( PDF ) Estudo físico-químico, biológico e tecnológico de frações saponosídicas de Ilex paraguariensis A.St. Hil

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

SAPONINAS DOS FRUTOS DE Ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate):

DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ANALÍTICA, ESTUDO FÍSICO-

QUÍMICO E BIOLÓGICO

MARIA PAULA GAROFO PEIXOTO

PORTO ALEGRE, 2009

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

SAPONINAS DOS FRUTOS DE Ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate):

DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ANALÍTICA, ESTUDOS FÍSICO-

QUÍMICO E BIOLÓGICO

Tese apresentada por Maria Paula Garofo

Peixoto para obtenção do GRAU DE DOUTOR

em Ciências Farmacêuticas

Orientador: Prof. Dr. George González Ortega

Porto Alegre, 2009

ads:

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, em

nível de Doutorado – Produção e Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos –

da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, perante a

Comissão Examinadora constituída por:

Profª. Drª. Clara Ismeria Damiani Bica

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Profª. Drª. Marlise Araújo dos Santos

Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul

Prof. Dr. Marcos Antonio Segatto Silva

Universidade Federal de Santa Catarina

P379s Peixoto, Maria Paula Garofo

Saponinas dos frutos de ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate):

desenvolvimento de metodologia analítica, estudos físico-químico e

biológico / Maria Paula Garofo Peixoto. Porto Alegre: UFRGS, 2009. –

xx, 165 p. : il., gráf., tab.

Tese (doutorado). UFRGS. Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas.

1. Saponinas. 2. Ilex paraguariensis. 3. Erva-mate. I. González Ortega,

George. II.Título.

CDU: 541.1:547.9

Bibliotecária responsável:

Margarida Maria Cordeiro Fonseca Ferreira – CRB 10/480

iii

Agradecimentos ao CNPq, à CAPES, órgãos que financiaram as

bolsas de estudos para o desenvolvimento deste trabalho no Brasil

e no exterior, respectivamente. Ao Laboratório de Desenvolvimento

Galênico desta Faculdade, ao Laboratório de Pesquisas

Veterinárias Desidério Finamor e ao Departamento de Farmácia

do King`s College, University of London, que disponibilizaram

todos os equipamentos e materiais necessários para elaboração

desta tese.

Dedico este trabalho

aos meus pais

Maria Tereza e Paulo,

Pelo amor e incentivo imensuráveis

vii

Agradecimentos

AgradecimentosAgradecimentos

Agradecimentos

Ao meu orientador Prof. Dr. George Ortega. Por ter carinhosamente me acolhido em

seu grupo, pela confiança, pelo incentivo e pelas infindáveis discussões. Nossa

convivência foi enriquecedora, agradável e proveitosa. Felizmente, pra mim, essa

convivência se transformou em amizade. Muito muito obrigada por tudo. É

imensurável o amadurecimento que tive em terras gaúchas e muito lhe devo por isso.

Aos amigos do Laboratório de Desenvolvimento Galênico: pelas lições de vida e por

todo o aprendizado. Simone, Cabral, Greice, Samuel, Gustavo, Lísias, Angela,

Bethânia, Francini, Romeu, Vinicius. Foi muito bom conviver com vocês. Em especial

à Janine e Pedro pelo auxílio, descontração e amizade. A ajuda de vocês, sempre com

um sorriso no rosto, foi imprescindível. Obrigada;

Ao Prof. Dr. Paulo Roehe e aos colegas do Instituto de Pesquisa Veterinária Desidério

Finamor, pela convivência prazerosa e por todos os enriquecedores momentos de

discussão. Foi muito bom conviver com vocês. Agradeço especialmente à Carine,

Samuel e Ana Paula;

À Profª Drª. Nádya Pesce da Silveira, pela colaboração e discussões;

À Faculdade de Farmácia do King`s College London, pela acolhida calorosa. À Profª.

Drª. Cécile Dreiss, pela convivência enriquecedora e pelo exemplo de Pesquisadora

que é;

Aos queridos colegas do 5º andar – King`s College. Vocês tornaram a minha

permanência além-mar inesquecível. Abhinav, André, Franziska, Huying, Jay, Jamie,

Nesrine. Obrigada por todo o carinho;

À minha companheira de casa, desafios e descobertas: Kelly, a convivência contigo foi

muito importante. Obrigada amiga;

À torcida Ribeirãopretana. Meus eternos amigos: Maria Lúcia, Matheus e Karina. Aos

eternos colegas de pós-graduação e amigos de sempre: Mônica, Alessandra, Camila,

Cristiane e Guilherme.

A Ricardo pela trajetória de apoio e amizade contantes;

À Tia Albertina e Tio José, exemplos de vida;

À minha família em Porto Alegre: Lis, Kátia e Diego;

À Ervateira Barão de Cotegipe, pela doação sempre segura da matéria-prima vegetal.

RESUMO

O presente trabalho teve por objetivo a avaliação físico-química e biológica de uma

fração de saponinas enriquecida, obtida a partir de frutos verdes de Ilex paraguariensis

A. St. Hil (mate). A espécie apresenta grande importância econômica para vários

países sul-americanos, dentre eles o Brasil. Os frutos verdes da espécie acumulam

significativa quantidade de saponinas, entretanto, são considerados subproduto da

indústria do beneficiamento das folhas de mate. O extrato liofilizado dos frutos

(EX40) foi obtido por turboextração na proporção planta-solvente de 1:10 utilizando

como solvente solução hidroalcoólica a 40%. Para análise do extrato bruto foi

desenvolvido e validado um método analítico por CLAE-UV, que permitiu: 1)

quantificar o marcador químico ilexosídeo II em EX40; 2) estimar o conteúdo em

saponinas totais do extrato, tendo sido obtidos valores de 8,2 g% e 47,6 g%

respectivamente. Uma fração enriquecida em saponinas, denominada MSF, foi obtida

mediante fracionamento em fase sólida a partir de EX40, utilizando resina hidrofóbica

poliaromática e gradiente metanol:água de polaridade decrescente. Os maiores teores

de saponinas foram obtidos para as frações contendo 70 e 90 % de metanol. A

reprodutibilidade do processo foi avaliada por CLAE-UV, considerando o desvio

padrão relativo (DPR) entre a área dos dois picos majoritários de MSF produzidas em

seis lotes distintos. Valores de DPR de 8,17% para o pico I (ilexosídeo II) e 5,96 %

para o pico II (majoritário) foram obtidos. A toxicidade da fração foi avaliada pelo

potencial hemolítico in vitro e citotoxicidade sobre cultura de células de mamífero

(MDBK ATCC CCL-22). Para atividade hemolítica foi determinado um valor de IC

0,2 g/L (0,22 mM, expresso em ilexosídeo II). O valor de IC50 para citotoxicidade foi

3,8 g/L (4,04 mM, expresso em ilexosídeo II), caracterizando um produto de baixa

toxicidade. Dentre as várias atividades biológicas descritas para saponinas, selecionou-

se avaliar MSF quanto ao seu potencial como imunoadjuvante, assim como a atividade

tricomonicida. Para o primeiro caso, MSF foi testada em uma vacina contendo

herpesvírus bovino tipo 5 como antígeno viral, nas doses de 100 e 500 µg. Entretanto,

o incremento no título de IgG totais, avaliado por ELISA, não foi significativo. A

atividade tricomonicida foi comparada aos tensoativos polissorbato 80 e tiloxapol e a

uma fração enriquecida em saponinas de Quillaja saponaria. Após 24 h de incubação

foi observado para MSF um efeito dose-dependente, atingindo letalidade total dos

trofozoítos na concentração de 0,6 g/L. Esse efeito foi superior ao observado para

polissorbato 80 e tiloxapol e similar ao de quillaia. O tratamento com metronidazol,

administrado tanto após tratamento prévio dos trofozoítos com MSF quanto em

associação com essa fração, não revelou qualquer alteração significativa no efeito de

ambos os produtos, o que sugere ausência de interação entre MSF e MTZ e a possível

existência de mecanismos de ação distintos. A caracterização físico-química enfatizou

o estudo do tamanho e forma das micelas, seu comportamento reológico e capacidade

de solubilizar compostos hidrofóbicos. A concentração micelar crítica foi determinada

em 0,41 g/L utilizando um corante hidrofóbico como marcador. A análise por

microscopia eletrônica de transmissão (MET) e CRIO-MET revelou a presença

simultânea de micelas alongadas, com tamanho superior a 500 nm, e micelas esféricas

de tamanho menor. Para a fração de micelas esféricas, a análise por espalhamento de

nêutrons a baixo ângulo permitiu estabelecer diâmetro de 17,9 Å, perfazendo 23,1 e

xii

32,6 % das micelas observadas em soluções de MSF a 0,5 e 1,0 % m/v,

respectivamente. O comportamento reológico de MSF nas concentrações de 0,25 a

4,0 %, determinado por reometria dinâmica com controle de deformação, foi do tipo

viscoelástico para todas as concentrações. Esse fato corrobora a existência de

agregados não-esféricos, filiformes, semelhantes a micelas tipo wormlike. A

solubilização micelar de fármacos mediante MSF foi avaliada utilizando como

substâncias-modelos os fármacos flurbiprofeno – FLB (ácido fraco) e carbamazepina -

CBZ (base fraca), ambos pouco solúveis, e saponinas de quillaia como produto de

comparação. Nas concentrações de 0,13 a 1,5 % as saponinas de quillaia foram mais

eficientes frente ao flurbiprofeno, enquanto MSF foi capaz de aumentar

significativamente a solubilidade da carbamazepina. O incremento na solubilização

gerado por MSF foi de 0,0145 e 0,0129 g/L para CBZ e FLB, respectivamente.

Palavras-chave: Ilex paraguariensis, saponinas, micelas, CLAE-UV, MET, CRIO-

MET, reologia dinâmica, solubilização micelar, citotoxicidade, tricomonas,

imunoadjuvante.

xiii

ABSTRACT

The present work aimed the physicochemical and biological evaluation of a saponin

enriched fraction from the green fruits of Ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate), a

species of great economical importance in several Southern American countries,

including Brazil. Despite possessing high amounts of saponins, mate green fruits have

no commercial use to date and are considered a waste product from the mate leaves

processing companies. Mate fruits lyophilized extract (EX40) was produced using

turbo-extraction having a 40:60 mixture of water and ethanol as solvent and a 1:10

drug/solvent proportion. An HPLC-UV method was developed and validated aiming

at: I) Quantify the EX40 chemical marker, ilexoside II; II) Determine the EX40 total

saponin content. The values obtained were of 8.20 wt% and 47.60 wt%, respectively.

An enriched saponin fraction (MSF) was obtained from EX40 through a solid phase

extraction process within a polyaromatic resin and a decreasing solvent polarity

gradient of methanol and water. The higher recovery of mate saponins was achieved

with the 70 and 90 % methanol-containing fractions. The process reproducibility was

assessed by HPLC-UV through the analysis of the relative standard deviation (RSD) of

the two major MSF saponins peak areas obtained in six different batches. RSD values

of 8.17 % for peak I (ilexoside II) and 5.96 % for peak II (major peak) were obtained.

The MSF toxicity was evaluated according to its haemolytical activity and in vitro

cytotoxicity against a mammalian cell culture lineage (MDBK ATCC CCL-22).

Values of IC

of 0.2 g/L (0.22 mM expressed as ilexoside II) and 3.8 g/L (4.04 mM as

Ilexoside II) were found for the haemolysis and cytotoxicity respectively. Therefore

we could classify MSF as a low toxicity product. Among the several biological

activities ascribed to saponins, this work focused on the investigation of MSF immune

enhancer potential and its anti-trichomonads vaginalis activity. For the first evaluation,

MSF wad added to a bovine herpesvirus 5 vaccine, at 100 and 500 µg doses. However

total IGg titres determined by ELISA were not statistically significant. The anti-

trichomonads activity of MSF was compared a saponin enriched fraction from the

species Quillaja saponaria (Quillaja) and to tyloxapol and polysorbate 80. After 24h

of incubation MSF presented a dose-dependent activity with total trophozoites lethality

at a concentration of 0.6 g/L. The activity was higher than the synthetic surfactants and

similar to Quillaja. The treatment with metronidazole (MTZ), peformed in association

and after exposing the trophozoites with MSF did not show any synergistic effect of

MZT and MSF which suggest an absence of interaction between the compounds and

also that they probably have distinct mechanisms of action. The physicochemical

evaluation of MSF focused the determination of MSF micelles size and shape, their

rheological behaviour and ability to increase the solubility of hydrophobic compounds.

MSF critical micellar concentration was determined as 0.41 g/L using a hydrophobic

dye as a probe. The transmission electron microscopy (TEM) and CRYO-TEM

analysis revealed the occurrence of filiform micelles higher than 500 nm and smaller

sizes spherical micelles simultaneously. The spherical micelles radius of 17.9 Å were

determined using small angle neutron scattering.and they corresponded to 23.1 and

32.6 % of the total micelles in MSF solutions of 0.5 and 1.0 % w/v, respectively. The

rheological behavior of MSF ranging in concentration from 0.25 to 4.0% was

determined on a dynamic strain control rheometer and a viscoelastic behavior was

xiv

observed for all concentrations. These findings corroborate the occurrence of non-

spherical micelles very long in size (wormlike). MSF ability to improve the

solubilisation of poor aqueous soluble drugs was assessed using carbamazepine (CBZ)

and flurbiprofen (FLB) as a model of amphiphilic basic and acidic coumpounds.

Saponin enriched fractions were evaluated in concentrations ranging from 0.13 to

1.5 %. Quillaja was more efficient toward the weak acid while MSF was able to

increase significantly the CBZ solubility. The increase on CBZ and FLB solubility

after MSF addition was of 0.0145 and 0.0129 g/L, respectively.

Keywords: Ilex paraguariensis, saponins, micelles, HPLC-UV, TEM, CRYO-TEM,

dynamic rheology, micellar solubilisation, cytotoxicity, trichomonas,

immunoadjuvant.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Esquema representativo da tese......................................................... 5

Figura 1.1 – Saponinas isoladas dos frutos de mate............................................ 13

Figura 2.1 – LC-UV chromatograms of EX40 and MSF.................................... 49

Figura 2.2 – Structures and retention times of reference saponins ….................

Figura 2.3 – Chromatogram of MSF after mass detection……………………..

Figura 2.4 – LC-UV and LC-MS chromatograms of ilexoside II……………...

II……………...……………..

Figura 2.5 – Haemolytical activity of MSF and Quillaja saponins……………. 54

Figura 3.1 – Chemical structure of ilexoside II…….………………………….. 68

Figura 3.2 – Susceptibility of Trichomonas vaginalis to MSF………………... 70

Figura 3.3 – Susceptibility of Trichomonas vaginalis to MSF/MTZ after pre-

treatmen

treatment and co-administration studies……………………………………….. 72

Figura 3.4 – Comparative cytotoxicity of MSF and synthetic surfactants.......... 72

Figura 4.1 – General structures of saponins from mate fruits……...……...…... 85

Figura 4.2 – Determination of CMC: Absorbance of MSF-PAN solutions…… 91

Figura 4.3 – TEM images of MSF at 0.6% (w/v)………………………………

Figura 4.4 – CRYO-TEM images of MSF at 4.0% (w/v)…………………….. 93

Figura 4.5 – Small angle neutron scattering data: MSF at 0.5 and 1.0% (w/v)...

Figura 4.6 – Dynamic strain sweep measurements of MSF solutions………….

Figura 4.7 – Dynamic frequency sweep measurements of MSF solutions……. 97

Figura 4.8 – Micellar solubilisation of model drugs by MSF and Quillaja…….

Figura A1: Distribuição granulométrica da droga vegetal.................................. 125

Figura A2.1 – Perfil de tensão superficial de MSF............................................ 131

Figura A3.1 –Comparação das ondas de tensão e deformação e sinais de onda

referência (0° e 90°).............................................................................................

136

Figura A3.2 – Relação entre os vetores de tensão e deformação com os

vetores

vetores de onda de referência.............................................................................. 136

Figura A3.3 – Transformação do vetor de deformação em vetor referência e

dete

determinação de θ................................................................................................ 137

Figura A.5.1 – Reverse phase LC-UV chromatograms of Ilexoside II at 0.5 mg/mL

and MSF……………………………………………………………………………….

151

Figura A5.2 – LC-UV chromatograms of alpha-hederin and quinovic derivatives

fraction……………………………………………

………………………...…………

152

Figura A.5.3 – Total IgG antibody using indirect ELISA…………………………... 153

Figura A5.4 – IgG1 antibody titres using indirect ELISA…………...………... 154

Figura A5.5 – IgG2A antibody titres using indirect ELISA.............................. 155

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1 – Condições cromatográficas para quantificação de saponinas

por CLAE-UV…………………………………..………………………… 20

Tabela 2.1 – Linear regression analysis, detection and quantification

limits

limits for ilexoside II and EX40…………………………………………... 51

Tabela 3.1 – Susceptibility of Trichomonas vaginalis after exposure to

MSF

MSF and reference substances……………………………………………..

Tabela 4.1 – Conductivity and pH values for MSF and Quillaja………….

Tabela 4.2 – Linear regressions and determination coefficients for the

solubilisation

solubilisation of model drugs by MSF and Quillaja………………………. 99

Tabela A2.1 – Pressão de superfície na CMC (π

CMC

), concentração

superfca

superficial de excesso (Γ) e área por molécula na interface (A)................... 132

LISTA DE ABREVIATURAS

CMC Critical Micellar Concentration

Concentração Micelar Crítica

CRYO-TEM Cryogenic Transmission Electron Microscopy

Microscopia eletrônica de transmissão em condições criogênicas

EX40 Lyophilized total extract from mate fruits

Extrato bruto liofizado obtido a partir dos frutos de mate

G’ Storage modulus

Módulo elástico

G’’ Loss modulus

Módulo viscoso

MSF Mate saponin enriched fraction

Fração enriquecida em saponinas de mate

MTZ Metronidazole

Metronidazol

PAN 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol

1-(2-piridilazo)-2-naftol

SANS Small Angle Neutron Scattering

Espalhamento de nêutrons a baixo ângulo

TEM Transmission Electron Microscopy

Microscopia eletrônica de transmissão

SUMÁRIO

Introdução Geral.................................................................................................. 1

CAPÍTULO 1: Revisão da Literatura.................................................................. 9

1.1 Ilex paraguariensis A. St. Hil. e saponinas................................................... 11

1.2 Métodos de obtenção de frações saponosídicas............................................

........................

1.3 Métodos de quantificação de saponinas........................................................

1.4 Propriedades tensoativas e de micelização ................................................... 20

1.5 Citotoxicidade................................................................................................

1.6 Atividades Biológicas....................................................................................

CAPÍTULO 2: Método analítico e obtenção da fração saponosídica................. 37

Introdução............................................................................................................ 39

PUBLICAÇÃO: Saponins from Ilex paraguariensis A. St. Hil.: LC-UV and

and haemolytic activity........................................................................................

CAPÍTULO 3: Avaliação biológica.................................................................... 59

Introdução............................................................................................................ 61

PUBLICAÇÃO: Anti-trichomonas vaginalis activity of Ilex paraguariensis

(mate

(mate) fruits......................................................................................................... 63

CAPÍTULO 4: Caracterização físico-química da fração de saponinas............... 77

Introdução............................................................................................................ 79

PUBLICAÇÃO: Micellar aggregates from Ilex paraguariensis fruits (mate)… 81

CAPÍTULO 5: Discussão Geral e Conclusão......................................................

107

ANEXO I Caracterização da droga vegetal e obtenção da solução extrativa......

121

ANEXO II Perfil de tensão superficial da fração enriquecida em saponinas......

129

ANEXO III Determinação dos módulos viscoso e elástico por reologia

dinâmica

dinâmica...............................................................................................................

133

ANEXO IV Parecer do Comitê de ética em Pesquisa......................................... 139

ANEXO V Artigo: avaliação da atividade imunoadjuvante da fração

enriquecida

saponosídica de mate........................................................................................... 143

Biografia.............................................................................................................. 162

INTRODUÇÃO

Saponinas são substâncias anfifílicas constituídas por um núcleo hidrofóbico,

triterpênico ou esteróide, ligado a uma ou mais cadeias de açúcares e apresentam

diversas atividades biológicas e usos tecnológicos (Francis et al., 2002).

A principal fonte de obtenção destes compostos são espécies vegetais superiores,

dentre as quais se destacam Panax ginseng, Gypsophila sp e Bupleurum falcatum, as

quais ocorrem na Ásia e Europa e, em especial, Quillaja saponaria, espécie

encontrada no continente sul-americano (Peru, Chile e Bolívia). Contudo, nenhuma

destas possui ocorrência natural no Brasil (Francis et al., 2002; Pavei, 2004).

Ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate) é uma espécie amplamente cultivada na

região sul do Brasil e que se caracteriza pelo elevado teor de saponinas em suas folhas

e, principalmente, nos frutos verdes (Kraemer, 1997; Athayde et al., 2000; Taketa et

al., 2004b; Pavei et al., 2007).

No Brasil, a erva-mate é reconhecidamente um dos principais produtos dentre a

produção vegetal e silvicultura, com produção estimada em cerca de 230 mil toneladas

em 2002 (IBGE, 2003).

Todo esse montante está relacionado estritamente ao comércio das folhas, sendo

os frutos subproduto do processamento da erva-mate e, portanto, desprovidos de valor

comercial. Considerando o maior acúmulo de saponinas no fruto em relação ao outros

órgãos, estes constituem uma fonte de matéria-prima abundante e ainda não explorada

para obtenção de saponinas (Alves et al., 2001; Heinrichs; Malavolta, 2001).

Uma consulta aos principais escritórios de patentes (US Patent Office, World

Intellectual Property Organization, European Patent Office, IK Patent Office,

Japanese Patent Office) gerou cerca de 10.000 resultados para a palavra-chave

saponinas. Nesses, incluem-se aspectos que abrangem desde a obtenção de frações

enriquecidas até uma vasta gama de aplicações, com destaque para o uso de saponinas

como imunoadjuvante na formulação de vacinas. Outras aplicações incluem atividades

biológicas como antiviral, anticâncer e antiprotozoários. Também são citadas

aplicações tecnológicas como agente promotor de absorção, agente espumante, agente

emulsificante e detergente. Quillaja saponaria e Panax ginseng são as principais

espécies encontradas nas citações (Base de dados Scopus, consulta em 12/11/2009).

Uma consulta à mesma base de dados com o termo Ilex paraguariensis resulta em 130

patentes. Entretanto, quando cruzados os termos Ilex paraguariensis e saponinas, este

número se reduz a 10, sendo que nenhuma explicita alguma aplicação tecnológica ou

biológica direta.

Dessa maneira, constata-se um amplo espaço para investigações no tocante às

saponinas de mate, tanto do ponto de vista acadêmico tanto com vistas ao

desenvolvimento de produtos. Nesse contexto este trabalho teve por objetivo geral a

avaliação de propriedades físico-químicas e biológicas de uma fração de saponinas

enriquecida, obtida a partir dos frutos verdes de mate, visando fornecer subsídios para

sua utilização. Para tal, foram realizadas as seguintes etapas:

 Desenvolvimento e validação de método analítico por CLAE-UV utilizando

Ilexosídeo II como marcador químico para a quantificação de saponinas totais e

monitoramento do processo de fracionamento e purificação;

 Adaptação e avaliação da reprodutibilidade do processo de fracionamento de

saponinas de Ilex paraguariensis desenvolvido por Pavei (2004);

 Avaliação da citotoxicidade in vitro da fração saponosídica sobre linhagem de

células de mamíferos;

 Avaliação do perfil hemolítico in vitro;

 Avaliação da atividade tricomonicida in vitro;

 Avaliação do potencial como imunoadjuvante em vacinas utilizando modelo in

vivo;

 Estudo físico-químico da fração saponosídica com ênfase nas estruturas

micelares e na capacidade de solubilização micelar de compostos hidrofóbicos;

As etapas do trabalho são ilustradas no esquema a seguir.

Avaliação toxicológica e biológica

Citotoxicidade in vitro

Atividade tricomonicida

Atividade imunoadjuvante

Atividade hemolítica

Caracterização físico-química

Caracterização da droga-vegetal

Obtenção da fração

saponinas

enriquecida

Obtenção do extrato hidroalcoólico

Método Analítico: LC-UV / LC-MS

Desenvolvimento e validação

Determinação da CMC*

MET

**/ Crio

MET

Espalhamento de nêutrons

Ensaio de reologia dinâmica

Solubilização micelar

Figura 1. Esquema representativo da tese

* Concentração micelar crítica

**Microscopia eletrônica de transmissão

Para fins de sua apresentação, o trabalho foi dividido em cinco capítulos, sendo eles:

I. Revisão da literatura;

II. Desenvolvimento de metodologia analítica, obtenção da fração

saponosídica e avaliação da atividade hemolítica;

III. Avaliação da atividade tricomonicida e citotoxicidade sobre

linhagem de células de mamíferos;

IV. Caracterização físico-química das micelas;

V. Discussão Geral e Conclusão

ANEXOS:

I. Caracterização da droga vegetal e obtenção da solução extrativa

II. Perfil de tensão superficial da fração saponosídica

III. Determinação dos módulos viscoso e elástico a partir do ensaio de

reologia dinâmica

IV. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa

V. Artifo: Avaliação da atividade imunoaddjuvante

Referências

Alves, L. F. A.; Santana, D. L. Q.; Brancalhão, R. M. C. Ocorrência de Perigonia lusca

(Fabr.) em erva-mate (Ilex paraguariensis) no Brasil. Neotropical Entomology, v.30,

p.339-340, 2001.

Athayde, M. L.; Coelho, G. C.; Schenkel, E. P. Caffeine and theobromine in

epicuticular wax of Ilex paraguariensis A. St.-Hil. Phytochemistry, v.55, n.7, p.853-

857, 2000.

Francis, G.; Kerem, Z.; Makkar, H. P. S.; Becker, K. The biological action of saponins

in animal systems: A review. British Journal of Nutrition, v.88, n.6, p.587-605,

2002.

Heinrichs, R.; Malavolta, E. Composição mineral do produto comercial da erva-mate

(Ilex paraguariensis St. Hil.). Ciência Rural, v.31, p.781-785, 2001.

IBGE. Produção em Comunicação Social: Produção da Extração Vegetal e da

Silvicultura. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IBGE, v.27 de

novembro, 2003.

Kraemer, K. H. Ilex paraguariensis St-Hil (erva-mate): distribuição de saponinas e

estudos iniciais em culturas de células em suspensão Porto Alegre: Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, 1997. 169 p. Tese (Doutorado em Farmácia).

Pavei, C. Desenvolvimento de métodos analíticos e tecnológicos aplicados à fração

saponosídica presente nos frutos de Ilex paraguariensis A. St. Hil. Porto Alegre:

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2004. 134 p. Dissertação (Mestrado em

Farmácia).

Pavei, C.; Guzatto, P.; Ros Petrovick, P.; Gosmann, G.; González-Ortega, G.

Development and validation of an HPLC method for the characterization and assay of

the saponins from Ilex paraguariensis A. St.-Hil (mate) fruits. Journal of Liquid

Chromatography and Related Technologies, v.30, n.1, p.87-95, 2007.

CAPÍTULO 1

REVISÃO DA LITERATURA

1. REVISÃO DA LITERATURA

1.1 Ilex paraguariensis A. St. Hil. e saponinas

As saponinas constituem uma classe química bastante heterogênea, cujo nome

deriva de sua propriedade de formação de espuma em solução aquosa (Milgate;

Roberts, 1995). Estão amplamente distribuídas em diversas espécies vegetais

abrangendo aproximadamente 100 famílias (Oleszek, 2002) e alguns gêneros de

esponjas marinhas. Quimicamente são constituídas por uma porção hidrofóbica

triterpênica ou esteróide ligada a uma ou mais cadeias de açúcares, em geral, glicose,

galactose, ácido glicurônico, xilose ou metilpentose (Francis et al., 2002) cuja massa

molecular pode variar entre 600 e 2000 Da, aproximadamente (Oleszek, 2002;

Schenkel et al., 2003).

As saponinas mais comumente encontradas na natureza são as triterpênicas com

agliconas de 30 átomos de carbono. No caso das saponinas triterpênicas, mais de 50%

apresentam o núcleo hidrofóbico do tipo oleano (Hiller, 1987).

Além da classificação relacionada ao núcleo fundamental triterpênico ou

esteróide, as saponinas podem ser subdivididas em função do número de cadeias de

açúcares ligados. Aquelas que apresentam uma única cadeia de açúcar ligado à

aglicona, em geral via ligação éter na posição C3, são denominadas

monodesmosídicas. Quando apresentam duas ou três cadeias de açúcares são

classificadas como bidesmosídicas ou tridesmosídicas, respectivamente (Hiller, 1987;

Schenkel et al., 2003).

Ilex paraguariensis, popularmente conhecida como mate, é uma espécie

endêmica em alguns países sul-americanos para a qual é relatado um significativo teor

de saponinas (Cardoso; George-Kraemer, 2008). A Argentina é atualmente o principal

produtor mundial seguida pelo Brasil e Paraguai. A produção mundial estimada no ano

de 2002 foi de cerca de 900.000 toneladas abrangendo uma área próxima a 3000

quilômetros quadradros (Heck; Mejia, 2007).

No caso específico do Brasil, o cultivo de mate envolve cerca de 180.000

propriedades rurais. Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - IBGE,

em 1998, a produção brasileira foi de 325 mil toneladas de erva, estando concentrada

nos Estados do Paraná (49,4%) seguido de Rio Grande do Sul (28,1%), Santa Catarina

(21,4%) e Mato Grosso do Sul com 1,1% da produção. Além do grande número de

agricultores, cerca de 750 empresas estão envolvidas no processamento da erva-mate

(Medrado, 2005).

Os constituintes químicos que ao longo da história do consumo e pesquisa de

mate têm despertado maior interesse são os polifenóis e metilxantinas (Schubert et al.,

2006; Gnoatto et al., 2007; Heck; Mejia, 2007).

Os estudos fitoquímicos com as saponinas de Ilex paraguariensis no País se

iniciaram no PPGCF-UFRGS no final da década de 80, sendo os frutos apenas mais

recentemente avaliados como uma matéria-prima de interesse (Gosmann et al., 1989;

Kraemer, 1997; Athayde et al., 2000).

O primeiro relato da ocorrência de saponinas e a constatação de um maior

acúmulo nos frutos verdes deram-se com o trabalho de Kraemer (1997). Este dado foi

posteriormente confirmado por Athayde (2000) e Pavei (2004).

No tocante à química de saponinas encontradas na folhas de mate, há relatos da

presença concomitante de saponinas mono e bidesmosídicas, derivadas principalmente

dos ácidos ursólico e oleanólico (Gnoatto et al., 2005). No caso dos frutos, foram

identificadas algumas sapogeninas e saponinas distintas daquelas encontradas nas

folhas (Figura 1). As saponinas encontradas nos frutos apresentam em adição aos

núcleos acima citados, os derivados dos ácidos rotúndico e pomólico (Taketa et al.,

2004a). Matessaponinas 2, 3, J1, J3, J4, descritas para as folhas, não foram

encontradas nos frutos (Pavei et al., 2007).

R1 R2 R3 R4

αα

α-L-Ara1





CH2OH HO H

αα

α-L-Ara1





CH3 HO

ββ

β-D-Glc1





ββ

β-D-Glc1



3α

αα

α-L-

Ara1





CH3 HO

ββ

β-D-Glc1





Figura 1. Saponinas isoladas dos frutos de Ilex paraguariensis. Fonte: (Taketa et

al., 2004a), com modificações.

O quadro a seguir ilustra alguns dos principais trabalhos sobre mate

realizados no período de 1989 a 2007.

Autores: A: (Gosmann, 1989); B: (Montanha, 1990); C; (Kraemer, 1997); D: (Athayde et al., 2000); E: (Coelho, 2002); F: (Campos, 1996); G: (Gnoatto,

2002); H: (Pavei, 2004); I: (Canto, 2007); J: (Silva, 2007).

ANALÍTICO

•

Quantificação de saponinas (agliconas) via hidrólise Folhas

(G)

• Quantificação de saponinas polares Frutos (H)

• Quantificação da fração de polifenóis de mate Folhas (J)

•

Influência do método de secagem da erva sobre teor de

polifenóis e metilxantinas (F) Folhas

• Secagem de extratos por nebulização (F e G) Folhas

• Comparação da distribuição de saponinas em frutos verdes e

maduros, raízes, ramos e folhas (C)

• Influência do método de extração sobre o perfil de

metilxantinas Folhas (G)

• Método de fracionamento de saponinas Frutos (H)

• Potencial espumógeno de saponinas, caracterização físico-

química Frutos (I)

TECNOLÓGICO

•

Identificação das matesaponinas 1 a 4 Folhas (A)

• Identificação das saponinas J1, J2, J3a, J3b, J4 Folhas (B)

• Identificação da saponina G5 (C) Folhas

• Variação intra e inter-populacional de metilxantinas e

saponinas Folhas (D)

• Variação dos teores de metilxantinas sob diferentes formas

de cultivo e variação intra-populacional do perfil de

saponinas Folhas (E)

AGRONÔMICO/QUÍMICO

•

Atividade anti-edematogênica (+), antialgica (+),

antibacteriana (-) e antifúngica (-) de saponinas de mate

Folhas (B)

• Atividade antioxidante de extratos de mate Folhas (J)

• Avaliação da produção de saponinas em culturas de células

(C)

• Avaliação da irritação dérmica de fração de saponinas

enriquecida Frutos (I)

BIO/TOXICOLÓGICO

Quadro 1. Trabalhos acerca da espécie Ilex paraguariensis realizados no PGGCF-UFRGS

Nota-se, portanto, o desenvolvimento de estudos nas diversas áreas necessárias à

caracterização e desenvolvimento de aplicações para matérias-primas vegetais, os

quais, no entanto, estão concentrados nas folhas de mate.

Especificamente no Laboratório de Desenvolvimento Galênico desta Faculdade

foram realizados os trabalhos pioneiros direcionados à obtenção de uma fração

enriquecida em saponinas a partir dos frutos verdes. O método de fracionamento foi

originalmente desenvolvido por Pavei (2004) mediante aplicação de extração em fase

sólida, sendo submetido à patente no ano seguinte (INPI 0501510-3 de 12/02/2006).

Neste mesmo trabalho foram desenvolvidos métodos para quantificação das saponinas

por CLAE-UV, tendo como enfoque as saponinas mais polares de mate.

Em um trabalho posterior, Canto (2007) avaliou a potencialidade desta fração

como adjuvante espumógeno, tendo obtido resultados bastante significativos quando

comparados aos tensoativos sintéticos. Adicionalmente foi avaliado o potencial de

irritação cutânea utilizando coelhos como modelo, não tendo sido detectada irritação

significativa. Tal observação torna esta fração um objeto de estudo ainda mais

interessante quanto comparada a frações de saponinas obtidas de outras espécies

vegetais, frequentemente hemolíticas e irritantes (Francis et al., 2002). Na tentativa de

entender fenômenos relativos à formação e estabilidade da espuma, nesse trabalho

deu-se início à avaliação físico-química das micelas formadas, tendo sido detectados

valores de tamanho de micelas significativamente superiores aos já relatados na

literatura para saponinas. Este dado, particularmente, instigou-nos no sentido de iniciar

uma melhor caracterização destas micelas e do comportamento físico-químico das

saponinas de mate.

1.2 Métodos de obtenção de frações enriquecidas em saponinas

A obtenção de frações enriquecidas a partir de plantas medicinais tem se tornado

uma estratégia interessante e de certa forma uma nova maneira de olhar para os

produtos provenientes de plantas, em função de algumas vantagens interessantes, tanto

sob o ponto de vista químico como biológico. Dentre elas tem-se o aumento da

concentração da classe de interesse com a conseqüente retirada de interferentes e

compostos de atividade antagônica, maior constância biológica, facilidade de

monitoramento químico e, conseqüentemente, um maior valor agregado.

O fracionamento líquido-líquido é um das técnicas mais empregadas para a

obtenção de saponinas isoladas ou mesmo sob a forma de misturas. O processo

consiste em extrações subseqüentes mediante uso de solventes apolares, como éter ou

hexano, seguidas de partição com n-butanol/água (Soetan et al., 2006; Güçlü-

Ustundag; Mazza, 2007). No entanto, esta técnica apresenta como desvantagens a

potencial perda de compostos mais polares e, ainda, a possibilidade da permanência

residual de solventes na fração de saponinas. Embora o fracionamento em fase líquida

ainda seja aplicado no isolamento visando a identificação de saponinas, ou para

posterior avaliação biológica (Atta Ur et al., 2008a; Atta Ur et al., 2008b; Dini et al.,

2009), outras técnicas apresentam-se viáveis, dentre elas, a utilização de cromatografia

líquida preparativa e o fracionamento em fase sólida.

Muitos dos trabalhos em pequena escala aplicam a extração em fase sólida

visando diminuir o número de compostos interferentes na quantificação analítica,

utilizado cartuchos preenchidos com resina (Nord; Kenne, 1999; Theunis et al., 2007;

Lin; Yang, 2008). Outros trabalhos fazem uso de colunas abertas, visando obter

maiores quantidades de material. Nesse caso, vários tipos de resina têm sido propostas,

dentre elas silica gel, silica C18 e resinas poliaromáticas. Resinas poliaromáticas

macroporosas como Diaion HP-20, D101 ou equivalentes são empregadas em diversos

trabalhos, sendo compostas por copolímeros de poliestireno e divinilbenzeno,

utilizando como solvente de eluição gradientes decrescentes de polaridade compostos

por água e metanol/etanol (Park et al., 2005; Kim et al., 2008). Esta última estratégia

foi empregada no presente trabalho.

1.3 Métodos de quantificação de saponinas

A análise quali e quantitativa de saponinas teve início com métodos

gravimétricos, biológicos e espectrofotométricos, chegando aos métodos

cromatográficos, dentre os quais se incluem CCD e CLAE acoplada a diversos tipos de

detectores, como UV, arranjo de diodos, espectrômetro de massa e detector por

espalhamento de luz evaporativo. Dentre eles, CLAE é o método mais aplicado à

detecção de saponinas e agliconas (Oleszek, 2002). A ausência de grupos cromóforos

com absorção acima de 205-210 nm tem levado a um incremento na utilização dos

detectores de massa e, mais recentemente, do detector por espalhamento de luz.

Entretanto, a detecção em UV continua sendo factível e amplamente utilizada na rotina

analítica em função da maior disponibilidade de equipamentos (Hubert et al., 2005). A

tabela 1 exemplifica condições empregadas na detecção de saponinas por CLAE

acoplada ao detector UV.

Os trabalhos demonstram grande variabilidade tanto no tipo de coluna como nas

fases móveis selecionadas, que vão desde pH ácido, mediante uso de ácido fórmico e

ácido trifluoroacético, até o uso de tampões para condições de pH mais elevados. O

tempo de corrida também é bastante variável, incluindo valores de 30 a 85 minutos.

No tocante à avaliação de saponinas de Ilex paraguariensis por CLAE, existem

dois trabalhos já publicados, ambos empregando detecção em UV. O primeiro deles

foi desenvolvido para extratos das folhas, mediante hidrólise, utilizando ácido

oleanólico como padrão (Gnoatto et al., 2005). Para os frutos, foi desenvolvido e

validado um método com eluição isocrática tendo como padrão a matesaponina 3

(Pavei et al., 2007). O segundo método teve enfoque nas saponinas mais polares de

mate, o que pode ter levado a uma subestimação do teor de saponinas totais nos frutos.

Tabela 1- Exemplo de condições cromatográficas empregadas na quantificação

de saponinas por CLAE-UV.

Autores Espécie Condições cromatográficas

Theunis

(2007)

Maesa lanceolata

Coluna: C18 (250 × 3,2 mm, 5 µm);

detecção em 210 nm, fluxo 0,5 mL/min; volume

de injeção 20 µL, Eluição em gradiente - Ácido

fórmico 0,05%; acetonitrila/ácido fórmico 0,05%,

Tempo de corrida: 55 min.

Jin (2007)

Radix Astragali

Coluna: Fenil-hexila: (150 mm x 4,6 mm, 5

µm,), Temperatura: 30 °C, detecção em 230 nm,

fluxo 1,0 mL/min, Eluição em gradiente – água;

acetonitrila/água 80:20, Tempo de corrida: 35 min.

Li (2005)

Panax notoginseng

Coluna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm,),

detecção em 203 nm, fluxo 0,8 mL/min, volume

de injeção: 5 µL, Eluição em gradiente –

acetonitrila; ácido Fórmico 0,001%, Tempo de

corrida: 30 min.

Hubert

(2005)

Glycine max Coluna: C18 (250 mm× 4.6 mm, 5 µm),

Temperatura 30 °C, detecção em 205 nm, fluxo: 1

ml/min,volume de injeção: 50µL Eluição em

gradiente – ácido trifluoroacético 0,05%,

acetonitrila, Tempo de corrida 40 min.

Zhu (2004)

Panax spp

Coluna: ODS-AQ303 (250 mm× 4,6 mm, 5

µm), Temperatura: 40 °C, detecção em 196 nm,

fluxo: 1mL/min, Eluição em gradiente: Tampão

fosfato de potássio 10 mM; acetonitrila, Tempo de

corrida: 85 min.

1.4 Propriedades tensoativas e micelização

O termo tensoativo é empregado para substâncias que apresentam atividade de

superfície, ou seja, que são capazes de interferir nas interfaces sólido-líquido, sólido-

gás e líquido-gás (Zhang; Somasundaran, 2006a; Zhang; Somasundaran, 2006b).

A adsorção de tensoativos nas interfaces modifica drasticamente propriedades

como hidrofobia, carga de superfície e propriedades diretamente relacionadas a

floculação/dispersão, flotação, molhabilidade, emulsificação, entre outras. Os

tensoativos possuem também a tendência de formar agregados micelares, quando

acima da concentração micelar crítica (CMC).

As saponinas de Ilex paraguariensis são tipicamente anfifílicas e possuem como

porção hidrofóbica núcleos triterpênicos como porção hidrofóbica, que são mais

rígidos e volumosos quando comparados aos tensoativos convencionais dotados de

cadeias alquílicas. As cadeias rígidas apresentam comportamento diferenciado quanto

à natureza de suas interações, tamanho, forma e estrutura dos agregados micelares

(Mitra; Dungan, 2000). Dessa forma, muitas das informações disponíveis sobre a

formação de micelas de tensoativos convencionais não podem ser diretamente

extrapoladas para estes tipos de compostos (Mitra; Dungan, 2000), sendo necessários

estudos físico-químicos para cada tipo de saponina ou fração enriquecida. A maior

parte dos estudos físico-químicos relatados se concentram nas saponinas de Quillaja

saponaria, sendo descritos dados de concentração micelar crítica, tamanho das micelas

e variação de ambas propriedades em função de modificações no meio, como variação

de pH, adição de eletrólitos e temperatura. Para quillaia, foram observada micelas de

cerca de 3 nanômetros de raio e valores de CMC variando entre 0,51 e 0,72 g/L (Mitra;

Dungan, 1997). Variações na estrutura, micelar, a exemplo da formação de micelas

alongadas (wormlike) só foram observadas após adição de outros elementos como

colesterol e fosfolipídeos (Demana et al., 2005; Myschik et al., 2006; Pham et al.,

2006). Para os demais trabalhos, que contemplam saponinas de Panax notoginseng,

Glycine max, Sapindus mukorossi e Gleditsia sinensis, apenas foram encontrados

dados a respeito dos valores de CMC e, em poucos casos, de tamanho micelar (Wang

et al., 2005; Balakrishnan et al., 2006; Decroos et al., 2006; Xiong et al., 2008).

Xiong e col. (2008) avaliaram a influência da concentração de uma mistura de

saponinas obtidas de Panax notoginseng sobre o tamanho das micelas formadas,

utilizando espalhamento de luz. As micelas sofreram um incremento linear em seu

tamanho, variando de 11 a 40 nm na faixa de 120 a 600 g/L. O valor de CMC da

mistura foi determinado em 0,339 g/L.

Já Decroos e col. (2006) avaliaram individualmente saponinas isoladas de soja e

seus valores de CMC. O enfoque no isolamento das saponinas foi justificado pela

grande variabilidade de sua composição química, que inclui além de saponinas mono e

bidesmosídicas, a possiblidade de acetilação e da ocorrência de um grupamento 2,3-

diidro-2,5-diidroxi-6-metil-4H-piran-4-ona (DDMP) conjugado, os quais conferem

maior hidrofobia às mesmas. Os valores de CMC variaram entre 0,56 e 3,2 g/L. Foram

observados ainda, menores valores de CMC para as saponinas monodesmosídicas em

relação as bidesmosídicas.

Para uma mistura de saponinas de Sapindus mukorossi, o valor de CMC de 0,45

g/L foi determinado por condutivimetria, sendo o tamanho micelar independente da

concentração (Balakrishnan et al., 2006).

Para a mistura de saponinas de mate, Canto (2007) determinou por espalhamento

de luz dinâmico um valor de diâmetro efetivo em torno de 170 nm, para a faixa de 0,3

a 12,5 g/L, sem uma alteração significativa em função da concentração. Embora sejam

escassos os dados na literatura, este valor é bastante superior aos já relatados.

1.5 Citotoxicidade

Por serem moléculas anfifílicas, os tensoativos são capazes de interagir em maior

ou menor grau com membranas biológicas, determinando assim várias das atividades

biológicas que lhes são atribuídas, entre elas, citotoxicidade e hemólise.

Grande parte dos estudos sobre citotoxicidade de saponinas tem utilizado

linhagens tumorais, visando o tratamento de vários tipos de câncer (Xiao et al., 2007;

Kim et al., 2008; Niu et al., 2008). Um menor número de trabalhos enfoca a

citotoxicidade como um efeito indesejável sobre as células do hospedeiro, quando da

utilização de saponinas frente a microorganismos ou ainda como adjuvantes em

formulações (Maes et al., 2004; Tiwari et al., 2008). O mecanismo responsável por

essas atividades tem sido associado à interação das saponinas com esteróis da

membrana celular, em especial o colesterol (Cheeke, 2000; Ikbal et al., 2007),

provocando citotoxicidade inespecífica, via necrose celular (Mimaki et al., 2001).

Também há relatos acerca da interferência das saponinas sobre as proteínas

transmembrânicas e do citoesqueleto celular (Chwalek et al., 2006) e, ainda, via

mecanismos apoptóticos (Hsu et al., 2000; Zhu et al., 2004; Choi et al., 2005), o que

denota a complexidade dessas interações.

Os estudos para estabelecer relações estrutura-atividade têm sido limitados pela

dificuldade de isolar ou sintetizar compostos análogos em quantidade necessária e pela

ampla diversidade estrutural desta classe de substâncias (Williams; Gong, 2007).

Kuljanabhagavad e col. (2008) avaliaram a citotoxicidade de saponinas

triterpênicas obtidas de diferentes partes da espécie Chenopodium quinoa Willd e

observaram uma maior atividade para as saponinas monodesmosídicas, onde a

presença de ácido carboxílico em C-28 mostrou ter importância significativa. As

saponinas bidesmosídicas apresentaram citotoxicidade moderada ou nula, exceto

quando determinados grupos funcionais estão ligados à aglicona, como acila e aldeído.

Nesse sentido, o padrão de fatores estruturais determinantes da citotoxicidade guarda

certa analogia com aqueles observados para a atividade hemolítica (Oda et al., 2000;

Voutquenne et al., 2002).

Para a atividade hemolítica, dentre as saponinas triterpênicas, as

monodesmosídicas têm se mostrado mais ativas que as bidesmosídicas (Oda e col.,

2000). Contudo há exceções notáveis à regra. Algumas saponinas derivadas da

hederagenina e os sojassapogenóis, embora monodesmosídicas, apresentam atividade

hemolítica virtualmente nula. Analisando a relação estrutura-atividade de 59 saponinas

triterpênicas com diferentes agliconas, Voutquenne e col. (2002) determinaram que

para as saponinas monodesmosídicas, substituições na aglicona contribuem fortemente

para atividade. Para as saponinas bidesmosídicas, ramificações na cadeia de açúcar,

assim como um balanço de polaridade das duas cadeias de açúcares parecem ser

significativos.

Chwalek (2006) analisaram a relação das atividades hemolítica e citotóxica de

saponinas derivadas do núcleo hederagenina sem chegar a evidenciar uma correlação

definida.

As saponinas isoladas de folhas e frutos de Ilex paraguariensis (mate) são

majoritariamente derivados triterpênicos dos ácidos ursólico e oleanólico, na maioria

bidesmosídicas (Gosmann et al., 1989; Taketa et al., 2004b) Nos frutos foram

identificadas as saponinas bidesmosídicas ilexosídeo II e ziyu-glicosídeo I e a

saponina monodesmosídica matesídeo.

Existem poucos trabalhos relativos à avaliação da toxicidade de mate.

Provavelmente, o motivo disso esteja associado ao consumo difundido e tradicional de

bebidas preparadas a partir desta espécie, mas que não reflete necessariamente a forma

de utilização e as concentrações, por exemplo, em formulações cosméticas e

farmacêuticas.

Os trabalhos de avaliação de toxicidade relatados concentram-se na avaliação de

efeitos mutagênicos/genotóxicos. Leitão e Braga (1994) detectaram a ocorrência de

atividade mutagênica no teste de AMES, sobre células bacterianas e atividade

genotóxica de extratos obtidos a partir das folhas. Outro trabalho avaliou a ocorrência

de efeitos mutagênicos, genotóxicos e clastogênicos sobre bactérias, culturas de

linfócitos e células de mamíferos, de uma infusão de folhas de mate, representando o

consumo usual pela população. Os resultados demonstraram efeitos genotóxicos sobre

bactérias, alterações cromossomais em linfócitos e ausência de clastogenicidade in

vivo (Fonseca et al., 2000). Alves e col. (2008) determinaram a ausência de efeitos

aneugênicos e clastogênicos sobre culturas de células de linfócitos.

No teste de Draize para potencial irritação tópica, uma fração de saponinas

enriquecida não mostrou efeito significativo (Canto, 2007).

Não foram localizados trabalhos relacionados à avaliação da citotoxicidade in

vitro utilizando cultura de células para Ilex paraguariensis. No tocante à atividade

hemolítica, existe apenas um trabalho que relata a ausência de efeito hemolítico para

uma fração de saponinas obtida a partir das folhas, mediante emprego de metodologia

clássica de fracionamento (Gosmann et al., 1989). Não foram encontrados relatos

acerca da atividade hemolítica de saponinas dos frutos de mate.

Adicionalmente, alguns dos estudos realizados focam a relação entre as

atividades hemolítica e imunoadjuvante (Kenji et al., 2000; Liu et al., 2002;

Voutquenne et al., 2002; Oda et al., 2003; Sun et al., 2006).

1.6 Atividades biológicas

Embora o papel fisiológico das saponinas nos vegetais não esteja completamente

elucidado, as mesmas são consideradas como parte integrante de seu sistema de

defesa. Diversos trabalhos têm constatado seus efeitos sobre células animais, fúngicas

e bacterianas (Francis et al., 2002).

Um amplo número de propriedades biológicas tem sido atribuído a esta classe de

substâncias em virtude de sua natureza anfifílica, suas propriedades de complexação

com esteróides, proteínas e fosfolipídeos, além das propriedades de formação de poros

em membranas celulares. Dentre elas se destacam a atividade hemolítica, ictiotóxica,

molusquicida, anti-helmíntica, hipocolesterolêmica, antiviral entre outras (Francis et

al., 2002; Schenkel et al., 2003).

Provavelmente, o maior número de trabalhos no tocante à atividade biológica de

saponinas esteja relacionado ao desenvolvimento de vacinas, tendo essas como

adjuvantes. Os trabalhos iniciais foram desenvolvidos com as saponinas de Quillaja

saponaria, sob a forma de misturas, saponinas isoladas ou de complexos

imunoestimulantes (Sjölander; Cox, 1998; Petrovsky; Aguilar, 2004). Recentemente,

diversas outras espécies com padrões estruturais distintos das saponinas de quillaia, a

exemplo das saponinas de soja, ginseng e polígala também apresentaram resultados

bastante satisfatórios (Cox; Coulter, 1999; Mimaki et al., 2001; Katselis et al., 2007;

Sun et al., 2008).

No tocante à Ilex paraguariensis, grande parte dos trabalhos relatados são

relativos à avaliação biológica de extratos obtidos a partir das folhas, tendo como

enfoque principal a atividade antioxidante (Gugliucci, 1996; Filip et al., 2000;

Schinella et al., 2000; Bastos et al., 2006; Da Silva et al., 2008; Arçari et al., 2009;

Matsumoto et al., 2009; Sugimoto et al., 2009). Outros relatos de atividade incluem

redução de inflamação aguda após exposição à fumaça de cigarro (Lanzetti et al.,

2008), efeito positivo anti-obesidade (Rossmann, 2005; Pang et al., 2008; Arçari et al.,

2009; Martins et al., 2009); vaso-relaxação e redução de colesterol e triglicerídeos,

diminuição da progressão da aterosclerose durante dieta hipercolesterolêmica (Stein et

al., 2005; Pamplona Mosimann et al., 2006), prevenção de hidrólise de nucleotídeos

associados ao desenvolvimento de doenças circulatórias (Görgen et al., 2005),

atividade antiviral in vitro (Müller et al., 2007) e atividade anti-bacteriana,

especificamente contra Propionibacterium acnes (Tsai et al., 2009).

Em relação aos frutos de mate, o único relato de avaliação de atividade biológica

foi feito por Schubert e col. (2007), no qual foi avaliada a atividade antioxidante de

extratos de diferentes polaridades obtidos a partir dos frutos verdes e a atividade

antimicrobiana de frações de saponinas enriquecidas. A atividade antioxidante dos

frutos foi inferior em relação às folhas, não sendo observada, ainda atividade frente a

fungos e bactérias modelo.

Referências

Alves, R. J. V.; Jotz, G. P.; Do Amaral, V. S.; Montes, T. M. H.; Menezes, H. S.; De

Andrade, H. H. R. The evaluation of mate: (Ilex paraguariensis) genetic toxicity in

human lymphocytes by the cytokinesis-block in the micronucleus assay. Toxicology

in Vitro, v.22, n.3, p.695-698, 2008.

Arçari, D. P.; Bartchewsky, W.; Dos Santos, T. W.; Oliveira, K. A.; Funck, A.;

Pedrazzoli, J.; De Souza, M. F. F.; Saad, M. J.; Bastos, D. H. M.; Gambero, A.;

Carvalho, P. D. O.; Ribeiro, M. L. Antiobesity effects of yerba maté extract (Ilex

paraguariensis) in high-fat diet-induced Obese Mice. Obesity, 2009.

Athayde, M. L. Metilxantinas e saponinas em quatro populações de Ilex

paraguariensis A. St. Hil.: triterpenos e saponinas em outras espécies do gênero

Ilex Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2000. 232 p. Tese

(Doutorado em Farmácia).

Athayde, M. L.; Coelho, G. C.; Schenkel, E. P. Caffeine and theobromine in

epicuticular wax of Ilex paraguariensis A. St.-Hil. Phytochemistry, v.55, n.7, p.853-

857, 2000.

Atta Ur, R.; Zareen, S.; Choudhary, M. I.; Akhtar, M. N.; Khan, S. N. alpha-

glucosidase inhibitory activity of triterpenoids from Cichorium intybus. Journal of

Natural Products, v.71, n.5, p.910-913, 2008a.

Atta Ur, R.; Zareen, S.; Choudhary, M. I.; Akhtar, M. N.; Ngounou, F. N. A

triterpenoidal saponin and sphingolipids from Pteleopsis hylodendron.

Phytochemistry, v.69, n.12, p.2400-2405, 2008b.

Balakrishnan, S.; Varughese, S.; Deshpande, A. P. Micellar characterisation of saponin

from Sapindus mukorossi. Tenside, Surfactants, Detergents, v.43, n.5, p.262-268,

2006.

Bastos, D. H. M.; Fornari, A. C.; Queiroz, Y. S.; Torres, E. A. F. S. Bioactive

compounds content of chimarrão infusions related to the moisture of yerba mate (Ilex

paraguariensis) leaves. Brazilian Archives of Biology and Technology, v.49, n.3,

p.399-404, 2006.

Campos, A. M. Desenvolvimento de extratos secos nebulizados de Ilex

paraguarienses St. Hil. aquifoliaceae (erva-mate) Porto Alegre: Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, 1996. 149 p. Dissertação (Mestrado em Farmácia).

Canto, G. S. Avaliação físico-química e tecnológica da fração saponosídica dos

frutos de Ilex paraguariensis A. St. Hil. : potencialidade como adjuvante

espumógeno. Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2007. 215 p.

Tese (Doutorado em Farmácia).

Cardoso, A. C.; George-Kraemer, J. E. Variabilidade genética em erva-mate (Ilex

paraguariensis A. St. Hilaire) em populações naturais da região noroeste do Rio

Grande do Sul. In: 54º Congresso Brasileiro de Genética, 2008, Salvador, Bahia.

Anais do 54° Congresso Brasileiro de Genética, 2008.

Cheeke, P. R. Actual and potential applications of Yucca schidigera and Quillaja

saponaria saponins in human and animal nutrition. Journal of Animal Science, v.77,

p.1-10, 2000.

Choi, Y. H.; Sertic, S.; Kim, H. K.; Wilson, E. G.; Michopoulos, F.; Lefeber, A. W.

M.; Erkelens, C.; Kricun, S. D. P.; Verpoorte, R. Classification of Ilex species based

on metabolomic fingerprinting using nuclear magnetic resonance and multivariate data

analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.53, n.4, p.1237-1245,

2005.

Chwalek, M.; Lalun, N.; Bobichon, H.; Ple, K.; Voutquenne-Nazabadioko, L.

Structure-activity relationships of some hederagenin diglycosides: Haemolysis,

cytotoxicity and apoptosis induction. Biochimica et Biophysica Acta - General

Subjects, v.1760, n.9, p.1418-1427, 2006.

Coelho, G. C. Teores de metilxantinas e saponinas e morfologia foliar de erva-

mate (Ilex paraguariensis A. St. Hil.) sob a influência de diferentes fatores

ambientais e em diferentes variedades e populações Porto Alegre: Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, 2002. 229 p. Tese (Doutorado em Farmácia).

Cox, J.; Coulter, A. Prospects for the development of new vaccine adjuvants.

BioDrugs, v.12, n.6, p.439-453, 1999.

Da Silva, E. L.; Neiva, T. J. C.; Shirai, M.; Terao, J.; Abdalla, D. S. P. Acute ingestion

of yerba mate infusion (Ilex paraguariensis) inhibits plasma and lipoprotein oxidation.

Food Research International, v.41, n.10, p.973-979, 2008.

Decroos, K.; Vincken, J. P.; Van Koningsveld, G. A.; Gruppen, H.; Verstraete, W.

Preparative chromatographic purification and surfactant properties of individual

soyasaponins from soy hypocotyls. Food Chemistry, v.101, n.1, p.324-333, 2006.

Demana, P. H.; Davies, N. M.; Hook, S.; Rades, T. Quil A-lipid powder formulations

releasing ISCOMs and related colloidal stuctures upon hydration. Journal of

Controlled Release, v.103, n.1, p.45-59, 2005.

Dini, I.; Tenore, G. C.; Dini, A. Saponins in Ipomoea batatas tubers: Isolation,

characterization, quantification and antioxidant properties. Food Chemistry, v.113,

n.2, p.411-419, 2009.

Filip, R.; Lotito, S. B.; Ferraro, G.; Fraga, C. G. Antioxidant activity of Ilex

paraguariensis and related species. Nutrition Research, v.20, n.10, p.1437-1446,

2000.

Fonseca, C. A. S.; Otto, S. S.; Paumgartten, F. J. R.; Leitão, A. C. Nontoxic,

mutagenic, and clastogenic activities of mate-chimarrão (Ilex paraguariensis).

Journal of Environmental Pathology, Toxicology and Oncology, v.19, n.4, p.333-

346, 2000.

Francis, G.; Kerem, Z.; Makkar, H. P. S.; Becker, K. The biological action of saponins

in animal systems: A review. British Journal of Nutrition, v.88, n.6, p.587-605,

2002.

Gnoatto, S. C. B. Metodologias analíticas para quantificação de marcadores

químicos em preparações de Ilex paraguariensis (A. St. Hil.) e desenvolvimento de

extrato seco por nebulização Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do

Sul, 2002. 122 p. Dissertação (Mestrado em Farmácia).

Gnoatto, S. C. B.; Bassani, V. L.; Coelho, G. C.; Schenkel, E. P. Influência do método

de extração nos teores de metilxantinas em erva-mate Química Nova, v.30, n.2, p.304-

307, 2007.

Gnoatto, S. C. B.; Schenkel, E. P.; Bassani, V. L. HPLC method to assay total

saponins in Ilex paraguariensis aqueous extract. Journal of the Brazilian Chemical

Society, v.16, n.4, p.723-726, 2005.

Görgen, M.; Turatti, K.; Medeiros, A. R.; Buffon, A.; Bonan, C. D.; Sarkis, J. J. F.;

Pereira, G. S. Aqueous extract of Ilex paraguariensis decreases nucleotide hydrolysis

in rat blood serum. Journal of Ethnopharmacology, v.97, n.1, p.73-77, 2005.

Gosmann, G. Saponinas de Ilex paraguariensis A. St. Hil. (erva-mate) Porto Alegre:

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1989. 108 p. Dissertação (Mestrado em

Farmácia).

Gosmann, G.; Schenkel, E. P.; Seligmann, O. A new saponin from mate, Ilex

paraguariensis. Journal of Natural Products, v.52, n.6, p.1367-1370, 1989.

Güçlü-Ustundag, O.; Mazza, G. Saponins: Properties, applications and processing.

Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v.47, n.3, p.231-258, 2007.

Gugliucci, A. Antioxidant effects of Ilex paraguariensis: Induction of decreased

oxidability of human LDL in vivo. Biochemical and Biophysical Research

Communications, v.224, n.2, p.338-344, 1996.

Heck, C. I.; Mejia, E. G. Yerba mate tea (Ilex paraguariensis): A comprehensive

review on chemistry, health implications, and technological considerations. Journal of

Food Science, v.72, n.9, p.138-151, 2007.

Hiller, K. New results on the strucuture and biological activity of triterpenoid

saponins. In: Hostettmann, K. (Org.). Biologically active natural products. Oxford:

Clarendon Press, 1987. p.167-184.

Hsu, M. J.; Cheng, J. S.; Huang, H. C. Effect of saikosaponin, a triterpene saponin, on

apoptosis in lymphocytes: Association with c-myc, p53, and bcl-2 mRNA. British

Journal of Pharmacology, v.131, n.7, p.1285-1293, 2000.

Hubert, J.; Berger, M.; Dayde, J. Use of a simplified HPLC - UV analysis for

soyasaponin B determination: Study of saponin and isoflavone variability in soybean

cultivars and soy-based health food products. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, v.53, n.10, p.3923-3930, 2005.

Ikbal, C.; Mounir, T.; Mounia, B. H. K.; Habib, B. H. M. Histological effects of

Cestrum parqui saponins on Schistocerca gregaria and Spodoptera littoralis. Journal

of Biological Sciences, v.7, n.1, p.95-101, 2007.

Jin, H. K.; Park, S. Y.; Hyun, K. L.; Ah, Y. P.; Ju, S. K.; Sam, S. K.; Youm, J. R.;

Sang, B. H. Quantitative evaluation of Radix astragali through the simultaneous

determination of bioactive isoflavonoids and saponins by HPLC/UV and LC-ESI-

MS/MS. Bulletin of the Korean Chemical Society, v.28, n.7, p.1187-1194, 2007.

Katselis, G. S.; Estrada, A.; Gorecki, D. K. J.; Barl, B. Adjuvant activities of saponins

from the root of Polygala senega L. Canadian Journal of Physiology and

Pharmacology, v.85, n.11, p.1184-1194, 2007.

Kenji, O.; Matsuda, H.; Murakami, T.; Katayama, S.; Ohgitani, T.; Yoshikawa, M.

Adjuvant and haemolytic activities of 47 saponins derived from medicinal and food

plants. Biological Chemistry, v.381, n.1, p.67-74, 2000.

Kim, J. Y.; Park, K. W.; Moon, K. D.; Lee, M. K.; Choi, J.; Yee, S. T.; Shim, K. H.;

Seo, K. I. Induction of apoptosis in HT-29 colon cancer cells by crude saponin from

Platycodi Radix. Food and Chemical Toxicology, v.46, n.12, p.3753-3758, 2008.

Kraemer, K. H. Ilex paraguariensis St-Hil (erva-mate): distribuição de saponinas e

estudos iniciais em culturas de células em suspensão. Porto Alegre: Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, 1997. 169 p. Tese (Doutorado em Farmácia).

Kuljanabhagavad, T.; Thongphasuk, P.; Chamulitrat, W.; Wink, M. Triterpene

saponins from Chenopodium quinoa Willd. Phytochemistry, v.69, n.9, p.1919-1926,

2008.

Lanzetti, M.; Bezerra, F. S.; Romana-Souza, B.; Brando-Lima, A. C.; Koatz, V. L. G.;

Porto, L. C.; Valenca, S. S. Mate tea reduced acute lung inflammation in mice exposed

to cigarette smoke. Nutrition, v.24, n.4, p.375-381, 2008.

Leitão, A. C.; Braga, R. S. Mutagenic and genotoxic effects of mate (Ilex

paraguariensis) in prokaryotic organisms. Brazilian Journal of Medical and

Biological Research, v.27, n.7, p.1517-1525, 1994.

Li, L.; Zhang, J. L.; Sheng, Y. X.; Guo, D. A.; Wang, Q.; Guo, H. Z. Simultaneous

quantification of six major active saponins of Panax notoginseng by high-performance

liquid chromatography-UV method. Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, v.38, n.1, p.45-51, 2005.

Lin, J. T.; Yang, D. J. Determination of steroidal saponins in different organs of yam

(Dioscorea pseudojaponica Yamamoto). Food Chemistry, v.108, n.3, p.1068-1074,

2008.

Liu, G.; Anderson, C.; Scaltreto, H.; Barbon, J.; Kensil, C. R. QS-21 structure/function

studies: Effect of acylation on adjuvant activity. Vaccine, v.20, n.21-22, p.2808-2815,

2002.

Maes, L.; Vanden Berghe, D.; Germonprez, N.; Quirijnen, L.; Cos, P.; De Kimpe, N.;

Van Puyvelde, L. In Vitro and In Vivo Activities of a Triterpenoid Saponin Extract

(PX-6518) from the Plant Maesa balansae against Visceral Leishmania Species.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.48, n.1, p.130-136, 2004.

Martins, F.; Noso, T. M.; Porto, V. B.; Curiel, A.; Gambero, A.; Bastos, D. H. M.;

Ribeiro, M. L.; Carvalho, P. D. O. Maté tea inhibits in vitro pancreatic lipase activity

and has hypolipidemic effect on high-fat diet-induced obese mice. Obesity, 2009.

Matsumoto, R. L. T.; Bastos, D. H. M.; Mendonça, S.; Nunes, V. S.; Bartchewsky, W.;

Ribeiro Jr, M. L.; Carvalho, P. D. O. Effects of Maté tea (Ilex paraguariensis)

ingestion on mRNA expression of antioxidant enzymes, lipid peroxidation, and total

antioxidant status in healthy young women. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, v.57, n.5, p.1775-1780, 2009.

Medrado, M. J. S. Sistemas de Produção: cultivo da erva-mate. Embrapa Florestas.

Versão Eletrônica, 2005. Disponível em <http:// sistemas deproducao .

cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Erva-mate/ Cultivo da ErvaMate / index.htm>.

Acesso em: 10/08/2009.

Milgate, J.; Roberts, D. C. K. The nutritional and biological significance of saponins.

Nutrition Research, v.15, n.8, p.1223-1249, 1995.

Mimaki, Y.; Yokosuka, A.; Kuroda, M.; Sashida, Y. Cytotoxic activities and structure-

cytotoxic relationships of steroidal saponins. Biological and Pharmaceutical

Bulletin, v.24, n.11, p.1286-1289, 2001.

Mitra, S.; Dungan, S. R. Micellar Properties of Quillaja Saponin. 1. Effects of

Temperature, Salt, and pH on Solution Properties. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, v.45, n.5, p.1587-1595, 1997.

______. Micellar properties of quillaja saponin. 2. Effect of solubilized cholesterol on

solution properties. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v.17, n.2, p.117-133,

2000.

Montanha, J. A. Estudo químico e biológico das saponinas de Ilex paraguariensis

A. St. Hil (Aquifoliaceae). Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande Sul,

1990. 92 p. Dissertação (Mestrado em Farmácia).

Müller, V.; Chavez, J. H.; Reginatto, F. H.; Zucolotto, S. M.; Niero, R.; Navarro, D.;

Yunes, R. A.; Schenkel, E. P.; Barardi, C. R. M.; Zanetti, C. R.; Simões, C. M. O.

Evaluation of antiviral activity of South American plant extracts against herpes

simplex virus type 1 and rabies virus. Phytotherapy Research, v.21, n.10, p.970-974,

2007.

Myschik, J.; Lendemans, D. G.; Mcburney, W. T.; Demana, P. H.; Hook, S.; Rades, T.

On the preparation, microscopic investigation and application of ISCOMs. Micron,

v.37, n.8, p.724-734, 2006.

Niu, Y. P.; Wu, L. M.; Jiang, Y. L.; Wang, W. X.; Li, L. D. β-Escin, a natural

triterpenoid saponin from Chinese horse chestnut seeds, depresses HL-60 human

leukaemia cell proliferation and induces apoptosis. Journal of Pharmacy and

Pharmacology, v.60, n.9, p.1213-1220, 2008.

Nord, L. I.; Kenne, L. Separation and structural analysis of saponins in a bark extract

from Quillaja saponaria Molina. Carbohydrate Research, v.320, n.1-2, p.70-81,

1999.

Oda, K.; Matsuda, H.; Murakami, T.; Katayama, S.; Ohgitani, T.; Yoshikawa, M.

Adjuvant and Haemolytic Activities of 47 Saponins Derived from Medicinal and Food

Plants. Biological Chemistry, v.381, n.1, p.67-74, 2000.

______. Relationship between adjuvant activity and amphipathic structure of

soyasaponins. Vaccine, v.21, n.17-18, p.2154-2160, 2003.

Oleszek, W. A. Chromatographic determination of plant saponins. Journal of

Chromatography A, v.967, n.1, p.147-162, 2002.

Pamplona Mosimann, A. L.; Wilhelm-Filho, D.; Da Silva, E. L. Aqueous extract of

Ilex paraguariensis attenuates the progression of atherosclerosis in cholesterol-fed

rabbits. BioFactors, v.26, n.1, p.59-70, 2006.

Pang, J.; Choi, Y.; Park, T. Ilex paraguariensis extract ameliorates obesity induced by

high-fat diet: Potential role of AMPK in the visceral adipose tissue. Archives of

Biochemistry and Biophysics, v.476, n.2, p.178-185, 2008.

Park, S. Y.; Choi, H. S.; Yook, C. S.; Nohara, T. A new lupane glycoside from the

leaves of Acanthopanax koreanum. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, v.53,

n.1, p.97-99, 2005.

Pavei, C. Desenvolvimento de métodos analíticos e tecnológicos aplicados à fração

saponosídica presente nos frutos de Ilex paraguariensis A. St. Hil. Porto Alegre:

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2004. 134 p. Dissertação (Mestrado em

Farmácia).

Pavei, C.; Guzatto, P.; Ros Petrovick, P.; Gosmann, G.; González-Ortega, G.

Development and validation of an HPLC method for the characterization and assay of

the saponins from Ilex paraguariensis A. St.-Hil (mate) fruits. Journal of Liquid

Chromatography and Related Technologies, v.30, n.1, p.87-95, 2007.

Petrovsky, N.; Aguilar, J. C. Vaccine adjuvants: Current state and future trends.

Immunology and Cell Biology, v.82, n.5, p.488-496, 2004.

Pham, H. L.; Shaw, P. N.; Davies, N. M. Preparation of immuno-stimulating

complexes (ISCOMs) by ether injection. International Journal of Pharmaceutics,

v.310, n.1-2, p.196-202, 2006.

Rossmann, J. Influencing obesity positively by an expert and modern health

management. Agro Food Industry Hi-Tech, v.16, n.5, p.XVII-XIX, 2005.

Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Athayde, M. L. Saponinas. In: Simões, C. M. D.

O.;Schenkel, E. P.;Gosmann, G.;Mello, J. C. P. D.;Mentz, L. A.;Petrovick, P. R.

(Org.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre/Florianópolis:

Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2003. p.711-740.

Schinella, G. R.; Troiani, G.; Dávila, V.; De Buschiazzo, P. M.; Tournier, H. A.

Antioxidant effects of an aqueous extract of Ilex paraguariensis. Biochemical and

Biophysical Research Communications, v.269, n.2, p.357-360, 2000.

Schubert, A.; Pereira, D. F.; Zanin, F. F.; Alves, S. H.; Beck, R. C. R.; Athayde, M. L.

Comparison of antioxidant activities and total polyphenolic and methylxanthine

contents between the unripe fruit and leaves of Ilex paraguariensis A. St. Hil.

Pharmazie, v.62, n.11, p.876-880, 2007.

Schubert, A.; Zanin, F. F.; Pereira, D. F.; Athayde, M. L. Variação anual de

metilxantinas totais em amostras de Ilex paraguariensis A. St. - Hil. (Ervamate) em Ijuí

e Santa Maria, Estado do Rio Grande do Sul. Química Nova, v.29, n.6, p.1233-1236,

2006.

Silva, F. A. Avaliação tecnológica e atividade antioxidante de produtos secos por

spray-drying de ilex paraguariensis A. St. Hil.-aquifoliaceae (erva-mate). Porto

Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2007. 212 p. Tese (Doutorado em

Farmácia).

Sjölander, A.; Cox, J. C. Uptake and adjuvant activity of orally delivered saponin and

ISCOM(TM) vaccines. Advanced Drug Delivery Reviews, v.34, n.2-3, p.321-338,

1998.

Soetan, K. O.; Oyekunle, M. A.; Aiyelaagbe, O. O.; Fafunso, M. A. Evaluation of the

antimicrobial activity of saponins extract of Sorghum Bicolor L. Moench. African

Journal of Biotechnology, v.5, n.23, p.2405-2407, 2006.

Stein, F. L. P.; Schmidt, B.; Furlong, E. B.; Soares, L. A. S.; Soares, M. C. F.; Vaz, M.

R. C.; Baisch, A. L. M. Vascular responses to extractable fractions of ilex

paraguariensis in rats fed standard and high-cholesterol diets. Biological Research for

Nursing, v.7, n.2, p.146-156, 2005.

Sugimoto, S.; Nakamura, S.; Yamamoto, S.; Yamashita, C.; Oda, Y.; Matsuda, H.;

Yoshikawa, M. Brazilian natural medicines. III1 structures of triterpene

oligoglycosides and lipase inhibitors from mate, leaves of ilex paraguariensis.

Chemical and Pharmaceutical Bulletin, v.57, n.3, p.257-261, 2009.

Sun, H. X.; Chen, Y.; Ye, Y. Ginsenoside Re and notoginsenoside R1: Immunologic

adjuvants with low haemolytic effect. Chemistry and Biodiversity, v.3, n.7, p.718-

726, 2006.

Sun, Y.; Tong, H.; Li, M.; Li, Y.; Guan, S.; Liu, J. Immunological adjuvant effect of

Japanese ginseng saponins (JGS) on specific antibody and cellular response to

ovalbumin and its haemolytic activities. Vaccine, v.26, n.47, p.5911-5917, 2008.

Taketa, A. T. C.; Breitmaier, E.; Schenkel, E. P. Triterpenes and triterpenoidal

glycosides from the fruits of Ilex paraguariensis (Mate). Journal of the Brazilian

Chemical Society, v.15, n.2, p.205-211, 2004a.

Taketa, A. T. C.; Gnoatto, S. C. B.; Gosmann, G.; Pires, V. S.; Schenkel, E. P.;

Guillaume, D. Triterpenoids from Brazilian Ilex species and their in vitro

antitrypanosomal activity. Journal of Natural Products, v.67, n.10, p.1697-1700,

2004b.

Theunis, M. H. B. L.; Foubert, K.; Pollier, J.; Gonzalez-Guzman, M.; Goossens, A.;

Vlietinck, A. J.; Pieters, L. A. C.; Apers, S. Determination of saponins in Maesa

lanceolata by LC-UV: Development and validation. Phytochemistry, v.68, n.22-24,

p.2825-2830, 2007.

Tiwari, P.; Singh, D.; Singh, M. M. Anti- Trichomonas activity of Sapindus saponins,

a candidate for development as microbicidal contraceptive. Journal of Antimicrobial

Chemotherapy, v.62, n.3, p.526-534, 2008.

Tsai, T. H.; Wu, W. H.; Tseng, J. T. P.; Tsai, P. J. In vitro antimicrobial and anti-

inflammatory effects of herbs against Propionibacterium acnes. Food Chemistry,

2009.

Voutquenne, L.; Lavaud, C.; Massiot, G.; Le Men-Olivier, L. Strucuture-activity

relathionships of haemolytic saponins. Pharmaceutical Biology, v.40, n.4, p.253-262,

2002.

Wang, Z. W.; Gu, M. Y.; Li, G. Z. Surface properties of Gleditsia saponin and

synergisms of its binary system. Journal of Dispersion Science and Technology,

v.26, n.3, p.341-347, 2005.

Williams, J. R.; Gong, H. Biological activities and syntheses of steroidal saponins: The

shark-repelling pavoninins. Lipids, v.42, n.1, p.77-86, 2007.

Xiao, J. X.; Huang, G. Q.; Zhu, C. P.; Ren, D. D.; Zhang, S. H. Morphological study

on apoptosis Hela cells induced by soyasaponins. Toxicology in Vitro, v.21, n.5,

p.820-826, 2007.

Xiong, J.; Guo, J.; Huang, L.; Meng, B.; Ping, Q. Self-micelle formation and the

incorporation of lipid in the formulation affect the intestinal absorption of Panax

notoginseng. International Journal of Pharmaceutics, v.360, n.1-2, p.191-196,

2008.

Zhang, L.; Somasundaran, P. Adsorption of mixtures of nonionic sugar-based

surfactants with other surfactants at solid/liquid interfaces. I. Adsorption of n-dodecyl-

β-d-maltoside with anionic sodium dodecyl sulfate on alumina. Journal of Colloid

and Interface Science, v.302, n.1, p.20-24, 2006a.

Zhang, R.; Somasundaran, P. Advances in adsorption of surfactants and their mixtures

at solid/solution interfaces. Advances in Colloid and Interface Science, v.123-126,

n.SPEC. ISS., p.213-229, 2006b.

Zhu, S.; Zou, K.; Cai, S.; Meselhy, M. R.; Komatsu, K. Simultaneous determination of

triterpene saponins in ginseng drugs by high-performance liquid chromatography.

Chemical and Pharmaceutical Bulletin, v.52, n.8, p.995-998, 2004.

CAPÍTULO 2

MÉTODO ANALÍTICO e OBTENÇÃO DA FRAÇÃO

SAPONOSÍDICA

Introdução

Considerando o alto teor de saponinas presente nos frutos verdes de mate e a

ausência de um método analítico capaz de detectar saponinas com uma ampla faixa

de polaridade, neste capítulo é apresentando o desenvolvimento e validação de um

método por CLAE-UV. Ilexosídeo II foi selecionado como marcador químico e sua

ocorrência no extrato bruto liofilizado foi demonstrada mediante uso de CLAE

acoplada a detector de massa (EM e EM/EM). O conteúdo de saponinas totais no

extrato foi também estimado.

A partir do extrato bruto foi obtida uma fração de saponinas enriquecida

(MSF) mediante extração em fase sólida, a qual constituiu a matéria-prima

analisada nos demais capítulos. A reprodutibilidade do método de obtenção da

fração foi avaliada por CLAE-UV.

MSF foi adicionalmente avaliada quanto ao seu potencial hemolítico, o qual

representa uma das limitações à utilização de saponinas na área farmacêutica.

Os dados são apresentados na forma de artigo, submetido ao periódico Die

Pharmazie.

Saponins from Ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate) fruits: LC-UV assay and

haemolytic activity

Maria Paula Garofo Peixoto

; Janine Treter

; Cabral Pavei

; Gustavo Luís Borré

;

Simone Gasparin Verza

; Samuel Cibulski

; Paulo Michel Roehe

; Grace Gosmann

;

Cécile Ayako Dreiss

; George González Ortega

Affiliation

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga,

2752, 90610-000, Porto Alegre, Brazil, Phone number (+55-51-33085278), Fax

number (+55-51-3308-5437).

Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor, Fepagro Saúde Animal,

Estrada Municipal do Conde, 6000, 92990-000, Eldorado do Sul, Brazil.

Pharmaceutical Science Division, King’s College London, Franklin-Wilkins

Building, 150 Stamford Street, London SE1 9NH, United Kingdom.

* Corresponding author: ortega@farmacia.ufrgs.br; phone number: +55-51-3308-

5278; fax number: +55-51-3308-5437.

Abstract

An LC-UV method was developed and validated to quantify the ilexoside II,

one of the major saponins occurring in unripe fruits of Ilex paraguariensis (mate) and

to estimate fruits total saponin content. From the green fruits, a saponin enriched

fraction (MSF) was produced by solid phase extraction with high yields and good

reproducibility. All MSF peaks detected by LC-MS spectrometry showed molecular

weights within the range of saponins. Ilexoside II and total saponin content on mate

lyophilized extract were 8.20 % (w/w) and 47.60 % (w/w) respectively. The MSF

showed low in vitro toxicity against red blood cells, affording favourable evidence

toward its potential use for biological and technological purposes.

Keywords: Ilex paraguariensis; saponins; method validation; mass pectrometry,

haemolytic activity; Aquifoliaceae

1. Introduction

Ilex paraguariensis A. St. Hil. (Aquifoliaceae) known as mate is widely

recognized in several South American countries due to the use of its leaves in the

production of stimulant tea-like beverages. The worldwide production of mate was

estimated at around 900,000 tons/year with Argentina, Paraguay and Brazil being the

main producers (Heck; Mejia, 2007). Due to its importance and increased

consumption, the species has recently been the subject of a review on its chemical and

technological properties (Heck; Mejia, 2007). However, the fruits are considered a

waste product of mate leaves industrial processing and currently have no application

(Schubert et al., 2007).

Besides methylxanthines, caffeoil-derivatives and other polyphenolics, high

saponin contents were reported in both mate leaves and green fruits (Schenkel et al.,

1997; Pavei, 2004; Taketa et al., 2004). Specifically, lower amounts of

methylxanthines and polyphenols and a higher accumulation of saponins were found

in the green fruits, making them a valuable and abundant source of saponins (Pavei et

al., 2007; Schubert et al., 2007).

Although some relevant biological properties have been previously ascribed to

mate extracts such as antiviral, anti-inflammatory, antiglycation as well as anti-

atherosclerosis activity (Gugliucci; Stahl, 1995; Lunceford; Gugliucci, 2005;

Pamplona Mosimann et al., 2006; Müller et al., 2007), most studies were mainly

focused on non-purified products derived from leaves. Instead, very little attention has

been devoted to the purification and biological evaluation of mate saponins either from

leaves or fruits (Montanha, 1990; Schubert et al., 2007).

Saponins possess a number of interesting biological activities and industrial

applications (Hiller, 1987; Milgate; Roberts, 1995; Güçlü-Ustundag; Mazza, 2007;

Heck; Mejia, 2007). In the pharmaceuticals area in particular, saponins have been

proposed as absorption enhancers, foaming agent, emulsifiers, imunoadjuvants and

imunostimulants, (Pillion et al., 1995; Benichou et al., 1999; Güçlü-Ustundag; Mazza,

2007; Guy, 2007). However the process of obtaining isolated pure compounds

generally is expensive, time-consuming, and leads to relative low yields. Conversely,

polymer solid phase extraction/purification is one of the strategies used to eliminate

low molecular weight compounds and obtain saponin fractions having different

polarity either aiming for analytical studies or biological evaluation (Nord; Kenne,

1999; Park et al., 2005; Khanna; Kannabiran, 2008; Liu et al., 2008; Dini et al., 2009).

As slight changes of chemical composition can lead to different responses in terms of

biological and toxicological features, the saponin mixture must be carefully monitored

and standardized. Analytically, saponins assay represents a hard task due the absence

of chromophore groups with absorption above 210-215 nm. Evaporative light

scattering and mass spectrometry are examples of feasible methods used for saponin

detection (Park et al., 1996; Young; Dolan, 2004; Yoo et al., 2006; Ma et al., 2008),

nevertheless the wider access to LC-UV probably makes a more sensible and

accessible approach for quality control and routine measurements.

In order to provide a background for the biological and technological

applications of mate green fruits, this study reports the development of a quantitative

method to quantify fruits total saponin content as well as ilexoside II. Ilexoside II, a

bidesmosidic saponin previously identified on mate fruits (Taketa et al., 2004), was

selected as the chemical marker of the lyophilized extract. Additionally, a saponin-

enriched fraction was extracted from mate fruits and its chemical fingerprint assessed

by LC-MS. Considering that one of the main drawbacks of in vivo application of

saponins is its high toxicity, especially to red blood cells (Qin et al., 2006; Gauthier et

al., 2009), the haemolytic activity of the mate saponin fraction was also evaluated.

2. Experimental

2.1 Plant material

Mate green fruits harvested from a selected cultivar in January 2008 were kindly

supplied by Ervateira Barão (Barão de Cotegipe, RS, Brazil). A voucher specimen was

identified for Dr. Lílian Auler Mentz from Federal University of Rio Grande do Sul

and deposited at the Herbarium under the code ICN 125105 (Porto Alegre, Brazil).

2.2 Chemicals and solvents

Acetonitrile LC-grade was purchased from Tedia (Brazil) and formic acid p.a.

from Vetec (Brazil). Ultrapure water (Milli-Q

system, Millipore, USA) was used

throughout the work. The saponins E7, E8, matesaponin-4, breviscuspisaponin-1,

ilexoside II and pedunculoside previously isolated and purified from Ilex species.

Quillaja saponin proceeded from Sigma (USA).

2.3 Plant extract and saponin fraction

Mate green fruits were manually selected, air-dried at 35°C during 72 h in a

forced ventilation oven (Memmert, Germany) and grounded in a cutter mill (Retsch

SK1, Germany). A 100 g- sample of middle coarse powder (2.1 µm) was first

extracted by static maceration during 40 min with 1 L of a 40% hydroethanolic

solution and subsequently submitted to vortical extraction (Ultra-turrax T25 Basic,

IKA, Germany) at 11000 rpm, during 15 min, avoiding overheating. The extractive

solution was centrifuged at 2.01 g for 20 min (T32 A, Janetzki, Germany), filtered,

concentrated at 55 ± 3°C under reduced pressure up to one-half of its original volume

(Buchi R-114, Switzerland) and freeze-dried (Modulyo 4L, Edwards, USA). The

freeze dried extracts were coded as EX40.

The mate saponin fraction (MSF) was obtained from EX40 by solid phase

extraction (SPE) within a Diaion HP-20 polyaromatic resin and a decreasing polarity

gradient using methanol:water mixtures. Saponins were recovered from the less polar

fractions containing methanol 70 and 90% (v/v). The process yield was determined by

considering the weight of lyophilized extract initially introduced into the column and

the amount recovered after the separation process. Reproducibility of the process was

assessed on six different batches monitoring the relative standard deviation (RSD) of

the two major saponin peak areas by LC-UV analysis.

2.4 LC-UV analysis

LC-UV analysis was performed in a Shimadzu LC-10AD Class equipment

(Kyoto, Japan), provided with a CBM-10A system controller, a SIL-10A automatic

injector (20 µL-loop) and an UV detector SPD-20AV. A Phenomenex C18 column

(USA), with 250 x 4.6 mm i.d., was thermostated to 40 ± 1 °C (Cromacon, Brazil).

The flow rate was set at 1.0 mL/min and wavelength detection at 205 nm. Elution was

performed following a nine-step gradient procedure with formic acid 0.01% (v/v; pH

3.2) as the mobile phase A and acetonitrile:formic acid (0.99:0.01, v/v) as the mobile

phase B, as follows: 0–3.0 min, 29–30% B; 3.01–4.0 min, 30% B; 4.01–8.0 min, 30–

33% B; 8.01–12.0 min, 33% B; 12.01–23.0 min, 33–47% B; 23.01–30.0 min, 47% B;

30.01–42.0, 47-29 %B; 42.01–45.0 min, 29%B.

2.4.1 Method validation

By analysing saponins obtained from some other Ilex species possessing

different substitutions patterns, a wide polarity range LC-UV method was developed in

order to assure the detection of both mono and bidesmosidic saponins occurring on

mate lyophilized extract. Method validation was conducted according to the ICH

(2005). Ilexoside II, a bidesmosidic saponin previous isolated and reported in mate

saponin fruits (Taketa et al., 2004) was selected as the EX40 chemical marker.

Standard purity was assessed by LC-MS analysis. Briefly:

For the standard curve, ilexoside II was dissolved in acetonitrile:water (1:1) to

achieve concentrations of 0.024, 0.048, 0.072, 0.096, and 0.12 mg/mL. For EX40

calibration curve the dilutions were performed using the same solvent to obtain

concentrations of 0.3, 0.6, 0.9, 1.2, and 1.5 mg/mL. Each curve point represents the

mean value of three different solutions, analyzed in triplicate. The Linearity test

comprised the regression analysis, ANOVA, and Durbin-Watson test for residues.

Repeatability was calculated from the analysis of nine working solutions of ilexoside

II and EX40 using the intermediate concentration from calibration curves.

Intermediate precision was assessed by the comparison of three calibration curves of

ilexoside II and EX40, prepared in three consecutive days. Results were expressed as

relative standard deviation (%RSD). For the accuracy test, an EX40 working solution

of 0.6 mg/mL was spiked in triplicate with 1.00, 2.00 and 3.00 mL of a 0.24 mg/mL

ilexoside II reference solution to a final volume of 10.0 mL, in order to introduce a

theoretical peak area increase of 40, 80, and 120%, respectively. The limit of detection

(LOD) and limit of quantification (LOQ) were calculated using the standard deviation

of the intercept and slope values according to literature (ICH, 2005).

2.5 LC-MS analysis

The LC-MS fingerprint of the MSF was obtained using an LCQ Deca XP

instrument (Columbia, USA) coupled to an MS pump Surveyour (USA). The analysis

was performed using a Zorban Narrow Bore column (California, USA) with

dimensions of 150 x 2.1 mm at 30° C, an ion trap detector and ESI on the negative

mode. A linear gradient using formic acid 1% (Mobile phase C) and acetonitrile

(Mobile phase D) was established as follow: 0 min–5% B; 47 min–90% B; 53 min–

90%B at a flow rate of 0.2 mL/min. The same method was employed to evaluate the

Ilexoside II standard. Ilexoside II fragmentation pattern was compared to literature

data (Taketa et al., 2004).

2.6 Haemolytic Activity

The in vitro haemolytic evaluation of MSF was conducted based on the method

described by Rönnberg et al., (1995) with some modifications. Human Red blood cells

obtained from a healthy adult volunteer were centrifuged at 2.01 g for 10 min, washed

twice with Phosphate-Buffered Saline (PBS) pH 7.2 and were diluted to a 0.5%

suspension in PBS. 100µL of cell suspension was added to V-bottomed 96-well

microplates in addition to other 100 µL of mate and Quillaja enriched saponin

fractions dissolved in PBS and ranging in concentration from 0.0125 to 5.0 mg/mL. A

10% solution of Triton X-100 was used as a positive control and PBS was used as

negative one. An enriched saponin fraction from Quillaja saponaria, specie widely

used as a source of saponins, was also evaluated. Plates were incubated at 37ºC for 1 h

and centrifuged at 2.01 g for 10 min. The supernatant was transferred from

conventional U-bottomed microplates and the absorbance was measured at 540 nm in

a Microplate reader (Anthos 2020, UK). The percentage of haemolysis was calculated

by comparison with the absorbance of the positive control. The absorbance developed

by the PBS negative control was subtracted from all groups. The experiment was

performed in triplicate

3. Investigations, Results and Discussion

3.1 Solid phase extraction of MSF

The LC-UV chromatograms of the total lyophilized extract EX40 and the mate

saponin fraction (MSF) produced after solid phase extraction (SPE) are presented in

Figure 1. Clearly, the SPE process resulted in the elimination of the majority of

compounds detected at earlier short elution times, more likely comprising more polar

and low molecular weight compounds found in the lyophilized extract, such as

polyphenols.

The yield achieved after SPE was 43.6% (w/w) related to EX40 weight.

Reproducibility analysis of the LC-area of the two major saponins from MSF, namely

peaks I and II (Figure 1B), showed a relative standard deviation of 8.17 and 5.96%,

respectively. These values also include the variation from the analytical method itself.

Figure 1. LC-chromatograms of EX40 (A) and MSF (B) at 1.0 mg/mL, after detection

at 205 nm.

3.2 LC-UV analysis and validation

The analytical method objective was the analysis and quality-control of the

fruits lyophilized extract (EX40), and can also be applied to the fingerprint analysis of

MSF (Figure1B). The development of a wide polarity range method was confirmed by

the analysis of reference saponins obtained from Ilex species displaying a variety of

substitution patterns. The method also demonstrates the presence of less polar saponins

in EX40 and complements our earlier work in which the most polar saponins found in

mate lyophilized extract were assayed using LC-UV (Pavei et al., 2007).

The reference saponins analyzed in the present work were all previously

isolated from different Ilex species and their chemical features are described in Figure

2 along with the individual retention times. The retention times observed for these

reference saponins varied from 15.6 to 29.2 with ilexoside II being the most polar

saponin under the current experimental conditions. The monodesmosidic

brevicuspisaponin-1 presented the higher retention time.

Figure 2. Structures and retention times of selected reference saponins

Linear regression analysis showed a good fit to the calibration curves of

ilexoside II and EX40 as reflected by R

values greater than 0.99 (Table 1). The LOD

and LOQ estimated from the calibration curve slopes were similar for both ilexoside II

and the lyophilized extract. The analysis of standardized residues and the Durbin-

Watson test showed an absence of autocorrelation and no outliers

Table 1. Linear regression analysis, detection and quantification limits for ilexoside II

and EX40.

Parameters Ilexoside II EX40

Regression equation

y = 4.0x10

x –

14318

y = 323860x +

8122.9

Coefficient of

determination (R

)

0.9983 0.9972

LOD (µg/mL) 0.030 0.033

LOQ (µg/mL) 0.091 0.100

The RSD for repeatability and intermediate precision of ilexoside II was 2.86%

and 5.09%, respectively. For EX40 the repeatability was 3.21% and the intermediate

precision was 4.15 %. Taking into account the samples complexity, the system showed

a satisfactory response with an RSD below 5%.

The accuracy data show a negligible interference of matrix compounds. For

lower spiking, which corresponds to a theoretical ilexoside II area increase of 40%, the

recovery was 102.00 ± 4.10. For the intermediate addition, equivalent to a theoretical

increase of 80%, recovery was 100.21 ± 0.50 and for the higher addition (120%

theoretical increase), 95.48 ± 0.75. Ilexoside II content found in EX40 was 8.20%

(w/w). Considering the peaks showing molecular weights within the range expected

for saponins and no absorption above 215 nm, the lyophilized extract EX40 total

saponin content can be estimated in 47.60 % (w/w), expressed as Ilexoside II.

3.3 LC-MS analysis

The chemical investigation of all saponins presented in MSF is outside the

scope of this work. Nevertheless, LC-MS analysis (Figure 3) shows that all peaks

detected in MSF have molecular weights within the range expected for mate saponins

(Schenkel et al., 2003) and none of them shows absorption above 215 nm, confirming

that all detectable low molecular weight compounds were eliminated. Ilexoside II LC-

UV chromatogram and fragmentation after LC-MS analysis are presented in Figure 4A

and 4B, respectively. The m/z values of 951 and 789 were detected on both ilexoside II

and the EX40. The m/z of 951 corresponds to the MW of ilexoside plus a sodium ion

(Taketa et al., 2004). The loss of glucose on C28 is proposed as the fragmentation in

the MS-MS analysis leading to the detection of an m/z of 789 (Taketa et al., 2004). No

other peaks were detected on MS and MS-MS analysis on Ilexoside II.

Figure 3. Chromatograms of MSF with mass detection: ESI in the negative mode, m/z

500-1700. * Ilexoside II.

Figure 4. A: LC-chromatogram of ilexoside II at 0.5 mg/mL after detection at 205 nm;

B: LC-MS-MS of ilexoside II: m/z 789.49.

3.4 Haemolytic activity

The haemolytic activity of MSF was assayed and compared to an enriched

saponin fraction from Quillaja saponaria, which represents one of the most employed

sources of saponins.

According to Figure 5 the HD

100

of MSF can be estimated at 0.05 wt% or 0.54

mM of total saponins expressed as Ilexoside II. For Quillaja saponins instead, the

100

is about 0.0125 mg/mL or 0.0077 mM, considering a MW of 1650 (Mitra;

Dungan, 2001). In contrast with what was observed from mate leaves (Gosmann,

1989), which show an absence of haemolytic properties, MSF shows some degree of

activity, however much weaker than Quillaja saponins. Voutquenne et al., (2002)

evaluated 59 samples of isolated, mixtures and synthetic saponins aiming the

evaluation of their haemolytic properties. Twelve saponins showed high activity with a

haemolytic index higher than 50,000. These saponins presented HD

100

from 0.0075 to

0.075 mg/mL, α and β-aescine being the most active ones, with HD

100

of 0.0075

mg/mL or 0.0066 mM. In comparison, Quillaja saponins can be classified as strongly

haemolytic while MSF is comparable to the less haemolytic saponins which showed

100

ranging from 0.025 to 0.1 wt%.

Figure 5. Haemolytical activities of saponin enriched fractions: mate (black bars) vs

Quillaja (grey bars).

Hence, the analysis of several reference saponins allowed us to develop a wide-

range polarity method in order to estimate total saponin contents and to quantify

ilexoside II in the lyophilized extract from Ilex paraguariensis green fruits as well

establishing a fingerprint for this mate saponin enriched fraction. The method showed

to be linear, precise and accurate. High saponin yield and good reproducibility could

be attained by the polymer solid phase extraction method applied. Moreover, LC-MS

analysis showed molecular weights within the range of saponins for all the peaks

observed. The mate saponin fraction presented low toxicity toward red blood cells,

affording favourable evidence toward its potential use for biological and technological

purposes.

Acknowledgments

The authors are grateful to the Brazilian National Council for Research and

Development (CNPq/Brazil) for financial support and scholarships granted to M. P. G.

Peixoto and J. Treter and to Ervateira Barão for the donation of the plant material. The

reference saponins were kindly gift from Prof. Grace Gosmann (Universidade Federal

do Rio Grande do Sul). Anna Przyborowska (Kings College, London) is gratefully

acknowledged for the LC-MS running. Maria Paula is grateful to Professor David

Cowan and Prof. Peter Hylands (Kings College, London) for the help and discussion

on LC-MS data analysis and to Huiying Zhao (Kings College, London) for the help on

LC-UV running.

References

Benichou A, Aserin A, Garti N (1999) Steroid-saponins from fenugreek seeds:

Extraction, purification and surface properties. J Dispers Sci Technol 20: 581-605.

Dini I, Tenore GC, Dini A (2009) Saponins in Ipomoea batatas tubers: Isolation,

characterization, quantification and antioxidant properties. Food Chem 113: 411-419.

Gauthier C, Legault J, Girard-Lalancette K, Mshvildadze V, Pichette A (2009)

Haemolytic activity, cytotoxicity and membrane cell permeabilization of semi-

synthetic and natural lupane- and oleanane-type saponins. Bioorg Med Chem 17:

2002-2008.

Gosmann G (1989) Saponinas de Ilex paraguariensis A. St. Hil. (erva-mate) Porto

Alegre, Brazil: Universidade Federal do Rio Grande do Sul. 108 p. MSc Thesis.

Güçlü-Ustundag O, Mazza G (2007) Saponins: Properties, applications and

processing. Crit Rev Food Sci Nutr 47: 231-258.

Gugliucci A, Stahl AJC (1995) Low density lipoprotein oxidation is inhibited by

extracts of Ilex paraguariensis. Biochem Mol Biol Int 35: 47-56.

Guy B (2007) The perfect mix: Recent progress in adjuvant research. Nat Rev

Microbiol 5: 505-517.

Heck CI, Mejia EG (2007) Yerba mate tea (Ilex paraguariensis): A comprehensive

review on chemistry, health implications, and technological considerations. J Food Sci

72: 138-151.

Hiller K (1987) New results on the strucuture and biological activity of triterpenoid

saponins. In: Hostettmann K (ed.) Biologically active natural products, 1

ed., Oxford,

p. 167-184.

ICH (2005) International conference on harmonization of technical requirements for

registration of pharmaceuticals for human use, validation of analytical procedures: text

and methodology, Q2(R1).

Khanna VG, Kannabiran K (2008) Antimicrobial activity of saponin fractions of the

leaves of Gymnema sylvestre and Eclipta prostrata. World J Microbiol Biotechnol 24:

2737-2740.

Liu W, Zheng Y, Han L, Wang H, Saito M, Ling M, Kimura Y, Feng Y (2008)

Saponins (Ginsenosides) from stems and leaves of Panax quinquefolium prevented

high-fat diet-induced obesity in mice. Phytomedicine 15: 1140-1145.

Lunceford N, Gugliucci A (2005) Ilex paraguariensis extracts inhibit AGE formation

more efficiently than green tea. Fitoterapia 76: 419-427.

Ma X, Xie L, Liu L, Tang Q, Wan Z, Li Y (2008) Simultaneous Quantification of

Seven Main Triterpenoid Saponins in Radix et Rhizoma Clematidis by LC-ELSD.

Chromatographia: 1-7.

Milgate J, Roberts DCK (1995) The nutritional and biological significance of

saponins. Nutr Res 15: 1223-1249.

Mitra S, Dungan SR (2001) Cholesterol solubilization in aqueous micellar solutions of

quillaja saponin, bile salts, or nonionic surfactants. J Agric Food Chem 49: 384-394.

Montanha JA (1990) Estudo químico e biológico das saponinas de Ilex paraguariensis

A. St. Hil (Aquifoliaceae). Porto Alegre: Universidade Federal do Rio grande Sul. 92

p. MSc Thesis.

Müller V, Chavez JH, Reginatto FH, Zucolotto SM, Niero R, Navarro D, Yunes RA,

Schenkel EP, Barardi CRM, Zanetti CR, Simões CMO (2007) Evaluation of antiviral

activity of South American plant extracts against herpes simplex virus type 1 and

rabies virus. Phytother Res 21: 970-974.

Nord LI, Kenne L (1999) Separation and structural analysis of saponins in a bark

extract from Quillaja saponaria Molina. Carbohydr Res 320: 70-81.

Pamplona Mosimann AL, Wilhelm-Filho D, Da Silva EL (2006) Aqueous extract of

Ilex paraguariensis attenuates the progression of atherosclerosis in cholesterol-fed

rabbits. Biofactors 26: 59-70.

Park MK, Park JH, Han SB, Shin YG, Park IH (1996) High-performance liquid

chromatographic analysis of ginseng saponins using evaporative light scattering

detection. J Chromatogr A 736: 77-81.

Park SY, Choi HS, Yook CS, Nohara T (2005) A new lupane glycoside from the

leaves of Acanthopanax koreanum. Chem Pharm Bull 53: 97-99.

Pavei C (2004) Desenvolvimento de métodos analíticos e tecnológicos aplicados à

fração saponosídica presente nos frutos de ilex paraguariensis A. St. Hil. Porto Alegre:

Universidade Federal do Rio Grande do Sul. 134 p. MSc Thesis.

Pavei C, Guzatto P, Ros Petrovick P, Gosmann G, González-Ortega G (2007)

Development and validation of an HPLC method for the characterization and assay of

the saponins from Ilex paraguariensis A. St.-Hil (mate) fruits. J Liq Chromatogr

Related Technol 30: 87-95.

Pillion DJ, Recchia J, Wang P, Marciani DJ, Kensil CR (1995) DS-1, a modified

Quillaja saponin, enhances ocular and nasal absorption of insulin. J Pharm Sci 84:

1276-1279.

Qin F, Ye YP, Sun HX (2006) Haemolytic activity and adjuvant effect of

notoginsenoside K from the roots of Panax notoginseng. Chem Biodivers 3: 1144-

1152.

Rönnberg B, Fekadu M, Morein B (1995) Adjuvant activity of non-toxic Quillaja

saponaria Molina components for use in ISCOM matrix. Vaccine 13: 1375-1382.

Schenkel EP, Gosmann G, Athayde ML (2003) Saponinas. In: UFSC EdUEd (ed.)

Farmacognosia: da planta ao medicamento, 5

ed., Porto Alegre/Florianópolis, p. 711-

740.

Schenkel EP, Gosmann G, Montanha JA, Heizmann BM, Athayde ML, Taketa ATC,

Pires VS, Guillaume D (1997) Saponins from Mate (Ilex paraguariensis) and other

South American Ilex species: ten years research on Ilex saponins. Cienc Cult 49: 359-

363.

Schubert A, Pereira DF, Zanin FF, Alves SH, Beck RCR, Athayde ML (2007)

Comparison of antioxidant activities and total polyphenolic and methylxanthine

contents between the unripe fruit and leaves of Ilex paraguariensis A. St. Hil.

Pharmazie 62: 876-880.

Taketa ATC, Breitmaier E, Schenkel EP (2004) Triterpenes and triterpenoidal

glycosides from the fruits of Ilex paraguariensis (Mate). J Braz Chem Soc 15: 205-

211.

Voutquenne L, Lavaud C, Massiot G, Le Men-Olivier L (2002) Strucuture-activity

relathionships of haemolytic saponins. Pharm Biol 40: 253-262.

Yoo HH, Kwon SW, Park JH (2006) The cytotoxic saponin from heat-processed

Achyranthes fauriei roots. Biol Pharm Bull 29: 1053-1055.

Young CS, Dolan JW (2004) Success with evaporative light-scattering detection, part

II: Tips and techniques. LC-GC Europe 17: 192-199.

CAPÍTULO 3

AVALIAÇÃO BIOLÓGICA

Introdução

As saponinas, em função de sua capacidade de interação com membranas

biológicas e em alguns casos de desencadear processos apoptóticos, possuem uma

gama de atividades biológicas. Nesse trabalho, duas atividades importantes foram

selecionadas: I) atividade tricomonicida in vitro, II) capacidade de modular a resposta

imune como adjuvantes em vacinas, utilizando modelo in vivo.

A atividade tricomonicida é apresentada neste capítulo sob a forma de artigo

aceito para publicação no periódico Latin American Journal of Pharmacy. A atividade

imunoadjuvante encontra-se incluída em anexo à tese, sob a forma de artigo.

Anti-Trichomonas vaginalis activity of saponins from Ilex paraguariensis (mate) fruits

Janine Treter

, Maria P. G. Peixoto

, Raquel B. Giordani

, Carine L. Holz

; Paulo M.

Roehe

Tiana Tasca

, George G. Ortega

Laboratório de Desenvolvimento Galênico, Faculdade de Farmácia, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga 2752, 90610-000 Porto Alegre, RS,

Brazil, Phone number: +55-51-3308-5278; fax number: +55-51-3308-5437.

Laboratório de Pesquisa em Parasitologia, Faculdade de Farmácia, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga 2752, 90610-000 Porto Alegre, RS, Brazil

CIRAD, Département Systèmes Biologiques, UMR15 "Contrôle des maladies

animales émergentes et exotiques", Campus International de Baillarguet, 34398

Montpellier Cedex 5, France

Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor, Fepagro Saúde Animal,

Estrada Municipal do Conde, 6000, 92990-000, Eldorado do Sul, Brazil.

Corresponding author: o[email protected].br

Abstract

This study evaluates the in vitro anti-trichomonads activity of a saponin enriched

fraction (MSF) obtained from the fruits of Ilex paraguariensis A. St. Hil

(Aquifoliaceae). The MSF showed better anti-trichomonads activity than polysorbate

and tyloxapol. A similar activity was obtained for quillaja saponins, but this fraction

presented the highest cytotoxicity to mammalian cells as follows: quillaja > tyloxapol>

polysorbate 80 > MSF. Neither the co-addition of MSF and metronidazole (MTZ) nor

the pretreatment of the trophozoites with MSF prior to the addition of MTZ elicited a

significant effect on MTZ activity.

Keywords: citotoxicity, Ilex paraguariensis

1. Introduction

Trichomonosis, caused by the flagellated protozoan Trichomonas vaginalis, is

the most prevalent non-viral, sexually transmitted disease (STD)

. Vaginitis due to T.

vaginalis clinically manifests with symptoms of vaginal itching, odor, and discharge

Trichomonosis among men can cause non-chlamydial, non-gonococcal urethritis,

commonly with mild symptoms

. There are serious health consequences for patients

with trichomonosis, including adverse pregnancy outcomes

, predisposition to

cervical and prostate cancer

5,6

, and increased infertility

and susceptibility to HIV

seroconversion

8,9

Metronidazole (MTZ) is the drug of choice against T. vaginalis since the 60’s

decade, nevertheless, the occurrence of side effects and cases of resistance stimulate

the search of new anti-trichomonads compounds

10-12

. In addition to synthetic drugs

with alternative sites of action

13-16

, natural products such as plant purified

fractions/extracts were investigated on recent antiprotozoal studies

17-21

. Saponins,

found mainly in superior plants, are amphiphilic molecules comprised of a triterpenic

or steroid core to which one or more sugar chains are attached

. Recently, a

significant anti-trichomonads activity with a mechanism of action unrelated to MTZ

was reported for a saponin enriched fraction obtained from Sapindus mukorossi

Gaertm

. In this context, the ability to form complexes with steroids, proteins and

phospholipids, and the surface active properties of the saponins make them active

upon several microorganisms, including parasites

23-26

Ilex paraguariensis A. St. Hil. is a saponin-rich specie widely known in South

American countries because the use of their leaves in the production of stimulant tea-

like beverages. The worldwide production of mate was estimated at around 900,000

tons/year with Argentina, Paraguay and Brazil being the main producers

Nevertheless, fruits are considered a by-product of industry discarded before mate

roasting

. Phytochemical studies on mate saponins indicated the prevalence of

triterpenoid glycosides in their leaves and green fruits

29-32

. In our previous work we

obtained a mate saponin enriched fraction (MSF) from lyophilized extract of mate

green fruits through solid phase extraction with good process reproducibility and a

yield close to 45% (w/w). MSF showed a very low cytotoxicity against red blood cells,

one of the main drawbacks of saponins in vivo application

Considering the importance of trichomonosis in public health, the necessity of

new alternatives for the treatment of this STD, and the potential use of saponins as

trichomonicidal agents, the aim of this study was to investigate the anti-trichomonads

activity as well as the in vitro cytotoxicity against eukaryotic cells of a saponin

enriched fraction obtained from green fruits of Ilex paraguariensis. In addition, the

results were compared to synthetic surface active compounds, tyloxapol and

polysorbate 80, and to a commercial saponin fraction from Quillaja saponaria.

2. Materials and methods

2.1 Chemicals

Quillaja saponins fraction (S-4521), tyloxapol, MTT ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-

yl)-2,5-difenyl-tetrazolium bromide]), metronidazole (MTZ), and the antibiotics

penicillin-streptomycin were purchased from Sigma. Polysorbate 80 was from Merck.

2.2 Saponin enriched fraction

Mate green fruits were harvested in January 2008 and kindly supplied by

Ervateira Barão (Barão de Cotegipe, RS, Brazil). A voucher specimen was deposited

at the Federal University of Rio Grande do Sul Herbarium under the code ICN 125105

(Porto Alegre, Brazil). Green fruits were manually separated from leafs and stalks,

dried at 35 °C for 72 h in a forced ventilation oven (Memmert, Germany) and milled

using a cutter mill (Retsch SK1, Germany). The plant powder (2.1 mm) was firstly

macerated with a 40% ethanol solution (10% w/v) during 40 min and afterwards

extracted by turbolysis (IKA T-25 basic, Germany) during 15 min avoiding

overheating. The extract was filtered and concentrated to one-half of it original volume

under vacuum in a rotating evaporator (Bücchi R114) and further lyophilized

(Edwards, USA). The mate saponin enriched fraction (MSF) was obtained from

lyophilized extract by solid phase extraction (Diaion HP-20, Supelco, USA) and a

methanol:water gradient. The saponins were recovered from the less polar fractions

containing methanol 70 and 90% (v/v)

2.3 Parasites and culture conditions

The T. vaginalis isolate TV-VP60

was used in this study. This fresh clinical

isolate was obtained from epidemiological survey in Porto Alegre city, Rio Grande do

Sul, Brazil, and it was kindly donated by Dr. Geraldo Attilio De Carli (PUCRS,

Brazil). Trichomonads were cultured axenically in vitro in trypticase-yeast extract-

maltose (TYM) medium

(pH 6.0), supplemented with 10% (v/v) heat-inactivated

serum, and incubated at 37°C (±0.5). Organisms in the logarithmic phase of growth

and exhibiting more than 95% viability and normal morphology were harvested,

centrifuged and resuspended on new TYM medium for anti-trichomonads activity

assays. All experiments were performed in triplicate and the results were obtained

from at least four independent cultures (3n).

2.4 Anti-trichomonads activity

The anti-trichomonads activity of MSF, tyloxapol, polysorbate 80 and quillaja

was determined in vitro. Parasites were counted with a haemocytometer and adjusted

to 5.0 10

trophozoites/mL in TYM medium. The MSF was added to this incubation

system at final concentration range from 0.008 to 0.5 wt% or 0.086 to 5.38 mM, if

expressed as ilexoside II (Figure 1, MW of 929.029), the major saponin identified on

MSF. Tyloxapol, quillaja and polysorbate 80 were analyzed at a concentration of 0.5

wt%. Two controls were carried out: parasites only, and a test with MTZ at 12.5

µg/mL as positive control. The results were expressed as the percentage of living

organisms compared with parasites control after 24 h of incubation considering

motility and normal morphology.

COO

R1 R2 R3 R4

-D-Glc13

-L-Ara1

-D-Glc1

Figure 1. Ilexoside II, the major identified saponin found on mate saponin enriched

fraction, obtained on green fruits of Ilex paraguariensis.

In order to investigate synergic or time dependent effects of the saponin sample

and metronidazole, two modifications were made to perform the anti-trichomonads

activity assays. First, MSF at 0.02 wt% was associated to MTZ at 6.25 µg/mL (MIC/2)

and 12.5 µg/mL (MIC) and the anti-protozoal effect evaluated after 24 h. Second, the

cultures were treated with MSF (0.02 wt%) during 2 h prior to the addition of MTZ, at

6.25 µg/mL and 12.5 µg/mL, and then, the anti-trichomonads activity was also

evaluated after 24 h. as shown in figure 2. Each test was carried out on triplicate, with

at least three independent experiments using three different cultures. Statistical

analysis was performed on Excel 2003 using the Student’s t-student test (P<0.05).

2.5 Cell cytotoxicity assay

MTT cytotoxicity assay was performed on an estabilished method with

modifications

. Briefly, Madin Darby Bovine Kidney cells (MDBK ATCC CCL-22)

were cultured in Eagle’s minimal essential medium (E-MEM) supplemented with 10%

fetal bovine serum and the antibiotics penicillin and streptomycin at usual

concentrations

. Cells were seeded on 96-well microplates at a concentration of 4.0 x

per/well and maintained at 37°C under a 5% C0

atmosphere. Confluent cells were

treated with MSF and surfactants tyloxapol, polysorbate 80 and quillaja dissolved in

E-MEM. After 24 h, the supernatant was removed and replaced by 40 µL of a 2.0

mg/mL MTT solution in serum-free medium. The medium was then removed and 100

µL of isopropyl alcohol was added to each well. Plates were submitted to constant

agitation for 30 min at 37 °C and the absorbance was detected at 550 nm using a

microplate ELISA Reader (Anthos 2020, Austria). Results were expressed as the

percentage of viable cells comparing the samples absorbance to the untreated control.

3. Results and Discussion

The effect of the mate saponin enriched fraction (MSF) upon fresh cultures of

T. vaginalis is showed in Figure 2.

MSF presented anti-trichomonads effect at increasing concentrations: at 0.008

wt% the trophozoites viability was close to 100%, while at 0.02 wt%, it was observed

80% of parasites viability. Importantly, 0.2 wt% MSF or 2.1 mM expressed as

Ilexoside II which also corresponds to nearly 5-fold the critical micelle concentration

(CMC) of MSF, caused total lethality of T. vaginalis trophozoites. The saponins from

Sapindus mukorossi, at 0.001 wt%, reduced 100% of T. vaginalis viability after 24 h-

treatment

. The CMC for S. mukorossi was determined as 0.045 wt%

being the

anti-trichomonads effect observed at a concentration lower than the CMC, in opposite

to our results to MSF.

Figure 2. Susceptibility of T. vaginalis trophozoites to MSF ranging concentration

from 0.008 to 0.5 wt% (0.086 to 5.38 mM).

The effect of the synthetic surfactants polysorbate 80 and tyloxapol as well as

saponins from Quillaja are summarized on Table 1.

Table 1. Susceptibility of T. vaginalis trophozoites after 24 h of exposure to MSF and

references substances at 0.5 wt%.

Treatment

(0.5 wt%)

Concentration

x CMC

Trophozoites viability

(%)

MSF

12.5 0

Quillaja 11 0

Polysorbate 80 100 52.3 ± 8.2

Tyloxapol 1.85 44.6 ± 1.8

Mate saponin enriched fraction

Equivalent to x-fold the critical micellar concentration (CMC)

All substances demonstrated anti-trichomonads activity when used at

concentrations higher than the respective CMC values. Quillaja and MSF were able to

cause 100% of parasites lethality, being more active than the non-ionic surfactants

polysorbate 80 and tyloxapol. A viability of 50%, approximately, was observed to

polysorbate 80 and tyloxapol after 24 h of incubation.

The surface activity as well as the capacity of surfactants to form complex

micelles with drugs is a time-dependent effect

40, 41

. In order to gain insights on MSF

mechanism of action and drug saponin interaction, a pretreatment with MSF before the

MTZ addition (at the MIC/2 and MIC values) was performed to evaluate the

occurrence of a potential increase of MTZ permeability throughout the trophozoites

membrane. Moreover, MTZ (at the MIC/2 and MIC values) and MSF were tested in

co-addition to assess the induction of some micellization effect. MTZ (MIC/2) was

able to reduce the trophozoites viability to 24.3%. When 0.02 wt% MSF was co-added

with MTZ (MIC/2), the parasites viability decreased to 21.5%, however the difference

between both effects was not statistically significant (P

T<=t; two-tailed

0.216). The

pretreatment with MSF before the MTZ (MIC/2) did not enhance MTZ anti-

trichomonads activity, in fact, this association increased the number of viable

trophozoites (Fig. 3A). Both the co-addition and the pretreatment of trophozoites with

MSF and MTZ (MIC) did not alter the anti-trichomonads effect of MTZ (P

T<=t; two-tailed

0.136 and 0.185, respectively) (Fig. 3B).

This found suggests that MSF operates neither by a synergistic mechanism nor

by improvement of MTZ absorption via membrane cell permeation. In that account,

preliminary electron microscopy studies conduced by our group had showed that mate

saponins are able to form rather intricate micelle-like structure (unpublished results).

However, the results here obtained suggest no interaction between mate saponins

micelles an MTZ.

An important drawback for the clinical use of saponins along with the

haemolytical effect is probably the induction of cytotoxicity toward mammalian cells.

In order to investigate the cytotoxic effect of MSF an assay was performed against

MDBK cells, a model of non-cancerous mammalian epithelial cell line (Fig. 4).

Figure 3. Susceptibility of T. vaginalis trophozoites after 24 h of exposure to: (A)

MTZ at MIC/2 (black bars); Co-addition of MSF 0.02 wt% + MTZ MIC/2 (white

bars); Pretreatment with MSF 0.02 wt% + MTZ MIC/2 (hatched bars); (B) MTZ at

MIC (black bars); Co-addition of MSF 0.02 wt% + MTZ MIC (white bars);

Pretreatment with MSF 0.02 wt%+ MTZ MIC (hatched bars). *Significant at P < 0.05

(Student’s t-test).

100

150

200

0.005 0.01 0.1 0.25 0.5

Concentration (%)

Cell viability (%)

Figure 4. Cytotoxicty of saponins and synthetic surfactants against a mammalian cell

using the MTT assay: quillaja (white bars); MSF (black bars); tyloxapol (hatched bars)

and polysorbate 80 (gray bars).

Trophozoites viability (%)

The enriched fraction of quillaja saponins was the most cytotoxic compound,

causing almost total lethality in all concentrations evaluated. Tyloxapol was toxic at

concentrations ranging from 0.05 to 0.5 wt% and polysorbate 80, at 0.5, 0.25, 0.1 wt%,

being slightly toxic at 0.05 wt%. These synthetic surfactants agents are widely used in

pharmaceutical formulation as excipients, in their most as solubilization agents, whose

use is FDA-approved

42, 43

. Importantly, MSF was cytotoxic only at 0.5 wt% or 5.4

mM expressed as ilexoside II. Therefore, MSF was not cytotoxic at anti-trichomonads

concentrations.

4. Conclusion

The saponin enriched fraction obtained from Ilex paraguariensis green fruits

demonstrated moderate trichomonicidal activity at 0.06 wt%. Moreover, this

concentration was not cytotoxic to a mammalian epithelial cell line. The MSF anti-

trichomonads activity was lower than MTZ and superior to the synthetic surfactants

tyloxapol and polysorbate 80. Additional work is necessary to provide details

regarding the mechanism of action of MSF anti-trichomonads activity.

5. Acknowledgments

The authors are grateful to the Brazilian National Council for Research and

Development (CNPq/Brazil), FAPERGS (Brazil), and CAPES (Brazil) for

scholarships and financial support and to Ervateira Barão for the donation of the plant

material.

6. References

1. WHO - World Health Organization (2001) Global Prevalence and Incidence of

Selected Curable Sexually Transmitted Infections, Overview and Estimates,

Switzerland.

2. Mabey, D., J. Ackers & Y. Adu-Sarkodie (2006) Sex. Transm. Infect. 82: 26-7.

3. Krieger, J.N. (1990) “Epidemiology and clinical manifestations of urogenital

trichomoniasis in men”, in: “Trichomonads parasitic in humans”, (B.M.

Honigberg, ed.), Springer-Verlag, New York, pp. 235-45.

4. Cotch, M.F., J.G. Pastorek II, R.P. Nugent, S.L. Hillier, R.S. Gibbs, D.H. Martin,

D.A. Eschenbach, R. Edelman, J.C. Carey, J.A. Regan, M.A. Krohn, M.A.

Klebanoff, A.V. Rao & G.G. Rhoads (1997) Sex. Transm. Dis. 24: 353-60.

5. Viikki, M., E. Pukkala, P. Nieminen & M. Hakama (2000) Acta Oncol. 39: 71-5.

6. Sutcliffe, S., E. Giovannucci, J.F. Alderete, T.H. Chang, C.A. Gaydos, J.M.

Zenilman, A.M. de Marzo, W.C. Willette & E.A. Platz (2006) Cancer Epidemiol.

Biomark. Prev. 15: 939-45.

7. Grodstein, F., M.B. Goldman & D.W. Cramer (1993) Am. J. Epidemiol.137: 577-

84.

8. Chesson, H.W., J.M. Blandford & S.D. Pinkerton (2004) Sex. Transm. Dis. 31: 547-

51.

9. McClelland, S., L. Sangaré, W.M. Hassan, L. Lavreys, K. Mandaliya, J. Kiarie, J.

Ndinya-Achola, W. Jaoko & J.M. Beten (2007) J. Infect. Dis. 195: 698-702.

10. Land K.M. & P.J. Johnson (1997) Exp. Parasitol. 87: 305-8.

11. Brown, D.M., J.A. Upcroft, H.N. Dodd, N. Chen & P. Ufcroft (1999) Mol.

Biochem. Parasitol. 98: 203-14.

12. Meneses-Marcel, A., O.M. Rivera-Borroto, Y. Marrero-Ponce, A. Montero, Y.

Machado Tugores, J.A. Escario, A. Gómez Barrio, D. Montero Pereira, J.J. Nogal,

V.V. Kouznetsov, C. Ochoa Puentes, A.R. Bohórquez, R. Grau, F. Torrens, F.

Ibarra-Velarde & V.J. Arán (2008) J. Biomol. Screen. 13: 785-94.

13. Narcisi, E.M. & W.E. Secor (1996) Antimicrob. Agents Chemother. 40: 1121-5.

14. Sobel, J.D., P. Nyirjesy & W. Brown (2001) Clin. Infect. Dis. 33: 1341-6.

15. Malagoli, M., T. Ross, A. Baggio, G. Zandomeneghi, C. Zanca, C. Casolari & M.

Castelli (2002) Pharmacol. Res. 46: 469-72.

16. Cudmore, S.L., K.L. Delgaty, S.F. Hayward-Mcclelland, D.P. Petrin & G.E.

Garber (2004) Clin. Microbiol. Rev. 17: 783-93.

17. Muelas-Serrano, S., J.J. Nogal, R.A. Martínez-Díaz, J.A. Escario, A.R. Martínez-

Fernández & A. Gómez-Barrio (2000) J. Ethnopharmacol. 71: 101-7.

18. Vermani, K. & S. Garg (2002) J. Ethnopharmacol. 80: 49-66.

19. Fidalgo, L.M., I.S. Ramos, A.M.M. Álvarez, N.G. Lorente, R.S. Lizima & J.A.

Payrol (2004) Rev. Cubana Med. Trop. 56: 230-233.

20. Calzada, F., L. Yépez-Mulia & A. Tapia-Contreras (2007) J. Ethnopharmacol.

113: 248-51.

21. Iwalewa, E.O., N.O. Omisore, C.O. Adewunmi, A.A. Gbolade, O.G. Ademowo, C.

Nneji, O.I. Agboola & O.M. Daniyan (2008) J. Ethnopharmacol. 117: 507-11.

22. Francis, G., Z. Kerem, H.P. Makkar & K. Becker (2002) Br. J. Nutr. 88: 587-605.

23. Tiwari, P., D. Singh & M.M. Singh (2008) J. Antimicrob. Chemother. 62: 526-34.

24. Germonprez, N., L. van Puyvelde, L. Maes, M. van Tri & N. de Kimpe (2004)

Tetrahedron 60: 219-28.

25. Germonprez, N., L. Maes, L. van Puyvelde, M. van Tri, D.A. Tuan & N. de Kimpe

(2005) J. Med. Chem. 48: 32-7.

26. Fuchino, H., S. Sekita, K. Mori, N. Kawahara, M. Satake & F. Kiuchi (2008)

Chem. Pharm. Bull. 56: 93-6.

27. Heck, C.I. & E.G. Mejia (2007) J. Food Sci. 72: R138-51.

28. Schubert, A., D.F. Pereira, F.F. Zanin, S.H. Alves, R.C. Beck & M.L. Athayde

(2007) Pharmazie 62: 876-80.

29. Gosmann, G., D. Guillaume, A.T. Taketa & E.P. Schenkel (1995) J. Nat. Prod. 58:

438-41.

30. Kraemer, K.H., A.T. Taketa, E.P. Schenkel, G. Gosmann & D. Guillaume (1996)

Phytochemistry 42: 1119-22.

31. Martinet, A., K. Ndjoko, C. Terreaux, A. Marston, K. Hostettmann & Y. Schutz

(2001) Phytochem. Anal. 12: 48-52.

32. Taketa, A.T.C., E. Breitmaier & E.P. Schenkel (2004) J. Braz. Chem. Soc. 15:

205-11.

33. Peixoto M.P.G., J. Treter, C. Pavei, G.L. Borré, S.G.Verza, S. Cibulski, P.M.

Roehe, G. Gosmann, C.A. Dreiss & G.G. Ortega Pharmazie submitted paper.

34. Ortega,G.G., C. Pavei, P.R. Petrovick & V.L. Bassani (2005) Brazilian Patent

PI0501510-3

35. Michel, R., F. Borges, R. Wiltuschnig, F. Neves, J. Ribeiro, R. Vieiro, P.B. Vieira,

G. Bohns, T. Tasca & G.A. de Carli (2006) Braz. J. Clin. Anal. 38:127-30.

36. Diamond L.S. (1957) J. Parasitol. 43: 488-90.

37. Denizot, F. & R. Lang (1986) J. Immunol. Methods 89: 271-7.

38. Paul, J. (1970) Cell and tissue cultures. First edition, London, UK.

39. Balakrishnan S., S. Varughese & A.P. Deshpande (2006) Tenside, surfactants,

detergents 43: 262-8.

40. Florence A.T. & D. Attwood (2003) Tensoativos - princípios físico-químicos em

farmácia. Third edition, São Paulo, SP.

41. Sinko P.J. (2008) Martin - Físico-farmácia e ciências farmacêuticas. Fifth edition,

Artmed, Porto Alegre, RS.

42. Aviv, H., D. Friedman, A. Bar-Ilan & M. Vered (1993) PCT WO 94/05298.

43. Nema, S., R.J. Washkuhn, R.J. Brendel (1997) J. Pharm. Sci. Tech. 51: 166–71.

44. Oliveira-Freitas, E., C.P. Casas, G.P. Borja-Cabrera, F.N. Santos, D. Nico, L.O.P.

Souza, L.W. Tinoco, B.P. da Silva, M. Palatnik, J.P. Parente & C.B. Palatnik-de-

Sousa (2006) Vaccine 24: 3909-20.

45. Nardin, E.H., G.A. Oliveira, J.M. Calvo-Calle, Z.R. Castro, R.S. Nussenzweig, B.

Schmeckpeper, F.B. Hall, C. Diggs, S. Bodison & E. Robert (2000) J. Infect. Dis.

182: 1486-96.

46. Saraiva, E.M., A.F. Barbosa, F.N. Santos, G.P. Borja-Cabrera, D. Nico, L.O.P.

Souza, C.O. Mendes-Aguiar, P. Fampa, L.E. Parra, I. Menz, J.G. Dias, S.M.

Oliveira & C.B. Palatnik-De-Sousa (2006) Vaccine 24: 2423-31.

47. Schetters, T.H.P.M. & M. Gravendyck (2006) Parasitology 133: S189-S95.

CAPÍTULO 4

CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA FRAÇÃO DE

SAPONINAS

Introdução

Em virtude da ocorrência de grupamentos de diferentes polaridades em sua

molécula, representados pelo seu núcleo triterpênico hidrofóbico e suas cadeias de

açúcar, as saponinas apresentam propriedades tensoativas e capacidade de formar

micelas. O conhecimento das propriedades físico-químicas é de fundamental

importância no desenvolvimento de aplicações.

Este capítulo tem por objetivo avaliar o comportamento das micelas em solução

visando determinar o tamanho, forma e seu comportamento reológico.

Adicionalmente, o seu potencial de solubilizar compostos pouco solúveis foi avaliado.

Dados de concentração superficial de excesso, área por molécula na superfície e

pressão de superfície na CMC encontram-se no ANEXO I desta tese. A abordagem

matemática referente à determinação dos módulos viscoso e elástico a partir do ensaio

de reologia dinâmica encontra-se no ANEXO II.

O trabalho será submetido ao Periódico Journal of Pharmaceutical Sciences.

Micellar aggregates of saponins from Ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate)

Maria Paula G. Peixoto

, Janine Treter

, Pedro Ernesto de Resende

, Nádya Pesce

da Silveira

, George G. Ortega

, Margareth J. Lawrence

, Cécile A. Dreiss

Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto

Alegre, RS, Brazil.

Instituto de Química. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre

RS, Brazil.

Pharmaceutical Science Division, King’s College London, Franklin-Wilkins

Building, 150 Stamford Street, London SE1 9NH, United Kingdom.

*Corresponding author: [email protected], phone number: +44-0-207-848-3766

Abstract

This work reports the physico-chemical characterisation of the micellar structures

formed by a saponin fraction obtained from an important South American species, Ilex

paraguariensis (mate). The mate saponins enriched fraction (MSF) mainly comprises

steroidal glycosides and was obtained from mate green fruits through solid phase

extraction. The physico-chemical studies focused the determination of the critical

micellar concentration (CMC), the size and shape of the micelles using conventional

transmission electron microscopy (TEM) as well as Cryo-TEM and small angle

neutron scattering (SANS). The rheological behaviour of the solutions up to 4 wt%

was also determined using a controlled-strain rheometer. Finally, the MSF ability to

solubilise poorly water soluble drugs was assayed using carbamazepine and

flurbiprofen as basic and weak acidic drug models. Small spherical micelles of around

20 Å radius were observed in the presence of elongated structures with lengths over

500 nm, possessing a well defined CMC of 0.41 g/L. MSF solutions ranging from 0.25

to 4% (w/v) demonstrated a viscoelastic behaviour independent of concentration. MSF

was able to improve the solubility of carbamazepine in the range of 0.13 to 1.5 %

(w/v).

1. Introduction

As a result of their interfacial and surface properties as well as their ability to

self-assemble into a wide range of structures, surfactants have found many

applications in the chemical, pharmaceutical and food industry

. Considering the

growing interest in replacing petroleum-based surfactants by those derived from

naturally occurring renewable sources, saponins have a real potential, due to their high

degree of biocompatibility and biodegradability. In the area of pharmaceuticals in

particular, they have already been proposed as absorption and dissolution enhancers,

immunoadjuvants and immunostimulants

2-5

Despite their clear potential as biocompatible surfactants from natural sources,

very few studies have been reported on the physico-chemical characterization of

saponins, either as mixtures or individual components. The majority of data available

have focused on the Quillaja saponaria species, where information have been reported

on its critical micellar concentration (CMC), micellar size, solution viscosity and the

influence of medium conditions such as pH, salt and temperature on such properties

. For a few other saponin species, some physico-chemical data can be found, mostly

on the determination of the CMC and, in some cases, on micellar size, as for instance

for the species Panax notoginseng, Glycine max, Sapindus mukorossi and Gleditsia

sinensis

9-12

Given that the production of mixtures of saponins is far more practical than

isolated ones, which require lengthy and costly purification processes, not easily

scaled-up, and taking into account the fact that such mixtures, when comprised of

similar chemical structures may display synergistic activity, we report here the

characterisation of physico-chemical properties of a saponin fraction extracted from

the Southern Latin American specie, Ilex paraguariensis (mate). The species is well

known due to the consumption of an herbal tea-like beverages made from its leaves,

which has stimulant properties. Due to its importance and increased consumption, the

species has recently been the subject of a review on its chemical and technological

properties

. Besides polyphenols and methylxantines, which are responsible for its

stimulant and antioxidant activities, mate is also a saponin-rich species

. Saponins

can be found in both the leaves and fruits of mate with a higher accumulation in the

latter one. However, the fruits are considered as a waste product from the mate leaves

industry and currently have no application

. The systematic phytochemical work

focused on this fraction has indicated the prevalence of triterpenic glycosides on its

leaves and green fruits

14,16-18

. Recently, saponin accumulation in mate green fruits was

confirmed by LC-assay, and saponin contents as high as about 30 wt% were found in

green fruits lyophilized extract

19,20

. Previous studies on the saponin-enriched fraction

obtained from mate fruits have revealed a low haemolytic activity and negligible in

vitro cytotoxicity against mammalian cell culture lines from

21,22

which comprise the

main drawbacks on saponins biological application. The main saponins occurring in

Ilex fruits are depicted on Figure 1

. To our knowledge however, no physico-

chemical studies has been reported to date. A prerequisite to any application of these

naturally occurring surfactants in either pharmaceutical or technological application

would require an understanding of their physico-chemical properties, in particular a

characterisation of the aggregate structures formed in solutions. This work therefore

aims at bringing some insight into the physico-chemical properties of micelles from a

saponin-enriched fraction (MSF) extracted from Ilex paraguariensis fruits, focusing on

CMC determination, micellar size and shape, its rheological behaviour as well as its

applicability for the solubilisation of poorly water soluble drugs.

COO

R1 R2 R3 R4

-L-Ara1

OH HO H

α-L-Ara1

-D-

Glc1

-D-Glc13

-L-

Ara1

-D-

Glc1

Figure 1. General structure of the saponins of mate fruits here represented by

mateside (1), zyhu-glycoside I (2) and ilexoside II (3). Based on Taketa, 2004.

2. Materials and methods

2.1 Materials

Mate green fruits harvested from a selected cultivar in January 2008 were kindly

supplied by Ervateira Barão (Barão de Cotegipe, RS, Brazil). A voucher specimen was

deposited at the Federal University of Rio Grande do Sul Herbarium under the code

ICN 125105 (Porto Alegre, Brazil). The dye 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol was

purchased from Fluka Chemika (Switzerland). Diaion HP-20 was from Mitsubishi

(Japan). Formvar-carbon and hexagonal thin bar grids were from Koch (Germany) and

Agar Scientific Ltd (England), respectively. Saponin enriched fraction from Quillaja

saponaria (S-4521) was from Sigma (USA). Cellulose acetate membrane filters were

obtained from Millipore, Ireland. All compounds were used as received.

2.2 Methods

2.2.1 Saponin enriched fraction (MSF)

Green fruits were manually separated from leaves and stalks, dried at 35 °C for

72 h in a forced ventilation oven (Memmert, Germany) and milled using a cutter mill

(Retsch SK1, Germany). The plant powder (2.1 mm) was firstly macerated with a 40%

ethanol solution (10% w/v) during 40 min and afterwards extracted by turbolysis (IKA

T-25 basic, Germany) during 15 min, avoiding overheating. The extract was filtered

and concentrated to one-half of its original volume under vacuum in a rotating

evaporator (Bücchi R114, Switzerland) and further lyophilized (Edwards, USA).

The saponin enriched fraction (MSF) was obtained from lyophilized extract by

solid phase extraction within a Diaion HP-20 polyaromatic resin and a methanol:water

gradient

23,24

. Saponins were recovered from the less polar fractions containing

methanol 70 and 90% (v/v) after organic solvent elimination and further lyophilisation.

Since the presence of salts can strongly affect micellar features, the analysis of

MSF micelles was carried out in the absence of buffers for pH-control. Natural pH was

of 5.17 ± 0.13.

2.2.2 Critical Micelle Concentration (CMC)

The determination of the CMC was based on a dye solubilisation technique,

using the water-insoluble dye 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol, PAN, with modifications

of the original method

. Briefly: 37.5 µL of a 1.6 mM PAN pentane solution was

added to 200 µL MSF solutions at concentration ranging from 1.53 × 10

-5

to 2% (w/v)

and left to rest for 30 min. The mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 10 min and

the supernatant transferred to a 96-well microplate. The absorbance was determined at

470 nm using a Spectra Max 190 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale,

USA) and plotted against surfactant concentration. Below the CMC, the dye is

insoluble and the absorbance is zero. As micellar aggregates start forming, the dye

becomes solubilised in the micelles and absorbance increases. The onset of

solubilisation, i.e. the point where absorbance starts increasing, is taken as the CMC.

The measurements were made in triplicates.

2.2.3 Transmission electron microscopy (TEM)

10 µL of a 0.6% (w/v) concentrated MSF solution were placed on formvar-

carbon grids (200 Mesh) and contrasted with uranile acetate (2% w/v) during 15 min.

The analysis was performed on a Jeol Microscope JEM 1200 Ex II at an acceleration

voltage of 80 kV and magnifications of 40.000 and 100.000 ×.

2.2.4 Cryo-TEM

Approximately 3µl of 4% (w/v) MSF solution were placed on a 700 mesh

hexagonal thin bar grid, blotted with filter paper, frozen by fast immersion in ‘slushed’

nitrogen (-210°C) and transferred to the specimen holder under liquid nitrogen. The

samples were imaged with a Tecnai T20 microscope (FEI

, Oregon, USA) at 200kV,

-175°C and a Gatan Ultrascan 2K camera (Pleasanton, USA).

2.2.5 Small Angle Neutron Scattering (SANS)

SANS measurements on 0.5 and 1.0 % (w/v) MSF solutions were performed on

LOQ beamline, at the ISIS facility (Didcot, U.K). The instrument uses incident

wavelengths λ from 2.2 to 10.0 Å sorted by time-of-flight with a fixed sample-detector

distance of 4.1 m, which corresponds to scattering vectors Q = 4π/λ sin(θ/2) from

0.008 to 0.240 Å

-1

, where θ is the measured scattered angle. The solutions were placed

in quartz cells with a 2.0 mm path length and the measurements were performed at a

controlled temperature of 25°C. The raw scattering data were corrected for background

scattering, empty cell scattering, detector efficiency, electronic noise and transmission

and converted to differential scattering cross-sections in absolute units of cm

-1

using

standard procedures at ISIS.

2.2.5.1 SANS data modelling

Initial data evaluation was performed using the Guinier analysis aiming to

achieve an estimate of the average radius of gyration. Considering the low-Q data from

dilutions of monodisperse particles

, the Guinier approximation is given by:

I(q)

I(0)exp(

−

/3) (Equation 1)

where I(0) is the coherent forward scattering intensity. By fitting the

experimental data to Equation 1, R

is assessed from the slope of the linear part of a ln

I(Q) vs Q

plot, which is called a "Guinier plot". As a result of the assumption of a

spherical shape the radius of gyration is given by:

(Equation 2)

where R is the radius of a sphere.

The data modelling program FISH was used to fit the SANS data. FISH uses a

standard iterative least-squares fitting method in which selected parameters of the

chosen model can be refined to optimize the fit. Parameters are refined from several

starting points to ensure that a global (rather than a local) minimum has been found. A

pre-factor, referred to as the ‘scale’ factor, contains parameters such as volume

fraction and contrast. The ‘scale’ parameter is left to float and then the value returned

by the fit checked against its calculated value to confirm consistency of the fit.

Data were fitted using a model for polydisperse spheres, with a size distribution

following the Schultz model:

( )

111













−













expr

(Equation 3)

Where

is the average value of R, Γ(x) is the gamma function and z is a measure

of the width of the distribution. The polydispersity index returned by the fit is given by

where σ is expressed by:

(Equation 4)

To account for the presence of large aggregates in the low-Q region, the spheres

model was combined with a Porod-like term (A × Q

). In order to estimate the fraction

of material present in the spherical micelles, the scale obtained after fitting the data

was compared with the theoretical ‘scale’ parameter calculated according to equation

‘scale’ = 10

-24

(∆

)

(Equation 5)

Where: ∆

represents the scattering length density difference between the solute

and the solvent (D

O) and

is the volume fraction of MSF.

The scattering length density of MSF (

MSF

) was calculated by considering the

molecular structure of ilexoside II, one of the main saponins found in mate fruits

(Taketa, 2004) and the chemical marker of MSF:

MSF

= 0.86×10

-2

2.2.6 Rheology

MSF solutions ranging in concentration from 0.25 to 4.0 % (w/v) were analysed

using a controlled-strain ARES rheometer (TA instruments, Delaware, USA) coupled

to a Julabo FP35 water bath (Seelbach, Germany). Dynamic strain and frequency

sweep tests were carried out at 25°C using a 50 mm plate diameter and a 0.8 mm gap.

After placing the solutions on the rheometer and lowering the upper plate, they were

left to rest for 15 min before starting the measurements to allow complete recovery.

For dynamic strain tests, the storage and loss modulus (G’ and G’’, respectively) were

measured at a frequency of 1Hz and strain varying between 0.05 to 100% in order to

determine the linear viscoelastic region of the material. Dynamic frequency

measurements were performed in the linear viscoelastic regime (taken as 50% of the

maximum strain) determined from the dynamic strain experiments.

2.2.7 Micellar solubilisation

An excess of carbamazepine or flurbiprofen (20 mg) were added separately to a

set of aqueous saponin solutions with concentrations ranging from 0.13 to 1.5% (w/v)

and stirred magnetically for 24 h at 25 ± 2°C. The samples were then left to rest for 30

min, prior to centrifugation for 30 min at 2.01 g and filtered through 0.45 µm-cellulose

acetate membrane filters to ensure the elimination of large particles. For each solution,

measurements of pH and electrical conductivity were performed at 25 ± 2°C (pHmeter

Digimed DM-22 Brazil, Quimis Q405M conductivimeter, Brazil). The concentration

of each dissolved drug was determined by UV spectrophotometry at 248 and 285 nm

for flurbiprofen and carbamazepine, respectively

27,28

. The percentage of drug

solubilised (w/v) was plotted against the concentration of surfactant in micellar form

(i.e. subtracting the value of the CMC from the experimental concentration). From the

slope, the amount of drug solubilised in the micelles (w/w) was obtained.

3. Results and Discussion

3.1 Determination of the CMC

Fig. 2 shows the results of the CMC determination using the dye-solubilisation

experiment. The absorbance of MSF-PAN solutions at fixed PAN concentration and

increasing MSF is shown as a function of MSF concentration, plotted in logarithmic

scale. The values are average values of triplicate measurements; the error bars are

about the size of the symbols and therefore are not shown for clarity. The point of

absorbance increase corresponds to the onset of micellar formation. By this method,

the CMC was estimated at 0.41 ± 0.005 g/L (ca. 0.04 wt%). A number of physico-

chemical properties of surfactant solutions change once they start aggregating into

micelles, and these alterations are used to determine the value of the CMC. For

comparison, the CMC of Quillaja saponin enriched fractions obtained from surface

tension measurements gave a CMC of 0.13 g/L for a highly purified fraction (S-4521)

while a lower grade fraction gave a CMC of 0.51 g/L for surface tension

measurements and 0.56 g/L using the dye solubilisation technique

7,8

. A CMC of 0.339

g/L was obtained for a commercialy available mixture of saponins from Panax

notoginseng saponins

. CMC from both mixtures of Quillaja and Panax notoginseng

are of the same order as the CMC found in our fraction from mate Ilex paraguariensis.

For isolated saponins obtained from soya, the CMC values determined using the

Wilhemy plate methodology were between 0.56 to 3.2 g/L

Figure 2. Absorbance of MSF-PAN solutions at fixed (7.5 µM) PAN

concentration and increasing MSF (1.53 × 10

-5

to 2%).

3.2 Transmission Electron Microscopy

TEM photomicrographs of MSF micelles (Fig. 3A and 3B) revealed the presence

of elongated micelles of length higher than 500 nm. Cryo-TEM was used to confirm

this finding; Cryo-TEM is considered to be a more accurate representation of the

sample as by circumventing the use of staining, it avoids the artefacts often associated

with the technique. Cryo-TEM images presented in Fig. 4 also confirmed the

occurrence of elongated structures, reminiscent of wormlike micelles. Smaller

particles are also visible, which may be attributed to small spherical micelles. There

are very few published data on the characterization of saponin micelles and, to our

knowledge; these are the first reported Cryo-TEM pictures on elongated saponin

aggregates. The occurrence of small size micelles (< 25 nm of diameter) for saponins

of Quillaja has been demonstrated by TEM

and larger structures such as wormlike

micelles have only been observed upon the addition of other components such as

cholesterol and phospholipids

30-32

Figure 3. TEM photomicrographs of MSF solution at 0.6% (w/v): A)

Magnification x 40,000 (scale bar 500 nm); B) Magnification x100,000 (scale bar 200

nm).

Figure 4. Cryo-TEM images of MSF solution at 4% (w/v): A) Magnification ×

25,000 (scale bar 100 nm); B) Magnification × 19,000 (scale bar 200 nm)

3.3 Small angle neutron scattering

The structure of saponin aggregates was further investigated by SANS. Fig. 5

shows the scattering curves obtained from solutions of MSF of 0.5 and 1.0% (w/v) and

the corresponding Guinier plots. The concentrations were chosen as being low enough

to avoid inter-particle interactions in the analysis of the data and high enough to

optimize signal-to noise ratio. The absence of a structure factor was indeed confirmed

by normalisation of the curves by the volume fraction and verifying that they

superimposed (not shown).

Two distinct regions can be distinguished from the scattering behaviour: at low-

Q, the scattering increases following approximately a Q

-2

behaviour; above this region

(from Q ~ 0.025 Å

1), a plateau is found, followed by a decrease in intensity and

typical Porod-like behaviour (Q

-4

) at high Q. A Guinier analysis performed in the mid-

Q region (0.025-0.085 Å

-1

) gave a very good linear fit (Fig. 6, inset), leading to a

radius of gyration of 17 Å at both concentrations. Assuming spheres, this gives a

radius of 22 Å. The scattering in this region could be fitted by a simple sphere model,

while the steeper increase in intensity in the lower-Q (below ca. 0.025Å

-1

) was

attributed to the scattering from larger aggregates, of which the full length is outside

the measurable Q range. A model to fit the full Q-range was constructed by adding a

Porod term, A × Q

, to the scattering of small spheres. N was found to be ~ -3.6 and

the radius of small spherical scattering objects in the mid-to-high Q region was 17.9 ±

0.8 Å at both concentrations, with a polydispersity R/

= 0.2. These are likely to be

saponin micelles, formed by one or several of the species in the saponin mixture. This

size is comparable to the size of micelles found in Quillaja-enriched fraction, namely

around 30 Å radius

. The ‘scale’ parameter (Equation 4) returned by the fit and

proportional to the volume fraction (see Materials and Methods) is obviously lower

than the expected one as the material included in the larger aggregates is not accounted

for. Comparing both fitted and experimental values gives an estimate of the volume

fraction of material included in the spherical micelles. Values of 23.1 ± and 32.6 ± 1.0

% were obtained for 0.5 and 1.0% concentrations, respectively, showing that only a

small fraction of MSF aggregates as spherical micelles. The presence of larger

scattering objects in the low Q region concurs with the findings from the TEM and

Cryo-TEM images showing elongated aggregates. These results seem to indicate that a

fraction of saponins self-assemble into spherical micelles, while some of the species

present in the mixture aggregates into wormlike micelles.

Figure 5. Small-angle scattering data obtained from MSF solutions at 0.5%

(squares) and 1.0% (triangles): row and fitted SANS data where the solid lines are best

fits to the curves, using the model described in the text. Both axes are presented in log

scale. Insert: Guinier plot

3.4 Rheology measurements

Fig. 6 shows the elastic (G') and viscous (G'') modulus of MSF solutions as a

function of strain (%) for two concentrations of MSF, namely, 0.25 and 4 w/v %. Both

present similar profiles with a linear viscoelastic region below 1.6% strain, mostly

independent of the concentration. This profile suggests the occurrence of weakly self-

assembled structures, with G' well above G'' in this region.

Figure 6. Dynamic strain sweep measurements of MSF solutions at 0.25 and 4.00

% (w/v), with strain varying from 0.05 to 100% at 1 Hz and 25°C.

Fig. 7 shows dynamic frequency sweep measurements of MSF solutions ranging

in concentration from 0.25 to 4.00 w/v%.

The data show the occurrence of viscoelastic behaviour, with G' > G'' over the

whole range of frequencies measured and the existence of slow relaxation processes

(the longest relaxation time, τ

max

, which is the cross-over between G' and G'' is τ

max

>10

s). The behaviour is reminiscent of the G' plateau in the rubbery region of

concentrated polymer solutions, with a very slight increase in G' with frequency and

decrease of G'' towards a minimum, with G'/ G'' ~ 15 at the minimum. Although the

values of the storage modulus are relatively weak (G' ~ 60 Pa), this visco-elastic

behaviour could not occur in a solution of small spherical micelles and can only be

explained by the presence of large interacting aggregates or entanglements of

elongated structures on some length scale. Therefore, this is a strong indication that

long and flexible aggregate structures are present, which also concurs with the findings

from TEM and Cryo-TEM. Surprisingly however, we note that the elasticity does not

increase much with concentration, suggesting that the structures do not significantly

grow in size within the range of concentration evaluated.

Figure 7. Dynamic frequency sweep measurements of MSF solutions ranging in

concentration from 0.25 to 4.00 w/v% at 25°C.

3.5 Micellar Solubilisation

Solubilisation by means of surfactants micelles is a well-known method to

enhance the bioavailability of poorly soluble drugs. The use of non-toxic and non-

irritating saponins seems to be an interesting alternative to more commonly used

surfactants and some reports can be found on the solubilisation of hydrophobic

compounds in saponins

6,33-35

In this work, carbamazepine and flurbiprofen were

selected as weak basic and weak acidic drug models, respectively, and the

solubilisation ability of MSF was compared to saponins from Quilaja. Both drugs have

been the subject of extensive studies to date

36-41

and their physical and chemical

properties are therefore well established.

Considering that pH can influence the solubility of ionizable compounds, pH

measurements were undertaken for each saponin solution in the absence of drug.

Conductivity was also analyzed as a descriptive parameter (Table 1).

Table 1. Conductivity and pH values for MSF and Quillaja in the absence of

model drugs.

[Surfactant] in

relation to CMC

Conductivity

(µS cm

-1

)

Quillaja 10 4.91 63.7

50 4.72 148.7

100 4.74 241

MSF 10 5.29 33.5

50 5.19 127.3

100 5.04 239

According to Table 1, all pH values are reasonably similar (RSD < 5%), which

allowed the comparison of the solubilisation effect of surfactants in the absence of

buffers. The conductivity of MSF reveals the presence of at least one ionic saponin,

since conductivity values increase significantly while pH decreases smoothly. The

values obtained are equivalent to those obtained from Quillaja, in which glucuronic

acid is one of the components

The values of pKa of flurbiprofen and carbamazepine are 4.22

and 13.9

respectively. Flurbiprofen is just slightly ionized and carbamazepine is ionized at the

analysis conditions. The solubilisation profile for both Quillaja and MSF is presented

on Fig. 8. From the curves is clear that the solubilisation of carbamazepine is higher

than flurbiprofen, which is probably influenced by the pH of both saponin fractions in

aqueous solutions. Curves linear regression as well as its determination coefficients are

demonstrated in Table 2.

Figure 8. Micellar solubilisation of carbamazepine (open symbol) and

flurbiprofen (filled symbols) using MSF (triangles) and Quillaja (squares).

Table 2. Linear regressions and determination coefficients for the solubilisation

of model drugs using MSF and Quillaja varing from 0.13 to 1.5 % (w/v)

Carbamazepine Flurbiprofen

Quillaja y = 0.0088x + 0.0238 (R

0.9675) y = 0.0257 x + 0.006 (R

0.9949)

MSF y = 0.0145x + 0.0231 (R

0.9719) y = 0.0129x + 0.002 (R

0.9999)

Considering that the intercept is correlated with the drug solubility in the absence

of surfactants, it can be concluded that results of both saponin mixtures were

comparable and the slightly difference of pH from both solutions didn’t affect strongly

the drug solubilisation. From the slope, it is possible to obtain the percentage of drug

solubilised on micelles (w/w), and it can be observed that Quillaja and MSF possess

different performances toward the drugs. MSF was able to improve carbamazepine

solubility in a higher amount while Quillaja was more effective toward flurbiprofen.

This demonstrates the influence of both chemical composition and micelles shape on

the proposed application.

100

For comparison, the amount of carbamazepine solubilised at a 1% MSF solution

was of 1.54 mM which was comparable to the improvement obtained using an aqueous

solution of pluronic micelles in the absence of pH control

. The performance of both

mixtures toward flurbiprofen was lower than the increase in the solubility obtained

with the use of Tween 20 at pH 5.4, which showed a molar solubilisation capacity of

0.32

, nevertheless they cannot be considered negligible.

4. Conclusions

The work presented here present for the first time quantitative physico-chemical

data on Ilex paraguarienis saponins. A combination of TEM, Cryo-TEM and small-

angle neutron scattering measurements concurred to show that the saponins mixture

formed both small spherical micelles of ~18 Å radius and elongated micellar

aggregates, reminiscent of wormlike micelles, at a critical micellar concentration of

0.41 g/L. The presence of elongated structures gave the saponins solutions a

viscoelastic behaviour, with low dependency on solution concentration (up to 4 wt%).

Saponin micelles demonstrated different abilities toward the solubilisation of model

drugs with MSF being successfully used to improve the aqueous solubility of the weak

basic drug, which make them promising materials for such application.

101

Acknowledgments

The authors are grateful to CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal

de Nível Superior) and CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico) for financial support. The ARES rheometer used in this study was

funded by EPSRC as part of research grant EP/F037902/1. ISIS is acknowledged for

the provision of neutron beam time.

102

References

1. Schramm LL, Stasiuk EN, Marangoni DG 2003. Surfactants and their

applications. Annual Reports on the Progress of Chemistry - Section C 99:3-48.

2. Sun HX, Xie Y, Ye YP 2009. Advances in saponin-based adjuvants. Vaccine

27(12):1787-1796.

3. Güçlü-Ustundag O, Mazza G 2007. Saponins: Properties, applications and

processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 47(3):231-258.

4. Vincken JP, Heng L, de Groot A, Gruppen H 2007. Saponins, classification and

occurrence in the plant kingdom. Phytochemistry 68(3):275-297.

5. Pillion DJ, Amsden JA, Kensil CR, Recchia J 1996. Structure-function

relationship among Quillaja saponins serving as excipients for nasal and ocular

delivery of insulin. Journal of Pharmaceutical Sciences 85(5):518-524.

6. Mitra S, Dungan SR 2001. Cholesterol solubilization in aqueous micellar

solutions of quillaja saponin, bile salts, or nonionic surfactants. Journal of Agricultural

and Food Chemistry 49(1):384-394.

7. Mitra S, Dungan SR 1997. Micellar Properties of Quillaja Saponin. 1. Effects of

Temperature, Salt, and pH on Solution Properties. Journal of Agricultural and Food

Chemistry 45(5):1587-1595.

8. Mitra S, Dungan SR 2000. Micellar properties of quillaja saponin. 2. Effect of

solubilized cholesterol on solution properties. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces

17(2):117-133.

9. Wang ZW, Gu MY, Li GZ 2005. Surface properties of Gleditsia saponin and

synergisms of its binary system. Journal of Dispersion Science and Technology

26(3):341-347.

10. Balakrishnan S, Varughese S, Deshpande AP 2006. Micellar characterisation of

saponin from Sopindus mukorossi. Tenside, Surfactants, Detergents 43(5):262-268.

11. Xiong J, Guo J, Huang L, Meng B, Ping Q 2008. Self-micelle formation and the

incorporation of lipid in the formulation affect the intestinal absorption of Panax

notoginseng. International Journal of Pharmaceutics 360(1-2):191-196.

12. Decroos K, Vincken JP, van Koningsveld GA, Gruppen H, Verstraete W 2006.

Preparative chromatographic purification and surfactant properties of individual

soyasaponins from soy hypocotyls. Food Chemistry 101(1):324-333.

13. Heck CI, Mejia EG 2007. Yerba mate tea (Ilex paraguariensis): A

comprehensive review on chemistry, health implications, and technological

considerations. Journal of Food Science 72(9):138-151.

103

14. Taketa ATC, Breitmaier E, Schenkel EP 2004. Triterpenes and triterpenoidal

glycosides from the fruits of Ilex paraguariensis (Mate). Journal of the Brazilian

Chemical Society 15(2):205-211.

15. Schubert A, Pereira DF, Zanin FF, Alves SH, Beck RCR, Athayde ML 2007.

Comparison of antioxidant activities and total polyphenolic and methylxanthine

contents between the unripe fruit and leaves of Ilex paraguariensis A. St. Hil.

Pharmazie 62(11):876-880.

16. Gosmann G. 1989. Porto Alegre: Saponinas de Ilex paraguariensis A. St. Hil.

(erva-mate) Universidade Federal do Rio Grande do Sul. 108. Dissertação (Mestrado

em Farmácia).

17. Kraemer KH, Taketa ATC, Schenkel EP, Gosmann G, Guillaume D 1996.

Matesaponin 5, a highly polar saponin from Ilex paraguariensis. Phytochemistry

42(4):1119-1122.

18. Martinet A, Ndjoko K, Terreaux C, Marston A, Hostettmann K, Schutz Y 2001.

NMR and LC-MSn characterisation of two minor saponins from Ilex paraguariensis.

Phytochemical Analysis 12(1):48-52.

19. Pavei C, Guzatto P, Ros Petrovick P, Gosmann G, González-Ortega G 2007.

Development and validation of an HPLC method for the characterization and assay of

the saponins from Ilex paraguariensis A. St.-Hil (mate) fruits. Journal of Liquid

Chromatography and Related Technologies 30(1):87-95.

20. Gnoatto SCB, Schenkel EP, Bassani VL 2005. HPLC method to assay total

saponins in Ilex paraguariensis aqueous extract. Journal of the Brazilian Chemical

Society 16(4):723-726.

21. Peixoto MPGP, Canto GS, Holz CL, Resende PE, Treter J, Roehe P, Ortega

GG. 2008. Hemolysis and skin irritancy evaluation of Ilex paraguariensis A. St-Hil.

saponins XII Congreso de La Federación Farmacéutica Sudamericana, Montevideo.

22. Treter J, Peixoto MPG, Giordani RB, Kaiser S, Tasca T, Ortega GG. 2009.

Atividade tricomonicida de saponinas de Ilex paraguariensis A. St. Hil. (Mate).

Congresso Internacional em Saúde da Universidade e III CISDEM (Cátedra

Iberoamericano-Suiza de Desarrollo de Medicamentos), Maringá.

23. Koike K, Jia Z, Nikaido T 2001. New triterpenoid saponins from Maesa tenera.

Chemical and Pharmaceutical Bulletin 49(6):758-761.

24. Pavei C. 2004. Porto Alegre: Desenvolvimento de métodos analíticos e

tecnológicos aplicados à fração saponosídica presente nos frutos de Ilex

paraguariensis A. St. Hil. . Universidade Federal do Rio grande do Sul. 134. Master

Thesis.

104

25. Furton KG, Norelus A 1993. Determining the critical micelle concentration of

aqueous surfactant solutions: Using a novel colorimetric method. Journal of Chemical

Education 70(3):254-257.

26. Kratky O 1963. X-ray small angle scattering with substances of biological

interest in diluted solutions. Progress in Biophysics and Molecular Biology

13(C):105-173,IN101.

27. Sajeev C, Jadhav PR, RaviShankar D, Saha RN 2002. Determination of

flurbiprofen in pharmaceutical formulations by UV spectrophotometry and liquid

chromatography. Analytica Chimica Acta 463(2):207-217.

28. Rane Y, Mashru R, Sankalia M, Sankalia J 2007. Effect of hydrophilic

swellable polymers on dissolution enhancement of carbamazepine solid dispersions

studied using response surface methodology. AAPS PharmSciTech 8(2).

29. Demana PH, Davies NM, Vosgerau U, Rades T 2004. Pseudo-ternary phase

diagrams of aqueous mixtures of Quil A, cholesterol and phospholipid prepared by the

lipid-film hydration method. International Journal of Pharmaceutics 270(1-2):229-

239.

30. Demana PH, Davies NM, Hook S, Rades T 2005. Quil A-lipid powder

formulations releasing ISCOMs and related colloidal stuctures upon hydration. Journal

of Controlled Release 103(1):45-59.

31. Pham HL, Shaw PN, Davies NM 2006. Preparation of immuno-stimulating

complexes (ISCOMs) by ether injection. International Journal of Pharmaceutics

310(1-2):196-202.

32. Myschik J, Lendemans DG, McBurney WT, Demana PH, Hook S, Rades T

2006. On the preparation, microscopic investigation and application of ISCOMs.

Micron 37(8):724-734.

33. Schopke T, Bartlakowski J 1997. Effects of saponins on the water solubility of

quercetin. Pharmazie 52(3):232-234.

34. Song S, Zhu L, Zhou W 2008. Simultaneous removal of phenanthrene and

cadmium from contaminated soils by saponin, a plant-derived biosurfactant.

Environmental Pollution 156(3):1368-1370.

35. Urum K, Pekdemir T 2004. Evaluation of biosurfactants for crude oil

contaminated soil washing. Chemosphere 57(9):1139-1150.

36. Park KM, Kim CK 1999. Preparation and evaluation of flurbiprofen-loaded

microemulsion for parenteral delivery. International Journal of Pharmaceutics

181(2):173-179.

37. Muraoka A, Tokumura T, Machida Y 2004. Evaluation of the bioavailability of

flurbiprofen and its β-cyclodextrin inclusion complex in four different doses upon oral

105

administration to rats. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics

58(3):667-671.

38. Li P, Zhao L 2003. Solubilization of flurbiprofen in pH-surfactant solutions.

Journal of Pharmaceutical Sciences 92(5):951-956.

39. Javadzadeh Y, Jafari-Navimipour B, Nokhodchi A 2007. Liquisolid technique

for dissolution rate enhancement of a high dose water-insoluble drug (carbamazepine).

International Journal of Pharmaceutics 341(1-2):26-34.

40. Kogan A, Aserin A, Garti N 2007. Improved solubilization of carbamazepine

and structural transitions in nonionic microemulsions upon aqueous phase dilution.

Journal of Colloid and Interface Science 315(2):637-647.

41. Savolainen M, Kogermann K, Heinz A, Aaltonen J, Peltonen L, Strachan C,

Yliruusi J 2009. Better understanding of dissolution behaviour of amorphous drugs by

in situ solid-state analysis using Raman spectroscopy. European Journal of

Pharmaceutics and Biopharmaceutics 71(1):71-79.

42. Soltysik S, Wu JY, Recchia J, Wheeler DA, Newman MJ, Coughlin RT, Kensil

CR 1995. Structure/function studies of QS-21 adjuvant: Assessment of triterpene

aldehyde and glucuronic acid roles in adjuvant function. Vaccine 13(15):1403-1410.

43. Saveyn P, Cocquyt E, Zhu W, Sinnaeve D, Haustraete K, Martins JC, Van Der

Meeren P 2009. Solubilization of flurbiprofen within non-ionic Tween 20 surfactant

micelles: A 19F and 1H NMR study. Physical Chemistry Chemical Physics

11(26):5462-5468.

44. Queiroz RHC, Bertucci C, Malfará WR, Dreossi SAC, Chaves AR, Valério

DAR, Queiroz MEC 2008. Quantification of carbamazepine, carbamazepine-10,11-

epoxide, phenytoin and phenobarbital in plasma samples by stir bar-sorptive extraction

and liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis

48(2):428-434.

45. Kadam Y, Yerramilli U, Bahadur A 2009. Solubilization of poorly water-

soluble drug carbamezapine in Pluronic micelles: Effect of molecular characteristics,

temperature and added salt on the solubilizing capacity. Colloids and Surfaces B:

Biointerfaces 72(1):141-147.

CAPÍTULO 5

DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÃO

109

O desenvolvimento e qualificação de um processo tecnológico de

fracionamento de substâncias a partir de materiais vegetais requerem um adequado

monitoramento do processo.

Pavei (2007) propôs um método analítico por CLAE-UV isocrático, com foco

na quantificação das saponinas mais polares dos frutos do mate, utilizando como

padrão externo a matessaponina-3, uma saponina isolada das folhas de mate.

Diferentemente desse, o método ora proposto visou abranger também a fração de

saponinas menos polares, utilizando ilexosídeo II como referência, saponina

anteriormente isolada a partir dos frutos de mate. O método foi validado para o extrato

bruto liofilizado e posteriormente aplicado à fração saponosídica enriquecida, o que

possibilitou o controle mais amplo do processo de purificação. A capacidade do

método de detectar saponinas com uma ampla faixa de polaridade foi confirmada

mediante a análise de substâncias-referência obtidas a partir de outras espécies do

gênero Ilex, com padrões de substituição e polaridade distintos, incluindo saponinas

mono e bidesmosídicas. O teor de saponinas determinado para os frutos verdes de

mate confirmou relatos anteriores acerca da riqueza destes como fontes de saponinas,

alcançando valores próximos a 7,30 g% em relação ao peso seco do fruto. Por sua vez,

a abordagem utilizada para a obtenção da fração saponosídica enriquecida (MSF),

adaptada de Pavei (2004), permitiu um alto rendimento em relação ao extrato bruto

liofilizado (43,6 g%). A análise comparativa por CLAE-UV do extrato bruto

liofilizado de MSF indica que o processo é capaz de eliminar de modo eficiente

polifenóis e metilxantinas, compostos caracterizados pelo seu menor tempo de eluição

e absorção característica acima de 215 nm. Este fato, já anteriormente relatado por

Pavei (2004), foi confirmado mediante análise por CLAE-MS, uma vez que as

substâncias detectadas na fração apresentaram massas moleculares de 950 a 1600 Da,

coerentes com o previsto para saponinas já relatadas para mate. Adicionalmente, ao se

comparar ponderalmente o rendimento da fração saponosídica em relação ao extrato

liofilizado (43,6 g%) com o teor de saponinas totais estimado pelo método analítico

(47,6 g%), notam-se valores bastante semelhantes, os quais denotam que o método de

fracionamento possibilitou a recuperação quase completa das saponinas presentes no

extrato liofilizado.

110

De modo geral, o potencial hemolítico e citotóxico das saponinas é uma das

principais limitações à sua aplicação biológica. Sendo o volume de informações

relativas aos frutos bastante restrito, a fração saponosídica de mate foi avaliada quanto

ao seu potencial hemolítico e citototóxico, ambos em modelos in vitro. O efeito

citotóxico de MSF foi avaliado utilizando linhagem de células de rim bovino MDBK,

um ensaio que indica a toxicidade via quantificação da atividade mitocondrial das

células após exposição à substância teste. O efeito da fração de saponinas de mate foi

comparado com uma fração enriquecida de Quillaja saponaria e com os tensoativos

não-iônicos tiloxapol e polissorbato 80. Com isso, mais do que uma comparação

guiada por parâmetros químicos, levou-se em consideração a natureza anfifílica das

substâncias testadas. O efeito citotóxico de MSF foi observado somente na maior

concentração ensaiada (5,0 g/L), tendo sido inferior à observada para os tensoativos

sintéticos, enquanto que a fração saponosídica de quillaia mostrou ser citotóxica em

todas as concentrações ensaiadas (0,05 a 5,0 g/L). O valor de IC

para MSF pôde ser

estimado em 3,8 g/L ou 4,10 mM, se expresso em ilexosídeo II. Comparativamente, os

valores de IC

de citotoxicidade sobre linhagem não-tumorais de fibroblastos,

relatados para algumas saponinas naturais e sintéticas derivadas do ácido oleanólico,

variaram de 6 a 60 µM (Gauthier et al., 2009).

Quanto à propriedade de hemólise, a ausência dessa atividade foi previamente

relatada para extratos da folhas do mate (Gosmann, 1989). Contudo, essa constatação

não é aplicável para o caso dos frutos, considerando a diferença de composição

química entre as frações saponosídicas de frutos e folhas de mate relatada por Taketa

(2004a). O valor de IC

de MSF foi estimado

em 0,25 g/L ou 2,5 mM, se expresso em

ilexosídeo II. Em comparação, saponinas de quillaia apresentam IC

de 0,0125 g/L ou

0,0077 mM, se expresso pelo valor médio de massa molecular relatada para esse

produto (Mitra; Dungan, 2001).

Os resultados obtidos para os testes de citotoxicidade e hemólise indicam

claramente uma baixa toxicidade para MSF, o que representa uma potencial vantagem

para seu uso, quer seja em ensaios biológicos ou desenvolvimento de produto à base

de saponinas de mate.

111

A capacidade de algumas saponinas de potencializar a resposta imune como

adjuvantes em vacinas tem sido, possivelmente, a propriedade biológica mais avaliada,

principalmente no caso das saponinas de quillaia. As primeiras evidências foram

relatadas na década de 30, quando se demonstrou a atividade significativa de uma

mistura de saponinas obtidas dessa espécie. Na década de 80, esta atividade começou

as ser melhor caracterizada, sendo comprovada a capacidade de estimular tanto a

imunidade humoral quanto a celular. Desde então outras espécies têm sido avaliadas

sob a forma de mistura ou substância isolada. O fato de as saponinas serem capazes de

estimular uma resposta celular, o que muitas vezes não ocorre no caso do hidróxido de

alumínio, adjuvante aprovado para uso humano, fez com que o interesse pelas

saponinas fosse ampliado. No presente trabalho, o modelo experimental selecionado

emprega herpesvírus bovino como antígeno, o qual foi anteriormente utilizado para o

ensaio de saponinas de Q. brasiliensis (Fleck et al., 2006). O modelo se mostrou

adequado em função dos resultados obtidos para os controles positivos Quil-A e

hidróxido de alumínio, porém o efeito de MSF não foi significativo estatisticamente.

Diversas atividades biológicas das saponinas decorrem da sua capacidade de

interagir com membranas biológicas. Nesse sentido sua atividade tem sido avaliada

frente a diversos patógenos como vírus, protozoários, fungos e moluscos (Francis et

al., 2002). As saponinas de mate foram ensaiadas quanto à sua atividade

tricomonicida, considerando a existência de um relato prévio para as saponinas de

Sapindus mukorossi (Tiwari et al., 2008). A avaliação comparativa com outras

substâncias tensoativas teve como base o caráter anfifílico e a atividade potencial

sobre interfaces orgânicas. Mais ainda, MSF foi testada na forma de pré-tratamento e

co-administração com o fármaco de referência metronidazol, na tentativa de observar

indicativos de seu mecanismo de ação e ampliar conhecimentos relativos à sua

interação com membranas biológicas. MSF apresentou um efeito concentração-

dependente, com letalidade total dos trofozoítos na concentração de 0,60 g/L. Essa

atividade foi superior ao efeito observado para os tensoativos sintéticos, testados em

concentrações superiores à concentração micelar crítica. Comparativamente à

atividade relatada para as saponinas de Sapindus mukorossi, MSF apresentou, contudo,

um efeito inferior. Para as saponinas de S. mukorossi foi observado efeito ainda abaixo

112

da sua concentração micelar crítica, sendo sugerido um mecanismo de ação baseado na

atividade sobre o citoesqueleto das tricomonas. No caso de MSF, a atividade aparece

apenas após a formação das micelas.

Ainda que a concentração efetiva seja superior à observada para Sapindus, esta

concentração não gerou toxicidade sobre o modelo de células de rim bovino e,

portanto, provavelmente não inviabilizaria a sua aplicação. Tanto o pré-tratamento

quanto a co-administração de MSF e metronidazol não geraram um incremento de

atividade. Isto demonstra que as saponinas não favoreceram a penetração celular do

fármaco e que, adicionalmente, não houve interação entre o fármaco e MSF.

A terceira etapa do trabalho objetivou um aprofundamento no estudo físico-

químico das saponinas enquanto substâncias anfifílicas, dando continuidade aos

achados preliminares relatados por Canto (2007).

As aplicações das saponinas no âmbito químico-farmacêutico, tanto industrial

quando em nível de pesquisa, dependem primeiramente de uma ampla caracterização

química e físico-química. O uso de tensoativos como agentes espumantes,

solubilizantes de fármacos hidrofóbicos, promotores de permeação, agentes

emulsionantes, entre outros, tem por princípio fundamental as propriedades de

interface e a formação de micelas, o que também se aplica às saponinas. Nesse sentido,

esta etapa do trabalho teve por enfoque a caracterização das micelas quanto a forma e

tamanho, seu comportamento reológico em solução, assim como na capacidade

solubilizante via micelar, utilizando duas substâncias modelo. Os dados referentes à

sua atividade de supefície foram incorporados ao trabalho sob a forma de anexo (Ver

anexo I).

Embora MSF seja composta por uma mistura de saponinas com ligeiras

variações estruturais, a CMC apresentou uma faixa de valores restrita e bem definida

em torno de 0,40 g/L. A análise por microscopia eletrônica de transmissão (MET)

mostrou micelas de tamanho superior a 500 nm, valor este, superior ao relatado

inicialmente por Canto (2007). Igualmente, foi possível constatar a ocorrência

predominante de micelas de forma filiforme, similar à observada em micelas

113

tipicamente worm-like. Este fato havia sido relatado para saponinas apenas quando

associadas a outras substâncias como colesterol, e no caso de tensoativos sintéticos

após adição de sais e co-tensoativos. No caso das saponinas de mate, estas estruturas

se formam de maneira espontânea, em uma ampla faixa de concentração.

Entretanto, a análise por MET, ainda que forneça fortes indicativos do padrão

estrutural de MSF, apresenta a desvantagem de necessitar da adição de agentes de

contraste e da ocorrência de perda de água na amostra durante seu preparo e análise.

Tais fatos podem gerar: I) aparecimento de artefatos; II) transição de forma em função

da diminuição do conteúdo aquoso. Com a finalidade de confirmar os dados anteriores,

foram feitas novas análises por crio-microscopia eletrônica de transmissão (CRIO-

MET). Essa técnica traz como vantagens o fato de dispensar o uso de agentes de

contraste e de que a amostra é previamente congelada, sendo mantida, portanto, em

condições mais próximas do seu estado em solução. Assim, o padrão estrutural

diferenciado de MSF foi igualmente detectado por CRIO-MET. Simultaneamente,

foram observadas algumas micelas esféricas de tamanho reduzido.

A análise pela técnica de espalhamento de nêutrons constatou a ocorrência

simultânea de micelas de tamanho elevado e de micelas esféricas de tamanho

reduzido, sendo estas últimas da ordem de 18 Å, correspondendo a cerca de 20 e 30%

da composição total de micelas, para as concentrações de 0,5 e 1,0 % (m/v) de MSF,

respectivamente.

Uma vez que o tipo de comportamento reológico é influenciado pela forma das

moléculas ou partículas, foi realizada a análise por reologia dinâmica com controle de

deformação. Observou-se que a diminuição implícita na parcela de micelas filiformes

não gerou qualquer modificação detectável no perfil reológico das soluções, as quais

demostraram comportamento viscoelástico invariável em todas as concentrações

avaliadas (0,25 a 4,0 % m/v), com módulo elástico (G’) bastante superior ao módulo

viscoso (G’’). Tal observação também confirma a presença de agregados não-

esféricos, já que micelas esféricas não geram a estruturação necessária ao

aparecimento de comportamento elástico.

114

Para todas as concentrações de MSF foi observado o mesmo valor de G’, ou

seja, as interações estabelecidas pelas micelas filiformes parecem não variar com a

concentração. O mesmo parece acontecer em relação ao comprimento das micelas. Tal

fato pode estar relacionado ao aumento do número das mesmas em detrimento da

transição de forma. Os valores de G’ e G’’ não sofrem alteração em função da

freqüência, para todas as concetrações, caracterizando um tempo longo de relaxação

superior a 100s. Considerando que o tempo longo de relaxação está associado à

ruptura e reorganização das micelas, este valor denota que em sua região de

viscoelasticidade linear, que ocorre a baixos valores de deformação, as micelas de

mate apresentam significativa estabilidade.

A observação de características inalteradas após manuseios diferentes, em testes

diferentes, também sugere a ocorrência de micelas saponosídicas termodinamicamente

estáveis, um fato a ser esclarecido ainda.

A aparente robustez desses agregados micelares pode estar associada ao

desempenho não tão satisfatório observado nos ensaios biológicos, que seriam

favorecidos pela desestruturação das micelas e, consequentemente, pela atividade das

saponinas como entes individuais. No caso da atividade imunoadjuvante, o alto valor

de tamanho das micelas também pode ter contribuído para o resultado observado.

Finalmente, as saponinas foram avaliadas como agente solubilizante, uma

propriedade associada à capacidade de formação de micelas. Para isso, foram

utilizados os fármacos flurbiprofeno e carbamazepina, ambos substâncias modelo

pouco solúveis. A fração saponosídida de quillaia foi empregada como produto

saponosídico de comparação.

A análise de condutividade demonstrou que tanto MSF como quillaia

apresentam ácidos carboxílicos em sua estrutura, no entanto, o desempenho de ambos

em relação à capacidade de solubilização foi oposto. Quillaia foi mais eficiente frente

ao flurbiprofeno, um ácido fraco, enquanto MSF foi mais efetiva frente à

carbamazepina, uma base fraca. Isso demonstra a influência da composição e forma

micelar sobre a aplicação proposta e reflete, ainda, uma maior dificuldade na predição

115

do comportamento de misturas de saponinas. No entanto, como vantagem, os

tensoativos de origem natural apresentam maior grau de biocompatibilidade e

biodegradabilidade.

117

Conclusões

 Um método analítico foi adequadamente desenvolvido e validado para o extrato

bruto de mate, utilizando ilexosídeo II como marcador químico, visando estimar o

conteúdo total de saponinas e o monitoramento do processo de fracionamento-

enriquecimento de uma fração saponosídica;

 O processo de obtenção da fração saponosídica de mate (MSF) mostrou-se

reprodutível e de elevado rendimento;

 Todas as substâncias detectáveis em MSF mostraram comportamento

cromatográfico por CLAE e massas moleculares características de saponinas;

 Os valores de IC

obtidos em testes de hemólise e citotoxicidade frente a

culturas de células de mamíferos indicam um produto de baixa toxicidade;

 A avaliação biológica da fração apontou uma fraca atividade imunoadjuvante e

moderada atividade tricomonicida;

 A caracterização físico-química do produto MSF indica fortemente a

ocorrência, inédita até onde se saiba, de micelas filiformes, com tamanho da ordem de

500 nm, com elevado grau de organização, associadas a uma parcela menor de micelas

esféricas de aproximadamente 20 Å;

 As estruturas fliliformes relatadas pela primeira vez para saponinas, se formam

de maneira espontânea, diferindo das estruturas similares, tipo wormlike, relatadas

para tensoativos sintéticos, as quais, em geral, requerem a adição de sais e co-

tensoativos para sua formação;

 A capacidade solubilizante dessas micelas foi evidenciada para a base fraca

carbamazepina, porém mostrou-se menos eficaz para o ácido fraco flurbiprofeno;

Esse conjunto de dados abre, certamente, novas possibilidades para o potencial

uso das saponinas de mate como adjuvante e carreador de interesse na área

farmacêutica.

ANEXOS

ANEXO 1 Caracterização da droga vegetal e obtenção da solução

extrativa

123

1. CARACTERIZAÇÃO DA DROGA VEGETAL

1.1 Secagem e moagem da droga vegetal

Os frutos verdes foram separados manualmente dos galhos e secos em estufa de

ar circulante à temperatura de 40 ± 3°C por 72 horas. Após a secagem, os frutos foram

submetidos a moagem, em moinho de facas desprovido de malha.

1.2 Determinação da perda por dessecação (Farmacopéia Brasileira, 1988)

Cerca de 1 g de material vegetal seco e moído foi acondicionado em pesa-filtro e

deixado à temperatura de 105 ± 2°C em estufa por 2 horas. Após resfriada em

dessecador durante 30 minutos a amostra foi pesada e novamente mantida em estufa,

sendo este procedimento realizado até a obtenção de peso constante. Os resultados

foram expressos como teor de umidade residual, em porcentagem, pela média de três

determinações.

1.3 Análise granulométrica (Farmacopéia Brasileira, 1988)

Cerca de 25 g de frutos secos e moídos foram submetidos a tamisação em

tamisador automático por 15 minutos sob 60 vibrações/min. Foram selecionados

tamises com abertura nominal de malha de 2,83; 1,4; 1,0 e 0,425 mm. As frações

retidas nos tamises e no coletor foram pesadas e os dados analisados pelo método

gráfico. Os resultados foram expressos pela média de três determinações.

2. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA SOLUÇÃO EXTRATIVA

2.1 Obtenção da solução extrativa

Uma solução hidroalcoólica a 40% (v/v) foi adiciona à droga vegetal na

proporção droga-solvente de 1:10 e deixada em maceração estática por 40 min, sob

124

proteção da luz. A amostra foi submetida a turbólise, em Ultra-turrax, a 11.000 rpm

por 15 min, a temperatura ambiente, sendo este período dividido em 3 etapas, com

intervalos de 3 min entre elas. A solução extrativa foi centrifugada a 2.01 g por 30 min

e filtrada sob pressão reduzida utilizando papel de filtro comum. Para caracterização

da solução extrativa, foi retomado o volume inicial adicionando-se álcool a 40%. Em

seguida. a fração orgânica foi eliminada em evaporador rotatório (55 ± 3 °C) e a fração

aquosa, congelada em freezer (-10 °C) e posteriormente liofilizada por 72 h.

2.2 Caracterização da solução extrativa

2.2.1 Determinação do resíduo seco (Farmacopéia Brasileira, 1977)

Uma amostra de 20,0 g da solução extrativa foi pesada em pesa-filtro e

concentrada em banho de água, a 90 °C, até resíduo. Em seguida, o pesa-filtro foi

mantido à temperatura de 105 ± 3°C em estufa, durante 2 horas. Após este período, foi

resfriado em dessecador por 30 minutos e pesado. Este procedimento foi repetido até

peso constante. Os resultados foram expressos em porcentagem de resíduo seco (%,

m/m), pela média de três determinações.

2.2.2 Determinação do pH (Farmacopéia Brasileira, 1988)

O pH da solução extrativa foi determinado em potenciômetro à 25 °C,

previamente calibrado. O resultado foi expresso pela média de três determinações.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Obtenção e caracterização da droga vegetal

A verificação de autenticidade e a caracterização da droga vegetal é a etapa

inicial no desenvolvimento de qualquer produto oriundo de uma matéria-prima

125

vegetal. A padronização de todas as etapas concernentes ao processamento do material

vegetal é imprescindível para estabelecer parâmetros de qualidade e obter

reprodutibilidade em lotes de produção distintos (Alberton et al., 2001).

O teor de umidade está diretamente relacionado à conservação da droga vegetal.

O valor obtido foi de 7,08% o qual pode ser considerado bastante satisfatório, dado

que o teor máximo de umidade estabelecido varia entre 8 e 14% nas diferentes

farmacopéias (Farias, 2003).

A granulometria do material vegetal pode influenciar o rendimento da etapa de

extração. Os dados referentes aos frutos de mate secos e moídos encontram-se na

Figura 1.

Abertura de malha (mm)

Droga vegetal retida (%)

100

120

Porcentagem acumula

< 0,42 0,425 < x < 1 1 < x < 1,4 1,4 < x < 2,83 < .2,83

Figura 1: Distribuição granulométrica da droga vegetal: barras – porcentagem retida;

linhas – porcentagem acumulada

A maior parte do material encontra-se na faixa de 1,4 a 2,83 mm. O pó obtido

pode ser considerado grosseiro, no entanto, considerando a alta taxa de cisalhamento

do método de extração empregado, esse valor de tamanho de partícula, provavelmente

não interfere de maneira negativa sobre o processo extrativo.

126

3.2 Caracterização da solução extrativa

O pH da solução extrativa e o teor sólidos solúveis foram de 5,18 ± 0,2 e 1,53%

± 0,02 (m/v), respectivamente. O valor de pH está de acordo com o obtido em

trabalhos anteriores (PAVEI, 2004; CANTO, 2007). O valor do teor de sólidos

encontra-se ligeiramente abaixo do anteriormente obtido, no entanto, embora, o

método de extração adotado tenha sido o mesmo, tratam-se de materiais obtidos em

épocas de coleta distintas, o que poderia justificar a variação encontrada.

127

Referências

Alberton, J. R., et al. Caracterização farmacognóstica do jambolão (Syzygium cumini

L. Skeels). Revista Brasileira de Farmacognosia, v.11, n.1, p.37-51. 2001.

Canto, G. S. Avaliação físico-química e tecnológica da fração saponosídica dos

frutos de ilex paraguariensis A. St. Hil. : potencialidade como adjuvante

espumógeno. Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2007. 215 p.

Tese (Doutorado em Farmácia).

Farias, M. R. Avaliação da qualidade de matérias-primas vegetais. In: Simões, C. M.

O. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre/Florianópolis: Editora

da UFRGS/Editora da UFSC, 2003, p.263-288.

Farmacopéia Brasileira, 3ª Ed. São Paulo: Andrei. 1977.

______. 4ª Ed. São Paulo: Ateneu. 1988.

Pavei, C. Desenvolvimento de métodos analíticos e tecnológicos aplicados à fração

saponosídica presente nos frutos de Ilex paraguariensis A. St. Hil. Porto Alegre:

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2004. 134 p. Dissertação (Mestrado em

Farmácia).

ANEXO 2 Perfil de tensão superficial da fração de saponinas

enriquecida

131

O perfil de tensão superficial foi determinado pelo método do anel de Le Comte

DuNöuy (Nima Technology DST 9005, Inglaterra), com uma velocidade de imersão

do anel de 5mm/min, a 25 ± 3 ºC (Figura 1). As soluções foram preparadas na faixa

de concentração de 0,006 a 2,7 mM utilizando água deionizada (condutividade de 2,8

µS/cm

, Milli-Q, Millipore, EUA). As concentrações molares de MSF foram expressas

em ilexosídeo II (MM 929,029). Os valores de concentração de excesso de superfície

(Γ, mol/m

) e área por molécula na interface (A

) foram calculados de acordo com

as equações 1 e 2, respectivamente (Tabela 1). O valor de abaixamento máximo da

tensão superficial na concentração micelar crítica (π

ππ

CMC

) foi determinado graficamente

a partir da Figura 1.

×−=Γ

(equação 1)

)(/1

NxA

(equação 2)

Sendo: R a constante universal dos gases (8,314 J mol

-1

); T temperatura absoluta

(K); γ

γγ

γ tensão superficial (mNm

-1

); c concentração de saponinas (mol L

-1

); N

constante de Avogadro (6,022 x 10

mol

-1

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2

(mM )

Tensão superficial (mN.m

-1

)

Figura 1. Perfil de tensão superficial de MSF na faixa de concentração de 0,006 a 2,7

mM (expresso em ilexosídeo II)

132

Tabela 1. Pressão de superfície na CMC (π

CMC

), concentração superficial de excesso

(Γ) e área por molécula na interface (A).

CMC

(mN m

-1

)

Γ (mol.m

-2

)

A (Å

)

52,8

3,5 x 10

47,45

Esses dados foram preteridos do texto principal devido à imprecisão observada

quando o método do anel se aplica à determinação de tensão superficial. A ruptura da

camada molecular superficial da fase líquida durante a determinação da tensão

superficial, assim como o efeito da massa molecular do tensoativo determinam uma

cinética mais lenta de reorganização na interface. Dessa maneira, os dados aqui

inseridos representam medidas aproximadas e indicativas das características de

superfície das saponinas de mate.

ANEXO 3 Determinação dos módulos viscoso e elástico a partir do

ensaio de reologia dinâmica

135

A técnica de reometria dinâmica permite a determinação das características

elásticas e viscosas da dispersão coloidal de saponinas, através dos respectivos

módulos G’ e G’’. Para isso, a amostra é submetida a uma deformação oscilatória,

correlacionando-se com a tensão necessária para que essa deformação seja mantida

(Radebaugh, 1996).

Ao se aplicar uma deformação senoidal em um material elástico ideal, os sinais

de onda de tensão e deformação estarão em fase. Se a amostra possuir caráter de fluído

ideal, a tensão estará defasada em 90º em relação à deformação. Para materiais

viscoelásticos, o ângulo de defasagem (δ) entre tensão e deformação estará entre 0 e

90º. A relação entre os módulos G’e G’’ é expressa pelo módulo complexo G* (Eq. 1),

o qual representa a energia total necessária para a deformação do material.

(Equação 1)

Sendo G’o módulo elástico, G’’ o módulo viscoso e i, matematicamente igual a

, uma ferramente utilizada para manter separados os componentes em fase e fora

de fase. O módulo também é dado pela relação entre as variáveis complexas de tensão

e deformação (σ*/γ*). Onde:

(Equação 2)

....... ....... .....(Equação 3)

Sendo: , a magnitude máxima da tensão; a magnitude máxima da

deformação; ω a frequência angular; t representa o tempo e .

Os módulos viscoso e elástico são derivados do módulo complexo de acordo

com as equações 4 e 5.

...... ........................(Equação 4)

.......... .......(Equação 5)

136

Experimentalmente, os sinais de onda de deformação e força são comparados à

ondas referências de amplitudes fixas tendo ângulo de fase de 0 e 90º (Figura 1). Os

dados são posteriormente transformados em vetores de onda relativos aos eixos

referências de 0 e 90º (Figura 2).

Figura 1. Comparação das ondas de força e deformação e sinais de onda referência (0°

e 90°).

Figura 2. Relação entre os vetores de força e deformação com os vetores de onda de

referência. Sendo: X: Vetor de referência, Y: Vetor de referência + 90°, F: Vetor de

força, S: vetor de deformação, θ

ângulo de defasagem força-referência, θ

: ângulo de

defasagem deformação-referência.

Dessa maneira, a partir da transformação do vetor de deformação (S) em um

novo vetor referência (Eixo X, Figura 3), é possível a determinação do ângulo de

defasagem entre ambos (θ), eliminando os vetores de referência originais (Ares, 2006).

137

Figura 3. Transformação do vetor de deformação em vetor referência e determinação

de θ. Sendo: F: vetor de força, S: vetor de deformação, X

: componente da força em

fase com a deformação, Y

: componente da força com 90º de defasagem, X: eixo de

referência da deformação, Y: eixo de referência de deformação + 90°.

O vetor de força é transformado em tensão, sendo então calculado o valor de

G*. Os valors de G’ e G’’ são obtidos de acordo com as equações 4 e 5.

As micelas apresentam valores de tempo de relaxação que também podem ser

verificados por com seu comportamento reológico. O tempo longo de relaxação, que

representa o tempo necessário para o rompimento e reconstituição das micelas é

determinado pelo cruzamento entre os perfis de G’ e G’’ (G’=G’’), quando os módulos

são avaliados em função da freqüência. Matematicamente este valor representa o

tempo necessário para a energia elástica armazenada ser dissipada e fornece indicativo

do tempo de vida ou estabilidade da micela. Micelas mais estáveis são as que

apresentam maiores valores de tempo longo de relaxação.

138

Referências

Ares rheometric series user manual, TA Instruments – Waters LLC, New Castle, 2006.

Radebaugh, G. W. Rheological and Mechanical Properties of Dispersed Systems. In:

Lierberman H. A.; Rieger, M. M.; Banker, S. B. (Org.).Pharmaceutical Dosage

Forms: Disperse Systems. New York: Marcel Dekker, 1996. p. 153-211.

ANEXO 4 Parecer do Comitê de ética em Pesquisa

141

ANEXO 5 Artigo: Avaliação da atividade imunoadjuvante da fração

de saponinas enriquecida

145

SHORT COMMUNICATION

Investigation of immunoadjuvant activity of triterpenic saponins from Ilex

paraguariensis and Uncaria tomentosa using a BoHV-5 viral vaccine

Maria P. G. Peixoto

, Cabral Pavei

, Samuel P. Cibulski

, Carine L. Holz

; Grace

Gosmann

; Paulo M. Roehe

, George G. Ortega

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga

2752, 90610-000 Porto Alegre, RS, Brazil

Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor, Fepagro Saúde Animal,

Estrada Municipal do Conde, 6000, 92990-000, Eldorado do Sul, RS, Brazil

CIRAD, Département Systèmes Biologiques, Campus International de Baillarguet,

34398 Montpellier Cedex 5, France

* Corresponding author: ortega@farmacia.ufrgs.br; phone number: +55-51-3308-

5278; fax number: +55-51-3308-5437.

146

1. Introduction

Vaccination remains a highly cost effective approach of both human and

veterinary healthy strategies of controlling infectious diseases (Vordermeier et al.,

2005; Mutwiri, 2007). The first generation of antigens used to produce vaccines were

mostly comprised of killed or live attenuated microorganisms (Shams, 2005).

Although these antigens generated satisfactory results in many cases, their use also

lead to some concerns as attenuated vaccines can recover virulence or cause disease in

imunodepressed animals. While killed antigens are safer than the attenuated ones, they

are generally less immunogenic and produce lower cell mediated responses (through

Th1 cells and cytotoxic T lymphocytes) which is essential when dealing with

intracellular pathogens such as virus.

New generations of antigens, such as recombinant proteins and DNA vaccines,

which were developed to overcome some disadvantages of the traditional antigens,

also posses a weak immunogenicity and therefore requires the addition of adjuvants.

Aluminum salts are the most used adjuvants, acting as both delivery systems and

immune potentiators, nevertheless, their activity is mainly through a Th2 response

(Daines et al., 2009). In this regard, there is an increased search for new adjutants

which can produce a Th1 or a balanced Th1/Th2 response. Saponins are among the

promising adjuvants for this purpose. They are naturally occurring amphiphilic

substances comprised of a triterpenic or steroid core to which one or more sugar chains

are attached (Francis et al., 2002). The interest for this class of compounds started on

the 30’s decade when a saponin fraction obtained from the species Quillaja saponaria

proved to enhance both humoral and cellular responses, however, they also showed an

intrinsic toxicity that can lead to unwanted side effects (Oda et al., 2000; Oliveira-

Freitas et al., 2006; Pickering et al., 2006; Quenelle et al., 2008). Compared to other

saponins, Quillaja has a non-usual chemical structure which comprises an aldehyde

group and acyl side chains attached to its hydrophobic triterpenic core. This pattern

was initially thought to be responsible for saponins activity, nevertheless, over the

years of research aiming to obtain less toxic Quillaja saponin fractions and establish its

structure-activity relationship, this unusual pattern were no longer considered essential

147

for saponins immune response (Oda et al., 2003; Sun et al., 2009). Hence, it was

further established that saponins adjuvant activity is likely to reside in a balance

between its hydrophilic and hydrophobic functional groups, rather than each individual

functional chemical group itself and several other species possessing less complex

saponins structures, such as Soyasaponins and saponins from Platycodon and Polygala

species, demonstrated significant results (Oda et al., 2003; Song; Hu, 2009; Sun et al.,

2009).

In this regard, we selected two important saponin-related species, Ilex

paraguariensis A. St. Hil (mate), widely cultivated in South American countries

possessing high contents of saponins with no previous studies as a vaccine adjuvant

and Uncaria tomentosa, commonly known as “cat’s claw”, a native liana of the

Amazonian forest where decoctions from its bark had been used traditionally as anti-

inflammatory, anti-tumoral and immune stimulating (Heitzman et al., 2005).

Considering the relative lack of adjuvants that can exhibit potent Th1 responses toward

intracellular patogens, the species imunnoadjuvant potential were tested using a bovine

hespesvirus (BoHV-5) viral antigen as model.

2. Materials and methods

2.1. Plant material

Mate unripe fruits were harvested in January, 2006, in Barão de Cotegipe,

Brazil, a credited cultivar of Ilex paraguariensis St. Hil. Barks of Uncaria tomentosa

(batch 0107/06) were kindly provided by Laboratorios Induquímica S.A., Lima, Peru.

The raw materials were identified and air-dried at 35°C during 72 h (Memmert,

Germany).

148

2.2. Preparation of enriched fractions

The extractive solutions of Ilex paraguariensis or Uncaria tomentosa were

prepared using a hydroethanolic solution (40%; v/v) and a drug:solvent ratio of 1.0:10

(w/w). The extracts were further lyophilized (Modulyo 4L, Edwards, USA) after

removal of the organic phase. Aliquots of dried extracts (300 mg) were fractioned by a

solid phase technique on a polystyrene macroporous resin (Diaion HP-20, Supelco,

USA) by applying a methanol:water gradient in decreasing polarity. The enriched

saponin fraction of mate (MSF) and cat’s claw quinovic derivatives (UQT) were

recovered from the less polar fractions containing methanol 70 and 90% (v/v). LC-

analyses of both fractions were performed by separated methods previously validated

and their purity and concentration assessed using Ilexoside II, previously isolated from

Ilex paraguariensis fruits (Taketa et al., 2004; Peixoto et al., 2009 ) and alpha-hederin,

selected as reference substance to expresses the total triterpenic derivatives in Uncaria

tomentosa (Pavei et al., 2009).

2.3. Animals

Male CF-1 of 6 weeks old were purchased from Fundação Estadual de

Produção e Pesquisa em Saúde (Porto Alegre, Brazil), housed in polypropylene cages,

acclimatized for 1 week prior to use and maintained at a temperature of 22 ± 3 °C and

a 12-h light-dark cycle. Feed and water were supplied ad libitum. All the experimental

procedures were carried out in accordance to the Guide for the Use and Care of

Laboratory Animals (1996) and were approved by the University Research Ethics

Committee (Projects n° 2007782 and 2007793).

2.4. Vaccine and immunization

The bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5 strain EVI 88) multiplication was

performed on the Madin-Darby bovine kidney cell lineage (MDBK, ATCC CCL-22).

149

Cells were multiplied and maintained in Eagle's minimal essential medium (Gibco)

supplemented with 10% foetal bovine serum (Soraly) and antibiotics (Penicillin-

Streptomycin) in usual concentrations (Paul, 1970). Cells were incubated at 37 ºC and

maintained in a 5% CO

atmosphere whenever necessary.

For virus multiplication, MDBK cells were infected with a multiplicity of

infection equal to 0.1, following usual methods (Roehe et al., 1997).

When typical herpervirus cytopathic effect was evident in at least 90% of the

monolayer, bottles were frozen at −70 °C, thawed, clarified by low speed

centrifugation (1500 rpm) and the supernatant used as the experimental vaccine

antigen. Virus titres were calculated according to usual methods (Mahy; Kangro,

1996) and expressed as the log10 tissue culture infectious doses per 50 mL

(TCID50/50 mL). The infectious virus titre of the antigen before inactivation was of

6.5

TCID

/50 µL.

Eight groups of six mice each were immunized subcutaneously twice, on days

0 and 14, with 100 µL of antigen added to 150 µL of saline containing individually:

100 or 500 µg of MSF (Ilex paraguariensis saponin enriched fraction) and UTQ

(Uncaria tomentosa quinovic acids), 50 µg of Quil-A and 100 µg of aluminum

hydroxide (Omega Química, Brazil).

Negative control groups were inoculated with antigen diluted in saline at the

same proportion used for the vaccine preparation and with saline only. All

experimental vaccines and negative controls were filtered trough 0.22 µm membranes

(Sartorius, Germany) with exception to aluminum which was autoclaved at 120 ºC for

15 min prior to the mixture with the antigen to avoid salt retention on the membrane.

2.4.1 Collection of serum samples

Blood was collected from mice on days 0, 14, 28 and 42 after the first

inoculation. Total IgG was evaluated at all times while IgG1 and IgG2a were assayed

150

at the days 28 and 42. Total IgG as well as IgG1 and IgG2a titres were determined

individually from sera trough an indirect ELISA based on Fleck et al. (2006) with

minor modifications. Briefly: 96 well ELISA plates were coated with 100 µL of a

BoHV-5 citrate buffer solution (pH 5) at a 1:100 dilution and left overnight at 4 °C.

Plates were then blocked using a 1% (w/v) albumine solution in phosphate buffer

saline (PBS) for 1h at 37 °C. After washing the plates with a 0.1% solution of

polysorbate 20 in PBS, sera samples were diluted (1:50) in a solution of PBS

containing albumin at 1%, added in duplicate to the coated plates and incubated for 1 h

at 37 °C. Next, 100 µL of an anti-mouse IgG or IgG1 or IgG2a peroxidase conjugate

in a 1:10,000 dilution (DAKO, Denmark) was added to wells and incubated for 1 hour

(37 °C). After plate washing, a mixture of 1,2 ortho-phenylenediamine and H

were

added to each well and plates were then incubated for 15 min at 37 °C. The reaction

was ended by adding 50 µL/well of H

(1M) and optical densities (O.D.) were

measured in an ELISA plate reader (Anthos 2020, England) at 492 nm. Data were

expressed as the mean O.D. value of the samples minus the mean O.D. value of

controls.

2.5. Statistical analysis

Data were expressed as mean ± standard error. Statistical significances were

evaluated by ANOVA and Newman-Keuls post test using GraphPad Prism 5

(GraphPad Software, USA). Differences in p-value of ≤0.05 were considered

significant.

3. Results and Discussion

Many infectious diseases, among them the bovine encephalitis caused by some

hespervirus such as BoHV-5 are mainly controlled by animals immunization (Souza et

al., 2009). Saponins and some other compounds from natural sources have been

successfully evaluated as vaccine adjuvants, although their mechanism of action is not

151

completely established (Oda et al., 2003; Fischer et al., 2007; Song; Hu, 2009).

Propolis, a natural resinous material comprised of a mixture of several compounds

such as polyphenols was successfully used as adjuvant in BoHV-5 oily vaccines

(Fisher et al., 2007).

Mate saponins are found in leaves and fruits of the specie Ilex paraguariensis.

Higher saponins accumulation is found on fruits reaching contents as high as 30 wt%

(Pavei et al., 2007). Phytochemical work on mate demonstrates the occurrence of

mono and bidesmosidic saponins derived mainly from ursolic and oleanolic acids

(Gosmann et al., 1989; Gosmann et al., 1995; Taketa et al., 2004). Ilexoside II, a

bidesmosidic saponin previously reported for mate, is the major compound identified

in MSF. The chemical profile of MSF and the occurrence of the chemical marker

ilexoside II were previously analyzed using liquid chromatography coupled to mass

spectrometry (LC-MS) and to UV detection (LC-UV) (Peixoto et al., 2009).

LC-UV profiles of MSF and ilexoside II are found in Fig. 1. Molecular weights

compatible with saponins were demonstrated for all peaks occurring on MSF by means

of LC-MS analysis (data not shown).

Fig. 1. Reverse phase LC-UV chromatograms of Ilexoside II at 0.5 mg/mL (A) and

MSF at 1mg/mL (B). UV detection at 205 nm (No absorbance was detected on higher

wavelengths).

152

Regarding, Uncaria tomentosa, the species in mainly used in the traditional

medicine as immunostimulant, and this ethnopharmacological data is supported by

solid scientific evidence (Wagner et al., 1985; Lemaire et al., 1999; Sandoval et al.,

2002). Certainly, the alkaloids fraction has been the main focus of the pharmacological

and analytical efforts, notwithstanding, relevant therapeutic activities including anti-

inflammatory and antiviral properties were also ascribed to the triterpenic fraction,

specifically, to the quinovic acid derivatives (Aquino et al., 1989; Aquino et al., 1991).

Fig. 2 shows the chromatographic profile of the alpha-hederin standard

substance and the quinovic derivative fraction from Uncaria tomentosa after cleanup

step.

Fig. 2. LC-UV chromatograms of alpha-hederin (A) and quinovic derivatives fraction

(B). UV detection at 205 nm (No absorbance was detected on higher wavelengths).

Total saponin contents were determined as 7.30 wt% and 0.25 wt% for MSF

and UQT, respectively (expressed as its chemical markers Ilexoside II and alpha-

hederin).

The total IgG titres after mice immunization with MSF and UQT are presented

in Fig. 3.

153

Fig. 3. Total IgG antibody, represented as optical density at 492 nm using indirect

ELISA. Mice were immunized on days 0 and 14 and sera were collected on days 0, 14,

28 and 42 (T0, T1, T2 and T3 respectively). Statistical significance: p < 0.001 (a), p <

0.01 (b), p < 0.05 (c). Groups were compared with antigen added to saline.

Quil-A, a mixture of saponins obtained from the species Quillaja saponaria,

has the ability to enhance both Th1 and Th2 immune responses and therefore, is

generally considered a promising adjuvant for viral vaccines. Both Quil-A and

aluminum hydroxide were able to enhance IgG titres. Fleck et al. (2006) evaluated the

activity of a saponin enriched fraction obtained from the species Quillaja brasiliensis

using a BoHV-1 as antigen and total IgG titres produced after the positive control

Quil-A were comparable to the achieved herein. However, although still significant

compared to controls groups, Quil-A titre had a lower increase compared to aluminum

hydroxide after 42 days. This was previously observed for a vaccine using BoHV-1

where Quil-A total IgG level started to decrease after 112 days (84 days after boosting)

(Fleck et al., 2006). Conversely, aluminum hydroxide total IgG titres increased

significantly from day 28 to day 42. Using hepatitis B antigen, 50 µg of an aluminum

hydroxide gel was also able to improve total IgG titres after 28 days (Xie et al., 2009).

154

IgG1 as well as IgG2a titres assayed at the days 28 and 42 are presented on Fig.

4 and 5.

Fig. 4. IgG1 antibody titres, represented as optical density at 492 nm using indirect

ELISA. Mice were immunized on days 0 and 14 and sera were analysed on days 28

and 42 (T2 and T3 respectively). Statistical significance: p < 0.001 (a). Groups were

compared with antigen added to saline.

IgG1 and IgG2a titres were significantly increased for Quil-A and Aluminum

hydroxide after 28 and 42 days. For both adjuvants the Th-2 response showed to be

stronger than Th-1 as demonstrated by the higher IgG1 levels. Aluminum hydroxide

presented higher titres for both IgG1 and IgG2a after 28 and 42 days while Quil-A

titres started to decrease after 42 days. UQT and MSF titres were not significantly

increased.

155

Fig. 5. IgG2a antibody titres, represented as optical density at 492 nm using indirect

ELISA. Mice were immunized on days 0 and 14 and sera were collected on days 28

and 42 (T2 and T3 respectively). Statistical significance: p < 0.001 (a) and p < 0.001

(b). Groups were compared with antigen added to saline.

This was the first report aiming the screening of saponins as adjuvants for

BoHV-5 viral vaccines. Saponins from Ilex paraguariensis and Uncaria tomentosa,

could not increase significantly total IgG titres. Total IgG obtained for Quil-A,

although significant, was lower than aluminum hydroxide after 42 days and moreover,

IgG1 and IgG2a were not kept constant with time. For aluminum, a predominantly Th-

2 like response is generally ascribed, nevertheless, increased IgG2a levels were also

observed for all times indicating that aluminum could possibly be considered as an

adjuvant for BoHV-5 vaccines. In view of the modest effect found for Ilex

paraguariensis and Uncaria tomentosa, further studies are needed to confirm the

engagement of the saponins fractions in the immune effect related for both species in

the traditional medicine.

156

Acknowledgments

The authors are grateful to Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) for the financial support and Laboratório Induquímica and

Ervateira Barão for cat’s claw bark and mate donation.

157

References

Aquino, R., Vicenzo, F., Francesco, S., 1989. Plant Metabolites. structure and in vitro

antiviral activity of quinovic acid glycosides from Uncaria tomentosa and Guettarda

platypoda. J. Nat. Prod., 52, 679-685.

Aquino, R., Vicenzo, F., Francesco, S., 1991. Plant Metabolites. New compounds and

anti inflammatory activity of Uncaria tomentosa. J. Nat. Prod., 54, 453-459.

Daines A. M., Greatrex B. W., Hayman C. M., Hook S. M., Mcburney W. T., Rades

T., Rendle P. M.; Sims I. M., 2009. Mannosylated saponins based on oleanolic and

glycyrrhizic acids. Towards synthetic colloidal antigen delivery systems. Bioorg. Med.

Chem., 17, 5207-5218.

Fischer, G., Cleff, M.B., Dummer, L.A., Paulino, N., Paulino, A.S., Vilela, C.D.O.,

Campos, F.S., Storch, T., Vargas, G.D., Hübner, S.D.O., Vidor, T., 2007. Adjuvant

effect of green propolis on humoral immune response of bovines immunized with

bovine herpesvirus type 5. Vet. Immunol. Immunopathol., 116, 79-84.

Fleck, J.D., Kauffmann, C., Spilki, F., Lencina, C.L., Roehe, P.M., Gosmann, G.,

2006. Adjuvant activity of Quillaja brasiliensis saponins on the immune responses to

bovine herpesvirus type 1 in mice. Vaccine, 24, 7129-7134.

Francis G., Kerem Z., Makkar H. P. S., 2002. Becker K. The biological action of

saponins in animal systems: A review. Br. J. Nutr, 88, 587-605.

Gosmann, G., Guillaume, D., Taketa, A.T.C., Schenkel, E.P., 1995. Triterpenoid

saponins from Ilex paraguariensis. J. Nat. Prod., 58, 438-441.

Gosmann, G., Schenkel, E.P., Seligmann, O., 1989. A new saponin from mate, Ilex

paraguariensis. J. Nat. Prod., 52, 1367-1370.

Heitzman, M.E., Neto, C.C., Winiarz, E., Vaisberg, A.J., Hammond, G.B., 2005.

Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of Uncaria. Phytochemistry, 66, 89-

98.

158

Lemaire, I., Assinewe, V., Cano, P., Awang, D.V., Arnason, J.T., 1999. Stimulation of

inerleukin-1 and-6 production in alveolar macrophages by the neotropical liana,

Uncaria tomentosa (uña de gato). J. Ethnopharmacol., 64, 109-115.

Mahy, B.W.J., Kangro, H.O., 1996. Virology Method Manual. London: Hasrcourt

Brace & Company. 374 pp.

Mutwiri, G., Gerdts, V., Lopez, M., Babiuk, L.A., 2007. Innate immunity and new

adjuvants. Rev. Sci. Tech., 26, 147-156.

Oda, K., Matsuda H., Murakami T., Katayama, S., Ohgitani, T., Yoshikawa, M., 2003.

Relationship between adjuvant activity and amphipathic structure of soyasaponins.

Vaccine, 21, 2154-2160.

Oda, K., Matsuda, H., Murakami, T., Katayama, S., Ohgitani, T., Yoshikawa, M.,

2000. Adjuvant and haemolytic activities of 47 saponins derived from medicinal and

food plants. Biol. Chem., 381, 67-74.

Oliveira-Freitas, E., Casas, C.P., Borja-Cabrera, G.P., Santos, F.N., Nico, D., Souza,

L. O.P., Tinoco, L.W., Da Silva, B.P., Palatnik, M., Parente, J.P., Palatnik-De-Sousa,

C. B., 2006. Acylated and deacylated saponins of Quillaja saponaria mixture as

adjuvants for the FML-vaccine against visceral leishmaniasis. Vaccine, 24, 3909-3920.

Paul, J., 1970. Cell and tissue cultures. London: Churchill Livingstone. 484 pp.

Pavei, C., Guzatto, P., Ros Petrovick, P., Gosmann, G., González-Ortega, G., 2007.

Development and validation of an HPLC method for the characterization and assay of

the saponins from Ilex paraguariensis A. St.-Hil (mate) fruits. Journal of Liquid

Chromatography and Related Technologies, 30, 87-95.

Pavei, C., Kaiser, S., Borré, G.L., Gonzalez-Ortega, G. LC method for quinovic acid

glycosides assay in Cat´s Claw (Uncaria tomentosa), 2009, submitted.

159

Peixoto, M.P.G., Treter, J., Pavei, C., Borré, G.L., Verza, S.G., Cibulski, S., Roehe, P.

M., Gosmann, G., Dreiss, C.A., Ortega, G.G. Saponins from Ilex paraguariensis A. St.

Hil. (mate) fruits: LC-UV assay and haemolytic activity, 2009, submitted.

Pickering, R.J., Smith, S.D., Strugnell, R.A., Wesselingh, S.L., Webster, D.E., 2006.

Crude saponins improve the immune response to an oral plant-made measles vaccine.

Vaccine, 24, 144-150.

Quenelle, D.C., Collins, D.J., Rice, T.L., Prichard, M.N., Marciani, D.J., Kern, E.R.,

2008. Effect of an immune enhancer, GPI-0100, on vaccination with live attenuated

herpes simplex virus (HSV) type 2 or glycoprotein D on genital HSV-2 infections of

guinea pigs. Antiviral Res., 80, 223-224.

Roehe P. M., Silva T. C. D., Nardi N. B., Oliveira L. G., Rosa J. C. D. A., 1997.

Diferenciação entre o vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (Bhv-1) e herpesvírus da

encefalite bovina (Bhv-5) com anticorpos monoclonais. Pesqui. Vet. Bras., 17, 41-44.

Sandoval, M., Okuhama, N.N., Zhang, X.-J., Condezo, L.A., Lao, J., Angeles, F.M.,

Musah, R.A., Bobrowski, P., Miller, M.J.S., 2002. Anti-inﬂammatory and antioxidant

activities of cats claw (Uncaria tomentosa and Uncaria guianensis) are independent of

their alkaloid content. Phytomedicine 9, 325–337.

Shams H., 2005. Recent developments in veterinary vaccinology. Vet. J., 170, 289-

299.

Song, X., Hu, S., 2009. Adjuvant activities of saponins from traditional Chinese

medicinal herbs. Vaccine, 27, 4883-4890.

Souza, L.F.L., Silva-Júnior, A., Freitas, C.M.B., Freitas E.C., Flores E.F., Almeida

M.R., Moraes, M.P, 2009. Immunogenicity of bovine herpesvirus 5 isolates as vaccine

candidates. Cienc. Rural, 39, 167-172.

Sun, H.X., Xie, Y., Ye, Y.P., 2009. Advances in saponin-based adjuvants. Vaccine,

27, 1787-1796.

160

Taketa, A.T.C., Breitmaier, E., Schenkel, E.P., 2004. Triterpenes and triterpenoidal

glycosides from the fruits of Ilex paraguariensis (mate). J. Braz. Chem. Soc., 15, 205-

211.

Vordermeier M., Hogarth P., 2005. Vaccine development in the 21st century: A time

of living dangerously. Vet. J., 170, 271-272.

Wagner, H., Kreutzkamp, B., Jurcic, K., 1985. Die Alkaloide von Uncaria tomentosa

und ihre Phagozytosesteigernde Wirkung. Planta Med., 51, 419-423.

Xie Y., Sun H-X, Li D., 2009. Platycodin D is a potent adjuvant of specific cellular

and humoral immune responses against recombinant hepatitis B antigen. Vaccine, 27,

757-764.

BIOGRAFIA

164

FORMAÇÃO ACADÊMICA

1998 - 2002 Graduação em Ciências Farmacêuticas. Universidade de São

Paulo

2000 - 2002 Bolsista de Iniciação Científica. Faculdade de Ciências

Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Departamento

de Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Osvaldo de

Freitas. Bolsista FAPESP.

2003 - 2005 Mestrado em Ciências Farmacêuticas. Faculdade de Ciências

Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Área de

Concentração: Fármacos e Medicamentos. Orientador: Prof.

Dr. Luís Alexandre Pedro de Freitas. Bolsista CNPq

2006 - 2009 Doutorado em Ciências Farmacêuticas. Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Orientador: Prof. Dr. George González Ortega. Bolsista CNPq

2009 - 2009 Estágio de Doutorado no Exterior. Faculdade de Farmácia.

Kings College – University of London. Orientadora: Profª.

Drª. Cécile Ayako Dreiss. Bolsista CAPES.

PRODUÇÃO CIENTÍFICA

Artigos publicados

Marreto, Ricardo Neves; Peixoto, Maria Paula Garofo, Teixeira, C. C. C., Freitas, Luís

Alexandre Pedro. Analysis of pressure fluctuation during water evaporation in spouted bed.

Canadian Journal of Chemical Engineering, v.87, p.386 - 393, 2009.

Marreto, Ricardo Neves, Peixoto, Maria Paula Garofo, Tacon, Luciana, Freitas, Luís

Alexandre Pedro De Paste Residence Time In A Spouted Bed Dryer I: The Stimulus

Response Methodology. Drying Technology, v.25, p.821 - 830, 2007.

Oliveira, Helder Vinícius, Peixoto, Maria Paula Garofo, Freitas, Luís Alexandre Pedro. Study

on the efficiency of hard gelatin capsules coating in a spouted bed. Drying Technology. , v.23,

p.2039 - 2053, 2005.

165

Artigos aceitos para publicação

Canto, G. S., Treter, J., Yang, S., Borré, G. L., Peixoto, Maria Paula Garofo, Ortega, G. G.

Evaluation of foam properties of saponin from Ilex paraguariensis A. St. Hil. (Aquifoliaceae)

fruits. RBCF. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, 2009.

Trabalhos completos publicados em anais de eventos

Peixoto, Maria Paula Garofo; Marreto, Ricardo Neves; Freitas, Luís Alexandre Pedro.

Avaliação do método de estímulo-resposta na determinação do tempo de residência de pastas

em leito de jorro. In: XXXI Encontro Nacional de Sistemas Particulados, 2004, Uberlândia.

Peixoto, Maria Paula Garofo, Freitas, Luís Alexandre Pedro. Determinação do tempo de

residência de pastas durante a secagem em leito de jorro In: International Drying Symposium,

2004, São Paulo.

Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo): 6 trabalhos

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 