( PDF ) Planejamento, síntese e avaliação farmacológica de novos candidatos a protótipos de fármacos anti-inflamatórios

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

MARCELO DO NASCIMENTO GOMES

Planejamento, síntese e avaliação farmacológica de novos

candidatos a protótipos de fármacos anti-inflamatórios.

Goiânia-2009.

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

MARCELO DO NASCIMENTO GOMES

Planejamento, síntese e avaliação farmacológica de novos

candidatos a protótipos de fármacos anti-inflamatórios.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Menegatti

Co-orientadora: Profª. Drª. Clévia Ferreira Duarte Garrote

Goiânia-2009.

Exame de defesa

apresentado à Faculdade de

Farmácia da Universidade

Federal de Goiás, como

requi

sito parcial para

obtenção do título de Mestre

em Ciências Farmacêuticas.

ads:

AGRADECIMENTOS

• Agradeço primeiramente a Deus pela vida e pela oportunidade de estar

fazendo o mestrado de forma a aprimorar o meu conhecimento.

• Aos meus pais por todo o amor, o ensinamento, o apoio porque sem eles não

teria chegado até aqui.

• Ao Prof. Dr. Ricardo Menegatti pela orientação, pelos ensinamentos e

discussões de forma que eu viesse a conhecer a Química Medicinal.

• À Profª. Drª Clévia Ferreira Duarte Garrote pela co-orientação e pelo apoio.

• Ao Prof. Dr. José Ricardo Sabino pelos ensinamentos em Modelagem

Molecular de forma a contribuir com o aprimoramento deste trabalho.

• Ao Prof. Dr. Elson do Instituto de Ciências Biológicas da UFG pela

coordenação dos ensaios biológicos.

• Aos Mestrandos Roberta Campos Lino e ao Marcus Vinícius Mariano

Nascimento pelos ensaios farmacológicos “in vitro” e “in vivo” que contribuem

de forma direta com este trabalho.

• Ao Prof. Dr. Luciano do IQ da UFG pela realização dos espectros de RMN

e de

C, HMBC e HMQC.

• Ao Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin pela realização dos espectros de

massas.

• Aos técnicos do LCQM por ceder o aparelho de infravermelho para realização

dos espectros de IV.

• Aos meus irmãos Marcio e Rodrigo e familiares pelas palavras de apoio e

pela oração.

• A minha colega de Mestrado Fabiula Ines Martins pelo companheirismo, pela

amizade e por todos os momentos que vivemos ao longo destes dois anos.

• Aos meus colegas de Mestrado Laura, Mirella, Lênis, Tiago, Francislene,

Carla e Wilsione e de Laboratório Karinna, Isabel, Ana Emília, Patrícia, Thaís,

Adriane e Carlos pelos momentos de descontração e pelo companheirismo.

• Aos técnicos da UFG pelo apoio.

• A Fernanda secretária do Programa de Pós-graduação pelo apoio

incondicional nestes dois anos.

• As Doutoras Adriane e Carolina pelas contribuições e discussões feitas ao

trabalho.

• Aos alunos da turma “ALFAFA” pela o qual fiz o estágio de docência.

• Ao estagiário Josimar pela ajuda nos experimentos.

• A CAPES pelo apoio financeiro.

“O desconhecimento de suas

possibilidades internas e dos

segredos que se aninham nas

profundezas de sua alma tornou

o homem cético a respeito de

seu próprio destino. Saiba ele

encontrar a chave de sua

evolução na lei que o proclama

rdeiro de si mesmo e

conhecerá o porquê das

angústias que padece, questão

sobre a qual não encontrou

ainda explicação alguma que

lhe satisfaça”

A Herança de Si Mesmo-Carlos

Gonzaga González Pecotche

RESUMO

No âmbito de uma linha de pesquisa que visa o planejamento, a síntese e a

avaliação farmacológica de novos candidatos a protótipos de fármacos anti-

inflamatórios, descreveremos neste trabalho o planejamento de novos derivados

pirazólicos (LQFM 002-003), originalmente desenhados a partir do nerolidilcatecol

(24) e arilsulfonilpiperazínicos (25), que apresentam perfil inibitório da enzima

sPLA2.

Os compostos (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-dimetil-1-H-pirazol-5-

amina (LQFM 002) e (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-dimetil-4-((4-

metilpiperazina-1-il) metil)-1H-pirazol-5-amina (LQFM 003), foram submetidos a

ensaios farmacológicos in vitro, visando avaliar a atividade de inibição enzimática da

sPLA2. Para o protótipo LQFM 002 os halos de inibição foram 14,43 ± 6,28%, 16,68

± 2,45 %, 23,61 ± 2,62 %, 37,06 ± 3,25 %, nas doses de 250, 500, 1000 e 2000

µg/mL respectivamente. Para o composto LQFM 003, os halos foram 1,85 ± 1,38 %,

9,29 ± 3,33 %, 7,82 ± 3,32 %, 13,21 ± 3,22 %, respectivamente. Posteriormente

foram realizados os ensaios in vivo o qual avalia o perfil de migração celular para

cavidade peritoneal e pleural. Sendo também analisada a concentração de proteína

plasmática pela metodologia do azul de Evans quando induzido o processo

inflamatório. O composto LQFM 002 apresentou inibição sobre a migração celular de

50,46 ± 14,34 % no teste de peritonite, 68,7 ± 2,65 % no teste de pleurisia e redução

de 40,1 ± 6,40 % das proteínas plasmáticas pelo método de coloração do azul de

Evans. O composto LQFM 003 apresentou inibição de 25,89 ± 5,39%, nas doses de

50 mg/Kg, caracterizando, desta forma, perfil anti-inflamatório significativo para o

protótipo (LQFM 002).

Paralelamente ao trabalho sintético e farmacológico, foi realizado estudos

teóricos através do emprego de dinâmica molecular. A parametrização da enzima

sPLA2 foi mais efetiva através do emprego de caixa de água, uma vez que o estado

de menor energia observado foi de -175000kcal/mol.

Ao término deste trabalho, podemos concluir que o planejamento estrutural

empregado no mesmo foi validado através dos ensaios farmacológicos empregados,

uma vez que ambas as moléculas foram reconhecidas pela enzima sPLA2 e

apresentaram atividade anti-inflamatória no ensaio de migração celular. Ademais, a

metodologia sintética empregada se mostrou satisfatória para a obtenção dos

protótipos pirazólicos (LQFM 002 - 003) estudados.

Palavras-chave: Química medicinal, modelagem molecular, inflamação, anti-

inflamatórios e derivados pirazólicos.

ABSTRACT

In the field of a research line that seeks the planning, the synthesis and the

pharmacologycal evaluation of new candidates to prototypes of anti-inflammatory

drugs, we will describe in this project the planning of derived new pyrazolics (LQFM

002-003), originally drawn starting from the nerolidilcatecol (24) and

arylsulfonilpiperazines, (25) that present profile inhibition of the enzyme sPLA2.

The compounds (E)-N-(3,7-dimethylocta-2,6-dienyl)-1,3-dimethtyl-1-H-pyrazol-

5-amine (LQFM 002) and (E)-N-(3,7-dimethylocta-2,6-dienyl)-1,3-dimethyl-4-((4-

methylpiperazin-1-il) methyl)-1H-pyrazol-5-amine (LQFM 003), were submitted to

pharmacologycal rehearsals in vitro, seeking to evaluate the enzymatic inhibition

activity of the sPLA2. For the prototype (LQFM 002) the inhibition halos were 14,43 ±

6,28%, 16,68 ± 2,45%, 23,61 ± 2,62%, 37,06 ± 3,25%, in the doses of 250, 500,

1000 and 2000 µg/mL respectively. For the compound (LQFM 003), the halos were

1,85 ± 1,38%, 9,29 ± 3,33%, 7,82 ± 3,32%, 13,21 ± 3,22%, respectively.

Subsequently the rehearsal in vivo was accomplished to evaluate the profile of

cellular migration. Being also analyzed the concentration of plasmatic protein by the

methodology of the Evans of blue once the inflammatory process was induced. The

compound (LQFM 002) presented inhibition on cellular migration of 50,46 ± 14,34%

in the peritonit test, 68,7 ± 2,65% in the pleurisy test and reduction of 40,1 ± 6,40% of

the plasmatics proteins for the method of coloration of the Evans of blue. The

compound (LQFM 003) presented 25,89 ± 5,39% inhibition, in the doses of 50

mg/Kg, characterizing, significant anti-inflammatory profile for the prototype (LQFM

002).

Parallel to the pharmacologycal synthetic work and, we carried out theoretical

studies through the application of molecular dynamics. The parameters of the

enzyme sPLA2 was more effective through the applications of the water box's, once

the smaller state energy observed was of -175000kcal/mol.

At the end of this project, we can conclude that the structural planning applied

in the project was validated through the applications of the pharmacologycal

rehearsals, once both molecules were recognized by the enzyme sPLA2 and they

presented anti-inflammatory activity in the rehearsal of cellular migration. In addition,

the applied synthetic methodology for obtaining of the prototypes pyrazolics (LQFM

002-003) studied was satisfatory.

Keywords: Medicinal chemistry, molecular modeling, inflammation, anti-inflammatory,

pyrazolics derivate.

LISTA DE ESPECTROS

Espectro 1: Espectro de IV. Do composto (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-

dimetil-1-H-pirazol-5-amina (LQFM 002). ................................................................ 115

Espectro 2: Espectro de RMN H

do composto (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-

dimetil-1-H-pirazol-5-amina LQFM 002. .................................................................. 116

Espectro 3: Espectro de IV do composto (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-dimetil-

4-((4-metilpiperazina-1-il)metil)-1H-pirazol-5-amina (LQFM 003). ........................... 117

Espectro 4: Espectro de RMN

H do composto (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-

dimetil-4-((4-metilpiperazina-1-il)metil)-1H-pirazol-5-amina (LQFM 003). ............... 118

Espectro 5: Espectro de IV do composto N-(1,3-dimetil-1-H-pirazol-5-il)acetamida

(32). ......................................................................................................................... 119

Espectro 6: Espectro de RMN

H do composto N-(1,3-dimetil-1-H-pirazol-5-

il)acetamida (32). ..................................................................................................... 120

Espectro 7: Espectro de RMN

C HMBC do composto N-(1,3-dimetil-1-H-pirazol-5-

il)acetamida (35). ..................................................................................................... 121

Espectro 8: Espectro de IV do composto (E)-etil 2-ciano-3(2-nitrofenil)acrilato (35).

................................................................................................................................ 122

Espectro 9: Espectro de RMN

H do composto (34) (E)-etil 2-ciano-3(2-

nitrofenil)acrilato (35). .............................................................................................. 123

Espectro 10: Espectro de RMN

C do composto (E)-etil 2-ciano-3(2-nitrofenil)acrilato

(35). ......................................................................................................................... 124

Espectro 11: Espectro de massas do composto (E)-etil 2-ciano-3(2-nitrofenil)acrilato

(35). ......................................................................................................................... 125

Espectro 12: Espectro de ampliação da região do pico do íon molecular do composto

(E)-etil 2-ciano-3(2-nitrofenil)acrilato (35). ............................................................... 126

Espectro 13: Espectro de IV do composto (E)-etil-2-ciano-3-fenilacrilato (36) ........ 127

Espectro 14: Espectro de RMN

H do composto (E)-etil-2-ciano-3-fenilacrilato (36)

................................................................................................................................ 128

Espectro 15: Espectro de RMN

C do composto (E)-etil-2-ciano-3-fenilacrilato (36)

................................................................................................................................ 129

Espectro 16: Espectro de massas do composto (E)-etil-2-ciano-3-fenilacrilato (36).

................................................................................................................................ 130

Espectro 17: Espectro de ampliação da região do pico do íon molecular do composto

(E)-etil-2-ciano-3-fenilacrilato (36) ........................................................................... 131

Espectro 18: Espectro de IV do composto (E)-etil-2-ciano-3-(4-

(dimetilamino)fenil)acrilato (39). .............................................................................. 132

Espectro 19: Espectro de RMN

H do composto (E)-etil-2-ciano-3-(4-

(dimetilamino)fenil)acrilato (39) ............................................................................... 133

Espectro 20: Espectro de RMN

C do composto (E)-etil-2-ciano-3-(4-

(dimetilamino)fenil)acrilato (39). .............................................................................. 134

Espectro 21: Espectro de massas do composto (E)-etil-2-ciano-3-(4-

(dimetilamino)fenil)acrilato (39) ............................................................................... 135

Espectro 22: Espectro de ampliação da região do pico do íon molecular do composto

(E)-etil-2-ciano-3-(4-(dimetilamino)fenil)acrilato (39). .............................................. 136

Espectro 23: Espectro de IV do composto (E)-etil 2-ciano-3-(4-hidroxi-3-

metoxi)fenil)acrilato (71) .......................................................................................... 137

Espectro 24: Espectro de RMN

H do composto (E)-etil 2-ciano-3-(4-hidroxi-3-

metoxi)fenil)acrilato (41). ......................................................................................... 138

Espectro 25: Espectro de RMN

C do composto (E)-etil 2-ciano-3-(4-hidroxi-3-

metoxi)fenil)acrilato (41) .......................................................................................... 139

Espectro 26: Espectro de massas do composto (E)-etil 2-ciano-3-(4-hidroxi-3-

metoxi)fenil)acrilato (41). ......................................................................................... 140

Espectro 27: Espectro de ampliação da região do pico do íon molecular do composto

(E)-etil 2-ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi)fenil)acrilato (41). .......................................... 141

Espectro 28: Espectro de IV do composto (E)-etil 2-ciano-3-(4-nitrofenil) acrilato (43)

................................................................................................................................ 142

Espectro 29: Espectro de RMN

H do composto (E)-etil 2-ciano-3-(4-nitrofenil)

acrilato (43). ............................................................................................................ 143

Espectro 30: Espectro de RMN

C do composto (E)-etil 2-ciano-3-(4-nitrofenil)

acrilato (43) ............................................................................................................. 144

Espectro 31: Espectro de massas do composto (E)-etil 2-ciano-3-(4-nitrofenil) acrilato

(43) .......................................................................................................................... 145

Espectro 32: Espectro de IV do composto (E)-etil 3-(2-clorofenil)-2-cianoacrilato (45).

................................................................................................................................ 146

Espectro 33: Espectro de RMN

H do composto (E)-etil 3-(2-clorofenil)-2-

cianoacrilato (45). .................................................................................................... 147

Espectro 34: Espectro de RMN

C do composto (E)-etil 3-(2-clorofenil)-2-

cianoacrilato (45) ..................................................................................................... 148

Espectro 35: Espectro de massas do composto (E)-etil 3-(2-clorofenil)-2-cianoacrilato

(45) .......................................................................................................................... 149

Espectro 36: Espectro de IV do composto (E)-etil 2-ciano-3-p-tolilacrilato (47). ..... 150

Espectro 37: Espectro de RMN

H do composto (E)-etil 2-ciano-3-p-tolilacrilato (47)

................................................................................................................................ 151

Espectro 38: Espectro de RMN

C do composto (E)-etil 2-ciano-3-p-tolilacrilato (47)

................................................................................................................................ 152

Espectro 39: Espectro de massas do composto (E)-etil 2-ciano-3-p-tolilacrilato (47)

................................................................................................................................ 153

Espectro 40: Espectro de ampliação da região do pico do íon molecular do composto

(E)-etil 2-ciano-3-p-tolilacrilato (47) ......................................................................... 154

Espectro 41: Espectro de IV do composto (E)-etil 3-(4-clorofenil)-2-cianoacrilato (49).

................................................................................................................................ 155

Espectro 42: Espectro de RMN

H do composto (E)-etil 3-(4-clorofenil)-2-

cianoacrilato (49). .................................................................................................... 156

Espectro 43: Espectro de RMN

C do composto (E)-etil 3-(4-clorofenil)-2-

cianoacrilato (49). .................................................................................................... 157

Espectro 44: Espectro de massas do composto (E)-etil 3-(4-clorofenil)-2-cianoacrilato

(49). ......................................................................................................................... 158

Espectro 45: Espectro de ampliação da região do pico do íon molecular do composto

(E)-etil 3-(4-clorofenil)-2-cianoacrilato (49). ............................................................. 159

Espectro 46: Espectro de IV do composto (E)-etil 2-ciano-3-(2-hidroxifenil) acrilato

(51). ......................................................................................................................... 160

Espectro 47: Espectro de RMN

H do composto (E)-etil 2-ciano-3-(2-hidroxifenil)

acrilato (51) ............................................................................................................. 161

Espectro 48: Espectro de massas do composto (E)-etil 2-ciano-3-(2-hidroxifenil)

acrilato (51). ............................................................................................................ 162

Espectro 49: Espectro de IV do composto Etil 2-aminoquinolina-3-carboxilato (52).

................................................................................................................................ 163

Espectro 50: Espectro de RMN

H do composto Etil 2-aminoquinolina-3-carboxilato

(52). ......................................................................................................................... 164

Espectro 51: Espectro de IV do composto (2-aminoquinolina-3-il)(4-metilpiperazina-

1-il)metanona (28). .................................................................................................. 165

Espectro 52: Espectro de RMN

H do composto (2-aminoquinolina-3-il)(4-

metilpiperazina-1-il)metanona (28). ......................................................................... 166

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Rota para o Planejamento Racional de Novos Fármacos, adaptado de

BARREIRO, 2002. ..................................................................................................... 29

Figura 2: Metodologia de Estudo Computacional de Possíveis Alvos Terapêuticos,

adaptado de CARVALHO, 2003. ............................................................................... 33

Figura 3: Cascata do Processo Inflamatório e biossíntese de eicosanóides adaptado

de VOET, 2002. ......................................................................................................... 37

Figura 4: Sobreposição da Estrutura Ribossômica das COX-1 (branca) e 2 (amarela),

adaptado de MALKOWSKI e de KIEFER, 2000. Figura editada no programa Swiss-

PDB Viewer (SPDBV). .............................................................................................. 39

Figura 5: Sobreposição do AA (10) nas COX-1 (branca) e 2 (amarelo), adaptado de

MALKOWSKI e de KIEFER, 2000. Figura editada no programa SPDBV. ................. 39

Figura 6: Estrutura da Fosfatidilcolina. ...................................................................... 41

Figura 7: Estrutura Ribossômica da PLA2, com 1,8 A de resolução, adaptado

CHANDRA, 2002. Figura editada no programa SPDBV. .......................................... 42

Figura 8: Hidrólise da fosfatidilcolina e síntese do ácido araquidônico, adaptado

VOET, 2002. .............................................................................................................. 42

Figura 9: Conservação dos resíduos Asp-His do sítio catalítico na presença do

análogo da fosfatidilcolina com resolução de 2,00 A, adaptado WHITE, 1990. Figura

editada no programa SPDBV. ................................................................................... 45

Figura 10: Desprotonação da molécula de água pelo resíduo de histidina e ataque

do par de elétrons a carbonila, adaptado de SCOTT, 1990. ..................................... 46

Figura 11: Conservação do estado tetraédrico de transição e protonação do átomo

de oxigênio da posição Sn-2 do glicerofosfolipídeo preparando para etapa de

eliminação, adaptado de SCOTT, 1990. ................................................................... 46

Figura 12: Liberação do ácido carboxílico (AA) via etapa de eliminação e formação

do lisofosfolipídeo, adaptado de SCOTT, 1990. ........................................................ 47

Figura 13: Estrutura do ciclopentanoperidrofenantreno (azul), i.e. cortisona (18) e

seus grupamentos farmacóforos, adaptado SILVA, 2002. ........................................ 49

Figura 14: Novos inibidores da sPLA2 desenhados a partir do nerolidilcatecol e de

sulfonilpiperazinas. .................................................................................................... 52

Figura 15: Análise conformacional entre derivado N-(1,3-dimetil-1H-pirazol-5-

il)acetamida (32) e paracetamol (19). ........................................................................ 76

Figura 16: Análise do efeito hiperconjugativo entre os compostos (32) e (19). ......... 77

Figura 17: Cristalografia de raio-X do composto (47) representando os átomos de C

e H (branco), N (azul) e O (vermelho). ...................................................................... 84

Figura 18: Arranjo cristalino do composto (47) representando as ligações de

hidrogênio que ocorrem entre as moléculas. ............................................................. 85

Figura 19: Estrutura ribossômica do complexo formado entre a sPLA2 e a vitamina E

com resolução de 1.8ª, adaptado de CHANDRA, 2002. Figura editada pelo programa

SPDBV. ..................................................................................................................... 90

Figura 20: Estrutura ribossômica da sPLA2 solvatada em esfera de água, adaptado

de CHANDRA, 2002. Figura editada no programa NAMD. ....................................... 91

Figura 21: Estrutura ribossômica da sPLA2 solvatada em caixa de água, adaptada

de CHANDRA, 2002. Figura editada no programa NAMD. ....................................... 91

Figura 22: Halos de inibição da sPLA2 pelo modelo de GUTIÉRREZ et. al., 1988 e

FORTES-DIAS et. al., 1999. ...................................................................................... 93

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Efeito inibitório de LQFM 002 sobre a sPLA2 presente na peçonha de

serpente (Crotalus durisso collilinectus), em relação ao veículo, segundo modelo de

(GUTIÉRREZ et. al. 1988, FORTEZ-DIAS, et. al., 1999). ........................................ 93

Gráfico 2: Efeito inibitório de LQFM 003 sobre sPLA2 presente na peçonha de

serpente (Crotalus durissus collilinectus) em relação ao veículo, segundo modelo de

GUTIÉRREZ et. al. 1988, FORTES-DIAS et. al. 1999. ............................................. 94

Gráfico 3: Efeito inibitório de LQFM 002 e LQFM 003 em relação a dexametasona

sobre a migração celular, segundo modelo de FERRÁNDIZ E ALCARAZ, 1991. ..... 95

Gráfico 4: Avaliação da atividade anti-inflamatória do composto LQFM 002 pela

concentração do azul de Evans. ............................................................................... 96

Gráfico 5: Avaliação da atividade anti-inflamatória pelo método de pleurisia induzido

por carragenina. ........................................................................................................ 96

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Distribuição do Mercado Farmacêutico Global em 2007 e 2008, adaptado

GLOBAL, 2009. ...................................................................................................................... 26

Tabela 2: Ranking de classes farmacológicas que movimentaram a indústria

farmacêutica no ano de 2008, adaptado GLOBAL, 2009. .............................................. 27

Tabela 3: Sínteses orgânicas clássicas que marcaram a evolução da química

orgânica, adaptado de CORREIA et. al, 2002. ................................................................. 31

Tabela 4: Isoformas da sPLA2 adaptado de DENNIS, et. al, 2006. .............................. 44

Tabela 5: Análise conformacional entre N-(1,3-dimetil-1H-pirazol-5-il) acetamida e

paracetamol. ........................................................................................................................... 78

Tabela 6: Condensação de Knoevenagel em água de diferentes espécies químicas

de aldeído. .............................................................................................................................. 81

LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SÍMBOLOS

AA: Ácido Araquidônico

AMBER: Assisted Model Building with Energy Refinement

ASP: Resíduo de aspartato

CHARMM: Chemistry at Harvard Molecular Mechanics

COX: Ciclo-oxigenase

cPLA2: Fosfolipase A2 citosólica

GLY: Resíduo de glicina

HIS: Resíduo de histidina

HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

iPLA2: Fosfolipase A2 Cálcio-independente

IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry

IV: Infravermelho

kDa: k Dalton

LQFM: Laboratório de Química Farmacêutica Medicinal

NAMD: Scalable Moleular Dynamics

PAF-AH: PAF acetilhidrolase

PBS: Solução Salina Tamponada com Fosfato

PDB: Protein Data Bank

PGG2: Prostaglandina G2

PGH2: Prostaglandina H2

PGI2: Prostaciclina

PLA2: Fosfolipase A2

RMN

C: Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

RMN

H: Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

SER: Resíduo de serina

sPLA2: Fosfolipase A2 secretada

TRY: Resíduo de tirosina

TXA2: Tromboxana

GLOSSÁRIO

Agonista: ligante, fármaco ou composto-protótipo que apresenta afinidade por um

receptor apresenta atividade intrínseca (IUPAC, 1998).

Análise conformacional: Consiste na exploração dos arranjos espaciais

energeticamente favoráveis de uma molécula (SANT’ ANNA, 2002).

Antagonista: ligante, fármaco ou composto-protótipo que apresenta afinidade por

um receptor sem apresentar atividade intrínseca (IUPAC, 1998).

Anti-inflamatórios: Classe terapêutica responsável pela prevenção e controle de

fisiopatologias de origem inflamatória, sendo classicamente dividida em anti-

inflamatórios do tipo não-esteroidais (AINEs), que tem como representante clássico

o ácido acetilsalicílico (AAS), e os anti-inflamatórios do tipo esteroidais a exemplo

dos corticosteróides (BARREIRO, 2001).

Biofase: diz-se dos diversos compartimentos biológicos do organismo (BARREIRO,

2001).

Bioisosterismo: resulta da obtenção de compostos o qual a substituição de átomos

por outros estruturalmente semelhantes (IUPAC, 1998).

Congênere: Substância estruturalmente relacionada à outra, ou sintetizada pela

mesma rota sintética. A série congênere é planejada de maneira a que as

modificações estruturais entre os compostos, obtidos através da mesma

metodologia sintética, possam antecipar variações próximas de propriedades físico-

químicas, por exemplo, comparação em termos das respostas biológicas

apresentadas (IUPAC, 1998).

Estrutura-atividade: estuda as alterações estruturais moleculares que podem ser

realizadas para ampliar a utilidade dos fármacos. Geralmente são determinadas

realizando pequenas alterações na estrutura de um protótipo, seguidas de teste em

que se observam os efeitos biológicos de tais modificações (PANDIT, 2008).

Farmacóforo: é o conjunto de características eletrônicas e estéricas que

caracterizam um ou mais grupos funcionais necessários para o reconhecimento

molecular pelo receptor (PANDIT, 2008).

Hibridação molecular: Estratégia de modificação molecular de fármacos e

compostos protótipos empregada para o desenho estrutural de novos análogos

ativos ou protótipos otimizados (BARREIRO, 2001).

Isoforma: são proteínas muito similares capazes de desempenharem as mesmas

funções das originais já que diferenças discretas nas sequências de aminoácidos

geram diferentes propriedades estruturais e funcionais (REGGIANI, 2000).

Otimização: A otimização do composto-protótipo representa a introdução de

modificações estruturais, conduzindo a uma nova substância estruturalmente

relacionada à primeira, acessível sinteticamente, capaz de apresentar propriedades

estéreo-eletrônicas e físico-químicas que representem um adequado perfil

farmacocinético ou menos tóxico, compatível com seu emprego clínico (PANDIT,

2008).

Protótipo: Primeiro tipo ou exemplar original, modelo. Diz-se do composto

originalmente identificado que apresenta atividade farmacológica “in vivo” (PANDIT,

2008).

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE GRÁFICOS

LISTA DE ESPECTROS

LISTA DE ABREVIATURAS

GLOSSÁRIO

1. INTRODUÇÃO

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. MERCADO FARMACÊUTICO GLOBAL

2.2. PESQUISA E DESENVOLVIMENTO DE FÁRMACOS

2.3. QUÍMICA MEDICINAL

2.3.1. SÍNTESE ORGÂNICA

2.3.2. MODELAGEM MOLECULAR

2.4. FISIOPATOLOGIA DA INFLAMAÇÃO

2.4.1. CASCATA DO PROCESSO INFLAMATÓRIO

2.4.2. EICOSANÓIDES

2.4.3. CICLOXIGENASES

2.4.4. MEDIADORES QUÍMICOS DA INFLAMAÇÃO

2.5. FOSFOLIPÍDEOS

2.6. FOSFOLIPASE

2.6.1. EFEITO DA sPLA2 CÉLULAS INFLAMATÓRIAS

2.7. ANTI-INFLAMATÓRIOS

2.7.1. ANTI-INFLAMATÓRIOS ESTEROIDÁIS

2.7.2. ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO-ESTEROIDAIS

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. APARELHAGEM ANALÍTICA

4.2. METODOLOGIA SINTÉTICA

4.2.1. SÍNTESE DE (E)-N-(3,7-DIMETILOCTA-2,6-DIENIL)-1,3-DIMETIL-

1-H-PIRAZOL-5-AMINA (LQFM 002)

4.2.2. SÍNTESE DE (E)-N-(3,7-DIMETILOCTA-2,6-DIENIL)-1,3-DIMETIL-

4-((4-METILPIPERAZINA-1-IL)METIL)-1H-PIRAZOL-5-AMINA (LQFM

003)

4.2.3. SÍNTESE DE N-(1,3-DIMETIL-1-H-PIRAZOL-5-IL)ACETAMIDA (32)

4.2.4. PROCEDIMENTO GERAL PARA REAÇÃO DE CONDENSAÇÃO

DE KNOEVENAGEL

4.2.4.1. SÍNTESE DE (E)-ETIL 2-CIANO-3(2-NITROFENIL)ACRILATO

(35)

4.2.4.2. SÍNTESE DE (E)-ETIL-2-CIANO-3-FENILACRILATO (37)

4.2.4.3. SÍNTESE DE (E)-ETIL-2-CIANO-3-(4-

(DIMETILAMINO)FENIL)ACRILATO (39)

4.2.4.4. SÍNTESE DE (E)-ETIL 2-CIANO-3-(4-HIDROXI-3-

METOXI)FENIL)ACRILATO (41)

4.2.4.5. SÍNTESE DE (E)-ETIL 2-CIANO-3-(4-NITROFENIL) ACRILATO

(43)

4.2.4.6. SÍNTESE DE (E)-ETIL 3-(2-CLOROFENIL)-2-CIANOACRILATO

(45)

4.2.4.7. SÍNTESE DE (E)-ETIL 2-CIANO-3-P-TOLILACRILATO (47)

4.2.4.8. SÍNTESE DE (E)-ETIL 3-(4-CLOROFENIL)-2-CIANOACRILATO

(49)

4.2.4.9. SÍNTESE DE (E)-ETIL 2-CIANO-3-(2-HIDROXIFENIL)

ACRILATO (51)

4.2.5. SÍNTESE DE ETIL 2-AMINOQUINOLINA-3-CARBOXILATO (52)

4.2.6. SÍNTESE DE (2-AMINOQUINOLINA-3-IL)(4-METILPIPERAZINA-1-

IL)METANONA (28)

4.3. METODOLOGIA DE MODELAGEM MOLECULAR

4.4. ENSAIOS FARMACOLÓGICOS

4.4.1. PERFIL INIBITÓRIO DA ATIVIDADE DA sPLA2

4.4.2. PERITONITE INDUZIDA POR CARRAGENINA

4.4.3. INDUÇÃO DA PLEURISIA PELA CARRAGENINA 1%.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. SÍNTESE ORGÂNICA MEDICINAL

5.2. MODELAGEM MOLECULAR

5.3. ENSAIOS FARMACOLÓGICOS

5.3.1. INIBIÇÃO DA ATIVIDADE DA sPLA2 “IN VITRO”

5.3.2. PERITONITE INDUZIDA POR CARRAGENINA “IN VIVO”

5.3.3. INDUÇÃO DA PLEURISIA PELA CARRAGENINA 1%.

6. CONCLUSÕES

7. PERSPECTIVAS

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

100

ANEXOS

1. INTRODUÇÃO

Desde a antiguidade o homem procura encontrar meios para aliviar a dor, a

febre entre outros distúrbios similares. Com a descoberta dos mecanismos da

fisiopatologia das doenças inflamatórias, abriu-se uma janela para investigação de

substâncias medicamentosas que pudessem interromper o circuito desta sinalização

(CARVALHO, 2002).

A colchicina (1) foi provavelmente um dos primeiros fármacos usado para tal

finalidade. Este alcalóide é extraído de uma planta conhecida como Colchicum

autummale.

(1)

Preparações com base nesta planta são usadas desde o sexto século da

nossa era. Posteriormente, curandeiros e estudiosos que se ocupavam com o

estudo de possibilidades de tratamento da dor usavam ungüentos, emplastos e

infusões feitos com as folhas de Myrtus communis L., cujo nome vulgar é Murto,

pertencente à mesma família da jabuticabeira, utilizadas em indivíduos acometidos

por dores, febre ou inchaço, uma vez que cogitava-se a presença de princípios

ativos nesta planta, relacionados à redução da inflamação, das dores e à redução da

temperatura corpórea (LUENGO, 2005).

Sem saber, estes homens estavam utilizando os primeiros anti-inflamatórios

da história da humanidade. Muito embora os gregos, nos Jogos Olímpicos da

Antiguidade, tratassem os atletas acometidos por lesões musculares, fazendo uso

de extratos de produtos naturais anti-inflamatórios e outras práticas terapêuticas

como a crioterapia, com o objetivo de aliviar a dor (DAVID, 2002).

Todas estas plantas apresentam em sua composição quantidades de ácido

salicílico (2). A casca da árvore do salgueiro branco Salix alba foi usada como

fármaco por milhares de anos, sendo citada por Hipócrates em 400 a.C e por

Dioscarides, cirurgião grego do exército romano, em 70 d.C. Edward Stone, vigário

de Chipping Norton, escreveu que 20 grãos da casca de árvore de salgueiro em um

pouco de água a cada 4 horas, constituía-se em uma excelente preparação para

tratar estados febris com calafrios (ROSEN, 1989).

Em 1828, Johann A Büchner descobriu a substância ativa, um produto de

cor amarela em forma de cristais, com sabor muito amargo, a qual denominou

Salicilina (3), encontrada também em outras plantas, como a Spiraea ulmaria que

mais tarde inspirou o nome aspirina® (4). Em 1874, o ácido acetilsalicílico (4) foi

sintetizado por Herman Kolbe na Alemanha (COLLIER, 1984).

Em 1890, foi concebida a síntese laboratorial deste composto, acrescido

ainda de diversas limitações, i.e. baixo índice de tolerância, irritação gástrica, sabor

amargo, apesar de ter sido utilizado por quase uma década devido a sua capacidade

de aliviar os sintomas da inflamação. Dez anos mais tarde, o químico alemão Félix

Hoffman, estudou estratégias de modificação da estrutura química desta substância,

o que culminou na descoberta do conhecido ácido acetilsalicílico (4) (BAYER, 2009),

e a Aspirina®, foi então o primeiro medicamento anti-inflamatório cientificamente

divulgado na história da humanidade. Surgiu assim uma geração de novas

substâncias com efeitos benéficos, os quais são denominamos atualmente como

fármacos (FIORUCCI et al., 2001).

(2)

(3)

(

)

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. MERCADO FARMACÊUTICO GLOBAL

No ano de 2008 a Indústria Farmacêutica Mundial movimentou ca. US $

773,1 bilhões de dólares, apresentando taxa de crescimento de 4,8 % em relação a

2007, sendo que, apenas a América do Norte e Europa, juntos, movimentaram US $

559,3 bilhões de dólares, enquanto que na América Latina este valor ficou

aproximadamente em torno US $ 46,5 bilhões de dólares (Tabela 1). Tendo em vista

números tão expressivos, se faz necessário a busca por investimentos em pesquisa

e na inovação de novas moléculas que possam ser economicamente viáveis para a

produção industrial, com eficácia, segurança e ausência de efeitos colaterais,

quando comparados aos fármacos disponíveis no mercado (GLOBAL, 2009).

Tabela 1: Distribuição do Mercado Farmacêutico Global em 2007 e 2008, adaptado GLOBAL,

2009.

Regiões

Vendas em dólares no

ano de 2007.

Vendas em dólares no

ano de 2008.

América do Norte

304,5

311,8

Europa

206,2

247,5

Ásia, África e Austrália

62,2

90,8

Japão

58,5

76,6

América Latina

32,0

46,5

Total

529,5

773,1

Do grupo de quinze classes farmacológicas que mais faturaram no ano de

2008 (Tabela 2) os agentes não-narcóticos é a décima quarta classe mais vendida

movimentando c.a. US $ 11,16 bilhões de dólares. Isto nos permite dizer que

desordens de origem inflamatória são algumas das patologias mais frequentes em

nossa sociedade (GLOBAL, 2009).

Tabela 2: Ranking de classes farmacológicas que movimentaram a indústria farmacêutica no

ano de 2008, adaptado GLOBAL, 2009.

Classes Farmacológicas

Ranque de vendas em

2008.

Vendas em dólares no

ano de 2008.

Quimioterápicos

anticâncer

48,865

Reguladores lipídicos

33,849

Agentes respiratórios 03 31,271

Antidiabéticos

27,267

Inibidores da bomba de

prótons

26,525

Antagonistas de

angiotensina II

22,875

Antipsicóticos

22,853

Antidepressivos

20,336

Antiepiléticos

16,912

Agentes autoimunes

15,933

Inibidores da agregação

plaquetária

13,633

Antiretrovirais HIV

12,234

Eritropoetinas 13 11,459

Analgésicos não-

narcóticos

11,161

Analgésicos narcóticos

10,606

2.2. PESQUISA E DESENVOLVIMENTO DE FARMÁCOS

A pesquisa e desenvolvimento (P&D) de fármacos são considerados pela

indústria farmacêutica e por especialistas, uma atividade complexa, multifatorial,

dispendiosa, demorada, envolvendo a aplicação de técnicas e metodologias

modernas, e cuja produtividade é questionada com base em dados que demonstram

a relação inversamente proporcional entre os investimentos nas mesmas e o

lançamento de novas entidades químicas (NEQs) (LIMA, 2007). Porém a pesquisa

de medicamentos deve fazer o caminho inverso a esta teoria, mesmo porque países

em desenvolvimento como o Brasil, devem buscar diminuir a dependência de países

desenvolvidos, não apenas na compra de matéria prima, como também investir no

desenvolvimento de novos fármacos, visto que, é um país de ampla diversidade que

permite isolar moléculas de diversas fontes a fim de termos um crescimento

sustentável das ciências farmacêuticas no Brasil, rumo a deter novas tecnologias

para o desenvolvimento de novos fármacos. E um passo importante para que isso

ocorra é a Lei n° 10973 implementada pelo Decreto n° 5563, que dispõe sobre

incentivos à inovação e à pesquisa científica e tecnológica no ambiente produtivo

(BRASIL, 2004).

2.3. QUÍMICA MEDICINAL

Por definição “A Química Medicinal pode ser definida com uma disciplina

baseada na química, envolvendo também aspectos de ciências biológicas, médicas

e farmacêuticas. É concernido, com a invenção, descoberta, projeto, identificação e

preparação de compostos biologicamente ativos, o estudo de seu metabolismo, a

interpretação de seu mecanismo de ação no nível molecular e a construção de

relações de estrutura-atividade” (WERMUTH et al., 1998).

Neste contexto, o planejamento criterioso de novos candidatos a protótipos

de fármacos se torna uma ferramenta importante em P&D de fármacos. Tal tarefa

pode se tornar complexa visto que, estão envolvidos diversos fatores que são

responsáveis pela resposta terapêutica, entre eles a complexidade dos sistemas

biológicos. Ao se fazer o planejamento de um candidato a protótipo de fármaco

deve-se escolher um alvo farmacológico cuja estrutura conhecida permita buscar a

melhor estratégia para construção da ligante desejado (BARREIRO, 2002).

Como ilustrado na Figura 1, o planejamento adequado de variações na

estrutura de um composto bioativo pode resultar em derivados com maior interesse

terapêutico, seja por apresentar maior potência, menor toxicidade ou, ainda, por

adquirir características farmacotecnicamente mais adequadas (TAVARES, 2004).

Figura 1: Rota para o Planejamento Racional de Novos Fármacos, adaptado de BARREIRO,

2002.

2.3.1. Síntese Orgânica

A síntese orgânica nos permite planejar e construir moléculas com os mais

variados tipos de complexidade, o que pode ser também aplicado à síntese de

fármacos que permite a busca por novos candidatos a protótipos de fármacos

(MENEGATTI, 2001)

Historicamente, a síntese orgânica tem se desenvolvido de acordo com as

necessidades e a curiosidade humana. Dentre os descobrimentos que marcaram

época e que podem ser considerados como fundamentais no desenvolvimento da

Química Orgânica destacam-se as sínteses da uréia (5) por Frederich Wöhler em

1828, a partir do cianato de amônio e a síntese do corante mauveína (6) por Willian

H. Perkin em 1856 (CORREIA, 2002).

Bioreceptor

Inibidor

agonista/antagonista

Estrutura da proteina

desconhecida

Estrutura da proteina

conhecida

Modificação

molecular

Bioisosterismo

Restrição conformacional

Simplificação

Hibridação

Série congênere

Grupo farmacóforo

Novo protótipo

Nova entidade

química

Definição do alvo

farmacológico

O feito de Wöhler marca não somente o fim da teoria da força vital, como

também o nascimento da Química Orgânica Sintética como ramo da Química

Orgânica. Já o feito de Perkin, uma tentativa frustrada de preparar quinina (7) a

partir da anilina, abriu caminho para o desenvolvimento racional e científico da

Química Medicinal e estabeleceu uma forte associação entre Química Orgânica e

Química Medicinal (TROST, 1985).

(7)

Já em 1904 a síntese do terpineol (8) (W. H. Perkin) e em 1917 a síntese da

tropinona (9) por R. Robinson revelavam uma sofisticada abordagem retrossintética.

A síntese de um alvo complexo como a quinina (7) em 1944, por Robert Woodward

e William von Eggers Doering, pode ser considerada como uma das grandes

realizações da síntese orgânica no final da primeira metade do século XX.

Entretanto, um fato curioso na síntese da quinina (7), relatada por Woodward e

Doering, é que ela foi realizada de maneira formal e não total como muitos

(5)

(6)

imaginaram até então. A única síntese total estereosseletiva da quinina foi relatada

bem recentemente por Gilbert Stork e colaboradores (STORK, 2001; BALL, 2001).

A síntese orgânica se desenvolveu mais rapidamente na segunda metade do

século XX (Tabela 1), devido à descoberta de muitas reações novas, principalmente

reações de formação da ligação C-C. Ao longo da história muitas sínteses totais de

substâncias complexas marcaram o desenvolvimento da área de síntese orgânica,

principalmente porque muitas destas sínteses trouxeram à luz novas metodologias

(CORREIA, 2002).

Tabela 3: Sínteses orgânicas clássicas que marcaram a evolução da química orgânica,

adaptado de CORREIA et. al, 2002.

Sínteses clássicas

Pesquisadores

Síntese do Cicloctatetraeno

R. Willstate (1915)

Síntese da Tropinona

R. Robinson (1917)

Síntese da Quinina

R.B. Woodward (1945)

Síntese da Penicilina

J.C. Sheehan (1957)

Síntese da Reserpina R.B. Woodward (1958)

Síntese do Dodecaedrano

L. Paquete (1963)

Uma das definições mais fiéis do que representa a síntese orgânica, dentro

de um contexto científico e do espírito humano, foi elaborada por E. J. Corey,

laureado com prêmio Nobel de Química de 1990 e criador do “Disconnection

Approach”, ferramenta de grande valor usada rotineiramente para o planejamento

sintético: “Um químico sintético é mais que um estrategista com lógica. Ele é um

explorador altamente influenciado na arte de especular, imaginar e também criar.

Estes elementos dão a ele um toque de artista o qual dificilmente poderia ser

(8)

(9)

incluído nos compêndios dos princípios básicos de síntese. Estes elementos são

reais e extremamente importantes” (COREY, 1989).

A preocupação com o meio ambiente também tem sido alvo de cientistas na

busca de alternativas para as reações orgânicas. Esta é a visão da ‘‘Green

Chemistry’’ que busca alternativas de redução, prevenção ou eliminação dos

resíduos de processo e que possam tornar as reações mais econômicas e menos

agressivas ao meio ambiente e à saúde humana (SANSEVERINO, 2000). As

reações em água tem sido importantes neste processo porque é um solvente barato,

benigno ambientalmente e também de reatividade completa (CHAO-JUN e LI 2006).

Estudos sobre a água como solvente demonstram que ela possui três classes

distintas de ativação: atua como um agente hidrolisante que media à formação de

produtos secundários que servem como catalisadores ou promotores de outras

reações, pode ser usada como agente interno de forma a dirigir os equilíbrios

químicos e, como ácido de Lewis, podendo ser ativador ou co-ativador de reações

(WIPF et al., 2001).

2.3.2. MODELAGEM MOLECULAR

A modelagem molecular segundo a IUPAC é a investigação das estruturas e

das propriedades moleculares usando a química computacional e as técnicas de

visualização gráfica visando fornecer uma representação tridimensional, sob um

dado conjunto de circunstâncias (Figura 2) (SANT’ ANNA, 2002).

Figura 2: Metodologia de Estudo Computacional de Possíveis Alvos Terapêuticos, adaptado de

CARVALHO, 2003.

Como parte na descoberta de novos fármacos por meio do planejamento

racional, tem-se empregado a modelagem molecular que se tornou importante não

apenas por sua utilização da descoberta de novos fármacos, mas também na

otimização dos já existentes. Podemos dizer que o avanço da modelagem molecular

se deve ao avanço dos recursos computacionais tanto de “hardwares“ que atuam na

velocidade do cálculo quanto de “softwares” que são os programas computacionais

(RODRIGUES, 2001).

A disponibilidade de programas computacionais de química e os bancos de

dados em rede i.e. “protein data bank” (PDB) são atualmente, ferramentas

fundamentais para a descoberta e planejamento de novos fármacos. Estas

informações permitem uma análise rápida da atividade biológica versus seus

descritores físico-químicos orgânicos de uma série de moléculas de interesse. Novos

agentes terapêuticos podem inclusive ser desenvolvidos, pela análise de dados

teóricos de relação estrutura-atividade de forma tridimensional, obtidos por técnicas

recentes de modelagem molecular (CARVALHO et al., 2003).

Manipulação por meio da

Química Computacional

Investigação de

estruturas moleculares

Descobrir o grupo

farmacóforo de forma a

obter a resposta biológica

O conhecimento da estrutura molecular se tornou essencial na descoberta

de novos fármacos, visto que, podemos fixar parâmetros sobre a relação estrutura-

atividade, as quais são importantes no reconhecimento molecular pela proteína, a

seletividade. Vale salientar que a biofase possui inúmeros compostos que podem se

ligar ao receptor com especificidade que determinará a atividade farmacológica de

uma substância (COHEN, 1990).

Para determinar as interações moleculares, a modelagem molecular

emprega cálculos matemáticos chamados de empíricos ou clássicos e quânticos,

subdivididos em semi-empíricos e ab initio. Os cálculos empíricos que empregam a

mecânica molecular calculam a energia e as estruturas da molécula com base no

movimento dos núcleos, neste caso os elétrons não são considerados (SANT’

ANNA, 2002). O campo de força é usado para calcular a geometria e a energia das

moléculas, ele é constituído pela soma de termos de energia, i.e. distância de

ligações, ângulos de ligação, ângulos diedros, forças de van der Waals, ligações de

hidrogênio, interações eletrostáticas, relacionados às posições de equilíbrio no

sistema (BURKET, 1982).

Os cálculos semi-empíricos e ab initio são cálculos mecânico quânticos que

usam equações exatas, sem aproximações que envolvem a quantidade total de

elétrons da molécula. Estes cálculos são baseados no uso da equação de

Schrödinger que permite fazer a aproximação para restringir a complexidade da

função de onda eletrônica e tornar o cálculo possível (BARREIRO, 1997).

2.4. FISIOPATOLOGIA DA INFLAMAÇÃO

A inflamação tem uma história antiga e rica, intimamente relacionada com

histórias das guerras, ferimentos e infecções. O termo inflamação, do Latim

inflammatio que significa atear fogo (WINKIPEDIA, 2008), fisiologicamente é uma

resposta de proteção dos organismos homeotérmicos, no qual sua função é livrar o

organismo tanto da causa da agressão celular como das consequências desta

agressão (KUMAR, 2005). De forma que sem esta defesa as infecções

permaneceriam, as feridas jamais cicatrizariam e os órgãos se degenerariam. Porém

a resposta inflamatória pode ser nociva ao organismo na forma de reações de

hipersensibilidade a picadas de insetos e toxinas, mas também, como doenças

crônicas como artrite reumatóide, aterosclerose e lúpus (PEREIRA, 1993).

Celsus, escritor romano do primeiro século d.C., foi o primeiro a enumerar os

quatros sinais da inflamação "Signa inflammationis quatror sunt: Rubor et Tumor,

cum Calor et Dolor", (KUMAR, 2005) redescobertos em 1443 pelo Papa Nicolas V., o

quinto sinal clínico que é a perda da função do tecido inflamado foi acrescentado por

Virchow (BROWN, 2006). Já em 1793, Jonh Hunter observou um fato que hoje para

nós parece óbvio, que a inflamação não é uma doença, mas uma resposta

inespecífica que age no hospedeiro. Julius Cohnheim (1839-1884) foi o primeiro a

observar a migração leucocitária e alterações do fluxo sanguíneo em microscópio

(GRUNDMANN, 1985). Em 1882 o biólogo russo Elie Metchnikoff descobriu o

processo da fagocitose concluindo que o propósito da inflamação era conduzir

células fagocitárias para que estas englobassem as bactérias invasoras

(SCHMALSTIEG, 2008). Esta descoberta foi de encontro à teoria da resposta

humoral proposta por Paul Ehrlich, onde o propósito da inflamação era mobilizar os

fatores séricos para neutralizar agentes infecciosos (SILVERSTEIN, 1982). Em

reconhecimento, estes dois cientistas dividiram o prêmio Nobel em 1908. Outra

contribuição importante foi acrescentada por Thomas Lewis, que por meio de

experimentos que envolviam respostas inflamatórias na pele fez descobertas

importantes sobre os mediadores químicos da inflamação e do potencial emprego de

agentes anti-inflamatórios (KUMAR, 2005).

O processo inflamatório nada mais é que uma resposta orgânica à infecção

ou lesão tecidual, que se dá a um conjunto de alterações bioquímicas e celulares,

celular e humoral, cuja finalidade é a ativação dos sistemas de defesa do organismo

no sentido de promover o reparo tecidual (PEREIRA, 1993). Todas as alterações

observadas no intercurso da resposta inflamatória são decorrentes das ações de

mediadores da inflamação. Estes mediadores são produzidos ou ativados por

estímulos que podem ser de caráter exógeno, injúria tecidual seja térmica, química,

bem como mecânica ou por agentes infecciosos, além de endógena e interações

antígeno-anticorpo (KUMAR, 2005). Basicamente a resposta inflamatória ocorre em

três fases distintas com mecanismos diferentes, sendo que estas fases são

classificadas em: aguda, cujas características são vasodilatação local e aumento da

permeabilidade vascular; subaguda, que tem por característica a infiltração

leucocitária; e a fase crônica, na qual ocorrem degeneração e fibrose do tecido

inflamado (GOLDSBY, 2002).

A resposta inflamatória geralmente causa efeitos que podem ser benéficos

ou prejudiciais ao organismo. Entre os efeitos benéficos, podemos destacar a

proteção ao organismo, o aumento da perfusão local que consequentemente causa

o aumento do fluxo celular das células de defesa, a inativação do imunógeno

prejudicial, o aumento de secreção glandular para a promoção da limpeza do local

afetado, a formação do coágulo para evitar a disseminação e por fim a cicatrização

do tecido afetado. Já os prejuízos causados pela resposta inflamatória podem ser

resumidos em lesões temporárias ou permanentes dos tecidos afetados, processos

alérgicos, reações de hipersensibilidade, dor causada pela compressão de

terminações nervosas causadas pelo edema e doenças auto-imunes (KUMAR,

2005).

2.4.1. CASCATA DO PROCESSO INFLAMATÓRIO

A catálise da hidrólise das ligações 2-acil éster dos fosfolipídeos de

membrana, cálcio-dependente, leva à liberação do ácido araquidônico (AA) (10) que

ao ser metabolizado é responsável pela produção de uma importante classe de

ácidos graxos conhecidos como eicosanóides (Figura 3) e do lisofosfolipídio,

responsável pela lise da membrana (DENNIS, 1997; FONTEH, 1998; FORTE-DIAS

et al., 1999).

Figura 3: Cascata do Processo Inflamatório e biossíntese de eicosanóides adaptado de VOET,

2002.

2.4.2. EICOSANÓIDES

Os eicosanóides são compostos que possuem vinte átomos de carbono, do

grego eikosi = vinte, constituindo uma importante família de ácidos graxos essenciais

produzidos a partir do ácido araquidônico (10), via enzimas prostaglandina sintase 1,

2 e 3, também conhecidas com ciclo-oxigenases (COX-1, COX-2 e COX-3) ou pela

via das lipo-oxigenase (LOXs). Os eicosanóides podem ser subclassificados em

prostaglandinas, tromboxanas e leucotrienos, com base em suas estruturas

químicas, bem como, pela via através da qual são formados, tendo em comum a

amplificação da resposta inflamatória (COOK, 2005; KHANAPURE, 2007). E quando

o lisofosfolipídeo, outro produto da hidrólise da fosfaditilcolina, é o liso-PAF este

Ciclo-oxigenase

(COX-1, COX-2)

O O

O-X

(10)

COOH

PGH

LTB

Leucotrieno

Ácido Araquidônico

COOH

(

)

COOH

(13)

COOH

TxA

Tromboxana

PGH

2α

Prostaglandina

6-Oxo-PGF

1α

Prostaciclina

(

)

(

)

(16)

(12)

pode ser convertido pela acetiltransferase em fator de agregação plaquetária (PAF),

que é outro mediador do processo inflamatório no tecido injuriado (BOUKLI et al.,

2008).

2.4.3. CICLOXIGENASES

As COXs catalisam a reação do AA (10) chamada de bis-oxigenação que

converte o AA (10) em prostaglandina G2 (PGG2) e posteriormente sofre ação da

enzima peroxidase formando assim a prostaglandina H (PGH2) (GOODMAN e

GILMAN, 2005).

A COX possui duas isoformas biológicas classicamente identificadas COX-1

e COX-2 além de uma terceira recém descoberta COX-3. A COX-1 e a COX-2

apresentam uma homologia estrutural de 60% na sequência de aminoácidos em

seus sítios catalíticos mesmo sendo codificadas por genes distintos localizados em

cromossomos não homólogos (MITCHELL E WARNER, 1999). Isto pode ser

observado na Figura 4 cuja é feita a sobreposição das COX 1-2 pelo programa

Swiss-SPDBV nota-se que em algumas partes as duas proteínas estão totalmente

sobrepostas e em outras partes não ocorre à sobreposição, o que também permite

observar na Figura 5 que a orientação do ácido araquidônico no sítio ativo das COX

1-2 seja diferente (MALKOWSKI, KIEFER, 2000). A COX-1 também chamada de

constitutiva está presente em condições fisiológicas normais, nos vasos sanguíneos,

plaquetas, estômago e rins, sendo responsável pela produção de prostanóides que

regulam funções fisiológicas importantes como a produção de muco no estômago.

Já a COX-2 é uma isoforma induzida, porque é rapidamente expressa durante uma

resposta inflamatória sendo a maior responsável pela produção de prostanóides em

processos dolorosos e inflamatórios, porém em alguns tecidos como no cérebro, rins

e endotélio vascular a mesma é constitutiva (FOORD, 2005; VANE et al., 1998).

Recentemente, estudos em linhagens de macrófagos feitos in vitro

demonstraram a existência de uma terceira isoforma chamada de COX-3. Sua

ativação não demonstrou a produção de prostaglandinas, mas de PGJ

que pertence

à família das ciclopentanonas e que também exerce atividade inflamatória. Cogita-se

que a COX-3 seja uma variante da COX-1, que é, encontrada e distribuída no córtex

cerebral, medula espinal e coração. A inibição da COX-3 estaria relacionada com o

mecanismo dos anti-inflamatórios não-esteróides, onde exerceriam principalmente

atividade analgésica e antipirética (CARVALHO, 2004).

Figura 4: Sobreposição da Estrutura Ribossômica das COX-1 (branca) e 2 (amarela), adaptado

de MALKOWSKI e de KIEFER, 2000. Figura editada no programa Swiss-PDB Viewer (SPDBV).

Figura 5: Sobreposição do AA (10) nas COX-1 (branca) e 2 (amarelo), adaptado de

MALKOWSKI e de KIEFER, 2000. Figura editada no programa SPDBV.

2.4.4. MEDIADORES QUÍMICOS DA INFLAMAÇÃO

A prostaglandina (PG) (15) faz parte do grupo de componentes dos lipídicos

que derivam da hidrólise de ácidos graxos e têm importantes funções no organismo.

Todas PGs contém 20 átomos de carbono, incluindo um anel de 5 carbonos (COOK,

2005).

As tromboxanas (TXA) são produzidas nas plaquetas via troboxana-A

sintase, dos endoperóxidos produzidos pela COX, a partir do substrato AA (10). As

TXAs são vasoconstritores e potentes agentes hipertensivos, além de facilitarem a

agregação plaquetária. Normalmente encontram-se num equilíbrio homeostático no

sistema circulatório, juntamente com as prostaciclinas. A Tromboxana A2 (TXA2)

(16), produzida por plaquetas ativadas, estimula a ativação de outras plaquetas,

aumentando a agregação plaquetária (FUNK, 2001).

Prostaciclina, (14) também denominada PGI

, é produzida no endotélio pela

transformação do AA (10) através da ação COX-2. É caracterizada como

vasodilatador, e também inibidor da agregação plaquetária.

A prostaglandina H2 (PGH2) é o precursor imediato da prostaciclina e possui

função de reduzir a concentração do ácido clorídrico no estômago e de aumentar a

concentração do muco protetor, atuando, portanto, como um protetor gástrico. Além

desta função, age como vasodilatador participando ativamente de processos

cardiovasculares e da circulação renal, para contrabalançar os processos de

vasoconstrição, no intuito de evitar a necrose renal (FUNK, 2001).

2.5. FOSFOLIPÍDEOS

Os fosfolipídeos são os principais componentes estruturais das membranas,

agem como agentes emulsificantes e surfactantes. Essas funções se devem a sua

característica anfifílica, pois são constituídos de caudas apolares alifáticas de ácidos

graxos e cabeças polares que contém grupos polares, i.e. glicerol. A fosfaditilcolina

(Figura 6) forma a base mais comum dos fosfolipídeos, que podem ser tanto

saturados como insaturados (PANDIT, 2008).

Figura 6: Estrutura da Fosfatidilcolina.

Devido à característica anfifílica dos fosfolipídeos eles podem agrupar-se

espontaneamente para formar uma bicamada lipídica que é uma estrutura fina

composta de duas camadas de moléculas de fosfolipídeos de aproximadamente

3nm de espessura. A bicamada é fechada separando os compartimentos

intracelulares e extracelulares aquosos da célula e é estabilizada por diversas forças

como as interações hidrofóbicas, entre as cadeias de ácidos graxos de moléculas

fosfolipídicas, interações de van der Waals entre cadeias dos ácidos graxos,

ocorrendo o agrupamento das caudas hidrofóbicas. As ligações de hidrogênio entre

grupamentos polares e as moléculas de água permitem que ocorram interações

eletrostáticas entre grupamentos polares carregados (VOET, 2002).

2.6. FOSFOLIPASE

A fosfolipase A2 (PLA2) (Figura 7) pertence a uma super família de enzimas

que é responsável pela reação de hidrólise do glicerofosfolipídeo na posição sn-2

(Figura 8) produzindo ácidos graxos e lisofosfolipídeo, podendo diferir entre si pela

estrutura, peso molecular, especificidade de ligação ao substrato, requerimento do

co-fator Ca

, localização celular e mecanismo de ação (LAI, 2001; YEDGAR, 2006;

BOUKLI et al., 2005).

(17)

Figura 7: Estrutura Ribossômica da PLA2, com 1,8 A de resolução, adaptado CHANDRA, 2002.

Figura editada no programa SPDBV.

Figura 8: Hidrólise da fosfatidilcolina e síntese do ácido araquidônico, adaptado VOET, 2002.

A classificação das PLA2s (Tabela 4) baseadas nas propriedades biológicas

e na sequência de nucleotídios

permitiram subdividí-las em cinco classes de

isoformas: secretada (sPLA2), citosólica (cPLA2), Ca

-independente (iPLA2), PAF

acetilhidrolase (PAF-AH) e lisossomal (DENNIS, 2006).

A cPLA2 são proteínas de alto peso molecular (61-114kDa). A estrutura

cristalina da cPLA2 humana apresenta dois domínios distintos, uma amina terminal

dependente e um domínio catalítico contendo no sítio ativo resíduos de Serina

(Ser) nas posições 228 e 549 (DENNIS, 2006). Também apresenta grande

O-X

O O

O-X

Lisofosfolipídeo

COOH

Ácido Araquidônico

PLA2

(17)

(11)

(10)

importância no processo inflamatório, pois age em conjunto com a sPLA2.

(TRIGGIANI, 2006).

A iPLA2

são proteínas que diferentemente da secretada e da citosólica são

independente, porém assim como a fosfolipase citosólica são proteínas

grandes, com alto peso molecular (84-146kDa) e também usam a serina como sítio

catalítico (DENNIS, 2006).

PAF-acetilhidrolase são dois grupos de PLA2s de Ser designados GVII e

GVIII que hidrolizam o grupo acetila na posição sn-2 do PAF, uma destas enzimas é

secretada GVIIA e normalmente se encontra associada no plasma a uma

lipoproteína. As outras duas enzimas GVIIB e GVIII são enzimas intracelulares

(MURAKAMI, 2002).

PLA2 lisossomal é uma enzima purificada recentemente pelos

pesquisadores Abe e Shayman em 1998, ela esterifica o grupo acila com um grupo

hidroxi na posição do C-1 da ceramida, usando fosfolipídeo como grupo acil doador.

Possui peso molecular de 45kDa e tem como sítio catalítico os aminoácidos da Ser,

His e Asp e apresenta no final da sequência da cadeia peptídica um N-terminal

(DENNIS, 2006).

Vários estudos tem classificado a sPLA2 como a principal isoforma entre as

PLA2s responsável pelo processo inflamatório (Tabela 4). Historicamente o primeiro

grupo de fosfolipase secretada a ser descoberto foi do grupo IB, em 1986, tendo

sido isolado do suco pancreático, posteriormente o segundo grupo a ser isolado foi o

grupo IIA do líquido sinovial, em 1989 (FONTEH, 1998; TRIGGIANI, 2006). É

classificada em 14 isoformas, sendo 10 humanas (DENNIS, 2006). Particularmente o

grupo IIA demonstra ação de indução do estímulo pró-inflamatório, importante na

manifestação de várias doenças inflamatórias i.e. líquido sinovial de pacientes

acometidos por artrite reumatóide, na síndrome do estresse respiratório adulto e em

pancreatites (FUENTES, 2002). Nestas patologias humanas há um aumento

significante da atividade da sPLA2. Ademais, a sPLA2 é o pivô da propagação e

amplificação de outras desordens inflamatórias, em muitos tumores tem sido

observado elevados níveis de eicosanóides que apresentam ação central no

desenvolvimento do câncer (JIANG, 2002). Em adição à ação pró-inflamatória,

verifica-se também atividade antibacteriana e propriedade aterosclerótica (ROSS,

1999). São proteínas pequenas que compartilham diversas características entre as

quais o peso molecular, entre 14 – 18 kDa, a necessidade de concentrações

milimolares de Ca

para sua ativação, são secretadas por células sendo

consequentemente extracelulares, são compostas por aproximadamente 125

aminoácidos, sendo que, 10 a 14 destes são cisteínas (Cis), contêm usualmente de

5 a 8 ligações dissulfeto que confere a estas enzimas estabilidade contra proteólise

e resistência à desnaturação, stress oxidativo e permitem a retenção da enzima nos

fluidos onde são encontradas (DENNIS, 1994; BALSINDE et al, 1999), e os resíduos

que compõe seu sítio ativo são His, Asp e triptofano (TRP) (DENNIS, 2006). Porém

outro resíduo também é importante para a conformação estrutural e para a atividade

enzimática, como a glicina (Gli), que é necessária para a flexibilidade conformacional

permitindo que os átomos de oxigênio da carbonila contribuam com a estabilização

da ligação com o co-fator Ca

(ARNI E WARD, 1996).

Tabela 4: Isoformas da sPLA2 adaptado de DENNIS, et. al, 2006.

Grupo

Fonte

Massa Molecular

(kDa)

Pontes

dissulfídicas

Pâncreas

humano e de

porco

13-15

IIA

Cascavel e

líquido sinovial

13-15

IID

Pâncres e baço

14-15

IIE

Cérebro, coração

e útero

14-15

IIF

Embrião e

testículos

16-17

III

Humanos,

lagartos e

abelhas

15-18

Murina humana

Macrófagos,

coração e pulmão

Leucócitos, baço

e timo

XII

Murina

O mecanismo catalítico (figura 9) para hidrólise dos glicerofosfolipídeos pela

sPLA2

é pautado em estudos de difração de raios-X (JAIN e BERG, 2006), onde

observamos

que os resíduos de Asp-His do sítio catalítico se encontram

conservados.

Figura 9: Conservação dos resíduos Asp-His do sítio catalítico na presença do análogo da

fosfatidilcolina com resolução de 2,00 A, adaptado WHITE, 1990. Figura editada no programa

SPDBV.

Como podemos observar na Figura 10, o resíduo de His age como uma

base, uma vez que ao desprotonar uma molécula de água a torna um melhor

nucleófilo para atacar a subunidade carbonila do glicerofosfolipídeo. Vale salientar

que o resíduo de His é ativado por um resíduo de Asp presente no sítio catalítico.

Esta etapa reacional pode ocorrer via mecanismo concertado ou por etapas, mas até

o momento não há subsídios experimentais que permitam sanar esta questão

(LAMBEAU, 2008). Na outra subunidade do sítio catalítico da enzima, o Co-fator

, conservado no “loop”, atua como um ácido de Lewis tornando a carbonila mais

eletronegativa (CHAKRABORTI, 2003).

Aps

His

Asp

Tir

Figura 10: Desprotonação da molécula de água pelo resíduo de histidina e ataque do par de

elétrons a carbonila, adaptado de SCOTT, 1990.

O ataque da molécula de água à subunidade carbonila do glicerofosfolipídeo

leva à formação do intermediário de adição tetrahédrico (Figura 11). Na sequência o

resíduo de His protonado na etapa anterior, protona o átomo de oxigênio da posição

sn-2 do glicerofosfolipídeo, tornando-o um melhor grupo abandonador na etapa de

eliminação.

Aps

His

Asp

Tir

Figura 11: Conservação do estado tetraédrico de transição e protonação do átomo de oxigênio

da posição Sn-2 do glicerofosfolipídeo preparando para etapa de eliminação, adaptado de

SCOTT, 1990.

Por fim, observamos a liberação do ácido carboxílico, bem como do

lisofosfolipídeo (Figura 12).

Aps

His

Asp

Tir

Figura 12: Liberação do ácido carboxílico (AA) via etapa de eliminação e formação do

lisofosfolipídeo, adaptado de SCOTT, 1990.

2.6.1.EFEITO DA sPLA2 NAS CÉLULAS INFLAMATÓRIAS

Diversos estudos já demonstraram a atividade sobre a biossíntese de

mediadores lipídicos inflamatórios, entretanto as sPLA2s exercem muitas outras

atividades biológicas relevantes na resposta inflamatória (ARNI e WARD, 1996).

Estudos realizados por Granata e coloboradores, em 2005, ilustraram que várias

sPLA2s induzem a exocitose e a desgranulação de macrófagos e eosinófilos,

aumentam as concentrações locais de citocinas, i.e. fator de necrose tumoral-α

(TNFα) interleucina 1 (IL-1) e 6 (IL-6), além de quimiocinas i.e. (IL-8/CXCL-8, MCP-

1/CCL2), induzem a produção de óxido nítrico outro mediador inflamatório, aumenta

a expressão de β2-integrina, aumenta a expressão de CD40 que consequentemente

aumenta a ligação do Fas e do FasL no THP-1 de monócitos que auxiliam na

resposta imune no mecanismo de apoptose , amplia a ativação de marcadores

CD44 e CD69 em eosinófilos promovendo a adesão de moléculas (COSTA-JUNIOR,

2006; TRIGGIANI, 2006). A expressão destes marcadores da inflamação é

importante tanto para o recrutamento celular para a região inflamada, quanto para

ativar funções celulares específicas (PICCOLI, 2007).

Mesmo que grupos da sPLA2 compartilhem suas características, eles

demonstram possuir diversas funções fisiológicas em que muitas são tecido-

específicas (GRANATTA, 2005).

Recentemente a sPLA2 do grupo IIA demonstrou ter papel central no

desenvolvimento e progressão de tumores. A expressão da proteína foi observada

em adenomas colo retal e neoplasia prostáticas benignas, porém não há correlação

entre a expressão de sPLA2-IIA com a fase do tumor ou presença de metástases

segundo a classificação de Gleason, que indica a severidade do câncer de próstata

(LAYE, 2003; PATEL, 2008).

Vários estudos tem sugerido a ação da sPLA2-IIA na patogênese da

aterosclerose, uma vez que interferem nas lipoproteínas do plasma e na formação

de placas de ateroma e de fato os níveis de sPLA2-IIA estão aumentados em

pacientes com doenças coronarianas (DENNIS, 1994). A sPLA2 hidrolisa as

lipoproteínas de baixa densidade (LDL) convertendo-as em partículas pró-

aterogênicas e promove múltiplos processos inflamatórios em várias células arteriais

(WEBB, 2005, LAMBEAU, 2008).

A inibição química da atividade de PLA2 pode ser uma importante

ferramenta farmacológica contribuindo para uma melhor compreensão das

especificidades das PLA2s (BHAVE et al., 2008; DIETHARD et al., 2008). Estudos

de sua inibição tem sido objeto de vários estudos devido ao seu promissor potencial

farmacológico no tratamento da inflamação e da injúria celular. A descoberta de

novas funções, bem como a descoberta de outras isoformas PLA2s corrobora com a

necessidade de novos estudos de inibição seletiva das mesmas (CUMMINGS et al.,

2000).

2.7. ANTI-INFLAMATÓRIOS

Os anti-inflamatórios são um grupo variado de fármacos que têm em comum

a capacidade de controlar os sinais clínicos da inflamação: o edema, o rubor, o

tumor, a dor e em casos mais graves a perda de função (SILVA, 2002). Podem ser

classificados em anti-inflamatórios esteroidáis (AIEs) e não-esteroidáis.

2.7.1. ANTI-INFLAMATÓRIOS ESTEROIDÁIS (AIES)

Os corticosteróides (Figura 13) i.e. cortisona (18) são fármacos amplamente

usados em função de seus efeitos imunossupressivos e anti-inflamatórios no

tratamento de doenças reumáticas, além de outras desordens inflamatórias

(CHAKRABORTI, 2003). Seu mecanismo de ação se dá por meio da ação inibitória

da PLA2, através da liberação de lipocortina-1, que são agentes inibidores da

produção de prostaglandinas e leucotrienos (ANTI, 2006; WILTON, 1998). O

resultado final da ação destes anti-inflamatórios, é a parcial ou total redução da

liberação das prostaglandinas e também dos leucotrienos. A lipocortina 1 atua por

sequestrar o substrato fosfolipídico e/ou inibir diretamente a enzima. Qualquer um

desses mecanismos poderia contribuir para a redução na produção tanto do fator

ativador de plaquetas quanto dos eicosanóides, observada na presença de

corticóides (OLIANI, 2006).

Os AIEs são análogos sintéticos do cortisol, hormônio produzido pelas

glândulas supra-renais a partir do colesterol, capturado da circulação sob a forma de

lipoproteína de baixa densidade (LDL). A cortisona (18) é um protótipo dos

glicocorticóides e possui a mesma estrutura básica dos esteróides caracterizada

pelo núcleo ciclopentanoperidrofenantreno. Na estrutura química dos

corticosteróides existem grupos essenciais que se alterados anulam a atividade

corticóide (JIANG, 2000).

(18)

Figura 13: Estrutura do ciclopentanoperidrofenantreno (azul), i.e. cortisona (18) e seus

grupamentos farmacóforos, adaptado SILVA, 2002.

2.7.2. ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO ESTEROIDÁIS (AINEs).

Os AINEs são fármacos de propriedades anti-inflamatórias, analgésica,

antitérmica e antitrombótica. A ação anti-inflamatória destes fármacos se dá pela

inibição de cicloxigenases constitutiva (COX-1) e induzida (COX-2). A primeira,

presente em sítios gástricos e renais, é responsável pela produção de PGs que

exercem proteção tecidual, já a COX-2 surge em locais inflamados (BERTOLINI,

2001). A inibição da COX-1 por anti-inflamatórios tidos como convencionais i.e.

ácido acetilsalicílico (4), paracetamol (19), diclofenaco (20), ibuprofeno (21) e ácido

mefenâmico (22), são responsáveis pelo surgimento de diversos efeitos colaterais

como a úlcera gástrica e a nefropatia (VANE, 1971, SÜLEYMAN, 2007). Já a classe

tida como inibidores seletivos da COX-2 teria uma vantagem sobre os inibidores

não-seletivos, pois executaria sua ação anti-inflamatória sem os efeitos colaterais da

inibição não-seletiva (WANNMACHER, 2004).

Porém a inibição seletiva da COX-2, i.e. rofecoxibe (25) logo revelou ter

seus próprios problemas, com o bloqueio da enzima ocorre a diminuição da

produção de prostaglandina E

(PGE

), cuja função é a indução da dor e da

inflamação. O mesmo mecanismo também reduz a síntese de prostaciclina (PGI

que é uma prostaglandina cardioprotetora cuja ação inibitória diminui a dilatação dos

vasos sanguíneos e impede a agregação plaquetária. O que aumenta os problemas

COOH

(4)

(19)

(20)

(21)

(

)

dessa inibição é que o tromboxano ainda exerce suas funções vasoconstritoras e de

agregação plaquetária que são opostas à PGI

. Este desequilíbrio estimula a

formação de coágulos e assim provoca distúrbios cardíacos e derrames cerebrais

(STIX, 2007).

Apesar de toda informação conhecida a respeito da fosfolipase A2, do

processo inflamatório e dos medicamentos anti-inflamatórios ainda existem muitos

pontos a serem explorados quando se entrelaçam estes temas principalmente no

que se refere a desenvolvimento de novos fármacos.

Ademais, a história recente dos fármacos anti-inflamatórios mais

especificamente os COXs-2 seletivos apresentaram graves problemas cardio-

vasculares, que acarretaram na retirada de vários membros desta classe de

fármacos do mercado farmacêutico global (MAMDANI, 2003). Isto ratifica a

necessidade da pesquisa e desenvolvimento de novas candidatos a protótipos de

fármacos anti-inflamatórios que atuem ou mesmo eliminem problemas anteriores

que ocorreram com estes fármacos por mecanismos distintos daqueles já

disponíveis no mercado. E se tornem alternativas no combate a doenças crônicas

derivadas da autoimunidade assim como a processos inflamatórios causados por

contusões, ferimentos ou traumas.

(23)

(24)

(25)

(26)

(27)

3. OBJETIVOS:

3.1.Objetivo geral.

No âmbito de uma linha de pesquisa que visa o planejamento, a síntese e a

avaliação farmacológica de novos candidatos a protótipos de fármacos anti-

inflamatórios, será descrito neste trabalho o planejamento de novos derivados

pirazólicos LQFM 002 e LQFM 003 e quinolínico (28) originalmente desenhados a

partir do nerolidilcatecol (26) e do derivado arilsulfonilpiperazínico (27), que

apresentam perfil inibitório da enzima sPLA2.

Para tal, foi empregado a estratégia de hibridação molecular, onde a partir

de subunidades específicas dos protótipos (26) e (27) descritos na literatura, com

valores de IC

= PLA2 B. asper 1,0 mM (26) e PLA2 pancreática bovina 1,4 µM,

PLA2 plaqueta lisada de coelho 1,7 µM (27), respectivamente, foi desenhado novos

candidatos a protótipos LQFM 002 e LQFM 003, que mantêm relação isostérica com

os protótipos mencionados (BINISTI et al., 2001; HEYMAN et al., 2005; NÚNEZ et

al., 2005).

(Y)

Figura 14: Novos inibidores da sPLA2 desenhados a partir do nerolidilcatecol e de

sulfonilpiperazinas.

(LQFM 002) Y=H

(LQFM 003) Y=C

(28) R

PLA2 pancreática bovina 1,4 µM

PLA2 plaqueta lisada de coelho 1,7 µM

PLA2 B. asper 1,0 mM

3.2. Objetivos específicos

3.2.1. Síntese das moléculas objeto de estudo através do emprego da

síntese orgânica medicinal em escala de bancada;

3.2.2. Estudos de modelagem molecular a fim de se avaliar a dinâmica do

processo de interação entre as moléculas objeto de estudo e seu correspondente

alvo terapêutico;

3.3.3. Ensaios farmacológicos, frente a protocolos de pesquisa, para a

atividade farmacológica proposta;

4. MATERIAIS E MÉTODOS:

4.1. Aparelhagem analítica:

Os espectros de RMN de

H, RMN de

C, de HMQC e de HMBC foram

obtidos no Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás no aparelho de

Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear, BRUKER 500Hz para

H, e as

amostras dissolvidas em CDCl

e no Instituto de Química da Universidade de Brasília

no aparelho de Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear, magneto

supercondutor 7,05T (300Hz) tendo as amostras dissolvidas em CDCl

Os espectros de infravermelho foram obtidos no Laboratório de Controle de

Qualidade de Medicamentos da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de

Goiás no aparelho de Espectrômetro de Infravermelho, Perkin-Elmer Spectrum BXII

FT-IR System, as amostras foram preparadas com brometo de potássio (KBr).

Os espectros de massas foram obtidos no Laboratório de Química da

Universidade Estadual de Campinas-SP no aparelho Micromass Q-Tof [M+Na]

m/z.

Os pontos de fusão foram determinados no aparelho Marte

modelo 284594

no Laboratório de Química Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal de Goiás.

Os dados de difração de raios X foram coletados com um difratômetro

KappaCCD, usando radiação Kα do molibdênio (λ = 0.71073 Å) à temperatura

ambiente (25º C). O intervalo de coleta em θ foi 2º a 27,55º no ângulo de

espalhamento. A varredura foi feita no ângulo φ em passos de 1º.

As placas cromatográficas para o monitoramento das reações em CCD

foram usadas placas de alumínio da marca Whatman

AL SIL G/UV fluorescente em

ultravioleta no comprimento de onda 254 (UV

254

). As visualizações em cromatografia

de camada delgada foram realizadas em lâmpada de ultravioleta 254-365nm.

4.2. METODOLOGIA SINTÉTICA

4.2.1. Síntese de (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-dimetil-1-H-pirazol-5-

amina (LQFM 002) (LUO, 2004).

ZnCl

/NaCNBH

Citral

MeOH/t.a./20min/76%

Em um balão foi adicionado 500 mg (4,49 mmol) de 5-amino-1,3-

dimetilpirazol, 0,3 mL (4,49 mmol) de citral, 215 mg (2,24 mmol) de ZnCl

e 173 mg

(2,24 mmol) de NaCNBH

, solubilizados em metanol. A mistura foi submetida à

agitação mecânica a temperatura ambiente por 20 minutos, posteriormente o

solvente foi evaporado a pressão reduzida. A mistura foi extraída em clorofórmio e

monitorada por cromatografia em camada delgada, usando como fase móvel n-

hexano-acetato (70:30) sendo que, a placa cromatográfica foi visualizada em

câmara de ultra-violeta. A substância foi purificada em cromatografia de adsorção

em coluna, empregando sílica como fase estacionária e n-hexano-acetato (10:90)

como fase móvel. Desta maneira a substância (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-

dimetil-1-H-pirazol-5-amina (LQFM 002) foi obtida com 76% de rendimento, cujo

aspecto é oleoso e de coloração amarela.

máx

-1

: 3218(νN-H), 1398 (νArN), 1268 (νC-N

sec

), 835 (νN-H). (Anexo 1)

RMN-

H (500 MHz) CDCl

/TMS, δ-ppm: 5,28 (1H, m, H-2), 5,27 (1H, s, H-4’), 5,08

(1H, m, H-6), 3,53 (3H, s, CH

N), 2,16 (3H, s, CH

-3’), 2,05 (4H, m, CH

-4, CH

-5),

1,70-1,50 (9H, 2s, 3xCH

). (Anexo 2)

(29)

(LQFM 002)

1’

2’

3’

5’

4’

4.2.2. Síntese de (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-dimetil-4-((4-

metilpiperazina-1-il)metil)-1H-pirazol-5-amina (LQFM 003) (BHARATHI et. al,

2007).

Formaldeído

MeOH/aq/24h/37%

Em um balão foram adicionados 718 mg (2,87 mmol) de (E)-N-(3,7-

dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-dimetil-1-H-pirazol-5-amina (LQFM 002) e 200 mg (2,87

mmol) de metilpiperazina, que foram solubilizados em 20 mL de metanol refluxado

durante 24 horas, cujo foi adicionado em intervalos de 8 horas duas porções iguais

de formaldeído 0,08 mL (2,87 mmol), ao término das 24 horas o solvente foi

evaporado a pressão reduzida. A mistura foi extraída em clorofórmio e monitorada

por cromatografia em camada delgada, sendo que, a placa cromatográfica foi

visualizada em câmara de ultra-violeta. A substância foi purificada em cromatografia

de adsorção em coluna, empregando sílica como fase estacionária e hexano-acetato

(100:0) como fase móvel. Desta maneira obtivemos a substância (E)-N-(3,7-

dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-dimetil-4-((4-metilpiperazina-1-il)metil)-1H-pirazol-5-amina

(LQFM 003) foi obtida com 37% de rendimento, cujo o aspecto é oleoso e de

coloração amarela.

máx

(cm

-1

): 3441,53 (νN-H); 1399,23 (νArN); 1058,81 (νC-N

sec

); 982,21 (νN-H).

(Anexo 3)

RMN-

H (500 MHz) CDCl

/TMS, δ-ppm: 5,25 (1H, m, H-2), 5,02 (1H, s, H-6), 3,60

(3H, s, CH

-1’), 3,53 (2H, m, CH

-1), 3,19 (2H, m, CH

-6’), 2,70-1,80 (12H, m, CH-

2”, CH

-3”, CH

5”, CH

6”, CH

-4, CH

-5), 2,20 (3H, s, CH

-3’), 2,05 (3H, s, CH

-4”),

1,62, 1,54, 1,52 (9H, 3s, 3xCH

). (Anexo 4)

(LQFM 002)

(

)

(LQFM 003)

7 8

1’

2’

3’

5’

6’

4’

1”

2”

3”

4”

5”

6”

4.2.3. Síntese de N-(1,3-dimetil-1-H-pirazol-5-il)acetamida (32)

(MUKHOPADHYAY, 2002).

/30min/t.a.

/10min/t.a./85%

Em um béquer foram adicionados 222,30 mg (2 mmol) de 5-amino-1,3-

dimetilpirazol, 0,2 mL (2,04 mmol) de anidrido acético e 0,013 mg de I

sob agitação

durante trinta minutos a temperatura ambiente, posteriormente foi adicionado

tiossulfato de sódio e a solução mantida em agitação por mais dez minutos, o

solvente foi evaporado a pressão reduzida. A mistura foi extraída em clorofórmio e

monitorada por cromatografia em camada delgada, sendo que, a placa

cromatográfica foi visualizada em câmara de ultra-violeta.

máx

(cm

-1

): 3231,96 (νNH), 2917,31 (νCH

), 1676,32 (νC=O), 1560,20 (νN-H).

(Anexo 5)

RMN-

H (500 MHz) CDCl

/TMS, δ-ppm: 8,47 (1H, s, NH), 5,98 (1H, s, H-4’), 3,59

(3H, s, CH

-1’), 2,18 (3H, s, CH

-3’), 2,13 (3H, s,CH

-CO). (Anexo 6)

HMBC (500 MHz) CDCl

/TMS, δ-ppm: 168,5 (1C, C=O), 146,3 (1C, C-3’), 135,7 (1C,

C-5’), 99,5 (1C, C4’), 69,9 (1C, CH

-1’), 22,9 (1C, CH

-CO), 13,9 (1C, CH

-3’).

(Anexo 7)

(29) (31)

(32)

1’

2’

3’

4’

5’

4.2.4. Procedimento Geral para Reação de Condensação de Knoevenagel (BIGI,

2000).

Em um balão foram adicionados 3,31 mmol de aldeído, 10 mL de água e

3,31 mL de etilcianoacetato. Esta mistura foi homogeneizada e adicionado 1 gota (5

mol %) de morfolina, formando uma suspensão que foi mantida em agitação

mecânica a temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi extraída em clorofórmio e

monitorada por cromatografia em camada delgada, sendo que, a placa

cromatográfica foi visualizada em câmara de ultra-violeta.

4.2.4.1. Síntese de (E)-etil 2-ciano-3(2-nitrofenil)acrilato (35).

CHO

COOEt

Morfolina

O/t.a./1h/92,3%

O derivado (35) foi obtido em 92,3% de rendimento como sólido laranja. P.F.

102ºC, Rf = 0.62 (n-hexano/acetato de etila, 7:3).

máx

(KBr) cm

-1

: 2231 (νC-N), 1727 (νC=O), 857 (νC-NO

), 758 (νC=C). (Anexo 8)

RMN-

H (300 MHz) CDCl

/TMS, δ-ppm: 8,78 (1H, s, Hβ), 8,62-8,30 (1H, m, H-2),

7,93-7,84 (3H, m, H-3, 4, e 5), 4,43 (2H, q, J 6,0 Hz, CH

), 1,44 (3H, t, J 6,0 Hz,

(Anexo 9)

RMN-

C (75 MHz) CDCl

/TMS, δ-ppm: 160,9 (C=O), 153,1 (Cβ), 147,3 (C-6), 134,4

(C-3), 132,1 (C-4), 130,5 (C-2), 128,0 (C-1), 125,4 (C-5), 113,8 (C-N), 108,5 (Cα),

63,1 (CH

), 14,0 (CH

). (Anexo 10)

MS m/z, 269.0538 [M-Na]

, Calcd. C

269.1819. (Anexo 12)

(33)

(34)

(35)

1’

2’

3’

4’

5’

6’

1”

2”

4.2.4.2. Síntese de (E)-etil-2-ciano-3-fenilacrilato (37)

CHO

COOEt

Morfolina

O/t.a./1h/89,6%

O derivado (37) foi obtido em 89,6% de rendimento como sólido amarelo.

P.F. 44ºC, Rf = 0.5 (n-hexano/acetato de etila 7:3).

máx

(KBr) cm

-1

: 2230 (νC–N), 1724 (νC=O), 768 (νCAr). (Anexo 13)

RMN

H (300 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 8.05 (1H, s, Hβ), 7.92 (2H, d, J 10.5 Hz, H-

2, e 6), 6.68 (2H, d, J 10.5 Hz, H-3, e 5), 4.32 (2H, q, J 6.0 Hz, CH

), 1.36 (3H, t, J

6.0 Hz, CH

(Anexo 14)

RMN

C (75 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 160.9 (C=O), 153.1 (Cβ), 147.3 (C-6), 134.4

(C-3), 132.1 (C-4), 130.5 (C-2), 128.0 (C-1), 125.4 (C-5), 113.8 (C-N), 108.5 (Cα),

63.1 (CH

), 14.0 (CH

). (Anexo 15)

MS m/z, 224.0687 [M-Na]

, Calcd. C

224.0813. (Anexo 17)

(36)

(34)

(37)

1’

2’

3’

4’

5’

6’

1”

2”

4.2.4.3. Síntese de (E)-etil-2-ciano-3-(4-(dimetilamino)fenil)acrilato (39)

CHO

COOEt

Morfolina

O/t.a./1h/98,0%

O derivado (39) foi obtido em 98,0% de rendimento como sólido amarelo.

P.F. 128ºC, Rf = 0,87 (CH

/MeOH, 95:5) e Rf = 0,64 (n-hexano/acetato de etila,

7:3).

máx

(KBr) cm

-1

: 2916 (νCAr-N), 2209(νC=N), 1705 (νC=O), 819 (νCAr 1,4di).

(Anexo 18)

RMN-

H (500 MHz) CDCl

/TMS, δ-ppm: 8,05 (1H, s, Hβ), 7,92 (2H, d, J 10,5 Hz, H-

2, e 6), 6,68 (2H, d, J 10,5 Hz, H-3 e 5), 4,32 (2H, q, J 6,0 Hz, CH

), 1,36 (3H, t, J 6,0

Hz, CH

(Anexo 19)

RMN

C (75 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 164,5 (C=O), 154,7 (Cβ), 153,8 (C-4), 134,3

(C-2 e 6), 119,5 (C-1), 117,8 (C-N), 111,7 (C-3 e 5), 94,1 (Cα), 62,1 (CH

), 40,2 (N-

), 14,5 (CH

). (Anexo 20)

MS m/z, 267.1100 [M-Na]

, Calcd. C

267,2603. (Anexo 22)

(38)

(34)

(39)

1’

2’

3’

4’

5’

6’

1”

2”

4.2.4.4. Síntese de (E)-etil 2-ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi)fenil)acrilato (41)

Derivado (41) foi obtido com 84,3% de rendimento como um sólido amarelo.

P.F. 110ºC, Rf = 0,78 (CH

/MeOH, 95:5) e Rf = 0,64 (n-hexano/acetato de etila,

7:3).

máx

(KBr) cm

-1

: 3375 (ν-OH), 2219 (νC=N), 1702 (νC=O), 762 (νOH Fenol). (Anexo

23)

RMN

H (300 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 8,05 (1H, s, Hβ), 7,92 (2H, d, J 10.5 Hz, H-2

e 6), 6,68 (2H, d, J 10,5 Hz, H-3 e 5), 4.32 (2H, q, J 6,0 Hz, CH

), 1,36 (3H, t, J 6,0

Hz, CH

). (Anexo 24)

RMN

C (75 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 163,1 (C=O), 154,8 (Cβ), 150,8 (C-4), 146,8

(C-3), 128,7 (C-6), 124,1 (C-1), 116,4 (C-N), 114,4 (C-5), 111,1 (C-2), 98,8 (Cα),

62,4 (OCH

), 56,1 (CH

), 14,1 (CH

). (Anexo 25)

MS m/z, 270.0742 [M-Na]

, Calcd. C

270.2129. (Anexo 27)

CHO

NC COOEt

Morfolina

O/t.a./1h/84,3%

OCH

(40)

(34)

(

)

1’

2’

3’

4’

5’

6’

1”

2”

4.2.4.5. Síntese de (E)-etil 2-ciano-3-(4-nitrofenil) acrilato (43)

CHO

COOEt

Morfolina

O/t.a./1h/87,6%

O derivado (43) foi obtido em 87,6% de rendimento como sólido amarelo.

P.F. 150,6ºC, Rf = 0,73 (n-hexano/acetato de etila, 7:3).

máx

(KBr) cm

-1

: 2226 (νC=N), 1720 (νC=O), 858 (νArNO

). (Anexo 28)

RMN

H (300 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 8,36 (2H, d, J 9,0 Hz, H-3, H-5), 8,30 (1H,

s, Hβ), 8,14 (2H, d, J 9,0 Hz, H-2, H-6), 4.42 (2H, q, J 6,0 Hz, CH

), 1,42 (3H, t, J 6,0

Hz, CH

(Anexo 29)

RMN

C (75 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 161,4 (C=O), 151,7 (Cβ), 149,6 (C-4), 136,8

(C-1), 131,5 (C-2 e 6), 124,3 (C-3 e 5), 114,5 (C-N), 107,3 (Cα), 63,3 (CH

), 14,1

(CH

). (Anexo 30)

MS m/z, enc. 269,0538 [M-Na]

, Calcd. C

269,1819. (Anexo 31)

(42)

(34)

(43)

1’

2’

3’

4’

5’

6’

1”

2”

4.2.4.6. Síntese de (E)-etil 3-(2-clorofenil)-2-cianoacrilato (45)

CHO

COOEt

Morfolina

O/t.a./1h/82,0%

O derivado (45) foi obtido em 82,0% de rendimento como sólido amarelo.

P.F. 55ºC, Rf = 3,5 (n-hexano/acetato de etila, 7:3).

máx

(KBr) cm

-1

: 2223 (νC-N), 1731 (νC=O), 1090 (νCAr–Cl), 757 (νCAr 1,2di).

(Anexo 32)

RMN

H (300 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 8,69 (1H, s, Hβ), 8,23 (1H, dd, J 7,5 e 3,0

Hz, H-2), 7,53-7,38 (3H, m, H-3, 4, e 5), 4.40 (2H, q, J 6,0 Hz, CH

), 1,41 (3H, t, J 6,0

Hz, CH

(Anexo 33)

RMN

C (75 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 162,0 (C=O), 151,4 (Cβ), 136,6 (C-6), 133,9

(C-4), 130,5 (C-3 e 6), 130,1 (C-1), 127,7 (C-2), 115,1 (C-N), 106,4 (Cα), 63,2 (CH

14,4 (CH

). (Anexo 34)

MS m/z, enc. 258,0350 [M-Na]

, Calcd. C

ClNO

258,6420. (Anexo 35)

(44)

(34)

(45)

1’

2’

3’

4’

5’

6’ 1

1”

2”

4.2.4.7. Síntese de (E)-etil 2-ciano-3-p-tolilacrilato (47)

CHO

COOEt

Morfolina

O/t.a./1h/88,0%

O derivado (47) foi obtido em 88,0% de rendimento como sólido amarelo.

P.F. 93,6ºC, Rf = 0,85 (n-hexano/acetato de etila, 7:3).

máx

(KBr) cm

-1

: 2216 (νC-N), 1725 (νC=O), 815 (νCAr 1,4Di). (Anexo 36)

RMN

H (300 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 8,21 (1H, s, Hβ), 7,90 (2H, d, J 7,5 Hz, H-2,

e 6), 7,30 (2H, d, J 7,5 Hz, H-3, e 5), 4,37 (2H, q, J 6,0 Hz, CH

), 1,39 (3H, t, J 6,0

Hz, CH

). (Anexo 37)

RMN

C (75 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 166,3 (C-8), 165,3 (C-6), 153,7 (C-1), 143,9

(C-5), 143,6 (C-3a), 138,5 (C-10), 134,5 (C-8a), 134,3 (C-100), 129,7 (C-400), 129,5

(C-200 e 600), 129,2 (C-30 e 50), 127,7 (C-300 e 500), 127,1 (C-40), 121,9 (C-20 e

60), 119,3 (C-5a), 110,7 (C-1a), 15.1 (CH

). (Anexo 38)

MS m/z, enc. 238,0891 [M-Na]

, Calcd. C

238,2321. (Anexo 39)

(46)

(34)

(47)

1’

2’

3’

4’

5’

6’

1”

2”

4.2.4.8. Síntese de (E)-etil 3-(4-clorofenil)-2-cianoacrilato (49).

CHO

COOEt

Morfolina

O/t.a./1h/85,0%

O derivado (49) foi obtido em 85,0% de rendimento como sólido amarelo.

P.F. 91,3ºC, Rf = 3.5 (n-hexano/acetato de etila, 7:3).

máx

(KBr) cm

-1

: 2226 (νC=N), 1723 (νC=O), 1081 (νCAr–Cl) 839 (CAr 1,4di).

(Anexo 41)

RMN

H (300 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 8,05 (1H, s, Hβ), 7,92 (2H, d, J 10,5 Hz, H-

2, e 6), 6,68 (2H, d, J 10,5 Hz, H-3, e 5), 4,32 (2H, q, J 6,0 Hz, CH

), 1,36 (3H, t, J

6,0 Hz, CH

). (Anexo 42)

RMN

C (75 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 162,2 (C=O), 153,3 (Cβ), 139,5 (C-1), 132,2

(C-2 e 6), 129,8 (C-3 e 5), 129,6 (C-4), 115,2 (C-N), 103,4 (Cα), 62,8 (CH

), 14,1

(CH

). (Anexo 43)

MS m/z, enc. 258,0350 [M-Na]

, Calcd. C

ClNO

258,6420. (Anexo 44)

(48)

(34)

(49)

1’

2’

3’

4’

5’

6’

1”

2”

4.2.4.9. Síntese de (E)-etil 2-ciano-3-(2-hidroxifenil) acrilato (51)

CHO

COOEt

Morfolina

O/t.a./1h/17,0%

O derivado (51) foi obtido em 17,0% de rendimento como sólido laranja. P.F.

90ºC, Rf = 0,87 (CH

/MeOH, 95:5) e Rf = 0,74 (n-hexano/acetato etila, 7:3).

máx

(KBr) cm

-1

: 3065 (νO–H), 2979 (νC-H) 1764 (νC=O), 775 (νCAr 1,2di). (Anexo

46)

RMN

H (300 MHz) CDCl

/TMS (δ-ppm): 8,51 (1H, s, Hβ), 7,66-7,58 (2H, m, H-2 e

4), 7,35-7,29 (2H, m, H-3 e 5), 4.40 (2H, q, J 7,5 Hz, CH

), 1.39 (3H, t, J 7,5 Hz,

). (Anexo 47)

MS m/z, enc. 241,0298 [M-Na]

, Calcd. C

240,1917. (Anexo 48)

(50)

(34)

(51)

1’

2’

3’

4’

5’

6’

1”

2”

4.2.5. Síntese de Etil 2-aminoquinolina-3-carboxilato (52) (ZHOU, 1998).

TiCl

/Zn

THF/2h/85,0%

Em sistema vedado de duas entradas foram adicionados 1,961 mg (30

mmol) de Zn ativado, 10 mL em tetrahidrofurano (THF) e 1,64 mL (15 mmol) de TiCl

sob agitação mecânica a temperatura ambiente para homogeneização,

posteriormente esta mistura foi refluxada por 2 horas. Após o período de refluxo a

mistura foi resfriada a temperatura ambiente e sob agitação mecânica foram

adicionados 1,230 mg (5 mmol) de (E)-etil 2-ciano-3(2-nitrofenil)acrilato (35), a

agitação foi mantida por 30 min. O solvente foi evaporado a pressão reduzida, e a

mistura foi adicionado uma solução de K

10% (100 mL), a mesma foi submetida

a filtração à vácuo e o filtrado extraído em diclorometano. A reação foi monitorada

por cromatografia em camada delgada, sendo que, a placa cromatográfica foi

revelada em câmara de ultra-violeta e em revelador específico para amina (p-

dimetilaminobenzaldeído). A substância foi submetida à extração ácido-base como

procedimento de purificação. Desta maneira a substância Etil 2-aminoquinolina-3-

carboxilato (52) foi obtida em 85,0% de rendimento, com aspecto sólido e de

coloração amarela.

O derivado (52) foi obtido em 85,0% de rendimento como sólido amarelo. Rf

= 0.37 (CH

/MeOH, 95:5).

máx

-1

: 3416 (νNH

), 2920-2850 (νC-H), 1697 (νC=O), 1622 (νN-H). (Anexo 49)

RMN-

H (500 MHz) CDCl

/TMS, δ-ppm: 8,73 (1H, s, HAr-4), 7,69-7,59 (3H, m, HAr-

6, 8, 9), 7,26-7,23 (1H, m, HAr-7), 4,42 (2H, q, J 7,2 Hz, OCH

), 1,45 (3H, t, J 7,1 Hz,

). (Anexo 50)

(35)

(52)

1’

2’

3’

4.2.6. Síntese de (2-aminoquinolina-3-il)(4-metilpiperazina-1-il)metanona (28)

(BARF, 2002).

N NH

AlCl

Cl/t.a./15min/68,0%

Em um sistema vedado foram adicionados 160 mg (1,2 mmol) de AlCl

, 1,1

mL (10,00 mmol) e metilpiperazina solubilizados em 20 mL de diclorometano, este

sistema foi mantido em agitação mecânica durante 10 min a temperatura ambiente.

Transcorrido este tempo foi adicionado 216 mg (1 mmol) de etil-2-aminoquinolina-3-

carboxilato (52) mantendo a mistura em agitação por mais 15 min., a mesma foi

adicionado 10 mL de solução de HCl 10%. A mistura foi extraída em diclorometano e

posteriormente o solvente evaporado a pressão reduzida. A reação foi monitorada

por cromatografia em camada delgada, sendo que, a placa cromatográfica foi

revelada em câmara de ultra-violeta. Desta maneira a substância (2-aminoquinolina-

3-il)(4-metilpiperazina-1-il)metanona (28) foi obtida em 68,0% de rendimento com

aspecto oleoso e de coloração castanha.

O derivado (28) foi obtido em 68,0% de rendimento como óleo castanho. Rf

= 0.43 (CH

/MeOH, 95:5).

máx

-1

: 2918 (νNH

), 1624 (νC=O), 1291 (νNH), 1235 (νC-N). (Anexo 51)

RMN-

H (500 MHz) CDCl

/TMS, δ-ppm: 7,81 (1H, s, HAr-4), 7,74-7,59 (4H, m, HAr-

6, 7, 8, 9), 2,68-2,36 (8H, m, 4 x CH

), 2,33 (3H, s, CH

). (Anexo 52)

(52)

(30)

(28)

1’

2”

3”

1”

4”

5”

6”

4.3. METODOLOGIA DE MODELAGEM MOLECULAR

Para efetuação dos estudos de dinâmica molecular foi utilizado o programa

Scalable Molecular Dynamics (NAMD) (PHILLIPS, 2005) de domínio público, o qual

a estrutura cristalográfica da enzima sPLA2 depositada no PDB sob o código de

1KPM foi parametrizada, aplicando os campos de força AMBER (CORNELL, 1995) e

CHARMM (MACKERELL E KARPLUS, 1998), ambos já descritos na literatura. Estes

fornecem parâmetros empíricos de mecânica molecular, para investigação das

propriedades moleculares da proteína, que permite estabelecer parâmetros de

relação estrutura atividade.

Os candidatos a protótipos inibidores da sPLA2 foram parametrizados pelo

programa Gaussian 03 (FRISCH E POPLE, 2005), pois a parametrização destas

substâncias permite avaliar as cargas parciais, com intuito de verificar a interação

ligante-receptor.

Para a análise conformacional entre o N-(1,3-dimetil-1H-pirazol-5-il)

acetamida e o paracetamol os cálculos foram realizados em PC com processador

Atlon de 1.8 GHz, com 512 MB de memória RAM, utilizando o programa PC Spartan

Pro. De maneira geral, os compostos estudados foram desenhados no programa PC

Spartan Pro e submetidos à otimização geométrica através do emprego de

Mecânica Quântica em nível semi-empírico AM1. Após a otimização geométrica os

compostos foram submetidos à análise conformacional sistemática e as

conformações de menor energia foram empregadas nos cálculos de “Single-point”.

4.4.ENSAIOS FARMACOLÓGICOS

4.4.1. Perfil inibitório da atividade da sPLA2

A avaliação do perfil inibitório da atividade da sPLA2 foi efetuada pelo

método originalmente descrito por Harbermann e Hardt (1972) e modificado para a

quantificação da ação de fosfolipase de peçonha de serpentes e avaliação dos

compostos obtidos durante o traballho (GUTIÉRREZ et al., 1988; FORTES-DIAS et

al., 1999). A peçonha de Crotalus durissus collilinectus foi utilizado como fonte de

sPLA2. Uma solução de agarose (0,6%) em tampão Tris 0,05 M (pH 7,5) foi

preparada e em seguida, foi adicionado a essa solução 0,96% de suspensão de

gema de ovo (1:3 em salina) e 0,96% de solução 0,01 M de CaCl

, transferindo-se

para placas de Petri. Após solidificação do gel foram perfuradas cavidades com dois

milímetros de diâmetro. Logo em seguida incubou-se de solução de veneno de

cobra (125 µg/mL) juntamente com igual volume de substâncias LQFM 002 e LQFM

003 em DMSO 3% (250, 500, 1000 e 2000 µg/mL) veículo (DMSO 3%) ou

quercetina usada como controle positivo do ensaio (250, 500, 1000 e 2000 µg/mL). E

após sessenta minutos 10µL de cada mistura foram adicionados às cavidades. Em

seguida à inoculação, as placas foram incubadas a 50º C por vinte horas, sendo

então realizada a medida dos halos produzidos pela atividade da sPLA2. Os

resultados foram expressos como a área dos halos formados (mm

) pela atividade

da sPLA2 (média + E.P.M.).

4.4.2. Peritonite induzida por carragenina

Este ensaio avalia a evolução da migração leucocitária para a cavidade

peritoneal, segundo protocolo originalmente descrito por Ferrándiz e Alcaraz (1991).

Quatro grupos experimentais de 10 camundongos foram tratados previamente pela

via v.o. com veículo (Tween 80 2% v/v ), LQFM 002 (50 mg/kg), LQFM 003 (50

mg/kg v.o.) e com dexametasona (2 mg/kg). Decorridos 60 minutos após os

tratamentos, foram administrados aos animais pela via i.p. 0,25 mL de carragenina

(1% m/v em salina). Após 4 horas, os animais foram submetidos a eutanasia em

câmara fechada com éter e na cavidade peritoneal foram injetados 2 mL de PBS

heparinizado (10 UI/mL de heparina). Após 60 compressões leves no abdômen, o

fluído foi coletado, a amostra diluída (1:20 em Solução de Tϋrck) e a contagem do

número de leucócitos totais migrados realizada em câmera de Newbauer. Os

resultados foram expressos como as médias ± EPM do números de leucócitos totais

migrados x 10

por mL.

4.4.3. Indução da pleurisia pela carragenina 1%.

Grupos de 8 animais foram anestesiados com éter, e posteriormente injetou-

se o corante azul de Evans (2,5 mg/mL), por via intravenosa (plexo orbital). Após

duas horas os animais foram tratados por via oral (v.o) com a LQFM002 nas

seguintes doses 25, 50, 100 mg/kg. O fármaco usado como controle positivo foi a

dexametasona a 20 mg/kg e o veículo foi DMSO 3% (10 mL/kg).

Decorrido uma hora após o tratamento anestesiou-se novamente os animais

com éter e foi aplicado na região pleural 100 μL de carragenina a 1%. Quatro horas

após o tratamento os animais foram submetidos a eutanasia em câmara fechada

com éter, seguido de deslocamento cervical. A cavidade pleural foi então aberta e

lavada com 1 mL de PBS-heparinizado, sendo que, em uma parte do exsudato foi

realizado a contagem total de células e a outra parte foi centrifugada a 3000 rpm, e

realizou-se a leitura em espectrofotômetro a 600 nm com o sobrenadante para

determinação da concentração de proteínas plasmáticas.

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1. Síntese Orgânica Medicinal

O início do trabalho sintético se deu com a reação de aminação redutiva,

através do emprego do 5-amino-1,3-dimetilpirazol (29) e citral, em meio de metanol,

cloreto de zinco e cianoborohidreto de sódio como agente redutor, à temperatura

ambiente, levando à obtenção do intermediário chave (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-

dienil)-1,3-dimetil-1-H-pirazol-5-amina (LQFM 002), em rendimento de 76%

(Esquema 1) (LUO et al, 2004).

ZnCl

/NaCNBH

Citral

MeOH/t.a./20min/76%

Esquema 1

(29)

(LQFM 002)

Como pode ser observado no Esquema 2, a reação de aminação redutiva

envolve a formação do intermedário iminium (57), via etapa de adição (55) e

eliminação (58), que, in situ, é reduzido (59) com cianoborohidreto de sódio. Nas

condições experimentais empregadas, considera-se que a etapa determinante da

velocidade da reação é a etapa de adição à carbonila (54) (SILVA, 2007).

Esquema 2

Na sequência (Esquema 3), o intermediário-chave LQFM 002 foi submetido

à condição de reação de Mannich (MANNICH, 1917). Cujo intermediário chave

LQFM 002, na presença de N-metil-piperazina (30), formaldeído e metanol sob

temperatura de refluxo, por um período de 24 horas, logrou no correspondente

produto final (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-dimetil-4-((4-metilpiperazina-1-

il)metil)-1H-pirazol-5-amina (LQFM 003) em rendimento de 37%, respectivamente

(BHARATHI et al 2007).

ZnCl

NH2

δ+

δ−

δ+

δ−

ZnCl

δ+

NaBH

δ−

δ+

(53)

(29)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

(59)

(60)

(LQFM 002)

Formaldeído

MeOH/aq/24h/37%

Esquema 3

Através da análise do mecanismo da reação de Mannich, concluir-se que se

trata de um processo químio e regiosseletivo, uma vez que observamos a formação

do produto funcionalizado na posição 4 do anel pirazólico. Como ilustrado no

Esquema 4, quando o formaldeído (61) reage com aminas secundárias, via etapa de

adição e eliminação, acaba formando um átomo de carbono eletrofílico, semelhante

ao de uma subunidade carbonila. Este carbono eletrofílico, na etapa subsequente,

reage com a subunidade do anel pirazólico (29) com maior densidade de elétrons. A

posição 4 do anel pirazólico apresenta maior densidade de elétrons devido a

deslocalização dos elétrons do átomo de nitrogênio, evidenciado a partir das

estruturas canônicas de ressonância (67). Esta etapa da reação ocorre de forma

semelhante a uma reação de substituição eletrofílica aromática, onde na primeira

etapa, os elétrons do anel aromático atacam o átomo de carbono eletrofílico, através

de um processo de adição, perdendo a aromaticidade. Na etapa seguinte, o átomo

de hidrogênio da posição 4 é abstraído por uma base, através de um processo de

eliminação (68), e o par de elétrons da ligação restitui a aromaticidade do sistema

pirazólico (LQFM 003).

(LQFM 002)

(30)

(LQFM 003)

δ−

H H

δ+

δ−

δ+

δ−

Esquema 4

(30)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

(LQFM 002)

(66)

(67)

(68)

(69)

(LQFM 003)

Ao se consultar a literatura (HORTON, 1989; HAMRICK, 1993) e verificar

que o fármaco paracetamol (19) inibe a sPLA2, planejou-se a síntese do N-(1,3-

dimetil-1H-pirazol-5-il) acetamida (32) que é estruturalmente semelhante ao (19).

Através da Figura 16, podemos observar que tanto o anel benzeno como o anel

pirazólico apresentam seis elétrons π. Ademais, a subunidade fenólica do

paracetamol (19) se encontra contemplada na estrutura do derivado (32), uma vez

que ambas as subunidades hidroxila e nitrogênio pirazólico podem receber ligações

de hidrogênio.

A fim de analisar as similaridades estruturais tridimensionalmente, já

mencionadas a partir da análise bidimensional, as moléculas (32) e (19) foram

submetidas à análise conformacional no vácuo e na água, em nível semi-empírico,

empregando a base Austim Model (AM1). Ao final da análise conformacional, as

mesmas foram submetidas à conformação de menor energia ao cálculo de “single

point energy”, o qual se obteve informações de energia das conformações, área (Å

volume (Å

) e momento de dipolo, além da medida das distâncias envolvidas entre

as subunidades aceptoras de ligação de hidrogênio e átomo de nitrogênio amídico

(Figura 15).

Figura 15: Análise conformacional entre derivado N-(1,3-dimetil-1H-pirazol-5-il)acetamida (32) e

paracetamol (19).

5.58Å

3.60Å

Verificou-se, portanto que a análise conformacional dos compostos (32) e

(19) feita no vácuo e na água não apresentou alterações significativas nos níveis de

energia e na disposição espacial dos átomos.

Ao observar na Tabela 5, a conformação de menor energia dos compostos

(32) e (19), são E=27,275kcal/mol e E=59,102kcal/mol, respectivamente. A diferença

de estabilidade observada entre as duas moléculas pode ser racionalizada em

termos de efeito hiperconjugativo (Figura 16). Na molécula (32), prevalece o efeito

hiperconjugativo, onde os orbitais p (π C=N) do anel pirazólico doam densidade de

elétrons para o orbital antiligante da ligação N-H (σ* N-H). Já na molécula (19), o par

de elétrons do átomo de nitrogênio amídico (N-sp3), doa densidade de elétrons para

os orbitais antiligantes, tanto para os orbitais p do anel aromático (π* C=C) quanto

para o orbital p da carbonila (π* C=O) (CUEVAS, 2002).

Por sua vez, a diferença de energia observada para as moléculas (32) e

(19), justificam as diferenças observadas para as áreas e volumes. No caso da

molécula (32), a distorção da subunidade carbonila em relação ao anel aromático,

faz com que a mesma apresente área e volume maior, quando comparado à

molécula (19). No caso da molécula (19), a coplanaridade da subunidade carbonila e

anel aromático faz com que ambas área e volume sejam menores. Em relação ao

momento de dipolo para as conformações de menor energia de (32) e (19), verifica-

se que o vetor resultante da molécula (19) é maior.

Figura 16: Análise do efeito hiperconjugativo entre os compostos (32) e (19).

A variação das distâncias observadas para (32) e (19), foi de 3.60 Å e 5.58

Å, respectivamente. Muito embora haja uma diferença de 1.98 Å entre as medidas

realizadas, sabemos que as interações entre micro e macromoléculas são processos

N-sp3

π* C=O

π* C=C

σ* N-H

π C=N

(32)

(19)

dinâmicos, havendo relatos onde foram observadas distorções na estrutura de

proteínas em até 17 Å, podendo haver variações de 30 Å em regiões mais afastadas

do sítio ativo (VERLI, 2005).

Tabela 5: Análise conformacional entre N-(1,3-dimetil-1H-pirazol-5-il) acetamida e paracetamol.

Parâmetros

N-(1,3-dimetil-

1H-pirazol-5-

il) acetamida

(vácuo)

N-(1,3-dimetil-

1H-pirazol-5-

il) acetamida

(água)

Paracetamol

(vácuo)

Paracetamol

(água)

Energia

27,275kcal/mol

59,102kcal/mol

dipolo

1,675

2,612

Área

212,08Å

196,24Å

Volume

187,64Å

176,94Å

A reação de acetilação do 5-amino-1,3-dimetil-pirazol (29) foi efetuada

através do emprego de anidrido acético (31) e iodo molecular como catalisador

(MUKHOPADHYAY, 2004), levando à obtenção do produto desejado (32) em 85%

de rendimento.

/30min/t.a.

/10min/t.a./85%

Esquema 5

O mecanismo para a reação de acetilação, segundo a metodologia

empregada, pode ser dividido na etapa de ativação do anidrido acético (Esquema 6),

seguido das etapas de adição e eliminação (Esquema 7). Na etapa de ativação do

anidrido acético, o iodo molecular se complexa com o anidrido acético através de

interações do tipo dipolo-dipolo (31), levando à formação da espécie (70), que auxilia

na etapa de eliminação do processo, uma vez que ao deixar o átomo de oxigênio

positivo, o torna um melhor grupo abandonador (SARMA, 1997).

Esquema 6

δ+δ−

δ−

(36)

(70)

(29)

(31)

(32)

O O

δ+

δ−

N O

δ−

N O

δ+

Esquema 7

O início da síntese do derivado quinolínico se deu a partir da reação de

condensação, envolvendo 2-nitrobenzaldeído (33) e etilcianoacetato (34), à

temperatura ambiente em meio aquoso. Estas condições experimentais foram

submetidas a dois sistemas, na ausência e na presença do catalisador morfolina. Na

ausência do catalisador o produto (35) foi obtido em 82,0% de rendimento, após 24

horas. Já na presença do catalisador morfolina (5 mol %) foi observado a formação

do mesmo produto (35) em 92,3% de rendimento, após 1 hora (Esquema 8).

CHO

NC COOEt

Morfolina

O/t.a./1h/92,3%

Esquema 8

(33)

(34)

(35)

(29)

(70)

(71)

(72)

(73)

(74)

(32)

(75)

Sob condição otimizada para a reação mencionada anteriormente, foram

submetidos outros aldeídos aromáticos (36-50), uma vez que, a condensação de

aldeídos aromáticos em água na presença de etilcianoacetato (34) ainda não foi

descrita. Para a maioria dos aldeídos (36-50) os produtos (37-51) foram obtidos em

rendimentos que variaram 87,6 a 98%, exceto para a condensação do salisaldeído

(50), que foi obtido em 17% de rendimento. Em relação à diastereoseletividade da

dupla ligação, só observamos diastereoseletividade para o benzaldeído (razão E:Z),

para os demais aldeídos as reações foram diastereoespecíficas para o

diastereoisômero E (Tabela 6).

Tabela 6: Condensação de Knoevenagel em água de diferentes espécies químicas de aldeído.

Ent.

Produtos

T. de

reação

com

catalisador

Rend

(%)

T. de reação

sem

catalisador

Rend

(%)

Especificidade

E/Z

>1h 89,6 >1h 70,0 3:1

98,0

Não reagiu

OCH

84,3

Reagiu

parcialmente

87,6

>1h

82,0

>1h

73,0

>1h

88,0

Reagiu

parcialmente

>1h

85,0

>1h

71,0

>1h

17,0

Não reagiu

Ao verificar a eficiência desta reação na presença de água como solvente

pode-se classificar este procedimento como química verde, pelo fato de que, além

de usar água como solvente evitando agressão ao meio ambiente e aos

manipuladores é uma reação de baixo custo energético pelo tempo reacional, não

necessita de aquecimento e possui alto rendimento. Sendo assim, seria vantajoso

em processos industriais que utilizam a condensação de Knoevenagel para

formação de ligações C-C, a substituição de solventes orgânicos pela água que

diminuiria a agressão ao meio ambiente e customizaria o processo.

Através do Esquema 9, pode-se observar o mecanismo reacional da

condensação de Knoevenagel cujo catalisador morfolina (76) abstrai o átomo de

hidrogênio metilênico do cianoacetato de etila (34), tornando-o um melhor nucleófilo.

Na etapa seguinte, o núcleófilo ataca a subunidade carbonílica do aldeído aromático

(33), levando ao produto de adição (81). Após sucessivas transferências de prótons

envolvendo a participação do catalisador, o átomo de oxigênio protonado se

converte em um bom grupo abandonador. Com a abstração do átomo de hidrogênio

α-carbonílico, o par de elétrons migra para formar a nova ligação eliminando a

molécula de água, logrando no produto desejado (35) através de um mecanismo de

tipo Eliminação Unimolecular da Base Conjugada (E

CB) (MARTINS, 2006).

Esquema 9

Como o estado físico dos compostos originados desta condensação foram

sólidos, os mesmos foram submetidos ao procedimento de cristalografia de raio-X

para confirmação dos produtos gerados, pois esta técnica dá suporte aos resultados

de RMN. Entre os compostos obtidos (37-51) o composto que melhor obteve o

arranjo cristalino foi o composto (47) (Anexo 53) representado na Figura 17 o qual as

esferas brancas de maior tamanho representam o esqueleto da cadeia carbônica, as

menores representam os hidrogênios, a de coloração azul caracteriza a o nitrogênio

da nitrila e as vermelhas caracterizam os oxigênios da carbonila do éster. Ao

observar a estrutura cristalina do composto (47) é notável que o C5 que representa a

metila ligada ao anel aromático não apresenta orientação definida, isto pode ser

COOEt

NC COOEt

δ+

δ−

δ+

(34) (76) (77) (78)

(77)

(34)

(79)

(78) (80)

(81)

(76)

(82)

(76)

(35)

explicado pelo fato de ser uma ligação simples, tendo assim, liberdade de rotacionar

no seu eixo não sendo possível estimar a orientação exata a qual, ela se encontra.

Figura 17: Cristalografia de raio-X do composto (47) representando os átomos de C e H

(branco), N (azul) e O (vermelho).

Na Figura 18 pode-se observar a formação do arranjo cristalino do composto

(47) o qual verificar-se que o arranjo ocorre por meio de ligações de hidrogênio

realizadas entre o oxigênio da carbonila do éster e o hidrogênio ligado ao C12,

permitindo a formação do arranjo cristalino.

Os outros compostos obtidos não apresentaram bons resultados

cristalográficos, que pode ser explicado por interferências externas, i.e. movimentos

mecânicos nos recipientes o qual se fazia a cristalização.

Figura 18: Arranjo cristalino do composto (47) representando as ligações de hidrogênio que

ocorrem entre as moléculas.

Uma vez obtido o intermediário (E)-etil-2-ciano-3(2-nitrofenil)acrilato (35), este

foi submetido a condições de ciclização redutiva para geração do intermediário 2-

aminoquinolina-3-carboxilato de etila (52) em rendimento de 85,0%, através do

emprego de espécies de titânio de baixa valência (Esquema 10) (ZHOU, 1998).

TiCl

/Zn

THF/2h/85,0%

Esquema 10

(

)

(52)

Na etapa seguinte o intermetiário, 2-aminoquinolina-3-carboxilato de etila (52)

foi submetido a condições de aminólise, utilizando N-metil-piperazina (30), em

diclorometano, e cloreto de alumínio como catalisador. O produto (28) foi obtido em

68,0% de rendimento (Esquema 11) (BARF, 2002).

AlCl

Cl/t.a./15min/68,0%

Esquema 11

A proposta mecanística para a reação de aminólise está ilustrada no

Esquema 12. Como se pode observar, o cloreto de alumínio se complexa com a N-

metil-piperazina (30), levando à formação de um sal orgânico (84). Na sequência, o

sal orgânico (84) se complexa com o par de elétrons não ligantes da subunidade

carbonílica de (85), orientando a adição da amina à carbonila. Após a transferência

de próton para o átomo de oxigênio, o mesmo se torna um melhor grupo

abandonador, quando comparado à molécula neutra. Na etapa de eliminação,

quando o par de elétrons do oxigênio restitui a dupla ligação (89), ao mesmo tempo

é eliminado etanol, levando à formação da amida (28). O complexo entre o

catalisador e o átomo de oxigênio é rompido pela adição de água ao término da

reação.

(52)

(30)

(28)

HCl

δ+

AlCl

HCl

Esquema 12

Quando foi empregado as mesmas condições para as reações de aminólise

com 4-nitrofenilpiperazina e 4-metoxifenilpiperazina, a reação não logrou sucesso. É

(30)

(83)

(84)

(85)

(86)

(87) (88)

(89)

(90)

(28)

provável que nestes dois casos os substituintes nitro e metóxi estejam se

complexando com o catalisador, interferindo sobre a reação de aminólise.

5.1.1. Análise Retrossintética

Como pode-se observar na análise retrossintética no Esquema 13, os

produtos pirazólicos finais LQFM 002 e LQFM 003 podem ser obtidos,

respectivamente, a partir de uma desconexão da ligação C-C, seguida de uma

desconexão C-N.

Esquema 13

No Esquema 14 pode-se observar que o derivado quinolínico (28) foi obtido a

partir da desconexão da ligação C-N de (28), logrando em (32). Por sua vez, o

intermediário (33), pode ser obtido através da desconexão da ligação C-N. Por fim,

da desconexão da ligação C-C do intermediário (33), podem ser obtidos 2-

nitrobenzaldeído (34) e cianoacetato de etila (35).

(29)

LQFM 003

LQFM 002

(30)

(53)

C-C

C-N

TiCl

CHO

COOEt

Esquema 14

5.2. MODELAGEM MOLECULAR

Após o levantamento no PDB, se optou pela estrutura cristalográfica da

sPLA2, sob o código 1KPM (Figura 19), uma vez que é o cristal do complexo que

melhor se enquadra em nosso estudo, devido à presença do inibidor vitamina E, que

apresenta analogia estrutural com as moléculas objeto de estudo deste trabalho

(CHANDRA, 2002).

(28)

(52)

(30)

(35)

(33)

(34)

C-N

C-C

Figura 19: Estrutura ribossômica do complexo formado entre a sPLA2 e a vitamina E com

resolução de 1.8ª, adaptado de CHANDRA, 2002. Figura editada pelo programa SPDBV.

Na sequência do trabalho, para obtermos simulações fidedignas, a

parametrização da sPLA2 foi efetuada através do emprego do programa NAMD.

Nesta etapa, inicialmente foram retiradas as moléculas de água e foi feita a

protonação da proteína, porém durante a simulação observou-se que as moléculas

de águas provenientes do cristal eram importantes para estabilização da proteína

abortando assim o passo da protonação conservando as moléculas de água. Para

efeito de comparação, a sPLA2 foi submetida a condições de solvatação em sistema

de esfera de água (Figura 20) e em sistema de caixa de água (Figura 21), afim de

obtermos o estado de menor energia.

No sistema de esfera de água, a sPLA2 atingiu seu estado menor de energia

em -25000kcal/mol, enquanto no sistema de caixa de água a mesma atingiu o

estado menor de energia em -175000kcal/mol. Estes dados nos permitem concluir

que o sistema de caixa de água foi mais adequado na estabilização da sPLA2, uma

vez que menores valores de estado de menor energia foram obtidos.

Figura 20: Estrutura ribossômica da sPLA2 solvatada em esfera de água, adaptado de

CHANDRA, 2002. Figura editada no programa NAMD.

Figura 21: Estrutura ribossômica da sPLA2 solvatada em caixa de água, adaptada de

CHANDRA, 2002. Figura editada no programa NAMD.

Nesta primeira etapa do estudo de modelagem descrita, realizou-se a

preparação da biomacromolécula alvo, através de sua parametrização e de

simulações de dinâmica molecular. Posteriormente será realizado o estudo de

docking do composto LQFM 002 no sítio ativo da enzima sPLA2 seguida de

simulações de dinâmica molecular para se avaliar as possíveis interações deste

composto com essa enzima, além de comparar as energias entre os estados não

ligado (enzima livre) e ligado (E-L).

5.3. ENSAIOS FARMACOLÓGICOS

5.3.1. Inibição de atividade da PLA2 “in vitro”

A fim de avaliar o perfil inibitório das moléculas objeto de estudo (LQFM 002-

003) sobre a enzima sPLA2, as mesmas foram submetidas ao ensaio descrito por

Harbermann e Hardt (1972) que avalia a inibição da ação da sPLA2 da peçonha de

serpente sobre fosfolipídeos de membrana da gema de ovo Figura 22 (GUTIÉRREZ

et al., 1988; FORTES-DIAS et al., 1999). Nas cavidades tratadas com a solução

contendo a peçonha (125 µg/mL), o valor médio dos halos formados pela ação da

enzima sPLA2 foi de 518,33 ± 6,86 mm

. Para a substância LQFM 002 os halos

foram 443,56 ± 27,89, 431,89 ± 10,61, 396,00 ± 10,40, 326,27 ± 10,61 mm

, nas

doses de 250, 500, 1000 e 2000 µg/mL, respectivamente. Como se pode observar

no Gráfico 1, a dose testada que exerceu maior atividade inibitória sobre a sPLA2,

em relação ao grupo controle positivo (quercetina), foi a de 2000µg/mL cujo inibição

enzimática foi de 37,25 ± 3,25%, seguida das doses em ordem decrescente,

mostrando assim que há correlação entre dose e a resposta a atividade inibitória.

Figura 22: Halos de inibição da sPLA2 pelo modelo de GUTIÉRREZ et. al., 1988 e FORTES-DIAS

et. al., 1999.

Gráfico 1: Efeito inibitório de LQFM 002 sobre a sPLA2 presente na peçonha de serpente

(Crotalus durisso collilinectus), em relação ao veículo, segundo modelo de (GUTIÉRREZ et. al.

1988, FORTEZ-DIAS, et. al., 1999).

Para a substância LQFM 003, os halos foram 508,78 ± 7,03, 470,22 ± 15,69,

477,82 ± 15,89, 449,91 ± 14,53 mm

, respectivamente as doses de 250, 500, 1000 e

2000 µg/mL (Gráfico 2). Neste ensaio, a dose que teve maior efeito na inibição

enzimática, em relação ao grupo controle positivo (quercetina) foi, dose a de

2000µg/mL cuja inibição enzimática foi de 13,21 ± 3,22%, seguida da dose de

500µg/mL. Este fato permite afirmar que para o composto LQFM 003 não há

correlação dose resposta. Salientando que a única das doses que apresentou

inibição enzimática significativa foi a de 2000µg/mL.

Gráfico 2: Efeito inibitório de LQFM 003 sobre sPLA2 presente na peçonha de serpente

(Crotalus durissus collilinectus) em relação ao veículo, segundo modelo de GUTIÉRREZ et. al.

1988, FORTES-DIAS et. al. 1999.

5.3.2. Peritonite induzida por carragenina “in vivo”

Para avaliarmos o efeito das moléculas de estudo na diminuição da

migração celular submetemos as moléculas (LQFM 002-003) ao ensaio descrito por

Ferrándiz e Alcaraz (1991). Neste ensaio os animais foram submetidos ao

tratamento prévio por via oral (v.o.), com controle negativo DMSO 3 % 10 mL/kg,

LQFM 002 e LQFM 003 e dexametasona na dose de 2 mg/mL usada como controle

positivo. Quatro horas após o tratamento foi feita a administração i.p. de carragenina

1% (m/v), o grupo controle, apresentou uma média de 9,85 ± 0,45 x 10

leucócitos/mL (n = 10). Os tratamentos prévios com as substâncias LQFM 002 e

LQFM 003 promoveram redução significativa na migração de leucócitos totais para a

cavidade peritoneal. Porém entre as substâncias testadas a que obteve maior

resultado na redução da migração celular em relação ao controle foi a substância

LQFM 002 apresentando médias de 4,88 ± 0,70 x 10

leucócitos/mL que

correspondeu a uma inibição de 50,46 ± 14,34%, com inibição menos significativa a

substância LQFM003 que apresentou médias de 7,30 ± 0,39 x 10

leucócitos/mL que

correspondeu a uma inibição de 25,89 ± 5,39%, e o grupo controle com

dexametosona apresentou médias de 3,15 ± 0,44 x 10

leucócitos/mL,

respectivamente (Gráfico 3).

Gráfico 3: Efeito inibitório de LQFM 002 e LQFM 003 em relação a dexametasona sobre a

migração celular, segundo modelo de FERRÁNDIZ E ALCARAZ, 1991.

5.3.3. Indução da pleurisia pela carragenina 1%.

A substância LQFM 002 nas doses 25, 50 e 100 mg/kg, v.o. também

reduziram a concentração do azul de Evans no exsudato pleural em 30,11 ± 6,40 %,

34,28 ± 5,74 % e 40,1 ± 6,40 %, respectivamente verificando que a dose de maior

efeito na redução da concentração do azul de Evans foi a de 100 mg/kg, já o grupo

controle positivo reduziu a concentração do azul de Evans em 57,59 ± 3,09 %

(Gráfico 4).

Gráfico 4: Avaliação da atividade anti-inflamatória do composto LQFM 002 pela concentração

do azul de Evans.

Outro ensaio que avalia a atividade anti-inflamatória é o de indução de

pleurisia pela carragenina. Neste ensaio os animais foram submetidos ao tratamento

prévio v.o. com controle negativo DMSO 3 % 10 mL/kg, LQFM 002 nas doses de 25,

50 e 100mg/kg e dexametasona na dose de 2 mg/mL usada como controle positivo.

Nas doses testadas a substância LQFM 002 reduziram o número de leucócitos

migrados para a cavidade pleural, em 37,5 ± 10,78 %, 64,10 ± 8,12 % e 68,7 ± 2,65

% respectivamente verificando que a dose de maior efeito na migração celular na

cavidade pleural foi de 100 mg/kg, já o grupo controle positivo reduziu a migração

celular em 82,0 ± 5,15 %.

Gráfico 5: Avaliação da atividade anti-inflamatória pelo método de pleurisia induzido por

carragenina.

Com os resultados obtidos nos testes de inibição e de inflamação vale

destacar que ambas as substâncias LQFM 002 e 003 demonstraram atividade na

inibição enzimática da sPLA2 e anti-inflamatória, porém o LQFM 002 foi o composto

que obteve resultados mais significativos observados principalmente no teste de

pleurisia, salientando que pode-se considerar uma molécula promissora, pois é de

rápida obtenção pois sua síntese se dá em apenas uma etapa, sem condições

bruscas e tempo reacional relativamente baixo.

6. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho permite concluir que a síntese de novos

candidatos a protótipos de fármacos anti-inflamatórios, foi obtida de forma

satisfatória quanto aos derivados pirazólicos (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-

dimetil-1-H-pirazol-5-amina (LQFM 002), (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-

dimetil-4-((4-metilpiperazina-1-il)metil)-1H-pirazol-5-amina (LQFM 003) e N-(1,3-

dimetil-1H-pirazol-5-il) acetamida (32) e quinolínico (2-aminoquinolina-3-il)(4-

metilpiperazina-1-il)metanona (28) referentes a escala de bancada.

Os estudos de modelagem molecular permitiram avaliar o sistema de menor

energia para desenvolver a simulação. Já a avaliação da dinâmica do processo de

interação entre, os protótipos propostos ainda não foram conclusivos a ponto de

avaliar a relação estrutura atividade.

Com relação aos ensaios farmacológicos o derivado (E)-N-(3,7-dimetilocta-

2,6-dienil)-1,3-dimetil-1-H-pirazol-5-amina (LQFM 002) apresentou atividade inibitória

da enzima sPLA2 com inibição de 37,25 ± 3,25 % e atividade anti-inflamatória no

teste de peritonite induzida por carragenina cuja a inibição da migração celular foi de

50,46 ± 14,34 %, e no teste de pleurisia cuja dose de maior efeito foi a de 100 mg/kg

com inibição de 68,7 ± 2,65 %. O composto (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-

dimetil-4-((4-metilpiperazina-1-il)metil)-1H-pirazol-5-amina (LQFM 003) apresentou

tanto atividade inibitória da enzima sPLA2 com inibição de 13,21 ± 3,22 %, quanto

atividade anti-inflamatória no teste de peritonite induzida por carragenina cuja a

inibição da migração celular foi de 25,89 ± 5,39 %. Conclui-se que os derivados

pirazólicos LQFM 002 e LQFM 003 apresentaram perfil inibitório da sPLA2 e de

atividade anti-inflamatória o que validam o planejamento de novos candidatos a

protótipos de fármacos anti-inflamatórios, com ênfase no composto LQFM 002 que

apresentou atividade anti-inflamatória superior tornando-o um potencial protótipo

agente anti-inflamatório.

7. PERSPECTIVAS

Como perspectivas se visa testar a atividade inibitória da enzima sPLA2 e

anti-inflamatória do derivado quinolínico (28) e do derivado (32), aumentando os

possíveis compostos para a atividade proposta. Testar os compostos obtidos

(LQFM 002 e 003) em outros alvos farmacológicos na busca de outras atividades

terapêuticas, visto sua analogia ao nerolidilcatecol que apresenta além da atividade

anti-inflamatória, possui atividade anticâncer e antioxidante.

Propor a síntese de outros derivados pirazólicos e quinolínicos de forma a

obter maior quantidade de protótipos a serem testados.

Realizar o estudo de docking do composto LQFM 002 na enzima sPLA2, e

realizar estudos de dinâmica molecular de forma a obter dados relativos à interação

ligante receptor.

100

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANTI, S. M. A., GIORGI, R. D. N., CHAHADE, W. H., Steroidal anti-inflammatory

drugs: glucocorticoids Einstein. V.6, (1), p. 159-165, 2006.

ARNI, R. K.; WARD, R. J. Phospholipase A2-A Structural Review Toxicon, v. 34, 8,

p. 827-41, 1996.

BALL, P.; Chemical Britanic., v, 26. 2001

BALSINDE ET AL 1999Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol, v.39p.175-189,1999.

BARF, T., VALLGARDA J., EMOND, R., HAGGSTROM, C., KURZ, G., NYGREN, A.,

LARWOOD, V., MOSIALOU, E., AXELSSON, K., OLSSON, R., ENGBLOM L.,

EDLING N., Arylsulfonamidothiazoles as a New lass of Potential Antidiabetic Drugs.

Discovery of Potent and Selective Inhibitors of the 11â-Hydroxysteroid

Dehydrogenase Type Journal of Medicinal Chemistry, v. 45, n. 18 p. 3813-3815,

2002.

BARREIRO, E J.; CARLOS A. M. FRAGA, ANA L. P. MIRANDA, CARLOS R.

RODRIGUES A QUÍMICA MEDICINAL DE N-ACILIDRAZONAS: NOVOS

COMPOSTOS-PROTÓTIPOS DE FÁRMACOS ANALGÉSICOS,

ANTIINFLAMATÓRIOS E ANTI-TROMBÓTICOS Química Nova, Vol. 25, n°. 1,

p.129-148, 2002.

BARREIRO, E.J.; FRAGA, C. A. M. Química medicinal: as bases moleculares da

ação dos fármacos, 1ª Ed. Porto Alegre, editora Artmed. 2001.

BARREIRO, E. J.; RODRIGUES, C. R.; Modelagem Molecular: Uma Ferramenta

para o Planejamento Racional de Fármacos em Química Medicinal. Química Nova,

v. 20, 3, p.300-310 1997.

101

BAYER, FELIX HOFFAMN 2009. Disponível em http://www.bayer.com/en/felix-

hoffmann.aspx Acesso em 02/05/2009

BERTOLINI A; OTTANI A, SANDRINI M, “Dual acting anti-inflammatory drugs: a

reappraisal”. Pharmacological Research v.44, 6, p.437-50 2001.

BHARATHI, K. S.; NARAYANAN, V.; SREEDARAN, S.; RAHIMAN, K.; RAJESH, K.;

Synthesis, spectral, magnetic, electrochemical and kinetic studies of copper(II),

nickel(II) and zinc(II) acetate complexes derived from phenol based ‘end-off’ ligands:

Effect of p-substituents. Polyhedron, v.26, p. 3993-4002, 2007.

BHAVE, V. S., DONTHAMSETTY S., LATENDRESSE, J. R. , MEHENDALE, H. M.,

Inhibition of cyclooxygenase-2 aggravates secretory phospholipase A2-mediated

progression of acute liver injury, Toxicology and Applied Pharmacology, v.228, p.

239–246, 2008.

BIGI, F., CONFORTI, M. L., MAGGI, R., PICCINNO, A., SARTORI, G. Clean

synthesis in water: uncatalysed preparation of Ylidenemalononitriles Green

Chemistry, p. 101-103, 2000.

BINISTI, C.; ASSOGBAA, L.; TOUBOULA, E.; MOUNIERB, C.; HUETA, J.,

OMBETTAA, J.; DONGA, C.; REDEUILHA, C.; HEYMANSA, F.; GODFROIDA, J.;

Structure–activity relationships in platelet-activating factor (PAF). 11-From PAF-

antagonism to phospholipase A2 inhibition: syntheses and structure–activity

relationships in 1-arylsulfamido-2-alkylpiperazines, European Jounal of Medicinal

Chemistry, v.36 p.809–828 2001.

BOUKLI, L.; ASSOGBA, L.; AHAMADA-HIMIDI A.; HABICH, N. M.; AOUN; D,

MASSICOT, F.; MOUNIER C. M.; HUET, J.; LAMOURI, A.; OMBETTA, J.;

GODFROID, J.; DONG, C.; HEYMANS, F., Inhibition of secretory phospholipaseA2.

1-Design, synthesis and structure–activity relationship studies starting from 4-

tetradecyloxybenzamidine to obtain specific inhibitors of group II Spla2s. European

Journal of Medicinal Chemistry v.40 p.850–861, 2005.

102

BOUKLI, L.; TOUAIBIA, M.; MEDDAD-BELHABICH, N.; DJIMDÉ, A.; PARK, C.; KIM,

J.; YOON, J.; LAMOURI, A.; HEYMANS, F.; Design of new potent and selective

secretory phospholipase A2 inhibitors. Part 5: Syntesis and biological activity of 1-

alkyl-4-[4,5-dihydro-1,2,4-[4H]-oxadiol-5-one-3ylmethylbenz-4’-yl(oyl)] piperazines.

Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 16, p. 1242-1253, 2008.

BRASIL, Lei n° 10.973 de 2 de dezembro de 2004. Disponível em:

http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2004-2006/2004/Lei/L10.973.htm Acesso

em: 01 jun. 2009.

BROWN, J.; TAN, S. Y., Medicine in Stamps Rudolph Virchow (1821-1902): “pope of

pathology” Singapore Med. J., v.47, 7, p. 567-568, 2006.

BURKET, U., ALLINGER, N.L. Molecular Mechanics. ACS Monograph nº 177,

American Chemical Society, Washington, 1982.

CAMPBELL, S. F.; HARDSTONE, J. D.; PALMER, M. J.; J. Med. Chem., 31, p.

1031, 1988.

CARVALHO, I.; PUPO, M. T.; BORGES, A. D. L.; BERNARDES, L. S. C. Introdução

a modelagem molecular de fármacos no curso experimental de química

farmacêutica. uímica Nova, v. 26, p. 428-438, 2003.

CARVALHO, A. W., Analgésicos, Antipiréticos e Anti-inflamatórios, Farmacologia

Penildon Silva, Ed. 6º Editora Guanabara Koogan 2002.

CARVALHO, W. A.; CARVALHO, R. D. S.; RIOS-SANTOS, F., Analgésicos

Inibidores Específicos da Ciclooxigenase-2: Avanços Terapêuticos. Revista

Brasileira de Anestesiologia, v. 54, n. 3, p. 448-464, 2004.

CHAKRABORTI, S.; Phospholipase A

isorforms: a perspective. Cellular

Singnalling v.15 p.637-665, 2003.

CHANDRA, V.; JASTI, J., KAUR, P.; BETZEL, C.; SRINIVASAN, A., SINGH, T.P.,

First Structural Evidence of a Specific Inhibition of Phospholipase A2 by alpha-

103

Tocopherol (Vitamin E) and its Implications in Inflammation: Crystal Structure of the

Complex Formed Between Phospholipase A2 and alpha-Tocopherol at 1.8 A

Resolution J.Mol.Biol., v. 320, p.215-222, 2002.

CHAO-JUN LI, CHEN, L.; Organic Chemistry in Water. Chem. Soc. Rev., v.35, p.68-

82, 2006.

COHEN, N. C., BLANEY, J. M., HUMBLET, C., GUND, P. & BARRY, D. C.;

Molecular modeling software and methods for medicinal chemistry., J. Med. Chem.

33, p. 883, 1990.

COLLIER, H.O.J., The story of aspirin. In: M.J. Parnham and J. Bruinvels (eds),

Discoveries in Pharmacology, Vol. 2, p. 555 1984.

COOK, J. A., Eicosanoids Crit. Care. Med. Vol. 33,12, 488-491, 2005.

COREY, E. J.; CHENG, X.-M. Em The Logic of Chemical Synthesis; John Wiley &

Sons: New York, 1989.

CORNELL, W. D.; CIEPLAK, P. ; BAYLY, C. I.; GOULD, I. R.; MERZ JR., K. M.;

FERGUSON, D. M.; SPELLMEYER, D. C.; FOX, T.; CALDWELL, J. W.; KOLLMAN,

P. A. J. Am. Chem. Soc., v.117, 5179, 1995.

CORREIA, C. R. D., COSTA, P. R.R., FERREIRA, V. F., Vinte e cinco anos de

reações, estratégias e metodologias em química orgânica. Química Nova, Vol. 25,

(1), p.82-89, 2002.

COSTA-JUNIOR, H. M. HAMATY, F. C.; FARIAS, R. S., EINICKER-LAMAS, M. M.

H. S.; PERSECHINI, P. M. Apoptosis-inducing factor of a cytotoxic T cell line:

involvement of a secretory phospholipase A2 Cell Tissue Res 324, p. 255–266,

2006.

CUEVAS, G., JUARISTI, E., Manifestation of Stereoelectronic Effects on the

Calculated Carbon-Hydrogen Bond Lengths and One Bond

C-H

NMR Coupling

104

Constants in Cyclohexane, Six-Membered Heterocycles, and Cyclohexanone

Derivatives J. AM. CHEM. SOC., v.124, p.13088-13096, 2002.

CUMMINGS, B. S., MCHOWAT, J., SCHNELLMANN, R. G.; Phospholipase A

s in

Cell Injury and Death. The Journal of Pharmacology and Experimental

Therapeutics, Vol. 294, 3, p.793-799, 2000.

DAVID, J. P. L.; DAVID, J. M. Plantas medicinais. Fármacos derivados de plantas. In

PENILDON, S. Editor. Farmalcologia, Guanabara Koogan, p. 134-45, 2002.

DENNIS, E. A. Diversity of Group Types,Regulation, and Function of Phospholipase

The Journal of Bioorganic Chemistry Vol. 269 No. 18 Issue of May 6 13057-

13060, 1994

DENNIS, E.; SCHALOSKE, R.; The phospholipase A2 superfamily and its group

numbering system. Biochimica et Biophysica Acta, 1761, p.1246-1259, 2006.

DENNIS, E.A. The growing phospholipase A2 superfamily of signal transduction

Enzymes, TiBS, 22, p-1-2, 1997.

DIETHARD R.L.; MONBALIU, M.D.; CHRISTEL N.T.; DUBUISSON, M, M.M.

ZEEGERS, MARTINE, M.J.; CRABBÉ, M.J. FEVERY, JACQUES M.F. Increased

Serum Phospholipase A2 Activity After Non-Heart-Beating Donor Liver

Transplantation and Association with Ischemia-Reperfusion Injury Journal of

Surgical Research , 2008 doi:10.1016/j.jss.2008.01.034

FERRANDIZ, M. L.; ALCARAZ, M. J., Anti-inflammatory activity and inhibition of

arachidonic acid metabolism by flavonoids. Agents Actions, v. 32, n. 3-4, p. 283-

288, 1991

FIORUCCI, S.; MELI, R.; BUCCI, M.; CIRINO, G. Dual inhibitors of cyclooxygenase

and 5-lipoxygenase. A new avenue in anti-inflammatory therapy?. Biochem

Pharmacol., v. 1, n. 11, p. 433-8, 2001.

105

FONTEH, A. N., SAMET, J. M., SURETTE, M., REED, W., CHILTON, F. H.

Mechanisms that account for the selective release of arachidonic acid from intact

cells by secretory phospholipase A2 Biochimica et Biophysica Acta, 1393, 253-

266 1998.

FOORD, S. M.; BONNER, T.I.; NEUBIG, R.R.; ROSSER, E.M.; PIN, J. P.;

DAVENPORT, A. P.; SPEDDING, M.; HARMAR, A. J. International Union of

Pharmacology. XLVI. G protein-coupled receptor list. Pharmacol Rev, v. 57, 2, p.

279-88, 2005.

FORTES-DIAS, C.L.; JANNOTTI, M.L.D.; FRANCO, F.J.L.; MAGALHÃES, A.; DINIZ,

C.R. Studies on the specicity of CNF, a phospholipase A2 inhibitor isolated from the

blood plasma of the South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus). I.

Interaction with PLA2 from Lachesis muta muta snake venon. Toxicon, 37, 1747-59,

1999.

FRISCH & POPLE et. Al Gaussian 03, Revision B.05,.; Gaussian, Inc., Wallingford

CT, 2004.

FUENTES, L.; HERNANDEZ, M., NIETO, M. L.; CRESPO, M. S., Biological effects of

group IIA secreted phosholipase A2 FEBS Letters, v. 531 p. 7-11, 2002.

FUNK, C. D., Prostaglandins and Leukotrienes: Advances in Eicosanoid Biology

Science Vol. 294, 2001.

GLOBAL Pharmaceutical Sales 2009. Disponível em:

<http://www.imshealth.com/portal/site/imshealth/menuitem.a46c6d4df3db4b3d88f611

019418c22a/?vgnextoid=67a89df4609e9110VgnVCM10000071812ca2RCRD&cpsex

tcurrchannel=1> Acesso em: 27 maio 2009.

GOLDSBY, R. A., KINDT, T. J., OSBORNE, B. J., Imunologia. 4.ed. Revinter, 2002.

106

GOODMAN, GILMAN. The Farmacological Basis of Therapeutics. Ed. 11:

McGraw-Hill, 2005. 1984p.

GRAFF, J. R. et. Al. Expression of group IIA secretory phospholipase A2 increases

with prostate tumor grade. Clinical Cancer Research. V. 7, p. 3857-3861, 2001.

GRANATTA, G., TRIGGIANI, M., Secretory phospholipase A2 in inflammatory and

allergic diseases: not just enzymes, Journal Allergy Clinic Immunology. V. 116, p.

1000-1006, 2005.

GRUNDMANN, E, “[The concept of Julius Cohnheim on tumor formation and

metastasis from the viewpoint of new research results]”, Zentralblatt für allgemeine,

Pathologie und pathologische Anatomie v.130, 4, 323-31, 1985.

GUTIÉRREZ, J.M.; AVILA, C.; ROJAS, E.; CERDAS, L. An alternative in vitro

method for testing the potency of the polyvalent antivenom produced in Costa Rica.

Toxicon, 26, 4, 411-3, 1988.

HAMRICK, M. E., HARRIS, S. R.; Antagonism of acetaminophen hepatotoxicity by

phospholipase A2 inhibitors. Research communications in chemical pathology

and pharmacology. Vol.79, 1, p.23-44 1993.

HARBERMAN, E.; HARDT. K.L., A sensitive and specific plate test for the

quantification of phospholipases. Analytical Biochemistry, v.50, p. 163-73, 1972

HORTON, A. A, WOOD, J.M. Effects of inhibitors of phospholipase A2,

cyclooxygenase and thromboxane synthetase on paracetamol hepatotoxicity in the

rat. Eicosanoids, vol. 2, 2, p.123-129, 1989.

IUPAC, GLOSSARY OF TERMS USED IN MEDICINAL CHEMISTRY,

Disponível em http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/medchem. Acesso em

15/03/09.

JAIN, M.K., BERG, O.G., Curr. Opin. Chem. Biol. V. 10, p. 473-479, 2006.

107

JIANG, J.; NEUBAUER B. L.; GRAFF, J. R.; CHEDID M., THOMAS J. E., ROEHM N.

W., ZHANG, S., ECKERT, G J.; KOCH, M O.; EBLE, J. N.; CHENG, L. Expression

of Group IIA Secretory Phospholipase A2. Is Elevated in Prostatic Intraepithelial

Neoplasia and Adenocarcinoma American Journal of Pathology, Vol. 160, No. 2,

2002.

LAYE, J. P., GILL, J. H. Phospholipase A2 expression in tumours: a target for

therapeutic intervention? Drug Discovery Today Vol. 8, No. 15 August 2003.

KHANAPURE SP; GARVEY DS, JANERO DR, LETTS LG “Eicosanoids in

inflammation: biosynthesis, pharmacology, and therapeutic frontiers”. Current Topic

in Medicinal Chemistry, v. 7, 3, p.311-340, 2007.

KIEFER, J.R., PAWLITZ, J.L., MORELAND, K.T., STEGEMAN, R.A., HOOD,

W.F., GIERSE, J.K., STEVENS, A.M., GOODWIN, D.C., ROWLINSON,

S.W., MARNETT, L.J., STALLINGS, W.C., KURUMBAIL, R.G. Structural insights

into the stereochemistry of the cyclooxygenase reaction. Nature, v.405, p. 97-101,

2000.

KNOEVENAGEL, E., Ber. Dtsch. Chem. Ges., v. 27, p. 2345–2346 1894.

KUMAR, V., ABBAS A. K., FAUSTO, N. Robbins e Cotran: Patologia: Bases

Patológicas das Doenças. 7.ed. Elsevier, p. 1504 2005.

LAI, L.; LIU, Y.; FENG, Y.; WANG, R.; GAO, Y.; Quinoline-4-acetamides as Spla

Inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 11, p.1639-1641, 2001.

LAMBEAU, G. GELB, M. H., Biochemistry and Physiology of Mammalian Secreted

Phospholipase A2. Annu. Rev. Biochemistry, v. 77, p.495-520, 2008.

LIMA, L. M., Química Medicinal Moderna: desafios e contribuição brasileira, Química

Nova, v. 30, nº 6, p. 1456-1468, 2007.

108

LUENGO, M. B. Uma revisão histórica dos principais acontecimentos da imunologia

e da farmacologia na busca do entendimento e tratamento das doenças

inflamatórias. Revista Eletrônica de Farmácia Vol 2, 2, 64-72, 2005.

LUO, G., MATTSON, G. K., BRUCE, M. A., WONG, H., MURPHY, B.J., LONGHI, D.,

ANTAL-ZIMANYI, I., POINDEXTER, G. S. Isosteric N-arylpiperazine replacements in

a series of dihydropyridine NPY

receptor antagonists. Bioorganic & Medicinal

Chemistry Letters. V. 14, p. 5975-5978, 2004.

MACKERELL, A. D.; BASHFORD JR., D.; BELLOTT, M.; DUNBRACK JR., R. L.;

EVANSECK, J. D.; FIELD, M. J.; FISCHER, S.; GAO, J.; GUO, H.; HA, S.; JOSEPH-

MCCARTHY, D.; KUCHNIR, L.; KUCZERA, K.; LAU, F. T. K.; MATTOS, C.;

MICHNICK, S.; NGO, T.; NGUYEN, D. T.; PRODHOM, B.; REIHER III, W. E.; ROUX,

B.; SCHLENKRICH, M.; SMITH, J. C.; STOTE, R.; STRAUB, J.; WATANABE, M.;

WIÓRKIEWICZ-KUCZERA, J.; YIN, D.; KARPLUS. M. J. Phys. Chem., B, v.102,

3586 1998

MALKOWSKI, M.G., GINELL, S.L., SMITH, W.L., GARAVITO, R.M. The productive

conformation of arachidonic acid bound to prostaglandin synthase. Science v. 289

p.1933-1937, 2000.

MAMDANI, M. et. Al. Effect of selective cyclooxygenase 2 inhibitors and naproxen on

short-term risk of acute myocardial infarction in the elderly. Arch Intern Med,

Chicago, n. 163, p. 481-486, 2003.

MANNICH, C., Arch. Pharm. V. 255, p.261–276, 1917.

MARTINS, L., CARDOSO, D.; Aplicação Catalítica de Peneiras Moleculares Básicas

Micro e Mesosporosas. Química Nova, Vol. 29, n°2, p. 358-364, 2006.

MENEGATTI, R.; FRAGA, C. A. F. M. E BARREIRO, E. J., A importância da Síntese

de Fármacos. Cadernos Temáticos de Química Nova na Escola, p 16-22, 2001

109

MITCHELL, J.A.; WARNER, T.D. Cyclooxigenase-2: pharmacology, physiology,

biochemistry and relevance to NSAID therapy. Br. J. Pharm., v. 128, p. 1121-1132,

1999.

MUKHOPADHYAY, B., RAVINDRANATHAN-KARTHA K. P., RUSSELL, D. A.,

FIELD R. A., Streamlined Synthesis of Per-O-acetylated Sugars, Glycosyl Iodides, or

Thioglycosides from Unprotected Reducing Sugars. Journal Organic Chemistry,

v.69, p.7758-7760, 2004

MURAKAMI, M.KUDO, I.,; Phospholipase A

Journal Biochemistry. 131, 285-292

2002.

NUNEZ, V.; CASTRO, V.; MURILLO, R.; PONCE-SOTO, L. A.; MERFORT I.;

LOMONTE, B., Inhibitory effects of Piper umbellatum and Piper peltatum extracts

towards myotoxic phospholipases A2 from Bothrops snake venoms: Isolation of 4-

nerolidylcatechol as active principle, Phytochemistry v. 66, p.1017–1025, 2005.

OLIANI, S. M., GIL, C. D., Proteína antiinflamatória anexina 1: mecanismos celulares

erelevância clínica. Arq Ciênc Saúde, v.13 (4): p.186-191, 2006.

PANDIT, N. K., Introdução às ciências farmacêuticas/ Nita K. Pandit; tradução

Lucimar Filot da Silva Brum...[et al.]. – Porto Alegre-RS: Ed. Artemd, 2008.

PATEL, M. I., KUREK, C., DONG, Q. The Arachidonic Acid Pathway and its Role in

Prostate Cancer Development and Progression Vol. 179, 1668-1675, May 2008

PEREIRA, F. E. L. Inflamações, Bogliolo Patologia Geral, Ed. Guanabara Koogan

S.A. p. 111, 1993.

PHILLIPS, J. C., BRAUN, R., WANG, W., GUMBART, J. , TAJKHORSHID, E.,

VILLA, E., CHIPOT, C., SKEEL, R. D., KALE´, L. , SCHULTEN, K. Scalable

Molecular Dynamics with NAMD J Comput Chem v.26, p.1781–1802, 2005.

110

PICCOLI, J. C. E. Estudo associativo entre três polimorfismos (-786T>C,

894G>T e VNTR INTRON 4 a/b) no gene que sintetiza para óxido nítrico sintase

endotelial e síndrome coronariana aguda . Porto Alegre: PUCRS, 2007.

Tese(Doutorado) – Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.

Faculdade de Biociências. Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e

Molecular.

REGGIANI,C., BOTTINELLI,R., STIENEN,G.J.M. Sarcomeric myosin uímicas:

fine tuninh of a molecular motor. News Physiol. Sci., Vol. 15, p.26-33, 2000.

RODRIGUES, C. R.; Processos Modernos no Desenvolvimento de Fármacos:

Modelagem Molecular. Cardernos Temáticos de Química Nova da Escola. N°3 p.

43-49, 2001.

ROSEN, G. D.; BIRKENMEIER, T. M.; RAZ, A.; HOLTZMAN, M. J. Identification of a

cyclooxygenase-related gene and its potential role in prostaglandin formation.

Biochem Biophys Res Commun., v. 15, n. 3, p. 358-65, 1989.

ROSS, R. Atherosclerosis: an inflammatory disease. N. Engl, J. Med. V.340, p. 115-

126, 1999.

SANSEVERINO, A. M.; Síntese Orgânica Limpa. Quimica Nova, v. 25, 1, p.102-107

2000.

SANT’ANNA, C. M. R.; Glossário de Termos Usados no Planejamento de Fármacos

(Recomendações da IUPAC para 1997) Química Nova, Vol. 25, 3, 505-512, 2002.

SARMA, J. C., BORAH, R., DEKA, N., Iodine as an Acetyl Transfer Catalyst J.

Chem. Research, p.110–111, 1997.

SCHMALSTIEG, FRANK C; GOLDMAN ARMOND S. “Ilya Ilich Metchnikoff (1845-

1915) and Paul Ehrlich (1854-1915): the centennial of the 1908 Nobel Prize in

Physiology or Medicine”. Journal of Medical Biography 16 (2): 96-103, 2008.

111

SCOTT, D. L., WHITE, S. P., OTWINOWSKI, Z., YUAN, W., GELB, M. H., SIGLER,

P. B. Interfacial Catalysis: The Mechanism of Phospholipase A2 Science, v. 250

1541-1546 1990.

SILVA, R. A., Aminação redutiva de aldeídos e cetonas promovida por zinco em

meio aquoso, 107 folhas, Universidade Federal de Pernambuco, 2007.

SILVERSTEIN, A. M. History of immunology. Development of the concept of

immunologic specificity, I. Cell Immunol., v. 67, n. 2, p. 396-409, 1982.

STIX, G., Pontaria contra a dor, Scientific American Brasil, Ano 5, nº 57, fevereiro,

2007.

STORK, G.; NIU, D.; FUJIMOTO, A.; KOFT, E. R.; BALKOVEC, J. M.; TATA, J. R.;

DAKE, G. R.; Journal. Am. Chem. Soc., v.123, 3239, 2001.

SÜLEYMAN H; DEMIRCAN B, KARAGÖZ Y. “Anti-inflammatory and side effects of

cyclooxygenase inhibitors”. Pharmacological reports v. 59, 3, p.247-58, 2007.

TAVARES, L. C. QSAR: A abordagem de Hansch. Quimica. Nova, v. 27, 4, p. 631 –

639, 2004.

TRIGGIANI, M.; GRANATA, F.; FRATTINI, A.; MARONE, G.; Activation of human

inflammatory cells by secreted phospholipase A

. Biochimica et Biophysica Acta,

p.1289-1300, 2006.

TROST, B. M., Sculpting horizons in organic chemistry, Science, v.227, p.908, 1985.

VANE, J. R.; BAKHLE, Y. S.; BOTTING, R.M. Cyclooxygenases 1 and 2. Anny Rev

Pharmacol Toxicol, v 38, p. 97-120, 1998.

VANE, J.R., Inhibition of prostaglandin syntheses as a mechanism of action for

aspirin-like drugs. Nature New Biology, v. 231, p.232-235, 1971.

112

VERLI, H.; BARREIRO, E. J. Um paradigma da química medicinal: a flexibilidade dos

ligantes e receptores Química. Nova, Vol. 28, 1, p. 95-102, 2005.

VOET, D. Fundamentos de Bioquímica, Artmed, 2000.

WANNMARCHER, L.; BREDEMEIER, M.; Antiinflamatórios não-esteróides: Uso

indiscriminado de inibidores seletivos de cicloxigenase-2. ISSN 1810-0791 Vol. 1, Nº

2 Brasília, Janeiro de 2004.

WEBB, N. R. Secretory phospholipase A2 enzymes in atherogenesis Current

Opinion in Lipidology, v.16, p.341–344, 2005.

WERMUTH, C.G.; GANELLIN, C.R.; LINDBERG, P.; MITSCHER, L.A. Pure & Appl.

Chem., 70, 1129, 1998.

WHITE, S.P., SCOTT, D.L., OTWINOWSKI, Z., GELB, M.H., SIGLER, P.B. Crystal

structure of cobra-venom phospholipase A2 in a complex with a transition-state

analogue. Science, p.1560-1563, 1990.

WILTON, D. C., BUCKLAND, A. G., Inhibition of secreted phospholipases A by

annexin V. Competition for 2 anionic phospholipid interfaces allows an assessment of

the relative interfacial affinities of secreted phospholipases A2 Biochimica et

Biophysica Acta 1391, p.367–376, 1998.

WINKIPÉDIA 2008 Inflamação. Disponível em

http://pt.wikipedia.org/wiki/Inflama%C3%A7%C3%A3o. Acesso em, 14/10/2008

WIPF, P., RIBE, S.; Water-accelerated Organic Transformations. Chem. Commun.,

p.299-307, 2001.

YEDGAR, S.; COHEN, Y.; SHOSEYOV, D.; Control of phospholipase A2 activities for

treatment of inflammatory condictions. Biochimica et Biophysica Acta, 1761

p.1373-1382, 2006.

113

ZHOU, L.; TU, S.; SHI, D.; DAI, G.; Facile and Efficient Synthesis of 2-

Aminoquinoline 3-carboxilic Acid Derivatives via Reductive Cyclization of Nitro and

Cyano Groups Induced by Low-valent Titanium. J. Chem. Research, p. 398-399,

1998.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 