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ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS
E MOLECULARES EM SEMENTES DE
SERINGUEIRA [Hevea brasiliensis (WILLD. EX
ADR. DE JUSS.) MÜELL.-ARG.] DURANTE O
ARMAZENAMENTO
LISANDRO TOMAS DA SILVA BONOME
2006
ads:
LISANDRO TOMAS DA SILVA BONOME
ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS E MOLECULARES
EM SEMENTES DE SERINGUEIRA [Hevea brasiliensis (WILLD. EX
ADR. DE JUSS.) MÜELL.-ARG.] DURANTE O ARMAZENAMENTO
Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras,
como parte das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia, área de concentração
em Fisiologia Vegetal, para obtenção do título de
“Doutor”.
Orientador
Dr. Luiz Edson Mota de Oliveira
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2006
Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Bonome, Lisandro Tomas da Silva
Alterações fisiológicas, bioquímicas e moleculares em sementes de seringueira
[Hevea brasiliensis (Willd. Ex Adr. de Juss.) Müell.-Arg.] durante o
armazenamento / Lisandro Tomas da Silva Bonome. -- Lavras : UFLA, 2006.
124 p. : il.
Orientador: Luiz Edson Mota de Oliveira.
Tese (Doutorado) – UFLA.
Bibliografia.
1. Seringueira. 2. Semente. 3. Armazenamento. 4. Alterações fisiológicas. 5.
Alterações bioquímicas. 6. Alterações moleculares. I. Universidade Federal de
Lavras. II. Título.
CDD-633.8952
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LISANDRO TOMAS DA SILVA BONOME
ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS E MOLECULARES
EM SEMENTES DE SERINGUEIRA [Hevea brasiliensis (WILLD. EX
ADR. DE JUSS.) MÜELL.-ARG.] DURANTE O ARMAZENAMENTO
Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras,
como parte das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia, área de concentração
em Fisiologia Vegetal, para obtenção do título de
“Doutor”.
APROVADA em 17 de novembro de 2006
Dr. Paulo de Souza Gonçalves IAC
Dr.Edvaldo Aparecido Amaral da Silva UFLA
Profa. Dra. Édila Vilela de Resende Von Pinho UFLA
Prof. Dr. Nelson Delú Filho UNINCOR
Prof. Dr. Luiz Edson Mota de Oliveira
UFLA
(Orientador)
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
Aos meus pais, Rolando Bonome e Sônia de Oliveira,
pela confiança, amor e carinho;
A minha irmã Dulcinéia Bonome,
pela amizade e carinho;
OFEREÇO
À minha querida esposa Ceyça e minha filha Nicolle;
Pelo amor, carinho, incentivo e amizade;
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A DEUS, por tudo.
À Universidade Federal de Lavras (UFLA) e ao Departamento de
Biologia/Setor de Fisiologia Vegetal pela oportunidade de realização do curso.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) pela concessão da bolsa de estudos.
Ao professor Dr. Luiz Edson Mota de Oliveira, orientador, e ao Dr.
Renato Mendes Guimarães, co-orientador, pela disponibilização dos seus
conhecimentos na condução deste trabalho.
Às professoras Édila Vilela de Resende Von Pinho e Maria Laene
Moreira de Carvalho pela disponibilização dos laboratórios de Análise de
Sementes e de Técnicas Moleculares para a condução da pesquisa e pelas
sugestões.
Aos estagiários, Marcelo Patto, Jorge Olavo e Flavia Fernandez, pela
laboriosa tarefa que contribuiu para a realização deste trabalho.
A todos os funcionários, estagiários, bolsistas e alunos do Setor de
Fisiologia Vegetal, pelo agradável ambiente de trabalho.
A todos os amigos e colegas do curso de Pós-Graduação, pelas sugestões
e apoio moral.
SUMÁRIO
RESUMO..............................................................................................................i
ABSTRACT .......................................................................................................iii
1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 1
2 REFERENCIAL TEÓRICO............................................................................ 3
2.1 Tolerância à dessecação em sementes .......................................................... 3
2.2 Longevidade e armazenamento de sementes ................................................ 5
2.3 Deterioração de sementes – Aspectos fisiológicos e bioquímicos................ 9
2.3.1 Integridade de membranas ....................................................................... 10
2.3.2 Carboidratos............................................................................................. 12
2.3.3 Lipídios.................................................................................................... 15
2.3.4 Proteínas .................................................................................................. 17
2.3.5 Alterações enzimáticas associadas à deterioração de sementes............... 18
3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 25
3.1 Aquisição e tratamento das sementes ......................................................... 25
3.2 Determinação do grau de umidade das sementes ....................................... 26
3.3 Avaliações fisiológicas ............................................................................... 26
3.3.1 Teste de emergência de plântulas, primeira contagem e índice de
velocidade de emergência.................................................................................. 26
3.3.2 Condutividade elétrica ............................................................................. 27
3.3.3 Delineamento experimental e procedimento estatístico........................... 28
3.4 Avaliações bioquímicas e ultra-estruturais ................................................. 28
3.4.1 Preparo do material para as análises bioquímicas.................................... 28
3.4.1.1 Extração e quantificação de amido ....................................................... 29
3.4.1.2 Extração e quantificação de lipídios ..................................................... 30
3.4.1.3 Quantificação de açúcares solúveis, açúcares redutores e aminoácidos 30
3.4.1.4 Fracionamento de proteínas.................................................................. 30
3.4.1.5 Peroxidação de lipídios......................................................................... 31
3.4.1.6 Delineamento experimental e procedimento estatístico........................ 31
3.4.2 Análise histoquímica................................................................................ 32
3.4.3 Preparação das amostras para microscopia eletrônica de
varredura (MEV)................................................................................................ 32
3.5 Avaliações moleculares .............................................................................. 33
3.5.1 Preparo do material para análise eletroforética........................................ 33
3.5.1.1 Extração de isoenzimas e análise eletroforética.................................... 33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................... 35
4.1 Grau de umidade das sementes................................................................... 35
4.2 Avaliações fisiológicas ............................................................................... 36
4.2.1 Emergência de plântulas .......................................................................... 36
4.2.2 Índice de velocidade de emergência de plântulas.................................... 40
4.2.3 Primeira contagem................................................................................... 42
4.2.4 Condutividade elétrica ............................................................................. 44
4.3 Avaliações bioquímicas e ultra-estruturais ................................................. 48
4.3.1 Amido ...................................................................................................... 48
4.3.2 Açúcares solúveis totais (AST)................................................................ 51
4.3.3 Açúcares redutores (AR) ......................................................................... 57
4.3.4 Lipídios.................................................................................................... 64
4.3.5 Peroxidação de lipídios............................................................................ 74
4.3.6 Proteínas .................................................................................................. 76
4.3.7 Aminoácidos............................................................................................ 86
4.4 Avaliações moleculares .............................................................................. 89
5 CONCLUSÕES ........................................................................................... 101
5.1 Avaliações fisiológicas ............................................................................. 101
5.2 Avaliações bioquímicas e ultra-estruturais ............................................... 101
5.3 Avaliações moleculares ............................................................................ 102
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 103
ANEXOS...........................................................................................................121
i
RESUMO
BONOME, Lisandro Tomas da Silva. Alterações fisiológicas, bioquímicas e
moleculares em sementes de seringueira [Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr.
de Juss.) Müell.-Arg.] durante o armazenamento. 2006. 124p. Tese
(Doutorado em Fisiologia Vegetal) – Universidade Federal de Lavras, Lavras,
MG.
∗
A dificuldade de armazenamento das sementes de seringueira é um dos
principais entraves para a produção de mudas em escala comercial nas regiões
“escape”, regiões essas com condições de baixa temperatura e umidade relativa,
não favoráveis ao desenvolvimento do fungo Microcyclus ulei causador do Mal
das folhas da seringueira. Estudos sobre as alterações fisiológicas, bioquímicas e
moleculares em sementes de seringueira durante o armazenamento podem
elucidar as causas da rápida perda da viabilidade dessas sementes, mesmo
quando colocadas em condições ideais para a sua conservação. A presente
pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Nutrição e Metabolismo de Plantas
do Departamento de Biologia em conjunto com os Laboratórios de Análise de
Sementes e de Técnicas Moleculares do Departamento de Agricultura da
Universidade Federal de Lavras, com o objetivo de avaliar e relacionar as
modificações fisiológicas, bioquímicas e moleculares que ocorrem em sementes
de seringueira acondicionadas em embalagem impermeável, tratadas ou não com
os fungicidas Tecto 600 (65g/100Kg semente) e Captan (135g/100kg sementes)
em dois ambientes (câmara fria a 10
o
C e condição ambiente ± 20
o
C), por um
período de 210 dias de armazenamento. Em diferentes períodos do
armazenamento, as sementes foram submetidas a determinações de
características fisiológicas, celulares por microscopia ótica e eletrônica de
varredura, bioquímicas e moleculares. As melhores condições para a
conservação das sementes de seringueira foram à temperatura ambiente sem
tratamento fungicida. O tratamento fungicida teve efeito fitotóxico sobre as
sementes. A temperatura de 10
o
C também foi prejudicial ao armazenamento das
sementes de seringueira, causando danos mais severos à sua qualidade
fisiológica do que o tratamento fungicida. A associação entre o tratamento
fungicida e a baixa temperatura de armazenamento foi potencialmente mais
danosa à preservação das sementes do que os fatores utilizados isoladamente.
Alterações significativas ocorreram no conteúdo de amido, de açúcares solúveis
∗
Comitê Orientador: Prof. Dr. Luiz Edson Mota de Oliveira - UFLA (Orientador), Prof.
Dr. Renato Mendes Guimarães - UFLA (Co-orientador).
ii
e redutores, de proteínas e de aminoácidos tanto no embrião quanto no
endosperma das sementes de seringueira no decorrer do período de
armazenamento, independentemente se tratadas ou não com fungicidas e das
condições de ambiente. No embrião ocorreu biossíntese de lipídios durante o
armazenamento, provavelmente, para a finalização de sua maturação. Já no
endosperma, foi observado degradação de lipídios no decorrer do
armazenamento. Foi notada ainda, a ocorrência de peroxidação de lipídios nos
primeiros meses do armazenamento, principalmente, quando as sementes foram
acondicionadas à baixa temperatura. Variações no perfil eletroforético de
isoenzimas estão associadas ao processo deteriorativo de sementes de
seringueira. As enzimas álcool desidrogenase, esterase, glutamato-oxalacetato
trasaminase, superóxido dismutase, catalase e peroxidase revelaram-se como
indicadores promissores para a avaliação da deterioração de sementes de
seringueira. (Projeto parcialmente financiado pelo CNPq).
iii
ABSTRACT
BONOME, Lisandro Tomas da Silva. Physiological, biochemical and
molecular alterations in rubber seeds [Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de
Juss.) Müell.-Arg.] during storage. 2006. 124p. Thesis (Doctorate in Plant
Physiology) – Federal University of Lavras, Lavras, MG
∗
The difficulty of storing rubber seeds is one of the main hindrances to
seedling production in a commercial scale in the ”escape” regions, which are
regions of low temperature and relative humidity not favorable to the
development of the Microcyclus ulei causer of the South American leaf blight.
Studies about the physiological, biochemical and molecular alterations in rubber
seedlings during storage can elucidate the causes of the fast loss of viability of
those seeds, even when placed in conditions ideal to their conservation. The
present research was developed in the Plant Nutrition and Metabolism
Laboratory in the Biology Department jointly with the Laboratories of Seed
Analysis and Molecular Techniques of the Agriculture Department of the
Federal University of Lavras, with the objective of evaluate and relating the
modifications occurring in rubber seeds packed in waterproof package, treated
or not with fungicides Tecto 600 (65g/100Kg seed) and Captan (135g/100kg
seeds) in two settings (cold chamber at 10
o
C and room condition ± 20
o
C), for a
210-day period of storage. In different periods of storage, the seeds were
submitted to determinations of physiological characteristics, cell characteristics
by light and scanning electron microscopy, biochemical and molecular
characteristics. The best conditions for rubber seed keeping were at room
temperature without any fungicide treatment. The fungicide treatment had a
phytotoxic effect upon the seeds. The temperature of 10
o
C was also harmful to
the storage of the rubber seeds causing more severe damages to their
physiological quality. The association between the fungicide treatment and low
temperature of storage was potentially more harmful to the preservation of seeds
tan the factors utilized singly. Significant alterations took place in the content of
starch, soluble and reducing sugars, proteins and aminoacids both in the embryo
and in the endosperm of the rubber seeds over storage, independent if treated or
not with fungicides of the environmental conditions. In the embryo biosynthesis
of lipids occurred over the storage, likely fro the finishing of its maturation. But
in the endosperm, degradation of lipids was observed over the storage. The
∗
Guidance Committee: Prof. Dr. Luiz Edson Mota de Oliveira – UFLA (Adviser), Dr.
Renato Mendes Guimarães - UFLA (Co-Adviser).
iv
occurrence of lipid peroxidation was still noticed in the first months of storage,
chiefly when the seeds were packed at low temperature. Variations in the
electrophoresis profile of isoenzimes are associated with the deteriorative
process of rubber seeds. The enzymes alcohol dehydrogenase, esterase,
glutamate-oxaloacetate transaminase, superoxide dismutase, catalase and
peroxidase revealed themselves as promising indicators for the evaluation of
rubber seed deterioration. (Project partially supported by CNPq).
1
1 INTRODUÇÃO
A seringueira [Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de Juss.) Müell.-Arg.]
é uma planta pertencente à família Euphorbiaceae, nativa da região amazônica,
amplamente conhecida por sua capacidade de produção de látex, do qual se
extrai a borracha natural.
Atualmente, a borracha natural é um artigo onipresente na vida dos seres
humanos, com mais de 50 mil itens produzidos com base em sua exploração.
Devido à importância da borracha, a grande maioria das pesquisas envolvendo
seringueira destina-se à produção de látex, sendo dada pouca atenção às outras
partes da planta, inclusive as sementes.
Entretanto, a implantação da heveicultura é altamente dependente de
sementes, visto que, atualmente, essa cultura é propagada quase exclusivamente
por enxertia, sendo suas sementes indispensáveis para a produção dos porta-
enxertos. Dessa maneira, a disponibilidade de sementes em qualidade e
quantidade adequada é de fundamental importância para exploração econômica
dessa cultura.
A característica recalcitrante dessas sementes faz com que elas percam,
rapidamente, o poder germinativo, principalmente quando o seu teor de água é
reduzido a valores inferiores a 30% (Cícero, 1986). Esse fato dificulta
severamente seu armazenamento, inviabilizando a instalação de viveiros, nas
regiões “escape” (regiões com condições ambientais – baixa temperatura e
umidade relativa – não favoráveis ao desenvolvimento do fungo Microcyclus
ulei causador do mal das folhas da seringueira), em época adequada ao
desenvolvimento das plântulas, gerando restrição de oferta de mudas em
determinadas épocas do ano, ou tornando-as disponíveis em épocas inadequadas
ao plantio.
2
A curta longevidade das sementes pode ser ainda, um enorme entrave
aos avanços tecnológicos da cultura, devido à dificuldade para realização de
programas de melhoramento genético, bem como, o desenvolvimento de
pesquisas que envolvam esse tipo de sementes. Com isso, tem crescido a
demanda de estudos pelos quais se pretende identificar as melhores condições de
armazenamento das sementes dessa espécie, tendo em vista a conservação da sua
qualidade fisiológica por um maior período de tempo. Entretanto, esses estudos,
embora importantes, têm por finalidade apenas a busca de alternativas para
minimizar os efeitos da recalcitrância e não a de elucidar as causas da rápida
perda de viabilidade de sementes com essas características. Para isso, torna-se
necessária também, a investigação dos eventos bioquímicos e moleculares que
ocorrem nas sementes durante o seu envelhecimento.
A deterioração das sementes durante o armazenamento é um processo
inevitável e irreversível, com sua exata causa ainda desconhecida. Portanto,
estudos acerca dos eventos fisiológicos, bioquímicos e moleculares que ocorrem
nas sementes de seringueira durante o armazenamento podem fornecer
importantes informações sobre as causas da rápida perda de sua viabilidade.
Com esse trabalho, teve-se por objetivo estabelecer as melhores
condições para a conservação das sementes de seringueira, bem como, avaliar e
relacionar as alterações fisiológicas, bioquímicas e moleculares que ocorrem
durante o seu armazenamento.
3
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Tolerância à dessecação em sementes
Na maioria das espécies vegetais de importância econômica, a
viabilidade e o vigor das sementes podem ser conservados pela redução do seu
teor de água e da temperatura do ambiente de armazenamento. Essas sementes
são denominadas ortodoxas, tolerando a dessecação pós-colheita a graus de
umidade próximos de 2% a 5%. Em contraste, existem espécies vegetais cujas
sementes além de não tolerarem baixas temperaturas, não podem sofrer secagem
durante e após o seu desenvolvimento e maturação. O conteúdo de água deve
permanecer alto durante todo o seu desenvolvimento até a germinação, o que
dificulta a sua conservação por períodos prolongados. Esse grupo de sementes é
chamado de recalcitrantes, não tolerando dessecação a graus de umidade entre
15% e 20% (Hong & Ellis, 1996; Roberts, 1973). Fazem parte desse grupo
sementes de muitas espécies de gramas aquáticas, árvores tropicais como canela
amarela, maçaranduba e seringueira, bem como algumas espécies de clima
temperado, como o carvalho.
Embora essa separação entre sementes ortodoxas e recalcitrantes seja
uma classificação clássica, nos últimos anos ela vem sofrendo uma série de
questionamentos. Para alguns pesquisadores, tanto as espécies de sementes
classificadas como ortodoxas quanto as recalcitrantes podem apresentar
diferentes níveis de tolerância à dessecação. Assim, surgiu na década de 90 uma
terceira categoria denominada de intermediária, que compreende sementes que
podem resistir à desidratação até certo nível, mas tem sua armazenabilidade
reduzida. De acordo com Hong & Ellis (1995), sementes dessa categoria toleram
dessecação a graus de umidade em torno de 10% a 13%, reduzindo sua
viabilidade a valores inferiores. Além dessa classificação, uma outra tem sido
4
sugerida para sementes recalcitrantes que, em função da variabilidade na
sensibilidade à dessecação, associada a outras características das sementes,
podem ser divididas em “altamente”, “moderadamente” e “minimamente”
recalcitrantes (Farrant et al., 1988).
Sementes recalcitrantes, quando são colhidas e a seguir desidratadas,
têm sua viabilidade reduzida à medida que a umidade é perdida, no princípio
vagarosamente, mas aumenta consideravelmente a partir de um determinado
conteúdo de umidade, denominado "teor de água crítico". A continuação da
desidratação a partir desse ponto conduz à perda total da viabilidade das
sementes. De acordo com Berjak & Pammenter (2003), a perda de viabilidade de
sementes recalcitrantes na desidratação é atribuída a duas causas principais: (1)
como conseqüência do metabolismo desequilibrado durante a desidratação das
sementes e; (2) dano por desidratação quando a água é essencial para a
integridade de estruturas intracelulares.
O teor de água crítico, abaixo do qual as sementes perdem rapidamente
seu poder germinativo e o grau de umidade mais adequado à conservação das
sementes de seringueira ainda não foram devidamente definidos, em virtude da
carência de estudos com sementes dessa espécie, bem como, devido às
divergências entre os resultados obtidos nas pesquisas já existentes. Segundo
Chin et al. (1981), as sementes de seringueira perdem rapidamente o poder
germinativo, principalmente, quando seu teor de água é reduzido a valores
inferiores a 20%. Já para Cícero et al. (1986), grau de umidade em torno de 30%
é tido como mínimo para manter a viabilidade das sementes dessa espécie por
período prolongado.
5
2.2 Longevidade e armazenamento de sementes
A longevidade corresponde ao período em que à semente se mantém
viva sendo capaz de germinar quando colocada em condições favoráveis, se não
for dormente (Toledo & Marcos Filho, 1977). Em uma das primeiras
classificações quanto à longevidade, Ewart (1908), citado por Hong & Ellis
(2003), dividiu as sementes em três categorias: microbióticas (longevidade
inferior a 3 anos), a qual inclui todas as recalcitrantes, mesobióticas
(longevidade entre 3 e 15 anos), como a maioria das espécies cultivadas e
macrobióticas (longevidade superior a 15 anos), como sorgo, aveia, trigo, milho
e fumo. Entretanto, a classificação de Ewart só é aplicável a condições naturais,
porque em condições artificiais, a maioria das sementes, quando retiradas do
ambiente natural, tem sua fisiologia alterada e pode ter seu período de vida
ampliado ou reduzido dependendo da espécie e das condições de
armazenamento (Kramer & Kozlowski, 1972).
A curta longevidade das sementes recalcitrantes restringe o período de
sua utilização, sendo necessária a semeadura imediatamente após o seu
desprendimento da planta-mãe (Stubsgaard, 1990). Esta característica acarreta
grandes prejuízos a algumas espécies de interesse econômico, pois além de
impossibilitar a instalação de viveiros em épocas apropriadas para a germinação
das sementes e o desenvolvimento das mudas, essa limitação pode restringir a
oferta de mudas em determinadas épocas do ano.
O armazenamento de sementes constitui-se em um conjunto de
procedimentos voltados à preservação de sua qualidade, no intuito de
proporcionar-lhes um ambiente nos quais as mudanças fisiológicas e
bioquímicas sejam mantidas em um nível aceitável, evitando perdas
desnecessárias tanto no aspecto qualitativo como no quantitativo. No entanto,
vale ressaltar que o processo de deterioração das sementes é inevitável, mesmo
6
quando colocadas em ambientes adequados a sua preservação. A qualidade das
sementes não melhora durante o armazenamento, portanto, sua qualidade inicial
é de fundamental importância para a manutenção da germinação e do vigor. De
acordo com Popinigis (1985), a longevidade das sementes é fundamentalmente
uma característica genética. Dessa maneira, somente a qualidade inicial das
sementes e as condições do ambiente de armazenamento podem ser
manipuladas.
As alterações observadas nas sementes durante o armazenamento variam
em função dos fatores que afetam sua conservação, tais como: a temperatura, a
umidade relativa do ar, o grau de umidade das sementes e o tipo de embalagem
utilizada (Carneiro & Aguiar, 1991). O grau de importância desses fatores no
armazenamento e suas interações são prioritários para o entendimento das
exigências da espécie quanto à manutenção de sua viabilidade.
Em relação à temperatura, Probert & Smith (1996) verificaram que
sementes recalcitrantes de espécies de clima temperado, como o carvalho
(Quercus robur), podem ser mantidas em temperaturas próximas de zero grau
Celcius. De acordo com os autores, com esse procedimento, permite-se a
manutenção de sua viabilidade por 2 a 3 anos. Por outro lado, o mesmo
procedimento não é verdadeiro para a maioria das sementes recalcitrantes
tropicais, uma vez que são danificadas pelo frio e não podem ser armazenadas
em temperaturas abaixo de 15-20
o
C.
O que se observa na literatura é que os resultados de pesquisas obtidos a
respeito da conservação de sementes recalcitrantes são muito contraditórios.
Segundo Ferraz & Sampaio (1996), sementes de andiroba, espécie de
comportamento recalcitrante, não toleram condições de baixas temperaturas
(6
o
C ± 4
o
C). Semelhantemente a esse resultado, temperaturas iguais ou
inferiores a 15
o
C não foram favoráveis ao armazenamento de sementes de
pupunha (Villalobos et al., 1992), de mangueira (Fu et al., 1990) e de cacau (Hor
7
et al., 1984). Por outro lado, sementes de abacate e de pitanga toleram
temperaturas de 3
o
C a 4
o
C e as de Inga edulis, temperaturas de 0
o
C (Bacchi,
1961).
Especificamente em relação a sementes de seringueira, resultados
igualmente conflitantes são encontrados na literatura. Segundo Cícero et al.
(1986), essas sementes não toleram temperaturas inferiores a 15
o
C.
Similarmente, Pereira (1980) observou efeito negativo da baixa temperatura
(10
o
C) sobre a viabilidade das sementes dessa espécie. No entanto, Paula et al.
(1997), avaliando as modificações fisiológicas em sementes de seringueira
durante o armazenamento, verificaram que a condição de baixa temperatura,
5
o
C, foi mais eficiente em prolongar a viabilidade dessas sementes, quando
comparado à temperatura de 20
o
C. De acordo com os autores, as sementes
armazenadas a 20
o
C apresentaram queda acentuada na germinação, aos 15 dias,
e apenas 10% mostraram-se germináveis aos 30 dias. Por outro lado, as
sementes armazenadas a 5
o
C mantiveram-se com 47 % de germinação até 90
dias de armazenamento.
Além da temperatura, outro aspecto que deve ser levado em
consideração durante o armazenamento é o grau de umidade das sementes, que
está diretamente associado à umidade relativa do ar e ao tipo de embalagem
utilizada. No caso de espécies recalcitrantes, sabe-se que elas não toleram a
dessecação e, portanto, devem ser armazenadas com altos teores de água. Dessa
maneira, a embalagem utilizada no armazenamento exerce importante papel na
manutenção da viabilidade das sementes, sendo sua escolha relacionada
diretamente com a umidade relativa do ar sob a qual as sementes ficarão
armazenadas.
Embalagem permeável e semipermeável ao vapor de água é utilizada
quando o ambiente de armazenamento das sementes é saturado de umidade.
Segundo Pereira (1980), tais embalagens, quando utilizadas em ambiente sem o
8
controle da umidade, são prejudiciais ao armazenamento de sementes de
seringueira. De acordo com o autor, a sua permeabilidade permite a perda de
água das sementes, comprometendo o seu poder germinativo em poucos dias.
Assim, nesse caso, há a necessidade de utilização de embalagem impermeável,
visando a eliminar a influência da umidade relativa do ar externo no ambiente
interno e, por conseguinte, as alterações no teor de água das sementes. No
entanto, quando as sementes são armazenadas com alta umidade e
acondicionadas nesse tipo de embalagem, é recomendável a abertura de
pequenos orifícios, 1mm de diâmetro, para permitir o fluxo de oxigênio dentro
da embalagem (Pereira, 1980). De acordo com Ibrahim & Roberts (1983),
embora a deterioração progrida com a elevação do grau de umidade das
sementes, os mecanismos celulares funcionais de reparo são mantidos pelo
metabolismo aeróbico.
Em virtude da sensibilidade à dessecação, as sementes recalcitrantes
vêm sendo armazenadas com altos teores de água, o que favorece a incidência de
microrganismos. De acordo com Goldbach (1979), a ocorrência de fungos
constitui um dos principais fatores prejudiciais à conservação de sementes
recalcitrantes. Esses patógenos são capazes de penetrar nas sementes durante o
seu desenvolvimento, maturação, colheita e pós-colheita, principalmente quando
armazenadas em condições desfavoráveis. Após invadirem as sementes, a
maioria dos patógenos vive em associação ou dentro dos protoplastos celulares,
onde se encontram os conteúdos celulares, como citoplasma e núcleo. Esses
patógenos nutrem-se desses conteúdos, que são ricos em pequenas moléculas
como açúcares e aminoácidos. Outros constituintes celulares, como proteínas e
ácidos graxos só podem ser utilizados quando clivados em moléculas menores
pelo aumento da atividade de proteases e lípases durante a deterioração,
aumentando o processo metabólico das sementes (Abdul-Baki & Anderson,
9
1972), ou após sua degradação por enzimas secretadas pelo próprio patógeno
(Carvalho & Von Pinho, 1997).
Uma alternativa para diminuir a incidência de microrganismos é a
utilização de baixas temperaturas durante o armazenamento. No entanto, esse
procedimento pode afetar negativamente a viabilidade da maioria das sementes
recalcitrantes de espécies tropicais (Probert & Smith, 1996). Outra opção tem
sido a aplicação de fungicidas, a qual tem proporcionado resultados satisfatórios
em sementes recalcitrantes de algumas espécies como: tangerina-cleópatra e
limão-cravo (Bonome & Von Pinho, 1999) e cacau (Figueiredo, 1986). Por
outro lado, sementes de outras espécies podem apresentar maior sensibilidade à
fitotoxidade de fungicidas, como observado em sementes de Citromelo swingle
por Bonome & Von Pinho (1999) e sementes de seringueira tratadas com
Benlate e Thiran (Garcia & Vieira, 1994), Benlate e Captan (Cícero et al., 1986)
e Benlate (Cícero et al., 1987).
2.3 Deterioração de sementes – Aspectos fisiológicos e bioquímicos
A deterioração ou envelhecimento de sementes envolve uma seqüência
de eventos bioquímicos e fisiológicos, que levam a um progressivo declínio na
sua qualidade e, finalmente, à perda da viabilidade. De acordo com Delouche &
Baskin (1973), a deterioração é caracterizada como um processo inevitável e
irreversível, mas que pode ser retardada por meio de práticas que conduzem a
um ótimo armazenamento. Os mesmos autores consideram que a seqüência
provável de eventos, durante a deterioração, envolve a degeneração das
membranas celulares, a redução das atividades respiratórias e biossintéticas, o
retardamento da germinação, a redução do potencial de armazenamento, o
retardamento do crescimento e do desenvolvimento de plântulas, a
desuniformidade na germinação e na velocidade de germinação, o aumento na
sensibilidade a adversidades ambientais, a redução da emergência de plântulas
10
no campo, o aumento da ocorrência de plântulas anormais, culminando com a
perda do poder germinativo e a morte.
Segundo Krzyzanowski et al. (1999), qualquer evento que precede a
perda do poder germinativo pode ser considerado uma avaliação do vigor e,
portanto, um indicativo da deterioração. Sendo assim, os testes de vigor são de
fundamental importância para avaliação da qualidade fisiológica das sementes,
uma vez que fornecem índices mais sensíveis que o teste de germinação.
2.3.1 Integridade de membranas
A deterioração das sementes é um processo degenerativo contínuo, que
se inicia logo após a maturidade fisiológica e continua até sua morte ou
incapacidade de germinar. Segundo Delouche & Baskin (1973), a primeira
alteração bioquímica do processo de deterioração é a desestruturação das
membranas, portanto testes que avaliam a integridade das membranas são bons
indicadores do processo de deterioração e, conseqüentemente, do vigor das
sementes (Krzyzanowski et al., 1999).
Entre os testes que avaliam a integridade das membranas celulares o de
condutividade elétrica tem se destacado por ser eficiente, rápido e prático. Esse
teste baseia-se no valor da condutividade elétrica, medido em função da
quantidade de lixiviado na solução de embebição das sementes, em
conseqüência do aumento da permeabilidade das membranas celulares à medida
que a semente deteriora (AOSA, 1983).
O processo de embebição pode alterar as membranas celulares das
sementes. Quando a semente é colocada para embeber a sua capacidade de
reorganização das membranas, bem como de reparo de certos danos, físicos e/ou
biológicos, que podem ter ocorrido durante o processo de produção, irá
influenciar significativamente na quantidade de lixiviados que serão liberados da
semente (Hampton & Tekrony, 1995). Assim, quanto maior a velocidade com
11
que a semente é capaz de restabelecer a integridade das membranas celulares,
menor será a quantidade de lixiviados liberados para o meio externo. Dessa
maneira, quanto menor o valor da condutividade elétrica da solução de
embebição das sementes, menor será sua deterioração (AOSA, 1983; Hampton
& Tekrony, 1995).
De acordo com a AOSA (1983), diversos compostos orgânicos
(açúcares, aminoácidos, ácidos orgânicos e proteínas) e inorgânicos (íons
fosfatos, Ca
++
, H
+
, Mg
++
e Na
+
) são lixiviados quando as sementes são colocadas
em solução de embebição, sendo a quantidade e o tipo de lixiviados na solução
os determinantes no valor da condutividade elétrica. Com relação à lixiviação de
aminoácidos associada à deterioração de sementes, Keys (1982) verificou
correlação direta entre baixos níveis de aminoácidos na solução de embebição e
sementes viáveis. A esse respeito, Taylor et al. (1995) consideram que nessas
sementes os aminoácidos estão compartimentalizados e disponíveis para o
metabolismo. Por outro lado, em sementes não viáveis, a hidrólise de proteínas,
em conseqüência do aumento da atividade enzimática, resultaria numa maior
quantidade de aminoácidos livres, que durante a embebição seriam lixiviados
devido à degradação das membranas celulares.
Em pesquisas realizadas com sementes de diversas espécies como:
algodão (Santos, 1993), milho (Bruggink et al., 1991) e soja (Loeffler et al.,
1988), têm sido observado que o decréscimo na germinação e no vigor é
diretamente proporcional ao aumento da liberação de solutos na solução de
embebição das sementes, indicando que a avaliação da condutividade elétrica é
eficiente para a determinação da deterioração. Ming et al. (1995), trabalhando
com sementes de repolho (Brassica oleracea) verificaram correlação
significativa entre o teste de condutividade elétrica e o teste de emergência em
campo. Entretanto, o mesmo teste não foi eficiente para diferenciar lotes de
sementes de mamona com diferente qualidade fisiológica (Fonseca et al., 2004).
12
De acordo com os autores, tal fato é justificado pela resistência à entrada de
água imposta pelo tegumento das sementes dessa espécie, não permitindo assim,
a lixiviação de solutos e interferindo nos resultados do teste. Por outro lado,
Paula (1997) recomenda a utilização do teste de condutividade elétrica como
indicador da qualidade fisiológica de sementes de seringueira. Espécie essa que
pertence à mesma família da mamona, ambas euphorbiaceae, cujas sementes
apresentam características muito semelhantes, inclusive o tegumento duro. No
entanto, a autora utilizou sementes sem tegumento para conduzir o teste.
2.3.2 Carboidratos
As sementes são constituídas de substâncias estruturais, como os
oligossacarídeos e os polissacarídeos das paredes celulares, e de substâncias de
reserva, como proteínas, lipídios e carboidratos (Begnami, 1998). Os
carboidratos são uns dos principais constituintes da maioria das sementes, sendo
o amido, o carboidrato presente em maior quantidade. Entretanto, em sementes
de seringueira, Paula (1997) verificou que o amido é pouco expressivo,
contribuindo com menos de 0,1% do peso seco das sementes. Alencar (2003)
também verificou baixo teor de amido em sementes de seringueira, porém, esse
valor foi aproximadamente 50 vezes superior ao observado por Paula (1997). De
acordo com Bewley & Black (1994), em oleaginosas há acúmulo de amido no
cotilédone durante o desenvolvimento das sementes. Entretanto, pouco amido
permanece na semente porque esse carboidrato é mobilizado para fornecer
esqueletos de carbono para a síntese de proteínas e de lipídios.
Além do amido, outros carboidratos estão presentes nas sementes em
quantidades consideráveis, como os açúcares não redutores e os açúcares
redutores. Os primeiros são de fundamental importância durante o
desenvolvimento das sementes sendo considerados por diversos autores como os
principais responsáveis pela aquisição da tolerância à dessecação (Leprince et
13
al., 1990a; Vertucci & Farrant, 1997). De acordo com Hottiyer et al. (1994),
esses açúcares são eficientes em estabilizar macromoléculas e estrutura de
membranas (Leprince et al., 1993), durante a dessecação. Por outro lado, alta
concentração de açúcares redutores, como glicose, frutose, galactose e maltose
nas sementes está associada à sua deterioração (Koster & Leopold, 1988).
Alterações no conteúdo de carboidrato são freqüentemente observadas
durante o envelhecimento das sementes. Ovcharov & Koshelev, citados por
Koster & Leopold (1988), estudando o armazenamento de sementes de Zea
mays, verificaram o desaparecimento de açúcares como sacarose e rafinose e o
aumento de outros, como glicose e frutose, quando essas sementes perderam a
viabilidade. Similarmente, Zeleny (1954) observou redução no conteúdo de
açúcares não redutores e aumento de açúcares redutores durante a deterioração
de sementes. Segundo Murthy & Sun (2000), o aumento na concentração de
açúcar redutor durante o armazenamento de sementes de Vigna radiata ocorre
em decorrência da hidrólise de sacarose e oligossacarídeos. Para Edje & Burris
(1970), esse declínio na quantidade de açúcares solúveis pode resultar numa
limitada disponibilidade de substratos para a germinação. Outra possibilidade é
que a diminuição de dissacarídeos pode resultar em um menor efeito protetor de
açúcares sobre a integridade das membranas (Crowe et al., 1984), ou pode
limitar a capacidade das sementes em manter o estado vítreo do citoplasma, um
estado líquido com propriedades de viscosidade de um sólido, que não forma
cristais mesmo em temperaturas muito baixas (Bruni & Leopold, 1991). Essa
condição parece ser essencial para a tolerância à dessecação em sementes.
Por outro lado, a presença em grande quantidade de açúcares redutores
pode causar alterações químicas em proteínas (Murthy & Sun 2000) e DNA (Lee
& Cerami, 1989) por meio das reações de Amadori e Maillard. Essas reações
consistem numa série de ligações entre açúcares redutores e proteínas ou ácidos
nucléicos, sem a necessidade de ser mediada por uma enzima. Esse processo não
14
enzimático, ao contrário do enzimático, adiciona açúcares redutores
desordenadamente a qualquer dos muitos sítios ao longo de qualquer cadeia
peptídica disponível. Segundo Cerami (1987), a glicosilação não enzimática de
certas proteínas desencadeia uma série de reações químicas que culminam na
formação e eventual acúmulo de ligações irreversíveis entre moléculas de
proteínas adjacentes. A reação se inicia quando um grupo aldeído do açúcar
redutor se liga a um grupo amino da proteína ou do ácido nucléico. As
moléculas se combinam formando o que é chamado de base de Schiff. Esta
combinação é instável e rapidamente se rearranja, porém é reversível e produz
uma substância conhecida como produto de Amadori. Com o envelhecimento,
alguns desses produtos de Amadori se desidratam e se rearranjam, dando novas
estruturas derivadas dos açúcares redutores, que podem combinar-se com vários
tipos de moléculas para formarem produtos finais de estrutura irreversível que
são nomeados produtos finais de glicosilação avançada. De acordo com
Wettlaufer & Leopold (1991), essas reações contribuem com a deterioração das
sementes, estimulam a respiração (Leprince e Vertucci, 1995) e aumentam a
formação de radicais livres (Leprince et al., 1990b).
Murthy & Sun (2000) observaram uma forte correlação entre o acúmulo
de produtos de Maillard e o incremento de glicose no eixo embrionário de
sementes de Vigna radiata armazenadas. Porém, o acúmulo de produtos de
Amadori foi mais fortemente correlacionado com a peroxidação de lipídios. Os
autores associaram à perda da viabilidade das sementes dessa espécie as reações
de Amadori e Maillard.
Por outro lado, Bernal-Lugo & Leopold (1992), estudando mudanças
nas concentrações de carboidratos solúveis em embriões de sementes de milho
durante o armazenamento, observaram que tanto a quantidade de rafinose quanto
as dos monossacarídeos, glicose, frutose e galactose reduziram com o
envelhecimento das sementes. Os autores associaram à queda na viabilidade das
15
sementes a participação desses açúcares nas reações de Amadori e Maillard. Em
sementes de seringueira, Paula (1997) também observou uma diminuição na
quantidade de açucares redutores com o aumento do período de armazenamento.
As sementes de seringueira por apresentarem caráter recalcitrante devem ser
armazenadas com alto teor de água (Pereira, 1980). Segundo Wettlaufer &
Leopold (1991), níveis mais altos de umidade favorecem as reações de Amadori
e Maillard.
2.3.3 Lipídios
As sementes de seringueira possuem alto teor lipídico, 45-50%
(Gonçalves et al., 1983; Ugwanyi e Njoku 1996), cujas características são de cor
amarela, viscosa, com cheiro forte e semi-secante. Diversos autores relacionam
expressivas modificações nas principais reservas das sementes quando estão em
processo de deterioração. De acordo com Abdul-Baki & Anderson (1972), em
sementes oleaginosas, uma das principais alterações associadas à deterioração é
sua acidificação. Segundo os autores, a acidificação é responsável pelo aumento
de ácidos graxos, de fosfatos ácidos e de aminoácidos, produzidos pela ação das
lípases, das fitases e das proteases, respectivamente. Entre os três grupos, o
maior e o mais rápido aumento ocorrem nos ácidos graxos (Smith & Berjak,
1995). De acordo com Abdul-Baki & Anderson (1972), quanto maior o grau de
insaturação dos ácidos graxos maior será sua susceptibilidade a peroxidação.
Segundo Bewley & Black (1994), a peroxidação de lipídios inicia-se
com a remoção de um hidrogênio de um grupo metil adjacente à dupla ligação
de um ácido graxo insaturado, para produção de um radical livre. Este reage com
o oxigênio molecular, resultando em um rearranjo na cadeia do ácido graxo,
culminando com a formação de um radical peróxido, que, por sua vez, reage
com outro ácido graxo insaturado, formando um hidroperóxido, o qual é instável
e se degrada favorecendo a formação de novos radicais livres, perpetuando o
16
processo. Alternativamente a esse processo, a lipoxigenase, uma enzima
presente em sementes, também é capaz de produzir oxigênio reativo, que por sua
vez, catalisa a reação de peroxidação de lipídios utilizando como substrato os
fosfolipídios da membrana (Wang et al., 1990).
Para Pukacka (1991), as alterações químicas nos ácidos graxos
insaturados resultantes da peroxidação de lipídios afeta as propriedades
estruturais e funcionais das membranas, aumentando sua permeabilidade. Essa
parece ser uma das principais conseqüências dessa reação. Entretanto, Araújo
(1995) relatou que a perda da viabilidade pode ocorrer ainda, como
conseqüência da reação de Maillard, promovida pela interação dos compostos
carbonílicos, formados na peroxidação, com aminoácidos e proteínas. Sung &
Chiu (1995) verificaram um significativo aumento na concentração de
malonaldeido em sementes de soja armazenadas, sugerindo um aumento na
peroxidação de lipídios. Segundo Dahle et al. (1962), a produção de
malonaldeido tem sido extremamente útil como indicador da oxidação de ácidos
graxos insaturados. Sendo assim um bom indicador da deterioração de muitos
alimentos (Schultz, 1962) e de sementes (Sung & Chiu, 1995).
Corbineau et al. (2002), estudando as causas da baixa viabilidade de
sementes de girassol quando submetidas à alta temperatura (45
o
C), relataram
que a perda da viabilidade está diretamente associada ao aumento na lixiviação
de potássio e eletrólitos totais, bem como, com o aumento da produção de
malonaldeido, sugerindo a baixa integridade das membranas devido à
peroxidação de lipídios. Em outras pesquisas, tem-se evidenciado a participação
da peroxidação de lipídios na deterioração de sementes de diversas espécies,
como: algodão (Goel et al., 2003), soja (Stewart & Bewley, 1980) amendoeira
(Zacheo et al., 2000) e Shorea robusta (Chaitanya & Naithani, 1994). De acordo
com Hendry (1993), a peroxidação de lipídios é um dos principais responsáveis
pela deterioração de sementes.
17
Embora a peroxidação de lipídios seja indicada como uma das principais
causas da deterioração de sementes em muitas pesquisas evidenciou-se uma não-
associação entre essa reação e a deterioração. Kalpana & Rao (1994) observaram
queda na peroxidação de lipídios durante o envelhecimento acelerado de
sementes de Cajanus cajan. De acordo com os autores, a queda na viabilidade
das sementes foi devida ao elevado acúmulo de peróxido de hidrogênio, que é
tóxico à semente e pode ter contribuído para a deterioração. A ausência de
peroxidação de lipídios durante a deterioração também foi observada em
sementes de soja (Priestley & Leopold 1983), de milho (Linn & Pearce 1990) e
de trigo (Girard & Le Meste 1992). De acordo com Sung & Chiu (1995), a
causa exata da perda da viabilidade das sementes não é conhecida. Assim, além
da peroxidação de lipídios, outras alterações bioquímicas e fisiológicas podem
estar envolvidas na redução de sua germinabilidade.
2.3.4 Proteínas
A deterioração das sementes durante o armazenamento é um fenômeno
complexo que envolve alterações em muitos de seus componentes (Priestley
1986). Em estudos, tem-se evidenciado que a membrana é o sitio preferencial de
injúria durante o envelhecimento, devido à oxidação e danos em componentes
como lipídios e proteínas (Sun & Leopold, 1995).
A queda na quantidade de proteínas durante a deterioração de sementes
é um evento comum, podendo ser o principal responsável pelo seu declínio
metabólico. A redução no conteúdo de proteínas durante o envelhecimento pode
ser devido a um extensivo dano no sistema de síntese de proteínas (Espindola et
al., 1994) ou devido à síntese ou ativação de grande quantidade de enzimas
proteolíticas (Bewley & Black 1982). De acordo com Misra & Kar (1990), o
aumento na atividade de proteases resulta em um concomitante declínio no
conteúdo de proteínas de armazenamento e enzimáticas (Perl et al., 1978).
18
Chaitanya et al. (2000) observaram uma gradual queda no conteúdo de
proteínas totais no eixo embrionário e cotilédones de sementes de Shorea
robusta no decorrer do armazenamento e associaram esse declínio ao aumento
na atividade de proteases. De acordo com os autores, a redução no conteúdo de
proteínas totais contribuiu para a perda de viabilidade das sementes.
Basavarajappa et al. (1991) verificaram que a atividade de proteases durante o
envelhecimento de sementes de milho contribui para elevar o conteúdo de
aminoácidos. O aumento no conteúdo de aminoácidos foi concomitante com a
redução da qualidade fisiológica de sementes de cinco espécies de olerícolas
(Taylor et al. 1995). Contrariamente, Paula (1997) verificou queda no conteúdo
de aminoácidos com o avanço da deterioração de sementes de seringueira.
Segundo Araújo (1994), a destruição de aminoácidos, especialmente, metionina,
lisina, histidina, cisteína e triptofano é uma das conseqüências da oxidação de
lipídios.
Além disso, os aminoácidos podem ser destruídos pela ocorrência das
reações de Amadori e Maillard (Wettlaufer & Leopold, 1991), que formando
glicosilaminas com açucares redutores são perdidos. A destruição de
aminoácidos pode provocar sérias perturbações no funcionamento das células,
devido a sua importância como precursores de substâncias essenciais,
participação em reações metabólicas vitais e constituírem unidades básicas para
a síntese de proteínas.
2.3.5 Alterações enzimáticas associadas à deterioração de sementes
Além da importância das proteínas como reserva e como componente
estrutural, outro aspecto que deve ser considerado é sua função catalisadora.
Muitas mudanças bioquímicas ocorrem na deterioração das sementes. Entre os
quais merecem destaque as alterações em atividades enzimáticas.
19
Sementes de espécies recalcitrantes são caracterizadas por não
apresentarem a fase de dessecação durante seu desenvolvimento. Por isso,
quando se desligam da planta-mãe e atingem a maturidade fisiológica,
apresentam alto teor de água. Como essas sementes perdem a viabilidade
rapidamente quando dessecadas, elas devem ser armazenadas com alto grau de
umidade. Essa condição favorece uma elevada atividade metabólica das
sementes e, conseqüentemente, um aumento de estresse oxidativo. Segundo
Bailly (2004), o estresse oxidativo é um dos principais fatores que conduzem à
baixa viabilidade de sementes recalcitrantes durante o armazenamento.
O oxigênio é um composto essencial para a produção eficiente de
energia tanto nos animais como para os vegetais, sendo assim indispensável para
a vida. No entanto, pode resultar em danos reversíveis e até mesmo irreversíveis
aos seres vivos devido à oxidação nos componentes celulares. Essa reação gera
radicais livres que estão envolvidos numa série de processos degenerativos. A
formação desses compostos é determinada pela perda ou ganho de um elétron,
ficando com um elétron desemparelhado, o que o torna altamente reativo. A
formação dessas espécies reativas de oxigênio (ERO) ocorre naturalmente nos
organismos, como por exemplo, a formação do superóxido durante a respiração
celular. No entanto, em um primeiro momento, logo após atingida a maturidade
fisiológica das sementes, a produção de ERO é ainda controlada. Porém, numa
situação de estresse como: desidratação, altas temperaturas e até mesmo durante
o envelhecimento, ocorrem distúrbios no balanço metabólico das sementes
culminando com a geração descontrolada de ERO (Okuda et al., 1991). Esse
distúrbio metabólico vem acompanhado ainda, da redução da eficiência dos
sistemas antioxidantes, resultando na peroxidação de lipídios das membranas,
seguido de sua desestruturação e morte celular (Leprince et al., 1999).
Os sistemas antioxidativos estão presentes nos diferentes tecidos das
plantas, com a função de impedir o acúmulo de substâncias tóxicas gerado pela
20
oxidação. Esses sistemas protetores são compostos de constituintes enzimáticos
e não enzimáticos, sendo os enzimáticos de fundamental importância, pois são
os primeiros a agir, evitando o acúmulo do radical superóxido e do peróxido de
hidrogênio. No sistema enzimático, merecem destaque as enzimas superóxido
dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a peroxidase (POX), que são enzimas
removedoras de radicais livres e de peróxidos, denominadas scavenging. De
acordo com Bailly et al. (1996) e Jeng & Sung (1994), essas enzimas podem
reduzir ou prevenir os danos celulares causados pela peroxidação de lipídios.
As superóxidos dismutase são um grupo de metaloenzimas que
catalisam a desproporcionalização de duas moléculas de superóxidos livres (O
-
2
), produzidos em diferentes locais na célula, em oxigênio molecular e peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
) (Scandalios, 1993). Existem três tipos de SOD, que são
caracterizadas dependendo do metal associado a elas (Cu e Zn no citoplasma de
eucariontes, Mn na matriz mitocondrial e Fe em bactérias). De acordo com
Halliwell & Gutteridge (1989), a SOD exerce um importante papel em proteger
a célula contra os efeitos deletérios de radicais superóxidos livres, sendo
considerada chave na regulação de concentrações intracelulares de radicais
superóxidos e peróxidos, os quais podem reagir nas reações de Haber-Weiss
para formar radicais hidroxil (Bowler et al., 1992).
Goel et al. (2003) verificaram que a perda da viabilidade de sementes de
algodão está associada ao decréscimo na atividade da superóxido dismutase.
Resultados semelhantes foram encontrados por Sung & Jeng (1994) em
sementes de amendoim e por Bailly et al. (1996) em sementes de girassol.
O papel primário da SOD é transformar o superóxido em peróxido de
hidrogênio cujo composto é muito menos reativo. Entretanto, o acúmulo de
peróxido na célula também é tóxico a ela, podendo levá-la a morte,
principalmente na presença de ferro cuja toxidade pode aumentar de 10 a 1000
vezes (Eaton, 1991). Além disso, o peróxido de hidrogênio pode atravessar
21
facilmente as membranas celulares e, ao receber mais um elétron, normalmente
proveniente do ferro
ou do cobre, origina o radical hidroxila. Esse último é, entre
as espécies radicalares conhecidas, uma das mais reativas, pois necessita
somente de mais um elétron para se estabilizar. Essas espécies reativas de
oxigênio, para se estabilizarem, devem doar ou receber elétrons de uma ou outra
molécula, tornando essa última uma espécie também radicalar, cuja
conseqüência é a oxidação dos fosfolipídios de membranas celulares e
subcelulares, do DNA, e das proteínas (Duran & Cadenas, 1987 citado por
Rover Junior et al., 2001).
Visando a minimizar o efeito tóxico do peróxido de hidrogênio na
célula, existem nos vegetais dois tipos de enzimas capazes de removê-lo. São
elas, a catalase e a peroxidade (Hallinwell & Guteridge, 1989). A catalase é
uma enzima presente nos peroxissomas das células com a função de catalisar a
decomposição do peróxido de hidrogênio em oxigênio molecular e água sem a
produção de radicais livres, desempenhando, dessa maneira, uma fundamental
importância na desintoxicação celular. Em diversos estudos, tem sido
demonstrada uma correlação entre perda da viabilidade das sementes e queda na
atividade dessa enzima. Sung & Chiu (1995) observaram redução na atividade
de enzimas scavenging, entre elas a catalase com o aumento do período de
armazenamento de sementes de soja. Resultados semelhantes foram observados
por Goel et al. (2003) em sementes de algodão, por Bailly (1996) em sementes
de girassol e por Sung (1996) em sementes de amendoim.
As peroxidases, assim como as catalases atuam desintoxicando a célula
do acúmulo de peróxido de hidrogênio, entretanto, diferentemente das catalases
estão localizadas no citosol e na matriz mitocondrial. A atividade dessa enzima,
assim como a de outras scavenging tende a cair com o aumento do
envelhecimento das sementes, conduzindo a uma ineficiência do sistema de
proteção das sementes (Sung, 1996; Sung & Chin, 1995 e Sung & Jeng 1994).
22
Por outro lado, Puntarulo & Boveris (1990), contrariando esses resultados
observaram um aumento da atividade das catalases e das peroxidases em
embriões de soja durante o envelhecimento.
Além dessas enzimas protetoras contra danos oxidativos, outras têm sido
mencionadas como eficientes indicadoras da deterioração de sementes. Entre as
quais merecem destaque a álcool desidrogenase, a esterase, e a glutamato
oxalacetato transaminase.
Segundo Zhang et al. (1994), a respiração aeróbica não é o único fator
que pode acelerar a deterioração das sementes. Em estudo realizado por esses
autores, foi observada em função do metabolismo anaeróbico, a ocorrência da
produção de compostos voláteis pelas sementes, cuja presença pode acelerar o
seu processo de deterioração. De acordo com os autores, entre os compostos
voláteis, o acetaldeido foi o que proporcionou maiores efeitos danosos,
independentemente do ambiente de armazenamento, enquanto o etanol causou
deterioração somente em altas umidades relativas.
A enzima álcool desidrogenase (ADH) possui reconhecida atuação no
metabolismo anaeróbico de plantas, promovendo a redução do acetaldeído a
etanol (Taiz & Zeiger, 2004). Dessa maneira, a diminuição da atividade de ADH
torna as sementes mais susceptíveis à ação deletéria do acetaldeído, reduzindo
assim, sua viabilidade (Zhang et al., 1994). Brandão Junior et al. (1999)
observaram uma correlação positiva entre viabilidade de sementes de milho e
atividade da enzima álcool desidrogenase. Resultados semelhantes foram
obtidos por Throneberry & Smith (1955) também com sementes de milho. O que
não foi verificado por Vieira (1996) a qual observou inalteração nos padrões
isoenzimáticos de álcool desidrogenase com o avanço do processo deteriorativo
de sementes de algodão.
A esterase é uma enzima que participa de reações de hidrólise de ésteres
podendo atuar sobre fosfolipídios de membrana, provocando a peroxidação de
23
lipídios. Segundo McDonald (1999), a peroxidação de lipídios é uma das
principais causas da deterioração em sementes. Santos et al. (2005) observaram
aumento na atividade de esterase durante o armazenamento de sementes de
feijão. De acordo com os autores esse aumento foi mais expressivo na cultivar
de menor qualidade fisiológica quando comparado ao observado nas outras
cultivares estudadas. Assim, os autores destacam as alterações no padrão dessa
enzima como um indicador da ocorrência de deterioração. Em pesquisas com
sementes de soja e cevada (Chauhan et al., 1985) e com algodão (Ribeiro, 2000)
também evidenciou-se uma correlação positiva entre a atividade de esterase e o
processo deteriorativo. Por outro lado, Brandão Junior et al. (1998), trabalhando
com sementes de cafeeiro e Brandão Junior et al. (1999), trabalhando com
sementes de milho verificaram decréscimo na atividade dessa enzima com o
avanço da deterioração das sementes.
Outra enzima que tem sido utilizada para detectar a deterioração em
sementes é a glutamato oxaloacetato transaminase (GOT), que participa da
reação específica de transferência do grupo amino de um aminoácido ao ácido α
cetoglutarato para formar o ácido glutâmico e produzir o cetoácido. Além disso,
essa enzima está envolvida na produção de ácido aspártico composto que exerce
importante papel no transporte de nitrogênio em plantas (Miflin & Lea, 1977). A
GOT reage em diferentes velocidades com praticamente todos os outros
aminoácidos, em uma reação reversível. Essas reações ocorrem, sobretudo, no
citoplasma e o ácido glutâmico, ao qual a membrana mitocondrial é permeável,
entra na matriz, onde pode ser novamente transaminado ou ser desaminado pela
glutamato desidrogenase. Portanto, essa é uma enzima atuante no processo de
degradação e síntese de proteínas (Conn & Stumpf, 1980), apresentando um
importante papel na germinação de sementes. Utilizando técnicas eletroforéticas,
Chauhan et al. (1985) observaram em soja e cevada um aumento no número de
bandas da GOT com o envelhecimento das sementes. Segundo os autores, essas
24
mudanças no número de bandas são devidas a um aumento na atividade
metabólica que ocorre com a evolução do processo de deterioração.
25
3 MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo foi conduzido no Laboratório de Nutrição e
Metabolismo de Plantas do Departamento de Biologia em conjunto com o
Laboratório de Análise de Sementes e de Técnicas Moleculares do
Departamento de Agricultura, ambos situados na Universidade Federal de
Lavras (UFLA), Lavras – Minas Gerais.
3.1 Aquisição e tratamento das sementes
As sementes de seringueira utilizadas no presente trabalho foram
provenientes de plantios multiclonais pertencentes à fazenda Água Milagrosa,
localizada no município de Tabapuã, estado de São Paulo.
As sementes foram colhidas na primeira quinzena de março de 2004 e
imediatamente transportadas para a Universidade Federal de Lavras. Parte delas
foi tratada com os fungicidas Tecto 600 (65g/100Kg sementes) e Captan 50
(135g/100kg sementes) e outra parte permaneceu sem tratamento. Durante a
execução do tratamento foram adicionados às sementes, conjuntamente com os
fungicidas, água e uma pequena porção de detergente (10ml de água/1gota de
detergente/2Kg de sementes). O detergente foi adicionado com objetivo de
quebrar a tensão superficial das sementes e, em conjunto com a água, facilitar a
distribuição homogênea dos fungicidas às mesmas. Em seguida, as sementes
foram repartidas em porções de 650g (constituindo cada repetição) e
acondicionadas em sacos de papel de 3Kg; os quais, posteriormente, foram
embalados em sacos de polietileno, lacrados e perfurados com auxilio de uma
agulha (6 orifícios) como recomendado por Pereira (1980). Concluído o
processo de embalagem, parte das sementes foi armazenada à temperatura de
26
10
o
C (câmara fria) e outra a temperatura ambiente ± 20
o
C, por um período de
210 dias.
A cada período de armazenamento, parte das sementes foi destinada à
determinação do grau de umidade e o restante utilizada para as demais
avaliações que foram divididas em fisiológicas, bioquímicas e ultra-estruturais e
moleculares.
3.2 Determinação do grau de umidade das sementes
A determinação do grau de umidade das sementes foi realizada ao zero,
30, 60, 90, 105, 135, 165 e 210 dias de armazenamento pelo método de estufa a
105 ± 2°C durante 24 horas (Brasil, 1992), utilizando duas repetições de
cinco sementes destegumentadas. Os resultados foram expressos em
porcentagem, com base no peso úmido das sementes.
3.3 Avaliações fisiológicas
A cada período de armazenamento (zero, 30, 60, 90, 105, 135, 165 e 210
dias) as sementes foram submetidas as seguintes avaliações fisiológicas:
emergência de plântulas, primeira contagem, índice de velocidade de
emergência de plântulas e condutividade elétrica. Exceção feita para o teste de
condutividade elétrica no qual não foi realizada avaliação aos 210 dias.
3.3.1 Teste de emergência de plântulas, primeira contagem e índice de
velocidade de emergência de plântulas
Para a realização desses testes foram semeadas 50 sementes em 4
repetições para cada tratamento, em bandejas contendo 4 litros de areia. A
profundidade de semeadura foi de aproximadamente 1 cm e as bandejas
27
mantidas em câmara de crescimento vegetal, previamente regulada à
temperatura de 30
o
C em regime alternado de luz e escuro (12 horas). As
bandejas foram irrigadas quando necessário. A partir da emergência, foram
realizadas avaliações diárias, computando-se o número de plântulas emergidas,
até a estabilização. A primeira contagem foi realizada no vigésimo dia,
computando-se plântulas completamente emergidas. O índice de velocidade de
emergência foi calculado segundo fórmula proposta por Maguirre (1962).
IVE: G1/N1 + G2/N2 +...+ Gn/Nn
em que:
IVE: índice de velocidade de emergência;
G1,G2, ..., Gn = número de plântulas emergidas, computadas na
primeira, segunda, ... , última contagem;
N1, N2, ... , Nn = número de dias de semeadura à primeira, segunda, ...,
última contagem.
A porcentagem de emergência das plântulas foi computada após a
estabilização da emergência nas parcelas, avaliando-se o número de plântulas
normais emergidas.
3.3.2 Condutividade elétrica
Esse teste foi efetuado com 4 repetições de 10 sementes para cada
tratamento. Sementes de cada repetição foram pesadas com precisão de 0,01 g e,
a seguir, colocadas em copos de plástico contendo 150 ml de água deionizada,
permanecendo por um período de 24 horas à temperatura constante de 25
o
C.
Com um condutivímetro de massa, marca DIGIMED, modelo CD21A, foi
28
efetuada a leitura em µS/cm e os resultados expressos com base no peso da
amostra. Os resultados foram obtidos por meio da fórmula de transformação:
Condutividade lida - condutividade da água
Condutividade(µS/cm/g) =
Peso das 10 sementes(g)
3.3.3 Delineamento experimental e procedimento estatístico
O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, em esquema
fatorial (2x2x8) com 4 repetições, sendo 2 tratamentos (presença e ausência de
tratamento fungicida); 2 temperaturas de armazenamento (câmara fria a 10
o
C e
ambiente ± 20
o
C) e 8 épocas de avaliação (zero, 30, 60, 90, 105, 135, 165 e 210
dias). Exceção feita para o teste de condutividade elétrica no qual teve apenas 7
épocas de avaliação (zero, 30, 60, 90, 105, 135 e 165 dias).
Dados quantitativos, quando possível, foram avaliados por meio de
análise de regressão e os dados qualitativos foram avaliados pelo teste de Tukey
a 5% de probabilidade.
A análise dos dados foi realizada pelo sistema de Análise de Variância
para Dados Balanceados, SISVAR, para microcomputadores, desenvolvido por
Ferreira (2006).
3.4 Avaliações bioquímicas e ultra-estruturais
3.4.1 Preparo do material para as análises bioquímicas
Em intervalos de zero, 60, 105 e 165 dias de armazenamento uma
amostra de 20 sementes de cada tratamento foi retirada de suas embalagens,
destegumentadas e, posteriormente, com o auxílio de um bisturi submetido à
separação do embrião em relação ao endosperma. Descartaram-se as sementes
29
visivelmente podres presentes em grande quantidade nos últimos períodos de
armazenamento. Imediatamente após esse procedimento, ambos os tecidos
foram colocados em cadinho sobre banho de gelo e posteriormente congelados
em nitrogênio liquido. Realizados esses procedimentos, os distintos tecidos
foram armazenados em depp freezer a -86
o
C até a realização da liofilização.
Concluída a liofilização do material, realizou-se a moagem em moinho
resfriado a 4
o
C. O material moído foi utilizado para as análises dos teores de
proteínas solúveis, de aminoácidos, de açúcares solúveis, de açúcares redutores,
de lipídios e de malonaldeído em embrião e endosperma separadamente, com
exceção do teor de malonaldeído que foi quantificado em semente inteira
destegumentada.
3.4.1.1 Extração e quantificação de amido
Para a extração do amido, 0,5 g de material (embrião ou endosperma) foi
colocado em tubo de centrífuga, homogeneizado em 10 mL de etanol 80% e
incubado a 40
o
C por 10 minutos. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 5000
g por 20 min e o sobrenadante separado do precipitado. Esse procedimento foi
repetido mais uma vez e os sobrenadantes unidos e guardados para a
quantificação das micromoléculas (açúcares solúveis totais, redutores e
aminoácidos). Ao precipitado foram adicionados 10 mL de ácido perclórico a
30% para a sua ressuspensão e, posteriormente, colocado em banho de gelo por
40 min. Após tal procedimento, a amostra foi centrifugada a 5000 g por 20 min.,
a solução filtrada, e seu volume completado para 50 mL de água destilada.
A quantificação do conteúdo de amido, em equivalente de glicose, foi
realizada pelo método de antrona como descrito por Yemm & Willis, (1954).
30
3.4.1.2 Extração e quantificação de lipídios
A extração e a quantificação de lipídios foram realizadas no Laboratório
de Produtos Vegetais do Departamento de Ciências dos Alimentos da UFLA
pelo método gravimétrico. Um grama de material (embrião ou endosperma) foi
colocado em cartucho de papel-filtro e transferido para o conjunto Soxhlet, por
um período de quatro horas. Foi realizada a extração contínua com refluxo, em
presença de éter etílico. Após a completa evaporação e recuperação do solvente,
as amostras foram pesadas e o teor de lipídios determinado.
3.4.1.3 Quantificação de açúcares solúveis totais, açúcares redutores e
aminoácidos
As quantificações de açúcares solúveis totais, açúcares redutores e
aminoácidos foram realizadas pelos métodos colorimétricos de antrona (Yemm
& Willis, 1954), ácido dinitro salicílico – DNS (Miller, 1959) e ninhidrina
(Yemm & Coccking, 1955), respectivamente, nos sobrenadantes resultantes das
duas centrifugações descritas no item 3.4.1.1. O padrão para aminoácidos foi a
glicina, e o utilizado para os métodos de antrona e de DNS foi a glicose.
3.4.1.4 Fracionamento de proteínas
As proteínas foram extraídas de acordo com a solubilidade. 0,5 g de
material (embrião ou endosperma) foi submetido à extração consecutiva
duplicada com 5 mL de água destilada cada (albuminas), 5 ml de cloreto de
sódio 1% (p/v) (globulinas), 5 mL de etanol 80% (prolaminas) e 5 mL de
hidróxido de sódio 0,1M (glutelinas). Os extratos foram incubados a 30
o
C por 40
minutos, centrifugados a 5000 g por 20 minutos, filtrados em papel filtro, sendo
recolhidos os sobrenadantes de cada extrator separadamente.
31
As proteínas de cada extrato foram quantificadas pelo método de
Bradford (1976), sendo a albumina bovina sérica (BSA) utilizada como padrão.
A proteína total foi o resultado da soma das frações protéicas.
3.4.1.5 Peroxidação de lipídios
O nível de peroxidação de lipídios foi mensurado em relação à
quantidade de malonaldeído (MDA) presente nas sementes, o qual foi
determinado pela reação do ácido tiobarbitúrico, de acordo com a metodologia
descrita por Heath & Packer (1968). Para essa quantificação, 10 sementes
destegumentadas foram liofilizadas e, posteriormente, moídas em moinho
refrigerado a 4
o
C. Pesaram-se 0,5 g do material moído e adicionaram-se 5 mL
de TCA 0,1%, o material foi homogeneizado em vortex e imediatamente
centrifugado a 10000 g por 5 minutos. Após a centrifugação, 1 mL do
sobrenadante foi coletado e misturado a 4 mL de ácido tiobarbitúrico 0,5% (p/v)
+ TCA 20% (p/v). Concluído esse procedimento, os tubos de ensaio foram
incubados em banho-maria a 90
o
C por 35 minutos e, em seguida, colocados em
gelo para a paralisação da reação. Após o esfriamento, as amostras foram
filtradas e lidas em espectrofotômetro a 532 nm e 600 nm, cujos valores foram
posteriormente subtraídos. O conteúdo de MDA foi estimado utilizando um
coeficiente de extinção de 155 (mmol / L
-1
cm
-1
) conforme descrito por Meriga et
al. (2004).
3.4.1.6 Delineamento experimental e procedimento estatístico
O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, em esquema
fatorial (2x2x4) com 4 repetições, sendo 2 tratamentos (presença e ausência de
tratamento fungicida); 2 temperaturas de armazenamento (câmara fria a 10
o
C e
ambiente ± 20
o
C) e 4 épocas de avaliação (zero, 60, 105 e 165).
32
Dados quantitativos, quando possível, foram avaliados por meio de
análise de regressão e os dados qualitativos foram avaliados pelo teste de Tukey
a 5% de probabilidade.
A análise dos dados foi realizada pelo sistema de Análise de Variância
para Dados Balanceados, SISVAR, para microcomputadores, desenvolvido por
Ferreira (2006).
3.4.2 Análise histoquímica
A preparação e observação de cotilédones de sementes de seringueira
em microscópio de luz foram realizadas no Laboratório de Anatomia de Plantas
do Departamento de Biologia da UFLA. As sementes foram destegumentadas e
suas “amêndoas” seccionadas longitudinalmente, com o auxilio de uma lâmina,
para a separação do cotilédone em relação ao endosperma. Concluído esse
procedimento, cotilédones foram seccionados, transversal e longitudinalmente,
por meio de um micrótomo de mão, posteriormente, os cortes foram tratados
durante três minutos com o reagente Sudan IV em solução etanólica a 80% para
a visualização de lipídios, segundo o protocolo proposto por Jensen (1962).
3.4.3 Preparação das amostras para microscopia eletrônica de varredura
(MEV)
A preparação e a observação das amostras em microscópio eletrônico de
varredura foram realizadas no Laboratório de Microscopia do Departamento de
Fitopatologia da UFLA. Cinco embriões (eixo embrionário e cotilédone) de
sementes coletadas a cada período de armazenamento (zero, 60, 105, 120 dias)
foram imersos em solução fixativa (Karnovisk`s modificado), pH 7,2 por 24
horas. Em seguida, foram transferidos para um líquido crio-protetor (glicerol
30%) por 30 minutos e cortados transversalmente e longitudinalmente em
33
nitrogênio líquido. As secções obtidas foram transferidas para uma solução de
tetróxido de ósmio 1% em água por 1 hora e subseqüentemente desidratadas em
uma série de acetona (30, 50, 70 e 100% por três vezes) e depois levadas para o
aparelho de ponto crítico. Os espécimes obtidos foram montados em suportes de
alumínio, stubs, com a ajuda de uma fita de carbono colocada sobre uma
película de papel alumínio, cobertos com ouro e observados em microscópio
eletrônico de varredura LEO EVO 90 XVP. Foram geradas e registradas
digitalmente, a aumentos variáveis, diversas imagens para cada amostra, nas
condições de trabalho de 20 Kv e distância de trabalho de 9 mm. As imagens
geradas foram gravadas e abertas no Software Photopaint do pacote Corel Draw
9, onde foram selecionadas e apresentadas neste trabalho.
3.5 Avaliações moleculares
3.5.1 Preparo do material para análise eletroforética
O preparo do material para a extração das isoenzimas e análise
eletroforética foi realizado conforme descrito no item 3.4.1 Entretanto, essa
análise foi realizada somente no embrião.
A análise das isoenzimas foi realizada ao zero, 60, 105, 165 e 210 dias
para sementes armazenadas a temperatura ambiente ± 20
o
C e ao zero, 60, 105 e
165 dias para sementes armazenadas em câmara fria 10
o
C.
3.5.1.1 Extração de isoenzimas e análise eletroforética
Para a extração das isoenzimas foi utilizado o tampão Tris HCL 0,2M
pH 8,0 + (0,1% de ß Mercaptoetanol, 0,4% PVP, 0,4% PEG e 1mM EDTA), na
proporção de 400 µ L por 100 mg de embriões. O material foi homogeneizado
em vortex e mantido por 12 horas a 4
o
C, seguido de centrifugação a 16.000 g
por 60 minutos a 4
o
C.
34
A corrida eletroforética foi desenvolvida em sistema de géis de
poliacrilamida a 7,5% (gel separador) e 4,5% (gel concentrador). O sistema
gel/eletrodo utilizado foi o Tris-glicina pH 8,9. Foram aplicados 40 µL do
sobrenadante da amostra para os géis revelados para os sistemas enzimáticos
catalase e esterase e 60 µL para os géis revelados para os sistemas enzimáticos
álcool desidrogenase, superóxido dismutase, glutamato oxalacetato transaminase
e peroxidase e as corridas foram efetuadas a 150 V por 4 horas.
Terminada a corrida, os géis foram revelados para os sistemas
enzimáticos citados acima, conforme Alfenas et al. (1991).
35
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Grau de umidade das sementes
Os dados obtidos na determinação do grau de umidade das sementes
durante o armazenamento (Figura 1) não foram submetidos à análise estatística.
No geral, pode-se verificar um incremento nos valores de grau de
umidade das sementes durante o armazenamento em todos os tratamentos,
embora sejam notadas algumas oscilações. Esses dados corroboram com os
observados por Garcia & Vieira (1994) e Vieira et al. (1995), os quais
verificaram aumento no grau de umidade das sementes de seringueira com o
decorrer do armazenamento. Por outro lado, difere dos observados por Pereira
(1980), que embora tenha também observado oscilação nos valores de grau de
umidade das sementes de seringueira durante o armazenamento, estes, ao fim de
180 dias, não foram superiores ao inicial.
O aumento do grau de umidade das sementes de seringueira durante o
armazenamento, provavelmente, ocorreu em função do tipo de embalagem
utilizada no experimento, impermeável, associado ao alto teor de água em que as
sementes foram armazenadas. Esse último fator contribui para elevação da
atividade metabólica das sementes e, conseqüentemente, para o aumento de sua
taxa respiratória, resultando numa maior liberação de CO
2
e vapor de água no
interior da embalagem. Como a embalagem impermeável não permite a troca de
umidade entre o ambiente interno e o externo, pode ser que o vapor de água
liberado durante a respiração das sementes tenha-se condensado nas paredes da
embalagem formando gotículas de água que acabaram sendo absorvidas pelas
próprias sementes aumentando seu grau de umidade.
36
0
10
20
30
40
50
60
0 30 60 90 120 150 180 210
Período de armazenamento (dias)
Umidade (%)
NTA TA NTCF TCF
FIGURA 1 Médias, em porcentagem, do grau de umidade de sementes de
seringueira, com (T) e sem (NT) tratamento fungicida, armazenadas à
temperatura ambiente ± 20
o
C (A) e em câmara fria 10
o
C (CF) ao longo do
armazenamento (zero, 30, 60, 90, 105, 135, 165 e 210 dias). UFLA, Lavras,
MG, 2006.
Vale ressaltar que durante todo o período de armazenamento, os valores
de grau de umidade das sementes foram superiores a 30%, pré-requisito básico
para a manutenção da viabilidade de sementes dessa espécie (Cícero, 1986).
4.2 Avaliações fisiológicas
4.2.1 Emergência de plântulas
Pelos resultados do resumo da análise de variância referente à
porcentagem de emergência de plântulas (Tabela 1A), observa-se significância
para a interação tripla, tratamento químico x ambiente de armazenamento x
37
período de armazenamento, indicando que os três fatores estão interagindo, ou
são dependentes, com um dos fatores influenciando na ação dos outros dois.
De maneira geral, observa-se pela Figura 2, redução na porcentagem de
emergência de plântulas com o decorrer do armazenamento das sementes em
todos os tratamentos. Com relação ao ambiente de armazenamento (Figura 2),
observam-se menores valores de emergência de plântulas em sementes
armazenadas em câmara fria a 10°C, durante todo o período de armazenamento,
quando comparado àquelas acondicionadas à temperatura ambiente, ± 20
o
C.
Esses resultados corroboram com os verificados por Pereira (1980), com
sementes de seringueira. Entretanto, diferem dos observados por Paula et al.
(1997), nos quais se verificou que a baixa temperatura de armazenamento foi
mais eficaz em manter a viabilidade das sementes de seringueira do que a
temperatura ambiente 25
o
C. Provavelmente a diferença nos resultados da
presente pesquisa com os observados por Paula et al. (1997), sejam em
decorrência do menor grau de umidade das sementes utilizadas pela autora, 27%
durante todo o período de armazenamento, em comparação as utilizadas nesse
trabalho, 35% atingindo valores de 41% durante o armazenamento (Figura 1).
Em trabalhos com sementes de diversas espécies recalcitrantes, como
manga (Fu et al., 1990), pupunha (Villalobos et al., 1992), e cacau (Hor et al.,
1984), evidenciou-se o efeito negativo da baixa temperatura sobre a sua
viabilidade durante o armazenamento. De acordo com Probert & Smith (1996),
sementes recalcitrantes tropicais não podem ser armazenadas em temperaturas
abaixo de 15-20
o
C, uma vez que são danificadas pelo frio.
38
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 30 60 90 120 150 180 210
Período de armazenamento (dias)
Emergência de plântulas (%)
FIGURA 2 Estimativa da porcentagem de emergência de plântulas originadas
de sementes de seringueira em função do tratamento fungicida (tratada (T) e não
tratada (NT)), do ambiente de armazenamento (temperatura ambiente ± 20
o
C (A)
e câmara fria 10
o
C (CF)) e do período de armazenamento (0, 30, 60, 90, 105,
135, 165 e 210 dias). As barras exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras,
MG, 2006.
Quando se observa o fator tratamento fungicida, nota-se seu efeito
negativo sobre a viabilidade das sementes. Vale ressaltar, que o efeito
prejudicial dos fungicidas foi imediato, causando uma redução, de 27%, na
emergência de plântulas, antes do início do armazenamento, em relação às
sementes não tratadas. Entretanto, aos 30 dias de armazenamento, sementes
tratadas e acondicionadas à temperatura ambiente apresentaram um acréscimo
nos valores de emergência de plântulas com posterior queda a partir do segundo
mês. O mesmo não foi verificado para sementes tratadas e armazenadas em
câmara fria. Vieira et al. (1995) verificaram resultados semelhantes com
♦ NTA Y = - 0,2035x + 91,534 R
2
= 0,9733
▲TA
Y
= 3E-05x
3
–
0,0098x
2
+ 0,6763x + 60,999 R
2
= 0,9825
------- ■ NTCF Y = 0,0012x
2
– 0,7208x + 91,665 R
2
= 0,9828
- x TCF Y = 0,002x
2
–
0,7236x + 62,808 R
2
= 0,9744
39
sementes de seringueira tratadas com benlate e armazenadas a temperatura
ambiente. Os autores atribuíram à queda na germinação das sementes, após o
segundo mês de armazenamento, mais ao envelhecimento do que ao efeito
fitotóxico do fungicida utilizado.
No geral, nota-se em ambas as condições de ambiente (baixa
temperatura, 10°C e temperatura ambiente ± 20°C) uma menor porcentagem de
emergência de plântulas em sementes tratadas com os fungicidas Tecto 600 e
Captan durante todo o período de armazenamento quando comparada à
observada em sementes não tratadas. Esse resultado sugere um efeito fitotóxico
dos fungicidas sobre as sementes. Sementes com alta umidade apresentam uma
elevada atividade metabólica, o que pode conduzir a uma rápida absorção do
produto químico causando a fitotoxidade. Bonome & Von Pinho (1999)
verificaram efeito fitotóxico dos fungicidas Tecto 600 e Captan sobre sementes
de Citromelo swingle, espécie recalcitrante, quando armazenadas com alta
umidade. No entanto, Garcia & Vieira (1994) não verificaram efeito negativo do
fungicida Captan sobre a qualidade fisiológica das sementes de seringueira,
embora outros como o Thiran e o Benomyl tenham contribuído para a perda de
sua viabilidade.
Assim, fica evidenciado pela Figura 2, que tanto a baixa temperatura
quanto o tratamento fungicida foram prejudiciais ao armazenamento das
sementes de seringueira. Vale ressaltar que a baixa temperatura teve efeito mais
drástico sobre a viabilidade das sementes do que o tratamento fungicida. Por
outro lado, quando esses dois fatores foram utilizados juntos, notou-se uma
redução na porcentagem de emergência de plântulas mais severa do que quando
utilizados isoladamente, atingindo valores próximos de zero aos 105 dias de
armazenamento. Em contrapartida, sementes armazenadas a temperatura
ambiente apresentaram ao fim de 210 dias de armazenamento, 47 % e 34% de
40
emergência de plântulas, quando não tratadas e tratadas com fungicidas,
respectivamente.
4.2.2 Índice de velocidade de emergência de plântulas
Verifica-se pelos resultados da Tabela 1A, que houve efeito significativo
para interação tripla tratamento fungicida x ambiente de armazenamento x
período de armazenamento.
Pela Figura 3, nota-se tanto em sementes não tratadas quanto naquelas
tratadas com fungicidas, uma oscilação, com tendência de queda, nos valores do
índice de velocidade de emergência de plântulas com o avanço do período de
armazenamento das sementes, quando as mesmas foram armazenadas a
temperatura ambiente ± 20°C. Já em sementes armazenadas a baixa temperatura,
10°C, observou-se uma redução linear nos valores do índice de velocidade de
emergência de plântula, tanto em sementes tratadas com fungicidas quanto
naquelas não tratadas com o avanço do período de armazenamento. Por meio
desses resultados infere-se que o vigor das sementes é afetado negativamente
pelo armazenamento. De acordo com Matthews (1985) a principal conseqüência
da deterioração de sementes é a redução dos valores de germinação, entretanto,
isto é frequentemente precedido pela redução na velocidade de germinação e
emergência de plântulas. Para Popinigis (1985), pelo teste de vigor, evidenciam-
se alterações mais sutis resultantes da deterioração das sementes do que pelo
teste de germinação.
41
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 30 60 90 120 150 180 210
Período de armazenamento (dias)
Índice de velocidade de emergência
FIGURA 3 Estimativa do índice de velocidade de emergência de plântulas
oriundas de sementes de seringueira em função do tratamento fungicida (tratada
(T) e não tratada (NT)), do ambiente de armazenamento (ambiente ± 20
o
C (A) e
câmara fria 10
o
C(CF)) e do período de armazenamento (0, 30, 60, 90, 105, 135,
165 e 210 dias). As barras exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras, MG,
2006.
Semelhantemente ao observado para emergência de plântulas, nota-se
que a temperatura ambiente, ± 20
o
C, foi mais apropriada para manutenção do
vigor das sementes de seringueira do que a baixa temperatura, 10
o
C, tanto em
sementes tratadas com fungicidas como nas não tratadas. Pereira (1980) também
observou maior declínio no vigor de sementes de seringueira quando estas foram
armazenadas em câmara fria em comparação àquelas armazenadas a temperatura
ambiente. Segundo King & Roberts (1979), espécies tropicais apresentam
sensibilidade ao frio, o que dificulta a utilização de temperaturas inferiores a
10
o
C.
♦ NTA Y = -7Ex
3
+ 0,0002x
2
– 0,0095x + 2,8189 R
2
= 0,5401
▲TA
Y
= 5E
–
07x
3
–
0
,
0002x
2
+ 0
,
273x + 1
,
4672 R
2
= 0
,
8913
------- ■ NTCF Y = - 0,0138x + 2,683 R
2
= 0,9665
- x TCF Y = - 0,0072x + 1,3518 R
2
= 0,9118
42
Observa-se ainda pela Figura 3 o fato de as sementes não tratadas
apresentarem maior vigor durante todo o período de armazenamento quando
comparadas àquelas tratadas com fungicidas, em ambos os ambientes de
armazenamento. A redução no vigor das sementes com o tratamento fungicida,
provavelmente, deve-se ao efeito fitotóxico dos produtos utilizados sobre elas.
Garcia & Vieira (1994) também verificaram perda de vigor em sementes de
seringueira em decorrência da fitotoxidez provocada pela utilização de
fungicidas.
Similarmente ao observado para a emergência de plântulas (Figura 2)
fica evidenciado pela Figura 3 o fato de os danos provocados pela baixa
temperatura terem sido mais severos do que aqueles proporcionados pelo
tratamento fungicida. Por outro lado, a associação dos dois fatores, baixa
temperatura e tratamento fungicida, resultaram num maior decréscimo do vigor
das sementes.
4.2.3 Primeira contagem
Para os dados de primeira contagem, diferença significativa foi detectada
para a interação tripla tratamento fungicida x ambiente de armazenamento x
período de armazenamento (Tabela 1 A).
De acordo com o vigor medido pelo teste de primeira contagem (Figura
4), verificam-se resultados semelhantes aos observados no índice de velocidade
de emergência e porcentagem de emergência de plântulas, em que foi verificada
tendência de queda no vigor e na viabilidade das sementes com o decorrer do
armazenamento e efeito fitotóxico dos fungicidas.
43
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 30 60 90 120 150 180 210
Período de armazenamento (dias)
Plântulas normais (%)
FIGURA 4 Estimativa de porcentagem de plântulas normais na primeira
contagem do teste de emergência de plântulas em função do tratamento
fungicida (tratada (T) e não tratada (NT)), do ambiente de armazenamento
(ambiente ± 20
o
C (A) e câmara fria 10
o
C(CF)) e do período de armazenamento
(0, 30, 60, 90, 105, 135 e 165 e 210 dias). As barras exibem o erro padrão da
média. UFLA, Lavras, MG, 2006
Com relação ao ambiente de armazenamento, verifica-se que as
sementes armazenadas em câmara fria apresentaram maior declínio no vigor,
medido pelo teste de primeira contagem, com o decorrer do armazenamento do
que aquelas armazenadas à temperatura ambiente. Ferreira & Gentil (2003),
também observaram redução no vigor de sementes de camu-camu, espécie
recalcitrante, quando foram armazenadas à temperatura de 10
o
C.
♦ NTA Y = - 0,0002x
2
+ 0,0425x + 38,608 R
2
= 0,8238
▲TA
Y
= 2E
–
05x
3
–
0,0063x
2
+ 0,5708x + 14,443 R
2
= 0,7635
------- ■ NTCF Y = 5E – 06x
3
– 0,0007x
2
– 0,2409x + 37,223 R
2
= 0,9928
- x TCF Y = 0,0004x
2
–
0,1401x + 12,643 R
2
= 0,9639
44
Vale ressaltar que a redução no vigor das sementes, foi ainda mais
acentuada, quando elas foram armazenadas em câmara fria e tratadas com
fungicidas, atingindo valor de plântulas normais na primeira contagem, próximo
de zero, aos 90 dias de armazenamento. Já em sementes não tratadas e
submetidas à mesma condição de ambiente, valor próximo de zero só foi
verificado a partir de 135 dias de armazenamento.
Diversos pesquisadores utilizam o teste de primeira contagem, realizado
durante o teste de germinação ou emergência de plântulas, como um índice de
vigor, o qual se baseia na premissa de que as plântulas que apresentam maior
velocidade de crescimento provêm de sementes mais vigorosas. Segundo
Camargo (2003), esse foi um eficiente método para avaliação da redução no
vigor de sementes de milho-doce durante o armazenamento.
4.2.4 Condutividade elétrica
Pelos resultados da análise de variância Tabela 2A, observa-se efeito
significativo para as interações tratamento fungicida x período de
armazenamento, tratamento fungicida x ambiente de armazenamento e ambiente
de armazenamento x período de armazenamento.
Observa-se pela Figura 5, que os valores de condutividade elétrica na
solução de embebição das sementes tenderam a subir com o aumento do período
de armazenamento, tanto nas sementes tratadas com fungicidas quanto nas não
tratadas. Esses resultados sugerem que o sistema de membranas das células estão
se desorganizando com o armazenamento, reduzindo a qualidade fisiológica das
sementes. De acordo com Vieira & Krzyzanowski (1999), o aumento no teor de
lixiviados no meio de embebição das sementes, está diretamente relacionado
com o nível de degradação das membranas e perda do controle da
permeabilidade. Para Delouche & Baskin (1973), a degradação das membranas
celulares se constitui no primeiro processo de deterioração, sendo dessa maneira,
45
um método muito mais sensível para detectar o envelhecimento das sementes do
que o teste de germinação. Para Martins et al. (2003), entre os testes de vigor
empregados em sua pesquisa, o de condutividade elétrica foi o mais eficiente em
detectar a deterioração de sementes de palmeira real australiana
(Archontophoenix alexandrae).
Ainda pela Figura 5, notam-se maiores valores de condutividade elétrica
em sementes tratadas durante todo o período de armazenamento, quando
comparadas aos das não tratadas, com exceção do período de 165 dias de
armazenamento, em que os valores de ambos os tratamentos não diferiram
estatisticamente. Com esses resultados, comprovam-se mais uma vez o efeito
negativo dos fungicidas utilizados sobre a qualidade fisiológica das sementes de
seringueira.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 30 60 90 120 150 180
Período de armazenamento (dias)
Condutividade elétrica (us/cm/g)
FIGURA 5 Estimativa dos valores de condutividade elétrica de sementes de
seringueira em função do tratamento fungicida (tratada (T) e não tratada (NT)) e
do período de armazenamento (0, 30, 60, 90, 105, 135 e 165 dias). As barras
exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
▲ NT
Y
= 2E
–
06x
3
- 0,0003x
2
+ 0,0228x + 0,609 R
2
= 0,9448
■ T
Y
= - 2E
–
06x
3
+ 0
,
0004x
2
+ 0
,
0032x + 1
,
0975 R
2
= 0
,
7638
46
Pela Tabela 1, observa-se que tanto o tratamento fungicida quanto a
baixa temperatura de armazenamento contribuíram para o aumento de lixiviados
na solução de embebição das sementes, o que significa que essas condições não
foram eficientes em preservar a integridade das membranas celulares. Por outro
lado, em sementes sem tratamento fungicida e armazenadas à temperatura
ambiente foram observados menores valores de condutividade elétrica na
solução de embebição, sugerindo ter sido essa a melhor condição para a
manutenção da sua viabilidade. Esses resultados corroboram com os obtidos no
teste de emergência de plântulas, índice de velocidade de emergência de
plântulas e primeira contagem, nos quais sementes tratadas e armazenadas em
câmara fria apresentaram menor viabilidade e vigor quando comparadas às não
tratadas e armazenadas à temperatura ambiente.
Ferreira & Gentil (2003), trabalhando com sementes de camu-camu
(Myrciaria dúbia), espécie recalcitrante, também verificaram efeito negativo da
baixa temperatura de armazenamento, 10
o
C, sobre a qualidade fisiológica das
sementes. Segundo Chin (1988), sementes recalcitrantes são sensíveis à baixa
temperatura, no entanto, essa sensibilidade pode variar consideravelmente entre
as espécies. Mediante a isso, Farrant et al. (1988) classificaram as sementes
recalcitrantes em altamente, moderadamente e minimamente recalcitrantes,
sendo as duas primeiras sensíveis a baixas temperaturas e a minimamente
recalcitrante mais tolerante, desde que a temperatura seja superior a 0
o
C.
47
Tabela 1 Resultados médios de condutividade elétrica de sementes de
seringueira em função da temperatura de armazenamento (ambiente ± 20
o
C e
câmara fria 10
o
C) e do tratamento fungicida (tratado e não tratado com
fungicida). UFLA, Lavras, MG, 2006.
Temperatura de armazenamento Tratamento fungicida
Tratada Não tratada
Temperatura ambiente
2,06Ab 1,02Aa
Câmara fria
2,99 Bb 2,31Ba
Médias seguidas de uma mesma letra maiúscula nas colunas e minúsculas nas linhas não
diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
A não-tolerância à dessecação das sementes de seringueira em graus de
umidade inferiores a 30% (Cícero, 1986) associada à sua perda de viabilidade e
vigor quando armazenadas à baixa temperatura, como exposto no presente
trabalho, indicam que as sementes dessa espécie, provavelmente, sejam
altamente ou moderadamente recalcitrantes de acordo com a classificação de
Farrant et al. (1988).
Pela Figura 6, fica evidenciado que ambos os fatores, temperatura de
armazenamento e período de armazenamento, contribuíram para a elevação nos
valores de condutividade elétrica na solução de embebição das sementes.
Entretanto, quando essas sementes foram armazenadas à temperatura ambiente,
o incremento no valor de lixiviados foi menos expressivo do que quando elas
foram armazenadas à temperatura de 10
o
C, indicando que a condição de baixa
temperatura teve efeito deletério sobre as sementes de seringueira, o que é
comumente constatado em sementes recalcitrantes (Chin, 1988). Pereira (1980)
também constatou efeito prejudicial da baixa temperatura no armazenamento
sobre a viabilidade de sementes de seringueira. Por outro lado, esse resultado se
48
opõe à recomendação de Paula (1997), que indica a temperatura de 10
o
C para a
manutenção da viabilidade das sementes dessa espécie.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
0 30 60 90 120 150
Período de armazenamento (dias)
Condutividade elétrica (us/cm/g)
FIGURA 6 Estimativa dos valores de condutividade elétrica de sementes de
seringueira em função da temperatura de armazenamento (temperatura ambiente
± 20
o
C (AMB) e câmara fria 10
o
C (CF)) e do período de armazenamento (0, 30,
60, 90, 105, 135 e 165 dias). As barras exibem o erro padrão da média. UFLA,
Lavras, MG, 2006.
4.3 Avaliações bioquímicas e ultra-estruturais
4.3.1 Amido
Para o teor de amido, diferença significativa foi detectada para a
interação ambiente de armazenamento x período de armazenamento no embrião
(Tabela 4A) e para o fator período de armazenamento no endosperma das
sementes (Tabela 5A).
▲ AMB
Y
= -5E
–
05x
2
+ 0,0147x + 0,8424 R
2
= 0,5748
■ CF
Y
= 6E
–
05x
2
+ 0
,
0152x + 0
,
828 R
2
= 0
,
9377
49
O teor inicial de amido (aproximadamente 7%) verificado tanto no
embrião quanto no endosperma das sementes de seringueira foi superior ao
observado por Alencar (2003) e por Paula (1997), os quais encontraram valores
de 5% e 0,1%, respectivamente. A variação no teor de amido entre as sementes
de seringueira utilizadas nos três trabalhos, talvez, se deva às diferenças na
qualidade fisiológica dessas sementes, cujos valores de porcentagem de
germinação foram 90%, 70% e 40%, respectivamente. Em diversos trabalhos,
evidenciam-se modificações expressivas nas principais reservas das sementes
durante a sua deterioração, principalmente, devido à ação de lípases, proteases e
amilases (Abdul-Baki & Anderson, 1972; Basavarajappa et al., 1991; Smith &
Berjak, 1995).
No embrião, quando as sementes foram armazenadas em câmara fria,
verificou-se uma manutenção no teor de amido nos primeiros dois meses, com
posterior queda no decorrer do armazenamento (Figura 7). Já quando as
sementes foram armazenadas à temperatura ambiente, o declínio no teor de
amido seguiu um padrão linear, apresentando aos 60 dias, um menor teor de
amido quando comparado ao embrião de sementes armazenadas à baixa
temperatura. Entretanto, aos 105 e 165 dias de armazenamento, não houve
diferença estatística no teor de amido entre os embriões de sementes
armazenadas em ambas as temperaturas. Provavelmente, o menor teor de amido
no embrião de sementes armazenadas aos 60 dias à temperatura ambiente se
deva ao mais alto metabolismo das sementes nessas condições, necessitando de
maiores quantidades de açúcares menores para o suprimento da respiração
(Roberts, 1979).
50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 60 120 180
Período de armazenamento (dias)
Amido (mg de glicose/g de embrião)
FIGURA 7 Estimativa do teor de amido em embrião de sementes de
seringueira em função do ambiente de armazenamento (câmara fria 10
o
C (CF) e
temperatura ambiente ± 20
o
C (AMB)) e do período de armazenamento (0, 60,
105 e 165 dias). As barras exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras, MG,
2006.
No endosperma, a variação no teor de amido (Figura 8) seguiu um
padrão semelhante ao observado no embrião de sementes armazenadas em
câmara fria, em que se nota uma manutenção na quantidade de amido nos meses
iniciais de armazenamento, com posterior declínio até o final desse período, cujo
valor foi 31% menor do que o observado no endosperma das sementes, antes do
armazenamento. Decréscimo no teor de amido durante o armazenamento de
sementes também foi relatado por Ramos & Souza (1991) trabalhando com
sementes de araucária e por Paula (1997) com sementes de seringueira.
Provavelmente, a redução no teor de amido no embrião e no endosperma das
▲ AMB
Y
= -0,1654x + 67,731 R
2
= 0,9383
■ CF Y = -0,0012x
2
+ 0,0081x + 70,488 R
2
= 0,8976
51
sementes no decorrer do período de armazenamento seja em função da maior
atividade de amilases clivando esse carboidrato em açúcares menores para a
utilização como substrato respiratório (Roberts, 1979).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 60 120 180
Período de armazenamento (dias)
Amido (mg de glicose/g de
endosperma)
FIGURA 8 Estimativa do teor de amido em endosperma de sementes de
seringueira em função do período de armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias). As
barras exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
4.3.2 Açúcares solúveis totais (AST)
Pelos resultados da análise de variância, observa-se efeito significativo
para a interação ambiente de armazenamento x período de armazenamento no
embrião (Tabela 4A) e para as interações ambiente de armazenamento x período
de armazenamento e tratamento fungicida x período de armazenamento no
endosperma das sementes (Tabela 5A).
Pela Figura 9, verifica-se que o teor de AST no embrião das sementes,
antes do armazenamento, foi em torno de 16,5%, valor 22% superior ao
Y = -0,0025x
2
+ 0,2740x + 77,0440 R
2
= 0,9969
52
observado no endosperma (Figura 10). Nota-se ainda, que esse valor decresce,
no embrião, com o decorrer do armazenamento, independentemente da
temperatura de acondicionamento das sementes. Entretanto, a redução no teor de
AST no embrião de sementes armazenadas à temperatura ambiente ocorre mais
acentuadamente quando comparado ao embrião de sementes armazenadas à
baixa temperatura. Mas ao fim do período de armazenamento, o teor de AST no
embrião das sementes não diferiu estatisticamente entre os ambientes de
armazenamento, cujos valores foram 11,9% (câmara fria) e 12% (temperatura
ambiente). Segundo Bernal-Lugo & Leopold, (1992), a redução no vigor de
plântulas, devido ao envelhecimento das sementes, está associado ao decréscimo
no teor de carboidratos solúveis.
No endosperma de sementes armazenadas em câmara fria observa-se um
incremento no teor de AST nos dois primeiros meses de armazenamento e, a
partir daí, tendência de declínio até o fim do mesmo (Figura 10). Já no
endosperma de sementes armazenadas à temperatura ambiente verifica-se um
comportamento diferente, com redução no teor de AST nos dois meses iniciais
de armazenamento e posterior acréscimo nesse valor com o avanço desse
período.
53
100
110
120
130
140
150
160
170
180
060120180
Período de armazenamento (dias)
Açúcares solúveis (mg/g)
FIGURA 9 Estimativa do teor de açúcares solúveis totais em embrião de
sementes de seringueira em função do ambiente de armazenamento (câmara fria
10
o
C (CF) e temperatura ambiente ± 20
o
C (AMB)) e do período de
armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias). As barras exibem o erro padrão da
média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
Provavelmente, a queda no teor de AST tanto no embrião quanto no
endosperma das sementes com o decorrer do armazenamento, principalmente,
naquelas acondicionadas à temperatura ambiente tenha ocorrido em função da
sua alta atividade metabólica, uma vez que, foram armazenadas com altos teores
de água. Dessa maneira, é possível que os AST tenham sofrido oxidação para a
produção de energia durante o processo respiratório (Bewley & Black, 1994).
Eichelberger et al. (2002) também verificaram declínio no teor de açúcares
solúveis em sementes de azevém durante o armazenamento.
Por outro lado, o incremento no teor de AST no endosperma das
sementes acondicionadas à temperatura ambiente, após os primeiros 60 dias de
▲ AMB Y = -0,2755x + 164,11 R
2
= 0,9197
■ CF Y = -0,0031x
2
+ 0,2235x + 167,75 R
2
= 0,9896
54
armazenamento, pode ser devido à hidrólise do amido (Figura 8), associado à
hidrólise de reservas de lipídios armazenados na semente. As sementes de
seringueira são ricas em lipídios (Alencar, 2003), portanto, a degradação desse
composto pode ter influenciado no aumento dos AST. A conversão de lipídios
em sacarose é um processo comum durante a germinação de sementes
oleaginosas. Esse processo é iniciado com a hidrólise dos triacilgliceróis
armazenados nos corpos lipídicos, por ação de lípases, para liberar os ácidos
graxos. Esses por sua vez são oxidados nos glioxissomos por meio da ß-
oxidação para produzir acetil-CoA. A acetil-CoA é metabolizada no glioxissomo
para produzir sucinato, o qual é transportado do glioxissomo para a mitocôndria,
onde é convertido primeiro a oxalacetato e então a malato. O processo termina
no citosol, com a conversão do malato a glicose via gliconeogênese e, então, a
sacarose (Taiz & Zeiger, 2004). Assim, sugere-se na presente pesquisa que em
sementes de seringueira esse processo de conversão de lipídios em sacarose
ocorra durante o armazenamento, uma vez que, as sementes dessa espécie são
armazenadas com alta umidade e, portanto, se encontram metabolicamente
ativas. Em estudo com Euphorbia heterophylla, Suda & Giorgini (2000)
observaram que os AST aumentaram no embrião sem uma concomitante
diminuição no endosperma, sugerindo que os açúcares solúveis são originados
do catabolismo de lipídios. Rodrigues et al. (2005) também observaram aumento
no teor de AST com o avanço do período de armazenamento de sementes de
Syagrus coronata submetidas a diversas condições de ambiente.
A manutenção na concentração de AST observado no embrião e o
ligeiro incremento observado no endosperma das sementes armazenadas em
câmara fria, nos primeiros 105 dias de armazenamento, podem ser em
decorrência de uma menor atividade metabólica das sementes nessas condições.
Entre as utilidades da câmara fria no armazenamento de sementes destaca-se a
sua eficiência na redução do metabolismo celular. Além disso, foi observado nas
55
Figuras 2, 3, 4 e 6 que, nessa condição de armazenamento, ocorreu uma maior
deterioração das sementes. De acordo com Wilson & McDonald (1986), existe
uma diminuição da atividade respiratória em sementes com a evolução do seu
processo deteriorativo. Booth et al. (1999) observaram degradação mitocondrial
em células da radícula do embrião de sementes de Eurotia lanata armazenadas a
5
o
C. De acordo com os autores, o envelhecimento das sementes provoca um
acúmulo de diferentes ácidos graxos livres nas membranas mitocondriais como
resultado da ativação da fosfolipase A
2
(Luzikov et al., 1985), induzindo o
desacoplamento da fosforilação oxidativa e, como conseqüência, reduzindo o
nível de ATP endógeno. Dessa maneira, pode ser que com a redução na taxa
respiratória tenha ocorrido uma menor oxidação desses açúcares nas sementes
quando armazenadas nessas condições.
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
060120180
Período de armazenamento (dias)
Açúcares solúveis (mg/g)
FIGURA 10 Estimativa do teor de açúcares solúveis totais em endosperma de
sementes de seringueira em função do ambiente de armazenamento (câmara fria
10
o
C (CF) e temperatura ambiente ± 20
o
C (AMB)) e do período de
armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias). As barras exibem o erro padrão da
média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
▲ AMB Y = 0,004x
2
–
0,6452x + 127,48 R
2
= 0,9049
■ CF Y = - 0,0043x
2
+ 0,5478x + 127,73 R
2
= 0,9598
56
Vale destacar que, durante todo o período de armazenamento, o teor de
AST no endosperma das sementes (Figura 10) armazenadas à temperatura
ambiente foi inferior ao das acondicionadas em câmara fria, similarmente ao
observado no embrião (Figura 9). Exceção feita aos 165 dias de armazenamento,
nos quais se notou uma inversão nesses valores no endosperma das sementes.
Pelos resultados apresentados na Tabela 2, verifica-se redução no teor de
AST, no endosperma de sementes tratadas, com o decorrer do armazenamento.
O mesmo não foi verificado no endosperma das sementes não tratadas, o qual
teve um acréscimo no valor de AST aos 105 dias de armazenamento. Esses
resultados indicam que o tratamento fungicida associado ao período de
armazenamento contribuiu para a redução no teor de AST no endosperma das
sementes, provavelmente, devido ao maior metabolismo das sementes quando
tratadas com fungicidas, os quais causaram fitotoxidez a elas, sendo responsável
pelo decréscimo do seu vigor e da sua germinabilidade (Figuras 2, 3, 4 e 6).
Quando se compara sementes tratadas com fungicidas com as não
tratadas, verifica-se que só ocorreu diferença significativa entre os tratamentos
no período de 105 dias, com superioridade na concentração de AST para as
sementes não tratadas com fungicidas.
57
TABELA 2 Resultados médios do teor de açúcares solúveis totais em
endosperma de sementes de seringueira em função do tratamento fungicida
(tratada e não tratada) e do período de armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias).
UFLA, Lavras, MG, 2006.
Período de armazenamento Tratamento fungicida
Tratada Não tratada
0
132,33Aa 125,66ABa
60
119,79ABa 118,24Ba
105
115,81Bb 135,91Aa
165
113,71Ba 114,04Ba
Médias seguidas de uma mesma letra maiúscula nas colunas e minúsculas nas
linhas não dif0erem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
4.3.3 Açúcares redutores (AR)
Para açúcares redutores, verifica-se efeito significativo entre as
interações ambiente de armazenamento x período de armazenamento e
tratamento fungicida x ambiente de armazenamento no embrião (Tabela 4A) e
nas interações ambiente de armazenamento x período de armazenamento,
tratamento fungicida x período de armazenamento e tratamento fungicida x
ambiente de armazenamento no endosperma das sementes (Tabela 5A).
Pela Figura 11, observa-se que o teor de AR no embrião decresceu com
o decorrer do armazenamento das sementes em ambos os ambientes. Entretanto,
a partir de 105 dias os valores desses açúcares tenderam a declinar mais
acentuadamente em embrião de sementes armazenadas em câmara fria do que
naquelas armazenadas à temperatura ambiente. A redução nos teores de AR no
embrião das sementes com o decorrer do armazenamento pode ser uma
58
conseqüência da demanda metabólica dessas sementes, as quais foram
armazenadas com elevado grau de umidade, sendo os açúcares, utilizados como
substrato na respiração. Entretanto, Wilson & McDonald (1986) afirmam que
durante o processo deteriorativo das sementes ocorre uma redução em sua
atividade respiratória, devido à quebra do gradiente protônico necessário para
manter o processo respiratório.
Outra explicação para a redução no teor de açúcares redutores nas
sementes durante o armazenamento pode ser a sua utilização na reação de
Amadori e, subsequentemente, na de Maillard (Bernal-Lugo & Leopold 1992).
Essas reações envolvem o ataque não enzimático ao grupamento amina de
aminoácido e de proteínas pelos açúcares redutores, formando derivados frutosil
ou glucosilamina (reação de Amadori), com a subseqüente interação entre esses
produtos, formando compostos poliméricos, responsáveis pela chamada “reação
do escurecimento” (reação de Maillard) (Wettlaufer & Leopold, 1991).
Trabalhando com sementes de soja envelhecidas artificialmente Wettlaufer &
Leopold (1991) verificaram uma relação entre o aumento dos produtos de
Maillard no eixo embrionário das sementes e o decréscimo na sua
germinabilidade.
59
0
10
20
30
40
50
060120180
Período de armazenamento (dias)
açúcares redutores (mg/g)
FIGURA 11 Estimativa do teor de açúcares redutores em embrião de sementes
de seringueira em função do ambiente de armazenamento (câmara fria 10
o
C
(CF) e temperatura ambiente ± 20
o
C(AMB)) e do período de armazenamento (0,
60, 105 e 165 dias). As barras exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras,
MG, 2006.
Maior teor de AR foi observado no embrião de sementes armazenadas à
temperatura ambiente e sem tratamento fungicida (Tabela 3). Por outro lado,
sementes tratadas com fungicidas apresentaram menores valores,
provavelmente, devido à participação desses açúcares nas reações de Amadori e
Maillard. Bernal-Lugo & Leopold (1992) observaram redução no teor de
glicose, frutose e galactose durante o envelhecimento de sementes de milho e
atribuíram a redução em seus níveis à participação dos mesmos nas reações de
Amadori e Maillard.
Relacionando esses resultados com os obtidos nas avaliações
fisiológicas (Figuras 2, 3, 4, 5 e 6), observa-se que a maior quantidade de AR no
embrião das sementes armazenadas à temperatura ambiente e sem tratamento
▲ AMB
Y
= 0,0011x
2
–
0,2680x + 40,9600 R
2
= 0,9851
■ CF Y = 0,0007x
2
– 0,2391x + 40,1410 R
2
= 0,8632
60
fungicida está associada à maior porcentagem de emergência de plântulas e
vigor das sementes. Esses resultados corroboram com os observados por Bernal-
Lugo & Leopold (1992), os quais relataram uma associação entre o declínio no
teor de AR no embrião de sementes de milho e redução no vigor das sementes.
No entanto, parece que os açúcares não são os únicos responsáveis por essa
redução na germinabilidade e no vigor das sementes de seringueira, uma vez que
seus valores não representam as diferenças observadas nos parâmetros
fisiológicos avaliados, entre os tratamentos. Diversas alterações bioquímicas
ocorrem durante a deterioração das sementes, no entanto, a exata causa da perda
de sua viabilidade é ainda desconhecida (Sung, 1996).
TABELA 3 Resultados médios do teor de açúcares redutores em embrião de
sementes de seringueira em função do ambiente de armazenamento (câmara fria
10
o
C e temperatura ambiente ± 20
o
C) e do tratamento fungicida (tratada e não
tratada). UFLA, Lavras, MG, 2006.
Ambiente de armazenamento Tratamento fungicida
Tratada Não tratada
Temperatura ambiente
27,52Ab 32,33Aa
Câmara fria
27,97Aa 28,09Ba
Médias seguidas de uma mesma letra maiúscula nas colunas e minúsculas nas
linhas não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
Pelos resultados apresentados na Figura 12, observa-se uma tendência de
aumento no teor de AR no endosperma das sementes, quando acondicionadas à
temperatura ambiente, até os 105 dias de armazenamento. A partir daí, nota-se
um decréscimo nesse valor, entretanto, não atingindo teores inferiores ao
observado no endosperma das sementes antes do armazenamento.
61
Para as sementes armazenadas em câmara fria, semelhantemente, ao
observado naquelas acondicionadas à temperatura ambiente, verifica-se um
incremento no teor de açúcares redutores nos primeiros dois meses de
armazenamento. Vale ressaltar que esse aumento foi 27% superior ao observado
no endosperma das sementes armazenadas à temperatura ambiente.
O aumento no teor de AR no endosperma das sementes em ambos os
ambientes de armazenamento, provavelmente, tenha ocorrido em função da
degradação de açúcares solúveis totais (Figura 10) como oligossacarídeos e
sacarose pelas enzimas α galactosidade, SuSy e invertases, respectivamente ou
pela hidrólise de lipídios, por ação de lípases e, posterior conversão dos ácidos
graxos formados em açúcares, via gliconeogênese. Por outro lado, o maior
acúmulo desses açúcares em sementes armazenadas em câmara fria, nos dois
primeiros meses, pode ter ocorrido em função da menor respiração das sementes
nessas condições. De acordo com Wilson & McDonald (1986), existe uma
diminuição da atividade respiratória em sementes com a evolução do processo
deteriorativo. Para os autores, isso ocorre devido ao aumento da peroxidação de
lipídios, uma vez que, a membrana interna das mitocôndrias é rica em lipídios
insaturados. Como conseqüência, há uma diminuição da fluidez das membranas
e/ou um aumento na sua permeabilidade (Wilson & McDonald, 1986),
culminando com a quebra do gradiente protônico necessário para manter o
acoplamento respiratório (Moreland & Huber, 1978). Vale ressaltar que nas
sementes acondicionadas nas condições de baixa temperatura, ocorreu maior
queda no vigor e na porcentagem de emergência de plântulas (Avaliações
fisiológicas - Figuras 2, 3, 4 e 6).
Contrariamente ao verificado no endosperma de sementes
acondicionadas à temperatura ambiente, a partir do segundo mês de
armazenamento o teor de AR do endosperma de sementes acondicionadas à
baixa temperatura começou a decrescer, até atingir o valor de 16,5 mg/g aos 165
62
dias de armazenamento. Esse valor representa 26% menos AR em relação ao
endosperma das sementes antes do armazenamento. A elevada queda no teor de
AR, a partir do segundo mês, pode ser devido à participação desses açúcares nas
reações de Amadori e Maillard (Feeney & Whitaker, 1982). Vale destacar que a
redução no teor de AR no endosperma de sementes armazenadas em câmara fria,
após os dois meses iniciais de armazenamento, está positivamente associada
com a perda do vigor e da viabilidade das sementes (Figuras 2, 3, 4 e 6 –
avaliações fisiológicas). Segundo Salisbury & Ross (1992), sérios distúrbios
podem ocorrer nas células em virtude da perda dos açúcares redutores, uma vez
que, alguns desses açúcares são importantes substratos para a respiração celular,
enquanto outros são componentes estruturais de ácidos nucléicos, além de
constituírem blocos básicos da construção de muitos outros carboidratos,
incluindo amido e celulose.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 60 120 180
Período de armazenamento (dias)
Açúcares redutores (mg/g)
FIGURA 12 Estimativa do teor de açúcares redutores em endosperma de
sementes de seringueira em função do ambiente de armazenamento (câmara fria
10
o
C (CF) e temperatura ambiente ± 20
o
C (AMB)) e do período de
armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias). As barras exibem o erro padrão da
média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
▲ AMB
Y
=
–
0,0010x
2
+ 0,2181x +22,2600 R
2
= 0,9808
■ CF Y = - 0,0033x
2
+ 0,4972x + 22,9020 R
2
= 0,9892
63
Em relação ao tratamento fungicida (Figura 13), verifica-se um aumento
no teor de AR, no endosperma das sementes, até os 80 dias de armazenamento,
tanto em sementes tratadas como nas não tratadas com fungicidas. A partir daí,
nota-se uma queda abrupta nesses valores, em ambos os tratamentos, não
apresentando diferença estatística ao final do período de armazenamento.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 60 120 180
Período de armazenameno (dias)
Açúcares redutores (mg/g)
FIGURA 13 Estimativa do teor de açúcares redutores em endosperma de
sementes de seringueira em função do tratamento fungicida (tratada (T) e não
tratada (NT)) e do período de armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias). As barras
exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
Nas avaliações fisiológicas (Figuras 2, 3, 4, 5 e 6), ficou evidenciado
que o tratamento fungicida teve efeito negativo sobre a qualidade fisiológica das
sementes. Entretanto, esse tratamento parece não proporcionar expressivas
variações no teor de AR no endosperma das sementes, diferentemente do
observado entre as diferentes temperaturas de armazenamento, nas quais
notaram-se grandes alterações nos níveis desses açúcares (Figura 12).
▲ NT
Y
= - 0,0018x
2
+ 0,2954x + 21,6150 R
2
= 0,9016
■ T
Y
= - 0
,
0025x
2
+ 0
,
4200x + 23
,
5370 R
2
= 0
,
9717
64
Quando se avalia a interação ambiente de armazenamento x tratamento
fungicida (Tabela 4), verificam-se menores valores de AR em endosperma de
sementes sem tratamento fungicida e armazenadas à temperatura ambiente
quando comparado aos demais tratamentos. Esses resultados diferem daqueles
observados para o embrião das sementes (Tabela 3), nas quais se verificaram
maiores teores de açúcares redutores nessas condições. Talvez o maior acúmulo
de AR no endosperma das sementes, quando armazenadas em câmara fria e/ou
tratadas (condições prejudiciais à qualidade fisiológica das sementes –
avaliações fisiológicas), seja em decorrência da maior hidrólise de lipídios no
endosperma das sementes nessas condições e não devido à diminuição das
reações de Amadori e Maillard.
TABELA 4 Resultados médios de teor de açúcares redutores em endosperma
de sementes de seringueira em função do ambiente de armazenamento
(temperatura ambiente ± 20
o
C e câmara fria 10
o
C) e do tratamento fungicida
(tratado e não tratado). UFLA, Lavras, MG, 2006.
Tratamento fungicida
Ambiente de armazenamento
Tratada Não tratada
Temperatura ambiente
33,26 Aa 25,96 Bb
Câmara fria
30,54 Ba 29,06 Aa
Médias seguidas de uma mesma letra maiúscula nas colunas e minúsculas nas
linhas não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
4.3.4 Lipídios
Em relação à composição lipídica, foi verificado efeito significativo para
o fator ambiente de armazenamento e para a interação tratamento fungicida x
período de armazenamento, no embrião (Tabela 4A) e para a interação tripla
tratamento fungicida x ambiente de armazenamento x período de
armazenamento, no endosperma (Tabela 5A).
65
De maneira geral, verificam-se altos teores de lipídios tanto no embrião
(Figura 18) quanto no endosperma (Figura 22) das sementes de seringueira.
Com superioridade em 21 pontos percentuais desse último em relação ao
observado no embrião das sementes, antes do armazenamento.
O alto teor de lipídios pode ser comprovado pela fotomicrografia de
cotilédones (Figura 14) e pelas eletromicrografias de varredura (Figuras 15, 16 e
17) de sementes de seringueira, nas quais, se verificam grandes quantidades de
oleossomos aderidos às membranas celulares e dispersos no citoplasma.
Segundo Aigbodion (1994), as sementes de seringueira possuem em média 43%
de lipídios, sendo esse o seu principal componente de reserva. De acordo com
Taiz & Zeiger (2004), óleos e gorduras são formas importantes de armazenagem
de carbono reduzido em muitas espécies de importância econômica como soja,
amendoim e algodão.
FIGURA 14 Fotomicrografia de cotilédone de sementes de seringueira, corado
com Sudan IV, antes do armazenamento. A coloração alaranjada evidencia a
presença de lipídios. UFLA, Lavras, MG, 2006.
66
Verifica-se ainda nas Figuras 15 e 16 a formação de coalescência de
lipídios, dando origem, a uma grande estrutura compacta. A coalescência dos
corpos lipídicos pode ocorrer em função da redução de enzimas denominadas de
oleosina. Essas enzimas cobrem a superfície dos oleossomos e impedem que os
fosfolipídios de corpos lipídicos adjacentes entrem e contato e se fusionem (Taiz
& Zeiger 2004). A formação de coalescência lipídica foi positivamente
correlacionada à deterioração de sementes de Coffea canephora durante o
armazenamento (Brandão Jr., 2000). Dessa maneira, pode ser que no presente
trabalho, o aparecimento dessas estruturas nos cotilédones de sementes de
seringueira possa estar envolvido com o avanço de sua deterioração.
FIGURA 15 Eletromicrografias de varredura de cotilédones de sementes de
seringueira armazenadas por 120 dias à temperatura ambiente ± 20
o
C. As setas
evidenciam a coalescência de corpos lipídicos. UFLA, Lavras, MG, 2006.
67
Ainda em relação ao embrião, observa-se um acréscimo no teor de
lipídios com o decorrer do armazenamento das sementes, tanto em sementes
tratadas com fungicidas quanto naquelas não tratadas (Figura 18). Priestley &
Leopold (1979), encontraram resultados semelhantes em sementes de Glycine
max submetidas ao envelhecimento acelerado, tendo sido detectado um aumento
de 20% no teor de lipídios. Resultado similar também foi verificado por Ramos
& Souza (1991) em sementes de Araucária angustifólia armazenadas. De acordo
com os autores, existe alguma ligação entre o acréscimo desse componente e a
perda da viabilidade das sementes.
FIGURA 16 Eletromicrografias de varredura de cotilédones de sementes de
seringueira armazenadas por 120 dias à temperatura ambiente ± 20
o
C. As setas
evidenciam a coalescência de corpos lipídicos. UFLA, Lavras, MG, 2006.
68
Para o embrião de sementes tratadas com fungicidas (Figura 18),
verifica-se uma elevação linear no teor de lipídios, atingindo ao fim de 165 dias
o valor de 47%, teor 19% superior ao observado no embrião das sementes antes
do armazenamento. Já no embrião de sementes não tratadas, o teor de lipídios
permaneceu estável nos primeiros 60 dias de armazenamento e a partir daí
tendeu a subir com o decorrer desse período. Entretanto, esse acréscimo foi
sempre inferior ao observado no embrião das sementes tratadas.
FIGURA 17 Eletromicrografias de varredura de cotilédones de sementes de
seringueira armazenadas por 120 dias à temperatura ambiente ± 20
o
C. As setas
evidenciam os oleossomos aderidos às membranas celulares. UFLA, Lavras,
MG, 2006.
69
Estes resultados sugerem a ocorrência de biossíntese de lipídios no
embrião das sementes com o decorrer do armazenamento. De acordo com
Kermode (1990), uma das principais diferenças entre as sementes ortodoxas e as
recalcitrantes é a capacidade da primeira em tolerar um essencial processo de
dessecação ao final da maturação das sementes. Por esse processo, permite-se
que as sementes mudem seu metabolismo de desenvolvimento para o de
germinação. O mesmo não ocorre em sementes recalcitrantes, o que sugere a
hipótese de que essas sementes apresentam um desenvolvimento incompleto
(Farrant et al., 1997). De acordo com Marcos Filho (2005), nas sementes
recalcitrantes, em média, apenas 60% das células estão em fase de pré-
replicação celular no momento da maturidade fisiológica, de modo que a
continuidade do metabolismo em sementes mais úmidas pode ser considerada o
fator determinante da sensibilidade à dessecação.
35
37
39
41
43
45
47
49
51
0 60 120 180
Período de armazenamento (dias)
Lipídios (%)
FIGURA 18 Estimativa do teor de lipídios no embrião de sementes de
seringueira em função do tratamento fungicida (tratada (T) e não tratada (NT)) e
do período de armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias). As barras exibem o erro
padrão da média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
▲ NT
Y
= 0,0002x
2
–
0,0089x + 40,118 R
2
= 0,7008
■ T
Y
= 0
,
0589x + 37
,
327 R
2
= 0
,
9365
70
Dessa maneira, tem sido sugerido que sementes com característica
recalcitrante continuam o seu desenvolvimento após a abscisão da planta-mãe.
Esse fato pode ser evidenciado por meio das Figuras 19, 20 e 21, nas quais é
observada a divisão celular no eixo embrionário das sementes ao zero, 60 e 105
dias de armazenamento, indicando que os embriões ainda estavam em processo
de formação nesses períodos. Isso pode justificar a elevação no teor de lipídios
no embrião das sementes durante o armazenamento, uma vez que tais
componentes são essenciais à estruturação de membranas celulares, além de
constituírem a principal substância de reserva das sementes desta espécie.
Vale ressaltar que na presente pesquisa não foi observada germinação
das sementes nas embalagens durante o armazenamento, o que descarta a
possibilidade da divisão celular ter ocorrido em função do início da germinação
das sementes. Por outro lado, resultados de pesquisas recentes com embrião de
sementes de café (Silva, 2002) e embrião de sementes de tomate (Castro et al.,
2000) evidenciam a ocorrência de divisão celular precedendo o inicio da
protrusão radicular (germinação).
71
FIGURA 19 Micrografias de varredura de eixo embrionário de sementes de
seringueira armazenadas por 105 dias à temperatura ambiente ± 20
o
C. As setas
evidenciam a divisão celular. UFLA, Lavras, MG, 2006.
Pelos resultados apresentados na Tabela 5, observa-se maior teor de
lipídios no embrião de sementes armazenadas em câmara fria do que naquelas
armazenadas à temperatura ambiente. Provavelmente, isso tenha ocorrido devido
à menor taxa respiratória do embrião nas sementes acondicionadas em baixa
temperatura, sendo necessário consequentemente, uma menor degradação de
lipídios para gerar substrato para a respiração.
72
FIGURA 20 Micrografias de varredura de eixo embrionário de sementes de
seringueira armazenadas por 60 dias à temperatura ambiente ± 20
o
C. As setas
evidenciam a divisão celular. UFLA, Lavras, MG, 2006.
TABELA 5 Resultados médios de teor de lipídios em embrião de sementes de
seringueira em função do ambiente de armazenamento (temperatura ambiente ±
20
o
C e câmara fria 10
o
C). UFLA, Lavras, MG, 2006.
Ambiente de armazenamento Teor de lipídios (%)
Temperatura ambiente
41,20B
Câmara fria
42,57A
Médias seguidas de uma mesma letra maiúscula nas colunas não diferem entre si
pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
73
FIGURA 21 Micrografias de varredura de eixo embrionário de sementes de
seringueira antes do armazenamento. As setas evidenciam a divisão celular.
UFLA, Lavras, MG, 2006.
No endosperma das sementes (Figura 22) verifica-se uma tendência de
queda no teor de lipídios com o decorrer do armazenamento das sementes em
todos os tratamentos. Redução no teor de lipídios com o avanço da deterioração
das sementes tem sido amplamente relatada na literatura. De acordo com
Kalpana & Madhava Rao (1996), a deterioração da membrana durante o
envelhecimento é frequentemente associada com o decréscimo no conteúdo de
fosfolipídio total, bem como, com a redução de ácidos graxos polinsaturados
(Linn & Pearce, 1990), os quais são a fonte de substrato para a peroxidação de
lipídios (Stewart & Bewley, 1980).
74
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
0 60 120 180
Período de armazenamento (dias)
Lipídios (%)
FIGURA 22 Estimativa do teor de lipídios em endosperma de sementes de
seringueira em função do ambiente de armazenamento (câmara fria 10
o
C (CF) e
temperatura ambiente ± 20
o
C (A)), do tratamento fungicida (tratada (T) e não
tratada (NT)) e do período de armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias). As barras
exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
4.3.5 Peroxidação de lipídios
Para os dados de peroxidação de lipídios, avaliada pela quantidade de
MDA foi detectada diferença significativa para a interação tripla tratamento
fungicida x ambiente de armazenamento x período de armazenamento (Tabela
3A).
Verifica-se por meio da Figura 23 que houve um acréscimo no teor de
MDA nas sementes nos primeiros 105 dias de armazenamento em todos os
tratamentos avaliados, com tendência de queda após esse período. Exceção feita
♦ NTA Y = 0,0003x
2
– 0,0984x + 52,157 R
2
= 0,6722
▲T
A
Y
= - 0,0006x
2
+ 0,0388x + 49,028 R
2
= 0,9349
------- ■ NTCF Y = 0,0004x
2
– 0,1162x + 51,939 R
2
= 0,7949
- x TCF Y = 0,0002x
2
–
0,0562x + 49,085 R
2
= 0,6267
75
para as sementes armazenadas à temperatura ambiente e não tratadas com
fungicidas, cujo valor de MDA tendeu a decrescer com o decorrer do
armazenamento. Estes resultados indicam a ocorrência de peroxidação de
lipídios nas sementes de seringueira durante o armazenamento. Stewart &
Bewley (1980), avaliando a peroxidação de lipídios em eixo embrionário de
sementes de soja submetidas ao envelhecimento acelerado, encontraram
resultados semelhantes, nos quais se verificou incremento no nível de MDA nos
primeiros dias de envelhecimento e posterior queda nesses valores com o avanço
do mesmo. Os autores sugeriram que o decréscimo no nível de MDA ocorreu em
função da redução no teor do ácido graxo insaturado (ácido linolênico) precursor
dessa reação, ou ainda, devido à facilidade de oxidação do MDA (Beuge &
Aust, 1978). Zacheo et al. (2000) estudando as alterações bioquímicas em
sementes de amendoim após o armazenamento também verificaram redução nos
teores de ácidos graxos insaturados, linoléico e linolênico.
Quando se compara o ambiente de armazenamento, observa-se que as
sementes armazenadas à baixa temperatura, 10
o
C, apresentaram maiores valores
de MDA do que aquelas armazenadas à temperatura ambiente (Figura 23). No
entanto, vale ressaltar que as sementes tratadas e armazenadas à temperatura
ambiente apresentaram aos 105 dias valores de MDA próximos aos observados
em sementes armazenadas em câmara fria. Esses resultados corroboram com os
observados no teste de emergência de plântulas e de vigor (avaliações
fisiológicas – Figuras 2, 3, 4, 5, 6), nos quais foi verificado que a baixa
temperatura de armazenamento e o tratamento fungicida afetaram negativamente
a qualidade fisiológica das sementes. A peroxidação de lipídios associada ao
estresse oxidativo por radicais livres tem sido considerada uma das principais
responsáveis pela deterioração de sementes (Murthy & Sun 2000), podendo
afetar a estrutura e a função das membranas celulares, incluindo a inativação de
76
proteínas da membrana e sua permeabilidade (Hendry, 1993; Priestley, 1986;
Wilson & McDonald, 1986).
Em relação ao tratamento fungicida verifica-se pela Figura 23 que este
também contribuiu para a elevação no teor de MDA das sementes, cujos valores
diferenciaram-se estatisticamente em relação às sementes não tratadas somente
nos períodos finais de armazenamento.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0 60 120 180
Período de armazenamento (dias)
Malonaldeído (nmol/g sementes)
FIGURA 23 Estimativa de peroxidação de lipídios em sementes de seringueira
em função do ambiente de armazenamento (câmara fria 10
o
C (CF) e temperatura
ambiente 20
o
C (A)), do tratamento fungicida (tratada (T) e não tratada (NT)) e
do período de armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias). As barras exibem o erro
padrão da média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
4.3.6 Proteínas
Quanto ao teor de proteínas solúveis totais verifica-se significância para
a interação tripla tratamento fungicida x ambiente de armazenamento x período
♦ NTA Y = - 7E-05x
2
+ 0,0053x + 6,8395 R
2
= 0,4233
▲ T
A
Y
= - 0,0002x
2
+ 0,0407x + 5,436 R
2
= 0,8943
------- ■ NTCF Y = - 0,0004x
2
+ 0,0624x + 6,6256 R
2
= 0,999
- x TCF Y = - 0,0003x
2
+ 0,0575x + 5,8402 R
2
= 0,7184
77
de armazenamento no embrião das sementes (Figura 4A) e interação dupla
ambiente de armazenamento x período de armazenamento no endosperma
(Tabela 5A).
Nas Figuras 24 e 25, estão apresentadas as alterações no teor de
proteínas solúveis totais no embrião e no endosperma de sementes de
seringueira, respectivamente. Comparando-se as duas figuras, nota-se que o
endosperma das sementes possui cerca de 8% mais proteínas do que o embrião,
cujos valores médios foram de 140mg/g e 130mg/g, respectivamente. Esses
valores estão um pouco abaixo dos observados por Paula (1997), cujo teor de
proteínas solúveis totais encontrados foi de 18%. Provavelmente, essa diferença
ocorreu em decorrência das distintas metodologias utilizadas entre os trabalhos.
No presente estudo utilizou-se a extração seqüencial das proteínas de acordo
com Osborne (1924), para sua quantificação e no conduzido por Paula foi
utilizado o método que Kjeldhal, que se baseia na determinação do nitrogênio
total. Esse método quantifica, além das proteínas solúveis, também as
insolúveis. Além disso, de acordo com Morrison (1992), quando se utiliza o
método de Kjeldhal para a quantificação de proteínas, parte do nitrogênio
determinado pode ser proveniente de lipídios, fazendo com que os valores de
proteínas sejam superestimados.
Por outro lado, o valor de proteínas solúveis encontrado por Alencar
(2003), em endosperma de sementes de seringueira foi 29% inferior ao
observado no presente trabalho, embora se tenha utilizado o mesmo
procedimento de extração. Possivelmente, a diferença no teor de proteínas
solúveis nos distintos estudos, seja em decorrência da dificuldade de preservação
da mesma quantidade de material durante todas as extrações. Pois a cada
centrifugação com os diferentes solventes foi necessária a filtragem do
sobrenadante com papel de filtro e posterior recuperação de parte da amostra
aderida ao mesmo, uma vez que, foi observado que a velocidade de
78
centrifugação utilizada no presente trabalho não foi suficiente para que o
precipitado ficasse completamente aderido ao tubo de centrifugação. Esse
procedimento de filtragem não foi realizado por Alencar.
Outra possibilidade é a variação no teor de proteínas entre os materiais.
Agunbiagle et al. (1995) relataram que a concentração de proteínas totais em
endosperma de sementes de seringueira pode variar. Os mesmos autores
encontraram valores entre 16,8 e 22,4%. De acordo com Marcos Filho (2005)
fatores como: genótipo, condições climáticas, idade das sementes, fertilidade do
solo e nutrição da planta mãe podem afetar a composição química das sementes.
Observando os dados apresentados na Figura 24, nota-se uma grande
redução no teor de proteínas, no embrião das sementes (aproximadamente 45%
para sementes armazenadas em câmara fria e 41% para as armazenadas à
temperatura ambiente), nos primeiros 105 dias de armazenamento, tanto em
sementes tratadas como nas não tratadas com fungicidas. A partir daí, nota-se
uma estabilização no teor de proteínas no embrião de sementes armazenadas à
temperatura ambiente e uma tendência de acréscimo no embrião de sementes
armazenadas em câmara fria.
Declínio no teor de proteínas com o decorrer do armazenamento também
foi observado por Chaitanya et al. (2000) em sementes de Shorea robusta. Para
Smith & Berjak (1995), a redução no teor de proteínas durante o envelhecimento
das sementes ocorre em virtude do aumento da atividade proteolítica. Entretanto,
outros fatores além do incremento da atividade proteolítica podem contribuir
para a diminuição do teor de proteínas (Chaitanya et al., 2000). Gutteridge &
Halliwell (1990) consideram a degradação de proteínas como uma das principais
conseqüências da peroxidação de lipídios. Comparando-se a Figura 23 com a 24,
nota-se que os maiores teores de malonaldeído está associado aos menores
valores de proteínas solúveis no embrião.
79
0
20
40
60
80
100
120
140
0 60 120 180
Período de armazenamento (dias)
proteínas solúveis totais (mg/g)
FIGURA 24 Estimativa do teor de proteínas solúveis totais em embrião de
sementes de seringueira em função do ambiente de armazenamento (câmara fria
10
o
C (CF) e temperatura ambiente ± 20
o
C (A)), do tratamento fungicida (tratada
(T) e não tratada (NT)) e do período de armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias).
As barras exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
No endosperma (Figura 25), similarmente ao observado no embrião
ocorre um decréscimo no teor de proteínas solúveis totais com o decorrer do
armazenamento, tanto em sementes acondicionadas à temperatura ambiente
quanto naquelas em câmara fria. Estes resultados sugerem, mais uma vez, a
provável degradação das proteínas por meio do incremento da atividade
proteolítica (Dunlop et al., 2002), além da destruição dessas proteínas como
conseqüência da peroxidação de lipídios (Araújo, 1995).
♦ NTA Y = 0,0038x
2
– 0,8782x + 121,3000 R
2
= 0,6834
▲T
A
Y
= 0,0031x
2
–
0,7063x + 111,0600 R
2
= 0,6066
------- ■ NTCF Y = 0,0059x
2
– 1,2051x + 126,3300 R
2
= 0,9995
- x TCF Y = 0,0049x
2
–
1,0101x + 113,5800 R
2
= 0,9276
80
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 60 120 180
Período de armazenamento (dias)
Proteínas solúveis totais (mg/g)
FIGURA 25 Estimativa do teor de proteínas solúveis totais em endosperma de
sementes de seringueira em função do ambiente de armazenamento (câmara fria
10
o
C (CF) e temperatura ambiente ± 20
o
C (AMB)) e do período de
armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias). As barras exibem o erro padrão da
média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
Nas Figuras 26 e 27, estão representadas as frações de proteínas solúveis
no embrião durante o armazenamento das sementes à temperatura ambiente e em
câmara fria, respectivamente.
Na temperatura ambiente a fração dominante – a glutelina – declina
severamente nos 60 dias iniciais de armazenamento, com posterior acréscimo no
seu valor aos 105 dias e novamente tendência de queda após esse período. Na
fração de albuminas, verifica-se uma queda no seu teor até os 105 dias de
armazenamento das sementes e um ligeiro acréscimo após esse período. Já nas
menores frações, globulinas e prolaminas verificam-se declínio nos seus valores
com o decorrer do armazenamento das sementes.
▲ AMB
Y
= 0,0026x
2
–
0,8336x + 145,07 R
2
= 0,9804
■ CF Y = 0,0021x
2
– 0,7306x + 140,92 R
2
= 0,9133
81
O declínio mais acentuado nos primeiros meses de armazenamento das
sementes para todas as frações protéicas, provavelmente, está associado à maior
ocorrência de peroxidação lipídica (Figura 23), bem como maior atividade
proteolítica nesse período. Por outro lado, a elevação no teor de algumas frações
de proteínas após os dois primeiros meses de armazenamento pode ser em
decorrência da diminuição da peroxidação de lipídios (Figura 23), talvez devido
à redução de substrato para a sua ocorrência (Stewart & Bewley 1980). Além
disso, pode ter ocorrido uma diminuição na atividade proteolítica. Chaitanya et
al. (2000) estudando alterações no teor de proteínas e na atividade proteolítica
durante o envelhecimento de sementes de Shorea robusta verificaram declínio
na atividade proteolítica após determinado período de envelhecimento das
sementes.
Outra explicação para o aumento nas frações glutelinas e albuminas no
embrião das sementes durante o armazenamento é a possibilidade de estar
ocorrendo síntese desse componente, uma vez que foi observado que até os 105
dias de armazenamento das sementes estava ocorrendo divisão celular no eixo
embrionário (Figuras 19, 20 e 21).
82
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 60 105 165
Período de armazenamento (dias)
Fração protéica (mg/g)
Albuminas Globulinas Prolaminas Glutelinas
FIGURA 26 Conteúdo de frações de proteínas solúveis em embrião de
sementes de seringueira durante o armazenamento a temperatura ambiente ±
20
o
C. As barras nas colunas exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras,
MG, 2006.
A variação nas frações de proteínas solúveis em embriões de sementes
armazenadas em câmara fria (Figura 27) foi semelhante ao observado em
sementes armazenadas à temperatura ambiente. Exceção feita à fração glutelina
aos 105 dias de armazenamento a qual não apresentou diferença estatística do
valor observado aos 60 dias de armazenamento.
83
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 60 105 165
Período de armazenamento (dias)
Fração protéica (mg/g)
Albuminas Globulinas Prolaminas Glutelinas
FIGURA 27 Conteúdo de frações de proteínas solúveis em embrião de
sementes de seringueira durante o armazenamento em câmara fria 10
o
C. As
barras nas colunas exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
Nas Figuras 28 e 29 estão representadas as frações protéicas em
endosperma de sementes de seringueira acondicionadas à temperatura ambiente
e em câmara fria, respectivamente, durante o armazenamento.
No endosperma similarmente ao observado no embrião das sementes, a
maior fração protéica foi de glutelinas. Esses resultados corroboram com os
observados por Alencar (2003), o qual também verificou maiores teores de
glutelina no endosperma de sementes de seringueira. Comparando-se o valor
inicial dessa fração no endosperma com o do embrião, nota-se uma
superioridade do primeiro em relação ao segundo.
84
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0 60 105 165
Período de armazenamento (dias)
Fração protéica (mg/g)
Albuminas Globulinas Prolaminas Glutelinas
FIGURA 28 Conteúdo de frações de proteínas solúveis em endosperma de
sementes de seringueira durante o armazenamento à temperatura ambiente ±
20
o
C. As barras nas colunas exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras,
MG, 2006.
Nota-se ainda, pelas Figuras 28 e 29, uma redução no teor de glutelina
durante o armazenamento, tanto no endosperma de sementes armazenadas à
temperatura ambiente quanto naquelas acondicionadas em câmara fria. Exceção
feita para o endosperma de sementes armazenadas por 105 dias à temperatura
ambiente, cujo valor não diferiu estatisticamente do observado aos 60 dias de
armazenamento. Vale ressaltar, que ao final do período de armazenamento os
valores observados para a fração glutelina no endosperma foram inferiores aos
do embrião das sementes, provavelmente, devido à síntese dessas proteínas no
embrião, associado à maior degradação das mesmas no endosperma.
85
Em relação às albuminas, verificam-se menores valores dessa fração no
endosperma quando comparado ao embrião das sementes, independentemente
do ambiente de armazenamento. No entanto, sua resposta se assemelha à
observada no embrião, cujos valores oscilaram durante o armazenamento.
Porém, quando se compara o valor de albuminas antes do armazenamento com o
observado ao fim dele, nota-se uma redução dessa fração no endosperma com o
armazenamento das sementes. De acordo com Palmiano & Juliano (1972), a
degradação das albuminas por proteases libera aminoácidos livres para a síntese
de novas proteínas solúveis (enzimas).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0 60 105 165
Período de armazenamento (dias)
Fração protéica (mg/g)
Albuminas Globulinas Prolaminas Glutelinas
FIGURA 29 Conteúdo de frações de proteínas solúveis em endosperma de
sementes de seringueira durante o armazenamento em câmara fria a 10
o
C. As
barras nas colunas exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
86
As frações das globulinas e prolaminas, as menores frações protéicas do
endosperma, também apresentam valores inferiores quando comparados aos do
embrião das sementes, considerando que as globulinas tiveram um grande
decréscimo com o armazenamento das sementes e a prolaminas estiveram quase
inexistentes em todos os períodos de avaliação.
4.3.7 Aminoácidos
O resumo da análise de variância dos teores de aminoácidos em
embriões e endospermas de sementes de seringueira está apresentado nas
Tabelas 4A e 5A, respectivamente.
Para o embrião verifica-se interação tripla, tratamento fungicida x
ambiente de armazenamento x período de armazenamento e para o endosperma
observa-se significância apenas para o fator período de armazenamento.
Observa-se no embrião (Figura 30), que ocorreu um pequeno
decréscimo no teor de aminoácidos, em todos os tratamentos, nos primeiros 60
dias de armazenamento das sementes. Entretanto, esperava-se um aumento,
resultante da degradação de proteínas por proteases. Segundo Smith & Berjak
(1995), ocorre um acréscimo no conteúdo de aminoácidos com o
envelhecimento das sementes devido ao aumento da atividade proteolítica.
Provavelmente, o não-acúmulo de aminoácidos no embrião das sementes, nos
meses iniciais de armazenamento, deu-se em função da sua destruição por meio
dos produtos da peroxidação de lipídios. Comparando-se a Figura 23 com a 30,
verifica-se uma associação entre altos níveis de malonaldeído e baixos níveis de
aminoácidos. Para Araújo (1994), uma das principais conseqüências da
peroxidação de lipídios é a destruição de aminoácidos, especialmente metionina,
lisina, histidina, cisteína e triptofano.
Outra possibilidade para o não-acúmulo de aminoácidos nos primeiros
105 dias de armazenamento seria sua destruição pela ocorrência das reações de
87
Amadori e Maillard (Wettlaufer & Leopold, 1991). Essas reações são
caracterizadas pelo ataque não enzimático aos grupos aminas pelos açúcares
redutores. Comparando-se os resultados apresentados para açúcares redutores
(Figura 11) e aminoácidos (Figura 30), observa-se uma associação entre os
dados. Paula (1997), também trabalhando com sementes de seringueira,
verificou um comportamento semelhante nos resultados de aminoácidos e de
açúcares redutores e sugeriu que os aminoácidos poderiam estar sendo atacados
pelos açúcares redutores nas reações de Amadori e Maillard.
0
3
6
9
12
15
0 60 120 180
Período de armazenamento (dias)
Aminoácidos (mg/g)
FIGURA 30 Estimativa do teor de aminoácidos em embrião de sementes de
seringueira em função do ambiente de armazenamento (câmara fria 10
o
C (CF) e
temperatura ambiente ± 20
o
C (A)), do tratamento fungicida (tratada (T) e não
tratada (NT)) e do período de armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias). As barras
exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
♦ NTA Y = 0,0003x
2
– 0,0484x + 5,0700 R
2
= 91,05
▲TA
Y
= 0,0005x
2
–
0,0476x + 3,4725 R
2
= 0,9872
------- ■ NTCF Y = 0,0009x
2
– 0,0944x + 5,1867 R
2
= 0,9758
- x TCF Y = 0,0005x
2
–
0,0469x + 3,5178 R
2
= 0,9842
88
No fim do período de armazenamento, nota-se uma elevação no teor de
aminoácidos em todos os tratamentos, cujos valores diferiram estatisticamente,
sendo o mais alto observado no embrião de sementes armazenadas em câmara
fria e não tratadas, seguidas pelo embrião de sementes tratadas e armazenadas
nas mesmas condições. Nesse último por sua vez, foi observado valor superior
ao do embrião de sementes tratadas e armazenadas à temperatura ambiente, que,
por outro lado, foi mais elevado do que o observado no embrião de sementes não
tratadas e armazenadas nas mesmas condições. Esse acúmulo de aminoácidos no
fim do período de armazenamento, provavelmente, ocorreu em função da
redução na peroxidação de lipídios (Figura 23) e das reações de Amadori e
Maillard, esta última, sugerida devido à manutenção no teor de açúcares
redutores (Figura 11).
Os valores e as alterações nos níveis de aminoácidos no endosperma
(Figura 31) seguiram os mesmos padrões do observado no embrião das
sementes, no qual foi observado pequeno decréscimo no seu teor nos primeiros
60 dias de armazenamento e posterior acúmulo até o fim desse período. O não-
acúmulo de aminoácidos nos períodos iniciais de armazenamento, no
endosperma, parece estar mais relacionado à alta peroxidação de lipídios,
verificada nesse período (Figura 23), do que à destruição desses pelas reações de
Amadori e Maillard. Visto que, ao se compararem os dois resultados, Figura 12
e 31 esses não apresentam associação. Já o aumento no teor de aminoácidos no
fim do período de armazenamento das sementes, provavelmente, ocorreu devido
à queda da peroxidação de lipídios, observada neste período (Figura 23),
associado à continuidade da degradação de proteínas no endosperma (Figura
25).
89
0
2
4
6
8
10
12
060120180
Período de armazenamento (dias)
Aminoácidos (mg/g)
FIGURA 31 Estimativa do teor de aminoácidos em endosperma de sementes de
seringueira em função do período de armazenamento (0, 60, 105 e 165 dias). As
barras exibem o erro padrão da média. UFLA, Lavras, MG, 2006.
4.4 Avaliações moleculares
Nos perfis isoenzimáticos de embrião de sementes de seringueira,
verificou-se, para a álcool desidrogenase (ADH), uma diminuição da intensidade
das bandas com o aumento do período de armazenamento das sementes (Figura
32 a e b), independentemente, se armazenadas à temperatura ambiente ou em
câmara fria. Vale ressaltar, no entanto, que no embrião de sementes
acondicionadas em câmara fria, a intensidade e o número de bandas foram
maiores do que naquelas à temperatura ambiente.
Esses resultados estão de acordo com os observados por Brandão Junior
(1996), o qual verificou redução na intensidade de banda, da ADH, com o
aumento do tempo de envelhecimento de sementes de milho. Throneberry &
Y
= 0,0005x
2
–
0,0572x + 4,2177 R
2
= 0,9685
90
Smith (1955) também observaram correlação positiva entre a viabilidade de
sementes de milho e a atividade da álcool desidrogenase.
A álcool desidrogenase é uma enzima que atua no metabolismo
anaeróbico de plantas, reduzindo o acetaldeído a etanol. Em estudos de efeitos
de voláteis endógenos no processo de deterioração de sementes Zhang et al.
(1994) verificaram maior efeito danoso do acetaldeído nas sementes,
independentemente da umidade relativa e da temperatura do ambiente de
armazenamento, quando comparado ao etanol. De acordo com os autores, esse
último só causou deterioração das sementes em condição de umidade relativa
alta. Assim, no presente trabalho, pode ser que a diminuição da atividade da
álcool desidrogenase com o avanço do período de armazenamento tenha
tornado a semente mais susceptível à ação deletéria do acetaldeído, reduzindo
com isso a sua viabilidade.
Quando se compara tratamento fungicida, verifica-se maior intensidade
e número de bandas em embrião de sementes tratadas em relação às não tratadas
(Figuras 32 a e b). O mesmo é verificado quando se compara a temperatura de
armazenamento, no qual embrião de sementes submetidas à baixa temperatura
apresentou maior atividade da ADH quando comparado ao de sementes
armazenadas à temperatura ambiente. De acordo com Zhang et al. (1994), a
formação de etanol tem influência sobre o processo deteriorativo de sementes
em condições de alta umidade relativa.
A maior atividade da ADH nos embriões de sementes de seringueira,
nessas condições de estresse (tratamento fungicida e baixa temperatura),
provavelmente, dá-se em decorrência do mal-funcionamento das mitocôndrias,
favorecendo uma maior conversão do piruvato, produzido por meio da glicólise,
em acetaldeído pela ação da enzima piruvato descarboxilase, e
consequentemente, maior produção de ADH para formar o etanol. Booth et al.
(1999) observaram degradação mitocondrial em células da radícula do embrião
91
de sementes de Eurotia lanata armazenadas a 5
o
C. De acordo com os autores, o
envelhecimento das sementes, nessa condição, favorece um acúmulo de ácidos
graxos livres nas membranas mitocôndrias, como resultado da ativação da
fosfolipase A
2
(Luzikov et al., 1985), induzindo o desacoplamento da
fosforilação oxidativa e, como conseqüência, reduzindo o nível de ATP
endógeno.
Para a enzima esterase (EST) (Figura 32 c e d), semelhantemente ao
observado para a enzima ADH, nota-se uma maior atividade em embriões de
sementes tratadas e armazenadas em câmara fria quando comparadas às não
tratadas e armazenadas à temperatura ambiente, demonstrando que os embriões
de sementes armazenadas na primeira situação apresentavam maior peroxidação
de lipídios, e conseqüentemente, estavam num processo deteriorativo mais
avançado do que o embrião de sementes não tratadas e armazenadas à
temperatura ambiente. Alterações nos padrões da enzima esterase, evidenciam a
ocorrência de eventos deteriorativos, que podem contribuir para a redução na
germinação das sementes, uma vez que, essa enzima está envolvida em reações
de hidrólise de ésteres, estando diretamente ligada ao metabolismo de lipídios
(Santos et al., 2004).
De maneira geral, verifica-se uma redução na atividade da EST no
embrião das sementes de seringueira com o avanço do período de
armazenamento, independentemente do tratamento fungicida e das condições de
armazenamento, exceção feita para o embrião de sementes não tratadas e
armazenadas à temperatura ambiente e câmara fria, cujas intensidades de bandas
de esterase (est
1
, est
2
e est
1
, respectivamente) aumentaram com o decorrer do
armazenamento. Esses resultados corroboram com os observados por Brandão
Junior (1996) e Carvalho et al. (2006), os quais verificaram redução na
intensidade de um grupo de bandas de esterase com o aumento do tempo de
envelhecimento artificial de sementes de milho e Copaifera langsdorffii,
92
respectivamente. Apesar das esterases serem um grupo de enzimas amplamente
associadas à deterioração de sementes por estarem envolvidas em reações de
hidrólise de ésteres de membrana (Ribeiro, 2000; Santos et al., 2005). Estas
enzimas podem também atuar na hidrólise de triacilglicerois presentes em
oleossomos, constituindo uma importante fonte de energia para a germinação de
sementes (Aung & McDonald,1995).
Avaliando a atividade de esterases durante a deterioração de sementes
de amendoim Aung & McDonald (1995) observaram decréscimo na sua
atividade total com o aumento da deterioração, tanto em sementes embebidas
como não embebidas. No entanto, com base nos perfis de bandas, observaram-se
que essas mudanças não foram uniformes entre todas as espécies de isoesterases.
Sete isoenzimas aumentaram e quatro diminuíram durante a embebição. Os
autores concluíram que isoesterases específicas são sucetíveis à deterioração
durante o envelhecimento de sementes de amendoim e que outras isoesterases
associadas à germinação são preferencialmente sintetizadas durante a
embebição.
Além disso, Vieira (1996) relata que apesar de a esterase ser uma enzima
envolvida em reações de hidrólise de ésteres e desempenhar papel essencial no
metabolismo de lipídios, ponto importante no processo deteriorativo de
sementes, a variação no seu perfil eletroforético parece estar mais relacionado à
associação de microrganismos do que o processo deteriorativo em si. Essa
talvez, tenha sido a causa da redução da atividade dessa enzima em embrião de
sementes tratadas, com o avanço do armazenamento, uma vez que tal
procedimento tem por finalidade minimizar a proliferação de microrganismos.
Já em sementes armazenadas à temperatura ambiente e sem tratamento
fungicida, foi observada a presença de maior quantidade de microrganismos com
o decorrer do armazenamento, o que pode justificar o aumento da atividade da
esterase.
93
FIGURA 32 Padrões isoenzimáticos de álcool desidrogenase (ADH) e esterase
(EST) de sementes de seringueira em função do tratamento fungicida (tratadas
(T) e não tratadas com fungicidas (NT)) e do período de armazenamento (0, 60,
105, 165 e 210 dias) sob duas condições (temperatura ambiente ± 20
o
C (A) e
câmara fria 10
o
C (CF)). As setas evidenciam o número e/ou a intensidade de
bandas. UFLA, Lavras, MG, 2006.
0 60
105 165
210
60 105 165
TA TA TCF
0 60
105 165
210
60 105 165
NTA NTA NTCF
0 60
105 165 210
60 105 165
TA TA TCF
0 60
105 165
210
60 105 165
NTA NTA NTCF
ADH
a
b
ADH
est
1
est
2
EST
c
EST
est
1
est
2
d
94
Para a glutamato-oxalacetato transaminase (GOT) (Figura 33 a e b),
verifica-se uma menor intensidade e número de bandas no embrião de sementes
tratadas com fungicidas, quando comparado às não tratadas, independentemente,
se armazenadas em câmara fria ou à temperatura ambiente. Esses resultados
diferem dos observados por Silva et al. (2000) que, avaliando as alterações dos
padrões de isoenzimas em sementes de milho infectadas por fungos, verificaram
uma redução na atividade da GOT quando essas sementes não foram tratadas
com fungicidas em comparação às tratadas. Vale ressaltar que essa diferença na
atividade da GOT encontrada por Silva et al. (2000) só foi notada na segunda
época de avaliação (30 dias de incubação das sementes a 25
o
C e 95% de
umidade relativa), época de maior incidência dos fungos Fusarium moniliforme
e Penicillium spp e não na primeira (15 dias de incubação das sementes a 25
o
C e
95% de umidade relativa).
Em embrião de sementes não tratadas e armazenadas à temperatura
ambiente, nota-se um aumento da atividade e do número de bandas da GOT nos
105 dias iniciais de armazenamento, com posterior queda na atividade da enzima
e no número de bandas após esse período. Provavelmente, a redução da
atividade e a diminuição do número de bandas da GOT, ocorreram em função do
aumento da incidência de microrganismos com o avanço do período de
armazenamento das sementes nessas condições. Silva et al. (2000) relataram
redução na intensidade de bandas da GOT em sementes de milho infectadas com
Aspergillus flavus, Fusarium moniliforme e Penicillium spp.
95
FIGURA 33 Padrões isoenzimáticos de glutamato oxalacetato transaminase
(GOT) e superóxido dismutase (SOD) de sementes de seringueira em função do
tratamento fungicida (tratadas (T) e não tratadas com fungicidas (NT)) e do
período de armazenamento (0, 60, 105, 165 e 210 dias) sob duas condições
(temperatura ambiente ± 20
o
C (A) e câmara fria 10
o
C (CF)). As setas
evidenciam o número e/ou a intensidade de bandas. UFLA, Lavras, MG, 2006.
GOT
G
GOT
SOD
SOD
0 60
105 165 210
60 105 165
TA TA
TCF
0 60
105 165
210
60 105 165
NTA
NTA NTCF
0 60
105 165 210
60 105 165
TA TA TCF
0 60
105 165
210
60 105 165
NTA NTA NTCF
a
b
c
d
96
Por outro lado, embrião de sementes armazenadas em câmara fria,
independentemente do tratamento fungicida, apresentou aumento da atividade e
do número de bandas da GOT com o avanço do período de armazenamento das
sementes. Esse resultado está de acordo com os obtidos por Chauhan et al.
(1985), que observaram em sementes de soja e cevada um incremento do
número de bandas da GOT com o declínio de viabilidade das sementes no
envelhecimento artificial. De acordo com Conn & Stumpf (1980), a GOT é uma
enzima que tem um importante papel no processo de degradação e síntese de
proteínas. Portanto, apresenta fundamental importância na germinação de
sementes. Assim, é provável que os aumentos do número e intensidade de
bandas estejam relacionados ao aumento da atividade metabólica das sementes,
nessas condições.
Para a enzima superóxido dismutase (SOD) (Figuras 33 c e d), verifica-
se um incremento da intensidade de bandas, no embrião, com o aumento do
período de armazenamento das sementes, independentemente do tratamento
fungicida e do ambiente de armazenamento aos quais foram submetidas,
exceção feita para o embrião de sementes tratadas e armazenadas à temperatura
ambiente, no qual houve redução da intensidade de bandas com o avanço do
período de armazenamento das sementes. Quando se compara esses padrões em
embrião de sementes armazenadas em câmara fria com os observados em
sementes armazenadas à temperatura ambiente nota-se um incremento da
intensidade e do número de bandas da primeira em relação à segunda condição
de armazenamento. Vale ressaltar que a baixa temperatura foi a pior condição de
armazenamento para a manutenção da viabilidade e do vigor de sementes de
seringueira (avaliações fisiológicas – Figuras 2, 3, 4 e 6).
Pukacka & Ratajczak (2005), avaliando a produção de superóxido, de
peróxido de hidrogênio e de enzimas scavenging em sementes de Fagus
sylvatica, sob diferentes temperaturas e umidades relativas de armazenamento
97
verificaram um aumento na produção de radical superóxido e de peróxido de
hidrogênio com o envelhecimento das sementes, independentemente da
temperatura e da umidade relativa de armazenamento. De acordo com os
autores, esse aumento de superóxido e de peróxido de hidrogênio foi seguido
pelo aumento das enzimas SOD e CAT, entretanto, não nas mesmas proporções.
Dessa maneira, os autores concluíram que a baixa germinabilidade durante o
armazenamento das sementes de Fagus sylvatica foi devido ao alto estresse
oxidativo associado a um ineficiente sistema scavengers de radicais livres.
No presente trabalho é possível que tenha ocorrido algo semelhante, ou
seja, embora tenha sido notado um aumento da atividade e do número de bandas
da SOD no embrião com o decorrer do armazenamento das sementes, esse
incremento pode não ter seguido as mesmas proporções do aumento de
superóxido.
A catalase (CAT), enzima envolvida na remoção de peróxido de
hidrogênio apresentou um ligeiro incremento em sua atividade até os 165 dias de
armazenamento, quando as sementes foram acondicionadas à temperatura
ambiente, independentemente se tratadas com fungicidas ou não (Figura 34 a e
b). Após esse período, nota-se uma redução em sua atividade. Bailly et al.
(1996) e Jeng & Sung (1994) também verificaram redução da atividade da
catalase com o envelhecimento de sementes de girassol e amendoim,
respectivamente.
Quando as sementes foram armazenadas em câmara fria, a atividade da
catalase manteve-se inalterada com o avanço do processo deteriotarivo das
sementes, independentemente do tratamento fungicida. Vale ressaltar que a
atividade dessa isoenzima foi menor em embriões de sementes armazenadas em
câmara fria quando comparada às armazenadas a temperatura ambiente.
98
FIGURA 34 Padrões isoenzimáticos de catalase (CAT) e peroxidase (POX) de
sementes de seringueira em função do tratamento fungicida (tratadas (T) e não
tratadas com fungicidas (NT)) e do período de armazenamento (0, 60, 105, 165 e
210 dias) sob duas condições (temperatura ambiente ± 20
o
C (A) e câmara fria
10
o
C (CF)). As setas evidenciam a ausência de bandas. UFLA, Lavras, MG,
2006.
CAT
POX
POX
CAT
0 60
105
165
210
60
105
165
TA T
A
TCF
0 60
105 165
210
60 105 165
NTA
NTA NTCF
0 60
105 165
210
60 105 165
TA TA
TCF
0 60
105 165
210
60 105 165
NTA NTA NTCF
a
b
c
d
99
A catalase pode desempenhar um controle de peróxidos endógenos,
através de um ciclo de óxido-redução, envolvendo glutatione e ascorbato.
Assim, uma ineficiência em sua atividade pode resultar numa diminuição da
prevenção de danos oxidativos. A presença do tóxico H
2
O
2
favorece a geração
de um radical muito mais reativo, o OH
-
(Pukacka & Ratajczak, 2005). Esse
radical ataca praticamente todas as macromoléculas, causando a degradação dos
componentes celulares, conduzindo à sua morte (Scandalios, 1993).
Os padrões isoenzimáticos da peroxidase (POX), no embrião (Figura 34
c e d), diminuíram em número e intensidade de bandas, com o avanço do
período de armazenamento das sementes quando acondicionadas à temperatura
ambiente, independentemente do tratamento fungicida. Merece destaque o
embrião de sementes armazenadas à temperatura ambiente e tratadas com
fungicidas nas quais praticamente não se observou atividade da POX a partir de
165 dias de armazenamento. Esses resultados corroboram com os obtidos por
Carvalho et al. (2006), Kalpana & Rao (1994), Sung & Chiu (1995), Sung
(1996) os quais observaram redução na atividade da peroxidase com o
envelhecimento das sementes. Os autores associaram a queda da atividade da
peroxidase ao aumento da peroxidação de lipídios. A peroxidase é uma enzima
responsável pela remoção de peróxido e a perda da sua atividade pode tornar as
sementes mais susceptíveis aos efeitos deletérios do O
2
e de radicais livres sobre
ácidos graxos insaturados de membrana, o que provoca a sua degeneração.
Quando se analisa embrião de sementes armazenadas em câmara fria,
nota-se uma maior intensidade de bandas para a POX comparado ao embrião de
sementes armazenadas à temperatura ambiente. Entretanto, semelhantemente ao
observado para embrião de sementes armazenadas à temperatura ambiente,
verifica-se uma redução da intensidade e do número de bandas com o avanço do
período de armazenamento das sementes (a partir de 105 dias). Redução na
atividade da POX também foi observada por Brandão Junior (1996), em
100
sementes de milho e por Jeng & Sung (1994) em sementes de amendoim, ambas
envelhecidas. Vale ressaltar que a condição de baixa temperatura foi prejudicial
à manutenção da viabilidade e do vigor das sementes de seringueira (avaliações
fisiológicas – Figuras 2, 3, 4 e 6). Provavelmente, essa condição de estresse
induziu a um aumento da atividade da POX, no entanto, esse incremento pode
ter sido menor do que o de radicais livres, tornando o mecanismo de eliminação
de peróxido de hidrogênio ineficaz, como sugerido por Pukacka & Ratajczak
(2005), em trabalho com sementes de Fagus sylvatica.
101
5 CONCLUSÕES
5.1 Avaliações fisiológicas
O tratamento fungicida causou fitotoxidez às sementes de seringueira,
contribuindo para a redução do seu vigor e da sua viabilidade;
A baixa temperatura no armazenamento, 10
o
C, contribuiu para a perda
do vigor e da viabilidade das sementes de seringueira;
A associação do tratamento fungicida com a baixa temperatura de
armazenamento teve efeito mais prejudicial sobre o vigor e a viabilidade das
sementes de seringueira do que quando comparado à utilização desses fatores
isoladamente;
As melhores condições para a conservação de sementes de seringueira
foi à temperatura ambiente ± 20
o
C, ausente de tratamento fungicida.
5.2 Avaliações bioquímicas e ultra-estruturais
Ocorreu redução na concentração de amido tanto no embrião quanto no
endosperma das sementes no decorrer do período de armazenamento;
Ocorreu redução nos teores de açúcares solúveis e redutores nos
embriões de sementes armazenadas tanto em câmara fria quanto em temperatura
ambiente;
Ocorreu biossíntese de lipídios no embrião das sementes de seringueira
no decorrer do armazenamento das sementes;
No endosperma das sementes de seringueira ocorreu degradação de
lipídios durante o avanço do armazenamento;
Ocorreu divisão celular no eixo embrionário das sementes de seringueira
até os 105 dias de armazenamento;
102
Ocorreu peroxidação de lipídios nos primeiros meses de armazenamento
das sementes de seringueira, principalmente quando acondicionadas à baixa
temperatura;
Os teores de proteínas solúveis decresceram com o armazenamento das
sementes tanto no embrião quanto no endosperma;
Os níveis de aminoácidos do embrião e do endosperma das sementes de
seringueira aumentaram, sobremaneira, a partir de 105 dias de armazenamento;
Sementes armazenadas à baixa temperatura apresentaram, no final do
período de armazenamento, maiores teores de aminoácidos no embrião.
5.3 Avaliações moleculares
Variações eletroforéticas de isoenzimas estão associadas ao processo
deteriorativo de sementes de seringueira;
As enzimas álcool desidrogenase, esterase, glutamato-oxalacetato
trasaminase, superóxido dismutase, catalase e peroxidase revelaram-se como
importantes ferramentas para a elucidação dos processos deteriorativos de
sementes de seringueira.
103
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120
ANEXOS
TABELA 1A Resumo das avaliações fisiológicas - teste de emergência de
plântulas (EP), índice de velocidade de emergência de plântulas (IVEP) e
primeira contagem (PC). UFLA, Lavras, MG, 2006. ...................................... 121
TABELA 2A Resumo das avaliações fisiológicas – teste de condutividade
elétrica (C.E.). UFLA, Lavras, MG, 2006. ...................................................... 122
TABELA 3A Resumo das avaliações bioquímicas – peroxidação de lipídios.
UFLA, Lavras, MG, 2006................................................................................ 122
TABELA 4A Resumo das avaliações bioquímicas – amido, açúcares solúveis
totais (AST), açúcares redutores (AR), lipídios, proteínas e aminoácidos em
embrião de sementes de seringueira. UFLA, Lavras, MG, 2006..................... 123
TABELA 5A Resumo das avaliações bioquímicas – amido, açúcares solúveis
totais (AST), açúcares redutores (AR), lipídios, proteínas e aminoácidos em
endosperma de sementes de seringueira. UFLA, Lavras, MG, 2006............... 124
121
ANEXOS
TABELA 1A Resumo das avaliações fisiológicas - teste de emergência de
plântulas (EP), índice de velocidade de emergência de plântulas (IVEP) e
primeira contagem (PC). UFLA, Lavras, MG, 2006.
FV Quadrados médios
GL
EP IVEP PC
T.F. 1 9800,0000** 16,1241** 3507,0313**
A.A.
1 36992,0000** 59,8555** 10260,2813**
P.A 7 6785,6429** 3,1972** 690,3884**
T.F. x A.A 1 28,1250
ns
0,0382
ns
3,7813
ns
T.F. x P.A. 7 145,6250** 0,4051** 193,4598**
A.A. x P.A. 7 1070,8036** 2,3127** 267,2098**
T.F. x A.A. x
P.A.
7 234,3214** 0,4092** 72,9955**
Erro
96 18,3645 0,1248 7,4063
CV - 9,31 21,35 15,03
* e ** Significativo pelo Teste F a 5 e 1% de probabilidade, respectivamente
ns não significativo pelo Teste F a 5% de probabilidade.
122
TABELA 2A Resumo das avaliações fisiológicas – teste de condutividade
elétrica (C.E.). UFLA, Lavras, MG, 2006.
Quadrados médios
FV GL
C.E.
T.F.
1 20,6143**
A.A.
1 34,3103**
P.A
6 14,2264**
T.F. x A.A
1 0,9417*
T.F. x P.A.
6 2,6917**
A.A. x P.A.
6 5,0226**
T.F. x A.A. x P.A.
6 0,3089
ns
Erro
84 0,1680
CV
19,56
TABELA 3A Resumo das avaliações bioquímicas – peroxidação de lipídios.
UFLA, Lavras, MG, 2006.
Quadrado médio
FV GL
Pex. Lip.
T.F.
1 1,0513
ns
A.A.
1 7,5661**
P.A
3 6,7072**
T.F. x A.A
1 0,2701
ns
T.F. x P.A.
3 3,3412**
A.A. x P.A.
3 1,3863 *
T.F. x A.A. x P.A. 3 2,2004
**
Erro
16 0,3435
CV
8,05
TABELA 4A Resumo das avaliações bioquímicas – amido, açúcares solúveis totais (AST), açúcares redutores (AR),
lipídios, proteínas e aminoácidos em embrião de sementes de seringueira. UFLA, Lavras, MG, 2006.
QUADRADOS MÉDIOS
FV GL
Amido AST AR Lipídios Proteínas Aminoácidos
T.F.
1 134,5360
ns
1751,6230** 43,2440* 4,4105
ns
392,3349**
6,3511**
A.A.
1 263,5781
ns
184,9566
ns
72,7669** 22,3178* 53,2355
ns
25,9896**
P.A
3 2418,3435** 5056,0169** 844,2201** 124,5747** 6838,3617**
101,7162**
T.F. x A.A
1 326,5633
ns
435,1046
ns
65,7540** 13,2195
ns
43,3010
ns
4,6004**
T.F. x P.A.
3 152,9927
ns
673,0784* 33,3241* 16,7648* 79,9429**
1,2645
ns
A.A. x P.A.
3 323,5270* 477,9015
ns
9,1427
ns
8,2610
ns
559,8797**
16,1215
**
T.F. x A.A. x P.A.
3 171,4621
ns
77,6753
ns
11,0796
ns
7,5291
ns
49,2659*
6,1888**
Erro
32 85,8702 176,3880 9,0763 5,3112 16,8480
0,5830
CV
- 14,84 9,01 10,40
5,50 4,77 15,02
TABELA 5A Resumo das avaliações bioquímicas – amido, açúcares solúveis totais (AST), açúcares redutores (AR),
lipídios, proteínas e aminoácidos em endosperma de sementes de seringueira. UFLA, Lavras, MG, 2006.
QUADRADOS MÉDIOS
FV GL
Amido AST AR Lipídios Proteínas Aminoácidos
T.F. 1 203,2399
ns
111,9047
ns
231,4408** 1,1563
ns
74,6255
ns
1,6539
ns
A.A.
1 133,7002
ns
1742,3095** 0,4219
ns
0,1355
ns
11,1844
ns
2,5808
ns
P.A 3 2801,0438** 555,1551** 728,8243** 146,3605** 10128,9662** 115,7208**
T.F. x A.A 1 504,0792
ns
0,3728
ns
101,4427** 1,5230
ns
23,6462
ns
0,3870
ns
T.F. x P.A. 3 50,2731
ns
414,0032* 62,7811** 16,3230** 80,5313
ns
1,4739
ns
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