ads:
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EVOLUTIVA
(Associação Ampla entre a UEPG e a UNICENTRO)
CITOGENÉTICA MOLECULAR DE Astyanax scabripinnis (CHARACIDAE, Incertae
sedis) COM ÊNFASE NO CROMOSSOMO B.
HELENA FLÁVIA DE MELLO PISTUNE
Ponta Grossa
2010
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EVOLUTIVA
(Associação Ampla entre a UEPG e a UNICENTRO)
CITOGENÉTICA MOLECULAR DE Astyanax scabripinnis (CHARACIDAE, Incertae
sedis) COM ÊNFASE NO CROMOSSOMO B.
Dissertação de mestrado apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Biologia Evolutiva da Universidade Estadual de
Ponta Grossa em associação com a Universidade do Centro
Oeste do Paraná, como parte dos requisitos para a obtenção do
título de mestre em Ciências Biológicas (Área de Concentração
em Biologia Evolutiva).
Ponta Grossa
2010
ads:
iii
iv
Orientador
Prof. Dr. Marcelo Ricardo Vicari
Co-orientadora
Prof
a
. Dr
a
. Mara Cristina de Almeida Matiello
v
Dedico este trabalho à pequena
Elisa Maria, minha irmã, o anjo que
tem iluminado cada um de meus
dias...
vi
É pensando nos homens que eu perdoo aos tigres as garras que dilaceram.
(Florbela Espanca)
Viver é ser outro. Nem sentir é possível se hoje se sente como ontem se sentiu: sentir hoje o
mesmo que ontem não é sentir - é lembrar hoje o que se sentiu ontem, ser hoje o cadáver vivo do
que ontem foi a vida perdida.
(Fernando Pessoa)
Smile (Sorria)
Sorria, apesar de seu coração estar doendo, sorria, mesmo que ele esteja partindo. Quando
houver nuvens no céu, você superará. Se você sorrir por entre seu medo e tristeza... Sorria, e talvez
amanhã você verá o Sol vindo brilhar para você. Ilumine sua face com alegria, esconda qualquer
traço de tristeza, apesar de uma lágrima poder estar sempre tão perto. Esta é a hora em que você
deve continuar tentando. Sorria! Para que chorar? Você descobrirá que esta vida ainda vale a pena,
se você apenas... sorrir!
(Charles Chaplin)
vi
i
Agradecimentos
Gostaria de neste momento agradecer a cada uma das instituições e pessoas que
contribuíram para a realização deste trabalho e também para minha formação pessoal.
Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva da Universidade Estadual
de Ponta Grossa pela oportunidade de realizar este estudo.
Ao prof. Dr. Roberto Ferreira Artoni, que foi meu orientador na iniciação científica, e me
acolheu muito bem no laboratório de Citogenética e Evolução. A cada ano que passa o laboratório
está mais bem estruturado, e o grupo de cientistas mais consolidado. Roberto é gratificante ver essa
segunda casa de todos crescer, e devemos muito à sua competência e perseverança, na conquista de
parcerias e apoio técnico. Agradeço também sua amizade e conselhos sempre válidos.
À profª Drª Mara Cristina de Almeida Matiello, pelos conhecimentos transmitidos desde a
graduação, pela paciência, pelas contribuições valiosas neste trabalho, e, sobretudo pela amizade, a
qual eu prezo muito. Agradeço por ser compreensiva e sempre disposta a ajudar.
Ao prof. Dr. Marcelo Ricardo Vicari, pela ajuda na bancada, por todo o auxílio, não só no
mestrado, mas na iniciação científica também. Você é um exemplo de persistência e dedicação.
À minha família, sempre torcendo por mim e me apoiando. Minha mãe, minha amiga,
Joana D´Arc de Mello Pistune, agradeço não só por ouvir cada desabafo e comemorar cada vitória
durante o mestrado. Agradeço por uma vida inteira ter se dedicado tanto a mim, eu simplesmente
não tenho palavras para agradecer. Ao meu pai, João Carlos Pistune. À minha irmãzinha Elisa,
agradeço cada sorriso, e digo que cada um deles me dá a força que preciso para continuar.
vi
i
i
Aos meus avós, Eva Maria Amaral de Mello, Neudi Ferreira de Mello (in memorian),
Dinarcy Rumbelsperger Pistune (in memorian) e José Francisco Pistune. Muito obrigada por
torcerem sempre por mim, pelo carinho dedicado. Amo vocês! À Edi e à Lúcia, pessoas muito
carinhosas que cuidaram de mim na infância enquanto meus pais trabalhavam. Aos meus queridos
padrinhos, Dilza Aparecida Sobczynski (16/01/1968 - 03/02/2010) e Álvaro Sobczynski, pelo
incentivo e presença constantes. Dilza, madrinha querida, nunca vou esquecer a força que você
sempre me deu, as vezes em que rimos muito juntas e o amor que sempre demonstrou por mim!
Saudades eternas, minha segunda mãe!
À “vó” Yolanda, pelo amor e por ter me auxiliado de diversas maneiras durante o período
da graduação e mestrado. A todos os meus tios e primos, pelo apoio e amizade!
À profª Drª Viviane Nogaroto Vicari, pelo auxílio com as técnicas de genética molecular e
pela agradável convivência, bem como suas contribuições neste trabalho, que foram de grande
ajuda! Agradeço também ao prof. Dr. Rodrigo Rodrigues Matiello as sugestões e correções em
relação a este trabalho. E a ambos, o incentivo e a compreensão.
Ao prof. Dr. Orlando Moreira-Filho da Universidade Federal de São Carlos, pelo
fornecimento das amostras, pelas sugestões e pelo auxílio com a revisão bibliográfica.
Ao técnico do laboratório de Citogenética e Evolução da UEPG, Miguel Aírton Carvalho,
por tantos anos de amizade! Só tenho a agradecer cada auxílio, cada conselho, por estar sempre
presente! Sem dúvida, você é um “paizão” para todos nós!
Aos meus colegas e amigos de mestrado: Maelin, Neto, Tatiana, Karin, Stella, Michelle,
Marília, Débora, Elise, Juliana, Aline, Simoní e Ricardo. Agradeço as conversas agradáveis, as
dificuldades que superamos juntos, e desejo muita felicidade a todos vocês!
ix
Aos colegas e amigos do laboratório: Bárbara, Kamila, Carin, Alain, Paulo, Leonardo,
Cléberson, Talita, Danizinha, Johnatan, Bruno, Larissa, Marcela e Taís, pela excelente
convivência, amizade e cooperação. Sucesso para vocês!
À profª Drª Daniele Matoso, do INPA, que muito me ajudou na graduação, pessoa a quem
muito estimo!
Aos meus amigos: Elize, Alexandre, Paola, Simone e Vinícius, Daiane, Rafaela, Aline,
Franciele, Carla, Mauro, Artur, Marcos, Leandro, Fernando, William e Marco. Obrigada pela
presença nos momentos alegres e nos mais difíceis também!
Ao IBAMA, pelas autorizações na captura de peixes.
Ao CNPq pelo apoio financeiro, e à CAPES, pela bolsa concedida.
Agradeço a Deus, cada desafio enfrentado, cada descoberta, cada dificuldade, pois tudo isso
fará de mim uma pessoa melhor e mais forte.
x
Sumário
RESUMO..................................................................................................................................................................11
ABSTRACT ........................................................................................................................................................... 13
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................................ 15
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................................................17
1.1 Considerações gerais sobre a bacia do rio Paraíba do Sul, sistemática, distribuição, filogenia e biologia dos
representantes da família Characidae ....................................................................................................................... 17
1.2 Caracterização do gênero Astyanax ......................................................................................................20
1.3 Caracterização citogenética de Astyanax, ênfase em A. scabripinnis .......................................................... 22
1.3.1 Os cromossomos B de Astyanax.......................................................................................................24
1.3.2 DNAs REPETITIVOS As51 E DE rDNA EM Astyanax..................................................................26
1.4 Cromossomos B.............................................................................................................................................31
2. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS....................................................................................................................36
3. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................................................................38
3.1 Material biológico e local de coleta...............................................................................................................38
3.2 Metodologias.................................................................................................................................................40
4. RESULTADOS.....................................................................................................................................................41
4.1 Localização de sondas cromossômica e repetitivas em Astyanax scabripinnis (Characidae, Incertae sedis).
Estudo da origem e diferenciação molecular do cromossomo B............................................................................42
5. CONCLUSÕES...................................................................................................................................................66
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................................................69
7. ANEXOS..............................................................................................................................................................81
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
11
Resumo
A origem, manutenção e frequência dos cromossomos B presentes em algumas populações de
Astyanax têm despertado interesse de grupos de citogeneticistas sobre um possível efeito
benéfico ou deletério para a espécie. Estes cromossomos geralmente apresentam variações
numéricas intra e interindividuais. O objetivo deste trabalho foi realizar uma análise
citogenética da origem e diversificação molecular do cromossomo B de Astyanax scabripinnis,
proveniente do córrego das Pedras, Campos do Jordão-SP. As análises mostraram um número
diplóide de 50 cromossomos, fórmula cariotípica: 6m, 22sm, 10st e 12a, além da variação intra
e interindividual de um macrocromossomo B. O macrocromosomo B heterocromático tem
forma e tamanho similar ao maior par do complemento A (1
o
par metacêntrico). Em metáfase
espermatogonial foi possível observar três metacêntricos grandes em células com 2n=51
cromossomos. Já em paquíteno com 26 elementos cromossômicos foi observado apenas um
bivalente grande, evidenciando que o cromossomo B realiza pareamento braço a braço. A
localização in situ da sonda cromossomo B evidenciou este elemento totalmente marcado,
além de pequenos sítios pericentroméricos e terminais nos cromossomos do complemento A,
entre eles o par 24. Já a sonda As51 mostrou localização na maior parte do cromossomo B,
além de 14 sítios autossômicos. Entre os sítios As51 está uma marcação intersticial do braço
longo do par acrocêntrico 24. Por sua vez, a localização das sequências repetitivas C
o
t-1 DNA,
obtidas de exemplares sem cromossomo B, mostraram sinais nas regiões pericentroméricas e
terminais de quase todos os cromossomos, incluindo o cromossomo B e o par 24. Nenhum
sítio de rDNA foi observado no cromossomo B. Esses dados corroboram a hipótese da origem
do cromossomo B a partir da formação de isocromossomo do par acrocêntrico 24. Ainda, a
análise citogenética em meiose evidencia que o cromossomo B realiza pareamento braço a
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
12
braço, mecanismo que pode contribuir para a transposição de sequências, auxiliando assim a
diversificação molecular do cromossomo B em relação ao complemento A. Dessa forma, este
trabalho contribui para uma melhor compreensão da natureza molecular do cromossomo B em
A. scabripinnis, bem como de sua origem e suas tendências evolutivas.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
13
Abstract
The origin, maintenance and frequency of B chromosomes present in some population of
Astyanax have been arousing interest of cytogeneticists groups about a possible beneficial or
deleterious effect for the species. These chromosomes generally shows intra and
interindividual numerical variation. The aim of this work was to perform a cytogenetical
analysis on the origin and molecular differentiation of the B chromosomes of Astyanax
scabripinnis from “Das Pedras” stream, Campos do Jordão, SP. The analysis showed a diploid
number of 50 chromosomes, karyotypic formula 6m, 22sm, 10st and 12a, besides the intra and
interindividual variation of a B macrochromosome. The heterochromatic B macrochromosome
shows shape and size similar to the major pair of the A complement (1
st
metacentric pair). In
spermatogonial metaphase was possible to observe three great metacentric chromosomes in
cells with 2n=51 chromosomes. However, was observed in pachitene cells with 26
chromosomical elements only one great bivalent, showing that the B chromosome performs
arm-to-arm pairing. In situ localization with a B chromosome probe showed this element
entirely marked, in addittion to small pericentromerics and terminal sites in the A
chromosomes complement, among them, the 24
th
pair. Besides, the As51 probe showed
localization in the major part of the B chromosome, and also 14 autossomical sites. Between
the As51 sites there is an interstitial marking in the long arm of the 24
th
acrocentric pair. On
the other hand, the localization of the repetitive sequences C
o
t-1 DNA, obtained from
individuals without B chromosome, showed signals on the pericentromeric and terminal
regions of almost all chromosomes, including the B chromosome and the 24
th
pair. No rDNA
site was observed on B chromosome. This data corroborate the hypothesis of the origin of B
chromosome through the formation of an isochromosome of the 24
th
acrocentric pair. Even,
the cytogenetical analysis in meiotic cells shows that the B chromosome performs arm-to-arm
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
14
pairing, a mechanism that can contribute to the transposition of sequences, rising thus the
molecular differentiation of the B chromosome in relation to the A complement. Therefore,
this work contributes to a better comprehension of the molecular nature of the B chromosome
in A. scabripinnis, as well as its origin and evolutionary trends.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
15
Lista de Figuras
Figura 1. Mapa do Brasil, em destaque a região sul/sudeste mostrando as bacias hidrográficas e o ponto de
amostragem de Astyanax scabripinnis do presente estudo em Campos do Jordão,
SP.............................................................................................................................................................39
Figura 2. Cariótipo de A. scabripinnis de Campos do Jordão (SP), Brasil. Em (a), coloração convencional
(Giemsa). Em (b), os mesmos cromossomos, submetidos ao bandamento C sequencial, destacando as
regiões heterocromáticas. Barra = 10µm.................................................................................................58
Figura 3. Células meióticas de espécimes de A. scabripinnis sem a presença de cromossomo B em coloração
convencional (Giemsa). Em (a) metáfase espermatogonial com 2n=50 cromossomos; (b) zigóteno
inicial; (c) paquíteno inicial; (d) paquíteno final evidenciando 25 bivalentes completamente
emparelhados; (e) desenho esquemático representativo dos 25 bivalentes em paquíteno final observado
em (d); (f) diplóteno evidenciando 1 a 2 quiasmas por bivalente e; (g) metáfase II com número
incompleto de cromossomos. Barras = 10µm...........................................................................................59
Figura 4: Células meióticas de espécimes de A. scabripinnis com a presença de cromossomo B em coloração
convencional (Giemsa). Em (a) metáfase espermatogonial com 2n=51 cromossomos, as setas indicam o
primeiro par metacêntrico, a cabeça de seta mostra o cromossomo B heteropicnótico positivo; (b)
metáfase II com 26 cromossomos; (c) paquíteno final mostrando 25 bivalentes e mais o provável
cromossomo B autopareado, a seta indica o bivalente do maior par metacêntrico e; (d) desenho
esquemático do paquíteno descrito em (c). Barras=10 µm......................................................................60
Figura 5: Metáfase mitótica de A. scabripinnis submetida à dupla FISH com sondas cromossômica e de DNAs
repetitivos:localização da sonda cromossomo B. Em (a-d), metáfase sem cromossomo B. Em (a), contra-
coloração DAPI. Em (b), localização da sonda do cromossomo B; em (c), localização do DNA repetitivo
As51 e, em (d), sobreposição das imagens. (as cabeças de seta indicam outros sítios As51 além dos já
indicados com o número correspondente ao par cromossômico) Barra =
10µm..........................................................................................................................................................61
Figura 6: Metáfase mitótica de A. scabripinnis submetida a dupla FISH com sondas cromossômica e de DNAs
repetitivos: localização da sonda cromossomo B. Em (a-d), metáfases com cromossomo B. Em (a),
contra-coloração DAPI. Em (b-d), é possível observar o cromossomo B totalmente hibridizado com a
sonda cromossomo B e quase totalmente hibridizado com a sonda As51, a exceção das regiões terminais
e centromérica. Barra = 10µm...................................................................................................................62
Figura 7: Metáfase de A. scabripinnis submetida a dupla FISH com sonda cromossômica (cromossomo B) e de
DNA repetitivo C
o
t–1. Em (a-d) metáfase apresentando cromossomo B submetida a dupla FISH para a
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
16
localização das sondas cromossomo B (b) e do DNA repetitivo C
o
t–1 obtido de espécimes sem
cromossomo B (c). Em (a), contra-colocração DAPI. Em (b) é possível observar o cromossomo B
totalmente localizado e destaque para o par a 24 portando sonda B em região pericentromérica; (c)
cromossomo B portando sonda C
o
t–1 em região pericentromérica e terminais, além do destaque para o
par a 24 portando este DNA repetitivo em região pericentromérica; (d) sobreposição das imagens sonda
cromossomo B e C
o
t–1 DNA. Barra = 10µm.............................................................................................63
Figura 8: Células paquitênicas de A. scabripinnis submetidas a localização in situ de sondas cromossômica e de
DNAs repetitivos. Em (a-d) paquíteno submetido a localização da sonda cromossomo B (b); localização
da sonda As51 (c) e; sobreposição das imagens (d). A seta destaca o cromossomo B com cerca da metade
do tamanho do maior bivalente. Em (e-f) paquíteno incompleto com a localização da sonda DNA
repetitivo C
o
t–1 obtido de espécimes sem cromossomo B. Em (e) contra-coloração DAPI e; (f) sítios
DNA repetitivo C
o
t–1 localizados em regiões terminais e centroméricas da maioria dos bivalentes.
Barras = 10µm............................................................................................................................................64
Figura 9: Metáfases mitóticas de A. scabripinnis submetidas a dupla FISH com sondas de rDNA 18S e 5S. Em
(a) contra-coloração DAPI; (b) localização in situ do rDNA 18S, com destaque para os pares m 4 e 10,
além de uma marcação adicional (seta); (c) localização dos sítios rDNA 5S (cabeça de seta) e; (d)
sobreposição das imagens (as setas indicam os sítios rDNA 18S e as cabeças de seta indicam os sítios
rDNA 5S). Barras = 10µm.........................................................................................................................65
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
17
1. Introdução
1.1 Considerações gerais sobre a bacia do rio Paraíba do Sul, sistemática,
distribuição, filogenia e biologia dos representantes da família Characidae
Os peixes compreendem mais da metade dos vertebrados vivos, ultrapassando 32.500
espécies conhecidas, constituindo um grupo extremamente diverso, habitando os mais
diferenciados ambientes aquáticos (NELSON, 2006). Grande parcela desta diversidade de
espécies está na região Neotropical. Os ecossistemas aquáticos da Mata Atlântica Brasileira
possuem uma fauna de peixes rica e variada, intimamente associada à floresta que proporciona
proteção e alimento (MENEZES et al., 1990; MENEZES, 1994). Com a devastação da
floresta, hoje reduzida a apenas 2 a 2,5 % de sua extensão inicial, houve uma profunda
alteração, reduzindo a fauna original a uma fração do que existia no passado. O traço mais
marcante desta fauna é o seu grau de endemismo, resultante do processo de evolução histórica
das espécies, em uma área geomorfológica isolada das outras áreas onde se localizam as
demais bacias hidrográficas brasileiras.
A bacia do rio Paraíba do Sul apresenta uma superfície de 55.400 km
2
, ocupando uma
área densamente povoada e urbanizada nos estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Minas
Gerais (CEIVAP, 2008). Está situada no fundo de uma depressão tectônica entre a Serra do
Mar e a Serra da Mantiqueira. O rio Paraíba do Sul é formado pela junção dos rios Paraibuna e
Paraitinga, no estado de São Paulo. Seu percurso inicial é de leste para oeste, entretanto, na
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
18
altura da cidade de Guararema, é barrado por serras elevadas, invertendo seu curso em quase
180 graus no sentido horário, a partir daí, seguindo em direção oeste-leste, até sua
desembocadura no oceano Atlântico, junto à cidade de São João da Barra, RJ (CEIVAP,
2008). Essa região é caracterizada por formações montanhosas, com muitos pequenos riachos
que compreendem uma rica ictiofauna, onde é verificada a ocorrência de populações isoladas.
O isolamento entre populações restringe o fluxo gênico, aumentando a probabilidade
dos acasalamentos ocorrerem entre indivíduos aparentados, tornando a população endogâmica.
Também vale ressaltar que animais aquáticos mostram uma maior diversidade regional em
regiões montanhosas onde há sistemas de rios isolados e o isolamento geográfico de espécies
de peixes nas cabeceiras de rios pode levar estas comunidades a processos evolutivos
importantes, culminando em especiação alopátrica (FUTUYMA, 2002).
Mecanismos de isolamento incluem barreiras físicas, químicas e bióticas, causando
isolamento espacial; isolamento temporal; e barreiras comportamentais (LOWE-
McCONNELL, 1969). Deste modo, estas populações isoladas passam a evoluir de maneira
independente umas das outras devido à ausência de fluxo gênico entre elas.
Consequentemente, a população pode se tornar altamente endogâmica. A endogamia promove
um aumento da frequência dos genótipos homozigotos em ambas as extremidades do espectro
fenotípico, enquanto diminuem os heterozigotos, ou seja, o fenótipo médio da população sofre
um declínio (a menos que o loco em questão tenha ação sobredominante). Quando os alelos
recessivos diminuem o valor adaptativo, serão eliminados mais rapidamente nessa população
endogâmica do que em uma exogâmica. Assim, inicialmente a população sofrerá depressão
endogâmica, porém eventualmente a seleção natural tende a eliminar os alelos deletérios e a
população reconquista alta média de valor adaptativo. A menor variação genética em
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
19
populações endogâmicas se deve não somente ao endocruzamento em si, mas da ação
combinada com a seleção natural e também a deriva genética (FUTUYMA, 2002).
A ordem Characiformes contém 18 famílias, 270 gêneros e aproximadamente 1674
espécies (NELSON, 2006; MOREIRA, 2007). Characidae é a maior e mais complexa família
da ordem Characiformes com cerca de 780 espécies válidas, é também a mais diversificada da
região Neotropical (FROESE e PAULY, 2010). Nos últimos anos, sua composição mudou
muito com o reconhecimento das subfamílias Crenuchinae e Characidinae como pertencentes
à família Crenuchidae, e a elevação do táxon africano Alestiinae, de subfamília a família
(NELSON, 2006). Seus representantes são conhecidos popularmente como piranhas, lambaris,
tetras, entre muitos outros e possuem hábitos alimentares muito diversificados (herbívoros,
onívoros, carnívoros), sendo coletados com relativa facilidade nos cursos de água, tanto pela
abundância de espécies como pelo grande número de espécimes encontrados (BRITSKI et al.,
1988).
A ampla variedade de formas encontradas na família Characidae certamente está
relacionada à sua condição polifilética. Do mesmo modo, Tetragonopterinae era tida como a
mais especiosa entre as subfamílias de Characidae. Entretanto, pela carência de dados que
suportariam o seu monofiletismo, foi considerada apenas com o gênero Tetragonopterus
(LIMA et al., 2003). Os demais gêneros de Tetragonopterinae, entre eles Astyanax, foram
listados em gêneros “Incertae sedis” em Characidae. No entanto, algumas das subfamílias de
Characidae são consideradas monofiléticas por apresentarem certas especializações.
Cheirodontinae, por exemplo, apresenta caracteres relacionados à morfologia dentária, à
musculatura e ao padrão de colorido na região umeral, que suportam seu monofiletismo
(MALABARBA, 1998). Apesar do grande
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
20
número de espécies encontradas, muitas delas, antes relatadas como abundantes em certos
sistemas, estão cada vez mais raras e podem desaparecer por completo sem ao menos serem
estudadas do ponto de vista biológico. Estes dados ressaltam a importância de uma
investigação mais detalhada e aprofundada das relações filogenéticas e da diversidade de
espécies de peixes, analisando caracteres morfológicos e moleculares (NELSON, 2006).
1.2 Caracterização do gênero Astyanax
O gênero Astyanax é um dos táxons de peixes de água doce mais amplamente
distribuído nas Américas. Sua distribuição vai desde a Argentina até a fronteira do México
com os Estados Unidos (BRITSKI, 1972). Seus exemplares possuem tamanho reduzido;
nadadeira adiposa geralmente presente; linha lateral completa, pouco curva na frente; pré-
maxilar não-protrátil; dentes pré-maxilares dispostos em duas séries, a interna com cinco
dentes; dentes com cúspides; altura do corpo cerca de três vezes ou menos o comprimento
padrão e escamas de tamanho normal, cobrindo apenas a base dos raios na nadadeira caudal
(BRITSKI et al., 1988). São peixes não-migradores, com fecundação externa e ausência de
cuidado parental.
Anteriormente alocado na subfamília Tetragonopterinae (GÉRY, 1977), Astyanax foi
considerado como Incertae sedis, por não apresentar evidências consistentes de monofiletismo
(LIMA et al., 2003). Reis et al. (2003), naquele ano, listaram 86 espécies válidas para este
gênero, o qual é apontado, juntamente com mais 87 gêneros da família Characidae, como
taxonomicamente pouco conhecido e possivelmente não monofilético. Atualmente, são
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
21
reconhecidas 127 espécies válidas para o gênero Astyanax (FROESE e PAULY, 2010). No
entanto, a maioria das descrições está baseada apenas em dados morfológicos, sem relatos de
estudos ecológicos, fisiológicos, reprodutivos e genéticos. Sendo assim, é um grupo de
especial interesse em estudos evolutivos e citogenéticos, representado por um grande número
de espécies amplamente distribuída pela América do Sul e Central (BRITSKI et al., 1984).
Dentro deste gênero, encontra-se o “complexo de espécies” Astyanax scabripinnis,
assim definido por Moreira-Filho e Bertollo (1991) com base em caracteres morfológicos e
cromossômicos, os quais apresentam grande diversidade dentro deste táxon. Este complexo de
espécies caracteriza-se por peixes de pequeno porte que habitam a cabeceira de pequenos rios
de diferentes bacias hidrográficas brasileiras (CARAMASCHI, 1986). Esta espécie é de
pequeno valor comercial, mas de grande importância na cadeia trófica de vários ecossistemas
(FRAGOSO et al., 2008). Os canais de grandes rios atuam como barreiras biológicas para
populações de pequenos afluentes, seja por competição com outras espécies de lambaris ou
por predação por outras espécies, restringindo o fluxo gênico e reforçando a condição
alopátrica entre eles. Assim, a tendência é de que as populações sigam diferentes caminhos
evolutivos, estando sob diferentes pressões seletivas e, devido ao tamanho restrito da
população, podem ser afetadas por deriva genética (KAVALCO e MOREIRA-FILHO, 2003;
VICARI et al., 2008a). Diante destas características, o complexo de espécies “Astyanax
scabripinnis” é considerado um excelente material para estudos genéticos e evolutivos.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
22
1.3 Caracterização citogenética de Astyanax, ênfase em A. scabripinnis
O número diplóide do gênero Astyanax pode variar de 36, em Astyanax schubarti a
50, em A. eigenmaniorum, A. mexicanus, A. taeniatus, A. lineatus, A. scabripinnis
(MOREIRA-FILHO e BERTOLLO, 1991) entre outros. Além da ampla diversidade
cromossômica para o número diplóide, vários relatos têm demonstrado uma alta diversidade
cariotípica neste gênero para a morfologia cromossômica, padrão de bandamento C, Regiões
Organizadoras de Nucléolos (RONs), ocorrência de micro e macro cromossomos B, triploidia
natural, localização de sítios de rDNA e DNAs satélites em populações naturais (MOREIRA-
FILHO e BERTOLLO, 1991; MAISTRO et al., 1994; FAUAZ et al., 1994; MESTRINER et
al., 2000; MANTOVANI et al., 2000; ABEL et al., 2006; PERES et al., 2008; VICARI et al.,
2008 a, b; KANTEK et al., 2007; 2009a, b).
O taxa nominal A. scabripinnis, de acordo com Moreira-Filho e Bertollo (1991),
representa um complexo de espécies. Neste estudo com caracteres cariotípicos e/ou
morfológicos com análises de variáveis canônicas, Moreira-Filho e Bertollo (1991)
diferenciaram seis das sete populações estudadas. Bertaco e Lucena (2006) relataram que este
complexo de espécies é representado por aproximadamente 15 espécies. Recentemente, Vicari
et al. (2008a) consideraram esse número possivelmente subestimado baseados em estudos
citogenéticos em populações de Astyanax de cabeceiras de rios. Análises cariotípicas em
populações do complexo “Astyanax scabripinnis”, pertencentes a diferentes córregos em uma
mesma bacia hidrográfica, ou mesmo a diferentes bacias hidrográficas podem mostrar
números diplóides específicos (2n=46, 48 e 50 cromossomos), bem como padrões particulares
de bandamento C (MANTOVANI et al., 2000; MOREIRA-FILHO et al., 2004; VICARI et
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
23
al., 2008a) e variações no número de sítios de rDNA (MANTOVANI et al., 2005; VICARI et
al., 2008a).
Apesar de populações simpátricas do complexo “Astyanax scabripinnis” com
números diplóides diferentes já terem sido descritas, nenhuma ocorrência de indivíduos
híbridos tem sido relatada (MIZOGUCHI e MARTINS-SANTOS, 1998a; VICARI et al.,
2008a). Mizoguchi e Martins-Santos (1998a) estudaram quatro populações de A. scabripinnis,
duas delas pertencentes à mesma bacia hidrográfica; uma delas apresentou número diplóide
igual a 50 cromossomos, e a outra, um número diplóide de 48 cromossomos. Além disso, a
população 2n=50 apresenta três pares de cromossomos metacêntricos, enquanto a população
2n=48 detém cinco pares metacêntricos. Segundo Moreira-Filho e Bertollo (1991), o grupo
metacêntrico de cromossomos em A. scabripinnis costuma ser bastante conservado, enquanto
a quantidade de cromossomos submetacêntricos, subtelocêntricos e acrocêntricos é mais
variável. Vicari et al. (2008a) também estudaram populações simpátricas e sintópicas do
complexo “Astyanax scabripinnis” com 2n=50 e 2n=48 cromossomos. Nesta análise
citogenética comparativa observaram a presença de um par metacêntrico a mais (5 pares) para
a população com 2n=48 cromossomos. O número diplóide igual a 50 também foi a
característica mais comumente encontrada para este complexo de espécies (MOREIRA-
FILHO e BERTOLLO, 1991; SOUZA e MOREIRA- FILHO, 1995; ROCON-STANGE e
ALMEIDA-TOLEDO, 1993; MAISTRO et al., 2000; NÉO et al., 2000a; b; MANTOVANI et
al., 2005; VICARI et al., 2008a). No entanto, a ocorrência de 2n=48 cromossomos já foi
descrita para algumas populações de A. scabripinnis, pertencentes à bacia do alto rio Paraná
(MOREIRA-FILHO e BERTOLLO, 1991; SOUZA et al., 1996; MIZOGUCHI e MARTINS-
SANTOS, 1998a; MAISTRO et al., 2000; MANTOVANI et al., 2000; ALVES e MARTINS-
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
24
SANTOS, 2002; VICARI et al., 2008a). Além da diferença numérica, essas populações
geralmente diferem daquelas com 2n=50 cromossomos pela presença de um par diferenciado
de cromossomos subtelocêntricos (MANTOVANI et al., 2000), submetacêntricos (MAISTRO
et al., 2000) ou metacêntricos (VICARI et al., 2008a). Nestes três estudos, o número diplóide
2n=48 cromossomos é considerado apomórfico e originado por evento de translocação
Robertsoniana.
1.3.1 Os cromossomos B de Astyanax
A origem, a manutenção e a frequência dos cromossomos B presentes em algumas
populações de Astyanax também têm despertado interesse de grupos de citogeneticistas sobre
um possível efeito benéfico ou deletério para a espécie. Estes cromossomos geralmente
apresentam variações numéricas intra e interindividuais, assim como podem diferir em
tamanho e na morfologia (MESTRINER et al., 2000; NÉO et al., 2000a).
Cromossomos B foram descritos para 21 populações de A. scabripinnis, algumas
destas isoladas das outras há milhões de anos em diferentes bacias hidrográficas e separadas
por centenas de quilômetros (MOREIRA-FILHO et al., 2004). Geralmente, para a espécie A.
scabripinnis este elemento supranumerário é caracterizado como um cromossomo
metacêntrico grande, similar em tamanho ao primeiro par cromossômico do complemento
(SALVADOR e MOREIRA-FILHO, 1992). Todavia, em algumas populações desta espécie
podem se apresentar como microcromossomos (MIZOGUCHI e MARTINS-SANTOS, 1997),
ou como metacêntricos pequenos e submetacêntricos grandes (NÉO et al., 2000a). O número
de cromossomos B por indivíduo pode variar de zero a quatro, embora a presença de apenas
um seja a mais frequente (NÉO et al., 2000a, b).
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
25
A frequência de cromossomos B no complexo “Astyanax scabripinnis” pode variar
entre populações em seu modo de segregação. Rocon-Stange e Almeida-Toledo (1993)
analisaram uma população de A. scabripinnis coletada no Rio Jucu – ES que apresentou
cromossomos B exclusivamente em machos. Por sua vez, em um estudo realizado por Néo et
al. (2000a) foi observada uma relação direta entre o aumento da altitude onde se encontra a
população e a quantidade destes elementos supranumerários em A. scabripinnis. Neste mesmo
estudo, foram descritos cromossomos B somente em populações isoladas acima de 1000
metros de altitude, além de ter sido verificada uma maior frequência de cromossomos B em
espécimes fêmeas (VICENTE et al., 1996; NÉO et al., 2000a).
Moreira-Filho et al. (2001) verificaram a ocorrência de cromossomos B
metacêntricos em populações de A. scabripinnis, A. fasciatus e A. schubarti de três bacias
hidrográficas diferentes, porém a maior frequência de cromossomos B é relatada para A.
scabripinnis. Por sua vez, em Astyanax eigenmaniorum também foram encontrados
cromossomos B metacêntricos em populações com 2n=50 cromossomos (STRIPECKE et al.,
1985; apud MOREIRA-FILHO et al., 2004) e com 2n=48 cromossomos (TORRES-
MARIANO e MORELLI, 2008). Nesse sentido, Moreira-Filho et al. (2004) hipotetizaram que
o cromossomo B metacêntrico grande teria uma origem remota comum dentro do gênero
Astyanax e que, uma análise molecular destes cromossomos poderia auxiliar no entendimento
de sua origem e dispersão. No entanto, não é possível descartar a hipótese de que os
cromossomos B de diferentes populações/espécies no gênero Astyanax sejam eventos
recorrentes.
Quatro tipos morfológicos de cromossomos B já foram relatados para A. scabripinnis:
metacêntrico grande; microcromossomo; subtelocêntrico grande e metacêntrico pequeno
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
26
(Anexo I). A origem dos cromossomos B de A. scabripinnis das populações isoladas da Serra
da Mantiqueira é descrita para um par autossômico (par 24) subtelo-acrocêntrico ancestral
(VICENTE et al., 1996; NÉO et al., 2000b). Néo et al. (2000b) sugeriram que os
cromossomos B de forma metacêntrica grande e a forma microcromossômica tenham se
originado deste par cromossômico 24 por evento de formação de isocromossomo. Por sua vez,
o cromossomo B submetacêntrico grande deve ter origem de uma inversão pericêntrica a
partir do metacêntrico grande. Já o metacêntrico pequeno pode ter sido derivado do
submetacêntrico grande por meio de deleções no braço longo (NÉO et al., 2000b).
A origem isocromossômica para o cromossomo B metacêntrico grande é suportada
por estudos meióticos que verificaram a formação de univalentes que realizam pareamento
entre seus braços em paquíteno, corroborando a hipótese que estes apresentam homologia
(MESTRINER et al., 2000). Esta conformação meiótica do cromossomo B permitiria a
ocorrência de trocas desiguais entre os braços cromossômicos, levando a padrões
diferenciados de heterocromatina entre os cromossomos B (NÉO et al., 2000b).
1.3.2 DNAs repetitivos As51 e de rDNA em Astyanax
A citogenética de peixes Neotropicais vem aprimorando-se nos últimos anos no sentido
de buscar respostas mais consistentes para os mecanismos de diversificação dos genomas das
espécies. Muitos pesquisadores utilizam as sequências de DNAs repetitivos dos genomas para
embasar suas teorias de evolução cariotípica. Mestriner et al. (2000) identificaram um DNA
satélite 59% rico em AT no genoma de A. scabripinnis, com unidades monoméricas de 51 pb,
denominado As51. Análises por hibridação in situ fluorescente (FISH) mostraram que este
DNA está localizado principalmente nas heterocromatinas distais, em alguns sítios de RONs e
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
27
no cromossomo B da população analisada (MESTRINER et al., 2000). Essa sequência
apresentou 58,8% de similaridade com uma porção do retrotransposon RT2 de Anopheles
gambiae e menor homologia com o gene da transposase do transposon TN4430 do Bacillus
thuringiensis, sugerindo que sua origem possa ter ocorrido a partir de um elemento
transponível de DNA.
Estudos posteriores identificaram esta família de DNA satélite em outras populações
de A. scabripinnis, assim como em A. fasciatus, A. janeiroensis, Astyanax sp. D e, A. paranae
(MANTOVANI et al., 2004; ABEL et al., 2006, PAZZA et al., 2008; VICARI et al., 2008a;
KANTEK et al., 2009a), evidenciando sua ocorrência não apenas no grupo scabripinnis, mas
também entre diferentes espécies do gênero. O padrão de distribuição da heterocromatina
constitutiva constitui um dos melhores marcadores cromossômicos para discriminar
populações locais de A. scabripinnis (MOREIRA-FILHO e BERTOLLO, 1991; MAISTRO et
al., 1998) e A. fasciatus (ARTONI et al., 2006a; PAZZA et al., 2008), indicando que processos
de diferenciação heterocromática/As51 podem estar diretamente envolvidos com a evolução
cromossômica deste grupo. Todos os cinco taxa acima mencionados possuem grandes blocos
distais de heterocromatina ou blocos intersticiais menores, principalmente em cromossomos
subtelocêntricos e acrocêntricos, embora este DNA satélite possa também ocorrer em
cromossomos meta e submetacêntricos.
Mantovani et al. (2004) mostraram que os blocos distais de heterocromatina com
homologia para a sequência As51, presentes em duas populações distintas de A. scabripinnis,
apresentavam respostas discordantes para fluorocromos base específicos, que não poderiam
ser atribuídos à composição de bases do DNA satélite As51. Vicari et al. (2008b), estudando a
composição da heterocromatina em uma outra espécie de Astyanax, A. janeiroensis,
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
28
mostraram que os 14 grandes blocos heterocromáticos, presentes nos cromossomos
subtelocêntricos e acrocêntricos dessa espécie, eram compostos por duas famílias de DNAs
repetitivos co-localizados, o satélite As51 e o rDNA 18S. É conhecido que nos peixes
teleósteos, a fração espaçadora do rDNA maior geralmente apresenta-se rica em GC
(AMEMIYA e GOLD, 1986; SCHMID e GUTTENBACH, 1988), enquanto o satélite As51
tem composição 59% AT. Assim sendo, é possível que a co-localização dos sítios GC do
rDNA maior e AT do satélite As51 possa propiciar um efeito de competição entre os
fluorocromos base específicos, Cromomicina A3 e 4'-6-diamidino-2-phenilindole (DAPI),
com consequentes respostas atenuadas ou discordantes nestes domínios cromossômicos
(VICARI et al., 2008b).
Elementos transponíveis de DNA são conhecidos como potentes agentes indutores
de alterações no genoma hospedeiro (KIDWELL e LISCH, 2000; 2001; KIDWELL, 2002,
DORER e HENIKOFF, 1997), O DNA satélite As51 tem origem provável a partir de um
elemento transponível de DNA (MESTRINER et al., 2000). Significantemente, as sequências
de rDNA 18S, presentes nos grandes domínios heterocromáticos As51 de A. janeiroensis,
mostraram-se inativas evidenciando o silenciamento dos genes de rRNA quando co-
localizados com o DNA satélite As51 (VICARI et al., 2008b).
Recentemente, Kantek et al. (2009a) realizaram um mapeamento comparativo por
FISH, com sondas do DNA satélite As51, entre algumas espécies de Astyanax: A. scabripinnis,
A. paranae, A. janeiroensis, Astyanax sp. D, A. altiparanae e A. fasciatus. A. altiparanae foi a
única espécie que não apresentou sítios de DNA satélite em nenhuma das populações
analisadas. Por outro lado, as demais espécies apresentaram extensas variações no número de
cromossomos marcados (1 a 16 sítios As51). As espécies A. paranae, A. janeiroensis,
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
29
Astyanax sp. D e A. altiparanae apresentam número diplóide de 50 cromossomos (ARTONI et
al., 2006a; DOMINGUES et al., 2007; VICARI et al., 2008a, b; KANTEK et al., 2009b)
enquanto que diferentes populações de A. scabripinnis e A. fasciatus podem apresentar
variações em seus números diplóides de 46 a 50 cromossomos (MOREIRA-FILHO e
BERTOLLO et al., 1991; JUSTI, 1993). Apesar de sítios de DNA satélite serem prováveis
alvos para quebras e fusões cromossômicas, o DNA satélite As51 não se mostrou associado
aos rearranjos cromossômicos que modificaram os números diplóides em A. scabripinnis e A.
fasciatus (KANTEK et al., 2009).
Esta família de DNA mostra-se basal para A. scabripinnis, A. paranae, A. janeiroensis,
Astyanax sp. D, A. fasciatus, constituindo assim um grupo de espécies mais relacionadas
quanto a esta característica, do que as outras espécies do gênero que não apresentam o satélite
As51, como A. altiparanae (KANTEK et al., 2009a). Assim, a grande variação em número e
posição de sítios As51 entre diferentes populações de uma mesma espécie deve ser decorrente
do isolamento geográfico existente entre elas. Considerando ser o DNA satélite As51 derivado
de um elemento transponível, cada população ou espécie poderia seguir vias evolutivas
independentes, quer seja para o acúmulo e invasão de outros sítios cromossômicos, ou
eliminação de sequências no genoma, acentuando assim as divergências cariotípicas entre as
populações/espécies. Neste sentido, não se pode descartar um papel potencial do DNA satélite
As51 nos processos de especiação do gênero Astyanax.
As famílias multigênicas de RNAs ribossomais 45S e 5S também são amplamente
utilizadas em inferências de diversificação dos genomas em Astyanax. Os sítios de rDNA 45S
ativos coincidem em localização com as RONs, enquanto as regiões 5S não estão associadas
com esta região na intérfase. A localização in situ destas regiões são marcadores genéticos
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
30
válidos em citotaxonomia e estudos evolutivos (GALETTI Jr., 1998; MANTOVANI et al.,
2005; entre outros). Entretanto, a análise por impregnação por prata (Ag-RON) apenas revela
os sítios ativos na intérfase precedente (MILLER et al., 1976). Por sua vez, para localizar
diretamente os sítios cromossômicos portadores do rDNA 45S (sitios ativos e inativos) são
utilizadas sondas desta região gênica em procedimentos de hibridação in situ fluorescente
(FERRO et al., 2001).
O rDNA 45S codifica os RNAs 18S, 5,8S e 28S, enquanto o RNA 5S é codificado
pelo rDNA 5S. Estudos apontam para uma variação intra/interindividual e inter populacional
do rDNA 45S em A. scabripinnis, contrastando com um certo grau de conservação da
localização do rDNA 5S (MANTOVANI et al., 2005; VICARI et al., 2008a). Sítios de RONs
múltiplas é a condição comumente encontrada em populações de A. scabripinnis (FERRO et
al., 2001; MANTOVANI et al., 2005; VICARI et al., 2008a). No tocante a localização dos
sítios de rDNA 45S, para a maioria dos pares, não há evidências da conservação dos
cromossomos portadores destes sítios de rDNA nos cariótipos entre diferentes populações,
evidenciando a ampla plasticidade deste marcador em A. scabripinnis, possivelmente
decorrente de eventos de transposição (SOUZA et a., 2007). Ainda, a presença de um
cromossomo subtelocêntrico com RONs biteloméricas foi constatada em algumas populações
do gênero Astyanax, como em A. scabripinnis (MANTOVANI et al., 2005; VICARI et al.,
2008a) e A. janeiroensis (VICARI et al., 2008b).
Enquanto que variações interpopulacionais ocorrem no número de sítios de rDNA 18S
em Astyanax, a localização dos sítios de rDNA 5S mostra evidências de sítios e cromossomos
homeólogos entre populações/espécies do gênero (FERRO et al., 2001; ALMEIDA-TOLEDO
et al., 2002; MANTOVANI et al., 2005; PERES et al., 2008; VICARI et al., 2008a;
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
31
FERREIRA-NETO et al., 2009). Sítios de rDNA 5S mostraram-se conservados em dois pares
cromossômicos, um metacêntrico e outro acrocêntrico, na região proximal do braço longo, em
populações do complexo A. scabripinnis (FERRO et al., 2001; ALMEIDA-TOLEDO et al.,
2002; MANTOVANI et al., 2005; VICARI et al., 2008a). Em Astyanax sp. D do rio Iguaçu e
A. janeiroensis o sítio de rDNA 5S foi localizado apenas em um par acrocêntrico em região
proximal do braço longo, comparável àquele encontrado no complexo A. scabripinnis
(KANTEK et al., 2007; VICARI et al., 2008b, respectivamente). Mantovani et al. (2000)
propõem que sítios de rDNA 5S em posição proximal do braço longo indicam ser um padrão
conservado para estes genes em Astyanax. Nesse sentido, os cromossomos portadores dos
sítios de rDNA 5S são comparáveis entre as populações de Astyanax estudadas, no entanto,
divergentes em morfologia cromossômica e número de sítios aos encontrados em outras
populações do gênero.
1.4 Cromossomos B
Cromossomos B são cromossomos adicionais dispensáveis, não homólogos aos do
complemento padrão e detectados em uma certa frequência na população (JONES e REES,
1982). Ocorrem em frequências variáveis em diferentes espécies de fungos, plantas, animais e
podem ser instáveis durante a mitose ou a meiose. Estes cromossomos já foram descritos em
mais de 1300 espécies de plantas e 500 espécies de animais, além de serem encontrados
também em várias espécies de fungos, segundo revisão feita por Camacho et al. (2000). São
elementos que não recombinam com os cromossomos do complemento padrão e apresentam
padrão de herança não-mendeliano. Estão presentes em aproximadamente 15% das espécies
eucarióticas e na maior partes das vezes se comportam de maneira parasítica, mostrando taxas
de transmissão mais alta que os cromossomos do complemento padrão e podem ter efeitos
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
32
prejudiciais aos seus portadores (TERUEL et al., 2009). Segundo Camacho et al. (2000), as
influências destes cromossomos supranumerários podem oscilar entre efeitos parasíticos e
neutros ou até mesmo efeitos benéficos.
Os cromossomos B podem ter origem intraespecífica, a partir de cromossomos do
complemento padrão (A) ou de cromossomos sexuais, ou interespecífica: neste último caso,
por meio de formação de híbridos entre duas espécies proximamente relacionadas
(CAMACHO et al., 2000). Em peixes neotropicais, o primeiro cromossomo B foi detectado
em Prochilodus lineatus, citado como Prochilodus scrofa (PAULS e BERTOLLO, 1983).
Posteriormente foram observados em Prochilodontidae, Parodontidae, Characidae,
Pimelodidae, Curimatidae, Callichthyidae, Loricariidae, Cichlidae e Coregonidae. A maioria
dos cromossomos B é composta de DNA satélite, coincidindo com sua natureza
heterocromática.
Camacho et al. (2000), descreveram as principais características acerca da frequência
destes elementos em diferentes espécies e populações.
“Estes cromossomos têm sido descritos predominantemente em certos grupos
taxonômicos, porém a alta frequência de B nestes taxa provavelmente reflete a intensidade e
a facilidade técnica com que cada grupo tem sido estudado. Assim, é provável que muitas
outras espécies, quando analisadas com intensidade suficiente, sejam descobertas como
portadoras destes cromossomos”.
Cromossomos B podem atingir frequências extremamente altas em populações
naturais, dependendo do quanto uma espécie particular pode tolerar estes elementos adicionais
bem como da força do mecanismo de acúmulo dos cromossomos B, se estes existirem
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
33
(JONES, 1985; PARDO et al., 1994; CAMACHO et al., 2000). Uma frequência estável destes
elementos é encontrada por muitos anos, o que, no passado, levou autores a concluir que o
polimorfismo está num estado de equilíbrio e que a frequência é o resultado da ação de duas
forças opostas: de acumulação do B, que tende a aumentar sua frequência e dos efeitos
danosos ao valor adaptativo dos indivíduos portando cromossomos B, o que tende a diminuir
sua frequência (ÖSTERGREN, 1945; NUR, 1966; 1977). Entretanto, o polimorfismo do
cromossomo B pode ser interpretado como um sistema dinâmico no qual a frequência
continuamente muda devido a forças opostas entre cromossomos do complemento A e B
(CAMACHO et al., 2000).
Em adição, diferenças interpopulacionais na frequência de cromossomos B depende de
fatores seletivos (por exemplo: a tolerância de portadores de cromossomos B em termos de
permissividade das condições ambientais para uma população particular), fatores históricos (o
número de gerações desde a origem do cromossomo B), fatores de transmissão (relacionados
a diferenças entre populações na intensidade de acúmulo de cromossomos B) e fatores
aleatórios (i.e. a ação da deriva genética em populações de tamanho finito) - (CAMACHO et
al., 2000). Os quatro tipos de fatores provavelmente agem simultaneamente, tornando difícil
avaliar a importância relativa de qualquer um separadamente, mesmo sob intensa análise. O
número máximo de cromossomos B que uma espécie é capaz de tolerar, medido pelo número
máximo destes elementos encontrados em indivíduos adultos varia amplamente, apesar de
depender crucialmente das intensidades relativas dos fatores acima mencionados
(CAMACHO et al., 2000).
Foram encontradas plantas de milho com 34 cromossomos B (envolvendo um
aumento de 155% no conteúdo de DNA nuclear (JONES e REES, 1982), uma situação que é
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
34
provavelmente tolerada devido à sua domesticação. Em plantas selvagens, como Lolium
perene, não foram encontrados indivíduos com mais de três cromossomos B, embora em
Allium schoenoprasum tenham sido reportados até 20 cromossomos B (BOUGOURD et al.,
1995). No gafanhoto Eyprepocnemis plorans é rara a ocorrência de mais de três cromossomos
B em populações naturais, porém indivíduos da espécie de sapo endêmica da Nova Zelândia
Leiopelma hochstetteri pode ter até 15 cromossomos B mitoticamente estáveis (GREEN et al.,
1993).
Karavtseva e Roslik (2004), em uma ampla revisão a respeito de cromossomos B no
rato do mato coreano, Apodemus peninsulae, verificaram uma ampla variação na morfologia,
no número de cromossomos B e sua frequência relativa, em populações analisadas do sudeste
e extremo leste (incluindo pequenas ilhas no Oceano Pacífico) da Rússia, leste da Mongólia,
nordeste da China, nas Coréias do Norte e do Sul e na ilha de Hokkaido, no Japão.
Classificaram os cromossomos B encontrados em macrocromossomos B (os quais eram
variáveis em morfologia e tamanho); e microcromossomos B (cuja morfologia somente era
possível de ser visualizada nas metáfases de melhor qualidade, do contrário, sendo visíveis
somente como pequenas estruturas sem formato definido). A frequência dos cromossomos B
nestas populações de Apodemus peninsulae foram extremamente variáveis, sendo que o
número de cromossomos B encontrados teve uma amplitude de 0-24 cromossomos adicionais.
Nesse sentido, a variação do número de cromossomos B pode partir do princípio de:
1) frequência de formação de um B a partir de um A; 2) taxa de aumento do cromossomo B
devido à amplificação do DNA ou à ação de outros mecanismos associados a reorganizações
destes cromossomos B; 3) frequência de rearranjos de B levando a alteração de morfologia e
tamanho; 4) direção e intensidade da seleção natural de portadores de B e; 5) direcionamento
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
35
meiótico de cromossomos B (RUBTZOV, 2009). A ausência de indivíduos sem B na maioria
das populações analisadas e um grande número de cromossomos B em algumas delas sugere
tanto um direcionamento meiótico positivo de Bs ou uma seleção natural positiva a respeito
dos seus portadores (RUBTZOV, 2009).
Duas correntes têm postulado a respeito da presença e evolução de cromossomos B.
Ambas assumem a manutenção dos B em populações naturais como resultado do equilíbrio de
sua frequência, contudo devido a causas distintas. O modelo heterótico assume um papel
adaptativo para os cromossomos B, especialmente quando em menor número (WHITE, 1973).
Por outro lado, o modelo parasítico considera a manutenção dos cromossomos B como
resultado do balanço entre sua taxa de transmissão e seu efeito sobre a adaptação do
hospedeiro (ÖSTERGREN, 1945; NUR, 1966, 1977; JONES, 1985; SHAW e HEWITT,
1990, CAMACHO et al., 2000).
Cromossomos B ocorrem em diferentes táxons de peixes sul-americanos, devendo
sua origem ter ocorrido de modo independente na história evolutiva de peixes de famílias
diferentes. No entanto, para o gênero Astyanax algumas hipóteses buscam explicar a origem
comum dos cromossomos B em diferentes espécies, de modo que estudos de citogenética
molecular podem dar início ao entendimento da origem, manutenção e dispersão dos
cromossomos B em algumas espécies do gênero.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
36
2. Justificativas e Objetivos
A população de A. scabripinnis da região de Campos de Jordão, SP, Brasil, é
caracterizada por apresentar uma alta frequência intra e interindividual de um
macrocromossomo B totalmente heterocromático. As populações com maiores frequências
deste cromossomo são aquelas isoladas por quedas da água em altitudes geralmente acima de
1920 m em relação ao nível do mar (NÉO et al., 2000b). Estas populações endêmicas, apesar
de localizadas em ambiente aparentemente inóspito e não habitado por nenhuma outra espécie
de peixe, mostram uma biologia reprodutiva normal. Uma questão central, associada a estas
populações, refere-se a estratégia que deve ser utilizada para manter altos níveis de
variabilidade e escapar dos problemas endogâmicos. Vicari et al. (2010) obtiveram por
microdissecção cromossômica e localizaram in situ uma sonda do macrocromossomo B de A.
scabripinnis de Campos de Jordão, SP. Nesse estudo, verificaram que o cromossomo B é
altamente diferenciado em relação ao complemento A, mantendo identidade apenas com sítios
do DNA satélite As51. Desta forma, a caracterização molecular deste macrocromossomo B e
aprofundamentos em estudos meióticos poderiam dar início ao entendimento da origem,
manutenção e diversificação deste cromossomo no genoma de populações endêmicas da
espécie.
Objetivo geral:
1. Ampliar o conhecimento da composição, diversificação molecular e manutenção
do macrocromossomo B de A. scabripinnis da população de Campos de Jordão,
SP;
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
37
Objetivos específicos:
1. Mapear a sonda do macrocromossomo B em células mitóticas e meióticas de A.
scabripinnis, buscando entender a diferenciação e distribuição deste cromossomo
sobre o genoma e seu comportamento em células paquitênicas;
2. Prospectar DNAs repetitivos que possam ser resolutivos para o entendimento da
diversificação genômica de Astyanax;
3. Localizar in situ sondas de DNAs repetitivos (As51, C
o
t-1 DNA, rDNA 18S e 5S)
visando esclarecer a composição do cromossomo B e inferir sobre sua diferenciação
em relação ao complemento A.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
38
3. Material e Métodos
3.1 Material biológico e local de coleta
Foram estudadas citogeneticamente espécimes de Astyanax scabripinnis do córrego
da Fazenda Lavrinha, bacia do Rio Paraíba do Sul, no município de Campos de Jordão, SP, em
populações isoladas em cabeceiras de rios a altitudes de 1200 a 1920m (Figura 1). O material
cromossômico foi obtido via preparação de espécimes coletados na natureza com licença do
SISBIO MMA/IBAMA (Anexo II), ou a partir do banco de preparações cromossômicas do
Laboratório de Citogenética e Evolução da Universidade Estadual de Ponta Grossa. Os
procedimentos estão de acordo com o Comitê de Ética em Experimentação Animal da
Universidade Estadual de Ponta Grossa (Protocolo: 04741/08 – Anexo III).
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
39
.Figura 1. Mapa do Brasil, em destaque a região sul/sudeste mostrando as bacias hidrográficas
e o ponto de amostragem de Astyanax scabripinnis do presente estudo em Campos do Jordão,
SP.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
40
3.2 Metodologias
As preparações cromossômicas mitóticas foram obtidas pela técnica de “air-drying”,
conforme descrito por Bertollo et al. (1978) – (Anexo IV). Os cromossomos meióticos foram
obtidos pela técnica descrita por Kligerman e Bloom (1977), com algumas adaptações
(BERTOLLO et al., 1978) - (Anexo V). O bandamento C seguiu o procedimento descrito por
Sumner (1972) – (Anexo VI). Foi utilizada a hibridação in situ fluorescente (FISH) para
mapear as sequências do cromossomo B, do DNA satélite As51, dos rDNA 18S e 5S e da
sonda C
o
t total sobre os cromossomos de A. scabripinnis. As sondas foram obtidas e
gentilmente cedidas por: sonda cromossomo B (VICARI et al., 2010); sonda DNA satélite
As51 (MESTRINER et al., 2000); sonda rDNA 18S (HATANAKA e GALETTI Jr,
2004); sonda rDNA 5S (MARTINS E GALETTI Jr, 1999). Os procedimentos de marcação
das sondas foram realizados por reação de Nick Translation conforme as orientações dos
fabricantes (Anexo VII). Os cromossomos B, após submetidos ao bandamento C, foram
microdissectados por Vicari et al. (2010) (Anexo VIII). As reações de DOP-PCR para
amplificação da sonda cromossomo B seguiram os procedimentos descritos por Telenius et al.
(1992), com as adaptações para cromossomos submetidos ao bandamento C (VICARI et al.,
2010) – (Anexo IX). A obtenção do DNA repetitivo total baseado na cinética de reassociação
C
o
t-1 foi realizada de acordo com Zwick et al. (1997) e recentemente adaptado por Ferreira e
Martins (2007) para isolamento de DNAs repetitivos em peixes (Anexo X). O procedimento
geral da FISH baseou-se na técnica descrita por Pinkel et al. (1986) – (Anexo XI). Os
cromossomos foram organizados em ordem decrescente de tamanho e de acordo com a
morfologia (LEVAN et al., 1964), obedecendo à regra de razão de braços (Anexo XII).
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
41
4. Resultados
Os resultados estão organizados em um capítulo correspondente ao artigo científico:
Capítulo I
Localização de sondas cromossômica e repetitivas em Astyanax scabripinnis (Characidae,
Incertae sedis). Estudo da origem e diferenciação molecular do cromossomo B
Manuscrito em preparo a ser submetido ao periódico Micron.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
42
4.1 Localização de sondas cromossômica e repetitivas em Astyanax
scabripinnis (Characidae, Incertae sedis). Estudo da origem e diferenciação molecular do
cromossomo B
Resumo
Neste estudo foi realizada análise citogenética convencional e molecular em espécimes de
Astyanax scabripinnis provenientes do córrego das Pedras, Campos de Jordão-SP, Brasil. A
análise mitótica convencional mostrou um número diplóide de 50 cromossomos,
6m+22sm+10st+12a, além da ocorrência intra e interindividual de um macrocromossomo B. O
cromossomo B heterocromático tem tamanho e forma similar ao primeiro par metacêntrico,
maior par do complemento. Utilizando a técnica de dupla FISH (fluorescent in situ
hibridization) para a localização das sondas cromossomo B, DNA satélite As51, C
o
t–1 DNA e
rDNAs 18S e 5S foi possível inferir que o cromossomo B tem origem por formação de
isocromossomo a partir de um elemento semelhante ao par acrocêntrico 24. Na análise por
meiose convencional em espécimes portando cromossomo B, em metáfase espermatogonial,
foram observados três cromossomos metacêntricos grandes. No entanto, em paquíteno com 26
elementos cromossômicos, apenas um bivalente grande é visualizado, sugerindo o pareamento
braço a braço do cromossomo B. Ainda, é discutida a diversificação molecular do
cromossomo B em relação aos elementos do complemento A.
Palavras chave: Pintura cromossômica; DNA satélite As51; rDNA; diversificação cariotípica;
C
o
t–1 DNA.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
43
Introdução
Cromossomos supranumerários ou B, também denominados de acessórios ou extras,
são cromossomos adicionais, dispensáveis, e não homólogos aos do complemento padrão. Em
determinadas espécies podem ocorrer nas populações com frequências intra/interindividuais
variáveis. Algumas hipóteses buscam explicar sua origem, frequência e evolução, como
derivação de autossomos seguida de silenciamento de genes, heterocromatinização, acúmulo
de DNA repetitivo e transposons (CAMACHO et al., 2000). Além disso, eles podem ser
diferentes morfologicamente dos cromossomos A, apresentam um padrão de herança não
Mendeliano e podem apresentar mecanismos de acúmulo (BEUKEBOOM, 1994).
Duas teorias buscam explicar a manutenção dos cromossomos B em populações
naturais. A primeira aceita a hipótese do cromossomo B conferir alguma vantagem adaptativa
ao indivíduo portador, principalmente quando em menor número (WHITE, 1973). Na
segunda, se aceita que a manutenção dos cromossomos B é resultado de um acúmulo de
fatores, entre eles a geração de células germinativas com diferentes quantidades de Bs durante
a embriogênese e o amadurecimento preferencial de células com alta quantidade de Bs nas
linhagens de células germinativas (ÖSTERGREN, 1945; NUR, 1966; 1977; JONES, 1985;
PARDO et al., 1995; CAMACHO et al., 2000).
Pertencente a ordem Characiformes e listado entre os Incertae sedis na família
Characidae (LIMA et al., 2003), a espécie Astyanax scabripinnis apresenta cromossomos B
em algumas populações (VICENTE et al., 1996; NÉO et al., 2000 a; b). A forma e o número
destes cromossomos podem variar em diferentes populações de A. scabripinnis, no entanto, a
ocorrência de um macrocromossomo B, similar em tamanho ao primeiro par cromossômico é
a condição mais usual (NÉO et al., 2000a). Estudos meióticos mostraram que os cromossomos
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
44
B de A. scabripinnis têm comportamento não mendeliano e formam univalentes durante a
meiose, por meio de pareamento entre os braços cromossômicos (MESTRINER et al., 2000).
Elementos de DNA repetitivos já foram mapeados sobre o macrocromossomo B de A.
scabripinnis. Mestriner et al. (2000) identificaram um DNA satélite 59% rico em AT no
genoma desta espécie, com unidades monoméricas de 51 pb, denominado As51. Análises por
hibridação in situ fluorescente (FISH) mostraram que este DNA está localizado
principalmente nas heterocromatinas distais, em alguns sítios de regiões organizadoras de
nucléolo (RONs) e no cromossomo B da população analisada (MESTRINER et al., 2000).
Neste trabalho foi analisado o comportamento, a composição, além da diferenciação do
cromossomo B de A. scabripinnis em relação aos elementos do complemento A em células
mitóticas e meióticas, com base na utilização de sondas do cromossomo B total e sondas de
DNAs repetitivos.
Material e Métodos
Foram estudados citogeneticamente 10 exemplares de A. scabripinnis, (4 machos e 6
fêmeas) coletados no córrego da Fazenda Lavrinha, bacia do rio Paraíba do Sul, Campos do
Jordão (SP), Brasil. Foram analisadas pelo menos 30 metáfases por indivíduo. As populações
de A. scabripinnis foram capturadas em altitudes de 1200 a 1920 metros em relação ao nível
do mar.
As preparações cromossômicas mitóticas foram obtidas das células do rim anterior
usando o procedimento de air drying (BERTOLO et al., 1978). Por sua vez, os cromossomos
meióticos foram obtidos pela técnica descrita por Kligerman e Bloom (1977), com algumas
adaptações (BERTOLLO et al., 1978). As preparações cromossômicas foram submetidas à
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
45
coloração convencional por Giemsa e bandamento C (SUMNER, 1972) para a determinação
do número diplóide, fórmula cromossômica, distribuição da heterocromatina e presença de
cromossomos B. Os cromossomos foram organizados em metacêntricos (m), submetacêntricos
(sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a) dependendo da razão de braços (LEVAN et al.,
1964), e arranjados em decréscimo de tamanho nos respectivos cariótipos. Para a análise do
cromossomo B, sondas do próprio cromossomo B e de DNAs repetitivos foram utilizadas
sobre células meióticas e mitóticas desta espécie, conforme procedimentos a seguir.
Reação de DOP-PCR do cromossomo B de A. scabripinnis
A sonda cromossomo B de A. scabripinnis foi obtida utilizando-se um microscópio
invertido IX51 (Olympus) equipado com micromanipulador mecânico Transferman
(Eppendorf) em preparações mitóticas submetidas ao bandamento C (VICARI et al., 2010).
Os cromossomos B recuperados foram então transferidos para um microtubo e
utilizados na reação de “Degenerated Oligonucleotide Primer – Polymerase Chain Reaction”
(DOP-PCR). As reações de DOP-PCR seguiram o procedimento geral descrito por Telenius et
al. (1992), com algumas modificações (VICARI et al., 2010). Os produtos obtidos foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%, observando-se um arrasto de tamanho
esperado entre 100 – 400 pb.
Uma segunda reação de amplificação foi realizada utilizando 100 ng do primeiro
produto de PCR num volume final de 50 µl. A reação foi composta de tampão (200 mM Tris
pH 8.4, 500 mM KCl) 1x da Taq DNA polimerase (Invitrogen); 2 mM MgCl
2
; 400 µM de
dNTP, 2µM de primer DOP = 5’-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ e 2 U de Taq DNA
polimerase. As reações de polimerização foram realizadas em termociclador Biocycler
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
46
programado da seguinte maneira: 3 minutos a 94°C; 35 ciclos de 1 minuto e 30 segundos a
90°C, 1 minuto e 30 segundos a 52°C e 1 minuto e 30 segundos a 72°C, finalizando com um
ciclo de 5 minutos a 72°C.
Obtenção da sonda de DNA repetitivo total baseado na cinética de reassociação C
ot
–1
O DNA genômico total de um exemplar de A. scabripinnis sem cromossomo B foi
utilizado no procedimento C
o
t–1 DNA (ZWICK et al., 1997) adaptado para obtenção de
DNAs repetitivos em peixes (FERREIRA e MARTINS, 2007; VICARI et al., 2010). O DNA
genômico com concentração de 500 ng/µL em solução de NaCl 0,3 mol/L foi autoclavado
(121 °C, 1,034 x 10
5
Pa) por 5 minutos para obter fragmentos entre 100 e 2000 pb. Amostras
de 50 µL do DNA autoclavado foram então desnaturadas a 95 °C por 10 minutos, colocadas
em gelo por 10 segundos e, posteriormente, incubadas a 65 °C por 3 minutos para
reanelamento das fitas. A seguir, foram adicionados 1 U nuclease S1 (Promega), 1x tampão
[20mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25°C), 0.1mM ZnCl
2
, 50mM NaCl e 50% (v/v) glicerol] da
enzima para 1 µg DNA e deixados a 37 °C por 8 min. Por último, a fração repetitiva deste
DNA foi recuperada congelando-o imediatamente em nitrogênio líquido e realizando uma
extração via fenol-clorofórmio. Após precipitação o DNA repetitivo total foi ressuspendido
em 20 µL de H
2
O ultrapura para posterior realização da localização in situ.
Hibridação in situ fluorescente (FISH)
Essencialmente, foram utilizadas uma sonda cromossômica (sonda cromossomo B) e
quatro sondas de DNA repetitivos para mapeamento destas regiões sobre os cromossomos da
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
47
espécie A. scabripinnis (DNA satélite As51; sonda C
o
t-1 total; rDNA 18S e rDNA 5S). A
sonda cromossomo B foi marcada em reação de DOP-PCR utilizando o nucleotídeo
modificado biotina 14-dATP (Invitrogen). A reação da PCR consistiu de: tampão 1x da Taq
DNA polimerase (Invitrogen), 2 mM MgCl
2
, 400 µM dTTP, dGTP e dCTP, 200 µM de
dATTP, 200 µM de dATP 14- biotina, 2 µM DOP primer e 2 U de Taq DNA polimerase. As
sondas DNA satélite As51; C
o
t-1 total; rDNA 18S foram marcadas pela técnica de nick
translation, utilizando o composto digoxigenina 16 - dUTP (Dig Nick Mix - Roche), e a sonda
rDNA 5S foi marcada com biotina pela técnica de nick translation, utilizando o composto
biotina 16 - dUTP (Nick Translation Biotin - Roche). O procedimento geral da FISH sob alta
condição de estringência (2,5 ng/µL sonda, 50 % formamida, 2x SSC, 10 % sulfato dextrano)
seguiu o procedimento geral descrito por PINKEL et al. (1986). A detecção do sinal foi
realizada com os anticorpos Avidina FITC (Sigma) e anti digoxigenina rodamina (Roche). Os
cromossomos foram contracorados com DAPI (0,2 μg/mL) em meio de montagem
Vectashield (Vector), e analisados em microscópio de epifluorescência Olympus BX41
acoplado ao sistema de captura de Imagens DP 71 (Olympus).
Resultados
A análise citogenética dos exemplares de A. scabripinnis provenientes da população
de Campos de Jordão (SP) apresentou 2n=50 cromossomos para o complemento padrão e,
adicionalmente foi observada uma variação intra e interindividual de 0 - 1 macrocromossomo
B nos espécimes estudados (Figura 2). O macrocromossomo B tem tamanho e forma similar
ao primeiro par cromossômico. A fórmula cariotípica do complemento A é composta por
6m+22sm+10st+12a, sem a presença de cromossomos sexuais heteromórficos (Figura 2). A
análise do bandamento C evidenciou blocos heterocromáticos nas regiões terminais de
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
48
cromossomos subtelo/acrocêntricos, em regiões pericentroméricas da grande maioria dos
cromossomos, pequenas bandas intersticiais nos pares 1, 15, 20 e 24, bem como, o
cromossomo B totalmente heterocromático (Figura 2b).
O estudo de células mitóticas espermatogoniais em indivíduos sem a presença de
cromossomos B mostrou a ocorrência de 50 cromossomos, confirmando a fórmula cariotípica
obtida com células mitóticas (Figura 3a). O estudo da cronologia de células meióticas
possibilitou a separação e subdivisão de algumas fases da prófase I, utilizando como
parâmetro o emparelhamento dos cromossomos homólogos. A análise de células em zigóteno
inicial evidenciou que os bivalentes estão quase totalmente emparelhados (Figura 3b), em
paquíteno inicial os bivalentes estão totalmente emparelhados (Figura 3c), tornando-se mais
espessos, mais curtos e mais visíveis em paquíteno final (Figura 3d). Nas células diplotênicas
observa-se o início da repulsão dos homólogos, permanecendo próximos pelas regiões de
quiasmas, sendo possível observar a formação de 25 bivalentes e a ocorrência de 1 a 2
quiasmas por bivalente (Figura 3f). Nestas células não foi possível observar nenhum
cromossomo com comportamento diferenciado que representasse os cromossomos sexuais.
A análise das células com cromossomos B mostrou em metáfases espermatogoniais a
ocorrência de 51 cromossomos sendo o cromossomo B de tamanho similar ao par 1 com os
braços heteropicnóticos positivos (Figura 4a). Em células paquitênicas foram observados 25
bivalentes, sendo encontrado somente um bivalente grande, assim o cromossomo B
provavelmente apresenta-se como um univalente com emparelhamento braço a braço (Figura
4c).
A análise por dupla FISH com a sonda B e sonda As51 em metáfases de indivíduos
sem a presença de cromossomo B mostrou a sonda B em pequenos sítios pericentroméricos e
terminais de alguns pares cromossômicos (Figura 5b). Já o DNA satélite As51 foi localizado
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
49
em 14 sítios cromossômicos (Figura 5c). A sobreposição das imagens evidenciou que essas
sondas são co-localizadas em alguns sítios cromossômicos (par 20, entre outros) e, em cinco
cromossomos (par 24 mais 3 cromossomos) essas sondas estão presentes no mesmo
cromossomo, porém em sítios distintos (Figura 5d). A dupla FISH com essas mesmas sondas
(sonda B e As51) em metáfases com a presença do macrocromossomo B evidenciou este
cromossomo totalmente marcado com a sonda B, além dos pequenos sítios pericentroméricos
e terminais de alguns pares cromossômicos (Figura 6b). O DNA satélite As51 foi localizado
em grande parte do cromossomo B a exceção das regiões terminais e centromérica (Figura
6c). A sobreposição destas imagens evidencia além do cromossomo B, cinco cromossomos
com a presença da sonda B e As51 em sítios distintos (Figura 6d). Por sua vez, a dupla FISH
utilizando as sonda B e C
o
t–1 DNA proveniente de genomas sem o cromossomo B mostrou
que os DNAs repetitivos obtidos da sonda C
o
t–1 DNA foram localizados em regiões terminais
e pericentroméricas da maioria dos cromossomos e também no cromossomo B (Figura 7 b, c,
d).
A dupla FISH com a sonda B e sonda As51 em células paquitênicas mostrou que
estas sondas localizam sobre um cromossomo com a metade do tamanho do bivalente maior
(primeiro par metacêntrico), além de alguns sítios menores em outros bivalentes (Figura 8 a, b,
c, d). A hibridação da sonda C
o
t–1 DNA sobre célula paquitênica sem cromossomo B
evidenciou sítios em regiões terminais e centromérica da grande maioria dos bivalentes
(Figura 8 e, f).
A localização in situ com as sondas ribossômicas não mostrou sinais positivos sobre
o cromossomo B (Figura 9). Foram observados sítios de rDNA 18S em regiões terminais de
cinco cromossomos (Figura 9 b) e seis sítios intersticiais de rDNA 5S (Figura 6 c) sempre em
cromossomos independentes (Figura 9 d).
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
50
Discussão
O complexo de espécies A. scabripinnis tem variação do número diplóide de 46 a 50
cromossomos (MOREIRA-FILHO e BERTOLLO, 1991). Vicari et al. (2008a) em uma análise
citogenética comparativa inferem que o caracter 2n= 50 cromossomos é plesiomórfico no
complexo Astyanax scabripinnis e rearranjos do tipo translocação Robertsoniana originariam
populações de menor número diplóide.
A localização da heterocromatina constitutiva evidenciou bandas pericentroméricas
em todos os cromossomos, alguns pequenos blocos terminais, um bloco C positivo no braço
curto do cromossomo 10, o qual é caracterizado por apresentar rDNA 18S e DNA satélite
As51 interspaçado, assim como um bloco na região terminal do braço longo do par
acrocêntrico 20 de composição As51, como também visualizado por Mestriner et al. (2000). A
banda heterocromática em região intersticial do par acrocêntrico 24 observada por Vicente et
al. (1996), no presente estudo, apresentou composição As51 e situação polimórfica entre os
homólogos. Além dos seis sítios As51 já descritos, oito sítios As51 pequenos foram
observados em regiões terminais dos cromossomos. Ainda, o bandamento C mostrou o
cromossomo B totalmente heterocromático e, em sua maior parte, de composição As51, a
exceção das regiões terminais e centromérica. Estudos anteriores evidenciaram que este
cromossomo B apresentava blocos de heterocromatina apenas em regiões intersticiais de
ambos braços cromossômicos (VICENTE et al., 1996; MESTRINER et al., 2000). Nesse
sentido, é possível hipotetizar que este macrocromossomo B vem, ao longo dos anos, sofrendo
um processo de heterocromatinização, como proposto para a teoria da diversificação do
cromossomo B (JONES e REES, 1982; CAMACHO et al., 2000).
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
51
A análise convencional em células meióticas com 2n=50 cromossomos mostrou um
comportamento normal, emparelhamento total em 25 bivalentes no paquíteno, repulsão e
formação de um a dois quiasmas por bivalente em diplóteno. Por sua vez, em metáfases
espermatogoniais que apresentaram 51 cromossomos, foi observado que o macrocromossomo
B é heteropicnótico positivo e de tamanho similar ao maior bivalente (primeiro par
metacêntrico). No entanto, apenas um bivalente grande correspondente ao primeiro par foi
observado em células com 26 elementos em paquíteno. Dessa forma, o macrocromossomo B
realiza emparelhamento braço a braço em paquíteno, permanecendo nesta fase com metade do
tamanho do maior bivalente e, de acordo com a teoria de origem do B de A. scabripinnis por
mecanismos de formação de isocromossomo (MESTRINER et al., 2000; NÉO et al., 2000a).
A origem dos cromossomos supranumerários, na maioria das vezes, é desconhecida e
controversa. Grande parcela dos autores aceita a hipótese que estes segmentos cromossômicos
surgem a partir de elementos do complemento A (CAMACHO e CABRERO, 1987;
PALOMEQUE et al., 1993; JESUS et al., 2003; ARTONI et al., 2006b). Outras teorias
buscam explicar à origem do cromossomo B como não derivada dos elementos do
complemento A (ZIEGLER et al., 2003). A origem heteróloga do cromossomo B foi utilizada
para explicar a origem do cromossomo B gigante do peixe Alburnus alburnus, o qual
apresenta o cromossomo B composto de DNA repetitivo disperso do tipo retrotransposon, o
qual não está presente nos cromossomos A da espécie (ZIEGLER et al., 2003).
Algumas hipóteses buscam explicar a origem do macrocromossomo B de A.
scabripinnis. Baseados no tamanho e morfologia do cromossomo B (SALVADOR e
MOREIRA-FILHO, 1992) propuseram que sua origem foi a partir da não disjunção do
primeiro par metacêntrico. Atualmente, a teoria amplamente aceita relata que o cromossomo B
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
52
de A. scabripinnis foi originado a partir da formação de isocromossomo em um elemento do
par acrocêntrico 24 (MESTRINER et al., 2000; NÉO et al., 2000a; MOREIRA-FILHO et al.,
2004). Esta hipótese está baseada na presença de uma banda heterocromática intersticial no
braço longo deste par, a qual, posterior a formação de isocromossomo, daria origem aos sítios
As51 intersticiais e em distâncias simétricas em relação ao centrômero em ambos os braços do
cromossomo B (MESTRINER et al., 2000).
No presente estudo, a localização da sonda cromossomo B, obtida por microdissecção
posterior ao bandamento C (VICARI et al., 2010) mostrou a composição altamente repetitiva
do cromossomo B, o qual mantém identidade com pequenas regiões centroméricas ou
terminais do complemento A. A dupla FISH sonda B e satélite As51 evidenciou que o
cromossomo B tem enormes sítios As51, a exceção das regiões terminais e centromérica. Esta
dupla FISH evidenciou a correspondência sonda B e As51 na região terminal do par
acrocêntrico 20, entre outros sítios menores. No entanto, em cinco cromossomos foi possível
observar que a sonda B e As51 são localizadas no mesmo cromossomo, porém em sítios
distintos. Um destes cromossomos foi o acrocêntrico 24, o qual apresenta As51 em região
intersticial do braço longo e sonda cromossomo B em região pericentromérica. Ainda, a
obtenção da sonda C
o
t–1 do DNA genômico de espécime sem cromossomo B e, posterior
localização in situ desta sonda sobre os cromossomos de A. scabripinnis evidenciou sinais
pericentroméricos e terminais em vários cromossomos, entre eles o acrocêntrico 24 e o
cromossomo B. A localização destas sondas repetitivas corrobora a hipótese da origem do
cromossomo B a partir do elemento do complemento A 24 a partir da formação de
isocromossomos (MESTRINER et al., 2000; NÉO et al., 2000a). Ainda, demonstram que o
macrocromossomo B de A. scabripinnis tem sequências compartilhadas do satélite As51 e de
DNAs repetitivos centromérico e terminais em relação ao complemento A. No entanto,
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
53
devido a baixa identidade da sonda B com o complemento padrão demonstram que este
cromossomo B vem sofrendo mecanismos de diferenciação molecular.
Além da origem, a localização destas sondas cromossômica e repetitivas sobre células
meióticas paquitênicas permite elaborar inferências sobre a diversificação molecular do
cromossomo B. A localização das sondas cromossomo B e As51 em paquíteno mostraram o
cromossomo B pareado braço a braço em uma estrutura semelhante a um bivalente.
Entretanto, ao contrário do relatado por Mestriner et al. (2000), no presente estudo não foram
encontradas evidências de ocorrências de quiasmas no cromossomo B autopareado. Gray
(2000) descreveu um mecanismo de recombinação ectópica entre cópias de elementos
repetitivos dispersos em cromossomos não homólogos, dessa forma, não dependentes de
crossing-over. Esse mesmo mecanismo foi utilizado por Vicari et al. (2008b) para explicar a
co-localização dos DNAs repetitivos As51 e do rDNA 18S em 14 grandes domínios
heterocromáticos da espécie Astyanax janeiroensis. Dessa forma, esse mesmo mecanismo
pode ser utilizado para explicar a heterocromatinização por dispersão de sequências de DNAs
repetitivos, principalmente o As51, entre os braços autopareados do cromossomo B, sem a
necessidade de crossing-over. O autopareamento dos braços destes cromossomos facilitaria
trocas ectópicas de sequências. Assim, mutações ao acaso em sequências do cromossomo B
poderiam ser espalhadas entre os braços, dessa forma, atuando na heterocromatinização do
cromossomo B e na sua diversificação molecular em relação ao complemento A. Ainda, é
possível inferir que o cromossomo B de A. scabripinnis se mantém em populações
endogâmicas incorporando as taxas mutacionais e consequente divergência molecular em
relação aos cromossomos do complemento A, com os quais realiza pouca ou nenhuma troca.
Contudo, análises mais aprofundadas ainda são necessárias para esclarecer definitivamente o
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
54
comportamento do cromossomo B na meiose. Do mesmo modo, análise da divergência
molecular das sequências do cromossomo B e do complemento A poderia auxiliar no
entendimento da diferenciação deste cromossomo.
Em peixes são raras as descrições da presença de sítios de rDNA nos cromossomos B.
A presença do rDNA 18S já foi descrito sobre o microcromossomo B de Moenkhausia
sanctaefilomenae (DANTAS et al., 2007) e no cromossomo B do ciclídeo africano
Haplochromis obliquidens (POLETTO et al., 2010). Por sua vez, a co-localização dos sítios
rDNA 18S e satélite As51 é um fato bem documentado no gênero Astyanax. Mestriner et al.
(2000) constataram que o sítio de RON do braço curto do cromossomo submetacêntrico 10 é
co-localizado ao DNA satélite As51 em A. scabripinnis da população de Campos de Jordão.
Na espécie A. janeiroensis foram observados 22 sítios de rDNA 18S, onde 14 destes eram
inativos e co-localizados ao DNA satélite As51 (VICARI et al., 2008b). Nesse mesmo estudo,
os autores verificaram a organização em duas classes de heterocromatina diferentes, onde os
oito sítios de apenas rDNA 18S eram organizados em uma heterocromatina GC rica, enquanto
os 14 sítios co-localizados rDNA 18S e satélite As51 não mostraram sinais brilhantes a
fluorocromos GC ou AT preferenciais. No presente estudo, apesar da enorme quantidade do
satélite As51, nenhum sítio de rDNA foi localizado sobre o cromossomo B. Ainda, a co-
localização dos sítios rDNA 18S e satélite As51 é restrita a região do braço curto do
cromossomo 10. Com estes resultados, é possível inferir que esta região do cromossomo 10
em A. scabripinnis não realiza trocas de sequências com outros domínios cromossômicos As51
de cromossomos não homólogos e com o cromossomo B.
A localização e número de sítios de rDNAs também são marcadores citogenéticos
úteis em inferências evolutivas e citotaxonômicas. No presente estudo, foram localizados in
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
55
situ cinco sítios de rDNA 18S, no braço curto do par submetacêntrico 10, na região terminal
do par submetacêntrico 4, além de um sítio adicional em um cromossomo subtelocêntrico. O
número de sítios e a localização do rDNA 18S costuma ser múltiplo e variável em Astyanax
(NÉO et al., 2000a; FERRO et al., 2001; MANTOVANI et al., 2005; VICARI et al., 2008a; b)
e algumas vezes co-localizados ao satélite As51 (MESTRINER et al., 2000; VICARI et al.,
2008b). Estudos de Mizoguchi e Martins-Santos (1998b) revelam uma variação intra e
interindividual no número de RONs e ainda, nas populações analisadas, havia um cromossomo
principal ativo na maioria das células, bem como apresentaram padrões específicos de
ativação. A ativação de sítios de RONs parece envolver um mecanismo de regulação gênica
que permite a expressão preferencial de genes de um dado cromossomo nucleolar principal no
sistema de RONs múltiplas. Souza et al. (2007) observaram uma variação nos blocos
heterocromáticos, principalmente de cromossomos acrocêntricos, em duas populações isoladas
por uma queda d´água de 100 metros de altitude, sendo que o fluxo gênico é unidirecional
(downstream). A transposição de sequências teloméricas seria facilitada por recombinações
entre DNAs repetitivos pré-existentes na heterocromatina e/ou clusters de rDNA nucleolar. O
desenvolvimento destes padrões genéticos ao longo de gradientes ecológicos seria facilitado
pelo isolamento parcial destas populações, resultando no surgimento de novos citótipos a
serem selecionados. Dessa forma, mecanismos do tipo transposição de sequências estão
amplamente associados à alta diversidade de número e localização do rDNA maior em
Astyanax. O rDNA 18S por apresentar características saltatórias e mecanismos de transposição
de sequências não tem sido considerado um bom marcador evolutivo.
Ao contrário do rDNA maior, a localização in situ dos sítios de rDNA 5S tende a ser
conservada nos cromossomos de Astyanax (MARTINS e GALETTI JR, 2000; MANTOVANI
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
56
et al., 2005; VICARI et al., 2008a). Neste gênero, geralmente o rDNA 5S está localizado nas
regiões proximais do braço longo de um par acrocêntrico e outro metacêntrico (ALMEIDA-
TOLEDO et al., 2002; MANTOVANI et al., 2005; VICARI et al., 2008a), por vezes apenas
no par acrocêntrico (VICARI et al., 2008b). No entanto, em algumas populações de A.
scabripinnis têm sido descrita a ocorrência de mais dois pares (FERRO et al., 2001). O
presente estudo mostrou a ocorrência de três pares com marcações de rDNA 5S. Os pares com
marcações proximais acrocêntrico e metacêntrico são homeólogos àqueles já descritos
(ALMEIDA-TOLEDO et al., 2002; MANTOVANI et al., 2005; VICARI et al., 2008a) e o par
acrocêntrico com marcação terminal ao braço longo pode ser considerado uma sinapomorfia
para este caracter.
Assim, este estudo demonstra por meio de análises mitóticas e meióticas
convencionais e moleculares que o macromossomo B de A. scabripinnis tem origem por
formação de isocromossomo a partir de um elemento do par acrocêntrico 24. A localização da
sonda cromossômica B e dos DNAs repetitivos mostraram que este cromossomo mantém
pequenos sítios de identidade com o complemento A, demonstrando a alta diversificação
molecular deste cromossomo. Ainda, é possível inferir que este cromossomo B tem se
heterocromatinizado ao longo do tempo por mecanismos de trocas ectópicas de sequências
entre seus braços autopareados.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
57
Agradecimentos
Os autores são gratos ao IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos
Naturais Renováveis) pela autorização de captura de espécimes na natureza
(IBAMA/MMA/SISBIO licença número: 15117). Este trabalho foi realizado com
financiamento dos órgãos de fomento a pesquisa CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Processo: 473448/2007-6), CAPES (Coordenação
de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, Processo: 087/2007), FAPESP (Fundação
de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) e Fundação Araucária (Fundação Araucária de
Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Estado do Paraná, Processo:
17217/2009). Nós também somos gratos ao Sr. Miguel Airton Carvalho pela colaboração nas
atividades de campo e laboratório.
Referências Bibliográficas
As referências citadas neste capítulo estão listadas ao final da dissertação em um único tópico
com todas as demais referências.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
58
Figura 2: Cariótipo de A. scabripinnis de Campos do Jordão (SP), Brasil. Em (a), coloração
convencional (Giemsa). Em (b), os mesmos cromossomos, submetidos ao
bandamento C sequencial, destacando as regiões heterocromáticas. Barra = 10µm.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
59
Figura 3. Células meióticas de espécimes de A. scabripinnis sem a presença de cromossomo
B em coloração convencional (Giemsa). Em (a) metáfase espermatogonial com
2n=50 cromossomos; (b) zigóteno inicial; (c) paquíteno inicial; (d) paquíteno final
evidenciando 25 bivalentes completamente emparelhados; (e) desenho
esquemático representativo dos 25 bivalentes em paquíteno final observado em
(d); (f) diplóteno evidenciando 1 a 2 quiasmas por bivalente e; (g) metáfase II com
número incompleto de cromossomos. Barras = 10µm.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
60
Figura 4. Células meióticas de espécimes de A. scabripinnis com a presença de cromossomo
B em coloração convencional (Giemsa). Em (a) metáfase espermatogonial com
2n=51 cromossomos, as setas indicam o primeiro par metacêntrico, a cabeça de
seta mostra o cromossomo B heteropicnótico positivo; (b) metáfase II com 26
cromossomos; (c) paquíteno final mostrando 25 bivalentes e mais o provável
cromossomo B autopareado, a seta indica o bivalente do maior par metacêntrico e;
(d) desenho esquemático do paquíteno descrito em (c). Barras = 10 µm.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
61
Figura 5: Metáfase mitótica de A. scabripinnis submetida a dupla FISH com sondas
cromossômica e de DNAs repetitivos:localização da sonda cromossomo B. Em (a-
d), metáfase sem cromossomo B. Em (a), contra-coloração DAPI. Em (b),
localização da sonda do cromossomo B; em (c), localização do DNA repetitivo
As51 e, em (d), sobreposição das imagens (as cabeças de seta indicam outros sítios
As51 além dos já indicados com o número correspondente ao par cromossômico).
Barra = 10µm.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
62
Figura 6: Metáfase mitótica de A. scabripinnis submetida a dupla FISH com sondas
cromossômica e de DNAs repetitivos: localização da sonda cromossomo B. Em (a-
d), metáfases com cromossomo B. Em (a), contra-coloração DAPI. Em (b-d), é
possível observar o cromossomo B totalmente hibridizado com a sonda
cromossomo B e quase totalmente hibridizado com a sonda As51, a exceção das
regiões terminais e centromérica. Barra = 10µm.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
63
Figura 7: Metáfase de A. scabripinnis submetida a dupla FISH com sonda cromossômica
(cromossomo B) e de DNA repetitivo C
o
t–1. Em (a-d) metáfase apresentando
cromossomo B submetida a dupla FISH para a localização das sondas cromossomo
B (b) e do DNA repetitivo C
o
t–1 obtido de espécimes sem cromossomo B (c). Em
(a), contra-colocração DAPI. Em (b) é possível observar o cromossomo B
totalmente localizado e destaque para o par a 24 portando sonda B em região
pericentromérica; (c) cromossomo B portando sonda C
o
t–1 em região
pericentromérica e terminais, além do destaque para o par a 24 portando este DNA
repetitivo em região pericentromérica; (d) sobreposição das imagens sonda
cromossomo B e C
o
t–1 DNA. Barra = 10µm.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
64
Figura 8: Células paquitênicas de A. scabripinnis submetidas a localização in situ de sondas
cromossômica e de DNAs repetitivos. Em (a-d) paquíteno submetido a localização
da sonda cromossomo B (b); localização da sonda As51 (c) e; sobreposição das
imagens (d). A seta destaca o cromossomo B com cerca da metade do tamanho do
maior bivalente. Em (e-f) paquíteno incompleto com a localização da sonda DNA
repetitivo C
o
t–1 obtido de espécimes sem cromossomo B. Em (e) contra-coloração
DAPI e; (f) sítios DNA repetitivo C
o
t–1 localizados em regiões terminais e
centroméricas da maioria dos bivalentes. Barras = 10µm.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
65
Figura 9: Metáfases mitóticas de A. scabripinnis submetidas a dupla FISH com sondas de
rDNA 18S e 5S. Em (a) contra-coloração DAPI; (b) localização in situ do rDNA
18S, com destaque para os pares m 4 e 10, além de uma marcação adicional (seta);
(c) localização dos sítios rDNA 5S (cabeça de seta) e; (d) sobreposição das
imagens (as setas indicam os sítios rDNA 18S e as cabeças de seta indicam os
sítios rDNA 5S). Barras = 10µm.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
66
5. Conclusões
1) A população de Astyanax scabripinnis de Campos do Jordão (SP) apresentou
número diplóde constante (2n=50), e esta condição é a mais presente neste complexo de
espécies, e possivelmente a mais ancestral. O padrão de bandamento C diferiu pouco em
relação a populações estudadas na mesma região. Estas pequenas diferenças devem-se ao
isolamento geográfico entre as populações e conseqüente ausência de fluxo gênico.
2) O cromossomo B mostrou-se como um metacêntrico grande e totalmente
heterocromático, sendo composto em sua grande maioria pelo DNA satélite As51, a exceção
da região centromérica e regiões terminais. Não foi observada a localização de nenhum sítio
de DNA ribossomal no cromossomo B, descartando a origem a partir do cromossomo 10.
3) A hibridação in situ com a sonda cromossomo B em metáfases mitóticas com e
sem este elemento acessório puderam detectar que o cromossomo B ainda mantém alguma
identidade com algumas poucas regiões do complemento A, entre elas as regiões do DNA
satélite As51 e, regiões centroméricas e terminais de alguns cromossomos, o que remete à
origem intraespecífica do macrocromossomo B.
4) Sinais positivos da sonda B e sonda C
o
t-1 DNA em região pericentromérica do
cromossomo acrocêntrico 24, além do sítio As51 intersticial neste par corroboram a origem
por formação de isocromossomo a partir do par 24. Entretanto, a sonda B hibridou totalmente
no cromossomo supranumerário e apresentou poucos e fracos sinais no complemento padrão,
indicando uma grande diferenciação do cromossomo B em relação ao complemento A.
5) A sonda C
o
t-1 evidenciou principalmente marcações na região centromérica de
quase todos os cromossomos, além de marcações teloméricas e pequenas marcações
intersticiais em alguns cromossomos. No cromossomo B, houve uma grande distribuição
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
67
destas sequências de DNA repetitivo, demonstrando que há outros tipos de DNA envolvidos
na composição do cromossomo B.
6) As análises em meiose convencional mostraram um comportamento regular para os
25 pares cromossômicos. A hibridação da sonda B e do DNA As51 na meiose mostraram o
cromossomo B com pareamento braço a braço, apresentando metade do tamanho do maior
bivalente, mais uma vez corroborando a origem isocromossômica, indicando o
autopareamento deste cromossomo. Não foi confirmada a formação de quiasmas no
cromossomo B, sugerindo desta forma, que o macrocrossomo B não deve realizar crossing-
over.
7) Com relação ao rDNA 18S, foram observadas duas marcações em regiões
terminais do par de cromossomos submetacêntricos quatro, duas marcações nos braços curtos
do par submetacêntrico dez, além de um sítio adicional em um cromossomo subtelocêntrico. A
localização terminal dos sítios de rDNA 18S é a mais encontrada na literatura, bem como a
condição de múltiplos sítios é a mais frequentemente observada em Astyanax. Mecanismos de
transposição de seqüências estão relacionados a esta diversidade de número e localização do
rDNA maior entre diferentes populações de Astyanax scabripjnnis.
8) A localização in situ do rDNA 5S evidenciou duas marcações na região
pericentromérica de um par metacêntrico pequeno, duas na região subterminal proximal de um
par acrocêntrico grande, e dois sítios em região pericentromérica de um par cromossômico
subtelo/acrocêntrico pequeno. Em geral, observa-se até 4 marcações de rDNA 5S dentro deste
complexo de espécies, embora já tenha sido relatada a existência de oito sítios de rDNA 5S. A
presença de um sítio pericentromérico em um par metacêntrico médio é coincidente com
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
68
outras espécies do gênero Astyanax, reforçando a conservação deste caracter, porém os sítios
adicionais podem ser considerados caracteres apomórficos nesta população.
Assim, este trabalho contribui para o melhor entendimento da origem e diversificação
do cromossomo B, por meio de análises citogenéticas e evolutivas. Os próximos passos seriam
uma melhor investigação deste cromossomo na meiose, bem como testar marcadores de DNA
repetitivo em mais populações, especialmente nas portadoras de cromossomo B, a fim de
testar a hipótese de que há uma origem comum para estes cromossomos dentro do gênero
Astyanax.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
69
6. Referências Bibliográficas
ABEL, L. D. S.; MANTOVANI, M.; MOREIRA-FILHO, O. Chromosomal distribution of the
As51 satellite DNA in two species complexes of the genus Astyanax (Pisces, Characidae).
Genetics and Molecular Biology, v. 29, n. 3, p. 448-452, 2006.
ALMEIDA-TOLEDO, L. F.; OZOUF-COSTAZ, C.; FORESTI, F.; BONILLO, C.; PORTO-
FORESTI, F.; DANIEL-SILVA, M. F. Z. Conservation of the 5S-bearing chromosome pair
and co-localization with major rDNA clusters in five species of Astyanax (Pisces, Characidae).
Cytogenetic and Genome Research, v. 97, p. 229-233, 2002.
ALVES, A.L.; MARTINS-SANTOS, I.C. Cytogenetics studies in two populations of Astyanax
scabripinnis with 2n=48 chromosomes (Teleostei, Characidae). Cytologia, v. 67, p. 117-122,
2002.
AMEMIYA, C.T. AND GOLD, J.R. Chromomycin A stains nucleolus organizer regions of
fish chromosomes. Copeia, p. 226-231, 1986.
ARTONI, R. F.; SHIBATTA, O. A.; GROSS, M. C.; SCHNEIDER, C. H.; ALMEIDA, M. C.;
VICARI, M. C.; BERTOLLO, L. A. C. Astyanax aff. fasciatus Cuvier, 1819 (Teleostei;
Characidae): evidences of a species complex in the upper rio Tibagi basin (Paraná, Brazil).
Neotropical Ichthyology, v. 4, n. 2, 2006a.
ARTONI, R. F.; VICARI, M. R.; ENDLER, A. L.; CAVALLARO, Z. I.; JESUS, C. M.;
ALMEIDA M. C.; MOREIRA-FILHO, O.; BERTOLLO, L. A. C. Banding pattern of A and B
chromosomes of Prochilodus lineatus (Characiformes, Prochilodontidae), with comments on
B chromosomes evolution. Genetica, v. 127, p. 277-284, 2006b.
BERTACO, V. A.; LUCENA, C. A. S. Two new species of Astyanax (Ostariophysi:
Characiformes: Characidae) from eastern Brazil, with a synopsis of the Astyanax scabripinnis
species complex. Neotropical Ichthyology, v. 4, p. 53–60, 2006.
BERTOLLO, L. A. C., TAKAHASHI, C. S. E MOREIRA-FILHO, O. Cytotaxonomic
considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Brazilian Journal of Genetics, v.
1, p. 103–120, 1978.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
70
BEUKEBOOM, L. W. Bewildering Bs: An Impression of the 1st B-Chromosome Conference.
Heredity, v. 73, p. 328-336, 1994.
BOUGOURD, S. M.; PLOWMAN, A. B.; PONSFORD, N. R.; ELIAS,M. L.; HOLMES; D.
S.; TAYLOR, S. The case for unselfish B-chromosomes: evidence from Allium
schoenoprasum. In Kew Chromosome Conference IV (ed. P. E. Brandham e M. D. Bennet),
Kew, UK: Royal Botanic Gardens, p. 21-34, 1995.
BRITSKI, H. A. Peixes de água doce do estado de São Paulo: sistemática, p. 79-108. In:
Comissão Inter Estadual da Bacia Paraná-Uruguai. Poluição e piscicultura. São Paulo,
Faculdade de Saúde Pública da USP, Instituto de Pesca, 1972, 108p.
BRITSKI, H. A.; SATO, Y.; ROSA, A. B. S. Manual de identificação de peixes da Região
de Três Marias. Brasília: CODEVASF, 1984, 116p.
BRITSKI, H. A.; SATO, Y.; ROSA, A. B. S. Manual de identificação de peixes da região
de Três Marias: com chave de identificação para os peixes da bacia do rio São Francisco.
Brasília: CODEVASF, 1988. 115p.
CAMACHO, J. P. M.; CABRERO, J. New hypotheses about the origin of supernumerary
chromosome segments in grasshoppers. Heredity, v. 58, p. 341–343, 1987.
CAMACHO, J. P. M, SHARBEL, T. F., BEUKEBOOM, L. W. B-chromosome evolution.
The Royal Society. n. 355, p. 163-178. 2000.
CARAMASCHI, E. P. Estudos da ictiofauna de riachos das bacias do Tietê e do
Paranapanema, junto ao divisor de águas. Tese de Doutorado. Universidade Federal de São
Carlos, Botucatu, SP. 1986.
CEIVAP. Disponível em http://www.ceivap.org.br. Acesso em: 02 ago 2008.
DANTAS, E. S. O.; VICARI, M. R.; SOUZA, I. L.; MOREIRA-FILHO, O.; BERTOLLO, L.
A. C.; ARTONI, R. F. Cytotaxonomy and Karyotype Evolution in Moenkhausia Eigenmann,
1903 (Teleostei, Characidae). Nucleus, v. 50, n. 3, p. 509-522, 2007.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
71
DOMINGUES, M. S.; VICARI, M.R.; ABILHOA, V.; WAMSER, J. P.; CESTARI, M. M.;
BERTOLLO, L. A. C.; ALMEIDA, M. C.; ARTONI, R. F. Cytogenetic and comparative
morphology of two allopatric populations of Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000
(Teleostei, Characidae) from upper rio Paraná basin. Neotropical Ichthyology, v. 5, p. 37-44.
2007.
DORER, D. R.; HENIKOFF, S. Transgene Repeat Arrays Interact With Distant
Heterochromatin and Cause Silencing in cis and trans. Genetics, v. 147, p. 1181-1890, 1997.
FAUAZ, G.; VICENTE, V. E.; MOREIRA-FILHO, O. Natural triploidy and B chromosomes
in the neotropical fish genus Astyanax (Characidae). Brazilian Journal of Genetics, v. 17, p.
157-163, 1994.
FERREIRA, I.; MARTINS, C. Physical chromosome mapping of repetitive DNA sequences
in Nile tilapia Oreochromis niloticus: Evidences for a differential distribution of repetitive
elements in the sex chromosomes, Micron, v. 39, p. 411-418, 2007.
FERREIRA NETO, M.; VICARI, M. R.; CAMARGO, E. F.; ARTONI, R. F.; MOREIRA-
FILHO, O. Comparative cytogenetics among populations of Astyanax altiparanae
(Characiformes, Characidae, Incertae sedis). Genetics and Molcular Biology, v. 32, n. 4, p.
792-796, 2009.
FERRO, D. A. M.; NÉO, D. M.; MOREIRA-FILHO, O.; BERTOLLO, L. A. C. Nucleolar
organizing regions, 18S and 5S in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): population
distribution and functional diversity. Genetica, v. 110, p. 55–62, 2001.
FRAGOSO, E. N.; FENERICH-VERANI, N.; VERANI, J R. ESTRUTURA DA
POPULAÇÃO DE Astyanax scabripinnis (JENYNS, 1842) (CHARACIFORMES,
CHARACIDAE) DO CÓRREGO DA LAGOA, SÃO CARLOS/SP. I Congresso de Pós
Graduação da UFScar; São Carlos, PPGERN/UFSCar, v.1, n.1, p. 135-138, 2001. Disponível
em: http://www.propg.ufscar.br . Acesso em: 20 mai 2008.
FROESE, R.; PAULY, D. (Eds). FishBase. Disponível em: http://www.fishbase.org . acesso
em: 9 jan. 2010.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
72
FUTUYMA, D. Biologia Evolutiva. 2a. ed. Funpec, 2002, 631p.
GALETTI JR., P. M. Chromosome diversity in Neotropical fishes: NOR studies. Italian
Journal of Zoology v. 65 (suppl), p. 53-56, 1998.
GERY, J. Characoids of the World. New Jersey, T. F. H. Publications, 1977, 672 p.
GRAY, Y. H. It takes two transposons to tango: transposable element-mediated chromosomal
rearrangements. Trends in Genetics, v. 16, p. 461–468, 2000.
GREEN, D. M.; ZEYL, C. W.; SHARBEL, T. F. The evolution of hypervariable sex and
supernumerary (B) chromosomes in the relict New Zealand frog, Leiopelma hochstetteri
Journal of Evolutionary Biology, v. 6, n. 3, p. 417-441, 1993.
HATANAKA, T.; GALETTI Jr,. P. M. Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes in
the fish Prochilodus argenteus Agassiz, 1829 (Characiformes, Prochilodontidae). Genetica, v.
122, p. 239-244, 2004.
JONES, R. N.; REES, H. B chromosomes. London, Academic Press, v. 8, 1982, 266p.
JONES, R. N. Are B chromosomes selfish? In: Cavalier-Smith, T. (ed.). The Evolution of
Genome Size, Wiley, London, p. 397–425, 1985.
JESUS, C. M.; GALETTI, Jr. P. M.; VALENTINI, S. R.; MOREIRA-FILHO, O. Molecular
characterization and chromosomal location of two families of satellite DNA in Prochilodus
lineatus (Pisces, Prochilodontidae), a species with B chromosomes. Genetica, v. 118, p. 25-
32, 2003.
JUSTI, A. J. Caracterização cariotípica de populações de Astyanax fasciatus (Cuvier,
1819) Pisces, Characidae, em três bacias hidrográficas. Dissertação de Mestrado.
Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 1993.
KANTEK, D. L. Z.; NOLETO, R. B.; FENOCCHIO, A. S.; CESTARI, M. M. Cytotaxonomy,
heterochromatic polymorphism and natural triploidy of a species of Astyanax (Pisces,
Characidae) endemic to the Iguaçu River Basin (Paraná, Brasil). Brazilian Archives of
Biology and Technology, v. 50, p. 67–74, 2007.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
73
KANTEK, D. L. Z., VICARI, M. R., PERES, W. A. M., CESTARI, M. M., ARTONI, R. F.,
BERTOLLO, L. A. C. & MOREIRA-FILHO, O. Chromosomal location and distribution of
As51 satellite DNA in five species of the genus Astyanax (Teleostei, Characidae, Incertae
sedis). Journal of Fish Biology, v. 75, p. 408-421, 2009a.
KANTEK, D .L. Z., CESTARI, M. M., BERTOLLO, L. A. C. & MOREIRA-FILHO, O.
Characterization of the constitutive heterochromatin of Astyanax sp. D (Characiformes:
Characidae) from the Upper Iguaçu River (PR). Folia biologica, v. 57, p. 37-41, 2009b.
KARTAVTSEVA, I. V.; ROSLIK, G. V. A complex B chromosome system in the Korean
field mouse, Apodemus peninsulae. Cytogenetic and Genome Research, v. 106, p. 271-278,
2004.
KAVALCO, K. F.; MOREIRA-FILHO, O. Cytogenetical analyses in four species of the genus
Astyanax (Pisces, Characidae) from Paraíba do Sul River Basin. Caryologia, v. 56, n. 4, p.
453-461, 2003.
KIDWELL, M. G.; LISCH, D. R. Transposable elements and host genome evolution. Trends
in Ecology & Evolution, v. 15, n. 3, p. 95-99, 2000.
KIDWELL, M. G.; LISCH, D. R. Perspective: transposable elements, parasitic DNA, and
genome evolution. Evolution, v. 55, n. 5, p. 1-24, 2001.
KIDWELL, M. G. Transposable elements and the evolution of genome size in eukaryotes.
Genetica, v. 115, p. 49-63, 2002.
KLIGERMAN, A. D.; BLOOM, S. E. Rapid chromosome preparation from solid tissues of
fishes. Jorunal of the Fisheries Research Board of Canada, v. 43, p. 266-269, 1977.
LEVAN, A..; FREDGA, K.; SANDBERG, A. A. Nomenclature for centromeric position on
chromosomes. Hereditas, v. 52, p. 201-220, 1964.
LIMA, F. C. T. et al. Genera Incertae sedis in Characidae. In: REIS, R. E.; S. O.
KULLANDER; FERRARIS JR. C. J. (Org.). Check list of the freshwater fishes of South
and Central America. Porto Alegre: EDIPUCRS, 2003, p. 106-169.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
74
LOWE-MCCONNELL, R.H. The cichlid fishes of Guiana, South America, with notes on their
ecology and breeding behavior. Zoological Journal of the Linnean Society, v. 48, p. 255-
302, 1969.
MAISTRO, E. L.; FORESTI, F.; OLIVEIRA, C. New occurence of a macro B-chromosome in
Astyanax scabripinnis paranae (PISCES, CHARACIFORMES, CHARACIDAE). Revista
Brasileira de Genética, v.17, n.2, p. 153-156, 1994.
MAISTRO, E. L.; FORESTI, F.; OLIVEIRA, C. Comparative cytogenetic and morphological
analysis of Astyanax scabripinnis paranae (Pisces, Characidae, Tetragonopterinae). Genetics
and Molecular Biology, v. 21, p. 201-206, 1998.
MAISTRO, E. L.; OLIVEIRA, C.; FORESTI, F. Sympatric occurrence of two cytotypes of
Astyanax scabripinnis (Characiformes, Characidae). Genetics and Molecular Biology, v.23,
n.2, p. 365-369, 2000.
MALABARBA, L. R. Monophyly of Cheirodontinae, characters and major clades. p.193-233.
In: Malabarba, L. R., R. E. Reis, R. P. Vari, Z. M. S. Lucena & C. A. S. Lucena. Phylogeny
and Classification of Neotropical Fishes. Porto Alegre, EDIPUCRS, 1998, 603p.
MANTOVANI, M.; ABEL, L. D. S.; MESTRINER, C. A.; MOREIRA-FILHO, O.
Accentuated polymorphism of heterochromatin and nucleolar organizer regions in Astyanax
scabripinnis (Pisces, Characidae): Tools for understanding karyotypic evolution. Genetica, v.
109, p. 161-168, 2000.
MANTOVANI, M.; ABEL, L. D. S; MESTRINER, C. A; MOREIRA-FILHO, O. Evidence of
the differentiated structural arrangement of constitutive heterochromatin between two
populations of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetics and Molecular Biology,
v. 27, p. 536–542, 2004.
MANTOVANI M.; ABEL L. D. S.; MOREIRA-FILHO, O. Conserved 5S and variable 45S
rDNA chromosomal localization revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces,
Characidae). Genetica, v.123, p. 211–216, 2005.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
75
MARTINS, C.; GALETTI Jr, P. M. Chromosomal localization of 5S DNA genes in Leporinus
fish (Anostomidae, Characiformes). Chromosome Research, v. 7, p. 363–367, 1999.
MARTINS, C.; GALETTI Jr, P. M. Conservative distribution of 5S rDNA loci in Schizodon
(Pisces, Anostomidae) chromosomes. Chromosome Research, v. 8, p. 353–355 2000.
MENEZES, N. A.; CASTRO, R. M. C.; WEITZMAN, S. H.; WEITZMAN, M. J. Peixes de
riacho da Floresta Costeira Atlântica Brasileira: Um conjunto pouco conhecido e ameaçado de
vertebrados. In: (Watanabe, S. coord.) II Simpósio de Ecossistemas da costa sul e sudeste
brasileira: Estrutura, 41 manejo e função. Academia de Ciências do estado de São Paulo, p.
290-295, 1990.
MENEZES, N. A. Importância da conservação da ictiofauna dos ecossistemas aquáticos
brasileiros. Seminários sobre fauna aquática e o setor elétrico brasileiro. COMASE,
ELETROBRÁS. Caderno 3, Conservação, p. 7-13, 1994.
MESTRINER, C. A.; GALETTI JR, P. M.; VALENTINI, S. R.; RUIZ, I. R. G.; ABEL, L. D.
S.; et al: Structural and functional evidence that a B chromosome in the characidae fish
Astyanax scabripinnis is an isochromosome. Heredity, v. 85, p.1–9, 2000.
MILLER, O. L.; DEV, V.; TANTRAVAHI, R.; MILLER, O. J. Suppression of human
nucleolus organizer activity in mouse-human somatic hybrid cells. Experimental Cell
Research, v. 101, n. 235–243, 1976.
MIZOGUCHI, S. M. H. N.; MARTINS-SANTOS, I. C. Macro- and microchromosomes B in
females of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Hereditas, n. 127, p. 249-253, 1997.
MIZOGUCHI, S. M. H. N.; MARTINS-SANTOS, I. C. Cytogenetics and morphometrics
differences in populations of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae) from Maringá region,
PR, Brazil. Genetics and Molecular Biology, v. 21, p. 55-61, 1998a.
MIZOGUCHI, S. M. H. N.; MARTINS-SANTOS, I. C. Activation patterns of the nucleolar
organizer regions in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Cytologia, v. 63, n. 3, p. 259-
265, 1998b.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
76
MOREIRA, C. L. R. Relações filogenéticas na ordem Characiformes (Teleostei,
Ostariophisi). Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil, 2007.
MOREIRA-FILHO, O.; BERTOLLO, L. A. C. Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): A
species complex. Brazilian Journal of Genetics, v. 14, p. 331–357, 1991.
MOREIRA-FILHO, O.; FENOCCHIO, A. S.; PASTORI, M. C.; BERTOLLO, L. A. C.
Occurence of a metacentric macrochromosome B in different species of the genus Astyanax
(Pisces, Characidae, Tetragonopterinae). Cytologia, v. 66, p. 59-64, 2001.
MOREIRA-FILHO, O.; GALETTI JR., P. M.; BERTOLLO, L. A. C. B chromosomes in the
fish Astyanax scabripinnis (Characidae, Tetragonopterinae): An overview in natural
populations. Cytogenetic Genome Research, v. 106, p. 230-234, 2004.
NELSON, J. S. Fishes of the world. 4 ed., Hoboken, John Wiley & Sons, 2006. 624p.
NÉO, D. M.; MOREIRA-FILHO, O.; CAMACHO, J. P. M. Altitudinal variation for B
chromosome frequency in the fish Astyanax scabripinnis. Heredity, v. 85, p. 136-141, 2000a.
NÉO, D. M.; BERTOLLO, L. A. C.; MOREIRA-FILHO, O. Morphological differentiation
and possible origin of B chromosomes in a natural Brazilian population of Astyanax
scabripinnis (PISCES, CHARACIDAE). Genetica, v. 108, p. 211-215, 2000b.
NUR, U. Harmful B chromosomes in a mealy bug population. Genetics, v. 54, p. 1225–1238,
1966.
NUR, U. Maintenance of a 'parasitic' B chromosome in the grasshopper Melanoplus femur-
rubrum. Genetics, v. 87, p. 499–512, 1977.
ÖSTERGREN, G. Parasitic nature of extra fragment chromosomes. Botaniska Notiser, v. 2,
n. 157-163, 1945.
PALOMEQUE, T.; CHICA, E.; DÍAZ DE LA GUARDIA, R. Supernumerary chromosome
segments in different genera of Formicidae. Genetica, v. 90, p. 17–29, 1993.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
77
PARDO, M. C.; LOPEZ-LEON, M. D.; CABRERO, J.; CAMACHO, J.P.M. Transmission
analysis of mitotically unstable B chromosomes in Locusta migratoria. Genome, n. 37, p.
1027-1034, 1994.
PAULS, E.; BERTOLLO, L. A. C. Evidence for a system of supernumerary chromosomes in
Prochilodus scrofa Steindachner, 1881 (Pisces, Prochilodontidae). Caryologia, v. 36 p.3 07-
314, 1983.
PAZZA, R.; KAVALCO, S. A. F.; PENTEADO, P. R.; KAVALCO, K. F.; ALMEIDA-
TOLEDO, L. F. The species complex Astyanax fasciatus Cuvier, 1819 (Teleostei,
Characiformes): A multidisciplinary approach. Jorunal of Fish Biology, v. 72, p. 2002-2010,
2008.
PERES, W. A. M.; BERTOLLO, L. A. C.; MOREIRA-FILHO, O. Physical mapping of the
18S and 5S ribosomal genes in nine Characidae species (Teleostei, Characiformes). Genetics
and Molecular Biology, v. 31, p. 222-226, 2008.
PINKEL, D.; STRAUME, T.; GRAY, J. W. Cytogenetic analysis using quantitative, high-
sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy Sciences,
USA, v. 83, p. 2934–2938, 1986.
POLETTO, A. B.; FERREIRA, I. A.; MARTINS, C. The B chromosomes of the African
cichlid fish Haplochromis obliquidens harbour 18S rRNA gene copies. BMC Genetics, v. 11,
n. 1, 2010, in press.
REIS, R. E.; KULLANDER, S. O.; FERRARIS, C. L. (EDS.). Checklist of the freshwater
fishes of the South and Central America. Porto Alegre, Edipucrs, 2003, 729 p.
ROCON-STANGE, E. A.; ALMEIDA-TOLEDO, L. F. Supernumerary B chromosome
restricted to males in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Brazilian Journal of
Genetics, v. 16, p. 601–615, 1993.
RUBTZOV, N. B.; BORISSOV, YU. M.; KARAMYSHEVA, T. V.; BOCHKAREV, M. N.
The mechanisms of formation and evolution of B chromosomes in Korean field mice
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
78
Apodemus peninsulae (Mammalia, Rodentia). Russian Journal of Genetics, v. 45, n. 4, p.
389-396, 2009.
SALVADOR, L. B.; MOREIRA-FILHO, O. B chromosomes in Astyanax scabripinnis
(Pisces, Characidae). Heredity, v. 69, p. 50-56, 1992.
SCHMID, M.; GUTTENBACH, M. Evolutionary diversity of reverse fluorescence
chromosome bands in vertebrates. Chromosoma, v. 97, p. 101-114, 2008.
SHAW, M. W.;HEWITT; G. M. B chromosomes, selfish DNA and theoretical models: where
next? In: Futuyma, D.; Antonovics, J. (eds) Oxford Surveys in Evolutionary Biology,
Oxford University Press, Oxford, v. 7, p. 197–223, 1990.
STRIPECKE, R.; NOGUEIRA-PINTO, M. T.; HACKEL, C.; SAZIMA, I. O caritótipo de
Astyanax engenmaniorum (Osteichthyes, Characidae). XII Congresso Brasileiro de Zoologia.
Campinas, Brasil, 1985. apud: MOREIRA-FILHO, O.; GALETTI JR., P. M.; BERTOLLO, L.
A. C. B chromosomes in the fish Astyanax scabripinnis (Characidae, Tetragonopterinae): An
overview in natural populations. Cytogenetic and Genome Research, v. 106, p. 230-234,
2004.
SOUZA, I. L.; MOREIRA-FILHO, O. Cytogenetic diversity in the Astyanax scabripinnis
species complex (Pisces, Characidae). I. Allopatric distribution in a small stream. Cytologia,
v. 60, p. 1-11, 1995.
SOUZA, I. L., Estudos citogenéticos em populações de Astyanax scabripinnis (Pisces,
Characidae), pertencentes a dois riachos de diferentes bacias do Sudeste Brasileiro.
Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, Brasil, 1996.
SOUZA, I. L.; VENERE, P. C.; MOREIRA-FILHO, O. Constitutive heterochromatin and Ag-
NOR polymorphism in the small Characidae fish Astyanax scabripinnis. Cytologia, v. 72, n.
1, p. 63-69, 2007.
SUMNER, A. T. A simple technique for demosntrating centromeric heterochromatin.
Experimental Cell Research, v. 74, p. 304-306, 1972.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
79
TELENIUS, H.; CARTER, N. P.; BEBB, C. E.; NORDENSKJOLD, M.; PONDER, B. A.;
TUNNACLIFFE, A. Degenerate oligonucleotideprimed PCR: general amplification of target
DNA by a single degenerate primer. Genomics, v.13, p. 718–725, 1992.
TERUEL, M.; CABRERO, J.; MONTIEL, E. E.; ACOSTA, M. J.; SÁNCHEZ, A. E
CAMACHO, J. P. M. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in
Locusta migratoria. Chromosome research, v. 17; p. 11-18, 2009.
TORRES-MARIANO, A. R.; MORELLI, S. B chromosomes in a population of Astyanax
eigenmanniorum (Characiformes, Characidae) from the Araguari River Basin (Uberlândia,
MG, Brazil). Genetics and Molecular Biology, v.31, n.1 (suppl), p. 246-249, 2008.
VICARI, M. R.; NOLETO, R. B.; ARTONI, R. F.; MOREIRA-FILHO, O.; BERTOLLO, L.
A. C. Comparative cytogenetics among species of the Astyanax scabripinnis complex.
Evolutionary and biogeographical inferences. Genetics and Molecular Biology, v.31 p. 173–
179, 2008a.
VICARI, M. R., ARTONI, R. F., MOREIRA-FILHO O. E. BERTOLLO, L. A. C.
COLOCALIZATION OF repetitive DNAs and silencing of major rRNA genes. A case report
of the fish Astyanax janeiroensis. Cytogenetic and Genome Research, v. 122, p. 67 – 72,
2008b.
VICARI, M. R.; NOGAROTO, V.; NOLETO, R. B.; CESTARI, M. M.; CIOFFI, M. B.;
ALMEIDA, M. C.; MOREIRA-FILHO, O.; BERTOLLO, L. A. C.; ARTONI, R. F. Satellite
DNA and chromosomes in Neotropical fishes: Methods, applications and perspectives.
Journal of Fish Biology, doi:10.1111/j.1095-8649.2010.02564.x in press.
VICENTE, V. E.; MOREIRA-FILHO, O.; CAMACHO, J. P. M. Sex-ratio distortion
associated to the presence of a B chromosome in Astyanax scabripinnis (Teleostei,
Characidae) Citogenetic and Cell Genetics, v. 74, p. 70-75, 1996.
WHITE, M. J. D. Animal cytology and evolution, 3 ed., London: Cambridge University
Press, 1973.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
80
ZIEGLER, C. G.; LAMATSCH, D. K. et al. The giant B chromosome of the cyprinid fish
Alburnus alburnus harbours a retrotransposon-derived repetitive DNA sequence.
Chromosome Research, v. 11, p. 23–25, 2003.
ZWICK, M. S.; HANSON, R. E.; MCKNIGHT, T. D.; ISLAM-FARIDI, H. M.; STELLY, D.
M.; WING, R. A. E ; Price, J. H. A rapid procedure for the isolation of C
0
t-1 DNA from
plants. Genome, v. 40, p. 138-142, 1997.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
81
7. Anexos
Anexo I: desenho esquemático a respeito da formação dos quatro tipos
morfológicos de cromossomos B encontrados no complexo Astyanax scabripinnis,
baseado em Neo et al. (2000b), com modificações.
Desenho esquemático dos tipos morfológicos de cromossomos B já encontrados em A.
scabripinnis, mostrando como possíveis caminhos para a sua origem. (a) representa um
cromossomos subtelo/acrocêntrico. (b) representa a quebra deste cromossomo na região
centromérica, com posterior formação de isocromossomo, originando (c), um
microcromossomo com origem nas cromátides irmãs do braço curto, ou (d), um
macrocromossomo metacêntrico, originado a partir das cromátides irmãs do braço longo.
Ainda, o cromossomo metacêntrico grande poderia sofrer uma inversão pericêntrica (e),
originando um cromossomo do tipo submetacêntrico grande (g). O submetacêntrico grande,
por sua vez, poderia originar um cromossomo metacêntrico pequeno por meio de deleções no
braço longo (h).
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
82
Anexo II: Licença permanente para a coleta de material zoológico
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
83
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
84
Anexo III: Aprovação do comitê de ética em experimentação animal
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
85
Anexo IV: Obtenção dos cromossomos mitóticos:
Para a obtenção dos cromossomos mitóticos foi utilizado o procedimento descrito por
Bertollo et al. (1978). Foi injetado intra-abdominalmente no animal uma solução aquosa de
colchicina 0,0125 %, na proporção de 1 ml/100 g de peso. Os peixes então foram mantidos em
aquário bem aerado durante 50-60 minutos, posteriormente foram anestesiados com
benzocaína diluída a 0,01%, e sacrificados. A porção do rim anterior foi retirada e dissociada
com uma seringa desprovida de agulha em cerca de 10 ml de solução hipotônica (KCl 0,075
M). O tecido dissociado foi incubado em estufa a 37°C durante 25-30 minutos, e depois foi re-
suspendido com auxílio de uma pipeta Pasteur e colocado em tubo de centrífuga. Foi
adicionado neste tubo algumas gotas de fixador (3 partes de metanol para 1 de ácido acético
glacial), o material foi novamente re-suspendido repetidas vezes (até ser homogeneizado), foi
centrifugado durante 10 minutos, a 900 rpm e depois foi descartado o sobrenadante. Após a
centrifugação foi adicionado 5-7 ml do mesmo fixador, re-suspendido e centrifugado por mais
10 minutos a 900 rpm, este passo foi repetido mais uma vez. Foi então descartado o
sobrenadante e adicionado uma quantidade de fixador para que se obtivesse uma suspensão
celular moderadamente concentrada (geralmente de 0,5 a 1,0 ml), re-suspendido e adicionado
em freezer para posterior utilização. Para confecção de lâminas foi pingado de 1-2 gotas da
suspensão celular, com uma pipeta Pasteur. A lâmina estava limpa, levemente inclinada, com
uma película d'água a 60°C, de tal forma que a água escorresse e permitisse que o material
ficasse aderido sobre a lâmina. O material foi então deixado secar ao ar e corado com solução
de Giemsa a 5 %, em tampão fosfato pH=6,8 durante 6-8 minutos.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
86
Anexo V: Preparação de cromossomos meióticos (KLIGERMAN e BLOOM,
1977, adaptada por Bertollo et al., 1978)
Após anestesiar o animal, este foi sacrificado. As gônadas foram retiradas e
seccionadas em pequenos fragmentos, os quais foram colocados em solução hipotônica de
KCl a 0,075M por 20 minutos. O material foi, então, tranferido para o fixador (metanol: ácido
acético; 3:1) recém preparado. Este processo foi repetido uma vez e a seguir o material foi
guardado no refrigerador a 4
o
C. Para a confecção das lâminas, o material foi retirado do
fixador e alguns fragmentos foram tranferidos para uma placa escavada, sendo então
adicionadas duas a três gotas de ácido acético a 60%. Após, o material foi bem fragmentado,
obtendo-se uma suspensão celular, transferida então para uma lâmina aquecida a 30-35
o
C,
sendo imediatamente reaspirada. Este processo foi repetido em 2 ou 3 pontos da lâmina e
posteriormente esta foi corada com Giemsa 10%.
Anexo VI: Detecção da Heterocromatina Constitutiva: Bandas-BSG
O procedimento seguiu o protocolo de Sumner (1972). As lâminas contendo o material
celular foram tratadas com ácido clorídrico (HCl) 0,2 N, a 37°C, durante 10 minutos e
posteriormente lavadas com água destilada. Elas então foram incubadas a 28°C em solução de
bário (Ba (OH)
2
) durante 1 a 2 minutos. Depois as lâminas foram submersas em solução de
ácido clorídrico 0,2 N e lavadas com água destilada. O material foi então imerso em solução
salina (Saline salt citrate) 2x SSC, a 60°C, durante 40 minutos, lavado em água destilada e
secado ao ar. As lâminas foram coradas com solução de Giemsa a 2 %, em tampão fosfato
pH=6,8 durante 15 minutos.
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
87
Anexo VII: Marcação de sondas por nick translation
As reações de nick translation seguiram as orientações do fabricante (Roche). Pipetar
os seguintes componentes em tubo de 1,5 mL no gelo: x µL água qsp (quantidade para
completar o volume final de 20 µL); x µL sonda (equivalente a 1µg – depende da
concentração da sonda em nanogramas por µL); 4 µL mix de nick translation; completar para
o volume total de 20 µL; colocar em banho Maria a 15 C por 1hora e 30 minutos; interromper
com 1 µL de EDTA 0,5 M pH 8,0; aquecer por 10 minutos à 65 C.
Anexo VIII: Microdissecção de cromossomos submetidos ao bandamento C
(VICARI et al., submetido)
Os cromossomos B de Astyanax scabripinnis (Campos do Jordão, SP) depois de
submetidos ao bandamento C foram microdissectados em microscópio invertido IX51
(Olympus) equipado com micromanipulador mecânico Transferman (Eppendorf). A
microdissecção foi realizada com agulhas de vidro, capilar, com pontas de aproximadamente
0,7 μm. Após a microdissecção, a ponta da agulha contendo o material cromossômico foi
quebrada no interior de um microtubo. Um total de 20 cromossomos B com bandamento C
extremamente visível e contrastante foram microdissectados. Estes cromossomos foram então
transferidos para um microtubo e utilizados na reação de “Degenerated Oligonucleotide
Primier – Polymerase Chain Reaction” (DOP-PCR).
Anexo IX: Iniciador oligonucleotídeo degenerado – reação em cadeia da polimerase
(DOP-PCR)
A reação DOP-PCR seguiu o procedimento descrito por Telenius et al. (1992) com
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
88
adaptações (VICARI et al., 2010). A reação de polimerização consistiu de tampão 1x
(ThermoSequenase - GE healthcare), 400 μM de dNTP, 2 μM do primer DOP– 5’
CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG - 3’. As reações de PCR foram realizadas em
termociclador Biocycler Gradient System (Biosystems ®). O microtubo foi aquecido a 95°C
por 10 minutos, seguido da adição de 10 U de ThermoSequenase. A primeira amplificação é
realizada via RAMP-PCR: 3 minutos a 94°C; 12 ciclos de baixa estringência (1 minuto e 30
segundos a 94°C, 2 minutos a 32°C aumentando 0,2ºC/s até 72°C e 2 minutos a 72°C),
seguidos por 30 ciclos de alta estringência (1 min. e 30 s a 94°C, 1 minuto e 30 segundos a
52°C e 1 minuto e 30 segundos a 72°C). Os produtos obtidos foram corridos em gel de
agarose 1%, onde o tamanho esperado foi corresponde a um arrasto entre 100 – 400 pb.
A segunda reação de amplificação foi feita com 100 ng do primeiro produto de PCR
realizando-se uma nova reação de amplificação num volume final de 50 µL. A reação foi
composta de tampão (200 mM Tris pH 8.4, 500 mM KCl) 1x da Taq DNA polimerase
(Invitrogen); 2 mM MgCl
2
; 400 µM de dNTP, 2 µM de primer DOP = 5’-
CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ e 2 U de Taq DNA polimerase. As reações de
polimerização foram constituídas por: 3 minutos a 94°C; 35 ciclos de 1 minuto e 30 segundos
a 90°C, 1 minuto.. e 30 segundos a 52°C e 1 minuto e 30 segundos a 72°C.
Anexo X: Isolamento de sequências repetitivas obtidas pela cinética de reassociação
do DNA (Cot-1)
O procedimento seguiu o protocolo de Zwick et al. (1997). O DNA genômico foi
diluído a 100-500 ng/µL em 0,3M NaCl; posteriormente 500 µL de DNA foram colocados em
tubos de 1,5 mL. Este DNA foi autoclavado por 3 a 5 minutos a 1.0 atm/120
o
C. Em seguida, 3
µL do DNA autoclavado foram aplicados em gel de agarose 1% para checar o tamanho dos
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
89
fragmentos obtidos (ideal obter fragmentos entre 100 e 1.000 pb). A seguir, 3 alíquotas (tubos
0, 1 e 5) com 50 µL do DNA autoclavado foram desnaturadas em banho a 95
o
C por 10
minutos. Os tubos foram então passados para gelo por 10 segundos: o tubo 0 foi
imediatamente tratado com S1 nuclease (Promega) e os tubos 1 e 5 foram colocados em
banho a 65
o
C para renaturação. Após 1 minuto, o tubo 1 foi retirado e tratado com S1
nuclease, e após 5 minutos, o tubo 5 sofreu o mesmo processo. Para o tratamento com S1
nuclease, foi utilizada 1U da enzima para 1ug de DNA e 5,5 µL tampão [20mM Tris-HCl (pH
7.5 at 25°C), 0,1mM ZnCl
2
, 50mM NaCl e 50% (v/v) glicerol] 10x para o volume final de 50
μl. As amostras foram incubadas a 37
o
C por 8 minutos e imediatamente congeladas em
nitrogênio líquido; em seguida igual volume de fenol/clorofórmio (1:1) foi adicionado. As
amostras foram centrífugadas por 5 minutos a 13.000 rpm. Coletou-se a fase aquosa e esta foi
passada para um tubo novo. O DNA foi precipitado com 2,5 volumes de etanol absoluto
gelado, e então deixado no freezer a –80
o
C por 30 minutos. Decorrido este tempo, foi
centrifugado por 15 minutos a 16.000 rpm a 4
o
C. Posteriormente, as amostas foram colocadas
para secar e ressuspendidas em 50 µl de água milliQ autoclavada. O DNA foi checado em gel
de agarose 1%.
Anexo XI: Hibridação in situ fluorescente (FISH) com sondas B, DNA repetitivo
As51 de C
o
t-1, rDNA 18S e rDNA 5S.
A. Preparação das sondas
Foram empregadas uma sonda cromossômica e quatro sondas de DNA repetitivos para
a localização dessas seqüências nos cromossomos metafásicos dos exemplares de Astyanax
scabripinnis estudados: (1) sonda do DNA total do cromossomo B de Astyanax scabripinnis
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
90
obtida por meio de microdissecção cromossômica; (2) sonda do DNA repetitivo As51 obtida
por meio de digestão enzimática do peixe Astyanax scabripinnis (MESTRINER et al., 2000) ;
(3) sonda de DNA repetitivo C
o
t-1, isolada a partir de DNA extraído do fígado de Astyanax
scabripinnis, seguindo protocolo de Zwick et al. (1997), (4) sonda de rDNA 18S, com
aproximadamente 1.800 pb, obtida por PCR a partir do DNA nuclear da espécie de peixe
Prochilodus argenteus (HATANAKA e GALETTI Jr., 2004) e (5) sonda de rDNA 5S, obtida
a partir da espécie de peixe Leporinus elongatus (MARTINS E GALETTI JR Jr., 1999).
B. Marcação das sondas
A sonda cromossomo B foi marcada em reação de DOP-PCR utilizando o nucleotídeo
modificado biotina 14-dATP (Invitrogen). A reação de PCR consistiu de: tampão 1x da Taq
DNA polimerase (Invitrogen), 2 mM MgCl
2
, 400 µM dTTP, dGTP e dCTP, 200 µM de
dATTP, 200 µM de dATP 14- biotina, 2 µM DOP primer e 2 U de Taq polimerase. As sondas
DNA satélite As51; C
o
t-1 total; rDNA 18S foram marcadas pela técnica de nick translation,
utilizando o composto digoxigenina 16 - dUTP (Dig Nick Mix - Roche), e a sonda rDNA 5S
foi marcada com biotina pela técnica de nick translation, utilizando o composto biotina 16 -
dUTP (Nick Translation Biotin - Roche).
C. Preparação da solução de hibridação
Em todas as FISH, a mistura de hibridação consistiu de: 200 µL Formamida 50%; 80
µL Sulfato de Dextrano 50% (concentração final de 10%); 40 μL de 20x Saline salt citrate -
SSC (concentração final 2x SSC); 80 μl de H2O qsp, perfazendo um volume total de 400 μL,
aos quais foram adicionados 1 μg da sonda 1 (DNA marcado com biotina) + 1 μg da sonda 2
(DNA marcado com digoxigenina 11dUTP), (Double FISH). A estringência destas misturas de
hibridação foi de 77%. Em seguida, a solução de hibridação foi transferida para um banho
fervente, durante 10 minutos, para desnaturação do DNA e, imediatamente após, para um
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
91
recipiente com gelo, impedindo a renaturação por choque térmico.
D. Preparação das lâminas (lavagens pré-hibridação)
As lâminas, contendo as preparações cromossômicas, foram lavadas em phosphate
buffer saline (PBS), por 5 minutos, em temperatura ambiente, e desidratadas em uma série de
etanol a 70, 85 e 100%, 5 minutos em cada banho. A seguir, foram tratadas com solução de
RNAse (100 μg/mL) durante 1 hora, em câmara úmida a 37°C, lavadas duas vezes em solução
de 2x SSC, por 10 minutos e em PBS, por 5 minutos. Em seguida a fixação com formaldeído
1%/ PBS 1x/ MgCl2 50mM, por 10 minutos, à temperatura ambiente, lavagem em PBS 1 x
por 5 minutos e desidratação em série de etanol a 70, 85 e 100%, 5 minutos cada banho, à
temperatura ambiente. As lâminas foram então tratadas com formamida 70% dissolvida em 2x
SSC, a 70°C, por 5 minutos e novamente desidratadas em série de etanol a 70, 85 e 100%, 5
minutos cada banho.
E. Hibridação e detecção dos sinais correspondentes
Foram aplicados, sobre as lâminas, cerca de 50 µL da solução de hibridação
permanecendo overnight a 37°C, em câmara úmida contendo solução de 2x SSC pH 7,0.
Decorrido este tempo, as lâminas foram lavadas com solução de formamida 15% em 0,2x SSC
pH 7,0 por 20 minutos, a 42°C e, em seguida, lavadas com 0,1x SSC a 60°C, por 15 minutos.
Em seguida foram lavadas em Tween 20, por 5 minutos, incubação em 90 μl de tampão non
fat dry milk (NFDM) a 5%, por 15 minutos em câmara úmida e duas lavagens com Tween 20,
cinco minutos cada. Para a detecção das sondas, foram colocados sobre as lâminas uma
mistura de 100 µL de tampão NFDM contendo 1:1000 de avidina-FITC (Fluoresceina Isotil
Cianato-avidina conjugada) a 0,25 μg/mL e; 5:1000 de anti digoxigenina rodamina a 1 μg/mL;
Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva (UEPG-UNICENTRO)
92
permanecendo por 1 h a 37°C, em câmara úmida. As lâminas foram então lavadas 3 vezes em
Tween 20, cinco minutos cada. Em seguida a desidratação em série de etanol a 70, 85 e 100%
à temperatura ambiente, por 5 minutos em cada banho. Os cromossomos foram então contra
corados com DAPI (0,2 μg/mL) diluído em uma solução “antifade” (Fluka).
Anexo XII: Análises dos resultados
Os cromossomos foram organizados em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), e
subtelocêntricos (st), e acrocêntricos (a) dependendo da razão de braços (LEVAN et al., 1964),
e arranjados em decréscimo de tamanho nos respectivos cariótipos. Os sinais de FISH foram
visualizados de acordo com PINKEL et al. (1986) e analisados em microscópio de
epifluorescência (Olympus BX50). As imagens dos cromossomos foram capturadas usando o
microscópio de epifluorescência Olympus BX41 acoplado ao sistema de captura de Imagens
DP 71 (Olympus).
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
