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RESPOSTAS ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS
DE Pfaffia glomerata E Eucalyptus camaldulensis
AO CÁDMIO
TERESA CRISTINA LARA LANZA DE SÁ E MELO
MARQUES
2007
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Marques, Teresa Cristina Lara Lanza de Sá e Melo.
Respostas anatômicas e fisiológicas de Pfaffia glomerata e
Eucalyptus camaldulensis ao cádmio
/ Teresa Cristina Lara Lanza
de Sá e Melo Marques. – Lavras : UFLA, 2007.
103 p. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Lavras, 2007.
Orientador: Ângela Maria Soares.
Bibliografia.
1. Solução nutritiva. 2. Mecanismos de tolerância. 3.
Fitorremediação. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD –
634.9734
TERESA CRISTINA LARA LANZA DE SÁ E MELO MARQUES
RESPOSTAS ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS DE
Pfaffia glomerata E Eucalyptus camaldulensis AO
CÁDMIO
Tese apresentada à Universidade Federal de
Lavras como parte das exigências do curso
de doutorado em Agronomia, área de
concentração Fisiologia Vegetal, para a
obtenção do título de Doutor
Orientadora:
Profa. Dra. Ângela Maria Soares
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2007
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TERESA CRISTINA LARA LANZA DE SÁ E MELO MARQUES
RESPOSTAS ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS DE
Pfaffia glomerata E Eucalyptus camaldulensis AO
CÁDMIO
Tese apresentada à Universidade Federal de
Lavras como parte das exigências do curso
de doutorado em Agronomia, área de
concentração em Fisiologia Vegetal, para a
obtenção do título de Doutor
APROVADA em 7 de março de 2007
Prof. Dr. Luiz Edson Mota de Oliveira DBI
Prof. Dr. Nelson Delú Filho Faculdade de Filosofia,
Ciência e Letras de Boa
Esperança
Prof. Dr. Evaristo Mauro de Castro UFLA
Profa. Dra. Janice Guedes de Carvalho UFLA
Profa. Dra. Ângela Maria Soares
UFLA
(Orientador)
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Lavras (UFLA) e ao Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela oportunidade de
realização do doutorado e pela concessão da bolsa de estudos.
À Fundação de Pesquisa, Ensino e Extenção de Minas Gerais (Fapemig),
pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho.
À professora Angela Maria Soares, pelos ensinamentos transmitidos,
estímulo, entusiasmo na orientação e amizade.
Aos professores Luiz Edson Mota de Oliveira, Evaristo Mauro de
Castro, Janice Guedes de Carvalho e Nelson Delú Filho, pelas críticas e
sugestões ao texto da tese.
A Daniela Deitos Fries, pela orientação e colaboração na parte
bioquímica deste trabalho; a Marcelo Pedrosa Gomes e Giordane Martins, pelo
auxílio na parte anatômica.
Aos professores do Setor de Fisiologia Vegetal, pelos ensinamentos
transmitidos.
Aos funcionários do Setor de Fisiologia Vegetal, pela grande
colaboração para a execução deste trabalho e convivência.
Aos colegas de curso, especialmente Andrea Shan, pelo
companheirismo.
Aos meus pais, Maurício e Maria do Carmo, pelo carinho e apoio
constante.
A minha querida avó, Marta Lara (in memoriam), pela alegria e pelas
orações.
Ao meu marido, João José Marques, pelo amor e dedicação e aos meus
filhos, Maria Augusta, Antônio, Nuno e Fernando, que encheram nossa casa de
muita luz.
A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste
trabalho.
Ao Nosso Senhor Jesus Cristo e a Nossa Mãe e Senhora, pelas graças
recebidas para a realização deste trabalho.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS....................................................................................
.
LISTA DE TABELAS...................................................................................
.
RESUMO.......................................................................................................
.
i
iv
v
ABSTRACT ..................................................................................................
.
vi
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................
.
1
2 REFERENCIAL TEÓRICO.......................................................................
.
3
2.1 Metais pesados: toxicidade para os vegetais........................................... 3
2.2 A toxicidade de Cd no vegetal................................................................
2.3 Sistema antioxidante de resposta das plantas ao estresse como
mecanismo de tolerância a exposição ao Cd.................................................
4
10
3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................
.
17
3.1 Considerações gerais…………………………………...……………... 17
3.2 Características avaliadas………………………….……………………. 20
3.2.1 Matéria seca.......................................................................................... 20
3.2.2 Teor de clorofila................................................................................... 20
3.2.3 Teor de carotenóide.............................................................................. 21
3.2.4 Potencial hídrico................................................................................... 21
3.2.5 Teores de Cd e dos nutrientes............................................................... 22
3.2.6 Peroxidação de lipídeos........................................................................ 22
3.2.7 Atividade de enzimas antioxidantes..................................................... 23
3.2.7.1 Extração protéica............................................................................... 23
3.2.7.2 Teor protéico..................................................................................... 23
3.2.7.3 Atividade da catalase........................................................................ 23
3.2.7.4 Atividade da ascorbato peroxidase................................................... 24
3.2.7.5 Atividade da guaiacol peroxidase..................................................... 24
3.2.7.6 Atividade da glutationa redutase...................................................... 25
3.2.7.7 Atividade da superóxido dismutase..................................................
3.2.8 Avaliações anatômicas.........................................................................
25
26
3.2.9 Eficiência fotoquímica do fotossistema II…………………………… 26
3.3 Análise de dados...................................................................................... 27
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................
4.1 Experimento I: Respostas anatômicas e fisiológicas de P. glomerata
submetida a doses crescentes de Cd em solução nutritiva............................
4.1.1 Matéria seca e sintomas visuais............................................................
4.1.2 Teores de pigmentos.............................................................................
28
28
28
30
4.1.3 Potencial hídrico...................................................................................
4.1.4 Teores de Cd e o estado nutricional.....................................................
34
35
4.1.5 Estresse oxidativo induzido pelo Cd....................................................
4.1.6 Respostas anatômicas...........................................................................
4.2 Experimento II: Respostas morfofisiológicas do E. camaldulensis
submetido a doses crescentes de Cd em solução nutritiva............................
4.2.1 Matéria seca e sintomas visuais............................................................
4.2.2 Teores de pigmentos.............................................................................
4.2.3 Eficiência fotoquímica do fotossistema II............................................
4.2.4 Potencial hídrico...................................................................................
4.2.5 Teores de Cd e o estado nutricional.....................................................
4.2.6 Peroxidação de lipídios........................................................................
4.2.4 Respostas anatômicas...........................................................................
5 CONCLUSÕES .........................................................................................
45
57
60
60
63
66
68
69
78
80
87
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................
89
i
LISTA DE FIGURAS
Página
FIGURA 1 Produção de matéria seca de raízes e parte aérea de P.
glomerata submetida a doses de Cd, em solução
nutritiva, durante período de 20 dias............................
29
FIGURA 2 Sistema radicular de P. glomerata aos 16 dias após
indução do tratamento (DAT), na presença de doses
de Cd, em solução nutritiva….....................................
29
FIGURA 3 Parte aérea de P. glomerata aos 16 dias após indução
do tratamento (DAT), na presença de doses de Cd,
em solução nutritiva...............................................
30
FIGURA 4 Relação de clorofila a/b e teores de clorofila total em
plantas de P. glomerata, no 1º, 12º e 20º DAT,
submetidas a três doses de Cd, em solução nutritiva...
32
FIGURA 5 Teores de carotenóides (mg g
-1
MF) em folhas de P.
glomerata, no 1º, 12º e 20º DAT, submetidas a três
doses de Cd, em solução nutritiva…………………...
33
FIGURA 6 Potencial hídrico total (MPa) de plantas de P.
glomerata, no 1º, 12º e 20º DAT, submetidas a três
doses de Cd, em solução nutritiva…..........................
35
FIGURA 7 Teores de Cd (mg kg
-1
) nas raízes e parte aérea de P.
glomerata submetida a doses crescentes de Cd, em
solução nutritiva, durante período de 20 dias............
37
FIGURA 8 Teores de macronutrientes (g kg
-1
) nas raízes e parte
aérea de P. glomerata submetida a doses crescentes
de Cd, em solução nutritiva, durante período de 20
dias………………………………………………......
39
FIGURA 9 Teores de micronutrientes (mg kg
-1
) na raízes e parte
aérea de P. glomerata submetida a doses crescentes
de Cd, em solução nutritiva, durante período de 20
dias........................................................................
42
FIGURA 10 Peroxidação de lipídeos (nmol MDA g
-1
MF) em
folhas e raízes de P. glomerata, no 1º, 12º e 20º DAT,
submetidas a três doses de Cd, em solução
nutritiva...................................................................
46
FIGURA 11 Atividade da SOD (U mg
-1
proteína) em folhas e
raízes de P. glomerata, no 1º, 12º e 20º DAT,
ii
submetidas a três doses de Cd, em solução
nutritiva....................................................................
48
FIGURA 12
Atividade da CAT (μmol H
2
O
2
mg
-1
proteína min
-1
)
em folhas e raízes de P. glomerata, no 1º, 12º e 20º
DAT, submetidas a três doses de Cd, em solução
nutritiva..................................................................
50
FIGURA 13
Atividade da APX (μmol ascorbato mg
-1
proteína
min
-1
) em folhas e raízes de P. glomerata, no 1º, 12º
e 20º DAT, submetidas a três doses de Cd, em
solução nutritiva…………………………………….
52
FIGURA 14
Atividade da GPX (μmol guaiacol mg
-1
proteína min
-
1
) em folhas e raízes de P. glomerata, no 1º, 12º e 20º
DAT, submetidas a três doses de Cd, em solução
nutritiva.....................................................................
54
FIGURA 15
Atividade da GR (μmol NADPH mg
-1
proteína min
-1
)
em folhas e raízes de P. glomerata, no 1º, 12º e 20º
DAT, submetidas a três doses de Cd, em solução
nutritiva.....................................................................
56
FIGURA 16 Seção paradérmica da folha de P. glomerata
submetida a doses crescentes de Cd, em solução
nutritiva, durante período de 20 dias...........................
59
FIGURA 17 Produção de matéria seca de raízes e parte aérea de E.
camaldulensis submetido a doses de Cd, em solução
nutritiva, durante período de 20 dias.........................
61
FIGURA 18 Sistema radicular de E. camaldulensis aos 16 dias
após indução do tratamento (DAT), na presença de
doses crescentes de Cd, em solução nutritiva..............
62
FIGURA 19 Parte aérea de E. camaldulensis aos 16 dias após
indução do tratamento (DAT) na presença de doses
crescentes de Cd, em solução nutritiva......................
63
FIGURA 20 Relação de clorofila a/b e teor de clorofila total em
plantas jovens de E. camaldulensis, no 1º, 12º e 20º
DAT, submetidas a três doses de Cd, em solução
nutritiva....................................................................
64
FIGURA 21 Teores de carotenóides (mg g
-1
MF) em folhas de E.
camaldulensis, no 1º, 12º e 20º DAT, submetido a
três doses de Cd, em solução nutritiva........................
66
FIGURA 22 Eficiência fotoquímica do fotossistema II (Fv/Fm)
em plantas jovens de E. camaldulensis, no 1º, 12º e
20º DAT, submetidas a três doses de Cd, em solução
nutritiva....................................................................
67
iii
FIGURA 23 Potencial hídrico total (MPa) de plantas jovens de
E.camaldulensis, no 1º, 12º e 20º DAT, submetidas a
três doses de Cd, em solução nutritiva......................
68
FIGURA 24 Teores de Cd (mg kg
-1
) nas raízes e parte aérea de E.
camaldulensis submetido a doses crescentes de Cd,
em solução nutritiva, durante período de 20 dias........
70
FIGURA 25 Teores de macronutrientes (g kg
-1
) nas raízes e parte
aérea de E. camaldulensis submetido a doses
crescentes de Cd, em solução nutritiva, durante
período de 20 dias.................................................
72
FIGURA 26 Teores de micronutrientes (mg kg
-1
) nas raízes e parte
aérea de E.camaldulensis submetido a doses
crescentes de Cd em solução nutritiva, durante
período de 20 dias..................................................
76
FIGURA 27 Peroxidação de lipídeos (nmol MDA g
-1
MF) em
folhas e raízes de plantas de E. camaldulensis, no 1º,
12º e 20º DAT, submetidas a três doses de Cd, em
solução nutritiva…….............................................
79
FIGURA 28 Seção transversal do limbo foliar das folhas de E.
camaldulensis submetida a doses crescentes de Cd,
em solução nutritiva, durante um período de 20
dias........................................................................
81
FIGURA 29 Seção paradérmica de folhas de
Ε.
camaldulensis submetidas a doses crescentes de
Cd, em solução nutritiva, durante um período de 20
dias.......................................................................
85
iv
LISTA DE TABELAS
Página
TABELA 1 Fontes, solução estoque e composição final das
soluções nutritivas utilizadas para o crescimento de P.
glomerata e E. camaldulensis em concentrações
crescentes de Cd.............................................................
19
TABELA 2 Médias das variáveis respostas analisadas nas seções
paradérmicas da superfície abaxial folhas de P.
glomerata submetida a doses crescentes de Cd, em
solução nutritiva, durante período de 20 dias................
58
TABELA 3 Densidade estomática e espessura de células e tecidos
de plantas jovens de E. camaldulensis submetidas a
doses crescentes de Cd em solução nutritiva……........
84
v
RESUMO
MARQUES, Teresa Cristina Lara Lanza de Sá e Melo. Respostas anatômicas e
fisiológicas de Pfaffia glomerata e Eucalyptus camaldulensis ao cádmio.
2007. 103 Tese ( Doutorado em Fisiologia Vegetal) - Universidade Federal de
Lavras, Lavras- MG.
Com o objetivo de caracterizar aspectos fisiológicos e anatômicos de espécies
com potencial para fitorremediação, foram realizadas avaliações de crescimento,
teores de pigmentos, potencial hídrico, estado nutricional da planta, peroxidação
de lipídios, atividade de enzimas antioxidantes e estudos anatômicos. Foram
conduzidos experimentos com Pfaffia glomerata (Sprengel) Pedersen e
Eucalyptus camaldulensis Dehnh., em solução nutritiva de Clark, contendo
doses crescentes de Cd (0, 15, 25, 45 e 90 μmol L
-1
). Durante um período
experimental de 20 dias, foram feitas coletas (1, 12 e 20 DAT) para avaliações
de pigmentos, estado hídrico, peroxidação de lipídeos e atividade enzimática,
nos tratamentos de 0, 45 e 90 μmol Cd L
-1
. Para o estudo de produção de matéria
seca, teores de nutrientes e de Cd e anatomia foram feitas coletas, no final do
experimento, em todos os tratamentos. Constatou-se que a adição de Cd no meio
de solução reduziu a produção de matéria seca das raízes e parte aérea, diminuiu
os teores de clorofila com o aumento do tempo de exposição e alterou o estado
nutricional das duas espécies estudadas. Em P. glomerata, os teores de
carotenóides foram reduzidos, enquanto em E. camaldulensis, estes teores foram
aumentados com o tempo de exposição. O potencial hídrico de P. glomerata foi
reduzido com o aumento do tempo de exposição ao Cd e foi maior no final do
período experimental em E. camaldulensis, aos 12 e 20 DAT. Ocorreram
alterações no metabolismo do oxigênio ativado, evidenciadas pelo aumento da
peroxidação de lipídeos nas doses maiores de Cd nas raízes e parte aérea de P.
glomerata e na parte aérea de E. camaldulensis. Em P. glomerata, as enzimas do
sistema antioxidativo tiveram suas atividades afetadas com a adição de Cd. No
estudo anatômico, constatou-se aumento dos números de estômatos e alterações
em seus diâmetros com o aumento das doses de Cd. O Cd na solução também
reduziu a espessura do limbo foliar de E. camaldulensis. Apesar do efeito do
enriquecimento de Cd acumulado nos tecidos das plantas estudadas ter resultado
na redução do crescimento das plantas, o conhecimento de estratégias
metabólicas de sobrevivência destas espécies poderá contribuir para o estudo de
melhoramento genético, objetivando a recuperação de áreas degradadas.
Palavras chave: solução nutritiva; mecanismos de tolerância; fitorremediação.
vi
ABSTRACT
MARQUES, Teresa Cristina Lara Lanza de Sá e Melo. Anatomical and
physiological responses of Pfaffia glomerata and Eucalyptus camaldulensis
to cadmium. 2007. 103 Thesis (Doctorate in Plant Physiology) - Federal
University of Lavras, Lavras-MG.
∗
Plant growth, photosynthetic pigment contents, water potential, mineral
nutrition, lipid peroxidation, antioxidant enzymes, and anatomical
changes of Pfaffia glomerata (Sprengel) Pedersen and Eucalyptus
camaldulensis Dehnh were investigated aiming to characterize their
physiological and anatomical features regarding their phytoremediation
potential. An experiment was carried out in Clark solutions containing
increase Cd concentration (0, 15, 25, 45 and 90 μmol L
-1
) with plantlets
of those species. During 20 days, plant sample material was collected to
evaluate pigment contents, water potential, lipid peroxidation, and
enzyme activity in treatments of 0, 45, and 90 μmol L
-1
of Cd. After 20
days, the plants were collected to investigate dry matter production,
nutrient and Cd contents, and anatomical changes. It was verified that Cd
addition decreased root and shoot dry matter production. Chlrophyll
contents were also reduced by increasing the time plants were exposed to
metals. In P. glomerata carotenoid contents were increased with Cd
exposition time. Water potential of P. glomerata was reduced with
exposition to Cd. As for E. camaldulensis, it was higher at the end of the
experiment. The verified changes in reactive oxygen metabolism were
demonstrated by an increase in the lipid peroxidation and highest levels
of Cd in P. glomerata and in the shoot of E. camaldulensis. In P.
glomerata, antioxidation system enzymes had their activities affected by
Cd exposition. It was also verified an increase in the number of stomata
and alterations in their diameters with Cd level increased. Cadmium also
decreased the thickness of leave limbo in E. camaldulensis. Although Cd
has had an overall negative effect, the understanding of the survival
strategies adopted by those species in Cd-rich environments will
∗
Guidance Committee: Ângela Maria Soares - UFLA (Major Professor),
Evaristo Mauro de Castro - DBI/UFLA.
vii
contribute to plant breeding programs aiming at the revegetation of a
contaminated area.
Key words: nutrient solution; tolerance mechanisms; phytoremediation.
1
1 INTRODUÇÃO
Metais pesados são importantes poluentes ambientais, particularmente
em áreas onde há grande atividade antropogênica. A presença deles na
atmosfera, no solo e na água, mesmo em concentrações traços, pode causar
sérios problemas a todos os organismos e a bioacumulação do metal pesado na
cadeia alimentar pode ser altamente perigosa. O Cd é um metal de vasta
ocorrência, liberado para o ambientes por meio de estações de energia, sistemas
de aquecimento, indústrias que trabalham com metais, incineradoras de lixo,
tráfego urbano, fábricas de cimento e também como um produto secundário de
fertilizantes fosfatados.
Dentre inúmeras estratégias de remediação, a fitorremediação é um tipo
bastante promissor, destacando-se a implantação de florestas em áreas
contaminadas. Pela técnica da fitorremediação, as plantas tolerantes aos metais
absorvem os elementos metálicos através de suas células, o que é facilitado por
mecanismos próprios de transporte e acumulação. No entanto, vários metais
pesados são necessários como micronutrientes, não podendo a planta evitar a
entrada de elementos tóxicos pelos mesmos mecanismos. Em particular, a
absorção do íon Cd parece competir pelo mesmo carreador transmembrana com
alguns nutrientes, tais como K, Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn, Ni.
Um dos requisitos básicos para o sucesso de qualquer técnica de
revegetação de áreas contaminadas por metais pesados é encontrar plantas
tolerantes aos contaminantes. No contexto sobre fitorremediação, estudos sobre
a viabilidade de espécies arbóreas para a reabilitação de áreas contaminadas por
metais pesados têm merecido destaque, por causa da maior imobilização destes
metais na biomassa vegetal por períodos mais longos (Eltrop et al., 1991). No
2
entanto, existem evidências de que as plantas herbáceas possuem maior
tolerância ao excesso de metais no solo do que as arbóreas (Baker, 1987).
Muitas espécies herbáceas têm sido estudadas. Entre elas, destaca-se a
mostarda (Brassica spp.), capaz de retirar até 9% do metal presente no solo
(Carneiro et al., 2001). A maior tolerância da mostarda aos metais pesados está
relacionada à sua capacidade de absorver grandes quantidades de P e Fe.
O efeito tóxico dos metais na planta altera os processos metabólicos,
como fotossíntese, respiração e atividade de enzimas. Esses efeitos causam a
redução do nível energético da planta, levando à diminuição da absorção dos
micronutrientes minerais e do crescimento. Nesta perspectiva, o presente estudo
foi realizado com o objetivo de conhecer os efeitos do Cd em espécies com
tolerância potencial ao metal (P. glomerata e E. camaldulensis). Foram
estudados efeitos na distribuição de matéria seca, anatomia foliar, nutrição
mineral, assim como mecanismos de tolerância por meio de estudos das
atividades de enzimas do sistema antioxidativo. Espera-se, assim, contribuir para
estudos que buscam genótipos tanto fitorremediadores quanto bioindicadores e,
consequentemente, gerar informações que possam auxiliar a definir estratégias
de melhoramento diretamente relacionadas ao programa de fitorremediação de
solos contaminados e de monitoramento ambiental.
3
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Metais pesados: toxicidade para os vegetais
Em um solo contaminado por metais pesados, as raízes são os primeiros
órgãos a entrar em contato com altas concentrações dos elementos tóxicos e, de
modo geral, esses elementos ficam mais acumulados nas raízes do que na parte
aérea (Barceló & Poschenreider, 1990). Mesmo que a planta sseja exposta, por
um longo tempo, a metais pesados de alta mobilidade, como o Pb, Cr, Cu ou Ba
ou, ainda, a elementos de baixa mobilidade como o Cd, o crescimento radicular
será mais intensamente reduzido do que a parte aérea, reduzindo assim a razão
raiz/parte aérea. Porém, a quantidade do metal pesado absorvido e a intensidade
de inibição do crescimento radicular vão depender da espécie e das condições de
crescimento da planta (Barceló & Poschenreider, 1990).
O grau pelo qual a planta é capaz de absorver o metal vai depender de
sua concentração na solução do solo e de sua biodisponibilidade, que é
controlada pela presença de matéria orgânica, pH do solo, potencial redox,
temperatura e concentração de outros elementos (Toppi & Gabbrielli, 1999). Em
particular a absorção do íon Cd parece competir pelo mesmo carreador
transmembrana com os nutrientes K, Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn e Ni (Marschner,
1995).
Os sintomas de toxidez observados nas plantas na presença de
quantidades excessivas do metal pesado podem ser devido a grandes interações,
em âmbito celular, causando alterações visuais, como, por exemplo, reduções no
crescimento, cloroses, necroses e murchas. A redução no crescimento como
resposta ao aumento dos níveis fitotóxicos indica claramente um impacto dos
metais pesados às plantas (Monni et al., 2001). Muitos estudos têm mostrado
que os teores de clorofila, ácido abscíssico (ABA) e ácidos orgânicos e o
potencial de água da planta têm sido utilizados para indicar a resposta do vegetal
4
a elevados níveis de metais pesados (Monni et al., 2001, Angelov et al., 1993,
Stobart et al., 1985). A taxa de fotossíntese e os teores de clorofila em geral são
reduzidos na presença de Cu, Ni, Cd e Pb, como observado por Chugh &
Sawhney, 1999, Angelov et al., 1993 e Stobart et al., 1985. O efeito de Ni, Cu e
Cd nas relações hídricas da planta são discutidos por Monni et al. (2001) e
Barceló & Poschenreider (1986).
Outros efeitos dos metais pesados podem estar relacionados com a
incorporação do metal ao grupamento sulfidril de uma proteína, provocando a
inibição da atividade ou a quebra de sua estrutura (Assche & Clijsters, 1990) e,
assim, as enzimas são um dos principais alvos dos metais. Portanto, a sua
exposição a níveis tóxicos pode levar à inibição da atividade, alterando sua
função como catalizadora ou, ainda, desnaturando a proteína (Benavides et al.,
2005). Além disso, podem-se encontrar metais pesados estimulando a formação
de espécies reativas de oxigênio (EROs), causando na célula danos diversos
(Sandalio et al., 2001; Gallego et al., 1996).
Alterações anatômicas são também observadas em plantas expostas aos
metais pesados. Muitas vezes, as plantas são capazes de desenvolver estratégias
de sobrevivência promovendo alterações morfológicas e anatômicas para
suportarem níveis fitotóxicos de metais pesados em seus tecidos. Outras vezes,
as plantas, quando expostas aos metais, sofrem danos em suas estruturas que
comprometem o metabolismo da planta. Altos níveis de Cd e Zn causaram
redução no tamanho das células da epiderme e dos parênquimas paliçádico e
esponjoso, além da redução no teor de amido e no teor relativo de água da folha
(Sridhar et al., 2005).
2.2 A toxicidade de Cd no vegetal
Cádmio (densidade = 8,6 g cm
-3
) é um metal pesado muito comum,
liberado ao ambiente por processos industriais, posto de combustíveis, resíduos
5
urbanos, tráfego urbano, agricultura, mineração e sistemas de aquecimento, entre
outros (Toppi & Gabbrielli, 1999). Em área com pouca atividade antropogênica,
o Cd pode ser liberado pelo processo de mineralização de rochas.
Uma estimativa da faixa de níveis não tóxicos de Cd para a solução do
solo varia entre 0,04 a 0,32 μM (Wagner, 1993). Uma solução de solo que
contém entre 0,32 a 1 μM Cd pode ser considerada como um nível moderado de
poluição, pois o Cd é tido como um elemento móvel no solo e encontrado,
principalmente, em sua forma iônica (Toppi & Gabbrielli, 1999). Sendo assim,
de acordo com suas características químicas, o Cd apresenta elevada capacidade
de ser absorvido pela planta e perdido por lixiviação no perfil do solo.
Na maioria das condições ambientais, o Cd é absorvido pelo sistema
radicular e, como consequência, espera-se encontrar efeitos desse metal nos
processos de absorção, transporte e uso de vários elementos nutrientes (Ca, Mg,
P, e K) e também na absorção de água (Benavides et al., 2005). De acordo
Seregin & Ivanov (2001), há dois mecanismos que explicam melhor a redução
na absorção dos macro e micronutrientes afetados pelo Cd. Um dos mecanismos
seria um físico-químico que depende do tamanho do raio iônico do Cd em
relação aos outros elementos. Logo, o Cd (1,03 Ǻ) reduziria a absorção do Zn
(0,83 Ǻ) e do Ca (1,06 Ǻ). Outro mecanismo seria a alteração no metabolismo
celular por interferir na estrutura das membranas, na atividade de enzimas de
membrana e provocar inibição no crescimento radicular. Estes efeitos causam
outros novos, como alterações no balanço hormonal, deficiência de nutrientes
essenciais, inibição da fotossíntese, variações na translocação de
fotoassimilados, alterações nas relações de água, alterações na estrutura e ultra-
estrutura, entre outros (Barceló & Poschenreider, 1990).
Entretanto, em estudos de toxidez, torna-se difícil distinguir se
realmente existe alguma diferença na ordem de surgimento entre os danos.
Efeito de Cd nas propriedades da membrana plasmática foi observado por
6
Hernández & Cooke (1997), que relataram modificações na composição de
lipídio da membrana plasmática radicular de Pisum sativum tratados com Cd.
Este efeito pode ter provocado a variação da seletividade da membrana e
redução na atividade da ATPase. No geral, o Cd inibe o crescimento do sistema
radicular, provocando supressão na taxa de elongamento celular de maneira
irreversível, atuando no sistema de bomba de próton (Toppi & Gabrielli, 1999).
Em raízes de abóbora (Cucumis sativus L.), Cd induziu a inibição da redutase do
Fe III, levando à deficiência do Fe II, o qual afetou seriamente a fotossíntese
(Alcantara et al., 1994). O Cd também reduz a absorção de nitrato pelas raízes e
seu transporte para a parte aérea, inibindo, indiretamente, a atividade da redutase
do nitrato na parte aérea (Hernández et al., 1996).
A toxicidade do metal afetando a permeabilidade da membrana pode
causar redução na absorção de água, interferindo, assim, no balanço de água da
planta (Barceló & Poschenreider, 1986). Segundo Seregin & Ivanov (2001),
vários mecanismos explicam o efeito do Cd no teor de água e na taxa de
transpiração, como redução na área foliar e extensibilidade celular; alteração na
quantidade e tamanho dos estômatos; alteração no teor dos compostos que
mantêm o turgor celular e a plasticidade de parede celular; redução no teor de
ABA, induzindo o fechamento dos estômatos e variações na respiração e na
fosforilação oxidativa que podem causar também alterações no regime de água
da planta.
Em experimentos com feijão, a expansão celular foi inibida, a área foliar
e o teor relativo de água foram reduzidos após 48 horas de exposição a 3 μM Cd,
enquanto o turgor foliar não foi afetado neste tempo, sugerindo que o Cd induziu
a redução na extensibilidade celular (Poschenreider et al., 1989). Em
Arabidopsis thaliana, o efeito do Cd na relação água-planta foi verificado por
meio da redução na condutância foliar induzida pela ação direta do Cd no
fechamento dos estômatos (Perfus-Barbeoch et al., 2002). Uma possível
7
explicação para o fechamento dos estômatos induzido pelo Cd seria a
modificação na regulação de canais de K nas células guardas. Entretanto, Perfus-
Barbeoch et al. (2002) verificaram que o Cd atravessa a membrana das células
guardas através dos canais de Ca dependente do potencial de membrana,
perturbando assim a concentração de Ca intracelular.
O Cd pode interferir no metabolismo das plantas por diferentes
maneiras, atuando, por exemplo, nas reações fotossintéticas por interferir na
estrutura e na biossíntese dos cloroplastos (Somashekaraiah et al., 1992; Stobart
et al., 1985), no PS II (Di Cagno et al., 1999) e em diferentes reações do ciclo de
Calvin (Siedlecka & Krupta, 1996). Em Helianthus annus, as plantas tratadas
com 10 e 20 μM Cd apresentaram redução no teor de clorofila e na taxa de
assimilação de CO
2
, não afetando a eficiência do fotossistema II (PS II).
Entretanto, variações foram observadas na produção do quantum do transporte
de elétrons do PS II, no quenching fotoquímico (q
N
) e não-fotoquímico (q
NP
) e
na eficiência de captura da excitação do PS II (Φ
exc
) (Di Cagno et al., 1999).
A toxidez de Cd na planta pode também induzir o estresse oxidativo, por
estar o metal envolvido em vários mecanismos que geram as espécies reativas de
oxigênio (EROs) (Benavides et al., 2005; Vitória et al., 2001). Estes radicais
ocorrem em organismos aeróbicos, sob condições normais, sendo gerados
também em células de planta durante os processos de fotossíntese e respiração
(Asada, 1999). Porém, estas EROs são capazes de gerar danos oxidando
proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, que têm como consequência alterações na
estrutura celular e na formação de mutagêneses (Benavides et al., 2005). Gallego
et al. (1996) mostraram que o Cd causou aumento na peroxidação do lipídio e na
atividade da lipoxigenase em plantas de girassol. A abundância de O
2
e as
reações de transferência de elétrons altamente energética associada com as
membranas do tilacóide fazem dos cloroplastos a principal fonte de oxigênio
ativo intermediário nos tecidos fotossintéticos das plantas (Prasad, 1995).
8
As plantas, quando expostas ao Cd, sofrem alterações de natureza
morfológica e anatômica. Os vasos do xilema, responsáveis pelo transporte dos
elementos nutricionais para a parte aérea, podem sofrer modificações quando
plantas são expostas ao Cd. A presença do Cd em Salix viminalis aumentou a
concentração de materiais fenólicos na parede celular e no lúmen do xilema
(Vollenweider et al., 2006). Foi também observado, neste mesmo estudo,
acúmulo de Cd nos tubos crivados, dificultando o movimento via simplasto, com
o floema tendendo a reduzir sua eficiência no transporte dos fotoassimilados.
Em Brassica juncea, espécie acumuladora de Cd, a presença de 10 mM Cd não
resultou em variações nas células da epiderme e do mesofilo, quando comparada
com o controle (Sridhar et al., 2005).
A presença de metais pesados nos tecidos das plantas em quantidades
tóxicas causa variações anatômicas que podem vir a alterar os processos
metabólicos destas. Em trigo, Quartacci et al. (2000) observaram que o
crescimento da planta na presença de 10 μM Cu não afetou a ultra-estrutura do
cloroplasto, permanecendo com a estrutura similar ao tratamento controle.
Entretanto, as folhas das plantas crescidas em 50 μM Cu tiveram a estrutura dos
cloroplastos alterada. O estroma e a grana dos tilacóides aumentaram de volume,
sem que as membranas fossem destruídas. A quantidade de amido nas raízes foi
reduzida em consequência da redução da quantidade de fotoassimilados
translocados para este órgão ou, ainda, acredita-se que, devido à ausência de
amido na parte aérea, o Cd pode ter interferido muito mais na fotossíntese do
que no transporte dos fotoassimilados (Barceló et al., 1988).
A capacidade da planta de tolerar o metal pesado em suas células
depende de uma rede interligada de mecanismos fisiológicos e moleculares que
incluem desde a sua absorção e acumulação em exsudatos extracelulares e na
parede celular como também a complexação do metal dentro da célula por
substâncias como ácidos orgânicos, aminoácidos, ferritinas, fitoquelatinas e
9
metalotioneínas (Benavides et al., 2005). De modo geral, a resposta de defesa ao
estresse bioquímico, como, por exemplo, a indução do sistema de enzimas
antioxidativas e a ativação ou a modificação do metabolismo da planta, permite
uma resposta rápida de adequação ao funcionamento das rotas metabólicas, em
consequência dos danos ocorridos na estrutura celular (Hall, 2002; Toppi &
Gabbrielli, 1999; Prasad, 1999).
O Cd, ao penetrar pelas raízes através dos tecidos do córtex, alcança o
xilema via apoplasto e ou simplasto, podendo estar complexado a vários ligantes
como os ácidos orgânicos e as fitoquelatinas (Salt et al., 1995). As plantas retêm
maiores teores de Cd nas raízes, translocando pouco para a parte aérea como
estratégia desta de tolerar o metal em seus tecidos (Baker, 1981). Deve-se
considerar também que a folha é de grande importância no estudo de
descontaminação de solos, pois a extração de elementos do solo está bastante
relacionada com a taxa de transpiração foliar, sendo os metais translocados e
acumulados no órgão aéreo. A existência de estruturas especiais de cada espécie
além da natureza dos tecidos, muitas vezes, funciona como uma estratégia a
mais para a planta defender-se contra a toxidez por metais. A natureza da
epiderme foliar e a existência de tricomas na superfície da folha ou glândulas e
hidatódios podem detoxificar mais Cd do que as células do mesofilo
(Vollenweider et al., 2006). Na epiderme e no mesofilo de folhas de Arabidopsis
thaliana foram encontradas apenas quantidades traços de Cd, enquanto nos
tricomas foi o local de maior acúmulo do metal (Isaure et al., 2006). Segundo os
autores, o seqüestro do Cd nos tricomas pode servir como um caminho para
proteger a atividade metabólica da toxidez do Cd. Muitas vezes, uma simples
adaptação poder ser tudo o que a planta necessita para tolerar locais altamente
contaminados por metais (Macnair, 1993), porém, mecanismos de tolerância
adaptativa são dependentes de mecanismos constitutivos (Meharg, 1994).
10
2.3 Sistema antioxidante de resposta das plantas ao estresse como
mecanismo de tolerância a exposição ao Cd
O estresse oxidativo, gerando espécies reativas de oxigênio (EROs) tais
como radicais superóxidos (O
2
.-
), oxigênio “singlet” (
1
O
2
), peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) e radical hidroxil (OH
-
), é um dos principais causadores de
injúria depois da planta exposta a condições de estresse, como seca, queimada,
geadas, alta intensidade de luz, radiação UV, metais pesados, vários químicos
orgânicos e poluentes do ar como O
3
e SO
2
(Benavides et al., 2005; Toppi &
Gabbrielli, 1999; Foyer et al., 1994). Estas espécies de oxigênio são altamente
reativas e danificam os lipídeos de membrana, as proteínas, os pigmentos e os
ácidos nucléicos, resultando na redução drástica do crescimento e da
produtividade, podendo levar à morte das plantas (Foyer et al., 1994).
As EROs são produzidas tanto sob condições de estresse quanto em
condições adequadas para o desenvolvimento dos vegetais. Por muito tempo,
consideravam-se as EROs como moléculas causadoras de danos, as quais
precisava ser mantidas em níveis baixos. Entretanto, sabe-se, hoje, da sua
importância no sistema de defesa contra patógenos (Resende et al., 2003), no
processo de morte programada de células (Fath et al., 2002) e como moléculas
sinalizadoras para regular a expressão gênica (Vranová et al., 2002). Dessa
forma, devido às suas múltiplas funções, é importante que as células controlem
os níveis EROs, sem, contudo, eliminá-los completamente (Schützendübel &
Polle, 2002).
Plantas que apresentam um sistema de defesa bem desenvolvido de
produção de ERO limitando sua formação são capazes de tolerar maiores
condições adversas do meio (Alscher et al., 2002). Sob condições não
estressantes, a formação e a remoção do O
2
-
estão balanceadas (Benavides et al.,
2005). Porém, se a produção dos radicais não for controlada, pode-se alterar a
atividade das enzimas responsáveis pela proteção antioxidante, bem como a
11
alteração da integridade da membrana, levando à destruição de células e de
tecidos (Scandalios, 1993).
O controle dos níveis dos agentes oxidantes é mantido pelos
componentes antioxidativos. Estes sistemas de defesa são mantidos por
compostos metabólicos, tais como o ascorbato, a glutationa, o tocoferol, etc. e
por enzimas eliminadoras de oxigênio ativo, como as superóxidos dismutases
(SOD), peroxidases (POD), catalases (CAT) e enzimas do ciclo ascorbato-
glutationa, como a glutationa redutase (GR) (Noctor & Foyer, 1998), agindo em
sincronia. A presença de Cd no meio de solução nutritiva pode inibir ou
estimular a produção destas enzimas do sistema antioxidativo (Wójcik et al.,
2006; Benavides et al., 2005).
Dentro da célula, a superóxido dismutase (SOD) constitui a primeira
linha de defesa contra as ERO. O O
2
-
é produzido onde a cadeia de transporte de
elétrons está presente, podendo sua ativação ocorrer em qualquer compartimento
da célula (Noctor & Foyer, 1998) incluindo mitocôndria, cloroplastos,
glioxissomos, peroxissomos e citoplasma, que são rapidamente convertidos a
H
2
O
2
pela ação da SOD (Alscher et al., 2002). Embora em todo o
compartimento celular seja possível a formação do O
2
-
, acredita-se que, nos
cloroplastos, mitocôndrias e peroxissomos são os principais locais de maior
produção das EROs (Benavides et al., 2005;, Toppi & Gabbrielli, 1999). As
SODs são as únicas enzimas que interferem nas concentrações de H
2
O
2
e O
2
-
, os
dois substratos da reação Haber-Weiss que originam os radicais OH.
Provavelmente, por isso constitui o mecanismo de defesa central dos organismos
vivos (Alscher et al, 2002).
Dependendo do co-fator utilizado pela enzima, as SODs são
classificadas em três grupos diferentes: Fe-SOD, Mn-SOD e Cu/Zn-SOD,
estando também localizadas em compartimentos diferentes, variando de planta
para planta em número e em tipo (Scandalios, 1993). As Fe-SODs estão
12
localizadas no cloroplasto, as Mn-SODs estão localizadas na mitocôndria e
peroxissomos e as Cu/Zn no cloroplasto, no citoplasma e, possivelmente, em
espaços extracelulares (apoplastos), sendo consideradas as mais abundantes em
vegetais (Winglse et al., 1991).
Quantidades padrões de SOD são requeridas a todo o tempo para
promover adequada proteção em âmbito celular, pois formação de O
2
-
e de
produtos da peroxidação de lipídios é altamente e imediatamente tóxica para as
plantas (Scandalios, 1993). Muitos estudos têm verificado o efeito do estresse
por Cd na atividade da SOD, porém, estes têm apresentado resultados
contraditórios. O aumento na atividade da SOD em plantas exposta aos metais
pesados tem sido observado em vários estudos (Vitória et al., 2001; Mishra et
al., 2006, Gwozdz et al., 1997), enquanto outros trabalhos têm resultado no
decréscimo da atividade da SOD ou, ainda, apresentado pouca alteração na
atividade da enzima (Benavides et al., 2005). Em girassol, baixas concentrações
de Cd provocaram aumento na atividade da enzima e, sob altas doses, o metal
teve pouco efeito na atividade da enzima (Gallego et al., 1999). Em Thlaspi
caerulescens, espécie hiperacumuladora de Cd e Zn, a atividade da SOD reduziu
com o aumento das doses de Cd (Wójcik et al., 2006). Enquanto foi reduzida em
Alyssum maritimum e Alyssum argenteum, a SOD teve sua atividade elevada
com o aumento das doses de Cd (Schickler & Caspi, 1999).
A catalase (CAT) é uma enzima importante no processo da
fotorrespiração, pois o H
2
O
2
formado durante este processo durante a conversão
do glicolato a glioxilato é decomposto em H
2
O e O
2
no peroxissomo, realizado
em plantas C3 (Foyer et al., 1994). Em plantas C4, nas quais a fotorrespiração é
reduzida, existe redução na atividade da CAT. De acordo com Willekens et al.
(1995), a ausência da atividade da CAT em plantas as torna mais sensíveis a
muitos estresse. A CAT, assim como a SOD, é a mais eficiente enzima no
13
sistema antioxidante, pois suas ações combinadas reduzem a ação tóxica e
altamente reativa dos radicais hidróxil (OH
-
) (Scandalios, 1993).
Existem três tipos de isoenzimas da CAT encontradas em plantas
(Willekens et al., 1997). O primeiro tipo presente nos glioxissomos de tecidos
que armazenam lipídios parece fazer parte da quebra do H
2
O
2
formado durante a
β-oxidação dos ácidos graxos (Holtman et al., 1994). Um segundo tipo está
presente nos peroxissomos de folhas verdes, sendo responsável pela dismutase
do H
2
O
2
produzido durante a fotorrespiração na conversão do glicolato a
glioxilato (Willekens et al., 1997). Uma terceira classe de CAT está presente nos
tecidos vasculares e pode estar envolvida na proteção contra o estresse ambiental
(Willekens et al., 1997).
Na literatura encontram-se trabalhos com resultados contraditórios,
estudando o efeito do Cd em plantas, podendo ocorrer ativação da CAT (Pereira
et al., 2002) ou inibição (Singh et al., 2006). No entanto, Hegedüs et al. (2001)
verificaram que o Cd não induziu variações na atividade da CAT em folhas de
plântulas de cevada, suportando a conclusão de que a maioria dos metais
pesados não afeta a atividade da CAT localizada no peroxissomo. Em Thlaspi
caerulescens, a atividade da CAT foi crescente com o aumento dos níveis de Cd,
porém, foi menor do que o tratamento controle (Wójcik et al., 2006).
A glutationa reduzida (GSH) é um importante metabólito no combate às
EROs, especialmente o O
2
-
e H
2
O
2
, via ciclo Halliwell-Asada (Noctor e Foyer,
1998). Para a regeneração de GSH a partir de sua forma oxidada (GSSG), a
enzima chave é a glutationa redutase (GR), que necessita do NADPH como
poder redutor (Israr et al., 2006). A GR é de grande ocorrência na natureza,
podendo ser encontrada desde bactérias heterotróficas e fotossintetizantes até em
plantas e animais superiores (Gallego et al., 1996). Esta reação é importante na
manutenção do pool da glutationa, pois mantém alta a relação GSH/GSSG,
crucial para proteger as células contra os danos oxidativos (Mishra et al., 2006).
14
O alto valor da relação GSH/GSSG é necessário para sustentar a função da
glutationa como um agente oxidante-redutor (Foyer et al., 1997), além de servir
como substrato para a produção de fitoquelatinas, um agente quelante de metais,
deixando-os indisponíveis no ciclo metabólico da planta (Cobbett, 2000).
Vários trabalhos têm verificado alterações na atividade da GR quando as
plantas são submetidas ao estresse por metais pesados. Um aumento na atividade
foi verificado em callus de Sesbania drummondii exposta a diferentes
concentrações de Cd (Israr et al., 2006). Em Brassica juncea exposta ao Cd e ao
Zn, Prasad et al. (1999) também encontraram aumento na atividade da GR.
Entretanto, uma redução na atividade da enzima foi verificada em plântulas de
cevada (Patra & Panda, 1998) e em plantas de tomate expostas ao excesso de Cu
(Mazhoudi et al., 1997), enquanto nenhuma diferença significativa foi verificada
na atividade da GR em Pisum sativum com o aumento dos níveis de Cd
(Sandalio et al., 2001). Em Alyssum argenteum, considerada uma espécie
hiperacumuladora de metal, a atividade da GR aumentou em baixos níveis de Cd
e foi reduzida nos níveis maiores de Cd (Schickler & Caspi, 1999). A baixa
atividade da GR em altos níveis de Cd pode ser devido à ação direta do metal
nos grupos sulfidril da proteína, interferindo no ciclo da glutationa (Schickler &
Caspi, 1999). Segundo os mesmos autores, maiores atividades da SOD e da GR
sugerem maiores tolerâncias à exposição da planta a níveis tóxicos dos metais.
A indução da atividade das peroxidases é uma resposta geral das plantas
superiores à diversidade de condições de estresses ambientais, incluindo o
estresse por metais pesados (MacFarlane, 2002). As peroxidases catalisam
reações “quenching” de dehidroxigenação, por meio da transferência de
hidrogênio de um doador antioxidante ao H
2
O
2
(Mocquot et al., 1996). Em
conseqüência, o aumento na atividade das peroxidases, quando a planta é
exposta ao metal, pode exercer uma função importante no mecanismo de defesa
celular contra a toxidez do metal (Assche & Clijsters, 1990).
15
O aumento da produção de peroxidases em decorrência da exposição da
planta a metais pesados pode ser considerado, devido à fração tóxica do metal ou
a não incorporação do metal livre à parede celular ou, ainda, ao acúmulo deste
no vacúolo (Assche & Clijsters, 1990). As atividades das peroxidases
apresentam correlação próxima com as variações nos processos fisiológicos, tais
como respiração, fotossíntese, fixação de CO
2
, transpiração e trocas gasosas
tendo, então, consequências diretas no crescimento e no desenvolvimento da
planta (Benavides et al., 2005). Dessa forma, as peroxidases apresentam
potencial para servir como um indicador das atividades metabólicas (Verkleij &
Schat, 1990).
Nas espécies vegetais, a guaiacol peroxidase (GPX) apresenta isoformas
ácidas e básicas. A isoforma ácida está envolvida numa variedade de processos
relacionados com a biossíntese da parede celular, incluindo a formação da
lignina, enquanto a isoforma básica participa da degradação do AIA (ácido
indol-acético) e da síntese do etileno (Fieldes & Gerhardt, 1998).
As isoformas da GPX atuando como agente de detoxificação são uma
função conhecida, entretanto, para a maioria dos organismos vivos, a função
principal desta enzima ainda não foi bem esclarecida (Fieldes & Gerhardt,
1998). Supõe-se que o estudo das alterações provocadas pela indução de
estresses fisiológicos poderia contribuir para a melhor compreensão da ação
específica das isoformas (Gratão, 2003).
Em plantas, o mais importante substrato redutor para a detoxificação do
H
2
O
2
é o ascorbato (Noctor & Foyer, 1998). A enzima ascorbato peroxidase
(APX) utiliza duas moléculas de ascorbato para reduzir o H
2
O
2
a H
2
O, gerando
duas moléculas de mono-hidroascorbato. A APX está localizada no cloroplasto e
no citoplasma das células vegetais (Noctor & Foyer, 1998). Das muitas funções
atribuídas ao ascorbato, relativamente poucas são bem caracterizadas. Porém,
está claro que o ascorbato é o principal antioxidante primário reagindo
16
diretamente com os OH, H
2
O
2
e O
2
-
, assumindo importante função na
fotoproteção e na regulação da fotossíntese (Noctor & Foyer, 1998).
De acordo com Noctor & Foyer (1998), a via das peroxidases para a
oxidação do H
2
O
2
é um modo alternativo e as peroxidases têm uma afinidade
muito maior por H
2
O
2
do que a CAT. Esta última enzima destrói o H
2
O
2
produzido pela glicolato peroxidase, principalmente nos peroxissomos
(Scandalios, 1993), enquanto o H
2
O
2
produzido nos cloroplastos é degradado
pela APX ligada à membrana dos tilacóides (Noctor & Foyer, 1998). Segundo
estes autores, as moléculas de O
2
-
e H
2
O
2
, que escapam da oxidação nos
tilacóides, serão oxidadas no estroma pela SOD e APX, respectivamente.
A atividade da APX em Alyssum maritimum e Alyssum argenteum não
foi induzida pela elevação da concentração de Cd nos meios de cultivo
(Schickler & Caspi, 1999), podendo esta atividade da enzima ter sido
compensada por alguma outra peroxidase. Em níveis mais baixos de Cd em
solução nutritiva, a atividade da APX foi crescente em raízes de Populus
canescens, sendo reduzida a níveis mais elevados do metal, como consequência
do aumento das concentrações de H
2
O
2
(Schützendübel & Polle, 2002).
17
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Considerações gerais
O experimento foi conduzido em casa de vegetação do Departamento de
Ciência do Solo da Universidade Federal de Lavras (UFLA), no município de
Lavras, na região sul do estado de Minas Gerais, a 918 m de altitude, latitude
21°14’S e longitude 45°00’W GRW.
As espécies estudadas neste trabalho foram selecionadas em função de
sua capacidade de tolerância aos metais pesados, a partir de estudos com solo
multicontaminado desenvolvidos no Departamento de Ciência do Solo. As
espécies Eucalyptus camaldulensis (Accioly, 2004) e Pfaffia sp. (Carneiro et al.,
2002) apresentam potencial para a revegetação de locais contaminados por
metais pesados. Entretanto, a Pffafia sp. é uma espécie que ocorre naturalmente
em áreas de mineração e, de acordo com Watanabe (1997), a vegetação
encontrada em áreas contaminadas representa importante fonte potencial de
ecótipos tolerantes à poluição, apresentando adaptada ao ambiente estressante.
Foram realizados dois experimentos, sendo cada um com uma espécie
diferente e em diferentes épocas. No primeiro experimento (Experimento I), a
espécie estudada foi a Pfaffia glomerata (Sprengel) Pedersen, cujas sementes
foram obtidas do Horto de Plantas Medicinais (HPM) do Núcleo Experimental
de Ciências Agrárias (NCA) da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul
(UFMS). As sementes foram colocadas para germinar em bandejas de isopor
com 60 células, contendo Plantmax, fazendo-se o desbaste sempre que
necessário, a fim de deixar apenas uma planta por célula da bandeja, onde
permaneceram por 50 dias.
No segundo experimento (Experimento II), foram avaliadas as
respostas fisiológicas e anatômicas de Eucalyptus camaldulensis Dehnh.
18
submetida a diferentes níveis de Cd em solução nutritiva. Para a obtenção de
mudas de Eucalyptus camaldulensis, sementes foram fornecidas pelo
Laboratório de Sementes Florestais do Departamento de Ciências Florestais da
UFLA. As mudas foram produzidas a partir de sementes, colocadas para
germinar em bandejas contendo vermiculita (Plantmax), onde permaneceram por
45 dias. No final deste período, as mudas de E. camaldulensis foram
transplantadas para tubetes individuais, permanecendo até os 100 dias.
Após o período de obtenção de mudas de P. glomerata e E.
camaldulensis, estas foram selecionadas quanto à altura e ao vigor, para que
cada tratamento ficasse com o mesmo padrão de desenvolvimento. Em seguida,
as plantas foram transferidas para bandejas de 30 L contendo solução nutritiva
de Clark (Clark, 1975) (Tabela 1) com ¼ da força iônica, com aeração constante.
Após uma semana, estas plantas receberam solução nutritiva com ½ da força
iônica, permanecendo por mais uma semana antes de receberem a solução
nutritiva definitiva com a força iônica total, para, então, serem aplicados os
tratamentos. Estes tratamentos consistiram da aplicação de doses crescentes de
Cd (0, 15, 25, 45 e 90 μmol L
-1
), utilizando o CdSO
4
como fonte de Cd. As
plantas foram mantidas em exposição aos metais durante 20 dias. Diariamente,
foi completado o volume da solução com água destilada, correspondente ao
perdido por evapotranspiração. Semanalmente, a solução dos vasos foi trocada e
o pH ajustado em 5,5, pela adição de NaOH ou HCl 0,1N.
19
TABELA 1 Fontes, solução estoque e composição final das soluções nutritivas
utilizadas para o crescimento de P. glomerata e E. camaldulensis
em concentrações crescentes de Cd.
Fonte/solução estoque
mL L
-1
Concentração
Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O 1 mol.L
-1
2,53 2,53 mmol Ca L
-1
5,06 mmol N-NO
3
-
L
-1
NH
4
NO
3
1 mol.L
-1
0,90 0,90 mmol N-NH
4
+
L
-1
0,90 mmol N-NO
3
-
L
-1
KNO
3
1 mol.L
-1
1,30 1,30 mmol N-NO
3
-
L
-1
1,30 mmol K L
-1
KCL 1 mol.L
-1
0,50 0,50 mmol. K L
-1
0,50 mmol Cl L
-1
Ca(H
2
PO
4
)
2
.H
2
O 23 mmol.L
-1
1,50 0,03 mmol Ca L
-1
0,07 mmol P L
-1
MgSO
4
.7H
2
O 1 mol.L
-1
0,50 0,50 mmol Mg L
-1
0,50 Mmol S L
-1
MgCl
2
0,1 mol.L
-1
1,00 0,10 mmol Mg L
-1
0,20 mmol Cl L
-1
MnCl
2
.4H
2
O 7 mmol.L
-1
7,00 μ mol Mn L
-1
H
3
BO
3
19 mmol.L
-1
19,0 μ mol B L
-1
ZnSO
4
.7H
2
O 2 mmol.L
-1
1,00
2,00 μ mol Zn L
-1
(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H
2
O 0,086 mmol.L
-1
0,60 μ mol Mo L
-1
CuSO
4
.5H
2
O 0,5 mmol.L
-1
0,50 μ mol Cu L
-1
FeCl
3
38 mmol.L
-1
+ EDTA 1,00
38,0 μ mol Fe L
-1
A duração do experimento foi de 20 dias após indução dos tratamentos
(DAT), sendo realizadas 3 avaliações nas datas 1, 12 e 20 DAT. Nestas datas
foram determinados os teores de clorofila e carotenóides, o potencial hídrico e a
20
peroxidação dos lipídios nos dois experimentos. Os teores de Cd e nutrientes,
distribuição de matéria seca e as avaliações anatômicas foram determinados ao
final do experimento, também para as duas espécies. Além das determinações já
citadas, para a P. Glomerata, avaliou-se também a atividade das enzimas do
sistema antioxidativo e, para o E.camaldulensis, foi determinada a eficiência do
fotossistema II e realizados estudos anatômicos em cortes transversais e
paradérmicos de folhas. Foram observados, em ambos os experimentos, ao 16º
DAT, sintomas visuais que foram registrandos em fotografias. Num total de 96
vasos por experimento, sendo quatro repetições por tratamento, foram montados
vasos de 1 L contendo solução nutritiva de Clark, sendo uma planta por vaso
como a unidade experimental.
3.2 Características avaliadas
3.2.1 Matéria seca
Apenas ao final do experimento (20 DAT) determinou-se a produção de
matéria seca para ambas as espécies, coletando-se três repetições de cada
tratamento e separando-se as plantas em raízes e parte aérea, que foram, então,
colocadas em sacos de papel e levadas à estufa com circulação constante de ar, a
70°C, até massa constante para a determinação da matéria seca.
3.2.2 Teor de clorofila
Os níveis de Cd estudados para as avaliações dos pigmentos nas duas
espécies foram: controle, 45 e 90 μmol Cd L
-1
. Para cada data de coleta do
experimento (1, 12 e 20 DAT) foi coletada uma folha completamente expandida
por vaso, sendo três repetições, localizadas entre o ápice e o meio da planta,
sendo imediatamente acondicionadas em papel de alumínio e colocadas em
caixa de isopor com gelo, para a quantificação dos pigmentos e da atividade de
21
enzimas. A quantificação das clorofilas a, b e total foi realizada segundo Arnon
(1949).
3.2.3 Teor de carotenóide
As coletas das folhas e determinação dos níveis de Cd para a definição
dos teores de carotenóides foram feitos como para a determinação dos teores de
clorofila, nas duas espécies. A extração e a quantificação foram realizadas de
acordo com Duke & Kenyon (1986), com algumas modificações.
Uma amostra de 400 mg de folhas foi macerada em 10 mL de KOH em
metanol (6% w/v) e, em seguida, centrifugada, a 5.000 g. por 5 minutos, sendo o
sobrenadante depositado num funil de separação. Foram adicionados também ao
funil de separação 3mL de éter de petróleo, com agitação vigorosa. A epifase foi
coletada (após +
15 minutos) com o auxílio de uma pipeta automática e ao
extrato foi adicionado, por mais duas vezes, o éter de petróleo. Após completar o
volume final da fase etária, procedeu-se à leitura espectrofotométrica do β-
caroteno a 445 nm.
Os teores do β-caroteno foram quantificados utilizando-se o coeficiente
de absortividade molar 2500 (Sandmann & Börger, 1983).
3.2.4 Potencial hídrico
O estado hídrico das duas espécies estudadas foi avaliado por meio de
medidas do potencial hídrico de base (Ψ
W
máximo), realizados com auxílio de
uma câmara de pressão (Soil Moisture – Modelo 3005), em folhas
completamente expandidas do 3º ou 4º nó. As avaliações foram realizadas em
uma folha de cada repetição, sendo quatro repetições por tratamento. As
avaliações foram realizadas de acordo com as épocas de coleta e as doses de Cd
já citadas para os pigmentos, sempre antes do amanhecer.
22
3.2.5 Teores de Cd e o dos nutrientes
Após a determinação da matéria seca de ambas as espécies, estas foram
moídas em moinho tipo Wiley equipado com peneira com malha de 0,38 mm
para a digestão nitroperclórica e posterior análise dos teores de P, K, Ca, Mg, S,
Cu, Fe, Mn, Zn e Cd (Silva, 1999). Nitrogênio foi extraído por digestão pelo
método de Kjeldahl.
O N oriundo da digestão Kjeldahl do material vegetal foi dosado por
titulação. Os elementos Ca, Mg, Cu, Fe, Mn, Zn e Cd da digestão nitroperclórica
do material vegetal foram determinados por espectrometria de absorção atômica;
o P foi determinado por colorimetria pelo método do fosfo-molibdato; o K por
fotometria de chama e o S da digestão nitroperclórica do material vegetal foi
mensurado por turbidimetria (Malavolta et al., 1989).
3.2.6 Peroxidação de lipídeos
Folhas completamente expandidas do 3º ou 4º nó e pontas de raízes das
duas espécies estudadas foram colhidas de três repetições de cada tratamento e
imediatamente envolvidas em papel alumínio e acondicionadas no gelo, para a
determinação da peroxidação de lipídeos. As datas de coletas (1, 12 e 20 DAT) e
níveis de Cd (0, 45 e 90 μmol Cd L
-1
) são aquelas já mencionadas anteriormente.
A peroxidação de lipídeos foi avaliada a partir da produção de
metabólitos reativos a ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), principalmente
malondialdeído (MDA), baseado nos trabalhos de Heath & Packer (1968) e
Buege & Aust (1978). Amostras de 200 mg de tecido foliar e radicular foram
maceradas com 5 mL de TCA (0,1%). Após completa homogeneização, 1,4 mL
do homogeneizado foi transferido para o tubo de Eppendorf para ser
centrifugado a 10.000 rpm por 5 minutos.
Do sobrenadante foi retirada uma alíquota de 0,5 mL, à qual foram
adicionados 2 mL de TCA 20 % contendo 0,5 % de TBA. A mistura foi deixada
23
em banho-maria, a 95°C, por 30 minutos e resfriada em gelo logo em seguida,
por 10 minutos. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro a 535 e 600
nm. A quantidade do MDA foi expressa em nmol g
-1
de tecido fresco.
3.2.7 Atividade de enzimas antioxidantes
As coletas para a determinação das atividades enzimáticas foram
realizadas em P. glomerata no 1, 12 e 20 DAT e nos níveis de contaminação por
Cd de 0, 45 e 90 μmol L
-1
.
3.2.7.1 Extração protéica
Para o desenvolvimento da pesquisa foi necessário utilizar métodos
que otimizassem a atividade das enzimas antioxidantes em P. glomerata
submetidas ao estresse ao Cd. Para isso, a extração do material vegetal foi feita
com 200 mg de tecido fresco das raízes e folhas maceradas, adicionando-se 800
μL de tampão de extração contendo: tampão fosfato de potássio 100 mM, pH
7,8; EDTA 100 mM e L-ácido ascórbico 1 mM. De cada tratamento, foram
coletadas três plantas para a determinação da extração protéica, sendo utilizadas
folhas completamente expandidas, coletadas do 3º ou 4º nó e ponta de raízes
(+
3cm a partir do ápice), que foram envolvidas em papel alumínio e colocadas
no gelo, sendo coletadas no 1º, 12º e 20º DAT.
3.2.7.2 Teor protéico
O teor protéico foi analisado pelo método de Bradford (1976).
3.2.7.3 Atividade da catalase
A atividade da catalase (CAT) (EC 1.11.1.6) foi determinanda de acordo
com o método descrito por Kraus et al. (1995), com algumas modificações,
conforme Azevedo et al. (1998). A CAT foi determinada por espectrofotometria
24
a 28°C, em uma mistura de reação final de 2 mL, contendo tampão fosfato de
potássio 100 mM (pH 7,0), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) 12,5 mM e água. A
reação foi iniciada pela adição de 30 μL do extrato e a atividade determinada
seguindo-se a decomposição de H
2
O
2
, por 1,5 minutos em intervalos de 10
segundos, por meio das alterações na absorbância a 240 nm, com um coeficiente
de extinção molar de 0,0394 mM
-1
cm
-1
. Os resultados foram expressos em μmol
de H
2
O
2
consumido por minuto e por mg proteína.
3.2.7.4 Atividade da ascorbato peroxidase
Para a atividade da ascorbato peroxidase (APX) (EC 1.11.1.11), a
metodologia empregada foi de acordo com Nakano &
Asada (1981), estimando-se a taxa de oxidação do ascorbato (coeficiente de
extinção de 2,8 mM
-1
cm
-1
). O meio de reação foi incubado a 28°C, contendo o
composto de tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0, peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) 0,1 mM, L-ácido ascórbico 0,5 mM, água destilada e 30 μL
do extrato protéico, com o volume final de tampão de incubação de 2 mL. A
taxa de oxidação do ascorbato foi monitorada a 290 nm, durante 3 minutos, a
cada 15 segundos e a atividade da enzima expressa em μmol de ascorbato
oxidado mg proteína
-1
min
-1
.
3.2.7.5 Atividade da guaiacol peroxidase
A atividade da guaiacol peroxidase (GPX) (EC 1.11.1.7) foi determinada
segundo Souza & MacAdam (1998), observando-se a formação de tetraguaiacol
à temperatura de 28°C. O meio de reação tendo como volume final 2 mL foi
composto por tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0), peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
), guaiacol 3,5 mM, água destilada e 10 μL do extrato protéico.
O aumento da absorbância devido à oxidação do guaiacol (coeficiente de
extinção de 26,6 mM
-1
cm
-1
) foi monitorado a 470 nm, durante 1 minuto e a cada
25
10 segundos. A atividade da enzima foi expressa em μmol de H
2
O
2
degradado
por minuto e por mg de proteína.
3.2.7.6 Atividade da glutationa redutase
A atividade da glutationa redutase (GR) (EC 1.6.4.2) foi determinada
como descrito por Cakmak et al. (1991), monitorando-se a taxa de oxidação do
NADPH com decréscimo na absorbância a 340 nm. O meio de reação foi
incubado a 28°C, contendo o composto de tampão fosfato de potássio 50 mM
(pH 7,8), glutationa oxidada (GSSG) 1 mM, NADPH 0,075 mM, água destilada
e 30 μL do extrato protéico. Para o cálculo da atividade da GR, foi utilizado o
coeficiente de extinção 6,2 mM
-1
cm
-1
, monitorado a 340 nm, durante 3 minutos
e a cada 15 segundos. A atividade da enzima foi expressa em μmol de GSSG
reduzido por minuto e por mg de proteína.
3.2.7.7 Atividade da superóxido dismutase
A atividade da superóxido dismutase (SOD) (EC 1.15.1.1) foi
determinada segundo sua capacidade de inibir a redução fotoquímica do
nitrobluetetrazolium (NBT), de acordo com a metodologia descrita por
Beauchamp & Fridovich (1971). O meio de reação tendo 2 mL como volume
final continha o tampão fosfato de potássio 50mM (pH 7,8), metionina 14 mM,
EDTA 0,1 μM, NBT 1 mM, riboflavina 2 μM e 50 μL do extrato protéico. A
riboflavina foi adicionada no final. Os tubos de ensaio contendo as amostras e os
tubos controle (sem amostras) foram colocados sob uma fonte de luz
fluorescente de 20 W. A reação foi iniciada quando se ligou a luz, que
permaneceu acesa por 10 minutos, finalizando a reação quando se desligou a
fonte de luz. O tubo de ensaio para o branco foi mantido no escuro. A leitura da
absorbância da solução foi feita a 560 nm. A atividade da SOD é a medida da
redução do NBT na luz, sem a proteína menos a redução do NBT com a
26
proteína. Uma unidade da atividade é a quantidade de proteína requerida para
inibir 50% da redução inicial do NBT sob a luz.
3.2.8 Avaliações anatômicas
A estrutura anatômica das folhas foi estudada no final do período
experimental para as duas espécies e nos 5 níveis de Cd, em folhas totalmente
expandidas (3º e 4º pares) e conservadas em álcool 70º GL. Os cortes
transversais das seções foliares foram realizados com auxílio do micrótomo de
mesa. As seções transversais foram clarificadas em solução a 1% de hipoclorito
de sódio e, em seguida, lavadas em água destilada e coradas com o corante azul
de astra-safranina. As lâminas foram montadas em água glicerinada 50% (Kraus
& Arduin, 1997). As lâminas das seções transversais foram fotografadas com
câmera digital, utilizando-se microscopia de luz.
Para as avaliações de caracterização dos estômatos, foram efetuados
cortes paradérmicos nas superfícies abaxial e adaxial na região mediana das
folhas, de acordo com Labouriau et al. (1961). As seções paradérmicas foram
montadas entre lâmina e lamínula, diretamente com a solução corante (safranina
1% em água glicerinada 50%). Para a determinação das características dos
estômatos (densidade estomática por mm
2
e diâmetro polar e equatorial, tanto
para a superfície adaxial quanto para a superfície abaxial), os cortes
paradérmicos foram fotografados com câmera digital ao microscópio. A partir
das fotos, com auxílio do software Sigma Scan, foram realizadas as contagens de
estômatos, das células epidérmicas por mm
2
e as medições dos diâmetros
equatoriais e polares.
3.2.9 Eficiência fotoquímica do fotossistema II
A eficiência fotoquímica do FSII (Fv/Fm) foi avaliada em folhas
expandidas de mudas de E. Camaldulensis, utilizando, para isso, o fluorômetro
27
portátil (Plant Efficiency Analyser – PEA) (Hansatech Instruments Ltd.). A
razão Fv/Fm foi determinada após as folhas serem pré-condicionadas no escuro
por 30 minutos, por meio da medição da fluorescência rápida in vivo (Fv=Fm-
Fo, em que Fm=fluorescência máxima; Fv=fluorescência variável e
Fo=fluorescência mínima). As medições foram feitas por vaso, contendo uma
planta casa e em uma folha por planta, em cada data de coleta (1, 12 e 20 DAT)
e nas doses de Cd de 0, 45 e 90 μmol Cd L
-1
.
3.3 Análise dos dados
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância,
determinando-se também o coeficiente de variação (CV), pelo programa
estatístico Sigma Plot. O erro padrão da média (EPM) foi também determinado
para cada média estudada. Os dados de produção de matéria seca, dos teores dos
nutrientes e do Cd na parte aérea e raízes foram analisados por meio de equações
de regressão, podendo ser os ajustes lineares ou quadráticos, enquanto as médias
das características anatômicas foram comparadas pelo teste de Tukey, a 5%.
Empregou-se Sigma Plot para as determinações das equações de regressão e o
programa Sisvar para a comparação das médias anatômicas.
28
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Experimento I: Respostas anatômicas e fisiológicas de Pfaffia glomerata
submetida a doses crescentes de Cd em solução
nutritiva
4.1.1 Matéria seca e sintomas visuais
O efeito das doses de Cd na produção de matéria seca pode ser
observado na Figura 1. Verificou-se uma tendência na inibição do crescimento
por meio de um decréscimo na produção de matéria seca da parte aérea em 28%
e, na matéria seca das raízes, em 54%, no tratamento de maior dose do metal (90
μmol Cd L
-1
) em relação ao controle.
O efeito do Cd na razão da matéria seca entre as raízes e a parte aérea
(R/PA) foi de 0,84 para o tratamento controle e de 0,49 para o tratamento de
maior dose de Cd. O Cd é um elemento tóxico, capaz de reduzir a R/PA como
resposta do efeito de fitotoxidez (Barceló & Poschenrieder, 1990).
O decréscimo na produção da matéria seca das raízes de P. glomerata
pode ser confirmado por meio de observações visuais de toxidez, observando-se
redução no comprimento e no volume radicular (Figura 2). Na parte aérea, as
folhas apresentaram, como sintoma visual, redução no tamanho do limbo foliar,
murcha e algum amarelecimento, com o aumento das doses de Cd (Figura 3).
Em plantas de ervilha, as raízes foram menos afetadas pela toxidez de
Cd do que a parte aérea (Sandalio et al., 2001). De acordo com Barceló et al.
(1988), a menor sensibilidade das raízes ao Cd poderia ser explicada pela
capacidade desse órgão de acumular o metal em sua forma não ativa. A maioria
das espécies acumula o Cd nas raízes, não o transportando para a parte aérea. O
desequilíbrio nutricional causado pelo Cd causou sintomas visuais de toxidez
similares à clorose férrica em plantas de trigo (Ouzounidou et al., 1997).
29
Cd (μmol L
-1
)
01525 45 90
Matéria seca (g)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
FIGURA 1 Produção de matéria seca de raízes ( ● ) e parte aérea ( ○ ) de P.
glomerata submetida a doses de Cd, em solução nutritiva, durante
período de 20 dias. Cada ponto representa a média±erro padrão de
três repetições.
FIGURA 2 Sistema radicular de P. glomerata aos 16 dias após indução do
tratamento (DAT), na presença de doses de Cd, em solução
nutritiva.
30
FIGURA 3 Parte aérea de P. glomerata aos 16 dias após indução do tratamento
(DAT), na presença de doses de Cd, em solução nutritiva.
4.1.2 Teores de pigmentos
O tempo de exposição ao metal e o aumento dos níveis de Cd em
solução nutritiva afetaram a razão clorofila a/b e o teor de clorofila total (Figura
4A e B). Nas doses de 45 e 90 μmol Cd L
-1
, o efeito do Cd na razão clorofila a/b
(Figura 4A) foi verificado no 1º e 20º DAT, por afetar mais a clorofila a do que
a b e, aos 12 DAT, foi verificado maior efeito do Cd na clorofila b. As maiores
variações na razão clorofila a/b foram verificadas aos 12 DAT e na dose de 45
μmol Cd L
-1
e também aos 20 DAT e na dose de 90 μmol Cd L
-1
, com aumento
de 56% e redução de 84%, respectivamente, em relação ao seu controle. No
maior tempo de exposição ao Cd e na dose mais elevada do metal, a clorofila a
mostrou-se mais sensível do que a clorofila b. De acordo com estes resultados,
pode-se ressaltar que há um comprometimento da eficiência da captação de
31
energia do fotossistema II e redução do transporte de elétrons (Küpper et al.,
2002), comprometendo o bom funcionamento do aparato fotossintético.
O efeito das doses de Cd nos teores de clorofila total pode ser verificado
na Figura 4B. Na dose de 45 μmol Cd L
-1
, verificou-se elevada redução no teor
total de clorofila aos 12 DAT e ligeiro aumento nas outras datas. Na dose de 90
μmol Cd L
-1
, verificou-se que, no 1º DAT, o teor total de clorofila aumentou
pouco em relação ao seu controle, enquanto, nas datas seguintes, houve redução
da clorofila total. Na dose de 90 μmol Cd L
-1
, quando os sintomas de toxidez
foram mais severos, o teor total de clorofila foi reduzido em 56% aos 12 DAT e
em 23% aos 20 DAT, em relação ao controle. A redução do teor de clorofila na
presença do Cd tem sido explicada pelo fato de este interferir na biossíntese do
pigmento, inibindo a formação do ácido δ-aminolevulínico (ALA) e também por
meio da inibição da redutase do protoclorofilídio, a enzima chave da
fototransformação do protoclorofilídio-clorofilídio (Stobart et al., 1985).
O efeito do Cd nos pigmentos pode também causar variações na
permeabilidade da membrana e na ultra-estrutura do cloroplasto, levando à
peroxidação dos lipídeos e, consequentemente, alterando as atividades das
peroxidases e, até mesmo, causando redução de outros antioxidantes, como, por
exemplo, os carotenóides, responsáveis por ajudar na diminuição dos danos
oxidativos (Somashekaraiah et al., 1992).
32
(A)
Clotofila a/b
0
1
2
3
4
5
(B)
Cd (μmol. L
-1
)
04590
Clotofila Total (mg. g
-1
MF)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
(B)
FIGURA 4 Relação de clorofila a/b (A) e teores de clorofila total (B) em plantas
de P. glomerata, no 1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT, submetidas a três
doses de Cd, em solução nutritiva. Todas as barras são médias±erro
padrão de três repetições.
33
No presente estudo, as doses de Cd causaram redução nos teores de
carotenóides com o decorrer do tempo de exposição, em relação ao seu controle
(Figura 5). Na dose de 90 μmol Cd L
-1
, observou-se ligeiro aumento nos teores
de carotenóides aos 12 e 20 DAT, em relação à dose de 45 μmol Cd L
-1
. Como
os carotenóides são considerados agentes de defesa antioxidativa da planta, esta
parece ter aumentado o teor do pigmento, a fim de aumentar a sua tolerância ao
metal.
Cd (μmol L
-1
)
04590
β
caroteno (mg g
-1
MF)
0
15
30
45
60
FIGURA 5 Teores de carotenóides (mg g
-1
MF) em folhas de P. glomerata, no
1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT, submetidas a três doses de Cd, em
solução nutritiva. Todas as barras são médias±erro padrão de três
repetições.
Em Bacopa monnieri, a presença de 100 μmol Cd L
-1
reduziu
ligeiramente o teor de carotenóides com o tempo de exposição ao metal (Mishra
et al., 2006). Segundo estes autores, os carotenóides servem como proteção da
34
planta contra radicais livres que causam danos fotossintéticos. Logo, um menor
aumento nos teores de carotenóides pode implicar numa suposta função destes
contra o estresse oxidativo.
4.1.3 Potencial hídrico
O potencial hídrico da P. glomerata nas diferentes doses e datas de
coleta do material é apresentado na Figura 6. Os valores de potencial hídrico
encontrados para os tratamentos que receberam o Cd foram menores do que no
tratamento controle, para todas as datas estudadas. Segundo Barceló &
Poschenrieder (1986), a exposição das plantas aos metais pesados,
especialmente ao Cd, é conhecida por deteriorar a condição hídrica da plantas.
Aos 12 e 20 DAT, o potencial hídrico foi menor na concentração de 90 μmol Cd
L
-1
, tendo, no 1ºDAT, a pressão da água na planta sido igual nas doses de 45 e
90 μmol Cd L
-1
. Ainda no 1º DAT, foi possível observar que as plantas
apresentaram-se mais túrgidas, mesmo aquelas do tratamento controle. O menor
potencial hídrico observado com o aumento da concentração do metal e com o
tempo de exposição pode ser verificado também por meio dos sintomas visuais,
como a murcha, o encurvamento do pecíolo e queda de folhas (Figura 3).
Em diferentes populações de Silene cucubalus, o efeito de doses
elevadas de Cu causou redução no teor de água naquelas plantas mais sensíveis
ao metal, enquanto na população mais tolerante ao Cu nenhum efeito foi
verificado no teor de água na planta, com o decorrer do tempo (Lolkema &
Voojs, 1986). Outras espécies também têm mostrado alguma alteração no
balanço hídrico, na presença de metal pesado. Em folhas de crisântemo, o
potencial hídrico respondeu com pouca variação a presença do Cd, após dois
dias de exposição. Porém, no final do experimento (49 dias), o tratamento com o
metal apresentou valor de potencial hídrico 300% menor do que o controle e as
plantas tiveram também a pressão de turgor e a taxa de transpiração reduzidas e
35
a resistência estomática aumentada, tudo isso fazendo com que a planta
murchasse (Kirkham, 1978). Redução na taxa de transpiração e no uso eficiente
de água com o aumento das doses de Cd foi observada em plantas de ervilha
(Sandalio et al., 2001) crescidas durante 28 dias em solução nutritiva. De acordo
com estes autores, o metal pesado pode afetar o movimento de água na planta,
reduzindo o tamanho e o número de vasos de xilema e, ainda, alterando o
balanço de hormônios.
Cd (μmol L
-1
)
04590
Potencial hídrico (MPa)
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
FIGURA 6 Potencial hídrico total (MPa) de plantas de P. glomerata, no 1º (■),
12º (■) e 20º (■) DAT, submetidas a três doses de Cd, em solução
nutritiva. Todas as barras são médias±erro padrão de três repetições.
4.1.4 Teores de Cd e o estado nutricional
As concentrações do metal nos tecidos da planta foram crescentes com o
aumento das doses do Cd em solução nutritiva (Figura 7). A quantidade máxima
36
de metal acumulado na planta ficou distribuída com, aproximadamente, 84%
para as raízes e apenas 16% para a parte aérea. Entretanto, vale a pena ressaltar
que a quantidade de Cd encontrada na parte aérea de P. glomerata após a dose
de 45 μmol Cd L
-1
sob condições hidropônicas, está de acordo com a faixa
encontrada em Brassica napus crescida em um solo contaminado reconstituído
(100 mg Cd kg
-1
MS).
As espécies Brassica napus e Thlaspi caerulenscens são conhecidas por
seus potenciais de hiperacumuladora de Cd, acumulando em seus tecidos
foliares concentrações superiores a 100 mg Cd kg
-1
MS. Tal concentração foi
também encontrada em P. glomerata nos tratamentos de 45 e 90 μmol Cd L
-1
(186 e 238 mg kg
-1
), respectivamente, sem que maiores danos visuais fossem
observados, principalmente na dose de 45 μmol Cd L
-1
.
Segundo Baker (1981), uma das maneiras da planta tolerar algum metal
tóxico em seus tecidos é evitar a translocação deste para a parte aérea. De acordo
com a literatura, pouco se sabe a respeito da translocação diferencial de um
metal pesado pela planta e também dos diferentes transportadores que estão
envolvidos na passagem deste metal para o interior do xilema e, finalmente, sua
distribuição para a parte aérea (Sandalio et al., 2001). O Cd pode acumular no
apoplasto das raízes por meio das interações iônicas com os grupos carboxil e ou
sulfidril, a partir de componentes de parede celular ou, ainda, parte do metal
pode ser complexada pelas fitoquelatinas e, posteriormente, ser seqüestrada no
vacúolo (Cobbett, 2000; Prasad, 1995).
Nas raízes, a quantidade máxima acumulada de Cd foi de 1.223 mg. kg
-1
no tratamento de 90 μmol Cd L
-1
, depois de 20 dias de exposição, indicando ser
este o órgão acumulador do Cd. De acordo com Hall (2002), o maior acúmulo de
Cd nos tecidos radiculares pode servir como estratégia da planta para tolerar o
metal, imobilizando-o nas paredes celulares ou adsorvendo-o pelos carboidratos
extracelulares.
37
Cd (μmol L
-1
)
01525 45 90
Cd (mg kg
-1
)
0
300
600
900
1200
1500
FIGURA 7 Teores de Cd (mg kg
-1
) nas raízes ( ● ) e parte aérea ( ○ ) de P.
glomerata submetida a doses crescentes de Cd, em solução
nutritiva, durante período de 20 dias. Cada ponto representa a
média±erro padrão de três repetições.
O estado nutricional das raízes e da parte aérea foi alterado pela
presença do Cd em solução nutritiva, sendo os macronutrientes afetados
principalmente nas doses mais elevadas do metal, 45 e 90 μmol Cd L
-1
(Figura
8). No geral, Cd tem mostrado interferir na absorção, no transporte e no
metabolismo de vários nutrientes (Ca, Mg, P e K) e também no transporte da
água nas plantas (Das et al., 1997). Para a espécie estudada, o teor de N nas
raízes reduziu a partir da dose de 25 μmol Cd L
-1
. O teor de N na parte aérea
teve o seu ponto máximo (49 g kg
-1
) no tratamento de 25 μmol Cd L
-1
, tendo, no
tratamento de 90 μmol Cd L
-1
, o teor de N sido inferior (34 g kg
-1
) ao tratamento
controle (41 g kg
-1
). Em plantas de arroz tratadas com Cd, o teor de N, tanto nas
38
raízes quanto na parte aérea, foi também reduzido (Hasson et al., 2005), como
verificado em P. glomerata. Neste trabalho, também se verificou que a toxidez
de Cd foi mais severa em plantas que utilizaram o NO
3
-
como fonte de N do que
naquelas tratadas com NH
4
+
. A fonte utilizada para o N foi o NH
4
NO
3
,
sugerindo, de acordo com Hassan et al. (2005), que o efeito do Cd poderia ter
sido menor se o suprimento do N fosse feito apenas com o NH
4
+
, indicando a
ocorrência de um efeito antagônico entre o Cd e o N-NH
4
+
e um efeito
sinergístico entre o Cd e o N-NO
3
-
. Cádmio reduziu também a absorção de
nitrato e seu transporte das raízes para a parte aérea, o que pode também ser
atribuído à inibição da atividade da nitrato redutase na parte aérea, como
verificado por Hernández et al. (1996).
O teor de P na parte aérea resultou o valor máximo no tratamento de 25
μmol Cd L
-1
(4 g kg
-1
), enquanto, para as raízes, o máximo foi observado no
tratamento com 15 μmol Cd L
-1
(2,3 g kg
-1
), sem muita alteração nos valores
para os demais tratamentos (Figura 8). Em uma espécie hiperacumuladora do
metal Zn, os teores de P em todas as partes da planta foram aumentados até a
dose de 400 μmol Cd L
-1
(Yang et al., 2004), dose esta bem superior à do
presente estudo. Em espécies mais sensíveis ao Cd, como os girassóis, por
exemplo, o teor de P foi reduzido na presença de Al, Cd e Zn (Saber et al.,
1999). Possivelmente, esta redução pode estar relacionada à interação destes
íons com PO
4
-
nas raízes ou, ainda, como resultado da redução da taxa
transpiratória, provocando a queda na energia requerida para a absorção ativa do
P (Saber et al., 1999).
39
N (g kg
-1
)
0
10
20
30
40
50
P (g kg
-1
)
0
1
2
3
4
5
K (g kg
-1
)
0
10
20
30
40
Ca (g kg
-1
)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Cd (μmol L
-1
)
01525 45 90
Mg (g kg
-1
)
0,0
1,5
3,0
4,5
6,0
01525 45 90
S (g kg
-1
)
0
1
2
3
4
FIGURA 8 Teores de macronutrientes (g kg
-1
) nas raízes ( ● ) e parte aérea ( ○ )
de P. glomerata submetida a doses crescentes de Cd, em solução
nutritiva, durante período de 20 dias. Cada ponto representa a
média±erro padrão de três repetições.
A concentração do K nos tecidos radiculares foi decrescente até a dose
de 45 μmol Cd L
-1
, com ligeiro aumento no tratamento de maior dose do metal.
Este aumento pode indicar um efeito de concentração do K em consequência da
redução acentuada na produção da matéria seca da raiz com o aumento da dose
do Cd. O efeito do Cd nos teores de K da parte aérea apresentou aumento apenas
40
na dose de 25 μmol Cd L
-1
. Para os demais tratamentos, os teores de K foram
iguais aos do controle. A toxidez de Cd também afetou os toeres de P e K em
plantas de ervilha (Sandalio et al., 2001). Estes autores encontraram redução na
concentração dos nutrientes na parte aérea com o aumento do Cd em solução
nutritiva, enquanto os teores desses elementos nas raízes foram reduzidos apenas
nas doses mais elevadas do metal. Redução nos teores de K com a adição de Cd
foi também verificada por Gussarsson et al. (1996). Segundo os autores, a
redução do K pode ser devido à redução na atividade da ATPase, responsável
pelo gradiente de próton necessário para a absorção do K
+
.
O efeito do Cd nos teores de Ca da parte aérea resultou num ligeiro
aumento enquanto nas raízes os teores de Ca foram praticamente iguais ao
controle em todos os tratamentos (Figura 8). Quanto aos teores de Mg, estes
tiveram comportamento bastante semelhante ao do Ca, Ainda assim, observou-
se que, no tratamento com 15 μmol Cd L
-1
, o teor de Mg nas raízes aumentou,
seguido de uma queda e de posterior aumento na dose de 45 μmol Cd L
-1
. Já na
parte aérea, o Mg comportou-se de forma contrária ao observado para as raízes.
Isto sugere que o Mg tem grande influência do íon Cd
2+
quanto à sua
mobilidade na planta. Segundo Marschner (1995), a absorção de cátions
polivalentes, como o Ca
2+
e o Mg
2+
, é bastante influenciada pela presença de
outros cátions polivalentes. Metais pesados, como o Cd e PB, competem com o
Ca pelos canais de Ca, interferindo na absorção do Ca (Perfus-Barbeoch et al.,
2002). Resultados semelhantes ao do presente estudo, para as concentrações de
Ca e Mg na planta, foram verificados por Sandalio et al. (2001) em plantas de
ervilha. Como o Mg faz parte da molécula de clorofila, uma redução nos teores
deste nutriente resultaria na deficiência da molécula na planta, causando a
clorose nas folhas (Figura 4).
Nas raízes, os teores de S foram reduzidos a partir da dose de 45 μmol
Cd L
-1
, permanecendo igual na dose superior do metal (Figura 8). Para a parte
41
aérea, observou-se maior redução nos teores de S apenas n dose de 90 μmol Cd
L
-1
. A homeostase e a detoxificação dos metais Ag, Cd, Cu e Hg e do As estão
relacionadas à capacidade de peptídeos e de proteínas quelarem tais elementos,
que apresentam alta afinidade pelo grupo tiol (Ernst et al., 2008). O S possui
efeito indireto na capacidade da espécie em tolerar certos metais como o Cd,
pois este nutriente faz parte da composição química do aminoácido cisteína. Este
aminoácido é o primeiro produto orgânico estável encontrado na rota da redução
do SO
4
2-
das plantas (Mengel & Kirkby, 1987), sendo requerida em grande
quantidade para a síntese de fitoquelatinas, que são um dos compostos
produzidos pelas plantas, responsáveis pela tolerância aos metais pesados
(Steffens, 1990). A indução da síntese das fitoquelatinas, que são peptídeos de
baixo peso molecular ricos em cisteínas, pelo Cd, foi observada em feijão (Oven
et al., 2001), trigo (Stolt et al., 2003)e milho (Chassaigne et al., 2001), entre
outros.
Efeito do Cd em micronutrientes foram também observados (Figura 9).
Os teores dos micronutrientes Cu, Fe e Zn foram maiores nos tecidos radiculares
do que nos tecidos da parte aérea. Apenas para o Mn houve maior translocação
do elemento para a parte aérea.
Os teores de Cu na parte aérea não variaram muito em relação ao seu
controle, quando foram aumentando as doses de Cd em solução nutritiva (Figura
9). Nas raízes de P. glomerata, os teores de Cu foram crescentes até a dose de 45
μmol Cd L
-1
, seguindo-se uma queda, para a dose de maior concentração de Cd
estudada. Apesar da redução no teor de Cu no tratamento de 90 μmol Cd L
-1
,
este ainda foi superior ao teor de Cu do tratamento controle. Porém, pode-se
observar, neste caso, um efeito de concentração do elemento nos tecidos da
planta, pois a matéria seca produzida neste tratamento foi reduzida em relação
ao seu controle. Como o Cu é um elemento que apresenta alta afinidade por
pepitídeos e pelo grupo sulfidril, em particular por proteínas ricas em cisteína
42
(Marschner, 1995), este elemento estaria relacionado ao metabolismo de
tolerância das plantas aos metais pesados. Logo, a redução do Cu nas doses mais
elevadas do Cd provocou redução na tolerância da P. glomerata ao estresse
abiótico.
01525 45 90
Mn (mg kg
-1
)
0
50
100
150
200
250
Zn (mg kg
-1
)
0
20
40
60
80
100
120
Cd (μmol L
-1
)
01525 45 90
Cu (mg kg
-1
)
0
10
20
30
40
50
Fe (mg kg
-1
)
0
700
1400
2100
2800
FIGURA 9 Teores de micronutrientes (mg kg
-1
) na raízes ( ● ) e parte aérea ( ○)
de P. glomerata submetida a doses crescentes de Cd, em solução
nutritiva, durante período de 20 dias. Cada ponto representa a
média±erro padrão de três repetições.
Nas raízes de P. glomerata, os teores de Fe foram bem maiores do que
na parte aérea, sendo crescentes a partir de 15 μmol Cd L
-1
, tendo uma queda
apenas no tratamento de maior dose do metal. Na parte aérea, estes teores pouco
variaram, sugerindo que o Cd pode ter interferido na translocação do Fe para a
parte aérea. O efeito do Cd nos teores de Fe tem mostrado resultados diferentes,
43
dependendo da espécie de planta e da condição experimental. A absorção e a
translocação do Fe podem ser modificadas pela presença do Cd, pois há
competição pelo mesmo transportador de Fe
2+
da família IRT1, principalmente
em condições de baixas concentrações de Fe em solução (Nakanishi et al.,
2006). A deficiência de Fe induzida pelo Cd foi encontrada em B. pendula
(Gussarsson et al., 1996) e ervilha (Sandalio et al., 2001), enquanto resultado
oposto foi verificado por Chaoui et al. (1997), em plantas de feijão.
Hernández et al. (1998) também observaram o efeito do Cd na absorção
do Fe em plantas de ervilha crescendo sob 50 μmol L
-1
do metal, resultando em
um teor do micronutriente pouco afetado aos 10 dias após indução do
experimento e um teor sendo reduzido após poucas horas de exposição,
sugerindo alguma adaptação da espécie ou, ainda, um efeito de concentração. A
deficiência do Fe induzida pela presença do Cd é responsável pelo sintoma
visual de clorose observado no tratamento de 90 μmol Cd L
-1
(Figura 4). O Fe
tem importante função como componente de enzima presente na transferência de
elétrons, tal como o citocromo, envolvidos na fotossíntese (Marschner, 1995),
por isso causa a clorose como sintoma de deficiência.
A presença de Cd reduziu acentuadamente os teores de Mn nas raízes e
na parte aérea, evidenciando o antagonismo entre Mn e Cd, porém, não
impedindo a tranlocação do Mn para a parte aérea (Figura 9). No tratamento de
15 μmol Cd L
-1
, houve redução nos teores de Mn encontrados nas raízes e na
parte aérea de, aproximadamente, 80% e 60%, respectivamente, em relação ao
tratamento não contaminado. Para os demais tratamentos, os teores de Mn
alteraram pouco. Redução no teor de Mn foi também observadaa na parte aérea
de plantas de ervilha (Sandalio et al., 2001) e de B. pendula (Gussarsson et al.,
1996), enquanto nas raízes de ervilha o Mn foi pouco afetado na presença de 50
μmol Cd L
-1
(Sandalio et al., 2001) e não sofreu nenhuma alteração significativa
em raízes de B. pendula (Gussarsson et al., 1996).
44
A toxidez por Cd afetou os teores de Zn, tanto na parte aérea quanto nas
raízes (Figura 10). Nas raízes, houve aumento tanto nos teores de Zn quanto na
presença do metal. Este aumento foi observado na dose de 15 μmol L
-1
de Cd,
mantendo-se sem grandes alterações até a dose maior do Cd. Na parte aérea, o
efeito foi oposto ao das raízes, observando-se redução nos teores de Zn no
tratamento de 15 μmol L
-1
de Cd, os quais se mantiveram sem grandes alterações
até o tratamento de maior dose de Cd. Dessa forma, observa-se que a presença
do Cd não limitou a absorção do Zn, porém, limitou sua translocação para a
parte aérea. Em B. pendula, Gussarsson et al. (1996) observaram que a presença
do Cd pouco alterou os teores de Zn, tanto nas raízes quanto na parte aérea.
De modo geral, o Cd interferiu na translocação dos micronutrientes das
raízes para a parte aérea, com exceção do Mn, que teve o maior teor do elemento
retido na parte aérea. Variações na atividade da H
+
- ATPase e na seletividade do
transportador IRT1 são alguns dos fatores que podem interferir na translocação
de um nutriente para a parte aérea, quanto o vegetal for submetido ao Cd (Fodor
et al., 1995). A atividade da H
+
- ATPase em raízes de girassol e de trigo foi
reduzida na presença de Cd, possivelmente devido a modificações nos
constituintes de membrana (Fodor et al., 1995). Porém, em plantas de ervilha
que apresentavam deficiência em Fe, a atividade da H
+
- ATPase não foi
associada com o aumento do Cd acumulado nas raízes (Cohen et al., 1998).
O IRT1 é outro fator que interfere na translocação do Cd, sendo
primeiramente identificado como um transportador de Fe (II), que também pode
transportar Mn, Zn e Cd, estando sua seletividade ao íon dependente do pH da
solução nutritiva (Korshunova et al., 1999). Em Arabidopsis thaliana, os
nutrientes Fe e Zn (Rogers et al., 2000) e Mn (Korshunova et al., 1999) tiveram
sua absorção reduzida devido ao excesso de Cd em solução, sugerindo que o
IRT1 pode também transportar o Cd.
45
4.1.5 Estresse oxidativo induzido pelo Cd
Verificou-se aumento na peroxidação de lipídeos em folhas de P.
glomerata na dose 45 μmol Cd L
-1
, a partir do 12º DAT, sendo este aumento
bastante acentuado aos 20 DAT na dose de 90 μmol Cd L
-1
(Figura 10A).
Enquanto, nas raízes, desde o 1ºDAT, pôde-se observar um aumento nos teores
de MDA produzidos, de maneira que, no tratamento de maior nível de Cd, a
peroxidação de lipídeos alterou-se pouco entre as três datas estudadas (Figura
10B). Para o presente estudo, o dano de maior incidência foi verificado na
membrana celular de folhas do tratamento de 90 μmol Cd L
-1
e aos 20 de
exposição ao Cd, sendo este cerca de 110% superior ao seu controle. Para as
raízes, neste mesmo tratamento, o aumento foi de 86% em relação ao seu
controle. Em Bacopa monnieri, uma espécie aquática, o aumento máximo de
peroxidação de lipídeos de183% foi verificado nas raízes na concentração de
200 μmol L
-1
(Singh et al., 2006).
As membranas celulares de plantas são, geralmente, consideradas como
locais de injúria dos metais (Singh et al., 2006), causando peroxidação dos
lipídeos. A peroxidação da membrana celular afeta severamente a
funcionalidade e a integridade da membrana, podendo causar danos irreversíveis
ao funcionamento da célula (Edreva, 2005). A peroxidação de lipídeos pode ser
iniciada por meio da ativação de espécies de oxigênio, tais como o O
2
-
, OH ou
1
O
2
, ou, ainda, pela ativação da lipogenase (Edreva, 2005). O Cd atua
bloqueando o fluxo de elétrons do fotossistema II, levando à formação de
clorofila excitada, causando a produção destes oxiradicais (Edreva, 2005). Um
aumento nos teores de MDA das folhas e das raízes de P. glomerata expostas ao
Cd no presente estudo indicou que o metal causou danos oxidativos à planta. De
acordo com os resultados encontrados, a toxidez de Cd também induziu o
estresse oxidativo em P. glomerata, assim como em B. monnieri (Mishra et al.,
2006; Singh et al., 2006) e em cevada (Hegedüs et al., 2001).
46
Peroxidação de lipídios (nmol MDA g
-1
MF)
0
70
140
210
280
Cd (μmol. L
-1
)
04590
0
25
50
(B)
(A)
FIGURA 10 Peroxidação de lipídeos (nmol MDA g
-1
MF) em folhas (A) e
raízes (B) de P. glomerata, no 1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT,
submetidas a três doses de Cd, em solução nutritiva. Todas as
barras são médias±erro padrão de três repetições.
Vários mecanismos são utilizados pelas plantas para a detoxificação de
EROs, sendo importante estabelecer se a exposição das plantas ao Cd está
causando efeito prejudicial ou estimulatório às enzimas envolvidas nos
processos de detoxificação. A presença de baixos níveis de EROs pode sugerir
47
respostas adaptativas, enquanto, em altas concentrações de Eros, danos mais
severos são observados, iniciando a morte celular (Benavides et al., 2005).
Em experimentos envolvendo tolerância de plantas a estresse com Cd
em solução nutritiva, tem-se observado aumento nas atividades de enzimas do
sistema antioxidativo, relacionados aos aumentos nas concentrações de EROs
(Vitória et al., 2001; Israr et al., 2006; Singh et al., 2006). A SOD é uma enzima
que faz parte de um grupo responsável pela eliminação destes radicais livres
formados. No presente trabalho, a atividade da SOD foi maior nas folhas do que
nas raízes (Figura 11). Nas folhas, observou-se redução na atividade da SOD, no
tratamento de 90 μmol Cd L
-1
, para os tempos de exposição ao Cd de 12 e 20
DAT, em relação ao seu controle. Nas raízes, onde foram encontrados maiores
teores de Cd, a atividade da SOD aumentou no tratamento de 90 μmol Cd L
-1
para todas as datas observadas, em relação ao seu controle. Porém, maiores
atividades da SOD aos 20 DAT foram encontradas na dose de 45 μmol Cd L
-1
. A
redução ou o aumento da produção de H
2
O
2
pela SOD, de acordo com os níveis
de Cd e do tempo de exposição a este, relacionam-se bem com a peroxidação de
lipídeos observada em P. glomerata, ou seja, a atividade das enzimas que
eliminam o H
2
O
2
produzido não foi suficiente para evitar a peroxidação no
maior nível e tempo de exposição ao Cd.
Vários trabalhos na literatura examinando o efeito do Cd na atividade da
SOD em plantas têm apresentado resultados contraditórios, embora em muitos
deles tenha sido observada redução ou pouca variação na atividade da enzima
(Benavides et al., 2005). Em plantas de B. monnieri cultivadas em solução
nutritiva, a atividade da SOD foi maior nas raízes do que nas folhas, porém,
houve redução na atividade da SOD em maiores concentrações de Cd,
provavelmente devido ao aumento do nível do H
2
O
2
e das EROs derivadas do
estresse (Singh et al., 2006).
48
Cd (μmol. L
-1
)
04590
0,0
1,5
3,0
4,5
6,0
7,5
9,0
SOD (U mg
-1
proteína)
0,0
1,5
3,0
4,5
6,0
7,5
9,0
(A)
(B)
FIGURA 11 Atividade da SOD (U mg
-1
proteína) em folhas (A) e raízes (B) de
P. glomerata, no 1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT, submetidas a três
doses de Cd, em solução nutritiva. Todas as barras são
médias±erro padrão de três repetições.
A CAT, uma das enzimas responsáveis pela eliminação do H
2
O
2
produzido, apresentou maior atividade nas folhas do que nas raízes (Figura 12).
Para as folhas, observou-se pouco aumento na atividade da CAT na dose de 45
μmol Cd L
-1
em relação ao controle. Entretanto, o estresse ao Cd na dose de 90
μmol L
-1
do metal foi observado por aumentar a atividade da CAT no 1º DAT e
49
reduzi-la aos 12 e 20 DAT. O maior valor encontrado para a atividade da enzima
foi observado no 1º DAT para o tratamento com de 90 μmol Cd L
-1
, sendo este
aumento de 64%.
Observou-se redução na atividade da CAT nas raízes com o aumento das
doses de Cd, no 1º DAT (Figura 12B). Aos 12 e 20 DAT, a atividade da CAT
diminuiu na dose de 45 μmol L
-1
e aumentou na dose 90 μmol L
-1
comparada
aos seus controles. Para as raízes, o tempo de exposição ao Cd induziu a
atividade da CAT, diminuindo a quantidade de H
2
O
2
produzida, podendo, assim,
aumentar a tolerância da espécie à dose de 90 μmol Cd L
-1
. No tratamento de
maior dose do metal e aos 20 DAT, houve acréscimo na atividade da CAT de
35% em relação ao seu controle.
Em células de P. glomerata, o aumento da atividade da CAT nas folhas,
em todas as concentrações do Cd, durante o período inicial de exposição ao
metal (1º DAT), contradiz a alguns resultados obtidos em feijão (Chaoui, 1997),
girassol (Gallego et al., 1999), ervilha (Sandalio et al., 2001) e tabaco (Gratão
2003), porém, está de acordo com os resultados em Bacopa monnieri (Singh et
al., 2006; Mishra et al., 2006). Considerando que a CAT é diretamente regulada
pelos níveis de H
2
O
2
(Polidoros & Scandalio, 1999), a atividade aumentada no
período inicial, em todas as concentrações, sugere que esta enzima atuou mais
no início da exposição da planta ao Cd nas folhas, enquanto nas raízes os
tratamentos de maiores estresses promoveram aumento na atividade da CAT.
50
Cd (μmol. L
-1
)
04590
0,4
0,8
1,2
0,0
CAT (
μ
mol H
2
O
2
mg
-1
proteína min
-1
)
0,4
0,8
1,2
0,0
(A)
(B)
FIGURA 12 Atividade da CAT (μmol H
2
O
2
mg
-1
proteína min
-1
) em folhas (A)
e raízes (B) de P. glomerata, no 1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT,
submetidas a três doses de Cd, em solução nutritiva. Todas as
barras são médias±erro padrão de três repetições.
Ao contrário da CAT, a atividade da APX foi maior nas raízes do que
nas folhas (Figura 13). Embora, no controle, tenha sido observada alta atividade
em relação a muitas avaliações realizadas, tem-se que levar em consideração a
atuação do Cd nos tratamentos contaminados, que pode vir a perturbar diversos
processos metabólicos, induzindo o estresse oxidativo, além de ativar o sistema
51
de defesa da planta que levou à participação da CAT, por exemplo, reduzindo os
níveis do H
2
O
2
.
Nas folhas, a atividade da APX foi maior aos 12 DAT para os
tratamentos que receberam Cd e foi menor, no 1º DAT, permanecendo sem
muita alteração aos 20 DAT, em relação ao seu controle (Figura 13A). Isto
sugere que a enzima foi inibida pelo estresse nas primeiras horas de exposição
ao Cd, sendo, em seguida, estimulada pela presença do metal, mantendo em
seguida sua atividade. Já para as raízes, as maiores atividades foram observadas
no 1º DAT, em todos os tratamentos (Figura 13B), porém, não diferiram muito
do controle. Na dose de 45 μmol Cd L
-1
, houve redução expressiva na atividade
da APX, quando aumentou o tempo de exposição ao metal. Quando se adicionou
mais Cd em solução nutritiva (90 μmol L
-1
), a APX mostrou atuar em condição
elevada de estresse, pois foi capaz de manter sua atividade comparada ao
controle.
Mesmo havendo maiores valores de Cd concentrado nos tecidos
radiculares, maiores valores percentuais da atividade da APX foram observados
em folhas de P. glomerata, em relação ao controle, ou seja, as raízes
apresentaram pouco aumento percentual na atividade da enzima. Segundo
Vitória et al. (2001), há evidência da existência de um sinal de estresse oxidativo
transportado das raízes para as folhas, tendo tal mecanismo de sinalização sido
reportado por Karpinski et al. (1999), aumentando a transcrição da APX em
folhas. Resultados semelhantes para a atividade da APX nas raízes e folhas de P.
glomerata foram encontrados em Bacopa monnieri (Singh et al., 2006).
52
Cd (μmol. L
-1
)
04590
0
5
10
15
20
APX (
μ
mol Ascorbato mg
-1
proteína min
-1
)
0
5
10
15
20
(A)
(B)
FIGURA 13 Atividade da APX (μmol ascorbato mg
-1
proteína min
-1
) em folhas
(A) e raízes (B) de P. glomerata, no 1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT,
submetidas a três doses de Cd, em solução nutritiva. Todas as
barras são médias±erro padrão de três repetições.
A enzima GPX também atua na eliminação do H
2
O
2
produzido, porém,
não faz parte do ciclo do ascorbato-glutationa, como o fazem a APX e CAT. Em
P. glomerata, assim como para a APX, observou-se maior atividade da GPX em
raízes do que em folhas (Figura 14). Nas folhas, a adição de Cd na solução
nutritiva na dose de maior estresse estimulou a atividade da enzima, quando
53
aumentou o tempo de exposição ao metal em 12 e 20 DAT. Pode-se observar,
nas folhas (Figura 14A), que a atividade da GPX foi reduzida em todas as doses
de Cd no 1º DAT. O comportamento da atividade da GPX nas folhas foi
bastante semelhante à atividade da APX e contrário ao comportamento da CAT,
no mesmo órgão. Isso indica a importância da atuação das enzimas em conjunto,
pois estas se mostram mais estimuladas ou inibidas em doses e tempos distintos.
Nas raízes, a atividade da GPX alterou-se pouco em relação ao controle
aos 12 e 20 DAT. Porém, na fase inicial do experimento (1º DAT), o estresse
induzido pelo Cd, reduziu a atividade da GPX. Neste caso, tivemos um
comportamento da atividade da GPX nas raízes, contrário ao observado para a
atividade da APX, que apresentou inibição na atividade com o aumento do
tempo de exposição ao metal.
Em Bacopa monnieri, a atividade da GPX nas folhas foi estimulada com
o tempo de exposição ao Cd e com o aumento da dose do metal (Singh et al.,
2006). Entretanto, foi encontrada redução na atividade da enzima nas raízes com
o aumento de exposição ao Cd na maior concentração (200 μmol. L
-1
). Aumento
na atividade da GPX foi também verificada em Nicotiana tabacum quandoo
exposta ao Cd, devido à grande disponibilidade de H
2
O
2
produzido pelo estresse,
principalmente no período final do experimento (Gratão, 2003).
54
Cd (μmol. L
-1
)
04590
0
3
6
9
12
GPX (
μ
mol Guaiacol mg
-1
proteína min
-1
)
0
3
6
9
12
(A)
(B)
FIGURA 14 Atividade da GPX (μmol guaiacol mg
-1
proteína min
-1
) em folhas e
raízes de P. glomerata, no 1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT,
submetidas a três doses de Cd, em solução nutritiva. Todas as
barras são médias±erro padrão de três repetições.
A APX utiliza o ascorbato como doador específico de elétrons para
reduzir o H
2
O
2
à água, gerando o monodehidroascorbato, que precisa ser
regenerado novamante a ascorbato, a fim de manter o sistema antioxidante ativo.
Para isso, outras reações estão envolvidas, intermediadas pela glutationa, a qual
é oxidada (Biemelt et al., 1998). A manutenção do pool da glutationa reduzida
55
para o processo depende da atividade da glutationa redutase (GR). No presente
trabalho, o aumento do estresse ao Cd interferiu na atividade da GR, tanto nas
folhas quanto nas raízes (Figura 15). Nas folhas de P. glomerata, o aumento das
doses de Cd aumentou a atividade da GR, com exceção do período inicial de
exposição ao Cd (1º DAT) que praticamente não alterou em relação ao controle
(Figura 15A).
Nas raízes, a atividade da GR apresentou como tendência geral um
decréscimo com o aumento do tempo de exposição ao Cd (Figura 15B). Porém,
aos 12 DAT, observou-se expressivo aumento na atividade da enzima nas duas
doses de Cd estudadas. Tanto nas folhas quanto nas raízes, os maiores aumentos
na atividade da GR ocorreram aos 12 DAT, sendo de 104% nas raízes e 56% nas
folhas, na dose de 90 μmol Cd L
-1
. Isto sugere que, nestes tratamentos, a enzima
respondeu bem ao Cd acumulado nos tecidos, como função de detoxificação das
EROs induzidas pelo metal, por meio do ciclo da ascorbato-glutationa, enquanto
naqueles tratamentos em que a atividade foi menor, a GR apenas manteve o
nível da glutationa em sua forma reduzida para posterior síntese das
fitoquelatinas (Cobbett, 2000).
Pequenas variações na atividade da GR com o decorrer do tempo de
exposição ao Cd foram verificadas em folhas de ervilha (Sandalio et al., 2001).
Assim como no presente estudo, a atividade da GR foi maior em raízes do que
nas folhas de rabanete (Vitória et al., 2001). No entanto, em Bacopa monnieri, a
atividade da GR foi maior nas folhas (Mishra et al., 2006) do que nas raízes de
plantas exposta ao Cd. Em Alyssum argenteum, uma espécie hiperacumuladora
de Cd, os baixos níveis do metal induziram a atividade da GR, sendo esta
atividade reduzida em maiores níveis (Schickler & Caspi, 1999). Segundo os
autores, esta redução pode ser resultado da ligação direta do Cd ao grupo
sulfidril da enzima, interferindo no ciclo da glutationa. A atividade da GR é
importante para manter alto o nível da relação GSH/GSSH, sendo crucial para o
56
funcionamento do ciclo ascorbato-glutationa, assim como para a síntese das
fitoquelatinas (Cobbett, 2000), responsáveis pela tolerância da planta à
contaminação por metais pesados, principalmente ao Cd (Benavides et al.,
2005).
Cd (μmol. L
-1
)
04590
0,0
0,6
1,2
1,8
GR (
μ
mol NADPH mg
-1
proteína min
-1
)
0,0
0,6
1,2
1,8
(A)
(B)
FIGURA 15 Atividade da GR (μmol NADPH mg
-1
proteína min
-1
) em folhas e
raízes de P. glomerata, no 1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT,
submetidas a três doses de Cd, em solução nutritiva. Todas as
barras são médias±erro padrão de três repetições.
57
O Cd tem sido bastante estudado por induzir o estresse oxidativo em
plantas com respostas diferenciadas na atividade das enzimas do sistema
antioxidativo, como SOD, CAT, APX, GPX e GR, dependendo da concentração
do metal, do órgão, da idade, da espécie de planta e do tempo de exposição ao
metal. Em raízes e folhas de Phaseolous vulgaris na dose de 5 mmol. L
-1
, Cd
aumentou a atividade das peroxidases GPX e APX (Chaoui et al., 1997). Em
folhas de Helianthus annus, o Cd diminuiu ou aumentou a atividade das enzimas
antioxidativas SOD, CAT, APX e GR (Gallego et al., 1996). Em duas espécies
de Alyssum, a atividade da GR aumentou no tratamento de 0,02 mmol Cd L-1,
mas diminuiu na dose de 0,05 mmol Cd L
-1
(Schickler & Caspi, 1999). A
atividade da CAT, normalmente, é reduzida quando exposta a altos níveis de Cd
(Singh et al., 2006; Mishra et al., 2006; Sandalio et al., 2001). Entretanto,
Pereira et al. (2002) e Vitória et al. (2001) relataram que as atividades de CAT,
GR e de isoenzimas de SOD aumentaram em folhas e raízes de Crotalaria
juncea e rabanete, respectivamente.
4.1.6 Respostas anatômicas
O número de estômatos por mm
2
da epiderme da face abaxial foi maior
nos tratamentos que receberam Cd, os quais não diferiram entre si
estatisticamente (Tabela 2 e Figura 16). O aumento na densidade de estômatos
de folhas em condições de estresse por Cd tem sido verificado em Silene
vulgaris (Chardonnens et al., 1998), Brassica napus (Baryla et al., 2001) e
Brassica juncea (Salt et al., 1995). Em E. camaldulensis, outra espécie em
estudo, a densidade estomática também aumentou com o estresse. Tanto para o
diâmetro polar quanto para o equatorial, apenas o tratamento controle foi
estatisticamente diferente dos demais. Os diâmetros polar e equatorial foram
menores no controle do que nos tratamentos que receberam Cd (Tabela 2).
58
A redução no potencial hídrico dos tratamentos na presença de Cd fez
com que as plantas ficassem com um aspecto de murchas, podendo a taxa de
transpiração ter diminuído e a resistência estomática aumentado, segundo
Kirkham (1978). Entretanto, o aumento no número de estômatos por mm
2
pode
representar uma estratégia para compensar o aumento da resistência estomática.
Este aumento na densidade estomática pode constituir uma estratégia adaptativa
da espécie, visando à manutenção do suprimento adequado de CO
2
, necessário à
fotossíntese e um maior controle de perda de água por meio da transpiração.
Melo et al. (2007) correlacionaram positivamente o aumento na densidade
estomática com o suprimento de CO
2
em situações de baixa transpiração.
TABELA 2 Médias das variáveis respostas analisadas nas seções paradérmicas
da superfície abaxial folhas de P. glomerata submetida a doses
crescentes de Cd, em solução nutritiva, durante período de 20 dias
μmol Cd L
-1
Nº de
estômatos
(mm
2
)
Diâmetro
equatorial
(DE) (μm)
Diâmetro
polar
(DP)(μm)
0
83,65 b 27,85 a 30,42 a
15 107,1 a 18,57 b 25,80 b
25
116,65 a 16,85 b 24,50 b
45
120,6 a 16,87 b 20,12 b
90
117,4 a 17,81 b 22,45 b
Médias seguidas pela mesma letra são estatisticamente iguais entre si, pelo teste de Tukey, a 5%
de probabilidade.
59
FIGURA 16 Seção paradérmica da folha de P. glomerata submetida a doses
crescentes de Cd, (A) controle, (B) 15 μmol L
-1
, (C) 25 μmol L
-1
,
(D) 45 μmol L
-1
, (E) 90 μmol L
-1
, em solução nutritiva, durante
período de 20 dias. A barra horizontal em negrito corresponde a
100 μM.
60
4.2 Experimento II: Respostas anatômicas e fisiológicas de Eucalyptus
camaldulensis submetido a doses crescentes de Cd
em solução nutritiva
4.2.1 Matéria seca e sintomas visuais
O aumento das doses do Cd em solução nutritiva reduziu a produção de
matéria seca das raízes e parte aérea em 55% e 56%, respectivamente, no nível
mais elevado de Cd em relação ao seu controle (Figura 17). A razão entre a
matéria seca das raízes e da parte aérea (R/PA) foi de 0,39 para o tratamento
controle e de 0,37 para o tratamento de 90 μmol Cd L
-1
. Isso indica que as raízes
e a parte aérea foram de maneira igual afetadas pelo excesso de Cd, não
diferindo do seu controle. Em mudas de diferentes espécies arbóreas crescidas
em solo multicontaminado, a razão R/PA também não foi influenciada pela
excesso de metais (Marques et al., 2000).
Em mudas de E. maculata e E. urophylla, a razão R/PA foi crescente até
32 μmol Cu L
-1
, decrescendo nas concentrações superiores de Cd (Soares et al.,
2000), porém, para as mesmas espécies em solução nutritiva contendo Cd, a
razão R/PA foi baixa, ficando entre 0,30-0,36 e sem sofrer influência do Cd
(Soares et al., 2005), concordando com o resultado encontrado no presente
estudo. No experimento com Pfafia glomerata, a razão R/PA foi reduzida com o
aumento dos níveis de Cd, indicando que o Cd interferiu de forma diferenciada
na produção de raízes e parte aérea da espécie.
61
Cd (μmol L
-1
)
01525 45 90
matéria seca (g )
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
FIGURA 17 Produção de matéria seca de raízes ( ● ) e parte aérea ( ○ ) de E.
camaldulensis submetido a doses de Cd, em solução nutritiva,
durante período de 20 dias. Cada ponto representa a média±erro
padrão de três repetições.
O sintoma visual da clorose induzida pelo excesso de Cd e também por
outros metais pesados presentes na planta é conseqüência da redução da
biossíntese de clorofila ou, ainda, dos danos ao sistema proteína-
protoclorofilídeos, causados pelo metal (Horváth et al., 1996). Dessa forma, o
teor de clorofila pode ser utilizado como indicador da toxidez pelo Cd (Oliveira
et al., 1994). Embora o Cd tenha causado redução no crescimento tanto das
raízes quanto da parte aérea (Figuras 18 e 19, respectivamente), nenhuma
clorose foi observada nas folhas de E. camaldulensis. Talvez, doses maiores do
Cd pudessem induzir tal sintoma, pois, em E. urophylla e E. maculata, doses de
62
Cd acima de 90 μmol L
−1
induziram o aparecimento de pontuações
avermelhadas, clorose internerval, necrose e murchamento das folhas (Soares et
al., 2005).
Os sintomas visuais do sistema radicular de E. camaldulensis foram
bastante marcantes, observando-se acentuada redução no crescimento, além do
escurecimento das raízes desde a dose mais baixa de Cd (Figura 18). Outro
sintoma de toxidez radicular observado foi a formação de algumas raízes laterais
mais espessas, principalmente no tratamento de maior nível do metal. O efeito
tóxico do Cd não somente afeta o comprimento radicular da raiz primária, mas
também provoca variações na arquitetura de todo o sistema radicular, levando a
algumas deformações (Figura 18). Conforme observado por Barceló &
Poschenrieder (1990), a toxidez de Cd tem sido verificada por promover o
aumento na formação de raízes laterais, resultando num sistema radicular mais
denso e compacto, além de promover a redução dos pêlos radiculares, sugerindo
a interferência do metal no balanço hormonal das raízes.
FIGURA 18 Sistema radicular de E. camaldulensis aos 16 dias após indução do
tratamento (DAT), na presença de doses crescentes de Cd, em
solução nutritiva.
Na parte aérea, os principais sintomas visuais de toxidez observados
foram a redução no crescimento e o avermelhamento nas folhas, principalmente
63
na dose de 90 μmol Cd L
-1
(Figura 19). Estes sintomas levam à redução na
eficiência fotossintética, comprometendo o aparato fotossintético, em particular
o sistema coletor de luz (LHC) (Krupa, 1988) e os fotossistemas I e II (Siedlecka
& Krupa, 1996).
Figura 19 Parte aérea de E. camaldulensis aos 16 dias após indução do
tratamento (DAT) na presença de doses crescentes de Cd, em
solução nutritiva.
4.2.2 Teores de pigmentos
O efeito do Cd nos teores de clorofila está representado na Figura 20. A
razão clorofila a/b foi crescente com o aumento de Cd em solução aos 12 DAT
(Figura 20A). No 20º DAT, a razão clorofila a/b foi reduzida na presença do
metal, enquanto, no 1º DAT, praticamente não houve diferença entre os
tratamentos.
64
Cd (μmol. L
-1
)
04590
Clotofila Total (mg. g
-1
)
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
Clotofila a/b
0
1
2
3
4
(A)
(B)
FIGURA 20 Relação de clorofila a/b (a) e teor de clorofila total (b) em plantas
jovens de E. camaldulensis, no 1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT,
submetidas a três doses de Cd, em solução nutritiva. Todas as
barras são médias±erro padrão de três repetições.
65
De acordo com o resultado apresentado acima, a biossíntese da clorofila
a foi mais sensível do que a biossíntese da clorofila b, pois, na presença de 90
μmol Cd L
-1
e aos 20 DAT, houve redução de 3,58 para, aproximadamente, 3 na
razão clorofila a/b.
O efeito do aumento dos níveis de Cd em solução nutritiva e o tempo de
exposição da planta ao metal afetaram o teor de clorofila total (Figura 20B).
Maiores danos à síntese de clorofila foram observados com o aumento do tempo
de exposição ao Cd. Aos 20 DAT, o aumento dos níveis do metal reduziu os
teores de clorofila total produzida pela planta, indicando um dano oxidativo
induzido pelo estresse. Provavelmente, este dano causou a inibição da redutase
do protoclorofilídio, a enzima chave da fototransformação do protoclorofilídio-
clorofilídio (Stobart et al., 1985). Em plântulas de Helianthus annus, as folhas
mais velhas tiveram os teores de clorofila a e clorofila total reduzidos, enquanto
para a clorofila b e a razão clorofila a/b não foi observada nenhuma alteração
(Di Cagno et al., 1999).
De modo geral, os teores de carotenóides aumentaram com o aumento
do estresse (Figura 21). No extremo do estresse aplicado, verifica-se que houve
um acréscimo na concentração do pigmento de 129% em relação ao controle.
Embora a principal função reconhecida dos carotenóides seja atuar como um
pigmento com antena fotoreceptiva para a fotossíntese, coletando comprimentos
de luz que não são absorvidos pela clorofila, sua função protetora contra danos
oxidativos tem sido reconhecida há décadas (Larsson, 1988). Aumentos nos
teores de carotenóides estão relacionados com o aumento da tolerância ao
estresse oxidativo (Somashekaraiah et al., 1992). Em Bacopa monnieri, os teores
de carotenóides foram crescentes com o tempo de exposição em doses menores
do Cd e foram decrescentes em doses maiores (Singh et al., 2006).
O aumento nos níveis de carotenóides com o aumento das doses de Cd
está, provavelmente, relacionado à estratégia adotada pela planta para tolerar o
66
efeito tóxico dos radicais livres, gerado pelo estresse, o qual está de acordo com
o resultado encontrado para as plantas aquáticas Nasturtium officinale e Mentha
aquatica (Aslan et al., 2003).
Cd (μmol L
-1
)
04590
β
caroteno (mg g
-1
MF)
0
15
30
45
60
75
FIGURA 21 Teores de carotenóides (mg g
-1
MF) em folhas de E.
camaldulensis, no 1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT, submetido a
três doses de Cd, em solução nutritiva. Todas as barras são
médias±erro padrão de três repetições.
4.2.3 Eficiência fotoquímica do fotossistema II
O aumento das doses de Cd não afetou a eficiência do fotossistema II. A
razão Fv/Fm apresentou valores na faixa de 0,73-0,79, para o tratamento
controle e valores de 0,69-0,82, para os tratamentos que receberam Cd (Figura
22). O Cd não inibiu os processos fotoquímicos de L. minor, por ter afetado
apenas ligeiramente a relação Fv/Fm, assim como o teor de clorofila total
submetida a pouca luminosidade, em relação ao controle (Artetxe, et al. 2002).
Em Chlorella, a presença do Cd não afetou a produção fotoquímica (Fv/Fm),
67
enquanto houve redução no teor de clorofila a (Ilangovan et al., 1998). Também
em folhas em Helianthus annus expostas ao Cd em solução nutritiva, a
eficiência quântica do PS II (Fv/Fm) não variou, apesar de haver redução na
absorção do CO
2
, na atividade da rubisco e não ter afetado a condutância
estomática (Di Cagno et al., 1999). Entretanto, em Brassica juncea exposta a Cd
em solução nutritiva, maiores valores da razão Fv/Fm foram observados na
espécie transgênica, comparada com a espécie selvagem, indicando maior
eficiência no funcionamento do aparato fotossintético da espécie transgênica que
tolerou mais o metal (Pilon-Smits et al., 2000).
Cd (μmol L
-1
)
04590
Fv/Fm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
FIGURA 22 Eficiência fotoquímica do fotossistema II (Fv/Fm) em plantas
jovens de E. camaldulensis, no 1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT,
submetidas a três doses de Cd, em solução nutritiva. Todas as
barras são médias±erro padrão de três repetições.
68
4.2.4 Potencial hídrico
O efeito do aumento dos níveis de Cd e do tempo de exposição ao metal
no potencial hídrico da planta pode ser verificado na Figura 23. No 1º DAT,
verificou-se que houve redução no potencial hídrico das plantas, com o aumento
dos níveis de Cd. Nas duas datas seguintes avaliadas, o potencial hídrico do
eucalipto foi maior do que no controle, para os dois tratamentos que receberam
metal.
Cd (μmol L
-1
)
04590
Potencial hídrico (MPa)
-0,9
-0,6
-0,3
0,0
FIGURA 23 Potencial hídrico total (MPa) de plantas jovens de
E.camaldulensis, no 1º (■), 12º (■) e 20º (■) DAT, submetidas
a três doses de Cd, em solução nutritiva. Todas as barras são
médias±erro padrão de três repetições.
Entre muitos fatores que influenciam a entrada de água em plantas
expostas a metais pesados, pode-se citar a redução na razão da matéria seca
produzida entre as raízes e a parte aérea (R/PA) (Barceló & Poschenrieder,
69
1990). No presente estudo, observou-se que houve um aumento nesta razão com
o aumento das doses de Cd, em relação ao tratamento controle, logo, a entrada
de água na planta não ficou prejudicada pelo tamanho do sistema radicular em
relação à parte aérea. Com o decorrer do período experimental, esperava-se que
o potencial hídrico da planta diminuísse, por causa do aumento do tamanho das
folhas. No entanto, encontramos aumento no potencial hídrico com a exposição
da planta ao metal para os tratamentos de 45 e 90 μmol Cd L
-1
. Como houve
redução na produção de matéria seca de E. camaldulensis com a exposição ao
metal, sugere-se que houve redução na taxa de transpiração durante este período,
devido, principalmente, aos efeitos do Cd na resistência estomática. A redução
na transpiração ou o aumento na resistência estomática têm sido observados em
muitos estudos com plantas expostas ao Cd (Barceló & Poschenrieder, 1990).
Em Chrysanthenum morifolium exposto à baixa concentração de Cd, o aumento
na taxa de transpiração foi acompanhado pelo aumento do turgor da folha e pela
redução no potencial osmótico e na resistência estomática (Kirkham, 1978).
4.2.5 Teores de Cd e o estado nutricional
O aumento dos teores de Cd nas folhas e raízes de E. camaldulensis,
crescidas em solução nutritiva e enriquecidas com Cd, e o gradiente de
concentração do metal encontrado entre as raízes e a parte aérea indicam
claramente que o Cd foi absorvido pelas raízes e translocado para a parte aérea.
O aumento das doses de Cd em solução promoveu incrementos nos teores desse
elemento nos tecidos, atingindo valores de até 186,11 mg kg
-1
, na parte aérea e
de 1.885,5 mg kg
-1
nas raízes de E. camaldulensis, expostas a 90 μmol Cd L
-1
por 20 dias (Figura 24).
Estes valores são bem superiores à faixa de 5-30 mg kg
-1
, considerada
tóxica para a maioria das plantas (Kabata-Pendias & Pendias, 2001). Tanto os
teores de Cd nas raízes quanto na parte aérea mostraram um aumento com
70
tendência linear ao aumento do Cd em solução nutritiva, com as raízes
acumulando 10 vezes mais Cd do que a parte aérea. Dessa forma, a maioria do
Cd acumulado pela planta ficou retida nas raízes e pouca quantidade foi
translocada para a parte aérea. De acordo com Toppi & Gabbrielli (1999), a
quantidade de Cd translocado das raízes para a parte aérea vai depender do nível
do agente complexante de metal encontrado nas raízes e de sua
compartimentalização e também da eficiência de transporte do metal através do
xilema. Dessa forma, as raízes de plantas podem atuar como uma barreira contra
a translocação de metais pesados e este pode ser um mecanismo potencial de
tolerância utilizado pela planta (Baker, 1981).
Cd (μmol L
-1
)
01525 45 90
Cd (mg kg
-1
)
0
700
1400
2100
FIGURA 24 Teores de Cd (mg kg
-1
) nas raízes ( ● ) e parte aérea ( ○ ) de E.
camaldulensis submetido a doses crescentes de Cd, em solução
nutritiva, durante período de 20 dias. Cada ponto representa a
média±erro padrão de três repetições.
71
O efeito do incremento do Cd em solução nutritiva afetou os teores dos
macronutrientes das raízes e da parte aérea (Figura 25). A resposta dos teores de
N na parte aérea foi decrescente com o aumento da contaminação por Cd,
enquanto, nas raízes, o teor foi pouco alterado (Figura 25). A redução nos teores
de N causa sintomas de deficiência, pois este nutriente é encontrado na planta na
forma orgânica (NH
3
), como componente estrutural de macromoléculas e
constituinte de enzimas (Marschner, 1995). Em folhas de Pisum sativum
crescidas em solução nutritiva com incrementos de Cd, os teores de N foram
reduzidos linearmente e os teores de N das raízes tiveram maiores valores nos
tratamentos com 20 e 30 μmol Cd L
-1
(Sandalio et al., 2001).
Observou-se aumento nos teores de P nas raízes e redução nos teores do
nutriente na parte aérea com o aumento das doses de Cd (Figura 25). Os valores
de P na parte aérea foram encontrados entre 3-4,4 g kg
-1
, sendo o valor máximo
verificado no tratamento com 15 μmol Cd L
-1
. Para as raízes, os valores
encontrados ficaram na faixa de 1,9-4,5 g N kg
-1
MS, verificando-se que houve
aumento no teor do nutriente até a dose de 25 μmol Cd L
-1
, seguido de pouca
alteração nos tratamento seguintes.
O incremento de Cd na solução nutritiva reduziu a translocação de P
para a parte aérea, a partir da dose de 15 μmol Cd L
-1
. Devido aos papéis de P na
planta participando da síntese e degradação de macromoléculas, principalmente
do ATP, a sua carência reflete no menor crescimento da planta (Marschner,
1995). Este sintoma de deficiência foi observado no presente estudo, além da cor
avermelhada das folhas, que é outro sintoma de deficiência de P. Em Betula
pendula, uma espécie arbórea, os teores de P foram reduzidos na parte aérea e,
nas raízes, não houve diferença estatística entre os tratamentos (Gussarsson et
al., 1996). Porém, num experimento com E. urophylla e E. maculata, os teores
de P foram crescentes em resposta ao aumento de Cd em solução nutritiva,
provavelmente, devido ao efeito de concentração (Soares et al., 2005).
72
N (g kg
-1
)
0
9
18
27
36
45
P (g kg
-1
)
0
1
2
3
4
5
K (g kg
-1
)
0
5
10
15
20
25
Ca (g kg
-1
)
0
4
8
12
16
01525 45 90
S (g kg
-1
)
0,0
0,7
1,4
2,1
2,8
3,5
Cd (μmol L
-1
)
01525 45 90
Mg (g kg
-1
)
0
1
2
3
4
FIGURA 25 Teores de macronutrientes (g kg
-1
) nas raízes ( ● ) e parte aérea (○)
de E. camaldulensis submetido a doses crescentes de Cd, em
solução nutritiva, durante período de 20 dias. Cada ponto
representa a média±erro padrão de três repetições.
73
O teor de K nas raízes reduziu com tendência linear, apresentando
valores entre 23,0-18,6 g kg
-1
. Em Betula pendula também houve redução nos
teores de K nas raízes afetada pelo Cd em solução nutritiva (Gussarsson et al.,
1996). Segundo o autor, esta redução na concentração de K pode estar
diretamente relacionada ao efeito do metal na atividade da ATPase, enzima
responsável pelo gradiente de próton necessário para a absorção ativa do K ou,
ainda, o Cd pode estar atuando na atividade da redutase férrica (Gussarsson et
al., 1996).
De modo geral, os níveis de Cd em solução nutritiva não afetaram os
teores de Ca na matéria seca de E. camaldulensis (Figura 25). Seus valores
variaram de 10,9-15,2 g kg
-1
na matéria seca da parte aérea, sendo o maior no
tratamento de 90 μmol Cd L
-1
. Como houve redução na matéria seca da planta,
os maiores valores observados para os tratamentos de maior nível de Ca podem
estar relacionados ao efeito de concentração do nutriente. Os teores de Cd nas
raízes variaram menos do que na parte aérea (8,6-9,7 g k
-1
). De acordo com
Marschner (1995), o Ca é um macronutriente de alta concentração na solução do
solo, porém, sua absorção acaba por ser dificultada, pois esta acontece
principalmente nas radicelas radiculares, nas quais as paredes celulares da
endoderme não foram ainda suberizadas. No presente estudo, observou-se que as
extremidades das raízes encontravam-se escurecidas, mesmo nos níveis mais
baixos de Cd. Provavelmente, este dano observado prejudicou a absorção do Ca
pelas raízes de E. camaldulensis.
Assim como observado para os teores de Ca, a toxidez do Cd afetou
pouco o teor de Mg na matéria seca da planta (Figura 25). O maior valor
encontrado nas raízes, 3,5 g kg
-1
foi observado no tratamento de 25 μmol Cd L
-1
.
Em E. urophylla e E. maculata, os teores de Ca e Mg reduziram com o
enriquecimento do meio de solução com Cd (Soares et al., 2005), tendo os teores
de Mg atingido valores abaixo do nível mínimo considerado adequado (Dell et
74
al., 1993). A redução nos teores de Ca e Mg com o aumento dos níveis de Cd
sugere efeito antagônico entre estes elementos, pois, sendo o Cd um cátion
divalente, altas concentrações deste inibem a absorção de outros cátions de
mesma valência (Marschner, 1995). A adição de 1 μmol Cd L
-1
em hidroponia
mostrou ligeiro estímulo ao crescimento de cevada, sendo também os teores dos
nutrientes pouco afetados (Guo et al., 2007). Entretanto, no presente estudo, os
níveis altos de Cd causaram redução no crescimento das plantas e deficiência
nutricional.
A variação dos teores de S na matéria seca das raízes e da parte aérea
mostrou o efeito do estresse ao metal pesado na absorção e na translocação do
nutriente (Figura 25). Nas raízes, os teores variaram de 1,7-3,2 g kg
-1
, sendo o
maior valor observado no tratamento de 15 μmol Cd L
-1
e o menor no tratamento
de 90 μmol Cd L
-1
. Na parte aérea, estes valores estiveram na faixa de 0,7-1,8 g
kg
-1
, nos tratamentos de 90 μmol Cd L
-1
e 25 μmol Cd L
-1
, respectivamente.
Pode-se observar que, no menor nível de Cd (15 μmol Cd L
-1
), o S pode ainda
ser absorvido pelas raízes, porém, à medida que as concentrações de Cd foram
aumentando, a absorção e a translocação do nutriente foram sendo afetadas. Em
ipê roxo, a resposta ao Cd nas raízes foi quadrática, com o pico máximo de
absorção em 83,5 μmol Cd L
-1
e sem ajuste significativo para a parte aérea
(Paiva et al., 2004).
Uma importante função do S na planta, quando esta se encontra sob
estresse por metais pesados, principalmente o Cd, é a produção de aminoácidos
ricos em S (glutationa) para a síntese de fitoquelatina. A fitoquelatina é
responsável por complexar o metal na planta, deixando-o indisponível no
metabolismo desta (Cobbett, 2000). Logo, a redução nos teores de S irá afetar a
síntese de fitoquelatinas, causando, assim, maior detoxificação da planta.
Os teores dos micronutrientes na matéria seca das raízes e parte aérea
em plantas de E. camaldulensis foram também afetados pelas doses do Cd em
75
solução nutritiva. A variação dos teores de Cu das raízes e parte aérea com os
níveis de Cd encontra-se na Figura 26. Os teores de Cu nas raízes foram
crescentes até a dose de 25 μmol Cd L
-1
e, a partir daí, não se alterou. Para a
parte aérea, observou-se um decréscimo até o nível de 25 μmol Cd L
-1
,
mantendo-se constante até o último nível. Observou-se, então, que o Cu ficou
retido nas raízes até o nível de 25 μmol Cd L
-1
, evitando sua translocação para a
parte aérea. Para as raízes, os valores dos teores variaram de 27,3-74,4 mg kg
-1
,
enquanto, na parte aérea, a faixa dos teores de Cu foi de 2,8-12,1 mg kg
-1
. O
decréscimo nos teores de Cu na parte aérea até o nível de 25 μmol Cd L
-1
pode
ter reduzido a taxa fotossintética da planta, pois grande parte do Cu encontrado
nos cloroplastos está ligada à plastocianina do Fotossistema I (Marschner,
1995).
O comportamento dos teores de Fe na matéria seca das raízes e parte
aérea foi bastante semelhante aos teores de Cu (Figura 26). Os teores de Fe nas
raízes foram crescentes até a dose de 45 μmol Cd L
-1
(4157 mg kg
-1
), porém,
para a parte aérea, estes teores foram reduzidos com a presença do Cd, sendo o
maior valor para o tratamento controle (245 mg kg
-1
). Estes resultados sugerem
que o Cd não interfere na absorção do Cu e do Fe, em doses não muito altas de
Cd e, sim, em sua translocação para a parte aérea. Resultados semelhantes de
plantas crescendo em solução nutritiva na presença de Cd foram encontrados em
E. urophylla e E. maculata (Soares et al., 2005) e Tabebuia impetiginosa (Paiva
et al., 2004). Em Betula pendula, os teores de Fe nas raízes pouco se alteraram,
enquanto, na parte aérea, houve redução significativa (Gussarsson et al., 1996).
O tempo de exposição da planta ao Cd pode também estar interferindo na
absorção do Fe, pois Hernandéz et al. (1998) verificaram que a absorção de Fe
foi pouco afetada em Pisum sativum crescida em 50 μmol Cd L
-1
, em
experimento de longo tempo de duração. Porém, em experimento de curta
duração, os teores de Fe foram bastante reduzidos.
76
Fe (mg kg
-1
)
0
900
1800
2700
3600
4500
Cu (mg kg
-1
)
0
20
40
60
80
01525 45 90
Mn (mg kg
-1
)
0
45
90
135
180
Cd (μmol L
-1
)
01525 45 90
Zn (mg kg
-1
)
0
40
80
120
160
FIGURA 26 Teores de micronutrientes (mg kg
-1
) nas raízes ( ● ) e parte aérea
(○) de E.camaldulensis submetido a doses crescentes de Cd em
solução nutritiva, durante período de 20 dias. Cada ponto
representa a média±erro padrão de três repetições.
Entre os micronutrientes avaliados, o Mn foi o único a apresentar
maiores teores na parte aérea do que nas raízes (Figura 26). O menor valor de
Mn no tecido radicular (18,1 mg kg
-1
) foi encontrado no tratamento de 15 μmol
Cd L
-1
e o maior (47,4 mg kg
-1
), no tratamento controle. No nível mais baixo de
Cd, pode-se observar que houve absorção do Mn, porém, sua translocação para a
parte aérea foi reduzida. Com o aumento da dose de Cd, os teores de Mn foram
reduzidos nas raízes, indicando que o excesso de Cd prejudicou a absorção do
nutriente. Os teores de Mn na parte aérea de Pisum sativum reduziram
77
ligeiramente em 10 μmol Cd L
-1
, enquanto, na concentração de 50 μmol Cd L
-1
,
o teor de Mn foi quatro vezes menor do que no controle (Hernandéz et al.,
1998). Nas raízes de P. sativum, a redução foi drástica na dose de 50 μmol Cd L
-
1
, com valores de um décimo a menos que o controle. No presente estudo,
verificou-se que houve apenas ligeira redução dos teores de Mn com o aumento
dos níveis de Cd. Também em Betula pendula, o efeito do Cd em solução
nutritiva reduziu os teores de Mn na parte aérea e, nas raízes, apenas
ligeiramente (Gussarsson, 1996).
Em doses menores de Cd, a absorção e a translocação do Zn foram
reduzidos, enquanto, nas doses maiores de Cd, os teores de Zn na planta
aumentaram (Figura 26). Nas raízes os teores de Zn apresentaram valores
maiores do que da parte aérea, com o menor valor observado no tratamento de
25 μmol Cd L
-1
. Os valores das concentrações de Zn na parte aérea alteraram-se
pouco, sendo encontrados na faixa de 30,5-56,3 mg kg
-1
, nos tratamentos de 25
μmol Cd L
-1
e controle, respectivamente. Menor valor encontrado no tratamento
pode estar relacionado aos valores baixos de Zn também nas raízes. A inibição
na absorção de Zn pelas raízes sugere competição por íons de mesma valência,
limitando, assim, a absorção um do outro. O Cd tem grande afinidade por
proteínas complexantes de baixo peso molecular que são também responsáveis
pela absorção e transporte de Zn (Woolhouse, 1983). Em E. urophylla, os teores
de Zn na parte aérea não foram influenciados pelas doses de Cd em solução,
enquanto, em E. maculata, os teores de Zn foram reduzidos em 48% na dose de
45 μmol Cd L
-1
, em relação ao controle (Soares et al., 2005).
Metais pesados como o Cd apresentam a capacidade de diminuir a
energia disponível para o funcionamento de transporte de membranas (Ghnaya,
et al., 2005), influenciando na aquisição de nutrientes, como verificado para o
Mn e Zn em níveis menores de Cd e para o Cu e Fe, nos níveis maiores do
metal. Além disso, durante o processo de absorção, íons de mesma valência
78
podem competir por sítios de absorção, interferindo na absorção um do outro
(Gussarsson et al., 1995). Apesar de ainda pouco compreeender-se, acredita-se
que íons divalentes, como Cd
2+
, Cu
2+
, F
2+
, Zn
2+
, utilizem os mesmos carreadores
de membrana ou canais de cátions de Ca
2+
e Mg
2+
.
4.2.6 Peroxidação de lipídeos
A formação de MDA em plantas expostas às condições adversas do
meio ambiente é um indicador da formação de radicais livres nos tecidos e pode
ser utilizado como um índice da peroxidação de lipídeos em sistemas biológicos
(Singh et al., 2006). De modo geral, os teores de MDA nas folhas foram
crescentes com o aumento da concentração de Cd e com o tempo de exposição
ao metal (Figura 27A). Os efeitos do Cd na peroxidação de lipídio das folhas
aumentaram, em média, 22% e 43% em relação aos seus controles, nos
tratamentos de 45 e 90 μmol Cd L
-1
, respectivamente. No primeiro dia de
exposição do eucalipto ao metal, apenas no nível maior de Cd, houve dano de
membrana. Já para as datas seguintes, a peroxidação de lipídeos das membranas
ocorreu nos dois níveis de metais estudados. Logo, não apenas a dose elevada do
metal provocou dano de membrana nas folhas, mas também o tempo de
exposição da planta ao Cd.
A peroxidação de lipídeos nas raízes foi menor do que na parte aérea
(Figura 27B), mesmo apresentando maiores teores de Cd em seus tecidos. O
efeito do Cd nos tecidos radiculares afetou os teores de MDA de modo a reduzir
seus valores com o aumento da concentração do metal, no 1º DAT. Nos
tratamentos que receberam Cd, a peroxidação de lipídeos nas membranas de
raízes foi, em média, bem próxima daquela ocorrida no tratamento controle. Isto
sugere que, mesmo sendo as raízes o órgão acumulador de Cd, este foi capaz de
desenvolver mecanismo de suportar altas concentrações do metal sem seus
tecidos, sem verificar grandes danos.
79
Cd (μmol. L
-1
)
04590
0
20
40
60
Peroxidação de lipídios (nmol MDA g
-1
MF)
0
90
180
270
(A)
(B)
FIGURA 27 Peroxidação de lipídeos (nmol MDA g
-1
MF) em folhas (A) e
raízes (B) de plantas de E. camaldulensis, no 1º (■), 12º (■) e 20º
(■) DAT, submetidas a três doses de Cd, em solução nutritiva.
Todas as barras são médias±erro padrão de três repetições.
Em Bacopa monnieri, o Cd no meio gerou EROs nos cloroplastos e
peroxissomos, induzindo a peroxidação de lipídeos que levou à distorção da
bicamada lipídica e das proteínas de membranas (Mishra et al., 2006). Este
aumento na oxidação da membrana causou aumento gradual nos teores de MDA
e na condutividade elétrica, tanto de raízes quanto de folhas, os quais
80
correlacionaram-se positivamente com o aumento do Cd nos tecidos (Mishra et
al., 2006). Em F. glomerata, outra espécie testada no presente estudo, a
peroxidação de lipídeos aumentou com o aumento dos níveis de Cd nos tecidos
radiculares e nas folhas, os teores de MDA foram maiores na dose de 90 μmol
Cd L
-1
.
4.2.7 Respostas anatômicas
A anatomia contribui com o estudo da tolerância vegetal ao estresse por
metais pesados, por ajudar no esclarecimento de sintomas visuais, reconhecendo
estruturas e alterações morfológicas que possam ser utilizadas como indicadoras
da reação do vegetal a situação de estresse. Os estudos anatômicos realizados
nos tecidos foliares revelaram alterações na organização e espessura dos tecidos,
causadas pela contaminação por Cd (Figura 28). Verificou-se maior
espessamento da epiderme e da endoderme radicular, proporcional ao aumento
nas doses de Cd (Tabela 3). A principal função da epiderme é o revestimento,
porém, importantes funções, como o controle da perda de água e as trocas
gasosas, por meio dos estômatos e absorção de água e sais minerais através de
pêlos radiculares, entre outras, são também controladas pela epiderme
(Appezzato-da-Glória & Carmello-Guerreiro, 2003). As células da epiderme são
encontradas bem justapostas, podendo variar sua forma ou número. No presente
trabalho, não foram encontradas variações no tipo de célula da epiderme, sendo
seu formato tabular (Figura 28).
81
FIGURA 28 Secção transversal do limbo foliar das folhas de E. camaldulensis
submetida a doses crescentes de Cd, em solução nutritiva, durante
um período de 20 dias. A barra horizontal em negrito corresponde
a 100 μM.
82
Por apresentar acúmulo de cargas negativas, o aumento na espessura da
epiderme pode ampliar o papel de filtro biológico para os íons metálicos
exercido por esse tecido. O aumento em espessura da endoderme, uma barreira
apoplástica, pode representar uma menor translocação do Cd para a parte aérea,
diminuindo os efeitos tóxicos deste metal no sistema fotossintético. A tolerância
aos metais pesados pode estar relacionada à proporção da raiz ocupada pelos
tecidos epidérmicos e pelas barreiras apoplásticas. Lux et al. (2004), trabalhando
com clones de Salix contrastantes quanto às características de acumulação e
sensibilidade ao Cd, verificaram que clones caracterizados por alta tolerância
têm elevada proporção desses tecidos, independente de suas características de
acumulação e translocação de metais.
Modificações quanto à espessura e à constituição química das barreiras
apoplásticas são adaptações importantes para a tolerância das plantas a fatores
de estresse. Muitos estudos relatam que a endoderme é um dos principais locais
de alocação de metais pesados nas raízes (Wójcik et al., 2006; Lux et al., 2004;
Ederli et al., 2004). Segundo Enstone & Peterson (2003), esse tecido constitui
uma barreira fisiológica que exerce, além de suas funções básicas, papel
importante de proteção contra estresses diversos.
O mesofilo e o limbo foliar de folhas de E. camaldulensis foram também
afetados pela presença do Cd. As espessuras do mesofilo e do limbo foliar
diminuíram de acordo com o aumento nas doses de Cd, não tendo diferenciado
entre os tratamentos 15 e 25 μmol Cd L
-1
e entre os tratamentos 45 e 90 μmol Cd
L
-1
(Tabela 3). Diminuição no tamanho das células do mesofilo tem sido relatada
em plantas expostas a metais pesados (Sridhar et al., 2005; Zhao et al., 2000).
Sirdhar et al. (2005) verificaram o colapso de células dos parênquimas
paliçadico e lacunoso de Brassica juncea exposta a Zn e a Cd. Tais dados
poderiam explicar a redução nas espessuras do mesofilo e do limbo foliar,
verificada no presente estudo. A diminuição em espessura do mesofilo sugere
83
uma redução na capacidade fotossintética das plantas expostas ao Cd, o que tem
sido verificado em vários estudos (Di Cagno et al., 2001; Chugh et al., 1999;
Baszynski et al., 1980).
A espessura das epidermes abaxial e adaxial da folhas foi menor nos
tratamentos 45 e 90 μmol Cd L
-1
, que não diferiram entre si (Tabela 3). De
acordo com Vollenweider et al. (2006), o colapso de células da epiderme da face
adaxial das folhas, a deposição de compostos polifenílicos e o maior
espessamento das paredes celulares das células epidérmicas de ambas as faces
do limbo foliar são algumas das variações anatômicas observadas em plantas
expostas ao Cd. Em experimentos com feijão, a expansão celular foi inibida e o
teor relativo de água foi reduzido, sugerindo que o Cd induziu a redução na
extensibilidade celular (Poschenrieder et al., 1989), o que poderia, em parte,
explicar a diminuição da epiderme foliar nos tratamentos de maior dose de Cd.
O número de células das epidermes das faces abaxial e adaxial das
folhas aumentou proporcionalmente com o aumento das doses de Cd na solução,
não diferindo entre os tratamentos controle e 15 μmol Cd L
-1
na epiderme da
face abaxial (Tabela 3). O aumento no número de células das epidermes pode
constituir uma adaptação deste tecido foliar para suportar o estresse ambiental. A
epiderme, tanto em folha quanto em raízes, é um tecido bastante responsivo ao
estresse, sendo verificadas variações para este tecido em plantas submetidas a
diferentes condições de ambiente, como luz, salinidade, umidade, seca e
inundação (Melo et al. 2007; Enstone & Peterson, 1998; Reinhardt & Rost,
1995).
84
TABELA 3 Densidade estomática e espessura de células e tecidos de plantas
jovens de E. camaldulensis submetidas a doses crescentes de Cd
em solução nutritiva.
Tratamentos (μmol Cd L
-1
)
Características
avaliadas
0
15 25 45 90
Epid. radicular (μm)
10,1 e 16,6 d 20,5 c 25,3 b 30,2 a
End. radicular (μm)
11,4 e 13,6 d 15,5 c 17,4 b 25,1 a
Mesofilo foliar (μm)
292,4 a 273,5 b 272,6 b 208,3 c 209,7 c
Limbo foliar (μm)
326,8 a 312,2 b 309,5 b 236,4 c 241,2 c
Epid abaxial (μm)
16,8 a 17,2 a 17,2 a 11,4 b 13,8 b
Epid adaxial (μm)
18,0 a 21,7 a 19,8 a 15,9 b 17,7 b
N° cel. EAb. 1509,2 d 1510, 3 d 1596,8 c 1787,9 b 2249,1 a
N° cel. EAd. 1204,0 e 1373,9 d 1627,0 c 1699, 6 b 2050,9 a
Dens. est. ad. 326,8 e 240,5 d 416,5 b 388,7 c 457,3 a
DPEEAb (μm)
21,4 a 22,1 a 20,3 a 18,9 a 18,3 a
DEEEAb (μm)
15,2 a 15,6 a 13,3 a 13,5 a 13,4 a
Dens. est. ab. 187,4 e 231,6 d 270,9 c 283,6 a 274,8 b
DPEEAd (μm)
22,1 a 22,5 a 22,6 a 22,2 a 20,0 a
DEEEAd (μm)
14,3 a 14,6 a 14,6 a 12,7 a 12,7 a
Epid. radicular = epiderme radicular; End. radicular = endoderme radicular; N° cel. EAb
= n° de células da epiderme abaxial; N° cel. EAd. = n° de células da epiderme adaxial;
Dens. est. ad. = densidade estomática da epiderme adaxial (n°/mm
2
); DPEEAd =
diâmetro polar dos estômatos da epiderme adaxial; DEEEAd = diâmetro equatorial do
estômatos da epiderme adaxial; Dens. est. ab. = densidade estomática da epiderme
abaxial (n°/mm
2
); DPEEAb = diâmetro polar dos estômatos da epiderme abaxial;
DEEEAb = diâmetro equatorial do estômatos da epiderme abaxial. Médias seguidas pela
mesma letra, na linha, não diferem estatisticamente entre si, pelo teste Scott-Knott, a
P≤0,05 (n=5).
O número de estômatos por mm
2
da epiderme das faces abaxial e adaxial
teve aumento proporcional ao aumento das doses de Cd na solução (Tabela 3 e
Figura 29). Os estômatos encontrados em folhas de E. camaldulensis estão
85
distribuídos em ambas as faces, porém, maior número de estômatos é encontrado
na face abaxial, sendo, então, classificado como anfi-hipoestomático
(Appezzato-da-Glória & Carmello-Guerreiro, 2003).
FIGURA 29 Seção paradérmica de folhas de
Ε.
camaldulensis submetidas a
doses crescentes de Cd, em solução nutritiva, durante um período
de 20 dias. A barra horizontal em negrito corresponde a 100 μM.
Os diâmetros polar e equatorial dos estômatos de ambas as faces não
diferiram entre os tratamentos (Tabela 3 e Figura 29). Aumento na densidade
estomática de folhas em condições de estresse por Cd tem sido verificado em
86
Silene vulgaris (Chardonnens et al., 1998), Brassica napus (Baryla et al., 2001)
e Brassica juncea (Salt et al., 1995). O aumento na densidade estomática poderia
constituir uma estratégia adaptativa das plantas visando à manutenção do
suprimento adequado de CO
2
, necessário à fotossíntese, tendo em vista que a
elevação no potencial hídrico das plantas de acordo com o tempo de exposição
ao Cd sugere uma redução nas taxas de transpiração. Melo et al. (2007)
correlacionaram positivamente o aumento na densidade estomática com o
suprimento de CO
2
em situações de baixa transpiração. Acréscimo na densidade
estomática e redução na taxa de transpiração de plantas expostas ao Cd foram
verificados em Phaseolus vulgaris, considerado sensível ao Cd (Barceló &
Poshenrieder, 1990).
87
5 CONCLUSÕES
As espécies P. glomerata e E. camaldulensis podem acumular certa
quantidade de Cd sem demonstrar fitotoxicidade ou redução no crescimento da
planta, quando a concentração do Cd no meio ambiente for baixa. Entretanto,
concentrações altas resultarão em variações na produção de matéria seca, na
estrutura das folhas, estimulação do sistema antioxidante, podendo sugerir que
essas plantas apresentam potencial para a detoxificação de Cd.
No presente trabalho, foram observadas algumas das implicações
fisiológicas de alterações estruturais causadas pela absorção, translocação e
acúmulo do Cd. A adição de Cd no meio de solução reduziu a produção de
matéria seca das raízes e da parte aérea, diminuiu os teores de clorofila com o
aumento do tempo de exposição e alterou o estado nutricional das duas espécies
estudadas. Em P. glomerata, os teores de carotenóides foram reduzidos,
enquanto, em E. camaldulensis, esses teores foram aumentados com o tempo de
exposição. O potencial hídrico de P. glomerata foi reduzido com o aumento do
estresse e foi maior no final do período experimental em E. camaldulensis, aos
12 e 20 DAT. Ocorreram alterações no metabolismo do oxigênio ativado,
evidenciadas pelo aumento da peroxidação de lipídios nas doses maiores de Cd
nas raízes e na parte aérea de P. glomerata e na parte aérea de E. camaldulensis.
Em P. glomerata, as enzimas do sistema antioxidativo tiveram suas atividades
afetadas com a adição de Cd. A SOD apresentou maiores atividades no início da
fase experimental. A CAT encontrada nas folhas apresentou aumento na
atividade com o aumento de Cd em solução para o 1º DAT e redução na
atividade com o aumento do tempo de exposição ao metal, enquanto, nas raízes,
a atividade da enzima foi maior aos 12 e 20 DAT, no tratamento com 90 μmol
Cd L
-1
. A atividade da APX nas raízes e parte aérea foi reduzida com o aumento
do estresse, enquanto a atividade da GPX nas raízes foi reduzida apenas no 1º
DAT, com o aumento das doses de Cd, sendo pouco afetada nos outros
88
tratamentos. Quanto a atividade da GR, tendo, nas folhas, sido observado um
ligeiro aumento e, nas raízes, redução na atividade com o aumento dos níveis de
Cd, com exceção da atividade avaliada no 12º DAT, que apresentou aumento na
atividade, tanto nas folhas quanto nas raízes. Por meio dos cortes anatômicos
realizados, constataram-se aumento dos números de estômatos e alterações em
seus diâmetros com o aumento das doses de Cd. O Cd na solução também
reduziu a espessura do limbo foliar de E. camaldulensis.
A temática deste estudo exige pesquisas complementares para a
compreensão, em nível mais aprofundado, de estudos relacionados a: regulação
de proteínas transportadoras, determinações da quantidade de substâncias
produzidas como glutationa oxidada (GSSG), H
2
O
2
e sua localização na célula,
também estudos histoquímicos da localização do metal na célula, além de
peptídeos de complexação de metais, como as fitoquelatinas.
A complementação do estudo torna-se necessária, a fim de eleger
genótipos tanto fitorremediadores quanto bioindicadores, para se obter um
conjunto maior de informações para traçar estratégias de melhoramento
diretamente relacionadas ao programa de fitorremediação de solos contaminados
e de monitoramento ambiental. Porém, a identificação de rotas bioquímicas
individuais, tais como a produção de fitoquelatinas, a regulação de proteínas
transportadoras, entre outras, é essencial. Sem a integração dentro de uma
resposta em âmbito celular, o estudo pode vir a perder a direção,
supervalorizando certa rota metabólica no melhoramento da tolerância.
89
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ACCIOLY, A.M.A.; SIQUEIRA, J.O.; CURI, N.; MOREIRA, F.M.S.
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