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NATHÁLIA COELHO VARGAS
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2009
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências
do Programa de Pós-graduação em Biologia
Animal, para obtenção do título de Magister
Scientiae
DESENVOLVIMENTO NINFAL E MORFOLOGIA DO TRATO
DIGESTIVO E REPRODUTOR DE FÊMEAS DE Phibalosoma phyllinum
(PHASMIDAE)
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ii
Aos meus queridos pais José Ronaldo e Mª Adelina.
Que nunca duvidaram da minha capacidade.
“Mil cairão ao teu lado, e dez mil a tua direita, mas nao chegará a ti”.
Salmo 91, versiculo: 7
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iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me permitido chegar até aqui, por ter me concedido sabedoria,
forças e perseverança para conquistar esta vitória.
A minha mãe Mª Adelina que sempre esteve ao meu lado nos meus momentos
de alegria e angústia, nunca me abandonando.
Ao meu pai José Ronaldo que teve a paciência de me acompanhar e me apoiar
pelas estradas de Muriaé/Viçosa.
Aos meus irmãos, Alexandre e Júnior, e minha cunhada Gisele, pelo incentivo
e amizade.
Ao meu companheiro, Luciano, por tudo e principalmente por em um momento
decisivo, não ter me deixado desistir.
A minha amiga Ana Paula Matta e seu esposo Paulo Roberto, por me
acolherem, incentivar e ajudar sempre. Obrigada!
Ao Professor e Orientador Evaldo Vilela, por ter me dado a oportunidade de
fazer parte deste maravilhoso mundo da pesquisa.
Ao meu co-orientador Zanuncio pelas correções e textos que muito
contribuiram para meu aprendizado.
Ao meu co-orientador Serrão, por ter depositado em mim confiança antes
mesmo de me conhecer. Pela maneira atenciosa e paciente com que se dedicou a mim
nos momentos de orientação. Guardarei sempre a amizade, o respeito e o carinho por
você. Obrigada!
Aos Professores Renato Feio e Fiuza, por sempre me ampararem com uma
palavra de carinho.
Ao Professor Sérgio da Matta, por diversas vezes ter me ajudado e cedido o
seu laboratório.
Ao Coordenador do Curso Professor Jorge Dergan por acreditar em mim.
Aos amigos e companheiros de trabalho: Ana Paula, Diego, Eliana, Fabíola,
Finim, Juliana, Leandro Goulart, Kívia, Michel, Uedson Jacobina, Vinícius (São
Pedro), por serem sempre tão legais, por toda contribuição durante o curso. Espero
iv
conviver outros momentos com vocês, para desfrutarmos um pouco mais desta
amizade que construímos.
Aos funcionários do Departamento de Biologia Animal, em especial ao
Adnilson pela paciência e atenção.
As minhas “amigas- irmãs” Núbia e Marina, pela companhia e amizade mesmo
distantes.
A minha família, tios (as), primos (as), padrinhos e amigos (as) que, sempre,
estiveram ao meu lado.
Aos Professores e funcionários da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras
Santa Marcelina que, desde o início, me incentivaram.
Agradeço a Fundação Zoobotânica de Belo Horizonte, M.G. pela doação dos
insetos e ovos utilizados neste trabalho, e também as informações necessárias sobre os
insetos.
Obrigada a todos!
v
BIOGRAFIA
Nathália Coelho Vargas, filha de José Ronaldo Vargas e Maria Adelina Coelho
Vargas, nasceu em Muriaé, Minas Gerais, em 20 de julho de 1983. Graduada em
Ciências Biológicas pela Faculdade de Filosofia Ciências e Letras Santa Marcelina
(Fafism), em Julho de 2006. Em outubro de 2006 ingressou no curso de Mestrado em
Biologia Animal, no Departamento de Biologia Animal da Universidade Federal de
Viçosa, defendendo dissertação em 03 de Julho de 2009.
vi
SUMÁRIO
RESUMO
....................
.................
....................
....................
....................
....................
....................
vii
ABSTRACT
.............................................................................................................................
........
viii
1.
INTRODUÇÃO
......
....................
....................
....................
....................
....................
...........
......
1
2.
OBJETIVOS
......................................................................................................
.........................
3
3. MATERIAL E MÉTODOS
................................................................................................
.......
4
3.1.
Análise morfométrica e biologia de ninfas de Phibalosoma phyllinum
......................
4
3.2.
Histologia
..............................................................................................................................
5
3.3.
Microscopia Eletrônica de Varredura
..............................................................................
5
4. RESULTADOS
..........................................................................................
.................................
6
4.1.
Morfometria e Biologia
.......................................................................................................
6
4.2. M
orfologia
............................................................................................................................
12
5. DISCUSSÃO
..................................................
..........................................................................
21
6. CONCLUSÃO
................................................................................................
.........................
25
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
..
.............................................................................
...
26
vii
RESUMO
VARGAS, Nathália Coelho Vargas, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, Julho de
2009. Desenvolvimento ninfal e morfologia do trato digestivo e reprodutor de
fêmeas de Phibalosoma phyllinum (Phasmidae). Orientador: Evaldo Ferreira Vilela.
Co-orientadores: José Cola Zanuncio e José Eduardo Serrão.
Phibalosoma phyllinum é o Phasmatodea mais comum no Brasil. O
desenvolvimento ninfal e a morfologia dos principais órgãos do aparelho digestivo e
reprodutor de fêmeas adultas desse inseto foram analisados. Ninfas foram alimentadas
com folhas de goiabeira (Psidium guajava), mangueira (Mangifera indica) e
pitangueira (Eugenia uniflora). Suas ninfas foram medidas a cada cinco dias, para
verificar o tamanho corpóreo, e observações sobre comportamentos e reprodução
foram realizados. Dez instares ninfais foram observados para ninfas alimentadas com
folhas de goiabeira e pitangueira e nove instares naquelas com folhas de mangueira,
com os insetos alimentados com folhas de mangueira e pitangueira apresentando
maior tamanho corporal. O trato digestivo de P. phillyinum apresenta–se como um
tubo alongado pouco diferenciado anatomicamente desde a boca até o ânus. A porção
anterior do intestino médio apresenta a parede pregueada, enquanto a porção posterior
não apresenta pregas. A passagem do intestino médio para o posterior caracteriza-se
por inúmeros túbulos de Malpighi. O intestino fino apresenta uma parede com dobras
do epitélio formado por uma camada única de células, sendo essas cúbicas e com
núcleo esférico. O reto de P. phyllinum é composto por epitélio simples, com células
achatadas e núcleo alongado, apresentando uma luz envolvida por uma cutícula
evidente e uma musculatura mais desenvolvida com fibras longitudinais e circulares.
As fêmeas dessa espécie possuem um par de ovários pectinados que percorrem todo o
abdômen. Uma glândula acessória foi encontrada associada ao sistema reprodutor
abrindo no oviduto comum. Os testes histoquímicos mostraram que a glândula é rica
em carboidratos, proteínas e algum conteúdo lipídico.
viii
ABSTRACT
VARGAS, Nathália Coelho, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, July 2009.
Nymphal development and morphology of digestory and reproductive tracts of
female Phibalosoma phyllinum (Phasmidae). Advisor: Evaldo Ferreira Vilela. Co-
advisors: José Cola Zanuncio and José Eduardo Serrão.
Phibalosoma phyllinum is the Brazilian most common Phasmatodea. The
nymphal development and the morphology of the main organs of both digestive and
reproductive apparatus of the female were studied. Nymphs were fed on guava
(Psidium guajava), mango (Mangifera indica) and Surinam cherry (Eugenia uniflora)
leaves and their body size were measured, and their behavior and reproduction were
observed. Nymphal instars fed on Surinam cherry leaves and on mango developed
bigger body sizes. The digestory tract of P. phillyinum was described as a long,
slightly differing anatomically tube since the mouth up to the anus. The front portion
of middle intestine has folded walls, whereas back portion has no folds. The passage
from middle to posterior intestine is characterized by having numerous Malpighi
tubules. The thin intestine is known for its wall with epidelio folds formed by an only
layer of cells, which are cubic and spherical nucleus. The rectum of P. phyllinum
comprises simple epitelio, with flat cells and long nucleus, presenting a light covered
by an evident cuticle and the musculature more developed with longitudinal and
circular fibers. The females of this species have a pair of pectinada ovaries which pass
through the whole abdomen. An accessory gland was found associated to reproductive
apparatus opened by the common oviduct. Histochemical tests showed that the gland
is rich in carbohydrates, proteins and some lipid content.
1
1. INTRODUÇÃO
Phasmatodea agrupa insetos com forma camuflada imitando gravetos, galhos, folhas
e até líquens, passando muitas vezes despercebidos (Costa-Lima, 1938). A primeira espécie
desta ordem foi descrito no século XVII (Teixeira, 1997), sendo o inseto mencionado boa-
mesa: “Trata-se de uma estranha criatura parecida com um rebento, ou um pedaço de
graveto quebrado, sendo a princípio verde como capim, e, depois amarelo-escuro. Quando
se quer agarrá-lo, salta para longe”.
Aproximadamente 3.000 espécies de Phasmatodea foram descritas, sendo 800 na
região neotropical (Faria et.al., 2004, Whiting et al. 2003). São insetos encontrados do
Leste ao Norte da América do Sul. De modo geral, apresentam corpo alongado,
subcilíndrico, pernas longas e finas com expansões ou espinhos; cabeça pequena livre, com
olhos desenvolvidos, antenas filiformes, asas apenas nos machos; protórax pequeno,
metatórax e mesotórax grandes e abdome formado por 19 urômeros (Costa-Lima, 1938).
A ordem Phasmatodea contém os insetos mais longos conhecidos, sendo:
Bactridium grande, Rehn 1920, cujo tipo (fêmea) tem 265 mm; Otocrania aurita, Bruto
1839, fêmeas podendo apresentar até 245 mm. Phibalosoma phyllinum, Gray, 1835, com
fêmeas atingindo 220 mm de comprimento e é uma das maiores espécies de insetos do
Brasil (Costa-Lima, 1938).
A reprodução de Phasmatodea é sexuada e são ovíparos. No entanto a reprodução
partenogenética, pode ocorrer (Costa-Lima, 1938). A cópula pode durar até 10 dias e após
esse período a fêmea pode permanecer com o cerco aberto por, até, 24 horas. A cópula de
Bactridium granullicolis pode durar de oito a 18 horas (Zapata & Torres, 1970).
A forma, cor e tamanho, dos ovos de Phasmatodea e servem de parâmetro para a
identificação das espécies (Clark, 1976).
Estudos morfológicos do aparelho reprodutor feminino dos insetos são importantes
para relações filogenéticas entre espécies dessa ordem (Lalitha et al., 1997; Bilinsk et al.,
1998; Jaglarz, 1998; Kubrakiewicz et al., 1998; Simiczyjew et al., 1998; Szklarzewicz,
1998; Martins & Serrão, 2002; 2004).
O sistema reprodutor de Phasmatodea é pouco estudado e, por isto, o sistema
reprodutor do grupo de insetos mais próximo, Orthoptera, tem sido utilizado para
2
comparação. O aparelho reprodutor de Orthoptera tem um par de ovários com número
variável de ovaríolos do tipo panoístico, ou seja, desprovidos de células nutridoras dos
ovócitos. Os ovaríolos ligam-se aos ovidutos laterais, que se unem formando o oviduto
comum conectando-se a câmara genital, onde se abre o ducto da espermateca (Uvarov,
1966; Silva & Caetano, 1991).
O aparelho reprodutor feminino de Orthoptera, especialmente de Acrididae,
apresenta variações morfológicas (Silva & Caetano, 1991) com o número de ovaríolos por
ovário variando com a espécie (Jaglarz, 1998). E esse número pode decrescer em de
Orthoptera, em até cinco ovaríolos por ovário em Acrididae (Matsuda, 1976).
O sistema digestivo de insetos pode indicar o modo de vida, e as relações
filogenéticas entre estes animais (Serrão, 2001, 2005, 2007).
O trato digestivo dos insetos em geral é dividido em: intestino anterior ou
estomodeu, intestino médio ou ventrículo e intestino posterior ou proctodeu de acordo com
em suas origens embriológicas. Os intestinos anterior e o posterior originam-se de
invaginações do ectoderma, enquanto o médio tem origem endodérmica (Chapman, 1998;
Cruz-Landim, 1985).
O sistema digestivo de insetos em geral varia entre suas espécies, mas, geralmente,
o intestino anterior está relacionado com o armazenamento e fragmentação dos alimentos
antes que alcancem o intestino médio. Essa parte encontra-se, primariamente, envolvida
com a digestão e absorção de nutrientes, e produção de enzimas. O intestino posterior está
relacionado com a excreção e equilíbrio hidroeletrolítico do organismo (Chapman, 1998;
Cruz-Landim, 1985; Terra, 1988).
O ciclo de vida dos insetos pode ser contínuo ou apresentar uma desaceleração ou
interrupção, através do atraso de eclosão das ninfas, ou alterações no desenvolvimento, em
qualquer fase (ovo, ninfa ou adulto), garantindo a sobrevivência em condições
desfavoráveis (Mansingh, 1971; Saunders, 1976; Danks, 1987). As condições externas,
como: clima, temperatura, alimentação afetam a longevidade e a reprodução de ortópteros
(Uvarov, 1966).
Insetos podem apresentar preferência por determinadas plantas (Anjos et al., 1970;
Oliveira et al., 1984; Osse & Brinquelot, 1970), o que interfere na escolha e biologia dos
mesmos (Silva et al. 2009; Saavedra et al. 1995; Lemos et al. 2003, Zanuncio et al. 2001).
3
2. OBJETIVO
O objetivo foi descrever a morfologia histológica dos principais órgãos do aparelho
digestivo e reprodutor feminino de fêmeas adultas de P. phyllinum e avaliar se diferentes
dietas afetaram suas ninfas.
4
3. MATERIAL E MÉTODOS
Adultos e os ovos de Phibalosoma phyllinum, foram doados pela Fundação
Zoobotânica, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil, mas esses exemplares tiveram origem
na região de Curitiba, PR. Na FZB-BH (Fundação Zoobotânica, Belo Horizonte), estes
animais eram alimentados com folhas de goiabeira e pitangueira uma criação para fins
didáticos. Os animais eram mantidos em viveiros, no auditório da Casa de Educação
Ambiental ou na Zooboteca - um dos espaços educativos da FZB-BH.
Ninfas foram acondicionadas em três gaiolas de madeira (100 cm de comprimento,
60 cm de largura, 60 cm de altura), teladas nas laterais e na tampa, com fundo de madeira e
a parte da frente de vidro. Essas gaiolas foram mantidas em temperatura ambiente de 22 a
33 graus. Ninfas de P. phyllinum foram separadas em três caixas logo após a eclosão, com
15 ninfas cada uma. Estas ninfas receberam seguintes dietas: o tratamento T1- folhas de
goiabeira (Psidium guajava), T2- folhas de mangueira (Mangifera indica) ou T3- folhas de
pitangueira (Eugenia uniflora). A escolha das espécies vegetais foi em função de trabalhos
preliminares que mostraram serem estas três espécies os melhores substratos para P.
phyllinum. Os ramos eram colhidos e colocados em potes com água e esponjas vegetais
para melhor conservação(Vargas et.al., 2008).. Os ramos foram trocados a cada cinco dias.
A inclusão de folhas de goiabeira foi necessária em outras gaiolas nos últimos meses de
tratamento, devido à morte de insetos, nas duas gaiolas sem folhas de goiabeira (Ferreira,
2007).
3.1 Análise morfométrica e biologia de ninfas de Phibalosoma phyllinum
Ninfas de P. phyllinum de cada caixa foram medidas com régua e paquímetro a cada
cinco dias, durante seis meses, para avaliar se as diferentes dietas alteravam o crescimento
corporal das mesmas, sendo feitas às medidas da cabeça até o fim do corpo, excluindo as
antenas e as pernas. A primeira medida foi realizada quando as ninfas eclodiram dos ovos e
apresentavam aproximadamente 2,3 cm e foram colocadas nas respectivas gaiolas, os ovos
recebidos também foram medidos. Os hábitos alimentares e a sobrevivência dos indivíduos
foram registrados pela manhã, à tarde e à noite, sendo as ninfas medidas no período da
tarde. Diariamente, água era borrifada nas folhas, para fornecimento de água aos insetos.
5
Cinco fêmeas jovens foram separadas dentre os insetos recebidos da criação da
Fundação Zoobotânica, Belo Horizonte, Minas Gerais, em uma gaiola isolada dos machos
para caracterizar a possível ocorrência de partenogênese.
Os dados morfométricos de tamanho das ninfas foram submetidos a análise de
variância, a 5% de probabilidade.
3.2 Histologia
Fêmeas adultas de P. phyllinum foram anestesiadas com éter etílico e dissecadas em
solução de NaCl 125 mM para a retirada do trato digestivo e do sistema reprodutor, os
quais foram transferidos para solução de Zamboni (Stefanini, 1967). Fragmentos de cada
órgão de P. phyllinum foram desidratados em concentrações crescentes de etanol (70°, 80°,
95° e 100°), com trocas a cada trinta minutos. Após a desidratação, os órgãos foram
embebidos em hidroxietil metacrilato (Historesin
®
Leica). Seções com 3µm de espessura
foram coradas com hematoxilina e eosina. Algumas seções foram submetidas a testes
histoquímicos de PAS para evidenciação de polissacarídeos neutros e de mercúrio
bromofenol para evidenciação de proteínas totais e à reação de Feulgen para evidenciação
de DNA (Pearse, 1953).
3.3 Microscopia Eletrônica de Varredura
Fragmentos do intestino médio e dos ovários foram desidratados em série de etanol,
passados por hexametildisilazane, secos ao ar, metalizados com ouro e analisados em
microscópio eletrônico de varredura LEO VP1430, após a dissecção e fixação.
6
4. RESULTADOS
4.1 Morfometria e Biologia
Phibalosoma phyllinum apresentou 10 instares ninfais nas larvas alimentadas com
folhas de goiabeira e pitangueira e nove instares nas ninfas alimentadas com folhas de
mangueira.
O tamanho do corpo das ninfas de P. phyllinum variou com a dieta recebida. O
tamanho inicial das ninfas foi de 2,3 ± 0,2 cm. A segunda medida evidenciou que ninfas
alimentadas com folhas de goiabeira foram maiores que aquelas alimentadas com folhas de
mangueira e pitangueira, respectivamente, sendo que as ninfas de P. phyllinum dobram em
tamanho entre a segunda e a quarta muda (Tabela 1).
A preferência por folhas de goiabeira ocorreu quando colocada como opção junto às
outras espécies de plantas e na presença desta espécie, os insetos não se alimentavam das
demais. Alguns instares foram melhores em goiabeira e outros em mangueira, mas ambos
foram melhores que pitangueira (Tabela 1, Figura 1).
Tabela 1 – Variação das médias de tamanho de acordo com alimentação oferecida.
Instar
Substrato alimentar
Psidium guajava Mangifera indica Eugenia uniflora Estatística
I 2,60 ± 0,03 a 2,48 ± 0,02 b 2,43 ± 0,01 b F
p
2;42
=16,793
0,0001
II 3,91 ± 0,04 a 3,77 ± 0,03 b 3,37 ± 0,88 c F
p
2;42
=87,149
0,0001
III 5,37 ± 0,04 a 5,48 ± 3,87 a 4,71 ± 0,02 b F
p
2;42
=39,369
0,0001
IV 6,98 ± 0,04 b 7,6 ± 0,02 a 6,57 ± 0,03c F
p
2;42
=280,336
0,0001
V 9,82 ± 0,03 a 10,28 ± 0,11 a 8,77 ± 0,12
c F
p
2;42
=585.734
0,0001
VI 11,45 ± 0,03 b 11,70 ± 0,05 a 10,74 ± 0,05 c F
p
2;42
=119,999
0,0001
VII 14,11 ± 0,06 a 13,86 ± 0,03 b 12,14 ± 0,04 c F
p
2;37
=529,947
0,0001
VIII 15,48 ± 0,02 a 13,86 ± 0,03 b 12,14 ± 0,05 c F
p
2;34
=1601,278
0,0001
IX 16,13
± 0,03 b 17,14
± 0,03 a 14,67
± 0,05 c F
p
2;32
=894,980
0,0001
X* 17,89 ± 0,08 a --------- 16,82 ± 0,03 b
F
p
1;20
=86,101
0,0001
7
Médias seguidas pela mesma letra na linha não difere significativamente pelo Teste de Tukey
(p≤0,05). Médias comparadas pelo teste F da análise de variância (duas médias).
ínstares
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
medida
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Psidium guajava
Mangifera indica
Eugenia uniflora
Estimativa de desenvolvimento de ....em Psidium guajava
Estimativa de desenvolvimento de .... em Mangifera indica
Estimativa de desnvlvimento de.... em Eugenia uniflora
Figura 1 – Análise do tamanho das ninfas de Phibalosoma phyllinum alimentados com
diferentes substratos.
Quinze ninfas de Phibalosoma phyllinum foram utilizadas por cada gaiola
ocorrendo T1 a morte de um espécime durante o nono ínstar. No T2 morreram cinco ninfas
sendo duas no sexto ínstar, uma no sétimo e no oitavo mais duas ninfas. No terceiro
tratamento morreram três ninfas no sexto ínstar, duas no sétimo, e três no nono (Tabela 2).
8
Tabela 2. Sobrevivência (%) por cada ínstar das ninfas de Phibalosoma phyllinum
(Phasmatodea) com diferentes dietas. T1- folhas de goiabeira, T2- folhas de mangueira e
T3- folhas de pitangueira.
Dieta 1º
ínstar
2º
ínstar
3º
ínstar
4º
ínstar
5º
ínstar
6º
ínstar
7º
ínstar
8º
ínstar
9º
ínstar
10º
instar
T1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 93,3
T2 100 100 100 100 100 100 86,6 80 66,6 0
T3 100 100 100 100 100 100 80 66,6 66,6 46,6
O mimetismo (Figura 2A) é a principal estratégia de defesa de P. phyllinum quando
o animal se confunde com os galhos onde se encontram. Quando ameaçado, balança o
corpo, com movimento semelhante dos galhos. Eles se camuflam por coloração crítpica, e
que sua coloração pode alterar de acordo com o ambiente onde se encontra, como outra
forma de defesa. Esse mimetismo foi observado, principalmente, em fêmeas que mudavam
sua cor, no período máximo de 24 horas.
Fêmeas de P. phyllinum, ficavam em média, até duas horas completamente imóveis,
com as pernas dianteiras projetadas para frente do corpo, cobrindo a cabeça e antenas, e as
outras distendidas para trás. Ao elevarem o corpo sobre as pernas, podem fazer
movimentos, ou assumir posição, que podem torná-las miméticas ao meio em que se
acham. A autotomia foi outro comportamento realizado com freqüência, que consiste na
amputação de membros como pernas e antenas, para escapar de uma situação de alto risco.
Phibalosoma phyllinum apresenta tanatose quando em perigo.
O dimorfismo sexual de P. phyllinum é expresso pela ausência de asas nas fêmeas
(apteria) e, na maioria das vezes maiores que os machos, medindo 19,0 ± 0,2 cm de
comprimento e 0,11cm de largura e os machos com 12,1± 03 cm de comprimento e 0,5cm
de largura, porém machos são mais ágeis que as fêmeas (Figura 2B, C).
9
C
A
B
Figura 2 – Mimetismo - A - estratégia de defesa, bicho-pau Phibalosoma phyllinum entre os
galhos de goiaba (Psidium guajava). Dimorfismo sexual de P. phyllinum - (B) - detalhe do
macho com asas. C - fêmea maior e áptera.
A cópula em P. phyllinum durou em média 12 horas, chegando até 48 horas. Neste
período, o macho permaneceu no dorso da fêmea e ambos não se alimentaram (Figura 3A)
fêmeas de P. phyllinum apresentam posturas sem fecundação e nenhuma alteração
comportamental com a ausência dos machos. A ovoposição foi iniciada aos seis meses de
vida. A partenogênese não foi comprovada, pois as ninfas não eclodiram. A capacidade de
ovoposição desta espécie foi de, aproximadamente, dois a três ovos por dia, em cinco
10
meses, totalizando aproximadamente 300 ovos, a eclosão das ninfas de P. phyllinum
ocorreu após 100 a 150 dias, sendo que a ovoposição se inicia 20 dias após a cópula.
Ovos de P. phyllinum apresentam cor marrom e opérculo preto na parte superior, e
aproximadamente 4 mm de comprimento (Figura 3B).
Figura 3 – Momento da cópula de P. Phyllinum (A), detalhe: o macho permanece no dorso
da fêmea. (B) Ovos de P. phyllinum.
Na eclosão, a ninfa começa a se movimentar e a região mais escura, o opérculo, se
rompe, quando o inseto jovem sai e momentos após o nascimento, seu tamanho é quase o
dobro do ovo. As ninfas de P. phyllinum levaram aproximadamente 10 a 15 minutos para
eclodirem, tempo que levaram para remover o opérculo e apresentam forma semelhante à
do adulto no nascimento, denominado paurometabolia
.
As ecdises se iniciam pelos membros posteriores, depois os anteriores e, por último
a cabeça é liberada com as antenas. A ecdise dura de 15 a 30 minutos. Neste período, os
animais ficam mais vulneráveis, podem perder membros e morrer. Algumas vezes, no final
4mm
B
A
A
11
A
da muda, o inseto se alimenta da exúvia que libera (Figura 4).
Figura 4 – Exúvias de P. phyllinum liberadas logo após a ecdise em diferentes ínstares.
Ninfas de P. phyllinum alimentadas com folhas de goiabeira apresentaram duração
média de 15 ± 2 dias por instar, exceto o décimo, com duração média de 35 ± 4 dias . Nos
demais tratamentos os instares não apresentaram um padrão de duração não sendo possível
verificar o porquê desta oscilação entre as mudas, porém o último instar foi sempre o mais
longo .
Ninfas de P. phyllinum são mais escuras, no primeiro e segundo instares, tendo as
inserções das pernas verde claro, e tornam-se mais claras da terceira em diante. Mudam de
cor com o tempo e ambiente em que vivem. São ágeis e se alimentam o tempo todo,
tornando-se mais lentas a partir das ecdises, são sensíveis como os adultos à temperatura
muito alta.
12
4.2 Morfologia
O trato digestivo de P. phillynum apresenta–se como um tubo alongado pouco
diferenciado anatomicamente da boca ao ânus (Figura 5A). O esôfago percorre todo o tórax
até o início do abdômen, sendo este mais fino que as demais regiões do intestino. Após o
esôfago, inicia-se o papo apresentando-se, bastante, alongado e, quando cheio, tem o
mesmo diâmetro do restante do intestino. A transição do papo para o intestino médio é
marcada por uma pequena constrição (Figura 5B).
Figura 5 - O trato digestivo (TD) de P. phillyinum apresenta–se como um tubo alongado
pouco diferenciado anatomicamente desde a boca até o ânus (A). Foto (B) do trato digestivo
de P. phyllinum mostrando a transição do papo (P) para o intestino médio (IM) marcada por
uma pequena constrição (ponta de seta). T - traquéias.
A
TD
B
13
A metade anterior do intestino médio apresenta a parede pregueada, enquanto a
metade posterior não apresenta tais pregas. A passagem do intestino médio para o posterior
caracteriza-se pela presença de grande número de túbulos de Malpighi (Figura 6). De forma
semelhante, o intestino posterior (íleo) se mostra como um tubo alongado com diâmetro
constante e pequena constrição marcando a transição do íleo para o reto, sendo este último
alongado.
Figura 6 - Trato digestivo de P. phyllinum mostrando a transição do intestino médio (IM)
para o intestino fino (IF) caracterizada por inúmeros túbulos de Malpighi (TM).
Externamente, o trato digestivo apresenta uma rede de traquéias, bem como uma
musculatura longitudinal bem desenvolvida (Figura 7).
Figura 7 – Micrografia eletrônica de varredura de P. phyllinum mostrando a musculatura
longitudinal (LM) bem desenvolvida envolvendo o tubo digestivo (TD). T – traquéias.
TD
LM
T
T
14
Há três tipos celulares no intestino médio de P. phyllinum: células com aparente
função endócrina, localizadas na base do epitélio, células indiferenciadas agrupadas em
ninhos, também na base do epitélio, e células colunares. Estas últimas apresentam o núcleo
mais ou menos central, bem desenvolvido, esférico e com grumos de cromatina condensada
e nucléolo evidente. O ápice das células colunares se mostra dilatado preenchido com um
conteúdo pouco acidófilo e estas dilatações formam borbulhas que parecem se desprender
das células sendo liberadas para o lúmen. Tais borbulhas têm uma superfície enrugada e
quando não estão presentes as microvilosidades de aproximadamente 4 µm de
comprimento, são visíveis (Figuras 8, 9). É comum observar células em processo de
degeneração caracterizadas por núcleos fragmentados e picnóticos.
Na base do epitélio há ninhos com células regenerativas espalhadas ao longo de
todo intestino médio. O intestino médio apresenta ainda uma membrana peritrófica bem
desenvolvida e basalmente existe uma camada de células musculares circulares internas e
longitudinais externas.
A
parede do intestino médio apresenta profundos vilos (Figura 10).
O intestino fino apresenta uma parede com dobras do epitélio formado por uma
camada única de células, sendo essas cúbicas e com núcleo esférico (Figura 10). O ápice
celular do intestino fino apresenta uma cutícula bem evidente, existindo ainda neste órgão
uma camada de músculos internos circulares e externos longitudinais.
O reto de P. phyllinum é composto por epitélio simples, com células achatadas e
núcleo alongado, apresentando uma luz que é envolvida por uma cutícula evidente e uma
musculatura mais desenvolvida com fibras longitudinais e circulares. As papilas retais se
mostram alongadas e caracterizadas por apresentarem uma camada de células colunares,
com núcleos esféricos, com a porção apical das células pouco acidófilas, assentadas sobre
camadas de células achatadas não havendo um lúmen entre essas camadas. Tanto as células
do reto como as das papilas retais são superficialmente revestidas por uma cutícula (Figura
12).
15
Figura 8 – Secção longitudinal do intestino médio de P. phyllinum. A- mostrando células
digestivas (CD) com núcleo central (N). B - Ninhos com células regenerativas (CR)
espalhadas ao longo de todo o intestino médio. L – lúmen, MP - membrana peritrófica. C-
Ápice das células digestivas dilatado formando borbulhas (B) em fase de liberação aparente
no lúmen do intestino.
A
B
C
10 µm
16
Figura 9 – Micrografia eletrônica de varredura do intestino médio de P. phyllinum. A-
mostrando células digestivas com borbulhas na superfície apical. B – Detalhe de superfície
enrugada (seta) das borbulhas. C – Ápice celular com microvilosidades (M).
A
B
B
B
C
M
17
Figura 10- Micrografia eletrônica de varredura de P. phyllinum mostrando a parede com
profundos vilos no intestino médio.
Figura 11- Secção longitudinal do intestino fino de P. phyllinum mostrando a parede com
dobras do epitélio (EP), formado por uma camada única de células, apresentando uma
cutícula (seta).
18
Figura 12 – Secção longitudinal do reto de P. phyllinum mostrando uma papila retal (PR)
formada por duas camadas de células basais (CB) e por células principais colunares. C –
cutícula, CM – músculo circular, LM – músculo longitudinal.
As fêmeas desta espécie possuem um par de ovários que percorrem todo o abdômen
e estes são pectinados, sendo que os ovaríolos estão colocados lateralmente percorrendo
todo o oviduto lateral e são caracterizados por folículos contendo ovócitos em diferentes
estágios de desenvolvimento, sendo que os mais maduros encontram-se mais próximos à
inserção do oviduto (Figuras 13, 14A, B). Este apresenta uma parede bastante pregueada
(Figura 14C), o epitélio é colunar e as células apresentam o ápice dilatado com muitos
vacúolos. Externamente, o oviduto apresenta musculatura desenvolvida e, internamente,
uma cutícula esclerosada e espessa.
Figura 13 – Aparelho reprodutor feminino de P. phyllinum. Secção transversal do oviduto
lateral mostrando o lúmen (L) revestido por cutícula espessa (C). CM - músculo circular,
EP – epitélio.
A
19
Figura 14 – Micrografia eletrônica de varredura do aparelho reprodutor feminino de P.
phyllinum. A, B – Ovário mostrando ovaríolos pectinados contendo folículos em diferentes
fases do desenvolvimento. C - Oviduto lateral mostrando a parede pregueada.
A
B
C
20
Os ovários de P. phyllinum são do tipo panoístico, ou seja, sem células nutridoras,
sendo cada ovaríolo revestido por uma bainha peritonial bastante espessa. Cada folículo
ovariano de P. phyllinum é formado por uma camada de células foliculares delimitando os
ovócitos em desenvolvimento. As células foliculares são colunares e nos folículos mais
jovens os núcleos são desenvolvidos ocupando quase toda a totalidade da célula. Alguns
desses núcleos são irregulares e à medida que as células foliculares se desenvolvem, elas se
tornam cúbicas e nos ovócitos maduros apresentam-se achatadas.
Uma glândula acessória foi encontrada associada ao sistema reprodutor abrindo no
oviduto comum. Essa glândula é bastante longa e formada por epitélio simples de células
cúbicas, apresentando um lúmen estreito, núcleos esféricos com cromatina condensada e
citoplasma vacuolizado (Figura 15). Os testes histoquímicos mostraram que a glândula é
rica em material PAS positivo, provavelmente carboidratos, proteínas e algum conteúdo
lipídico.
Figura 15 - Secção histológica da glândula acessória do sistema reprodutor feminino de P.
phyllinum formada por epitélio simples de células cúbicas com citoplasma vacuolizado e
núcleo com predomínio de cromatina condensada (N).
21
5. DISCUSSÃO
As durações médias do período ninfal de P. phyllinum, variaram entre nove e dez
instares, dependendo do tipo de alimento ofertado, o que aproxima de Bacteria tuberculata,
onde o período ninfal de fêmeas variou entre oito e nove instares (Dorval, 2003). A
ocorrência de variações nas quantidades de ínstares por sexo, entre espécies de fasmídeos
parece ser bastante comum, pois, em B. granullicolis ocorrem de quatro a seis instares
(Zapata e Torres, 1970) e em P. wilkinsoni, sete e oito, para machos e fêmeas,
respectivamente (Campbell, 1966).
Folhas de goiabeiras foram preferidas e as mais indicadas para a alimentação de P.
phyllinum, já que apresentaram maior desenvolvimento corpóreo quando alimentadas com
está espécie de planta, mas na ausência desta os insetos se alimentam também de folhas de
mangueira e pitangueira, folhas de goiabeira também foram às preferidas por P. phyllinum
no trabalho realizado por Ferreira (2007), que encontrou mortalidade de 100% dos machos
de Phibalosoma phyllinum, ao se alimentarem somente com folhas de eucalipto, sendo
necessária a inserção de folhas de goiabeiras, assim como ocorreu também no presente
estudo.
As estratégias de defesa de P. phyllinum foram semelhantes àquelas relatadas para
Bacteria tuberculada (Phasmatodea) (Costa-Lima 1938; Dorval 2003). Registros de
tanatose foram observados em algumas espécies de Phasmatodea por Piéron (1913) e
Schmidt (1913) e diagnosticado também em Phibalosoma phyllinum.
O dimorfismo sexual de P. phyllinum se deu através da presença de asas nos machos
e ausência nas fêmeas e também pela diferença de tamanho entre esses insetos onde a
fêmea se apresenta maior que o macho. Comparado com o estudo de Dorval, 2003, onde
nos adultos de B. tuberculata, o dimorfismo sexual é bastante acentuado: as fêmeas são
ápteras com o comprimento e diâmetro do corpo bem desenvolvidos, e nos machos, com
dois pares de asas, apropriados para vôos curtos. Pode-se afirmar que o dimorfismo nestas
duas espécies se apresenta de forma semelhante. O dimorfismo sexual é bastante variado
nas espécies deste grupo de inseto, sendo encontrados desde indivíduos ápteros até alados
(Clark,1974; Bedford, 1978).
Embora possa ocorrer reprodução partenogenética em Phasmatodea (Costa Lima,
1938), fêmeas virgens de P. phyllinum realizaram a postura de ovos, porém estes não foram
22
viáveis. Partenogênese tem sido registrada em muitas ordens de insetos como meio normal
de reprodução, exceto em Odonata, Dermaptera, Neuroptera, Siphonaptera (Chapman,
1998, Silvia Pinent, 1998). Costa-Lima, (1938) relata: "A aptidão dos Phasmidae para a
reprodução partenogenética,” de fato, em várias espécies, cujos machos são excessivamente
raros, a reprodução agâmica ocorre freqüentemente e dos ovos partenogenéticos (Costa-
Lima, 1938) originando fêmas, fenômeno conhecido com telitoquia. Kuyten (1962)
também observou o ciclo biológico e a ocorrência de partenogênese em Orxines macklotti,
Phasmatodea, (Zapata & Torres, 1970).
A cópula de P. phyllinum foi observada com duração de 12 a 48 horas, comparada
com a de B. granullicolis que pode durar de oito a 18 horas (Zapata & Torres, 1970),
podendo afirmar que a cópula nos Phasmidaes pode durar mais do que na espécie estudada
por Zapata & Torres, 1970.
Carausius morosus em 225 dias, pôs em média, 480 ovos, tendo também, observado
um máximo de 712 ovos (Roth, 1916), em P. phyllinum foi observado a postura de 300
ovos, em 150 dias.
Em P. phyllinum, a postura dos ovos se inicia com, aproximadamente, 20 dias da
cópula com os ovos sendo liberados pela fêmea sem qualquer cuidado de segurança. As
fêmeas, em geral, não escolhem um lugar especial para a postura e como se acham quase
sempre pousadas sobre as plantas deixam cair os ovos no solo e não apresentam nenhum
cuidado parental. A eclosão dos ovos de P. phyllinum demora de 100 a 150 dias. O período
embrionário de Bacteria tuberculata foi de 107,38 ± 1,43 dias para ovos de fêmeas
copuladas (Dorval, 2003), diferindo dos valores para B. granullicolis, cujo período foi de
aproximadamente 90 dias (Zapata & Torres, 1970). Algumas espécies apresentam ovos
fertilizados com período de incubação de 60 a 80 dias e os não fertilizados, de 85 a 110
dias, podendo chegar a 280 dias, porém, na maioria dos ovos, o período de incubação foi de
85 a 110 dias (Bedford, 1978).
Os ovos dos Phasmidae podem apresentar variações nas formas, cores e tamanhos e
isso serve de parâmetro para a identificação das espécies (Clark, 1976). Os ovos de P.
phyllinum apresentam cor marrom e opérculo preto na parte superior, diferentemente dos
ovos de B. tuberculata que apresentam que forma de barril, semelhantes às sementes, com
coloração variando do marrom ao preto e tendo a parte superior fechada por um opérculo
ovóide (Dorval, 2003).
23
Ovos de P. phyllinum têm tamanho semelhante aqueles de, B. tuberculata (4,56 ±
0,18 mm) (Dorval, 2003), porém são maiores que os ovos de B. granullicolis (2,5 mm)
(Zapata e Torres 1970).
Ao saírem dos ovos, as ninfas de P. phyllinum, rapidamente se distendem e
apresentam um tamanho surpreendente em relação ao do ovo onde apresentam 2,4 cm de
comprimento, semelhante ao observado para Autolyca sp. cujos jovens, logo após o
nascimento, apresentam 11 mm de comprimento, isto é, cerca de quatro vezes o diâmetro
do ovo (Goudot (1843) apud Costa-Lima, 1938).
As ninfas de P. phyllinum levaram aproximadamente de 10 a 15 minutos para
eclodirem, tempo que levaram para remover o opérculo, diferindo muito no tempo gasto
pelas ninfas de B. tuberculata levaram de dois a quatro minutos para eclodirem (Dorval,
2003). O tempo gasto nessa fase é bastante variado entre os fasmídeos, segundo Korboot
(1961), pode atingir quatro minutos e meio em Exatosoma tiaratum (Phasmatodea).
Nos primeiros estádios, as ninfas são ágeis e se movimentam todo o tempo,
apresentam coloração escura e as inserções das pernas verde claro a partir do terceiro
estádio as ninfas vão alterando a cor para um marrom claro, ou mudam de cor de acordo
com o ambiente em que se encontram, diferindo-se das ninfas de B. granullicolis que são
lentas e apresentam coloração verde amarelada de aspecto cristalino, que vai mudando até a
fase adulta (Zapata & Torres 1970).
O período crítico para a sobrevivência das ninfas de P. phyllinum, é o momento da
ecdise, quando muitas ficam presas na exúvia, pelas antenas ou pernas, impedindo-as de se
deslocarem até o alimento, e por diversas vezes ao nascer as ninfas ficam com as pernas
presas dentro dos ovos impedindo assim o seu desenvolvimento e muitas vezes, levando-as
a morte. O mesmo foi observado para ninfas de B. granullicolis por Zapata & Torres
(1970).
A análise da anatomia interna das fêmeas de P. phyllinum constatou que o canal
alimentar é diferenciado em três regiões principais com diferente origem embriológica: o
intestino anterior ou estomodeu, o intestino médio ou mesentério e o intestino posterior ou
proctodeu observado por Uvarov (1966) e Borror & Delong (1969).
O sistema digestivo de P. phyllinum é relativamente regular, com dilatações pelo
corpo, abdômen e reto. Estes insetos apresentaram o intestino com formato tubular, que
percorre desde a boca até o final do abdômen como na maioria dos insetos em geral
24
(Chapman, 1998). O papo inicia-se após o esôfago apresentando-se bastante alongado e,
quando cheio, tem o mesmo diâmetro do restante do intestino. A transição do papo para o
intestino médio apresenta pequena constrição, o inglúvio (Borror & Delong, 1969; Gallo et
al., 1988; Gallo et al., 2002).
De uma maneira geral, nos insetos o epitélio do intestino médio é formado por três
tipos celulares: as células digestivas ou principais, as células regenerativas e as células
endócrinas (Cruz-Landim et al., 1996; Neves et al., 2003). O intestino médio de Phasmidae
também é formado por três tipos celulares diferentes formando um epitélio simples. Na
base das células há pequenos ninhos com células reduzidas regenerativas espalhadas ao
longo de todo intestino. Observou-se que entre as células digestivas, na maioria dos insetos
mostram-se pequenas células regenerativas que podem se apresentar isoladas, em pares ou
formando pequenos agrupamentos denominados ninhos celulares, fundamentais para a
renovação do epitélio digestivo (Billingsley et al., 1996).
A passagem do intestino médio para o posterior caracteriza-se por inúmeros túbulos
de Malpighi, os quais são principais órgãos excretores dos insetos, cuja função é
homeostática, através da eliminação do excesso de sais e produtos nitrogenados, segregação
de substâncias presentes na hemolinfa e reabsorção de constituintes úteis. De forma
semelhante o intestino posterior (íleo) se mostra como um tubo alongado com diâmetro
constante e pequena constrição marcando a transição do íleo para o reto, sendo este
alongado. O intestino posterior - subdividido em piloro, íleo, reto e ânus - é separado do
intestino médio pela válvula pilórica, e, também, é recoberto internamente pela íntima
(Chapman, 1998). Entretanto, sua cutícula é menos espessa e mais permeável que a do
intestino anterior. Algum tipo de absorção de nutrientes e de água pode ocorrer nesta
região, o que não é verificado no intestino anterior (Chapman, 1998). O piloro é a região de
transição entre o intestino médio e posterior e, na maioria das vezes, é o local onde
desembocam os túbulos de Malpighi.
O reto é composto por epitélio simples, com células mais achatadas, núcleo
alongado, apresentando uma luz que é envolvida por uma cutícula evidente e uma
musculatura mais desenvolvida com fibras longitudinais e circulares. O reto é, geralmente,
dilatado com uma parede fina e papilas retais envolvidas na reabsorção de água, íons e,
algumas vezes, aminoácidos (Chapman, 1998).
25
Fêmeas de P. phyllinum possuem um par de ovários que percorrem todo o abdômen
e com ovaríolos são do tipo panoístico com núcleos pequenos com cromatina condensada.
O aparelho reprodutor de Orthoptera também apresenta um par de ovários, constituídos por
um número variável de ovaríolos do tipo panoístico, ou seja, desprovidos de células
nutridoras dos ovócitos. Ovários panoísticos também são encontrados nas ordens de
Apterygota, Orthoptera, Odonata e Siphonaptera (Bunning, 2004).
6. Conclusão
A preferência das ninfas de Phibalosoma phyllinum foi pela folha de goiaba
(Psidium guajava), alimentando-se somente desta, mesmo tendo ofertas de outras espécies.
E todas as ninfas alimentadas com esta folha, apresentaram maior desenvolvimento
corpóreo e maior índice de sobrevivência.
Não foi comprovada a reprodução partenogenética em P. phyllinum, uma vez que os
ovos vindos desta forma de reprodução não eclodiram.
Nesta espécie o número de instares variou entre nove e oito, dependendo da
alimentação oferecida.
A morfologia interna de P. phyllinum é semelhante à de outros Orthopteroidea.
26
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