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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
Análise de mutações nos genes FMR1 e MTHFR em pacientes com transtornos
do espectro autista idiopático
Dissertação submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre.
Pollyanna Almeida Costa dos Santos
Orientadora: Profª Dra. Lavínia Schüler-Faccini
Co-orientadora: Dra. Sandra Leistner-Segal
Porto Alegre
05 de março 2010
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre e no Departamento de Genética da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul sob o apoio financeiro do CNPq, CAPES e FIPE-HCPA.
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(...) Já ancorado na Antártica, ouvi ruídos
que pareciam de fritura. Pensei: Será que até
aqui existem chineses fritando pastéis? Eram
cristais de água doce congelada que faziam
aquele som quando entravam em contato com a
água salgada. O efeito visual era belíssimo.
Pensei em fotografar, mas falei pra mim mesmo
- Calma, você terá muito tempo para isso... Nos
637 dias que se seguiram, o fenômeno não se
repetiu. As oportunidades são únicas (...).
Amir Klink
A todas as crianças, especialmente as
“especiais”:
As pessoas grandes não compreendem nada
sozinhas, e é cansativo, para as crianças, estar
a toda hora explicando.
O pequeno príncipe – Saint-Exupéry
Agradecimentos
Agradeço às famílias que aceitaram participar do estudo por compartilharem conosco
suas expectativas e suas frustrações, e por acreditarem no nosso trabalho.
À minha orientadora, Dra. Lavínia Schüler-Faccini, por lutar junto comigo neste
projeto, e pelo apoio nos momentos mais necessários.
À minha co-orientadora, Dra. Sandra Leistner-Segal, pela exequibilidade laboratorial
deste trabalho.
Aos amigos e funcionários do PPGBM pelo companheirismo, especialmente à
Luciana Tovo, Caio César e Ana Paula Brandalize pela cumplicidade e deliciosos
momentos de descontração.
À Eliane Bandinelli pela ajuda com os polimorfismos, pelas idéias sempre muito
pertinentes, e por estar sempre disposta e animada.
À Danae Longo, por ter sido tudo neste trabalho. Sem ela este projeto sequer
existiria.
Aos meus queridíssimos colegas de laboratório Daniel Graichen, Guilherme B.
Santos, Lucas Fraga, Bibiane Godoy e Caroline Gross, pelas enriquecedoras e nem-
tão-enriquecedoras conversas.
À minha família que sempre me apóia em todas as minhas escolhas, e acredita no
meu potencial.
Ao Ricardo Abu Hana pelo companheirismo, afeto, incentivo e apoio no
desenvolvimento deste trabalho.
À Têmis Felix pela avaliação clínica dos pacientes.
E a todos os amigos que de alguma forma fazem parte da minha vida: simplesmente
por saber que vocês existem, torno-me muito mais feliz.
vi
Sumário
Sumário........................................................................................................................vi
Índice de Quadros......................................................................................................viii
Índice de Tabelas.........................................................................................................ix
Índice de Figuras..........................................................................................................x
Lista de Abreviaturas...................................................................................................xi
Resumo.......................................................................................................................xii
Abstract......................................................................................................................xiii
Capítulo I...................................................................................................................14
1. Introdução........................................................................................................15
1.1. Autismo............................................................................................................15
1.2. Incidência.........................................................................................................19
1.3. Etiologia...........................................................................................................20
1.4. O autismo secundário: fatores genéticos e ambientais...................................21
1.5. Síndrome do X-Frágil.......................................................................................26
1.6. Autismo e X-Frágil...........................................................................................32
1.7. Autismo e o metabolismo do ácido fólico.........................................................35
Capítulo II..................................................................................................................40
2. Objetivos..........................................................................................................41
2.1. Objetivo Geral..................................................................................................41
2.2. Objetivos Específicos......................................................................................41
Capítulo III.................................................................................................................42
3. Materiais e Métodos........................................................................................43
3.1. População alvo................................................................................................43
3.2. Critérios de Inclusão........................................................................................43
3.3. Critérios de Exclusão.......................................................................................44
3.4. Termo de Consentimento Informado...............................................................44
3.5. Tamanho da amostra.......................................................................................45
3.6. Métodos Laboratoriais.....................................................................................45
vii
3.7. Análise Comportamental..................................................................................47
3.8. Análise de dados..............................................................................................47
Capítulo IV - Artigo 1................................................................................................49
MTHFR C677T is not a risk factor for Autism Spectrum Disorders in South
Brazil...........................................................................................................................50
Capítulo V- Artigo 2…………………………………….………….……………………..64
Fragile X Syndrome diagnostic in sample of individuals with idiopathic Autism
Spectrum Disorders....................................................................................................65
Capítulo VI.................................................................................................................80
6. Discussão............................................................................................................81
Capítulo VII................................................................................................................87
7. Referências Bibliográficas.................................................................................88
Anexo I.......................................................................................................................97
8. Anexo................................................................................................................98
viii
Índice de Quadros
Quadro 1. Subgrupos das desordens de desenvolvimento global (PDDs) segundo a
classificação do Manual Estatístico e Diagnóstico das Desordens Mentais da
Associação Americana de Psiquiatria (American Psychiatric Association, 2000). ..... 18
Quadro 2. Prevalência estimada para síndromes ligadas ao X com características
autistas. Adaptado de Marco & Skuse (2006) ............................................................ 23
Quadro 3. Patologias potencialmente associadas ao Transtorno Autista .................. 26
ix
Índice de Tabelas
Tabela 1. Frequências de SXF em amostras de TEA................................................81
Tabela 2. Distribuição das freqüências alélicas do polimorfismo C677T do gene
MTHFR em diferentes estudos...................................................................................86
x
Índice de Figuras
Figura 1. Representação do gene FMR1..................................................................29
Figura 2. Representação esquemática do metabolismo da homocisteína................38
xi
Lista de Abreviaturas
APAE = Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais
DP = Desvio padrão
EEG = Eletroencefalograma
FMR1 = Fragile Mental Retardation 1
FMRP1 = Fragile Mental Retardation Protein 1
MECP2 = Methyl–CpG–binding protein 2
MTHFR = Metilenotetrahidrofolato redutase
PCR = Reação de Polimerização em Cadeia
POF = Disfunção Ovariana Prematura
STA = Síndrome do Tremor/Ataxia associada a Síndrome do X-frágil
SXF = Síndrome do X-frágil
TC = Tomografia computadorizada
TDAH = Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade
TEA = Transtorno do Espectro Autista
TGD-NE = Transtorno Global do Desenvolvimento sem nenhuma especificação
5’ – UTR = Região não traduzida 5’
xii
Resumo
O transtorno do espectro autista (TEA) é uma alteração do desenvolvimento
neuropsiquiátrico que afeta três grandes áreas: interesse social, dificuldade de
comunicação e comportamentos restritos. O TEA pode estar presente em algumas
síndromes já bem descritas, como a Síndrome do X frágil (SXF), que é a mais
frequente causa de retardo mental herdável, e também está associada a transtornos
de desenvolvimento. O gene MTHFR faz parte do metabolismo do ácido fólico e está
associado a síntese de nucleotídeos e metilação do DNA. O polimorfismos C677T
deste gene, está relacionado a hipometilação quando na presença do alelo T,
levando a alterações na expressão gênica. O objetivo deste trabalho foi investigar a
ocorrência da síndrome do X-frágil e de variantes polimórficas no gene MTHFR em
uma amostra de pacientes do sexo masculino e feminino com TEA. Analisamos
uma amostra de 154 crianças diagnosticadas com TEA idiopático, sendo que 136
destas foram testadas para a SXF (97 meninos e 39 meninas). Todas as análises
moleculares foram feitas a partir da técnica de PCR. Uma vez que a triagem fosse
positiva para SXF, o DNA do paciente foi encaminhado para confirmação por
Southern Blotting. Nossa análise molecular identificou três (3,1%) meninos com
mutação completa, e para a maioria das meninas o resultado se mostrou
inconclusivo (71,8%). Para o teste de associação do polimorfismo C677T do gene
MTHFR e a susceptibilidade a TEA, analisamos 151 crianças com TEA idiopático e
100 crianças controles. Não foram observadas diferenças significativas na
distribuição alélica (T=0,38 casos e T=0,35 controle) nem na distribuição genotípica
(p=0,72) entre os dois grupos. Nenhuma associação foi encontrada entre a presença
do alelo T e comportamentos autistas selecionados: evitação do olhar, movimentos
corporais complexos e auto-agressão. Estes resultados mostram que a SXF
representa uma fração importante dos casos de autismo idiopático pois nem sempre
a expressão clinica da doença é identificada pela equipe medica. Além disto, ao
contrario de outros trabalhos prévios, na nossa população, polimorfismos no gene
xiii
MHTFR não representam papel na suscetibilidade aos transtornos do espectro
autista.
Abstract
Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder that acts in three
areas: social interests, communication difficulties and restrict behaviors. ASD can be
present in Fragile X Syndrome (FXS) that is the most frequent cause of inherited
mental retardation and it is also associated a developmental disorders. The MTHFR
gene plays in acid folic pathway and it is associated with the nucleotide synthesis and
DNA methylation. The C677T MTHFR polymorphism is related with hypomethylation
when T allele is present, leading to genic expression alterations. We analyzed a
sample of 154 children with idiopatic TEA, being 136 tested for XFS through PCR
technique (97 males and 39 females). All molecular analysis were made from PCR
technique. Once the screening was positive for FXS, the patient DNA was referred
for confirmation by Southern Blotting. In our molecular analyse, we identified three
(3.1%) boys with full mutation, and for the girls, 71.8% was inconclusive. By
analysing the MTHFR C677T polymorphism association and the susceptibility for
TEA, we analyzed 151 children with idiopatic TEA and 100 controls children. There
were any significant differences in allelic distribution (T=0.38 cases and T=0.35
controls) or genotypic distribution (p=0.72) between the groups. No association was
found between the presence of T allele and autistic behaviors selected: averted gaze,
complex body movements and self-injury behavior. These results show that FXS
presents a significant part of idiopatic autism cases because is not always the
expression of clinical disease is identified by the medical team. Moreover, unlike
other previous studies, in our population, polymorphisms in the gene MHTFR do not
represent role in susceptibility to autism spectrum disorders.
14
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
15
1. Introdução
1.1. Autismo
O termo ‘autismo’ foi primeiramente usado por Bleuler, em 1911, para
designar crianças que, aparentemente, haviam perdido o contato com a realidade
apresentando grande dificuldade ou incapacidade de comunicação. Mais tarde,
em 1943, Leo Kanner, um psiquiatra da Universidade Johns Hopkins, usou o
mesmo termo para descrever 11 crianças que compartilhavam o mesmo
comportamento peculiar: dificuldade na interação social e extrema atração por
objetos inanimados. Ele descreveu o autismo como uma síndrome rara,
caracterizada pela inabilidade inata em estabelecer contato afetivo com outras
pessoas.
Em 1944, Hans Asperger, pediatra austríaco, publicou um artigo que
descrevia crianças com os mesmos sintomas dos pacientes de Kanner;
entretanto as habilidades cognitivas e verbais eram mais preservadas em seus
pacientes. O transtorno de Asperger é, algumas vezes, chamado como “uma
forma mais branda de autismo”, o que subestima o impacto negativo do
transtorno na maioria dos indivíduos afetados. Indivíduos com Asperger têm, por
definição, habilidades cognitivas medianas ou acima da média e desenvolvimento
da linguagem durante a pré-escola; eles podem desenvolver conhecimentos
16
avançados de linguagem e interesses atípicos num assunto e/ou intensidade
(Johnson et al. , 2007; Caronna et al. , 2008).
Baseados na descrição de Kanner, numerosos estudos envolvendo a
epidemiologia, classificação e identificação do autismo se seguiram. Esses
estudos contribuíram significativamente para a elucidação dos aspectos
biológicos envolvidos na síndrome, mas, ao mesmo tempo, revelaram que o
autismo não é uma entidade simples, e sim uma desordem comportamental
complexa, com etiologias múltiplas e variáveis níveis de severidade (Keller &
Persico, 2003).
O nível de gravidade do quadro clínico dos indivíduos caracterizados como
autistas varia de crianças não-verbais com importante retardo mental (Gillberg &
Coleman, 2000) até estudantes de QI acima da média, a despeito de linguagem e
uso de habilidades sociais inadequados (Baron-Cohen et al., 2001). Apesar de
80% das crianças autistas apresentarem retardo mental, as habilidades Savant,
ou seja, desempenho extraordinário em certos domínios cognitivos como cálculo,
música, artes e memória, apesar de QI global baixo; são 200 vezes mais
comuns em autistas do que em outras formas de retardo mental (Treffert &
Wallace, 2002).
Autismo é um transtorno global do desenvolvimento neurológico, e é
evidente a partir dos três anos de idade. Neste transtorno as crianças podem
apresentar vários níveis de dificuldades nas áreas de comunicação, interação
social, tendência a comportamentos repetitivos e falta de imaginação. Crianças
17
com autismo têm dificuldades de entender como iniciar e responder a uma
conversa, têm dificuldades de acompanhar o ritmo de comunicação social, e
podem não entender as intenções dos outros, principalmente quando estas são
expressadas através de gestos e linguagem (McConachie & Diggle , 2007).
Portanto, devido à heterogeneidade fenotípica, ou seja, a grande variação
observada nos padrões comportamentais e nos níveis de habilidade social e
comunicativa dos pacientes, hoje esses padrões são mais propriamente reunidos
sob a designação de Transtornos do Espectro Autista (TEA).
Os critérios de diagnóstico para TEA não estavam incluídos na terceira
edição do Manual Diagnóstico e Estatístico de Doenças Mentais (DSM, do inglês
Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders), sendo que os mais
recentes são encontrados no DSM–IV. Segundo a classificação dos transtornos
de desenvolvimento global (pervasive developmental disorders – PDD) da
Associação Americana de Psiquiatria (American Psychiatric Association, 2000),
as PPDs são divididas em Transtorno Autista, Transtorno de Asperger,
Transtorno Global do Desenvolvimento sem outra especificação, Transtorno
Desintegrativo da Infância e Transtorno de Rett (Quadro 1). Embora a Síndrome
de Rett e o Transtorno Desintegrativo do Infância estejam incluídos na listagem
do DSM-IV, eles não são considerados TEA, mas devem ser contemplados no
diagnóstico diferencial de cada criança, dependendo da apresentação dos sinais
e sintomas (Freitag, 2007; Johnson et al. , 2007). A Síndrome de Rett não está
incluída nos TEA por ter uma causa genética conhecida – mutações no gene
18
MeCP2, e o Transtorno Desintegrativo da Infância está associado a transtornos
metabólicos e neurológicos, como mucopolissacaridose San Filippo e encefalite
virótica, além de apresentar um desenvolvimento normal até os 2 anos de vida,
ao contrário dos casos de TEA, onde a criança pode apresenta sintomas desde
os primeiros meses de vida (Mercadante et al., 2006).
Quadro 1. Subgrupos dos transtornos de desenvolvimento global (PDDs) segundo a
classificação do Manual Estatístico e Diagnóstico dos Transtornos Mentais da Associação
Americana de Psiquiatria (American Psychiatric Association, 2000).
Transtornos de
Desenvolvimento Global (PDD)
Características
Transtorno Autista * Autismo clássico.
Transtorno de Rett
Desordem genética no desenvolvimento cerebral
pós-natal, causado por um gene simples, afetando
predominantemente meninas.
Transtorno Desintegrativo da
Infância
Regressão cognitiva, comportamental e na
linguagem entre dois e 10 anos, precedida de
desenvolvimento completamente normal.
Transtorno de Asperger *
Desenvolvimento da linguagem na idade
esperada, sem retardo mental.
Transtorno Global do
Desenvolvimento sem outra
especificação *
Indivíduos com algumas características autistas e
não pertencem as categorias anteriores.
*Também denominadas conjuntamente como transtornos do espectro do autismo (TEA).
19
1.2. Incidência
As estimativas da prevalência de TEA vêm aumentando nas últimas
décadas. Na década de 1970 e 1980, a incidência era de 5 a 6 por 10 mil. No ano
2002, aumentou para 66 por 10 mil. As possíveis origens desse aumento na
incidência parecem estar ligadas à maior informação da população, e aos
avanços na detecção e na ampliação dos critérios de diagnóstico (Deth et al. ,
2007; Rice et al. , 2007).
A prevalência do TEA varia dependendo do critério de inclusão e da
população em estudo, variando de 4 a 66 por 10 mil. Uma pesquisa nacional
britânica com crianças de 5 a 15 anos de idade encontrou uma prevalência de 26
por 10 mil; nos Estados Unidos, o Centro de Controle e Prevenção a Doenças
estimou uma prevalência de 6,7 casos de TEA para cada mil crianças (Williams
et al., 2006;
Centers for Disease Control and Prevention, 2007; McConachie &
Diggle, 2007; MMWR Survaillance, 2007).
Os TEA aparecem em terceiro lugar entre os transtornos de
desenvolvimento depois das malformações congênitas e a síndrome de Down
(Williams et al., 2006). A taxa aumenta para duas a cinco ocorrências em cada
1.000 indivíduos em estudos que consideraram os critérios de TEA (Wing &
Potter, 2002). No Brasil, na ausência de dados oficiais, a Associação Brasileira
de Autismo calcula que existam cerca de 600.000 pessoas com a doença (Bosa
& Callias, 2000). O Transtorno Autista é mais comum em meninos do que em
20
meninas, com razão sexual em torno de 3:1 e 4:1 (Gillberg, 1993; Fombonne,
1998, AACAP Official Action, 1999).
1.3. Etiologia
Desde a primeira descrição do autismo por Kanner (1943), alguns dos
seus aspectos característicos começaram a ser notados na personalidade de
alguns dos pais de crianças autistas. Essas observações, inicialmente, foram
interpretadas como se as características parentais, influenciando na educação
dos filhos, estivessem levando ao desenvolvimento do transtorno.
Posteriormente, foi reconhecido que o autismo estava associado com retardo
mental em mais do que 75% dos casos (Lockyer & Rutter, 1969) e com epilepsia
em cerca de 33% (Rutter, 1970), o que levou a confirmação de que o autismo, de
fato, possuía uma base orgânica.
Centenas de estudos têm tentado desvendar os fatores genéticos
associados à doença. As causas neurobiológicas, associadas ao autismo, tais
como convulsões, deficiência mental, diminuição de neurônios e sinapses na
amígdala, hipocampo e cerebelo, tamanho aumentado do encéfalo e
concentração aumentada de serotonina circulante, sugerem um forte
componente genético. Além disso, estudos com gêmeos têm demonstrado uma
concordância que varia de 32 a 90%, em contraste com gêmeos dizigóticos, onde
a concordância é mais baixa, de 0 a 5%. Embora o risco de recorrência para o
autismo seja baixo, entre 2 e 8%, o risco relativo é de 50 a 200 vezes maior que
21
a prevalência da doença na população em geral (Carvalheira et al. , 2004;Marco
& Skuse, 2006).
Os casos de autismo podem ser divididos em: “idiopático”, sem causa
definida, o qual compreende a maioria dos casos e se estima que mais de 10
genes estejam associados, e “secundário”, onde agentes ambientais, anomalias
cromossômicas ou alterações gênicas podem ser identificadas. De 5-10% dos
indivíduos com autismo podem ser diagnosticados como secundário; os restantes
90-95% possuem autismo idiopático resultado das interações de múltiplos genes
(Lintas and Persico, 2008). Cerca de 30% das crianças com autismo idiopático
possuem uma forma complexa, definida pela presença de características
dismórficas ou microcefalia ou uma má-formação estrutural do cérebro (Barton &
Volkmar, 1998; Marco & Skuse, 2006).
1.4. O autismo secundário: fatores genéticos e ambientais
Muitas doenças genéticas estão associadas com um aumento de risco
para TEA. As mais comuns são Esclerose Tuberosa, Síndrome do X-frágil.
Algumas mais raras, mas tratáveis com medicamentos, são a Fenilcetonúria e
Síndrome de Smith-Lemli-Optiz. A Fenilcetonúria não tratada como causa de
TEA tem se tornado cada vez mais rara em países com um programa de
acompanhamento neonatal. Estudos epidemiológicos têm mostrado que a
22
prevalência de TEA em portadores de Esclerose Tuberosa é mais de 100 vezes
maior que o esperado (Caronna et al., 2008; Freitag, 2007).
Evidências sugerem que influências genéticas do cromossomo X tenham
um papel importante na vulnerabilidade masculina para TEA. No quadro 2 estão
descritas as prevalências estimadas para algumas síndromes ligadas ao X com
características secundárias do TEA. Anormalidades citogenéticas são
encontradas em 3-5% de indivíduos portadores de TEA. De 7-10% das crianças
portadores da Síndrome de Down apresentam autismo, sendo a mais prevalente
anormalidade citogenética (Gosh et al., 2008). Outra anormalidade genética
frequentemente encontrada é a do cromossomo 15q11-13, com uma taxa de
aproximadamente 1%, sendo na maioria dos casos uma duplicação da região
materna ou um cromossomo supernumerário, que é uma duplicação invertida. O
fenótipo da duplicação ou inversão em 15q11-13 é caracterizado por uma alta
incidência de epilepsia na infância, hipotonia muscular e problemas de
coordenação motora, juntamente com retardo mental grave ou moderado, atraso
ou falta de fala, e algumas vezes, grave hiperatividade. Deleções das regiões
cromossômicas 15q11-13 maternas ou paternas são associadas com duas
doenças relacionadas a imprinting: Síndrome de Angelman e Prader-Willi,
respectivamente (Freitag, 2007; Gupta & State, 2007).
23
Quadro 2. Prevalência estimada para as principais síndromes ligadas ao X com
características autistas. Adaptado de Marco & Skuse (2006)
Doença ligada ao X Prevalência
Síndrome de Turner (XO) - 5/10.000 nascimentos de mulheres
- Mais de 25% com TEA
Síndrome de Klinefelter (XXY) - 10-40/10.000 na população em geral
Síndrome do X-Frágil - 2,5/10.000 homens
- Mais de 30% tem critérios para TEA
Síndrome de Rett (MECP2) - 1/10.000 meninas recém-nascidas
- 2,8% das meninas com TEA
Em uma revisão, Freitag (2007) relatou algumas deleções cromossômicas
em 2q37, 7q31, 22q11 e 22q13.3 como alvos importantes no estudo de avaliação
citogenética para autismo. Algumas síndromes causadas por microdeleções
cromossômicas estão associadas à presença de autismo secundário, como por
exemplo, síndrome velocardiofacial, síndrome DiGeorge, síndrome de anomalia
facial conotruncal.
O gene que codifica a Proteína de Ligação Methyl-CpG 2 (MeCP2), que
causa a maioria dos casos de Síndrome de Rett – doença dominante ligada ao X,
é considerado, também um dos fatores etiológicos para um pequeno número de
autistas. Análise do sequenciamento do MeCP2 é, normalmente, solicitada para
meninas com fenótipo de Rett, e mutações nos éxons 2, 3 e 4 são as mais
freqüentes (Ghidoni, 2007; Caronna et al. , 2008). Inicialmente MeCP2, um
24
importante fator de transcrição neuronal, foi identificado por sua habilidade de se
ligar à DNA metilado, e se pensava que esta ligação era repressora de
transcrição. Portanto, esperava-se que mutações interrompendo a função MeCP2
fossem responsáveis pelo aumento da expressão gênica, perturbando a função
neuronal. Entretanto, uma pesquisa recente demonstrou que MeCP2 tem um
papel muito complexo, coordenando tanto repressão da transcrição quanto
ativação, dependendo do contexto molecular. Se o promotor do gene está
enriquecido com ilhas CpG este é ativado. Sabe-se, também, que esta proteína
tem um papel relevante na organização estrutural da cromatina (Cohen et al. ,
2008).
Mutações em MeCP2 em meninos normalmente são letais ou causam
encefalopatias extramente graves. Mas há casos descritos na literatura de
meninos que carregam mutações mais leves que não levam ao fenótipo Rett-
Like, mas apresentam retardo mental, autismo, ataxias e distúrbios psiquiátricos.
E quando a família era estudada, encontrava-se muitos homens com fenótipos
variáveis de portadores da mutação (Ghidoni, 2007).
Ainda que as evidências mostrem que a maioria dos casos de TEA sejam
causados por fatores genéticos, a expressão desses genes pode ser modulada
por fatores ambientais desde o período gestacional. Muitas deficiências de
desenvolvimento cerebral que estão associadas ao TEA ocorrem durante o
primeiro e segundo trimestre da gravidez, fatores ambientais com efeito
teratogênico – como talidomida e ácido valpróico – são os mais prováveis de
25
interagir com o feto via meios maternos. É também possível que doença materna,
como a rubéola, tenha um papel importante (Johson et al., 2007). No quadro 3
estão descritas algumas patologias associadas ao TEA.
A exposição a xenobióticos é uma característica inevitável da vida
contemporânea, principalmente pelos resíduos químicos encontrados no ar, água
e comida e outros materiais que entram em contato durante toda nossa rotina
diária. Metais pesados, como arsênico, chumbo e mercúrio foram listados como
as três substâncias mais perigosas pelo departamento de saúde humana dos
Estados Unidos (
www.atsdr.cdc.gov/cercla/07list.html
), desde os seus mais baixos
níveis são associados com danos neurológicos, incluindo déficit de atenção e
hiperatividade (TDAH) e baixo QI. Outros metais pesados (cádmio, manganês,
níquel etc) exercem efeitos similares, levando a doenças neurodegenerativas,
como Mal de Parkinson e Alzheimer, indicando que o cérebro humano é
especialmente sensível (Deth et al. , 2008).
Vacinas para caxumba, sarampo e rubéola têm uma atenção considerável
nos últimos anos. Os estudos com estas vacinas consideram a presença do
timerosol (mercúrio usado para conservação da vacina) como principal fator de
risco para desenvolver o TEA, principalmente em neonatos com deficiência de
enzimas de detoxificação, uma vez que o mercúrio é neurotóxico. Entretanto,
alguns estudos encontraram associação e outros não (Freitag, 2007; Schultz et
al., 2008).
26
Quadro 3. Patologias potencialmente associadas ao Transtorno Autista
Classificação
Patologias
Ambiental
Infecções Congênitas: Sarampo, Toxoplasmose, Citomegalovírus,
Encefalite, Rubéola, Intoxicação por chumbo e mercúrio, Síndrome
da talidomida fetal (Sykes and Lamb, 2007).
Genéticas ou
Congênitas
Anormalidades cromossômicas, Síndrome do X Frágil, Esclerose
Tuberosa, Neurofibramatose, Amaurose congênita de Leber,
Lipofucsinose ceróide, Doença celíaca, Adrenoleucodistrofia,
Distrofia Muscular de Duchenne, Síndrome de Angelman,
Sequencia de Moebius, Síndrome de Dandy-Walker, Síndrome de
Cornelia de Lange, Síndrome de Sotos, Síndrome de Goldenhar,
Síndrome Williams, Hipomelanose de Ito, Síndrome de Joubert,
Síndrome de West, Microcefalia, Hidrocefalia, Meduloblastoma do
cerebelo (Fombonne, 1999; Hertz-Picciotto et al., 2006).
Metabólica
Fenilcetonúria, Histidinemia, Desordem do metabolismo de purinas
(Newschaffer et al., 2007).
1.5. Síndrome do X-Frágil
A Síndrome do X-frágil (SXF), descrita pela primeira vez por Martin e Bell
em 1943, é a mais comum causa de retardo mental herdável com
aproximadamente 1:4000 homens afetados e 1:8000 mulheres, com penetrância
27
de 80% em homens e 30% em mulheres. Na maioria dos casos, a doença ligada
ao X é causada pela expansão de repetições CGG na região 5’ não traduzida (5’-
UTR) do gene FMR1 – localizado no braço longo do cromossomo X (Xq27.3) – o
que confere uma instabilidade meiótica. Mais de 99% dos indivíduos com X-frágil
possuem mutação com perda de função no gene FMR1 causada pelo aumento
do número de trinucleotídeos CGG repetidos acompanhado por hipermetilação
da ilha CpG na região promotora do gene e silenciamento da transcrição (Curry
et al. , 1997; Garber et al., 2008; Reis et al., 2008).
O número de repetições CGG é altamente polimórfico, indo de 5-40 em
indivíduos normais, 41-58 repetições em intermediários, 59-200 repetições em
indivíduos com pré-mutação, e acima de 200 repetições em indivíduos com
mutação completa, ou seja, X-frágil. Quando a pré-mutação é transmitida por via
materna, ela pode ser expandida para mutação completa, devido a uma
instabilidade na meiose da mulher. O alelo intermediário parece ser levemente
instável (Allen et al., 2005; Sherman, 2005; Otsuka et al., 2009) (Figura 1).
O gene FMR1 tem 38kb de tamanho, possui 17 éxons e um RNAm de
aproximadamente 4kb. Uma repetição de trinucleotídeos, composta
primariamente de CGG, está presente na região não traduzida do éxon 1
finalizando com 69 pares de base a montante do início de tradução. Existe uma
variação do número de cópias nos alelos normais com uma distribuição trimodal
tendo um pico maior em torno de 30 repetições e um menor pico em 20 e 40
repetições. Um aumento no número de repetições do trinucleotídeo CGG no
28
gene FMR1 ocorre exclusivamente durante a meiose de mulheres portadoras de
pré-mutação. O risco de aumento no tamanho da expansão de alelos maternos
com pré-mutação depende do número de repetições CGG e a presença de AGG
entre os segmentos repetidos de CGG (Curry et al., 1997).
O produto de FMR1, fragile X mental retardation 1 protein – FMRP, é
encontrado no citoplasma de muitos tipos celulares, mas é mais abundante nos
neurônios. A proteína contém dois domínios de ligação KH, encontrado em
outras proteínas com propriedades de ligação ao RNA e parece funcionar como
uma proteína de ligação ao RNA que interage com um conjunto de RNAs
mensageiros contendo motivos quaternários. FMRP contém tanto sinal de
localização nuclear quanto sinal de exportação nuclear, sugerindo que possui
uma função de proteína nucleocitoplasmática que se liga a muitos RNAs
mensageiros, inclusive ao seu próprio RNAm; forma complexos de
ribonucleoproteínas mensageiras; e se associa a ribossomos de tradução. Esta
proteína também está envolvida na maturação estrutural e funcional de sinapses
servindo como um supressor traducional nos espaços pós-sinápticos (Ceman et
al., 1999; Weiller & Greenough, 1999).
29
Figura 1. Representação do gene FMR1 (A) representação esquemática do gene FMR1 (B)
Processo de expansão e hipermetilação do gene. Adaptado de Florência et al. (2006).
As características clínicas das SXF são frequentemente sutis, e a primeira
indicação clínica é, geralmente, atraso no desenvolvimento, como atraso de
linguagem e motor, ou ainda comportamentos autistas. Características físicas
incluem macroorquidismo, displasia do tecido conjuntivo, que inclui face longa e
estreita, dando um aspecto triangular, orelhas proeminentes, hipermobilidade de
articulações e pé chato. Refluxo gastrointestinal ocorre na infância, e pode
apresentar irritabilidade ou vômito recorrente. Exames de Eletroencefalograma
(EEG) confirmam que a epilepsia é outra característica comum em SFX na
30
infância, com uma incidência entre 13 e 18% em meninos, e 5% em meninas
(Garber et al., 2008; Koukoui & Chaudhui, 2007).
O fenótipo comportamental pode ser sugestivo para o diagnóstico de SXF.
Características autistas são comuns em indivíduos portadores da síndrome, e
incluem movimento de “flap” com as mãos, dificuldade em olhar fixo ou nos
olhos, defensiva tátil, dificuldades em manter contato social e reciprocidade
sócio-emocional. Estas características são expressas com grandes níveis de
variabilidade em crianças com SXF, e pode ser um indicativo de diagnóstico
precoce para TEA (Garber et al. , 2008).
Aproximadamente 50% das mulheres com mutação completa para X-frágil
apresentam retardo mental, e embora sejam, geralmente, menos gravemente
afetadas que os homens, também podem apresentar ansiedade, déficit de
linguagem, labilidade de humor e depressão. Cerca de 50% das mulheres
heterozigotas para mutação completa são intelectualmente normais, esta
variabilidade deve-se ao processo de inativação de um cromossomo X nas
mulheres (Allen et al. , 2005; Garber et al. , 2008).
A maioria dos indivíduos com pré-mutação são considerados não afetados
cognitivamente, mas alguns estudos têm documentado déficits cognitivos ou de
comportamento em um subgrupo de homens e mulheres, sendo menos freqüente
neste último. Os homens são mais propensos a desenvolver problemas de
atenção, disfunções executivas, déficits sociais, e comportamento obsessivo
compulsivo (TOC). Aproximadamente 20% das mulheres com pré-mutação têm
31
disfunção ovariana prematura (POF) que é a cessação da menstruação antes
dos 40 anos de idade. É interessante ressaltar que mulheres com mutação
completa não desenvolvem POF, e uma explicação para isto seria que os níveis
de RNAm tendem a se normalizar, em mulheres, quando o número de cópias
CGG aumentam (Farzin et al. , 2006; Garber et al. , 2008; Tejada et al. , 2008).
Um fenótipo neurológico foi descrito e parece estar restrito a homens mais
velhos portadores da pré-mutação. Estes homens têm a Síndrome do
Tremor/Ataxia (STA) com declínio neurológico associado. Estudos
neurofisiológicos em uma amostra de homens com pré-mutação e fenótipo de
STA mostraram inclusões eosinofílicas intranucleares em neurônios e astrócitos,
e a ressonância magnética mostrou um padrão de imagem característico
(Hagerman & Hagernam, 2002; Allen et al. , 2005).
Ao nível celular, há evidências que a pré-mutação, na forma de RNA,
causa toxicidade ao neurônio, levando a grande vulnerabilidade para apoptose
quando submetido a estresse. Em um estudo usando células de linhagem
humana, a pré-mutação causou uma super-regulação de muitos genes, incluindo
interação com a proteína FMRP citoplasmática, que controla a conectividade
neuronal em Drosophila e com a rho-GTPase, Rac1; caspase-8, uma proteína
envolvida com a via de morte por apoptose induzida por receptor; UBE3A, uma
proteína associada à Síndrome de Angelman, e também ligada ao autismo; e
neurotensina, um componente do axis hipotalamico-pituitário-gonadal, que é
importante na regulação da fertilidade feminina. É evidente que a pré-mutação é
32
tóxica para a célula e sua toxicidade está presente desde o início do
desenvolvimento (Schenk et al. , 2003; Farzin et al. , 2006)
A prevalência estimada de portadores de pré-mutação na população em
geral é de 1 a cada 113 – 441 mulheres e 1 em 813 – 1674 homens (Otsuka et
al. , 2009). Um estudo realizado em Taiwan com 10.046 recém-nascidos estimou
uma prevalência de 1:1.674 em meninos com pré-mutação e 1:1.143 com alelos
intermediários. Em mulheres, presume-se que seja a metade da prevalência dos
homens (Crawnford et al. , 2002; Tzeng et al. , 2005).
1.6. Autismo e X-Frágil
O autismo é um dos achados clínicos comuns na síndrome do X-frágil.
Estima-se sua prevalência entre indivíduos com X-frágil entre 25 a 33% (Bailey et
al. , 1998; Rogers et al. , 2000; Jonhson et al. , 2007). Usando análises
moleculares, a incidência da Síndrome do X-frágil em indivíduos diagnosticados
como autistas idiopáticos foi estimada em 5% por Havlovicova et al. (2002),
11,1% por Estécio et al. (2002), 12% por Gurling et al. (1997), 2,1% por Kielinen
et al. (2004), 2,2% por Reddy (2005), e 1,5% por Steiner et al. (2005). A
diferença na incidência estimada pelos diferentes estudos pode ser devida ao
pequeno tamanho populacional ou diferenças nos critérios clínicos de seleção de
pacientes.
33
Em uma pesquisa realizada por Clifford et al. (2007), numa amostra de 33
homens e 31 mulheres com mutação completa no gene FMR1, eles encontraram
que 67% e 23% tinham critérios para diagnóstico de TEA, respectivamente,
utilizando escalas específicas para detectar este transtorno. E no grupo portador
da pré-mutação, 14% dos homens e 5% das mulheres apresentaram critérios
para TEA.
Zhang et al. (2009) analisaram a expressão do gene FMR1 em cinco
regiões cerebrais (hipocampo, córtex, cerebelo, diencéfalo e tronco cerebral) de
camundongos selvagens e nocauteados para SXF usando a técnica de qRT-
PCR. Como esperado, os níveis de expressão do gene FMR1 foram
significativamente mais baixos em camundongos nocauteados comparados com
os controles selvagens. Juntamente com isto, eles avaliaram se a expressão de
RNA de MecP2 variava nos camundongos nocauteados em relação aos
selvagens. O qRT-PCR mostrou que os níveis de mRNA MecP2 no hipocampo,
córtex, diencéfalo e tronco cerebral foram significativamente mais baixos nos
camundongos nocauteados.
A proteína FMRP pode influenciar a expressão de muitos outros genes
que devem estar relacionados ao desenvolvimento do autismo. Foi mostrado,
neste mesmo trabalho, que camundongos nocauteados para SXF apresentaram
nível de expressão de genes associados ao autismo drasticamente afetados no
cérebro desses animais.
34
O TEA pode não ser devido a uma patologia célula-específica, mas sim
por uma perturbação das propriedades de redes neuronais que emergem quando
os neurônios interagem. Portanto, apesar da SXF e do autismo diferirem no nível
de função de um único gene, eles podem carregar um grande número de
similaridades em relação a disfunções de rede neuronal e a combinação de
efeitos genéticos, epigenéticos e ambientais que modificam fatores nestas
disfunções, justamente pela importante função da proteína FMRP interagir com
outras proteínas associadas ao autismo (Liao et al., 2008; Zhang et al., 2009).
Embora ainda não conclusivas, diversas investigações sugerem que
meninos portadores da pré-mutação possuem um risco aumentado de
desenvolver TEA (Borghgraef et al. , 2004; Farzin et al. , 2006). O TEA nos
pacientes com a pré-mutação poderia ser resultado da elevação anormal do
RNAm do gene FMR1, ou talvez em função da redução dos níveis da FMRP a
qual é a responsável pela SXF e é sabido que ocorre em alguns homens
portadores da pré-mutação, especialmente aqueles com grandes números de
repetições (Hessl et al. , 2007).
Devido às evidências, é inquestionável que existe uma relação entre a
patogenia do TEA e a expansão do gene FMR1. Uma vez que os sinais
dismórficos da SXF se apresentam de maneira variável, o diagnóstico clínico
desta síndrome pode não ser evidente. Por isso, sugere-se que todos pacientes
com diagnóstico de autismo idiopático sejam também testados para a expansão
no gene FMR1.
35
1.7. Autismo e o Metabolismo do ácido fólico
O ácido fólico, folato ou vitamina B11, é uma vitamina hidrossolúvel do
complexo B, considerada um nutriente essencial para o homem. A única fonte
desta vitamina para o organismo humano é a dieta. O folato é essencial na
síntese de DNA, tRNA e aminoácidos (Eskes, 1997).
O folato é um importante substrato para o metabolismo da homocisteína. A
deficiência de folato é uma condição geralmente associada à baixa ingesta em
relação à demanda metabólica. Isto é particularmente importante durante a
gestação, sendo que qualquer alteração genética envolvendo o metabolismo do
folato em gestantes, pode representar um papel importante na etiologia de várias
malformações congênitas, principalmente na dos defeitos de tubo neural
(Rosemblat & Fenton, 2001). Diversos estudos apontam para uma associação
entre a ingestão materna de vitaminas e o metabolismo envolvendo o ácido fólico
e a homocisteína na gênese destes efeitos estruturais.
Vários estudos demonstraram que a suplementação vitamínica
periconcepcional leva a uma diminuição tanto de ocorrência como de recorrência
de anomalias congênitas, como DTN, cardiopatias, fissuras lábio-palatinas e
transtornos neurológicos (Mattson & Shea, 2003; Czeizel, 2004).
Os eventos moleculares que levam a anomalias congênitas devido à
deficiência de folato ainda não estão bem definidos, mas podem incluir a
metilação do DNA, que está envolvido na diferenciação, estrutura da cromatina,
36
expressão gênica tecido-específica, imprinting, inativação do cromossomo X,
eventos epigenéticos e apoptose. A freqüência de TEA aumenta em crianças
portadoras de doenças genéticas que alteram a metilação do DNA, como SXF,
Síndrome de Angelman e Rett (Razin, 1998; Schanen, 2006).
Níveis baixos de vitamina B12 e folato ocasionam um aumento nos níveis
plasmáticos de homocisteína. Em gestantes, tem-se a hipótese de que o nível
elevado de homocisteína poderia atuar como agente teratogênico, inibindo
reações de metilação do DNA e a síntese de novo de timina. Sendo assim, este
processo induziria danos no DNA pela incorporação errada de uracilas no lugar
de timina, seguida por reações de excisão-reparo, quebras na fita de DNA, pausa
no ciclo celular e, finalmente, apoptose (Mattson & Shea, 2003). Em conclusão,
folato, vitamina B12 e homocisteína têm um papel relevante no crescimento
celular, no desenvolvimento embrionário e no desenvolvimento neurológico.
Após a sua obtenção, o ácido fólico é rapidamente reduzido a sua forma
ativa chamada tetrahidrofolato, passando a 5,10-metilenotetrahidrofolato. A partir
de então ocorre uma reação muito importante, catalisada pela enzima codificada
pelo gene metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR), que tem um papel
fundamental neste metabolismo, convertendo 5,10-metilenotetrahidrofolato a 5-
metiltetrahidrofolato, a forma circulante do folato (Goyette et al., 1994). Este
substrato é vital para o metabolismo de ácidos nucléicos e aminoácidos, incluindo
aqueles que são requeridos para a síntese de nucleotídeos e, consequentemente
a divisão celular, base substancial da gestação (Bailey, 2000). O produto desta
37
reação são grupos metil utilizados para a síntese de metionina, necessários para
a metilação de DNA (Goyette et al. , 1994) (figura 2).
Em humanos, o gene MTHFR está localizado no cromossomo 1 (1p36.3).
Sua seqüência de DNA complementar apresenta 2,2 kilobases e 11 éxons. A
atividade normal deste gene ajuda a manter os níveis adequados de
homocisteína (Frosst et al., 1995). Foram identificadas 18 variantes alélicas para
esse gene, normalmente raras, de herança autossômica recessiva e que podem
levar a deficiência grave da enzima metilenotetrahidrofolato redutase. A
deficiência desta enzima pode estar relacionada ao aumento no risco de
desenvolver retardo de desenvolvimento neuropsicomotor, alterações
psiquiátricas e complicações vasculares (Botto & Yang, 2000).
Alguns estudos brasileiros relataram associação entre polimorfismos do
gene MTHFR e defeitos cardíacos congênitos (Arruda et al., 2007; Brandalize et
al., 2009), enquanto outros não encontraram associação quando avaliaram
defeitos de tubo neural e fendas lábio-palatinas (Félix et al., 2004; Brandalize et
al., 2007).
O polimorfismo mais estudado e considerado de maior relevância é o
C677T, (que troca uma citosina por uma timina no nucleotídeo 677, resultando na
forma termolábil da enzima), convertendo alanina em resíduo de valina (Frosst et
al., 1995). O alelo 677T é comumente chamado de termolábil, pois a atividade
redutora da enzima se dá a partir de 37º C, e está associado com uma redução
da atividade enzimática em até 60% quando em homozigose (Rozen, 1997).
38
Figura 2. Representação esquemática do metabolismo da homocisteína (adaptado de
Sharp & Little, 2004).
Nos últimos anos muitos trabalhos vêm sendo publicados questionando o
aumento na freqüência de diagnósticos de TEA. Além da hipótese já discutida
sobre hipometilação do DNA devido a deficiência de folato, alguns estudiosos
formularam a hipótese que em virtude do melhor aporte nutricional da população
nos últimos anos, principalmente devido aos programas de enriquecimento de
farináceos e cereais com ácido fólico, o processo de seleção natural foi alterado.
O número de rupturas placentárias e abortos devido à hiperhomocisteinemia
diminuíram, o que levou a um aumento na sobrevivência neonatal e, portanto, as
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39
taxas de neonatos com genótipo 677T do gene MTHFR (Roger, 2008; Mayor-
Olea et al., 2008).
Existem, atualmente, poucos estudos de associação entre MTHFR e TEA.
Dentre eles, apenas um estudo encontrou associação (Mohammad et al. , 2009)
e outros dois que não a encontraram (James et al., 2006; Pasça et al., 2008).
Goin-Kochel et al. (2009) encontrou uma freqüência maior do alelo T do gene
MTHFR em crianças autistas que apresentavam alguns comportamentos
característicos, como evitação de olhar, movimentos corporais complexos e auto-
agressão.
Devido à heterogeneidade do TEA e a importância do metabolismo do
ácido fólico, em particular o gene MTHFR, para processos celulares e
desenvolvimento neurológico, fica clara a relevância de se testar a associação
entre esses processos.
40
CAPÍTULO II
OBJETIVOS
41
2. Objetivos
2.1. Objetivo Geral
Investigar a ocorrência da síndrome do X-frágil e de variantes polimórficas
no gene MTHFR em uma amostra de pacientes do sexo masculino e feminino
com Transtornos do Espectro Autista Idiopático.
2.2. Objetivos Específicos
• Verificar a frequência de mutação completa em um dos alelos do gene
FMR1 em meninos e meninas com diagnóstico de TEA;
• Relacionar a presença da alteração no gene FMR1 e o quadro clínico
comportamental dos portadores;
• Investigar a associação de variantes polimórficas no gene MTHFR e o TEA
idiopático.
42
CAPÍTULO III
MATERIAIS E MÉTODOS
43
3. Materiais e Métodos
3.1. População alvo
Casos: Crianças com diagnóstico de transtornos do espectro autista
(Transtorno Autista, Transtorno de Asperger ou Transtorno Global do
Desenvolvimento sem outra especificação), de acordo com os critérios do DSM
IV-TR (American Psychiatric Association, 2000), que foram encaminhadas
através das APAEs (Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais) do Rio
Grande do Sul e do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto
Alegre (HCPA).
Os pais das crianças responderam um questionário e uma escala para
diagnóstico de autismo na infância.
As crianças foram avaliadas pelo PROTID (Programa de Transtornos
Invasivos de Desenvolvimento) e por seus médicos particulares.
Controle: crianças saudáveis selecionadas durante coleta de sangue para
testes laboratoriais rotineiros no HCPA.
44
3.2. Critérios de Inclusão
- Indivíduos com idade superior a 03 anos de idade, com Diagnóstico de
Transtorno Autista, Transtorno de Asperger ou Transtorno Global do
Desenvolvimento sem outra especificação, conforme diagnóstico referido acima;
- Pais ou responsáveis legais concordarem em participar do estudo
assinando o termo de consentimento informado.
3.3. Critérios de Exclusão
- Presença de síndrome neurológica, genética, congênita ou metabólica
associada (por exemplo, X Frágil, Esclerose Tuberosa, e outras descritas no
Quadro 3);
- Pais ou responsáveis legais não concordarem em participar do estudo.
3.4. Termo de Consentimento Informado
Os pais ou responsáveis pela criança, antes de assinarem o termo, foram
esclarecidos sobre o diagnóstico de Transtorno Autista e sobre o procedimento
de retirada e o destino da amostra de sangue, sendo exposta de forma acessível
a questão do sigilo sobre a identificação do paciente. Este projeto e seu termo de
45
consentimento livre e esclarecido foram aprovados pelo Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre sob o número 05-451 (anexo I).
3.5. Tamanho da amostra
Fizeram parte deste estudo 154 crianças casos, sendo que apenas
136 foram testadas para SXF. As 18 crianças restantes já possuíam o respectivo
exame.
No grupo controle contamos com 100 crianças.
3.6. Métodos Laboratoriais
Extração de DNA:
A partir de 5 mL de sangue total coletado através de punção venosa periférica,
utilizando a técnica de precipitação de sal descrita por Lahiri e Nurnberger
(1991).
Genotipagem para X-frágil - Triagem:
- PCR triagem: foi utilizado um protocolo para X-frágil descrito por O’Connell et al.
(2002) com os seguintes primers:
5’ GCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGT 3’
5’ AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA 3’
46
A amplificação foi verificada em gel de agarose 2.5%, onde a ausência de
banda significa positivo pra Síndrome do X-frágil quando se analisa os meninos;
quanto as meninas, duas bandas significa que ela possui os dois alelos normais,
e na presença de apenas uma banda, seu resultado é inconclusivo, visto que não
é possível saber por este método se os dois alelos possuem o mesmo tamanho,
ou um dos alelos porta a expansão.
Genotipagem para o gene MTHFR C677T:
O PCR foi realizado segundo protocolo e primers descritos por Frosst et al.
. (1995).
A amplificação do PCR resultou em um fragmento de 198 pb que foi
visualizado em gel de agarose 1,5%. O fragmento obtido foi digerido com a
enzima de restrição Hinf I a 37ºC por no mínimo 3 horas, em seguida a análise
foi feita por eletroforese em gel de poliacrilamida 6% por 2 horas a 80 V. Após a
digestão, o genótipo CC resultou em um fragmento de 198 pb, enquanto no
genótipo CT foram três fragmentos de 198, 175 e 23 pb, e o genótipo TT mostrou
dois fragmentos de 175 e 23 pb.
3.7. Análise Comportamental
A avaliação dos comportamentos foi realizada segundo critérios do ADI-R
– Autism Diagnostic Interview Revised (Lord et al., 1994). Nós testamos os três
47
comportamentos que Goin-Kochel et al. (2009) encontraram associação
significante com o polimorfismo C677T do gene MTHFR, os quais são: evitação
do olhar (evitar olhar nos olhos para se comunicar e para responder aos
chamados dos outros), movimentos corporais complexos (movimentos
complexos, esteriotipados e voluntários com todo o corpo, como movimentar os
braços como se estivesse voando enquanto fica na ponta dos pés) e auto-
agressão (atos agressivos consigo mesmo em período mínimo de três meses). A
escala ADI-R foi convertido para “0” na ausência do comportamento específico e
de 1 a 2 na presença do comportamento.
3.8. Análise dos Dados
Um banco de dados com os dados clínicos e de laboratório foi
estabelecido no programa Excel®. Dados para análise epidemiológica e clínica
foram tratados de maneira descritiva.
Os dados genotípicos foram analisados no software SPSS versão 10.0. O
teste de qui-quadrado foi utilizado para testar o Equilíbrio de Hardy-Weinberg,
comparar freqüências alélicas e genotópicas entre os grupos, e comparar os
comportamentos selecionados de acordo com os genótipos. O nível de
significância foi p<0,05 e o intervalo de confiança foi de 95%.
48
CAPÍTULO IV
ARTIGO 1
MTHFR C677T IS NOT A RISK FACTOR FOR AUTISM SPECTRUM
DISORDERS IN SOUTH BRAZIL
Artigo aceito para publicação na Psychiatric Genetics mediante correções
49
MTHFR C677T IS NOT A RISK FACTOR FOR AUTISM SPECTRUM
DISORDERS IN SOUTH BRAZIL
(Influence of MTHFR C677T on ASD - Santos et al.)
Pollyanna Almeida Costa dos Santos
1
, Dânae Longo
1
, Ana Paula Carneiro
Brandalize
1
, Lavínia Schüler-Faccini
1,2
1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto
Alegre, Brasil
2
Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre,
Brasil
Correspondence to Lavínia Schüler-Faccini, Departamento de Genética. Instituto
de Biociências, UFRGS, Caixa Postal 15031. Porto Alegre – RS – Brasil
Zip Code 91501-970
Tel: +55 51-3308-9826
E-mail: [email protected]
Research supported by CNPq and CAPES. The authors declare no conflict of
interest.
50
Abstract
Many studies have suggested that autism may be associated with
metabolic abnormalities in the folate/homocysteine pathway, which is involved in
DNA methylation, thus altering gene expression. One of the most important
polymorphisms in this pathway is C677T of the methylenetetrahydrofolate
reductase (MTHFR) gene, because the T allele is associated with a decrease in
enzymatic activity. We evaluated the association between C677T polymorphism
and autism spectrum disorders (ASD) through a case-control study. Additionally,
we analyzed the influence of this polymorphism on certain autistic behaviors like
complex body movements, self-injury and averted gaze according to the Autism
Diagnostic Interview-Revised (ADI-R). The analyses involved 151 children with
idiopathic ASD and 100 healthy control children. The frequency of the T allele was
0.38 for the case group and 0.35 for the control group (p=0.77). The genotypic
distribution did not show significant differences between cases and controls
(p=0.72), nor association between the T allele and selected behaviors.
Key-words: homocysteine metabolism, autism spectrum disorders, MTHFR,
averted gaze, self-injury.
51
Introduction
Autism spectrum disorders (ASD) form a heterogeneous group of
neurodevelopmental disorders defined behaviorally by three core disturbances:
marked deficits in interpersonal social interaction, disrupted communication, and
restricted repetitive and stereotyped patterns of behavior and interests (American
Psychiatric Association, 2000). ASD is one of the most heritable among
neuropsychiatric disorders, with a concordance rate in monozygotic twins
between 60% and 90%, and 5% in dizygotic twins (Chakrabarti S and Fombonne
E, 2005; Marco and Skuse, 2006).
One of the main difficulties in research on autism, besides its clinical
heterogeneity, is the lack of biological markers. Several studies have revealed
that folate plays an important role in neurological development due to its
involvement in metabolic routes of transfer of methyl groups. The efficiency of this
process depends on an interaction between nutritional, metabolic and genetic
factors (Muskiet and Kemperman, 2006; Sudgen, 2006).
Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) is one of the most important
enzymes in this pathway. It converts 5,10- methylenetetrahydrofolate to 5-
methylenetetrahydrofolate and regulates the intracellular flow of folate (Frosst et
al., 1995). The C677T polymorphism in the MTHFR gene (A222V, rs1801133) is
associated with a decrease in enzymatic activity to 50-60% in homozygotes T
(Rozen, 1997).
52
The possible pathogenic mechanisms derived from imbalance of folate
metabolism during embryo-fetal development and autism involve two hypotheses:
(1) the modulation of the concentration of placentary homocysteine, which may
lead to teratogenesis, miscarriages and ruptures in the placenta, when in
excessive levels. The folate supplementation programs adopted in several
countries is one of the reasons for the lowest prevalence of pregnancy
complications, and consequently fetal viability and the frequency of children
carriers of the MTHFR 677T allele (Altomare et al., 2007; Mayor-Olea et al., 2008;
Rogers, 2008); and (2) DNA methylation that is responsible for a variety of
functions, like myelination, tissue-specific gene expression, chromatin structure,
imprinted gene expression and inactivation of the X chromosome. Mutations in
the MTHFR gene lead to hypomethylation and thus alter the accessibility to
transcription factors. The fragile X syndrome and Rett syndrome are examples of
diseases exhibiting changes in DNA methylation, and may present ASD as a
characteristic (Schanen, 2006; James et al., 2006; Lopes-Rangel and Lewis,
2006; James et al. 2008).
Some case-control studies reported an association between the T allele of
the MTHFR 677T polymorphism and greater susceptibility to ASD (Rogers, 2008;
Mohammad et al., 2009), whereas others have not found any association (James
et al., 2006; Pasça et al., 2008). Goin-Kochel et al. (2009) have found higher
frequency of behaviors like averted gaze, complex body movements and self-
injury in autistic children with at least one copy of the T allele.
53
This work investigates whether the MTHFR C677T polymorphism is
associated with susceptibility to ASD through a case-control approach in a south
Brazilian population. Additionally, we analyzed the influence of this polymorphism
on certain autistic behaviors such as complex body movements, self-injury and
averted gaze according to information provided in the Autism Diagnostic
Interview-Revised (ADI-R).
Methods and Materials
The case group (n=151) comprised patients with idiopathic ASD in
treatment at Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) or at autistic support
groups. Those patients were evaluated by experienced professionals from
PROTID (Programa para Transtornos Invasivos do Desenvolvimento), a
multidisciplinary program directed to the research and treatment of Pervasive
Developmental Disorders in HCPA. Patients were diagnosed using Diagnostic
and Statistical Manual of Mental Disorder, 4
th
Edition (DSM-IV-TR criteria
(American Psychiatric Association, 2000), or the Childhood Autism Rating Scale
(CARS) (Schopler et al., 1986) in its Brazilian version (Pereira et al., 2008).
Exclusion criteria were age under three years and/or diagnosis of genetic or
neurological disorder associated with ASD. The control group (n=100) comprised
healthy children randomly selected during a blood collection for routine laboratory
tests at HCPA. Case and control groups were predominantly European derived
(92% and 93%, respectively). This study was approved by Research Ethics
54
Committee of HCPA (nº 05-451) and informed consent was obtained from all
guardians of participants.
The ADI-R criteria were used for evaluation of patient’s behavior (Lord et
al., 1994). We have tested three behaviors that Goin-Kochel et al. (2009) have
found as significantly associated to C677T MTHFR polymorphism, namely
averted gaze, complex body movements and self-injurious behavior. We
converted the “0” ADI-R scale into absence of the specific behavior, or presence
(1 to 2).
We collected 5 ml peripheral blood in EDTA. DNA was extracted according
to Lahiri and Nurnberger (1991). MTHFR C677T polymorphism gene was
analyzed by polymerase chain reaction (PCR) and performed according to Frosst
et al. (1995).
The data were analyzed in SPSS software version 10.0. The chi-square
test was used to test for deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE), to
compare allelic and genotype frequencies between the groups, and to compare
the selected behaviors according to genotypes. The significance level was p<0.05
and the confidence interval (CI) was 95%.
Results
The genotype distribution of the MTHFR C667T polymorphism was similar
in both groups (p=0.72) and it was in HWE in both (Table 1). Similarly, no
significant differences were observed across genotypes (CC, CT, TT) for the three
55
selected behaviors – averted gaze, complex body movements, self-injurious,
p=0.12, p=0.57 and p=0.91, respectively (Table 2).
Discussion
We assessed the C677T polymorphism in the MTHFR gene in children with
ASD and control children, and did not find differences in allelic and genotypic
distributions. The frequency of the T allele observed in the control group in the
present study (35%) is similar to that recorded in other studies conducted in
samples formed by white subjects, since 93% of our sample was formed by
descendants of European immigrants. Stevenson et al. (1997) and Yanamandra
et al. (2003) recorded frequencies of 35% of this allele in North American
Caucasian subjects.
A small study conducted by Pasca et al. (2008) with 39 subjects with ASD
and 80 controls likewise did not observe any association between the C677T
MTHFR polymorphism and susceptibility to ASD. However, Mohammad et al.
(2009) found a significant association between 677T MTHFR and ASD, in a study
conducted in India with 138 cases and 138 matched controls. The authors
reported that this polymorphism increases the risk for ASD by 8 times when
conjointly evaluated with the 1298C MTHFR.
James et al. (2006) investigated several polymorphisms in genes linked to
folate/homocysteine pathways and to oxidative stress in ASD patients, among
which were the polymporphisms MTHFR C677T and MTHFR A1298C, and did
56
not report any significant association when these polymorphisms were assessed
separately. Yet, when these polymorphisms were analyzed conjointly, it was
observed that they contributed to an increase in the risk for ASD. This type of
analysis is important, since it includes the set of genetic enzyme variants that act
in the same metabolic pathway, where there is an actual expectation that some
kind of interaction occurs in terms of the role they play.
Goin-Kochel et al. (2009) analyzed autistic children and observed an
association between presence of at least one T allele of MTHFR C677T and
some frequent behaviors, including direct gaze, current complex body movements
and self-injurious behavior. In the present study, we assessed the same
behaviors and did not record any association.
Conflicting results are common in studies on complex diseases, which do
not have defined biomarkers, and on metabolic routes where several genes are
involved. In this study, we restricted our efforts to assess the effect of MTHFR
C667T, since it is considered a key enzyme in the folate/homocysteine pathway.
In conclusion, from our findings and from other similar studies we infer that
MTHFR C677T alone is not a risk factor for autism spectrum disorders.
57
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61
Table 1. Genotype and allelic distribution of MTHFR C677T polymorphism in
patients with autism spectrum disorders (case group) and control individuals.
MTHFR C677T
Genotype
CC
N (%)
CT
N (%)
TT
N (%)
p
Allele T
OR (CI)
p
Case (n=151) 60 (40)
68 (45)
23 (15)
0.72
0.38
1.15 (0.8 –
1.7)
0.52
Control
(n=100)
45 (45)
41 (41)
14 (14)
0.35
62
Table 2. MTHFR C677T polymorphism and autistic behaviors in patients with
autism spectrum disorders.
MTHFR C677T
Behavior (according to ADI-R)
CC
Y/N
a
CT
Y/N
TT
Y/N
χ
2
p
Averted gaze 37/19 34/28 15/5 4.30 0.12
Complex body movements 44/16 52/16 15/8 1.12 0.57
Self-injurious behavior 29/31 31/37 10/13 0.19 0.91
ADI-R, autism diagnostic interview revised;
a
“Y” indicates that the behavior is present, “N” indicates that the behavior is not present
63
CAPÍTULO V
ARTIGO 2
Fragile X Syndrome Diagnostic in sample of individuals with idiopathic Autism
Spectrum Disorders
Manuscrito em preparação para Genetics and Molecular Biology
64
Fragile X Syndrome Diagnostic in sample of individuals with idiopathic Autism
Spectrum Disorders
Pollyanna Almeida Costa dos Santos
1
; Dânae Longo
1
; Sandra Leistner-Segal
2
;
Têmis Maria Félix
2
; Lavínia Schüler-Faccini
1;2
1
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular – Universidade
Federal do Rio Grande do Sul – Porto Alegre – RS – Brasil.
2
Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre – Universidade
Federal do Rio Grande do Sul – Porto Alegre – RS – Brasil
Short running: Fragile X Syndrome in Autism
Key words: Fragile X syndrome, autism, autistic spectrum disorders, full mutation,
Pervasive Developmental Disorders
Correspondence to Lavínia Schüler-Faccini, Departamento de Genética. Instituto de
Biociências, UFRGS, Caixa Postal 15031. Porto Alegre – RS – Brasil
Zip Code 91501-970
Tel: +55 51-3308-9826
E-mail: [email protected]
Research supported by CNPq and CAPES. There was not conflict of interest.
65
Abstract
Fragile X syndrome (FXS) is the most frequent cause of inherited mental retardation,
and it is associated to developmental disorders, behavioral problems and autism
spectrum disorders (ASD). The present study aimed to investigate FXS frequency in
an idiopathic ASD sample. We studied a sample of 136 children, 97 were males and
39 females, presenting idiopathic ASD using the PCR technique. Our molecular
analysis showed three (3.1%) males with full mutation, though it was inconclusive for
most females (71.8%). These results show that it is essential to investigate FXS in all
ASD patients, since the dysmorphological clinical feature of FXS is not enough to
identify this disorder.
66
Introduction
Autism Spectrum Disorders (ASDs) represent a heterogeneous group of
neurodevelopmental disorders characterized by social and communication deficits,
accompanied by repetitive and stereotyped behaviors, with onset before 3 years of
age (American Psychiatric Association, 1994; McConachie and Diggle, 2007). The
male:female sex ratio for autistic disorder is 4:1, implying an involvement of the X
chromosome and/or imprinting mechanisms. Autism is associated with seizures and
mental retardation (MR) in up to 30% and 80% of cases, respectively (Fombonne,
1999; Tuchman and Rapin, 2002).
Many genetic disorders are associated with a higher risk of ASD, the most common
are tuberous sclerosis, Fragile X Syndrome (FXS) and Down Syndrome. FXS is the
most frequent cause of inherited mental retardation. It occurs in approximately one in
4,000 males and more than 30% of those children are also diagnosed with ASD
(Pembrey et al., 2001; Reddy, 2005). The incidence of FXS in ASD patients is shown
in table 1. Females are also affected at a rate of one in 8,000, but often with a milder
phenotype (Marco and Skuse, 2006).
In most cases, this disorder is caused by expansions of a CGG repeat in the 5’-
untranslated (UTR) region of the FMR1 gene that arises due to the mother meiotic
instability (Garber et al., 2008). This gene normally contains a stable repeat of 6-45
CGG trinucleotides, expansions ranging from 55-200 CGG repeats, defined as
permutation that do not cause FMRP1 protein deficits, but demonstrate meiotic
instability. If the expansion is over 200 CGG repeats, it is called full mutation and this
condition leads to switching off the gene causing the FXS (O’Connel et al., 2002;
67
Clifford et al., 2007). The FMRP1 protein is involved in complex messenger
ribonucleoproteins and translation ribosome association (Ceman et al., 1999).
Approximately 50% of the women with complete fragile X mutation present mental
retardation, though they are in general less affected than men, and may also exhibit
anxiety, language impairments, mood swings and depression. Around 50% of the
females heterozygous for the complete mutation are intellectually normal. This
variability is due to the process of inactivation of an X chromosome in women (Allen
et al., 2005; Garber et al., 2008).
Clinically, patients with FXS exhibit mental retardation, macroorchidism, large ears
and long faces. In most cases, the MR is moderate to severe, with frequent
occurrence of autistic-like behaviors, including hyperarousal, social anxiety,
withdrawal, stereotypic behaviors, gaze aversion and impaired social reciprocity
(Rogers et al., 2001; Hessl et al., 2006; Otsuka et al., 2009).
Because ASD and FXS share same behaviors characteristics and the clinical features
in FXS are not always evident, the aim of this study was to investigate the frequency
of FXS in an idiopathic ASD.
Material and Methods
We evaluated 136 patients (39 females and 97 males) with idiopathic ASD in
treatment at Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) or at autistic support
groups. Those patients were evaluated by experienced professionals from PROTID
(Programa para Transtornos Invasivos do Desenvolvimento), a multidisciplinary
program directed to research and treatment of Pervasive Developmental Disorders in
68
HCPA. Patients were diagnosed using Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorder, 4
th
Edition (DSM-IV-TR criteria) (American Psychiatric Association, 1994),
or the Childhood Autism Rating Scale (CARS) (Schopler et al., 1986) in its Brazilian
version (Pereira et al., 2008). Exclusion criteria were age under three years and/or
diagnosis of disorder associated to ASD. This study was approved by Research
Ethics Committee of HCPA (nº 05-451) and informed consent was obtained from all
guardians of participants.
We collected 5 ml peripheral blood in EDTA. DNA was extracted according to Lahiri
and Nurnberger (Lahiri and Nurnberger, 1991). The FMR1 gene was analyzed by
polymerase chain reaction (PCR) for specific amplification of the CGG repeat in the
5’end, according the protocol described by O’Connel et al. (2002). After amplification,
the samples were submitted to electrophoresis in a 2.5% agarose gel at 80V for one
hour. Two reactions were performed on each patient sample to confirm the results.
The male FXS patients did not show amplified bands. Female patients were
considered normal when showing two bands, and inconclusive when showing one
band, because it is not possible to establish whether this unique band represents
homozygosity for the normal allele or whether it in fact indicates the presence of an
expanded allele, which cannot be identified using the PCR technique (figure 1).
Results
Table 2 summarizes the number of cases per diagnosis. The full mutation of FMR1
gene was observed in 3 males (3.1%), but in 28 females (71.8%) the result was
inconclusive.
69
Discussion
Frequently the clinical characteristics of FXS are very subtle, and therefore medical
assistance is sought after due to motor delays, mental deficiency and autism signs
because these are the most evident clinical manifestations. Our sample was selected
so as to include only idiopathic ASD patients, that is, with no defined causes,
according to the medical records. Among these, we observed a frequency of 3.1% of
boys with positive result for FXS. Other groups conducted the same analysis and
observed different frequencies, which may be explained by sample size and the
inclusion criteria utilized (Table 1). Johnson et al. (2007) estimate that the prevalence
of FXS in idiopathic ASD patients is between 2 and 8% of the general population,
since there are no differences in relative prevalence in terms of ethnicity.
In our sample it was possible to identify 28 (71.8%) of girls with only one amplified
band. Therefore, it is not possible to affirm whether the patient is homozygous for the
normal allele or one of the alleles presents a pre-mutation or a complete mutation,
and the result is called inconclusive. Steiner et al (2005) conducted a study with 82
autistic children, of which 69 were boys and 13 girls, finding one boy (1.5%) with FXS
and 12 girls (92.2%) with inconclusive results, as observed in the present study.
Studies have demonstrated that due to the synaptic importance of the FMRP protein,
which is abundant in neurons and is involved in structural and functional maturity of
synapses, even acting as a RNA ligation protein that interacts with a set of
messenger RNAs, it is believed that this association with other RNAs influence the
expression of several other genes also related to autism, and would explain why 30%
of children with FXS present not only ASD, but also epilepsy, mental retardation,
70
obsessive compulsive disorder, TDAH, among other psychiatric manifestations
(Ceman et al., 1999; Zhang et al., 2009).
Due to the aspects addressed, it is recommended to sort for FXS all boys with ASD
diagnosis, and if possible also girls, since the frequency of permutation in girls is twice
as high as that observed in boys: one in 113 – 441 women and one in 813 – 1674
men, and in 5% of girls with pre-mutation have diagnosis criteria for ASD (Clifford et
al., 2007; Otsuka et al., 2009). It is fundamental, therefore, to track all boys with ASD
diagnosis, since the dysmorphological clinical picture of FXS is not enough to identify
the syndrome.
71
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76
Table 1. Incidence of Fragile X Syndrome in an Autism Spectrum Disorder sample.
Author Year Country Sample
Number
Result (%)
Gurling et al
1997 UK 25 12
Havlovicová et al
2002 Czech
Republic
20 5
Estécio et al
2002 Brazil 30 11.1
Kielinen et al
2004 Finland 187 2.1
Reddy 2005 EUA 316 2.2
Steiner et al
2005 Brazil 82 1.5
77
Table 2. Population with idiopathic Autism Spectrum Disorder under investigation
Clinical diagnosis N (%)
Autism 40 (29.4)
Asperger’s syndrome 12 (8.8)
PDD-NOS 66 (48.6)
Like-autistic behavior 18 (13.2)
PDD-NOS: Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified
78
Figure 1. PCR technique showing picture of agarose gel. Lanes 1 and 2 represent
inconclusive females. Lane 3 represents a heterozygous female. Lanes 4-8 are
normal males for FXS and lanes 9-10 are FXS males.
79
CAPÍTULO VI
DISCUSSÃO
80
6.
Discussão
Frequentemente as características clínicas da SXF são muito sutis, por isso a
maioria dos familiares procuram ajuda médica devido aos atrasos motores,
deficiência mental e sinais autistas por serem as manifestações clínicas mais
evidentes.
Nossa amostra foi selecionada para incluir apenas autistas idiopáticos, ou seja,
sem causa definida, segundo os laudos médicos das crianças encaminhadas pelas
APAES. Desses, encontramos uma frequência de 3,1% dos meninos com resultado
positivo para SXF. Outros grupos realizaram a mesma análise, e encontraram
diferentes frequências, que podem ser explicadas pelo tamanho amostral e os
critérios de inclusão utilizados (Tabela 1). Em uma revisão de Johnson et al. (2007),
eles estimam que a prevalência de SXF em autistas idiopáticos seja de 2 a 8% na
população em geral, visto que não há diferenças de incidência relativas às diferenças
étnicas. Nossa freqüência parece ser baixa, mas isto se deve ao fato de que todos os
pacientes com diagnóstico prévio de SXF foram excluídos desta amostra.
Em nossa amostra foi possível identificar 28 (71,8%) meninas com apenas uma
banda. Desta forma, não é possível afirmar se a paciente apresenta dois alelos com
o mesmo tamanho, ou se um dos alelos apresenta uma pré-mutação ou mutação
completa, e o resultado é chamado de inconclusivo. Steiner et al. (2005) realizaram
um estudo com 82 crianças autistas, sendo 69 meninos e 13 meninas, encontrando
12 meninas (92,2%) com resultados inconclusivos, após a realização de Southern
Blot todas apresentaram padrão normal.
81
Clifford et al. (2007) descreveram em seu estudo que 5% das meninas com
pré-mutação apresentam critérios de diagnóstico para TEA. Esta é, portanto, uma
importante limitação deste trabalho. A impossibilidade técnica da realização de
Southern Blot nos nossos pacientes, principalmente devido à necessidade de
radiação, impediu que se fizesse o diagnóstico de presença de mutação completa em
meninas e da pré-mutação em meninos e meninas.
Tabela 1. Freqüências de SXF em amostras de TEA.
Autor Ano País Número amostral Resultado (%)
Gurling et al.
1997 Inglaterra 25 12
Havlovicová et al.
2002 Rep. Tcheca 20 5
Estécio et al.
2002 Brasil 30 11,1
Kielinen et al.
2004 Finlância 187 2,1
Reddy 2005 EUA 316 2,2
Steiner et al.
2005 Brasil 82 1,5
Apesar dos meninos encaminhados ao nosso grupo de pesquisa terem
passado por uma avaliação de seus médicos particulares ou de instituições a eles
vinculadas, e não serem diagnosticados como portadores da SXF, após um exame
clínico detalhado apresentaram sinais clínicos característicos de SXF, o que sugere a
presença de mutação completa e não pré-mutação, e também a necessidade de uma
avaliação mais aprimorada do corpo clínico que tratava esses pacientes. No caso
das meninas, o exame clínico não é suficiente para uma inferência diagnóstica.
82
Apenas cerca de 10% dos casos de TEA são devido a síndromes que tem o
autismo como sintoma secundário ou a efeitos ambientais e teratogênicos já bem
estabelecidos, os outros 90% ainda estão sem explicação (Lintas and Persico, 2008).
Com o aumento do interesse em estudos com essa população, a tendência é que
essa proporção tão alta de TEA idiopático diminua, principalmente pela difusão do
conhecimento e da investigação mais detalhada desses pacientes.
Em virtude dos aspectos abordados, recomenda-se a testagem para SXF em
todos os meninos com diagnóstico de TEA, e se possível nas meninas, também,
visto que a freqüência de pré-mutação nelas é o dobro da encontrada em homens: 1
para cada 113 – 441 mulheres e 1 em 813 – 1674 homens (Otsuka et al. , 2009).
Estudos têm demonstrado que devido a importância sináptica da proteína
FMRP, que é encontrada em abundância nos neurônios e está envolvida em
processos de maturação estrutural e funcional das sinapses, inclusive agindo como
uma proteína de ligação ao RNA que interage com um conjunto de RNAs
mensageiros, acredita-se que essa associação com outros RNAs influenciam a
expressão de muitos outros genes também relacionados ao autismo, e explicaria
porque 30% das crianças com SXF apresentam não apenas TEA, mas também
epilepsia, retardo mental, transtornos obsessivos compulsivos, TDAH, entre outras
manifestações psiquiátricas (Ceman et al. , 1999; Weiller & Greenough, 1999; Zhang
et al. , 2009).
Apesar da limitação deste estudo pelo fato de ter não ter sido possível
detectar a presença de mutação em meninas ou de pré-mutação em meninos e
83
meninas, ainda assim, o índice de 3,1% de mutação em meninos indica que a SXF é
um importante fator na etiologia do autismo classificado como idiopático. É
fundamental, portanto, o rastreio de todos os meninos com diagnóstico de TEA, uma
vez que o quadro clínico dismorfológico da SXF não é suficiente para a identificação
desta síndrome.
Depois de feita triagem e excluídos os pacientes com SXF da nossa amostra
inicial, ficamos com um grupo selecionado, onde avaliamos a possível associação
entre o polimorfismo C677T do gene MTHFR e TEA. Estudos do tipo caso-controle
têm investigado o papel de polimorfismos presentes no metabolismo do ácido fólico e
homocisteína como possíveis fatores de risco para TEA. No ano de 2009, o resultado
de um estudo realizado Índia, composto de 138 casos e 138 controles, sugeriu que o
polimorfismo C677T no gene MTHFR pode aumentar a susceptibilidade a TEA em
crianças com pelo menos um alelo T (Mohammad et al., 2009). Entretanto, outras
pesquisas não confirmaram esta associação.
Um pequeno estudo realizado por Pasca et al. (2008) com 39 indivíduos com
TEA e 80 controles não encontraram associação entre MTHFR C677T e
susceptibilidade a TEA. James et al. (2006) realizaram um estudo caso-controle e
analisaram muitos polimorfismos em genes ligados ao metabolismo do ácido fólico e
homocisteína em pacientes com TEA, entre eles os polimorfismos C677T e A1298C
do gene MTHFR, e não encontraram nenhuma associação quando os polimorfismos
foram testados individualmente. Entretanto, quando analisados conjuntamente,
84
observou-se que o heterozigoto composto C677T/A1298C apresentou um aumento
de risco limítrofe para TEA em 1,78 vezes (IC=0,97-3,26).
No presente estudo, também não encontramos nenhum associação entre
MTHFR e TEA (p=0,72). A freqüência do alelo T foi similar em casos (0,38) e
controles (0,35) e está de acordo com as freqüências de outros estudos que
avaliaram euro-descendentes. Arruda et al. (1998) avaliaram a prevalência deste
polimorfismo entre diversos grupos étnicos no Brasil e relataram que a freqüência do
alelo T é de 0,37 em euro-descendentes. Recente estudo brasileiro avaliando uma
população do sul do Brasil encontrou a mesma freqüência de 37% (Brandalize et al.,
2009). Stevenson et al . (1997) e Yanamandra et al. (2003) encontraram freqüências
de 0,35 para o alelo T em norte americanos brancos.
Goin-Kochel et al.(2009) analisaram crianças autistas e observaram uma
associação entre ao menos um alelo T do gene MTHFR e alguns comportamentos
característicos de TEA, incluindo evitação de olhar, movimentos corporais complexos
e auto-agressão. No presente estudo, fizemos a mesma análise utilizando os
critérios comportamentais descritos no ADI-R, e não encontramos nenhuma
associação (tabela 8).
Na tabela 2 é possível observar um resumo de todos os trabalhos publicados
até o momento envolvendo MTHFR e susceptibilidade a TEA.
85
Tabela 2. Distribuição das freqüências alélicas do polimorfismo C677T do gene MTHFR em
diferentes estudos.
Freqüência alélica MTHFR C677T
Casos
Controles
Referências Ano
País C T
C T
Pasça et al. 2008
Romênia 0,72 0,28
0,75 0,25
Goin-Kochel et al.
a
2009
EUA 0,65 0,35
- -
Mohammad et al. 2009
Índia 0,84 0,16
0,93 0,07
James et al. 2008
EUA 0,62 0,38
0,67 0,33
Presente estudo 2009
Brasil 0,62 0,38
0,65 0,35
a
Goin-Kochel et al. (2009) não é caso-controle.
Resultados inconsistentes são comuns quando se trata de doenças complexas
visto que muitos fatores estão envolvidos: genéticos, ambientais e metabólicos.
Definir um biomarcador específico para estas doenças é muito difícil, e por isso a
relevância de estudos como o nosso, onde avaliamos a relação de um importante
polimorfismo à susceptibilidade para TEA. Nossos achados inferem que MTHFR
C677T não é um fator de risco para TEA, corroborando com estudos anteriores.
Diante dos nossos resultados ainda não é possível descartar nenhuma das
hipóteses preconcebidas em estudos anteriores – suplementação vitamínica e
hipometilação do DNA – pois não encontrar associação entre TEA e um dos
polimorfismos do gene MTHFR não significa que outras variantes também não
estejam relacionadas. Sendo o metabolismo do ácido fólico e homocisteína vias que
envolvem muitas variáveis genéticas, está em nossa perspectiva ampliar a análise
dessas outras variáveis, uma vez que esperamos que ocorram interações entre os
sistemas.
86
CAPÍTULO VII
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
87
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97
ANEXO I
98
8. Anexo I
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
I. Justificativa e os objetivos da pesquisa:
O Autismo é uma doença neurológica que se caracteriza por problemas de
linguagem e integração social acompanhados por comportamentos repetitivos e
interesses restritos. Atinge mais ou menos uma em cada 500 crianças e é causado
por fatores genéticos e ambientais. O objetivo desse trabalho é entender as algumas
das possíveis causas do Autismo, o que poderá auxiliar no tratamento e prevenção
dessa doença no futuro.
II. Procedimentos que serão utilizados:
Serão coletados do filho(a), da mãe e do pai de 5 a 10 ml de sangue. As
amostras serão estudadas para análise genética relacionada com Autismo no
Hospital de Clínicas de Porto Alegre. As amostras de sangue serão armazenadas no
Serviço de Genética Médica no Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
III. Riscos e desconfortos potenciais:
No momento da coleta de sangue poderá haver alguma dor decorrente da
punção da pele. Complicações de coleta de sangue rotineira são raras e geralmente
de pequeno porte. Se houver pequena perda de sangue da veia no local da punção
geralmente há um pequeno desconforto que desaparece em poucos dias.
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IV. Benefícios esperados:
Este estudo poderá no futuro beneficiar as famílias dos afetados através de
aconselhamento em que fatores de risco genético poderão ser identificados,
contribuindo no diagnóstico e estimativa de risco de ocorrência de outros casos
nestas famílias.
V. Procedimentos alternativos:
Eu entendo que tive o direito de recusar a participar deste projeto e que
minha recusa não afetará de nenhuma maneira os cuidados médicos do meu filho(a)
ou de minha família.
VI. Formas de acompanhamento e assistência:
O atendimento clínico e as informações sobre o aconselhamento genético da
família serão realizadas pelo Dr. Gilberto de Lima Garcias e pela Dra. Lavínia
Schüler-Faccini. As coletas de sangue serão realizadas por pessoal especializado.
Pelo presente Consentimento, declaro que fui esclarecido, de forma
detalhada, livre de qualquer forma de constrangimento e coerção, dos objetivos, da
justificativa, dos procedimentos que serei submetido, dos riscos, desconfortos e
benefícios do presente projeto de pesquisa, assim como dos procedimentos
alternativos aos quais poderia ser submetido, todos acima listados.
Fui igualmente informado:
100
- da garantia de receber esclarecimento a qualquer dúvida acerca dos
procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados a
pesquisa;
- da liberdade de retirar meu consentimento, a qualquer momento, e deixar
de participar do estudo, sem que isso traga prejuízo à continuação do meu
cuidado e tratamento;
- da segurança de que não serei identificado e que se manterá o caráter
confidencial das informações relacionadas com a minha privacidade;
Os pesquisadores responsáveis por esse projeto de pesquisa são a Profª Dra.
Lavínia Schüler-Faccini (Fone: 51 2101-8008) e Dânae Longo (Fone: 51 3316-6727),
tendo sido esse documento revisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
do Hospital de Clínicas de Porto Alegre em ___ / ___ / ___ .
Data ___ / ___ / ___ .
Nome ou assinatura do Paciente ou Responsável
________________________________________________________
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