim como as propriedades de proteção
desta proteína (BOGAERT et al., 2004).
Outra proteína de superfície também pertencente ao grupo de proteínas de
superfície ligantes à colina é a CbpA (Choline binding protein A). Ela é exposta na
superfície de S. pneumoniae e está envolvida na aderência e colonização dos tecidos do
hospedeiro (JEDRZEJAS, 2001).
A PsaA (pneumococcal surface adhesin A), membro da família das chamadas
lipoproteínas ligantes de metal, é outra proteína relacionada à virulência de
S. pneumoniae e importante candidata a uma vacina (BOGAERT et al., 2004;
BAROCCHI et al., 2007). Esta proteína faz parte de um sistema de transporte de
manganês e zinco para o citoplasma da bactéria e está ancorada na membrana celular
(JEDRZEJAS, 2001).
Outros fatores de virulência são as proteínas pneumocócicas homólogas de
superfície celular denominadas Pht (pneumococcal histidine triad) (BOGAERT et al.,
2004; BAROCCHI et al., 2007), as quais são altamente conservadas, implicando em um
potencial de ampla cobertura para uma vacina (BOGAERT et al., 2004).
A Hialuronato liase (Hyl), outra proteína investigada como fator de virulência,
pertencente ao grupo das hialuronidases, hidrolisa ácido hialurônico, o qual é um
importante componente de tecidos conectivos (JEDRZEJAS, 2001). Recentemente,
novas proteínas têm sido descritas, como as proteínas de pili que contribuem para a
aderência, virulência e induzem resposta inflamatória (BAROCCHI et al., 2006), a
proteína de choque térmico ClpP, que modula a expressão dos genes de virulência
(KWON et al., 2004), e a proteína Imunoglobulina A1 protease (IgA1 protease), que
desempenha um importante papel na aderência e na resistência do patógeno à resposta
imune do hospedeiro (ROMANELLO et al., 2006).
9
2.1.2.1 ClpP
A ClpP é uma serino-protease (GRIBUN et al., 2005) pertencente ao grupo
conhecido como proteínas de choque térmico (HSPs) (KWON et al., 2004). Esta
proteína é altamente conservada tanto em procariotos quanto em eucariotos (CAO et al.,
2007), sendo que, entre os vários sorotipos de S. pneumoniae, sua seqüência é muito
conservada (CAO et al., 2009).
Esta proteína de choque térmico forma um complexo com proteínas ATP-
dependentes, como a ClpA e ClpX, sendo que o papel funcional deste complexo é a
regulação de proteínas através de proteólise, atuando como uma espécie de controle de
qualidade de proteínas (KIM E KIM, 2008). As proteínas ClpA e ClpX são responsáveis
por desdobrar e conduzir as proteínas até o sítio ativo da ClpP, onde serão degradadas
(GRIBUN et al., 2005; KIM E KIM, 2008). Além disso, a ClpP por si so é capaz de
degradar apenas peptídeos de 6 aminoácidos, sendo que grandes polipeptídeos só
podem ser degradados quando esta proteína está complexada com ClpX ou ClpA
(GRIBUN et al., 2005).
A ClpP é composta por dois anéis heptaméricos, onde cada anel heptamérico é
formado por sete unidades principais da ClpP (monômero), sendo cada monômero com
aproximadamente 21kDa. O monômero de ClpP, mostrado na figura 2.1, pode ser
dividido em duas principais regiões, uma região em alça que é responsável pelas
interações entre os anéis e um domínio principal (head domain) (GRIBUN et al., 2005).
Figura 2.1 Representação do monômero de ClpP de S. penumoniae. Adaptado de GRIBUN et al. (2005)
10
A região em alça de um anel heptamérico se une à região em alça do outro anel,
formando a estrutura tetradecamérica da ClpP, mostrada na figura 2.2. Na região N-
terminal de cada monômero, a qual possui uma seqüência altamente conservada nos
diversos reinos da vida, a proteína apresenta um gancho, que é essencial para a
formação do complexo ClpAP ou ClpXP. Entre as regiões em alça e o domínio
principal se localiza o sítio catalítico da ClpP, a tríade catalítica Ser
111
, His
136
e Asp
185
,
característica de serino-proteases. A figura 2.3 mostra a região da tríade catalítica de
proteínas ClpP de algumas bactérias, inclusive de S. pneumoniae (GRIBUN et al.,
2005).
Figura 2.2 (A) Estrutura da proteína ClpP de S. pneumoniae depositada no PDB (Protein Data Bank) sob
o número de identificação 1Y7O (GRIBUN et al., 2005). (B) Representação esquemática da estrutura da
molécula tetradecamérica de ClpP de Helicobacter pilory, a qual apresenta seqüências e estrutura
razoavelmente bem conservadas. Composição da molécula semelhante à de ClpP de S. pneumoniae (KIM
E KIM, 2008)
Figura 2.3 Desenho esquemático da região próxima ao sítio catalítico da proteína ClpP de seis diferentes
microrganismos. Os desenhos em verde e lilás representam duas cepas de H. pilory, em marrom E. coli,
em azul S. pneumoniae, em laranja P.falciparum e em amarelo M. tuberculosis (KIM E KIM, 2008).
11
Sabe-se que as proteínas de choque térmico, como a ClpP, protegem a bactéria
contra efeitos adversos, aumentando seus níveis de sobrevivência. Quando o
microrganismo passa para a corrente sanguínea do hospedeiro, ocorrem mudanças
morfológicas, na expressão de genes, e, além disso, ocorre um estresse térmico, pois na
corrente sanguínea a temperatura é maior, sendo acionado um aumento na síntese das
proteínas de choque térmico. Cepas mutantes na proteína ClpP mostram-se sensíveis a
altas temperaturas, corroborando a ideia de que esta proteína protege a bactéria de
situações adversas. A ClpP se localiza no citoplasma, no entanto, em virtude do choque
térmico, esta é direcionada para a parede celular (KWON et al., 2004). Em seus estudos,
CAO et al. (2008) confirmaram a localização da ClpP na superfície.
A ClpP desempenha alguns papéis na virulência de S. pneumoniae. Um deles é a
modulação da expressão de genes de virulência, assim como ocorre com outras
proteínas de choque térmico. Sugere-se também que a ClpP seja requerida para a
sobrevivência intracelular e aumente a estabilidade de mRNA a altas temperaturas
(KWON et al., 2004). Cepas mutantes nesta proteína, quando comparadas a cepas
selvagens, mostraram-se menos virulentas, o que reforça a ideia de que a ClpP seria
uma excelente candidata a antígeno para a composição de uma vacina (KWON et al.,
2004).
Em vários trabalhos, a ClpP protease tem sido clonada e expressa, e a sua
imunogenicidade tem sido testada em modelo animal. KWON et al. (2004)
demonstraram que ratos imunizados com ClpP produzem uma forte e específica
resposta de anticorpos ao antígeno. CAO et al. (2007) também demonstraram que a
ClpP protease, expressa em E. coli, conferiu proteção em modelo animal contra
infecções pneumocócicas, sendo que, quando misturada a outras duas proteínas, PspA e
PspC, produziu níveis ainda maiores de proteção. Além destes estudos, CAO et al.
(2009) demonstraram a capacidade da proteína ClpP de proteger sozinha contra
infecções invasivas de S. pneumoniae pertencentes a diversos sorotipos.
12
2.1.2.2 IgA1 protease
A IgA1 protease é uma enzima que cliva ligações peptídicas específicas da
imunoglobulina A, subclasse 1, conhecida como IgA1. Esta protease é um importante
fator de virulência que está diretamente ligado à colonização e infecção das mucosas
(MISTRY E STOCKLEY, 2006), sendo de grande importância para a resistência de
S. pneumoniae à resposta imunológica do hospedeiro. Além disso, a IgA1 protease é
expressa em todas as cepas de S. pneumoniae (PAOLIS et al., 2007).
A IgA1 protease de S. pneumoniae é uma grande proteína de superfície
(ROMANELLO et al., 2006), identificada como uma Zn-metaloprotease
(CHIAVOLINI et al., 2003) pois apresenta a seqüência HEMMH a qual é o sítio ativo
da enzima. Esta protease possui 1964 aminoácidos, podendo variar de 130 a 200 kDa,
mantendo a atividade proteolítica, devido a modificações pós-traducionais na parte N-
terminal (ROMANELLO et al., 2006). Esta parte N-terminal da cadeia apresenta três
regiões hidrofóbicas. A primeira região é uma seqüência que se apresenta em
procariotos como um peptídeo sinal, a segunda junto com a seqüência LPNTGS
funciona como ponto de fixação da protease na parede celular (POULSEN et al., 1998;
ROMANELLO et al., 2006). A cadeia apresenta ainda um domínio fibrilar de 200
aminoácidos, uma região com segmentos envolvidos na ligação de componentes da
matriz extracelular e ainda domínio central e C-terminal, onde se localiza o sítio ativo
da enzima (PAOLIS et al., 2007). Uma representação esquemática da IgA1 protease é
mostrada na figura 2.4. Sabe-se que a IgA1 protease é capaz de se transportar sozinha
para fora da célula pois ela possui em sua cadeia todas as informações necessárias para
este transporte (MISTRY E STOCKLEY, 2006).
13
Figura 2.4 Representação esquemática de IgA1 protease típica de Streptococcus. Adaptado de PAOLIS
et al. (2007)
O substrato da enzima IgA1 protease, a IgA1 humana, está presente nas
mucosas, e, no soro, é o principal isotipo de IgA (PAOLIS et al., 2007). A IgA1
protease é altamente heterogênea entre as cepas de um microrganismo e acredita-se que
isto seja um mecanismo de proteção do microrganismo contra as defesas do hospedeiro.
Apesar desta alta heterogenicidade, esta proteína é capaz de provocar uma forte resposta
imunológica in vivo (MISTRY E STOCKLEY, 2006).
Em seus estudos, ROMANELLO et al. (2006) clonaram e expressaram três
diferentes fragmentos de IgA1 protease. Por combinação destes fragmentos, obtiveram a
proteína praticamente inteira, com exceção dos primeiros aminoácidos, os quais
compreendem a região do peptídeo sinal e a parte N-terminal correspondente ao
domínio de fixação da proteína. Apenas o fragmento do final da seqüência,
correspondendo aos aminoácidos 1032 a 1964, não teve atividade enzimática. Além
disso, os três fragmentos se mostraram imunogênicos quando submetidos a soros de
pacientes infectados com S. pneumoniae, indicando que a IgA1 protease pode ser um
antígeno na formulação de uma vacina contra S. pneumoniae.
2.1.2.3 Hialuronato liase (Hyl)
A hialuronidase é uma enzima capaz de degradar ácido hialurônico, o qual é um
importante componente e o mais abundante glicosaminoglicano da matriz extracelular
de tecidos conectivos (AKHTAR E BHAKUNI, 2004). O ácido hialurônico é
14
encontrado nos tecidos e fluidos de seres humanos e animais superiores e, além da
função estrutural, também está presente em processos como fertilização,
desenvolvimento embrionário, diferenciação celular, cicatrização e metástase de células
tumorais (JEDRZEJAS, 2001; AKHTAR E BHAKUNI, 2004).
A hialuronidase encontrada em bactérias é a hialuronato liase (Hyl), que catalisa
e quebra as ligações glicosídicas do ácido hialurônico pelo processo de β-eliminação,
resultando como produto final principalmente dissacarídeos, como mostrado na figura
2.5. Além da Hyl existem pelo menos mais dois tipos de hialuronidases que degradam o
ácido hialurônico por mecanismos diferentes (JEDRZEJAS, 2001; AKHTAR E
BHAKUNI, 2004).
Figura 2.5 Degradação do ácido hialurônico e formação da unidade dissacarídica (principal produto da
ação da Hyl bacteriana sobre o ácido hialurônico). Adaptado de AKHTAR E BHAKUNI (2004).
A estrutura da Hyl é dividida em dois domínios aproximadamente do mesmo
tamanho, o domínio α-hélice e o domínio de folhas β-pregueadas (JEDRZEJAS, 2001;
AKHTAR E BHAKUNI, 2004). O domínio α-hélice é responsável pela ligação e
degradação do substrato, enquanto o domínio de folhas β-pregueadas é provavelmente
responsável pela manutenção da fenda catalítica e por modular o acesso a mesma
(JEDRZEJAS, 2001). A estrutura da Hyl pode ser visualizada na figura 2.6.
15
Figura 2.6 Estrutura da Hyl de Streptococcus pneumoniae complexada com dissacarídeo de ácido
hialurônico, depositada no PDB (Protein Data Bank) sob o número de identificação 1C82 (PONNURAJ
E JEDRZEJAS, 2000).
Hialuronidase é uma das principais proteínas de superfície de S. pneumoniae que
pode contribuir para sua virulência. Sabe-se que pelo menos uma parte da hialuronidase
é liberada nos tecidos do hospedeiro com o objetivo de facilitar a invasão, aumentando a
permeabilidade dos tecidos através da degradação de componentes da matriz
extracelular, ou seja, esta enzima está diretamente envolvida nos mecanismos de
invasão de S. pneumoniae (JEDRZEJAS, 2001; AKHTAR E BHAKUNI, 2004). Como
a hialuronidase está diretamente envolvida nos mecanismos de invasão do
microrganismo, esta representa outra alternativa para composição de uma vacina
(JEDRZEJAS, 2001). A hialuronidase já foi clonada e expressa por BERRY et al.
(1994), os quais obtiveram a proteína expressa com aproximadamente 89kDa, e com
atividade enzimática. No entanto, experimentos com cepas mutantes nesta proteína
mostraram que estes mutantes não têm sua virulência atenuada, o que indica que a
hialuronidase pode ser utilizada em uma vacina contra S. pneumoniae apenas quando
estiver combinada com outros fatores de virulência (JEDRZEJAS, 2001). Outro ponto
que reforça o uso desta enzima na composição de uma vacina é o fato da maioria das
cepas de S. pneumoniae produzirem a Hialuronato liase. (AKHTAR e BHAKUNI,
2004).
16
2.2 Sistemas de expressão de proteínas recombinantes
Para atender a demanda industrial, proteínas de interesse podem ser produzidas
em altos níveis através da utilização da engenharia genética (DEMAIN E VAISHNAV,
2009). A expressão de proteínas recombinantes pode ser realizada em bactérias, em
leveduras ou em células de insetos, plantas ou mamíferos. Para a expressão da proteína
de forma bem sucedida, a escolha do sistema de expressão é de fundamental
importância e deve levar em consideração a estrutura da proteína, sua funcionalidade e
complexidade, e também a produtividade desejada (LARENTIS et al., 2006; DEMAIN
E VAISHNAV, 2009). Nesta seção serão apresentados alguns aspectos importantes na
clonagem e expressão de proteínas recombinantes e, em especial, das duas bactérias
utilizadas como sistemas de expressão neste trabalho, Escherichia coli e Bacillus
subtilis.
Para a produção da proteína heteróloga de interesse, o gene da proteína a ser
expresso deve primeiramente ser inserido em um vetor de expressão. Os vetores de
expressão são capazes de se auto-replicar e regular a expressão dos genes neles
codificados. As estruturas que formam um vetor são: promotores, origens de replicação,
sítios iniciadores e terminadores tanto da transcrição como da tradução, marcadores
seletivos, sítios de múltipla clonagem ou de ligação do gene isolado. Para a clonagem
de genes são utilizados três tipos de vetores: plasmídeos, bacteriófagos e cosmídeos
(LARENTIS et al., 2006). Como neste trabalho foram utilizados plasmídeos como
vetores de expressão, estes serão o foco de uma breve revisão.
Com capacidade de replicação autônoma, plasmídeo é um DNA circular não
cromossomal de fita dupla. Eles podem ser naturalmente encontrados em bactérias e, no
processo de divisão celular, são replicados e passados para as novas células geradas. Já
os promotores presentes nos plasmídeos regulam a expressão do gene. Os plasmídeos
são muito utilizados para clonagem de genes com até 5 kb (LARENTIS et al., 2006).
Os plasmídeos podem ser classificados de acordo com seu número de cópias,
que é o número de cópias do plasmídeo por célula, sendo que esta classificação pode
variar muito na literatura. De acordo com FRIEHS (2004), classificam-se como
17
plasmídeos com baixo número de cópias aqueles que apresentam 1 a 10 plasmídeos por
célula, plasmídeos com médio número de cópias apresentam 10 a 20 plasmídeos por
célula e plasmídeos de alta cópia podem chegar a aproximadamente 700 cópias por
célula. Já SCHUMANN E FERREIRA (2004) mostram uma classificação um pouco
diferente, onde plasmídeos de muito alto número de cópias estão presentes em mais de
100 plasmídeos por célula, plasmídeos de alto número de cópias apresentam 15 a 60
plasmídeos por célula, plasmídeos de médio número de cópias apresentam cerca de 10
plasmídeos por célula e plasmídeos de baixo número de cópias que apresentam de 1 a 2
plasmídeos por célula.
Através de marcadores seletivos inseridos no vetor é realizada a seleção das
cepas contendo o vetor de interesse. Entende-se por marcadores seletivos genes que
conferem alguma característica específica que diferencia as células transformadas das
demais. Normalmente, os plasmídeos apresentam um gene que confere resistência a
algum antibiótico, como forma de selecionar as células com o plasmídeo das demais
células que não o possuem (pressão seletiva) (LARENTIS et al., 2006).
A produção de proteína recombinante não é um processo natural da célula
hospedeira, sendo assim, muitas vezes causa problemas à célula, dificultando a
produção da proteína heteróloga. Desta forma, a produção da proteína recombinante
envolve vários fatores, como características da proteína a ser produzida, vetores e
hospedeiros utilizados, escolha do processo utilizado e purificação da proteína
produzida, sendo que todos estes fatores precisam ser profundamente conhecidos. Ainda
é necessário considerar o compartimento celular em que a proteína será expressa, assim
como as estratégias utilizadas na purificação, já que a proteína pode ser ligada, durante a
clonagem, a um polipeptídeo de fusão para facilitar a purificação (LARENTIS et al.,
2006). O nível de expressão da proteína pode ser influenciado por alguns fatores como
as características estruturais do gene a ser expresso, a estabilidade e eficiência do
mRNA, o enovelamento correto e eficiente da proteína, a toxicidade da proteína para a
célula hospedeira, a degradação da proteína por proteases e também os códons
utilizados na seqüência do gene (SCHUMANN E FERREIRA, 2004).
18
Para a expressão, a célula é cultivada sob pressão seletiva, na maioria dos casos
através da adição de antibiótico no meio de cultivo e, desta forma, apenas as células que
possuem o plasmídeo com o gene de resistência ao antibiótico poderão crescer. Um dos
problemas do uso de antibiótico é a contaminação da biomassa e do produto, o que não
seria aceitável para proteínas utilizadas para fins médicos (BANEYX, 1999; FRIEHS,
2004). Além disso, este método pode se tornar inviável em escala industrial, pois os
custos da adição de antibióticos poderiam ser enormes e, para produtos com fins
alimentícios e farmacêuticos, os antibióticos devem ser removidos no processo de
purificação (FRIEHS, 2004).
2.2.1 Escherichia coli como sistema de expressão de proteínas recombinantes
A bactéria gram-negativa E. coli é um dos mais utilizados sistemas de expressão
de proteínas recombinantes, inclusive em escala comercial (BANEYX, 1999; TERPE,
2006), isto porque, além de oferecer várias vantagens, como a capacidade de crescer
rapidamente em altas concentrações celulares e em substratos baratos, possui genética
bem caracterizada e existem vários vetores e cepas mutantes disponíveis
comercialmente (BANEYX, 1999; PETI E PAGE, 2007). Além disso, o genoma de
E. coli pode ser modificado com facilidade, as células de E. coli têm capacidade de
acumular mais de 80% da sua massa seca em proteína recombinante e ainda sobrevivem
em uma variedade de condições de cultivo. Esta bactéria pode produzir proteínas
recombinantes funcionais não-glicosiladas, sendo que, normalmente, estas proteínas,
quando possuem fins terapêuticos, são produzidas em E. coli ou em leveduras
(DEMAIN E VAISHNAV, 2009).
Uma das desvantagens de utilizar E. coli como sistema de expressão é que em
alguns casos esta cepa apresenta dificuldade de produzir proteínas heterólogas
funcionais, biologicamente ativas e solúveis. A produção de proteínas complexas, com
pontes de enxofre, múltiplas subunidades ou modificações pós-traducionais é
dificultada neste microrganismo pela falta da maquinaria necessária para fazer estes
tipos de modificações (BANEYX, 1999). Altas densidades celulares podem se tornar
tóxicas devido à formação de acetato, o que pode ser contornado através de controles do
19
processo, como o controle de oxigênio e alimentação exponencial de glicose (DEMAIN
E VAISHNAV, 2009).
A superprodução de proteínas heterólogas no citoplasma muitas vezes ocasiona
a perda da conformação e tendência à agregação, formando agregados insolúveis,
conhecidos como corpos de inclusão (BANEYX, 1999; SCHUMANN E FERREIRA,
2004; TERPE, 2006). Este fenômeno provavelmente ocorre, pois a capacidade do
sistema de chaperonas - as quais mediam o correto enovelamento, a secreção das
proteínas e o controle das proteínas com má formação através de ação proteolítica - é
extrapolada durante a produção em altas densidades da proteína heteróloga (KURLAND
E GALLANT, 1996; MERGULHÃO et al., 2005). A formação de corpos de inclusão é
vista por muitos como um problema, no entanto, há também aqueles que afirmam que a
formação destes corpos de inclusão pode simplificar a purificação. Entretanto, após a
purificação é necessário o re-enovelamento da proteína in vitro, o que pode se tornar um
problema na produção de grandes quantidades da proteína na sua forma biologicamente
ativa (BANEYX, 1999; SWARTZ, 2001). Além disso, estes agregados insolúveis não
são compostos apenas por cadeias da proteína recombinante, eles possuem em sua
composição diversas impurezas (SCHUMANN E FERREIRA, 2004). Algumas
alternativas para reduzir a formação destes corpos de inclusão podem ser adotadas,
como reduzir a temperatura de expressão (reduzindo a taxa de expressão), co-expressar
as chaperonas, mudar algumas condições de cultivo, como o pH (TERPE, 2006).
Quando a proteína expressa em E. coli é destinada ao uso na saúde humana, o
acúmulo de lipopolissacarídeos (LPS) por parte deste microrganismo pode se tornar
uma dificuldade, porque os LPSs atuam como endotoxinas pirogênicas para humanos e
outros mamíferos. Se as proteínas têm finalidade de uso humano, elas devem passar por
uma etapa de purificação capaz de reter estas toxinas (TERPE, 2006).
Normalmente as proteínas são produzidas no citoplasma de E. coli, no entanto
elas podem ser exportadas para o periplasma, para facilitar a purificação, através da
fusão com um peptídeo que sinalize a translocação para o periplasma. Todavia, a
produção no citoplasma normalmente apresenta rendimentos maiores (DEMAIN E
20
VAISHNAV, 2009), e o sinal de transporte da proteína para o periplasma nem sempre
funciona (LARENTIS et al., 2006).
Para superar as limitações apresentadas, muitas pesquisas têm sido feitas para
melhorar o sistema de expressão em E. coli. O plasmídeo está fortemente associado à
eficiência da produção da proteína heteróloga dependendo do promotor utilizado e sua
regulação, das regiões de terminação e iniciação, da eficiência da seqüência de ligação
ao ribossomo, da origem de replicação e conseqüentemente do número de cópias do
plasmídeo, dos marcadores de resistência utilizados, dos códons utilizados, da
estabilidade do mRNA, da estabilidade da proteína e da cepa utilizada como hospedeira
(MAKRIDES, 1996; SØRENSEN E MORTENSEN, 2005; JANA E DEB, 2005).
Promotores com diversas características têm sido desenvolvidos para melhorar a
eficiência do sistema utilizando E. coli. Um bom promotor deve ser forte, ser fortemente
regulado, a indução deve ser simples, de baixo custo e independente dos componentes
normalmente utilizados no meio de cultura (TERPE, 2006). Muitas vezes são utilizados
promotores derivados do sistema lac de regulação da bactéria (BANEYX, 1999), muitos
promotores foram construídos empregando o elemento regulador do sistema lac
(TERPE, 2006). O sistema lac é formado por uma região composta por
promotor/operador que antecede os genes a serem transcritos. Na ausência de um
indutor, o repressor do sistema, codificado pelo gene lacI, liga-se ao operador,
impedindo a transcrição (SCHUMANN E FERREIRA, 2004). Para alcançar altas
concentrações de proteína, vários plasmídeos utilizam o sistema de promotor do
bacteriófago T7 RNA polimerase (BANEYX, 1999). A enzima T7 RNA polimerase é
capaz de estender cadeias cinco vezes mais rápido que a mesma enzima de E. coli. O
gene que codifica a T7 RNA polimerase foi inserido no cromossomo da cepa BL21
(DE3) sob controle de um promotor derivado do sistema lac, permitindo forte indução
da produção desta enzima pela adição de IPTG, mesmo na presença de glicose (TERPE,
2006).
Além de explorar as características genéticas das cepas de E. coli e dos
plasmídeos utilizados, devem também ser utilizadas outras estratégias para maximizar o
rendimento da proteína de interesse. Uma destas estratégias seria aumentar a densidade
celular no cultivo, manipulando as variáveis: temperatura, composição do meio de
21
cultivo, modo de operação do bioreator e aeração (HANNING E MAKRIDES, 1998;
BANEYX, 1999; JANA E DEB, 2005; SØRENSEN E MORTENSEN, 2005; PETI E
PAGE, 2007).
2.2.2 Bacillus subtilis como sistema de expressão de proteínas recombinantes
A produção de proteínas heterólogas em outros hospedeiros, que não E. coli, tem
se tornado cada vez mais freqüente, provavelmente devido ao aumento do conhecimento
em genômica, que entre outras vantagens, permite comparar os códons utilizados pelo
hospedeiro com os do organismo produtor original da proteína (TERPE, 2006).
O gênero Bacillus é o mais utilizado como sistema de expressão bacteriano,
depois de E. coli, sendo utilizado para a expressão de muitas proteínas de importância
farmacêutica. Quando comparadas a E. coli, as cepas de Bacillus apresentam a
vantagem de não possuírem lipopolissacarídeos (LPS) na sua membrana externa. Outro
fator importante é o fato de terem naturalmente a capacidade de secretar as proteínas
para o meio de cultivo em uma única operação (TERPE, 2006).
O microrganismo gram-positivo B. subtilis possui, como uma de suas maiores
vantagens, a capacidade de secretar as proteínas diretamente no meio de cultivo (LI et
al., 2004; FERREIRA et al., 2005; TERPE, 2006; FU et al., 2007). B. subtilis é capaz
de crescer rápido em substratos simples e baratos (FERREIRA et al., 2005). O genoma
de B. subtilis já foi seqüenciado e esta cepa não produz exotoxinas ou endotoxinas
prejudiciais. A capacidade de secretar as proteínas para o meio de cultivo e não formar
corpos de inclusão facilita a purificação, elimina a necessidade de romper a célula para
extrair a proteína, aumentando os rendimentos da produção (DEMAIN E VAISHNAV,
2009). Esta bactéria é de fácil manipulação e reconhecida como GRAS (generally
recognized as safe) (LI et al., 2004; FERREIRA et al., 2005; FU et al., 2007; DEMAIN
E VAISHNAV, 2009). Além disso, como este microrganismo é utilizado
industrialmente para a produção de muitas enzimas, a sua tecnologia de cultivo é bem
conhecida e várias ferramentas genéticas têm sido desenvolvidas para o uso na produção
de proteínas recombinantes (LI et al., 2004). Sabe-se também que o sistema de
expressão utilizando B. subtilis tem sido empregado para a produção de proteínas
22
heterólogas com atividades farmacológicas e imunológicas, inclusive para a expressão
de antígenos com possível aplicação em vacina humana (FERREIRA et al., 2005).
O uso de B. subtilis como sistema de expressão normalmente pode apresentar
dois inconvenientes que limitam a sua aplicação: a instabilidade dos plasmídeos, tanto
estrutural quanto segregacionista, e o baixo nível de proteína produzida (LI et al., 2004;
FERREIRA et al., 2005). Outras limitações apresentadas na expressão em B. subtilis
são o correto enovelamento da proteína, os elevados níveis de proteases naturalmente
secretadas para o meio, o processamento do peptídeo sinal e secreção da proteína. O
correto enovelamento pode se tornar um problema na expressão de altos níveis de
proteína. B. subtilis apresenta chaperonas intracelulares e extracitoplasmáticos. As
chaperonas intracelulares estão envolvidos no enovelamento, minimizando a agregação
e mantendo a conformação adequada das proteínas para a secreção. Devido à atividade
limitada das chaperonas intracelulares, a proteína pode formar agregados insolúveis no
citoplasma. A proteína PrsA é uma chaperona extracitoplasmática responsável pelo
correto enovelamento da proteína madura em uma conformação ativa e estável. Para
aumentar a produção de proteína heteróloga, um nível celular alto destas chaperonas
pode ajudar (LI et al., 2004).
Uma das principais desvantagens deste microrganismo são os níveis elevados de
proteases também secretadas para o meio, no entanto, este tem sido o foco de muitos
desenvolvimentos nos últimos anos (LI et al., 2004; TERPE, 2006). Atualmente já
existem cepas deficientes em 6 ou 8 proteases. A cepa WB600 é deficiente em seis das
principais proteases extracelulares de B. subtilis (protease neutra A, subtilisina, protease
extracelular, metaloprotease, bacilopeptidase F e protease neutra B) e apresenta um
nível muito baixo de atividade de proteases quando comparada à cepa selvagem (WU et
al., 1991). Já a cepa WB800 é deficiente em 8 proteases extracelulares (TERPE, 2006).
O processo de transporte das proteínas através da membrana plasmática ocorre
em três estágios: reconhecimento, deslocamento através da membrana e liberação no
meio de cultivo. O reconhecimento é feito no citoplasma, através de reconhecimento do
peptídeo sinal. A proteína é transportada através da membrana por um canal formado
por um transportador específico, a translocase. Então o peptídeo sinal é removido pela
23
peptidase sinal e a proteína madura é liberada do transportador. As peptidases sinal
podem se tornar um fator limitante no processo de produção da proteína (LI et al.,
2004), assim como a estrutura do peptídeo sinal. Uma das possibilidades para melhorar
a quantidade de proteína secretada seria a construção de vetores de expressão nos quais
fossem incluídas seqüências sinalizadoras. Sabe-se também que o aparato celular para
secreção de proteínas pode ser saturado pela expressão de altos níveis de proteína,
diminuindo a produção da proteína heteróloga (FU et al., 2007).
2.2.3 Estabilidade plasmidial
Durante a produção de proteínas recombinantes uma das questões fundamentais
é a estabilidade plasmidial, principalmente durante o escalonamento do processo ou
produção industrial (GUPTA et al., 1995). A estabilidade do plasmídeo é caracterizada
em dois tipos: a estrutural e a segregacionista. A instabilidade estrutural é o resultado de
alterações estruturais no plasmídeo durante o cultivo, como alterações da seqüência de
nucleotídeos de um plasmídeo, inserções, deleções ou rearranjos no DNA plasmidial. Já
a segregação plasmidial é a perda do plasmídeo durante a divisão celular, resultando em
uma das células filha sem o plasmídeo (GUPTA et al., 1995; FRIEHS, 2004). Na
maioria das vezes, a expressão “instabilidade plasmidial” se refere à segregação
plasmidial. A replicação correta dos plasmídeos durante a divisão celular é um
problema central em sistemas recombinantes. A taxa de crescimento específico de
células sem plasmídeo é maior quando comparado à de células com plasmídeo, logo, se
houver algumas células sem plasmídeo no início do cultivo, estas células crescerão mais
que as células com plasmídeo e se tornarão dominantes no cultivo, levando a culturas
mistas. Desta forma, a produtividade da proteína recombinante será drasticamente
afetada (FRIEHS, 2004). Segundo FRIEHS (2004), a segregação plasmidial é tão
importante que, sem um estudo para determiná-la no processo em questão, nenhuma
conclusão real pode ser feita sobre a produtividade da proteína recombinante.
Muitos fatores podem influenciar a estabilidade plasmidial. Alguns destes
fatores são a taxa de crescimento celular, o número de cópias do plasmídeo, o tamanho
do inserto e do plasmídeo, o nível de expressão da proteína recombinante, a toxicidade
da proteína recombinante, a formulação do meio de cultivo, a concentração de oxigênio
24
dissolvido, o pH, a temperatura e o modo de operação do cultivo (GUPTA et al., 1995;
FRIEHS, 2004; LARENTIS et al., 2006; XU et al., 2006). Alguns autores afirmam que
a carga metabólica imposta à célula pela replicação do plasmídeo, transcrição do gene e
síntese da proteína recombinante é responsável pela segregação plasmidial
(CORCHERO E VILLAVERDE, 1998).
A composição do meio de cultivo pode afetar a estabilidade plasmidial através
de diferentes rotas metabólicas e sistemas regulatórios, isto porque a composição do
meio influencia as atividades metabólicas da célula (LARENTIS et al., 2006). Segundo
GUPTA et al., (1995) meios de cultura mais complexos levam a diminuição da
estabilidade plasmidial. Sabe-se também que cultivos em meios mínimos apresentam
menor segregação plasmidial que aqueles em meios com aminoácidos, além disso, a
adição de extrato de levedura diminui a estabilidade plasmidial (FRIEHS, 2004)
Influenciam também na segregação plasmidial o mecanismo de replicação
(FRIEHS, 2004; XU et al., 2006) e o tamanho do plasmídeo, sendo que plasmídeos
maiores podem apresentar maior instabilidade segregacionista (FRIEHS, 2004). O
número de cópias do plasmídeo também tem influência sobre a segregação, visto que a
estabilidade segregacionista significa que pelo menos um plasmídeo esteja presente em
cada célula depois da divisão celular, então, um alto número de cópias por célula
aumentaria as chances de pelo menos um plasmídeo estar presente na célula (FRIEHS,
2004; LARENTIS et al., 2006). No entanto, alguns autores relatam que um número
muito alto de cópias do plasmídeo pode aumentar a perda do plasmídeo (BANEYX,
1999).
Condições de cultivo, como a concentração de oxigênio dissolvido e o pH,
podem influenciar na segregação. Sabe-se que a diminuição da concentração de
oxigênio dissolvido leva a um aumento da instabilidade do plasmídeo (FRIEHS, 2004).
A disponibilidade de oxigênio pode afetar a taxa de crescimento, além de apresentar
outros efeitos complexos sobre as rotas metabólicas. A replicação e a transcrição de um
plasmídeo com múltiplas cópias requer uma grande quantidade de energia, porém, a
diminuição da concentração de oxigênio no meio diminui a geração de energia pelo
catabolismo celular e pode afetar a replicação e partição do plasmídeo. A temperatura
25
também afeta a estabilidade plasmidial, já que esta afeta a taxa de crescimento celular,
as rotas metabólicas e os sistemas regulatórios (LARENTIS et al., 2006). Além disso, a
perda do plasmídeo pode aumentar quando o cultivo de células é feito em altas
densidades ou de forma contínua (BANEYX, 1999).
A indução da expressão da proteína sempre diminui a estabilidade plasmidial,
provavelmente devido aos efeitos tóxicos da proteína para a célula (FRIEHS, 2004;
LARENTIS et al., 2006; XU et al., 2006). Quando o nível de expressão é aumentado, a
estabilidade plasmidial tende a diminuir e isto pode ser ocasionado pela repressão da
replicação (LARENTIS et al., 2006). Os dados mostrados por XU et al. (2006) indicam
que a instabilidade plasmidial é muito mais dependente da indução em si do que da
presença do antibiótico (pressão seletiva). Além disso, o modo de indução do promotor
também tem grande influência sobre a estabilidade. Por exemplo, sabe-se que a indução
com IPTG apresenta maior taxa de perda do plasmídeo que aquela feita com lactose
(FRIEHS, 2004).
2.3 Planejamento de experimentos em sistemas recombinantes
As variáveis que influenciam na expressão de proteínas recombinantes são
numerosas e interagem umas com as outras. A estratégia normalmente aplicada na área
para avaliar os fatores que influenciam o processo é variar um fator por vez mantendo
os demais constantes (SWALLEY et al., 2006). No entanto, esta estratégia pode não
ser eficiente, não permitindo avaliar as interações entre as variáveis do processo e
acarretando em um número maior de experimentos. As técnicas de planejamento de
experimentos reduzem o número de experimentos envolvidos, diminuem o tempo gasto
e o custo final do processo, melhoram a qualidade das informações obtidas, permitem
analisar os fatores simultaneamente e suas interações, avaliar os erros experimentais e
ainda otimizar mais de uma variável ao mesmo tempo (RODRIGUES E IEMMA,
2005).
O planejamento de experimentos tem sido aplicado muito recentemente na
avaliação e otimização da expressão de proteínas recombinantes em bactérias. Esta
técnica ainda não é um procedimento usual para avaliação dos fatores envolvidos no
26
processo de produção de proteína recombinantes, e seu potencial pode ser mais
explorado para a avaliação da composição dos meios de cultura (NIKEREL et al., 2005;
NIKEREL et al., 2006; REN et al., 2006; ZHANG et al., 2006) e para as variáveis
envolvidas na indução, como temperatura, tempo pós-indução, concentração celular,
concentração do indutor e cepa empregada na expressão (LEÓN et al., 2004; WANG et
al., 2005; CAO et al., 2006; SWALLEY et al., 2006; MALDONADO et al., 2007;
ISLAM et al., 2007; LO et al., 2007).
27
3 METODOLOGIA
3.1 Seleção da proteína
Neste item, além de descrever os procedimentos para a seleção da proteína, para
um melhor entendimento das análises realizadas, também serão descritos alguns termos
das ferramentas de bioinformática utilizadas neste trabalho.
Através de revisão da literatura foram pré-selecionadas 3 proteínas: ClpP, IgA1
protease e Hialuronato Liase (Hyl). Para seleção da proteína utilizada neste trabalho,
dentre estas três pré-selecionadas, foram feitas análises através de ferramentas de
bioinformática e também foram levados em consideração dados obtidos da literatura. A
seleção da proteína utilizou os seguintes critérios: conservação e prevalência entre os
sorotipos de S. pneumoniae, imunogenicidade e presença de peptídeos sinais e regiões
transmembranares – o que dificultaria a clonagem e a expressão da proteína de forma
solúvel, principalmente em E. coli.
Para avaliar a conservação e prevalência das proteínas entre as cepas de
S. pneumoniae, análises de bioinformática foram utilizadas. Primeiramente, as
seqüências de nucleotídeos e aminoácidos das proteínas, pertencentes à cepa
S. pneumoniae CGSP14, sorotipo 14, foram buscadas do GenBank, um banco de dados
onde se encontram seqüências públicas disponíveis de nucleotídeos e proteínas, sendo
que este pode ser acessado pelo sitio do NCBI (National Center for Biotechnology). As
seqüências foram então submetidas a um alinhamento com outras disponíveis no banco
de dados, através da ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), um
algoritmo para fazer alinhamentos (processo de comparar duas ou mais sequências
buscando o máximo de similaridade ou conservação entre elas) entre a sequência em
estudo e outras depositadas no banco de dados, fazendo um alinhamento local,
comparando uma base com outra base, ou um aminoácido com outro (ALTSHUL et al.,
1990). Existem vários tipos de BLAST, comparando sequências de proteínas (blastp),
seqüências de nucleotídeos (blastn), e seqüências de nucleotídeos com proteínas ou
vice-versa (blastx e tblastn). Neste estudo foram realizados alinhamentos utilizando
blastp com o objetivo de identificar outras seqüências homólogas, disponíveis nos
28
bancos de dados, das proteínas de S. pneumoniae em questão. As seqüências
encontradas foram utilizadas para a realização de um múltiplo alinhamento através do
programa CLUSTAL W (THOMPSON et al., 1994), capaz de fazer alinhamentos
globais de múltiplas seqüências. Desta forma, foi possível identificar o grau de
conservação e prevalência das proteínas nas diferentes cepas de S. pneumoniae.
Para a obtenção de dados gerais das proteínas, bem como de regiões
transmembranares, o programa CLC Workbench 4 foi utilizado. Para avaliar a presença
de regiões transmembranares é realizada uma predição de regiões hidrofóbicas na
seqüência de aminoácidos da proteína.
As possíveis seqüências sinalizadoras (peptídeos sinais) presentes na proteína
foram verificadas através do programa SignalP 3.0. Este programa permite fazer
predições de peptídeos sinais e da localização do sítio de clivagem entre a proteína e o
peptídeo sinal, de gram-negativos, gram-positivos e eucariotos, utilizando combinações
de redes neurais e de modelos escondidos de Markov (BENDTSEN et al., 2004).
Com o auxílio de dados disponíveis na literatura, as proteínas foram avaliadas
quanto à sua imunogenicidade, ou seja, a capacidade de uma substância induzir uma
resposta imunológica eficaz.
3.2 Clonagem e expressão do gene clpP de S. pneumoniae em Escherichia coli
3.2.1 Extração de DNA genômico de Streptococcus pneumoniae
O DNA genômico foi extraído da cepa Streptococcus pneumoniae 113/95,
sorotipo 14, depositada no Instituto Adolfo Lutz. Sabe-se que um dos sorotipos que
mais causa doenças pneumocócicas invasivas no mundo é o sorotipo 14 (DING et al.,
2009). A extração foi feita a partir de um cultivo de 16h a 37°C e 100rpm, em meio
TSB (Tryptic Soy Broth), com concentração de 47,24 g/L (pH 7,6), suplementado com
0,630 g/L de MgSO
4
.7 H
2
O, 0,236 g/L de Hidrocloreto de cisteína e 0,0205 g/L de
CaCl
2
. 2H
2
O. Foram pesadas 2,25 g de células úmidas deste cultivo e a elas
adicionados 40 mL de TE (Tris 10mM, EDTA 1mM, pH8,0), 20% m/v de sacarose, 200
29
mg de lisozima, sendo que a lisozima age na quebra dos carboidratos da membrana
celular. A amostra foi incubada por 1 hora a 37ºC. Depois da incubação a amostra foi
dividida em duas alíquotas de 24 mL e a cada alíquota adicionados 0,2 mg/mL de
proteinase K e 1,2 mL de SDS 20%. As amostras foram novamente incubadas a 56ºC
por 1 hora, sendo agitadas delicadamente a cada 15 minutos, evitando o rompimento do
DNA total celular. A proteinase K age na desnaturação de proteínas que se ligam ao
DNA e tem sua atividade aumentada com a adição de SDS e incubação em temperaturas
elevadas (50ºC-60ºC). Posteriormente foram adicionados 0,2 mg/mL de RNAse em
cada alíquota e então estas incubadas a 37ºC por 30 minutos. Após estes procedimentos
de lise celular, as proteínas se encontravam solúveis na fase aquosa junto com o DNA.
A partir desta etapa foram iniciadas extrações sucessivas com
fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1). Para cada 24 mL da amostra foram
adicionados 24 mL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. A mistura resultante foi
homogeneizada delicadamente, evitando o rompimento do DNA, e centrifugada a
4000rpm por 10 minutos em centrífuga Eppendorf 5810R (rotor A-4-62). A fase aquosa
superior foi retirada e utilizada para fazer nova extração, repetindo o procedimento com
fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. Após as duas extrações, clorofórmio foi adicionado
à fase aquosa superior na mesma proporção de volume e a mistura centrifugada por 10
minutos a 4000 rpm em centrífuga Eppendorf 5810R (rotor A-4-62). A fase aquosa
superior foi retirada e a ela adicionado 0,1 volumes de acetato de sódio 3M (pH5,3) e
0,7 volumes de isopropanol. O material resultante foi incubado por 16 horas a 10ºC e
posteriormente centrifugado por 20 minutos a 12000 rpm em centrífuga Eppendorf
5810R (rotor A-4-62). O sobrenadante foi retirado cuidadosamente e descartado. O
precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 70%, incubado a temperatura ambiente por 5
minutos e centrifugado por 5 minutos a 14000 rpm em centrífuga Eppendorf 5417R
(rotor F45-30-11). Após a retirada do sobrenadante, o precipitado contendo DNA foi
submetido à secagem em concentrador centrífugo a vácuo (Vacufuge
TM
Eppendorf) a
30ºC por 3 minutos. Após este procedimento foram adicionados 50 µL de TE (Tris 10
mM, EDTA 1 mM, pH8,0) à amostra e esta incubada a 37ºC por 15 minutos. Como no
início do procedimento a amostra foi dividida em duas alíquotas, foram obtidas duas
amostras de DNA extraído, denominados amostra 3 e amostra 4. Ao final, as amostras
foram estocadas a -20ºC.
30
A análise das amostras de DNA total extraído foi realizada através de
eletroforese em gel de agarose 0,8% m/v utilizando solução tampão de corrida TAE
(0,04 M de Tris-baseÁcido acético glacial e 0,01 M de EDTA). Foram utilizadas na
eletroforese as amostras da extração de DNA total, concentradas e diluídas 10 e 100
vezes. As amostras de DNA extraído e diluído 100 vezes foram quantificadas no
equipamento Qubit Fluorometer (Invitrogen). Após a confirmação da extração do DNA
em gel de agarose e quantificação, este foi utilizado como molde para o isolamento e
amplificação do gene que codifica a proteína ClpP através da técnica de reação em
cadeia da polimerase (PCR), a qual será descrita na próxima seção.
3.2.2 Amplificação do gene através da técnica de PCR
A amplificação do gene clpP foi feita utilizando a técnica de PCR (Reação em
Cadeia da Polimerase). A Reação em Cadeia da Polimerase foi desenvolvida na metade
da década de 1980 por Kary Mullis. Esta técnica é capaz de produzir cópias de regiões
específicas do DNA, ou seja, é capaz de amplificar apenas a região do DNA
correspondente ao gene desejado, produzindo muitas cópias (WATSON et al. 1992).
Esta reação simula in vitro a replicação da molécula de DNA que ocorre in vivo
utilizando a enzima DNA polimerase, oligonucleotídeos iniciadores e temperatura
(WATSON et al. 1992; LARENTIS et al., 2006). A reação ocorre em vários ciclos,
sendo que cada ciclo é composto por basicamente 3 etapas. Na primeira etapa, ocorre a
abertura da fita molde de DNA, na segunda etapa ocorre a ligação (anelamento) dos
oligonucleotídeos iniciadores, que são complementares a cada uma das regiões 3’ do
gene a ser copiado, nas fitas simples. Na terceira etapa, ocorre a síntese das novas fitas
de DNA pela extensão dos oligonucleotídeos iniciadores sob ação da DNA polimerase
(LARENTIS et al., 2006).
3.2.2.1 Oligonucleotídeos iniciadores
Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados neste trabalho para amplificação do
gene clpP foram desenhados de acordo com o gene de S. pneumoniae CGSP14 e podem
ser visualizados na tabela 3.1.
31
Tabela 3.1 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de PCR para amplificação do gene clpP a
partir de DNA de S. pneumoniae CGSP14. Os sítios de clivagem das enzimas de restrição são mostrados
sublinhados nas seqüências, sítio de NcoI na seqüência senso e XhoI na anti-senso.
Oligonucleotídeo iniciador Seqüência
pET28bHisClpPf (Senso) 5´- CCCATGGTTCCTGTAGTTATTGAACAAAC - 3´
pET28bHisClpPr (Anti-senso) 5´- CACTCGAGGTTCAATGAATTGTTGGC - 3´
Os oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados de forma a parearem com as
extremidades 3’ do gene de interesse. Nas extremidades 5’ dos oligonucleotídeos
iniciadores foram colocadas seqüências reconhecidas e clivadas por enzimas de
restrição (sítios de restrição) de acordo com a estratégia de clonagem e vetor utilizados.
As enzimas de restrição são capazes de reconhecer certas seqüências de nucleotídeos e
catalisar a hidrólise das ligações fosfodiéster de bases específicas da seqüência (ZAHA
et al., 1996). Foram inseridas as seqüências dos sítios de restrição da enzimas NcoI e
XhoI nos oligonucleotídeos senso e anti-senso, respectivamente. Estas enzimas foram
escolhidas, de acordo com o vetor utilizado, neste caso pET28b (Novagen), de forma
que, depois da clonagem, o vetor permita a expressão da proteína fusionada com uma
cauda de histidina na sua extremidade carbóxi-terminal para facilitar posterior
purificação. A figura 3.1 mostra a seqüência do sítio de clonagem e expressão do vetor
pET28b, com uma representação da seqüência das enzimas de restrição onde foi
inserido o gene clpP.
32
Ligação do gene clpP
Códon de terminação
Figura 3.1 Sítio de clonagem e expressão do vetor pET28b (Novagen). Os círculos vermelhos indicam os
sítios das enzimas de restrição, também adicionados aos oligonucleotídeos iniciadores, onde o gene clpP
amplificado irá se ligar. O círculo verde indica o códon de terminação, ou seja, a sinalização para o
termino da tradução, possibilitando assim a expressão da proteína fusionada a cauda de histidina.
3.2.2.2 Reação de PCR
A amplificação do gene clpP foi realizada utilizando como molde a amostra 4 do
DNA extraído e diluído 100 vezes, com concentração de aproximadamente 30 ng/µL.
Foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores desenhados para esta reação e
mostrados na seção anterior.
A reação foi feita empregando 30 ng do DNA extraído de S. pneumoniae, 1U de
DNA polimerase de alta fidelidade (Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity,
Invitrogen), 2,5 µL de tampão específico para a enzima DNA polimerase utilizada (10X
High Fidelity PCR Buffer, Invitrogen), 1 µL de MgSO
4
50 mM, 200 µM de cada tipo de
dNTP e 5 pmol de cada oligonucleotídeo (senso e anti-senso) específicos para esta
amplificação em 25 µL de reação, sendo que foi utilizada como solvente da reação água
ultrapura. Para cada reação de PCR, foi realizado um controle negativo, ou seja, uma
reação idêntica, exceto pela substituição do volume empregado de DNA pelo mesmo
volume de água ultrapura.
Primeiramente foi realizado um PCR em gradiente, no qual foram feitas quatro
reações variando em cada uma delas a temperatura de anelamento dos oligonucleotídeos
33
iniciadores de 54ºC até 56ºC, com o objetivo de avaliar a temperatura ideal de
anelamento. Nesta etapa as condições empregadas na reação foram as seguintes: 94ºC
por 5 minutos, 30 ciclos compostos por 3 etapas cada ciclo (94ºC por 1 minuto; 54ºC,
55,1ºC, 55,9º e 56ºC, uma temperatura para cada uma das 4 reações, por 30 segundos;
68ºC por 1 minuto), 68ºC por 7 minutos e resfriamento a 4ºC.
Após a verificação da temperatura ideal de anelamento, em torno de 55ºC, as
reações seguintes de PCR feitas neste trabalho foram realizadas com as seguintes
condições: 94ºC por 5 minutos, 30 ciclos compostos por 3 etapas cada ciclo (abertura da
dupla fita de DNA: 94ºC por 1 minuto, anelamento dos oligonucleotídeos: 55ºC por 30
segundos, extensão dos oligonucleotídeos e síntese de novas fitas de DNA: 68ºC por 1
minuto), 68ºC por 7 minutos e resfriamento a 4ºC.
Tanto a verificação da melhor temperatura de anelamento, quanto a confirmação
da amplificação do gene clpP, com o tamanho esperado, foram feitas através de
eletroforese em gel de agarose 0,8% m/v.
3.2.2.3 Purificação do gene clpP amplificado
Após a confirmação da amplificação no tamanho esperado do gene clpP através
de eletroforese em gel de agarose, o produto da reação de PCR foi purificado para a
remoção de nucleotídeos, oligonucleotídeos iniciadores e possíveis amplificações não
específicas com concentrações muito baixas, as quais não possibilitam a visualização
em gel de agarose. A purificação foi feita através do kit Wizard® SV Gel and PCR
Clean-Up System (Promega). Para tanto, o produto da reação de PCR foi submetido à
eletroforese em gel de agarose 0,8%. Utilizando um bisturi, a banda de DNA foi cortada
e retirada do restante do gel de agarose. Foram recortados pequenos pedaços da banda
de DNA e pesados dentro de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, de forma que cada
pedaço não apresentasse massa superior a 350 mg. Para cada 10 mg de gel pesados nos
tubos de microcentrífuga, foram adicionados 10 µL de Membrane Binding Solution
(4,5M de isotiocianato de guanidina, 0,5M de acetato de potássio), e estes agitados
vigorosamente e incubados a 55ºC até a completa solubilização da agarose. Depois da
solubilização a solução resultante foi transferida para uma minicoluna com membrana,
34
capaz de reter fragmentos de DNA, e incubada à temperatura ambiente por 1 minuto. A
minicoluna foi centrifugada a 14000 rpm em centrífuga Eppendorf 5417R (rotor F45-
30-11) por 1 minuto e a solução percolada foi descartada. A minicoluna foi então lavada
com 700 µL de Wash Solution (10mM de acetato de potássio, pH 5.0; 80% de etanol;
16,7 µM de EDTA, pH 8,0) e centrifugada novamente a 14000 rpm em centrífuga
Eppendorf 5417R (rotor F45-30-11) por 1 minuto. Novamente o percolado foi
descartado e a coluna lavada com 500 µL de Wash Solution (contendo etanol) e
centrifugada novamente a 14000 rpm em centrífuga Eppendorf 5417R (rotor F45-30-
11) por 5 minutos. A solução que percolou foi descartada e a minicoluna vazia foi
centrifugada por 1 minuto a 14000 rpm em centrífuga Eppendorf 5417R (rotor F45-30-
11). A minicoluna foi transferida para um tubo de microcentrífuga limpo. Então foram
adicionados 30 µL de água ultrapura autoclavada na minicoluna, com o objetivo de eluir
os fragmentos de DNA retidos. A coluna foi incubada por 1 minuto à temperatura
ambiente e centrifugada por 1 minuto a 14000 rpm em centrífuga Eppendorf 5417R
(rotor F45-30-11). O percolado contendo uma solução aquosa dos fragmentos de DNA,
retido no tubo de microcentrífuga, foi estocado a -20ºC e analisado em gel de agarose
1,5%.
3.2.3 Clonagem
A estratégia de clonagem utilizada neste trabalho foi a clonagem clássica,
empregando enzimas de restrição para clivar o gene e o vetor, e ligá-los através de DNA
ligase. As enzimas DNA ligases são capazes de unir fitas de DNA clivadas por enzimas
de restrição, ou seja, catalisam a formação de ligações fosfodiésteres de fragmentos de
DNA (ZAHA et al., 1996). Um desenho esquemático das etapas da clonagem é
mostrado na figura 3.2.
35
Enzima
T4 ligase
Enzimas
NcoIe XhoI
pET 28b
pET 28b
Gene clpP
amplificado e
purificado
Enzimas
NcoIe XhoI
Figura 3.2 Desenho esquemático das etapas realizadas na clonagem (construção do vetor pET28b/clpP).
O vetor utilizado nesta clonagem, foi o pET28b (Novagen). O vetor pET28b
utiliza o promotor do bacteriófago T7 RNA polimerase e marcador de resistência à
canamicina. O mapa do vetor pET 28b é mostrado na figura 3.3.
Figura 3.3 Mapa do vetor pET28a, igual ao pET28b (Novagen). O mapa mostra a origem de replicação
(ori), o repressor lac (lacl), o gene de resistência à canamicina (Kan) e o sítio de múltipla clonagem (seta
em preto sólido).
36
Após a purificação do gene clpP amplificado, foram realizadas as digestões do
gene clpP e do vetor pET28b com as enzimas de digestão XhoI e NcoI. Na reação de
digestão do gene clpP, empregando água ultrapura como solvente, foram utilizados
aproximadamente 3 µg do gene, 5U de XhoI (Invitrogen), 3 µL de solução tampão
react2 (Invitrogen), em um volume total de reação de 30 µL. Na reação de digestão do
vetor pET28b, empregando água ultrapura como solvente, foram utilizados
aproximadamente 0,5 µg do gene, 5U de XhoI (Invitrogen), 4 µL de solução tampão
react2 (Invitrogen), em um volume total de reação de 40 µL. As reações foram
incubadas por 2 horas a 37ºC. Após este tempo foram retirados 2 µL de cada reação e
adicionados 5U da enzima NcoI (Invitrogen) e 2U de enzima XhoI. À reação com o
gene clpP foram ainda adicionados mais 1µL de solução tampão react2 (Invitrogen) e o
volume completado com água ultrapura a 40µL e à reação com o vetor foram ainda
adicionados mais 1µL de solução tampão react2 (Invitrogen) e o volume completado
com água ultrapura a 50 µL. As reações foram incubadas por 1 hora e 30 minutos a
37ºC. Após este tempo as reações foram incubadas por 20 minutos a 65ºC para a
inativação das enzimas. Os produtos das digestões foram purificados através do kit
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) da mesma forma exemplificada
na seção 3.2.2.3, exceto pelo fato de que a solução Membrane Binding Solution foi
adicionada diretamente a solução com os produtos da digestão e não ao gel de agarose.
As reações de digestão purificadas foram confirmadas em eletroforese de gel de agarose
0,8%.
Com o gene clpP e o vetor pET28b digeridos, foi realizada a construção do vetor
pET28b/clpP através de ligação com a enzima T4 DNA ligase (Invitrogen), respeitando
na reação de ligação a razão molar inserto(clpP)/vetor de 5/1. Foram realizadas duas
reações de ligação, uma com o vetor e o gene, e outra (controle negativo) utilizando
apenas o vetor. As reações foram compostas por 25 ng do gene clpP (exceto no controle
negativo), 50 ng do vetor pET28b, 1U de T4 DNA ligase e 4 µL da solução tampão 5X
Ligase Reaction Buffer (Invitrogen) sendo o volume completado até 20µL com água
ultrapura autoclavada. As reações foram incubadas por 1 hora a 25ºC. Esta reação foi
utilizada para fazer a transformação em célula eletrocompetente E. coli TOP10.
37
3.2.4 Preparação de células eletrocompetentes
A cepa Escherichia coli TOP 10 (Invitrogen) foi utilizada como hospedeiro do
vetor construído nas rotinas de clonagem e a cepa Escherichia coli BL21 Star (DE3)
(Invitrogen) foi empregada como hospedeiro para o vetor construído nas rotinas de
expressão da proteína. A cepa Escherichia coli TOP 10 é ideal para a propagação do
plasmídeo, permitindo a replicação estável de plasmídeos de alto número de cópias e
possui genótipo:
F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1
araD139 ∆(araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG. Já a cepa Escherichia
coli BL21 Star (DE3) possui genótipo: F- ompT hsdS
B
(r
B
-
m
B
-
) gal dcm rne131 (DE3).
Esta cepa possui o gene que codifica a T7RNA polimerase sob controle do promotor
lacUV5, o qual pode ser induzido por IPTG. Além disso, esta cepa é deficiente nas
proteases lon e OmpT, reduzindo a degradação das proteínas heterólogas expressas, e
possui
uma mutação no gene rne, que codifica para a RNAse E, aumentando a
estabilidade do mRNA.
A transformação dos hospedeiros com o plasmídeo construído pET28b/clpP foi
feita por eletroporação das células. Para isso as células passaram por um processo com
lavagens sucessivas para a retirada do sal presente no meio de cultivo. Para obter as
células eletrocompetentes, uma colônia isolada foi inoculada em em meio LB (Luria-
Bertani), 5g/L de extrato de levedura (BD), 10g/L de triptona (BD), 10g/L de NaCl
(Merck), pH 7, e então, incubada a 37ºC e 200 rpm por 16 horas. Depois deste período,
2,5 mL deste pré-inóculo foram inoculados em 250 mL de LB e incubado a 37ºC e 200
rpm até a biomassa atingir a fase exponencial de crescimento (Abs
600nm
aproximadamente 0,7). O cultivo foi então colocado no gelo por 15 minutos e, logo
após, dividido em duas alíquotas, as quais foram centrifugadas por 20 minutos a
4000rpm e 4ºC em centrífuga
Eppendorf 5810R (rotor A-4-62). O sobrenadante foi
descartado e as células de cada alíquota ressuspensas com o mesmo volume de água
ultrapura gelada. As células lavadas foram divididas em alíquotas de 40 mL e foram
novamente centrifugadas nas mesmas condições anteriores. O sobrenadante foi
descartado e as células ressuspensas delicadamente em 20mL de água ultrapura gelada.
As células foram centrifugadas (nas mesmas condições) e o sobrenadante descartado.
Nesta etapa as células foram ressuspensas com 1 mL de glicerol 10% gelado e cada
38
duas alíquotas foram reunidas em uma, para aumentar o volume das amostras. As três
alíquotas resultantes foram centrifugadas por 15 minutos a 4000rpm e 4ºC em
centrífuga
Eppendorf 5810R (rotor A-4-62) e resuspensas com um total de 1mL glicerol
10% gelado (dividido entre as 3 alíquotas). As células foram aliquotadas em amostras
de 100 µL e congeladas rapidamente em gelo seco com álcool etílico (-45ºC). As
alíquotas com as células eletrocompetentes foram estocadas a -70ºC.
3.2.5 Transformação de Escherichia coli
As células de E. coli eletrocompetentes preparadas foram utilizadas como
hospedeiros para o plasmídeo construído pET28b/clpP. A inserção deste plasmídeo nas
células foi feita por eletroporação. O método da eletroporação consiste na inserção do
plasmídeo na célula mediante um choque elétrico, o qual produz rompimentos
transientes na membrana celular.
Para a eletroporação foram misturados delicadamente, para evitar a formação de
bolhas, 10 µL da reação de ligação (seção 3.2.3) e 100 µL de E. coli TOP 10
eletrocompetente. A mistura foi transferida para uma cubeta de 0,2cm de espessura
entre os eletrodos, e então submetida a uma descarga elétrica por cerca de 5ms, com
voltagem de 2,5 kV, capacitância de 25 µF e resistência de 200 Ω em um eletroporador
Gene Pulser® II (Bio-Rad). Após o choque elétrico, rapidamente foram adicionados
1 mL de meio SOC estéril e a mistura foi transferida para um recipiente de 15 mL
estéril e incubada a 37ºC, sob agitação de 200 rpm, por 1 hora. Depois deste período
200 µL da mistura foram plaqueados em placa de LB Agar contendo 50 µg/mL de
canamicina. As placas foram incubadas em estufa a 37ºC por 16 horas. A placa
contendo antibiótico permite fazer a seleção das colônias que foram transformadas com
o plasmídeo contendo o gene de resistência a canamicina. No entanto, algumas células
podem ser transformadas apenas com o vetor pET28b, sem o gene clpP. Por isso, se faz
necessário o uso de outras técnicas, além da pressão seletiva na placa, para confirmar as
cepas transformadas com a construção pET28b/clpP que deram origem as colônias na
placa. Além disso, todo o procedimento de transformação também foi efetuado com a
reação de ligação apenas com o vetor pET28b (controle negativo mostrado na seção
3.2.3).
39
Após a confirmação do clone positivo, transformado com a construção
pET28b/clpP de maneira correta, este plasmídeo é extraído e transformado, pelo mesmo
procedimento apresentado acima, na cepa E. coli BL21 Star (DE3) utilizada para
expressão da proteína ClpP.
3.2.6 Seleção de clones e preparação de estoques em glicerol
A seleção dos clones que foram transformados com o plasmídeo foi feita através
do plaqueamento das células em meio LB ágar com pressão seletiva (uso de antibiótico,
canamicina). Apenas as células com o plasmídeo, o qual possui gene de resistência à
canamicina, foram capazes de crescer em meio com este antibiótico. No entanto, como
mencionado na seção anterior, algumas colônias transformadas podem ter recebido o
plasmídeo com algum tipo de não conformidade, como por exemplo, com o gene de
interesse ligado de forma errada, alguma base incorporada de maneira errônea no PCR
ou até mesmo sem o gene. Para fazer a seleção, algumas colônias presentes na placa
foram selecionadas, transferidas para outra placa com LB ágar e 50 µg/mL de
canamicina, e ainda inoculadas em meio LB líquido com 50 µg/mL de canamicina e
incubadas a 37ºC e 200 rpm por 16 horas. A partir destes cultivos foram feitos os
estoques de glicerol (chamados de banco mãe) e as extrações plasmidiais para a
confirmação dos clones (padrão de digestão e seqüenciamento).
O estoque de glicerol foi realizado utilizando 300µL do cultivo, citado
anteriormente, de cada clone e a este volume foram adicionados 300µL de glicerol 50%
estéril. Os estoques foram armazenados a -70ºC.
Os mesmos procedimentos (estoque de glicerol e extração plasmidial) foram
repetidos para a cepa E. coli BL21 Star (DE3) após a sua transformação com a
construção pET28b/clpP-C2P.
40
3.2.7 Extração de DNA plasmidial
A extração de DNA plasmidial foi utilizada em algumas partes deste trabalho,
como para a digestão dos plasmídeos e seqüenciamento dos mesmos para confirmação
dos clones e para verificação da correta seqüência de gene clpP no vetor pET28b/clpP.
Para a extração de DNA plasmidial, foi utilizado o kit Wizard® Plus SV
Minipreps DNA Purification System (Promega). Este sistema é baseado na separação
do DNA plasmidial através de uma membrana de sílica presente dentro de uma coluna.
As extrações foram feitas a partir de 10 mL de um cultivo de 16 horas das células
contendo o DNA plasmidial. O cultivo foi centrifugado por 5 minutos a 4000 rpm em
centrífuga
Eppendorf 5810R (rotor A-4-62) e o sobrenadante descartado. As células
foram resuspensas com 250µL da solução Cell Resuspension (50 mM de Tris-HCl (pH
7.5), 10 mM de EDTA, 100 µg/ml RNase A) e, logo após, adicionados 250 µL da
solução Cell Lysis
(
0,2 M de NaOH, 1% SDS). A mistura foi invertida quatro vezes,
cuidadosamente, e então adicionados 10 µL da solução de Protease alcalina. Novamente
a mistura foi invertida quatro vezes, cuidadosamente, e incubada por 5 minutos a
temperatura ambiente. Após estes 5 minutos, foram adicionados 350 µL da solução
Neutralization
(
4,09 M de hidrocloridrato de guanidina,0,759 M de acetato de potássio,
2,12 M de ácido acético glacial), a mistura foi invertida quatro vezes e centrifugada a
14000 rpm por 10 minutos em centrífuga Eppendorf 5417R (rotor F45-30-11). Depois
da centrifugação o sobrenadante clarificado foi transferido para a coluna com a
membrana e esta centrifugada por 1 minuto a 14000 rpm em centrífuga Eppendorf
5417R (rotor F45-30-11). O percolado foi descartado e a coluna lavada com 750 µL de
Wash solution (60% de etanol, 60 mM de acetato de potássio, 8,3 mM de Tris-HCl,
0,04 mM de EDTA) e centrifugada por 1 minuto a 14000 rpm em centrífuga Eppendorf
5417R (rotor F45-30-11). Novamente o percolado foi descartado, a coluna foi lavada
desta vez com 250 µL de Wash solution e centrifugada a 14000 rpm por 2 minutos em
centrífuga Eppendorf 5417R (rotor F45-30-11). A coluna foi transferida para um tubo
de microcentrífuga de 1,5 mL e a ela foram adicionados 50 µL de ultrapura autoclavada,
para eluir o DNA plasmidial, e centrifugada por 1 minuto a 14000 rpm em centrífuga
Eppendorf 5417R (rotor F45-30-11). A solução percolada, contendo DNA plasmidial,
41
foi estocada a -20ºC. O DNA plasmidial foi visualizado em eletroforese em gel de
agarose.
3.2.8 Confirmação dos clones
A confirmação dos clones foi feita primeiramente através do padrão de digestão
dos plasmídeos extraídos, com enzimas de restrição específicas, e depois através de
seqüenciamento do plasmídeo.
3.2.8.1 Digestão com enzimas de restrição
Para a confirmação dos clones, os plasmídeos extraídos foram submetidos à
digestão. A digestão foi realizada para confirmar a presença do gene no plasmídeo e
para confirmar a ligação do inserto de maneira correta. Para isto foram selecionadas
enzimas de restrição de maneira que uma fosse capaz de digerir o gene e outra de digerir
o vetor, formando dois fragmentos facilmente identificáveis em eletroforese de gel de
agarose. Para a digestão foram selecionadas as enzimas PstI e EcoRV, capazes de
digerir o gene clpP e o vetor pET28b, respectivamente. Desta forma, para a confirmação
dos clones, ao digerir os plasmídeos extraídos com as duas enzimas são esperadas duas
bandas de 1697pb e 4134pb.
As reações de digestão foram realizadas utilizando 8µL da extração plasmidial
(cerca de 200 – 250 ng de DNA), 2U de EcoRV (Invitrogen), 2U de PstI (Invitrogen),
1 µL do Tampão React2 (Invitrogen), e o volume completado com água ultrapura até
10 µL. Também foram realizadas digestão apenas do vetor pET28b com EcoRV e
apenas do gene clpP com PstI, como controle positivo para as enzimas. A reação apenas
com o gene foi realizada utilizando aproximadamente 300 ng de DNA, 2U de PstI, 1 µL
do Tampão React2 e o volume completado com água ultrapura até 10 µL. Para a reação
com o vetor pET28b foram utilizados aproximadamente 300 ng de DNA, 2U de EcoRV,
2 µL do Tampão React2 e o volume completado com água ultrapura até 20 µL. Todas as
reações de digestão foram incubadas a 37ºC por 16 horas.
42
3.2.8.2 Seqüenciamento
O plasmídeo pET28b/clpP extraído e confirmado por digestão, foi seqüenciado
para verificação do correto posicionamento do gene no plasmídeo e para confirmação da
correta incorporação de bases no gene durante o PCR. O seqüenciamento foi realizado
com terminadores fluorescentes (Big Dye, Applied Biosystems) utilizando o
seqüenciador capilar ABI PRISM® 3100 (Applied Biosystems) do Laboratório de
AIDS & Imunologia Molecular – IOC/Fiocruz. Para a reação de seqüenciamento foram
feitas seis reações, quatro contendo os oligonucleotídeos iniciadores capazes de
amplificar a partir de uma região do plasmídeo (T7 senso e anti-senso), duas com cada,
uma com o oligonucleotídeo pET28bHisClpPf (Senso) e uma com o oligonucleotídeo
pET28bHisClpPr (anti-senso). Além destas seis reações, foi realizada uma reação, como
controle positivo, utilizando o oligonucleotídio iniciador MI3 e o vetor pGEM como
DNA a ser seqüenciado. As reações, utilizando água ultrapura como solvente, foram
compostas por: 150 ng de DNA, 2 µL de solução tampão MgCl
2
(400 mM Tris pH 9,0,
10 mM MgCl
2
), 2 µL de Big Dye (Applied Biosystems), 3,2 pmol do oligonucleotídeo
iniciador e o volume completado até 10 µL. O programa utilizado no termociclador para
a extensão das fitas foi de 1 minuto a 95ºC para a desnaturação das fitas e depois 30
ciclos composto pelas seguintes etapas: 96ºC por 10 segundos, 50ºC por 5 segundos e
60ºC por 4 minutos. As reações foram armazenadas a 4ºC, protegidas da luz, até o
momento da precipitação. O DNA foi precipitado com isopropanol e seco em
concentrador centrífugo a vácuo (Vacufuge
TM
Eppendorf). As amostras foram então
submetidas ao seqüenciador capilar ABI PRISM® 3100 (Applied Biosystems). A
seqüência foi analisada e comparada com as seqüências depositadas no GenBank
utilizando programa CLUSTAL W.
3.2.9 Preparação de lote de trabalho e viabilidade celular
Após as confirmações do clone positivo, o plasmídeo pET28b/clpP-C2P
extraído deste clone foi transformado em E. coli BL21 Star (DE3). Os clones desta cepa
foram confirmados e a partir deles foi preparado um lote de trabalho, estocado em
glicerol. A partir deste lote que foram realizadas todas as expressões da proteína ClpP
deste trabalho.
43
O lote de trabalho foi preparado a partir do estoque de glicerol (banco mãe) dos
quatro clones selecionados e confirmados de E. coli BL21 Star (DE3)/pET28b/clpP. As
cepas foram crescidas em 10 mL de meio LB (5 g/L de extrato de levedura (BD); 10 g/L
de triptona (BD); 10 g/L de NaCl (Merck), pH 7), enriquecido com 1% de glicose
(Merck), 0,4% de glicerol e 50 µg/mL de canamicina (Sigma), a 37ºC e agitação de
200 rpm, até atingirem Abs
600nm
de aproximadamente 1,0. Foram preparadas várias
alíquotas com 100 µL do cultivo e 100 µL de glicerol 50% estéril. As alíquotas com
(lote de trabalho) foram estocadas a -70ºC.
As expressões foram sempre realizadas a partir deste banco de trabalho, sendo
que as alíquotas sempre que utilizadas eram avaliadas quanto à viabilidade celular,
apresentando em torno de 10
8
UFC/mL. A viabilidade celular do lote de trabalho da
cepa recombinante E. coli BL21 Star (DE3)/pET28b/clpP foi avaliada a partir da
contagem de UFC (Unidades Formadoras de Colônia). Foram feitas diluições seriadas
em PBS pH 7,4, e estas diluições foram plaqueadas em placas de Petri contendo LB
Ágar e canamicina 50 µg/mL. Na figura 3.4 é mostrado um desenho esquemático das
etapas realizadas na análise de viabilidade celular.
Lote de trabalho
Estoque em glicerol
(-70°C)
Viabilidade
celular
Figura 3.4 Desenho esquemático dos procedimentos realizados para a análise de viabilidade celular.
44
3.2.10 Crescimento celular e curva de massa seca de células
A avaliação do crescimento celular foi realizada através de medidas de Abs
600nm
.
No entanto, todas estas leituras foram convertidas para massa seca de células. Para tanto
foi realizada uma curva de absorbância em função da concentração de células em massa
seca para realizar as conversões.
Para fazer a curva foi utilizado um precipitado celular proveniente de 200 mL do
cultivo da cepa E. coli BL21 Star (DE3)/pET28b/clpP com 4 horas de expressão. O
precipitado foi lavado exaustivamente com água destilada gelada até a obtenção de um
sobrenadante límpido. Com este precipitado lavado foi preparada um suspensão em
balão volumétrico com concentração final de 21,29 mg de massa úmida de células/mL.
Foram transferidos 5 mL desta suspensão para uma placa previamente pesada, e este
conjunto levado a estufa a 60ºC até obtenção de massa constante. Com esta massa foi
possível obter a concentração de massa seca de células/mL da suspensão preparada. A
partir da suspensão de 21,29 mg de massa úmida de células/mL foram preparadas outras
suspensões diluídas em água destilada 100, 70, 50, 30, 25 e 20 vezes. Estas suspensões
foram submetidas à leitura de Abs
600nm
. Com isso foi traçado um gráfico da Abs
600nm
em
função da concentração de células em massa seca e assim obtido através de regressão
linear a equação que correlaciona Abs
600nm
com concentração de massa seca de células.
3.2.11 Expressão e preparação dos extratos protéicos para análise de solubilidade
Primeiramente para realizar a expressão da proteína foram utilizados os lotes de
trabalho dos quatro clones de E. coli BL21 Star (DE3)/pET28b/clpP. Um esquema geral
dos procedimentos realizados para fazer a expressão e a análise de solubilidade da
proteína heteróloga é mostrado na figura 3.5.
45
Lote de trabalho
Estoque em glicerol
(-70°C)
Pré-inóculo
pré-inóculo
Inóculo
0,65-0,75
Abs600nm
Expressão (4h)
IPTG
Indução
Centrifugar
Células
Tampão
Sonicar
Fração solúvel
Fração insolúvel
Avaliação em
SDS-PAGE
Centrifugar
Figura 3.5 Esquema dos procedimentos realizados nos experimentos de expressão e análise de
solubilidade da proteína.
Para fazer o pré-inóculo, 10 µL do lote de trabalho da bactéria recombinante E.
coli BL21 Star (DE3)/pET28b/clpP foram inoculados em 10 mL de meio LB (5 g/L de
extrato de levedura (BD); 10 g/L de triptona (BD); 5 g/L de NaCl (Merck), pH 7)
enriquecido com 1% de glicose (Merck), 0,4% de glicerol e 50 µg/mL de canamicina
(Sigma). O pré-inóculo foi incubado por 16 horas a 37ºC e 200 rpm, em frascos
agitados de 50 mL. Após as 16 horas, o inóculo foi preparado, em frascos de 500 mL,
com 2 mL do pré-inóculo em 100 mL do meio LB enriquecido com 1% de glicose
(Merck), 0,4% de glicerol e 50 µg/mL de canamicina (Sigma). O cultivo foi incubado a
37ºC e 200 rpm até atingir a fase exponencial de crescimento (Abs
600nm
entre 0,65 e
0,75). Neste ponto, a expressão foi induzida com 1 mM de IPTG (isopropil-β-D-
tiogalactopiranosídeo) por 4 horas. Amostras de 1 mL do cultivo foram retiradas, antes
e ao final das 4 horas de expressão, e centrifugadas, para avaliar a expressão da proteína
ClpP e também sua solubilidade.
Para avaliar a expressão da proteína foram utilizados os precipitados celulares
obtidos das amostras de 1 mL retiradas dos cultivos antes (não induzido) e após as 4
horas de expressão. Aos precipitados foi adicionado tampão Tris-HCl 60 mM pH6,8,
10% de glicerol, 5%
β-mercaptoetanol, 2% de SDS e 0,5% de azul de bromofenol,
46
seguindo a razão de 25 µL de tampão para cada 0,1 de Abs
600nm
. As amostras foram
incubadas em banho de água fervente por 5 minutos e aplicadas em Gel de Eletroforese
Desnaturante de Poliacrilamida com SDS 12,5% (SDS-PAGE). Foram realizadas
corridas a 120 V por 90 minutos e então os géis foram corados com Coomassie Blue R-
250.
Para a análise de solubilidade da proteína expressa foram utilizadas as amostras
de 1mL retiradas ao final das 4 horas de expressão dos cultivos realizados a partir dos
clones E. coli BL21 Star (DE3)/pET28b/clpP-C2P/2 e E. coli BL21 Star
(DE3)/pET28b/clpP -C2P/4. As amostras foram resuspendidas em tampão de lise (Tris
20 mM; EDTA 1 mM, pH8,0), seguindo a razão 25 µL de tampão para cada 0,1 de
Abs
600nm
(normalizando pela Abs
600nm
), obtendo os extratos totais das proteínas. Os
extratos totais foram submetidos a ultra-som por cinco ciclos de 10 segundos com
amplitude de 30% em sonicador Sonics&Material Inc. Através de centrifugação foram
separadas as frações solúveis e insolúveis das proteínas totais dos cultivos. A estas
frações foi adicionado tampão Tris-HCl 60 mM pH6,8, 10% de glicerol, 5% β-
mercaptoetanol, 2% de SDS e 0,5% de azul de bromofenol. As amostras foram
incubadas em banho de água fervente por 5 minutos e então aplicadas em gel de
poliacrilamida 12,5%. Foi realizada corrida a 120 V por 90 minutos, e após a corrida, o
gel foi corado com Coomassie Blue R-250.
3.2.12 Otimização da expressão por planejamento de experimentos
Com o objetivo de otimizar alguns parâmetros importantes na expressão da
proteína ClpP foi realizado um planejamento fatorial a dois níveis com duas variáveis
(2²). Neste trabalho foram avaliadas as influências de duas variáveis do processo,
concentração de canamicina e concentração de IPTG, sobre o crescimento celular, sobre
a concentração de proteína e sobre a estabilidade plasmidial. Antibióticos, como a
canamicina, são largamente utilizados em escala laboratorial para fazer a pressão
seletiva no meio, evitando a segregação do plasmídeo, já que a maioria dos plasmídeos
utilizados possui um gene marcador de resistência a algum antibiótico. A segregação
plasmidial pode ter reflexos muito importantes na produtividade da proteína
recombinante principalmente em escala industrial. No entanto, em escala industrial o
47
uso destes antibióticos se torna inviável por vários motivos. Os antibióticos possuem um
custo elevado e, além disso, contaminam o produto e precisam ser completamente
removidos nos processos de purificação dos produtos com fins farmacêuticos ou
alimentícios (FRIEHS, 2004). Por estes motivos o estudo da variável canamicina é tão
importante neste processo, no entanto, a variação do antibiótico no cultivo pode ter
reflexos sérios na instabilidade plasmidial. O IPTG também é uma variável muito
importante no processo, principalmente em larga escala, já que também possui custo
elevado e a sua toxicidade o torna contra indicado para proteínas de uso humano
(HANNING E MAKRIDES, 1998).
A matriz do planejamento fatorial utilizado neste estudo é mostrada na tabela
3.2. Foram realizados 8 experimentos, sendo que destes experimentos 4 foram réplicas
no ponto central. Os 8 experimentos do planejamento foram realizados com o clone E.
coli BL21 Star (DE3)/pET28b/clpP-C2P/4. Para fazer o pré-inóculo, 10µL do lote de
trabalho da bactéria recombinante E. coli BL21 Star (DE3)/pET28b/clpP-C2P/4 foram
inoculados em 10 mL de meio LB (5 g/L de extrato de levedura (BD); 10 g/L de
triptona (BD); 5 g/L de NaCl (Merck), pH 7) enriquecido com 1% de glicose (Merck),
0,4% de glicerol e 50 µg/mL de canamicina (Sigma), e incubados por 16 horas a 37ºC e
200 rpm. A cada pré-inóculo realizado, a viabilidade celular do lote de trabalho
utilizado foi avaliada conforme descrito na seção 3.2.9, sendo todas avaliadas em torno
de 10
8
UFC/mL.
Tabela 3.2 Tabela com as condições dos experimentos do planejamento fatorial 2². Os números entre
parênteses são os valores das variáveis independentes normalizados.
Experimento IPTG (mM) Canamicina (
µ
g/mL)
1 0,1 (-1) 0 (-1)
2 0,1 (-1) 50(1)
3 1 (1) 0 (-1)
4 1 (1) 50(1)
PC5 0,55 (0) 25 (0)
PC6 0,55 (0) 25 (0)
PC7 0,55 (0) 25 (0)
PC8 0,55 (0) 25 (0)
48
O inóculo foi preparado em frascos de 500 mL, com 2 mL do pré-inóculo
saturado em 100 mL do meio LB com a mesma composição e concentrações do pré-
inóculo, exceto a concentração do antibiótico canamicina que variou de acordo com os
experimentos do planejamento fatorial (tabela 3.2). O cultivo foi incubado a 37ºC e
200 rpm. A indução da expressão da proteína recombinante com IPTG (isopropil-β-D-
tiogalactopiranosídeo) foi feita por 4 horas a partir da fase exponencial de crescimento
(com Abs
600nm
entre 0,65 e 0,75), variando a concentração de IPTG (Promega) de
acordo com os experimentos do planejamento fatorial (tabela 3.2).
As análises estatísticas foram feitas através do programa STATISTICA 6.1,
empregando as variáveis normalizadas. O efeito de cada um dos fatores foi estimado,
assim como o erro padrão, e avaliado pelo teste t, considerando estatisticamente
significativos aqueles com p<0,1 (RODRIGUES E IEMMA, 2005).
3.2.13 Avaliação do crescimento celular e quantificação da proteína expressa em SDS-
PAGE
Após 4 horas de indução, o crescimento foi medido por Abs
600nm
(Abs
final
).
Amostras de células antes da indução e ao final do cultivo de cada condição de
expressão do planejamento experimental foram resuspensas em tampão de amostra,
obtendo os extratos totais das proteínas, seguindo a razão 25µL de tampão para cada 0,1
de Abs
600nm
, normalizando as amostras pela Abs
600nm
. Estas amostras foram aplicadas
em gel de poliacrilamida 12,5%, corado com Coomassie Blue R-250. Neste mesmo gel
também foi aplicado um marcador de massa molar LMW (Amersham Bioscience), com
bandas de 97kDa, 66kDa, 45kDa, 30kDa, 20,1kDa e 14,4kDa, e concentrações
conhecidas de proteína em cada banda, para comparação com as bandas
correspondentes a proteína ClpP. A quantidade de proteína expressa em cada condição
foi analisada por densitometria em equipamento Bio-Rad (GS-800 Calibrated
Densitometer) e programa QuantityOne 4.4.1. Através do marcador de massa molar foi
feita uma curva padrão, com a qual foi calculada a concentração de proteína expressa.
49
3.2.14 Análise da segregação plasmidial
A segregação plasmidial foi avaliada através da contagem de UFC (unidades
formadoras de colônia) na presença e ausência de canamicina (BAHERI et al., 2001;
TOMAZETTO et al, 2007). As análises foram realizadas através de 100 µL do cultivo,
os quais passaram por diluições seriadas em PBS estéril até a diluição 10
-6
. Foram
colocados 10 µL de cada diluição, em no mínimo 3 réplicas, em placas de LB Ágar,
com canamicina 50 µg/mL e também sem o antibiótico. A estabilidade plasmidial foi
mensurada através de F (fração de células com plasmídeo), para tanto foi realizada a
razão entre a contagem de colônias da placa com antibiótico (apenas células com
plasmídeo) e a contagem de colônias da placa sem antibiótico (total de células
presentes). A figura 3.6 mostra um desenho esquemático das etapas realizadas na
análise da segregação plasmidial.
Expressão (4h)
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
LB
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
LB com Canamicina
Figura 3.6 Desenho esquemático das etapas realizadas na análise de segregação plasmidial.
As diluições foram feitas de modo que na placa sempre estivessem presentes
uma diluição sem células e uma diluição com crescimento confluente. Na figura 3.7,
para exemplificar, é mostrada uma foto das placas realizadas no experimento PC8 do
planejamento fatorial realizado neste trabalho.
50
LB com canamicina
LB
Figura 3.7 Fotos das placas de LB ágar, com e sem canamicina, das análises de segregação plasmidial do
experimento PC8 do planejamento fatorial.
3.2.15 Validação da condição otimizada no planejamento fatorial
Após as análises do planejamento fatorial, foram realizadas réplicas da condição
de cultivo otimizada para validar os resultados obtidos no planejamento. Após a indução
foram retiradas amostras a cada hora para avaliar a cinética de produção da proteína
ClpP, o crescimento celular e a segregação plasmidial. Estas análises foram realizadas
conforme descrito anteriormente.
3.2.16 Purificação
A purificação da proteína ClpP clonada de forma a ser expressa fusionada a uma
cauda de histidina foi realizada por cromatografia de afinidade através de coluna
empacotada com resina contendo íons níquel imobilizados (HisTrap™ HP, GE
Healthcare) de 1 mL, em HPLC ÄKTA Purifier 10 system (Amersham Biosciences).
Primeiramente, a purificação foi realizada com amostras preparadas de duas
maneiras distintas, a partir de um precipitado celular proveniente de uma expressão de 4
horas a 37ºC e 200 rpm. Em uma das amostras foi utilizada a solução tampão Tris
20 mM, EDTA 1 mM, imidazol 20 mM, pH8,0, tanto para fazer a lise celular quanto
51
para equilibrar a coluna utilizada na purificação. Na outra amostra foi utilizada a
solução tampão Tris 20 mM, EDTA 1 mM, imidazol 5 mM, pH8,0 também para fazer a
lise celular e para equilibrar a coluna utilizada na purificação.
As amostras foram aplicadas na coluna (cerca de 12 mg de proteína total) e o
material que atravessou a coluna, não adsorvido, foi recolhido para posterior análise
como sendo a fração não adsorvida. Após, a coluna foi eluída com solução tampão Tris
20 mM, EDTA 1 mM, pH8,0, fazendo um gradiente de 0 a 1 M de imidazol, para a
desorção das proteínas. Amostras foram sendo recolhidas do material eluído da coluna
em diferentes concentrações de imidazol para análises posteriores.
Depois destas duas amostras, ainda foram realizadas mais duas análises com
outras duas amostras. No entanto, desta vez foi utilizada solução tampão Tris 20 mM,
EDTA 1 mM, DTT (Ditiotreitol) 1 mM, pH8,0 para equilibrar a coluna e para fazer a
lise celular de uma das amostras e solução tampão Tris 20 mM, EDTA 1 mM, DTT
1 mM, 1 mM imidazol, pH8,0, para equilibrar a coluna e fazer a lise celular da outra
amostra. A purificação destas duas amostras foi realizada em coluna de níquel da
mesma forma como nas duas primeiras purificações.
As amostras eluídas nas quatro purificações foram analisadas através de SDS-
PAGE 12,5%.
3.3 Clonagem utilizando
Bacillus subtilis
como sistema de expressão
3.3.1 Caracterização da cepa de Bacillus subtilis WB600
A cepa de Bacillus subtilis WB600 (WU et al., 1991) empregada neste trabalho
foi gentilmente cedida pelo professor Dr. Sui-Lam Wong da Universidade de Calgary –
Canadá. Esta cepa é deficiente de seis das principais proteases extracelulares presentes
em Bacillus subtilis. Os esporos da cepa foram abertos no Laboratório de Fisiologia
Bacteriana (LFB) e Coleção de Culturas do Gênero Bacillus e Gêneros Correlatos
(CCGB) do Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ. Estes esporos foram inoculados em
meio LB com 5
µg/mL de eritromicina e lincomicina e incubados a 37ºC por
52
aproximadamente 16 horas. Através desta cultura foram feitos novos estoques de
esporos em papel filtro, estoques em LB ágar (com 5 µg/mL de eritromicina e
lincomicina) inclinado, e isolamento de colônias em placas também de LB ágar (com
5 µg/mL de eritromicina e lincomicina). Em parceria com o LFB e CCGB foram
realizados ensaios de caracterização desta cepa de gênero e espécie.
A morfologia das colônias foi caracterizada através de sua visualização nas
placas e a morfologia celular foi caracterizada por coloração de Gram e também por
visualização em microscópio de lâminas a fresco. Foram ainda realizados ensaios
bioquímicos, como redução de nitrato, Voges-Proskauer (VP), utilização de citrato,
arabinose, xilose e glicose, crescimento em diferentes concentrações de NaCl,
degradação da caseína, do amido e da gelatina, β-hemólise em placas de ágar sangue,
entre outros. Foram também realizados testes bioquímicos através do sistema de
identificação Api 50
CHB (Biomerieux).
3.3.2 Desenho do gene clpP sintético e vetores utilizados
Para fazer a expressão da proteína em B. subtilis um gene sintetizado
quimicamente foi utilizado. O gene foi desenhado de acordo com a seqüência da
proteína ClpP obtida no seqüenciamento da construção pET28b/clpP-C2P. A esta
seqüência ainda foi adicionado a seqüência do peptídeo sinal Epr (BROCKMEIER et
al., 2006) e um sítio de clivagem entre o peptídeo sinal e a seqüência da proteína. Os
códons utilizados no gene sintético foram otimizados para os códons mais freqüentes
utilizados por B. subtilis. O gene sintético, flanqueado pelas enzimas de restrição XbaI e
BamHI, foi inserido no vetor pBluescript II SK para a manutenção do gene, o qual
passou a se chamar pBSKClpP717. O mapa do vetor pBSKClpP717 é mostrado na
figura 3.8, e sua seqüência juntamente com a seqüência do gene sintético se encontram
no apêndice A.
53
GS44387 pBSK Clp717
3580 bps
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
NaeI
NgoMIV
BanII
BsaAI
DraIII
PsiI
BtgI
NcoI
StyI
BamHI
RsrII
SphI
HincII
HpaI
NheI
Bpu10I
BbsI
Bpu1102I
ClaI
XbaI
AvaI
XhoI
SapI
AflIII
PciI
AhdI
BsaI
BpmI
ScaI
TatI
BsaHI
f1 origin
LacZ
T7/M13F
Clp717
T3/M13R
pUC origin
Ampcillin
Figura 3.8 Mapa do plasmídeo pBSK ClpP717.
Para as rotinas de clonagem em E. coli JM109 e posterior expressão em
B. subtilis, o vetor utilizado foi o pHCMC03 (NGUYEN et al.,2005), gentilmente
cedido pela pesquisadora Rita C. Ferreira do Departamento de Microbiologia da
Universidade de São Paulo - Brasil. Este vetor possui o gene marcador de resistência à
ampicilina e é capaz de se replicar tanto em E. coli quanto em B. subtilis. O pHCMC03
utiliza o promotor PgsiB que pode ser induzido por estresse térmico, ácido ou por
etanol. A figura 3.9 mostra o mapa do vetor pHCMC03.
54
Figura 3.9 Mapa do plasmídeo pHCMC03 (NGUYEN et al.,2005)
3.3.3 Preparo de células competentes para transformação por choque térmico
A cepa E. coli JM109 (Promega) utilizada para as rotinas de clonagem nesta
parte do trabalho possui o seguinte genótipo: endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (r
k
–
,
m
k
+
), relA1, supE44, ∆(lac-proAB), [F´traD36, proAB, laqI
q
Z∆M15]. Esta cepa,
E. coli JM109, foi inoculada em LB e incubada por 16 horas à 37ºC e 200 rpm. Após as
16 horas, 0,5 mL desta cultura foram inoculados em 50 mL de meio LB com 20 mM de
MgSO
4
e incubados à 37ºC e 200 rpm até atingir a fase exponencial de crescimento
(Abs
600nm
aproximadamente 0,6). A cultura foi centrifugada a 4000 rpm e 4ºC por 5
minutos. As células foram resuspensas em 20 mL de uma solução estéril gelada de 30
mM de acetato de potássio, 100 mM de RbCl, 10 mM de CaCl
2
, 50 mM de MnCl
2
e
15% de glicerol, com pH 5,8. As células resuspensas foram mantidas em gelo por 5
minutos e então centrifugadas por 5 minutos à 5000 rpm e 4ºC. Nesta etapa, as células
foram resuspensas em solução estéril gelada contendo 10 mM de Mops
(Morfolinopropanosulfônico), 10 mM de RbCl, 75 mM de CaCl
2
, e 15% de glicerol,
com pH 6,5. As células resuspensas foram incubadas por 45 minutos em gelo. Após este
período foram feitas alíquotas de 100 µL e congeladas rapidamente em gelo seco. As
alíquotas foram estocadas a -70ºC.
55
3.3.4 Clonagem
Nesta parte do trabalho a clonagem foi feita utilizado o gene sintético clpP e o
vetor pHCMC03 (NGUYEN et al., 2005). Um esquema geral das etapas realizadas na
construção do vetor para esta clonagem é mostrado na figura 3.10.
Digestão: enzimas
BamHI e XbaI
Enzima
T4 DNA ligase
Digestão: enzimas
BamHI e XbaI
pHCMC03/clpP
pHCMC03
Figura 3.10 Desenho esquemático das etapas realizadas para a construção do vetor utilizado na clonagem
em B. subtilis.
Para fazer a construção do vetor pHCMC03/clpP foram realizadas reações de
digestão com o vetor pHCMC03, para a sua linearização, e com o vetor pBSKClpP717,
56
para a liberação do inserto clpP. Na reação de digestão do vetor pBSKClpP717
empregando água ultrapura como solvente, foram utilizados aproximadamente 2 µg do
vetor, 10U de BamHI (Fermentas), 4 µL de solução tampão Tango
-
33mM de Tris-
acetato (pH 7.9 a 37°C), 10 mM de acetato de magnésio, 66 mM acetato de potássio e
0.1 mg/mL de BSA - (Fermentas), em um volume total de reação de 20 µL. Na reação
de digestão do vetor pHCMC03, empregando água ultrapura como solvente, foram
utilizados aproximadamente 2 µg do gene, 10U de BamHI (Fermentas), 4 µL de solução
tampão Tango (Fermentas), em um volume total de reação de 20 µL. As reações foram
incubadas por 8 horas a 37ºC. Após este tempo a enzima foi inativada sendo incubada à
80ºC por 20 minutos. Foram então adicionados 10U da enzima XbaI (Fermentas) em
cada reação de digestão. As digestões foram então incubadas a 37ºC por 16 horas. As
digestões foram visualizadas através de eletroforese em gel de agarose 1%. As digestões
foram purificadas através do kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System
(Promega) da mesma forma exemplificada na seção 3.2.2.3, exceto pelo fato de que a
solução Membrane Binding Solution foi adicionada diretamente à solução com os
produtos da digestão e não ao gel de agarose. As reações de digestão purificadas foram
confirmadas em eletroforese de gel de agarose 1%.
Com o gene clpP digerido (liberado do vetor pBSKClpP717) e o vetor
pHCMC03 também digerido, foi realizada a construção do vetor pHCMC03/clpP
através de ligação com a enzima T4 DNA ligase (Fermentas), respeitando na reação de
ligação a razão molar inserto(clpP)/vetor de 5/1. Foram realizados dois tipos de reações
de ligação, uma com o vetor e o gene, e outra (controle negativo) utilizando apenas o
vetor. As reações foram compostas por 42 ng do gene clpP (exceto no controle
negativo), 81 ng do vetor pHCMC03, 5U de T4 DNA ligase e 2 µL da solução tampão
10X T4 DNA Ligase Buffer (Fermentas) sendo o volume completado até 20 µL com
água ultrapura autoclavada. As reações de ligação foram incubadas a 22ºC por
diferentes tempos, 1 hora, 2 horas e 16 horas. Após a incubação a enzima foi inativada
por incubação a 65ºC por 10 minutos. Estas reações foram utilizadas para fazer a
transformação em célula competente E. coli JM109.
57
3.3.5 Transformação por choque térmico
As células competentes de E. coli JM109 foram utilizadas como células
hospedeiras para a construção pHCMC03/clpP. Para a transformação, 10 µL da reação
de ligação foram adicionados a 100 µL das células E. coli JM109 competentes. A
mistura foi incubada em gelo por 1 hora e após este tempo, foi realizado um choque
térmico a 37ºC por 45 segundos. Depois do choque térmico, a mistura foi incubada
novamente em gelo por 2 minutos e logo após, foram adicionados 400 µL de meio LB
contendo 0,4% de glicose e incubados a 37ºC sob agitação vigorosa por 30 minutos. As
células foram centrifugadas e ressuspensas em 50µL de LB, sendo então plaqueadas em
LB ágar com 100 µg/mL de ampicilina.
58
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Seleção da proteína
A seleção das proteínas foi realizada utilizando ferramentas de bioinformática e
dados disponíveis na literatura. Foram pré-selecionadas e analisadas três proteínas,
ClpP, IgA1 protease e Hialuronato Liase (Hyl).
Através da utilização do programa Blastp (ALTSHUL et al., 1990), a seqüência
de aminoácidos da proteína ClpP de S. pneumoniae
CGSP14, sorotipo 14, depositada no
GenBank sob o código GI: 182629000, foi alinhada com outras contidas nos bancos de
dados, sendo o resultado deste alinhamento mostrado na figura 4.1. Neste alinhamento
foram encontradas 55 seqüências com 100% de identidade com a seqüência da cepa
CGSP14, o que indica que a ClpP é altamente conservada entre as diversas cepas de S.
pneumoniae. Destas, foram escolhidas oito seqüências de aminoácidos da proteína ClpP
e realizado o alinhamento, através do programa CLUSTAL W (Figura 4.2). As
seqüências escolhidas são pertencentes às seguintes cepas: S. pneumoniae P1031 (GI:
225856422), S. pneumoniae 70585 (GI: 225858557), S. pneumoniae D39 (GI:
116076792), S. pneumoniae Hungary19A-6 (GI:168994986), S. pneumoniae CGSP14
(GI:182629000), S. pneumoniae G54 (GI:194358110), S. pneumoniae R6 (GI: 934194)
S. pneumoniae TIGR4 (GI: 930696).
59
Figura 4.1. Comparação da seqüência de aminoácidos da proteína ClpP de S. pneumoniae CGSP14,
depositada no GenBank sob o código GI: 182629000, com outras sequências depositadas no banco de
dados de proteínas, através da ferramenta Blastp. A seta indica onde a análise avalia que além das três
seqüências demonstradas existem mais 52 seqüências com 100% de identidade.
O alinhamento múltiplo feito pelo programa CLUSTAL W apresentou tamanho
de 196 aminoácidos, com 72,96% de resíduos idênticos (mostrados em vermelho na
figura 4.2), 1,02% de resíduos com fraca similaridade (mostrados em azul na figura 4.2)
e 26,02% de resíduos diferentes (mostrados em preto na figura 4.2). O alto percentual
de resíduos diferentes ocorreu pois a seqüência pertencente à cepa S. pneumoniae G54
possui apenas 147 aminoácidos, enquanto as demais possuem 196 aminoácidos. No
entanto, se retirarmos apenas a seqüência pertencente à cepa S. pneumoniae G54
(GI:194358110), o alinhamento das outras sete seqüências passa a apresentar 98,98% de
resíduos idênticos, 0,52% de resíduos com alta similaridade e 0,52% de resíduos com
baixa similaridade.
60
Figura 4.2. Alinhamento múltiplo, realizado com o auxílio do programa CLUSTAL W, de oito
seqüências da proteína ClpP, de diferentes cepas de S. pneumoniae, depositadas no GenBank. O
alinhamento foi realizado com as seguintes cepas de S. pneumoniae: 70585 (GI: 225858557), TIGR4 (GI:
930696), R6 (GI: 934194), CGSP14 (GI:182629000), Hungary19A-6 (GI:168994986), D39 (GI:
116076792), P1031 (GI: 225856422), G54 (GI:194358110).
Os dados obtidos no alinhamento múltiplo feito com o programa CLUSTAL W,
juntamente com os dados do alinhamento feito pelo programa Blastp (55 sequências
com 100% de identidade com a seqüência da cepa CGSP14), indicam que a proteína
61
ClpP possui elevada identidade entre as cepas de S. pneumoniae, sendo altamente
conservada. Por conta de sua elevada identidade, as próximas análises continuaram a ser
realizadas utilizando a seqüência da proteína ClpP de S. pneumoniae
CGSP14
depositada no GenBank sob o código GI: 182629000.
A proteína ClpP, com 196 aminoácidos, de acordo com o programa CLC
Workbench 4, possui massa molar estimada em 21,5kDa, o que está de acordo com
dados da literatura (KWON et al., 2004), e ponto isoelétrico em pH 5,11. Além disso, a
proteína não possui regiões transmembranares (hidrofóbicas). Para a análise de
possíveis seqüências sinalizadoras presentes na proteína, a seqüência de aminoácidos foi
submetida ao programa SignalP 3.0. Através dos resultados obtidos pode-se inferir que
esta proteína não possui peptídeo sinal.
Outra proteína analisada foi a proteína IgA1 protease. A seqüência de
aminoácidos da proteína IgA1 protease de S. pneumoniae CGSP14, depositada no
GenBank sob o código GI:182629447, foi alinhada com outras seqüência disponíveis no
banco de dados, utilizando o programa Blastp, com o objetivo de identificar outras
seqüências de IgA1 protease. A partir do resultado, foram selecionadas oito seqüências
de IgA1 protease de S. pneumoniae. Com estas seqüências, um alinhamento múltiplo foi
realizado no programa CLUSTAL W. O alinhamento múltiplo mostrou identidade de
51,08% entre as seqüências, confirmando que a proteína é altamente heterogênea entre
os sorotipos (MISTRY E STOCKLEY, 2006). Os demais dados deste alinhamento são
mostrados na tabela 4.1, e o alinhamento completo é mostrado no apêndice B. Assim
como realizado com a proteína ClpP, as demais análises foram realizadas com a
seqüência da cepa S. pneumoniae
CGSP14.
62
Tabela 4.1. Dados gerados pelo alinhamento múltiplo, realizado no programa CLUSTAL W, de oito
sequências de aminoácidos da proteína IgA1 protease de S. pneumoniae depositadas no GenBank.
Dados do Alinhamento Múltiplo
Tamanho do Alinhamento: 2081 aa
Identidade: 1063 aa , 51,08%
Alta similaridade: 293 aa, 14,08%
Baixa similaridade: 153 aa, 7,35%
Diferente: 572 aa, 27,49 %
Seqüências utilizadas:
S. pneumoniae SP195, GI:168488981 ( 1999 aa)
S. pneumoniae CDC1087-00, GI:168486448 (1928 aa)
S. pneumoniae G54, GI:194398492 ( 1945 aa)
S. pneumoniae CGSP14, GI:182629447 ( 1908 aa)
S. pneumoniae R6, GI:15903086 ( 1963 aa)
S. pneumoniae 70585, GI:225858942 ( 1942 aa)
S. pneumoniae TIGR4, GI:15901019 ( 2004 aa)
S. pneumoniae Hungary19A-6, GI:169833458 ( 1892 aa)
A proteína IgA1 protease, com 1908 aminoácidos, foi também analisada no
programa CLC Workbench 4, através do qual estimou-se o tamanho da proteína em
214,2kDa, valor um pouco acima dos dados encontrados na literatura, os quais
indicavam uma proteína variando de 130 a 200 kDa (ROMANELLO et al., 2006). Esta
diferença provavelmente ocorre devido à elevada heterogeneidade das seqüências de
aminoácidos das diferentes cepas. O ponto isoelétrico da proteína foi estimado em pH
5,61. Utilizando o mesmo programa, foram preditas três regiões transmembranares
(hidrofóbicas) na proteína, as quais são mostradas na figura 4.3.
63
Figura 4.3. Regiões transmembranares presentes na proteína IgA1 protease de S. pneumoniae CGSP14,
segundo predição do programa
CLC Workbench 4. (A) Desenho esquemático da região amino terminal
de IgA1 protease, apresentando as regiões transmembranares e o peptídeo sinal. (B) Esquema da
disposição da proteína na membrana celular, apresentando as três regiões que atravessam a membrana.
Para a verificação de possíveis seqüências sinalizadoras presentes na proteína, a
região amino terminal da proteína IgA1 protease foi analisada através do programa
SignalP 3.0. A figura 4.4 mostra a análise feita pelo programa SignalP 3.0. Conforme
indicado nesta figura, a linha verde mostra a probabilidade de um aminoácido fazer
parte da seqüência sinalizadora, enquanto as linhas vermelha e azul indicam o provável
começo da proteína. Através desta análise, pode-se inferir que os 36 primeiros
aminoácidos da proteína têm elevada probabilidade de fazer parte do peptídeo sinal.
64
Figura 4.4. Análise da região amino terminal da proteína IgA1 protease de S. pneumoniae CGSP14.
Predição do peptídeo sinal através do programa SignalP 3.0. S score (linha verde) mostra a probabilidade
de um aminoácido estar presente no peptídeo sinal, C score (linha vermelha) e Y score (linha azul)
mostram onde seja o provável começo da proteína.
Continuando a análise das proteínas, a seqüência de aminoácidos da proteína
Hialuronato liase (Hyl) de S. pneumoniae CGSP14, depositada no GenBank sob o
código GI: 182683292, também foi alinhada com outras seqüências disponíveis no
banco de dados, utilizando o programa Blastp, com o objetivo de identificar seqüências
da proteína de outras cepas do microrganismo. A partir deste alinhamento, foram
selecionadas nove seqüências da proteína de diferentes cepas de S. pneumoniae.
Utilizando estas seqüências foi realizado um alinhamento múltiplo no programa
CLUSTAL W, com o objetivo de verificar os níveis de identidade entre diversas cepas
de S. pneumoniae. Os dados do alinhamento são mostrados na tabela 4.2 e o
alinhamento completo é mostrado no apêndice B. Os dados do alinhamento, de 1088
aminoácidos, mostram uma identidade de 95,95% entre as seqüências, o que sugere que
a Hyl é conservada entre diversos sorotipos de S. pneumoniae.
Como a proteína Hyl apresenta elevada identidade entre as diferentes cepas de
S. pneumoniae, e assim como ocorreu na análise das outras duas proteínas, as próximas
análises foram realizadas utilizando a seqüência da proteína Hyl de S. pneumoniae
CGSP14 depositada no GenBank sob o código
GI:182683292
.
65
Tabela 4.2. Dados gerados pelo alinhamento múltiplo, realizado no programa CLUSTAL W, de nove
seqüências de aminoácidos da proteína Hyl de S. pneumoniae depositadas no GenBank.
Dados do Múltiplo Alinhamento
Tamanho do Alinhamento: 1078 aa
Identidade: 1030 aa , 95.55%
Alta similaridade: 11aa, 1,02%
Baixa similaridade: 12 aa, 1,11%
Diferente: 25 aa, 2,32 %
Seqüências utilizadas:
S. pneumoniae
D39, GI:116076553 (1067 aa)
S. pneumoniae R6, GI:15457838 (1078 aa)
S. pneumoniae Taiwan19F-14, GI: 225860354
(1067 aa)
S. pneumoniae Hungary19A-6, GI:169833327 (1067 aa)
S. pneumoniae CGSP14, GI:182683292 (1078 aa)
S. pneumoniae G54, GI:194396877 (1067 aa)
S. pneumoniae P1031, GI: 225856058
(1067 aa)
S. pneumoniae CDC1087-00, GI: 168486599
( 1066 aa)
S. pneumoniae TIGR4, GI: 15900247
( 1066 aa)
Da mesma forma que no caso das outras proteínas, o tamanho da Hyl foi
estimado em 122,1kDa e o ponto isoelétrico em pH 6,07. Foram preditas duas regiões
transmembranares (hidrofóbicas) na proteína, uma na região amino terminal e outra na
região carbóxi terminal. Um esquema da disposição da proteína na membrana é
mostrado na figura 4.5.
Figura 4.5. Esquema da disposição da Hyl na membrana celular, de acordo com o programa
CLC
Workbench 4. As duas regiões da proteína que atravessam a membrana (transmembranares) são
representadas no esquema.
66
Para a verificação da presença de peptídeos sinais na proteína, a região amino
terminal da Hyl foi analisada através do programa SignalP 3.0. A figura 4.6 mostra a
análise feita pelo programa SignalP 3.0, conforme indicado nesta figura, a linha verde
mostra a probabilidade de um aminoácido fazer parte da seqüência sinalizadora,
enquanto as linhas vermelha e azul indicam o provável começo da proteína. Através
desta análise, pôde-se verificar que os 41 primeiros aminoácidos da proteína têm
elevada probabilidade de fazer parte de um peptídeo sinal.
Figura 4.6. Análise da região amino terminal da proteína Hyl de S. pneumoniae CGSP14. Predição do
peptídeo sinal através do programa SignalP 3.0. S score (linha verde) mostra a probabilidade de um
aminoácido estar presente no peptídeo sinal, C score (linha vermelha) e Y score (linha azul) mostram
onde seja o provável começo da proteína.
4.1.1 Comparação das proteínas: ClpP, IgA1 protease e Hialuronato liase
As análises apresentadas acima mostram que a proteína ClpP não possui regiões
transmembranares, nem seqüências sinalizadoras, e pelos alinhamentos foi possível
perceber que, assim como indicado na literatura (CAO et al., 2009), a ClpP é altamente
conservada entre os vários sorotipos de S. pneumoniae. Além disso, dados da literatura
mostram que esta proteína possui alta imunogenicidade (KWON et al., 2004; CAO et
al., 2007; CAO et al., 2009). Já a proteína IgA1 protease possui peptídeo sinal e regiões
transmembranares, o que dificultaria a clonagem e expressão da proteína de forma
solúvel. Esta proteína se mostra pouco conservada entre os sorotipos, corroborando os
67
dados que afirmam sua heterogeneidade (MISTRY E STOCKLEY, 2006). No entanto,
a IgA1 protease tem mostrado ser imunogênica (ROMANELLO et al., 2006). As
análises feitas com a proteína Hyl, mostraram que ela também possui peptídeo sinal e
regiões transmembranares, no entanto apresenta alta conservação entre os sorotipos de
S. pneumoniae. Apesar disso, estudos mostraram que cepas mutantes nesta proteína não
tiveram a virulência atenuada, o que indica que ela só pode ser usada em uma vacina
quando combinada com outros fatores de virulência (JEDRZEJAS, 2001). Através do
exposto acima, a proteína ClpP foi selecionada para a realização deste trabalho devido a
sua alta conservação, imunogenicidade e à ausência de peptídeo sinal e regiões
transmembranares, visando o alto nível de expressão em sistemas bacterianos.
4.2 Amplificação do gene clpP de S. pneumoniae
4.2.1 Extração de DNA genômico de S. pneumoniae
A extração de DNA genômico foi feita a partir do cultivo da cepa Streptococcus
pneumoniae 113/95, sorotipo 14, depositada no Instituto Adolfo Lutz. O DNA extraído
por fenol/clorofórmio foi analisado em gel de agorose 0,8% (Figura 4.7). O gel de
agarose 0,8% mostra que o DNA foi extraído por fenol/clorofórmio de maneira eficiente
e em alta concentração. Devido à concentração elevada de DNA extraído, este foi
utilizado diluído 100 vezes para o isolamento e amplificação do gene clpP através de
PCR (reação em cadeia da polimerase), isto porque altas concentrações de DNA podem
inibir a reação de PCR (LARENTIS et al., 2006). Através desta diluição foi possível a
obtenção de aproximadamente 59 ng/µL de DNA (amostra 3) e 30 ng/µL de DNA
(amostra 4).
68
23130pb
Figura 4.7 Gel de agorose 0,8% em TAE mostrando o perfil eletroforético da solução resultante da
extração de DNA genômico de S. pneumoniae. 1 e 2, DNA genômico extraído de S. pneumoniae
(amostras 3 e 4 respectivamente); 3 e 4, DNA genômico extraído de S. pneumoniae diluído 10 vezes
(amostras 3 e 4 respectivamente); 5 e 6, DNA genômico extraído de S. pneumoniae diluído 100 vezes
(amostras 3 e 4 respectivamente); M, padrão de tamanho de fragmento (DNA λ digerido com Hind III). A
seta indica a banda do marcador com 23130bp.
4.2.2 Amplificação do gene clpP por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
Através da técnica de PCR, utilizando os oligonucleotídeos desenhados
especificamente para esta amplificação, foi possível amplificar o gene clpP a partir de
DNA genômico extraído de S. pneumoniae. A reação de PCR amplificou fragmentos de
599 pb (Figura 4.8A), o que era esperado de acordo com as seqüências do gene
depositadas no GenBank, utilizadas nas análises de bioinformática e para o desenho dos
oligonucleotídeos iniciadores. A reação de PCR gradiente foi analisada através de
eletroforese em gel de agarose 0,8%, mostrado na figura 4.8A. É possível perceber que
em todas as temperaturas de anelamento utilizadas, o gene foi amplificado de forma
específica e com bom rendimento. Como todas as temperaturas de anelamento
apresentaram rendimento similar, a temperatura de anelamento de 55ºC foi escolhida
para as próximas reações de PCR realizadas neste trabalho. A temperatura de 55ºC foi
escolhida por ser a intermediária entre as testadas visando à maior eficiência da reação,
visto que temperaturas baixas diminuem a especificidade e temperaturas altas podem
diminuir a eficiência do anelamento. Após a definição das condições empregadas na
reação de PCR e a confirmação da amplificação do gene clpP, o produto de PCR foi
purificado. O gene purificado foi visualizado em gel de agarose (Figura 4.8B), também
com tamanho esperado de 599 pb.
69
603 pb
1M 2
3
4 5
603 pb
M 1
(A) (B)
Figura 4.8 (A) Gel de agorose 0,8% em TAE da amplificação do gene clpP utilizando diferentes
temperaturas de anelamento no programa do PCR. M, padrão de tamanho de fragmento (ΦX174 DNA
digerido com Hae III); Gene clpP amplificado por PCR utilizando temperatura de anelamento dos
oligonucleotídeos iniciadores igual a 54ºC (1), 55,1ºC (2), 56ºC (3), 55,9ºC (4); Controle negativo da
reação de PCR (5); A seta indica o banda do marcador com 603bp, próximo ao tamanho esperado do gene
clpP amplificado. (B) Gel de agarose 1,5% em TAE do produto de PCR purificado. M, padrão de
tamanho de fragmento (ΦX174 DNA digerido com Hae III); 1, Purificação do gene clpP amplificado; A
seta indica o banda do marcador com 603bp, próximo ao tamanho esperado do gene clpP amplificado.
4.3 Clonagem e expressão utilizando Escherichia coli como sistema de expressão
4.3.2 Clonagem utilizando o vetor pET28b
Através do gene amplificado e purificado foram realizadas as reações de
digestão e ligação ao vetor pET28b. A estratégia utilizada para amplificação do gene e
ligação ao vetor possibilita a expressão da proteína com cauda de histidina na posição
C-terminal da proteína, já que o códon de terminação da tradução, desta forma, ficou
localizado após a seqüência que codifica a cauda de histidina. A célula eletrocompetente
E. coli TOP10 foi transformada com o vetor construído, denominado pET28b/clpP, por
eletroporação. Após a transformação, as células foram plaqueadas em meio LB com
antibiótico. Foram selecionadas quatro colônias desta placa, como sendo possíveis
cepas recombinantes com a construção pET28b/clpP correta. Estes clones tiveram seus
plasmídeos extraídos e submetidos à digestão com enzimas de restrição específicas para
70
sua confirmação. As reações de digestão foram analisadas em gel de agarose (Figura
4.9).
1636 pb
4072 pb
M 32
1
6
5
4
8
9
10
11 12
7
Figura 4.9 Confirmação dos clones - Digestão dos plasmídeos extraídos das cepas transformadas E. coli
TOP 10 com o vetor construído. M, padrão de tamanho de fragmento 1 kb DNA Ladder (Invitrogen); 1,
3, 5 e 7, plasmídeos extraídos dos clones C1N, C8N, C2P e C4P, respectivamente; 2, 4, 6 e 8, plasmídeos
digeridos extraídos dos clones C1N, C8N, C2P e C4P, respectivamente; 9 e 11, clpP e pET28b,
respectivamente; 10 digestão do gene clpP com PstI (controle positivo); 12, digestão do vetor pET28b
com EcoRV (controle positivo). As setas indicam as bandas do padrão de tamanho de fragmento mais
próximas as bandas esperadas na digestão de clones positivos.
Através da análise da figura 4.9 é possível visualizar que apenas o plasmídeo
extraído do clone E. coli TOP10/pET28b/clpP-C2P apresentou os padrões de bandas
esperados, 1697pb e 4134pb, ao ser digerido pelas enzimas EcoRV no plasmídeo e PstI
no gene. Os plasmídeos das demais cepas recombinantes apresentaram apenas uma
banda característica do vetor pET28b linearizado pela enzima EcoRV, indicando que
estas cepas possuíam apenas o plasmídeo pET28b, sem o gene clpP. A partir deste
resultado pode-se inferir que apenas o clone C2P possui o plasmídeo com o inserto
clpP, sendo possível confirmar esta cepa recombinante como positiva. O plasmídeo
extraído deste clone foi seqüenciado e também transformado na cepa de expressão
E. coli BL21 Star (DE3), previamente submetida ao protocolo de obtenção de células
competentes.
As colônias, geradas pela cepa E. coli BL21 Star (DE3) transformada com a
construção pET28b/clpP-C2P, passaram pela mesma confirmação que as cepas de
clonagem. Os plasmídeos de quatro colônias foram extraídos e confirmados por
digestão com enzimas de restrição. Todas as quatro colônias se mostraram positivas por
71
apresentarem o padrão de bandas da digestão esperado. Este resultado pode ser
visualizado na figura 4.10.
M 32
1
6
5
4
8 9
10
11
12
7
1636 pb
4072 pb
Figura 4.10 Digestão dos plasmídeos extraídos das cepas transformadas E. coli BL21 Star (DE3). M,
padrão de tamanho de fragmento 1 kb DNA Ladder (Invitrogen); 1, 3, 5 e 7, plasmídeos extraídos dos
clones C2P/1, C2P/2, C2P/3, C2P/4, respectivamente; 2, 4, 6 e 8, plasmídeos digeridos extraídos dos
clones C2P/1, C2P/2, C2P/3, C2P/4, respectivamente; 9 e 11, clpP e pET28b, respectivamente; 10
digestão do gene clpP com PstI (controle positivo); 12, digestão do vetor pET28b com EcoRV (controle
positivo). As setas indicam as bandas do padrão de tamanho de fragmento mais próximas as bandas
esperadas na digestão de clones positivos.
4.3.3 Seqüenciamento
A construção pET28b/clpP-C2P foi seqüenciada a fim de confirmar a seqüência
correta do gene a ser expresso. O resultado do seqüenciamento (seqüência consenso) é
mostrado na Figura 4.11.
Figura 4.11 Seqüenciamento do Plasmídeo pET28b/clpP-C2P. A figura mostra a seqüência de
nucleotídeos do gene clpP (preto), o sítio de restrição da enzima XhoI (rosa), a seqüência da cauda de
histidina (azul) e o códon de terminação (vermelho), presentes no plasmídeo construído e seqüenciado.
72
Para a análise do seqüenciamento, a seqüência consenso obtida foi alinhada com
outras seqüências do gene clpP, disponíveis no GenBank, através do programa
CLUSTAL W. Através deste alinhamento foram encontrados 5 nucleotídeos diferentes
entre o consenso e a seqüência de S. pneumoniae CGSP14 depositada no GenBank. A
troca do nucleotídeo na posição 4 da seqüência, adenina por guanina, foi feita
propositalmente quando os oligonucleotídeos foram desenhados para conseguir inserir a
seqüência da enzima NcoI e manter a temperatura de fusão dos oligonucleotídeos baixa.
Esta mudança resultou na troca do segundo aminoácido da cadeia, isoleucina por valina.
A outras quatro mudanças de nucleotídeos são mostradas na tabela 4.3. As mudanças
são todas silenciosas, ou seja, não acarretam mudanças de aminoácidos. Além disso,
alguns destes nucleotídeos se mostram diferentes na cepa CGSP14, mas idênticos em
outras utilizadas no alinhamento. Sendo assim, é possível que as mudanças ocorridas
não tenham sido por nucleotídeos erroneamente incorporados pela ação da DNA
polimerase durante a PCR, mas, que estes nucleotídeos já estavam presentes no DNA
utilizado como molde na reação de amplificação do gene, já que este DNA se refere ao
da cepa depositada no Instituto Adolfo Lutz e cuja seqüência não está depositada no
GenBank.
Tabela 4.3 Mutações detectadas no seqüenciamento do plasmídeo pET28b/clpP-C2P quando comparada
a seqüência obtida pelo seqüenciamento e a seqüência de S. pneumoniae CGSP14 depositada no
GenBank.
Posição Nucleotídeo Aminoácido Mutação
Nucleotídeo 136 C T Leucina Silenciosa
Nucleotídeo 165 A G Treonina Silenciosa
Nucleotídeo 294 A G Glicina Silenciosa
Nucleotídeo 297 A T Treonina Silenciosa
4.3.4 Expressão da proteína recombinante ClpP
Com o objetivo de verificar a expressão nos quatro clones selecionados e
confirmados da cepa E. coli BL21 Star (DE3), estes foram cultivados a 37ºC sob
agitação de 200 rpm, em meio LB com 50 µg/mL de canamicina até a fase exponencial
73
de crescimento (Abs
600nm
aproximadamente 0,7). Nesta fase, a expressão da proteína foi
induzida, pela adição de 1 mM de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo), por 4 horas. As
análises da expressão da proteína, feitas através de SDS-PAGE, mostraram que os
quatro clones expressam a proteína ClpP em concentrações semelhantes e com o
tamanho esperado (cerca de 21,5 kDa). Com isso foram utilizados dois destes clones
para fazer as análises de expressão e solubilidade da proteína recombinante. Os clones
C2P/2 e C2P/4 foram cultivados e expressos nas mesmas condições anteriores. Ao final
da expressão foram retiradas amostras, com as quais os extratos protéicos foram
preparados, sendo separadas as frações solúvel e insolúvel das proteínas totais. Estas
amostras também foram analisadas em SDS-PAGE, mostrado na figura 4.12. Através
desta análise é possível perceber que os dois clones expressam a proteína, visualizada
no gel entre as bandas de 18,4 kDa e 24 kDa do marcador de massa molar. Além disso,
esta mesma banda não é visualizada antes da indução da expressão (amostra não
induzida), não havendo “vazamentos” na expressão, já que é utilizado o sistema do
promotor do bacteriófago T7 RNA polimerase, que é fortemente regulado e permite a
expressão da proteína recombinante apenas quando adicionado o indutor. A proteína é
expressa em níveis semelhantes pelos dois clones, em altas concentrações e de forma
solúvel, não ocorrendo a formação de corpos de inclusão. De acordo com BANEYX
(1999), um dos problemas da superprodução de proteínas heterólogas dentro do
citoplasma desta bactéria é a formação de proteínas insolúveis em forma de agregados
(corpos de inclusão) ocasionados pela perda da conformação da proteína, contudo isto
não foi verificado no presente trabalho.
74
M1
M2
2
1 3 4 5
6
7
8
18,4kDa
14,4kDa
24kDa
45kDa
66kDa
Figura 4.12 Gel de SDS-PAGE 12,5% dos extratos protéicos totais e de suas frações, solúvel e insolúvel,
obtidos através da expressão da proteína ClpP por E. coli BL21 Star (DE3). M1 e M2, padrão de massa
molar; 1 e 5, amostras do cultivo não induzido dos clones C2P/2 e C2P/4, respectivamente; 2 e 6, extratos
protéicos totais dos clones C2P/2 e C2P/4, respectivamente; 3 e 7, frações insolúveis dos clones C2P/2 e
C2P/4, respectivamente; 4 e 8, frações solúveis dos clones C2P/2 e C2P/4, respectivamente. As amostras
aplicadas no gel foram normalizadas por Abs
600nm
.
Após estas análises, como os dois clones apresentados no gel acima mostram os
mesmos níveis de expressão, foram feitos estoques em glicerol para um banco de
trabalho com a cepa E. coli BL21 Star (DE3)/pET28b/clpP-C2P/4. O banco de trabalho,
utilizado para fazer todas as expressões a partir deste ponto, foi feito a partir de um
cultivo em fase de crescimento exponencial, com Abs
600nm
aproximadamente 1,0.
4.3.5 Otimização da expressão e estudos de segregação plasmidial
Para analisar a influência de algumas variáveis importantes na expressão da
proteína ClpP, foi utilizada a ferramenta de planejamento de experimentos, através da
realização de um planejamento fatorial a dois níveis com duas variáveis (2²) e quatro
réplicas no ponto central. As duas variáveis independentes utilizadas foram: a
concentração de indutor do sistema, IPTG, e a concentração do antibiótico canamicina,
o qual é responsável pela pressão seletiva do sistema. Através do planejamento foi
avaliada a influência destas variáveis independentes sobre o crescimento celular, sobre a
produção de proteína e sobre a segregação plasmidial. Os experimentos foram
realizados como descrito na seção 3.2.10. A expressão da proteína foi realizada por 4
horas e ao final deste tempo foram retiradas amostras para leituras de Abs
600nm
, as quais
foram convertidas para massa seca de células conforme descrito na seção 3.2.10, com o
75
objetivo de avaliar o crescimento celular. Foram também retiradas amostras para a
quantificação da concentração de proteína expressa (por densitometria) e para análises
de segregação plasmidial (através de diluições sucessivas e crescimento em placas com
e sem antibiótico). As condições empregadas em cada um dos experimentos do
planejamento fatorial 2² são mostradas na tabela 4.4, juntamente com as respostas das
variáveis dependentes analisadas.
Tabela 4.4 Experimentos do planejamento fatorial e suas variáveis de resposta
Experimento
IPTG
(mM)
Canamicina
(µg/mL)
Massa seca
de células
(mg/mL)
ClpP
(mg /L)
F
(fração de células
com plasmídeo)
1
0,1 0 0,91 247,3 0,44
2
0,1 50 0,87 251,1 0,55
3
1 0 0,71 271,6 0,05
4
1 50 0,76 225,9 0,09
PC5
0,55 25 0,74 266,3 0,07
PC6
0,55 25 0,72 244,2 0,23*
PC7
0,55 25 0,77 229,7 0,06
PC8
0,55 25 0,76 221,2 0,11
* possível outlier
Através dos dados mostrados na tabela 4.4, é possível perceber que a
concentração de proteína se mantém em níveis semelhantes em todas as condições
empregadas no planejamento. Já os experimentos com menos IPTG apresentaram
crescimento celular acima dos demais, independente da concentração de canamicina.
Também apresentaram maior estabilidade plasmidial, já que os valores de F (fração de
células com plasmídeo) dos experimentos 1 e 2 estão acima dos outros experimentos. É
possível verificar uma tendência dos valores de F, já que no menor valor de IPTG a
fração de células com plasmídeo se apresenta entre 44% e 55%, enquanto nos outros
experimentos, induzidos com concentrações maiores de IPTG o valor de F está em uma
faixa de 5% a 11%, desconsiderando o experimento PC6, ou seja, experimentos que
utilizam concentrações menores de IPTG apresentam menor segregação plasmidial. Este
76
efeito do IPTG sobre a segregação é relatado na literatura, pois são encontrados alguns
trabalhos que discutem a influência negativa de indutores utilizados em promotores
baseados no operon lac, como o IPTG, sobre a estabilidade plasmidial, reduzindo o
valor de F (FRIEHS, 2004).
O valor de F do experimento PC6 pode tratar-se de um outlier, pois ele
apresenta um valor diferente da tendência apresentada pelos demais valores de F das
réplicas no ponto central. Um outlier é definido como um ponto experimental que
parece não se adequar a uma distribuição particular de probabilidades definida pela
grande maioria dos demais pontos experimentais (SCHWAAB E PINTO, 2007). O
cálculo para detecção de um outlier pode ser realizado através do cálculo do intervalo:
σ
µ
⋅
±
2 , onde µ é a média no ponto central e σ é o desvio padrão. Através deste
cálculo, utilizando os valores de F dos três pontos centrais (PC) na faixa entre 0,06 e
0,11 para o cálculo da média e desvio padrão, obtém-se um intervalo de dados entre
0,02 e 0,14. Sendo assim, o valor de F do experimento PC6 está fora do intervalo
calculado e pode ser considerado um outlier. Desta forma, valor de F do experimento
PC6 pode ser desconsiderado nas análises estatísticas. No entanto, a análise dos efeitos
será realizada tanto utilizando quanto não utilizando o valor de F do experimento PC6, a
fim de comparar os resultados obtidos.
Através dos experimentos com 0,55 mM de IPTG e 25 µg/mL de canamicina
(réplicas no ponto central) obteve-se média de 240,4 mg/L de ClpP com desvio padrão
de 19,7 e desvio padrão relativo de 8%. Obteve-se também média de 0,75mg/mL de
massa seca de células com desvio padrão de 0,02 e desvio padrão relativo de 2,5%. A
variável F apresentou média de 0,08 com desvio padrão de 0,03 e desvio padrão relativo
de 36%.
Para analisar estatisticamente as respostas obtidas no planejamento, o programa
STATISTICA 6.1 foi utilizado considerando significativos os efeitos com p<0,1.
Primeiramente foram avaliados os efeitos das variáveis IPTG e canamicina sobre o
crescimento celular (Tabela 4.5). Analisando a tabela 4.5 observa-se que o p-valor para
a variável IPTG é menor que 0,1, ou seja, a variável IPTG influencia significativamente
o crescimento celular, de forma negativa. Logo pode-se inferir, com 90% de confiança,
77
que a concentração de IPTG influencia significativamente de forma negativa o
crescimento celular. Alguns autores já relataram o efeito tóxico do IPTG
(ANDERSSON et al., 1996) sendo que a indução com altas concentrações de IPTG
pode diminuir drasticamente o crescimento celular (LÉON et al., 2004). Já o fator
canamicina apresentou p-valor maior que 0,1, logo a concentração deste antibiótico não
influencia significativamente o crescimento celular.
Tabela 4.5 Efeitos das variáveis sobre o crescimento celular (mg/mL de massa seca de células)
Efeitos Erro Padrão t(5) p-valor
Média 0,779 0,016 47,31 <0,0001
IPTG -0,152 0,046 -3,27 0,022
Canamicina 0,008 0,046 0,185 0,86
O valor da concentração de proteína de cada experimento foi obtido através de
densitometria. Os géis de SDS-PAGE dos extratos protéicos totais dos experimentos do
planejamento, utilizados para a análise de densitometria, são mostrados na figura 4.13.
Observando os géis é possível verificar, mais uma vez, que a proteína ClpP foi expressa
em níveis similares em todos os experimentos. Além disso, a proteína é expressa em
todos os experimentos em altas concentrações e de forma solúvel a 37ºC e 200rpm, o
que é vantajoso, já que E. coli normalmente expressa proteínas insolúveis nestas
condições, como já discutido na seção 4.3.4. A concentração de ClpP obtida nestes
experimentos está dentro da faixa de concentrações obtidas por outros trabalhos da
literatura, onde são realizados experimentos de otimização de expressão de outras
proteínas em E. coli, utilizando frascos agitados e cultivos em batelada (CHOI et al.,
2006; MALDONADO et al., 2007; CHUAN et al., 2008; HAN et al., 2008). Dados da
literatura mostram que concentrações mais elevadas de proteínas produzidas em E. coli,
em termos de g/L, são alcançadas quando a expressão da proteína heteróloga é realizada
e otimizada em bioreatores, onde as condições de cultivo podem ser controladas (CHOI
et al., 2006).
78
M 1
2 3
4 5
6
7
8
30kDa
20,1kDa
45kDa
66kDa
97kDa
(B)
30kDa
20,1kDa
45kDa
66kDa
97kDa
M 1
2 3
4
5
6
7
8
(A)
Figura 4.13 Gel de SDS-PAGE 12,5% com o extrato total das proteínas dos experimentos do
planejamento fatorial. (A) M, padrão de massa molar LMW (Amersham Bioscience); 1, 3, 5, e 7, extrato
total sem indução dos experimentos 1, 2, 5(PC) e 7(PC), respectivamente; 2, 4, 6 e 8, extrato total com 4h
de indução dos experimentos 1, 2, 5(PC) e 7(PC), respectivamente. (B) M, padrão de massa molar LMW
(Amersham bioscience); 1, 3, 5, e 7, extrato total sem indução dos experimentos 3, 4, 6(PC) e 8(PC),
respectivamente; 2, 4, 6 e 8 extrato total com 4h de indução dos experimentos 3, 4, 6(PC) e 8(PC),
respectivamente. As amostras foram normalizadas pela Abs
600nm
.
Através das análises estatísticas foram calculados os efeitos dos fatores sobre a
concentração de proteína. Os resultados, visualizados na tabela 4.6, indicam que tanto a
concentração de IPTG, quanto a concentração de canamicina, nas faixas testadas, não
influenciam significativamente na expressão da proteína, já que o p-valor em ambos os
casos é maior que 0,1. Por meio destas análises é possível indicar que, nas condições
estudadas, pode-se diminuir a concentração do indutor em até 10 vezes (vantajoso
também pelo efeito negativo sobre o crescimento celular), e até mesmo retirar a
canamicina do sistema sem prejudicar significativamente a concentração de proteína,
desta forma reduzindo custos e mantendo a expressão em níveis similares.
79
Tabela 4.6 Efeitos das variáveis sobre concentração de ClpP (mg/L)
Efeitos Erro Padrão t(5) p-valor
Média 244,68 6,95 35,21 <0,0001
IPTG -0,486 19,65 -0,024 0,981
Canamicina -20,98 19,65 -1,067 0,334
Da mesma forma que para o crescimento celular e para a concentração de
proteína, foram avaliados os efeitos das variáveis independentes IPTG e canamicina
sobre a estabilidade plasmidial através da análise da variável dependente F (fração de
células com plasmídeo). Para tanto, foram considerados significativos os efeitos com
p<0,1, ou seja, as análises foram feitas com grau de confiança de 90%, assim como nos
demais casos analisados anteriormente. Na tabela 4.7 são mostrados os efeitos das
variáveis sobre a estabilidade plasmidial, considerando o valor de F do experimento
PC6 um outlier, ou seja, desconsiderando este valor nas análises estatísticas. Através
destas análises é possível concluir, com 90% de confiança, que a concentração de IPTG,
na faixa testada, possui efeito negativo sobre a estabilidade plasmidial, e que a
concentração de canamicina no sistema não apresenta efeito significativo sobre F,
dentro das faixas estudadas. Isso significa que quanto mais próxima de 0,1 mM for a
concentração de IPTG utilizada, menor será a segregação plasmidial (perda do
plasmídeo), em qualquer concentração de canamicina dentro da faixa estudada.
Tabela 4.7 Efeitos das variáveis sobre o valor de F (fração de células com plasmídeo), desconsiderando o
valor de F do experimento PC6.
Efeitos Erro Padrão t(4) p-valor
Média 0,194 0,05 3,825 0,019
IPTG -0,419 0,134 -3,11 0,036
Canamicina 0,074 0,134 0,557 0,607
Os efeitos das variáveis independentes, IPTG e canamicina, sobre a estabilidade
plasmidial também foram avaliados utilizando o valor de F do experimento PC6 nas
análises estatísticas. Os efeitos das variáveis sobre o valor de F utilizando os valores do
experimento PC6 são mostrados na tabela 4.8. Assim como na análise anterior, é
possível concluir, através da análise da tabela 4.8, que a concentração de IPTG possui
80
efeito negativo sobre a estabilidade plasmidial, e que a concentração de canamicina no
sistema não apresenta efeito significativo sobre F, mesmo utilizando o valor de F do
experimento PC6. Ou seja, considerando ou desconsiderando o valor de F do
experimento PC6 nas análises estatísticas, o resultado da avaliação dos efeitos das
variáveis sobre a estabilidade plasmidial é o mesmo: o IPTG possui efeito negativo
sobre a estabilidade plasmidial e a canamicina não apresenta efeito significativo sobre
esta variável.
Tabela 4.8 Efeitos das variáveis sobre o valor de F (fração de células com plasmídeo), considerando o
valor de F do experimento PC6.
Efeitos Erro Padrão t(5) p-valor
Média 0,199 0,004 4,65 0,006
IPTG -0,419 0,121 -3,44 0,018
Canamicina 0,074 0,121 0,616 0,564
O efeito negativo da indução com IPTG sobre a segregação é mencionado em
alguns trabalhos na literatura (FRIEHS, 2004). Em seus estudos, MARÍ et al. (1999)
demonstram que na presença de IPTG ocorre uma diminuição na estabilidade plasmidial
quando comparada a culturas sem o indutor, na presença ou ausência de antibiótico.
Portanto, este trabalho indica que a estabilidade plasmidial é dependente da variável
IPTG e independente do marcador de seleção (antibiótico) (MARÍ et al., 1999). Além
disso, os dados apresentados por XU et al. (2006) indicam que a segregação plasmidial
é muito mais dependente da indução do que da presença ou ausência de antibiótico. Isto
porque, em seus estudos XU et al. (2006) mostram que a estabilidade plasmidial em
culturas não induzidas apresenta valores em torno de 95% com antibiótico e 90% sem
antibiótico; já em culturas induzidas, a estabilidade diminui drasticamente, em torno de
15% com antibiótico e 10% sem antibiótico.
Através dos valores de F (fração de células com plasmídeo) mostrados na tabela
4.4, pode-se perceber que F não apresenta um comportamento linear, o que foi
confirmado pelo baixo valor do coeficiente de ajuste ao modelo (R
2
), igual a 0,72.
Como para realizar as análises de um plano fatorial 2
2
, como o empregado, só é possível
81
avaliar os coeficientes de regressão linear de cada variável, o valor baixo de R
2
indica
que o modelo linear não se ajusta bem aos dados. O comportamento não linear do
sistema, também pode ser visualizado pelo gráfico apresentado na figura 4.14. Assim,
de acordo com as faixas estudadas, para obter menores níveis de segregação plasmidial,
deve-se utilizar o indutor IPTG em concentração de 0,1mM. Estes dados ainda sugerem
a possibilidade de existir um ponto ótimo, menor que 0,1mM de IPTG, onde a
segregação seja mínima, e a expressão da proteína continue em altos níveis. Para
confirmar esta hipótese e avaliar a concentração mínima de IPTG, novos estudos
precisam ser realizados, ajustando esta concentração em relação ao número de células,
uma vez que o indutor liga-se ao promotor T7.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,1 0,55 1
F (Fração de células com plasmídeo)
Concentração de IPTG (mM)
Figura 4.14 Gráfico de F (fração de células com plasmídeo) em função da concentração de IPTG,
mostrando o efeito não linear do sistema.
Através das análises do planejamento fatorial foi possível inferir a condição
otimizada dentro dos limites estudados. A condição otimizada com base no
planejamento foi a utilizada no experimento 1 (0,1mM de IPTG e 0µg/mL de
canamicina). Utilizando esta condição é possível reduzir 10 vezes a concentração de
indutor e retirar a canamicina do sistema, apresentando elevada concentração de
proteína e crescimento celular, e ainda mantendo a estabilidade plasmidial em níveis
que não prejudiquem a produção da proteína recombinante nas 4 horas de expressão.
82
4.3.5.1 Validação da condição otimizada pelo planejamento de experimentos -
Estudo da cinética de produção da proteína e segregação plasmidial.
Para validar a condição otimizada pelo planejamento foram realizadas 5 réplicas
de cultivos nesta condição. Foram realizados 5 experimentos (induzidos com 0,1 mM
IPTG e 0 µg/mL canamicina), denominados A, B, C, D e E. Além destes experimentos
também foi realizado um cultivo nas mesmas condições, no entanto, utilizando a cepa
transformada apenas com o vetor pET28b (sem o gene), como controle negativo,
denominado experimento N. Os cultivos foram realizados até atingirem fase
exponencial de crescimento (Abs
600nm
aproximadamente 0,7) e então induzidos com 0,1
mM de IPTG. A partir deste ponto foram retiradas amostras de hora em hora para as
análises, até o término das 4 horas de indução. Os experimentos A, B, C, D, E e N (sem
o gene) foram analisados quanto ao crescimento celular (massa seca de células -
mg/mL) e quanto à produção de proteína recombinante ao longo do tempo. Para a
análise de segregação plasmidial foram utilizados apenas os experimentos B, D, E e
N (sem o gene), isto porque esta é uma análise mais demorada.
Os resultados dos crescimentos celulares das réplicas são mostrados na tabela
4.9. O crescimento celular médio (expresso em massa seca de células – mg/mL) obtido
nestas réplicas foi 0,91mg de células/mL ao final das 4 horas de indução, com desvio
padrão relativo de 13%, o que está de acordo com o valor obtido no experimento 1 do
planejamento fatorial. O crescimento celular também foi acompanhado durante todo o
tempo de cultivo e o gráfico da cinética do crescimento celular é mostrado na figura
4.15.
Tabela 4.9 Crescimento celular dos experimentos de validação do planejamento fatorial
Tempo de
cultivo
(minutos)
Tempo de
indução
(horas)
Exp. A
Massa seca
de células
(mg/mL)
Exp. B
Massa seca
de células
(mg/mL)
Exp. C
Massa seca
de células
(mg/mL)
Exp. D
Massa seca
de células
(mg/mL)
Exp. E
Massa seca
de células
(mg/mL)
0 - 0,020 0,027 0,019 0,023 0,025
122 0 0,211 0,219 0,191 0,204 0,202
182 1 0,603 0,681 0,531 0,434 0,451
242 2 0,753 0,841 0,772 0,697 0,769
302 3 0,758 1,065 0,791 0,825 0,880
362 4 0,794 1,121 0,927 0,858 0,863
83
A figura 4.15 mostra o gráfico de concentração de células (em massa seca de
células - mg/mL) em função do tempo de cultivo dos experimentos do ponto otimizado
e do crescimento utilizando a cepa E. coli BL21 Star (DE3) apenas com o vetor pET28b
sem o gene (experimento N – controle negativo). Pode-se perceber, que após 2 horas de
indução (242 minutos de cultivo), as células começam a chegar à fase estacionária de
crescimento. Alguns autores afirmam que quando são utilizados sistemas com
promotores fortes, como é o caso do promotor T7, ao induzir o sistema, a taxa de
crescimento diminui devido à sobrecarga do metabolismo da célula hospedeira
(TOKSOY et al., 2002). Já o experimento N apresentou um crescimento um pouco
menor que os demais. Este crescimento menor pode representar os mesmos números
que os demais devido aos erros presentes no experimento, já que o experimento N foi
realizado apenas uma vez e não foi possível mensurar a magnitude do erro associado a
ele. No entanto, levando em consideração o erro de 13% presente nos últimos pontos
das réplicas e supondo um erro de 13% também no experimento N, poder-se-ia dizer
que estatisticamente as duas curvas de crescimento são similares.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 100 200 300 400
Concentração de células
(mg/mL)
Tempo de cultivo (minutos)
Média da conc. de células
dos experimentos de
validação
Conc. de células do Exp. N
(vetor sem o gene)
Figura 4.15 Cinética de crescimento celular das réplicas da condição otimizada, experimentos A, B, C, D
e E, e do experimento N (controle negativo). A seta mostra o ponto em que foi adicionado o indutor
IPTG.
A velocidade específica de crescimento (µ) nestes experimentos foi calculada a
partir da equação de conservação de biomassa (X) para processos em batelada (1).
84
µ
⋅= X
dt
dX
(1)
Integrando a equação (1) de
X
0
a
X
e de
0
a
t
, sendo
X
0
a massa seca de células no
tempo de indução da expressão (
t
=0), e logo após, aplicando logaritmo natural nos dois
lados da igualdade da equação resultante, obteve-se a equação (2).
tXX
⋅=
µ
)/ln(
0
(2)
Utilizando a equação (2) e realizando ajuste linear dos pontos durante a fase
exponencial de crescimento a partir da indução da expressão (Figura 4.16), obteve-se a
velocidade específica de crescimento.
ln(X/X0) = 0,7204.t
R² = 0,9182
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 0,5 1 1,5 2 2,5
ln (X/X0)
Tempo de cultivo após a indução (horas)
Figura
4.16 Ajuste linear dos pontos durante a fase exponencial de crescimento celular a partir da
indução da expressão. Cálculo da velocidade específica de crescimento de E. coli durante a expressão da
proteína ClpP.
A velocidade específica de crescimento obtida neste trabalho foi de 0,72 h
-1
e o
tempo de geração de 0,96 horas. ALMEIDA (2001) obteve em seu trabalho velocidade
específica de crescimento de
E. coli,
durante a expressão da proteína heteróloga, de
aproximadamente 0,5 h
-1
. Estes valores são inferiores às taxas de crescimento descritas
para cepas selvagens de
E. coli
. Como discutido na literatura (TOKSOY
et al
., 2002), a
85
diminuição da taxa de crescimento está relacionada à sobrecarga metabólica imposta à
célula hospedeira pela expressão da proteína heteróloga.
Também foram analisadas as quantidades da proteína ClpP produzida ao longo
do cultivo, nas cinco réplicas do ponto otimizado pelo planejamento. As concentrações
de proteína de cada uma das réplicas são mostradas na tabela 4.10.
Tabela 4.10 Concentração de ClpP recombinante produzida ao longo das 4 horas de expressão nos
experimentos da validação.
Exp. A Exp. B Exp. C Exp. D Exp. E
Tempo de
indução
(horas)
Conc. ClpP
(mg/L)
Conc. ClpP
(mg/L)
Conc. ClpP
(mg/L)
Conc. ClpP
(mg/L)
Conc. ClpP
(mg/L)
0* 0 0 0 0 0
1 105,4 134,3 102,7 107,7 107,4
2 190,3 256,6 201,2 225,2 221,6
3 235,4 273,6 238,3 266,8 300,9
4 238,3 306,6 321,1 270,6 335,7
* Instante em que ocorre a adição do indutor
A média de proteína expressa nos experimentos, de aproximadamente 294mg/L,
apresentou concentração um pouco mais elevada que a obtida no experimento 1 do
planejamento fatorial. No entanto, levando em consideração os erros associados às
medidas de densitometria que variaram entre 10 e 13 % nestes experimentos e o erro
estimado em 8% do experimento 1 do planejamento, pode-se afirmar que os valores
obtidos na validação são similares aos do planejamento. Na figura 4.17 é mostrado o
gráfico da média da concentração da proteína nos experimentos da validação em função
do tempo de expressão.
86
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 1 2 3 4 5
Concentração de ClpP (mg/L)
Tempo de cultivo após a indução (horas)
Figura 4.17 Cinética da produção de proteína. Os quadrados representam a concentração média de ClpP
ao longo do tempo utilizando a condição otimizada pelo planejamento de experimentos (0,1mM IPTG e
0µg/mL). As barras representam os desvios padrões nos pontos do experimento na condição otimizada.
Pode-se perceber que após a segunda hora de indução a taxa de produção de
proteína começa a diminuir e se aproxima de uma fase estacionária na quarta hora de
indução. Pode-se concluir que tempos de expressão mais longos não seriam vantajosos
já que a concentração de proteína se manteria constante, reduzindo a produtividade do
processo.
Através da razão entre a concentração de proteína e a massa seca de células,
pode-se calcular o fator de rendimento Y
P/X
(produção de produto por célula) ao longo
do tempo de indução. Estes dados são mostrados na tabela 4.11. É possível perceber
que, após a segunda hora de indução, o rendimento não aumenta mais na mesma
proporção, indicando mais uma vez que tempos mais longos de expressão não seriam
tão vantajosos.
Tabela 4.11 Fatores de rendimento (Y
P/X
) ao longo do tempo de indução
Tempo de indução
(horas)
Média da
Concentração de ClpP
(mg/L)
Média da Massa
seca de células
(mg/mL)
(Y
P/X
)
Fator de rendimento
(mg ClpP/mg célula)
0* 0 0,21 -
1 111,5 0,54 0,21
2 219,0 0,77 0,29
3 263,0 0,86 0,30
4 294,5 0,91 0,32
* Instante em que ocorre a adição do indutor
87
Outra análise realizada foi o estudo de segregação plasmidial dos cultivos ao
longo do tempo a partir da indução. A figura 4.18 mostra o gráfico da variável
F
(fração
de células com plasmídeo) em função do tempo de cultivo. Em 4 horas de expressão a
segregação média chega a níveis de 50 %, o que está de acordo com a segregação obtida
no experimento 1 do planejamento fatorial. No gráfico também é mostrada a segregação
ocorrida no experimento N, utilizando a cepa transformada apenas com o vetor. Este
experimento foi realizado com o objetivo de verificar se o gene poderia interferir na
segregação. Os valores de
F
obtidos no experimento N foram um pouco superiores aos
valores obtidos nas réplicas da validação, no entanto, devido aos erros em alguns
pontos, é difícil afirmar que o gene pode influenciar na segregação, já que o
experimento foi realizado sem réplicas. Para poder avaliar a influência do gene na
segregação, novas análises precisam ser realizadas, no mínimo em triplicata, para
conseguir mensurar a magnitude dos erros presentes.
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0 1 2 3 4 5
F(fração de células com plasmídeo)
Tempo de cultivo após a indução (horas)
Média do valor F
dos experimentos B,
D e E
Valores de F do
Experimento N
(vetor sem o gene)
Figura 4.18 Gráfico da variável F (fração de células com plasmídeo) em função do tempo.
Os valores de estabilidade plasmidial obtidos em todos os experimentos,
juntamente com suas médias e desvios padrão, podem ser visualizados na tabela 4.12.
88
Tabela 4.12 Valores da variável F (fração de células com plasmídeo) ao longo do tempo nas réplicas dos
experimentos da validação
Tempo (h) F (Exp. B) F (Exp. D) F (Exp. E) Média
Desvio
Padrão
0* 1,24 0,88 0,82 0,98 0,23
1 1,10 0,79 0,84 0,91 0,17
2 0,40 1,20 0,66 0,75 0,41
3 0,31 0,63 0,89 0,61 0,29
4 0,50 0,47 0,44 0,47 0,03
* Instante em que ocorre a adição do indutor
Os valores de
F
obtidos são similares aos obtidos por SUNITHA
et al.
(2000)
em seu trabalho expressando uma fitase e também utilizando um vetor da série pET.
Neste trabalho os autores relatam que depois da indução os níveis de estabilidade
caíram para 10% em 4 horas. Os autores ainda relatam que, antes da indução, o
plasmídeo foi estável por mais de 96h; no entanto, após a indução, o plasmídeo
começou a apresentar segregação. TOMAZETTO
et al
. (2007) também mostraram que
o vetor pET101 apresenta maior estabilidade em cultivos não induzidos. A maior
instabilidade depois da indução pode ser atribuída ao fato de que ao induzir a expressão
da proteína recombinante o metabolismo celular fica sobrecarregado, aumentando os
níveis de segregação. Neste mesmo trabalho (TOMAZETTO
et al
. 2007), foi
demonstrado que induzindo um sistema com lactose, a estabilidade plasmidial também
é baixa, chegando a cerca de 30% quando o pH não é controlado e cerca de 60%
mantendo o pH em 7,0, ao final de 4 horas. Estes números também indicam que o pH
pode estar influenciando na baixa estabilidade obtida neste trabalho, já que o pH dos
cultivos não foi mantido constante. Nos experimentos de validação da condição
otimizada pelo planejamento fatorial, os cultivos apresentaram pH inicial igual a 7,0 e,
após as 4 horas de expressão, apresentaram pH em torno de 5,1. Como já discutido
anteriormente, alguns autores ainda apontam o IPTG como um fator que aumenta a
segregação plasmidial (FRIEHS, 2004). No entanto, outros fatores podem ainda ser
associados à baixa estabilidade plasmidial encontrada nestes cultivos. Ainda segundo
FRIEHS (2004), a diminuição do oxigênio dissolvido pode diminuir a estabilidade
plasmidial. Como os experimentos foram conduzidos em frascos agitados e neles não se
tem o controle do oxigênio dissolvido no meio, esta pode ser uma das causas para os
89
altos níveis de segregação encontrados ao longo do cultivo. Para controlar os níveis de
aeração, pH, assim como monitorar outras variáveis de processo, bioreatores devem ser
empregados.
Outros trabalhos ainda mostram que a composição da construção do vetor e os
promotores utilizados podem influenciar muito a segregação. TOKSOY
et al
. (2002)
obtiveram níveis de estabilidade plasmidial de 80, 72 e 0,1% ao final de 4 horas de
indução, variando as construções (plasmídeo/gene) e plasmídeos utilizados, sendo que o
plasmídeo, derivado do vetor pET28a sob controle do promotor T7, foi o que
apresentou maior estabilidade.
Além dos fatores apresentados, muitos outros são envolvidos nos níveis de
estabilidade plasmidial. Segundo GUPTA
et al.
(1995), meios de cultura mais
complexos levam à diminuição da estabilidade plasmidial. Outros fatores que podem
afetar a estabilidade são: taxa de crescimento, número de cópias do plasmídeo, tamanho
do inserto e nível de expressão da proteína recombinante (GUPTA
et al.
, 1995). O vetor
utilizado neste trabalho, pET28b, segundo SILVA (2005) apresenta de 15 a 20 cópias
por célula, sendo um plasmídeo de médio a alto número de cópias (FRIEHS, 2004;
SCHUMANN E FERREIRA, 2004), o que seria positivo para manter pelo menos 1
plasmídeo em cada célula após a divisão celular (FRIEHS, 2004).
Na figura 4.19 é mostrado o gráfico do fator de rendimento (Y
P/X
) e da fração de
células com plasmídeo (
F
) em função do tempo. Como esperado, à medida que a
segregação aumenta, a taxa de formação de produto por massa de célula diminui e o
fator de rendimento (Y
P/X
) se aproxima de um estado estacionário. O fator de
rendimento, mesmo a uma taxa mais lenta, ainda mostra um aumento nas últimas 2
horas de expressão. Isto pode ocorrer devido a um aumento da produção da proteína
pelas células que ainda possuem plasmídeo. Provavelmente, o fator de rendimento
começaria a diminuir nos próximos pontos, depois das 4 horas de indução. Em seus
estudos, expressando fitase em
E. coli
, SUNITHA
et al
. (2000) mostraram que nas duas
primeiras horas da indução a produção de fitase aumenta de 0 até 800 U/L enquanto a
estabilidade plasmidial diminui para 60% neste período, ou seja, mesmo com
segregação de 40% a produção de fitase continua aumentando. Em duas horas e meia de
90
indução, a produção de fitase aumenta ainda mais, para 1000 U/L, enquanto a
segregação aumenta para 80%, e só após este ponto é que a atividade de fitase começa a
diminuir. Como mostrado na figura 4.19, em quatro horas de indução, a segregação
ainda estava em torno de 55%, e o fator de rendimento ainda estava aumentando. No
entanto, assim como mostrado por SUNITHA
et al
. (2000), quando a segregação
atingisse níveis ainda maiores, o fator de rendimento começaria a diminuir, o que
provavelmente seria visualizado nas próximas horas de indução, se o cultivo tivesse
sido mantido por mais de 4 horas de indução.
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0 1 2 3 4 5
F (fração de células com plasmídeo)
Y
P/X
(mg de ClpP/mg de célula)
Tempo de cultivo após a indução (horas)
Yp/x -Fator de
rendimento
F(fração de
células com
plasmídeo)
Figura 4.19 Gráfico do Fator de rendimento de massa de ClpP produzida por massa de célula (Y
P/X
) e da
Fração de células com plasmídeo (F) em função do tempo.
4.3.6 Purificação
Ensaios preliminares foram realizados para purificação da proteína expressa
fusionada à cauda de histidina, utilizando cromatografia de afinidade, empregando
coluna empacotada com resina contendo íons de níquel imobilizados. A proteína,
quando fusionada a uma cauda de histidina, tem sua purificação facilitada, pois interage
de forma pseudo-específica com ligantes metálicos, como o níquel (LARENTIS
et al
.,
2006). Alguns trabalhos já expressaram a proteína ClpP fusionada à cauda de histidina e
esta proteína fusionada foi testada contra células rompidas de
S. pneumoniae
em
Western blot
, mostrando especificidade para os antígenos protéicos (KWON
et al
.,
91
2004; CAO
et al
., 2007). Estes dados indicam que a princípio a cauda de histidina não
influencia na estrutura da proteína, mantendo o reconhecimento da mesma pelos
antígenos protéicos.
A solução tampão utilizada na purificação, tanto para o rompimento celular
quanto para o equilíbrio e eluição da coluna, foi a solução 20 mM Tris/1 mM EDTA.
Primeiramente, foram utilizadas para a purificação soluções tampão com 20 mM e
5 mM de imidazol, para equilibrar a coluna e fazer o rompimento celular das amostras a
serem purificadas. No entanto, ao passar as amostras pela coluna, uma grande
quantidade da proteína de interesse não foi adsorvida na coluna (fração não adsorvida).
Isto pode ter ocorrido devido à proteína estar enovelada de tal forma que a cauda de
histidina não esteja exposta na superfície, impedindo a sua ligação com o níquel. Por
isso, foram feitos novos testes, utilizando uma amostra lisada com solução tampão sem
imidazol, mas com 1 mM de DTT, e outra lisada com solução tampão com 1 mM de
imidazol e 1 mM de DTT. O imidazol compete com as proteínas pela ligação com o
metal (neste caso o níquel), logo, o próprio imidazol pode ter prejudicado a ligação da
ClpP à coluna. A coluna com as proteínas adsorvidas foi eluída com solução tampão em
gradiente de 0-500 mM de imidazol. As análises desta purificação foram feitas em SDS-
PAGE (Figura 4.20).
30kDa
20,1kDa
M 1
2
3
4
5
6
7 8 9
45kDa
66kDa
97kDa
Figura 4.20 Gel de SDS-PAGE 12,5% da purificação da proteína ClpP. M, padrão de massa molar LMW
(Amersham Bioscience); 1, extrato celular total lisado; 2, fração não adsorvida (amostra sem imidazol); 3;
eluído com a primeira concentração de imidazol (amostra sem imidazol), 4, eluído com 220 mM de
imidazol (amostra sem imidazol); 5, eluído com 300 mM de imidazol (amostra sem imidazol); 6, fração
não adsorvida (amostra com 1mM de imidazol); 7, eluído com a primeira concentração de imidazol
(amostra com 1 mM de imidazol); 8, eluído com 220 mM de imidazol (amostra com 1mM de imidazol);
9, eluído com 300 mM de imidazol (amostra com 1 mM de imidazol).
92
A proteína ClpP foi eluída com cerca de 220 a 300mM de imidazol. Como pode
ser visualizado na figura 4.20, foram obtidas frações da proteína ClpP com mais de 98%
de pureza, já que praticamente não existem bandas de outras proteínas, segundo as
análises de densitometria do gel. Futuros estudos podem ser realizados para a
determinação do rendimento da purificação e para melhorar a fração purificada.
A proteína purificada foi submetida à diálise contra tampão PBS para retirada de
imidazol, sendo verificada precipitação da ClpP no processo de diálise. A proteína
purificada se mostrou estável por aproximadamente 7 meses, armazenada a -20ºC. A
figura 4.21 apresenta o gel de poliacrilamida a 12,5% com a amostra da proteína
purificada e desta mesma amostra armazenada por sete meses a -20ºC. Nesta figura é
possível visualizar a banda íntegra da proteína ClpP.
(A)
(B)
M 1 2
M
12
3
30kDa
20,1kDa
45kDa
66kDa
97kDa
30kDa
20,1kDa
45kDa
66kDa
97kDa
14,4kDa
Figura 4.21 Gel de SDS-PAGE 12,5% do teste de estabilidade da proteína. (A) gel das amostras logo
após a purificação; M, padrão de massa molar LMW (Amersham Bioscience); 1 e 2, amostras de ClpP
purificada. (B) gel das amostras armazenadas a -20ºC durante 7 meses após a purificação; M, padrão de
massa molar LMW (Amersham Bioscience); 1, 2, e 3, amostras de ClpP purificadas e armazenadas a -
20ºC por 7 meses.
93
4.4 Clonagem e expressão utilizando Bacillus subtilis como sistema de expressão
4.4.1 Caracterização da cepa
Bacillus subtilis
WB600
A cepa de
Bacillus subtilis
WB600 (WU
et al
., 1991) empregada neste trabalho,
deficiente de 6 proteases extracelulares, foi caracterizada, quanto ao gênero e à espécie,
em parceria com o Laboratório de Fisiologia Bacteriana (LFB) e Coleção de Culturas do
Gênero
Bacillus
e Gêneros Correlatos (CCGB) do Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ.
As colônias da cepa
Bacillus subtilis
WB600 em meio LB ágar apresentaram-se
irregulares e opacas, o que está de acordo com a morfologia das colônias de
B. subtilis
(SNEATH e BERGEY, 1986). As células se mostraram gram-positivas e nas lâminas a
fresco também apresentaram a morfologia celular esperada para
B. subtilis
. Foram
também realizados testes bioquímicos com a cepa
Bacillus subtilis
WB600 e com a cepa
Bacillus subtilis
LFB732 (utilizada para comparação). Os resultados dos testes
bioquímicos, exceto os realizados através do sistema de identificação Api 50 CHB
(Biomerieux), são mostrados na tabela 4.13. As diferenças nos resultados de 3 testes
bioquímicos da cepa WB 600, quando comparados aos resultados da cepa LFB732,
provavelmente se devem à ausência na cepa WB600 de seis das principais proteases
extracelulares de
B. subtilis
. No entanto, os testes bioquímicos, de acordo com
SNEATH e BERGEY (1986), e também o teste feito com o sistema
de identificação
Api 50 CHB, caracterizaram que a cepa WB600 é de
Bacillus subtilis
.
94
Tabela 4.13 Resultado dos testes bioquímicos realizados com as cepas Bacillus subtilis WB600 e
Bacillus subtilis LFB732 (utilizada para comparação).
Testes Bioquímicos B. subtilis WB600 B. subtilis LFB732
Amido + +
Caseína - +
Tirosina - -
Gelatina - +
Lectinase - -
β-Hemólise em ágar - -
Uréia - -
Citrato - +
VP + +
Glicose + +
Arabinose - -
Xylose - -
Nitrato + +
NaCl 5% + +
NaCl 7% + +
NaCl 10% - -
4.4.2 Clonagem
A fim de obter um sistema que fosse capaz de expressar a proteína ClpP
extracelularmente,
Bacillus subtilis
foi escolhido como hospedeiro para clonar e
expressar a proteína. Este microrganismo, que também tem sido utilizado como sistema
de expressão de proteínas de uso farmacológico e imunológico, é atrativo por algumas
razões, como secretar as proteínas diretamente no meio de cultura, ser considerado
GRAS (
generally regarded as safe
), produzir esporos (facilitando a preservação das
cepas) e ter habilidade de crescer e expressar as proteínas em meios baratos
(FERREIRA
et al
., 2005). Para tanto o gene
clpP
foi sintetizado quimicamente
fusionado a um peptídeo sinal, para a expressão extracelular da proteína. O gene
sintético utilizou como base a mesma seqüência obtida no seqüenciamento do vetor
pET28b/
clpP
-C2P, clone positivo de
E. coli
obtido neste trabalho, incluindo a cauda de
histidina. Ao gene sintético ainda foram adicionados uma seqüência sinalizadora e um
sítio de clivagem entre esta seqüência e o gene. Além disso, o gene sintético utilizado
ainda teve seus
códons
otimizados. A otimização foi realizada levando em
95
consideração: a freqüência de códons utilizados em
B. subtilis
(alterando os códons com
freqüência menor que 15%) e a formação de fortes estruturas secundárias, alterando os
códons para evitar este problema. Na figura 4.22 é mostrado um alinhamento múltiplo
do gene
clpP
sintético antes e depois da otimização de códons. As freqüências em que
os códons ocorrem em
B. subtilis
, tanto para o gene sem otimização quanto para o gene
otimizado, são mostradas no apêndice C. O gene sintético com códons otimizados foi
inserido no vetor pBSK com marcador de resistência à ampicilina.
Figura 4.22 Alinhamento múltiplo do gene clpP sintético utilizado para a clonagem em B. subtilis, sem a
otimização de códons (submetido) e otimizado. Em verde são mostrados os nucleotídeos que sofreram
alterações no gene otimizado. A seqüência do peptídeo sinal está realçada em amarelo. A seqüência do
sítio de clivagem está sublinhada.
96
Para a construção do vetor foram realizadas reações de digestão com o vetor
pBSKClpP717, para a liberação do inserto, e com o vetor pHCMC03, para a
linearização do vetor. As reações de digestão foram visualizadas em gel de agarose
(Figura 4.23). Foram obtidas bandas nos tamanhos esperados tanto do inserto, 717pb,
quanto do vetor pHCMC03 linearizado. As bandas correspondentes ao inserto (gene
clpP
) e ao vetor linearizado foram purificadas e novamente visualizadas em gel de
agarose (Figura 4.23). Foram obtidos fragmentos nos tamanhos esperados.
750kb
6000kb
3000kb
1
M
2 3 4 5
(A)
6
750kb
6000kb
3000kb
1
M
2 3 4 5
(B)
6
Figura 4.23 (A) gel de agarose 1% das digestão dos vetores pBSKClpP717 e pHCMC03. M, marcador
padrão de tamanho de fragmento 1kb DNA ladder; 1, vetor pBSKclpP717; 2 e 3, vetor pBSKclpP717
digerido com as enzimas BamHI e XbaI; 4, vetor pHCMC03; 5 e 6, vetor pHCMC03 digerido com as
enzimas BamHI e XbaI. (B) gel de agarose 1% das purificações das digestões. M, marcador padrão de
tamanho de fragmento 1kb DNA ladder; 1, vetor pBSKclpP717; 2, inserto (clpP) digerido e purificado; 3,
vetor pHCMC03; 4, 5 e 6 vetor pHCMC03 linearizado e purificado.
A reação de ligação foi realizada, utilizando o gene e o vetor digeridos e
purificados, através da enzima T4 DNA ligase. O vetor construído nesta ligação foi
transformado por choque térmico em
E. coli
JM109 competente. Não foram obtidas
colônias transformantes, nem mesmo no controle negativo (reação de ligação apenas
com o vetor). As reações de ligação foram realizadas em algumas condições diferentes e
mesmo assim não se obteve êxito nas transformações. Algumas possibilidades são
levantadas, como o fato de o vetor utilizado não ser um vetor comercial e poder não ter
todos os mecanismos necessários para se manter linearizado. Além disso, após a
97
digestão, o vetor pode ter formado alças e mantido a conformação enovelada,
dificultando a ligação com o inserto. A instabilidade estrutural dos plasmídeos tem sido
citada em trabalhos como o motivo pela falta de sucesso na utilização de
B. subtilis
como sistema de expressão (LI
et al
., 2004; NGUYEN
et al
., 2005).
98
5 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
O gene clpP foi clonado em E. coli, utilizando o vetor pET28b (Novagen), sendo
que a proteína foi expressa de forma eficiente, em altos níveis e de forma solúvel. Além
de E. coli, objetivou-se o emprego de B. subtilis como sistema de expressão, utilizando
para esta clonagem o vetor pHCMC03 (NGUYEN et al., 2005), no entanto, não foram
obtidas células recombinantes para este sistema de expressão. Uma das possibilidades
levantadas para a falta de êxito nesta clonagem, é o fato de o vetor utilizado
(pHCMC03) não ser comercial e poder não ter todos os mecanismos necessários para se
manter linearizado ou ter sofrido algum tipo de mutação ou deleção em sua seqüência,
causada por uma instabilidade estrutural. Como mencionado no capítulo de discussão, a
instabilidade estrutural dos plasmídeos tem sido um dos obstáculos na utilização de B.
subtilis como sistema de expressão (LI et al., 2004; NGUYEN et al., 2005).
Quando se trata de E. coli como sistema de expressão se pode dizer que existem
várias ferramentas genéticas, bem desenvolvidas, sendo comercializadas. São
encontrados vetores e cepas com as mais diversas especificações, para serem utilizados
de acordo com a proteína a ser produzida e o processo utilizado. Mesmo este sistema
ainda apresentando algumas limitações, como a produção da proteína heteróloga muitas
vezes em forma de agregados insolúveis, ainda é o mais atraente do ponto de vista da
eficiência e facilidade da obtenção da proteína recombinante, e também dos
conhecimentos adquiridos e técnicas disponíveis para o uso deste sistema. Já a
utilização de B. subtilis como sistema de expressão pode ser dificultada, pois apesar de
ser citado na literatura como um sistema atrativo por secretar as proteínas diretamente
no meio de cultura, ser considerado GRAS (generally regarded as safe), produzir
esporos facilitando a preservação das cepas e ter habilidade de crescer e expressar as
proteínas em meios baratos (FERREIRA et al., 2005), este sistema ainda apresenta
algumas falhas e precisa ser melhor estudado e desenvolvido. Apesar de já existirem
cepas para serem utilizadas na expressão de proteínas recombinantes, estas ainda
precisam ser aprimoradas e estarem disponíveis comercialmente, além disso, os vetores
precisam ser desenvolvidos para serem mais estáveis e de fácil utilização.
99
Através de planejamento de experimentos, a expressão da proteína ClpP em
E. coli foi otimizada, variando a concentração de indutor (IPTG) e canamicina. Nestes
experimentos foram estudados o crescimento celular, a produção de proteína e a
estabilidade plasmidial. A proteína foi expressa, de forma solúvel, em níveis similares
em todos os experimentos do planejamento fatorial, sendo que a média de proteína
expressa no ponto central foi de 240,4 ± 19,7 mg/L de ClpP com desvio padrão relativo
de 8%. As concentrações de IPTG e canamicina não apresentaram efeito significativo
sobre a concentração de proteína expressa. Apesar da concentração de proteína variar
muito dependendo da proteína que está sendo expressa, a concentração de proteína
expressa neste trabalho está dentro da faixa de concentração obtida por outros trabalhos
que otimizaram a expressão de outras proteínas em cultivos batelada em frascos
agitados (CHOI et al., 2006; MALDONADO et al., 2007; CHUAN et al., 2008; HAN
et al., 2008). Para aumentar os níveis de expressão em termos de g/L o cultivo precisa
ser feito em bioreatores, pois as variáveis do processo precisam ser bem controladas e o
regime de operação do cultivo precisa ser estudado, o que seria alvo para novos estudos.
Também no planejamento de experimentos, nos experimentos do ponto central, obteve-
se média de 0,75 ± 0,02 mg/mL de massa seca de células com desvio padrão relativo de
2,5%, já a fração de células com plasmídio (F) apresentou média de 0,08 ± 0,03 com
desvio padrão relativo de 36% ao final das 4 horas de expressão. O IPTG mostrou efeito
negativo sobre o crescimento celular e sobre a estabilidade plasmidial, enquanto a
canamicina não apresentou efeito significativo sobre nenhuma destas duas variáveis. O
ponto otimizado do sistema foi obtido nas condições de 0,1mM de IPTG e 0µg/mL de
canamicina, apresentando concentração da proteína ClpP de 247,3 mg/L, crescimento
celular de 0,91 mg/mL de massa seca de células e fração de células com plasmídeo (F)
de 0,44. Com isso foi possível concluir, dentro das condições e faixas estudadas, que é
possível diminuir em 10 vezes a concentração de indutor e retirar o antibiótico do
sistema, mantendo a expressão da proteína em níveis similares e reduzindo custos de
processo.
Durante os experimentos do planejamento fatorial, a estabilidade plasmidial foi
estudada. A estabilidade plasmidial é um dos pontos mais importantes do processo
recombinante, já que o plasmídeo é o ponto chave para a produção da proteína
heteróloga. Os estudos encontrados na literatura nesta área de estabilidade plasmidial,
100
muitas vezes são contraditórios, possivelmente devido aos altos erros experimentais
associados às técnicas experimentais empregadas. Além disso, a dificuldade de
encontrar artigos sobre o assunto, principalmente atuais, e que expliquem o problema da
segregação com maior detalhamento e profundidade, é grande, indicando a necessidade
de maiores estudos nesta área. Através do estudo de segregação plasmidial realizado
neste trabalho, foi possível inferir que ocorre perda do plasmídeo mesmo nas
concentrações padrão empregadas de antibiótico. A perda de plasmídeo é reduzida em
concentrações mais baixas de IPTG, sendo que no ponto otimizado pelo planejamento
de experimento, quando os estudos foram realizados ao longo do tempo, a estabilidade
plasmidial atinge média de 47% em 4 horas de indução. Novos estudos precisam ser
realizados para a determinação da concentração ótima de IPTG, a concentração mínima
possível, onde se consiga o máximo de estabilidade plasmidial e de proteína expressa.
Outra possibilidade é o estudo da estabilidade plasmidial utilizando temperaturas mais
baixas para a expressão da proteína. Além disso, para melhorar os níveis de estabilidade
plasmidial e possivelmente aumentar a concentração de proteína produzida, todas as
variáveis descritas como as que influenciam na perda do plasmídeo, precisam ser
estudadas ao mesmo tempo. Para tanto ferramentas de planejamento experimental,
como os planejamentos fracionados e os delineamentos de Plackett e Burman, podem
ser fundamentais permitindo avaliar todas as variáveis ao mesmo tempo, selecionando
as realmente significativas (RODRIGUES E IEMMA, 2005). Outra ferramenta que se
torna importante para a maximização da produção de proteína e estabilidade plasmidial,
assim como para determinar as condições ideais do processo em bioreator, é a
modelagem matemática do processo e simulação.
A proteína expressa, fusionada a uma cauda de histidina, foi purificada por
cromatografia de afinidade de forma eficiente, utilizando resina com íons de níquel
imobilizados. A princípio a cauda de histidina não modifica a conformação da proteína,
conforme dados obtidos na literatura (KWON et al., 2004; CAO et al., 2007). A
proteína foi purificada com mais de 98% da proteína na fração purificada em gradiente
de concentração de imidazol. Novos estudos poderiam ser realizados empregando
eluição com pulsos de imidazol e também para determinar o rendimento da purificação.
101
APÊNDICE A
Apêndice A.1 – Seqüência do plasmídeo pBSKClpP717
LOCUS GS44387 pBSK Clp717 3580 bp DNA CIRCULAR SYN 31-MAY-2009
DEFINITION Ligation of Clp717 into pGS1/SmaI
ACCESSION GS44387 pBSK Clp717
KEYWORDS .
SOURCE Unknown.
ORGANISM Unknown
Unclassified.
REFERENCE 1 (bases 1 to 3580)
AUTHORS Self
JOURNAL Unpublished.
COMMENT SECID/File created by SciEd Central, Scientific & Educational Software
FEATURES Location/Qualifiers
CDS 21..327
/gene="f1 origin"
misc_feature 600..643
/gene="T7/M13F"
CDS complement (460..615)
/gene="LacZ"
CDS 653..1369
/gene="Clp717"
misc_feature complement (1391..1447)
/gene="T3/M13R"
/product="T3 primer"
misc_feature 1777..2444
/gene="pUC origin"
CDS complement (2595..3452)
/gene="Ampcillin"
BASE COUNT 899 a 872 c 882 g 927 t
ORIGIN
1 CTGACGCGCC CTGTAGCGGC GCATTAAGCG CGGCGGGTGT GGTGGTTACG CGCAGCGTGA
61 CCGCTACACT TGCCAGCGCC CTAGCGCCCG CTCCTTTCGC TTTCTTCCCT TCCTTTCTCG
121 CCACGTTCGC CGGCTTTCCC CGTCAAGCTC TAAATCGGGG GCTCCCTTTA GGGTTCCGAT
181 TTAGTGCTTT ACGGCACCTC GACCCCAAAA AACTTGATTA GGGTGATGGT TCACGTAGTG
241 GGCCATCGCC CTGATAGACG GTTTTTCGCC CTTTGACGTT GGAGTCCACG TTCTTTAATA
301 GTGGACTCTT GTTCCAAACT GGAACAACAC TCAACCCTAT CTCGGTCTAT TCTTTTGATT
361 TATAAGGGAT TTTGCCGATT TCGGCCTATT GGTTAAAAAA TGAGCTGATT TAACAAAAAT
421 TTAACGCGAA TTTTAACAAA ATATTAACGC TTACAATTTG CCATTCGCCA TTCAGGCTGC
481 GCAACTGTTG GGAAGGGCGA TCGGTGCGGG CCTCTTCGCT ATTACGCCAG CTGGCGAAAG
541 GGGGATGTGC TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACGCCAGG GTTTTCCCAG TCACGACGTT
601 GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA GGGCGACCCC ATGGATCCAT
661 GAAGAATATG TCTTGCAAAC TGGTCGTTTC TGTCACACTG TTCTTCAGCT TTCTGACTAT
721 CGGACCGTTA GCGCATGCAG CTGAGTTTAT GGTGCCTGTC GTCATTGAAC AAACATCTCG
781 CGGTGAACGC TCATACGATA TTTATTCTCG TCTGTTGAAA GATCGGATTA TTATGTTAAC
841 GGGGCCGGTG GAAGATAACA TGGCCAACAG CGTTATTGCG CAGTTGCTGT TCCTGGACGC
901 GCAAGATTCT ACGAAAGATA TCTATTTATA TGTGAACACC CCAGGCGGCT CAGTTAGCGC
961 CGGGTTGGCT ATCGTGGACA CCATGAATTT TATCAAGGCC GACGTACAAA CGATTGTAAT
1021 GGGCATGGCT GCCAGCATGG GAACAGTAAT TGCTAGCTCA GGAGCGAAAG GCAAAAGATT
1081 TATGCTTCCT AACGCGGAAT ACATGATCCA TCAGCCGATG GGCGGCACGG GGGGAGGAAC
1141 ACAGCAAACA GACATGGCCA TTGCGGCGGA GCATCTTCTG AAGACAAGAA ATACTTTAGA
1201 AAAGATTCTG GCAGAGAACT CAGGTCAAAG CATGGAGAAA GTTCATGCAG ATGCTGAGCG
1261 TGATAATTGG ATGTCAGCAC AGGAGACACT TGAATATGGC TTTATCGATG AAATCATGGC
1321 AAATAATTCA TTGAATTTGG AACATCATCA TCATCATCAT TAATCTAGAA TCGGGGATAT
1381 CCTCGAGGTT CCCTTTAGTG AGGGTTAATT GCGAGCTTGG CGTAATCATG GTCATAGCTG
1441 TTTCCTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA
1501 AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA
1561 CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC
1621 GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG
1681 CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA
1741 TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC
1801 AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG
1861 CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC
1921 CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC
1981 GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCATAG CTCACGCTGT
2041 AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC
2101 GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA
2161 CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA
102
2221 GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGAACAGTA
2281 TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA
2341 TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG
2401 CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG
2461 TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC
2521 TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT
2581 TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT
2641 CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA
2701 CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA
2761 TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC
2821 GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT
2881 AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT
2941 ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG
3001 TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA
3061 GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA
3121 AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG
3181 CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT
3241 TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG
3301 CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT
3361 ACTTTCACCA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA
3421 ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC
3481 ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA
3541 CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC
103
APÊNDICE B
Apêndice B.1 – Alinhamento Múltiplo de IgA1 protease
10 20 30 40 50 60
| | | | | |
SP195x2 MEKYFGEKQERFSFRKLSVGLVSATISSLFFMSVLASSSVDAQETAGVHYKYVADSELSS
CDC1087_00 MEKYFGEKQERFSFRKLSVGLVSATISSLFFMSVLASSSVDAQETAGVHYKYVADSELSS
G54xxx4 MEKYFGEKQERFSFRKLSVGLVSATISSLFFMSVLASSSVDAQETAGVHYKYVADSELSS
CGSP14 MEKYFGEKQERFSFRKLSVGLVSATISSLFFMSVLASSSVDAQETAGVHYKYVADSELSS
R6xxxx0 MEKYFGEKQERFSFRKLSVGLVSATISSLFFMSVLASSSVDAQETAGVHYKYVADSELSS
70585x1 MEKYFGEKQERFSFRKLSVGLVSATISSLFFMSVLASSSVDAQETAGVHYKYVADSELSS
TIGR4x7 MEKYFGEKQERFSFRKLSVGLVSATISSLFFMSVLASSSVDAQETAGVHYKYVADSELSS
Hungary19A_6 MEKYFGEKQERFSFRKLSVGLVSATISSLFFMSVLASSSVDAQETAGVHYKYVADSELSS
************************************************************
Prim.cons. MEKYFGEKQERFSFRKLSVGLVSATISSLFFMSVLASSSVDAQETAGVHYKYVADSELSS
70 80 90 100 110 120
| | | | | |
SP195x2 EEKKQLVYDIPTYVENDDETYYLVYKLNSQNQLAELPNTGSKNERQALVAGASLAALGIL
CDC1087_00 EEKKQLVYDIPTYVENDDETYYLVYKLNSQNQLAELPNTGSKNEMQALVAGASLATLGIL
G54xxx4 EEKKQLVYDIPTYVENDDETYYLVYKLNSQNQLAELPNTGSKNERQALVAGASLAALGIL
CGSP14 EEKKQLVYDIPTYVENDDETYYLVYKLNSQNQLAELPNTGSKNERQALVAGASLAALGIL
R6xxxx0 EEKKQLVYDIPTYVENDDETYYLVYKLNSQNQLAELPNTGSKNERQALVAGASLAALGIL
70585x1 EEKKQLVYDIPTYVENDDETYYLVYKLNSQSQLAELPNTGSKNEMQALVAGASLAALGIL
TIGR4x7 EEKKQLVYDIPTYVENDDETYYLVYKLNSQNQLAELPNTGSKNERQALVAGASLAAMGIL
Hungary19A_6 EEKKQLVYDIPTYVENDDETYYLVYKLNSQNQLAELPNTGSKNERQALVAGASLAALGIL
******************************.************* **********::***
Prim.cons. EEKKQLVYDIPTYVENDDETYYLVYKLNSQNQLAELPNTGSKNERQALVAGASLAALGIL
130 140 150 160 170 180
| | | | | |
SP195x2 IFAVSKKKVKNKTVLHLVLVAGIGNGVLVSVHALENHLLLNYNTDYELTSGEKLPLPKEI
CDC1087_00 IFAVSKKKVKNKTVLHLVLVAGIGNGVLVSVHALENHLLLNYNTDYELTSGEKLPLPKEI
G54xxx4 IFAVSKKKVKNKTVLHLVLVAGIGNGVLVSVHALENHLLLNYNTDYELTSGEKLPLPKEI
CGSP14 IFAVSKKKVKNKTVLHLVLVAGIGNGVLVSVHALENHLLLNYNTDYELTSGEKLPLPKEI
R6xxxx0 IFAVSKKKVKNKTVLHLVLVAGMGNGVLVSVHALENHLLLNYNTDYELTSGEKLPLPKEI
70585x1 IFAVSKKKVKNKTVLHLVLVAGIGNGVLVSVHALENHLLLNYNTDYKLTSGEKLPLPKDI
TIGR4x7 IFAVSKKKVKNKTVLHLVLVAGIGNGVLVSVHALENHLLLNYNTDYELTSGEKLPLPKEI
Hungary19A_6 IFAVSKKKVKNKTVLHLVLVAGIGNGVLVSVHALENHLLLNYNTDYELTSGEKLPLPKEI
**********************:***********************:***********:*
Prim.cons. IFAVSKKKVKNKTVLHLVLVAGIGNGVLVSVHALENHLLLNYNTDYELTSGEKLPLPKEI
190 200 210 220 230 240
| | | | | |
SP195x2 SGYTYIGYIKEGKTTSESEVSNQKSSVATSTKQQKVDYNVTPNFVDHPSTVQAIQEQTPV
CDC1087_00 SGYTYIGYIKEENITSESEVSNQKSSIVTPTKQQKVDYSVTPNFVDHPSTVQAIQEQTPV
G54xxx4 SGYTYIGYIKEGKTTSDFEVSNQEKSAATPTKQQKVDYNVTPNFVDHPSTVQAIQEQTPV
CGSP14 SGYTYIGYIKEGKTTSDFEVSNQEKSAATPTKQQKVDYNVTPNFVDHPSTVQAIQEQTPV
R6xxxx0 SGYTYIGYIKEGKTTSDFEVSNQEKSAATPTKQQKVDYNVTPNFVDHPSTVQAIQEQTPV
70585x1 SGYTYIGYIKEENITSESEVSNQKSSVATPIKQQKVDYSVTPNFVDHPSTVQAIQEQTPV
TIGR4x7 SGYTYIGYIKEGKTTSESEVSNQKSSVATPTKQQKVDYNVTPNFVDHPSTVQAIQEQTPV
Hungary19A_6 SGYTYIGYIKEGKTTSDFEVSNQEKSAATPTKQQKVDYNVTPNFVDHPSTVQAIQEQTPV
*********** : **: *****:.* .*. *******.*********************
Prim.cons. SGYTYIGYIKEGKTTS22EVSNQ22SAATPTKQQKVDYNVTPNFVDHPSTVQAIQEQTPV
250 260 270 280 290 300
| | | | | |
SP195x2 SSTKPTEVQVVEKPFSTELINPRKEEKQSSDSQEQLAEHKNLETKKEEKISPKEKTGVNT
CDC1087_00 SSTKPTEVQVVEKPFSTELINPRKEEKQSSDSQEQLAEHKNLETKKEEKISPKEKTGVNT
G54xxx4 SSTKPTEVQVVEKPFSTELINPRKEEKQSSDSQEQLAEHKNLETKKEEKISPKEKTGVNT
CGSP14 SSTKPTEVQVVEKPFSTKLINPRKEEKQSSDSQEQLAEHKNLETKKEEKISPKEKTGVNT
R6xxxx0 SSTKPTEVQVVEKPFSTELINPRKEEKQSSDSQEQLAEHKNLETKKEEKISPKEKTGVNT
70585x1 SSTKPTEVQVVEKPFSTELINPRKEEKQSSDSQEQLAEHKNLETKKEEKISPKEKTGVNT
TIGR4x7 SSTKPTEVQVVEKPFSTELINPRKEEKQSSDSQEQLAEHKNLETKKEEKISPKEKTGVNT
Hungary19A_6 SSTKPTEVQVVEKPFSTELINPRKEEKQSSDSQEQLAEHKNLETKKEEKISPKEKTGVNT
*****************:******************************************
Prim.cons. SSTKPTEVQVVEKPFSTELINPRKEEKQSSDSQEQLAEHKNLETKKEEKISPKEKTGVNT
104
310 320 330 340 350 360
| | | | | |
SP195x2 LNPQDEVLSGQLNKPELLYREETIETKIDFQEEIQENPDLAEGTVRVKQEGKLGKKVEIV
CDC1087_00 LNPQDEVLSGQLNKPELLYREETIEIKIDFQEEIQENPDLSEGIVRVKQEGKLGKKVEIV
G54xxx4 LNPQDEVLSGQLNKPELLYREETIETKIDFQEEIQENPDLAEGTVRVKQEGKLGKKVEIV
CGSP14 LNPQDEVLSGQLNKPELLYREETIETKIDFQEETQENPDLAEGTVRVKQEGKLGKKVEIV
R6xxxx0 LNPQDEVLSGQLNKPELLYREETIETKIDFQEEIQENPDLAEGTVRVKQEGKLGKKVEIV
70585x1 LNPQDEVLSGQLNKPELLYREETIETKIDFQEEIQENPDLAEGTVRVKQEGKLGKKVEIV
TIGR4x7 LNPQDEVLSGQLNKPELLYREETMETKIDFQEEIQENPDLAEGTVRVKQEGKLGKKVEIV
Hungary19A_6 LNPQDEVLSGQLNKPELLYREETIEIKIDFQEEIQENPDLVEGIVRVKQEGKLGKKVEIV
***********************:* ******* ****** ** ****************
Prim.cons. LNPQDEVLSGQLNKPELLYREETIETKIDFQEEIQENPDLAEGTVRVKQEGKLGKKVEIV
370 380 390 400 410 420
| | | | | |
SP195x2 RIFSVNKEEVSREIVSTSTTAPSPRIVEKGTKKTQVIKEQPETGVEHKDVQSGAIVEPAI
CDC1087_00 RIFSVNKEEVSREIVSTSTTAPIPRIVEKGTKKTQVIKEQPETGVEHKDVQSGAIVEPTI
G54xxx4 RIFSVNKEEVSREIVSTSTTAPIPRIVEKGTKKTQVIKEQPETGVEHKDVQSGAIVEPAI
CGSP14 RIFSVNKEEVSREIVSTSTTAPSPRIVEKGTKKTQVIKEQPETGVEHKDVQSGAIVEPAI
R6xxxx0 RIFSVNKEEVSREIVSTSTTAPSPRIVEKGTKKTQVIKEQPETGVEHKDVQSGAIVEPAI
70585x1 RIFSVNKEEVSREIVSTSTTAPIPRIVEKGTKKTQVIKEQPETGVEHKDVQSGAIVEPAL
TIGR4x7 RIFSVNKEEVSREIVSTSTTAPSPRIVEKGTKKTQVIKEQPETGVEHKDVQSGAIVEPAI
Hungary19A_6 RIFSVNKEEVSREIVSTSTTAPIPRIVEKGTKKTQVIKEQPETGVEHKDVQSGAIVEPAI
********************** ***********************************::
Prim.cons. RIFSVNKEEVSREIVSTSTTAP2PRIVEKGTKKTQVIKEQPETGVEHKDVQSGAIVEPAI
430 440 450 460 470 480
| | | | | |
SP195x2 QPELPEAVVSDKGEPAVQPELPEAVVTDKGETEVQPESPDTVVSDKGEPEQVAPLPEYTR
CDC1087_00 QPELPEAVVSDKGVPEVQPALPKAVVTDKG------------------------------
G54xxx4 QPELPEAVVSDKGVPEVQPALPEAVVTDKG------------------------------
CGSP14 QPELPEAVVSDKGVPEVQPALSEAVVTDKG------------------------------
R6xxxx0 QPELPEAVVSDKGEPEVQPTLPEAVVTDKGE-----------------------------
70585x1 QPELPEAVVSDKGVPEVQPALPEAVVTDKGEPAIQPELPEAVVTDKG-------------
TIGR4x7 QPELPEAVVSDKGEPEVQPTLPEAVVTDKGE-----------------------------
Hungary19A_6 QPELPEAVVSDKGVPEVQPALSKAVITDKGE-----------------------------
************* * *** *.:**:****
Prim.cons. QPELPEAVVSDKGVPEVQPALPEAVVTDKGE222QPE2P22VV2DKGEPEQVAPLPEYTR
490 500 510 520 530 540
| | | | | |
SP195x2 PQAGAVVEPAIQPELPEAVVTDKGEP---AVQPELPEAVVTDKGETEVQPESPDTVVSDK
CDC1087_00 -------EPAVQPELPEAVVTDKGEP---EVQPALPEAVVSDKG----------------
G54xxx4 -------EPAVQPELPEAVVTDKGEP---EVQPELPEAVVTDKGEPEVQPALPEAVVSDK
CGSP14 -------EPAVQPELSEAVVTDKGEP---AVQPELSEAVVTDKG----------------
R6xxxx0 --------TEVQPESPDTVVSDKGEPEQVAPLPEYKGNIEQVKP----------------
70585x1 -------EPAVQPELPEAVVSDKGEPEQVAPLPEYKGNIEQVKP----------------
TIGR4x7 --------TEVQPESPDTVVSDKGEPEQVAPLPEYKGNIEQVKP----------------
Hungary19A_6 --------TEVQPESPDTVVSDKGEP---AVQPESPDTVVSDKG----------------
. :*** .::**:***** * : *
Prim.cons. PQAGAVVEPAVQPELPEAVV2DKGEPEQVAVQPELPEAVV2DKGE2EVQP22P22VVSDK
550 560 570 580 590 600
| | | | | |
SP195x2 GEPEQVAPLPEYTRPQAGAVVEPAIQPELPEAVVTDKG------EPAVQPELPEAVVTDK
CDC1087_00 -EPEQVAPLPEYTRPQAGAVVEPAIQPELPEAVVTDKG------EPAVQPELPEAVVTDK
G54xxx4 GEPEQVAPLPEYTRPQAGAVVEPAIQPELPEAVVTDKG------EPAVQPELPEAVVTDK
CGSP14 ---------------------EPAVQPELPEAVVSDKG------EPAVQPELPEAVVTDK
R6xxxx0 -ETPVEKTKEQGPEKTEEVPVKPTEETPVNPNEGTTEGTSIQEAENPVQPAEESTTNSEK
70585x1 -ETPVEKTKEQGPEKTEEVPVKPTEETPVNPNEGTTEGTSIQEAENPVQPAEESTTNSEK
TIGR4x7 -ETPVEKTKEQGPEKTEEVPVKPTEETPVNPNEGTTEGTSIQEAENPVQPAEESTTNSEK
Hungary19A_6 -EPKQVAPLPEYTGPQASAIVEPEQVAPLPEYTGVQAG---AIVEPAVQPALPEAVVSDK
:* . : * * .*** .:. ::*
Prim.cons. GEP2QVAPLPEYT2PQA2A2VEPA2QP2LPEAV2TDKGTSIQEAEPAVQP2LPEAVV2DK
105
610 620 630 640 650 660
| | | | | |
SP195x2 GEPAVQPELPEAVVTDKGETEVQPESPDTVVS---DKGEPKQVAPLPEYTGPQAS-----
CDC1087_00 GE-----------------TEVQPESPDTVVS---DKGEPKQVAPLPEYTGPQAS-----
G54xxx4 GE-----------------TEVQPESPDTVVS---DKGEPKQVAPLPEYTGPQAS-----
CGSP14 GE-----------------TEVQPESPDTVVS---DKGEPKQVAPLPEYTGPQAS-----
R6xxxx0 VS-----------------PDTSSENTGEVSSNPSDSTTSVGESNKPEHNDSKNENSEKT
70585x1 VS-----------------PDTSSENTGEVSSNPSDSTTSVGESNQPEKNRTATK-----
TIGR4x7 VS-----------------PDTSSKNTGEVSSNPSDSTTSVGESNKPEHNDSKNENSEKT
Hungary19A_6 GV-----------------PEVQPELPEAVVS---DKGVPEVQPELPEAVVSDKG-----
.:...: . * * *. . . ** .
Prim.cons. GEPAVQPELPEAVVTDKGE2EVQPESPDTVVSNPSDKGEPKQVAPLPEYTGPQASNSEKT
670 680 690 700 710 720
| | | | | |
SP195x2 ----------------AIVEPEQ-VAPLPEYTGVQAGSIVEPEKVEAPKEYTGKIEQPSA
CDC1087_00 ----------------AIVEPEQ-VAPLPEYTGVQAGSIVEPEKVEAPKEYTGKIEQPSA
G54xxx4 ----------------AIVEPEQ-VAPLPEYTGVQAGSIVEPEKVEAPKEYTGKIEQPSA
CGSP14 ----------------AIVEPEQ-VAPLPEYTGVQAGSIVEPEKVEAPKEYTGKIEQPSA
R6xxxx0 VEEVPVNPNEGTVEGTSNQETEKPVQPAEETQTNSG--KIANENTGEVSNKPSDSKPPVE
70585x1 -----P-------ENSGNTTSEN--GPTEPSNGNS---------TEDVSTESNTSN----
TIGR4x7 VEEVPVNPNEGTVEGTSNQETEKPVQPAEETQTNSG--KIANENTGEVSNKPSDSKPPVE
Hungary19A_6 -------------------EPEQ-VAPLPEYKGNI-------------------------
.*: *
Prim.cons. VEEVPVNPNEGTVEGTAIVEPEQPVAPLPEYTG2QAGSIVEPEKVEAPKEYTGKIEQPSA
730 740 750 760 770 780
| | | | | |
SP195x2 EDTKPENEASSTNGESER-----------------------------------------P
CDC1087_00 EDTKPENEASSTNGESER-----------------------------------------P
G54xxx4 EDTKPENEASSTNGESER-----------------------------------------P
CGSP14 EDTKPENEASSTNGESER-----------------------------------------P
R6xxxx0 ESNQPEKNGTATKPENSG-----------------------------------------N
70585x1 -SNGNEE----IKQEN-------------------------------------------E
TIGR4x7 ESNQPEKNGTATKPENSGNTTSENGQTEPEPSNGNSTEDVSTESNTSNSNGNEEIKQENE
Hungary19A_6 -----EQ----VKPETP-------------------------------------------
*: : *.
Prim.cons. EDTKPENEASST2GESERNTTSENGQTEPEPSNGNSTEDVSTESNTSNSNGNEEIKQENP
790 800 810 820 830 840
| | | | | |
SP195x2 KDKIKEEKQVDKKLELRNVSNVELYTVENNKYRHITAVDGALDSSLKYFMKVKSENFKDI
CDC1087_00 KDKIKEEKQVDKKLELRNVSNVELYTVENNKYRHITAVDGALDSSLKYFMKVKSENFKDI
G54xxx4 KDKIKEEKQVDKKLELRNVSNVELYTVENNKYRHITAVDGALDSSLKYFMKVKSENFKDI
CGSP14 KDKIKEEKQVDKKLELRNVSNVELYTVENNKYRHITAVDGALDSSLKYFMKVKSENFKDI
R6xxxx0 TTSENGQTEPEKKLELRNVSDIELYSQTNGTYRQHVSLDGIPENTDTYFVKVKSSAFKDV
70585x1 LDPDKMVEEPEKKLELRNVSDIELYSQTNGTYRQHVSLDGIPENTDTYFVKVKSSAFKDV
TIGR4x7 LDPDKKVEEPEKTLELRNVSDLELYSLSNGTYKQHISLEQVPSNPNSYFVKVKSSSFKDV
Hungary19A_6 -VEKLQEEEPEKTIELRSVSDVELYSYEANQSKQHTILDKVPDNKSAYFIKVKSAKFKDV
: :*.:***.**::***: . :: :: .. **:**** ***:
Prim.cons. KDKIKEEK222KKLELRNVS2VELY2VENNKYR22TA2DGA2D2SLKYFMKVKSENFKD2
850 860 870 880 890 900
| | | | | |
SP195x2 MLPVTKIESTTKNNKEVYKIVAHAENLIQHENNVISNDYTYYLPKTQQSETGVYTSFKNL
CDC1087_00 MLPVTKIESTTKNNKEVYKIVAHAENLIQHENNVISNDYTYYLPKTQQSETGVYTSFKNL
G54xxx4 MLPVTKIESTTKNNKEVYKIVAHAENLIQHENNVISNDYTYYLPKTQQSETGVYTSFKNL
CGSP14 MLPVTKIESTTKNNKEVYKIVAHAENLIQHENNVISNDYTYYLPKTQQSETGVYTSFKNL
R6xxxx0 YIPVASITEEKRNGQSVYKITAKAEKLQQELENKYVDNFTFYLDKKAKEENTNFTSFSNL
70585x1 YIPVASITEEKRNGQSVYKITAKAEKLQQELENKYVDNFTFYLDKKAKEENTNFTSFSNL
TIGR4x7 YLPVASISEERKNDKILYKITAKVEKLQQEIESRYKDNFTFYLAKKGTEETTNFTSFSNL
Hungary19A_6 LLPVSNIEDTTKDGKVVYKITARLEHLKQSVDNQYQDNFTYYLPKVVQNDGPIYTSFKKL
:**:.* . ::.: :***.*: *:* * :. :::*:** * .: :***.:*
Prim.cons. MLPVTKIESTTKNNKEVYKI2AHAENLIQHENNV2S222TYYLPKTQQSETGVYTSFKNL
106
910 920 930 940 950 960
| | | | | |
SP195x2 VDAMNSDPNGTFHLGATMDAREVELPDDQESYVKNEFYGKLIGENNGKYYAIYNLKKPLF
CDC1087_00 VDAMNSDPNGTFHLGATMDAREVELPDDQESYVKNEFYGKLIGENNGKYYAIYNLKKPLF
G54xxx4 VDAMNSDPNGTFHLGATMDAREVELPDDQESYVKNEFYGKLIGENNGKYYAIYNLKKPLF
CGSP14 VDAMNSDPNGTFHLGATMDAREVELPDDQESYVKNEFYGKLIGENNGKYYAIYNLKKPLF
R6xxxx0 VKAINQNPSGTYHLAASLNANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLF
70585x1 VKAINQNPSGTYHLAASLNANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLF
TIGR4x7 VKAINQNPSGTYHLAASLNANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLF
Hungary19A_6 VTDMNSRPDGTFILGATMNAREFELGENQESYVTKNFTGTLIGSHQGKHYAIYNLKKPLF
* :*. *.**: *.*:::*.*.** ::.**:.. * * ***.::** ***********
Prim.cons. VDAMNSDPNGTFHLGATM2AREVEL2DDQESYVKNEF2GKLIGENNGKYYAIYNLKKPLF
970 980 990 1000 1010 1020
| | | | | |
SP195x2 KTLNTATIQNLSIKEANVSSKEDAATISKEAKYNTLIDNVHSDGIIAGERGIGGLVSKVD
CDC1087_00 KTLNTATIQNLSIKEANVSSKEDAATISKEAKYNTLIDNVHSDGIIAGERGIGGLVSKVD
G54xxx4 KTLNTATIXNLSIKEANVSSKEDAATISKEAKYNTLIDXVHSDGIIAGERGIGGLVSKVD
CGSP14 KTLNTATIQNLSIKEANVSSKEDAATISKEAKYNTLIDNVHSDGIIAGERGIGGLVSKVD
R6xxxx0 ENLSGATVEKLSLKNVAISGKNDIGSLANEATNGTKIKQVHVDGVLAGERGVGGLLAKAD
70585x1 ENLSGATVEKLSLKNVAISGKNDIGSLANEATNGTKIKQVHVDGVLAGERGVGGLLAKAD
TIGR4x7 ENLSGATVEKLSLKNVAISGKDDIGSLANEAQNNTKIKQVHVDGVLAGERGIGGLLAKAE
Hungary19A_6 NTLNNAAIQDLTLKDVNISGKNHVASVAMEATNSSTLDNVHANGIIAGELGIGGLVQKVD
:.*. *:: .*::*:. :*.*:. .::: ** .: :. ** :*::*** *:***: *.:
Prim.cons. KTLNTATIQNLS2KE2N2S2KEDAA2I2KEAK2NTLIDNVHSDGIIAGERGIGGLVSKVD
1030 1040 1050 1060 1070 1080
| | | | | |
SP195x2 NSRISNSSFTGRITNTYDTTVGYEIGGLVGKLSGSLASIEKSIASIDIASNAKSGDQIVG
CDC1087_00 NSRISNSSFTGRITNTYDTTVGYEIGGLVGKLSGSLASIEKSIASIDIASNAKSGDQIVG
G54xxx4 NSRISNSSFTGRITNTYDTTVGYEIGGLVGKLSGSLASIEKSIASIDIASNAKSGDQIVG
CGSP14 NSRISNSSFTGRITNTYDTTAGYEIGGLVGKLSGSLASIEKSIASIDIASNAKSGDQIVG
R6xxxx0 QSSIAESSFKGRIVNTYETTDAYNIGGLVGHLTGKNASIAKSKATVTISSNTNRSDQTVG
70585x1 QSNIAESSFKGRIVNTYETTDAYNIGGLVGHLTGKNASIAKSKATVTISSNTNRSDQTVG
TIGR4x7 QSSITESSFKGRIINTYETTAAYNIGGMVGHLTGDKALLTKSKATVAISSNTNTSDQTVG
Hungary19A_6 NSTVRNSSFTGRITNTFVTTSQYAIGGLVGQLTGANARVAHSISTVVISSNGEHSNQTIG
:* : :***.*** **: ** * ***:**:*:* * : :* ::: *:** : .:* :*
Prim.cons. NSRISNSSFTGRITNTYDTTVGYEIGGLVGKL2GSLASIEKSIA22DI2SNAKS2DQ2VG
1090 1100 1110 1120 1130 1140
| | | | | |
SP195x2 GIAGVVEKSATIKYSYVEGNVNNVRHFGKVGGVAGNLWDRDSQDVSKSGKLSYVLSDVNV
CDC1087_00 GIAGVVEKSATIKYSYVEGNVNNVRHFGKVGGVAGNLWDRDSQDVSKSGKLSYVLSDVNV
G54xxx4 GIAGVVEKSATIKYSYVEGNVNNVRHFGKVGGVAGNLWDRDSQDVSKSGKLSYVLSDVNV
CGSP14 GIAGVVEKSATIKYSYVEGNVNNVRHFGKVGGVAGNLWDRDSQDVSKSGKLSYVLSDVNV
R6xxxx0 GLAGLVDQDAHIQNSYAEGDINNVKHFGKVAGVAGYLWDRTSGEEKHAGELTNVLSDVNV
70585x1 GLAGLVDQDAHIQNSYAEGDINNVKHFGKVAGVAGYLWDRTSGEEKHAGELTNVLSDVNV
TIGR4x7 GLAGLVDRDAQIQDSYAEGDINNVKHFGRVAGVAGNLWDRTSGDVRHAGSLTNVLSDVNV
Hungary19A_6 GIVGIVENNATVENSYAEGEINNAKPFARVGGVAGSLWTQEGGTDNNTGRLTNVLSDMNI
*:.*:*:..* :: **.**::**.: *.:*.**** ** : . ::* *: ****:*:
Prim.cons. GIAGVVEKSATIKYSY2EGN2NNV2HFGKVGGVAGNLWDRDS2DVSKSGKL22VLSDVNV
1150 1160 1170 1180 1190 1200
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SP195x2 TNGNAISGDNFDNMKEDHAYSSKGNKVVNVVQVDDELVTKDSDVQRGTVLDADKVKEKKA
CDC1087_00 TNGNAISGDNFDNMKEDHAYSSKGNKVVNVVQVDDELVTKDSDVQRGTVLDADKVKEKKA
G54xxx4 TNGNAISGDNFDNMKEDHAYSSKGNKVVNVVQVDDELVTKDSDVQRGTVLDADKVKEKKA
CGSP14 TNGNAIAGYNFNGIKTIETYSNKNNKVVNVVQEDDEVVTKDSDVQRGTVLDADKVKEKKV
R6xxxx0 TNGNAITGYHYTGMKVANTFSSKANRVFNVTLEKDEVVSKESFEERGTMLDASQIVSKKA
70585x1 TNGNAITGYHYTGMKVANTFSSKANRVFNVTLEKDEVVSKESFEERGTMLDASQIVSKKA
TIGR4x7 TNGNAITGYHYNEMKVKDTFSSKANRVYNVTLVKDEVVSKESFEERGTMLDASQIASKKA
Hungary19A_6 TNGNAISGYHFNGIKETNVYSNKENKVVNVQAVGDEVMSVDSTVERGTEIEKTSVQAKKD
******:* :: :* ..:*.* *:* ** **::: :* :*** :: .: **
Prim.cons. TNGNAISGY2F2GMKED2TYSSK2NKVVNVVQVDDEVV2KDSDV2RGTVLDADKVKEKKA
107
1210 1220 1230 1240 1250 1260
| | | | | |
SP195x2 ELVSKHSTKVEDFDFTSRYTTIYNEVTGYQKSREQVYKNIEKLLPFYNRETIVKYGNLVD
CDC1087_00 ELVSKHSTKVEDFDFTSRYTTIYNEVTGYQKSREQVYKNIEKLLPFYNRETIVKYGNLVD
G54xxx4 ELVSKHSTKVEDFDFTSRYTTIYNEVTGYQKSREQVYKNIEKLLPFYNRETIVKYGNLVD
CGSP14 ELVSKHSTKVEDFDFTSRYNTNYNEVTGYQQSREQVYKNIEKLLPFYNRETIVKYGNLVE
R6xxxx0 EINPLTLPTVEPLSTSGKKDSDFSKIAHYQANRALVYKNIEKLLPFYNKSTIVKYGNLVK
70585x1 EINPLTLPTVEPLSTSGKKDSDFSKIAHYQANRALVYKNIEKLLPFYNKSTIVKYGNLVK
TIGR4x7 EINPLILPTVEPLSTSGKKDSDFSKVAYYQAKRNLTYKNIEKLLPFYNKATIVKYGNLVN
Hungary19A_6 EITKKHTITVEDFTNSVKQDVDYTKAAHYQSTREVAYKNIEKLLPFYNRDTIVKYGNQLS
*: .** : : : :.: : ** .* .************: ******* :.
Prim.cons. E2VSKHST2VEDFDF2S2YDTDYN2V2GYQ2SREQVYKNIEKLLPFYNRETIVKYGNLVD
1270 1280 1290 1300 1310 1320
| | | | | |
SP195x2 ESSELFTKELLSVVPMKNNEVITDINKNKQEINKLLLHFEGNKSQVLNIAYKNDFSKVAE
CDC1087_00 ESSELFTKELLSVVPMKNNEVITDINKNKQEINKLLLHFEGNKSQVLNIAYKNDFSKVAE
G54xxx4 ESSELFTKELLSVVPMKNNEVITDINKNKQEINKLLLHFEGNKSQVLNIAYKNDFSKVAE
CGSP14 DNSDLFTKKLLSVVPMKNNEVITDINKNKQEINKLLLHFEGNKSRVLNIAYKNDFSKVAE
R6xxxx0 ENSLLYQKELLSAVMMKDDQVITDIVSNKQTANKLLLHYNDHSSEKFDLKYQTDFANLAE
70585x1 ENSLLYQKELLSAVMMKDDQVITDIVSNKQTANKLLLHYNDHSSEKFDLKYQTDFANLAE
TIGR4x7 ENSLLYQKELLSAVMMKDNQVITDIVSNKQTANKLLLHYKDDLSEKLDLKYQNDFAKLAE
Hungary19A_6 TDHNLFKKELLSVVAMKNDEVVSDITSNKNSINHLLLHYKDGTSEKVDLTYNSDFANLAE
. *: *:***.* **:::*::** .**: *:****::. *. .:: *:.**:::**
Prim.cons. ENS2LFTKELLSVVPMKNNEVITDIN2NKQEINKLLLH2E2NKSE2L22AYKNDF2K2AE
1330 1340 1350 1360 1370 1380
| | | | | |
SP195x2 YSIEYQGLLYTPNTLLHDYSNIVDNVLTDLNSVQYDSNAIKKILDISDKVKNTELYLDEQ
CDC1087_00 YSIEYQGLLYTPNTLLHDYSNIVDNVLTDLNSVQYDSNAIKKILDISDKVKNTELYLDEQ
G54xxx4 YSIEYQGLLYTPNTLLHDYSNIVDNVLTDLNSVQYDSNAIKKILDISDKVKNTELYLDEQ
CGSP14 YDIANTKLMYTPNTMLHDYNNIVKTILNDLKSVQYSSADVRKVLDISGNIKLTELYLGEQ
R6xxxx0 YNLGNTGLLYTPNQFLYDRDSIVKEVLPELQKLDYQSDAIRKTLGISPEVKLTELYLEDQ
70585x1 YNLGNTGLLYTPNQFLYDRDSIVKEVLPELQKLDYQSDAIRKTLGISPEVKLTELYLEDQ
TIGR4x7 YSLGNTGLLYTPNQFLYDQTSIIKQVLPDLQKVDYHSEAIRKTLGISPNVKQTELYLEDQ
Hungary19A_6 YNIENTGLVYTPNAFLKNYTPIIDRVKNDLTAVPYNPTALKNLLGISDNVKLTELYLDEQ
*.: *:**** :* : *:. : :* : * . ::: *.** ::* ***** :*
Prim.cons. YSIENTGLLYTPNTFLHDYSNIV2NVL2DL2SVQYDSNAI2K2L2ISD2VKLTELYLDEQ
1390 1400 1410 1420 1430 1440
| | | | | |
SP195x2 FVKTKANIKDTLSKLLSADAAIAENSNSIIDNYVIQKIKQNKEALLLGLTYLERWYNFKY
CDC1087_00 FVKTKANIKDTLSKLLSADAAIAENSNSIIDNYVIQKIKQNKEALLLGLTYLERWYNFKY
G54xxx4 FVKTKANIKDTLSKLLSADAAIAENSNSIIDNYVIQKIKQNKEALLLGLTYLERWYNFKY
CGSP14 FEKTKANIEDSLSKLLTADAAIVENNNKVIDNYVIEKIKNNKEALLLGLTYLERWYNFNY
R6xxxx0 FSKTKQNLGDSLKKLLSADAGLA-SDNSVTRGYLVDKIKNNKEALLLGLTYLERWYNFNY
70585x1 FSKTKQNLGDSLKKLLSADAGLA-SDNSVTRGYLVDKIKNNKEALLLGLTYLERWYNFNY
TIGR4x7 FAKTKQQLEDSLKKLLSADAGLA-SANPVTEGYLVDKIKRNKEALLLGLTYLERWYNFSY
Hungary19A_6 FTKTKEHLTETLKKLLSADAAVS-GNNDIIDNYIVDKIKRNKEALMLGLTYLERWYDFKF
* *** :: ::*.***:***.: . * : .*:::***.*****:**********:*.:
Prim.cons. FVKTKAN2KD2L2KLLSADAAIAENSNS2IDNYV2DKIK2NKEALLLGLTYLERWYNFKY
1450 1460 1470 1480 1490 1500
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SP195x2 GETKAKDLVMYHLDFFGKSNSSALDNVIQLGKSGFNNLLAKNNVITYNVLLSKNYGTESL
CDC1087_00 GETKAKDLVMYHLDFFGKSNSSALDNVIQLGKSGFNNLLAKNNVITYNVLLSKNYGTESL
G54xxx4 GETKAKDLVMYHLDFFGKSNSSALDNVIQLGKSGFNNLLAKNNVITYNVLLSKNYGTESL
CGSP14 GETNAKDLIMYHLDFFGKSNSSALDNVIELGKSGFNNLLAKNNVITYNVLLAKNYGTESL
R6xxxx0 GQVNVKDLVMYHPDFFGKGNTSPLDTLIELGKSGFNNLLAKNNVDTYGISLASQHGATDL
70585x1 GQVNVKDLVMYHPDFFGKGNTSPLDTLIELGKSGFNNLLAKNNVDTYGISLASQHGTTDL
TIGR4x7 GQVNVKDLVLYHLDFFGKGNASPLDTLIELGKSGFNNLLAKNNVDTYGISLASQHGTTDL
Hungary19A_6 DKASAKDLLMFHMDFFGKGNTSPLDAIIELGKSGYNNLLAKNNVVTYNALLTNNYGTKDL
.:...***:::* *****.*:*.** :*:*****:********* **. *:.::*: .*
Prim.cons. GETNAKDLVMYHLDFFGK2NSS2LDNVIELGKSGFNNLLAKNNVITYNVLLAKNYGTE2L
108
1510 1520 1530 1540 1550 1560
| | | | | |
SP195x2 FKALEGYRKVFLPTTSNNEWFKAQTKAYIVEEKSSIPEVSKKQSEQGTKYSIGIYDRLTS
CDC1087_00 FKALEGYRKVFLPTTSNNEWFKAQTKAYIVEEKSSIPEVSKKQSEQGTKYSIGIYDRLTS
G54xxx4 FKALEGYRKVFLPTTSNNEWFKAQTKAYIVEEKSSIPEVSKKQSEQGTKYSIGIYDRLTS
CGSP14 FKALEGYRKVFLPTISNNEWFKKQTKAYIVEEKSTIEEGREKQGKEGTKYSIGVYDRLTN
R6xxxx0 FSTLEHYRKVFLPNTSNNDWFKSETKAYIVEEKSTIEEVKTKQGLAGTKYSIGVYDRITS
70585x1 FSTLEHYRKVFLPNTSNNDWFKSETKAYIVEEKSTIEEVKTKQGLAGTKYSIGVYDRITS
TIGR4x7 FSTLEHYRKVFLPNTSNNDWFKSETKAYIVEEKSTIEEVKTKQGLAGTKYSIGVYDRITS
Hungary19A_6 FSALEGYRKAFAPHQTNNEWFKSQTKAYIVEEKSNIEEVKTKQGLVGTKYSIGVYDRITS
*.:** ***.* * :**:*** :**********.* * **. *******:***:*.
Prim.cons. F2ALEGYRKVFLPTTSNNEWFKSQTKAYIVEEKSTIEEVKTKQGL2GTKYSIGVYDR2TS
1570 1580 1590 1600 1610 1620
| | | | | |
SP195x2 PSWKYQSMVLPLLTLPEEKTVFMIANISTIGFGAYDRYRSKVHPKGDNLNKFVEDNVREA
CDC1087_00 PSWKYQSMVLPLLTLPEEKTVFMIANISTIGFGAYDRYRSKVHPKGDNLNKFVEDNVREA
G54xxx4 PSWKYQSMVLPLLTLPEEKTVFMIANISTIGFGAYDRYRSKVHPKGDNLNKFVEDNVREA
CGSP14 PSWKYQSMVLPLLTLPEEKTVFMIANISTIGFGAYDRYRSSEYPKGEKLNKFVEDNAKEA
R6xxxx0 ATWKYRNMVLPLLTLPE-RSVFVISTMSSLGFGAYDRYRSSDHKAGKALNDFVEENARET
70585x1 ATWKYRNMVLPLLTLPE-RSVFVISTMSSLGFGAYDRYRSSDHKAGKALNDFVEENARET
TIGR4x7 ATWKYRNMVLPLLTLPE-RSVFVISTMSSLGFGAYDRYRSSDHKAGKALNDFVEENARET
Hungary19A_6 ATWKYRNMVLPLLTLPE-KSVFVISTISSLGFGAYDRYRNSEHKAGKDLNDFVEENARET
.:***:.********** ::**:*:.:*::*********.. : *. **.***:*.:*:
Prim.cons. 22WKY22MVLPLLTLPEEK2VF2I22IS22GFGAYDRYRSS2H22GK2LN2FVE2NARE2
1630 1640 1650 1660 1670 1680
| | | | | |
SP195x2 AKRFRDHYDYWYKILEPENREKLYRSLLVYDAFKFGRDNTEDKVTYQADFETDHPAIKYF
CDC1087_00 AKRFRDHYDYWYKILELENREKLYRSLLVYDAFKFGRDNTEDKVTYQADFETDHPAIKYF
G54xxx4 AKRFRDHYDYWYKILEPENREKLYRSLLVYDAFKFGRDNTEDKVTYQADFETDHPAIKYF
CGSP14 AKRFRDHYDYWYKILDNDNKEKLYRSILVYDAFKFGTDKDKDKVTHQATFETDHPAIKYF
R6xxxx0 AKRQRDHYDYWYRILDEQSREKLYRTILLYDAYKFGDDTTSGKATAEAKFDSSNPAMKNF
70585x1 AKRQRDHYDYWYRILDEQSREKLYRTILLYDAYKFGDDTTSGKATAEAKFDSSNPAMKNF
TIGR4x7 AKRQRDHYDYWYRILDDNAREKLYRNILLYDAYKFGDDNTVGKATEVADFDNPNPAMQHF
Hungary19A_6 AKHQRDHYDYWYRILDDNAREKLYRNILLYDAYKFGDDNTVGKATEVADFDNPNPAMQHF
**: ********:**: : :*****.:*:***:*** *. .*.* * *:. :**:: *
Prim.cons. AKR2RDHYDYWY2ILD3ENREKLYRSIL2YDA2KFGDDNTE2K2TYQADF2TD2PA2KYF
1690 1700 1710 1720 1730 1740
| | | | | |
SP195x2 FGPAGNNVVHNGHGAYATGDAFYYMAYRMLDKDGAVTYTHEMTHNSDREIYLGGYGRRSG
CDC1087_00 FGPAGNNVVHNGHGAYATGDAFYYMAYRMLDKDGAVTYTHEMTHNSDREIYLGGYGRRSG
G54xxx4 FGPAGNNVVHNGHGAYATGDAFYYMAYRMLDKDGAVTYTHEMTHNSDREIYLGGYGRRSG
CGSP14 FGPAGNNVVHNGHGAYATGDAFYYMAYRMLDKDGAVTYTHEMTHNSDREIYLGGYGRRSG
R6xxxx0 FGPVGNKVVHNQHGAYATGDGVYYMSYRMLDKDGAITYTHEMTHDSDQDIYLGGYGRRNG
70585x1 FGPVGNKVVHNQHGAYATGDGVYYMSYRMLDKDGAITYTHEMTHDSDQDIYLGGYGRRNG
TIGR4x7 FGPVGNKVGHNQHGAYATGDAVYYMGYRMLDKDGAITYTHEMTHDSDQDIYLGGYGRRSG
Hungary19A_6 FGPVGNKVGHNQHGAYATGDAVYYMGYRMLDKDGAITYTHEMTHDSDQDIYLGGYGRRSG
***.**:* ** ********..***.*********:********:**::*********.*
Prim.cons. FGP2GN2VVHN2HGAYATGDA2YYMAYRMLDKDGA2TYTHEMTH2SD22IYLGGYGRRSG
1750 1760 1770 1780 1790 1800
| | | | | |
SP195x2 LGPEFYAKGLLQAPDHPYDPTITINSVLKYD--DSENSTRLQVADPTQRFNSAEDLHNYM
CDC1087_00 LGPEFYAKGLLQAPDHPYDPTITINSVLKYD--DSENSTRLQVADPTQRFNSAEDLHNYM
G54xxx4 LGPEFYAKGLLQAPDHPYDPTITINSVLKYD--DSENSTRLQVADPTQRFNSAEDLHNYM
CGSP14 LGPEFYAKGLLQAPDHPYDPTITINSVLKYE--DSENSTRLQVADPTQRFNSAEDLHNYM
R6xxxx0 LGPEFFAKGLLQAPDQPSDATITINSILKHSKSDSTEGSRLQVLDPTERFQNAADLQNYV
70585x1 LGPEFFAKGLLQAPDQPRDATITINSILKHSKSDSTEGSRLQVLDPTKRFQNAADLQNYV
TIGR4x7 LGPEFFAKGLLQAPDHPDDATITINSILKHSKSDSTESRRLQVLDPTTRFNNADDLKQYV
Hungary19A_6 LGPEFFAKGLLQAPDHPDDATITINSILKHSKSDSTESRRLQVLDPTTRFNNADDLKQYV
*****:*********:* *.******:**:. ** :. **** *** **:.* **::*:
Prim.cons. LGPEF2AKGLLQAPDHPYD2TITINS2LK2SKSDS22STRLQV2DPTQRFN2AEDLHNY2
109
1810 1820 1830 1840 1850 1860
| | | | | |
SP195x2 HNMFDLIYTLEILEGRAVA-KLDYNAKNDLLRKIENKYKQDP-DGNSVYATNVVRRLTMD
CDC1087_00 HNMFDLIYTLEILEGRAVA-KLDYNAKNDLLRKIENKYKQDP-DGNSVYATNVVRRLTMD
G54xxx4 HNMFDLIYTLEILEGRAVA-KLDYNAKNDLLRKIENKYKQDP-DGNSVYATNVVRRLTMD
CGSP14 HNMFDVIYMLEYLEGKAVA-NLETNQKYELLRKIENKFDLDQ-DGNNVYATNVVRRLTMD
R6xxxx0 HNMFDLIYMMEYLEGQSIVNKLSVYQKMAALRKIENKYVKDPADGNEVYATNVVKELTEA
70585x1 HNMFDLIYMMEYLEGQSIVNKLSVYQKMAALRKIENKYVKDPADGNEVYATNVVKELTEA
TIGR4x7 HNMFDVVYMLEYLEGNSIL-KLDTNQKQQLLRKVTNEYHPDP-DGNKVYATNVVRNLTVE
Hungary19A_6 HNMFDVVYMLEYLEGNSIL-KLDTNQKQQLLRKVTNEYHPDP-DGNKVYATNVVRNITVE
*****::* :* ***.:: :*. * ***: *:: * ***.*******:.:*
Prim.cons. HNMFDLIYMLEYLEGR22ANKLD2NQKNDLLRKIENKYKQDPADGNSVYATNVVRRLTMD
1870 1880 1890 1900 1910 1920
| | | | | |
SP195x2 EVNKLNSFDSLIENDIITSRGYKDQEYKRNGYYTIDLFSPIYSALSGEKGTPGDLMGRRI
CDC1087_00 EVNKLNSFDSLIENDIITSRGYKDQEYKRNGYYTIDLFSPIYSALSGEKGTPGDLMGRRI
G54xxx4 EVNKLNSFDSLIENDIITSRGYKDQEYKRNGYYTIDLFSPIYSALSGEKGTPGDLMGRRI
CGSP14 EVNKLNSFDSLIENDIITSRGYKDQEYKRNGYYTIDLFSPIYSALSGEKGTPGDLMGRRI
R6xxxx0 EARNLNSFESLIDHNILSAREYQSGDYERNGYYTIKLFAPIYSALSSEKGTPGDLMGRRI
70585x1 EARNLNSFESLIDHNILSAREYQSGDYERNGYYTIKLFAPIYSALSSEKGTPGDLMGRRI
TIGR4x7 EVERLRSFNDLIDNNILSSREYASGKYERNGYFTIKLFAPIYAALSNDIGTPGDLMGRRI
Hungary19A_6 EVERLRSFNDLIDNNILSSREYASGKYERNGYFTIKLFAPIYAALSNDDGTPGDLMGRRM
*...*.**:.**:::*:::* * . .*:****:**.**:***:***.: **********:
Prim.cons. EVNKLNSFDSLI2N2I22SR2YK22EY2RNGYYTI2LF2PIYSALSGEKGTPGDLMGRRI
1930 1940 1950 1960 1970 1980
| | | | | |
SP195x2 AFELLAAKGYKEGMVPYISNQYEKDAKAAGSKIKSYGKEVGLVTDKLVLEKVFNNRYSSW
CDC1087_00 AFELLAAKGYKEGMVPYISNQYEKDAKAAGSKIKSYGKEVGLVTDKLVLEKVFNNRYSSW
G54xxx4 AFELLAAKGYKEGMVPYISNQYEKDAKAAGSKIKSYGKEVGLVTDKLVLEKVFNNRYSSW
CGSP14 AFELLAAKGYKEGMVPYISNQYEKDAKAAGSKINSYGKEVGLVTDELVLEKVFNGQYKTW
R6xxxx0 AYELLAAKGFKDGMVPYISNQYEEDAKQQGQTINLYGKERGLVTDELVLKKVFDGKYKTW
70585x1 AYELLAAKGFKDGMVPYISNQYEEDAKQQGQTINLYGKERGLVTDELVLKKVFDGKYKTW
TIGR4x7 AYELLAAKGFKDGMVPYISNQYEEEAKQKGKTINLYGKTRGLVTDDLVLEKVFNNQYHTW
Hungary19A_6 AYELLAAKGFKDGMVPYISNQFEADARANNKTITSYGKTKGLVTDTLVLQRLFNGQYNTW
*:*******:*:*********:* :*: ...*. *** ***** ***:::*:.:* :*
Prim.cons. A2ELLAAKG2K2GMVPYISNQYEKDAKAAGS2INSYGKEVGLVTD2LVLEKVFN22Y2TW
1990 2000 2010 2020 2030 2040
| | | | | |
SP195x2 VEFKKAMYNERIAKFNNLISVSFNNPNVSWGRTNRITITSIANLQNMINTAVNEDAED--
CDC1087_00 VEFKKAMYNERIAKFNNLISVSFNNPNVSWGRTNRITITSIANLQNMINTAVNEDAED--
G54xxx4 VEFKKAMYNERIAKFNNLISVSFNNPNVSWGRTNRITITSIANLQNMINTAVNEDAED--
CGSP14 TQFKKDMYKEREKQFSKLNRVNFINPNNPLSRQRNVSVTDIGVLERMIVEAVRDDAQD--
R6xxxx0 AEFKTAMYQERVDQFGNLKQVTFKDPTKPWPSYGTKTINNVDELQALMDQAVLKDAEG--
70585x1 AEFKTAMYQERVDQFGNLKQVTFKDPTKPWPRYGTKTINNVDELQKLMDEAVLQDATG--
TIGR4x7 SEFKKAMYQERQDQFDRLNKVTFNDTTQPWQTFAKKTTSSVDELQKLMDVAVRKDAEHNY
Hungary19A_6 SDFKKAMYKERQDKFNKLNKISFKDPSQPWTRNIIKTIHSVNELQNLMNEAVRKDTET--
:**. **:** :*..* :.* :.. . : .: *: :: ** .*:
Prim.cons. VEFKKAMY2ERID2FNNL2SVSFN2PNVPWGRTNRKTITS22ELQN22N2AV22DAEDNY
2050 2060 2070 2080
| | | |
SP195 -FRAQLYPDTNSRVLKLKKAIYKAYLDQTNDFRRSIFENKK
CDC1087_00 -FRAQLYPDTNSRVLKLKKAIYKAYLDQTNDFRRSIFENKK
G54 -FRAQLYPDTNSRVLKLKKAIYKAYLDQTNDFRRSIFENKK
CGSP14 -DVAKFYPETNSRVLKLKKAIYKAYLDQTNDFRSSIFENKK
R6 PRWSNYDPEIDSAVHKLKRAIFKAYLDQTNDFRSSIFENKK
70585 TRWSNYNPETDSAVHKLKRAIFKAYLDQTNDFRSSIFENK-
TIGR4 YHWNNYNPDIDSEVHKLKRAIFKAYLDQTNDFRSSIFENKK
Hungary19A_6 PHWYNYNPEIDSAVHKLKRAIFKAYLDQTNDFRSSIFENKK
: *: :* * ***:**:*********** ******
Prim.cons. PFWANYYP2T2SRV2KLK2AI2KAYLDQTNDFRSSIFENKK
110
Apêndice B.2 – Alinhamento Múltiplo de Hialuronato liase
10 20 30 40 50 60
| | | | | |
D39 -----------MQTKTKKLIVSLSSLVLSGFLLNHYMTVGAEETTTNTIQQSQKEVQYQQ
R6 MILQYVYWSVYMQTKTKKLIVSLSSLVLSGFLLNHYMTVGAEETTTNTIQQSQKEVQYQQ
Taiwan19F_14 -----------MQTKTKKLIVSLSSLVLSGFLLNHYMTVGAEETTTNTIQQSQKEVQYQQ
Hungary19A_6 -----------MQTKTKKLIVSLSSLVLSGFLLNHYMTVGAEETTTNTIQQSQKEVQYQQ
CGSP14 MILQYVYWSVYMQTKTKKLIVSLSSLVLSGFLLNHYMTVGAEETTTNTIQQSQKEVQYQQ
G54 -----------MQTKTKKLIVSLSSLVLSGFLLNHYMTVGAEETTTNTIQQSQKEVQYQQ
P1031 -----------MQTKTKKLIVSLSSLVLSGFLLNHYMTVGAEETTTNTIQQSQKEVQYQQ
CDC1087_00 -----------MQTKTKKLIVSLSSLVLSGFLLNHYMTIGAEETTTNTIQQSQKEVQYQQ
TIGR4 -----------MQTKTKKLIVSLSSLVLSGFLLNHYMTIGAEETTTNTIQQSQKEVQYQQ
***************************:*********************
Prim.cons. MILQYVYWSVYMQTKTKKLIVSLSSLVLSGFLLNHYMTVGAEETTTNTIQQSQKEVQYQQ
70 80 90 100 110 120
| | | | | |
D39 RDTKNLVENGDFGQTEDGSSPWTGSKAQGWSAWVDQKNSSADASTRVIEAKDGAITISSP
R6 RDTKNLVENGDFGQTEDGSSPWTGSKAQGWSAWVDQKNSSADASTRVIEAKDGAITISSP
Taiwan19F_14 RDTKNLVENGDFGQTEDGSSPWTGSKAQGWSAWVDQKNSSADASTRVIEAKDGAITISSP
Hungary19A_6 RDTKNLVENGDFGQTEDGSSPWTGSKAQGWSAWVDQKNSSADASTRVIEAKDGAITISSP
CGSP14 RDTKNLVENGDFGQTEDGSSPWTGSKAQGWSAWVDQKNSSADASTRVIEAKDGAITISSP
G54 RDTKNLVENGDFGQTEDGSSPWTGSKAQGWSAWVDQKNSSADASTRVIEAKDGAITISSP
P1031 RDTKNLVENGDFGQTEDGSSSWTGSKAQGWSAWVDQKNSSADASTRVIEAKDGAITISSH
CDC1087_00 RDTKNLVENGDFGQTEDGSSPWTGSKAQGWSAWVDQKNS-ADASTRVIEAKDGAITISSH
TIGR4 RDTKNLVENGDFGQTEDGSSPWTGSKAQGWSAWVDQKNS-ADASTRVIEAKDGAITISSH
********************.****************** *******************
Prim.cons. RDTKNLVENGDFGQTEDGSSPWTGSKAQGWSAWVDQKNSSADASTRVIEAKDGAITISSP
130 140 150 160 170 180
| | | | | |
D39 EKLRAAVHRMVPIEAKKKYKLRFKIKTDNKVGIAKVRIIEESGKDKRLWNSATTSGTKDW
R6 EKLRAAVHRMVPIEAKKKYKLRFKIKTDNKVGIAKVRIIEESGKDKRLWNSATTSGTKDW
Taiwan19F_14 EKLRVAVHRMVPIEAKKKYKLRFKIKTDNKVGIAKVRIIEESGKDKRLWNSATTSGTKDW
Hungary19A_6 EKLRAAVHRMVSIEAKKKYKLRFKIKTDHKVGIAKVRIIEESDKDKRLWNSATTSGTKDW
CGSP14 EKLRAAVHRMVPIEAKKKYKLRFKIKTDNKVGIAKVRIIEESGKDKRLWNSATTSGTKDW
G54 EKLRAAVHRMVPIEAKKKYKLRFKIKTDHKVGIAKVRIIEESGKDKRLWNSATTSGTKDW
P1031 EKLRAALHRMVPIEVKKKYKLRFKIKTDNKVGIAKVRIIEESGKDKRLWNSATTSGTKDW
CDC1087_00 EKLRAALHRMVPIEAKKKYKLRFKIKTDNKIGIAKVRIIEESGKDKRLWNSATTSGTKDW
TIGR4 EKLRAALHRMVPIEAKKKYKLRFKIKTDNKIGIAKVRIIEESGKDKRLWNSATTSGTKDW
****.*:****.**.*************:*:***********.*****************
Prim.cons. EKLRAAVHRMVPIEAKKKYKLRFKIKTDNKVGIAKVRIIEESGKDKRLWNSATTSGTKDW
190 200 210 220 230 240
| | | | | |
D39 QTIEADYSPTLDVDKIKLELFYETGTGTVSFKDIELVEVADQPSEDSQTDKQLEEKIDLP
R6 QTIEADYSPTLDVDKIKLELFYETGTGTVSFKDIELVEVADQPSEDSQTDKQLEEKIDLP
Taiwan19F_14 QTIEADYSPTLDVDKIKLELFYETGTGTVSFKDIELVEVADQPSEDSQTDKQLEEKIDLP
Hungary19A_6 QTIEADYSPTLDVDKIKLELFYETGTGTVSFKDIELVEVADQPSEDSQTDKQLEEKIDLP
CGSP14 QTIEADYSPTLDVDKIKLELFYETGTGTVSFKDIELVEVAAQLSEDSQTDKQLEEKIDLP
G54 QTIEADYSPTLDVDKIKLELFYETGTGTVSFKDIELVEVADQLSEDSQTDKQLEEKIDLP
P1031 QTIEADYSPTLDVDKIKLELFYETGTGTVSFKDIELVEVAAQLSEDSQTDKQLEEKIDLP
CDC1087_00 QTIEADYSPTLDVDKIKLELFYETGTGTVSFKDIELVEVADQPSENSQTDKQLEEKIDLP
TIGR4 QTIEADYSPTLDVDKIKLELFYETGTGTVSFKDIELVEVADQLSEDSQTDKQLEEKIDLP
**************************************** * **:**************
Prim.cons. QTIEADYSPTLDVDKIKLELFYETGTGTVSFKDIELVEVADQPSEDSQTDKQLEEKIDLP
250 260 270 280 290 300
| | | | | |
D39 IGKKHVFSLADYTYKVENPDVASVKNGILEPLKEGTTNVIVSKDGKEVKKIPLKILASVK
R6 IGKKHVFSLADYTYKVENPDVASVKNGILEPLKEGTTNVIVSKDGKEVKKIPLKILASVK
Taiwan19F_14 IGKKHVFSLADYTYKVENPDVASVKNGILEPLKEGTTNVIVSKDGKEVKKIPLKILASVK
Hungary19A_6 IGKKHVFSLADYTYKVENPDVASVKNGILEPLKEGTTNVIVSKDGKEVKKIPLKILASVK
CGSP14 IGKKHVFSLADYTYKVENPDVASVKNGILEPLKEGTTNVIVSKDGKEVKKIPLKILASVK
G54 IGKKHVFSLADYTYKVENPDVASVKNGILEPLKEGTTNVIVSKDGKEVKKIPLKILASVK
P1031 IGKKHVFSLADYTYKVENPDVASVKNGILEPLKGGTTNVIVSKDGKEVKKIPLKILASVK
CDC1087_00 IGKKHVFSLADYTYKVENPDVASVKNGILEPLKEGTTNVIVSKDGKEVKKIPLKILASVK
TIGR4 IGKKHVFSLADYTYKVENPDVASVKNGILEPLKEGTTNVIVSKDGKEVKKIPLKILASVK
********************************* **************************
Prim.cons. IGKKHVFSLADYTYKVENPDVASVKNGILEPLKEGTTNVIVSKDGKEVKKIPLKILASVK
111
310 320 330 340 350 360
| | | | | |
D39 DTYTDRLDDWNGIIAGNQYYDSKNEQMAKLNQELEGKVADSLSSISSQADRIYLWEKFSN
R6 DTYTDRLDDWNGIIAGNQYYDSKNEQMAKLNQELEGKVADSLSSISSQADRIYLWEKFSN
Taiwan19F_14 DAYTDRLDDWNGIIAGNQYYDSKNEQMAKLNQELEGKVADSLSSISSQADRIYLWEKFSN
Hungary19A_6 DTYTDRLDDWNGIIAGNQYYDSKNEQMAKLNQELEGKVADSLSSISSQADRTYLWEKFSN
CGSP14 DTYTDRLDDWNGIIAGNQYYDSKNEQMAKLNQELEGKVADSLSSISSQADRTYLWEKFSN
G54 DAYTARLDDWNGIIAGNQYYDSKNEQMAKLNQELEGKVADSLSSISSQADRTYLWEKFSN
P1031 DTYTDRLDDWNGIIAGNQYYDSKNEQMAKLNQELEGKVADSLSSISSQADRTYLWEKFSN
CDC1087_00 DTYTDRLDDWNGIIAGNQYYDSKNEQMAKLNQELEGKVADSLSSISSQAARTYLWEKFSN
TIGR4 DAYTDRLDDWNGIIAGNQYYDSKNEQMAKLNQELEGKVADSLSSISSQADRTYLWEKFSN
*:** ******************************************** * ********
Prim.cons. DTYTDRLDDWNGIIAGNQYYDSKNEQMAKLNQELEGKVADSLSSISSQADRTYLWEKFSN
370 380 390 400 410 420
| | | | | |
D39 YKTSANLTATYRKLEEMAKQVTNPSSRYYQDETVVRTVRDSMEWMHKHVYNSEKSIVGNW
R6 YKTSANLTATYRKLEEMAKQVTNPSSRYYQDETVVRTVRDSMEWMHKHVYNSEKSIVGNW
Taiwan19F_14 YKTSANLTATYRKLEEMAKQVTNPSSRYYKDETVVRTVRDSMEWMHKHVYNSEKSIVGNW
Hungary19A_6 YKTSANLTATYRKLEEMAKQVTNPSSRYYQDETVVRTVRDSMEWMHKHVYNSEKSIVGNW
CGSP14 YKTSANLTATYRKLEEMAKQVTNPSSRYYQDETVVRTVRDSMEWMHKHVYNSEKSIVGNW
G54 YKMSANLTATYRKLEEMAKQVTNPSSRYYQDETVVRTVRDSMEWLHKHVYNSEKSIVGNW
P1031 YKTSANLTATYRKLEEMAKQVTNPSSRYYQDETVVRTVRDSMEWMHKHVYNSEKSIVGNW
CDC1087_00 YKTSANLTVTYRKLEEMAKQVTNPSSRYYQDETVVRTVRDSMEWLHKHVYNSEKSIVGNW
TIGR4 YKTSANLTATYRKLEEMAKQVTNPSSRYYQDETVVRTVRDSMEWMHKHVYNSEKSIVGNW
** *****.********************:**************:***************
Prim.cons. YKTSANLTATYRKLEEMAKQVTNPSSRYYQDETVVRTVRDSMEWMHKHVYNSEKSIVGNW
430 440 450 460 470 480
| | | | | |
D39 WDYEIGTPRAINNTLSLMKEYFSDEEIKKYTDVIEKFVPDPEHFRKTTDNPFKALGGNLV
R6 WDYEIGTPRAINNTLSLMKEYFSDEEIKKYTDVIEKFVPDPEHFRKTTDNPFKALGGNLV
Taiwan19F_14 WDYEIGTPRAINNTLSLMKEYFSDEEIKKYTDVIEKFVPDPEHFRKTTDNPFKALGGNLV
Hungary19A_6 WDYEIGTPRAINNTLSLMKEYFSDEEIKKYTDVIEKFVPDPEHFRKTTDNPFKALGGNLV
CGSP14 WDYEIGTPRAINNTLSLMKEYFSDEEIKKYTDVIEKFVPDPEHFRKTTDNPFKALGGNLV
G54 WDYEIGTPRAINNTLSLMKEYFSDEEIKKYTDVIEKFVPDPEHFRKTTDNPFKALGGNLV
P1031 WDYEIGTPRAINNTLSLMKEYFSDEEIKKYTDVIEKFVPDPEHFRKTTDNPFKALGGNLV
CDC1087_00 WDYEIGTPRAINNTLSLMKEYFSDEEIKKYTDVIEKFVPDPEHFRKTTDNPFKALGGNLV
TIGR4 WDYEIGTPRAINNTLSLMKEYFSDEEIKKYTDVIEKFVPDPEHFRKTTDNPFKALGGNLV
************************************************************
Prim.cons. WDYEIGTPRAINNTLSLMKEYFSDEEIKKYTDVIEKFVPDPEHFRKTTDNPFKALGGNLV
490 500 510 520 530 540
| | | | | |
D39 DMGRVKVIAGLLRKDDQEISSTIRSIEQVFKLVDQGEGFYQDGSYIDHTNVAYTGAYGNV
R6 DMGRVKVIAGLLRKDDQEISSTIRSIEQVFKLVDQGEGFYQDGSYIDHTNVAYTGAYGNV
Taiwan19F_14 DMGRVKVIAGLLRKDDQEISSTIRSIEQVFKLVDQGEGFYQDGSYIDHTNVAYTGAYGNV
Hungary19A_6 DMGRVKVIAGLLRKDDQEISSTIRSIEQVFKLVDQGEGFYQDGSYIDHTNVAYTGAYGNV
CGSP14 DMGRVKVIAGLLRKDDQEISSTIRSIEQVFKLVDQGEGFYQDGSYIDHTNVAYTGAYGNV
G54 DMGRVKVIAGLLRKDDQEISSTIRSIEQVFKLVDQGEGFYQDGSYIDHTNVAYTGAYGNV
P1031 DMGRVKVIAGLLRKDDQEISSTIRSIEQVFKLVDQGEGFYQDGSYIDHTNVAYTGAYGNV
CDC1087_00 DMGRVKVIAGLLRKDDQEISSTIRSIEQVFKLVDQGEGFYQDGSYIDHTNVAYTGAYGNV
TIGR4 DMGRVKVIAGLLRKDDQEISSTIRSIEQVFKLVDQGEGFYQDGSYIDHTNVAYTGAYGNV
************************************************************
Prim.cons. DMGRVKVIAGLLRKDDQEISSTIRSIEQVFKLVDQGEGFYQDGSYIDHTNVAYTGAYGNV
550 560 570 580 590 600
| | | | | |
D39 LIDGLSQLLPVIQKTKNPIDKDKMQTMYHWIDKSFAPLLVNGELMDMSRGRSISRANSEG
R6 LIDGLSQLLPVIQKTKNPIDKDKMQTMYHWIDKSFAPLLVNGELMDMSRGRSISRANSEG
Taiwan19F_14 LIDGLSQLLPVIQKTKNPIDKDKMQTMYHWIDKSFAPLLVNGELMDMSRGRSISRANSEG
Hungary19A_6 LIDGLSQLLPVIQKTKNPIDKDKMQTMYHWIDKSFAPLLVNGELMDMSRGRSISRANSEG
CGSP14 LIDGLSQLLPVIQKTKSPIDKDKMQTMYHWIDKSFAPLLVNGELMDMSRGRSISRANSEG
G54 LIDGLSQLLPVIQKTKSPIDKDKMQTMYHWIDKSFAPLLVNGELMDMSRGRSISRANSEG
P1031 LIDGLSQLLPVIQKTKNPIDKDKMQTMYHWIDKSFAPLLVNGELMDMSRGRSISRANSEG
CDC1087_00 LIDGLSQLLPVIQKTKSPIDKDKMQTMYHWIDKSFAPLLVNGELMDMSRGRSISRANSEG
TIGR4 LIDGLSQLLPVIQKTKNPIDKDKMQTMYHWIDKSFAPLLVNGELMDMSRGRSISRANSEG
****************.*******************************************
Prim.cons. LIDGLSQLLPVIQKTKNPIDKDKMQTMYHWIDKSFAPLLVNGELMDMSRGRSISRANSEG
112
610 620 630 640 650 660
| | | | | |
D39 HVAAVEVLRGIHRIADMSEGETKQRLQSLVKTIVQSDSYYDVFKNLKTYKDISLMQSLLS
R6 HVAAVEVLRGIHRIADMSEGETKQRLQSLVKTIVQSDSYYDVFKNLKTYKDISLMQSLLS
Taiwan19F_14 HVAAVEVLRGIHRIADMSEGETKQRLQSLVKTIVQSDSYYDVFKNLKTYKDISLMQSLLS
Hungary19A_6 HVAAVEVLRGIHRIADMSEGETKQRLQSLVKTIVQSDSYYDVFKNLKTYKDISLMQSLLS
CGSP14 HVAAVEVLRGIHRIADMSEGETKQRLQSLVKTIVQSDSYYDVFKNLKTYKDISLMQSLLS
G54 HVAAVEVLRGIHRIADMSEGETKQRLQSLVKTIVQSDSYYDVFKNLKTYKDISLMQSLLS
P1031 HVAAVEVLRGIHRIADMSEGETKQRLQSLVKTIVQSDSYYDVFKNLKTYKDISLMQSLLS
CDC1087_00 HVAAVEVLRGIHRIADMSEGETKQRLQSLVKTIVQSDSYYDVFKNLKTYKDISLMQSLLS
TIGR4 HVAAVEVLRGIHRIADMSEGETKQCLQSLVKTIVQSDSYYDVFKNLKTYKDISLMQSLLS
************************ ***********************************
Prim.cons. HVAAVEVLRGIHRIADMSEGETKQRLQSLVKTIVQSDSYYDVFKNLKTYKDISLMQSLLS
670 680 690 700 710 720
| | | | | |
D39 DAGVASVPRTSYLSAFNKMDKTAMYNAEKGFGFGLSLFSSRTLNYEHMNKENKRGWYTSD
R6 DAGVASVPRTSYLSAFNKMDKTAMYNAEKGFGFGLSLFSSRTLNYEHMNKENKRGWYTSD
Taiwan19F_14 DAGVASVPRTSYLSAFNKMDKTAMYNAEKGFGFGLSLFSSRTLNYEHMNKENKRGWYTSD
Hungary19A_6 DAGVASVPRPSYLSAFNKMDKTAMYNAEKGFGFGLSLFSSRTLNYEHMNKENKRGWYTSD
CGSP14 DAGVASVPRTSYLSAFNKMDKTAMYNAEKGFGFGLSLFSSRTLNYEHMNKENKRGWYTSD
G54 DAGVASVPRPSYLSAFNKMDKTAMYNAEKGFGFGLSLFSSRTLNYEHMNKENKRGWYTSD
P1031 DAGVASVPRPSYLSAFNKMDKTAMYNAEKGFGFGLSLFSSRTLNYEHMNKENKRGWYTSD
CDC1087_00 DAGVASVPRPSYLSAFNKMDKTAMYNAEKGFGFGLSLFSSRTLNYEHMNKENKRGWYTSD
TIGR4 DAGVASVPRPSYLSAFNKMDKTAMYNAEKGFGFGLSLFSSRTLNYEHMNKENKRGWYTSD
*********.**************************************************
Prim.cons. DAGVASVPRPSYLSAFNKMDKTAMYNAEKGFGFGLSLFSSRTLNYEHMNKENKRGWYTSD
730 740 750 760 770 780
| | | | | |
D39 GMFYLYNGDLSHYSDGYWPTVNPYKMPGTTETDAKRADSDTGKVLPSAFVGTSKLDDANA
R6 GMFYLYNGDLSHYSDGYWPTVNPYKMPGTTETDAKRADSDTGKVLPSAFVGTSKLDDANA
Taiwan19F_14 GMFYLYNGDLSHYSDGYWPTVNPYKMPGTTETDAKRADSDTGKVLPSAFVGTSKLDDANA
Hungary19A_6 GMFYLYNGDLSHYSDGYWPTVNPYKMPGTTETDAKRADSDTGKVLPSAFVGTSKLDDANA
CGSP14 GMFYLYNGDLSHYSDGYWPTVNPYKMPGTTETDAKRADSDTGKVLPSAFVGTSKLDDANA
G54 GMFYLYNGDLSHYSDGYWPTVNPYKMPGTTETDAKRADSDTGKVLPSAFVGTSKLDDANV
P1031 GMFYLYNGDLSHYSDGYWPTVNPYKMPGTTETDAKRADSDTGKVLPSAFVGTSKLDDANA
CDC1087_00 GMFYLYNGDLSHYSDGYWPTVNPYKMPGTTETDAKRADSDTGKVLPSAFVGTSKLDDANA
TIGR4 GMFYLYNGDLSHYSDGYWPTVNPYKMPGTTETDAKRADSDTGKVLPSAFVGTSKLDDANA
***********************************************************.
Prim.cons. GMFYLYNGDLSHYSDGYWPTVNPYKMPGTTETDAKRADSDTGKVLPSAFVGTSKLDDANA
790 800 810 820 830 840
| | | | | |
D39 TATMDFTNWNQTLTAHKSWFMLKDKIAFLGSNIQNTSTDTAATTIDQRKLESSNPYKVYV
R6 TATMDFTNWNQTLTAHKSWFMLKDKIAFLGSNIQNTSTDTAATTIDQRKLESSNPYKVYV
Taiwan19F_14 TATMDFTNWNQTLTAHKSWFMLKDKIAFLGSNIQNTSTDTAATTIDQRKLESGNPYKVYV
Hungary19A_6 TATMDFTNWNQTLTAHKSWFMLKDKIAFLGSNIQNTSTDTAATTIDQRKLESSNPYKVYV
CGSP14 TATMDFTNWNQTLTAHKSWFMLKDKIAFLGSNIQNTSTDTAATTIDQRKLESSNPYKVYV
G54 TATMDFTNWNQTLTAHKSWFMLKDKIAFLGSNIQNTSTDTAATTIDQRKLESSNPYKVYV
P1031 TATMDFTNWNQTLTAHKSWFMLKDKIAFLGSNIQNTSTDTAATTIDQRKLESSNPYKVYV
CDC1087_00 TATMDFTNWNQTLTAHKSWFMLKDKIAFLGSNIQNTSTDTAATTIDQRKLESSNPYKVYV
TIGR4 TATMDFTNWNQTLTAHKSWFMLKDKIAFLGSNIQNTSTDTAATTIDQRKLESGNPYKVYV
****************************************************.*******
Prim.cons. TATMDFTNWNQTLTAHKSWFMLKDKIAFLGSNIQNTSTDTAATTIDQRKLESSNPYKVYV
850 860 870 880 890 900
| | | | | |
D39 NDKEASLTEQEKDYPETQSVFLESSDSKKNIGYFFFKKSSISMSKALQKGAWKDINEGQS
R6 NDKEASLTEQEKDYPETQSVFLESSDSKKNIGYFFFKKSSISMSKALQKGAWKDINEGQS
Taiwan19F_14 NDKEASLTEQEKDYPETQSVFLESSDSKKNIGYFFFKKSSISMSKALQKGAWKDINEGQS
Hungary19A_6 NDKEASLTEQEKDYPETQSVFLESSDSKKNIGYFFFKKSSISMSKALQKGAWKDINEGQS
CGSP14 NDKEASLTEQEKDYPETQSVFLESSDSKKNIGYFFFKKSSISMSKALQKGAWKDINEGQS
G54 NDKEASLTEQEKDYPETQSVFLESFDSKKNIGYFFFKKSSISMSKALQKGAWKDINEGQS
P1031 NDKEASLTEQEKDYPETQSVFLESSDSKKNIGYFFFKKSSISMSKALQKGAWKDINEGQS
CDC1087_00 NDKEASLTEQEKDYPETQSVFLESSDSKKNIGYFFFKKSSISMSKALQKGAWKDINEGQS
TIGR4 NDKEASLTEQEKDYPETQSVFLESFDSKKNIGYFFFKKSSISMSKALQKGAWKDINEGQS
************************ ***********************************
Prim.cons. NDKEASLTEQEKDYPETQSVFLESSDSKKNIGYFFFKKSSISMSKALQKGAWKDINEGQS
113
910 920 930 940 950 960
| | | | | |
D39 DKEVENEFLTISQAHKQNGDSYGYMLIPNVDRATFNQMIKELESSLIENNETLQSVYDAK
R6 DKEVENEFLTISQAHKQNGDSYGYMLIPNVDRATFNQMIKELESSLIENNETLQSVYDAK
Taiwan19F_14 DKEVENEFLTISQAHKQNGDSYGYMLIPNVDRATFNQMIKELESSLIDNNETLQSVYDAK
Hungary19A_6 DKEVENEFLTISQAHKQNGDSYGYMLIPNVDRATFNQMIKELESSLIENNETLQSVYDAK
CGSP14 DKEVENEFLTISQAHKQNGDSYGYMLIPNVDRATFNQMIKELESSLIENNETLQSVYDAK
G54 DKEVENEFLTISQAHKQNGDSYGYMLIPNVDRATFNQMIKELESSLIENSETLQSVYDAK
P1031 DKEVENEFLTISQAHKQNGDSYGYMLIPNVGRATFNQMIKKLESSLIENNETLQSVYDAK
CDC1087_00 DKEVENEFLTISQAHKQNGDSYGYMLIPNVDRATFNQMIKELESSLIENNETLQSVYDAK
TIGR4 DKEVENEFLTISQAHKQNRDSYGYMLIPNVDRATFNQMIKELESSLIENNETLQSVYDAK
****************** ***********.*********:******:*.**********
Prim.cons. DKEVENEFLTISQAHKQNGDSYGYMLIPNVDRATFNQMIKELESSLIENNETLQSVYDAK
970 980 990 1000 1010 1020
| | | | | |
D39 QGVWGIVKYDDSVSTISNQFQVLKRGVYTIRKEGDEYKIAYYNPETQESAPDQEVFKKLE
R6 QGVWGIVKYDDSVSTISNQFQVLKRGVYTIRKEGDEYKIAYYNPETQESAPDQEVFKKLE
Taiwan19F_14 QGVWGIVKYDDSVSTISNQFQVLKRGVYIIRKEGDEYKIAYYNPETQESAPDQEVFKKLE
Hungary19A_6 QGVWGIVKYDDSVSTISNQFQVLKRGVYTIRKEGDEYKIAYYNPETQESAPDQEVFKKLE
CGSP14 QGVWGIVKYDDSVSTISNQFQVLKRGVYTIRKEGDEYKIAYYNPETQESAPDQEVFKKLE
G54 QGVWGIVKYDDSVSTISNQFQVLKRGVYTIRKEGDEYKIAYYNPETQESAPDQEVFKKLE
P1031 QGVWGIVKYDDSVSTISNQFQVLKRGVYTIRKEGDEYKIAYYNPETQESAPDQEVFKKLE
CDC1087_00 QGVWGIVKYDDSVSTISNQFQVLKRGVYTIRKEGDEYKIAYYNPETQESAPDQEVFKKLE
TIGR4 QGVWGIVKYDDSVSTISNQFQVLKRGVYTIRKEGDEYKIAYYNPETQESAPDQEVFKKLE
**************************** *******************************
Prim.cons. QGVWGIVKYDDSVSTISNQFQVLKRGVYTIRKEGDEYKIAYYNPETQESAPDQEVFKKLE
1030 1040 1050 1060 1070
| | | | |
D39 QAAQPQVQNSKEKEKSEEEKNHSDQKNLPQTGEGQSILASLGFLLLGAFYLFRRGKNN
R6 QAAQPQVQNSKEKEKSEEEKNHSDQKNLPQTGEGQSILASLGFLLLGAFYLFRRGKNN
Taiwan19F_14 QATQPQVQNSKEKEKSEEEKNHSDQKNLPQTGEGQSILASLGFLLLGAFYLFRRGKNN
Hungary19A_6 QAAQPQVQNSKEKEKSEEEKNHSDQKNLPQTGEGQSILASLGFLLLGAFYLFRRGKNN
CGSP14 QAAQPQVQNSKEKEKSEEEKNHSDQKNLPQTGEGQSILASLGFLLLGAFYLFRRGKNN
G54 QAAQPQVQNSKEKEKSEEEKNHSDQKNLPQTGEGQSILASLGFLLLGAFYLFRRGKNN
P1031 QAAQPQVQNSKEKEKSEEEKNHSDQKNLPQTGEGQSILASLGFLLLGAFYLFRRGKNN
CDC1087_00 QAAQLQVQNSKEKEKSEEEKNHSDQKNLPQTGEGQSILASLGFLLLGAFYLFRRGKNN
TIGR4 QAAQPQVQNSKEKEKSEEEKNHSDQKNLPQTGEGQSILASLGFLLLGAFYLFRRGKNN
**:* *****************************************************
Prim.cons. QAAQPQVQNSKEKEKSEEEKNHSDQKNLPQTGEGQSILASLGFLLLGAFYLFRRGKNN
114
APÊNDICE C
Apêndice C.1 – Freqüência de códons em B. subtilis para a seqüência do gene clpP
antes da otimização
Análise de freqüência de códons realizada pelo programa Graphical Codon
Usage Analyser 2.0, disponível no sítio www.gcua.de.
115
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Apêndice C.2 – Freqüência de códons em B. subtilis para a seqüência do gene clpP
otimizado
Análise de freqüência de códons realizada pelo programa Graphical Codon
Usage Analyser 2.0, disponível no sítio www.gcua.de.
117
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AKHTAR, M.S., BHAKUNI, V., 2004, “Streptococcus pneumoniae hyaluronate lyase:
An overview”, Current Science, v.86 (Jan), n.2, p.285-295.
ALMEIDA, R.V., 2001, Clonagem e Expressão do Gene de uma Lipase de
Pyrococcus furiosus em Escherichia coli. Dissertação de M.Sc., COPPE/UFRJ, Rio de
Janeiro, RJ, Brasil.
ALTSCHUL, S. F., GISH, W., MYERS, E. W. et al., 1990, "Basic Local Alignment
Search Tool", Journal of Molecular Biology, v. 215, n.3, pp. 403-410.
ANDERSSON, L., YANG, S., NEUBAUER, P., 1996, “Impact of plasmid presence
and induction on cellular responses in fed batch cultures of Escherichia coli”, Journal
of Biotechnology, v. 46, p.255-263.
BAHERI, H.R., HILL, G.A., ROESLER W.J., 2001, “Modelling plasmid instability in
batch and continuous fermentors”, Biochemical Engineering Journal, v.8, p.45-50.
BANEYX, F., 1999, "Recombinant protein expression in Escherichia coli", Current
Opinion in Biotechnology, v. 10, p. 411-421.
BAROCCHI, M.A., CENSINI, S., RAPPUOLI, R., 2007, “Vaccines in the era of
genomics: The pneumococcal challenge”, Vaccine, v.25, p.2963–2973.
BENDTSEN, J.D., NIELSEN, H., VON HEIJNE, G. et al., 2004, “Improved Prediction
of Signal Peptides: SignalP 3.0”, Journal of Molecular Biology, v. 340, pp. 783-
795.
BERRY, A.M., LOCK, R.A., THOMAS, S.M. et al., 1994, “Cloning and Nucleotide
Sequence of the Streptococcus pneumoniae Hyaluronidase Gene and Purification of the
Enzyme from Recombinant Escherichia coli”, Infection and Immunity, v. 62 (Mar),
n.3, p.1101-1108.
119
BOGAERT, D., HERMANS, P.W.M., ADRIAN, P.V. et al., 2004, “Pneumococcal
vaccines: an update on current strategies”, Vaccine, v.22, p.2209–2220.
BRAIDO, F., BELLOTTI, M., MARIA, A.D. et al., 2008, “The role of Pneumococcal
vaccine”, Pulmonary Pharmacology and Therapeutics, v.21, p.608– 615.
CAO, J., LI D., GONG, Y. et al., 2009, “Caseinolytic protease: a protein vaccine which
could elicit serotype-independent protection against invasive pneumococcal infection”,
Clinical and Experimental Immunology, v.156, p.52-60.
CAO, J., CHEN T., LI D. et al., 2008, “Mucosal immunization with purified ClpP could
elicit protective efficacy against pneumococcal pneumonia and sepsis in mice”,
Microbes and Infection, v.10, p.1536-1542.
CAO, J., CHEN, D., XU, W. et al., 2007, “Enhanced protection against pneumococcal
infection elicited by immunization with the combination of PspA, PspC, and ClpP”,
Vaccine, v.25, p. 4996–5005.
CAO, Y., XIA, Q., FANG, B. et al., 2006, “Optimization of expression of dhaT gene
encoding 1,3-propanediol oxidoreductase from Klebsiella pneumonia in Escherichia
coli using the methods of uniform design and regression analysis”, Journal of
Chemical Technology and Biotechnology, v.81, p.109-112.
CHIAVOLINI, D., MEMMI, G., MAGGI, T. et al., 2003, “The three extra-cellular zinc
metalloproteinases of Streptococcus pneumoniae have a diferent impact on virulence in
mice”, BMC Microbiology, v.3(Jul), n.1, p.1-9.
CHUAN, Y. P., LUA, L.H.L., MIDDELBERG A.P.J., 2008, “High-level expression of
soluble viral structural protein in Escherichia coli”, Journal of Biotechnology, v.134,
p.64–71.
120
CHOI, J.H., KEUM, K.C., LEE, S.Y., 2006, “Production of recombinant proteins by
high cell density culture of Escherichia coli”, Chemical Engineering Science, v.61, p.
876 – 885.
CORCHERO, J.L., VILLAVERDE A., 1998, “Plasmid Maintenance in Escherichia coli
Recombinant Cultures is Dramatically, Steadily, and Specifically Influenced by
Features of the Encoded Proteins”,
Biotechnology and Bioengineering, v.58, n.6,
p.625-632.
DAGAN, R., FRASCH, C., 2009, “Introduction”, The Pediatric Infectious Disease
Journal, v.28 (Apr.), n.4, p.S63-S65.
DEMAIN, A.L., VAISHNAV, P., 2009, “Production of recombinant proteins by
microbes and higher organisms”, Biotechnology Advances, v.27, p.297–306.
DI GUILMI, A.M., DESSEN, A., 2002, “New approaches towards the identification of
antibiotic and vaccine targets in Streptococcus pneumoniae”, EMBO reports, v.3,
p.728-734.
DING F., TANG P., HSU M., et al., 2009, “Genome evolution driven by host
adaptations results in a more virulent and antimicrobial-resistant Streptococcus
pneumoniae serotype 14”, BMC Genomics, v.10, n.158, p.1-13.
FERREIRA, L.C.S., FERREIRA, R. C.C., SCHUMANN, W., 2005, “Bacillus subtilis
as a tool for vaccine development: from antigen factories to delivery vectors”, Anais da
Academia Brasileira de Ciências , v.77, n.1, p.113-124.
FRIEHS, K., 2004, “Plasmid Copy Number and Plasmid Stability” Advances in
Biochemical Engineering Biotechnology, v.86, p.47–82.
FU, L.L., XU, Z.R., LI, W.F. et al., 2007, “Protein secretion pathways in Bacillus
subtilis: Implication for optimization of heterologous protein secretion”, Biotechnology
Advances, v.25, p.1-12.
121
GARCÍA-SUÁREZ, M.M., VÁZQUEZ, F., MÉNDEZ, F. J., 2006, “Streptococcus
pneumoniae virulence factors and their clinical impact: an update”, Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica, p.512-517, 2006.
GRIBUN, A., KIMBER, M. S., CHING, R. et al., 2005, “The ClpP Double Ring
Tetradecameric Protease Exhibits Plastic Ring-Ring Interactions, and the N Termini of
Its Subunits Form Flexible Loops That Are Essential for ClpXP and ClpAP Complex
Formation”, The Journal of Biological Chemistry, v.280, n.16 (abril), p.16185-16196.
GRIMPREL, E., 2009, “Segurança e imunogenicidade de uma vacina pneumocócica
conjugada 13-valente administrada com a vacinação pediátrica de rotina em bebês
sadios na França”. In: Foco em Vacina Pneumocócica Conjugada: atual e futura,
p.8-10.
GUPTA, R., SHARMA, P., VYAS, V.V., 1995, “Effect of growth environment on the
stability of a recombinant shuttle plasmid, pCPPS-31, in Escherichia coli”, Journal of
Biotechnology, v.41, p.29-37.
HAN G.H., SHIN H., KIM, S.W., 2008, “Optimization of bio-indigo production by
recombinant E. coli harboring fmo gene”, Enzyme and Microbial Technology, v.42,
p.617–623.
HANNING, G., MAKRIDES, S. C., 1998, “Strategies for optimizing heterologous
protein expression in Escherichia coli”, Trends in Biotechnology, v.16, p.54-60.
ISLAM, R.S., TISI, D., LEVY, M.S. et al., 2007, “Framework for the rapid
optimization of soluble protein expression in Escherichia coli combining microscale
experiments and statistical experimental design”, Biotechnology Progress, v. 23, p.785-
793.
JANA, S., DEB, J. K., 2005, “Strategies for efficient production of heterologous
proteins in Escherichia coli”, Applied Microbiology and Biotechnology, v.67, p. 289-
298.
122
JEDRZEJAS, M.J., 2001, “Pneumococcal Virulence Factors: Structure and Function”,
Microbiology and Molecular Biology Reviews, v.65 (Jun), n.2, p. 187–207.
KIM, D. Y., KIM, K. K., 2008, “The Structural Basis for the Activation and Peptide
Recognition of Bacterial ClpP”, Journal of Molecular Biology, V.379, p.760–771.
KADIOGLU, A., WEISER, J.N., PATON, J.C. et al., 2008, “The role of Streptococcus
pneumonia virulence factors in host respiratory colonization and disease”, Nature
Reviews Microbiology, v.6 (abril), p.288-301.
KWON, H.Y., OGUNNIYI, A. D., CHOI, M. et al., 2004, “The ClpP Protease of
Streptococcus pneumoniae Modulates Virulence Gene Expression and Protects against
Fatal Pneumococcal Challenge”, Infection and Immunity, v.72, n.10 (Out.), p.5646-
5653.
LARENTIS, A. L., ALMEIDA, R. V., MARTINS, O. B., ALVES, T. L. M., 2006,
Engenharia de Bioprocessos Recombinantes. Escola Piloto Virtual do Programa de
Engenharia Química/COPPE.
LEÓN, A.D., ISLÃS, H.J., CUEVAS, M.G. et al., 2004, “Analysis of the expression of
the Trichoderma harzianum ech42 gene in two isogenic clones of Escherichia coli by
surface response methodology”, Process Biochemistry, v.39, p.2173-2178.
LI, W., ZHOU, X., LU, P., 2004, “Bottlenecks in the expression and secretion of
heterologous proteins in Bacillus subtilis”, Research in Microbiology, v.155, p.605–
610.
LO, P.K., HASSAN, O., AHMAD, A. et al., 2007, “Excretory over-expression of
Bacillus sp. G1 cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) in Escherichia coli:
Optimization of the cultivation conditions by response surface methodology”, Enzyme
and Microbial Technology, v. 40, p.1256-1263.
123
LOBATO, F., 2010, “Bio-Manguinhos assina cooperação para introduzir a vacina
pneumocócica no calendário nacional e desenvolver imunizantes contra dengue, febre
amarela e malária” BioNotícias - Publicação Bimestral de Bio-Manguinhos/Fiocruz,
n.42 (Jan).
MAKRIDES, S.C., 1996, “Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in
Escherichia coli”, Microbiological Reviews, v.60 (Sept), n.3, p.512-538.
MALDONADO, L.M.T.P., HERNÁNDEZ, V.E.B., RIVERO, E.M. et al., 2007,
“Optimization of culture conditions for a synthetic gene expression in Escherichia coli
using response surface methodology: the case of human interferon beta”, Biomolecular
Engineering, v.24, p.217-222.
MARÍ, Y.M., ESPINOSA, A.E.S., UBIETA, R. et al., 1999, “Effect of the Selection
Marker on the Viability and Plasmid Stability of Two Human Proteins with
Neurotrophic Action Expressed in Escherichia coli”, Biochemical and Biophysical
Research Communications, v.258, p. 29–31.
MERGULHÃO, F.J.M., SUMMERS, D.K., MONTEIRO, G.A., 2005, “Recombinant
protein secretion in Escherichia coli”, Biotechnology Advances, v.23, p.177–202.
MISTRY, D., STOCKLEY, R. A., 2006, “IgA1 protease”, The International Journal
Of Biochemistry & Cell Biology, v.38, p. 1248-1248.
NGUYEN, H. D., NGUYEN, Q. A., FERREIRA, R. C. et al., 2005, “Construction of
plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural
stability”, Plasmid, v.54, p.241–248.
NIKAREL, I.E., TOKSOY, E., KIRDAR, B. et al., 2005, “Optimizing medium
composition for TaqI endonuclease production by recombinant Escherichia coli cells
using response surface methodology”, Process Biochemistry, v.40, p1633-1639.
124
NIKAREL, I.E., ÖNER, E., KIRDAR, B. et al., 2006, “Optimization of medium
composition for biomass production of recombinant Escherichia coli cells using
response surface methodology”, Biochemical Engineering Journal, v.32, p.1-6.
NOVAK R, HENRIQUES B, CHARPENTIER E. et al., 1999, “Emergence of
vancomycin tolerance in Streptococcus pneumonia”, Nature, v.399, p.590–593.
OGUNNIYI, A.D., GRABOWICS, M., BRILES, D.E. et al., 2007, “Development of a
vaccine against invasive pneumococcal disease based on combinations of virulence
proteins of Streptococcus pneumoniae”, Infection and Immunity, v.75, p.350-357.
OMS (Organização Mundial da Saúde), 2007, “Pneumococcal conjugate vaccine for
childhood immunization – WHO position paper”, Weekly epidemiological record,
v.82, n.12, p.93-104. Disponível em: <http://www.who.int/wer/2007/wer8212.pdf>,
Acesso em: 18/12/2009.
PAOLIS, F., BEGHETTO, E., SPADONI, A. et al., 2007, “Identification of a human
immunodominant B-cell epitope within the immunoglobulin A1 protease of
Streptococcus pneumonia”, BMC Microbiology, 7:113, p.
PATON, J.C., 1998, “Novel Pneumococcal surface proteins: role in virulence and
vaccine potencial”, Trends in Microbiology, v.6, p.85-87.
PETI, W., PAGE, R., 2007, “Strategies to maximize heterologous protein expression in
Escherichia coli with minimal cost”, Protein Expression and Purification, v.51, p.1–
10.
PLETZ, M.W., MAUS, U., KRUG, N. et al., 2008, “Pneumococcal vaccines:
mechanism of action, impact on epidemiology and adaption of the species”,
International Journal of Antimicrobial Agents, v.32, n.3, p.199-206.
125
PONNURAJ, K., JEDRZEJAS, M.J., 2000, “Mechanism of hyaluronan binding and
degradation: structure of Streptococcus pneumoniae hyaluronate lyase in complex with
hyaluronic acid disaccharide at 1.7 A resolution”, Journal of Molecular Biology, v.299
(Jun), n.4, p.885-895.
POULSEN, K., REINHOLDT J., JESPERSGAARD C. et al., 1998, “A Comprehensive
Genetic Study of Streptococcal immunoglobulin A1 Proteases: Evidence for
Recombination within and between Species”, Infection and Immunity, v.66 (Jan), n.1,
p. 181-190.
REN, X., YU, D., HAN, S. et al., 2006, “Optimization of recombinant
hyperthermophilic esterase production from agricultural waste using response surface
methodology”, Bioresource Technology, v. 97, p.2345-2349.
RODRIGUES E IEMMA, 2005, Planejamento de Experimentos e Otimização de
Processos – Uma estratégia seqüencial de planejamentos, 1ed., São Paulo, Brasil,
Editora Casa do Pão.
ROMANELLO, V., MARCACCI, M., DAL MOLIN, F. et al.,2006, “Cloning,
expression, purification, and characterization of Streptococcus pneumoniae IgA1
protease”, Protein Expression and Purification, v.45, p.142–149.
SCHUMANN, W., FERREIRA, L. C. S., 2004, “Production of recombinant proteins in
Escherichia coli”, Genetics and Molecular Biology, v.27, p.442-453.
SCHWAAB, M., PINTO, J.C., 2007, Análise da Dados Experimentais, I:
fundamentos de estatística e estimação de parâmetros. 1ed. Rio de Janeiro, Brasil,
Editora e-papers.
SILVA, M., 2005, Clonagem, Expressão e Purificação das Proteínas de Superfície,
PsaA e fragmentos de PspA de Streptococcus pneumoniae. Tese de D.Sc., IPT/USP,
São Paulo, SP, Brasil.
126
SNEATH. P. H.A., BERGEY, D. H., 1986, “Gram-positive Bacteria other than
Actinomycetes”. In: Holt J.G. (eds), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1
ed., v.2, Baltimore, USA, Williams & Wilkins.
SØRENSEN, H.P., MORTENSEN, K.K., 2005, “Advanced genetic strategies for
recombinant protein expression in Escherichia coli”, Journal of Biotechnology, v.115,
p.113–128.
SUNITHA, K., KIM, Y., LEE, J. et al., 2000, “Statistical optimization of seed and
induction conditions to enhance phytase production by recombinant Escherichia coli”,
Biochemical Engineering Journal, v.5, p.51-56
SWALLEY, S.E., FULGHUM J.R., CHAMBERS, S.P., 2006, “Screening factors
effecting a response in soluble protein expression: Formalized approach using design of
experiments”, Analytical Biochemistry, v.351, p.122–127.
SWARTZ, J.R., 2001, “Advances in Escherichia coli production of therapeutic
proteins”, Current Opinion in Biotechnology, v.12, p.195–201.
TERPE, K., 2006, “Overview of bacterial expression systems for heterologous protein
production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems”,
Applied Microbiology and Biotechnology, v.72, p.211-222.
THOMPSON, J. D., HIGGINS, D. G., GIBSON, T. J., 1994, “Clustal W: Improving the
Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment through Sequence Weigthing,
Position-Specific Gap Penalties and Weigth Matrix Choice”, Nucleic Acids Research,
v. 22, p.4673-4680.
TOKSOY, E., ÖNSAN, Z.Í., KIRDAR, B., 2002, “High-level production of TaqI
restriction endonuclease by three different expression systems in Escherichia coli cells
using the T7 phage promoter”, Applied Microbiology and Biotechnology, v.59, p.239-
245.
127
TOMAZETTO, G., MULINARI, F., STANISÇUASKI, F. et al., 2007, “Expression
kinetics and plasmid stability of recombinant E. coli encoding urease-derived peptide
with bioinsecticide activity”, Enzyme and Microbial Technology, v.41, p.821-827.
XU, J., LI, W., WU, J. et al., 2006, “Stability of plasmid and expression of a
recombinant gonadotropin-releasing hormone (GnRH) vaccine in Escherichia coli”,
Applied Microbiology and Biotechnology, v.73, p.780–788.
WANG, Y.H., JING, C.F., YANG, B. et al., 2005, “Production of a new sea anemone
neurotoxin by recombinant Escherichia coli: Optimization of culture conditions using
response surface methodology”, Process Biochemistry, v.40, p.2721–2728.
WATSON, J. D., GILMAN, M., WITKOWSKI, J. et al., 1992, Recombinant
DNA. 2 ed. New York, Scientific American Books.
WU, X., LEE, W., TRAN, L. et al., 1991, “ Engineering a Bacillus subtilis expression-
secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases”, Journal of
Bacteriology, v. 173 (Ago), n. 16, p.4952-4958.
WYSOCKI, J., TEJEDOR, J.C., GRUNERT, D. et al., 2009, “Immunogenicity of the
10-Valent Pneumococcal Non-Typeable Haemophilus influenza Protein D Conjugate
Vaccine (PHiD-CV) When Coadministered With Different Neisseria miningitidis
Serogroup C Conjugate Vaccines”, The Pediatric Infectious Disease Journal, v.28
(Apr.), n.4, p.S77-S88.
ZAHA, A., FERREIRA, H. B., PASSAGLIA, L. M. P. et al., 1996, “Técnicas de DNA
Recombinante”, Biologia Molecular Básica, ed., Capítulo 15, Porto Alegre, Mercado
Aberto.
ZHANG, X., LI, Y., ZHUGE, B. et al., 2006, “Optimization of 1,3-propanediol
production by novel recombinant Escherichia coli using response surface
methodology”, Journal of Chemical Technology e Biotechnology, v.81, p.1075-1078.
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