( PDF ) Seleção de rizóbios e estudo da compatibilidade simbiótica em Desmodium incanum e Lotus spp

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO

AMBIENTE

SELEÇÃO DE RIZÓBIOS E ESTUDO DA COMPATIBILIDADE SIMBIÓTICA

EM Desmodium incanum e Lotus spp.

CAMILLE EICHELBERGER GRANADA

Engenheira de Bioprocessos e Biotecnologia – UERGS

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Microbiologia

Agrícola e do Ambiente como um dos

requisitos para obtenção do Grau de

Mestre na Área de Microbiologia

Agrícola e do Ambiente.

Porto Alegre, abril de 2010.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO

AMBIENTE

SELEÇÃO DE RIZÓBIOS E ESTUDO DA COMPATIBILIDADE SIMBIÓTICA

EM Desmodium incanum e Lotus spp.

Camille Eichelberger Granada

Engenheira de Bioprocessos e Biotecnologia – UERGS

Prof. Dr. Enilson Luiz Saccol de Sá

Orientador

Porto Alegre, abril de 2010.

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PÁGINA PARA HOMOLOGAÇÃO

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Luiz Carlos e Rita, pelo exemplo de luta e vida sempre a serem

seguidos. Seu apoio e estímulo que foram fundamentais para todas as minhas

conquistas. Amo vocês.

Ao professor Enilson Luiz Saccol de Sá, pela paciência, orientação, amizade e

por todo empenho, e, acima de tudo, exigência. Seus ensinamentos foram

fundamentais para minha formação acadêmica.

Ao Dr. Luciano Kayser Vargas pela amizade e ajuda no decorrer da minha vida

acadêmica.

Ao Programa de Pós Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente e

sua equipe de professores pela oportunidade e ensinamentos a mim

oferecidos.

Ao professor Miguel Dall’ Agnol, do Departamento de Plantas Forrageiras, pela

concessão e ajuda com as sementes.

A CAPES pelo auxílio financeiro.

Ao funcionário Márcio Silveira pela amizade e tempo dedicados, e pelas “dicas”

em química.

Aos colegas de Laboratório Andréia Bins, Marcelo Wallau, Rafael Lima, Rafael

Machado, Thais Cabral, Raquel Damasceno, Gleidson Reiff, Rogério Fontoura,

André Nunes pela amizade. Em especial a Manuela Bruxel e Marcos

Stroschein pela troca de conhecimentos, força e ajuda nos momentos mais

difíceis.

Aos amigos que sempre torceram por mim, em especial as “novas” amigas Ana

e Mica pelos vários momentos de amizade e descontração.

A galera do apartamento Franci, Rafael, Fani e meu irmão Jonas pelas

brincadeiras, amizade e compreensão no dia-a-dia.

Aos meus padrinhos Nice e Pepo pela acolhida, amizade, papos cabeça e

vários almoços e jantas deliciosas.

Ao Raul pela força e apoio na reta final do mestrado.

A todos os que de alguma forma contribuíram para a realização desse trabalho.

iii

SELEÇÃO DE RIZÓBIOS E ESTUDO DA COMPATIBILIDADE SIMBIÓTICA

EM Desmodium incanum e Lotus spp.

Autor: Camille Eichelberger Granada

Orientador: Prof. Dr. Enilson Luiz Saccol de Sá

RESUMO:

A existência de rizóbios nativos eficientes na fixação simbiótica do nitrogênio

em leguminosas introduzidas nos campos do Rio Grande do Sul, como as

forrageiras do gênero Lotus, é um fator determinante para adaptação ou o

fracasso destas novas espécies. Este trabalho visou estudar a compatibilidade

simbiótica de rizóbios simbiontes em Desmodium incanum, uma planta nativa

dos campos do Rio Grande do Sul, e em L. corniculatus, L. uliginosus, L. glaber

e L. subbiflorus. Para isto 35 isolados e 17 estirpes de rizóbios foram

estudadas. Os isolados foram caracterizados fenotípicamente quanto a

morfologia colonial, produção de ácido indol-acético e sideróforos. Os rizóbios

foram estudados quanto a compatibilidade simbiótica pela inoculação cruzada

com as espécies de plantas estudadas. Observou-se existem rizóbios nativos

dos solos do Rio Grande do Sul capazes de produzir auxinas e sideróforos. Os

rizóbios estudados neste trabalho foram sensíveis a salinidade. Também

observou-se que todos os rizóbios isolados de Lotus foram capazes de induzir

nodulação em pelo menos duas das cinco espécies estudadas. Os rizóbios de

L. uliginosus que apresentaram compatibilidade com as cinco espécies de

plantas estudadas, já os de D. incanum mostraram alta especificidade. Em

experimento em casa de vegetação as plantas de L. corniculatus inoculadas

com os o isolado UFRGS Lu 2 e as estirpes EEL 698 e SEMIA 816 produziram

maior massa seca da parte aérea. Este isolado também foi eficiente em plantas

de D. incanum. Os resultados deste trabalho mostram que existem rizóbios

autóctones dos solos do Rio Grande do Sul que apresentam baixa

especificidade hospedeira sendo capazes de formar simbiose com plantas de

D. incanum, L. corniculatus, L. subbiflorus, L. glaber e L. uliginosus. A

compatibilidade simbiótica com diferentes hospedeiros dificultou o

estabelecimento de grupos de compatibilidade. A técnica de REP-PCR com o

oligonucleotídeo iniciador BOX A1 mostrou que existe variabilidade entre os

rizóbios estudados, sendo estes, diferentes das estirpes fornecidas pelas

coleções de cultura.

Dissertação de Mestrado pelo Programa de Pós Graduação em Microbiologia Agrícola e do

Ambiente – Para obtenção do grau de Mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente –

Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto

Alegre, RS, Brasil. (70 p.) Abril, 2010.

Selection of Rhizobia and symbiotic compatibility study in Desmodium

incanum and Lotus sp. plants

Author: Camille Eichelberger Granada

Adviser: Prof. Dr. Enilson Luiz Saccol de Sá

Abstract:

The presence of native Rhizobia which are efficient in symbiotic nitrogen

fixation in legumes introduced in the fields of Rio Grande do Sul, such as the

forages plants of the genus Lotus, is one of the factors determining the success

or the failure of the adaptation of these new plant species. This work aimed to

evaluate the symbiotic compatibility of Rhizobia in association with Desmodium

incanum, a native plant from the fields of Rio Grande do Sul, as well as with L.

corniculatus, L. uliginosus, L. glaber and L. subbiflorus species. For this, 35

isolates and 17 lineages of Rhizobia were analyzed. The isolates were

characterized phenotypically based on the colony morphology and on the indole

acetic acid and siderophore production. The Rhizobia were studied for

symbiotic compatibility by cross-inoculation with the plant species studied. It

was observed that there are indigenous Rhizobia in the soils of Rio Grande do

Sul capable of producing siderophores and auxins. All of Lotus Rhizobia were

able to induce nodulation in at least two of the five studied species. Rhizobia

strains isolated from L. uliginosus have shown a broad specificity, being able to

induce nodulation in all studied species. On the other hand, Rhizobia isolated

from D. incanum have shown to be highly specific. In a green-house experiment

the plants of L. corniculatus inoculated with the isolate UFRGS Lu 2 and strains

EEL 698 and SEMIA 816 produced higher shoot dry mass. This isolate was

also efficient in D. incanum plants. The results show that there are indigenous

Rhizobia in the soils of Rio Grande do Sul, which have low host specificity and

are capable of forming symbiosis with D. incanum, L. corniculatus, L.

subbiflorus, L. glaber and L. uliginosus plants. The symbiotic compatibility with

different hosts made difficult the establishment of compatibility groups. The

technique of REP-PCR using primer BOX A1 showed differences among the

Rhizobia studied, which are different from strains provided by culture

collections.

Master of Science dissertation in Agricultural Microbiology, Instituto de Ciências Básicas da

Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (70 p.) April, 2010

SUMÁRIO

Pág.

INTRODUÇÃO........................................................................................

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................

2.1. Simbiose Rizóbio-Leguminosa e a fixação biológica do nitrogênio

atmosférico.............................................................................................

2.2. Bactérias diazotróficas simbiontes de leguminosas........................

2.3. Compatibilidade simbiótica entre rizóbios e leguminosas...............

2.4. Caracterização genética de rizóbios................................................

2.5. Leguminosas e o estudo da simbiose..............................................

2.5.1. Características da leguminosa Desmodium incanum............

2.5.2. Características das espécies de Lotus com potencial

forrageiro: L. corniculatus, L. glaber, L. uliginosus e L. subbiflorus........

MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................

3.1. Isolados de rizóbios de Lotus spp. e estirpes estudadas................

3.2. Obtenção dos isolados bacterianos de D. incanum........................

3.3. Resistência ao choque salino em 1, 2 e 3% de cloreto de sódio

em meio ágar LM....................................................................................

3.4. Reação de pH dos rizóbios em meio de cultura..............................

3.5. Produção de auxinas equivalentes ao ácido-indol-acético (AIA)....

3.6. Produção de sideróforos.................................................................

3.7. Determinação da compatibilidade simbiótica entre os rizóbios e

plantas de D. incanum, Lotus spp. e Glycine max..................................

3.8. Avaliação da eficiência na fixação simbiótica do nitrogênio dos

rizóbios em plantas de L. corniculatus e D. Incanum.............................

3.9. Caracterização genética dos rizóbios.............................................

3.9.1. Amplificação do DNA genômico pela técnica de Rep-PCR

pelo oligonucleotídeo iniciador BOX.......................................................

3.9.2. Análise dos produtos da amplificação...................................

RESULTADOS........................................................................................

4.1. Características morfológicas dos rizóbios......................................

4.2. Resistência ao choque salino em meio de cultura com 1, 2 e 3%

de cloreto de sódio (NaCl).....................................................................

4.3. Produção de auxinas e sideróforos pelos rizóbios.........................

4.4. Avaliação da compatibilidade simbiótica dos rizóbios com as

plantas estudadas..................................................................................

4.5. Avaliação da eficiência na fixação simbiótica do nitrogênio dos

rizóbios em plantas de L. corniculatus e D. Incanum.............................

4.6

CONCLUSÕES.......................................................................................

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................

APÊNDICE 1...........................................................................................

7.1. Meios de Cultura e Soluções utilizadas...........................................

7.1.1 Levedura Manitol (LM) (Vincent, 1970)................................

7.1.2. Soluções para a extração de DNA........................................

7.1.3. Solução Nutritiva (Sarruge, 1974).........................................

7.1.4. Meio de Cultura de Wood & Cooper adaptado por Sá

(2001)*.............................................................................................

APÊNDICE 2 ..........................................................................................

8.1. Mistura de cada reação para o PCR com o oligonucleotídeo

iniciador BOX A 1-R..............................................................................

8.2. Ciclos para a amplificação do DNA genômico no Rep-PCR BOX...

vii

RELAÇÃO DE TABELAS

Pág

TABELA 1:

Relação de Isolados e estirpes dos rizóbios para L. glaber,

L. subbiflorus, L. corniculatus e L. uliginosus estudados

neste trabalho.......................................................................

TABELA 2:

Características das colônias de rizóbios avaliadas neste

trabalho: tempo de aparecimento de colônias de 1 mm,

diâmetro da colônia após sete dias de crescimento,

densidade óptica em meio de cultura ágar LM com

vermelho congo e reação de pH em meio ágar LM com

azul de bromotimol...............................................................

TABELA 3:

Resistência dos Rizóbios ao choque salino em meio de

cultura LM com concentrações de cloreto de sódio de 1, 2

e 3%.....................................................................................

TABELA 4:

Produção de ácido indol acético (AIA) e sideróforos pelos

rizóbios estudados...............................................................

TABELA 5:

Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e

fixação simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes e

isolados de rizóbios de plantas de D. incanum quando

inoculados em plantas de D. incanum, L.corniculatus, L.

uliginosus, L. glaber, L. subbiflorus e Glycine

Max......................................................................................

TABELA 6:

Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e

fixação simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes e rizóbios

isolados de plantas de L. corniculatus quando inoculados

em plantas de D. incanum, L. corniculatus e L. uliginosus..

TABELA 7:

Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e

fixação simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes e rizóbios

isolados de plantas de L. uliginosus quando inoculados

em plantas de D. incanum, L. corniculatus, L. uliginosus,

L. subbiflorus e L. glaber......................................................

viii

TABELA 8:

Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e

fixação simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes e rizóbios

isolados de plantas de L. subbiflorus quando inoculados

em plantas de D. incanum, L. corniculatus, L. uliginosus,

L. subbiflorus e L. glaber......................................................

TABELA 9:

Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e

fixação simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes e rizóbios

isolados de plantas de L. glaber quando inoculados em

plantas de D. incanum, L. corniculatus, L. uliginosus, L.

subbiflorus e L. glaber..........................................................

TABELA 10:

Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e

fixação simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes para soja

(G. max) quando inoculadas em plantas de D. incanum, L.

corniculatus e L. subbiflorus................................................

TABELA 11:

Massa seca (MS) da raíz e da parte aérea (PA) das

plantas Desmodium incanum inoculadas com rizóbios e

cultivadas em casa de vegetação........................................

TABELA 12:

Massa seca (MS) e número de nódulos, massa seca da

raíz, da parte aérea por tratamento e nitrogênio (N) total

por planta de L. corniculatus inoculadas com os rizóbios e

cultivadas em casa de vegetação e eficiência relativa da

inoculação dos rizóbios nestas plantas...............................

RELAÇÃO DE FIGURAS

Pág.

FIGURA 1:

Foto do perfil eletroforético em gel de agarose dos

fragmentos da amplificação do DNA genômico por Rep–PCR

BOX de 13 isolados e quatro estirpes de rizóbios estudados

neste trabalho.......................................................

FIGURA 2:

Foto do perfil eletroforético em gel de agarose dos

fragmentos da amplificação do DNA genômico por Rep–PCR

BOX de oito isolados e 11 estirpes de rizóbios estudados

neste trabalho..........................................................

FIGURA 3:

Dendrograma de genotipagem de 36 estirpes e isolados de

rizóbios estudados neste trabalho. Agrupamento obtido por

UPGMA, utilizando-se o coeficiente de Jaccard, para perfil de

bandas obtido a partir da PCR com o oligonucleotídeo

iniciador BOX A1.......................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS

AIA – Ácido indol acético

BOX - Sequências repetitivas de enterobactérias

CAS – Cromazurol S

DNA – Ácido desoxiribonucleico

EEL – Estação Experimental de Lages

ERIC - Sequências repetitivas intergênicas consenso em enterobactérias

Lc – Lotus corniculatus

Lg – Lotus glaber

Ls – Lotus subbiflorus

Lu – Lotus uliginosus

LM – Levedura Manitol

mg – Miligramas

mL – Mililitros

µL – Microlitros

mM – Milimolar

N - Nitrogênio

PCR – Reação em cadeia pela polimerase

rDNA - Ácido Desoxirribonucléico Ribossômico

REP - Sequências repetitivas extragênicas palindromicas

RFLP - Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição

RPM – Rotações por minuto

SDS - Dodecil Sulfato de Sódio

SEMIA – Seção de Microbiologia Agrícola

U - Unidade

UFRGS – Universidade Federal do Rio Grande do Sul

1. INTRODUÇÃO

O bioma Pampa, no Brasil, possui uma área de aproximadamente

176.496 Km

, o que constitui cerca de 2,07% da área total do país, sendo que

no Rio Grande do Sul, este é formado pelos campos da parte sul do estado,

também conhecidos como campos nativos. Grande parte da riqueza da

biodiversidade do Pampa ainda é desconhecida, pois foram desenvolvidas até

hoje poucas pesquisas de levantamento e de identificação da fauna e da flora

deste Bioma.

A grande quantidade e diversidade de plantas nativas com potencial

forrageiro que existem nos campos do Rio Grande do Sul, fazem com que a

pecuária seja uma das principais atividades da região. A lotação excessiva do

gado pode gerar perda de biodiversidade. Além do potencial forrageiro, as

pastagens permanentes e a introdução de espécies são fundamentais para a

proteção do solo, podendo também contribuir na recuperação de áreas com

solos degradados.

Existem diversas espécies leguminosas características destas

regiões que apresentam um grande potencial forrageiro, entre elas encontram-

se espécies do gênero Desmodium. As raízes destas plantas podem ser

colonizadas por bactérias diazotróficas genericamente denominadas rizóbios,

formando uma associação simbiótica entre a planta e a bactéria. Quando a

planta e o rizóbio estão em simbiose, ocorre a fixação biológica do nitrogênio,

que fornece esse nutriente para a leguminosa e, ao mesmo tempo, beneficia

outras espécies associadas, por meio da liberação de exudados radiculares e

da ciclagem dos resíduos da leguminosa.

A existência de rizóbios de baixa especificidade, que estabeleçam

simbiose eficiente com as leguminosas forrageiras nativas e também com

plantas exóticas (como forrageiras do gênero Lotus) pode facilitar a adaptação

das leguminosas forrageiras introduzidas e também melhorar a qualidade da

forragem nas áreas de pastagem nativa. Mas em geral, a população de rizóbios

nativos de um solo é menos eficiente na fixação biológica do nitrogênio do que

as estirpes que são introduzidas via inoculação, podendo estabelecer simbiose

ineficiente com a leguminosa, o que dificulta a adaptação e o desenvolvimento

das plantas exóticas.

Por isso, a determinação de grupos de compatibilidade e a seleção

de estirpes de rizóbios que possuam a capacidade de estabelecer simbiose e

fixar o nitrogênio atmosférico eficientemente em mais de uma leguminosa é de

grande importância atualmente. Assim, o objetivo deste trabalho foi selecionar,

avaliar a compatibilidade simbiótica e a capacidade de fixação simbiótica do

nitrogênio de rizóbios nativos dos solos do Rio Grande do sul simbiontes de

plantas de D. incanum, L. corniculatus, L. subbiflorus, L. uliginosus e L. glaber

nestas respectivas plantas.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O estudo da simbiose entre leguminosas e bactérias diazotróficas

fixadoras de nitrogênio atmosférico é de grande importância para o

desenvolvimento de tecnologias que facilitem a adaptação de novas espécies,

aumentem a produtividade, reduzam os custos de produção, com o mínimo

risco de degradação do solo e do ambiente.

2.1.Simbiose rizóbio-Leguminosa e a fixação biológica do

nitrogênio atmosférico

A formação dos nódulos, que ocorre durante a associação

simbiótica, é controlado, em grande parte, pela troca de sinais entre os rizóbios

e a planta hospedeira (Hirsch et al., 2003). Devido à diversidade de compostos

e metabólitos secundários que compõem os exudatos radiculares, as plantas

podem enviar um número bem diverso de sinais. Tais sinais são altamente

específicos entre o hospedeiro e o simbionte, pois diferem consideravelmente

entre as leguminosas, e esta especificidade possibilita que os rizóbios

simbiontes identifiquem seus próprios hospedeiros (Bais et al., 2004).

O processo da simbiose é iniciado pela ausência de nitrogênio no

solo. Os flavonóides excretados pelo sistema radicular da leguminosa

acumulam-se na membrana citoplasmática dos rizóbios e, se os receptores de

membrana das bactérias reconhecerem estes metabólitos, o gene nodD é

ativado (Recourt et al., 1989; Hubac et al., 1993) e, o produto deste gene,

ativa os genes de nodulação nod, nol e noe (Goormachtig et al., 2004) mais

conhecidos como fatores de nodulação.

Os fatores de nodulação atuam no estabelecimento da

especificidade pela planta hospedeira. A estrutura formada pelo produto dos

genes nodABC é essencial para o estabelecimento da simbiose (o gene nodA

sintetiza uma acil transferase, nodB uma desacetilase e nodC uma N-acetil-

glucosamil transferase). A união destas moléculas resulta na formação de um

lipo-quito-olissacarídeo que é reconhecido pelas células das raízes da planta, e

juntamente com uma série de hormônios liberados pelas bactérias (auxinas,

citocininas), provocam o encurvamento do pêlo radicular (Loh & Stacey, 2003).

Em seguida, a expressão de um gene de iniciação da nodulação pelos rizóbios,

a nodulina (enod), provoca uma série de alterações da estrutura do pêlo

radicular formando um cordão de infecção que permite, finalmente, a entrada

da bactéria pela raiz, seguido pela infecção da planta, e o desenvolvimento dos

nódulos (Pereira, 2008).

Com a formação dos nódulos, inicia-se o processo de fixação

biológica do nitrogênio. Este processo é regulado pelos genes nif e fix que são

responsáveis pela síntese e regulação de um sistema enzimático, onde se

inclui a nitrogenase, que atua como catalisadora da reação, e que é capaz de

reduzir o nitrogênio atmosférico (N

) em amônia (NH

) (Argudo et al. 2004).

Este complexo enzimático é altamente conservado em termos de estrutura e

função, constituindo-se basicamente de duas metaloproteínas, uma chamada

ferro proteína que liga-se ao ATP e atua como doadora de elétrons, e outra

molibdênio ferro proteína que contém o sítio de redução do substrato que

transforma o gás nitrogênio (N

) em amônia (NH

) (Burris & Roberts, 1993;

Eady, 1996; Ferguson, 1998). Esta então é liberada por difusão pelo

bacterióide para o citosol da célula infectada por transportadores de membrana

(Taiz & Zieger, 2004).

O contato da amônia com o substrato aquoso do citoplasma das

células faz com que este se transforme em no íon amônio (NH

). Por sua vez,

o acúmulo de NH

no citoplasma inibe a fixação biológica dentro dos

bacterióides, desta forma, este íon é transportado para dentro das células

hospedeiras e transformado em aminoácidos pelas enzimas glutamina

sintetase e glutamato sintase (King & Purcell, 2005).

2.2 Bactérias diazotróficas simbiontes de leguminosas

Genericamente conhecidas como rizóbios, estas bactérias são

bastonetes gram-negativas, aeróbias, não formadoras de endosporos. O

número e a posição de flagelos dependem do gênero. São bactérias

predominantemente quimiorganotróficas (Somasegaram & Hoben, 1994;

Moreira & Siqueira, 2002).

No ambiente, estas bactérias são pleomórficas, pois no solo, são

bacilos de vida livre, móveis, aeróbios, incapazes de fixar o nitrogênio

atmosférico (N

) (Melo et al., 1998). Já em simbiose com as raízes das

leguminosas, assumem formas irregulares (sendo denominados bacterióides),

aumentam o tamanho das suas células (Cardoso et al., 1992), nutrem-se de

compostos sintetizados pela planta hospedeira, vivem em condições

microaerofilicas (Canigia, 2003) e fixam o nitrogênio atmosférico (Moreira &

Siqueira, 2002).

A primeira classificação considerava todas as bactérias formadoras

de nódulos em leguminosas como pertencentes ao gênero Rhizobium (Frank,

1889). Nesta classificação, a especificidade da bactéria com a planta

hospedeira era o principal fator determinante da espécie (Fred et al., 1932).

Com o passar do tempo, este critério deixou de ser tão relevante, pois um

grande número de exceções dentro dos grupos começou a ser detectado

(Wilson, 1944). Posteriormente, Jordan (1982) sugeriu uma separação

taxonômica baseada na taxa de crescimento, pois esta pode diferenciar os

rizóbios de multiplicação rápida (Rhizobium) daqueles de multiplicação lenta

(Bradyrhizobium).

Nos últimos 20 anos, a classificação dos rizóbios passou por

constantes alterações (Wang et al., 2006). O emprego de técnicas de biologia

molecular revolucionou o estudo da taxonomia procariótica. Estudos com o

DNA das bactérias levaram à reclassificação de muitos microrganismos.

Técnicas de amplificação e caracterização do DNA ribossomal das bactérias

estabeleceram relações filogenéticas antes não conhecidas, mostrando

relações taxonômicas mais confiáveis (Garrity & Holt, 2001).

Atualmente os microrganismos diazotróficos que são capazes de

induzir a formação de nódulos e fixar o nitrogênio atmosférico em simbiose com

leguminosas são classificados como pertencentes ao filo α-proteobactéria e β-

proteobactéria (Zakhia & Laujudie, 2001). Os gêneros de rizóbios mais

conhecidos são: Rhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium e

Azorhizobium, sendo estes também, os mais estudados atualmente (Sahgal &

Johri, 2003). Recentemente, algumas bactérias estão sendo denominadas

rizóbios por serem simbiontes de leguminosas, mas pertencem a gêneros bem

distintos, tais como Devosia (Rivas et al., 2003), Methylobacterium (Jourand et

al., 2004) e Ochrobactrum (Trujillo et al., 2005), pertencentes a classe α-

proteobactéria, Burkholderia (Vandamme et al., 2002), Phyllobacterium

(Valverde et al., 2005) e Cupriavidus (Barrett e Parker, 2006) pertencentes a

classe β-proteobactéia.

2.3 Compatibilidade simbiótica entre rizóbios e leguminosas

De um modo geral, pode ser observada uma especificidade na

formação dos nódulos pelos rizóbios nas plantas leguminosas (Melo et al.,

1998). A soja (Glycine max) é um exemplo deste tipo de planta, uma vez que,

dentre as variedades brasileiras, foram identificadas somente duas espécies de

rizóbios que estabelecem simbiose com a mesma: Bradyrhizobium japonicum e

B. elkanii (Neves & Rumjanek, 1996; Arruda et al., 2001; Campos et al., 2001;

Silva et al., 2002; Pavanelli & Araújo, 2009).

Entretanto existem rizóbios que apresentam baixa especificidade

pela leguminosa hospedeira, ou seja, vários rizóbios possuem a capacidade de

estabelecer simbiose com diversos hospedeiros. Em estudo realizado por

Fernandes et al. (2003) é relatada a existência de isolados de rizóbios em

Sergipe (Brasil) capazes de nodular e fixar eficientemente o nitrogênio

atmosférico em três espécies: guandu (Cajanus cajan), feijão-de-porco

(Canavalia ensiformise) e feijão- caupi (Vigna unguiculata). Melloni et al. (2006)

estudaram a diversidade fenotípica de isolados de rizóbios simbioticamente

compatíveis com feijão-caupi e feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) em áreas de

mineração de bauxita e encontraram oito grupos diferentes entre os isolados

estudados e as respectivas estirpes recomendadas.

Já em trabalhos sobre a simbiose entre rizóbios e leguminosas

forrageiras, no caso de plantas de Lotus, Hernández et al. (2005) sugeriram a

existência de estirpes de rizóbios de crescimento intermediário, Mesorhizobium

loti (Jarvis et al., 1997), compatíveis simbioticamente com plantas de Lotus

corniculatus e L. glaber. Segundo os mesmos autores, as plantas de L.

subbiflorus e L. uliginosus formariam outro grupo de compatibilidade,

relacionando-se efetivamente com estirpes de bactérias de crescimento lento,

como as pertencentes ao gênero Bradyrhizobium. Contrariando estes

resultados, Tonon (2008) em seu estudo sobre compatibilidade simbiótica entre

os rizóbios e estas quatro espécies de Lotus já citadas, observou que a

formação de nódulos nas plantas ocorreu de maneira aleatória, sem a

formação dos grupos de compatibilidade entre os rizóbios e estas forrageiras.

Outro gênero de forrageira estudado quanto à possibilidade de

estabelecer simbiose com os rizóbios é o Desmodium. Em um estudo realizado

por Parker (2002) foi verificado a existência de muitos isolados de rizóbios de

crescimento lento e rápido capazes de estabelecer simbiose em duas

leguminosas distintas: Desmodium glutinosum (popularmente conhecido como

pega-pega) e Amphicarpaea bracteata, que são plantas comuns na América do

Norte.

No entanto, o fato dos rizóbios apresentarem baixa especificidade

hospedeira, pode fazer com que bactérias eficientes em uma espécie possam

comportar-se como parasitárias em outras, induzindo a nodulação, mas sendo

simbioticamente ineficientes, não fixando o nitrogênio atmosférico para as

plantas (Baraibar et al., 1999). Sá (2001), em seu trabalho realizado com

rizóbios e plantas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris), notou que o fato de uma

grande variedade de espécies de rizóbios estabelecerem simbiose em uma

mesma planta aumenta a probabilidade desta simbiose ser ineficiente.

Observação semelhante foi relatada por Hernández et al. (2005) e Tonon

(2008) com plantas de Lotus corniculatus, L. subbiflorus, L. glaber e L.

uliginosus, e por Fontoura (2008) com L. glaber e L. subbiflorus.

2.4 Caracterização genética de rizóbios

Tradicionalmente são utilizados testes morfológicos, bioquímicos,

enzimáticos e simbióticos para classificação e caracterização dos rizóbios

(Vincent, 1970). Recentemente técnicas de biologia molecular têm facilitado o

estudo e identificação destas bactérias (de Brujin 1992; Laguerre et al, 1994;

Menna et al., 2006). A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é a

mais utilizada atualmente, pois esta permite a amplificação de sequências

definidas na molécula de DNA (Chueire et al., 2000; Laguerre et al., 2001).

Vários são os relatos sobre a utilização desta tecnologia nos estudos de

ecologia, genética e taxonomia de rizóbios (de Brujin, 1992; Judd et al.,1993;

Agius et al., 1997; Laguerre et al., 2001; Santos et al., 1999; Tonon, 2008), e de

comparações genéticas entre estirpes de Rhizobium e Bradyrhizobium

(Laguerre et al., 1994; Vinuesa et al., 1998).

Para a caracterização da variabilidade das espécies existem muitas

variações da técnica de PCR, que gera perfis diferenciados, e facilita o estudo

dos isolados (Grange, 2001; Stralioto, 2005). Algumas das técnicas mais

utilizadas são: comparação e sequenciamento dos nucleotídeos dos genes, em

especial, o gene 16S rDNA, considerado conservado nas bactérias, mas que

contém variações significativas dentro do gene, sendo capaz de mostrar

relações filogenéticas entre espécies (Willems, 2007). A técnica de RFLP

(Restriction fragment Length polymorphism – polimorfismo no comprimento de

fragmentos de restrição) é muito utilizada para caracterizar a variabilidade dos

isolados bacterianos, com a amplificação de um gene seguida pelo uso de

endonucleases de restrição. A técnica de Rep-PCR amplifica regiões

altamente conservadas e repetitivas no genoma bacteriano (Chapaval et al.,

2010). Suas variações Rep-PCR REP (repetitive extragenic palindromic –

Sequências repetitivas extragênicas palindromicas) Rep-PCR ERIC

(enterobacterial repetitve intergenic consensus – Sequências repetitivas

intergênicas consenso) e Rep-PCR BOX (enterobacterial repetitive sequences

– Sequências repetitivas de enterobactérias) amplificam regiões altamente

conservadas e repetitivas (Stern et al., 1984; Versalovic et al.,1994; Chapaval

et al., 2010) e permitem a diferenciação das estirpes estudadas (de Brujin,

1992; Selenska-Pobell et al., 1995; Hungria et al., 1998; Santos et al., 1999;

Chueire et al., 2000; Mostasso et al., 2002; Frizzo, 2007; Fontoura, 2008;

Tonon, 2008).

Alguns trabalhos que estudaram a variabilidade dos rizóbios usando

técnicas de biologia molecular foram descritos por Chen et al. (2000), Grange &

Hungria (2004) e Giongo (2007) que utilizaram a amplificação e

sequenciamento do rDNA 16S e Rep-PCR ERIC; e Stroschein (2007) utilizou

Rep-PCR BOX para a caracterização de seus isolados bacterianos.

2.5 Leguminosas e o estudo da simbiose

A família Leguminosae compreende 650 gêneros distribuídos em

18.000 espécies que estão amplamente distribuídas pelo mundo (Biondo el al.,

2005). Estas espécies estão distribuídas em três subfamílias: Papilionoideae,

Mimosoideae, Caesalpinioideae.

Alguns gêneros de leguminosas despertam o interesse de muitos

pesquisadores no que se refere ao estudo da simbiose planta-rizóbio. Dentre

elas estão forrageiras do gênero Desmodium (Tlusty et al., 2004; Gu et al.,

2007) e Lotus (Scheffer-Basso et al, 2001; Frizzo,2007; Fontoura, 2008; Tonon,

2008), e a oleoginosa do tipo Glycine max (soja) (Campos et al., 2001; Fagan

et al., 2007; Carvalho et al., 2008)

2.5.1 Características da leguminosa Desmodium incanum

O gênero Desmodium sp. é constituído por aproximadamente 300

espécies, distribuindo-se em zonas tropicais de todo o mundo, tendo maior

concentração de espécies no leste de Ásia, México e Brasil (Schubert, 1980).

A espécie D. incanum é nativa da América do Sul e distribuída nas

comunidades vegetais de todas as regiões fisiográficas do Rio Grande do Sul

(Garcia & Baseggio, 1999). Estas plantas, popularmente como pega pega,

possuem um alto potencial forrageiro devido ao seu elevado valor nutricional,

chegando a aproximadamente 15% de proteína bruta na planta (Krzyzanowski

& Santos, 1984). Estas plantas adaptam-se aos mais variados tipos de solo,

crescendo bem em solos ácidos e de baixa fertilidade, campos úmidos, secos,

pedregosos, graminosos (Silva et al, 2002).

Estas leguminosas também possuem a capacidade de estabelecer

relações simbióticas com os rizóbios. No estudo realizado por Gu et al. (2007)

sobre a diversidade genética dos rizóbios noduladores de Desmodium mostrou

que, a maioria das cepas isoladas fazia parte do gênero Bradyrhizobium sendo

caracterizados como B. elkanii, B. japonicum e B. yuanmingense, restando

pequenos grupos de isolados caracterizados como Rhizobium, Sinorhizobium

ou Mesorhizobium.

2.5.2 Características das espécies de Lotus com potencial

forrageiro: L. corniculatus, L. glaber, L. uliginosus e L. subbiflorus.

As plantas das espécies Lotus corniculatus, L. glaber, L. subbiflorus

e L. uliginosus são leguminosas com potencial forrageiro, perenes, inverno-

primaveril, de origem européia e mediterrânea, distribuídas em todas as

regiões de clima temperado (Soster et al., 2004). Podem apresentar variações

quanto ao tamanho, à forma, à coloração das folhas (Seaney & Henson, 1970).

O cornichão (L. corniculatus) é uma leguminosa forrageira de grande

importância em diversos países (Maroso & Scheffer-Basso, 2007), com

excelente adaptação no sul do Brasil, Uruguai, Argentina e Chile (Paim &

Riboldi, 1991). No Rio Grande do Sul, a cultivar “São Gabriel” de L.

corniculatus, foi desenvolvida a partir de pesquisas na Estação Experimental do

município de São Gabriel, RS (Paim, 1988). Esse cultivar é caracterizado pelo

rápido estabelecimento inicial, grande vigor vegetativo, boa produtividade,

elevada qualidade de forragem e boa ressemeadura natural, mas apresenta

problemas de persistência, devido ao hábito de crescimento ereto, não

suportando pastejo intenso (Paim & Riboldi, 1991).

As plantas de L. uliginosus (cultivar tetraplóide Maku) são

denominadas popularmente como “cornichão dos banhados” (Maroso &

Scheffer-Basso, 2007). Esta se caracteriza por apresentar maior tolerância a

solos ácidos e deficientes de fósforo em relação às outras espécies de Lotus.

Esta espécie de planta também possui elevada capacidade de estabelecimento

em áreas úmidas (Paim & Riboldi, 1991; Brose, 1992), suportando também

pastejos intensos (Ayala et al., 2003).

Em relação à espécie L. subbiflorus não há relatos de quando foi

introduzida no Rio Grande do Sul (Paim & Riboldi, 1991), encontrando-se de

forma espontânea em áreas de antigas coleções. É uma leguminosa de

inverno, e pode comportar-se de maneira bianual ou perene em áreas sem

restrições hídricas. É adaptada a solos ácidos, de baixa fertilidade e drenagem

deficiente (Lowther et al., 1987). Essa espécie possui um sistema radicular

pouco profundo, mas abundante.

L. glaber é uma forrageira perene que se adapta bem em ambientes

úmidos de clima temperado (Beuselinck, 1999). Esta espécie cresce no outono

e na primavera, mas tolera baixas temperaturas e cobertura de gelo (Vigniolo et

al., 1999). Também adapta-se a ambientes de muita salinidade (Mujica &

Rumi,1999) e cresce em solos com pH 5,8 a 6,0. No Chile, esta espécie é

encontrada de forma espontânea nas áreas arrozeiras.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Isolados de rizóbios de Lotus spp e estirpes estudadas.

Os rizóbios nativos de solos do Rio Grande do Sul simbiontes de

plantas de Lotus glaber, L. subbiflorus estudados neste trabalho foram isolados

por Fontoura (2008), e os rizóbios de L.corniculatus e L. uliginosus foram

obtidos por Frizzo (2007) (Tabela 1). Estes isolados bacterianos fazem parte da

Coleção de Culturas de Rizóbios do Laboratório de Microbiologia do Solo da

UFRGS.

Também foram estudadas as estirpes EEL698, para L. subbiflorus, e

EEL8084, para L. uliginosus, da coleção da Estação Experimental de Lages –

SC (EEL), e a estirpe U512 que está sendo estudada no Uruguai. Além destas,

também foram estudadas as estirpes de rizóbios obtidos da coleção de estirpes

SEMIA localizadas na FEPAGRO (Fundação Estadual de Pesquisa

Agropecuária) liberadas para a produção de inoculantes no Brasil para Glicyne

max, Desmodium incanun, D. intortum, D. ovalifolium, Lotus corniculatus, L.

uliginosus, L. subbiflorus e L. glaber listadas na Tabela 1.

TABELA 1: Relação de Isolados e estirpes dos rizóbios para L. glaber, L.

subbiflorus, L. corniculatus, L. uliginosus, Desmodium sp. e Glycine max

estudados neste trabalho.

Espécies

Isolados

Estirpes

Espécies

isolados

Estirpes

L. corniculatus

UFRGS Lc 10

SEMIA 806

L. subbiflorus

UFRGS Ls 1

SEMIA 848

UFRGS Lc 14

SEMIA808

UFRGS Ls 8

EEL 698

UFRGS Lc 22

SEMIA 816

UFRGS Ls 22

UFRGS Lc 36

U 510

UFRGS Ls 28

UFRGS Lc 322

UFRGS Ls 36

UFRGS Lc 336

UFRGS Ls 59

UFRGS Lc 340

UFRGS Ls 62

L. uliginosus

UFRGS Lu 2

SEMIA 822

Desmodium

SEMIA 6028

UFRGS Lu 8

EEL 8084

SEMIA 656

UFRGS Lu 9

SEMIA 6208

UFRGS Lu 10

SEMIA 6209

UFRGS Lu 12

UFRGS Lu 13

UFRGS Lu 14

UFRGS Lu 19

G. Max

SEMIA 5079

L. glaber

UFRGS Lg 109

SEMIA 830

SEMIA 5080

UFRGS Lg 111

SEMIA 587

SEMIA 5019

: Estirpe recomenda para Desmodium incanun;

: Estirpe recomendada para

D. intortum;

: Estirpe recomendada para D. ovalifolium

3.2 Obtenção dos isolados bacterianos de D. incanum

Os rizóbios para Desmodium incanum foram isolados a partir dos

nódulos radiculares de plantas desta espécie coletadas nas localidades de Rio

Pardo, Eldorado do Sul e Viamão. Em laboratório, os nódulos radiculares foram

destacados e desinfestados por lavagens sucessivas com etanol (70%) por 45

segundos, seguido de hipoclorito (1%) por 30 segundos e, cinco lavagens com

água destilada e esterilizada. Em seguida, cada nódulo foi macerado com uma

pinça estéril em tubos de microcentrífuga contendo 100 µL de água destilada e

esterilizada, a suspensão obtida foi inoculada pela técnica de esgotamento por

estrias em placas de Petry contendo o meio ágar Levedura Manitol (LM)

(Vincent, 1970) com Vermelho Congo (25 mg/L) e incubadas em estufa a 28ºC

até o aparecimento de crescimento bacteriano. Os rizóbios obtidos foram

purificados utilizando-se a técnica de esgotamento de inóculo por estriamento

em placas de Petry com meio ágar LM, até a obtenção de colônias isoladas,

homogêneas e com características persistentes. As colônias obtidas foram

preservadas em tubos de dois mL contendo glicerol 50% e mantidos em ultra

freezer a -80ºC.

O crescimento dos isolados de rizóbios foi observado diariamente e

as colônias foram caracterizadas. Foram avaliados o tempo de aparecimento

de colônias (o tempo de aparecimento em dias foi avaliado quando a colônia

bacteriana atingiu um diâmetro de um milímetro), tamanho e morfologia de

colônia após sete dias de crescimento em meio de cultura ágar LM (Vincent,

1970) com vermelho congo.

3.3 Resistência ao choque salino em 1, 2 e 3% de Cloreto de

Sódio em meio ágar LM.

Os isolados bacterianos foram crescidos em frascos âmbar de 10mL

com tampa de baquelite contendo 5mL de meio líquido LM (Vincent, 1970) por

três dias a 28ºC sob agitação de 120 rpm. Logo após, o choque salino foi

avaliado pela inoculação do caldo bacteriano pela técnica de inoculação de

gotas de 20 µL em placas de Petry contendo o meio ágar LM adicionado de 1,

2, e 3 % de Cloreto de Sódio (NaCl). Após sete dias de incubação em estufa a

28ºC, os isolados que cresceram na respectiva concentração de NaCl foram

considerados resistentes.

3.4 Reação de pH dos rizóbios em meio de cultura

A produção de compostos alcalinos ou ácidos pelos rizóbios foi

avaliada pela inoculação das bactérias em meio ágar LM (Vincent, 1970) com

Azul de Bromotimol (25mg/L). Após sete dias de incubação a 28°C, a mudança

da coloração do meio de verde para amarelo indica a acidificação do meio, já a

alteração para o azul, indica a alcalinização do mesmo (Somasegaran &

Hoben, 1994).

3.5 Produção de auxinas equivalentes ao ácido-indol-acético

(AIA)

Para avaliar-se a capacidade dos rizóbios de produzir auxinas

equivalentes ao AIA, adaptou-se a metodologia proposta por Asghar et al.

(2002). Os isolados bacterianos preservados foram cultivados em meio líquido

LM com adição de triptofano (50 mg/L), por três dias a 28ºC sob agitação de

120 rpm. Após este período, em microplacas de poliestireno de 96 poços, 50

µL do caldo bacteriano crescido foram adicionados a 50 µL da solução de

Salkowski (2 mL de FeCl

0,5M + 98 mL de HClO

35%). Esta metodologia

baseia-se na oxidação dos compostos indólicos por sais férricos, pois em pH

2,6 o ferro decompõem os compostos indólicos lentamente.

As suspensões obtidas pela mistura do reagente de Salkowski e o

caldo bacteriano foram incubadas à temperatura ambiente por uma hora. As

reações que mudaram a coloração de amarelo claro para rosa foram um

indicativo da existência de auxinas semelhantes ao AIA, assim o rizóbio da

reação foi considerado produtor de AIA.

3.6 Produção de Sideróforos

Para avaliação da capacidade de produção de sideróforos, os

rizóbios foram inoculados em meio líquido de Wood & Cooper (Wood &

Cooper, 1985) adaptado por Sá (2001) e mantidos por três dias a 28ºC sob

agitação de 120 rpm. Após este período, 50 µL do caldo bacteriano obtido foi

adicionado a 50 µL da solução descrita por Schwynn & Neilands (1987) de

Chrome Azurol S (CAS). Esta metodologia baseia-se na imobilização do Ferro

no complexo CAS + Fe

+ brometo de hexadeciltrimetilamônio. Com a

remoção do ferro do complexo pelo sideróforo, a solução muda do azul para o

amarelo e o rizóbio é considerado produtor de sideróforo.

3.7 Determinação da compatibilidade simbiótica entre os

rizóbios e plantas de D. incanum, Lotus spp. e Glycine max

A compatibilidade simbiótica entre os rizóbios e as plantas de D.

incanum, Lotus corniculatus, L. subbiflorus, L. glaber, L. uliginosus e Glycine

max foi determinada pela inoculação dos rizóbios nas seis espécies citadas

acima. Para isto, sementes das plantas estudadas foram desinfestadas

segundo a metodologia já descrita e pré-germinadas em papel filtro. Em

seguida, as sementes pré-germinadas foram colocadas em tubos de ensaio de

250 mm de comprimento e 24 mm de diâmetro, contendo uma tira de papel

filtro embebida parcialmente em solução nutritiva isenta de nitrogênio (Sarruge,

1975) esterelizados. Em cada tubo, as sementes foram inoculadas com 1 mL

de caldo LM contendo o rizóbio a ser avaliado, crescido por três dias a 28ºC

sob agitação de 120 rpm. Os tubos foram colocados em um lampadário com

fotoperíodo de 12 horas a temperatura ambiente.

O desenvolvimento das plantas foi acompanhado diariamente com

a finalidade de avaliar a capacidade de formação de nódulos do isolado na

respectiva planta após 60 dias da inoculação. Os rizóbios que formaram

nódulos nas plantas foram considerados como compatíveis com a respectiva

planta. Como indicativo de que o rizóbio inoculado é um possível fixador de

nitrogênio, considerou-se a persistência da cor verde escuro na parte aérea

das plantas inoculadas em comparação com as testemunhas não inoculadas e

com adição de nitrogênio.

3.8 Avaliação da eficiência na fixação simbiótica do nitrogênio

dos rizóbios em plantas de L. corniculatus e D. Incanum.

Foi realizado um experimento em casa de vegetação utilizando

vasos do tipo Leonard (Vincent, 1970) contendo uma mistura de vermiculita

com areia estéril (na proporção 2:1) na parte superior dos vasos e, solução

nutritiva isenta de nitrogênio (Sarruge, 1975) na parte inferior do mesmo.

Sementes de L. corniculatus cv. São Gabriel e D. incanum foram desinfestadas

com uma lavagem por 30 segundos com etanol (70%), uma com hipoclorito

(1%) seguida de cinco lavagens com água destilada e esterilizada, pré-

germinadas e plantadas nos vasos. Logos após, cada tratamento foi inoculado

com um isolado de rizóbio compatível com a planta crescido em cinco mL de

caldo bacteriano LM por três dias sob agitação de 120 rpm. Além dos

tratamentos inoculados foram utilizados dois tratamentos controles, um sem

adição de nitrogênio e outro com adição de 72 mg de nitrato de amônio

(NH

) divididos em 26 doses ao longo do experimento. Para L.

corniculatus, além dos tratamentos já citados foi avaliado a estirpe SEMIA 816

recomendada para produção de inoculantes para esta planta.

O experimento foi conduzido por um período de 90 dias em

delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições. Após a colheita

das plantas, a parte aérea das mesmas foi separada do sistema radicular com

corte próximo a base do caule. As raízes foram lavadas e estas amostras

acondicionadas em sacos de papel etiquetados e colocados em estufa para

secagem a 60ºC até atingir peso constante. Após foi determinada a massa

seca da raiz e parte aérea.

Os nódulos de D. incanum foram contados e secos juntamente com

o sistema radicular. Já os nódulos das plantas de L. corniculatus foram

destacados contados e colocados separadamente do sistema radicular em

estufa com temperatura de 60ºC para determinação do peso seco. O teor de

nitrogênio total na parte aérea das plantas de L. corniculatus foi determinado

pela metodologia semi micro Kjeldhal descrita por Tedesco et al. (1995).

Devido à pouca quantidade de massa seca obtida com as plantas de D.

incanum, o teor de nitrogênio total da parte aérea não foi determinado.

Os dados referentes ao número e à massa seca de nódulos, à

massa seca da raíz e parte aérea e ao nitrogênio total da parte aérea foram

submetidos à análise de variância (ANOVA) pelo programa estatístico SISVAR

(2003), e as médias foram comparadas pelo teste de Scot Knott ao nível de 5%

de probabilidade. O índice de eficiência relativa (Brockwell et al., 1966), que

mede a acumulação de massa seca dos tratamentos inoculados em relação

aos tratamentos controles com e sem adição de nitrogênio. Este índice foi

calculado através da fórmula descrita abaixo.

IER = __(MS total tratamento – MS do T-N)_ x 100

(MS do T+N – MS do T-N)

onde:

MS total tratamento = Massa seca total da planta do tratamento

inoculado;

MS do T-N = Massa seca total do tratamento controle sem N;

MS do T+N = Massa seca total do tratamento controle com N.

3.9 Caracterização genética dos Rizóbios

Vinte e um isolados e quinze estirpes de rizóbios estudados neste

trabalho quanto a compatibilidade simbiótica em plantas de L. corniculatus, L.

glaber, L. uliginosus, L. subbiflorus e Glycine max foram caracterizados

geneticamente pelo método de amplificação do DNA genômico utilizando-se a

técnica de PCR.

O DNA genômico dos rizóbios foi extraído pelo método de extração

de DNA com clorofórmio. Este procedimento inicia-se a partir de uma cultura de

células multiplicadas em meio LM por 72 horas a 28°C sob agitação de 120

rpm. Uma alíquota de 1,5 mL das culturas foi transferida para tubos de

microcentrífuga esterilizados em autoclave por 20 minutos, os tubos foram

centrifugados por três minutos a 12.000 rpm. A suspensão de células obtida foi

submetida a uma lavagem com uma solução estéril de cloreto de sódio (NaCl)

1%. Logo após, as células foram homogeneizadas no vórtex em 700 µL de

TES (Apêndice 1) e novamente centrifugadas por dois minutos a 12.000rpm.

Os sobrenadantes foram desprezados e as suspensões de células foram

homogeneizadas em 500 µL de TE1 (Apêndice 1) e 25 µL de lisozima

(20mg/mL) e posteriormente incubados a 37ºC por uma hora. Transcorrido este

período, foi adicionado 100 µL de SDS 20% a 60ºC e 5 µL de proteinase K (20

mg/mL) a cada microtubo e incubados a 60ºC por 15 minutos. Logo após, foi

adicionado às misturas 600 µL de clorofórmio álcool isoamílico (24:1). As

suspensões foram agitadas no vórtex e centrifugadas por três minutos a 10.000

rpm. Os sobrenadantes foram transferidos para microtubos novos e adicionado

8 µL de NaCl 5M juntamente com 500 µL de isopropanol gelado. As misturas

ficaram por 10 minutos no gelo e posteriormente centrifugadas por 15 minutos

a 12000 rpm. Os pellets obtidos foram lavados com etanol 70% e foram secos

por 1 hora à temperatura ambiente e finalmente ressuspendidos em 50 µL de

TE2 (Apêndice 1).

3.9.1 Amplificação do DNA genômico pela técnica de Rep-PCR

pelo oligonucleotídeo iniciador BOX.

Os DNAs genômicos dos isolados de rizóbios e das estirpes

recomendadas foram caracterizados pela técnica de Rep-PCR que amplifica

regiões conservadas e repetitivas do DNA cromossômico (Versalovic et al.,

1994). O oligonucleotídeo iniciador utilizado para as reações foi o seguinte:

BOX A1 - (5’ –CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3’).

As reações de Rep-PCR foram realizadas de acordo com o

protocolo de Versalovic et al. (1994) (Apêndice 2 ítem 8.1) para um volume

total de 25L. As condições empregadas para a programação do termociclador

estão descritas no Apêndice 2 ítem 8.2.

3.9.2 Análise dos produtos da amplificação

Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel

de agarose 1% em cuba horizontal com tampão TBE 0,5X (Sambrook et al.,

2001). Como padrão de peso molecular foi utilizado o DNA do fago lambda

clivado com as endonucleases de restrição EcoRI e HindIII. Os géis foram

corados em solução de brometo de etídio (1 µg mL

-1

). A visualização dos

fragmentos foi realizada em transiluminador de luz ultravioleta e documentada

com equipamento de fotografia digital Kodak G2200.

O perfil de bandas no gel foi transformado em uma matriz binária,

utilizando-se o programa GelPro Analyser 3.1, onde 0 (zero) indicava a

ausência de banda e 1 (um) a presença. A similaridade genética entre os

isolados foi medida pelo coeficiente de Jaccard (i, j) que não considera as

similaridades negativas. As matrizes foram analisadas em conjunto pelo

programa PAST (Hammer et al., 2007) e os dendrogramas obtidos pelo método

de agrupamento UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic

Averages).

4. RESULTADOS

Neste trabalho foram obtidos a partir de nódulos radiculares de

plantas de Desmodium incanun 11 isolados de rizóbios que posteriormente

foram caracterizados juntamente com os outros 24 isolados de rizóbios de

Lotus spp. e 17 estirpes recomendadas para a produção de inoculantes nas

plantas estudadas.

4.1 Características morfológicas dos Rizóbios

Na tabela 2 são mostradas as características das colônias dos 35

isolados estudados neste trabalho juntamente com as estirpes EEL 698, EEL

8084 e U510. Nota-se que todos os rizóbios isolados de L. corniculatus, L.

glaber, L. uliginosus e L. subiflorus apresentaram o crescimento rápido, com

um tempo de aparecimento de colônias variando de dois a três dias.

Resultados diferentes foram obtidos por Brose (1992), Gault et al. (1994),

Jarvis et al. (1997), Barrientos et al. (2002) e Tonon (2008) que afirmaram que

a simbiose destas quatro espécies de Lotus se dá com rizóbios de crescimento

intermediário (Mesorhizobium loti) e lento (Bradyrhizobium sp.).

TABELA 2: Características das colônias de rizóbios avaliadas neste trabalho:

tempo de aparecimento de colônias de 1 mm, diâmetro da colônia após sete

dias de crescimento, densidade óptica em meio de cultura Agar LM com

vermelho congo e reação de pH em meio ágar LM com azul de bromotimol.

Rizóbio

Tempo

(dias)

Diâmetro

(mm)

Densidade

óptica

reação de

UFRGS Lc 10

Translúcida

Ácido

UFRGS Lc 14

Translúcida

Ácido

UFRGS Lc 22

Translúcida

Ácido

UFRGS Lc 36

Translúcida

Ácido

UFRGS Lc 322

Translúcida

Ácido

UFRGS Lc 336

Opaca

Ácido

UFRGS Lc 340

Translúcida

Ácido

EEL 698

Translúcida

Ácido

EEL 8084

Translúcida

Ácido

U 510

Translúcida

Ácido

UFRGS Lg 109

Translúcida

Ácido

UFRGS Lg 111

Opaca

Ácido

UFRGS Lu 2

Opaca

Ácido

UFRGS Lu 8

Opaca

Ácido

UFRGS Lu 9

Opaca

Ácido

UFRGS Lu 10

Opaca

Ácido

UFRGS Lu 12

Opaca

Alcalino

UFRGS Lu 13

Opaca

Ácido

UFRGS Lu 14

Opaca

Ácido

UFRGS Lu 19

Opaca

Ácido

UFRGS Ls 1

Opaca

Ácido

UFRGS Ls 8

Opaca

Ácido

Continuação: TABELA 2: Características das colônias de rizóbios

avaliadas neste trabalho: tempo de aparecimento de colônias de 1

mm, diâmetro da colônia após sete dias de crescimento, densidade

óptica em meio de cultura Agar LM com vermelho congo e reação de

pH em meio ágar LM com azul de bromotimol.

Rizóbio

Tempo

(dias)

Diâmetro

(mm)

Densidade

óptica

reação de

UFRGS Ls 22

Opaca

Ácido

UFRGS Ls 28

Opaca

Ácido

UFRGS Ls 36

Opaca

Ácido

UFRGS Ls 59

Opaca

Ácido

UFRGS Ls 62

Opaca

Ácido

UFRGS Di 1

Opaca

Neutro

UFRGS Di 2

Opaca

Alcalino

UFRGS Di 3

Opaca

Alcalino

UFRGS Di 4

Opaca

Neutro

UFRGS Di 5

Opaca

Ácido

UFRGS Di 6

Opaca

Ácido

UFRGS Di 7

Opaca

Alcalino

UFRGS Di 8

Opaca

Neutro

UFRGS Di 9

Opaca

Alcalino

UFRGS Di 10

Opaca

Ácido

UFRGS Di 11

Opaca

Neutro

Já os isolados de rizóbios de plantas de D. incanum apresentaram o

crescimento lento, com o tempo de aparecimento de colônias de

aproximadamente sete dias. A característica de crescimento lento tem sido

atribuída ao gênero Bradyrhizobium (Somasegaran & Hoben, 1994). Estes

resultados concordam com o trabalho de Gu et al. (2007) que mostraram que

os rizóbios simbiontes de Desmodium pertenciam ao gênero Bradyrhizobium.

4.2 Resistência ao choque salino em meio de cultura com 1, 2 e

3% de cloreto de sódio (NaCl).

Para que o processo de Fixação biológica do nitrogênio seja

eficiente faz-se necessário que sejam selecionadas estipes nativas adaptadas

às condições edafoclimáticas. Assim, pode-se obter um inoculante mais

competitivo capaz de se estabelecer mais rapidamente no solo e tolerar melhor

condições adversas do ambiente como a salinidade do solo (Medeiros 2007).

O resultado da avaliação da resistência dos isolados de rizóbios ao

choque salino em concentrações de 1, 2 e 3 % de cloreto de sódio (NaCl) pode

ser observado na Tabela 3. Todos os isolados bacterianos estudados neste

trabalho foram capazes de crescer em meio de cultura ágar LM com adição de

1% de NaCl, mas, somente os isolados UFRGS Ls 1 e UFRGS Lu 2 cresceram

na concentração de 2% e, nenhum isolado bacteriano cresceu em 3%. No

estudo realizado por Freitas et al. (2007) sobre a diversidade dos rizóbios de

solos salinos de Pernambuco (Brasil), os rizóbios estudados cresciam de

maneira normal em concentração de até 1,2% de NaCl. A partir desta

concentração estes rizóbios começaram a apresentar resistência com

decréscimo significativo no crescimento bacteriano. Esta resistência a

concentrações de cloreto de sódio acima de 1,2% também foi observada por

Hua et al. (1982), Martins et al., (1997), Ohwada et al. (1998), Medeiros et al.

(2007) e Singh et al. (2008).

TABELA 3: Resistência dos Rizóbios ao choque salino em meio de cultura LM

com concentrações de cloreto de sódio de 1, 2 e 3%.

Concentração de

NaCl

Concentração de

NaCl

Rizóbios

UFRGS Lc 10

UFRGS Lu 19

UFRGS Lc 14

UFRGS Ls 1

UFRGS Lc 22

UFRGS Ls 8

UFRGS Lc 36

UFRGS Ls 22

UFRGS Lc 322

UFRGS Ls 28

UFRGS Lc 336

UFRGS Ls 36

UFRGS Lc 340

UFRGS Ls 59

EEL 698

UFRGS Ls 62

EEL 8084

UFRGS Di 1

U 510

UFRGS Di 2

UFRGS Lg 109

UFRGS Di 3

UFRGS Lg 111

UFRGS Di 4

UFRGS Lu 2

UFRGS Di 5

UFRGS Lu 8

UFRGS Di 6

UFRGS Lu 9

UFRGS Di 7

UFRGS Lu 10

UFRGS Di 8

UFRGS Lu 12

UFRGS Di 9

UFRGS Lu 13

UFRGS Di 10

UFRGS Lu 14

UFRGS Di 11

+: Isolado que cresceu na concentração de sal analisada (resistente); -: Isolado

que não cresceu na concentração de sal analisada (sensível)

4.3 Produção de auxinas e sideróforos pelos rizóbios

Entre os rizóbios estudados neste trabalho, somente cinco isolados

produziram auxinas, o que corresponde a aproximadamente 18% do total dos

isolados de rizóbios estudados (Tabela 4). A produção deste fito-hormônio

pelos rizóbios pode promover o crescimento das plantas, melhorando o

desenvolvimento e o rendimento destas (Osório Filho, 2009). Trabalhos

realizados por Biswas et al. (2000), Schlindwein et al. (2008) e Vargas et al.

(2009) mostraram que rizóbios produtores de auxinas, podem melhorar o

desenvolvimento de plantas de arroz, alface e trevo branco respectivamente.

A Tabela 4 mostra que 31% dos isolados apresentaram a

capacidade de produzir sideróforos. Sideróforos são compostos orgânicos de

baixo peso molecular que possuem alta afinidade por Fe

, sendo produzidos

por diversos microrganismos sob condições de indisponibilidade deste no

ambiemte, tornando-o disponível para a planta (Silveira, 2009).

Uma das maneiras de contornar o problema de escassez de ferro

no ambiente é o uso de rizobactérias produtoras de sideróforos via inoculação.

Muitos trabalhos realizados mostram grande variabilidade na quantidade de

rizóbios estudados produtores de sideróforos. Entre estes estão os estudos

realizados por Antoun & Beauchamp (1998) que verificaram que 86% dos

isolados de Rhizobium leguminosarum estudados em seu trabalho produziram

sideróforos. Já os trabalhos realizados por Derylo et al. (1994) e Vargas et al.

(2009) mostraram que somente 10% dos 84 isolados de rizóbios estudados e

8% dos 252 rizóbios avaliados produziram sideróforos respectivamente.

TABELA 4: Produção de ácido indol acético (AIA) e sideróforos pelos rizóbios

estudados.

Isolado

Auxinas

Sideróforo

Isolado

Auxinas

Sideróforo

UFRGS Lc 10

UFRGS Lu 19

UFRGS Lc 14

UFRGS Ls 1

UFRGS Lc 22

UFRGS Ls 8

UFRGS Lc 36

UFRGS Ls 22

UFRGS Lc 322

UFRGS Ls 28

UFRGS Lc 336

UFRGS Ls 36

UFRGS Lc 340

UFRGS Ls 59

EEL 698

UFRGS Ls 62

EEL 8084

UFRGS Di 1

U 510

UFRGS Di 2

UFRGS Lg 109

UFRGS Di 3

UFRGS Lg 111

UFRGS Di 4

UFRGS Lu 2

UFRGS Di 5

UFRGS Lu 8

UFRGS Di 6

UFRGS Lu 9

UFRGS Di 7

UFRGS Lu 10

UFRGS Di 8

UFRGS Lu 12

UFRGS Di 9

UFRGS Lu 13

UFRGS Di 10

UFRGS Lu 14

UFRGS Di 11

+: Produtor de ácido indol-acético e ou sideróforos; -: Não produtor de ácido

indol-acético e sideróforos.

4.4 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos rizóbios com

as plantas estudadas

A Tabela 5 mostra a inoculação dos 11 isolados de rizóbios obtidos

de nódulos de D. incanum em plantas de D. incanum, L. corniculatus, L.

uliginosus, L. glaber, L. subbiflorus e Glycine max (FEPAGRO RS 10).

Somente o isolado UFRGS Di 9 e a estirpe SEMIA 6028 induziram a formação

de nódulos em mais de uma planta: com D. incanum e L. corniculatus. No

entanto, esta simbiose não foi eficiente, pois o desenvolvimento e a coloração

da parte aérea das plantas, em comparação com as do tratamento controle

sem inoculação e com adição de nitrogênio, mostraram sinais de deficiência de

nitrogênio.

As demais estirpes de rizóbios estudadas neste trabalho SEMIA

6208 e SEMIA 6209 recomendadas para a produção de inoculantes para D.

ovalifolium, e SEMIA 656 recomendada para D. incanum não formaram

nódulos em nenhuma das espécies de plantas estudadas, o que sugere que

estas bactérias tem uma alta especificidade pela planta hospedeira.

As plantas de L. uliginosus, L. glaber, L. subbiflorus e Glycine max

(FEPAGRO RS 10) não apresentaram nodulação quando inoculadas com os

isolados e as estirpes de rizóbios de D. incanum. Este fato sugere que não

existe compatibilidade entre os rizóbios e estas plantas. Esta incompatibilidade

pode ser favorável ao desenvolvimento destas plantas, pois a formação de

simbiose ineficiente com rizóbios nativos prejudica o desenvolvimento destas

plantas nas áreas em que estas são introduzidas (Fernandes et al., 2003).

TABELA 5: Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e fixação

simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes e isolados de rizóbios de plantas de D.

incanum quando inoculados em plantas de D. incanum, L.corniculatus, L.

uliginosus, L. glaber, L. subbiflorus e Glycine max.

Leguminosas hospedeiras

incanum

Lotus

corniculatus

Lotus

uliginosus

Lotus

subbiflorus

Glycine

max

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Estirpes

SEMIA 6208

SEMIA 6209

SEMIA 6028

SEMIA 656

Isolados de rizóbios de plantas de D. incanum

UFRGS Di 1

UFRGS Di 2

UFRGS Di 3

UFRGS Di 4

UFRGS Di 5

UFRGS Di 6

UFRGS Di 7

UFRGS Di 8

UFRGS Di 9

UFRGS Di 10

UFRGS Di 11

+: isolado Formador de nódulos e ou fixador de nitrogênio; -: Isolado não

formador de nódulos e ou não fixador de nitrogênio.

Os resultados da inoculação dos rizóbios isolados de plantas de L.

corniculatus em plantas de D. incanum, L. corniculatus e L. uliginosus podem

ser observados na Tabela 6. Estes isolados e estirpes quando inoculados em

plantas de L. uliginosus somente quatro rizóbios induziram a formação de

nódulos nesta planta, o que corresponde a 40% dos rizóbios testados, mas

somente um destes isolados apresentaram a capacidade de fixar nitrogênio

simbioticamente. O trabalho realizado por Baraibar et al. (1999) mostrou

resultados diferentes, pois foi observado que os rizóbios isolados de L.

corniculatus não induziam a formação de nódulos em plantas de L. uliginosus

mas sim, somente com L. glaber.

Quando estes rizóbios foram inoculados em plantas de D. incanum,

apenas o isolado UFRGS Lc 336 foi capaz de induzir a formação de nódulos

(Tabela 6). Mas este isolado não foi eficiente na fixação biológica do nitrogênio,

pois o desenvolvimento da parte aérea das plantas mostrou-se prejudicado em

relação ao tratamento não inoculado e com adição de nitrogênio. Estes

resultados mostram a existência de baixa compatibilidade simbiótica entre os

rizóbios nativos simbiontes de plantas de L. corniculatus e as plantas de D.

incanum, indicando assim, que um grupo pouco diverso de rizóbios que possui

a capacidade de induzir nodulação nestas plantas.

As estirpes SEMIA 816, SEMIA 806 e SEMIA 808 recomendadas

para a produção de inoculantes no Brasil e U 510 recomendada no Uruguai

para inoculação em plantas de L. corniculatus, mostraram-se altamente

específicas, estabelecendo simbiose somente com as plantas em que são

recomendadas.

TABELA 6: Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e fixação

simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes e rizóbios isolados de plantas de L.

corniculatus quando inoculados em plantas de D. incanum, L. corniculatus e L.

uliginosus.

Leguminosas hospedeiras

Desmodium

incanum

Lotus

corniculatus

Lotus

uliginosus

Rizóbios

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Estirpes

U510

SEMIA 816

SEMIA 806

SEMIA 808

Isolados de rizóbios de L. corniculatus

UFRGS Lc10

UFRGS Lc14

UFRGS Lc 22

UFRGS Lc 36

UFRGS Lc 269

UFRGS Lc 322

UFRGS Lc 336

UFRGS Lc 340

+: isolado simbionte ou fixador de nitrogênio; -: Isolado não simbionte ou não

fixador de nitrogênio.

Os isolados de rizóbios de plantas L. uliginosus foram os menos

específicos, pois induziram a formação de nódulos nas quatro espécies de

Lotus e em D. incanum estudadas neste trabalho (Tabela 7).

TABELA 7: Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e fixação

simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes e rizóbios isolados de plantas de L.

uliginosus quando inoculados em plantas de D. incanum, L. corniculatus, L.

uliginosus, L. subbiflorus e L. glaber.

Leguminosas Hospedeiras

Desmodium

incanum

Lotus

corniculatus

Lotus

uliginosus

Lotus

subbiflorus

Lotus

glaber

Rizóbio

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Estirpes

EEL8084

SEMIA 822

Isolados de rizóbios de L. uliginosus

UFRGS Lu 2

UFRGS Lu 8

UFRGS Lu 9

UFRGS Lu 10

UFRGS Lu 12

UFRGS Lu 13

UFRGS Lu 14

UFRGS Lu 19

+: Isolado simbionte ou fixador nitrogênio; -: Isolado não-simbionte ou não

fixador de nitrogênio.

Sete isolados de rizóbios de L. uliginosus apresentaram a

capacidade de realizar simbiose com plantas de D. incanum (90%), sete em

plantas de L. corniculatus (90%), oito em plantas de L. subbiflorus (100%) e

sete com plantas de L. glaber (90%). Esta simbiose foi eficiente, pois a maioria

das plantas inoculadas, que estabeleceram simbiose com o isolado de rizóbio,

apresentou o desenvolvimento e a coloração da parte aérea semelhante a

testemunha nitrogenada e sem inoculação, podendo assim, ser um isolado de

rizóbio fixador de nitrogênio para a respectiva planta.

Os isolados de rizóbios UFRGS Lu 2, UFRGS Lu 9, UFRGS Lu 10,

UFRGS Lu 12 e UFRGS Lu 13 mostraram-se inespecíficos, pois foram capazes

de induzir a formação de nódulos em D. incanum e nas quatro espécie de

Lotus estudadas. Destacando o isolado UFRGS Lu 2 que além de formar

nódulos fixou nitrogênio eficientemente nestas plantas. Entre as estirpes

recomendadas para L. uliginosus testadas, a SEMIA 822 foi capaz de

estabelecer simbiose na planta em que esta é recomendada. E a estirpe EEL

8084, da estação experimental de Lages (SC), induziu a formação de nódulos e

fixou nitrogênio em plantas de L. corniculatus e L. uliginosus.

Os resultados sobre a inoculação dos rizóbios de L. subbiflorus em

plantas de D. incanum, L. corniculatus, L. uliginosus, L. subbiflorus e L. glaber

podem ser visualizados na Tabela 8. Todos os rizóbios isolados de plantas de

L. subbiflorus e a estirpe EEL 698 induziram a formação de nódulos radiculares

e fixar nitrogênio em simbiose com as plantas de D. incanum.

Os isolados de rizóbios UFRGS Ls 1 e UFRGS Ls 59, apresentaram

baixa especificidade pela planta hospedeira, pois induziram a formação de

nódulos em D. incanum e nas quatro espécies de Lotus estudadas (Tabela 8).

Mas estes isolados não fixaram nitrogênio para todas as plantas em que foram

inoculados. O isolado de rizóbio UFRGS Ls 1 foi ineficaz em plantas de L.

glaber e o rizóbio UFRGS Ls 59 fixou o nitrogênio atmosférico somente em

plantas de D. incanum.

TABELA 8: Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e fixação

simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes e rizóbios isolados de plantas de L.

subbiflorus quando inoculados em plantas de D. incanum, L. corniculatus, L.

uliginosus, L. subbiflorus e L. glaber.

Leguminosas Hospedeiras

incanum

Lotus

corniculatus

Lotus

uliginosus

Lotus

subbiflorus

Lotus

Glaber

Rizóbio

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Estirpes

EEL 698

SEMIA 848

Isolados de rizóbios de L. subbiflorus

UFRGS Ls 1

UFRGS Ls 8

UFRGS Ls 22

UFRGS Ls 28

UFRGS Ls 36

UFRGS Ls 59

UFRGS Ls 62

NA: Isolado não testado na referida planta; +: isolado simbionte ou fixador de

nitrogênio; -: isolado não-simbionte ou não fixador de nitrogênio.

A estirpe recomendada para inoculação em plantas de L. subbiflorus

SEMIA 848 estabeleceu simbiose eficiente somente com as plantas em que

são recomendadas, sugerindo alta especificidade entre planta hospedeira-

rizóbio.

Em plantas de L. corniculatus, aproximadamente 70% dos isolados

de rizóbios de L. subbiflorus estudados induziram a formação de nódulos, mas

somente o isolado UFRGS Ls 1 e a estirpe EEL 698 fixaram nitrogênio nesta

planta (Tabela 8). Em plantas de L. glaber, 42% destes isolados induziram a

formação de nódulos, mas nenhum fixou nitrogênio atmosférico. Tonon (2008)

também mostrou que poucos dos rizóbios isolados de L. subbiflorus estudados

em seu trabalho estabeleceram simbiose eficiente com plantas de L. glaber.

Os resultados obtidos com a inoculação dos rizóbios isolados de

plantas de L. glaber em plantas de D. incanum, L. corniculatus, L. uliginosus, L.

subbiflorus e L. glaber são mostrados na Tabela 9. Somente dois isolados e

uma estirpe desta simbiontes desta espécie foram inoculadas nas plantas

estudadas. Estes isolados de rizóbios apresentaram a capacidade de realizar

simbiose eficiente nas plantas em que foram isolados e em plantas de L.

uliginosus.

TABELA 9: Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e fixação

simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes e rizóbios isolados de plantas de L.

glaber quando inoculados em plantas de D. incanum, L. corniculatus, L.

uliginosus, L. subbiflorus e L. glaber.

Leguminosas Hospedeiras

Desmodium

incanum

Lotus

corniculatus

Lotus

uliginosus

Lotus

subbiflorus

Lotus

glaber

Rizóbio

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Estirpes

SEMIA 830

Isolados de rizóbios de L. glaber

UFRGS Lg 109

UFRGS Lg 111

NA: Isolado não testado na respectiva planta; +: isolado simbionte ou fixador

de nitrogênio; -: isolado não-simbionte ou não fixador de nitrogênio.

Devido ao baixo número de rizóbios de L. glaber estudados, não foi

possível fazer conclusões mais abrangentes sobre estes. Contudo, Hernández

et al. (2005) supõem que os isolados de rizóbios de plantas de L. glaber

estabeleceriam simbiose também com plantas de L. corniculatus, o que

contraria os resultados obtidos neste trabalho, onde a simbiose foi formada

com plantas de L. uliginosus.

Devido ao alto número de isolados de rizóbios estudados neste

trabalho possuírem características do gênero Bradyrhizobium, a avaliação da

inoculação das estirpes liberadas para a produção de inoculantes para soja

(Glycine max) no Brasil também foi avaliada. Estas estirpes foram inoculadas

soja, D. incanum, L. corniculatus e L. subbiflorus, e os resultados desta

inoculação podem ser visualizados na Tabela 10.

TABELA 10: Avaliação da capacidade de induzir nodulação (Nod) e fixação

simbiótica de nitrogênio (Fix) de estirpes para soja (G. Max) quando inoculadas

em plantas de D. incanum, L. corniculatus e L. subbiflorus.

Leguminosas hospedeiras

Glycine

max

Desmodium

incanum

Lotus

corniculatus

Lotus

subbiflorus

Estirpes

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

Nod

Fix

SEMIA 587

SEMIA 5019

SEMIA 5079

SEMIA 5080

+: isolado simbionte ou fixador de nitrogênio; -: isolado não-simbionte ou não

fixador de nitrogênio.

Nota-se que as estirpes recomendadas para soja foram altamente

específicas, pois não induziram a formação de nódulos em nenhuma das

leguminosas forrageiras estudadas neste trabalho.

Com base nos resultados obtidos anteriormente, nota-se que com

exceção da estirpe recomendada para plantas de D. incanum SEMIA 6028, que

estabeleceu simbiose com plantas de D. incanum e L. corniculatus, as estirpes

SEMIA estudadas neste trabalho são específicas, já que, entre as plantas

estudadas, estas estirpes só realizaram simbiose com as plantas nas quais são

recomendadas. Algumas destas estirpes também foram estudadas por Tonon

(2008) que também mostrou alta especificidade pela planta hospedeira.

4.5 Avaliação da eficiência na fixação simbiótica do nitrogênio

dos rizóbios em plantas de L. corniculatus e D. incanum.

Em experimento em casa de vegetação com plantas de D. incanum

foram avaliados o número de nódulos, a massa seca das raízes e da parte

aérea das plantas (Tabela 11). O nitrogênio total acumulado na parte aérea não

foi calculado, pois a massa seca das plantas inoculadas não atingiu o peso

necessário para a realização dos testes.

As análises estatísticas do número de nódulos obtido nos

tratamentos mostraram três grupos com diferenças significativas. O primeiro

grupo, com a maior quantidade de nódulos, é formado pelos isolados UFRGS

Di 9 e UFRGS Di 11. O segundo grupo, é formado pelos isolados UFRGS Di 3,

UFRGS Di 4, UFRGS Di 5 e UFRGS Lu 2. E o terceiro grupo, com o menor

número de nódulos, estão os isolados UFRGS Di 2, UFRGS Ls 1, UFRGS Lu

13, UFRGS Lc 336 e a estirpe EEL 698.

TABELA 11: Número de nódulos, massa seca (MS) da raíz e da parte aérea

(PA) das plantas Desmodium incanum inoculadas com rizóbios e cultivadas em

casa de vegetação.

Tratamento

Num. de nódulos

MS da raíz (mg)

MS da PA (mg)

T + N

---

12,56 a

26,33 a

UFRGS Di 2

4,75 c

16 a

40,00 a

UFRGS Di 4

19,75 b

14,62 a

37,25 a

UFRGS Ls1

6,25 c

14,83 a

30,5 a

UFRGS Lu 13

5,25 c

20,50 a

27,00 a

EEL 698

6 c

16,87 a

33,00 a

UFRGS Lu 2

18,25 b

12,12 a

28,00 a

UFRGS Di 9

26 a

13,62 a

22,75 b

UFRGS Di 11

30 a

12,00 a

16,75 b

UFRGS Di 3

16,75 b

7,87 a

17,37 b

UFRGS Lc 336

6 c

11,00 a

17,75 b

UFRGS Di 5

15 b

9,75 a

20,00 b

UFRGS Di 8

16 b

11,17 a

20,33 b

T – N

---

8,56 a

15,22 b

Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente

pelo teste de Scott-Knott a 5%.

Estas análises mostraram que não houve diferenças significativas

nos resultados de massa seca das raizes. Já a análise dos resultados de

massa seca da parte aérea destas plantas separou os tratamentos em dois

grupos. O primeiro grupo, que obteve os melhores resultados, é formado pelos

tratamentos inoculados com os rizóbios UFRGS Ls 1, EEL 698, UFRGS Lu 2,

UFRGS Lu 13 e UFRGS Di 2 e UFRGS Di 4, no qual as plantas apresentaram

um bom desenvolvimento da parte aérea com massa seca semelhante à

testemunha nitrogenada, sendo um indicativo que a fixação biológica do

nitrogênio foi eficiente. O segundo grupo é formado pelos tratamentos

inoculados com os rizóbios UFRGS Di 3, UFRGS Di 5, UFRGS Di 8, UFRGS Di

9, UFRGS Di 11 e UFRGS Lc 336, que apresentaram o desenvolvimento e a

massa seca da parte aérea das plantas de D. incanum inoculadas semelhante

à testemunha sem adição de nitrogênio, indicando que a fixação biológica do

nitrogênio não foi eficiente.

Quanto à massa seca da parte aérea dos tratamentos inoculados

com os rizóbios do primeiro grupo, obteve-se uma média de 32,5 miligramas, já

o segundo grupo, obteve uma média de 18,6 miligramas. Estes números são

muito inferiores aos resultados obtidos por Rheinheimer et al. (1997) e Silva et

al. (2001) que, em experimento com vasos e solo, conduzido por um período

de 60 dias, obtiveram uma massa seca da parte aérea das plantas de

Desmodium superior a 2 gramas.

A maioria dos rizóbios isolados de plantas de D. incanum

(aproximadamente 70%) não foi eficiente na fixação biológica do nitrogênio

atmosférico nestas plantas, prejudicando o desenvolvimento da parte aérea em

relação à testemunha com adição de nitrogênio. Ainda assim, as plantas

inoculadas com o isolado UFRGS Di 2 obtiveram a maior massa seca da parte

aérea e a quantidade de nódulos muito pequena (Tabela 11). Uma pequena

quantidade de nódulos implica em um menor desgaste fisiológico da planta

para a formação destes, e ainda assim, sendo capaz de suprir o nitrogênio

necessário da planta inoculada. O contrário foi observado com as plantas

inoculadas com o isolado UFRGS Di 11, que apresentaram grande quantidade

de nódulos e a parte aérea destas plantas obtiveram um desenvolvimento

inferior.

O isolado UFRGS Lc 336 isolado de nódulos de plantas de L.

corniculatus não fixou o nitrogênio atmosférico eficientemente. Este isolado de

rizóbio já foi identificado anteriormente por Osório Filho (2009) como

pertencente á espécie Bradyrhizobium japonicum, concordando com o trabalho

realizado por Gu et al. (2007) que relatam que a maioria dos rizóbios

simbiontes de plantas de Desmodium pertenciam a este gênero bacteriano.

Na Tabela 12 são mostrados os resultados da produção de massa

seca da parte aérea e da raiz, massa seca e número de nódulos, nitrogênio

total acumulado e também a eficiência relativa da fixação biológica do

nitrogênio em relação à massa seca da parte aérea das plantas de L.

corniculatus cultivadas em experimento realizado em casa de vegetação.

Em relação ao número de nódulos radiculares formados nas plantas

de L. corniculatus observou-se o maior número foi obtido nas plantas

inoculadas com a estirpe SEMIA 816, seguido pelo tratamentos formados pelas

plantas inoculadas com a estirpe EEL 698 e com os isolados de rizóbios

UFRGS Lu 2, UFRGS Lu 13, UFRGS Ls 1. Já as plantas inoculadas com o

isolado UFRGS Lc 336 e UFRGS Di 9 foram as que apresentaram o menor

numero de nódulos (Tabela 12).

TABELA 12: Massa seca (MS) e número de nódulos, massa seca da raíz, da parte aérea por tratamento e nitrogênio (N) total

por planta de L. corniculatus inoculadas com os rizóbios e cultivadas em casa de vegetação e eficiência relativa da inoculação

dos rizóbios nestas plantas.

Tratamento

Num. de

nódulos

MS dos nódulos

(mg)

MS da raiz

(mg)

MS da Parte

aérea (mg)

N total por planta

(mg)

Eficiência

relativa

T+N

----

1065,5 a

1008,5 a

5,63 c

----

SEMIA 816

538,5 a

109,5 a

627,25 b

1120,25 a

14,22 a

115%

UFRGS Lu 2

280,5 b

83,5 b

335,25 c

992,75 a

12,53 a

103,1%

EEL 698

290,25 b

71,5 b

365 c

875 a

10,1 b

80,16%

UFRGS Lc 336

155 c

36 c

182,5 c

337,75 b

2,41 d

17,47%

UFRGS Ls 1

231 b

51,5 c

189,25 c

332,5 b

2,63 d

14,4%

UFRGS Lu 13

334 b

53,25 c

221 c

454,75 b

2,48 d

14,01%

UFRGS Di 9

143,75 c

40,75 c

292,25 c

265 b

1,31 d

8.40%

T- N

----

304,75 c

207,25 b

0,57 d

----

Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente pelo teste estatístico de Scott-Knott a 5%.

Ainda em relação á massa seca dos nódulos, a Tabela 12 mostra

que a média de nódulos dos tratamentos de L. corniculatus foi de 280 gerando

uma massa seca de aproximadamente 63 miligramas. Os resultados do

trabalho de Frizzo (2007), também com plantas de L. corniculatus, mostraram a

formação de em média 40 nódulos, com massa seca de 82 mg. A análise

destes resultados sugere que foram formados muitos nódulos pequenos e

ineficientes nas plantas inoculadas. Este fenômeno já foi observado

anteriormente em outros trabalhos com Brose (1992) em plantas de L.

corniculatus, Giongo (2003) em plantas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris l.),

Laguerre et al. (2003), Maâtallah et al. (2002) e Fontoura (2008) em plantas de

L. glaber e L. subbiflorus.

Dentre os rizóbios inoculados nas plantas de L. corniculatus

destaca-se estirpe liberada para a produção de inoculantes no Brasil SEMIA

816 com maior número e massa seca dos nódulos, 538.5 e 109.5 miligramas

respectivamente (Tabela 12). O isolado UFRGS Lc 336 foi o que o que obteve

os menores resultados de número e massa seca dos nódulos entre os isolados

analisados, com 143,75 e 40,75 miligramas respectivamente. Os resultados

obtidos por Barrientos et al. (2002) com isolados de rizóbios autóctones de

regiões do Chile, mostraram que media da quantidade de nódulos em plantas

de L. corniculatus muito inferior, sendo de aproximadamente de apenas dois

nódulos, sendo esta, ineficiente na fixação do nitrogênio para a planta.

Ainda na Tabela 12, observa-se que os rizóbios inoculados que

fixaram mais eficientemente o nitrogênio nas plantas de L. corniculatus foram a

estirpe SEMIA 816, liberada para a produção de inoculantes no Brasil, e o

isolado UFRGS Lu 2, obtido de plantas de L. uliginosus. Resultados

semelhantes foram obtidos por Frizzo (2007) onde a estirpe SEMIA 816 em

plantas de L. corniculatus, foi a mais eficiente na fixação simbiótica do

nitrogênio nestas plantas. Os tratamentos inoculados com os isolados UFRGS

Di 9, UFRGS Lc 336, UFRGS Lu 13 e UFRGS Ls 1 apresentaram as mais

baixos valores de nitrogênio acumulado na parte aérea das plantas, sendo

semelhantes ao obtido no tratamento controle não inoculado e sem adição de

nitrogênio, indicando que esta simbiose não foi eficiente

Os resultados de eficiência relativa da inoculação dos rizóbios em

plantas de L. corniculatus em relação á massa seca das plantas mostraram que

o melhor rizóbio testado foi a estirpe SEMIA 816 com 115% de eficiência na

fixação simbiótica do nitrogênio atmosférico, seguido pelo isolado de L.

uliginosus UFRGS Lu 2 com 103,1% e a estirpe EEL 698 com 80,16%. A

inoculação dos demais tratamentos mostrou-se ineficiente, pois estes geraram

uma eficiência inferior a 20%, destacando os rizóbios UFRGS Di 9, isolado de

plantas de D. incanum, e UFRGS Lc 336 que obtiveram eficiência de somente

8,4% e 17,4% respectivamente.

4.6 Análise da variabilidade dos isolados de rizóbios pela

técnica de Rep-PCR utilizando o oligonucleotídeo iniciador BOX A1

Neste trabalho a técnica de Rep-PCR BOX foi utilizada para

avaliação da diversidade genética dos rizóbios autóctones do Rio Grande do

Sul simbiontes de espécies as L. corniculattus, L. subbiflorus, L. uliginosus, L.

glaber, D. incanum e Glycine max e as estirpes recomendadas para estas

plantas.

O perfil eletroforético dos produtos de amplificação do DNA

genômico de 21 isolados e 15 estirpes estudadas podem ser visualizados nas

figuras 1 e 2. O tamanho dos fragmentos de DNA analisados no perfil

eletroforético dos produtos de amplificação variou entre 5000 até 200 pares de

bases, dependendo do isolado avaliado. Perfis eletroforéticos com semelhante

faixa de peso molecular dos fragmentos foram obtidos por Fontoura (2008) que

observaram que a faixa de variação dos produtos de amplificação dos rizóbios

simbiontes de plantas de L. corniculatus, L. uliginosus, L. glaber e L. subbiflorus

ficou entre 5.000 pb a 500 pb.

FIGURA 1: Foto do perfil eletroforético em gel de agarose dos fragmentos da

amplificação do DNA genômico por Rep–PCR BOX de 13 isolados e quatro

estirpes de rizóbios estudados neste trabalho.

FIGURA 2: Foto do perfil eletroforético em gel de agarose dos fragmentos da

amplificação do DNA genômico por Rep–PCR BOX de oito isolados e 11

estirpes de rizóbios estudados neste trabalho.

Gu et al. (2007) já demonstraram uma grande variabilidade dos

isolados e estirpes de rizóbios de Desmodium, utilizando-se de outra técnica de

avaliação da variabilidade: o PCR-RFLP. Neste mesmo trabalho, o

sequenciamento do DNA 16S dos rizóbios confirmaram que os isolados

pertenciam a gêneros distintos, entre eles vários Bradyrhizobium sp.

Os perfis mostram uma grande variabilidade entre os isolados no

que se refere ao peso molecular das bandas. Vale ressaltar que esta grande

variabilidade era esperada, já que os rizóbios estudados eram simbiontes de

seis espécies diferentes de plantas e ainda, possuírem características

morfológicas e de crescimento das colônias bem diferenciadas, como

mostrados nos resultados expressos anteriormente.

No trabalho desenvolvido por Fontoura (2008) com rizóbios isolados

de plantas da espécie L. subbiflorus, e Frizzo (2007) com plantas de L.

corniculatus, as técnicas de Rep-PCR BOX e Rep-PCR ERIC mostraram perfis

eletroforéticos bem distintos, gerando um dendograma de similaridade em

torno de 30% entre os rizóbios.

O dendograma gerado pelo perfil eletroforético obtido com o produto

da amplificação do DNA genômico pela técnica de Rep-PCR BOX é mostrado

na figura 3. Nota-se uma baixa similaridade entre os isolados de rizóbios

estudados, indicando poucos grupos com similaridade superior a 50%.

Nota-se que dois isolados de L. subbiflorus UFRGS Ls 8 e UFRGS

Ls 62 apresentaram 100% de similaridade por esta técnica de PCR, fato

ocorrido igualmente com as duas estirpes recomendadas para L. corniculatus

SEMIA 808 e SEMIA 806. Analisando a inoculação dos dois primeiros isolados

nota-se uma diferença no comportamento dos mesmos, pois o isolado UFRGS

Ls 62 foi capaz de estabelecer simbiose com plantas de L. corniculatus e o

isolado UFRGS Ls 8 não (Tabela 8).

Alguns isolados apresentaram semelhança superior a 80% entre si,

este é o caso do rizóbio UFRGS Di 9 e a estirpe SEMIA 830 recomendada para

produção de inoculantes em plantas de L. glaber , e os isolados UFRGS Lu 8 e

UFRGS Lu 13. O rizóbio UFRGS Di 7 foi o menos semelhante entre os isolados

estudados

FIGURA 3: Dendrograma de genotipagem de 36 estirpes e isolados de rizóbios

estudados neste trabalho. Agrupamento obtido por UPGMA, utilizando-se o

coeficiente de Jaccard, para perfil de bandas obtido a partir da PCR com o

oligonucleotídeo iniciador BOX A1.

O isolado e a estirpe que apresentaram melhor eficiência relativa na

fixação biológica do nitrogênio em plantas de L. corniculatus no experimento

realizado em casa de vegetação, UFRGS Lu 2 e SEMIA 816 (Mesorhizobium

loti (Toledo et al., 2009)), formaram um pequeno grupo de similaridade de

aproximadamente 50%. Já os isolados que não fixaram nitrogênio atmosférico

eficientemente em plantas de L. corniculatus UFRGS Lc 336, UFRGS Lu 13,

UFRGS Ls 1 E UFRGS Di 9 mostraram perfil eletroforético de bandas do DNA

completamente distintos, mostrando similaridade entre si de aproximadamente

30%.

As tabelas de inoculações dos rizóbios e as leguminosas forrageiras

demonstradas neste trabalho mostram uma grande diversidade no que se

relaciona a rizóbio - planta hospedeira, não sendo capaz de formar de grupos

de compatibilidade. O dendograma dos produtos de amplificação pela técnica

de Rep-PCR BOX ilustrado na figura 3 demonstra esta grande variabilidade

entre os isolados e estirpes analisadas, confirmando a inexistência de relação

entre a formação de grupos de inoculação e a variabilidade genética do DNA

total das bactérias.

5.CONCLUSÕES

Existem rizóbios autóctones dos solos do Rio Grande do Sul que

apresentam baixa especificidade hospedeira sendo capazes de formar

simbiose com plantas de D. incanum, L. corniculatus, L. subbiflorus, L. glaber e

L. uliginosus.

Os rizóbios autóctones dos solos do Rio Grande do sul isolados de

plantas de D. incanum apresentam alta especificidade hospedeira.

Os rizóbios estudados neste trabalho apresentam compatibilidade

simbiótica em diferentes hospedeiros, dificultando o estabelecimento de grupos

de compatibilidade hospedeira.

Os rizóbios estudados neste trabalho são sensíveis a salinidade.

A técnica de REP-PCR com o oligonucleotídeo iniciador BOX A1

mostrou que existe variabilidade entre os rizóbios estudados, sendo estes,

diferentes das estirpes fornecidas pelas coleções de cultura.

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7. APÊNDICE 1

7.1. Meios de Cultura e Soluções utilizadas

7.1.1 Levedura Manitol (LM) (Vincent, 1970)

Manitol ......................................... 10 g

HPO

........................................ 0,5 g

MgSO

x 7H

O ............................. 0,2 g

NaCl ............................................. 0,1 g

Extrato de Levedura ..................... 0,4 g

Ágar .............................................. 15g

Água destilada ............................... 1L

pH da solução deve ser ajustado para 6,8.

Para a caracterização das colônia dos rizóbios adicionar 25mgL

-1

corante vermelho congo. E para ver a reação de pH no meio de cultura

adicionar o corante azul de bromotimol 25mgL

-1

7.1.2. Soluções para a extração de DNA

TE1: Tris 10mM e EDTA 25mM.

TE2: Tris 2mM e EDTA 25mM

TES: Tris 10mM, EDTA 25mM e NaCl 150mM.

7.1.3. Solução Nutritiva (Sarruge, 1974)

Macronutrientes

Estoque (g/L)

Quantidade do

estoque (mL) para 1 L

de Solução (100%)

KH2PO4

136,1

MgSO4 x 7H2O

246,4

CaCl2

111,1

KCl

74,6

NH4NO3

Fe EDTA

Micronutrientes

H3BO3

2,86

ZnCl2

0,1

CuSO4 x 5 H2O

0,04

Na2Mo4 x 4 H2O

0,02

O pH da solução foi ajustado em torno de 6,0.

Para elaboração de meio semi-sólido, acrescentar 7 g de ágar por

litro de meio. Nos experimentos é utilizado a solução nutritiva diluída a 25%

7.1.4. Meio de Cultura de Wood & Cooper adaptado por Sá

(2001)*

Composição

Concentração (µM)

CaCl

. 6H

1000

MgSO

. 7H

500

KCl

Fe EDTA**

HPO

MnSO

. 4H

ZnSO

. 7H

CuSO

. 5H

NaMoO

. 2 H

CoCl

. 6H

Glutamato de sódio***

1,8 g/L

Arabinose***

0,3 g/L

Galactose***

0,3 g/L

Tiamina HCl***

100 µg/L

Biotina***

250 µg/L

* Ajustou-se o pH do meio após a autoclavagem com HCl ou NaOH 10%

esterilizados por filtração; ** Fe EDTA foi substituído por FeCl3; *** Soluções

esterilizados por filtração e adicionadas ao meio após autoclavagem.

Foi adicionado 100mM de MOPS (ácido 3-[N-morpholine]

propanesulfonico), como agente tamponante.

8.APÊNDICE 2

8.1. Mistura de cada reação para o PCR com o oligonucleotídeo

iniciador BOX A 1-R

Componentes

BOX A 1-R

Tampão 10X *

MgCl

(50 mM)

1 mM

dNTP (10mM)

200 µM

Taq DNA pol (5 U µL

-1

)

1 U

DMSO

1 µL

Oligonucleotídeo iniciador

10 Pm

Água ultra pura

(*) Tampão 10X (500 mM KCl, 15 mM MgCl

, 100 mM Tris-HCl, pH 9,0)

8.2. Programação do termociclador para a amplificação do DNA

genômico no Rep-PCR BOX

Ciclo

Nº de repetições

Fases do ciclo

Hot start

95 °C - 7 min

Desnaturação

94 °C - 1 min

Anelamento

53 °C - 1 min

Extensão

65 °C - 8 min

Extensão final

65 °C - 16 min

Estoque

4 °C – α

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