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Synara Alexandre Araujo Silva
Desenvolvimento de uma técnica molecular
para detecção e quantificação do vírus da
hepatite G (GBV-C/HGV)
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo para obtenção do
titulo de Mestre em Ciências
Área de concentração: Doenças Infecciosas e
Parasitárias
Orientador: Dr. José Eduardo Levi
São Paulo
2010
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2
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Silva, Synara Alexandre Araujo
Desenvolvimento de uma técnica molecular para detecção e quantificação do
vírus da hepatite G (GBV-C/HGV) / Synara Alexandre Araujo Silva. -- São
Paulo, 2010.
Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias.
Área de concentração: Moléstias Infecciosas e Parasitárias.
Orientador: José Eduardo Levi.
Descritores: 1.Vírus GB C 2.HIV 3.Hepatite 4.Reação em cadeia da polimerase
USP/FM/SBD-057/10
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL
DEPARTAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS
Chefe do Laboratório: Prof. Dr. Cláudio Sérgio Pannuti
Coordenador do Curso de Pós –Graduação: Prof. Dr. Aluísio Segurado
Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo ( FAPESP) – projeto de número 2005/01072-9.
4
DEDICATÓRIA
A DEUS e a Mãe Rainha, por me iluminarem todos os dias;
aos meus pais Valter (in memória) e Eliete, pelo amor e apoio incondicional;
e aos meus irmãos Nayra e Valter Jr., por acreditarem em mim.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus e a Mãe Rainha, por me mostrarem que não há escuridão onde a luz da fé não
possa chegar.
Ao meu orientador Dr. José Eduardo Levi “Dudi”, pela oportunidade deste trabalho,
pelos ensinamentos, incentivos e mais que tudo pelo apoio e compreensão em um dos
momentos mais difíceis de minha vida. Obrigada!!
Aos meus pais Valter Alexandre (in memória) e Maria Eliete, fonte de minha força e
coragem e aos meus irmãos Nayra Lygia e Valter Jr. e sobrinhos Vinícius e Yasmin pelo
apoio e amor sempre presente. Agradeço pelo orgulho que sentem de mim.
Ao Dr. Cláudio Pannuti e a Dra. Clarisse Machado, por me abrirem as portas do
laboratório de Virologia com a oportunidade de estágio que me foi dada ao chegar em São
Paulo.
Aos meus tios Miguel, Ednalva e Marcos Edilson, por estarem sempre ao meu lado
me incentivando e apoiando, acreditando que eu conseguiria.
A todos os meus familiares que estiveram sempre ao meu lado, por meio de palavras,
pensamentos e orações.
A Lucy, por ter sido um anjo na terra, que por muitas vezes estendeu a mão para mim.
Com seu carinho, apoio, compreensão e amizade.
Aos amigos Renato, José de Paula, Adriana Machado, Cristina Fink, Laura Sumita,
Marli, Carolina Bernal, Cíntia Canto, Michela Gabriele e Alessandra Machado pelo convívio
e amizade fundamental no desenvolvimento deste trabalho.
As amigas Cynthia Cristina, Célia Rodrigues, Carolina Mamana e Jaila Borges, pelo
carinho especial, amizade e apoio na construção e finalização deste projeto. Obrigada!! Vocês
foram fundamentais para mim.
6
As secretárias da Pós-graduação Roseli e Vânia, pelo apoio, carinho e alegria
dedicados a mim.
A todos os colegas que fazem parte do Instituto de Medicina Tropical da USP, por de
alguma forma participarem da minha jornada em São Paulo.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo ( FAPESP), pelo apoio
financeiro.
7
SUMÁRIO
Resumo
Summary
1. INTRODUÇÃO
14
1.1.Vírus da Hepatite G ou GBV-C
14
1.2.Reação de PCR em tempo real
22
2. JUSTIFICATIVA
25
3. OBJETIVOS
26
4. MATERIAIS E MÉTODOS
27
4.1. Amostras
27
4.2. Determinação qualitativa de anticorpos anti-E2 GBV-C
28
4.2.1. Teste confirmatório para de detecção do anticorpo específico anti-E2
28
4.3. Extração de RNA
29
4.4. Reação de Transcrição Reversa
29
4.5. Reação de PCR GBV-C Convencional
31
4.6. Reação de NESTED PCR GBV-C
32
4.7. Validação da PCR em tempo real para GBV-C
33
4.7.1. Definição do ensaio e dos primers
34
4.7.2. Calibração do ensaio e curva – padrão
35
4.7.3. Teste de avaliação da interferência de outros vírus na reação de PCR em tempo
real para GBV-C.
36
5. RESULTADOS
38
5.1. Sorologia
38
5.2. PCR GBV-C convencional
38
5.3. Nested PCR GBV-C
39
5.4. PCR em Tempo Real para GBV-C
40
5.4.1. Calibração do ensaio e curva padrão
40
5.4.2 Avaliação de interferência
43
5.4.3. Amostras
43
6. DISCUSSÃO
47
7. CONCLUSÕES
52
8. REFERÊNCIAS
53
8
Lista de Tabelas
Tabela 1. Pacientes do estudo divididas por faixa etária 27
Tabela 2. Reagentes, volumes e concentrações utilizados na primeira
etapa da reação de transcrição reversa ( mix I) 30
Tabela 3. Reagentes, volumes e concentrações utilizados na segunda
etapa da reação de transcrição reversa ( mix II) 30
Tabela 4. Reagentes, volumes e concentrações utilizados na reação
de PCR GBV-C convencional 31
Tabela 5. Reagentes, volumes e concentrações utilizados na reação
de NESTED PCR GBV-C 33
Tabela 6. Reagentes, volumes e concentrações utilizados no
PCR em tempo real 35
Tabela 7. Resultados de Carga Viral de GBV-C (N=57) e contagem de CD4 e
Carga Viral de HIV 43
Tabela 8. Resultados finais dos testes laboratoriais para GBV-C.
α = anti-HGVenv; RNA = Viremia GBV-C 45
Tabela 9. Comparação dos resultados laboratoriais sorológicos e
moleculares, técnica por técnica. Sorologia = anti-E2 45
Tabela 10. Média, Mediana e Desvio-Padrão dos valores de Carga Viral HIV
e Contagem de Células CD4 nos grupos GBV-C-RNA positivo e negativo 45
9
Lista de Figuras
Figura 1. Fotografia de gel de agarose referente à PCR
GBV-C convencional 39
Figura 2. Fotografia de gel de agarose referente à reação de Nested
PCR GBV-C 40
Figura 3. Relatório do PCR em tempo real de corrida da amostra padrão 41
Figura 4. Gráfico de amplificação correspondente ao relatório da Fig.3 41
Figura 5. Curva de Calibração do PCR em Tempo Real GBV – C 42
Figura 6. Relatório de uma reação de PCR em tempo real com amostras
do estudo 42
10
Lista de Abreviações
AIDS - Síndrome da Imunodeficiência Humana
Anti- E2 - Anticorpos contra a proteína E2 do envelope do HGV/GBV-C
CCR5 - Co-receptor celular da infecção pelo HIV
CD4 - Marcador de superfície celular de células T auxiliares
cDNA - Ácido desoxirribonucléico complementar
Ct - Cycle Treshold
CXCR4 - Co-receptor celular da infecção pelo HIV
Elisa - Ensaio Imunoenzimático
EUA - Estados Unidos da América
FDA - Agência Americana para administração de drogas e alimentos
GBV-A - Vírus GB-A
GBV-B - Vírus GB-B
GBV-C - Vírus GB-C
HBV - Vírus da Hepatite B
HCV - Vírus da Hepatite C
HGV - Vírus da Hepatite G
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana
NCR - Região não codificante
OMS - Organização Mundial da Saúde
PCR - Reação em cadeia da polimerase
PDN - Primers randômicos
RANTES - Reguladores naturais da expressão de receptores das células T
RNA - Ácido Ribonucléico
UTR – Região não traduzida
11
RESUMO
Introdução: O vírus da hepatite G (GBV-C/HGV) é um flavivírus de genoma RNA de fita
simples polaridade positiva, replicando em linfócitos, não sendo até hoje associado a qualquer
patogenia humana. Estudos recentes demonstram que pessoas co-infectadas pelos vírus GBV-
C/HGV e HIV têm menor progressão para AIDS e morte, embora alguns estudos tenham
falhado em demonstrar tais efeitos.
Objetivo: Determinar a soroprevalência e viremia (qualitativa) por GBV-C/HGV nas
amostras de pacientes HIV+ e desenvolver uma metodologia de PCR em tempo real para
fazer a determinação das cargas virais de GBV-C/HGV.
Métodos: Avaliamos a presença de anticorpo e RNA do vírus GBV-C/HGV em 253 amostras
de plasma de mulheres HIV positivas, coletadas entre 1997-99. Realizamos o ensaio
imunoenzimático anti-E2 (EIA anti-HGenv kit, Roche™), a reação em cadeia da polimerase
(PCR), o NESTED PCR e, padronizamos um PCR em tempo real (RT-PCR), ensaio baseado
no sistema Taqman, também aplicado nas mesmas amostras. A curva-padrão do ensaio foi
feita com diluições seriadas de uma bolsa de plasma GBV-C/HGV+, e os resultados
expressos em unidades aleatórias/mL.
Resultados: Das 253 amostras testadas, 64 foram positivas para o anticorpo anti-E2 (25,3%),
36 RNA positivas no PCR convencional (14,2%) e, no NESTED PCR e PCR em tempo real
57 amostras foram concordantemente RNA positivas (22,5%), perfazendo um índice total de
exposição de 48% (25.3 + 22.5). A carga viral teve uma média de 1.396 UA/mL (13.625 -
1.1UA/mL. As cargas virais encontradas não tiveram correlação direta com parâmetros
laboratoriais da infecção pelo HIV como a carga viral e a contagem de células CD4.
Conclusões: Foi obtida uma metodologia simples, rápida e de boa sensibilidade e
especificidade, permitindo a quantificação do RNA do vírus GBV-C com reprodutibilidade.
A metodologia permite análise simultânea de um grande número de amostras, sendo
apropriada para estudos clínicos. A prevalência de exposição á este agente na população
feminina HIV+ estudada é alta, provavelmente decorrente da via sexual comum de
transmissão dos agentes.
12
SUMMARY
Introduction: The Hepatitis G (GBV-C / HGV) agent is a flavivirus. Its genome is composed
of single stranded RNA of positive polarity, replicating in lymphocytes. Up to now, it hasn’t
been implicated in any disease associated to human beings. Recent studies demonstrate that
persons co-infected by the viruses GBV-C / HGV and HIV have a slower rate of progression to
AIDS and death, although some studies have failed in demonstrating such effects.
Objective: To determine the soroprevalence and viremia (qualitative) of GBV-C / HGV in
samples from HIV-infected women. To develop a methodology of Real-Time PCR for GBV-C
/ HGV viral load determination.
Methods: The presence of antibody and GBV-C/HGV RNA was evaluated in 253 plasma
samples from HIV infected women, collected between 1997-99. An immunoenzymatic assay
(EIA kit for anti-E2, Roche™) was applied to obtain the seroprevalence while the polymerase
chain reaction (PCR), nested PCR, and a standardized Taqman based real-time PCR (RT-PCR),
were used in the assessment of viral RNA. For the viral load, a standard-curve was made with
serial dilutions of a plasma bag containing GBV-C/ HGV RNA+, and results were expressed in
random units/mL, in comparison to the reference matherial.
Results: Of the 253 samples tested, 64 were positive for anti-E2 (25.3%), 36 RNA positive by
PCR (14.2%), and 57 (22.5%) where both nested PCR and real-time PCR RNA positive, for a
total exposure index of 48%. The mean viral load was of 1.396 RU/mL (13.625 - 1.1 RU/mL).
GBV-C/HGV Viremia was not correlated to HIV laboratorial parameters, i.e. CD4 and HIV-
RNA counts.
Conclusions: A simple, fast and efficient system for the determination of GBV-C/HGV viral
load was developed, presenting appropriate sensitivity and specificity, allowing reproducible
quantification of GBV-C RNA in stored plasma samples. The methodology allows
simultaneous analysis of a large number of samples, being appropriate for clinical studies. The
prevalence of exposition to this agent in the studied female population is high, probably a
consequence of the common sexual way of transmission of the agents.
13
__________________________________________________________1. Introdução______
1.1 – Vírus da Hepatite G ou GBV-C
Ao estudar agentes causadores de hepatites virais em 1967, Deinhardt e
colaboradores
1
, realizaram um experimento com o soro de um paciente de 34 anos, (cujas
iniciais eram G.B.), que apresentava há três dias um quadro de hepatite aguda. O soro do
paciente foi inoculado em sagüis, estes tiveram seus soros testados e apresentaram alterações
na função hepática. Foram realizadas inoculações seriadas em outros sagüis, que também
apresentaram o desenvolvimento da doença. O vírus então foi nomeado de agente GB, em
homenagem ao paciente do qual foi retirado. Estudos seguintes demonstraram que o vírus GB
era transmitido pela via parenteral entre os sagüis e não estava relacionado sorologicamente
com outros vírus causadores de hepatite
2
.
Em 1995, Simmons e colaboradores
3
, inocularam novamente alguns sagüis, com
amostras originadas de um pool de soro dos sagüis que apresentaram o agente GB, esses
novos primatas também desenvolveram hepatite. Esses animais tiveram seus soros analisados
e foram encontrados dois vírus chamados de GBV-A e GBV-B. Em seqüência, Simmons
4
realizou um novo estudo em humanos, com duas populações consideradas de alto risco para
exposição aos vírus de hepatites, identificando um novo vírus que foi chamado de GBV-C,
por apresentar grande semelhança das suas seqüências genômicas com os vírus GBV-A e
GBV-B. O GBV-C foi implicado como agente causador de hepatite humana de etiologia
desconhecida por ser encontrado em pacientes que apresentavam um quadro clínico de
hepatite, porém sem a evidência de infecção dos vírus das hepatites A,B,C,D ou E.
Simultaneamente, outro estudo era realizado por um grupo que trabalhava com
hepatites, coordenado por Linnen
5
, identificando em 1996, um novo vírus causador da
hepatite não-A -E em pacientes com hepatite crônica, que foi chamado vírus da hepatite G ou
HGV. Com a publicação da seqüência genômica completa do HGV e sua análise filogenética
6-9
, foi possível comparar e constatar que o GBV-C e o HGV possuíam 96% de homologia
entre seus genomas, indicando que de fato, tratava-se de dois isolados do mesmo vírus
5
.
Desde então, ambas as nomenclaturas (GBV-C/ HGV) são usadas na literatura.
14
O GBV-C/HGV é um Flavivírus, que possui um genoma RNA de fita simples com
polaridade positiva composto aproximadamente por 9.400 nucleotídeos
10
, contendo apenas
um longo ORF (“open reading frame”) codificando uma grande poliproteína viral que é
clivada por peptidases virais e do hospedeiro, dando origem às proteínas estruturais: duas
proteínas do envelope viral, E1 e E2 e as proteínas não estruturais: uma RNA helicase, uma
serina protease, e uma RNA polimerase RNA-dependente
4,5
.
O GBV-C/HGV faz parte de um grupo da família Flaviviridae que é capaz de infectar
humanos, dentre eles estão o vírus da dengue, o vírus da encefalite japonesa, o vírus da febre
amarela e o vírus do Oeste do Nilo
14
, além de apresentar uma homologia genômica de 25%
com o vírus da Hepatite C
15
. Embora haja esta homologia, há também muitas diferenças,
entre elas estão as proteínas estruturais do GBV-C/HGV e do HCV, o que faz com que o
GBV-C/HGV seja muito menos variável e como esta característica está ligada diretamente no
escape do sistema imune e persistência viral, ao contrário do HCV, que produz cerca de 75%
de infecção crônica, o GBV-C/HGV persiste em 25% dos infectados
16
.
A segunda diferença entre estes vírus é a falta de uma região codificadora de proteína
do núcleocapsídeo em muitos isolados do GBV-C/HGV, o que poderia sugerir que este seria
um vírus envelopado sem núcleocapsídeo. Entretanto, estudos realizados por microscopia
eletrônica e análises biofísicas, mostraram posteriormente que GBV-C/HGV tem um
núcleocapsídeo, porém a composição exata desta estrutura ainda não foi elucidada
17
.
Comprovadamente, o GBV-C/HGV é um vírus linfotrópico, que replica nas células
mononucleares do sangue periférico, medula óssea e baço, tendo como menos importante a
replicação hepática
18
. Doravante, a partir deste momento utilizaremos apenas a nomenclatura
vírus GB-C (GBV-C) como indicado pela literatura.
A análise filogenética de seqüências genômicas do GBV-C isoladas de amostras de
todo o mundo, revelaram a existência de cinco genótipos, que estão estreitamente
relacionados com a região geográfica, sugerindo que o GBV-C é um vírus antigo, que
acompanhou as migrações populacionais ao longo da história
19,20
. Há um predomínio do
15
genótipo 1 na África Ocidental, do genótipo 2 na Europa e EUA, do genótipo 3 na Ásia, do
genótipo 4 no Sudeste Asiático e do genótipo 5 na África do Sul
21
. No Brasil, há um
predomínio dos genótipos 2 com cerca de 80 a 92% das infecções e 1 com aproximadamente
8 a 20%
22,23
.
No ensaio imunoenzimático, utilizado para identificar se o indivíduo já foi exposto ao
vírus GBV-C, é o anticorpo contra a glicoproteína E2 do envelope que é detectado. Por ser o
anti-E2 um anticorpo neutralizante, raramente se encontra um indivíduo que apresente a
viremia após desenvolver o anticorpo anti-E2
10
. A ocorrência deste fato é de menos de 1%
dos casos
11-13
. A infecção pelo GBV-C é definida pela detecção do RNA do vírus no soro ou
plasma. Essa detecção é feita pela técnica de amplificação do ácido nucléico viral, utilizando
métodos como PCR, nested - PCR ou Real Time – PCR.
24-28
Estudos epidemiológicos indicam que o GBV-C é encontrado mundialmente em
populações sadias com uma prevalência alta, apesar de ser constatado que as populações que
foram expostas a sangue e derivados apresentem uma prevalência ainda maior
24
. A taxa de
exposição da população sadia (doadores de sangue) ao GBV-C na Europa e na América do
Norte é de aproximadamente 1 a 4%, já na América do Sul, África e Ásia esta prevalência é
aumentada, se apresentando entre 8 a 15%
25,26
. Estes dados indicam que doadores de sangue
apresentarão 5 a 10 vezes mais viremia pelo GBV-C que pelo HCV. No grupo que apresentou
exposição ao sangue e derivados, a prevalência de positividade para o anticorpo anti E2 foi de
até 70%
11
.
A transmissão do GBV-C pela via sexual, parece ser muito eficiente, pois um estudo
realizado verificou que a taxa global de infecção pelo GBV-C é semelhante entre pessoas
HIV positivas que adquiriram o HIV pela via parenteral e as que adquiriram pela via sexual
27
. Um estudo realizado por Thomas e colaboradores
11
verificou que cerca de 30 a 40% dos
homens HIV positivos que foram infectados pela via sexual, eram também positivos para
GBV-C e que 40 a 50% destes homens HIV positivos apresentavam o anticorpo anti E2 em
seus soros. Já a transmissão materno- infantil ocorre em até 89% dos casos, entretanto novos
estudos precisam ser realizados para determinar com clareza as taxas de persistências e cura
espontânea em crianças infectadas verticalmente
25
.
16
No Brasil, uma pesquisa conduzida por Bassit e colaboradores
28
, em 1998, avaliou a
prevalência da viremia pelo GBV-C entre 200 doadores de sangue e relatou uma taxa de 9%.
Já em 2002, um grupo de São Paulo
29
avaliou a viremia em 1039 amostras de indivíduos
sadios maiores de 2 anos e relatou uma prevalência de 5,1%; outro trabalho do mesmo ano,
de Oliveira e colaboradores
22
, avaliou 241 doadores da região central do Brasil e relatou uma
freqüência de viremia de 7,1%. Em 2003, Levi e colaboradores
30
, reportaram que entre 545
doadores de sangue da cidade de São Paulo havia uma prevalência de 9,7% de positividade
para o GBV-C RNA. Com base nos dados acima, observamos que a prevalência de viremia
pelo GBV-C entre doadores de sangue voluntários no Brasil está situada entre 5 a 10%.
A maioria dos indivíduos infectados pelo GBV-C desenvolve uma infecção
assintomática e muitos eliminam o vírus espontaneamente, através dos mecanismos do
próprio sistema imunológico. No entanto, o vírus foi bastante estudado em diferentes
populações, procurando-se determinar sua fisiopatologia. Após vários estudos, grande parte
das pesquisas não associou o GBV-C a nenhuma patologia, exceto por alguns pesquisadores
que utilizaram dados não controlados
4, 5
.
O GBV-C não é mais freqüentemente associado a hepatites pós-transfusionais não-A-
E
31
, nem a hepatites criptogênicas não-A-E
17, 31-35
e não foi encontrada qualquer correlação
entre a viremia pelo GBV-C e os níveis de transaminases em doadores e receptores de
sangue, pacientes em diálise, usuários de drogas e hemofílicos
31,36
, assim como também não
foi encontrada associação entre a viremia pelo GBV-C e a hepatite fulminante
33-35
ou
influência na severidade da hepatite pós-transplante e na sobrevida do enxerto
31, 32, 36-39
.
Vários estudos falharam em tentar demonstrar alguma associação entre a viremia pelo
GBV-C e o carcinoma hepatocelular
14, 40, 41
, carcinoma oral
42
, linfoma não-hodgkin
16, 43
e
porfiria cutânea tardia
44
. A maior parte dos estudos realizados comprovou que o GBV-C, não
é o agente causador de hepatite aguda ou crônica de etiologia desconhecida e nem está
associado à outra patologia.
17
A agência americana FDA (Food and Drug Administration), com base nestes dados
decidiu não realizar a triagem para RNA do GBV-C ou dos anticorpos contra a proteína E2
em doadores de sangue dos EUA. Uma decisão de grande importância, já que existem
aproximadamente 11.500.000 unidades de sangue doadas anualmente nos Estados Unidos e
que a prevalência estimada de viremia pelo GBV-C entre doadores de sangue americanos gira
em torno de 1 a 2%, levando a suposição de que milhares de unidades contaminadas com o
GBV-C são doadas diariamente naquele país
45
.
O tratamento para indivíduos infectados pelo GBV-C não é realizado, mas estudos em
pacientes portadores deste vírus e co-infectados pelo HCV demonstraram que o tratamento
com interferon alfa é eficaz na erradicação da viremia pelo GBV-C
46- 48
.
A publicação de um grande número de trabalhos demonstrando que o GBV-C não é
um vírus patogênico, fez com que o interesse por este agente fosse diminuindo
consideravelmente. Entretanto, dois estudos publicados simultaneamente em 1998, renovaram
o interesse por este vírus, agora sob um novo aspecto. Ambos os estudos descreveram um
melhor prognóstico para os pacientes HIV positivos co-infectados pelo GBV-C, propondo
que esta interação retardava a progressão da infecção pelo HIV para AIDS
43, 44
.
A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) é uma manifestação clínica
avançada da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)
49
. Existem dois tipos de
HIV, denominados HIV-1 e HIV-2, são membros da família Retroviridae, na subfamília dos
lentivírus
50-52
. O HIV-1 foi isolado em 1983, sendo ele responsável pela pandemia a nível
mundial. O HIV-2 é causador de epidemias localizadas, especialmente em países da África
Ocidental e de um número reduzido de casos em outros continentes.
Os retrovírus caracterizam-se por terem replicação dependente de um DNA de dupla-
hélice intermediário, que se forma a partir do RNA de fita única do próprio vírus, através da
ação da enzima transcriptase reversa, integrando-o ao genoma da célula hospedeira
53
.
Geralmente, a infecção pelo HIV leva a uma imunodepressão progressiva, especialmente da
imunidade celular e uma desregulação imunitária
49
.
18
Estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS) indicam que aproximadamente
30 milhões de pessoas estão infectadas pelo HIV no mundo. No Brasil, dados divulgados pelo
Ministério da Saúde indicam que desde 1980 a junho de 2008 foram notificados 506.499
casos de AIDS no País, sendo 305.725 no Sudeste, 95.552 no Sul, 58.348 no Nordeste,
28.719 no Centro Oeste e 18.155 no Norte e que o número de casos vem aumentando
especialmente no Norte e Nordeste do país, principalmente entre as mulheres na faixa etária
de 25 a 49 anos
76, 77
.
O HIV é transmitido pelas vias sexual, parenteral e materno-infantil
54
. Essas vias de
transmissão são em sua maioria, compartilhadas com alguns outros agentes, em especial o
GBV-C, determinando dessa forma a alta prevalência desta infecção em pacientes HIV
positivos
44,
54,
55
. Na população infectada pelo HIV, a prevalência da viremia GBV-C é de 30
a 40%, se acrescida à taxa da presença do anticorpo anti-E2 nesta população os valores
aumentam para 40 a 50%. A co-infecção GBV-C-HIV é muito comum, devido à ambos os
vírus serem transmitidos de forma eficiente pelas vias sexual e parenteral, ressaltando a
importância dos estudos realizados para a avaliação de todos os parâmetros que envolvem
esta associação
10, 12, 58, 68.
Vários estudos demonstraram os efeitos favoráveis da co-infecção GBV-C e HIV,
com uma progressão mais lente para AIDS e uma maior sobrevida após o desenvolvimento da
AIDS, associada a uma menor taxa de mortalidade
44,
55-58
. Outros estudos demonstram uma
associação entre a co-infecção pelo GBV-C em pacientes HIV e um significante aumento na
contagem de células T CD4
55-58
.
O primeiro trabalho analisando a co-infecção GBV-C /HIV foi realizado a partir de
uma coorte de 41 hemofílicos japoneses, infectados pelo HIV pela via transfusional em 1983
43
. Neste estudo foi observado que os pacientes com viremia pelo GBV-C (27%)
apresentaram menores cargas virais de HIV e uma tendência, estatisticamente não-
significante, de maior tempo de evolução para AIDS e morte.
Já o estudo de Heringlake e cols
44
, encontrou uma prevalência de 17% do RNA viral,
entre os 197 pacientes estudados, sendo que mais 57% tinham anticorpos anti-E2, perfazendo
um índice de exposição ao GBV-C de 74%. Os indivíduos com GBV-C RNA apresentaram
19
um maior nível basal de CD4 (344 células/μL) em relação aos anti-E2 positivos (259 células/
μL) e aos GBV-C negativos (RNA e anticorpo, 170 células/μL).
No ano seguinte, outro estudo realizado por Sabin e colaboradores indicou que a
mortalidade de 94 ingleses hemofílicos HIV positivos não foi influenciada pelo GBV-C,
sugerindo que não havia influência da co- infecção deste vírus na mortalidade relacionada aos
pacientes HIV positivos. Entretanto, o estudo não fez distinção entre os pacientes que
apresentavam a viremia e aqueles que já apresentavam os anticorpos anti-E2, apenas
considerou todos como expostos ao vírus G
42
.
Os dados de Toyoda e Heringlake foram corroborados neste mesmo ano por um
estudo realizado na França
55
, a partir de uma casuística de 95 pacientes HIV positivos com
soroconversão documentada, ocorrida entre 1985-1991, a maioria infectada através de contato
homossexual. Com um período médio de observação de oito anos, analisou-se a amostra
inicial e atual de dois grupos; um de 23 pacientes com viremia por GBV-C em todo período e
outro de 72 pacientes, sendo 18 anti-E2 positivos em algum momento do estudo (15 na
avaliação inicial) e os outros negativos para RNA e anticorpo. Este estudo concluiu que a
viremia por GBV-C promove uma progressão mais lenta da doença pelo HIV.
O grupo alemão dando continuidade a linha de pesquisa, publicou em 2001 dados
expandidos
59
, avaliando também o impacto da terapêutica antiretroviral (HAART) e sua
relação com a contagem de linfócitos T CD4, níveis de GBV-C RNA e HIV RNA. Além de
reforçarem os achados anteriores, por terem maior prazo de observação, eles concluíram que
o efeito benéfico do GBV-C RNA continuava mesmo após a introdução do HAART e que a
carga viral de GBV-C possuía uma relação inversa à de HIV, mas nenhuma relação com a
contagem de CD4
60
, concluindo que o GBV-C parece diminuir a replicação do HIV,
indicando um efeito inibitório direto.
Neste mesmo ano, um grupo de Iowa
58
publicou dados da mesma natureza em 362
pacientes observados por 4,1 anos, verificando uma mortalidade mais acentuada entre os
GBV-C -RNA negativos (56,4%) em relação aos GBV-C -RNA positivos (28,5%). Também
obtiveram evidências “in vitro” da inibição da replicação do HIV pelo GBV-C em culturas de
células mononucleares co-infectadas.
20
Outro dado interessante foi obtido por Rodriguez e colaboradores
61
, observando que
os pacientes com viremia pelo GBV-C apresentavam uma melhor resposta ao HAART e uma
magnitude de reconstituição imune (aumento de CD4) independente dos níveis basais de CD4
e carga viral de HIV).
Em 2004, Williams e colaboradores
62
, publicaram uma avaliação de 271 pacientes
seguidos desde a soroconversão até 11 anos após, analisando-se tanto a viremia quanto a
presença do anticorpo anti-E2 de GBV-C. A grande maioria dos pacientes apresentou algum
marcador de GBV-C (46% anticorpo, 39% viremia) e 9% dos pacientes clarearam a infecção
por GBV-C entre a primeira e a última avaliação. A melhora na sobrevida foi mais acentuada
após um período mais longo de observação. Os autores verificaram que o pior prognóstico foi
apresentado pelos pacientes que clarearam a infecção pelo GBV-C e concluíram então que, a
influência do tempo de infecção pelo HIV, pode explicar os resultados contraditórios de
outros estudos quanto ao efeito protetor do GBV-C.
Na tentativa de explicar os mecanismos pelos quais o GBV-C, influenciava de forma a
inibir a replicação do HIV, foram realizados vários estudos que indicavam um efeito
inibitório direto. Um primeiro modelo sugerido por Natterman e colaboradores
63
, que
demonstrou o efeito inibitório direto, baseado no fato de que ambos os vírus replicam nas
células mononucleares do sangue periférico, analisou a expressão de um dos receptores
celulares utilizados pelo HIV, o CCR5, em linfócitos de pacientes HIV positivos e negativos
e concomitantemente GBV-C -RNA positivos ou negativos, demonstrando que a infecção
pelo GBV-C promove o aumento na secreção de citoquinas e a diminuição da expressão do
receptor CCR5, sugerindo, portanto ser este o meio pelo qual o GBV-C retarda a progressão
da doença por HIV.
Outros estudos vieram a apoiar esta pesquisa demonstrando que a glicoproteína E2 do
envelope do GBV-C se liga ao receptor do CD81 dos linfócitos T, resultando no aumento de
secreção de citoquinas RANTES, que é um ligante natural do co-receptor CCR5, usado pelo
HIV para entrada nas células-alvo
64,65
. Usando uma metodologia diferente, Xiang e
colaboradores
66
obtiveram resultados semelhantes e mostraram que também ocorre o bloqueio
do receptor CXCR4 através da expressão aumentada de ligantes naturais deste receptor
(citoquinas).
21
Os estudos em co-infectados GBV-C/HIV demonstraram de forma inequívoca que a
viremia pelo GBV-C está associada a um aumento na sobrevida em relação aos não-
infectados, um retardamento na queda de linfócitos CD4 e menores valores de carga viral de
HIV. A elucidação dos mecanismos moleculares destes efeitos benéficos poderá levar a
novas abordagens terapêuticas
67
e o status GBV-C, certamente deverá ser mais uma variável a
ser analisada nos próximos estudos em HIV/AIDS.
No entanto, a maioria absoluta dos estudos envolvendo a interação GBV-C x HIV,
determinou o status GBV-C através de métodos qualitativos, sejam estes sorológicos e/ou
moleculares. É evidente que o estudo da associação entre variáveis quantitativas como
contagem de células CD4+ e carga viral de HIV com uma variável binária como o status
GBV-C + ou -, pode obscurecer certas relações evidenciadas por gradientes biológicos. Desta
forma é possível que haja diferenças importantes entre um paciente com alta carga de GBV-C
e outro com uma viremia baixíssima. Este detalhamento só poderá ser averiguado com uma
metodologia que permita não apenas detectar o RNA viral plasmático mas também ser capaz
de quantificá-lo com precisão.
Além de métodos que possam avaliar de forma mais criteriosa os dados desta co-
infecção, a maioria dos estudos realizados utilizaram coortes exclusivamente masculinas, ou
predominantemente masculinas, deixando uma lacuna sobre os valores desta co-infecção
encontrados em uma população exclusivamente feminina.
1.2- Reação de PCR em tempo real
A técnica de amplificação enzimática da seqüência genômica da ß-globina e análise
do sítio de restrição, em portadores de anemia falciforme, elaborada por K. Mullis e
desenvolvida pela equipe de cientistas da Cetus Corporation, foi publicada pela primeira vez
em 1985 na Science
69
e aclamada como uma das mais poderosas ferramentas da biologia
molecular.
22
Com as dificuldades apresentadas pela técnica de PCR convencional, pesquisadores
buscaram aperfeiçoar e suprir as deficiências da técnica anterior o que gerou nos últimos 10
anos, a evolução dos termocicladores, das marcações químicas de DNA com compostos
fluorescentes e a miniaturização das câmeras tipo CCD levando à invenção do PCR em tempo
real. Inicialmente, a amplificação produzia um aumento na quantidade de DNA de dupla fita
no qual o brometo de etídeo se ligava, resultando em um aumento da fluorescência, o
procedimento era realizado em um termociclador adaptado para irradiar as amostra com luz
ultravioleta e a fluorescência emitida era captada por uma câmera CCD. O sistema era capaz
de indicar a quantidade de alvo inicial de uma amostra durante a PCR, por avaliar a produção
do produto de PCR a cada ciclo
70,71
.
O aperfeiçoamento foi realizado utilizando o SYBR Green no lugar do brometo de
etídeo como intercalante, por possuir uma afinidade maior com o DNA de fita dupla. A
fluorescência é medida apenas no momento da extensão, tornando a reação mais específica, a
medida é realizada por filtros específicos selecionados e os resultados fornecidos por um
software próprio do equipamento.
Esta metodologia, apesar de representar um avanço, trazia a desvantagem de que o
intercalante se ligava a produtos de PCR não específicos de dupla fita, o que tornava a
quantificação passível de erros. Para corrigir isto, foi desenvolvido um sistema que usa
sondas marcadas internas ao amplicon, garantindo a emissão de fluorescência apenas quando
o alvo específico estivesse sendo amplificado.
Em 1991, um estudo realizado por Holland
72
e colaboradores demonstrou que a
clivagem de uma sonda alvo durante a PCR pela atividade 5’ nuclesase da Taq DNA
polimerase poderia ser utilizada para detectar a amplificação de um alvo específico, pois o
sistema desenvolvido garantia que a clivagem da sonda só ocorresse quando o a seqüência
alvo estivesse sendo amplificada.
Simultaneamente, Lee e colaboradores
73
desenvolveram uma forma de eliminar o
processamento dos resultados pós-PCR com o desenvolvimento de sondas fluorogênicas. A
sonda era marcada com um composto fluorescente na extremidade 5’ e um composto que
impede a fluorescência do primeiro, quando ambos encontram-se fisicamente próximos,
23
denominado “quencher”. Assim quando houvesse o pareamento dos primers e a extensão da
seqüência alvo, a sonda era quebrada pela ação da Taq polimerase e o composto fluorescente
era separado do “quencher”, liberando então uma fluorescência, sendo interpretado como
uma cópia de DNA.
A emissão de fluorescência do produto de PCR é medida a cada ciclo, daí o nome
PCR em tempo real. Na fase exponencial, a quantidade inicial da seqüência alvo está
diretamente relacionada com esta emissão, ou seja, quanto maior o número de cópias inicial,
mais cedo ocorrerá a emissão de fluorescência, acima de um valor basal denominado
“treshold”.
A validação de um PCR em tempo real para GBV-C poderá ser muito útil à pesquisa
de HIV/AIDS, pois, é uma técnica de fácil execução liberando os resultados de um grande
número de pacientes de forma rápida, apresentando as vantagens de ter uma boa
especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade, além de diminuir os riscos de contaminação
por um menor manuseio das amostras, qualificando e quantificando as amostras positivas.
24
_________________________________________________________2. Justificativa______
O presente estudo foi proposto considerando-se que:
Estudos realizados em co-infectados GBV-C/ HIV demonstraram que a viremia pelo
GBV-C está associada com uma progressão mais lenta para AIDS e o aumento da sobrevida
dos pacientes após o desenvolvimento da AIDS, devido a uma diminuição na queda de
linfócitos CD4 e valores de carga viral de HIV menores.
Entretanto, estes estudos foram em sua maioria realizados com casuística
predominantemente ou exclusivamente masculina, ressaltando a importância de novos dados
provindos de uma coorte feminina.
A determinação do status GBV-C nestes estudos, foi majoritariamente através de
métodos qualitativos, sejam eles sorológicos e/ou moleculares. O desenvolvimento de uma
técnica de PCR em tempo real para detecção do GBV-C, permite correlacionar os dados
qualitativos aos quantitativos, fornecendo informações mais completas e específicas das
amostras positivas para GBV-C.
25
____________________________________________________________3. Objetivos______
- Desenvolver uma metodologia de PCR em tempo real para GBV-C/RNA e fazer a
determinação das cargas virais de GBV-C.
- Avaliar a soroprevalência e viremia (qualitativa) por GBV-C nas amostras de pacientes
infectadas pelo HIV, coletadas entre 1997-1999 e arquivadas em plasmateca a -70ºC.
26
_________________________________________________4. Materiais e Métodos______
4.1 – Amostras
As amostras de plasma foram coletadas durante a execução do projeto de estudo da
infecção pelo Papilomavírus Humano em pacientes HIV positivas
74
, realizado anteriormente
no laboratório de Virologia do Instituto de Medicina Tropical (LIM 52 – HCFMUSP).
A coleta das amostras foi realizada entre 1997- 1999 no Instituto de Infectologia
Emílio Ribas e na Divisão de Moléstias Infecciosas e Parasitárias do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (Casa da AIDS), durante o
acompanhamento e tratamento das pacientes infectadas pelo HIV e armazenadas a -70ºC
desde então.
Foram utilizadas da plasmateca 253 amostras HIV positivas, as quais apresentavam
quantidade suficiente para realização dos ensaios de determinação do status GBV-C.
Obtivemos através de arquivo, os valores de carga viral do HIV e contagem de CD4 de todas
as amostras utilizadas; estes testes foram realizados logo após a coleta dando seqüência ao
acompanhamento das pacientes em tratamento nas instituições citadas.
Tabela 1: Pacientes do estudo divididas por faixa etária.
FAIXA
ETÁRIA
18 - 20
21 - 30
31 - 40
41 - 50
51 - 60
≥ 61
TOTAL
Nº DE
MULHERES
07
80
101
56
8
01
253
O estudo obteve a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do II Emílio Ribas, da
Casa da AIDS e da Comissão de Ética para a Análise de Projetos de Pesquisa – CAPPesq –
27
da Diretoria Clinica do Hospital das Clínicas e da Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo (protocolo nº 029/06).
4.2 – Determinação qualitativa de anticorpos anti-E2 GBV-C
Realizamos a importação dos kits de detecção de anticorpo específico anti-E2. Este kit
é um ensaio imunoenzimático comercial (µPlate antiHGenv teste, Roche Diagnostics,
Penzburg – Alemanha) realizado com soro/plasma humano e foi doado pelo Dr. Dietmar
Zdunek da empresa Roche Diagnostics, Penzburg – Alemanha.
Foram submetidas ao ensaio as 253 amostras de plasma da soroteca, cada amostra
correspondendo a uma paciente. A reação de Elisa foi realizada conforme indicação do
fabricante do kit e abaixo descrito.
As amostras e os controles foram diluídos (1:20) e pipetados 20 μl em cada poço da
placa, seguido de 80 μl da solução de incubação contendo o antígeno-GBV-C-E2 e incubados
no shaker por 2 horas. Após lavagem, foi adicionado 100 μl do conjugado que contem o
anticorpo anti-h-Fcγ em cada poço e novamente incubados por 1 hora no shaker. Feita nova
lavagem e adicionado 100 μl do substrato contendo o cromógeno em cada poço, foram
incubados por mais 1 hora, homogeneizando protegidos da luz. Em seguida, foi realizada a
leitura no espectrofotômetro na faixa de 405 ηm.
Avaliados os critérios do fabricante para definir o cut-off, determinamos as amostras
positivas e negativas. As amostras com resultado em torno de ± 15% do valor do cut-off,
foram repetidas e as que continuaram dentro desta classificação foram para o teste
confirmatório, como indicado pelo fabricante.
4.2.1 – Teste confirmatório para de detecção do anticorpo específico anti-E2
As amostras positivas ou indeterminadas foram submetidas ao teste confirmatório. Em
contraste ao procedimento normal do teste, a solução de incubação não continha o antígeno-
GBV-C -E2, ou seja, não havendo possibilidade das amostras positivas para o anti-E2
apresentarem reação colorimétrica por não ocorrer a ligação antígeno-anticorpo. Os outros
passos foram seguidos normalmente.
28
Havendo a diminuição da densidade ótica em mais de 1,5X em relação á leitura inicial
conclui-se que é um positivo confirmado. Ocorrendo o inverso, trata-se de um falso-positivo,
uma amostra que contém anticorpos contra um antígeno semelhante ao E2, mas que não é o
próprio, já que a absorbância se mantém na ausência do mesmo.
4.3 – Extração de RNA da amostra
Para obtenção de RNA das amostras de plasma foi utilizado o kit de extração QIAamp
Viral RNA Mini kit (Qiagen®,Chattlesworth, EUA). Como indicado pelo fabricante, foram
pipetados 560 μl de tampão AVL em cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionados
140 μl de plasma da amostra, agitando-se em seguida por 15 segundos e incubando-se em
temperatura ambiente por 10 minutos, centrifugando-se rapidamente e adicionando-se 560 μl
de etanol 100%, agitando-se novamente. Em seguida foram aplicados 630 μl da solução de
lavagem na coluna “QIAamp spin” e centrifugou-se a 6000 x g por 1 minuto, descartando-se
o filtrado. Foi repetido o procedimento anterior e realizadas as lavagens como indicado no kit.
Ao final obtivemos um eluato de RNA de 60 μl de cada amostra.
4.4 – Reação de Transcrição Reversa
Para a etapa da síntese do DNA complementar- cDNA foi utilizado um protocolo “in-
house” com hexâmeros randômicos (PDN, N6, Invitrogen®, CA, EUA) e a enzima
transcriptase reversa de M-MLV (Invitrogen®, São Paulo, Brasil).
Na primeira etapa da reação de síntese de cDNA, procedeu-se uma linearização do
RNA, ajustando-se no termociclador Eppendorf gradient (Eppendorf®, Hamburgo,
Alemanha) a temperatura para 65ºC durante 5 minutos, e utilizando-se o mix I, constituído
pelo tampão, os nucleotídeos (dNTPs), o cloreto de magnésio (MgCl2), o inibidor de RNAses
(RNAse-Out 40U/μl - Invitrogen®, CA, EUA), o DTT (Invitrogen®, CA, EUA) e o RNA
extraído, conforme a tabela 2.
Na segunda etapa da reação, o termociclador Eppendorf gradient (Eppendorf®,
Hamburgo, Alemanha) foi ajustado para 22º C durante 10 minutos, acrescentando-se ao mix
I, 5,5 μl do mix II, constituído pela enzima M-MLV, a água livre de RNAses e os primers
29
randômicos, nas concentrações indicadas na tabela 3. Seguindo-se o programa 37º C por 30
minutos e 95º C por 5 minutos, para inativação da enzima M-MLV. Finalmente o cDNA
ficou a 4º C no termociclador, sendo removido e estocado no freezer a -20º C.
Tabela 2: Reagentes, volumes e concentrações utilizados na primeira etapa da reação
de transcrição reversa ( mix I ).
Reagente
Volume (μl)
[final]
Tampão PCR 10x minus Mg
4,0
1x
dNTPs (2,5mM)
3,2
0,2mM
MgCl
2
(50mM)
4,0
5mM
RNAsin (40U/ μl)
1,0
1U
DTT
0,4
3M
Volume final
12,6
cDNA
22,0
Volume da reação
34,6
Tabela 3: Reagentes, volumes e concentrações utilizados na segunda etapa da reação
de transcrição reversa (mix II).
Reagente
Volume (μl)
[final]
PDN (50 μM)
2,0
2,5 μM
M-MLV(200U/ μl)
0,5
2,5U
H2O DEPC
3,0
Volume final
5,5
Volume mix I + mix II
40,1
30
4.5 – Reação de PCR GBV-C Convencional
A padronização da PCR convencional para detecção de GBV-C RNA nas amostras foi
feita utilizando primers previamente publicados, que amplificam uma porção da região
5`NCR por esta ser a parte mais conservada do vírus
30
. O procedimento amplificou as
amostras positivas a partir de 5 μl de cDNA em uma reação de PCR de volume final de 25 μl,
usando os primers antisense LG1 (5’ CACTGGTCCTTGTCAACTCGC 3’), sense LG2 ( 5’
CACTGGGTGCAAGCCCCAGAA 3’) e reagentes como indicado na tabela 4.
A reação consistiu de uma etapa de desnaturação a 95ºC por 5 minutos, seguida por 40
ciclos de amplificação a 94ºC por 30 segundos, 55ºC por 30 segundos, 72ºC por 1 minuto e
incubação final de 72ºC por 5 minutos. As amostras positivas, foram detectadas por
eletroforese com brometo de etídeo em gel de agarose a 2%. Foram utilizados também
controles positivos e negativos a cada reação. Os controles são amostras de plasma doadas
pelo Banco de sangue do Hospital Sírio Libanês, já devidamente testadas e classificadas
como negativa para todos os agentes infecciosos inclusive para o GBV-C no caso do controle
negativo, Já o controle positivo passou pelos mesmos testes porém, apresentou-se positivo
apenas para o GBV-C. Este material foi aliquotado e guardado refrigerado a -80ºC.
Tabela 4: Reagentes, volumes e concentrações utilizados na reação de PCR GBV-C
convencional.
Reagentes
Volume ( μL)
[Final]
Tampão de PCR 10X minus Mg
2,5
1x
dNTPs (2,5mM)
2,0
200 μM
MgCl
2
(50mM)
1,5
3,0mM
LG 1 (10μM)
0,5
200 ηM
LG 2 (10μM)
0,5
200 ηM
Taq Platinum (5U/ μL)
0,25
1,25U
H2O DEPEC
7,75
-
Glicerol 57%
2,5
5,70%
Cresol Red (1μg/ μL)
2,5
0.1μg/ μL
Volume Final
20,0
cDNA
5,0
Volume de Reação
25 μL
31
4.6 – Reação de NESTED PCR GBV-C
A reação de Nested PCR GBV-C foi padronizada utilizando os primers publicados por
Andonov
75
e colaboradores. Neste estudo, os pesquisadores avaliaram 6 diferentes conjuntos
de primers e o de maior sensibilidade foi adotado por nós, conforme abaixo.
Para o primeiro tempo utilizamos 5 μl de cDNA que foi submetido ao PCR usando os
primers G58 sense (5’ CAGGGTTGGTAGGTCGTAAATCC 3’) e G75 antisense (5’
CCTATTGGTCAAGAGAGACAT 3’) e para o segundo tempo utilizamos 2,5 μl do produto
de PCR do primeiro tempo que foi amplificado pelos primers G134 sense ( 5’
GGTCAYCYTGGTAGCCACTATAGG 3’) e G131 antisense (5’ AAGAGAGACATTG
WAGGGCGACGT 3’) e reagentes nas concentrações e volumes mostrados na tabela 5.
Para ambos os tempos, a reação foi realizada em um volume total de 25 μl, a
denaturação ocorreu a 95ºC por 5 minutos, seguida por 25 ciclos de amplificação a 94ºC por
45 segundos, 55ºC por 45 segundos, 72ºC por 90 segundos e incubação final de 72ºC por 5
minutos. O produto final da reação de NESTED PCR foi detectado por eletroforese com
brometo de etídeo em gel de agarose a 2%, sendo utilizados os mesmos controles positivos e
negativos derivados das alíquotas de plasma doadas pelo Banco de sangue do Hospital Sírio
Libanês.
32
Tabela 5: Reagentes, volumes e concentrações utilizados na reação de Nested PCR GBV-C.
Reagentes
Volume(µL)
[ Final]
Reagentes
Volume(µL)
[ Final]
1º PCR
2º PCR
Tampão de PCR
10X minus Mg
2,5
1x
Tampão de PCR
10X minus Mg
2,5
1x
dNTPs (2,5mM)
2,0
200µM
dNTPs (2,5mM)
2,0
200µM
MgCl
2
(50mM)
1,25
2,5mM
MgCl
2
(50mM)
1,25
2,5mM
G58 (10µM)
0,5
200 ηM
G134 (10 µM)
0,5
200 ηM
G75 (10µM)
0,5
200 ηM
G131 (10 µM)
0,5
200 ηM
Taq Platinum
(5U/µL)
0,25
1,25U
Taq Platinum (5U/µL)
0,25
1,25U
H2O
8,0
H2O
10,5
Glicerol 57%
2,5
Glicerol 57%
2,5
Cresol Red
1μg/µL
2,5
Cresol Red 1μg/µL
2,5
Volume Final
20,0
Volume Final
22,5
cDNA
5,0
1st round PCR prod.
2,5
Volume de Reação
25,0
Volume de Reação
25,0
4.7 – Validação da PCR em tempo real para GBV-C
O estudo da padronização de um PCR em tempo real para GBV-C iniciou-se com a
escolha do melhor método para avaliar a sequência alvo, levando em consideração as
características filogenéticas e físico-químicas da mesma. Optamos por desenvolver um ensaio
baseado no sistema Taqman, por apresentar maior especificidade.
A sonda se liga a seqüência alvo dez graus acima da temperatura de ligação dos
primers para garantir que ela seja sempre a primeira a se ligar na seqüência alvo, até aí ela
ainda não emite fluorescência, pois a proximidade entre o quencher e o reporter impede que
isto ocorra. Após diminuir os dez graus, na fase de pareamento, os primers se ligam ao alvo e
a enzima Taq polimerase promove a síntese da nova fita ao mesmo tempo exerce sua
atividade exonucleásica clivando a sonda que passa a liberar um sinal de fluorescência, que
será captado pelos filtros e analisado como uma cópia da seqüência alvo.
33
4.7.1 – Definição do ensaio e dos primers
Desenvolvemos um ensaio baseado no sistema Taqman, que se vale da atividade
exonucleolítica da Taq Polimerase para digerir uma sonda cuja região de hibridização é
interna aos do fragmento delimitado pelos primers de amplificação. Esta sonda é marcada
com um composto fluorescente na extremidade 5’ e um composto que impede a fluorescência
do primeiro, quando ambos encontram-se fisicamente próximos, denominado “quencher”.
O estudo das seqüências de primers vai além das propriedades teóricas de qualquer
primer, pois deve atender também as características físico-químicas desejáveis ao ensaio de
Taqman, mas também e principalmente, cobrir a variação molecular naturalmente observada
no genoma-alvo. No caso específico da detecção e quantificação do GBV-C, buscamos
atender ambas as exigências filogenéticas e físico-químicas, usando os dados de diversidade
de seqüência dos diferentes genótipos de GBV-C para selecionar os primers idealmente mais
conservados, e ao mesmo tempo, procurando desenhar uma sonda interna que possuísse as
desejadas propriedades.
Por analogia ao HCV, e revisando os trabalhos que fizeram comparações das melhores
regiões gênicas para alvo de diagnóstico molecular para GBV-C, ficou evidente que
deveríamos focar na região 5’NCR. É a região mais conservada tanto do HCV quanto do
GBV-C, e aquela que dois estudos diferentes obtiveram as maiores prevalências, ou seja,
maior sensibilidade
60,85
.
Após esta definição, iniciamos a busca por primers já disponíveis na literatura,
avaliados contra diferentes genótipos de GBV-C, e delimitando amplicons com tamanho
inferior a 200 pares de bases, característica esta desejável em PCR em tempo real. A sonda
por sua vez também deveria atender exigências de sonda Taqman, descritas e analisáveis pelo
programa Primer Express (Applied Biosystems) instalado em nossos equipamentos de PCR
em tempo real. Após muitas análises, obtivemos o conjunto de primers/sonda .
Como descrito na tabela 6, o ensaio foi produzido pela empresa Applied Biosystems
que faz o Assay Mix, reagente que já vem pronto para uso como uma mistura 20X
concentrada. No Assay Mix está incluso tudo que é necessário para que a reação de PCR
34
ocorra, como: os primers, a sonda, o tampão, a enzima Taq, os dNTPs, e o normalizador de
fluorescência ou referência passiva, que controla para as variações de fluorescência que
podem ocorrer por causas não relacionadas ao ensaio Taqman propriamente, como diferenças
de volume e etc. Neste ensaio o fluoróforo utilizado para este fim é o ROX.
Para realizar a reação, foi só adicionar à mistura o cDNA e levar ao equipamento de
PCR em tempo real (ABI Prism 7300 – Applied Biosystems). Este procedimento utilizou o
primer sense RTG1 (5’ GTGGTGGATGGGTGATGACA 3’ ), o primer antisense RTG2 ( 5’
GACCCACCTATAGTGGCTACCA3’) e a sonda antisense (5’FAM-
CCGGGATTTACGACCTACC-NFQ3’), onde FAM é o composto fluorescente ou
“reporter“, e NFQ significa “non-fluorescente quencher”. Seguindo o protocolo de 95ºC por
10 minutos, seguido por 40 ciclos de amplificação a 95ºC por 15 segundos, 60ºC por 1
minuto. As amostras positivas, amplificaram uma seqüência de 72 pb e tiveram suas cargas
virais quantificadas pelo próprio equipamento de PCR em tempo real, baseado na curva
padrão.
Tabela 6: Reagentes, volumes e concentrações utilizados no PCR em tempo real.
Reagente
Volume (μl)
TaqMan Universal PCR Master
Mix 2X
10,0
20X Assay Mix
1,0
cDNA
9,0
Volume Final
20,0
Concentração dos Primers
18 µM
Concentração da Probe
5µM
4.7.2 – Calibração do ensaio e curva – padrão.
Para obterem-se dados quantitativos (carga viral) sempre é necessário haver em cada
corrida, alguns tubos/poços que contém cDNAs derivados de concentrações previamente
conhecidas de uma amostra-padrão. Estas diluições da amostra-padrão são colocadas para o
software de gerenciamento da reação como controles (Qc) aos quais se atribuí um valor
35
quantitativo em qualquer unidade estabelecida, cópias/mL, unidades internacionais/mL,
genoma-equivalentes/mL etc.
Como não há até este momento, uma padronização quanto ao GBV-C RNA, optamos
por criar um padrão interno do laboratório, para o qual existe material abundante e que possa
ser analisado muitas vezes. Obtivemos uma bolsa de plasma já previamente identificada
poconter GBV-C RNA e estar livre de outros agentes infecciosos como HBV, HCV e HIV.
Esta bolsa de cerca de 350 mL de plasma foi gentilmente doada pelo Banco de Sangue do
Hospital Sírio-Libanês de São Paulo. Ao chegar ao Laboratório de Virologia do IMT a bolsa
foi descongelada e o plasma imediatamente aliquotado em microtubos contendo 0,5 mL de
plasma cada um. Uma alíquota foi então diluída com plasma normal GBV-C negativo, de
forma a gerar uma curva de titulação, partindo-se do plasma puro até uma diluição de
1:100.000. Triplicatas de cada ponto (puro-1:5 - 1:10 - 1:100 - 1:1.000 - 1:10.000 -
1:100.000) foram extraídas e processadas conforme descrito anteriormente. Os cDNAs forma
submetidos à reação de PCR em tempo real. Observamos que até a diluição de 1:10.000 havia
uma amplificação consistente e reprodutível. A partir deste resultado determinamos que a
bolsa-padrão contém uma carga viral de 10.000 unidades-aleatórias (UA/mL) de GBV-C
RNA por mililitro de plasma.
Nesta fase de testes para validação da curva-padrão, observamos um fenômeno ao
qual descrevemos como uma inibição causada por excesso de RNA viral, onde a amostra pura
e na diluição 1:5 apresentaram um Ct superior ao das outras diluições, o que fez com que
esses pontos fossem retirados da curva garantindo a reprodutibilidade do ensaio. Assim nossa
curva ficou com quatro pontos que foram colocados em todos os ensaios sempre em
triplicatas (1:10, 1:100, 1:1.000, 1: 10.000).
4.7.3 – Teste de avaliação da interferência de outros vírus na reação de PCR em tempo real
para GBV-C.
Realizamos um ensaio de PCR em tempo real para GBV-C, com amostras de
pacientes sabidamente RNA positivos para HCV e Dengue. Escolhemos estes vírus por serem
da mesma família Flaviviridae o que aumentaria a chance de uma amplificação inespecífica
se houvesse uma falha nos primers escolhidos.
36
Neste teste utilizamos os mesmos critérios que foram realizados nos ensaios com as
amostras das pacientes como: A curva padrão em Triplicata, com quatro pontos; o controle
positivo para GBV-C e um controle negativo. Na reação foram testadas 20 amostras sendo 10
positivas para HCV e 10 positivas para Dengue.
37
__________________________________________________________5. Resultados______
5.1- Sorologia
Analisamos os resultados da pesquisa qualitativa de anticorpos anti-E2 GBV-C,
realizada nas 253 amostras. Na primeira análise obtivemos 64 amostras positivas, 43
indeterminadas e 146 negativas. Em seqüência, todas as amostras que estavam
indeterminadas foram repetidas e apenas 5 revelaram-se positivas, as demais foram todas
negativas. Assim, realizamos o teste confirmatório em 69 amostras positivas e 5 amostras que
eram positivas já no primeiro Elisa continuaram a ser positivas, sendo consideradas amostras
com resultado falso- positivo.
No teste confirmatório, a incubação é feita na ausência do antígeno E2, ou seja, todas
as amostras deveriam ter resultados negativos para este teste, considerando que estas são
positivas para GBV-C e o anticorpo não teria onde se ligar. O resultado final desta análise foi
de 64 positivos e 189 negativos.
5.2 – PCR GBV-C convencional
A reação de PCR convencional para GBV-C, utilizando os primers LG1 e LG2
amplificou uma seqüência de 367pb em 36 amostras, sendo 217 negativas.
Este método avaliou a presença de RNA GBV-C nas amostras de forma qualitativa.
Em todas as corridas de PCR houve a presença dos controles positivos e negativos que
passaram pelos mesmos procedimentos das amostras até a obtenção dos resultados, como
mostra a figura 1.
38
Figura 1: Fotografia de gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo (Alphaimager® EC,
Alpha Innotech Corporation, EUA) referente à PCR GBV-C convencional com três amostras
positivas (Am110, Am116 e Am119) além do controle positivo (cp) e do controle negativo
(br).
5.3 – Nested PCR GBV-C
A realização do ensaio de Nested PCR para GBV-C foi pensada com o intuito de
detectar amostras positivas com cargas virais baixas. Devido ao tempo de estocagem das
mesmas, havia a possibilidade de uma diminuição dos níveis de RNA nas amostras, ao
mesmo tempo o resultado deste ensaio serviu para avaliar o método de Tempo Real para
GBV-C.
Assim como o PCR convencional, este método avaliou a presença de RNA GBV-C
nas amostras de forma qualitativa e em todas as corridas houve a presença dos controles
positivos e negativos, como mostra a figura 2. As reações positivas tiveram como resultado a
amplificação de um produto de PCR de 241pb e 208pb, respectivamente do primeiro e
segundo tempo. No resultado final foram observadas 57 amostras positivas, sendo 36 que já
eram positivas no PCR convencional e 21 novas amostras positivas apenas para o Nested
GBV-C e 196 negativas.
39
Figura 2: Fotografia de gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo (Alphaimager® EC,
Alpha Innotech Corporation, EUA) referente à reação de Nested PCR GBV-C com quatro
amostras positivas (Am116, Am119, Am128 e Am130) além do controle positivo (cp) e
negativo (cn).
5.4 – PCR em tempo real para GBV-C
5.4.1 - Calibração do ensaio e curva padrão
As corridas realizadas para calibração do ensaio de real time, foram feitas com o
cDNA da amostra padrão, derivada da bolsa de plasma doada pelo Banco de Sangue do
Hospital Sírio-Libanês de São Paulo. Os testes foram feitos com triplicatas de cada ponto,
partindo do plasma puro até a diluição de 1:100.000, como já descrito anteriormente em
métodos. Conseguimos quantificar a bolsa-padrão através desta diluição, que apresentou uma
carga viral de 10.000 unidades-aleatórias de GBV-C -RNA por mililitro de soro, obtendo-se
sempre valores de Ct (Cycle Treshold) de 38 ±1.
Ao realizarmos as corridas, observamos um fenômeno que pode ser notado nas figuras
3 e 4, ao qual reputamos ser uma inibição causada por excesso de RNA viral (cDNA), onde a
amostra pura apresenta um Ct superior ao das diluições 1:5 e 1:10, algo que ocorreu também
com a diluição 1:5 em outras corridas, e para garantirmos a reprodutibilidade do ensaio esse
ponto também foi eliminado e nossa curva ficou com quatro pontos (1:10, 1:100, 1:1000 e
1:10.000) que foram colocados em todas as corridas sempre em triplicata (figuras 5 e 6).
40
Figura 3: Relatório do PCR em tempo real de corrida apenas com o cDNA da amostra padrão,
utilizada para gerar a curva de calibração e quantificação, onde a amostra pura apresenta um
Ct superior ao das diluições 1:5 e 1:10.
Figura 4: Gráfico de amplificação correspondente ao relatório acima.
41
Figura 5: Curva de Calibração.
Figura 6: Relatório mostrando os Cts dos calibradores (Standard) e as cargas virais de
algumas amostras (Unknown).
42
5.4.2 – Avaliação de interferência
O ensaio realizado com 20 amostras sendo, 10 positivas para RNA-HCV e 10 positivas
para RNA-Dengue comprovou que não houve inespecificidade na reação já que se tratava de
amostras com cargas virais altas para ambos os vírus e não houve nenhuma amplificação na
reação para GBV-C.
5.4.3 – Amostras
Todas as amostras de plasma foram extraídas e submetidas à síntese de cDNA. A cada
corrida colocamos as amostras, a curva padrão e os controles positivo e negativo, todos em
triplicata para eliminarmos grandes variações na amplificação por eventuais erros de
pipetagem.
Ao final observamos que das 253 amostras, 196 foram negativas e as 57 amostras que
apresentaram amplificação, também haviam sido positivas para GBV-C no PCR nested. As
cargas virais de GBV-C individualizadas e os valores de CD4 e de carga viral de HIV das 57
amostras com viremia detectável no ensaio de PCR em tempo real aparecem na tabela 7, a
seguir:
Tabela 7: Resultados de Carga Viral de GBV-C (N=57) e contagem de CD4 e Carga Viral de
HIV
Nº Estudo
GBV-C RNA UA/mL
CD4/uL
Carga HIV cps/mL
70
13625,37
237
4.451
81
12015,04
355
81.986
157
4511,69
655
1.165
66
4477,56
333
56.116
213
4430,64
271
100
64
4318,85
235
100
151
3974,57
355
1.411
197
3899,52
332
4.738
186
2769,24
254
100
130
2336,16
314
100
230
1916,43
208
100
148
1895,83
108
100
128
1710,4
379
477
30
1638,68
410
40.763
212
1589,9
375
858
43
Tabela 7 (continuação): Resultados de Carga Viral de GBV-C (N=57) e contagem de CD4 e
Carga Viral de HIV
Nº Estudo
GBV-C RNA UA/mL
CD4/uL
Carga HIV cps/mL
88
1467,71
284
810
172
1339,76
445
5.840
119
1221,67
487
4.604
171
1221,35
500
100
110
910,52
623
19.435
209
853,43
300
100
104
820,29
228
33.951
47
812,89
365
13.042
25
637,06
317
16.878
235
619,8
89
100
246
604,04
507
100
232
576,59
305
100
185
493,88
189
499
236
458,93
296
2.467
105
438,7
676
2.404
168
285,92
135
100
231
275,99
449
7.607
227
233,51
308
42.000
245
195,28
437
13.151
239
178,17
508
13.091
155
139,73
304
4.153
99
110,77
512
130.637
182
91,97
319
10.744
220
77,22
155
4.436
103
56,13
506
378.307
116
52,08
293
481.653
219
45,09
38
100
228
43,13
272
28.546
6
41,02
168
2267
45
38,32
57
502
62
25,16
258
111.173
263
23,43
74
942
12
23,34
175
49.347
237
16,46
443
2.720
242
16,37
293
5.971
109
9,32
108
47.420
247
9,06
219
100
114
5,88
230
46.323
205
4,63
146
29.006
20
2,81
361
3.455
15
2,79
341
22.578
254
1,1
353
920
44
O resumo geral dos resultados sorológicos e moleculares obtidos estão apresentados
na tabela 8 abaixo.
Tabela 8: Resultados finais dos testes laboratoriais para GBV-C. α = anti-HGVenv; RNA =
Viremia GBV-C.
α + / RNA +
0
0,00%
α + / RNA -
64
25,30%
α - / RNA +
57
22,53%
α - / RNA -
132
52,17%
253
100,00%
A comparação dos resultados entre os métodos pode ser vista na tabela 9, onde
podemos observar com mais clareza o resultado de cada teste e como esses valores
demonstram uma maior sensibilidade e especificidade de um método comparado a outro em
números, pois podemos verificar que o número de amostras positivas do PCR convencional
difere dos métodos de PCR Nested e Real Time, devido aos critérios acima citados. Também
podemos ver que nenhum dos métodos que avaliou a viremia quando comparado com a
sorologia teve resultados positivos para ambos.
45
Tabela 9: Comparação dos resultados laboratoriais sorológicos e moleculares, técnica por
técnica. Sorologia = anti-E2.
pos
neg
pos
neg
Sorologia pos
0
64 PCR simples pos
36
0
neg
36
153 Total neg
21
196 Total
36 217
253
57 196
253
pos
neg
pos
neg
Sorologia pos
0
64 PCR simples pos
36
0
neg
57
132 Total neg
21
196 Total
57 196
253
57 196
253
pos
neg
pos
neg
Sorologia pos
0
64 PCR nest. pos
57
0
neg
57
132 Total neg
0
196 Total
57 196
253
57 196
253
PCR Tempo Real
PCR Tempo Real
PCR simples
PCR Tempo Real
PCR nest.
PCR nest.
A correlação entre as cargas virais de ambos os vírus foi ainda menor (índice Pearson
= -0,09) onde o valor negativo denota correlação inversa, porém estatisticamente não-
significante p= 0,2). A tabela 10 traz os dados estatísticos das médias, medianas e desvios-
padrão das amostras GBV-C-RNA positivas e negativas.
Tabela 10: Média, Mediana e Desvio-Padrão dos valores de Carga Viral HIV e
Contagem de Células CD4 nos grupos GBV-C-RNA positivo e negativo.
MÉDIA
MEDIANA
Desvio Padrão
Carga Viral
HIV/mL
CD4/uL
Carga Viral
HIV/mL
CD4/uL
Carga Viral
HIV/mL
CD4/uL
GBV-C-
RNA+
(N=57)
35.162,6
313,9
4.738,0
305,0
87.672,1
145,8
GBV-C-
RNA- (N=
196)
71.859,2
294,9
5.902,0
280,5
159.882,3
183,5
46
_______________________________________________________________6. Discussão______
Desde a década de 80 quando foi descoberto o primeiro caso de AIDS, o número de pessoas
portadoras do vírus HIV aumentou de forma abrupta, elevando a AIDS a um dos mais importantes
problemas de saúde pública da atualidade. No começo a AIDS atingiu de forma intensa, os
homossexuais, os usuários de drogas ilícitas endovenosas e indivíduos que receberam transfusões
sanguineas e de hemoderivados. Porém, com o passar dos anos o perfil epidemiológico vem
mudando e o número de casos de portadores do vírus HIV está aumentando entre os heterossexuais,
as mulheres, pessoas de baixa renda e saindo dos grandes centros para as pequenas cidades
76
.
Dados atuais da Organização Mundial da Saúde (OMS) estimam que aproximadamente 30
milhões de pessoas vivam com AIDS no mundo. Segundo o último boletim epidemiológico do
Ministério da Saúde, até Junho/2008 foram identificados 506.499 casos de AIDS no Brasil, com um
total de óbitos acumulados até 2007 de 205.409. O número de casos vem aumentando no país,
principalmente nas regiões Norte, Nordeste e Centro- Oeste, em especial entre as mulheres
76
.
Foram identificados até Junho de 2008 um total de 333.485 casos de AIDS no sexo
masculino e 172.995 no sexo feminino, observou-se também que a razão de sexo (M:F) no Brasil
diminuiu bastante ao longo do tempo, passando de 15,1: 1 em 1986 para 1,5:1 em 2006
76, 77
.
Em 1996, o Brasil desenvolveu um projeto que dava a todos os portadores do HIV, acesso
ao tratamento anti- retroviral. A partir deste ano, houve uma importante diminuição no número de
óbitos destes pacientes. Dados do Ministério da Saúde informam que os coeficientes de mortalidade
nos anos de 95 e 96 foram em média de 9,6 óbitos por 100 mil habitantes, sendo que em 1997 caiu
para 7,6 mantendo uma diminuição gradativa a cada ano
76
.
Em 1998, dois estudos publicados simultaneamente por Toyoda e Heringlake, descreviam
um melhor prognóstico para os pacientes HIV positivos co-infectados pelo GBV-C, propondo que
esta interação retardava a progressão da infecção pelo HIV para AIDS e renovando ao mesmo
tempo o interesse pelo vírus GBV-C
43, 44
.
Devido ao fato de que o vírus GBV-C compartilha as mesmas vias de transmissão do HIV, é
comum encontrar pacientes que apresentam esta co-infecção. A partir deste ponto, várias pesquisas
foram realizadas em coortes de pacientes HIV positivos buscando uma patologia que se associasse
ao GBV-C. Entretanto, os pesquisadores observaram que a presença da co-infecção GBV-C não
apresentava nenhum aspecto desfavorável para os pacientes, ao contrário, esta interação estava
associada a uma diminuição na mortalidade e melhores resultados clínicos, o que retardava a
progressão da infecção pelo HIV para AIDS, comparado a pacientes que apresentavam apenas a
infecção isolada pelo HIV
42, 44, 55, 58, 59, 60
.
A avaliação da associação entre variáveis quantitativas como contagem de células CD4+ e
carga viral de HIV e com uma variável binária como o status GBV-C + ou -, pode demonstrar uma
relação benéfica para os pacientes co-infectados ou descartar esta hipótese. Desta forma é possível
que haja diferenças importantes entre um paciente com alta carga de GBV-C e outro com uma
viremia baixíssima. Este esclarecimento só poderá ser averiguado com uma metodologia que
permita não apenas detectar o RNA viral plasmático, mas também ser capaz de quantificá-lo com
precisão. Devido a altíssima prevalência do GBV-C na população HIV, o uso de uma variável
apenas qualitativa (RNA+ ou RNA-) pode não permitir a averiguação de diferenças prognosticas
dentro do grupo RNA+. A determinação da carga viral de GBV-C permitirá investigações mais
apuradas deste fator que modula a infecção pelo HIV e sua patogenia.
Levando em consideração todos estes aspectos, o desenvolvimento de uma técnica de PCR
em tempo real será de grande importância para qualificar e quantificar amostras positivas do GBV-
C em pacientes HIV positivos, acrescentando dados que possam ajudar a esclarecer os possíveis
benefícios desta co-infecção em relação ao curso da doença causada pelo HIV. Um exemplo prático
desta aplicação foi o trabalho de Maidana-Giret e colaboradores
87
, que empregou nosso método na
avaliação de uma coorte HIV+.
Observamos após a realização da sorologia que das 253 amostras, 64 foram positivas (25%)
para o anticorpo anti E2 do GBV-C, o que é muito próximo do descrito por Maidana-Giret et al
87
,
que verificou a presença do anticorpo em 42 pacientes portadores do HIV (24%) dentro de um
total de 175.
48
Para avaliar a presença do RNA do GBV-C nas amostras realizamos um PCR convencional,
resultando em um total de 36 amostras positivas (14%) e 217 negativas (86%) e percebemos que os
valores estavam abaixo dos citados na literatura para a população infectada pelo HIV. A
prevalência da viremia do GBV-C nessa população é de aproximadamente 30 a 40%, somada a
exposição ao anticorpo anti- E2 sobe para 40 a 50%
10,12,58,68
. Desenvolvemos então, um PCR
Nested para o GBV-C utilizando os primers publicados por Andonov e colaboradores
75
, com o
intuito de aumentar a sensibilidade e obtermos o número real de amostras positivas. Ao avaliarmos
todas as amostras, encontramos mais 21 amostras positivas, além das 36 que já eram positivas no
PCR convencional, totalizando 57 amostras positivas (22,5%). A concordância de 100% entre os
resultados do nested PCR e o ensaio de Taqman aqui desenvolvido reforça a ideia que este Taqman
tem uma sensibilidade analítica adequada, podendo substituir o uso do nested PCR para esta
finalidade, com o benefício adicional de permitir a quantificação do RNA viral e sem enfrentar os
problemas já discutidos dos métodos convencionais de PCR e especialmente, da questão de
contaminação muito freqüente em metodologia nested.
Nossos resultados corroboram dados já existentes na literatura, pois não obtivemos nenhuma
amostra que fosse positiva para ambas variáveis, anticorpo e o RNA do GBV-C, isto ocorre por se
tratar de um anticorpo neutralizante
10
. O percentual de expostas ao GBV-C, produto da soma dos
valores de exposição da sorologia com os da presença de RNA nas amostras, de aproximadamente
48%, também mostram um valor muito próximo ao encontrado por Maidana-Giret e colaboradores,
em uma população brasileira recém-infectada pelo HIV
87
. Em um total de 175 soroconversores
(HIV) o RNA do GBV-C foi detectado em 24% e o anticorpo anti-E2 em 25%, perfazendo 49%,
sendo que um indivíduo apresentou concomitância dos marcadores, o que não foi verificado na
população por nós estudada.
Considerando que o tempo de armazenamento de algumas amostras foi de até dez anos, isto
poderia ter influenciado nas cargas virais baixas do GBV-C, já que a degradação do RNA viral é
normal com o passar do tempo, mesmo armazenado em condições ideais.
Apesar da alta incidência do GBV-C nos portadores do HIV, o fato do mesmo não ser um
vírus patogênico fez com que o interesse das empresas no desenvolvimento de kits comerciais se
perdesse. Com isto, a importância do desenvolvimento de uma técnica que nos possibilite continuar
49
a estudar o GBV-C além de acrescentar dados como a carga viral deste vírus, torna-se mais
eminente.
Ao medir-se a viremia por GBV-C observamos uma amplitude de 4 log10 dos valores (1 –
13.625 UA/mL). O estudo realizado por Maidana-Giret e colaboradores em São Paulo, utilizando
o ensaio por nós desenvolvido, obteve cargas virais do GBV-C entre (1 – 223.000 UA/mL) em
uma população HIV+ recém-infectada
87
. Outro estudo que também avaliou a carga viral de GBV-
C em portadores do HIV
60
encontrou valores entre 67.000 cópias/mL e 143.000.000 cópias/mL,
portanto da mesma magnitude de amplitude por nós verificada (4 log10). O estudo de Souza e
colaboradores empregou um método de PCR em tempo-real baseado na região 5’UTR para
quantificar o GBV-C RNA, encontrando valores entre 2.3 x 10
3
a 6.5 x10
8
GE/mL. Convém
ressaltar que a ausência de um padrão universal de GBV-C -RNA impede a comparação direta de
valores lembrando, que nosso ensaio utilizou como calibrador uma bolsa de plasma padrão, à qual
atribuímos a carga viral de 10.000 UA/mL (unidades aleatórias por mL). Se uma unidade
aleatória = 1 cópia, teremos valores absolutos muito parecidos com os do estudo de Tillman e
cols
60
, ou seja, de 10.000 a 136.250.000).
Utilizando o ensaio de tempo real obtivemos das 253 amostras de plasma de mulheres HIV
positivas uma prevalência do GBV-C -RNA de 22,5%. Esta prevalência é semelhante à da maioria
dos estudos com diferentes populações HIV+ como hemofílicos japoneses
43
(27%) população
HIV+ em geral dos EUA, majoritariamente masculina e homossexual
58
(39,8%,) ou população
semelhante alemã
60
(16,8%). A metanálise de Zhang e cols.
84
traz um panorama global destes dados
mostrando resultados entre 16,8 e 42%. Esta metanálise incluiu onze estudos sobre o efeito da co-
infecção HIV/GBV-C. A conclusão é que há um efeito “protetor” e este se torna mais evidente nas
fases mais avançadas da doença por HIV/Aids. O hazard ratio combinado de todos estes estudos é
de 0.39 ou seja, uma redução na mortalidade de cerca de 60% nos co-infectados em comparação
àqueles virgens de infecção pelo GBV-C e dos anticorpo anti-E2 positivos. Deve-se acrescentar que
este papel protetor ou de melhor prognóstico, do GBV-C -RNA, permanece significante mesmo em
análises multivariadas que incluem os principais fatores que poderiam levar ao erro tais como
contagem inicial de CD4 e carga viral de HIV positiva, idade, terapêutica anti-retroviral.
No Brasil a prevalência encontrada por Souza e cols.
85
foi de 24% também em uma
população majoritariamente masculina (90%) e homossexual. Estes valores são bastante superiores
50
aos descritos para a população de doadores de sangue brasileiros
86, 30
(aproximadamente 10%). Por
tratar-se de um vírus com eficiente transmissão sexual, é plausível que esta maior prevalência na
população HIV+ esteja relacionada à atividade sexual desprotegida.
51
______________________________________________________________7. Conclusões______
A prevalência de viremia por GBV-C nesta população foi de 22,5% enquanto a de
anticorpo anti-E2 de 25,3%, perfazendo uma freqüência de exposição ao GBV-C de
47,8%.
O método de determinação da carga viral de GBV-C desenvolvido é prático, sensível
e reprodutível. A carga viral de GBV-C apresentou uma amplitude de cerca de 4
log10, inferior à observada em outros vírus como HBV, HCV e HIV.
Não houve correlação entre a carga viral de GBV-C e as contagens de CD4 e carga
viral de HIV observadas na mesma amostra.
52
______________________________________________________________8. Referências______
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