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Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro de Tecnologia e Ciências
Instituto de Química
Daniele Avilez Duó
Determinação do potencial tóxico de cobre e níquel e seus
complexos com EDTA frente à Daphnia similis
Rio de Janeiro
2010
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Daniele Avilez Duó
Determinação do potencial tóxico de cobre e níquel e seus complexos com
EDTA frente à Daphnia similis
Dissertação apresentada, como requisito
para a obtenção do título de Mestre, ao
Programa de Pós-graduação do Instituto
de Química da Universidade do Estado
do Rio de Janeiro. Área de
concentração: Química Ambiental.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Merçon
Co-orientador: Profª. Drª. Roberta Lourenço Ziolli
Rio de Janeiro
2010
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CATALOGAÇÃO NA FONTE
UERJ/REDE SIRIUS/NPROTEC
Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial
desta dissertação.
_______________________________ ____________________________
D928 Duó, Daniele Avilez.
Determinação do potencial tóxico de cobre e níquel e seus
complexos com EDTA frente à Daphnia similis / Daniele Avilez
Duó. – 2010.
81 f.
Orientador : Fábio Merçon.
Co-orientadora : Roberta Lourenço Ziolli.
Dissertação (mestrado) – Universidade do Estado do Rio de
Janeiro, Instituto de Química.
1. Metais tóxicos – Teses. 2. Toxicidade aguda – Teses. 3.
Água – Qualidade – Teses. I. Merçon, Fábio. II. Ziolli, Roberta
Lourenço. III. Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
Instituto de Química. IV. Título.
CDU 543.32/.34
Daniele Avilez Duó
Determinação do potencial tóxico de cobre e níquel e seus complexos com
EDTA frente à Daphnia similis
Dissertação apresentada, como requisito
para a obtenção do título de Mestre, ao
Programa de Pós-graduação em
Química, da Universidade do Estado do
Rio de Janeiro. Área de concentração:
Química Ambiental.
Aprovada em _____________________________________________________
Banca Examinadora
_____________________________________________________
Prof. Dr. Fábio Merçon (orientador)
Instituto de Química - UERJ
_____________________________________________________
Profa. Dra. Roberta Lourenço Ziolli (co-orientadora)
Departamento de Química - PUC
_____________________________________________________
Prof. Dr. Alcides Wagner Serpa Guarino
Instituto de Biociências - UNIRIO
_____________________________________________________
Profa. Dra. Mônica Regina Marques
Instituto de Química - UERJ
Rio de Janeiro
2010
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Carlos (in memorian) e Cíntia, pelo apoio de sempre, pela formação
e educação que foram e são fundamentais para continuar na minha jornada. Aos
meus irmãos, Bruno e Daniel, que com suas histórias e idéias, me fazem cada dia
melhor. Ao meu namorado Vitor e toda sua família que me acolheram e me
apoiaram de forma que sem eles, essa etapa de minha vida não estaria sendo
passada.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por me permitir continuar nessa jornada.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Fábio Merçon pela orientação e paciência.
Obrigado por não ter duvidado da minha capacidade e interesse em desenvolver
este trabalho.
A minha co-orientadora Prof. Dra. Roberta Lourenço Ziolli e ao Prof. José
Guerchon que tornaram possível o desenvolvimento deste trabalho cientifico na área
de meu interesse, pelos ensinamentos e pelo incentivo na busca de novos
resultados, na pesquisa e na vida.
Ao Instituto de Química da UERJ e ao Departamento de Química da PUC-Rio
pelo suporte físico e material para a realização desta pesquisa.
Ao técnico Bruno Corrêa do Laboratório de Ecotoxicologia do CENPES /
Petrobrás que cedeu os primeiros lotes de Daphnia similis e algas para iniciar o
nosso cultivo.
Aos professores do Programa de Pós-graduação de Química da UERJ, pelos
ensinamentos e paciência durante esses 2 anos.
Aos meu colegas da turma de mestrado da UERJ, que sem as aulas extras,
no laboratório avançado, não teria graça.
A minha mãe Cintia pelo incentivo constante, fornecendo suporte para seguir
em frente no caminho que escolhi. Obrigada pelas várias horas no MSN e no
telefone ouvindo minhas lamúrias e conquistas.
Aos meus irmãos, Bruno e Daniel, pela confiança e incentivo em todos os
momentos de minha vida, pelos instantes de alegria e constantes demonstrações de
amor.
A toda a minha família, incluindo, tios, avós, primos e agregados que
tornaram mais feliz cada volta para casa.
Ao meu namorado Vitor, pelos sorrisos e pela paciência durante a realização
desse trabalho. Agradeço a toda sua família e amigos que me acolheram com
extrema gentileza em seu meio.
A todos aqueles que contribuíram, direta ou indiretamente, na condução deste
trabalho.
Pai, verás que um filho teu não foge à luta.
Própria
RESUMO
DUÓ, Daniele Avilez. Determinação do potencial tóxico de cobre e níquel e seus
complexos com EDTA frente à Daphnia similis. 2010. 86f. Dissertação (Mestrado em
Química) – Instituto de Química, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de
Janeiro, 2010.
Quando se trata de efluentes muito complexos e de amostras de água ou de
sedimento de locais poluídos, é inviável ou até mesmo impossível detectar a
presença de todas as substâncias presentes. Os principais contaminantes
associados à poluição das águas naturais, tem-se os metais pesados, uma classe de
compostos de toxicidade elevada e que são bioacumulados nos seres vivos. Desses
metais, o cobre e o níquel se destacam, tanto por seu amplo uso em processos
industriais, o que acarreta sua presença em diversos tipos de despejos, quanto por
sua toxicidade elevada. O objetivo deste trabalho foi determinar o potencial tóxico do
sulfato de cobre e sulfato de níquel, de sua mistura e seus complexos com EDTA
frente a Daphnia similis para utilização na avaliação do desempenho do processo de
separação com membranas no tratamento de efluentes. Em um estudo de
toxicidade, as interações do metal com o organismo-teste são influenciadas pela
espécie testada, pela combinação dos metais ou pela composição do meio aquoso.
O íon Cu
2+
apresentou toxicidade superior ao Ni
2+
, sendo que na mistura desses
dois íons, prevaleceu o resultado obtido para o Cu
2+
, decorrente de sua maior
toxicidade. A complexação dos metais reduz significativamente o potencial tóxico
dos metais.
Palavras-chave: Metal tóxico. Toxicidade aguda. Qualidade da água.
ABSTRACT
When it comes to very complex effluents and water samples or sediment
contaminated sites, it is impractical or even impossible to detect the presence
of all substances. The main contaminants associated with the pollution of
natural waters, has the heavy metals, a class of compounds of high toxicity
and are bioaccumulated in living organisms. Of these metals, copper and
nickel stand out, both for its wide use in industrial processes, leading to their
presence in several kinds of evictions, and by their high toxicity. The objective
of this study was to determine the potential toxic effects of copper salts II and
nickel II of its moisture and its complexes with EDTA compared to Daphnia
similis for use in assessing the performance of the separation membrane in
the treatment of effluents. In a study of toxicity, the interactions of metal with
the test organisms are influenced by the species tested, the combination of
metals or the composition of the aqueous medium. The ion Cu
2+
toxic than the
Ni
2+
, and the mixture of these two ions, prevailed the result obtained for the
Cu
2+
, due to its greater toxicity. The complexation of metals greatly reduces
the potential toxic metals.
Keywords: Heavy metals, Acute toxicity, Water quality
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Principais aplicações do níquel................................................................25
Figura 2 - Complexo formado entre o EDTA e um metal (M). ..................................30
Figura 3 - Daphnia similis em idade adulta (aumento de 40x). ...............................41
Figura 4 - Culturas de Daphnia similis no Meio Básico-M4: (a) câmara incubadora e
(b) cristalizador de vidro de 2 L .............................................................50
Figura 5 - Tubos de ensaio para montagem dos testes de toxicidade com Daphnia
similis ....................................................................................................52
Figura 6 - Organograma do procedimento do teste de toxicidade aguda.................53
Figura 7 - Controle de qualidade dos organismos-teste e estabelecimento da faixa
aceitável, de CL50;24h do dicromato de potássio frente a Daphnia simlis
(LS = limite superior; LI = limite inferior). ...............................................56
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores Máximos Permissíveis (VMP) de descarte para efluentes .........23
Tabela 2 - Valores máximo permitidos de níquel de acordo com a classificação
das águas. ..................................................................................................26
Tabela 3 - Valores das constantes de formação dos complexos de metais com o
EDTA ..........................................................................................................31
Tabela 4 - Volume e composição das soluções para preparo de 50 L de água de
cultivo Meio Básico-M4 ...............................................................................47
Tabela 5 - Composição e volume das soluções de preparo do meio de cultura
para algas verdes unicelulares com meio CHU-12.....................................48
Tabela 6 - Valores de CL50;24h calculados para os testes de toxicidade aguda
do dicromato de potássio e do intervalo de confiança (95%) em Meio
Básico-M4 frente à Daphnia similis ............................................................55
Tabela 7 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares de toxicidade
aguda utilizando o sulfato de cobre frente à Daphnia similis .....................57
Tabela 8 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares de toxicidade
aguda utilizando o sulfato de níquel frente à Daphnia similis .....................58
Tabela 9 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares de toxicidade
aguda utilizando a mistura do sulfato de cobre e sulfato de níquel frente
à Daphnia similis ........................................................................................58
Tabela 10 - Concentrações definitivas utilizadas nos testes de toxicidade aguda
dos compostos metálicos e suas misturas frente à Daphnia similis ...........59
Tabela 11 - Valores de CL50;48h calculados para o sulfato de cobre e do
intervalo de confiança (95%) em Meio Básico-M4 frente à Daphnia
similis .........................................................................................................60
Tabela 12 - Valores de CL50;48h calculados para o sulfato de níquel e do
intervalo de confiança (95%) em Meio Básico-M4 frente à Daphnia
similis .........................................................................................................60
Tabela 13 - Valores de CL50;48h calculados para a mistura de sulfato de níquel
e sulfato de cobre e do intervalo de confiança (95%) em Meio Básico-M4
frente à Daphnia similis ..............................................................................62
Tabela 14 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares de toxicidade
aguda utilizando o complexo de EDTA com o sulfato de cobre .................64
Tabela 15 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares de toxicidade
aguda utilizando o complexo de EDTA com o sulfato de níquel ................64
Tabela 16 - Concentrações definitivas utilizadas nos testes de toxicidade aguda
dos compostos metálicos e seus complexos frente à Daphnia similis .......65
Tabela 17 - Valores de CL50;48h calculados para o sulfato de cobre complexado
com EDTA em Meio Básico-M4 frente à Daphnia similis ...........................66
Tabela 18 - Valores de CL50;48h calculados para o sulfato de níquel
complexado com EDTA em Meio Básico-M4 frente à Daphnia similis .......66
Tabela 19 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares utilizando o
complexo de EDTA com a mistura de sulfato de cobre e sulfato de
níquel, na proporção de 1:1:1 .....................................................................67
Tabela 20 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares utilizando o
complexo de EDTA com a mistura de sulfato de cobre e sulfato de
níquel, na proporção de 1:1:3 .....................................................................68
Tabela 21 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares utilizando o
complexo de EDTA com a mistura de sulfato de cobre e sulfato de
níquel, na proporção de 1:1:6. ...................................................................68
Tabela 22 - Concentrações definitivas utilizadas nos testes de toxicidade aguda
com complexos de metais e EDTA em diferentes proporções ...................69
Tabela 23 - Valores de CL50;48h calculados para a solução da mistura dos
metais complexados com EDTA na proporção de 1:1:1 .............................69
Tabela 24 - Valores de CL50;48h calculados para a solução da mistura dos
metais complexados com EDTA na proporção de 1:1:3 .............................70
Tabela 25 - Valores de CL50;48h calculados para a solução da mistura dos
metais complexados com EDTA na proporção de 1:1:6 .............................70
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
AIPC Agência Internacional de Pesquisa em Câncer
ATSDR Agência para Substâncias Tóxicas e Registro de Enfermidades
BOD Biochemical Oxigen Demand
CL Concentração Letal
DIN Instituto Alemão para Normatização
DNPM Departamento Nacional de Produção Mineral
EDTA Àcido etilenodiamino tetra-acético
FATMA Fundação de Amparo Técnico ao Meio Ambiente
HSDB Hazardous Substances Data Bank
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis
OECD Organization for Economic Co-operation and Development
USEPA Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
VMP Valores máximo permitidos
WHO Organização Mundial de Saúde
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO............................................................................................17
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................21
1.1 Poluição aquática .....................................................................................21
1.2 Os metais no ecossistema aquático .......................................................22
1.3 Caracterização dos metais.......................................................................24
1.3.1 Níquel .........................................................................................................24
1.3.2 Cobre ..........................................................................................................26
1.3.3 EDTA (Ácido etilenodiamino tetra-acético) .................................................29
1.3.4 Efeitos aditivos, sinérgicos e antagônicos.........................................................32
1.4 A Ecotoxicologia.......................................................................................33
1.4.1 Princípio do método de testes de toxicidade...............................................36
1.4.2 Seleção do organismo-teste .......................................................................37
1.5 Testes de Ecotoxicidade com Daphnia similis.......................................41
1.6 Controle da sensibilidade dos organismos-teste..................................43
2 MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................44
2.1 Material ......................................................................................................44
2.1.1 Reagentes...................................................................................................44
2.1.2 Equipamentos.............................................................................................45
2.2 Métodos.....................................................................................................45
2.2.1 Preparo do meio de cultivo (Meio Básico-M4) ............................................45
2.2.2 Preparo da solução algácea (Meio Chu-12)................................................48
2.2.3 Cultivo de Daphnia similis...........................................................................49
2.2.4 Testes de ecotoxicidade aguda com Daphnia similis..................................51
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................55
3.1 Testes de controle de sensibilidade das daphnias com dicromato
de potássio................................................................................................55
3.2 Ensaios de toxicidade aguda do sulfato de cobre, do sulfato de
níquel e suas misturas frente à Daphnia similis ....................................57
3.2.1 Testes preliminares.....................................................................................57
3.2.2 Testes definitivos ........................................................................................59
3.3 Ensaios de toxicidade aguda dos metais complexados com EDTA
frente à Daphnia similis............................................................................63
3.3.1 Testes preliminares.....................................................................................63
3.3.2 Testes definitivos ........................................................................................65
3.4 Ensaios de toxicidade aguda da mistura dos metais complexados
com EDTA em diferentes proporções frente à Daphnia similis............67
3.4.1 Testes preliminares.....................................................................................67
3.4.2 Testes definitivos ........................................................................................69
4 CONCLUSÕES...........................................................................................72
APÊNDICE.................................................................................................. 73
REFERÊNCIAS ..........................................................................................74
17
INTRODUÇÃO
A água é um dos mais importantes recursos naturais, sendo elemento
indispensável à vida e às atividades humanas. Por outro lado, as atividades
humanas têm provocado, ao longo dos anos, grandes impactos nos ecossistemas
aquáticos, sendo que os despejos de efluentes industriais e domésticos constituem-
se na maior fonte antrópica de compostos químicos e de micro-organismos que são
lançados nos corpos d’água (BASSOI et al., 1990).
A água é um recurso necessário a todos os aspectos da vida e ao
desenvolvimento das atividades humanas. Embora exista em abundância na Terra,
cobrindo 71% da superfície terrestre, a mesma é escassa em muitas áreas, devido a
sua má distribuição e às perdas, assim como por causa da degradação antrópica.
De acordo com o Banco Mundial, cerca de 80 países, hoje, enfrentam problemas de
abastecimento e cerca de 1,5 bilhão de pessoas não têm acesso a fontes de água
de qualidade (MOTA, 1997).
A crescente preocupação com o meio ambiente, além da maior
conscientização da população, decorre das implicações econômicas da
contaminação dos recursos naturais, principalmente os hídricos. Empresas químicas
situadas em pólos industriais, freqüentemente se deparam com problemas na
qualidade da água captada, que limita a capacidade produtiva ou leva a maiores
gastos no seu tratamento.
O descarte dos efluentes também traz crescentes preocupações, tanto do
ponto de vista ambiental, pela emissão de diversos componentes de difícil remoção,
como pelas crescentes taxas impostas pelos órgãos governamentais responsáveis
pelo controle ambiental.
Dentre os diversos poluidores, os metais têm contribuído de forma
significativa para a poluição do ar, do solo e principalmente da água. Considerando-
se a grande importância da água para a Humanidade e seu atual comprometimento,
muitos trabalhos com organismos aquáticos coletados em ambientes degradados
têm sido desenvolvidos para a avaliação da qualidade da água em áreas
urbanizadas.
18
Uma grande variedade de compostos de origem industrial e agrícola são
lançados indiscriminadamente no ambiente, comprometendo a qualidade do meio e
a saúde dos organismos vivos ali presentes (AHMAD et al., 2000).
Alguns metais são essenciais aos seres vivos, como o ferro, manganês, zinco
e cobre, entre outros que possuem uma função biológica, mas que em altas
concentrações também podem apresentar toxicidade. Outros metais como mercúrio,
cromo e níquel, que não têm função biológica, comumente apresentam alta
toxicidade, mesmo que em baixas concentrações.
Nos ecossistemas aquáticos têm sido verificado aumentos significativos nos
estoques de metais, relacionados principalmente a origem antrópica e, uma vez
inseridos no sistema aquático, os metais se distribuem no material em suspensão,
no sedimento, na água superficial e na água intersticial.
Com a adoção de estudos toxicológicos, é possível fazer predições sobre
riscos de intoxicação, constituindo-se em ferramenta para a compreensão das
extensões dos impactos. Isto porque, os organismos vivos utilizados nos testes de
ecotoxicidade funcionam como verdadeiros biosensores que respondem à presença
de contaminantes (ESPÍNDOLA et al., 2003).
A escolha das espécies utilizadas como bioindicadores da poluição das águas
deve-se, principalmente, à facilidade na obtenção dos organismos e à manutenção
de grande quantidade em condições de laboratório, além do fato desses organismos
já terem sido alvos de estudos ecotoxicológicos anteriores.
Os altos índices de toxicidade de alguns metais para os organismos, mesmo
em baixas concentrações, associados a sua relativa facilidade de entrar e
permanecer nas cadeias tróficas por longos períodos reforçam a importância de
estudos que determinem suas concentrações em ambientes aquáticos.
Esses estudos devem contemplar não somente o problema da contaminação
já instalada, uma vez que, neste caso, torna-se difícil a depuração nos corpos
d´agua desses elementos metálicos. Sendo assim, torna-se necessário monitorar e
preservar os ecossistemas aquáticos da poluição ambiental por metais pesados por
meios de tratamentos eficientes dos efluentes industriais.
Dentro da área da toxicologia ambiental encontra-se a ecotoxicologia, que,
segundo Matias (1996), é a ciência que estuda os impactos deletérios de poluentes
ambientais sobre populações de organismos vivos ou ecossistemas, considerando a
19
interação dos poluentes com o meio ambiente (mobilidade, degradabilidade,
bioacumulação e bioamplificação).
De acordo com Knie e Lopes (2004), na ecotoxicologia o uso de biomonitores
permite a detecção de substâncias em concentrações bem abaixo dos limites de
detecção por métodos de análises químicas. Além disto, os seres vivos respondem
de forma integrada a todos os fatores perturbadores, inclusive os formados através
de interações de várias substâncias.
O bioensaio é um dos parâmetros mais utilizados para estudos da qualidade
da água por vários órgãos ambientais no mundo, já que as análises físico-químicas
convencionais mais utilizadas não tem precisão adequada para determinar a
influência dos poluentes e seus fatores toxicológicos na água de abastecimento
público (GUIMARÃES et al., 2004).
Testes de toxicidade são empregados no biomonitoramento, por serem
métodos mais sensíveis na detecção de diversos impactos, determinando a
capacidade que os mesmos têm de afetar negativamente os processos fisiológicos
dos organismos (UNEP, 1992) abrangendo uma grande variedade de substâncias
em um único ensaio (BRANCO, 1989).
Quando a poluição da água resulta em prejuízos à saúde do homem, diz-se
que essa água está contaminada. Assim, contaminação é um caso particular de
poluição. Uma água está contaminada quando contém micro-organismos
patogênicos ou substâncias químicas e/ou radioativas, causadores de doenças e/ou
morte ao homem (MOTA, 1997).
Os poluentes podem alcançar as águas superficiais ou subterrâneas através
do lançamento direto, precipitação, escoamento pela superfície do solo ou
infiltração. As fontes de poluição da água podem ser localizadas (pontuais), quando
o lançamento da carga poluidora é feito de forma concentrada, em determinado
local, ou não localizadas (difusas), quando os poluentes alcançam um manancial de
modo disperso, não se determinando um ponto específico de introdução
(SPERLING, 1996).
Dentre as tecnologias utilizadas para a remoção de metais de águas
residuárias, destacam-se os processos com membranas, que propiciam uma
corrente aquosa com qualidade para reúso industrial e urbano. Os processos de
separação por membranas são recentes quando comparados aos processos
tradicionais de tratamentos de efluentes. As membranas sintéticas surgiram como
20
uma tentativa de se imitar as membranas naturais, especialmente quanto às suas
características únicas de seletividade e de permeabilidade (HABERT et al., 2003).
Recentemente, o uso de uma etapa prévia de complexação do metal vem
sendo muito estudado, com o intuito de aumentar a capacidade de retenção do
metal pela membrana. O EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) é um dos
agentes complexantes mais utilizados, sendo que suas aplicações vão desde a área
médica até a ambiental. Esse composto forma um complexo octaédrico com a
maioria dos cátions metálicos. Uma das razões prioritárias pelo qual o EDTA é
usado tão extensivamente na complexação de cátions metálicos é que a constante
de formação para complexos de cátion metálico-EDTA é muito alta, diminuindo a
disponibilidade dos metais na água (HABERT et al., 2003).
O objeitvo geral deste trabalho é determinar o potencial tóxico da água
contaminada com metais frente a Daphnia similis para utilização na avaliação do
desempenho do processo de separação com membranas no tratamento de
efluentes.
Como objetivo especifico, tem-se:
Determinar a toxicidade aguda do sulfato de cobre (CuSO
4
.5H
2
O) utilizando
Daphnia similis como bioindicador;
Determinar a toxicidade aguda do sulfato de níquel (NiSO
4
.6H
2
O) utilizando
Daphnia similis como bioindicador;
Determinar a toxicidade aguda de uma solução de mistura de sulfato de cobre e
sulfato de níquel utilizando Daphnia similis como bioindicador;
Determinar a toxicidade aguda do EDTA utilizando Daphnia similis como
bioindicador;
Determinar a toxicidade aguda do sulfato de cobre (CuSO
4
.5H
2
O) complexado com
EDTA utilizando Daphnia similis como bioindicador;
Determinar a toxicidade aguda do sulfato de níquel (NiSO
4
.6H
2
O) complexado com
EDTA utilizando Daphnia similis como bioindicador;
Determinar a toxicidade aguda de uma solução de mistura de sulfato de cobre e
sulfato de níquel complexados com EDTA utilizando Daphnia similis como
bioindicador;
Analisar e diferenciar os valores de toxicidade obtidos.
21
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Poluição aquática
Com a crescente expansão demográfica e industrial que vem ocorrendo nas
últimas décadas em todo o mundo, a preocupação com o suprimento de água para a
população tem se tornado alvo de estudos e debates na comunidade cientifica
internacional. A água proveniente de rios e lagos que representa a maior parte da
água doce da Terra, se tornou um recurso escasso e que deve ser preservado
(MAZON, 2002).
A contaminação dos ecossistemas aquáticos vem sendo causada por um
número crescente de poluentes que, uma vez inseridos no ambiente, se distribuem e
interagem de acordo com suas características e com as condições do meio receptor.
Os poluentes estão sujeitos a transformações químicas, físicas e biológicas,
podendo atingir níveis mais altos da cadeia trófica por meio da bioacumulação
(BERGMAN & PUGH, 1994).
A industrialização e a urbanização representam um risco para o ambiente,
especialmente para o sistema aquático, devido ao fato de a maior parte dos países
não terem atingido um estágio de desenvolvimento sustentável, com a utilização
coerente dos seus recursos naturais. Assim, rios, lagos e reservatórios sofrem com a
contaminação crescente, resultante principalmente de atividades humanas (MAZON,
2002).
A poluição aquática pode ser definida como a adição de qualquer substância
que altere a composição química, microbiológica e a temperatura da água (HEATH,
1987). A poluição pode ser gerada por efluentes domésticos, industriais e por carga
difusa de origem urbana e agrícola (CETESB, 1996).
Muitos dos compostos tóxicos fazem parte da composição de pesticidas e
inseticidas utilizados na agricultura e na pecuária. Em geral tornam-se letais a partir
de uma certa dose. Como não são degradáveis, é preciso considerar o efeito de
bioacumulação, a que corresponde sucessivamente um aumento da concentração
do produto tóxico (BOUDOU et al., 1991).
22
Nas últimas décadas, os níveis excedentes de nitrato e nitrito nos aqüíferos
são atribuídos a intervenções humanas, as atividades agrícolas e industriais e, a
deposição de resíduos de animais (FORMAN et al., 1985; BRUNING-FANN et al.,
1994).
Os metais pesados diferem de outros agentes tóxicos porque não são
sintetizados nem destruídos pelo homem. Atualmente, ocorrências a médio e longo
prazo são observadas, e as relações causa-efeito são pouco evidentes e quase
sempre subclínicas. Geralmente esses efeitos são difíceis de serem distinguidos e
perdem em especificidade, pois podem ser provocados por outras substâncias
tóxicas ou por interações entre esses agentes químicos. A manifestação dos efeitos
tóxicos está associada à dose e pode distribuir-se por todo o organismo, afetando
vários órgãos, alterando os processos bioquímicos, organelas e membranas
celulares (MAZON, 2002).
1.2 Os metais no ecossistema aquático
A poluição hídrica pode ser definida como a introdução num corpo d’água de
qualquer matéria ou energia que venha a alterar as propriedades dessa água. Essa
alteração pode afetar a saúde das espécies animais ou vegetais que dependem
dessas águas ou com elas tenham contato. A água é um bem fundamental nas
indústrias, na agricultura, nos lares e em todas as atividades humanas (BAIRD,
2002) .
A introdução de metais nos sistemas aquáticos ocorre naturalmente por meio
de processos geoquímicos e de intemperismo. Os ciclos biológicos e geológicos são
responsáveis pela redistribuição desses metais no ambiente, transportando-os para
os rios (YABE & OLIVEIRA, 1998).
Entretanto, a ação humana no despejo dessas substâncias, advindas
principalmente da atividade industrial, promove danos irreparáveis nos organismos
aquáticos provocando o declínio ou até mesmo a extinção de populações (EXLEY et
al., 1991).
O cádmio, cobre, cromo e chumbo possuem características que reúnem
riscos substanciais à saúde pública e aos ecossistemas, pois são persistentes e
23
móveis no ambiente. Grandes quantidades destes metais utilizados nas indústrias e
no comércio aumentam a possibilidade de acúmulo na água, no solo e nos alimentos
(ABBASI et al., 1988; HERKOVITS & HELGUERO, 1998).
Dessa forma, a intervenção humana pode ser considerada como a maior
responsável pela freqüência da disposição dos metais. Essa intervenção gera
diversos impactos em níveis local e global, causando um estresse contínuo da
natureza e, conseqüentemente, efeitos agudos e crônicos à saúde dos ecossistemas
e do homem (BRAYNER, 1998).
Diversos fatores interferem na disponibilidade de metais. A composição física
e química da água, por exemplo, determina a forma de transporte dos metais, assim
como o material em suspensão (MOORE & RAMAMOORTHY, 1984).
Conforme já mencionado, o meio mais comum de contaminação por esses
metais é através da descarga de efluentes não tratados em rios e lagos. Assim, fez-
se necessário o estabelecimento de normas para o lançamento de efluentes. Os
valores máximos permitidos de metais pesados que possam estar em determinado
efluente foram estabelecidos, na Resolução número 357, de 17 de março de 2005,
do Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA, 2005).
A Tabela 1 mostra os valores máximos permissíveis (VMP) de algumas
substâncias presentes nos efluentes, de acordo com a Resolução número 357, de
17 de março de 2005, do Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA, 2005).
Tabela 1 - Valores Máximos Permissíveis (VMP) de descarte para efluentes.
Componentes tóxicos VMP (mg.L
-1
)
Cádmio 0,2
Chumbo 0,5
Cobre dissolvido 1,0
Cromo Total 0,5
Mercúrio 0,01
Níquel 2,0
Prata 0,1
Zinco 5,0
Fonte: Resolução n° 357/2005, do CONAMA.
24
1.3 Caracterização dos metais
1.3.1 Níquel
No ambiente aquático, a toxicidade pelo níquel indica tolerâncias que variam
amplamente e são influenciados por vários fatores, entre eles o pH e o efeito
sinérgico, ou seja, o efeito que a combinação de várias espécies químicas pode
provocar no meio aquático. Segundo a CETESB (1986) a toxicidade crônica para
peixes varia de 380 a 730 µg.L
-1
, mas em concentrações de 0,51 µg.L
-1
pode causar
danos a uma serie de vegetais, como tomate e frutas cítricas.
A saúde do homem e dos outros seres vivos, assim como o meio ambiente é
influenciado pelo níquel. Este metal é ativo tanto na fosiologia dos organismos (por
exemplo, as hidrogenases das bactérias, como as ureases presentes nas plantas
que contêm níquel no sitos ativos e precisam dele para exercerem sua ação) como
danoso (toxicidade, carcinogénese e teratogénese)
no organismo (MAHAN, 1995).
O níquel entra no organismo essencialmente por 3 vias: percutânea, inalatória
e ingestão. Na maior parte dos indivíduos, incluindo alguns que se encontram
expostos a nível ocupacional, a maior porta de entrada do níquel é a ingestão por
meio da dieta. A absorção é menor quando administrado, juntamente, com comida
do que com água. Por outras vias o níquel é absorvido rapidamente, distribuído para
os rins e pulmões, não se acumulando, significativamente, no organismo (BRAGA,
2005).
Atualmente a presença e o uso do níquel é cada vez maior na vida do homem
moderno. É utilizado em diversas ligas, como o aço inoxidável, em galvanização,
fundições, catalisadores, baterias, eletrodos e moedas, de acordo com a Figura 1.
Dessa forma, o níquel está presente em materiais, produtos e equipamentos de
transporte, bélicos, equipamentos eletrônicos, produtos químicos, equipamentos
médico-hospitalares, materiais de construção, equipamentos aeroespaciais, bens de
consumo duráveis, pinturas, e cerâmicas (ALVES, 2005).
25
Figura 1 - Principais aplicações do níquel. ALVES, 2005.
A galvanoplastia é um processo pelo qual se dá proteção superficial, através
de processos eletroquímicos a determinadas peças, por exemplo, espetos, grelhas,
utensílios domésticos, canos, tubos, arremates mecânicos, fazendo com que as
mesmas tenham maior durabilidade. Nesse processo é feita uma eletrólise e
deposita-se o metal na superfície do outro para protegê-lo ou para efeito decorativo.
Este procedimento é empregado para diversos fins, principalmente para proteger as
superfícies metálicas contra a ação de intempéries, ataques de produtos químicos,
água salgada e outros (MOORE & RAMAMOORTHY, 1984).
1.3.1.1 Impactos do níquel ao meio ambiente
Durante os útimos anos, inúmeras pesquisas científicas têm sido realizadas
visando a remoção do níquel, descartado de forma inadequada no meio ambiente
(KOENE & JANSSEN, 2001).
A Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (AIPC) incluiu o níquel no
grupo I (agentes carcinógenos em humanos), juntamente com o arsênio, o berílio, o
cádmio, o cromo(VI). Entretanto, em concentrações traço, o níquel, assim como o
ferro, cobre, manganês, zinco e cobalto são essenciais ao organismo humano, pois
estão diretamente envolvidos em seus processos biológicos (BENITE, 2007).
11%
12%
61%
6%
10%
Galvanização
Ligas não-ferrosas
Aço inoxidável
Outras inclusive química
Outras ligas de aço
26
A Tabela 2 mostra os teores máximos de níquel permitidos para as águas
classes 1 e 2 (destinadas ao consumo humano após tratamento simplificado e
convencional, respectivamente), classe 3 (também destinadas para fins domésticos
após tratamento convencional), classe 5 (salinas), classe 7 (salobras) e limites
máximos para lançamento de efluentes, segundo a resolução do Conama (2005).
Tabela 2 - Valores máximo permitidos de níquel de acordo com a classificação das
águas. (Conama, 2005).
Classificação das águas Valor Máximo (mg.L
-1
)
Classe 1 0,025
Classe 2 0,025
Classe 3 0,025
Classe 5 74 x 10
-3
Classe 7 0,025
Lançamento de Efluente 2,0
Apesar de tudo, o níquel não é considerado um contaminante global, mas
cada vez mais as mudanças ecológicas têm levado ao decréscimo do número e
variedade de espécies que habitam locais perto de fontes de libertação de níquel.
Estudos dos microsistemas revelam que a adição de níquel nos solos causa
distúrbios no ciclo do nitrogênio (SALGADO, 1996).
1.3.2 Cobre
O cobre ocupa o 26º lugar em abundância na crosta terrestre. Na natureza
ocorre como os minérios cuprita (CuO
2
), calcopirita (CuFeS
2
) e malaquita
(Cu
2
CO
3
(OH)). Assim, os mais importantes minérios de cobre são os óxidos, sulfetos
e carbonatos. O cobre pertence à terceira serie do grupo dos metais de transição,
podendo ser encontrado nos estados de oxidação +1 e +2 (MAHAN, 1995).
27
A toxicidade do cobre para a vida aquática depende de fatores como
componentes orgânicos e da alcalinidade. O cobre é tanto mais tóxico quanto menor
for a alcalinidade (FATMA, 1981).
A espécie metálica é estável em ambientes secos; reage lentamente com a
umidade do ar formando um filme amorfo esverdeado de hidroxicarbonatos e
hidroxissulfatos sobre a superfície do metal, protegendo-o contra posterior oxidação.
O íon cuproso é instável em solução aquosa, dissociando-se rapidamente em íon
cúprico e elementar (WHO, 1988; BARCELOUX, 1999).
O estado de oxidação mais importante no meio ambiente aquático ou in
natura é o bivalente. Todo cobre monovalente presente no meio ambiente, quando
não se encontra complexado, é rapidamente oxidado por qualquer agente oxidante
do entorno. Esta forma divalente pode, ainda, adsorver-se rapidamente a vários
óxidos metálicos hidratados, incluindo os de ferro, alumínio e manganês. Os
compostos cúpricos e complexos são geralmente solúveis em água, e de coloração
azul ou verde (WHO, 1988; ATSDR, 1990; BARCELOUX, 1999).
1.3.2.1 Fontes de contaminação ambiental por cobre
O cobre é amplamente distribuído na natureza no estado elementar e como
íon em sulfetos, arsenitos, cloretos e carbonatos. O conteúdo de cobre nos
depósitos minerais varia de 0,5 a 5% do peso; as rochas ígneas contêm 0,01% e as
rochas cristalinas, 0,0055% do peso (ATSDR, 1990; HSDB, 2000; WHO, 1988); os
arenitos apresentam entre 10 a 40 ppm de cobre, os xistos, entre 30 a 150 mg.L
-1
e
os xistos marinhos, entre 20 a 300 mg.L
-1
(HSDB, 2000).
O Instituto Brasileiro de Mineração (Ibram) prevê para os próximos anos a
auto-suficiência na produção de cobre em 2010 e que deve alcançar, até 2011, US$
7 bilhões. A expectativa é que o País passe das atuais 80 mil t de níquel para 286
mil t em 2011. O cobre também atingirá, em 2010, um consumo aparente no País de
743,6 mil t., segundo o Departamento Nacional de Produção Mineral (DNPM)
(Revista Minérios & Minerales, 2007)
A maior parte do cobre primário é produzido a partir dos minérios contendo
sulfeto. É a partir do cobre metálico que se obtêm os principais compostos de cobre
28
de uso industrial. O sulfato de cobre é um subproduto na produção de cobre,
formado durante a refinação do minério com ácido sulfúrico (ATSDR, 1990;
BARCELOUX, 1999; BURGESS, 1995).
O sulfato de cobre é mundialmente utilizado para inibir o crescimento de algas
em reservatórios municipais, equipamentos de irrigação, piscinas e sistemas de
refrigeração industriais (WHO, 1988). Porém, somente 7% de sua produção é
empregada no tratamento de água, 65% é utilizada na agricultura e 28% na
indústria, incluindo a produção de cromoarseniato de cobre (preservante de
madeira), galvanoplastia e manufatura de corantes (ATSDR, 1990).
A mineração e refino de cobre são as atividades mais importantes na questão
de contaminação do ambiente por cobre. Várias ligas metálicas contêm cobre, como
o latão (amálgama com o zinco) e o bronze (amálgama com cerca de 10% de
estanho) (WHO, 1988). De modo geral, o fluxo de cobre atmosférico decorrente de
fontes antropogênicas é três vezes maior do que o fluxo do metal proveniente de
fontes naturais (HSDB, 2000).
1.3.2.2 Transporte do cobre na água e no sedimento
A disponibilidade é geralmente pequena para as concentrações totais de
metais em água. Vários processos influenciam a disponibilidade do cobre no sistema
aquático, incluindo a complexação a ligantes orgânicos e inorgânicos, adsorção a
óxidos metálicos, argila e material particulado em suspensão, bioacumulação e troca
entre sedimento e água (WHO, 1988).
Em valores de pH e concentrações de carbonato características de águas
naturais a maior parte do cobre dissolvido acha-se preponderantemente na forma de
complexos, e não como íon cúprico livre (WHO, 1988).
A combinação dos processos de complexação, adsorção e precipitação
controlam a concentração de Cu (II) livre e, na maioria das águas naturais. As
condições químicas são tais que, mesmo em concentrações relativamente elevadas
de cobre, estes processos reduzem o cobre livre para valores extremamente baixos
(ATSDR, 1990).
29
Os metais formam complexos estáveis com ligantes orgânicos, como o ácido
húmico, ligando-se aos grupos -NH e -SH, e, em menor proporção, aos grupos -OH.
As águas naturais contêm quantidades variáveis de espécies orgânicas e
inorgânicas, o que afeta a capacidade de complexação e os tipos de complexos
formados. Na água do mar, a matéria orgânica é geralmente o agente de
complexação mais importante. A formação de ligantes pode afetar outras processos
fisico-químicos como adsorção, precipitação e óxido-redução na água (SKOOG,
2006).
A toxicidade do cobre geralmente decresce com o aumento da dureza da
água, provavelmente pela competição entre cálcio e cobre pelos sítios de adsorção
em superfícies biológicas. Assim, quanto maior a concentração de cálcio menor a
adsorção de cobre. Vários estudos correlacionaram a toxicidade do cobre à atividade
do íon cúprico livre, influenciada pela dureza da água (WHO, 1988).
Segundo Rand e Petrocelli (1985), entende-se por biodisponibilidade a
quantidade da substância presente no meio ambiente (água, sedimento, solo e
alimentos) que pode ser absorvida pelos organismos vivos. Entretanto, em
Toxicologia, utiliza-se o termo disponibilidade para referir a quantidade da substância
em condições de ser absorvida por qualquer organismo, dependendo das
características da exposição.
Quanto maior a disponibilidade, maior o potencial tóxico ou bioacumulação da
substância (WHO, 1988). O cobre apresenta, em geral, disponibilidade limitada no
meio ambiente. A extensão da bioacumulação é determinada pela espécie do metal
em associação às diferenças na absorção e velocidade de excreção.
1.3.3 EDTA (Ácido etilenodiamino tetra-acético)
O EDTA (Ácido etilenodiamino tetra-acético) é um composto orgânico que age
como agente quelante, formando complexos muito estáveis com diversos íons
metálicos. O EDTA é usado como descolorante para cabelos e pode ser também
utilizado na fabricação de pães e derivados na indústria alimentícia. Usado também
durante tratamento endodôntico, o EDTA apresenta uma função quelante e retira
30
íons cálcio (Ca
2+
). Essa afinidade com o cálcio, faz com que seja também utilizado
como anticoagulante (BENITE et al., 2007).
Esse composto apresenta quatro grupos carboxila e dois grupos amina que
podem atuar como doadores de pares de elétrons, ou bases de Lewis, sendo um
ligante hexadentado, conforme esquematizado na Figura 2 (EBBING, 1998).
Figura 2 – Complexo formado entre o EDTA e um metal (M). BASSET, et al., 1981.
A alta estabilidade do complexo formado resulta dos vários sítios
complexantes da molécula de EDTA, que dão origem a uma estrutura pela qual o
cátion é efetivamente envolvido e isolado das moléculas do solvente. Essa
estabilidade resulta no equilíbrio químico representado pela equação (1):
M
2+
+ H
4
EDTA ↔ MH
2
EDTA + 2 H
+
(1)
Quando se emprega o EDTA na forma de sal dissódico, o equilíbrio é
representado pela equação (2):
M
2+
+ Na
2
H
2
EDTA ↔ MH
2
EDTA + 2 Na
+
(2)
Em química analítica a abreviatura "Na
2
H
2
Y" é tipicamente usada para
designar EDTA dissódico. Esta abreviatura pode ser usada para denominar qualquer
espécie de EDTA. O "Y" representa a molécula de EDTA, e o "H" designa o número
de prótons ácidos ligados à molécula de EDTA.
A estabilidade de um complexo caracteriza-se pela sua constante de
estabilidade (ou constante de formação). A Tabela 3 mostra as constantes de
31
formação de formação do EDTA com alguns metais e fica evidenciado que o
complexo NiH
2
EDTA é muito estável, porém a estabilidade do CuH
2
EDTA é um
pouco maior (SKOOG et al., 2006).
Tabela 3 – Valores das constantes de formação dos complexos de metais com o
EDTA.
Cátion K(*)
Ag
+
2,1 x 10
7
Mn
2+
6,2 x 10
13
Fe
2+
2,1 x 10
14
Co
2+
2,0 x 10
16
Zn
2+
3,2 x 10
16
Cd
2+
2,9X 10
16
Pb
2+
1,1 x 10
18
Ni
2+
4,3 x 10
18
Cu
2+
6,2 x 10
18
Hg
2+
6,3 x 10
21
(*) Constantes de formação a 20° C e em força iônica de 0,1.
Fonte: SKOOG et al., 2006.
A habilidade do EDTA em complexar metais é responsável por seu uso
difundido como conservante alimentício e no tratamento do envenenamento por
metais, ligando-se com o metal e sendo excretado pelo sistema urinário (CETESB,
1991).
A intoxicação por elementos metálicos beneficia-se de um tipo de tratamento
específico baseado em sua reatividade química, através de sua capacidade de
formação de complexos com diversas substâncias denominadas agentes quelantes.
É o caso do complexo formado entre os metais e o EDTA, que se trata de um
composto de coordenação atóxico e hidrossolúvel, que é eliminado pela urina e,
portanto, muito utilizado na medicina (BENITE et al., 2007).
32
1.3.3.1 Quelatos importantes
Algumas substâncias têm a propriedades de se ligar a metais prevenindo ou
revertendo à ligação com moléculas celulares. Estas drogas também são chamadas
agentes complexantes, entendendo-se por complexante, a formação de complexo
químicos estáveis em anel, a partir da ligação de elétrons do metal com par de
elétrons do composto orgânico (LEE,1999).
Alguns quelatos são compostos importantes para a vida na terra, como a
hemoglobina e a clorofila. A clorofila, um quelato de magnésio, é a molécula que
sustenta a vida na terra, por ser responsável pela absorção dos fótons da luz solar
nas plantas verdes (SKOOG et al., 2006).
A hemoglobina, substância fundamental à nossa vida, por ser responsável
pelo transporte de oxigênio (O
2
) e gás carbônico (CO
2
) em nosso corpo, é um
quelato de ferro. Na medicina, os quelatos têm como principais aplicações o
tratamento de envenenamentos e a correção de deficiências nutricionais minerais.
No tratamento de envenenamentos metálicos por chumbo, mercúrio ou outros
elementos, agentes quelantes são administrados para “seqüestrar” os íons
metálicos, formando quelatos que possibilitam sua eliminação pelo organismo. Este
tipo de tratamento para eliminação de metais tóxicos é às vezes denominado
quelação (BENITE et al., 2007).
1.3.4 Efeitos aditivos, sinérgicos e antagônicos
Em relação à toxicidade de misturas como, por exemplo, efluentes industriais,
os efeitos resultantes das interações de seus constituintes podem ser classificados
em: aditivos, sinérgicos e antagônicos (JAMES, 2000).
O efeito é aditivo quando a toxicidade da mistura é igual à soma das
toxicidades individuais de seus componentes. Quando a toxicidade de uma mistura é
maior que a soma das toxicidades dos seus constituintes há um efeito sinérgico e
quando a toxicidade da mistura é menor que a soma das toxicidades de seus
componentes, há um efeito antagônico (JAMES, 2000).
33
A ocorrência desses efeitos depende dos modos de interação entre os
constituintes da mistura e o sítio alvo no organismo. Em conseqüência, quatro tipos
de interações são possíveis: os constituintes da mistura afetam a mesma função
fisiológica; uma interação química entre os constituintes da mistura afeta a
toxicidade de um dos compostos; a absorção, o metabolismo, a distribuição ou a
excreção de um constituinte sofre alteração provocada pelos demais constituintes da
mistura e, há uma competição entre os constituintes da mistura pelo mesmo tecido
receptor (PANOUILLÉRES, 2007).
1.4 A Ecotoxicologia
Segundo Lobo e Callegaro (2000), o termo geral “monitoramento da qualidade
da água” inclui tanto o monitoramento físico e químico quanto o monitoramento
biológico. Desses dois enfoques, o monitoramento biológico destaca-se basicamente
em função de dois importantes argumentos. Primeiro, os organismos apresentam
uma resposta integrada ao seu ambiente, e, segundo, se o que interessa é manter
comunidades biológicas saudáveis, é muito mais apropriado monitorar as
comunidades aquáticas que somente as variáveis físicas e químicas.
Como alternativa a complementação da caracterização física e química de
efluentes, recomenda-se a avaliação toxicológica (ZAGATTO et al.,1999; BOHRER,
1995; GOLDSTEIN, 1988).
Segundo Matias (1996), uma subdivisão da toxicologia ambiental é a
ecotoxicologia, que estuda os impactos deletérios de poluentes ambientais sobre
populações de organismos vivos ou ecossistemas, considerando a interação dos
poluentes com o meio ambiente (mobilidade, degradabilidade, bioacumulação e
bioamplificação).
Ecotoxicologia, segundo Azevedo e Chasin (2003), é o estudo do destino e
dos efeitos das substâncias químicas sobre o ecossistema, com base em métodos
de laboratório e de campo, que estuda de forma quali e quantitativa os efeitos
adversos das substâncias químicas.
O termo ecotoxicologia foi cunhado pelo professor e pesquisador francês
René Truhaut, em 1969, reunindo a designação eco (do grego oikos, elemento de
34
composição com o significado de casa, domicílio, habitat: ecologia) e a palavra
toxicologia (ciência dos agentes tóxicos, dos venenos e da intoxicação) (AZEVEDO
e CHASIN, 2003).
Já para Zagatto et al., (1999), Bohrer (1995) e Goldstein (1988), a
ecotoxicologia é a moderna ciência que estuda o impacto potencialmente deletério
de substâncias ou compostos químicos que constituem poluentes ambientais sobre
os organismos vivos.
Segundo Azevedo e Chasin (2003) nos estudo de ecotoxicidade, avaliam-se
os efeitos causados ao organismo-teste, por meio da exposição de organismos
representativos do ambiente às várias concentrações do efluente ou da substância
potencialmente tóxica a ser testada, por período determinado.
De acordo com Hoffman et al. (1995), o primeiro método padronizado para
testes de toxicidade aquática foi publicado em 1945 e subseqüentemente adotado
pela ASTM (American Society for Testing and Materials). Na mesma época,
Doudoroff et al. (1951) utilizaram testes de toxicidade com peixes para avaliar a
toxicidade de efluentes e para dar suporte ao desenvolvimento de novos métodos
padronizados. Ao uso de organismos aquáticos na análise de efluentes foi dada a
denominação de “bioensaios aquáticos”. A publicação de Doudoroff et al. (1951)
levou aos procedimentos padronizados que foram incluídos no “Standard Methods
for Examination of Water and Wastewater”, uma publicação da APHA (American
Public Health Association).
Nos estudos ecotoxicológicos, a toxicidade de uma substância ou efluente,
bem como o do corpo receptor e sedimento, pode ter efeitos agudos ou crônicos
sobre os organismos. Os efeitos agudos são aqueles em que há uma resposta
rápida e brusca no organismo (CETESB, 1986). Já os efeitos crônicos são aqueles
que afetam seu crescimento, reprodução, entre outros (PETTS, 1996).
Os primeiros testes de toxicidade aguda consistiam na exposição de produtos
químicos ou efluentes a um número limitado de espécies. Segundo Fonseca (1998),
os cientistas Penny e Adams, em 1863, e Weigelt e colaboradores, em 1885, foram
alguns dos primeiros autores a realizar estes testes. De acordo com o mesmo autor,
Carpenteer, em 1924, foi o autor que publicou o primeiro dos trabalhos expressivos
de toxicidade do chumbo e zinco.
Fonseca (1998) cita que o organismo-teste Daphnia similis é utilizado em
teste de toxicidade desde a década de 40 e nos últimos 20 anos tem sido utilizado
35
em testes de toxicidade agudos e crônicos, regulatórios e em pesquisa básica de
ecotoxicologia.
Atualmente, a padronização de métodos para testes de toxicidade é um
esforço da comunidade científica. As normas para realização de testes de
toxicidade com organismos de água doce têm sido amplamente desenvolvidas e
implementadas internacionalmente. No entanto, a aplicação de tais testes já é uma
realidade, pois a Resolução CONAMA nº 357 (CONAMA, 2005) que dispõe sobre a
classificação de corpos d'água preconiza a utilização de testes de toxicidade para
classificação, avaliação e monitoramento dos corpos d'água e efluentes.
Estes bioensaios são um instrumento alternativo ou complementar às
tradicionais análises químicas para determinação da toxicidade de amostras
ambientais podem auxiliar na avaliação dos efeitos à saúde (toxicidade humana e
animal) e dos efeitos ecológicos de milhares de substâncias químicas que são
introduzidas no meio ambiente (BITTON, 1983; BASSOI et al., 1990; BERVOETS et
al., 1996).
YU et al. (2003) e HONGXIA et al. (2004) afirmam que o monitoramento
toxicológico oferece muitas vantagens sobre a mensuração individual de elementos
químicos, pois, podem estar presentes elementos tóxicos não conhecidos e ocorrer
interações entre múltiplos tóxicos, alterando a biodisponiblidade tóxica no efluente.
A utilização destes ensaios de toxicidade em vários países ocidentais, quer
seja para agentes químicos ou efluentes industriais, em conjunção a outros dados
físicos e químicos, objetivam promover estudos e relatórios de impacto de efluentes
líquidos nos corpos receptores e implantação de uma política para emissão de
efluentes (BERVOETS et al., 1996; VILLEGAS-NAVARRO et al., 1997; YU et al.,
2003; HONGXIA et al., 2004).
Em particular, a daphnia é reconhecida como uma espécie do zooplâncton de
água doce altamente sensível. Este microcrustáceo tem sido utilizado em ensaios,
agudo e crônico, com substâncias puras e complexas (VILLEGAS-NAVARRO et al.,
1997). As vantagens desta espécie são: ciclos de vida relativamente curtos; requer
pequenos espaços para o cultivo no laboratório; adaptáveis às condições de
laboratório e sensíveis a uma grande variedade de contaminantes aquáticos
(EMMANUEL et al., 2004).
O uso de daphnia em toxicologia tem sido aceito em numerosos países, como
nos Estados Unidos e na França, para o monitoramento de suas águas residuárias,
36
além de ser amplamente recomendado como um bom método de investigação na
determinação das concentrações permissíveis de poluentes e no estabelecimento
dos critérios de qualidade para a água dos efluentes (VILLEGAS-NAVARRO et al.,
1997; SANCHEZ et al., 1998).
No Brasil, o Estado de São Paulo, através da Companhia de Tecnologia de
Saneamento Ambiental - CETESB, faz uso dos testes de toxicidade no controle de
efluentes líquidos (CETESB, 1991). O destino dos poluentes ambientais, por
bioacumulação (processo que leva ao aumento da concentração química de
compostos poluentes, nos organismos, comparativamente, à sua concentração
quando estes se encontram no meio ambiente, águas ou solos, não poluído)
é um
aspecto fundamental da ecotoxicologia.
Para Bohrer (1995), os testes ecotoxicológicos apontam informações, como
os efeitos resultantes das interações de compostos químicos e, ainda, permitem
estabelecer diluições necessárias para reduzir ou prevenir efeitos tóxicos em águas
receptoras, bem como avaliar o impacto dos corpos receptores e determinar a
persistência da toxicidade.
O estabelecimento de correlações entre as concentrações de compostos
tóxicos presentes em águas residuárias e efluentes, e que são removidos na estação
de tratamento de despejos industriais, com as respostas apresentadas pelos
organismos indicadores nos ensaios biológicos com esses mesmos despejos é uma
ferramenta muito útil que permite avaliar a remoção de cargas tóxicas (QUAGLIA e
QUADROS, 1995).
1.4.1 Princípio do método de testes de toxicidade
Os métodos de testes de toxicidade aquática podem ser categorizados de
acordo com o tempo de exposição, situação de teste, efeitos a serem avaliados e
organismos a serem testados (RAND, 1995). Em geral, o princípio do método de
avaliação de toxicidade ambiental consiste na exposição de organismos-teste a
várias diluições da amostra a ser testada, por um período determinado de tempo
(NBR 12.713) (ABNT, 1993).
37
Neste contexto, levando em consideração o tempo de exposição, os testes de
toxicidade aquática podem ser classificados, segundo Rand (1995) e Knie e Lopes
(2004) em testes de toxicidade aguda ou testes crônicos.
Os testes de toxicidade aguda são usados para determinar a toxicidade ou
um efeito deletério de uma amostra sobre um organismo, exposto a várias
concentrações desta amostra. O tempo de exposição geralmente compreende de 24
a 48h. Os efeitos avaliados são mortalidade e/ou imobilidade e, no caso das algas, o
crescimento (RAND, 1995).
Os resultados obtidos nos ensaios de toxicidade aguda são expressos através
das concentrações efetivas medianas (CE50) ou concentrações letais medianas
(CL50) que são as concentrações da substância química testada capazes de causar
efeito ou mortalidade a 50% da população em estudo. Valores acima da CE50 ou
CL50 ameaçam a integridade, sobrevivência da espécie e o equilíbrio e dinâmica do
ecossistema (RAND E PETROCELLI, 1985).
Já os testes crônicos permitem avaliar os possíveis efeitos adversos de uma
amostra sob condições de longo tempo de exposição a concentrações subletais
(RAND, 1995). O teste crônico expõe o organismo teste ao agente potencialmente
tóxico durante todo seu ciclo de vida, incluindo estágios sensíveis como juventude,
crescimento, maturidade sexual e reprodução.
Avaliam-se efeitos como desenvolvimento e reprodução. O resultado é
expresso em Concentração de Efeito Não Observado - CENO, sendo esta a mais
alta concentração do agente testada que não provoca efeito quando comparada com
o controle; e em Concentração de Efeito Observado - CEO, a mais baixa
concentração que causa efeito significativo sobre a população quando comparada
ao controle (RAND, 1995).
1.4.2 Seleção do organismo-teste
A escolha de organismos-testes para realizar análises de toxicidade aquática
em condições de laboratório segue os critérios utilizados pela USEPA (1985). Esses
incluem as seguintes exigências: organismos representativos de grupo taxonômico
ecológico, disponibilidade desses para execução de teste, existência de informações
38
adequadas sobre a espécie, e uso (sempre que possível) de espécies nativas que
sofrem o impacto (RAND e PETROCELLI, 1985). No Brasil, poucas espécies de
organismos nativos são utilizadas em testes de toxicidade aguda ou crônica
(FONSECA, 1998).
Os cladóceros
1
estão entre os organismos mais utilizados para bioensaios,
sendo o grupo recomendado para representar os invertebrados aquáticos (IBAMA,
1987). As daphnias são abundantes no meio aquático e exercem funções
importantes na cadeia alimentar, ocupando diferentes níveis tróficos (ALMEIDA,
1997).
Rand (1995) ratifica o critério de facilidade de manutenção e cultivo em
laboratório das daphnias e acrescenta a necessidade de representatividade do
organismo em relação a um determinado grupo de importância ecológica, a
estabilidade genética gerando populações uniformes e a pertinência como membro
de uma família que pertença a cadeia alimentar do homem.
1.4.3 A Daphnia similis
Segundo Ruppert e Barnes (1996), a daphnia é classificada taxonomicamente
no filo Arthropoda, subfilo Crustacea, classe Branchiopoda, ordem Diplostraca,
subordem Cladocera, família Daphnidae.
Segundo os mesmos autores, o nome Branchiopoda caracteriza a classe que
possui coxas providas de epípodos achatados que servem como brânquias. Os
animais da ordem Diplostraca são lateralmente comprimidos, com a cabeça livre e o
tronco fechado dentro de uma carapaça bivalve que termina posteriormente em um
espinho apical. A extremidade da ponta do tronco, o pós abdômen, vira-se
ventralmente e para frente, portando garras e espinhos especiais para limpeza da
carapaça.
A Daphnia similis é um microcrustáceo de água doce, com cerca de 4 mm de
comprimento, vulgarmente designado por pulga-de-água devido aos movimentos
1
Cladóceros: Uma classe do filo Artrópoda, onde se encontram microcrustáceos de 2 a 3 mm de comprimento.
39
específicos das segundas antenas que lhe dão a aparência de se deslocar em
pequenos saltos (FONSECA, 1998).
A bionomia
2
dos microcrustáceos varia de grupo para grupo, sendo altamente
dependente da espécie e das condições ambientais. Nos cladóceros, o padrão
reprodutivo envolve a eclosão de fêmeas a partir de ovos partenogenéticos
diplóides
3
por várias gerações, sob condições favoráveis, e reprodução sexuada sob
condições desfavoráveis (RIETZLER, 1995).
O desenvolvimento é direto e os jovens são liberados da câmara incubadora
por meio de flexão ventral do pós-abdome da fêmea, processo que é seguido por
ecdise
4
e nova postura de ovos. O número de instares
5
juvenis é variável sendo que,
de maneira geral, o número de mudas até a primeira reprodução gira em torno de 2
a 4, não superando 6. Nos adultos, o número de instares é usualmente maior e mais
variável, cessando, geralmente, a produção de ovos nos últimos estágios da vida
(RIETZLER, 1995).
Os ovos partenogenéticos são liberados por gerações, e uma fêmea pode
produzir uma sucessão de incubações. Contudo, em algum ponto, determinados
fatores (alteração na temperatura da água, redução do suprimento alimentar em
função de um aumento populacional) induzem o aparecimento de machos e são
produzidos ovos fertilizados (RUPPERT e BARNES, 1996).
Os ovos fertilizados são grandes e só são produzidos dois em uma ninhada,
um de cada ovário. As paredes da câmara incubatória encontram-se então
transformadas em uma cápsula protetora (efípio). Esta é descartada na próxima
muda, ou separando-se do exoesqueleto, ou permanecendo com o resto do mesmo.
Os efípios flutuam, afundam ou aderem a objetos podendo suportar o ressecamento
e o congelamento até a passagem pelo intestino dos peixes, das aves e dos
mamíferos que se alimentam de peixes. Por meio de tais ovos em repouso
protegidos, os cladóceros podem dispersar-se pelo vento ou por meio de animais
podendo sobreviver ao inverno e às secas (RUPPERT e BARNES, 1996).
2
Bionomia: Ramo da ciência voltado para as interrelações de organismos e seu ambiente, desenvolvimento e
estrutura da comunidade, interações entre espécies de organismos diferentes.
3
Ovos partenogenéticos diplóides: Ovos gerados a partir da mãe partenogenética, ou seja, em que não há a
reprodução sexuada e a prole é idêntica a mãe.
4
Ecdise: Mudança do exoesqueleto dos organismos, normalmente constituído de quitina.
5
Instares: Estágio atingido após a muda ou ecdise do organismo. Os ístares permanecem apenas até o animal
se tornar adulto.
40
Atuando na cadeia alimentar aquática como consumidor primário entre os
metazoarios, as dapnhias se alimentam por filtração de material orgânico
particulado, principalmente algas unicelulares. Como todos os crustáceos, a daphnia
apresenta uma carapaça que no seu caso sofre muda diária. A carapaça é feita
praticamente de quitina, que é um polissacarídeo e oferece uma proteção ao
organismo servindo como uma escudo (FONSECA, 1998).
A dinâmica da tomada do alimento segue um tipo funcional. Quando a
concentração de alimento está abaixo do normal, a tomada do alimento da água
(taxa de alimentação) é proporcional à concentração do alimento, e à taxa de
filtração (uma quantidade de água filtrada por um tempo) é máxima. Acima deste
nível, a taxa de alimentação é constante porque a taxa de filtração diminui com a
concentração crescente do alimento na água. O intestino é tubular, há dois cécos
digestivos pequenos que são vistos facilmente na seção principal do intestino
(FERNÁNDEZ-CASALDERREY et al., 1994).
Embora o instrumento de alimentação seja tão eficiente que mesmo as
bactérias podem ser coletadas, o alimento é composto geralmente de algas
planctônicas. As algas verdes estão entre o melhor alimento, e a maioria de
experiências de laboratório são feitas com o gênero Scenedesmus ou
Pseudokirchneriella, ambos são fáceis de cultivar em colonias. A D. similis consome
geralmente partículas ao redor 1 µm até 50 µm, embora que partículas de até 70 µm
de diâmetro possam ser encontradas no inicio do intestino de grandes indivíduos
(CLÉMENT e ZAID, 2004).
As pulgas d’água nadam por meio das segundas antenas, sendo que o
movimento é predominantemente vertical e geralmente desajeitado. O curso
descendente das antenas propele o animal para cima; depois ele afunda lentamente,
utilizando as antenas como um pára-quedas. As pequenas cerdas plumosas na
extremidade do abdômen agem como estabilizadoras. O olho naupliano
6
é composto
e séssil, fundido em um único olho mediano, que persiste na fase adulta, sendo útil
para orientar o animal no nado (RUPPERT e BARNES, 1996).
A daphnia tem uma circulação de sangue aberta. O coração se localiza na
parte dorsal e anterior da câmara da ninhada. Em 20 ºC, o coração bate
aproximadamente 200 vezes por minuto, retardando a temperaturas mais baixas. Os
6
Olho naupliano: Olho simples, característico na fase larval, localizado na parte anterior da cabeça da daphnia.
41
glóbulos são facilmente visíveis através do corpo transparente porque passam
rapidamente pela cavidade do corpo (FERNÁNDEZ-CASALDERREY et al., 1994).
O sistema nervoso é caracterizado pelo gânglio cerebral, que é posicionado
perto do intestino e próximo do olho. O organismo juvenil e adulto tem um grande
olho composto, visto que os embriões mostram dois pontos acastanhados do olho
que se fundem durante a última parte do desenvolvimento (VILLAROEL et al., 1999).
Quatro períodos podem ser reconhecidos no ciclo de vida de daphnias: ovo,
juvenil, adolescente e adulto (Figura 3). O ciclo de vida do ovo até a morte do adulto
varia de acordo com as condições ambientais. Em geral, o ciclo de vida aumenta
com o decréscimo da temperatura, em função da diminuição da atividade
metabólica. A 20ºC a média do ciclo de vida de Daphnia similis (de ovo a adulto) é
de 56 dias. Quando mantida em laboratório, esta espécie tem, normalmente, juvenis
de 2 em 2 dias e precisa de 6 a 10 dias para dar origem à primeira ninhada (RAND,
1995).
Figura 3 - Daphnia similis em idade adulta (aumento de 40x).
1.5 Testes de Ecotoxicidade com Daphnia similis
Para realização de testes agudos com daphnia, dentre a normatização
internacional, cita-se a existência de duas normas: a americana estabelecida pela
"International Standard Organization" - ISO 6341 (ISO, 1982) e a alemã
desenvolvida pelo "Deutsches Institut für Normung" - DIN 38412 (DIN, 1989). No
42
Brasil, a Associação Brasileira de Normas Técnicas – ABNT normatizou o uso da
espécie através da NBR 12.713 (ABNT, 1993).
Já para a realização de testes crônicos com daphnia, não há protocolos
definidos e publicados. O que encontra-se na literatura internacional é um protocolo
da "Organization for Economic Co-operation and Development" - OECD, o
"Guidelines 202", (OECD, 1984) desenvolvido para Daphnia magna. Os testes,
contudo, são realizados em um período de 14 dias, com fluxo semi-estático, e
avaliam a reprodução do organismo. Assim, este teste visa a avaliação geral do
desempenho reprodutivo das fêmeas como um indicativo de contaminação
ambiental. Outrossim, não cobre todo o ciclo ontogênico do indivíduo, avaliando
apenas as primeiras proles, sendo classificado então como um teste sub-letal.
Arauco (2002) teve como um dos seus objetivos avaliar a toxicidade aguda do
sulfato de cobre frente a três espécies de daphnias (Daphnia similis, Daphnia magna
e Daphnia laevis) na ausência e presença de sedimento. Os valores obtidos de
CL50;48h para D. magna foram de 0,345 mg.L
-1
na presença de sedimento e 0,045
mg.L
-1
sem sedimento. Já para a D. similis, 0,282 mg.L
-1
com sedimento e 0,042 sem
sedimento e para D. laevis, 0,140 mg.L
-1
com sedimento e 0,107 mg.L
-1
sem
sedimento. Pode notar que o sedimento reduziu significativamente a
biodisponibilidade do sulfato de cobre para as três espécies de daphnias.
De acordo com os resultados obtidos por Deleebeeck (2007), o cálcio e o
magnésio reduziram a toxicidade do níquel sobre as daphnias. Um aumento da
dureza da água de 50 para 325 mg.L
-1
de CaCO
3
provocou a diminuição da
toxicidade em até 3 vezes, apresentando resultados de CL50;48h de 1,82 e 5,50
mg.L
-1
respectivamente.
Barata, et al. (2006) avaliou a toxicidade aguda de metais (cobre e cádmio) e
de inseticidas (Cyhalothrin e Deltamethrin) utilizando Daphnia magna como
bioindicador. De acordo com os resultados, o cobre apresentou um valor de
CL50;48h de 675,52 nmol.L
-1
enquanto que o cádmio causou um efeito tóxico no
valor de 48,42 nmol.L
-1
de CL50;48h. Para o Cyhalothrin, o valor de CL50;48h foi de
0,87 nmol.L
-1
e para o Deltamethrin, de 0,31 nmol.L
-1
. A partir desses resultados,
Barata (2006), aplicou um estudo de um projeto experimental para obter a toxicidade
dessas misturas binárias a partir da toxicidade individual de cada composto.
Utilizando dois conceitos, denominados de além da concentração (AC) e ação
independente (IA), permitindo o cálculo da toxicidade de uma mistura esperado com
43
base no conhecimento da toxicidade, o autor conclui que em todo estudo mais
complexo, deveria ser feito um estudo toxicológico para se obter tais resultados e
assim, predizer o efeito tóxico causado no ambiente.
Bioensaios de toxicidade aguda e crônica foram realizados para determinar os
efeitos de cobre, chumbo, zinco e suas misturas, utilizando os organismos de
Ceriodaphnia dubia e Daphnia carinata. Soluções de cobre, chumbo e zinco
combinados nas concentrações de 5,2, 4,5 e 51,8 mg.L
-1
, respectivamente, não
provocaram mortalidade significativa durante a exposição aguda. Quando os
organismos foram submetidos a misturas de 10,6, 9 e 101,1 mg.L
-1
apresentou
mortalidade de até 100% (COOPER, et al., 2009).
Além da mortalidade, Cooper (2009) submeteu os organismos a ensaios
crônicos com as combinações binárias de cobre + zinco (1,3 + 13,0 mg.L
-1
), cobre +
chumbo (1,3 + 1,1 mg.L
-1
) e combinações ternárias de cobre + chumbo + zinco (1,3
+ 1,1 + 13,0 mg.L
-1
) obtendo um efeito significativo sobre a reprodução. Na maioria
dos casos apresentados pelo autor, a maior parte das interações de metais seriam
classificados como aditivo.
1.6 Controle da sensibilidade dos organismos-teste
Os organismos-teste Daphnia similis são testados em nível de sensibilidade,
mensalmente, visando assegurar a qualificação dos mesmos dentro dos padrões
das normas nacionais e internacionais e garantir a validação dos testes realizados.
Para tal, realiza-se testes de toxicidade aguda com a substância de referência
dicromato de potássio (K
2
Cr
2
O
7
). A partir desses testes, são obtidos valores de
CL50;24h e comparados com os valores propostos por CETESB
(1986). Tendo
como base o valor da norma, os valores obtidos devem estar dentro da faixa
aceitável, que é de 0,9 e 2,0 mg.L
-1
. A metodologia de execução dos testes é a
mesma usada nos demais testes de toxicidade aguda apresentados ao longo do
trabalho.
44
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material
2.1.1 Reagentes
- Acido bórico – PA - Vetec
- Acido clorídrico – PA - Vetec
- Bicarbonato de sódio – PA - Vetec
- Brometo de sódio – PA - Vetec
- Cianocabalamina (Vitamina B12) – Farmácia de manipulação
- Cloreto de cálcio (CaCl
2
.2 H
2
O) – PA - Vetec
-
Cloreto de cobalto (CoCl
2
.6H
2
O) – PA - Vetec
- Cloreto de cobre (CuCl
2
.2H
2
O) – PA - Vetec
- Cloreto de estrôncio (SrCl
2
.6H
2
O) - PA - Vetec
- Cloreto de lítio – PA - Vetec
- Cloreto de manganês (MnCl
2
.4H
2
O) – PA - Vetec
- Cloreto de potássio - PA - Vetec
- Cloreto de rubídio – PA - Vetec
- Cloreto de sódio – PA - Vetec
- Cloreto de zinco – PA - Vetec
- D(+)Biotina (Vitamina B7) – Farmácia de manipulação
- Dicromato de potássio - PA - Reagen
-EDTA, ácido etilenodiamino tetra-acético (C
10
H
14
N
2
O
8
Na
2
.2H
2
O) - PA - Vetec
- Hidrocloreto de tiamina (Vitamina B1) – Farmácia de manipulação
- Hidróxido de potássio - PA - Vetec
- Iodeto de potássio - PA - Vetec
- Fosfato de potássio monobásico - PA - Vetec
- Fosfato de potássio dibásico - PA - Vetec
- Molibdato de sódio (Na
2
MoO
4
.2H
2
O) – PA - Vetec
- Nitrato de cobalto (Co(No
3
)
2
.6 H
2
O) – PA - Vetec
45
- Oxido de molibdênio - PA - Vetec
- Selenito de sódio – PA - Vetec
- Silicato de sódio – PA - Vetec
- Sulfato de cobre (CuSO
4
.5H
2
O) - PA - Vetec
- Sulfato de ferro (FeSO
4
.7H
2
O) – PA - Vetec
- Sulfato de magnésio (MgSO
4
.7H
2
O) - PA - Vetec
- Sulfato de níquel (NiSO
4
.6H
2
O) - PA - Vetec
- Nitrato de sódio – PA - Vetec
- Hidróxido de sódio – PA - Vetec
- Metavanadato de amônio – PA - Vetec
- Sulfato de zinco (ZnSO
4
.7H
2
O) – PA - Vetec
2.1.2 Equipamentos
- Câmara incubadora de demanda bioquímica de oxigênio (DBO), modelo
EL202E - Eletrolab
- Pipetas automáticas de volumes variáveis - Digipet
- pH-metro – pH300 - Analyser
- Soprador de aquário – SC7500 - Boyu
- Sonda Multiparamétrica Troll 9000 – Clean Environmental
2.2 Métodos
2.2.1 Preparo do meio de cultivo (Meio Básico-M4)
A cultura depende essencialmente da qualidade da água e do alimento. Nas
diversas normas existentes mundialmente são propostos diferentes tipos de água e
46
alimentos que nem sempre são os mais adequados para o uso ao longo do tempo,
porque podem causar perturbações no cultivo.
Uma água de cultivo comprovadamente adequada, que garante boas
condições de vida para as daphnias durante anos, é composta por um Meio Básico,
que contém os sais essenciais característicos da água natural (Ca, Mg, K, Na) e pelo
Meio M4, constituído de elementos-traços e vitaminas (DIN 38409, 1989; DIN 38412,
1989). Esse meio foi desenvolvido especialmente para atender as necessidades
vitais da daphnias e já vem sendo utilizado há anos em muitos laboratórios com
excelentes resultados na cultura de organismos.
As soluções que compõem o Meio Básico e o M4, bem como o modo de
prepará-las são apresentados na Tabela 4.
Com as 10 soluções prontas, o preparo do Meio Básico-M4 foi feito
adicionando-se os volumes demonstrados na Tabela 4, em ordem crescente de
numeração das soluções, no barrilete e completar até atingir os 50 L com água
destilada. Essa água foi armazenada neste barrilete a 20 ºC, não ultrapassando 20
dias, onde o que não era utilizado, foi descartado e preparado um novo lote para
evitar contaminações por fungos ou bactérias.
Após esse procedimento, o meio foi aerado por 24h, utilizando uma bomba
sopradora de aquário para a completa saturação de oxigênio. Antes do uso do lote
de Meio Básico-M4 preparado, o pH foi ajustado entre 7 e 7,2 com solução de ácido
clorídrico 0,2 N ou hidróxido de sódio 0,2 N. Os valores obtidos de concentração de
oxigênio, condutividade e pH, foram registrados em uma carta controle (Apêndice).
47
Tabela 4 - Volume e composição das soluções para preparo de 50 L de água de
cultivo Meio Básico-M4.
Solução Vol (mL) Composição (g/L)
1 200 CaCl
2
.2H
2
O (73,52)
2 50 MgSO
4
.7H
2
O (123,3)
3 50 KCl (5,8)
4 50 NaHCO
3
(64,8)
5 5
MnCl
2
.4H
2
O (7,21)
LiCl (6,12)
RbCl (1,42)
SrCl
2
.6H
2
O (3,04)
CuCl
2
.2H
2
O (0,335)
ZnCl
2
(0,26)
CoCl
2
.6H
2
O (0,20)
6 25
NaNo
3
(0,548)
H
3
BO
3
(5,719)
NaBr (0,032)
Na
2
MoO
4
.2H
2
O (0,126)
NH
4
VO
3
(0,00115)
KI (0,0065)
Na
2
SeO
3
(0,00438)
7 * 10 Na
2
SiO
3
(0,02146)
8 250
Na
2
EDTA.7H
2
O (0,5)
FeSO
4
.7H
2
O (0,1991)
9 25
KH
2
PO
4
(0,268)
K
2
HPO
4
(0,368)
10 ** 5
Hidrocloreto de tiamina (0,75)
Cianocabalamina (0,01)
D(+)Biotina (0,0075)
* Manter a solução em agitação até obter seu clareamento.
** Conservar congelada em volume adequado para uso.
48
Após a aeração, o meio, em geral, apresenta as seguintes características:
- dureza total de 250 ± 25 mg.L
-1
de CaCO
3
;
- concentração de oxigênio acima de 80% de saturação
- pH de 7,8 ± 0,2
2.2.2 Preparo da solução algácea (Meio Chu-12)
O meio de cultivo utilizado para o preparo da solução algácea
Pseudokirchneriella subcapitata é constituído por água destilada e dez soluções
diferentes preparadas conforme a Tabela 5 (KNIE e LOPES, 2004).
Tabela 5 - Composição e volume das soluções de preparo do meio de cultura para
algas verdes unicelulares com meio CHU-12.
Solução Vol (mL) Composição (g/L)
1 10 NaNO
3
(25)
2 10 CaCL
2
2 H
2
O (2,5)
3 10 MgSO
4
7 H
2
O (7,5)
4 10 K
2
HPO
4
(7,5)
5 10 KH
2
PO
4
(17,5)
6 1 NaCl (2,5)
7 1
EDTA (50)
KOH (31)
8 1 FeSO
4
7 H
2
O (4,98)
9 1 H
3
BO
3
(11,42)
10 1
ZnSO
4
7 H
2
O (8,82)
MnCl
2
4 H
2
O (1,44)
MoO
3
(0,71)
CuSO
4
5 H
2
O (1,57)
Co(NO
3
)
2
6 H
2
O (0,49)
49
Após o preparo das 10 soluções, o meio CHU-12 foi feito adicionando-se os
volumes acima citados, em um erlenmeyer, completando para 1 L de água destilada.
Com a solução pronta, foi adicionado 30 mL da solução algácea pronta adquirida
inicialmente no Laboratório de Ecotoxicologia do Centro de Pesquisas da Petrobras
(Cenpes), na cidade do Rio de Janeiro, RJ.
Essa solução foi mantida a 20 °C, sob luminosidade e aeração constante para
que houvesse a reprodução e proliferação das algas verdes por um período de 10
dias. Após o preparo, a solução algácea foi mantida na geladeira para evitar a morte
e/ou contaminação da solução. Meia hora antes de ser utilizada, a solução era
retirada da geladeira para que a temperatura se igualasse com a do Meio Básico-M4
em que estavam as culturas de Daphnia similis.
2.2.3 Cultivo de Daphnia similis
As matrizes de Daphnia similis foram adquiridas no Laboratório de
Ecotoxicologia do Centro de Pesquisas da Petrobras (Cenpes), na cidade do Rio de
Janeiro, RJ. Os organismos que nasceram das matrizes adquiridas (neonatos) foram
transferidos em grupos de até 150 indivíduos para recipientes de 2 L de água de
cultivo (meio M4). No quinto ou sexto dia de idade, o grupo foi subdividido em grupos
menores de até 30 indivíduos mantidos em recipientes de 1 L de meio de cultivo. Os
neonatos obtidos a partir da terceira geração foram utilizados para testes de
sensibilidade, pois dessa forma, os descendentes já estariam adaptados ao novo
ambiente e às condições da sala de cultivo.
As culturas de Daphnia similis foram conduzidas em câmara incubadora de
demanda bioquímica de oxigênio (DBO), com temperatura de 20 ± 2°C, sob
intensidade luminosa de 1.000 lux e fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de
escuro (Figura 4). Os animais foram mantidos em cristalizadores de vidro de 2L,
contendo água reconstituída (Meio Básico-M4) ajustada para pH 7,0, condutividade
de 160 μS/cm, dureza de 180 a 200 mg/L de CaCO
3
e com oxigênio acima de 80%
de saturação.
50
Os organismos foram alimentados uma vez ao dia com 5 mL de suspensão
de algas Pseudokirchneriella subcapitata, segundo a metodologia de cultivo (IBAMA,
1987; CETESB, 1991; ABNT, 2006).
O aparecimento de machos, ocorre geralmente devido a condições adversas
tais como variações fora dos limites da temperatura, excesso ou falta de alimento e
superpopulação, interferem na reprodução das daphnias, favorecendo, muitas
vezes, o aparecimento de machos e conseqüentemente de efípios. Essas condições
induzem também a produção de um ou dois ovos fertilizados, maiores e envolvidos
por cápsula protetora que lhes confere grande resistência (efípio). Estes são ovos de
resistência, resultantes da reprodução sexuada. Portanto, o aparecimento de
machos ou efípios é um indicador de que algo não vai bem com a cultura. Se a
porcentagem de machos em um recipiente de cultivo for superior a 10 % da
população, ou o numero de efípios for maior que 2, o lote era descartado. Sendo
assim, somente as fêmeas eram utilizadas nos ensaios de toxicidade.
Os machos se distinguem facilmente das fêmeas, pois são menores, possuem
o corpo mais afilado e nadam mais rapidamente. Alem disso, as fêmeas se
caracterizam pela bolsa incubadora, na qual estão quase sempre contidos ovos ou
embriões, bem visíveis.
(a) (b)
Figura 4 - Culturas de Daphnia similis no Meio Básico-M4: (a) câmara incubadora e
(b) cristalizador de vidro de 2 L
51
Pelo menos uma vez por semana, as daphnias foram transferidas para outro
recipientes contendo água de cultivo Meio Básico-M4 fresca, cuja temperatura não
pode diferir em mais de 3 ºC daquela em que estavam. A limpeza e retirada das
carapaças (exoesqueletos quitinosos) dos aquários foram feitas diariamente e a
troca da água do meio de cultivo foi realizada uma vez por semana, sempre antes do
fornecimento do alimento.
2.2.4 Testes de ecotoxicidade aguda com Daphnia similis
A CL50 é definida como o valor de concentração do composto utilizado em
que 50% dos organismos testados são mortos/imobilizados. Esse valor é obtido a
partir dos valores das doses e das respectivas respostas buscando-se identificar a
relação entre ambas e com base nesta relação estima-se a dose letal.
Os testes de ecotoxicidade aguda foram efetuados segundo as normas DIN
38409 (1989), DIN 38412 (1982) e CETESB (1986) divididos em duas fases,
preliminar e definitiva, sendo utilizados neonatos com idade entre 6 e 24h.
Testes preliminares: Nos testes preliminares, preparou-se uma solução-mãe
do reagente a ser testado em água destilada. A partir da solução-mãe preparou-se,
por diluição, cinco soluções-teste com concentrações diferentes em um volume de 9
mL. Foram feitas triplicatas de cada concentração testada e um controle, contendo
apenas o meio de cultivo. Os testes foram realizados em tubos de ensaio de vidro.
Após a preparação das soluções-teste, foram adicionados 5 organismos
neonatos juntamente com 1 mL de água do Meio Básico-M4, totalizando um volume
de 10 mL em cada tubo (Figura 5). Após 48h de exposição, no escuro e a 20 ºC a
leitura foi realizada, avaliando-se a imobilidade e/ou a mortalidade dos neonatos.
Com base nos valores de CL50 encontrados na revisão bibliográfica
consultada, os ensaios preliminares foram montados com concentrações aleatórias
para poder se chegar em uma faixa estreita de concentração.
52
Figura 5 - Tubos de ensaio para montagem dos testes de toxicidade com Daphnia
similis
Testes definitivos: Os testes definitivos foram realizados a partir dos
resultados obtidos nos testes preliminares, escolhendo-se a maior concentração que
em que houve 0% de mortalidade e a menor concentração onde houve 100% de
mortalidade. O ensaio foi mantido por 48 horas de exposição dos organismos, no
escuro e a 20 ºC, às soluções contaminantes.
O procedimento utilizado foi o mesmo tanto para os testes preliminares
quanto para os definitivos. Ao término dos testes, fez-se um controle de qualidade e
validade obedecendo aos seguintes requisitos: concentração de oxigênio dissolvido
(OD) no controle ≥ 2 mg.L
-1
, número de organismos imóveis no controle não
excedendo 10%, manutenção da temperatura da sala entre 20 ± 2 ºC e instalação de
testes com a substância de referência com valores aceitáveis (CETESB, 1986).
Teste com substância de referência: Os testes de referência foram
realizados com soluções de dicromato de potássio (K
2
Cr
2
O
7
) e foram necessários
para assegurar a viabilidade da cultura a ser utilizada, tendo como base o valor com
a faixa aceitável de CL50;24h entre 0,9 e 2,0 mg.L
-1
de acordo com a norma
proposta por CETESB
(1986). Os testes com a substância de referência foram
conduzidos em paralelo com a montagem dos testes definitivos.
Após serem realizados os testes preliminares e definitivos, foram calculados
os valores de CL50;48h e de seus intervalos de confiança, como limite superior e
inferior (5 e 95%), utilizando o método estatístico Probit. Este método é utilizado
através de um software em que a partir dos resultados de mortalidade e valores de
concentrações, estatisticamente é gerado um valor de CL50, juntamente com seus
53
intervalos de segurança. A análise de Probit consiste em um conjunto de métodos
que pode ser usado para analisar dados qualitativos desta natureza (FINNEY, 1971).
O procedimento utilizado foi o mesmo tanto para os testes preliminares
quanto para os definitivos e é apresentado na Figura 6.
Solução-mãe (reagente +
água destilada)
Solução mais diluída
Tubo de ensaio (soluções-
teste)
Adição de 5 organismos +
1mL de M4
48h escuro e 20ºC
Avaliação cálculo CL50
Solução-mãe (reagente +
água destilada)
Solução mais diluída
Tubo de ensaio (soluções-
teste)
Adição de 5 organismos +
1mL de M4
48h escuro e 20ºC
Avaliação cálculo CL50
Figura 6 - Organograma do procedimento do teste de toxicidade aguda.
A etapa definitiva foi realizada com faixas de concentrações estabelecidas a
partir dos testes preliminares. Todas as soluções-mãe utilizadas foram de 1.000
mg.L
-1
e a partir dela, foram feitas soluções menos concentradas para chegar a
diluição final das concentrações utilizadas nos testes. Todos os ensaios foram feitos
em triplicatas, diminuindo assim o erro e garantindo seus resultados.
As misturas das soluções foram feitas proporcionalmente em volume de
soluções de 1.000 mg.L
-1
de cada composto utilizado. Nos ensaios utilizando o
agente quelante EDTA, foram feitos testes com diferentes proporções mássicas de
EDTA para a mistura dos metais cobre e níquel.
Baseando-se no fato de que o complexo é formado na proporção equimolar
do metal e do EDTA, a solução constituída na proporção mássica 1:1:1 apresentou
54
excesso de metais em relação ao EDTA (2,7 mmol L
-1
de EDTA, 4,0 mmol L
-1
de
cobre e 3,8 mmol L
-1
de niquel). Já a solução na proporção mássica 1:1:3
apresentou um equilíbrio estequiométrico em que teoricamente, todo o metal
disponível estaria complexado com o agente quelante (8,1 mmol L
-1
de EDTA, 4,0
mmol L
-1
de cobre e 3,8 mmol L
-1
de níquel). Por fim, a solução na proporção
mássica 1:1:6 apresentou o dobro da quantidade de matéria do agente complexante,
gerando um excesso de EDTA em relação aos cátions adicionados (16,2 mmol L
-1
de EDTA, 4,0 mmol L+ de cobre e 3,8 mmol L
-1
de níquel).
55
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Testes de controle de sensibilidade das daphnias com dicromato de
potássio
Os valores calculados de CL50;24h dos dez testes de toxicidade aguda com a
substância de referência dicromato de potássio, estão apresentados na Tabela 6,
com os respectivos valores de intervalo de confiança (Limite superior - L.S. e Limite
inferior - L.I.), calculados a partir dos valores obtidos no programa estatístico
PROBIT, média aritmética dos testes (X), desvio padrão (S) e coeficiente de
variação (C.V.).
As datas informadas na tabela, referem-se a data de montagem do teste,
demonstrando que durante toda a execução dos ensaios de toxicidade, os lotes de
organismos estavam aptos para serem submetidos aos testes de acordo com as
nomas exigidas pela CETESB (1986) .
Tabela 6 - Valores de CL50;24h calculados para os testes de toxicidade aguda do
dicromato de potássio e do intervalo de confiança (95%) em Meio Básico-M4 frente à
Daphnia similis.
Data
CL50;24h
mg.L
-1
L.S.
mg.L
-1
L.I.
mg.L
-1
X
mg.L
-1
S C.V.
23-01-2009 1,40 1,64 1,14
05-02-2009 1,87 1,99 1,65
10-03-2009 1,65 1,84 1,43
18-03-2009 1,31 1,46 1,14
03-05-2009 1,29 1,62 1,09
16-06-2009 1,52 1,64 1,41
23-06-2009 1,49 1,55 1,39
23-09-2009 1,06 1,23 0,87
27-10-2009 1,61 1,94 1,32
28-10-2009 1,08 1,30 0,84
1,43 0,25 17,76
LS = limite superior; LI = limite inferior; X = média; S = Desvio padrão; C.V. =
Coeficiente de variação.
56
A média dos valores obtidos nos ensaios de referência com solução aquosa
de dicromato de potássio indicaram CL50;24h igual a 1,43 mg.L
-1
. Esse resultado
garante a viabilidade do estudo com o organismo Daphnia similis, pois se encontram
dentro da faixa estabelecida como aceitável, entre 0,9 e 2,0 mg.L
-1
(CETESB, 1986).
Considerando-se o critério de média dos limites para determinar o intervalo de
aceitação dos valores de CL50;24h, para o controle da sensibilidade das daphnias
(USEPA, 1985), verifica-se na Figura 7 que as daphnias submetidas também o
atendem. No gráfico, os pontos representam os valores de CL50;24h obtidos ao
longo de 10 ensaios. Os limites estabelecem a variação máxima que é permitida
para que haja uma maior confiabilidade dos ensaios de toxicidade.
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
12345678910
Número do teste
Valor de CL50;24h
LS
LI
Figura 7 - Controle de qualidade dos organismos-teste e estabelecimento da faixa
aceitável, de CL50;24h do dicromato de potássio frente a Daphnia simlis (LS = limite
superior; LI = limite inferior).
57
3.2 Ensaios de toxicidade aguda do sulfato de cobre, do sulfato de níquel e
suas misturas frente à Daphnia similis
3.2.1 Testes preliminares
A toxicidade dos compostos para os organismos aquáticos depende da
sensibilidade do organismo e da concentração biodisponível.
Os valores das concentrações dos testes preliminares foram sendo ajustados
de acordo com os resultados obtidos em cada ensaio, individualmente. As
concentrações premiliminares utilizadas nos ensaios estão apresentados na Tabela
7, 8 e 9.
Tabela 7 – Concentrações testadas nos ensaios preliminares de toxicidade aguda
utilizando o sulfato de cobre (CuSO
4
.5H
2
O) frente à Daphnia similis.
Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio 4
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
0 0 0,00 0 0,00 1 0,00 0
0,001 0 0,05 0 0,10 0 0,10 0
0,005 0 0,10 1 0,30 0 0,30 3
0,010 0 0,30 3 0,60 3 0,60 7
0,020 2 0,60 10 0,90 5 0,90 13
0,050 1 0,90 14 1,20 5 1,20 15
0,100 3 1,20 15 1,50 5 - -
M = Mortalidade e/ou imobilidade dos organismos
58
Tabela 8 – Concentrações testadas nos ensaios preliminares de toxicidade aguda
utilizando o sulfato de níquel (NiSO
4
.6H
2
O) frente à Daphnia similis.
Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
0,00 0 0,0 0,0 0,0 0
0,05 0 3,0 6,6 3,0 6,6
0,10 0 6,0 13,3 6,0 20
0,50 0 9,0 33,3 9,0 33,3
1,0 0 12,0 66,6 12,0 60
3,0 0 15,0 93,3 15,0 100
5,0 13,3 - - - -
7,0 6,6 - - - -
10,0 13,3 - - - -
M = Mortalidade e/ou imobilidade dos organismos
Para a realização dos ensaios onde teríamos uma mistura de solução, como
apresentado na Tabela 9, os valores de concentrações referem-se a cada metal
utilizado (sulfato de cobre e sulfato de níquel).
Tabela 9 – Concentrações testadas nos ensaios preliminares de toxicidade aguda
utilizando a mistura do sulfato de cobre e sulfato de níquel frente à Daphnia similis.
Ensaio 1 Ensaio 2
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
0,0 0 0,0 0
0,1 0 0,2 6,6
0,4 6,6 0,4 20,0
0,8 100 0,6 46,6
1,0 100 0,8 46,6
3,0 100 1,0 60,0
5,0 100 1,2 93,3
M = Mortalidade e/ou imobilidade dos organismos
59
Após cada ensaio realizado, os dados obtidos eram utilizados para calcular o
valor da CL50;48h. Com esse valor, as novas concentrações eram estabelecidas de
forma que se encontrasse a maior concentração em que não haveria mortalidade e a
menor concentração em que teríamos 100% dos organismos mortos. Em todos os
ensaios, cada concentração foi feita em triplicata e a mortalidade foi calculada com a
soma das replicatas.
3.2.2 Testes definitivos
Após a realização dos ensaios preliminares, as concentrações definitivas
estabelecidas e utilizadas estão apresentadas na Tabela 10.
Essas concentrações são as que melhores de adequaram a este ensaio, ou
seja, um range de concentrações onde não houve mortalidade na menor
concentração e 100% de mortalidade nas maiores concentrações.
Tabela 10 - Concentrações definitivas utilizadas nos testes de toxicidade aguda dos
compostos metálicos e suas misturas frente à Daphnia similis.
Solução Concentrações (mg.L
-1
)
Sulfato de cobre II (CuSO
4
.5H
2
O) 0,0 0,1 0,3 0,6 0,9 1,2
Sulfato de níquel II (NiSO
4
.6H
2
O) 0,0 3,0 6,0 9,0 12,0 15,0
CuSO
4
.5H
2
O e NiSO
4
.6H
2
O (1:1) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,2
Os ensaios foram realizados em triplicatas, obtendo os resultados
apresentados na Tabela 11 e 12.
Os valores de CL50 expressam uma relação inversa à toxicidade da
substância, logo quanto maior o valor de CL50 menor é a toxicidade do composto.
60
Tabela 11 - Valores de CL50;48h calculados pelo programa PROBIT (Finney, 1971)
para o sulfato de cobre (CuSO
4
.5H
2
O) e do intervalo de confiança (95%) em Meio
Básico-M4 frente à Daphnia similis.
Data
CL50;48h
mg.L
-1
L.S.
mg.L
-1
L.I.
mg.L
-1
X
mg.L
-1
S
C.V.
(%)
20/02/09 0,40 0,51 0,28
13/03/09 0,56 0,74 0,39
22/07/09
0,51 0,63 0,38
0,49 0,20 41,29
LS = limite superior; LI = limite inferior; X = média; S = Desvio padrão;
C.V. = Coeficiente de variação.
O potencial tóxico do cobre é mais elevado do que o do níquel para a Daphnia
similis, chegando a ser aproximadamente 20 vezes mais tóxico que o níquel.
Os resultados obtidos nesse trabalho encontram-se de acordo com outros
estudos que também utilizaram a Daphnia similis como bioindicador. Khangarot e
Ray (1989), utilizando Meio Básico-M4 com dureza de 250 mg.L
-1
em CaCO
3
,
obtiveram CL50;48h igual a 0,54 mg.L
-1
para Cu
2+
. Resultado consistente com o
presente trabalho, que obteve para esse mesmo cátion CL50;48h igual a 0,49 mg.L
-1
em um meio com dureza na faixa entre 180 e 200 mg.L
-1
em CaCO
3
.
Tabela 12 - Valores de CL50;48h calculados pelo programa PROBIT (Finney, 1971)
para o sulfato de níquel (NiSO
4
.6H
2
O) e do intervalo de confiança (95%) em Meio
Básico-M4 frente à Daphnia similis.
Data
CL50;48h
mg.L
-1
L.S.
mg.L
-1
L.I.
mg.L
-1
X
mg.L
-1
S
C.V.
(%)
13/03/09 9,41 11,40 7,71
27/03/09 9,17 11,18 7,41
05/04/09 9,48 10,26 6,80
9,35 0,16 1,74
LS = limite superior; LI = limite inferior; X = média; S = Desvio padrão;
C.V. = Coeficiente de variação.
Por sua vez, Mount e Norberg (1984)
e Elnabarawy e Robideu (1986),
utilizando um meio com dureza menor, 45 a 80 mg.L
-1
em CaCO
3
, obtiveram
resultados iguais a 0,054 mg.L
-1
e 0,041 mg.L
-1
de cobre, respectivamente. As
61
diferenças obtidas entre esses dois grupos de autores podem ser baseadas na
dureza da água, pois esta propriedade afeta de forma significativa a toxicidade do
metal utilizado, sendo que quanto maior a dureza, menor a toxicidade apresentada.
O efeito da dureza sobre a toxicidade de Cu
2+
e Cr
6+
foi observado por Park e
colaboradores
(2009), onde o valor de CL50 para o Cu
2+
foi aumentado ligeiramente
(de 0,006 para 0,028 mg.L
-1
) com dureza crescente. Isto está de acordo com o
trabalho de Long e colaboradores (2004), que mostrou que a baixa dureza afeta a
toxicidade do Cu
2+
para Daphnia similis.
Em estudos ecotoxicológicos, a dureza da água do meio de cultivo utilizado é
um importante fator que pode afetar a toxicidade de alguns químicos, principalmente
metais, tais como o cobre, o zinco, o cromo e o mercúrio
(SPRAGUE, 1985).
Uma provável explicação para a toxicidade diminuir em função do aumento da
dureza do meio decorre do fato de que cátions responsáveis pela dureza da água,
como o Ca
2+
e o Mg
2+
, diminuem a toxicidade através da concorrência com os
metais tóxicos.
Resultados semelhantes foram obtidos para o níquel. Deleebeeck e
colaboradores (2008) constataram que a dureza afeta diretamente a toxicidade para
esse cátion. Em meios com a dureza variando entre 50 a 325 mg.L
-1
de CaCO
3
obteve-se CL50;48h variando entre 1,82 a 5,50 mg.L
-1
para a Daphnia magna.
De acordo com Yim (2005), os resultados de CL50 são afetados de acordo
com a dureza apresentada pela água. A partir de bioensaios, o autor obteve os
valores de 3, 4, 95 e 300 µg.L
-1
para cádmio, cobre, chumbo e zinco em água mole
(45 a 80 mg.L
-1
) e de 4, 12, 894 e 1290 µg.L
-1
em águas duras (acima de 80 mg.L
-1
),
respectivamente.
Yim (2005) atribui esse fato a influência da permeabilidade da membrana
biológica, devido à mudança de dureza, resultando em um aumento do fluxo de íons
metálicos conforme a concentração de cálcio diminui.
Part et al. (1985) também demonstraram que uma diminuição de íons de
cálcio levou a um aumento do fluxo do cádmio. Muitos estudos têm demonstrado
que a toxicidade dos metais é afetada pelas interações de misturas com os sítios de
ligação de organismos (OTITOLOJU, 2003). Portanto, é evidente que a dureza é um
fator importante para a toxicidade do metal e devem ser considerados na
determinação dos valores de CL50 (YIM, et al., 2005)
62
Uma grande diferença de CL50;48h ocorre quando comparamos o potencial
tóxico do cobre com o níquel. Este resultado pode ser devido a maior tolerância
desta espécie ao níquel.
Quando ocorre a mistura dos sais de metais, podemos notar que o potencial
tóxico do cobre prevalece sobre a do níquel, obtendo um valor de CL50 muito
próximo com o valor obtido somente com a solução de sulfato de cobre, conforme
apresentado na Tabela 13.
Tabela 13 - Valores de CL50;48h calculados pelo programa PROBIT (Finney, 1971)
para a mistura de sulfato de níquel e sulfato de cobre (1:1 em razão mássica) e do
intervalo de confiança (95%) em Meio Básico-M4 frente à Daphnia similis.
Data
CL50;48h
mg.L
-1
L.S.
mg.L
-1
L.I.
mg.L
-1
X
mg.L
-1
S C.V.
30/04/09 0,69 0,86 0,55
07/07/09 0,69 0,89 0,55
15/07/09 0,71 0,80 0,59
0,70 0,01 1,52
LS = limite superior; LI = limite inferior; X = média; S = Desvio padrão;
C.V. = Coeficiente de variação.
Em estudos com misturas de metais essenciais (cobre, níquel e zinco) e não
essenciais (cádmio e chumbo), Komjarova et al. (2008) constataram que o cádmio e
o cobre apresentaram um bloqueio sobre as taxas de absorção de todos os outros
metais presentes na mistura. Esses autores mostraram que as interações metálicas
são significativas e ocorrem em baixas concentrações e que o cobre é o metal que
mais afeta a absorção dos outros metais, principalmente a do níquel, que quanto
maior a concentração do cobre, menor é a absorção do níquel, fato este que justifica
a maior toxicidade do cobre em relação ao níquel.
Assim como apresentou Komjarova et al. (2008), nos testes com interação de
metais, o cobre suprimiu os efeitos do demais metais presentes no meio, pois
apresenta uma toxicidade muito alta. Como a toxicidade do cobre é muitas vezes
maior do que a toxicidade do níquel e a absorção do cobre pela D. similis pode ser
maior, quando ocorre a mistura desses dois sais, o cobre afeta primeiro o
organismo, levando-o a morte e/ou imobilidade.
63
Em relação à toxicidade de misturas como, por exemplo, efluentes industriais,
os efeitos resultantes das interações de seus constituintes podem ser classificados
em: aditivos, sinérgicos e antagônicos. O efeito é aditivo quando a toxicidade da
mistura é igual à soma das toxicidades individuais de seus componentes. Quando a
toxicidade de uma mistura é maior que a soma das toxicidades dos seus
constituintes há um efeito sinérgico e quando a toxicidade da mistura é menor que a
soma das toxicidades de seus componentes, há um efeito antagônico (JAMES,
2000). No presente trabalho podemos sugerir que há um efeito antagônico, pois
quando há a mistura dos metais, o valor de CL50;48h é de 0,70 mg.L
-1
, sendo menor
que a soma das toxicidade dos componentes que é de 9,84 mg.L
-1
.
A ocorrência desses efeitos depende dos modos de interação entre os
constituintes da mistura e o sítio alvo no organismo. Quatro tipos de interações são
possíveis: os constituintes da mistura afetam a mesma função fisiológica; uma
interação química entre os constituintes da mistura afeta a toxicidade de um dos
compostos; a absorção, o metabolismo, a distribuição ou a excreção de um
constituinte sofre alteração provocada pelos demais constituintes da mistura e, há
uma competição entre os constituintes da mistura pelo mesmo tecido receptor
(BAIRD, 1989).
3.3 Ensaios de toxicidade aguda dos metais complexados com EDTA frente
à Daphnia similis
3.3.1 Testes preliminares
Os ensaios preliminares de toxicidade aguda dos metais complexados com
EDTA utilizando a Daphnia similis como bioindicador foram sendo ajustados a partir
das concentrações utilizadas apresentadas na Tabela 14 e 15.
64
Tabela 14 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares de toxicidade aguda
utilizando o complexo de EDTA com o sulfato de cobre.
Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
0,0 0 0,0 0 0,0 0
10,0 6,6 6,0 0 9,0 0
15,0 100 10,0 0 11,0 20
20,0 100 14,0 100 13,0 80
25,0 100 18,0 100 15,0 100
30,0 100 22,0 100 17,0 100
35,0 100 - - - -
M = Mortalidade e/ou imobilidade dos organismos
Tabela 15 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares de toxicidade aguda
utilizando o complexo de EDTA com o sulfato de níquel.
Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
0 0 0,0 0 0 0
5 0 15 0 20 0
10 0 25 6,6 30 40
20 13,3 35 53,3 40 73,3
40 86,6 45 73,3 50 80
80 100 55 93,3 60 93,3
160 100 65 100 - -
M = Mortalidade e/ou imobilidade dos organismos
65
3.3.2 Testes definitivos
Os ensaios realizados com solução de EDTA indicaram que esse composto
não apresenta toxicidade para a Daphnia similis, pois nos ensaios realizados não se
verificou mortalidade dos organismos até um valor de 500 mg.L
-1
. Esse valor foi
determinado aleatóriamente, sendo que na ficha de segurança do produto utilizado,
o EDTA apresentou um valor de CL50 para ratos acima de 2.000 mg.L
-1
e não
apresenta valores de toxicidade para microcrustáceos, que é o caso da Daphnia
similis, organismo utilizado neste estudo. Como esse valor de concentração de
EDTA não seria atingido nos ensaios dos metais complexados, optamos por parar
de testar com concentrações maiores, afinal, o EDTA sozinho, não afeta a
mortalidade dos bioindicadores. Essa afirmação não sugere que o EDTA não seja
tóxico em concentrações maiores que 500 mg.L
-1
.
Com base nos resultados obtidos a partir dos ensaios preliminares de
toxicidade aguda, os ensaios definitivos foram feitos em triplicatas com as
concentrações apresentadas na Tabela 16.
Tabela 16 - Concentrações definitivas utilizadas nos testes de toxicidade aguda dos
compostos metálicos e seus complexos frente à Daphnia similis.
Solução Concentração (mg.L
-1
)
CuSO
4
.5H
2
O e EDTA (1:1) 0,0 9,0 11,0 13,0 15,0 17,0
NiSO
4
.6H
2
O + EDTA (1:1) 0,0 20 30 40 50 60
Na presença do agente quelante, ocorre a complexação dos metais,
diminuindo a quantidade de íons livres dos metais, e assim diminuindo o seu
potencial tóxico.
Os valores de CL50 para os metais complexados com EDTA estão
apresentados na Tabela 17 e 18.
66
Tabela 17 - Valores de CL50;48h calculados para o sulfato de cobre complexado
com EDTA em Meio Básico-M4 frente à Daphnia similis.
Data
CL50;24h
mg.L
-1
L.S.
mg.L
-1
L.I.
mg.L
-1
X
mg.L
-1
S
C.V.
(%)
07/07/09 11,94 12,61 11,23
22/07/09 12,77 12,90 11,41
27/07/09 12,01 12,75 22,38
12,24 0,46 2,78
LS = limite superior; LI = limite inferior; X = média; S = Desvio padrão;
C.V. = Coeficiente de variação.
Tabela 18 - Valores de CL50;48h calculados para o sulfato de níquel complexado
com EDTA em Meio Básico-M4 frente à Daphnia similis.
Data
CL50;24h
mg.L
-1
L.S.
mg.L
-1
L.I.
mg.L
-1
X
mg.L
-1
S
C.V.
(%)
01/07/09 36,16 40,17 31,75
07/07/09 33,69 38,48 28,60
15/07/09 34,12 37,67 32,10
34,66 1,32 3,81
LS = limite superior; LI = limite inferior; X = média; S = Desvio padrão;
C.V. = Coeficiente de variação.
Nos ensaios empregando o EDTA, constatou-se um aumento do valor da
CL50, comparando-os com os valores de CL50 obtidos nos experimentos anteriores
deste trabalho, ou seja, para cada solução de metal testada e também com suas
misturas. A toxicidade do cobre sofreu um decaimento de aproximadamente 25
vezes quando complexado com EDTA. Já o níquel apresentou uma toxicidade 3,5
vezes menor quando misturado ao agente quelante.
Sorvari (1986) constatou que com a presença de EDTA, a toxicidade de
metais diminui drasticamente. De acordo com os valores de CL50;24h para Daphnia
magna utilizando o Fe
3+
, Cu
2+
, Mn
2+
, Zn
2+
, Cd
2+
e Hg
2+
, complexados com EDTA, a
ordem de toxicidade dos metais é: Hg
2+
>Cu
2+
>Cd
2+
>Zn
2+
>Fe
3+
>Mn
2+
. Após a
complexação, os efeitos tóxicos dos metais diminuíram, por exemplo, como o do
cobre que teve um decaimento de até 1.700 vezes, apresentando um valor de
CL50;48h para o íon livre de 0,022 e de 38 mg.L
-1
quando complexado.
67
3.4 Ensaios de toxicidade aguda da mistura dos metais complexados com
EDTA em diferentes proporções frente à Daphnia similis.
3.4.1 Testes preliminares
Quando misturadas as soluções de metais tóxicos complexados, o potencial
tóxico sofre uma mudança. Nos ensaios preliminares foram testados as
concentrações apresentadas na Tabela 19, 20 e 21.
Essas concentrações foram escolhidas aleatoriamente a partir dos ensaios
realizados anteriormente sem a mistura. A partir dos ensaios realizados, as
concentrações foram sendo definidas com concentrações em que não há
mortalidade e concentrações em que há 100% de mortalidade dos organismos
testados.
Tabela 19 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares utilizando o complexo
de EDTA com a mistura de sulfato de cobre e sulfato de níquel, na razão mássica de
1:1:1.
Ensaio 1 Ensaio 2
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
0,0 0 0,0 0
0,5 6,3 0,5 3,3
1,0 100 0,7 40
1,5 100 0,9 93,3
2,0 100 1,0 100
4,0 100 1,2 100
M = Mortalidade e/ou imobilidade dos organismos
68
Tabela 20 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares utilizando o complexo
de EDTA com a mistura de sulfato de cobre e sulfato de níquel, na razão mássica de
1:1:3.
Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
0,0 0 0,0 0 0,0 0
0,1 3,3 0,8 0 1,8 0
0,5 0 1,6 13,3 2,1 26,6
1,0 3,3 2,0 33,3 2,4 53,3
3,0 100 2,4 93,3 2,7 86,6
5,0 100 3,2 100 3,0 100
M = Mortalidade e/ou imobilidade dos organismos
Tabela 21 - Concentrações testadas nos ensaios preliminares utilizando o complexo
de EDTA com a mistura de sulfato de cobre e sulfato de níquel, na razão mássica de
1:1:6.
Ensaio 1 Ensaio 2
Conc.
mg.L
-1
M
%
Conc.
mg.L
-1
M
%
0,0 0 0,0 0
0,5 0 1,0 0
1,0 0 5,0 20
1,5 0 10,0 53,3
2,5 0 15,0 73,3
3,0 0 20,0 100
5,0 0 35,0 100
M = Mortalidade e/ou imobilidade dos organismos
69
3.4.2 Testes definitivos
As concentrações apresentadas na Tabela 22, foram usadas nos ensaios de
toxicidade definitivos e foram obtidas a partir dos ensaios preliminares.
Nessa mistura, a concentração apresentada refere-se a concentração de
cada composto contido na mistura, considerando-se a razão mássica de cada
ensaio.
Tabela 22 - Concentrações definitivas utilizadas nos testes de toxicidade aguda com
complexos de metais e EDTA em diferentes proporções.
Solução Concentração (mg.L
-1
)
CuSO
4
.5H
2
O, NiSO
4
.6H
2
O e EDTA (1:1:1) 0,0 0,5 0,7 0,9 1,0 1,5
CuSO
4
.5H
2
O, NiSO
4
.6H
2
O e EDTA (1:1:3) 0,0 1,8 2,2 2,6 2,8 3,2
CuSO
4
.5H
2
O, NiSO
4
.6H
2
O e EDTA (1:1:6) 0,0 4,0 8,0 12,0 16,0 20,0
O potencial tóxico da mistura dos metais com diferentes massas do quelante,
apresentou variações no valor da CL50;48h, conforme apresentado na Tabela 23, 24
e 25.
Tabela 23 - Valores de CL50;48h calculados para a solução da mistura dos metais
complexados com EDTA na proporção de 1:1:1.
Data
CL50;24h
mg.L
-1
L.S.
mg.L
-1
L.I.
mg.L
-1
X
mg.L
-1
S
C.V.
(%)
22/07/09 0,70 0,76 0,62
23/07/09 0,63 0,70 0,59
15/08/09 0,66 0,72 0,58
0,66 0,05 7,71
LS = limite superior; LI = limite inferior; X = média; S = Desvio padrão;
C.V. = Coeficiente de variação.
70
Tabela 24 - Valores de CL50;48h calculados para a solução da mistura dos metais
complexados com EDTA na proporção de 1:1:3.
Data
CL50;24h
mg.L
-1
L.S.
mg.L
-1
L.I.
mg.L
-1
X
mg.L
-1
S C.V.
15/08/09 2,00 2,14 1,83
16/09/09 2,33 2,45 2,20
24/09/09 1,84 1,96 1,63
2,05 0,25 12,02
LS = limite superior; LI = limite inferior; X = média; S = Desvio padrão;
C.V. = Coeficiente de variação.
Tabela 25 - Valores de CL50;48h calculados para a solução da mistura dos metais
complexados com EDTA na proporção de 1:1:6.
Data
CL50;24h
mg.L
-1
L.S.
mg.L
-1
L.I.
mg.L
-1
X
mg.L
-1
S
C.V.
(%)
28/10/09 8,80 11,16 6,29
05/11/09 9,21 12,36 7,29
15/11/09 8,57 11,94 8,01
8,86 0,32 3,66
LS = limite superior; LI = limite inferior; X = média; S = Desvio padrão;
C.V. = Coeficiente de variação.
No presente trabalho, o potencial tóxico da mistura dos metais com diferentes
quantidades do agente complexante demonstrou variações no valor da CL50;48h, de
modo que a mistura na proporção mássica 1:1:1 apresentou maior toxicidade e a de
proporção 1:1:6 a menor toxicidade. Essa diferença é resultado do excesso de metal
livre ou agente complexante no meio.
No ensaio na proporção 1:1:3 foi alcançado o equilíbrio estequiométrico entre
os componentes, de forma que, possivelmente, ocorreu a total complexação dos
metais. Quando aumentou-se a quantidade de EDTA no meio, na proporção 1:1:6, a
toxicidade diminuiu ainda mais. Por fim, para a mistura de níquel e cobre, na
proporção mássica de 1:1:6, a toxicidade diminuiu aproximadamente 3 vezes.
Podemos notar que a toxicidade apresentada na mistura (1:1:1) é superior a
apresentada na mistura (1:1:3). Essa diferença obtida é resultante do excesso de
metal livre na solução, provavelmente, o cobre colaborando para a maior toxicidade,
por apresentar um potencial tóxico maior, não havendo quelante suficiente para a
sua total complexação.
71
Já na mistura (1:1:3), em que há um equilíbrio estequiométrico entre as
massas, onde possivelmente, há a total complexação, a toxicidade diminui, deixando
menos metais disponíveis para o organismo. Quando a proporção de EDTA
aumenta, ficando 1:1:6, a toxicidade diminui ainda mais. Isso pode estar ocorrendo
pelo fato do EDTA em excesso estar se complexando com o cálcio e o magnésio,
sendo filtrado pela D. similis, causando algum efeito benéfico para ela, ou até
mesmo auxiliando a excreção desses metais no organismo.
A toxicidade dos metais e complexos estudados demonstraram toxicidades
diferentes, apresentadas em ordem decrescente Cu > Cu+Ni+Edta (1:1:1) > Cu+Ni >
Cu+Ni+Edta (1:1:3) > Cu+Ni+Edta (1:1:6) > Ni > Cu+Edta > NI+Edta.
Keithly et al. (2004) demonstrou o efeito protetor da dureza (Ca e Mg
combinado) sobre a toxicidade de Ni para as daphnias. O efeito protetor do Mg é
mais provável, devido à seu papel fundamental no mecanismo de toxicidade do
níquel. Pane et al. (2003) demonstrou que a exposição aguda ao níquel reduz a
concentração de magnésio no organismos. Com isso, a absorção de níquel é
compartilhada com a nova absorção de magnésio do meio para manter sua
concentração interna. Esse processo só é possível porque o níquel e o magnésio
possuem os raios iônicos semelhantes, facilitando assim a sua absorção através da
membrana.
Já para o cálcio, ocorre também a proteção contra a toxicidade, segundo
Deleebeeck (2007), deve-se principalmente à sua função na regulação da
permeabilidade membrana. Através de seu reforço nas junções celulares, o cálcio
pode proteger contra a toxicidade dos metais indiretamente, dificultando o refluxo do
magnésio através desses canais bloqueados. Apesar do magnésio também proteger
dessa forma, bloqueando os canais, Schwartz e Playle (2001) sugere que esse
mecanismo seja mais fraco do que o causado pelo cálcio.
72
4 CONCLUSÕES
Em um estudo de toxicidade, as interações do metal com o organismo-teste
são influenciadas pela espécie testada, pela combinação dos metais ou pela
composição do meio aquoso. Os dados gerados neste estudo reiteram os resultados
de estudos precedentes que relataram efeitos de metais e suas misturas em
espécies aquáticas mesmo quando as concentrações individuais do metal estão em
concentrações aceitáveis máximas ou estão em concentrações não perceptíveis
para efeito tóxico.
O íon cobre apresentou um valor médio de CL50;48h de 0,49 mg.L
-1
, sendo
superior ao apresentado pelo níquel que foi de 9,35 mg.L
-1
. Já na mistura desses
dois íons, prevaleceu o resultado obtido para o cobre, decorrente de seu maior
potencial tóxico para a espécie utilizada.
A complexação dos metais reduziu significativamente o potencial tóxico dos
metais, obtendo uma redução de aproximadamente 25 e 4 vezes para o cobre e
para o níquel, respectivamente.
A Daphnia similis demonstrou ser um bom bioindicador de poluição aquática,
proporcionando resultados de toxicidade compatíveis com dados presentes na
literatura e por ser um organismos de fácil adaptação e cultivo. Com estes
resultados, é possível identificar problemas de lançamento de substâncias tóxicas,
determinar prioridades de controle em regiões críticas, viabilizar ações corretivas
apropriadas, e ainda, monitorar o ecossistema aquático, tendo em vista os usos
predominantes das águas.
Cabe ressaltar que o uso de estudos ecotoxicológicos são utilizados,
padronizados e recomendados por várias instituições de análise ambiental, inclusive
em nível internacional.
Com este estudo é possível ainda prever o potencial tóxico dos metais
estudados, complexados ou não, que poderia ser encontrado na água após o
tratamento da água de efluentes, nos casos em que a separação de membrana não
seja 100% eficiente, causando um impacto aos organismos presentes no local de
despejo.
73
APÊNDICE – Ficha controle dos teste de toxicidade aguda para Daphnia spp.
TESTE DE TOXICIDADE AGUDA COM DAPHNIA
Espécie:
( ) preliminar ( ) definitivo
Teste número:
Produto usado: Concentração inicial (mg/L):
Inicio do teste Término do teste Água do meio
Data:
hora:
Data:
hora:
( ) M4 ( ) natural
Características do meio de cultivo
Dureza total
(mg Ca CO3/L)
pH Condutividade (µS/cm) O.D. (mg O2/L)
TEMPERATURA
inicio (°C): final (°C): máx. (°C): min. (°C):
Resultado do teste
N° de organismos
imóveis por replicas
N° acumulo de
organismos
%
imóveis
Medidas finais Concentração
nominal
(mg/L)
1 2 3
Imóveis Total O.D. pH
Controle
CE (I)
50
:
Método estatístico empregado:
Teste ( ) 24h ( ) 48h
Observações:
Operador (es) do teste
Adição de organismos: Leitura:
74
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