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SILVIA TAVARES DONATO
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS CONVENCIONAIS E
SEMI-AUTOMATIZADOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE
Enterococcus spp.FRENTE À BIOLOGIA MOLECULAR
EM IDENTIFICAÇÕES DISCREPANTES
FORTALEZA / CE
2007
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
FACULDADE DE MEDICINA
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA
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COMPARAÇÃO DE MÉTODOS CONVENCIONAIS E
SEMI-AUTOMATIZADOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE
Enterococcus spp.FRENTE À BIOLOGIA MOLECULAR
EM IDENTIFICAÇÕES DISCREPANTES
FORTALEZA / CE
2007
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia Médica da
Faculdade de Medicina da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Microbiologia
Médica.
Orientador:
Prof. Dr. José Júlio Costa Sidrim
Orientanda:
Silvia Tavares Donato
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE MESTRADO EM MICROBIOLOGIA
MÉDICA
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS CONVENCIONAIS E SEMI-AUTOMATIZADOS
PARA IDENTIFICAÇÃO DE Enterococcus spp.FRENTE À BIOLOGIA MOLECULAR
EM IDENTIFICAÇÕES DISCREPANTES
SILVIA TAVARES DONATO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Médica da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Microbiologia Médica.
Data da Aprovação: ___ / ___ / ____
BANCA EXAMINADORA:
____________________________________________
Orientador (Presidente)
Prof. Dr. José Júlio Costa Sidrim
Universidade Federal do Ceará
_____________________________________________
Prof(a). Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira
Universidade Estadual do Ceará
_____________________________________________
Prof(a). Dra. Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante
Universidade Federal do Ceará
_____________________________________________
Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Universidade Estadual do Ceará
4
AGRADECIMENTOS
Expresso agradecimentos a todos os que, direta ou indiretamente, contribuíram para a
feitura desta dissertação e para a realização do mestrado.
Ao Professor Doutor José Júlio da Costa Sidrim, por sua paciência, orientação,
compreensão, questionamentos, recomendações e apoio para a realização deste trabalho.
À amiga, presente em todos os momentos, Aline Mirreile da Cunha Fiévez, pela ajuda,
recomendações e apoio na execução desta pesquisa.
Aos colegas bioquímicos, companheiros de trabalho do Hospital Geral Dr. César Cals,
pelo apoio e auxílio recebidos nos momentos das dificuldades.
Áos técnicos de laboratório Maria de Lourdes Sousa Coelho, Luciana Sousa Coelho,
Tereza de Jesus Santos Rodrigues, José Olavo Morais, José Everardo Araújo de Sousa pelo
auxílio, presteza, atenção e gentileza.
À Marta Vasconcelos, secretária do Mestrado em Microbiologia Médica, por toda
atenção e gentileza.
Aos colegas da turma 2005.01 do mestrado em Microbiologia Médica, pelo
companheirismo e incentivo.
Aos colegas Alexandre Rocha Matos Júnior, Jones Barbosa Lima Neto e Joyce Fonteles
Ribeiro, sempre presentes nos laboratórios da Microbiologia, pela presteza, gentileza e auxílio
nos momentos de dificuldades.
Às prof (as). Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante e Rossana de Aguiar Cordeiro, do
Centro Especializado em Micologia Médica, pelas orientações, acompanhamento, presteza e
gentileza para a execução de procedimentos.
À Dra. Vaulice Café pela gentileza e presteza na cedência de cepas bacterianas.
Ao CNPq, pelo apoio financeiro disponibilizado para a execução do presente experimento.
5
Existe uma coisa mais poderosa do que todos os exércitos:
uma idéia cujo tempo é chegado.
VICTOR HUGO
6
RESUMO
Os Enterococcus são cocos Gram-positivos catalase-negativos, habitantes do trato gastrintestinal
e geniturinário. São identificados por meios manuais baseados no clássico de Facklam, por
sistemas semi-automatizados, automatizados e por Biologia Molecular. Em vista da diversidade
de métodos de identificação e com o intuito de se verificar a concordância entre alguns métodos,
foi realizada identificação de 62 cepas bacterianas, advindas da coleção do Centro Especializado
em Micologia Médica (CEMM) da Universidade Federal do Ceará, Brasil, presumidamente
identificadas como Enterococcus sp. e Enterococcus faecalis pelo esquema de Facklam. Este
estudo iniciou-se com a identificação por três métodos manuais: esquema de facklam e dois
modificados deste - Modificado 1 e Modificado 2 - e semi-automatizado – API 20 Strep. Para a
definição de resultados discordantes, recorreu-se ao semi-automatizado – BBL – e à Biologia
Molecular – PCR. O esquema de Facklam identificou 16% (10) como cepas do gênero
Enterococcus sp. e 84% (52) como E. faecalis. O esquema Modificado 1 apresentou a seguinte
identificação: 82,2% (51) E. faecalis, 9,7% (6) E. mundtii, e 8,1% (5) E. gallinarum. O
Modificado 2 identificou 98,4% (61) E. faecalis e 1,6% (1) E. gallinarum. O API 20 Strep
identificou 51,6% (32) E. faecalis, 19,4% (12) A viridans, 13,0% (8) E. avium, 4,8% (3) S.
agalactiae, 3,2% (2) E. faecium, 1,6% (1) S. acidominimus, 1,6% (1) Leuconoctocc sp., 1,6% (1)
S. uberis, 1,6% (1) A. adiacens e 1,6% (1) Inaceitável. Foram selecionadas 10 amostras (cepas
n°
s
05, 13, 15, 20, 27, 31, 32, 33, 50 e 60), que apresentaram resultados discordantes entre os
sistemas Modificado 1, Modificado 2 e API 20 Strep para serem identificadas pelo BBL Crystal
e por PCR. O BBL identificou 6 amostras como E. faecium, inclusive a cepa-controle E. faecalis
ATCC 29212 e não identificou 4 amostras. Na PCR, uma amostra não amplificou e 9 foram
identificadas como Streptococcus spp.. Uma amostra apresentou-se positiva para o gênero
Enterococcus, mas não para a espécie E. faecalis e 1 (uma) amplificou para a espécie S.
agalactiae. Nenhuma das amostras se apresentou positiva para a espécie E. gallinarum. A
amostra-controle – E. faecalis ATCC 29212 - foi amplificada corretamente. Com a análise dos
resultados, verificou-se que houve concordância de identificação das 62 cepas em 84% das
amostras entre os sistemas manuais (Facklam, Modificado 1 e Modificado 2) e em 52% das
amostras entre os sistemas manuais e semi-automatizado (API 20 Strep). Nas 10 amostras com
resultados discrepantes, não houve concordância de identificação entre os sistemas manuais, API
20 Strep e o BBL. A PCR concordou com os sistemas manuais e o BBL e foi discordante do API
20 Strep, em gênero, em 01 amostra. Correlacionando a PCR com o API 20 Strep, houve
concordância, em gênero, em 01 amostra e foi discordante dos demais sistemas. Para aumentar a
sensibilidade de identificação de Enterococcus spp. devem ser utilizados pelo menos dois
métodos com testes fenotípicos. Amostras com identificações discordantes devem ser
reidentificadas por PCR.
Palavras-chave: Estrepto-Enterococos, Enterococos, API 20 Strep, BBL Crystal, PCR
7
ABSTRACT
The Enterococcus are Gram-positive cocci catalase negative - which inhabit the gastrointestinal,
and genitourinary tract. They are identified manually and the procedure is based on the classic of
Facklam, by semi-authomatized and automatized systems as well as by Molecular Biology. Due
to the diversity of identification methods and aiming to verify the concordance among some
methods, it was accomplished the identification of 62 bacteria strains proceeding from the
collection of the Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM) of the Federal University
of Ceará, in Brazil. They were presumably identified as Enterococcus sp. e Enterococcus
faecalis by the Facklam scheme. This study was begun with the identification for two manual
methods, modified from the Facklam scheme – Modified 1 and Modified 2- and semi-
automatized – API 20 Strep. For the inconsistent results definition we used the semi-automatized
– BBL and the Molecular Biology- PRC. The Franklin scheme identified 16% (10) as strains of
the genre Enterococcus sp. and 52% (84) as E. faecalis. The Modified Scheme 1 presented the
following identification: 82, 2% (51) E. faecalis, 9, 7% (6) E. mundtii and 8, 1% (5) E.
gallinarum. The Modified 2 identified 98, 4% (61) E. faecalis and 1, 6% (1) E. gallinarum. The
API 20 Strep identified 51,6% (32) E. faecalis, 19,4% (12) A viridans, 13,0% (8) E. avium, 4,8%
(3) S. agalactiae, 3,2% (2) E. faecium, 1,6% (1) S. acidominimus, 1,6% (1) Leuconoctocc sp.,
1,6% (1) S. uberis, 1,6% (1) A. adiacens and1,6% (1) unacceptable. It was made the selection of
10 sample (strains), among them, the ones numbered (05, 13, 15, 20, 27, 31, 32, 33, 50 and 60),
which presented discordant results among the systems Modified 1, Modified 2 and API 20 Strep
to be identified by BBL Crystal and by PCR. The BBL identified 6 samples as E. faecium,
including the control- strain E. faecalis ATCC 29212 and did not identify 4 samples. In the PCR,
one sample did not amplify and 9 were identified as Streptococcus spp. One sample was
identified as positive for the genre Enterococcus, but it did not for the species E. faecalis and 1
(one) was amplified for the species S. agalactiae. None of the samples presented were positive
for the species E. gallinarum. The control-sample – E. faecalis ATCC 29212 – was correctly
amplified. With the analysis of the results, it was noticed that there was identification
concordance of the 62 strains in 84% of the samples among the manual systems (Facklam,
Modified 1 and Modified 2) and in 52% of the samples among the manual and semi-automatized
systems (API 20 Strep). In 10 samples with disagreeing results there was no identification
concordance among the manual systems, API 20 Strep and the BBL. A PCR agreed with the
manual systems and the BBL and did not agree with the API 20 step, in genre, in one sample.
Correlating the PCR with the API 20 Strep, there was agreement, in genre, in 01 sample and
disagreement with the other systems.
Key-words: Strepto-Enterococcus, Enterococcus, API 20 Strep, BBL Crystal, PCR
8
LISTA DE FIGURAS
21
22
23
29
30
30
31
32
33
33
39
9
LISTA DE QUADROS
23
28
35
10
LISTA DE TABELAS
37
38
40
41
42
43
44
45
47
47
11
LISTA DE ABREVIATURAS
µL – microlitro
4MU – 4 - metilumbeliferona
7AMC – 7 – amino-4-metilcumarina
A. viridans – Aerococcus viridans
ADH – arginina
AMD – amido
ARA – arabinose
ATCC – American Type Culture Colection
BHI – Brain Heart Infusion
CCIH – Comissão de Controle de Infecção Hospitalar
CDC – Centers for Disease Control and Prevention
CEMM – Centro Especializado em Micologia Médica
COLS – colaboradores
CPN60 – proteína 60 de choque de calor
DNA – ácido desoxirribonucléico
dNTP – oligonucleotídeos
ESC – esculina
EUA – Estados Unidos da América
GLIG – glicogênio
HIP – ácido hipúrico
HSP – proteína 60 de choque de calor
INU – inulina
L. garvieae – Lactococcus garvieae
LAC – lactose
LACT – lactose
LAP – leucina aminopeptidase
MAN – manitol
MgCl – cloreto de magnésio
mL – mililitro
mM – micromol
NaCl – cloreto de sódio
NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards
12
ng – nanograma
PAL – fosfato alcalina
PCR – reação em cadeia da polimerase
PFGE – pulsed-field gel electrophoresed
pmol – picomol
PYR – PYrrolidonil arilamidase
PYRA – PYrrolidonil arilamidase
RAF – rafinose
RIB – ribose
RNA – ácido ribonucléico
rRNA – RNA ribossômico
SOR – sorbitol
SUBSP – subespécie
TE – tris EDTA
TRE – trealose
UNIFESP – Universidade Federal de São Paulo
UTI – Unidade de Terapia Intensiva
var – variante
VP – Voges Proskauer
VRE – enterococo resistente a vancomicina
α Gal – α galactosidade
β Gal – β Galactosidade
β Gur – β giucuronidase
13
SUMÁRIO
15
15
18
19
20
21
24
24
25
26
27
27
27
28
28
28
28
29
29
32
34
34
34
35
35
14
36
36
38
42
45
48
53
54
61
84
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos Históricos
O termo "enterococo" foi usado pela primeira vez em 1899 por microbiologistas franceses,
que escolheram este nome para enfatizar a origem intestinal deste microrganismo Gram-positivo
e o incluiram no gênero Streptococcus. O nome Streptococcus faecalis foi citado em 1906, por
Andrewes e Horder, ao descreverem um organismo isolado do sangue de um paciente com
endocardite e considerado "característico" do intestino humano
.
Naquela década, vários autores
estudaram e escreveram sobre esses isolados, referindo-os como S. faecalis, mas, em 1919, Orla-
Jensen usou outra terminologia, com a qual descreveu cepas de Streptococcus glycerinaceus e
Streptococcus faecium. Por cerca de 20 anos, esses nomes foram ignorados e todos considerados
como S. faecalis
45,47
.
Em 1930, Sherman correlacionou os Streptococcus com o sistema sorológico, originado
por Lancefield. Nesse sistema, os enterococos reagem com o antisoro do grupo D, enquanto os
outros estreptococos reagem com anti-soros do grupo A, B, C, E, F, ou G, exceção esta feita aos
Streptococcus viridans e Streptococcus pneumoniae. Dentro do grupo enterococos, Sherman
reconheceu como espécies de enterococos, S. faecalis, Streptococcus liquefaciens, Streptococcus
zymogenes e Streptococcus durans. Em razão da similaridade entre as três primeiras espécies
citadas, porém, ele sugeriu uma terminologia mais apropriada: S. faecalis (hemólise e proteólise
negativa), S. faecalis var. liquefaciens (hemólise negativa e proteólise positiva), S. faecalis var.
zymogenes (hemólise positiva, proteólise positiva), S. faecalis var. hemolyticus (hemólise
positiva, proteólise negativa) e S. durans. Algum tempo depois, demonstrou-se que a hemólise
era mediada por plasmídeos e que podia ser transferida para cepas não hemolíticas, confirmando
a inapropriedade de se utilizar esta característica para distinguir espécies. Em 1937, Sherman
propôs um esquema de classificação que separou esse grupo de microrganismos em quatro
divisões: piogênicos, viridans, lácticos e enterococos. O último vocábulo foi usado para
organismos (pelo menos a maior parte) que cresciam entre 10°C e 45°C, na concentração de
6,5% de NaCl e pH 9.6. Ademais, esses microrganismos sobreviviam a 60°C por 30 min e
tinham a habilidade de hidrolisar esculina
47
.
Embora as espécies que Orla-Jensen nomeou, em 1919, como S. glycerinaceus e S. faecium
terem sido consideradas por Sherman como S. faecalis, alguns estudiosos mostraram que o
organismo referido como S. faecium apresentava características bioquímicas que o distinguia do
S. faecalis. Entre estas diferenças estavam incluídas: a inibição por telurito de potássio, reações
de fermentação e falha na redução do tetrazólio. Embora S. faecium não tenha sido reconhecido
16
oficialmente como uma espécie separada pelo Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology,
em 1957, o status da espécie não foi afetado e ele foi incorporado à nomenclatura oficial em
meados de 1960. Durante este período, S. durans foi listado como uma espécie separada e,
algum tempo depois, referida como uma variante do S. faecium
47
.
A motilidade dos enterococos foi percebida em 1935 em cepas de S. faecium, que viriam a
ser conhecidas como S. faecium subsp. mobilis. Em 1950, foi percebida a produção do pigmento
amarelo e em 1968 o nome S. faecium var. casseliflavus foi sugerido. O enterococo isolado de
queijo gouda foi referido, em 1955, como malodoratus em razão do mau odor. Algumas cepas
de enterococos não reagiam somente com o anti-soro do grupo D de Lancefield, mas bem
melhor com o do grupo Q. Por causa destes organismos, semelhantes a enterococos de frangos, a
dicção Streptococcus avium foi proposta em 1967 e reconhecida em 1974 pelo Bergey’s Manual
47
.
Em 1972, estreptococos do grupo D foram definidos como aqueles pertencentes ao
grupo de Lancefield, que apresentavam o polissacarídeo D na parede celular, ou seja, a presença
do ácido teicóico glicerol, associado à parede celular, identificava estas cepas como
estreptococos do grupo D
(13)
. Pelo fato de algumas cepas não reagirem ao anti-soro do grupo D,
foram separadas em estreptococos do grupo D enterococos e não-enterococos
13, 45, 47
.
Na década de 1980, o uso de ácidos nucléicos esclareceu e expandiu o esquema de
classificação dos enterococos. Farrow e cols. apresentaram, em 1983, dados bioquímicos e de
hibridização de DNA que permitiram que S. faecalis, S. faecium, S. casseliflavus, S. avium, S.
durans e S. faecalis var. maloduratus fossem assim distinguidos: “S. faecium var. mobilis” como
S. casseliflavus; S. faecalis e as subespécies liquefaciens e zymogenes em uma só espécie; e que
algumas espécies de enterococos (de frango) do grupo D designados como S. gallinarum fossem
diferenciados de S. avium
47
.
Em 1984, Schleifer e Kilpper-Bälz utilizaram hibridização de DNA-DNA e DNA-rRNA
para demonstrar que S. faecalis e S. faecium estavam cada vez mais distantes do gênero
Streptococcus e propuseram a transferência destas espécies deste gênero para sua colocação
natural no gênero Enterococcus. Assim, as espécies foram designadas como Enterococcus
avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus
faecium, Enterococcus maloduratus e Enterococcus gallinarum
13, 45, 47
.
Esses trabalhos foram
publicados durante a preparação do Bergey’s Manual, de 1984, e o gênero Enterococcus não foi
incorporado à nomenclatura oficial, no entanto, foi citado no Manual e considerado um suporte
para a criação de outro gênero de organismos do grupo dos enterococos. Com os estudos dos
ácidos nucléicos, outras espécies foram propostas para serem incluídas no gênero: Enterococcus
hirae, Enterococcus mundtii, Enterococcus raffinosus, Enterococcus solitarius e Enterococcus
17
pseudoavium
47
. Daí a seguinte lista de espécies de enterococos foi proposta: E. faecalis, E.
faecium, E.durans, E. avium, E. casseliflavus, E. maloduratus, E. gallinarum, E. hirae, E.
mundtii, E. rafinous, E. solitarius e E. pseudoavium
47
- recebendo a seguinte classificação:
família Streptococcaceae, o gênero Enterococcus sendo constituído por dezesseis espécies: E.
avium, E. casseliflavus, E. cecorum, E. columbae, E. díspar, E. durans, E. faecium, E. faecalis,
E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus, E. mundtii, E. pseudoavium, E. raffinosus, E.
saccharolyticus e E. sulfureus
30, 47
. Os E. faecalis e E. faecium se apresentam como as espécies
mais incidentes, responsáveis por cerca de 80 a 90% e 5 a 10%, respectivamente, pela maioria
das infecções humanas. As outras espécies (E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans, E. avium
e E. raffinosis) são menos freqüentemente isoladas, responsáveis por menos de 5% dos achados
clínicos
13, 15, 30
.
Foi divulgada na França em 2006 uma nova constituição do gênero Enterococcus,
conforme está na seqüência.
i) Grupo Avium – Enterococcus avium, Enterococcus devriesei, Enterococcus gilvus,
Enterococcus hermanniensis, Enterococcus maloduratus, Enterococcus pallens,
Enterococcus pseudoavium e Enterococcus raffinosus.
ii) Grupo Cecorum: Enterococcus cecorum e Enterococcus columbae.
iii) Grupo Díspar: Enterococcus díspar, Enterococcus asini e Enterococcus pallens.
iv) Grupo Faecalis: Enterococcus faecalis, Enterococcus haemoperoxydus, Enterococcus
moraviensis e Enterococcus ratti.
v) Grupo Faecium: Enterococcus faecium, Enterococcus canis, Enterococcus durans,
Enterococcus hirae, Enterococcus mundtii e Enterococcus villorum.
vi) Grupo Gallinarum: Enterococcus gallinarum e Enterococcus casseliflavus.
São constituintes de grupos separados as espécies: Enterococcus phoeniculicola,
Enterococcus saccharolyticus e Enterococcus sulfureus. Enterococcus italicus apresentam
semelhança com Enterococcus sulfureus. Uma nova classificação foi sugerida: família
Enterococcaceae; gênero Enterococcus
23
.
18
1.2 Epidemiologia
Os enterococos fazem parte da microbiota normal do trato gastrintestinal do homem e de
outros animais
34
, podendo ainda ser encontrados na cavidade oral, vesícula biliar, uretra e
vagina. No ambiente, podem ser isolados do solo, alimentos e na água
34
. Podem causar
infecções como endocardites, infecções urinárias, infecções intra-abdominais, infecções em
feridas operatórias e bacteremias
15, 17, 29, 57
, sendo o foco inicial da infecção a microbiota do
paciente, bem como o contato destes com pessoas e/ou água e alimentos contaminados
34
. No
ambiente hospitalar, tornou-se patógenos emergentes de controle e erradicação difíceis por parte
das comissões de controle de infecção hospitalar (CCIHs)
60
. A importância destes
microrganismos decorre não somente da sua elevada freqüência em infecções humanas nos
últimos anos
29
, mas também da grande capacidade de disseminação e resistência aos processos
comuns de desinfecção de ambientes
29
, bem como de um variado número de antimicrobianos,
tais como beta-lactâmicos (penicilinas), aminoglicosídeos (gentamicina e estreptomicina) e, mais
recentemente, glicopeptídeos (vancomicina)
11, 34
.
A prevalência dos enterococos é observada em todo o mundo. Em 2005, na China, 396
isolados de enterococos foram assim identificados: E. faecalis 79,8%, E. faecium 11,1%, E.
hirae 3,0%, E. gallinarum 3,0% e E. casseliflavus 3,0%
2
. Em 2005, no norte da Índia, um estudo
demonstrou que num total de 105 espécies de enterococos identificados, 42,9% eram E. faecium
e 40% E. faecalis
46
.
A incidência de enterococos isolados de pacientes em unidade de tratamento intensivo (UTI)
em vários países foi relatada, em 2004, em um estudo sobre resistência emergente entre
patógenos bacterianos em UTIs, utilizando dados de estudo de vigilância norte-americano e
europeu do período entre 2000 e 2004. Entre as amostras dos Estados Unidos da América
(EUA), os enterococos aparecem em sexto lugar, representando 5,4% dos patógenos isolados e,
especificamente, E. faecalis está em oitavo lugar, com a incidência de 3,7% do total de bactérias
isoladas. No Canadá e Alemanha, estão em ambos os países em quinto lugar, porém com a
incidência de 7,6% e 7,4% , respectivamente. E. faecalis aparece, no entanto, em décimo lugar,
com 2,1% no Canadá e em oitavo lugar na Alemanha, com 4,3% de incidência. Na França, E.
faecalis aparece em sétimo lugar, com 3% de incidência, e os enterococos em décimo lugar, com
2,3% de incidência. Na Itália, E. faecalis aparece em quinto lugar, com 3,9% de incidência e os
enterococos em sétimo lugar, com 3,3% de incidência
1
.
Outra pesquisa, na França, em 2003, mostrou os enterococos apresentando a seguinte ordem
de incidência: 79,6% E. faecalis, 13,0% E. faecium, 6,0% E. durans e 1,4% E. avium
36
. Nos
19
EUA, em 2004, foram isoladas 185 cepas de enterococos, 52% (97) das quais eram E. faecium,
21% (38) E. faecalis e 27% (50) outras espécies de enterococos
38
.
No Brasil, em 2003, um estudo em São Paulo, determinando a prevalência bacteriana de
infecções urinárias hospitalares em 188 pacientes encontrou 11% de enterococos
18
. Em 2004,
dois hospitais de Brasília isolaram 99 enterococos de swab retal de pacientes em unidades de
terapia intensiva (UTIs), tendo sido identificados por testes bioquímicos como 76% E. faecalis,
9% E. faecium e 15% outras espécies (E. hirae, E. raffinosus, E. gallinarum, E. casseliflavus e
E. avium)
57
. No mesmo ano, em Porto Alegre, 455 enterococos isolados foram identificados
como E. faecalis 92,8%, E. faecium 2,9%, E. gallinarum 1,5%, E. hirae 0,7%, E. casseliflavus
0,4%, E. durans 0,4% e E. raffinosus 0,2%
15
. Ainda em Porto Alegre, neste mesmo ano, um
outro estudo identificou 80 cepas de enterococos como E. faecalis 50%, E. faecium 17,5%, E.
gallinarum 11,3%, E. avium 6,3%, E. hirae 5,0%, E. durans 3,7%, E. raffinosus 2,5%, E.
casseliflavus 2,5% e L. garvieae 1,2%
16
.
1.3 Reservatório / Colonização / Transmissão
No ambiente, os enterococos podem ser isolados do solo, alimentos e na água
34, 38
. Fazem
parte da microbiota normal do trato gastrintestinal do homem e de outros animais
17, 58
podendo
ainda ser encontrados na cavidade oral, vesícula biliar, uretra e vagina
30
. O trato gastrintestinal é
considerado, indubitavelmente, o maior reservatório de enterococos
13
e o encontro de E.
faecium, em espécimes clínicas positivas, na ausência de carreamento fecal, evidenciam a
aquisição de uma colonização gastrintestinal exógena e subseqüente infecção endógena
13
.
Dependendo da relação parasito-hospedeiro, podem causar infecções, como endocardites,
infecções urinárias, infecções intra-abdominais, infecções em feridas operatórias e bacteremias
33,
44, 58
.
A importância do enterococo decorre não somente da sua elevada freqüência em
infecções humanas nos últimos anos, como pelo seu potencial de disseminação por contato
29
e
também da sua capacidade de desenvolver resistência aos antimicrobianos – enterococos
resistentes a vancomicina (VRE) - comumente utilizados
13, 19, 55
. A transmissão de VRE por
funcionários da área médica, cujas mãos se tornam contaminadas transitoriamente com o
organismo, quando em contato com os pacientes afetados, provavelmente, é o modo mais
comum de transmissão de infecção nosocomial
13
. Este conceito é apoiado pela recuperação de
VRE e outros enterococos resistentes de culturas de espécimes das mãos deste pessoal. Também
pode ocorrer transmissão de VRE por equipamentos médicos contaminados, embora esta
20
probabilidade seja considerada menos importante do que a transmissão por mãos do pessoal
contaminadas
13
.
Em resposta ao rápido aumento de VRE, o Subcomitê de Prevenção e Controle a
Resistência a Antimicrobianos do Hospital Infection Control Practices Advisory Committe do
CDC, publicou em 1995 as seguintes recomendações para controlar a transmissão nosocomial de
VRE: o uso prudente de vancomicina, a educação de staff do hospital, o uso efetivo do
laboratório de Microbiologia e a implementação de medidas de controle de infecção (inclusive o
uso de luvas e roupas de isolamento de pacientes apropriados a condições específicas)
13, 54, 60
,
além de enfatizar a idéia de que a minimização da transmissão nosocomial de VRE requer uma
equipe multidisciplinar com a participação de vários departamentos
13
.
1.4 O Microrganismo: Aspectos Fenotípicos
As bactérias do gênero Enterococcus consistem de organismos Gram-positivos que se
apresentam como cocos isolados ou agrupados em cadeias curtas. Freqüentemente, a morfologia
microscópica desses microrganismos não pode ser diferenciada de algumas espécies de
Streptococcus. São isolados rotineiramente em Brain Heart Infusion (BHI) ágar contendo 5% de
sangue desfibrinado de carneiro numa temperatura ótima de 35° C por 24 hs
16, 26
, embora a
maioria se desenvolva entre 10° e 45°C
26
. As colônias são, em geral, não hemolíticas, mas
podem ser alfa (hemólise parcial) ou beta-hemolíticas (hemólise total)
10
(Figura 1). São
anaeróbios facultativos e catalase-negativos
26, 30
. Possuem habilidade de crescer em meios
contendo altas concentrações de sal (NaCl a 6,5%) em pH 9.6 e hidrolisam esculina na presença
de 40% de bile (em meio de bile-esculina)
26
. Estas são propriedades básicas que permitem
distinguir os enterococos de outros cocos Gram-positivos catalase-negativos. Para diferenciar as
espécies de enterococos, são necessários testes fenotípicos específicos, como reações de
fermentação de carboidratos, hidrólise da pirrolidonil-beta-naftilamida (PYR) e presença de
pigmento amarelo
10
.
21
Figura 1: Placa contendo cultura pura de Enterococcus spp. A seta mostra os aspectos
característicos da colônia de E. faecalis ATCC 29212: ausência de hemólise,
aspecto mucóide, isoladas e agrupadas.
1.4.1 Sistemas de Identificações Manuais
A identificação de espécies do gênero Enterococcus pode ser realizada a partir do
esquema proposto, em 1989, por Facklam e Collins
25, 53
. Ainda bastante utilizado, com algumas
variações, nos dias atuais
17, 30
este sistema identifica cepas de cocos Gram-positivos, catalase-
negativos e bile esculina positivos e PYR positivos, associado a provas de fermentação com
diferentes carbohidratos (arabinose, lactose, manitol, rafinose, ribose, sacarose, sorbitol, sorbose,
xilose), desaminação de arginina, verificação de motilidade, detecção de pigmento amarelo,
crescimento em 0,4% de telurito e crescimento em piruvato
41
(Figura 2).
22
Figura 2: Fluxograma de identificação de espécies de Enterococcus, segundo Facklam
41
.
As modificações realizadas no esquema de Facklam têm o intuito de diminuir a
quantidade de provas bioquímicas e verificar que com algumas diferenças de provas as mesmas
cepas são identificadas.
Uma modificação proposta pelo Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal
de São Paulo (UNIFESP) no sistema de Facklam – Esquema Modificado 1 (Figura 3) para a
identificação de espécies de enterococos utiliza bacterioscopia por Gram, a prova da bile
esculina, prova do PYR, verificação do pigmento amarelo, observação da motilidade a 30°C e
fermentação dos carboidratos arabinose e xilose.
23
Figura 3: Esquema Modificado 1 utilizado na UNIFESP (2005).
Outra modificação no sistema de Facklam – Esquema Modificado 2 (Quadro 1), com o
intuito de reduzir a quantidade de provas bioquímicas utilizadas para identificar cepas de
Enterococcus sp., além da bacterioscopia pelo Gram, prova da catalase, bile esculina e tolerância
ao cloreto de sódio a 6,5%, utiliza provas de fermentação dos carboidratos arabinose, lactose,
rafinose, manitol, sorbitol e xilose, verificação da motilidade a 30ºC, desaminação de arginina e
tolerância ao telurito a 0,4%
22
.
Quadro 1: Esquema Modificado 2
Cepas
Provas
E. avium
E. durans
E. faecalis
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavus
Motilidade
--
--
--
--
d*
+
Arabinose
+
--
--
+
+
+
Lactose
+
--
+
+
+
+
Rafinose
--
+
--
--
+
+
Manitol
+
--
+
+
+
+
Sorbitol
+
--
+
--
--
+
Arginina
--
+
+
+
+
+
Telurito
--
--
+
--
--
--
d* – variável (positivo ou negativo).
Fonte: EUZÉBY
22
24
1.4.2 Sistemas Automatizados e Semi-automatizados
Nos últimos 20 anos, uma variedade de sistemas automatizados utilizados para a
realização de identificação e testes de sensibilidade a antimicrobianos de microrganismos, foram
desenvolvidos baseados na interpretação automatizada dos resultados de provas bioquímicas ou
microdiluição seguida de incubação overnight e determinação fotométrica de crescimento
43
.
Os equipamentos automatizados e os sistemas semi-automatizados foram
produzidos para a identificação de bactérias de importância clínica, desenvolvidos com o intuito
de realizar vários testes simultaneamente e obter um resultado em 4 a 24 horas
42
. As bactérias
são inoculadas em galerias contendo testes bioquímicos, que, após incubação, têm seus
resultados analisados. Estes são anotados em formulário adequado, onde para cada resultado é
determinado um número que se baseia na importância e confiança de cada teste e um perfil
numérico é criado. Os fabricantes fornecem uma interpretação computadorizada dos resultados
das provas
6, 7
, a qual determina a bactéria identificada.
Atualmente, muitos laboratórios clínicos utilizam sistemas automatizados comerciais na
identificação dos enterococos, como: API 20S (Analytab Products, Plainciew, N.Y.)
4,
39
, GPI
(Gram-Positive Identification) system (Vitek Systems. Inc., Hazelwood, Mo.), Rapid Strep
System (também conhecido como API)
4
ou RapID STR system (Innovative Diagnostic Systems,
Inc. Atlanta, GA.)
24
, API 20 Strep system (bioMérieux AS, Marcy l`Etoile, France)
8, 9
, BBL
Crystal Gram Positivo ID (Becton Dickinson Systems, Sparks, MD)
36
, Phoenix (Becton
Dickinson Systems, Sparks, MD)
9, 12, 20
, Vitek Classic (bioMérieux, Marcy L`Ètoile, France),
Vitek 2 (bioMérieux)
20, 30
, Microscan Walkaway (Dade Behring MicroScan, Sacramento, CA)
20
entre outros.
1.4.3 Métodos Moleculares
A introdução de técnicas de Biologia Molecular no diagnóstico médico possibilita
grandes progressos na identificação de doenças infecciosas, pois permite a obtenção, a partir de
único fragmento de DNA ou RNA, de milhões de cópias idênticas, garantindo o fornecimento de
material necessário para importantes manipulações, como seqüenciamento, produção de sondas
em larga escala, entre outras. Várias técnicas moleculares são utilizadas na identificação das
espécies de enterococos, como a reação em cadeia da polimerase (PCR– polymerase chain
reaction), que consiste numa técnica eficiente, simples e confiável
51
, a PCR em tempo real que
25
oferece um resultado com rapidez, no entanto, apresenta alto custo para sua execução
19
, Pulsed-
field gel electrophoresed (PFGE) é bem aceita como ferramenta epidemiológica para a
identificação de cepas correlatas mas requer equipamento especial e pode ser inconveniente para
a identificação de um grande número de isolados
43
, a hibridização reversa que tem demonstrado
eficiência e confiabilidade na detecção simultânea de várias espécies
21
.
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é empregada de forma crescente na
identificação de enterococos, com resultados que demonstram rapidez e ótima sensibilidade,
tanto para ajuda diagnóstica como para a resolução das discrepâncias entre métodos de
identificação
55
, além de detectar genes de resistência
5, 51, 59
, o que faz desta técnica um bom
método de investigação epidemiológica e pesquisa
51
.
1.5 Aspectos Genotípicos
Uma variedade de genes conservados, inclusive genes de rRNA, o gene da proteína 60 de
choque de calor (HSP ou CPN60), o gene da proteína de choque fria e o gene sod são estudados
para utilização na detecção de enterococos. O gene tuf está envolvido na formação da cadeia
peptídica e é componente essencial do genoma dos enterococos e é detectado nestas bactérias
mediante PCR com excelente sensibilidade e aceitável especificidade
40
.
Os inicializadores mais utilizados na identificação de enterococos devem ser derivados
de regiões altamente conservadas do gene tuf que está envolvido na formação da cadeia
peptídica dos enterococos. Os inicializadores universais - U1 5’-
AAYATGATIACIGGIGCIGCICARATGGA-3’ - e U2 5’-AYRTTITCICCIGGCATIACCAT-
3’ - permitem a amplificação deste gene (região 803 pb) de 14 espécies de enterococos.
Os inicializadores espécies-específicos - Ent1 5’-TACTGACAAACCATTCATGATG-3’
e Ent2 5’-AACTTCGTCACCAACGCGAAC-3’ são estabelecidos ao utilizar-se seqüências
parciais do gene tuf, por conseguirem identificar regiões conservadas de 4 espécies mais
prevalentes de enterococos: E. avium, E. faecalis, E. faecium e E. gallinarum
40, 50
.
26
1.7 Relevância do Estudo
Com a necessidade crescente de se identificar microrganismos com rapidez e confiança
para a implantação de um processo terapêutico eficiente, o laboratório de Microbiologia busca
utilizar técnicas de identificação que proporcionem um resultado eficaz e seguro dentro do
menor espaço de tempo possível.
Diante da diversidade existente de sistemas manuais de identificação de enterococos,
modificados ante o esquema clássico de Facklam, ocorre o questionamento se os sistemas semi-
automatizados podem oferecer um resulatdo com maior segurança, precisão e rapidez que estes.
Assim é que este estudo visa comparar o resultado da identificação de uma coleção de cepas
presumidamente identificadas como enterococos por três métodos manuais e um semi-
automatizado a fim de verificar o grau de concordância e qual método oferece maior segurança
no resultado. Para a resolução de discrepâncias utilizou-se um outro sistema semi-automatizado
e a PCR.
27
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Comparar a identificação fenotípica de cepas de Enterococcus sp., por meio de sistemas
semi-automatizados e manuais e utilizar PCR para definição de discrepâncias.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar a capacidade de identificação de esquemas manuais modificados ante o clássico
de Facklam;
Comparar rapidez e capacidade de identificação de sistema semi-automatizado
considerando padrão ouro com validação manual; e
Utilizar PCR para definir eventuais discrepâncias.
28
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção dos Isolados
Foram utilizadas 62 cepas oriundas da coleção de bactérias do Centro Especializado em
Micologia Médica (CEMM), da Universidade Federal do Ceará, de Fortaleza, Ceará, Brasil,
presumidamente identificadas como E. faecalis. Em seguida, estas amostras foram submetidas às
provas de bacterioscopia pelo Gram, prova da catalase, da bile esculina e tolerância ao cloreto de
sódio a 6,5% (Quadro 2), com base no método de Facklam, visando a confirmar a identificação
realizada inicialmente.
Quadro 2: Provas utilizadas na identificação inicial de Streptococcus sp., segundo Facklam
Cepas
Provas
E. faecalis
Enterococcus sp.
Streptococcus sp
S. pyogenes
Bile esculina
+
--
+
--
NaCl a 6,5%
+
+
--
--
Fonte: KONEMAN
41
.
3.2 Armazenamento das Amostras Bacterianas
As 62 cepas de Enterococcus spp. utilizadas foram colocadas em meio Brain Heart
Infusion (BHI), contendo 20% de glicerol e armazenadas em freezer a –70°C, visando a manter
suas características fenotípicas e genéticas
10
.
3.3 Identificação Fenotípica por Métodos Manuais
As 62 amostras foram repicadas em ágar sangue (Columbia Blood Agar Base) e, após
incubação a 35°C, por 24 horas, partindo de uma cultura pura, realizou-se triagem inicial pelo
sistema de Facklam.
Foram empregados dois esquemas modificados a partir do sistema de Facklam. O
Esquema Modificado 1 usou para a identificação de espécies de enterococos, as seguintes
provas: bacterioscopia pelo Gram, bile esculina, utilização do PYR, verificação do pigmento
29
amarelo, observação da motilidade a 30°C e fermentação dos carboidratos arabinose e xilose. O
Esquema Modificado 2, além da bacterioscopia pelo Gram, prova da catalase, da bile esculina e
tolerância ao cloreto de sódio a 6,5%, utilizou provas de fermentação dos carboidratos arabinose,
lactose, rafinose, manitol, sorbitol e xilose, verificação de motilidade, desaminação de arginina e
tolerância ao telurito a 0,4% (Apêndice I).
3.4 Identificação Fenotípica por Sistema Semi-automatizado
3.4.1 API 20 Strep
As 62 cepas foram identificadas pelo sistema API 20 STREP (bioMérieux, Marcy l’Etoile,
France), que consiste de uma galeria com 20 cúpulas (Figura 4) contendo substâncias desidratadas
para a determinação das seguintes reações: Voges-Proskauer; produção de enzimas pirrolidonil
arilamidase, -galactosidade, -glicuronidase, -galactosidade, fosfatase alcalina, leucina
arilamidase; hidrólise de hipurato e esculina; arginina diidrolase; e fermentação de ribose, L-
arabinose, manitol, sorbitol, lactose, trealose, inulina, rafinose, amido e glicogênio
7
.
Figura 4: Galeria de reações bioquímicas – API 20 Strep.
Fonte: BIOMÉRIEUX AS
7
.
Após cultivo das amostras em placas contendo ágar sangue (Columbia Blood Agar Base)
com incubação por 24 horas e a 35°C, colônias das cepas de enterococos foram suspendidas em
solução salina 0,85% (com turbidez ≥ 4 na escala McFarland) e inoculadas nas cúpulas das
galerias. Após 4 horas de incubação a 35ºC, foram adicionados os reagentes de Voges-Proskauer,
hipurato e das enzimas, e realizou-se a leitura conforme Quadro de leitura de reações do API 20
Strep
7
(Apêndice I) (Figura 5).
30
Figura 5: Quadro de leitura de reações do API 20 Strep.
Fonte: BIOMÉRIEUX AS
7
.
Para verificar a veracidade das colorações resultantes das reações bioquímicas
preconizadas pelo sistema API 20 Strep, usou-se a cepa E. faecalis ATCC 29212 como
parâmetro-padrão de coloração. Observou-se que a coloração preconizada para um resultado
positivo para a prova da arginina é o vermelho, entretanto, verificou-se que esta não ultrapassou
o tom rosa-escuro (Figura 6).
Figura 6: E. faecalis ATCC 29212 – API 20 Strep.
31
A cada reação, conforme o resultado, foi preconizado um valor específico (preestabelecido
pelo fabricante) e, ao final da leitura, conforme o somatório resultante, foi gerada uma seqüência
numérica de sete dígitos, que correspondeu à identificação de uma cepa (Figura 7).
Figura 7: Formulário para registro de leitura – API 20 Strep.
Fonte: BIOMÉRIEUX AS
7
.
O código gerado foi pesquisado no banco de dados informatizado do sistema e a cepa
identificada (Anexo I). Quando, porém, a seqüência gerada não encontrou o seu correspondente no
banco de dados, o próprio sistema indicou a necessidade de reincubação por mais 24 horas, e nova
leitura das reações de esculina, arginina e fermentação dos açúcares foi realizada; a seguir a
segunda sequência de sete dígitos foi gerada e este perfil foi considerado o definitivo
7
.
De acordo com os resultados, as cepas foram classificadas em três grupos: (i) identificadas
ao nível de espécie, (ii) identificadas ao nível de gênero, e (iii) não identificadas, isto é, cepas com
baixo nível de discriminação. Conforme as instruções do fabricante, as cepas identificadas ao
nível de espécie foram divididas em 4 grupos: (i) excelente identificação (% id 99,9%); (ii)
muito boa identificação (% id 99,0%); (iii) boa identificação (% id 90,0%); e (iv) identificação
aceitável (% id 80,0%)
8
.
32
3.4.2 BBL Crystal Gram Positivo ID
O BBL Crystal Gram Positivo ID foi utilizado como sistema de confirmação para 10 cepas
que tiveram o resultado de sua identificação discrepante entre os sistemas manuais e o API 20
Strep. Este sistema é composto de painéis, bases e fluídos de inóculos. Cada painel contém 29
substratos desidratados (4 MU-β-D glicosídeo, L-valina-AMC, L-fenilalanina-AMC, 4 MU-α-D
glicosídeo, ácido-L-piroglutâmico-AMC, L-triptofano-AMC, 4 MU-N-acetil-β-D-Glicosaminida,
4 MU-fosfato, 4 MU-β-D-glicoronídeo, L-isoleucina-AMC, trealose, lactose, metil-α e β-
glicosídeo, sacarose, manitol, maltotriose, arabinose, glicerol, frutose, p-n-p-β-D-glicosídeo, p-n-
p-β-D-celobiosídeo, prolina e leucina-p-nitroanilida, p-n-p-fosfato, p-n-p-α-D-maltosídeo, ONPG
e p-n-pl-α-D-galactosídeo, uréia, esculina e arginina) e um controle de fluorescência. A base
possui 30 orifícios de reações. O inóculo (0,5 na escala de McFarland) é preparado com o fluido
de inóculo e é utilizado para preencher os 30 orificios da base de reações (Apêndice I) (Figura 8)
6
.
Figura 8: Painel de reações bioquímicas – BBL.
(Pronto para Leitura)
Fonte: BECTON DICKISON
6
.
Assim que o painel foi alinhado com a base e encaixado corretamente, o inóculo
reidratou os substratos dessecados e as reações foram iniciadas. Após 24 h de incubação a 35°C,
os orifícios foram examinados quanto a alterações de tom ou presença de fluorescência,
resultantes das atividades metabólicas dos microrganismos (Figura 9).
33
Figura 9: Quadro de leitura de reações bioquímicas do BBL Crystal.
Fonte: BECTON DICKISON
6
.
O padrão de tonalidade resultante foi convertido em um número, por meio de um perfil
de dez dígitos, o qual foi utilizado como base para se proceder à identificação (Figura 10).
Figura 10: Formulário para registro de leitura – BBL Crystal.
Fonte: BECTON DICKISON
6
.
34
Procedeu-se à identificação mediante análise comparativa do padrão de reação
apresentado pelo material testado, em contraposição ao padrão armazenado no banco de dados
(Anexo II).
3.5 Identificação Genotípica por Métodos Moleculares
3.5.1 Extração de DNA
Foi realizada extração de DNA de 10 cepas bacterianas (n°
s
05, 13, 15, 20, 27, 31, 32, 33,
50 e 60) pelo método de lise química (2002)
14
(Apêndice I):
As amostras foram cultivadas em 2 mL de caldo BHI a 37ºC por 24 hs. Transferiu-se 1 mL
desta cultura para um eppendorf e centrifugou-se a 14.000 rpm por 1 min. A seguir, removeu-se
o sobrenadante, adicionando-se 40 L da solução de lise; homogeneizou-se em vortex para
ressuspender o sedimento. Daí colocou-se a 100°C por 15 minutos e depois diluiu-se com 950
L de tampão TE e homogeneizou-se no vortex. Armazenou-se a 4°C.
3.5.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A reação de PCR foi realizada em 50 L, para cada amostra, nos seguintes volumes: 5 L de
tampão 10X, 1 L de MgCl
2
25mM, 0,5 L de taq polimerase, 1 L de cada primer a 10 M
(Invitrogen, USA), 0,4 L dNTP mix a 25mM, 2 L de DNA (100ng/ L) e 41,1 L de água
deionizada
10
.
As condições para a reação de PCR foram: 94°C por 3 minutos. Para 30 ciclos, utilizando:
94°C por 45 segundos, 52°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto. Utilizou-se um período de
extensão a 72°C por 10 minutos
10
.
O produto da amplificação foi analisado em eletroforese em 1,5% de gel de agarose
contendo brometo de etídio por 15 minutos a 70 V.
A preparação dos reagentes e processos encontra-se no Apêndice I.
35
3.5.2.1 Iniciadores
Foram utilizados os primers ou iniciadores (Quadro 3) Universal para os gêneros
Streptococcus e Enterococcus: 5’ AAY ATG ATI ACI GGI GCI GCI CAR ATG GA 3’ (fita
sentido) e 5’ TTC TAC TAA TGA CCA CGA CGA GTG TAC CT 3’ (fita anti-sentido), para o
gene tuf para o gênero Enterococcus: 5’ TAC TGA CAA ACC ATT CAT GAT G 3’ (fita
sentido) e 5’ ATG ACT GTT TGC TAA GTA CTA C 3’ (fita anti-sentido)
40
, para o gene vanA
para a espécie E. faecalis: 5’ CAT GAC GTA TCG GTA AAA TC 3’ (fita sentido) e 5’ GTA
CTG CAT AGC CAT TTT AG 3’ (fita anti-sentido), para o gene vanC1 para a espécie E.
gallinarum: 5’ GAT GGC WGT ATC CAA GGA 3’ (fita sentido) e 5’ CTA CCG ACA TAG
GTT CTT 3’ (fita anti-sentido)
49
e para a espécie S. agalactiae 5’ TAA TCT CTT AAA GCC
AAT CTC AGT T 3’ (fita sentido) e 5’ ATT AGA GAA TTT CGG TTA GAG TCA A 3’ (fita
anti-sentido)
32
.
Quadro 3: Iniciadores utilizados para amplificação
Indicação
do Iniciador
Sequência
Região alvo
N° de pares de
bases
Universal
Sentido 5’ AAY ATG AT I AC I GGI GCI GCI CAR ATG GA 3’
Antisentido 5’ TTC TAC TAA TGA CCA CGA CGA GTG TAC CT 3’
271-300
803
Enterococcus sp.
Sentido 5’ TAC TGA CAA ACC ATT CAT GAT G 3’
Antisentido 5’ ATGACT GTT TGC TAA GTA CTA C 3’
618-639
112
E. faecalis
Sentido 5’ CAT GAC GTA TCG GTA AAA TC 3’
Antisentido 5’ GTA CTG CAT AGC CAT TTT AG 3’
49 – 933
885
E. gallinarum
Sentido 5’ GAT GGC WGT ATC CAA GGA 3’
Antisentido 5’ CTA CCG ACA TAG GTT CTT 3’
307 - 773
467
S. agalactiae
Sentido 5’ TAA TCT CTT AAA GCC AAT CTC AGT T 3’
Antisentido 5’ ATT AGA GAA TTT CGG TTA GAG TCA A 3’
1278-1302
25
Fonte: GREISEN
32
, PATEL
49
, KE
40
.
3.6 Controle de Qualidade
A cepa E. faecalis ATCC 29212 foi utilizada como controle de qualidade, conforme
documento M2-A8, do National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS
48
.
36
4 RESULTADOS
4.1 Identificação Fenotípica Manual
As 62 amostras selecionadas por serem presumidamente E. faecalis foram submetidas a
identificação inicial pelo método de Facklam para características do gênero Enterococcus,
mediante a realização das seguintes provas: bacterioscopia pelo Gram, prova da catalase, bile
esculina e tolerância ao cloreto de sódio a 6,5%; 10 amostras foram identificadas como
Enterococcus sp. e 52 como E. faecalis.
Em seguida, foram novamente submetidas a identificação pelos esquemas Modificado 1 e
Modificado 2. No esquema Modificado 1, foram identificados 82,2% (51) das cepas como E.
faecalis, 9,7% (6) como E. mundtii e 8,1% (5) como E. gallinarum. Verificou-se pela observação
do fluxograma que a identificação das cepas como E. mundtii decorreu da presença do pigmento
amarelo, mostrando esta avaliação ser bastante subjetiva. No esquema Modificado 2, foi
identificado 1,6% (1) das cepas como E. gallinarum e 98,4% (61) como E. faecalis. Dos 98,4%
E. faecalis, 8,2% (5)
foram identificados com restrição, em decorrência da prova de fermentação
do manitol, pois era esperado um resultado positivo e ficou duvidoso mesmo após ter sido
repetido.
Para demonstrar o resultado obtido de identificações de cepas de Enterococcus por
metodologias manuais, formou-se a seguinte tabela (Tabela 1):
37
Tabela 1: Resultado da identificação de Enterococcus por metodologias manuais
01NN°n°
Triagem
Facklam
Modificado 1
Modificado 2
01
E. faecalis
E. faecalis
E. mundtii
E. gallinarum
02
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
03
E. faecalis
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
04
E. faecalis
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
05
E. faecalis
Enterococcus sp.
E. gallinarum
E. faecalis
06
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
07
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
08
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
09
E. faecalis
E. faecalis
E. mundtii
E. faecalis
10
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
11
E. faecalis
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
12
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
13
E. faecalis
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
14
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
15
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
16
E. faecalis
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
17
E. faecalis
Enterococcus sp.
E. mundtii
E. faecalis
18
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
19
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
20
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
21
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
22
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
23
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
24
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
25
E. faecalis
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
26
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
27
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
28
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
29
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
30
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
31
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
32
E. faecalis
E. faecalis
E. gallinarum
E. faecalis
33
E. faecalis
E. faecalis
E. gallinarum
E. faecalis
34
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
35
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
36
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
37
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
38
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
39
E. faecalis
E. faecalis
E. mundtii
E. faecalis
40
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
41
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
42
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
43
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
44
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
45
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
46
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
47
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
48
E. faecalis
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
49
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
50
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
51
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
52
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
53
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
54
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
55
E. faecalis
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
56
E. faecalis
E. faecalis
E. gallinarum
E. faecalis
57
E. faecalis
E. faecalis
E.mundtii
E. faecalis
58
E. faecalis
E. faecalis
E. gallinarum
E. faecalis
59
E. faecalis
E. faecalis
E. mundtii
E. faecalis
60
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
61
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
62
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
Fonte: Pesquisa direta.
38
4.2 Identificação Fenotípica por Sistema Semi-automatizado
As 62 amostras foram submetidas a identificação pelo sistema de identificação API 20
Strep. Os resultados podem ser vistos na Tabela 2.
Tabela 2: Resultado da Identificação de Enterococcus pelo API 20 Strep.
N°
Resultado API 20 Strep
%*
N°
Resultado API 20 Strep
%*
01
E.faecalis
99,3
32
E. faecium
99,7
02
A. viridans
35,2
33
A. viridans
97,5
03
A. viridans
76,1
34
Leuconostoc spp
93,2
04
E.faecalis
96,8
35
E. faecalis
96,0
05
S. agalactiae
99,9
36
E. faecalis
80,9
06
E.faecalis
99,9
37
E. faecalis
96,7
07
E.faecalis
63,9
38
E. faecalis
93,4
08
E.faecalis
99,3
39
E. faecalis
93,4
09
E. avium
99,1
40
E. faecalis
80,9
10
E. avium
86,6
41
A viridans
97,8
11
E.faecalis
63,9
42
E. faecalis
98,0
12
E.faecalis
70,0
43
E. faecalis
98,0
13
S. agalactiae
99,9
44
E. faecalis
98,1
14
E. avium
63,8
45
E. faecalis
99,3
15
E. avium
99,9
46
E. faecalis
99,3
16
E.faecalis
60,9
47
E. faecalis
98,0
17
S. agalactiae
99,9
48
A adiacens
89,4
18
S. acidominimus
46,0
49
E. faecalis
98,0
19
E.faecalis
99,2
50
A viridans
83,2
20
A. viridans
76,6
51
E. faecalis
67,8
21
E.faecalis
99,7
52
S. uberis
93,3
22
E. avium
99,6
53
E. faecalis
89,1
23
E. avium
99,5
54
A viridans
38,3
24
E. avium
99,7
55
A viridans
80,3
25
E.faecalis
99,7
56
A viridans
38,0
26
E. faecalis
99,3
57
A viridans
40,0
27
E. faecalis
99,7
58
A viridans
99,9
28
E. faecalis
98,1
59
E. avium
99,3
29
E. faecalis
89,1
60
A viridans
95,0
30
E. faecalis
89,1
61
Perfil Inaceitável
--
31
E. faecalis
99,5
62
E. faecium
95,5
* Sensibilidade de identificação apresentada pelo API 20 Strep.
Fonte: Pequisa direta.
Observando o resultado da identificação das 62 cepas pelo sistema API 20 Strep,
destacou-se a diversidade de identificação (4 gêneros, 8 espécies) (Figura 11): 51,6% (32) E.
faecalis, 19,4% (12) Aerococcus viridans, 13,0% (8) E. avium, 4,8% (3) S. agalactiae, 3,2% (2)
E. faecium, 1,6% (1) Streptococcus acidominimus, 1,6% (1) Aerococcus adiacens, 1,6% (1)
Leuconostoc sp., 1,6% (1) Streptococcus uberis e 1,6% (1) Inaceitável. Estes dados podem ser
sumariados na Figura 11:
39
Com o objetivo de avaliar a correlação do tempo de leitura com o resultado final, em 46
amostras submetidas a identificação pelo API 20 Strep foi realizada leitura com 4 e 24 horas,
independentemente da indicação do sistema, pois a leitura com 24 h é realizada apenas quando o
sistema indica a sua necessidade para finalizar a identificação.
O resultado indicou que as seguintes amostras foram identificadas com a leitura de 4 h e
apresentaram perfis inaceitáveis quando lidas em 24 h: 1 A. adiacens, 4 A. viridans, 1 E. avium,
2 Leuconostoc sp., 1 S. acidominimus. Em 1 amostra, o perfil de leitura foi considerado
inaceitável nos dois tempos de leitura, não sendo identificada pelo sistema. Em 1 amostra o
perfil de leitura em 4 h foi considerado inaceitável, no entanto, em 24 h a amostra foi
identificada como E. faecium. Em 3 amostras, não houve leitura das reações em 4 h, o sistema
indicou a necessidade de reincubação a 37°C por mais 24 h e, após este período, o resultado
mostrou a identificação de 2 cepas de A. viridans e 1 de E. faecalis. O resultado da identificação
com dois tempos (4 e 24 h) de leitura pode ser visualizado na Tabela 3.
A. adiacens
1,6%
A. viridans
19,4%
E. avium
12,9%
E. faecalis
51,6%
E. faecium
3,2%
Leuconostoc sp.
1,6%
S. acidominimus
1,6%
S. agalactiae
4,8%
S. uberis
1,6%
Inaceitável
1,6%
Figura 11: Distribuição dos Enterococcus identificados pelo API 20 Strep
Fonte: Pesquisa direta.
40
Tabela 3: Resultado da identificação das espécies no API 20 Strep em 4 e 24 horas
API 20 Strep
4 h
24 h
Espécies identificadas
N
Espécies identificadas
n
A. adiacens
01
Inaceitável
01
A. viridans
11
A. viridans
E. faecalis
Lactis lactis lactis
Inaceitável
04
02
01
04
E. avium
12
E. faecalis
Inaceitável
11
01
E. faecalis
05
E. faecalis
05
E. faecium
01
E. faecium
01
Lactis lactis cremoris
01
E. faecalis
01
Leuconostoc sp.
06
E. faecalis
E. faecium
Inaceitável
03
01
02
S. acidominimus
02
S. agalactiae
Inaceitável
01
01
S. equinus
01
E. faecalis
01
S. uberis
01
S. uberis
01
Não deu resultado*
03
A viridans
E. faecalis
02
01
Inaceitável
02
E. faecium
Inaceitável
01
01
Total:
46
Total:
46
* Não deu resultado na leitura de 4 h sendo necessário reincubação por mais 24 horas, conforme sistema API 20
Strep.
Fonte: Pesquisa direta.
O sistema considera perfil inaceitável aquele cujo código gerado com a leitura não
encaixa em nenhum perfil de identificação constante na base de dados. Neste estudo as cepas
que apresentaram este perfil foram consideradas como não identificadas.
As leituras das reações em dois tempos de leitura (4 e 24 h) de 46 cepas podem ser
observadas na Tabela 4.
41
Cepa N°
Identificação
Tempo
de
leitura
E
S
C
A
D
H
R
I
B
A
R
A
M
A
N
S
O
R
L
A
C
T
R
E
I
N
U
R
A
F
A
M
D
G
L
I
Cepa
N°
Identificação
Tempo
de
leitura
E
S
C
A
D
H
R
I
B
A
R
A
M
A
N
S
O
R
L
A
C
T
R
E
I
N
U
R
A
F
A
M
D
G
L
I
Inaceitável
4 hs
+
-
-
-
-
+
-
+
-
+
+
+
E. faecalis
4 hs
+
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
2
E. faecalis
24 hs
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
40
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
A. viridans
4 hs
+
-
+
-
+
-
-
+
-
-
-
-
Sem resultado
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3
A. viridans
24 hs
-
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
41
A. viridans
24 hs
-
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
-
A. viridans
4 hs
+
-
+
-
+
-
-
+
-
-
+
-
E. avium
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
-
-
-
4
E. faecalis
24 hs
-
+
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
42
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
S. acidominimus
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
E. faecalis
4 hs
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
5
S. agalactiae
24 hs
-
+
+
-
-
-
+
+
-
-
-
-
43
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
E. avium
4 hs
+
-
+
+
+
+
-
+
-
-
+
-
E. avium
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
-
-
-
8
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
44
E. faecalis
24 hs
-
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
S. acidominimus
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
E. faecalis
4 hs
+
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
13
Inaceitável
24 hs
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
45
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
Leuconostoc sp.
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A. viridans
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
-
-
-
17
Inaceitável
24 hs
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
46
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
-
A. viridans
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
+
+
-
E. faecalis
4 hs
+
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
18
Inaceitável
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
-
47
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
E. faecalis
4 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
-
A. adiacens
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
20
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
-
48
Inaceitável
24 hs
-
+
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
E. avium
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
-
-
-
E. avium
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
-
-
-
25
E. faecalis
24 hs
-
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
-
49
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
E. avium
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
-
-
-
A. viridans
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27
E. faecalis
24 hs
-
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
-
50
A. viridans
24 hs
-
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
-
E. avium
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
-
-
-
Leuconostoc sp.
4 hs
-
-
+
-
+
-
-
+
-
-
-
-
28
E. faecalis
24 hs
-
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
51
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
-
-
E. avium
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
-
-
-
S. uberis
4 hs
+
-
+
-
+
-
+
+
-
-
+
-
29
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
52
S. uberis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
E. avium
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
-
-
-
S. equinus
4 hs
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
30
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
53
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
-
E. avium
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
-
-
-
A. viridans
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
31
E. faecalis
24 hs
-
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
-
54
A. viridans
24 hs
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
E. faecium
4 hs
-
-
+
+
+
-
+
+
-
-
-
-
Sem resultado
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
32
E. faecium
24 hs
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
55
A. viridans
24 hs
-
-
+
+
+
+
-
+
-
-
+
-
A. viridans
4 hs
-
-
+
-
-
-
+
+
-
-
-
-
A. viridans
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
33
Inaceitável
24 hs
-
+
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
56
A. viridans
24 hs
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
Leuconostoc sp.
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A. viridans
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
34
Inaceitável
24 hs
-
+
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
57
Lc. lactis lactis
24 hs
+
+
+
+
+
-
+
+
-
-
+
-
Sem resultado
4 hs
+
-
+
-
+
-
-
+
-
-
-
-
A. viridans
4 hs
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
35
E. faecalis
24 hs
-
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
-
58
Inaceitável
24 hs
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
Leuconostoc sp.
4 hs
+
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
E. avium
4 hs
-
-
+
+
+
+
+
+
-
+
-
-
36
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
59
Inaceitável
24 hs
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
Leuconostoc sp.
4 hs
-
-
+
-
+
-
-
+
-
-
-
-
A. viridans
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
37
E. faecalis
24 hs
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
-
-
60
Inaceitável
24 hs
-
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
-
Lc. Lactis cremoris
4 hs
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
Inaceitável
4 hs
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
38
E. faecalis
24 hs
-
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
61
Inaceitável
24 hs
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
E. avium
4 hs
-
-
+
-
+
-
+
+
-
-
-
-
Leuconostoc sp.
4 hs
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
39
E. faecalis
24 hs
-
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
62
E. faecium
24 hs
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
Fonte: Pesquisa direta.
42
4.3 Resultado Comparativo entre Identificação Convencional e Semi-automatizada
As provas que constam nos esquemas de identificações utilizados para identificar cepas
de Enterococcus sp. constam na Tabela 5.
Tabela 5: Provas apresentadas nos sistemas de identificações utilizados
Sistema
Provas Bioquímicas
Facklam
Modificado 1
Modificado 2
API 20 Strep
BBL Crystal
Acido hipúrico
X
Ac.-L-piroglutâmico-AMC
X
Amido
X
Arabinose
X
X
X
X
Arginina
X
X
X
Bile esculina
X
X
X
X
X
Catalase
X
X
X
Cloreto de sódio
X
X
Derivado cumarínico
X
Fosfato alcalina
X
Frutose
X
-galactosidase
X
- galactosidase
X
-giucuronidase
X
Glicerol
X
Glicogênio
X
Gram
X
X
X
X
X
Inulina
X
Lactose
X
X
X
L-arginina-AMC
X
Leucina
X
X
L-fenilalanina-AMC
X
L-triptofano-AMC
X
L-valina-AMC
X
Maltotriose
X
Manitol
X
X
X
Metil- & -glicosídeo
X
Motilidade
X
X
4MU- -D-glicosídeo
X
4MU- -D-glicosídeo
X
4MU- -D-glicuronídio
X
4MU-fosfato
X
4MU-N-acetil- -D-glicosaminida
X
Pigmento Amarelo
X
Piruvato
X
p-n-p- -D-galcatosídeo
X
p-n-p- -D-celobiosídeo
X
p-n-p- -D-glicosídeo
X
p-n-p- fosfato
X
Prolina e leucina-p-nitroanilida
X
PYR
X
X
X
Rafinose
X
X
Ribose
X
Sacarose
X
Sorbitol
X
X
Sorbose
Telurito a 0,04%
X
Trealose
X
X
Uréia
X
Xilose
X
Fonte: Pesquisa direta.
Avaliando o resultado de quatro sistemas de identificações, observou-se o E. faecalis
como o microrganismo mais prevalente (Tabela 6).
43
Tabela 6: Resultado da identificação de 62 cepas nos sistemas utilizados
Cepa n°
Facklam
Modificado 1
Modificado 2
API 20 Strep
01
E. faecalis
E. mundtii
E. gallinarum
E.faecalis
02
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A. viridans
03
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
A. viridans
04
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
E.faecalis
05
Enterococcus sp.
E. gallinarum
E. faecalis
S. agalactiae
06
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E.faecalis
07
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E.faecalis
08
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E.faecalis
09
E. faecalis
E. mundtii
E. faecalis
E. avium
10
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. avium
11
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
E.faecalis
12
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E.faecalis
13
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
S. agalactiae
14
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. avium
15
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. avium
16
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
E.faecalis
17
Enterococcus sp.
E. mundtii
E. faecalis
S. agalactiae
18
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
S. acidominimus
19
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E.faecalis
20
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A. viridans
21
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E.faecalis
22
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. avium
23
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. avium
24
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. avium
25
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
26
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
27
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
28
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
29
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
30
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
31
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
32
E. faecalis
E. gallinarum
E. faecalis
E. faecium
33
E. faecalis
E. gallinarum
E. faecalis
A viridans
34
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
Leuconostoc spp
35
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
36
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
37
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
38
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
39
E. faecalis
E. mundtii
E. faecalis
E. faecalis
40
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
41
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A viridans
42
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
43
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
44
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
45
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
46
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
47
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
48
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
A. adiacens
49
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
50
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A. viridans
51
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
52
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
S. uberis
53
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
54
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A. viridans
55
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
A. viridans
56
E. faecalis
E. gallinarum
E. faecalis
A. viridans
57
E. faecalis
E.mundtii
E. faecalis
A. viridans
58
E. faecalis
E. gallinarum
E. faecalis
A. viridans
59
E. faecalis
E. mundtii
E. faecalis
E. avium
60
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A. viridans
61
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
Perfil Inaceitável
62
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecium
Fonte: Pesquisa direta.
44
O Esquema de Facklam identificou 16% (10) como cepas do gênero Enterococcus sp. e
84% (52) como E. faecalis. O Esquema Modificado 1 exibiu a seguinte identificação: 82,2%
(51) E. faecalis, 9,7% (6) E. mundtii, e 8,1% (5) E. gallinarum. O Esquema Modificado 2
identificou 98,4% (61) E. faecalis e 1,6% (1) E. gallinarum. O API 20 Strep identificou 51,6%
(32) E. faecalis, 19,4% (12) A viridans, 13,0% (8) E. avium, 4,8% (3) S. agalactiae, 3,2% (2) E.
faecium, 1,6% (1) S. acidominimus, 1,6% (1) Leuconoctocc sp., 1,6% (1) S. uberis, 1,6% (1) A.
adiacens e 1,6% (1) Inaceitável. Estes dados podem ser visualizados na Tabela 7.
Tabela 7: Distribuição de espécies identificadas por sistema
Espécies identificadas
N = 62
Método de identificação (n)
Facklam
Modificado 1
Modificado 2
API 20 Strep
A adiacens
1
A. viridans
--
--
--
12
Enterococcus sp.
10
--
--
--
E. avium
--
--
--
8
E. faecalis
52
51
61
32
E. faecium
--
--
--
2
E. gallinarum
--
5
1
--
E. mundtii
--
6
--
--
Leuconostoc sp.
--
--
--
1
S. acidominimus
--
--
--
1
S. agalactiae
--
--
--
3
S. uberis
--
--
--
1
Sem identificação
--
--
--
1
Total
62
62
62
62
Fonte: Pesquisa direta.
Foram selecionadas 10 cepas, que apresentaram discrepâncias de resultados entre os
métodos manuais (Facklam, Modificado 1 e 2) e o API 20 Strep para serem identificadas pelo
sistema BBL Crystal Gram Positivo ID (Becton Dickinson Systems, Sparks, MD), utilizado
como mais um método de identificação semi-automatizado. Também foi utilizada a cepa E.
faecalis ATCC 29212 como amostra-controle. O BBL identificou 6 amostras como E. faecium,
inclusive a cepa-controle E. faecalis ATCC 29212 e 4 amostras não foram identificadas. O
resultado está descrito na Tabela 8.
45
Tabela 8: Resultado da identificação de 10 cepas por sistemas manuais e semi-automatizados
Cepa n°
Facklam
Modificado 1
Modificado 2
API 20 Strep
BBL
05
Enterococcus sp.
E. gallinarum
E. faecalis
S. agalactiae
Não identificada
13
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
S. agalactiae
Não identificada
15
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. avium
E. faecium
20
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A. viridans
E. faecium
27
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecium
31
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecium
32
E. faecalis
E. gallinarum
E. faecalis
E. faecim
Não identificada
33
E. faecalis
E. gallinarum
E. faecalis
A viridans
Não identificada
50
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A viridans
E. faecium
60
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A viridans
E. faecium
ATCC 29212
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecium
4.4 Avaliação Molecular
Com vistas a definir as discrepâncias encontradas nos ensaios bioquímicos, utilizou-se a
reação em cadeia da polimerase – PCR, com a função de confirmar (ou não) os resultados
apresentados pelos sistemas, nas 10 amostras selecionadas anteriormente. Foi utilizada como
amostra-controle nesta reação a cepa E. faecalis ATCC 29212. Foram utilizados os seguintes
iniciadores:
i) iniciador de amplificação universal (U), para identificação de cepas dos gêneros
Streptococcus e Enterococcus.
ii) iniciador Enterococcus (Ent), específico para identificação de cepas do gênero
Enterococcus com o gene tuf presente na cadeia peptídica das 14 espécies mais
prevalentes.
iii) iniciador E. faecalis – específico para a identificação de cepas desta espécie, com
o gene vanA, que apresenta maior prevalência nesta espécie.
iv) iniciador E. gallinarum – específico para a identificação de cepas desta espécie,
com o gene vanC1, que apresenta maior prevalência nesta espécie.
v) iniciador S. agalactiae – específico para a identificação de cepas desta espécie
A escolha dos iniciadores para E. faecalis direcionados ao gene vanA e E. gallinarum ao
vanC1 decorreu da idéia inicial de pesquisar gene de resistência para estas espécies. Com a
obsevação dos resultados inicialmente obtidos com os ensaios bioquímicos, no entanto,
verificou-se a necessidade de firmar um sistema de identificação fidedigno para estas espécies.
46
Das 10 amostras avaliadas pela PCR, uma não amplificou, 9 foram identificadas como
Streptococcus spp.. Apenas 1 (uma) amostra apresentou-se positiva para o gênero Enterococcus
mas não para a espécie E. faecalis, indicando ser outra espécie de Enterococcus e 1 (uma) para a
espécie S. agalactiae. Nenhuma das amostras se apresentou positiva para a espécie E.
gallinarum. A amostra-controle foi amplificada corretamente: positiva para o primer universal,
Enterococcus e E. faecalis. Presume-se, como causa da não-amplificação da amostra n°15, a
pequena quantidade utilizada da mesma por não ter sido possível recuperá-la.
O resultado sumariado da PCR encontra-se na Tabela 9.
Tabela 9: Resultado da identificação por PCR
Amostra n°
PCR
Iniciadores utilizados
Universal
a
(Strep + Ent)
Enterococcus
b
E. faecalis
c
E. gallinarum
d
S. agalactiae
e
05
+
--
NR
NR
+
13
+
--
NR
NR
NR
15
Não amplificada
Não amplificada
Não amplificada
Não amplificada
Não amplificada
20
+
--
NR
NR
NR
27
+
--
NR
NR
NR
31
+
--
NR
NR
NR
32
+
--
NR
NR
NR
33
+
--
NR
NR
NR
50
+
--
NR
NR
NR
60
+
+
--
NR
NR
ATCC 29212
+
+
+
NR
NR
a:5’ AAY ATG AT I AC I GGI GCI GCI CAR ATG GA 3’; b: 5’ TAC TGA CAA ACC ATT CAT GAT G 3’; c: 5’ CAT GAC GTA TCG
GTA AAA TC 3’; d: 5’ GAT GGC WGT ATC CAA GGA 3’; e: 5’ TAA TCT CTT AAA GCC AAT CTC AGT T 3’
NR – Não Realizado
A demonstração destas discrepâncias encontra-se na Tabela 10.
47
Tabela 10: Discrepâncias entre os sistemas de identificações utilizados em 10 cepas
Esquema
Ident.
Amostra n°
Facklam
Modificado 1
Modificado 2
API 20 Strep
BBL
PCR
05
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. gallinarum
S. agalactiae
Não identificada
Streptococcus spp.
13
Enterococcus sp.
E. faecalis
E. faecalis
S. agalactiae
Não identificada
Streptococcus spp.
15
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. avium
E. faecium
Não amplificada
20
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A viridans
E. faecium
Streptococcus spp.
27
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecium
Streptococcus spp.
31
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecium
Streptococcus spp.
32
E. faecalis
E. gallinarum
E. gallinarum
E. faecium
Não identificada
Streptococcus spp.
33
E. faecalis
E. faecalis
E. gallinarum
A viridans
Não identificada
Streptococcus spp.
50
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A viridans
E. faecium
Streptococcus spp.
60
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
A viridans
E. faecium
Enterococcus sp.
ATCC 29212
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecium
E. faecalis
48
5 DISCUSSÃO
Os kits comerciais de identificação bacteriana baseiam-se em reações bioquímicas
agrupadas em séries nos diversos protocolos de identificação de espécies. A presença, porém,
das discrepâncias nos resultados apresentados por estes kits e a necessidade constante de se
aumentar a base de dados destes, bem como a confusão taxonômica das espécies de
estreptococos, resultam numa identificação com baixo nível de confiança. Isto é reforçado pelo
uso de métodos moleculares, pois sua aplicação, resultou na demonstração, ao longo dos anos,
da inexistência de fidedignidade dos sistemas convencionais, automatizados e semi-
automatizados quando comparados seus resultados com os obtidos pela Biologia Molecular.
Na década de 1980, vários estudos, demonstraram as controvérsias entre pesquisadores e
as dificuldades de interpretação no emprego de sistemas comerciais e convencionais para a
identificação de enterococos. Na Inglaterra, em 1981, pesquisadores concluíram que o sistema
API 20 Strep apresentou boa correlação com os métodos convencionais na identificação de 100
cepas de enterococos, mesmo com as dificuldades encontradas pelo processo na identificação de
alguns isolados como: (i) a necessidade de mais 24 h de incubação para o resultado final e (ii) a
possibilidade de utilização de outra placa de crescimento, quando o sistema indicasse
inconclusão no resultado
55
.
Em 1984, nos EUA, estudiosos verificaram alguns problemas na interpretação da leitura
das reações do sistema API 20S (Sistema anterior ao API 20 Strep): testes para -glicosidase, N-
acetilglicosaminidase, -galactosidase e fosfatase continham substratos cromogênicos e as
reações eram detectadas por orto e para-nitrofenol de coloração amarela. As reações de cor
amarela eram lidas como positivas, ao passo que as reações incolores ou amarelo-claras eram
lidas como negativas. Em alguns casos, a coloração resultou num amarelo-claro equivocado,
dificultando a leitura destas reações. Reações de carboidratos produziam colorações amarelo-
alaranjadas ou alaranjadas que também apresentavam alguns problemas, enquanto testes de
aminopeptidases (especialmente serina) apresentavam, com freqüência, dificuldade de leitura
3
.
Apesar de o fabricante do API 20 Strep determinar que a cor resultante para uma
interpretação positiva na prova da arginina seja vermelha, verificou-se no presente ensaio que,
com a cepa E. faecalis ATCC 29212, a tonalidade resultante foi a rósea e este padrão seguiu-se
em todas as amostras.
Em 1985, ainda nos EUA, pesquisadores demonstraram que o sistema API 20S
(Analytab Products, Ayerst Laboratories, Plainview, N.Y.) e API Rapid Strep (DMS
Laboratories, Inc., Flemington, N.J.) eram semelhantes por apresentarem os mesmos testes,
porém o API 20S requeria um período de incubação de 4 h e o Rapid Strep dois períodos de
49
incubação - 4 e 24 horas. Neste último sistema, se a identificação não fosse obtida com a leitura
em 4 h, indicava que deveria ser utilizada a instrução do fabricante de incubação overnight do
teste
21, 37
.
Para avaliar a influência do tempo de leitura das reações, foram postas 46 amostras para
reincubação espontânea overnight, ou seja, independentemente do requerimento pelo API 20
Strep. O resultado mostrou que 10 amostras apresentaram uma identificação de espécies com a
leitura de 4 horas, mas, quando lidas em 24 h, apresentaram perfis inaceitáveis. Em 1 amostra, o
perfil de leitura foi considerado inaceitável nos dois momentos de leitura, não sendo identificada
pelo sistema. Em 1 amostra, o perfil de leitura em 4 h foi considerado inaceitável, no entanto, em
24 h a amostra foi identificada. Em 3 amostras, não houve resultado de leitura das reações em 4
h; daí o sistema indicou a necessidade de reincubação overnight e, após este período, a amostra
foi identificada (Tabela 4). Salienta-se o fato de que, das 46 amostras reincubadas
espontaneamente, apenas 3 realmente requereram esta reincubação pelo sistema.
Em 1999, no Canadá, foi publicado um estudo que buscava averiguar a habilidade do
laboratório de Microbiologia em detectar e identificar cocos Gram-positivos catalase-negativos.
Foram identificadas 42 cepas por multiplex PCR, pelo sistema comercial API 20 Strep e por um
algoritmo utilizando métodos fenotípicos tradicionais. A PCR detectou todos os enterococos
com genes van, especialmente os E. faecalis e E. faecium, sensíveis a vancomicina, e excluiu
todos os cocos Gram-positivos catalase-negativos não-enterococos resistentes a vancomicina. O
algoritmo com métodos fenotípicos identificou 41 das 42 cepas (98%) e o sistema API 20 Strep
identificou corretamente apenas 25 (60%) destes microrganismos. O estudo concluiu que o
algoritmo de testes fenotípicos apresentou bom nível de confiança e deveria ser recomendado
para uso, no entanto, o sistema API 20 Strep apresentava baixo nível de confiança e deveria ser
substituído. Em comparação com os outros métodos, a PCR era uma técnica rápida, de detecção
acurada e econômica
47
. No mesmo ano, no Canadá, outros pesquisadores relataram que a
identificação de enterococos pelos métodos convencionais era complicada e requeria de 24 a 48
horas para a obtenção do resultado final e que os métodos automatizados eram incapazes de
identificar com a necessária confiança os enterococos senão E. faecalis e E. faecium, mas a PCR,
identificava-os eficientemente e com rapidez
38
.
Em 2002, na Grécia, um trabalho relatou que na identificação de 392 cepas de
enterococos o sistema API 20 Strep identificou 22 E. durans (5,6%), 61 E. faecalis (15,6%), 98
E. faecium (25,0%) e 86 E. gallinarum (21,9%). Em 125 cepas não identificadas pelo sistema
(31,9%), foi necessária a utilização de provas bioquímicas complementares para obtenção de
resultados precisos
60
. Na Espanha, neste mesmo ano, pesquisadores utilizando técnicas
bioquímicas clássicas, de acordo com o esquema de Carvalho e cols. e Biologia Molecular por
50
PCR, para identificar 305 cepas de enterococos, concluiram que a PCR era uma técnica rápida e
promissora para a identificação de enterococos
18
. No Reino Unido, em 2003, mostrou-se a
presença das discrepâncias na identificação de 10 cepas de enterococos de pacientes
hematológicos, quando os pesquisadores utilizaram provas bioquímicas convencionais
(fermentação de carboidratos, motilidade, pigmentação, fermentação de piruvato e tolerância ao
telurito) e PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis). Na Itália, no mesmo ano, 179 isolados de
enterococos foram identificados pelo sistema Phoenix, API 32 Strep e Vitek 2 (bioMérieux,
Marcy l’Etoile, France), concomitantemente. Em 98,9% dos casos, houve concordância de
resultados entre os sistemas, ou seja, 177 cepas identificadas apresentaram resultados
concordantes e 2 discordantes
26
. No Canadá, ainda neste ano, 406 cepas de cocos Gram-
positivos, catalase–negativos, não beta-hemolíticos, isolados de leite de vaca, foram
identificadas em concomitância pelo método convencional-padrão, pelo sistema API 20 Strep e
API 32 Strep (BioMérieux Canadá, Inc.,Saint-Laurent, Quebec, Canadá). A mudança de
tonalidade inconclusiva das galerias do API 32 Strep dificultou a interpretação da leitura neste
sistema e não no API 20 Strep, e, por esta razão, apenas o resultado das identificações do API 20
Strep foi comparado com o do método tradicional. Apenas 23% dos enterococos foram
corretamente identificados pelo API 20 Strep, de acordo com os testes convencionais. Outros
isolados identificados nas provas convencionais como enterococos foram identificados pelo API
20 Strep como Aerococcus spp, S. uberis ou Lactococcus spp.. Houve acordo entre os dois
procedimentos de identificação para 70% dos S. bovis e 69% dos S. uberis isolados. Para S.
dysgalactiae, nenhuma discrepância relevante foi notada, pois o acordo entre os dois métodos foi
de 91%
15
. Em Zürich, em 2004, 171 cepas de cocos Gram-positivos catalase-negativos foram
identificadas por metodologia molecular (16S rDNA) e pelo sistema de identificação API 20
Strep. Os resultados demonstraram que o API 20 Strep identificou 67 (39%) cepas no contexto
de espécie, 32 (19%) relativamente ao gênero e 72 (42%) dos isolados não foram identificados.
Em comparação, os resultados do seqüenciamento do 16S rDNA identificou 138 (81%) cepas
em relação à espécie e 33 (19%) no âmbito do gênero. Para 42 cepas, das 67 identificadas na
espécie com o API 20 Strep, os resultados foram discrepantes, quando analisados com o método
molecular. Das 72 cepas não alocadas numa taxonomia pelo sistema API 20 Strep, com o
método molecular, 63 cepas foram identificadas em relação a espécie e 9 na contextura do
gênero. O trabalho concluiu que o método molecular é um meio eficaz na identificação de cocos
Gram-positivos catalase-negativos
8
. Nos EUA, neste mesmo ano, um estudo utilizou multiplex
PCR para identificar 23 cepas de enterococos, comparando seus resultados com o de testes
bioquímicos-padrões, com o sistema BBL Crystal, Vitek e API Rapid 32 Strep. Em 90% das
amostras, houve concordância entre a PCR, as provas bioquímicas e o Vitek; 85% concordaram
51
a PCR com o API rapid 32 Strep e 82% a PCR com o Vitek. O estudo concluiu ser a PCR um
método melhorado e rápido para a identificação deste grupo de bactérias
34
. No Brasil, ainda em
2004, o grau de concordância observado na identificação de enterococos com testes bioquímicos
e moleculares por PCR (95% para E. faecalis e E. faecium, 100% para E. gallinarum e E.
casseliflavus) concluiu que um protocolo de PCR pode ser utilizado para uma identificação
rápida e segura de enterococos
55
. Na China, em 2005, 395 cepas de enterococos foram
identificadas com sucesso pelo sistema Rapid 32 Strep, quando seus resultados foram
comparados com os de métodos convencionais propostos por Facklam e Collins
2
. Nos EUA, em
2006, um estudo comparou o resultado da identificação de 90 cepas de enterococos realizado
pelo sistema de automação BD Phoenix, que utiliza susbstratos fluorogênicos, cromogênicos e
provas bioquímicas, com o de métodos tradicionais de identificação. Os resultados mostraram
que, no plano de gênero e espécie, o equipamento apresentou elevado grau de concordância com
as provas bioquímicas convencionais, 99,7% e 99,3% , respectivamente, e que todos os
enterococos foram corretamente identificados
12
. Na Itália, no mesmo ano, um estudo utilizou o
sistema automatizado Phoenix, o sistema API 20 Strep e o sistema ID 32 Strep, além de métodos
moleculares, para a investigação de resultados discordantes, na identificação de 200 cepas de
bactérias Gram-positivas, catalase-negativas. Comparado com o sistema API, o sistema Phoenix
identificou em consonância 180/200 (90,0%) na espécie: 116/129 (89,9%) estreptococos, 63/70
(90,0%) enterococos e 1/1 A. viridans. Nas 20 espécies de resultados discordantes, foram
realizadas provas moleculares em 13 estreptococos, 9 dos quais foram corretamente
identificados no contexto da espécie ou grupo pelo sistema Phoenix e 5 pelo sistema API. Três
(3) isolados não foram identificados por nenhum dos sistemas. Sete (7) resultados discordantes
de enterococos foram corretamente identificados pelo API e não pelo Phoenix. Estreptococos
(4/5) que não puderam ser identificados por Biologia Molecular foram identificados na
contextura de grupo pelos dois sistemas
9
.
No experimento ora relatado, observou-se larga variação de resultados de identificação
entre os sistemas manuais, semi-automatizados e PCR, semelhante ao demonstrado nas
pesquisas há pouco mencionadas. Com relação aos sistemas manuais, o esquema de Facklam
identificou das 62 cepas, 16% (10) das cepas no plano de gênero como sendo Enterococcus sp. e
84% (52) no contexto de espécie como E. faecalis. O esquema Modificado 1 apresentou a
seguinte identificação: 82,2% (51) E. faecalis, 9,7% (6) E. mundtii, e 8,1% (5) E. gallinarum.
Entrementes, o esquema Modificado 2, identificou 98,4% (61) E. faecalis e 1,6% (1) E.
gallinarum (Tabela 1). Estes resultados demonstram que não há concordância entre os sistemas
manuais, seja o original de Facklam ou suas modificações.
52
No que concerne à identificação pelo API 20 Strep, destaca-se a diversidade (3 gêneros, 7
espécies): 51,6% (32) E. faecalis, 19,4% (12) A. viridans, 13,0% (8) E. avium, 4,8% (3) S.
agalactiae, 3,2% (2) E. faecium, 1,6% (1) S. acidominimus, 1,6% (1) A. adiacens, 1,6% (1)
Leuconostoc sp., 1,6% (1) S. uberis e 1,6% (1) Inaceitável (Gráfico 1). Observa-se que, além da
diversidade de espécies encontradas, não há concordância com os métodos manuais.
Sobre à identificação de 10 amostras discrepantes nos sistemas há instantes descritos,
adicionando, ainda, o BBL Crystal, também não houve concordância entre eles, pois o BBL
identificou 6 amostras como E. faecium, inclusive a cepa-controle E. faecalis ATCC 29212 e 4
amostras não foram identificadas (Tabela 8).
Para análise das discrepâncias, usou-se PCR nestas 10 amostras. Verificou-se que 1
(uma) das amostras não amplificou e 9 foram identificadas como sendo do gênero Streptococcus
spp.. Apenas 1 (uma) amostra amplificou para o gênero Enterococcus mas não para a espécie E.
faecalis, indicando ser outra espécie de Enterococcus e 1 (uma) para a espécie S. agalactiae.
Nenhuma das amostras amplificou para a espécie E. gallinarum (Tabela 10).
Os resultados neste passo apresentados concordam com os estudos, ao demonstrar a
ausência de confiabilidade nas identificações apresentadas pelos sistemas utilizados. Ao se
avaliar as discrepâncias encontradas em 10 amostras em cinco sistemas de identificações
(Facklam, Modificado 1, Modificado 2 e API 20 Strep, BBL Crystal) e utilizando a PCR como
método confirmatório, constatou-se a ausência de um sistema confiável de identificação de cepas
de enterococos. Não houve concordância com grau de confiança tal que pudesse expressar, à
certeza, qual a cepa identificada (Tabela 10).
53
6 CONCLUSÕES
Houve concordância de identificação em 84% das amostras entre os sistemas manuais.
Registrou-se identificação em 52% das amostras entre os sistemas manuais e semi-
automatizados.
A utilização de um outro sistema semi-automatizado, em 10 amostras, para confirmar a
identificação de algum dos sistemas, ofereceu mais um resultado discrepante.
Não houve concordância de identificação, em espécie, entre a PCR e os sistemas
utilizados nas 10 amostras.
54
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56. TREITMAN, A. N.; YARNOLD, P. R.; WARREN, J.; NOSKIN, G. A. Emerging incidence
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57. VAN HORN, K.; TÓTH, C.; KARIYAMA, R.; MITSUHATA, R.; KUMON, H. Evaluation
of 15 Motility Media and a Direct Microscopic Method for Detection of Motility in
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Microbial Source Tracking. J Environ, 2002, v. 31, p. 1286 – 1293.
61
APÊNDICES
62
APÊNDICE I – (Reagentes, procedimentos, interpretações)
Agar Sangue
Agar columbia.........................................3,9 g.
Água destilada....................................100,0 mL.
Sangue de carneiro desfibrinado............5,0 mL.
- Pesar o ágar columbia e adicionar os 100 mL de água destilada.
- Autoclavar a 121°C por 15 minutos.
- Deixar esfriar até 50°C e adicionar o sangue de carneiro.
- Distribuir em placas de Petri previamente esterilizadas.
Escala de McFarland
Reagentes: 0,048M BaCl
2
[1,75% (peso/vol) BaCl
2
2H
2
O].
0,35N H
2
SO
4
[1% (vol/vol)].
Procedimento
- Colocar 0,5 mL da solução de 0,048M BaCl
2
em 99,5 mL da solução de 0,35N H
2
SO
4.
- Agitar constantemente.
- Medir a densidade da solução preparada em espectrofotômetro no comprimento de onda
de 625 nm.
- O resultado da absorbância deve estar entre 0,80 e 0,10, o que equivale a 1,5 x 10
8
UFC
/mL.
- Distribuir a solução sob agitação, em tubos com tampa de rosca da mesma espessura dos
tubos utilizados para fazer o antibiograma.
- Validade: 1 mês se mantido protegido da luz e a temperatura ambiente.
- Nota: a escala de McFarland (0,5 a 10) pode ser adquirida comercialmente.
Glicerol para Manutenção de culturas
Reagentes: Glicerol
Caldo BHI
Procedimento
63
Caldo BHI
Infusão cérebro de bezerro..............................................12,5 g.
Infusão de carne e coração................................................5,0 g.
Proteose peptona............................................................10, 0 g.
Glicose...............................................................................2,0 g.
Cloreto de sódio................................................................5,0 g.
Fosfato de disódio..............................................................2,5 g.
- Pesar 37 g da mistura acima e adicionar 1000 mL de água destilada.
- Autoclavar a 121°C por 15 minutos.
Diluição
- Fazer a seguinte diluição: 20 mL de glicerol com 80 mL de BHI.
- Distribuir em alíquotas de 2,5 mL em tubos de vidro com tampa rosqueável de 13 x 100
mm.
Coloração de Gram
Princípio: as bactérias são Gram-positivas ou Gram-negativas de acordo com as diferenças
de composição da parede celular. As Gram-positivas possuem uma parede espessa de
peptidoglicano e grandes quantidades de ácido teicóico, o qual retém o corante inicial (cristal
violeta), não sendo afetado pela descoloração com álcool-acetona. Com isso, as células
aparecem em azul-escuro. As bactérias Gram-negativas possuem parede celular constituída
de uma camada delgada de peptidoglicano, que permite a descoloração do cristal violeta com
álcool-acetona e posterior coloração com o corante de fundo, safranina ou fucsina.
Reagentes: Solução de cristal violeta.
Solução de fucsina.
Solução de lugol.
Procedimento
Solução de cristal violeta
Violeta de genciana ou cristal violeta..................1,0 g.
Água destilada..................................................100,0 mL.
- Dissolver a violeta de genciana na água destilada.
- Em seguida filtrar em papel de filtro.
- Guardar em frasco escuro.
64
Solução de fucsina
Fucsina básica...........................1,1 g.
Água destilada.......................100,0 mL.
- Dissolver a fucsina na água destilada.
- Em seguida, filtrar em papel de filtro.
- Guardar em frasco escuro.
Solução de lugol
Iodo ......................................1,0 g.
Iodeto de potássio................2,0 g.
Água destilada.................300,0 mL.
- Macerar o iodo e iodeto de potássio no grau e pistilo.
- Adicionar água aos poucos, até dissolução completa.
- Guardar em frasco escuro.
Coloração
- Fixar o esfregaço no calor.
- Cobrir o esfregaço com cristal violeta e deixar durante 1 minuto.
- Lavar com água corrente, retirando o excesso de corante.
- Cobrir o esfregaço com lugol e deixar por 1 minuto.
- Lavar com água corrente.
- Descorar com álcool-acetona, até que não escorra mais cristal violeta (cuidado para não
descorar demais).
- Lavar com água corrente.
- Cobrir o esfregaço com fucsina.
- Deixar durante 30 segundos.
- Lavar com água corrente e secar ao ar com papel de filtro.
- Examinar ao microscópio.
Interpretação
Resultado
Cepa
Resultado esperado
Gram – Positivo
E. faecalis
Cocos corados em azul-escuro ou violeta.
Gram – Negativo
K. pneumoniae
Bacilos corados de rosa.
65
Prova da Catalase
Princípio: enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) em água e oxigênio. O
surgimento rápido e a produção sustentada de bolhas de gás ou efervescência constituem
reação positiva
40
.
Reagentes: peróxido de hidrogênio a 3%, conservado em frasco-âmbar sob refrigeração.
Procedimento
- Com um filamento de inoculação em agulha ou com um palito de madeira, transferir
parte do centro de uma colônia para uma lâmina.
- Adicionar uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%.
Interpretação
Resultado
Cepa
Resultado esperado
Positivo
S. aureus
Formação de bolhas e/ou efervescência.
Negativo
E. faecalis
Não há formação de bolhas e/ou efervescência.
Prova da Bile Esculina
Princípio: o microrganismo apresenta a capacidade de hidrolisar esculina na presença de
40% de bile. A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e de um
composto denominado esculetina que, por sua vez, reage com íons férricos (fornecidos pelo
citrato férrico do meio), formando um complexo negro difusível. O enegrecimento difuso de
mais da metade da área inclinada em ágar em 24 - 48 horas indica hidrólise de esculina. Nas
placas são observados halos negros ao redor das colônias isoladas e qualquer grau de
enegrecimento é considerado positivo
40
.
Reagentes: Ágar bile esculina
Água destilada
Procedimento:
Agar bile esculina
Extrato de carne...........................................3,0 g.
Peptona........................................................5,0 g.
Esculina........................................................1,0 g.
Solução da bile do boi................................40,0 g.
Citrato férrico..............................................0,5 g.
Agar...........................................................15,0 g.
66
- Suspender 64,0 g do ágar bile esculina em 1 litro de água destilada.
- Homogeneizar.
- Esterilizar em autoclave à 121°C por 15 minutos.
- Distribuir em alíquotas de 2 mL em tubos de 13x100 mm com tampa rosqueável.
- Deixar solidificar em posição inclinada.
Inoculação
- Semear duas ou três colônias em caldo.
- Incubar por 18 horas a 35°C em estufa com ar ambiente.
Interpretação
Resultado
Cepa
Resultado esperado
Positivo
E. faecalis
Desenvolvimento de tom preto na base e na superficie
inclinada do meio ou apenas na superfície.
Negativo
S. pyogenes
Meio inalterado.
Tolerância ao Cloreto de Sódio
Princípio: os enterococos crescem em caldo BHI com uma concentração de NaCl de 6,5%.
Uma prova positiva é indicada por crescimento bacteriano evidente no meio, com ou sem
viragem do indicador (púrpura de bromocresol). Utilizada em conjunto com a prova de bile-
esculina, um resultado positivo na prova da bile e o crescimento em caldo com 6,5% de NaCl
indica que o microrganismo é espécie de Enterococcus. Se for bile-esculina positivo e não se
desenvolver em caldo com 6,5% de NaCl é um estreptococo do grupo D
40
.
Reagentes: NaCl a 6,5%.
Solução de púrpura de bromocresol à 1,6%.
Água destilada.
Procedimento
Caldo hipercloretado a 6,5%
Caldo BHI (brain heart infusion).......................….....2,5 g.
Cloreto de sódio...........................................................6,5 g.
Glicose.........................................................................0,1 g.
Solução de púrpura de bromocresol a 1,6%...............0,1 mL.
Água destilada......................................................1000,0 mL.
67
- Pesar os componentes ora descritos e dissolvê-los em 1000 mL de água destilada, de
modo a obter uma solução homogênea.
- Distribuir em alíquotas de 2 mL em tubos de vidro, com tampa rosqueável de 13 x 100
mm.
- Esterilizar em autoclave a 121°C por 15 minutos.
Solução de púrpura de bromocresol à 1,6%
Púrpura de bromocresol...........................0,16 g.
Etanol P. A................................................5,0 mL.
Água destilada..........................................5,0 mL.
- Dissolver o corante inicialmente no etanol e depois acrescentar a água destilada.
- Transferir esta solução para um frasco de tonalidade âmbar que possa ser fechado
hermeticamente (pois se o etanol evaporar, o corante precipitará), rotular, datar e manter
em geladeira.
Inoculação
- Semear duas ou três colônias em caldo.
- Incubar por 18 horas a 35°C em estufa com ar ambiente.
Interpretação
Tom original do meio – roxo
Resultado
Cepa
Resultado esperado
Positivo
E. faecalis
Mudança de tonalidade para o amarelo e/ou
turvação do meio.
Negativo
S. bovis
Meio inalterado ou límpido, sem turvação ou
mudança de tom.
Prova do PYR
Princípio: utiliza a L-pirrolidonil- -naftilamida como substrato, hidrolisado por uma
aminopeptidase bacteriana, que libera -naftilamida. Esta é detectada por adição de N,N-
dimetilamonocinamaldeído que, quando se acopla à naftilamida forma uma base de Schiff,
vermelha. Um resultado positivo ocorre pelo desenvolvimento da coloração vermelho-cereja
escura em 1 minuto após adição do reagente
40
.
Reagentes: caldo PYR.
Reagente PYR (p-dimetilaminocinamaldeído a 0,01%).
68
Procedimento
Caldo PYR
Meio Todd-Hewitt, com 0,01% de L-pirrolidonil- -naftilamida, distribuído em tubos
esterilizados com tampa rosqueável, em volumes de 0,2 mL.
Inoculação
- Com uma alça bacteriológica esterilizada, colher duas ou três colônias de aspecto similar e
suspender em caldo PYR.
- Incubar a 35°C por 4 horas.
- Adicionar uma gota do reagente PYR e observar desenvolvimento de cor. A reação pode
ser lida 1 minuto após adição do reagente.
Interpretação
Resultado
Cepa
Resultado esperado
Positivo
E. faecalis
Surgimento de coloração rosa forte ou púrpura.
Negativo
Pediococcus spp
Inalterado.
Desaminação de Arginina
Princípio: ocorre uma reação de descarboxilação (a enzima descarboxilase reage com o
grupo carboxila – COOH - do aminoácido) cujo resultado é uma amina e Co
2
. No início da
incubação, o meio sofre viragem para o amarelo, em virtude da fermentação da pequena
quantidade de glicose contida neles. Quando o aminoácido é descarboxilado, são formadas
aminas alcalinas e o meio reverte à sua tonalidade púrpura original (indicação da prova
positiva)
40
.
Reagentes: caldo descarboxilase de Möeller.
Solução de púrpura de bromocresol à 1%.
Procedimento
Caldo descarboxilase de Möeller
Meio descarboxilase...............................................1,5 g.
Arginina...................................................................1,0 g.
Solução de púrpura de bromocresol à 1%............0,1 mL.
Água destilada....................................................100,0 mL.
- Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante.
69
Solução de púrpura de bromocresol a 1%
Púrpura de bromocresol...........................0,1 g.
Etanol P. A................................................5,0 mL.
Água destilada..........................................5,0 mL.
- Dissolver o corante inicialmente no etanol e depois acrescentar a água destilada.
- Transferir esta solução para um frasco de tonalidade âmbar que possa ser fechado
hermeticamente (pois se o etanol evaporar o corante precipitará); rotular, datar e manter
em geladeira.
Inoculação
- A partir de uma colônia bem isolada do microrganismo em estudo, desenvolvida em meio
primário, semear em dois tubos de meio descarboxilase de Möeller, um com o
aminoácido-teste e o outro sem aminoácido, que será utilizado como controle.
- Colocar óleo mineral esterilizado em ambos os tubos até cerca de 1 cm acima da
superfície do meio e incubar a 35°C por 18 a 24 horas.
Interpretação
Coloração original do meio – roxo
Resultado
Cepa
Resultado esperado
Positivo
E. faecalis
Desenvolvimento de tom roxo intenso.
Negativo
K. pneumoniae
Desenvolvimento de cor amarela.
Fermentação de Carboidratos
Princípio: – utiliza um meio contendo proteína (BHI), um carboidrato (ex., manitol) e um
indicador de pH (púrpura de bromocresol). As bactérias inoculadas podem utilizar a proteína
ou o carboidrato como fonte de energia. Se elas catabolizam o carboidrato e produzem
ácidos, o indicador de pH muda de tom
40
.
Reagentes: Água destilada.
caldo para fermentação de açúcares.
solução de carboidrato a 10%.
70
Procedimento
Caldo para fermentação de açúcares
Brain heart infusion (BHI)..............................................2,5 g.
Solução do carboidrato a 10%......................................10,0 mL.
Solução de púrpura de bromocresol a 1%......................0,1 mL.
Água destilada...............................................................90,0 mL.
- Pesar o BHI e adicionar os 90 mL de água destilada; em seguida, adicionar 0,1 mL do
indicador púrpura de bromocresol.
- Em seguida, esterilizar em autoclave a 121°C por 15 minutos.
- Deixar o meio esfriar até a temperatura de 60°C.
- Adicionar a solução do carboidrato; homogeneizar.
- Distribuir em alíquotas de 2,5 mL em tubos de vidro com tampa rosqueável de 13 x 100
mm.
Solução de carboidrato a 10%
Açúcar (manitol, sorbitol...)...................10 g.
Água destilada......................................100 mL.
- Dissolver 10 g do açúcar em 100 mL de água destilada.
- Esterilizar por filtração.
- Armazenar em alíquotas de 10 mL em tubos de vidro com tampa rosqueável de 13 x 100
mm.
Inoculação
- A partir de uma colônia bem isolada do microrganismo em estudo, desenvolvida em
meio primário, semear em caldo para fermentação de açúcares.
- Incubar por 18 horas a 35°C em estufa com ar ambiente.
Interpretação
Tom original do meio – roxo.
Resultado
Cepa
Resultado esperado
Positivo
E. faecalis
Desenvolvimento de cor amarela.
Negativo
K. pneumoniae
Desenvolvimento de tom roxo intenso.
71
Tolerância ao Telurito
Princípio: ocorre o crescimento de microrganismos na presença de telurito de potássio numa
concentração de 4% e a sua presença é detectada pelo enegrecimento do meio
(40)
.
Reagentes: Água destilada.
ágar Müeller-Hinton.
telurito de potássio.
Procedimento
Agar Mueller-Hinton.............................3,8 g.
Água destilada...................................100,0 mL.
Telurito de potássio................................1,0 mL ou 0,04 g.
- Pesar o ágar Müeller-Hinton e adicionar a água destilada.
- Esterilizar em autoclave a 121°C por 15 minutos. Deixar o meio esfriar até atingir a
temperatura aproximada de 60°C.
- Adicionar o telurito de potássio.
- Distribuir em alíquotas de 3 mL em tubos de 13x100 mm, com tampa rosqueável.
- Deixar solidificar em posição inclinada.
Inoculação
- A partir de uma colônia bem isolada do microrganismo em estudo, desenvolvida em
meio primário, semear no meio acima descrito.
- Incubar a 35°C por até 7 dias.
Interpretação
Resultado
Cepa
Resultado esperado
Positivo
E. faecalis
Surgimento de colônias negras.
Negativo
E. faecium
Ausência de colônias negras.
Motilidade
Princípio: o meio utilizado para a detecção de motilidade deve ter uma concentração de ágar
de 0,4% ou menos, pois, em concentrações maiores, o gel é demasiado firme para permitir
que os microrganismos dispersem livremente. A utilização de meio semi-sólido permite a
dispersão dos microrganismos
40
.
Reagentes: Água destilada.
SIM BIOS Médium.
72
Procedimento
SIM BIOS Médium
Triptona..........................................20,0 g.
Peptona............................................6,0 g.
Sulfato de amônia............................0,2 g.
Sódio tiosulfato................................0,2 g.
Agar Bios L L....................................3,5 g.
- Suspender 30 g em 1000 mL de água destilada.
- Homogeneizar. Esterilizar em autoclave a 121°C por 15 minutos.
- Distribuir em alíquotas de 2 mL em tubos de 13x100 mm, com tampa rosqueável.
Inoculação
- A partir de uma colônia bem isolada do microrganismo em estudo, desenvolvida em
meio primário, semear com agulha até cerca da metade da coluna do meio.
- Incubar a 35°C por até 7 dias.
Interpretação
Resultado
Cepa
Resultado esperado
Positivo
E. casseliflavus
Presença de turvação do meio.
Negativo
E. faecalis
Ausência de turvação do meio.
Pigmento Amarelo - é detectado colhendo-se parte de uma colônia com swab de drácon
branco e examinando-o para presença de tom amarelo ou amarelo-alaranjado
40
.
Interpretação
Resultado
Cepa
Resultado esperado
Positivo
E. mundtii
Presença de coloração amarela.
Negativo
E. faecalis
Ausência de coloração amarela.
P
A
73
Procedimento - API 20 STREP
Preparação do inóculo
Preparar uma suspensão bastante densa: opacidade superior a 4 de McFarland.
Inoculação da galeria
1 Distribuir a suspensão anterior na primeira metade da galeria (testes VP a ADH), evitando a
formação de bolhas (inclinar ligeiramente a caixa de incubação para a frente) e colocar a ponta
da pipeta ou da PSIpeta de lado na cúpula)
1.a Para os testes VP a LAP: distribuir cerca de 100µL em cada cúpula.
1.b Para o teste ADH: encher unicamente o tubo.
2 Na segunda metade da galeria (testes RIB a GLYG):
2.a abrir uma ampola de API GP Médium e transferir o resto da suspensão, ou seja, 0,5 ml no
mínimo. Homogeneizar corretamente.
2.b Distribuir esta nova suspensão unicamente nos tubos.
74
3 Encher as cúpulas dos testes sublinhados ADH a GLYC G com óleo de parafina, formando
um menisco convexo.
4 Fechar a caixa de incubação.
5 Incubar a 36
O
C ± 2
O
C em aerobiose durante 4 – 4 h 30 min para a primeira leitura e 24 h (±
2 h) se necessário, para a segunda leitura.
Leitura e interpretação
Leitura da galeria
Após 4 h de incubação
a) Adicionar os reagentes
- Teste VP: 1gt de VP1 e VP2.
- Testes HIP: 2 gts. de NIN.
- Testes PYRA, α GAL, β GUR, β GAL, PAL, LAP: 1gt de Zym A e Zym B.
b) Esperar 10 min; em seguida, ler todas as reações, consultando o Quadro de Leitura.
*Se necessário, colocar a galeria por baixo de uma lâmpada potente (1000 W) 10 seg para
descolorar o reagente em excesso nos tubos PYRA a LAP.
É necessária uma reincubação
- se o perfil não for encontrado no Catálogo Analítico API 20 STREP;
- se a nota seguinte for indicada para o perfil obtido
IDENTIFICAÇÃO NÃO VÁLIDA ANTES DE 24 HORAS
75
Procedimento BBL Crystal Gram Positivo ID
1 Remover os painéis de sua embalagem. Descartar o dessecante.
2 Num tubo de fluido de inóculo, anotar o número da amostra do paciente na etiqueta.
3 Utilizando técnica asséptica, coletar com swab de algodão estéril (não usar swab de
poliéster) ou com um palito de madeira, colônias de mesma morfologia.
4 Suspender as colônias no tubo de fluido de inóculo BBL Crystal GP.
5 Tampar o tubo e homogeneizar por 10 a 15 segundos.
A turbidez deverá ser equivalente à escala de McFarland n° 0,5.
6 Pegar uma base e anotar a identificação do paciente na lateral.
7 Verter todo o conteúdo do tubo contendo o fluido de inóculo na área preta da base.
8 Segurar a base com as mãos e correr o inóculo suavemente dentro do corredor preto, até que
todos os orifícios sejam preenchidos. Conduzir o excesso de fluido para a área mais larga do
corredor e colocar a base sobre uma superfície plana.
76
9 Encaixar a tampa de modo que o rótulo fique exatamente sobre a área mais larga do corredor
preto da base.
10 Pressione para baixo até sentir uma leve resistência. Coloque os polegares de cada lado da
borda da tampa, no meio do painel e pressione para baixo simultaneamente, até que a tampa
se encaixe em seu devido lugar (atente para o som de dois clicks).
11 Colocar o painel inoculado na bandeja de incubação. Todos os painéis devem ser incubados
dispostos para baixo (janela maior para cima; etiqueta para baixo).
12 O tempo de incubação para os painéis é de 18 a 24 horas a uma temperatura entre +35 a
+37°C. Caso os painéis sejam incubados durante 24 horas, devem ser lidos no período de até
30 minutos após sua retirada da incubadora.
Leitura e Interpretação
Leitura do painel
1 Após o período de incubação recomendado, retirar os painéis da incubadora.
2 Todos os painéis devem ser lidos dispostos para baixo (janela maior para cima; etiqueta para
baixo), usando-se o iluminador BBL Crystal.
3 Leia primeiramente as colunas de E a J, utilizando-se da luz comum (branca).
4 A seguir, leia as colunas de A a D (substratos fluorescentes) utilizando-se da luz UV, no
iluminador. Um orifício com substrato fluorescente é considerado positivo exclusivamente se a
intensidade da fluorescência observada no orifício for maior do que a da fluorescência
verificada no orifício de controle negativo (4
A).
77
5 Consulte o cartão de reação para a interpretação das reações.
6 Cada reação positiva (exceto 4 A, que é utilizada como controle negativo de fluorescência)
recebe um valor de 4, 2 ou 1, correspondente à fila onde se verifica a ocorrência da reação.
Cada resultado negativo recebe um valor de 0 (zero).
7 Procede-se ao somatório dos valores resultantes de cada reação positiva em cada coluna.
8 Obtém-se, dessa forma, um número de dez dígitos; este número é o número de perfil.
Protocolo 1: Extração de DNA
Método: Lise química.
Princípio: adiciona-se, ao pellet, uma solução alcalina contendo SDS (dodecyl sulfato de sódio),
que é um detergente que removedor de lipídeos da membrana celular, seguido de tampão TE,
que contém 10 mM Tris para estabilizar o pH e EDTA que seqüestra o cálcio e o magnésio para
preservar o material (DNA).
Procedimento
1 Semear culturas puras de bactérias em 2 mL de meio caldo BHI e colocar a 37°C por 24 horas.
2 Retirar 1 mL da cultura e centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto em um eppendorf de 1,5 mL e
remover o sobrenadante.
3 Adicionar 40 L de solução de lise ao pellet e homogeneizar no vortex para ressuspender as
células bacterianas.
4 Colocar esta suspensão a 100°C por 15 minutos para secar a parede celular.
5 Em seguida, acrescentar 950 L de tampão TE e homogeneizar no vortex.
6 Armazenar a -20°C.
Soluções e cálculos utilizados:
Solução estoque de lise – p/ 50mL Concentração da solução estoque
NaOH........................2,5mL NaOH – 1M
SDS............................1,25mL SDS - 10%
TE………………….46,25mL
SDS 10% - p/ 10 mL
SDS………….......1g
Água destilada…..9mL
78
NaOH 1M – p/ 5mL
1 mol - 40 g
1 L - 40 g
1000 mL – 40 g
10 mL - X
TE
10mM Tris – pH 8,0.
1mM EDTA - 0,37224 gr.
Esterilizar em autoclave a 121°C por 15 minutos.
Armazenar a 4°C.
Protocolo 2: Reação em Cadeia da Polimerase – PCR
Reconstituição dos iniciadores (primers)
1Centrifugar por 1 minuto a 12.000 rpm para desprender o liofilizado.
2Cálculo da quantidade de água que deve ser utilizada para reconstituição:
(1) Universal
Verso: 34900pmoles
500pmoles 1 L
34900pmoles x x = 69,8 L.
Reverso: 26800pmoles
500pmoles 1 L
26800pmoles x x = 53,6 L.
(2) Enterococcus
Verso: 33400pmoles
500pmoles 1 L
33400pmoles x x = 66,8 L.
X = 40 x 10 X = 0,4 g P/ 5 mL 0,2 g ou 0,02 mg.
1000
79
Reverso: 37600 pmoles
500pmoles 1 L
37600pmoles x x = 75,2 L.
(3) E. faecalis
Verso: 40900pmoles
500pmoles 1 L
40900pmoles x x = 81,8 L.
Reverso: 39500 pmoles
500pmoles 1 L
39500pmoles x x = 79,0 L.
(4) E. gallinarum
Verso: 44200pmoles
500pmoles 1 L
44200pmoles x x = 88,4 L.
Reverso: 28800 pmoles
500pmoles 1 L
28800pmoles x x = 57,6 L.
(5) S. agalactiae
Verso: 28700pmoles
500pmoles 1 L
28700pmoles x x = 57,4 L.
Reverso: 44400 pmoles
500pmoles 1 L
44400pmoles x x = 88,8 L.
3 Após reconstituído deixar a 4°C por 24 horas para estabilizar e daí poder ser utilizado.
4 Diluição da solução estoque:
para um volume final de 100 L numa concentração de 50 pmol
10 L da solução estoque (liofilizado reconstituído) + 90 L de água.
80
Preparação do Mix:
Quantidade
Componentes
1 X
3X
9X
11X
12X
Tampão 10X
5 L
15 L
45 L
55 L
60 L
MgCl
2
25mM
1 L
3 L
9 L
11 L
12 L
DNTPMix 25mM
0,4 L
1,2 L
3,6 L
4,4 L
4,8 L
Primer 1 (verso) 10 M
1 L
3 L
9 L
11 L
12 L
Primer 2 (reverso) 10 M
1 L
3 L
9 L
11 L
12 L
Taq Polimerase
0,5 L
1,5 L
4,5 L
5,5 L
6 L
H
2
O
39,1 L
117,3 L
351,9 L
430,1 L
469,2 L
Total
48,0 L
144,0 L
432,0 L
528,0 L
576,0 L
Quantidade de Mix e DNA utilizado na preparação final
Amostra
Mix
DNA
Para 01 amostra
48,0 L
2,0 L
Colocar as amostras no termociclador com a seguinte programação:
Ciclo Inicial
30 ciclos
Ciclo Final
Desnaturação
94°C – 45 segundos
Extensão
94°C
52°C – 1 minuto
72°C – 10 minutos
3 minutos
72°C – 1 minuto
Eletroforese
Reagentes: agarose.
TBE.
Tampão de carregamento.
Tampão TBE
Tris base..........60,5 g.
Ácido bórico.....30,91 g.
EDTA...............9,306 g.
Dissolver em 300 mL, ajustar pH final 8,0 com HCl.
Completar o volume final para 500 mL e esterilizar em autoclave a 121°C por 15 minutos.
81
Preparo do gel de agarose (1,0%)
Pesar 0,5g de agarose e adicionar 50 mL de tampão TBE.
Dissolver a agarose em frasco do tipo Erlenmeyer em manta aquecedora.
O tampão não deve ocupar mais do que 50% do volume do frasco. Deixar esfriar.
Selar com fita do tipo crepom as laterais de bandeja para gel de agarose.
Adicionar o gel de agarose.
Posicionar o pente, de modo que fique o espaço de ~ 1 mm para a base da bandeja.
Deixar o gel solidificar à temperatura ambiente e depois remover cuidadosamente o pente.
Colocar a bandeja contendo o gel no tanque eletroforético e adicionar solução-tampão TBE até
cobrir o gel em aproximadamente ~ 1 mm.
Adição da amostra
Pipetar 15µL de amostra do DNA , adicionar 7 µL de solução loading buffer (tampão de
carregamento)
Corrida eletroforética
Adicionar 3 µL de brometo de etídio no lado oposto aos poços de carregamento da amostra de
DNA .
Colocar a tampa do tanque e conectar os respectivos cabos.
Conectar o cabo preto (cátodo) no mesmo lado dos poços de carregamento, enquanto que o cabo
vermelho (ânodo) no lado oposto.
Aplicar voltagem de 80V por 90 minutos.
Visualização do DNA em luz ultravioleta
Desligar a voltagem quando observar que os corantes se moveram até a metade do comprimento
do gel.
Examinar o gel em câmara escura contendo transiluminador de luz ultravioleta a 302 nm.
Fotografar em máquina polaroid.
82
ANEXOS
83
ANEXO I – Microrganismos identificados no sistema API 20 Strep
84
ANEXO II – Microrganismos identificados no sistema BBL Crystal
Actinomyces pyogenes
Aerococcus species (includes A.
urinae and A. viridans)
Aerococcus urinae
Aerococcus viridans
Allolococcus otitidis *
Arcanobacterium haemolyticum*(2)
Bacillus brevis
Bacillus cereus
Bacillus circularis
Bacillus coagulans
Bacillus licheniformis
Bacillus megaterium
Bacillus purnilus
Bacillus species (includes B. brevis,
B. circularis, B. licheniformis, B.
megaterium, B. purnilus and B.
sphaericus, P. alvei, P. macerans)
(9)
Bacillus sphaericus
Bacillus subtilis (1)
Corynebacterium aquaticum
Corynebacterium bovis
Corynebacterium diphteriae
(includes C. diphteriae subsp gravis.
C. diphteriae subsp mitis and C.
diphteriae subsp intermedius)
Corynebacterium genitalium
Corynebacterium jeikeium (7)
Corynebacterium kutscheri
Corynebacterium propinquum (1)
Corynebacterium pseudodiphteriticum
(2)
Corynebacterium pseudogenitalium
Corynebacterium pseudotuberculosis
Corynebacterium renale group
Corynebacterium species (includes
C. aquatium, C. bovis, C. kutscheri,
C. propinquum, C.
pseudodiphteriticum, C.
pseudotuberculosis, C. renale
group, C. striatum and C. ulcerans)
(29)
Corynebacterium striatum (6),
Corynebacterium ulcerans,
Enterococcus avium (3),
Enterococcus casseliflavus/
gallinarum (14)
Enterococcus durans (2)
Enterococcus faecalis (78)
Enterococcus faecium (33)
Enterococcus hirae
Enterococcus raffinosus
Enterococcus solitarius
Erysipelothrix rhusiopathiae
Gardnerella vaginalis
Germella haemolysans
Germella morbillorum
Germella species (includes G.
haemolysans and G.
morbillorum)
Globicatella sanguis (3)
Helcococcus kunzii, Lactococcus
garvieae, Lactococcus lactis
subsp. cremoris
Lactococcus lactis subsp.
hordniae
Lactococcus lactis subsp. lactis
Lactococcus raffinolactis
Lactococcus species (includes L.
lactis subsp. cremoris, L. .lactis
subsp. hordniae
L. lactis subsp. lactis
L. raffinolactis)
Leuconostoc citreum
Leuconostoc lactis (1)
Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides
Leuconostoc
pseudomesenteroides
Leuconostoc species (includes L.
citreum, L. lactis, L.
mesenteroides subsp.
mesenteroides and
L. pseudomesenteroides)
Listeria grayi*
Listeria ivanovii subsp ivanovii
Listeria monocytogenes (3)
Listeria murray
Micrococcus kristinae
Micrococcus luteus
Micrococcus lylae
Micrococcus roseus
Micrococcus sedentarius
Micrococcus species (includes
M. kristinae
M. luteus
M. lylae
M. roseus
M. sedentarius) (10)
Oerskovia species (includes O.
turbata and O. xanthineolytica)
Paenibacillus alvei
Paenibacillus macerans
Pediococcus damnosus
Pediococcus parvulus
Pediococcus pentosaceus
Pediococcus species
(includes P. damnosus
P. parvulus
P. pentosaceus)
Rhodococcus equi
Rothia dentocariosa* (1)
Staphylococcus aureus (88)
Staphylococcus auriculars
(2)
Staphylococcus capitis
(includes S. capitis subsp.
capitis and S. capitis subsp
ureolyticum) (13)
Staphylococcus caprae
Staphylococcus carnosus
Staphylococcus cohnii
(includes S. cohnii subsp
cohnii and S. cohnii subsp
urealyticum) (1)
Staphylococcus cohnii subsp
cohnii
Staphylococcus cohnii subsp
urealyticum
Staphylococcus epidermidis
(88)
Staphylococcus equorum
Staphylococcus felis
Staphylococcus gallinarum
Staphylococcus haemolyticus
(23)
Staphylococcus homins (17)
Staphylococcus intermedius
Staphylococcus kloosii
Staphylococcus lentus
Staphylococcus lugdunensis
(3)
Staphylococcus pasteuri* (1)
Staphylococcus
saccharolyticus (6)
Staphylococcus
saprophyticus
Staphylococcus scheleiferi
(includes S. scheleiferi subsp
coagulans and S. scheleiferi
subsp. scheleiferi)
Staphylococcus sciuri
Staphylococcus simularis
Staphylococcus vitulus
Staphylococcus warneri (6)
Staphylococcus xylosus (1)
Stomatococcus mucilaginosus
(6)
Streptococcus acidominimus
Streptococcus agalactiae (54)
Streptococcus arginosus (1)
Streptococcus bovis (includes S.
bovis and S. bovis) (10)
Streptococcus constellatus (1)
Streptococcus cricetus*
Streptococcus crista
Streptococcus equi (includes S.
equi subsp equi and S. equi
subsp zooepidermicus) (1)
Streptococcus equi subsp equi
Streptococcus equi subsp
zooepidermicus
Streptococcus equinus
Streptococcus gordonii
Streptococcus Group C/G (11)
Streptococcus intermedius
Streptococcus milleri group
(includes S. anginosus, S.
constellatus and S. intermedius)
(20)
Streptococcus mitis (4)
Streptococcus mitis (4)
Streptococcus mitis group
(includes S. mitis and S. oralis)
Streptococcus mutans
Streptococcus mutans group
(includes S. cricetus, S. mutans
and S. sobrinus) (2)
Streptococcus oralis
Streptococcus parasanguis (1)
Streptococcus pneumoniae (54)
Streptococcus porcinus
Streptococcus pyogenes (50)
Streptococcus salivarius (3)
Streptococcus salivarius group
(includes S. salivarius and S.
vestibularis) (4)
Streptococcus sanguis (2)
Streptococcus sanguis group
(includes S. crista, S. gordonii,
S. parasanguis and S. sanguis)
Streptococcus sobrinus
Streptococcus uberis
Streptococcus vestibularis
Turicella otitidis*
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