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UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Adriana Corrêa Pereira Oliveira
Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia
Bioanalítica Para Quantificação de Zolpidem em
Plasma Humano Utilizando a Técnica de
Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria
de Massas (LC-MS/MS)
BRAGANÇA PAULISTA
2010
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Ficha catalográfica elaborada pelas bibliotecárias do Setor de
Processamento Técnico da Universidade São Francisco.
QV 38 Oliveira, Adriana Corrêa Pereira.
O45d Desenvolvimento e validação de uma metodologia
bioanalítica para quantificação de Zolpidem em plasma
humano utilizando a técnica de Cromatografia Líquida
acoplada a Espectrometria de Massas (LC-
MS/MS) /
Adriana Corrêa Pereira Oliveira. -- Bragança Paulista, 2010.
51 p.
Dissertação (mestrado) – Programa de Pós-Graduação
Stricto Sensu em Ciências da Saúde da Universidade São
Francisco.
Orientação de: Eduardo César Meurer.
1. Zolpidem. 2. Espectrometria de massas - Metodologia.
3. Bioanalítica. I. Meurer, Eduardo César. II. Título.
iv
ADRIANA CORRÊA PEREIRA OLIVEIRA
Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia
Bioanalítica Para Quantificação de Zolpidem em
Plasma Humano Utilizando a Técnica de
Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de
Massas (LC-MS/MS)
BRAGANÇA PAULISTA
2010
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ADRIANA CORRÊA PEREIRA OLIVEIRA
Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia
Bioanalítica Para Quantificação de Zolpidem em
Plasma Humano Utilizando a Técnica de
Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de
Massas (LC-MS/MS)
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, da Universidade São Francisco, como
parte dos requisitos para a obtenção do título
de Mestre em Ciências da Saúde. Área de
Concentração: Farmacologia Clinica e Geral.
Orientador: Eduardo César Meurer
BRAGANÇA PAULISTA
2010
vi
ADRIANA CORRÊA PEREIRA OLIVEIRA
Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia
Bioanalítica Para Quantificação de Zolpidem em
Plasma Humano Utilizando a Técnica de
Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de
Massas (LC-MS/MS)
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, da Universidade São Francisco, como
parte dos requisitos para a obtenção do título
de Mestre em Ciências da Saúde. Área de
Concentração: Farmacologia Clinica e Geral.
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________
Eduardo César Meurer
_______________________________________________________
Silvana Calafatti
_______________________________________________________
Luiz Alberto Moraes
vii
DEDICATÓRIA
Dedico com todo carinho, este trabalho a minha
mãe Ana Maria que muito me ajudou e também pelo
amor, educação e pelo exemplo de vida que me deu
Ao meu esposo Silvio que muito me
compreendeu, muito me apoiou, muito me incentivou e
principalmente pelo seu companheirismo
A minha filha Ana Carolina, pelo amor, afeto e
carinho, gestos que foram essenciais para a realização
deste trabalho
As minhas irmãs Débora e Eliege, meus cunhados
Eduardo e Nailson e principalmente meus sobrinhos
Matheus e Gabriel, que me apoiaram e me ajudaram
muito.
viii
AGRADECIMENTO
Desejo manifestar o meu agradecimento, de
uma forma muito especial, à Deus pela sua presença
em todos os momentos da minha vida, inclusive em
todo decorrer deste trabalho.
Ao Professor Doutor Eduardo Cesar Meurer pela
orientação científica desta tese, pelos ensinamentos,
que muito contribuíram para a minha formação
científica, pelo apoio concedido durante a realização
deste trabalho e pelas valiosas sugestões, e
principalmente pela amizade e incentivo.
Ao Professor Doutor Fabio Alessandro Proença
Barros, por toda a disponibilidade e apoio concedido,
pela amizade e incentivo.
Aos meus colegas e amigos dos laboratórios
Core Pesquisas Clinicas e Unifag, que de uma forma
ou outra, deram suas contribuições.
A minha amiga Daiane pela imensa contribuição
e amizade.
ix
EPÍGRAFE
"Quando morremos, nada pode ser levado
conosco, com a exceção das sementes lançadas por
nosso trabalho e do nosso conhecimento." [Dalai Lama]
x
RESUMO
Uma metodologia bioanalítica, sensível e seletiva, foi desenvolvida e validada
através de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS)
para quantificação de Zolpidem em plasma humano. A preparação da amostra
consistiu na adição de Diazepam como padrão interno (PI), extração líquido-líquido em
condições ácidas usando uma mistura de hexano/acetato de etila (1:1; v/v) como
solvente extrator; seguida de centrifugação, secagem e ressuspensão da amostra em
acetonitrila. Ambos, Zolpidem e seu respectivo padrão interno (PI), foram analisados
utilizando uma coluna C18 e uma fase móvel composta de acetonitrila
(MeCN):hidróxido de amônio 0,1 M e ácido fórmico 88% (60:40:0,1; v/v/v). Os
compostos eluídos foram monitorados utilizando espectrometria de massas via
electrospray em modo positivo (ESI
+
). As análises foram realizadas por monitoramento
de reações múltiplas (MRM) empregando a combinação da molécula e seu fragmento
iônico de m/z 308,32 > 235,32 (Zolpidem) e m/z 285,11 > 154,04 (Diazepam) com uma
breve corrida cromatográfica de 2,0 minutos. A razão de área do pico (resposta) do
analito e do padrão interno foram utilizadas para quantificação do Zolpidem. O limite de
quantificação (LQ) alcançado foi de 10 ng/mL; um intervalo linear dinâmico
demonstrado pela análise de 1,0-500,0 ng/mL com o coeficiente de determinação (r
2
)
mínimo de 0,98. Os resultados validados em seletividade, linearidade, exatidão,
precisão e estabilidade em plasma, demonstraram a aplicabilidade desta metodologia
analítica para estudos farmacocinéticos de acordo com as diretrizes do FDA e ANVISA.
Palavras-Chave: Zolpidem – Espectrometria de Massas – Metodologia Bioanalítica.
xi
ABSTRACT
A sensitive and selective liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-
MS/MS) method for Zolpidem quantification in human plasma is presented. Sample
preparation consisted of addition of Diazepam as internal standard (IS), liquid-liquid
extraction in acidic conditions using a mixture of hexane/ethyl acetate (1:1;V/V) as
extracting solvent, followed by centrifugation, solvent evaporation and sample
reconstitution in acetonitrile. Both Zolpidem and IS were analyzed using a C18 column
and a mobile-phase composed of acetonitrile: ammonium hidroxide 0,1M and formic
acid 88% (60:40:0,1;v/v/v). Eluted compounds were monitored using positive mode
electrospray (ES) tandem mass spectrometry. Analyses were carried out by selected
reaction monitoring (SRM) using the sodiated molecule to ionic fragment combinations
of m/z 308,32 > 235,32 (Zolpidem) and m/z 285,11 > 154,07 (Diazepam) with short
chromatographic run time of 2.0 min. The peak areas ratio (response) of the analyte
and IS were used for quantification of Zolpidem. The achieved limit of quantification
(LOQ) was 1,0 ng/mL; assay exhibited a linear dynamic range of 1.0-500.0 ng/mL with
a determination coefficient (r
2
) of at least 0.98. Validation results on selectivity, linearity,
accuracy, precision and stability in plasma, demonstrated the applicability of this
analytical method to pharmacokinetic studies accordly to FDA guidelines.
Key words: Zolpidem - mass spectrometry – bioanalytical method
xii
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Pontos da curva de calibração
26
Tabela 2 – Controles de Qualidade
26
Tabela
3
–
Equações da curva decalibração das três Linearidades
38
xiii
Lista de Figuras
Figura 1 – Estrutura do Zolpidem.
03
Figura 2 –
Modelo de funcionamento do complexo macromolecular do
receptor BDZ/GABA
A.
04
Figura 3 – Ilustração do processo de migração diferencial de
seus
componentes entre a fase móvel e a fase estacionária.
08
Figura 4
-
Ilustração da separação analítica de três componentes de
uma mistura.
08
Figura 5 – Representação esquemática de um sistema de
cromatografia líquida.
09
Figura 6 –
Foto de um sistema de cromatografia líquida
09
Figura 7 –
Foto de um espectrômetro de massas
11
Figura
8
-
Descrição básica do espectrômetro de massas
12
Figura
9
-
Utilização da espectrometria de massas em diferentes áreas
do conhecimento. Todos os dados foram obtidos de pesquisa realizada
em www.isiknowledge.com, no período de 1993 a 2004, considerando
as 500 primeiras citações de cada ano. No gráfico aparecem
apenas
áreas que atingiram mais de 1%.
13
Figura
10
-
Número total de artigos publicados envolvendo as técnicas
de ionização mais utilizadas. Baseado nos dados obtidos de pesquisa
realizada em www.isiknowledge.com, no período de 1993 a 2004.
13
Figura
1
1
-
Ilustração da fonte de electrospray
(14)
.
14
xiv
Figura
1
2
-
Ilustração do analisador quadrupolar.
15
Figura 13
-
Demonstração da aplicação dos potencias.
16
Figura 14
-
Ilustração dos eixos nos quais sofrem influência dos
potenciais aplicados.
16
Figura 15 - Ilustração da trajetória dos íons.
17
Figura 16
-
Esquema do separador quadrupolo.
17
Figura 17
-
Demonstração do espectrômetro de massas triplo
quadrupolar
18
Figura 18
-
(a) Representação dos símbolos utilizados em um
experimento b) MS
2
e c) MS
3
.
18
Figura 19
-
Espectro de massas do Zolpidem.
28
Figura 20
-
Ilustração dos parâmetros otimizados no modo positivo
(ESI+).
28
Figura
21
-
Espectro de MS/MS do Zolpidem
29
Figura 22
-
Fragmentação proposta para o Zolpidem
30
Figura 23
-
Estrutura do Diazepam
31
Figura 24 - A) Plasma branco normal lote 10427/4, cromatograma
referente ao zolpidem. B) plasma branco normal lote 10427/4,
cromatograma referente ao padrão interno.
33
Figura 25 - A) Plasma branco lipêmico lote 55295/1, cromatograma
referente ao zolpidem. B) Plasma branco lipêmico lote 55295/1,
34
xv
cromatograma referente ao padrão interno.
Figura 26
-
A)
Plasma branco hemolisado lote 17591/11, cromatograma
referente ao zolpidem. B) Plasma branco hemolisado lote 17591/11,
cromatograma referente ao padrão interno.
34
Figura 27
-
Solução aquosa de Zolpidem na concentração de 1,0 ng/ml
(concentração do limite de quantificação).
35
Figura 28 - Solução aquosa de Diazepam na concentração de 250,0
ng/ml (concentração final de padrão interno na amostra extraída)
35
Figura 29 - Resultados da média das linearidades.
37
Figura 30 - Resultados das análises intra-lote plasma normal.
38
Figura 31 - Resultados das análises intra-lote plasma lipêmico.
38
Figura 32
-
Resultados das análises intra-lote plasma hemolisado.
39
Figura
33 -
Resultados das análises inter-lote.
39
Figura
34 -
Resultados das análises intra-lote.
40
Figura
35 -
Resultados das análises inter-lote.
40
Figura
36 -
Resultados da recuperação.
41
Figura
37 -
Resultados da estabilidade em tempo e condições de
análise entre o tempo 0 h e 10 h.
42
Figura
38-
Resultados da estabilidade entre os ciclos de degelo.
43
xvi
Figura
39-
Resultados da estabilidade das amostras não processadas.
43
Figura
40-
Resultados da estabilidade das soluções padrão
para Zolpidem e Diazepam.
44
Figura
41-
Resultados da estabilidade de longa duração.
45
xvii
ABREVIATURAS
Anvisa
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BDZs
Benzodiazepíncos
CL
-
EM
-
EM
Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de Massas
Seqüencial
CQ
Controle de Qualidade
CQB
Controle de Qualidade Baixo
CQM
Controle de Qualidade Médio
CQA
Controle de Qualidade Alto
C
máx
Concentração plasmática máxima
ESI
Electrospray
FDA
Food and Drug Administration
FE
Fase Estacionária
FM
Fase Móvel
GABA Ácido Gama-aminobutírico
GABA-A
Receptor-benzodiazepínico-ácido gamaaminobutírico do tipo A
HUSF
Hospital Universitário São Francisco
LOD
Limite de Detecção
LOQ
Limite de Quantificação
MRM Monitoramento de Reação Múltipla.
SPE
Extração líquida em fase sólida
TGI
Trato Gastrointestinal
xviii
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO............................................................................................................1
1.1 Medicamentos Genéricos..........................................................................1
1.1.1 Histórico....................................................................................................1
1.1.2 Definições.................................................................................................2
1.2 Zolpidem......................................................................................................3
1.3 Fatores que Afetam a Biodisponibilidade de medicamentos................6
1.4 Técnica Bioanalitica...................................................................................7
1.4.1 Cromatografia Líquida (LC).....................................................................7
1.4.1.1 Modos de separação.............................................................................9
1.4.1.1.1 Cromatografia no modo normal......................................................10
1.4.1.1.1.2 Cromatografia no modo reverso..................................................10
1.4.2 Espectrometria de massas (MS)...........................................................11
1.4.2.1 Fonte de íons – Electrospray (ESI)....................................................12
1.4.2.2 Analisador Quadrupolar.....................................................................15
1.4.2.2.1 Simbologia dos Experimentos de Espectrometria de Massas
Seqüencial..................................................................................................................18
1.4.3 Acoplamento da Cromatografia Líquida à Espectrometria de Massas
(LC-MS/MS).................................................................................................................19
1.4.4 Tratamento de Amostras.......................................................................20
2. OBJETIVO...............................................................................................................22
3. REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................23
4. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................24
4.1 Método Bioanalítico..................................................................................24
4.1.1 Equipamentos e Materiais.....................................................................24
xix
4.1.2 Preparo das soluções............................................................................24
4.1.3 Fase Móvel..............................................................................................24
4.1.4 Preparo dos Padrões da Curava de Calibração e das Amostras
Controle de Qualidade...............................................................................................24
4.1.5 Parâmetros do Cromatógrafo Líquido..................................................26
4.1.6 Parâmetros do Espectrômetro de massas..........................................26
4.1.7 Preparo de Amostras.............................................................................26
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................................27
5.1 Desenvolvimento......................................................................................27
5.1.1 Iniciando o Desenvolvimento................................................................27
5.1.2 Iniciando a Obtenção do Espectro no Modo MS e Ionização.............27
5.1.3 Iniciando a Obtenção do Espectro no Modo MS/MS...........................29
5.1.4 Acoplamento da Cromatografia Líquida ao Espectrômetro de
Massas........................................................................................................................30
5.1.5 Padrão Interno........................................................................................30
5.1.6 Tratamento da amostra.........................................................................31
5.2 Validação do Método Bioanalitido..........................................................32
5.2.1 Validação Pré-estudo.............................................................................32
5.2.2 Seletividade.............................................................................................32
5.2.3 Determinação do Limite de Quantificação (LQ)..................................36
5.2.4 Linearidade.............................................................................................36
5.2.5 Precisão e Exatidão................................................................................37
5.2.5.1 Intra-Lote..............................................................................................37
5.2.5.2 Inter-Lotes............................................................................................39
5.2.6 Validação da Diluição.............................................................................40
xx
5.2.7 Recuperação...........................................................................................41
5.3 Estabilidades............................................................................................42
5.3.1 Estabilidade de curta duração..............................................................41
5.3.1.1 Estabilidade no tempo e condições da análise................................41
5.3.1.2 Estabilidade do fármaco em ciclos de congelamento e degelo.....42
5.3.1.3 Estabilidade das amostras de plasma não processadas................43
5.3.1.4 Estabilidade de solução padrão.........................................................44
5.3.1.5 Estabilidade de longa duração
................................................................44
6. CONCLUSÃO.......................................................................................................................46
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................47
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Medicamentos Genéricos
1.1.1 Histórico
A indústria de genéricos teve sua origem nos Estados Unidos na década de 60,
através de uma iniciativa do governo. Em 1984 os norte-americanos adotaram critérios
para o registro desse tipo de medicamento e, posteriormente esses critérios foram
adotados internacionalmente. A criação do genérico foi uma alternativa legal do
governo norte-americano para reduzir os custos dos tratamentos de saúde e aumentar
o acesso da população aos medicamentos. Os genéricos se mostraram desde o início,
mais baratos que os medicamentos de referência, isso é possível, pois os genéricos
são cópias dos medicamentos de referência que já possuem suas patentes expiradas,
assim tendo exonerados os gastos com a pesquisa e desenvolvimento dos mesmos.
(1)
Em 1999, três anos após o Brasil voltar a respeitar o direito de patentes (1996),
foi criado o programa de medicamentos genéricos com a publicação da Lei 9787. Com
o passar de 4 anos já se encontravam no país mais de 4 mil apresentações que
compreendiam as principais classes terapêuticas e cerca de 60% das prescrições
médicas.
(1)
A legislação brasileira de medicamentos genéricos foi criada com base nas
legislações dos Estados Unidos, FDA (Food and Drugs Administration) e do Canadá
(Health Canada), pois nesses países os medicamentos genéricos detêm uma parcela
significativa do mercado conquistando a confiabilidade da população e da classe
médica.
(1)
De acordo com a legislação brasileira, o medicamento genérico só pode chegar
ao consumidor após passar por testes de bioequivalência, que determina que o
genérico seja absorvido pelo paciente na mesma velocidade e concentração que o
medicamento referência, e pelo teste de equivalência farmacêutica, que garante que o
genérico terá composição idêntica do princípio ativo ao medicamento de referência.
Esses cuidados com o registro dos medicamentos genéricos, que vai de sua produção
até sua comercialização, é essencial para que o mesmo não perca sua principal
característica, a intercambialidade com o medicamento referência.
(1)
2
Na RDC 135 de 29 de maio de 2003, esta disposto que a intercambialidade
pode ser sugerida pelo profissional farmacêutico no ato da venda além de requisitos e
critérios técnicos para o registro do medicamento genérico.
(2)
1.1.2. Definições
Equivalência terapêutica – Quando dois medicamentos são considerados
terapeuticamente equivalentes se eles são farmaceuticamente equivalentes e, após
administração na mesma concentração, seus efeitos em relação à eficácia e segurança
são essencialmente os mesmos, o que se avalia por meio de estudos de
bioequivalência apropriados, ensaios farmacodinâmicos, ensaios clínicos ou estudos in
vitro.
(2)
Equivalentes farmacêuticos – são medicamentos que contém o mesmo princípio
ativo, na mesma quantidade, na mesma forma farmacêutica e podendo ou não conter
os mesmo excipientes. Eles também devem conter as mesmas especificações com
relação aos parâmetros de qualidade, ou relacionados à identidade, dosagem, pureza,
potência, uniformidade de conteúdo, tempo de desintegração e velocidade de
dissolução, quando for o caso, conforme legislação vigente.
(2)
Medicamentos bioequivalentes – São equivalentes farmacêuticos que ao serem
administrados a mesma concentração e com as mesmas condições experimentais, não
apresentam diferenças estatisticamente significativas com relação a
biodisponibilidade.
(2)
Medicamento inovador – Medicamento comercializado no mercado nacional, que
contém pelo menos um princípio ativo, sendo que este deve ter sido patenteado, pela
empresa responsável pelo desenvolvimento e introdução no mercado do país de
origem, mesmo que a patente já esteja extinta. O medicamento inovador normalmente
é o medicamento de referência, mas na ausência, a ANVISA (Agência Nacional de
Vigilância Sanitária) indicará o medicamento de referência.
(2)
Medicamento de referência – É o medicamento inovador registrado no órgão
federal responsável pela vigilância sanitária e comercializado no país, cuja eficácia,
3
segurança e qualidade foram comprovadas cientificamente junto ao órgão federal
competente, por ocasião do registro.
(3)
Medicamento genérico – É o medicamento similar a um produto de referência ou
inovador, que se pretende ser com este intercambiável, geralmente produzido após a
expiração ou renúncia da proteção patentária ou de outros direitos de exclusividade,
comprovada a sua eficácia, segurança e qualidade, e designado pela DCB ou pela
DCI.
(3)
1.2. Zolpidem
O Zolpidem é um novo agonista de receptores benzodiazepínicos. Ele é um
agente hipnótico-sedativo não-benzodiazepínico que se tornou disponível nos Estados
Unidos em 1993, somente cinco anos depois de estar disponível na Europa. Esse
medicamento se mostrou eficaz no tratamento de insônia no início do sono. O FDA
(Food and Drugs Administration) aprovou o uso para tratamentos por um período de 7-
10 dias.
(4)
Este medicamento é classificado (IUPAC) com uma imidazopiridina
(4)
, seu nome
é N,N,6-Trimethyl-2-(4-methylphenyl)imidazo(1,2-a)pyridine-3-acetamide.
A Figura 01 demonstra sua estrutura.
(5)
Figura 1 – Estrutura do Zolpidem.
4
O principal neurotransmissor do sistema nervoso central é o ácido gama amino
butírico (GABA). O receptor GABA é o complexo molecular receptor-benzodiazepínico-
ácido gama amino butírico do tipo A (GABA-A). Este receptor possui uma região
específica para a ligação dos benzodiazepínicos (BZDs) e uma outra para moléculas
como os barbitúricos e o álcool, conforme ilustrado na Figura 2. A ligação do GABA e
de seus agonistas ao receptor GABA-A produzem uma modificação estrutural com
abertura dos canais de cloro aumentando o influxo celular deste íon gerando uma
inibição sináptica rápida e hiperpolarização de membrana celular. Existem dois tipos de
sub-receptores que fazem parte do complexo GABA-A, o sub-receptor ômega tipo 1,
relacionado com efeitos hipnóticos e cognitivos e o subreceptor ômega tipo 2,
relacionado com cognição, psicomotricidade, efeitos ansiolíticos, limiar convulsivo,
depressão respiratória, relaxamento muscular e potencialização dos efeitos do etanol.
Agonistas seletivos GABA-A ômega 1 exercem um efeito hipnótico seletivo e efeitos
cognitivos negativos. Os benzodiazepínicos e barbitúricos ligam-se inespecificamente
nas subunidades ômega 1 e 2 do GABA-A.
(6)
Figura 2 – Modelo de funcionamento do complexo macromolecular do receptor
BDZ/GABA
A
.
Embora as ações do Zolpidem sejam devido aos efeitos agonistas sobre
receptores benzodiazepínicos, e em geral, assemelha-se aos benzodiazepínicos, este
fármaco apresenta efeitos anticonvulsivantes fracos em animais de laboratório. Sua
ação sedativa é relativamente forte e parece esconder os efeitos ansiolíticos quando
testados em animais de laboratório. Ao contrário dos benzodiazepínicos, o Zolpidem
5
exerce pouco efeito sobre os estágios do sono em seres humanos, mas o fármaco é
tão eficaz quanto os benzodiazepínicos na redução da latência do sono e no
prolongamento do sono total em pacientes que sofrem de insônia. Depois da
interrupção do tratamento com Zolpidem, os efeitos benéficos do sono devem ocorrer
por até uma semana, mas pode ocorrer efeito rebote na primeira noite. Foi observado
que o Zolpidem melhorou o sono em pacientes que sofriam de insônia crônica por até
seis meses de tratamento sem sinais de abstinência ou efeito rebote. Todavia,
atualmente o Zolpidem é aprovado apenas para tratamentos em curto prazo. Em doses
terapêuticas de 5-20 mg, onde raramente é observado sedação diurna ou amnésia, e a
incidência de outros efeitos adversos é diminuída. Como os benzodiazepínicos, o
Zolpidem não causa depressão respiratória grave, a não ser quando ingeridos
concomitantemente a outros agentes, por exemplo, o etanol.
(4)
O Zolpidem é absorvido rapidamente pelo trato gastrintestinal (TGI), o
metabolismo de primeira passagem resulta em uma biodisponibilidade oral de
aproximadamente 70%, mas quando ingerido com alimentos esse valor é mais baixo
devido à absorção mais lenta e o fluxo sanguíneo hepático aumentado. O fármaco é
quase totalmente eliminado no fígado através da oxidação de grupamento metila nos
anéis fenilícos e imidazopiridina nos ácidos carboxílicos correspondentes.
(4)
O tempo de meia vida do Zolpidem é de cerca de duas horas, o suficiente para
cobrir a maior parte do período típico de sono que é de oito horas. Atualmente a
administração do mesmo é aprovada somente ao deitar. A meia vida pode aumentar
até duas vezes em pacientes com cirrose e também tende a ser maior em pacientes
idosos. A eliminação é mais lenta em pacientes com insuficiência renal crônica.
(4)
Os efeitos colaterais cognitivos mais comuns com os hipnóticos são sedação,
sonolência, déficits cognitivos e sintomas motores. Os sintomas motores incluem
alterações de coordenação motora, afasia, riscos de quedas, fraturas em idosos e
acidentes. Em casos raros, efeitos paradoxais como insônia, agitação. A meia vida
longa, metabólicos ativos, doses repetidas, idade do paciente e doenças prévias são
fatores que causam efeitos residuais.
(6)
6
Podem ocorrer perca de memória quando se toma qualquer hipnótico
benzodiazepínico ou não benzodiazepínico. Quanto maior a dose plasmática da droga,
maior a probabilidade de ocorrer amnésia. Quanto mais próximo do pico plasmático,
maior a probabilidade de amnésia anterógrada. Após tomar o medicamento o paciente
não consegue reter novas informações depois de instalado o quadro clínico. Assim,
pessoas que precisam realizar tarefas no meio da noite não devem usar esse tipo de
medicamento.
(6)
Os hipnóticos devem ser contra-indicados em pacientes com história de abuso
de álcool, mulheres grávidas, doença pulmonar obstrutiva crônica, miastenia gravis,
porfiria e em pessoas com necessidade de operar máquinas perigosas ou veículos.
(6)
O desenvolvimento de novos medicamentos deve levar em consideração a
biodisponibilidade do mesmo no organismo, pois isso pode ser um fator limitante no
desenvolvimento de novas formulações.
1.3 Fatores que Afetam a Biodisponibilidade de Medicamentos
A biodisponibilidade de medicamentos que são administrados por via oral podem
ser influenciada por vários fatores fisiológicos e físico-químicos. A absorção de um
fármaco só ocorre após a sua solubilização, assim processos como desintegração,
dissolução e também a permeabilidade da membrana plasmática são fatores
determinantes.
(7)
A absorção de um medicamento pelas membranas biológicas depende da
solubilidade dele nos fluidos gastrointestinais, essa é influênciada por algumas
características do próprio fármaco como constante de dissociação, lipossolubilidade,
tamanho da partícula, forma cristalina e sua forma molecular como sais ou ésteres.
(7)
As características da forma farmacêutica e seus excipientes são fundamentais
na biodisponibilidade de fármacos. Existem várias formas farmacêuticas de
administração oral de medicamentos, sendo as mais utilizadas: soluções, suspensões,
comprimidos, drágeas e cápsulas. As suspensões e as formas farmacêuticas sólidas
são as que apresentam as maiores alterações em termos de biodisponibilidade. As
suspensões são utilizadas quando o fármaco é insolúvel ou pouco solúvel em água. No
7
caso das formas farmacêuticas sólidas, o processo de produção e os componentes da
formulação fazem com que os mecanismos de biodisponibilidade destas sejam
relativamente complexos, atualmente o teste de dissolução é utilizado para garantir a
qualidade das formulações lote a lote.
(7)
Fatores fisiológicos relacionados ao trato gastrointestinal (TGI) afetam também a
biodisponibilidade de medicamentos. Os processos de esvaziamento gástrico, trânsito
intestinal e passagem do fármaco através das membranas biológicas são alterados por
diversos fatores e assim fazendo com que a absorção de fármacos seja influenciada. A
coadministração de fármacos com alimentos, ou outros fármacos altera a absorção do
medicamento, assim como também a idade e doenças do trato gastrointestinal alteram
a fisiologia do mesmo, alterando a absorção do medicamento.
(7)
Para determinar se uma nova formulação de um determinado medicamento
genérico é adequada ao consumo humano, realiza-se o estudo de bioequivalência, que
usualmente utiliza uma técnica bioanalítica para quantificação do fármaco em plasma
humano.
1.4 Técnica Bioanalítica
A espectrometria de massas tem despontado como técnica chave na indústria
farmacêutica, atuando desde a pesquisa para a descoberta de novos fármacos como
também no controle de qualidade. Através do surgimento do medicamento genérico,
em paralelo ao processo de comprovação de equivalência biológica a cromatografia
líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) vem conquistando uma
relevância político-econômica crucial neste segmento de aplicação tecnológica.
(8)
1.4.1 Cromatografia Líquida (LC)
A técnica cromatográfica foi aplicada pela primeira vez em 1903, por M. Tswett
, para a separação de pigmentos de plantas. Como a separação gerou bandas
coloridas, originou-se o nome cromatografia.
(9)
A principal diferença entre a cromatografia líquida clássica e a cromatografia
líquida de alta eficiência e a utilização de fase estacionária com micropartículas
8
esféricas de 10, 5 e 3 mm. Devido a essas serem menos permeáveis, sugiram as
bombas para a eluição da fase móvel. O desenvolvimento dessas novas fases
estacionárias aliadas ao desenvolvimento da instrumentação analítica fez com que a
cromatografia líquida tivesse uma melhor performance em termos de resolução,
quantificação e detecção em menor tempo.
(10)
A separação cromatográfica baseia-se na migração diferencial dos componentes
de uma mistura, que ocorre entre duas fases imiscíveis, ou seja, a fase estacionária e a
fase móvel, conforme ilustrado na Figura 3 e Figura 4. Estas interações podem ser
realizadas por meio de interações do tipo ligações de hidrogênio, interações
eletrostáticas e hidrofóbicas ou forças de Van der Waals. O equilibrio dos analitos
podem ser afetados por alguns fatores como: composição da fase móvel, composição
da fase estacionária e temperatura. Mudanças em qualquer um destes fatores levam a
alterações na migração diferencial.
(11)
Figura 3 – Ilustração do processo de migração diferencial de seus componentes entre
a fase móvel e a fase estacionária.
9
Figura 4 – Ilustração da separação analítica de tres componentes de uma mistura.
Um sistema de cromatografia líquida é basicamente composto por módulos, que
são projetados para proporcionar versatilidade, rapidez, reprodutibilidade e alta
sensibilidade a análise a que é destinado. Na Figura 5 está demonstrado um esquema
dos componentes de um cromatógrafo líquido. Na Figura 6 esta demonstrada uma foto
de um Cromatógrafo Líquido.
(11)
Figura 5 – Representação esquemática de um sistema de cromatografia líquida.
10
Figura 6 – Foto um sistema de cromatografia líquida.
1.4.1.1 Modos de separação
Deve existir uma relação de interação do analito com as fases móvel e
estacionária, e entre fase móvel e fase estacionária. Assim, o modo de separação
escolhido depende da fase estacionária e fase móvel para cada classe de analito.
(11)
Existem dois modelos propostos para retenção em cromatografia líquida. Um por
Scott e Kucera, interação-solvente, e o outro por Snyder, competição-solvente. Os
modelos são equivalentes, uma vez que eles consideram que em uma separação a
interação do analito com a fase estacionária permanece constante, portanto, a fase
móvel é quem determina a retenção do analito.
(11)
1.4.1.1.1 Cromatografia no modo normal
Na cromatografia de modo normal a polaridade da fase estacionária é maior do
que a polaridade da fase móvel. Os solventes utilizados são orgânicos, mas sem a
adição de água. A fase estacionária utilizada são adsorventes orgânicos, como sílica e
alumina, ou fase polares quimicamente ligadas, como ciano, diol, fenil e amino.
(10)
Esse tipo de separação é utilizado em grande parte em moléculas neutras, mas
também pode ser utilizada para moléculas ionizáveis ou iônicas. A eluição acontece
11
através da saída das moléculas menos polares seguidas pelas moléculas mais polares
que ficam mais retidas pela fase estacionária.
(11)
Quando se encontra traços de água na fase móvel, ocorre-se pouca retenção do
analito na fase estacionária, em especial quando se usa sílica não modificada na fase
estacionária. Esse problema é resolvido pela utilização de solventes anidros.
(11)
1.4.1.1.2 Cromatografia no modo reverso
Na cromatografia no modo reverso a polaridade da fase móvel é maior do que a
fase estacionária. Este método é mais empregado, uma vez que possibilita a utilização
de água na composição da fase móvel, dessa forma permite a separação de uma
grande variedade de compostos. A fase móvel mais utilizada é uma mistura de
acetonitrila/água, podendo substituir a acetonitrila por metanol ou tetrahidrofurano
quando necessário. São usados esses três solventes devido à pequena quantidade de
solventes orgânicos miscíveis com água.
(10)
O princípio da separação em fase reversa é a hidrofobia e deve-se
principalmente a interações entre a parte não polar do soluto e a fase estacionária, isto
é, à repulsão desta parte do soluto pela fase móvel aquosa. É importante lembrar que a
força do solvente em fase reversa aumenta com o decréscimo da polaridade do
solvente.
1.4.2 Espectrometria de Massas (MS)
A espectrometria de massas teve seu inicio com Joseph John Thomson em
1987
(12)
. A MS é uma das técnicas analíticas mais úteis e poderosas para a
investigação científica, além de poder ser aplicada em várias áreas, como ciências
biológicas, biomédicas, geologia, produtos naturais, seqüenciamento de proteínas,
identificação de marcadores biológicos entre outras.
(13)
A Figura 7 apresenta uma foto
de um espectrômetro de massas.
(14)
12
Figura 7 – Foto de um Espectrômetro de Massas.
Esta técnica tem sido muito utilizada para a medida de isótopos e também para
a determinação estrutural de moléculas orgânicas. Considerada atualmente como
melhor técnica de detecção para cromatografia, devido a alta sensibillidade a pequenas
concentrações bem como pelo fornecimento de informações quantitativas e qualitativas
dos compostos separados no cromatógrafo, a MS também permite a distinção de
diferentes substâncias com o mesmo tempo de retenção.
(9)
O espectrômetro de massas é composto por uma fonte de íons, no qual ocorre a
ionização dos analitos, o analisador que faz a separação dos íons e o detector, que faz
a geração de sinais elétricos que são mensuráveis. A Figura 8 demonstra uma
representação esquemática do espectrômetro de massas.
(11)
Figura 8 –
Descrição básica do espectrômetro de massa
1.4.2.1 Fonte Íons –
Electrospray
Nos últimos anos a espectrometria de massas com ionização por
v
em se difundindo por diversas
número crescente de artigos publicados por essa técnica
Figura 10.
(15)
Descrição básica do espectrômetro de massa
s.
Electrospray
(ESI)
Nos últimos anos a espectrometria de massas com ionização por
em se difundindo por diversas
áreas da ciência
conforme apresenta a Figura 9
número crescente de artigos publicados por essa técnica
pode ser visualizado na
13
Nos últimos anos a espectrometria de massas com ionização por
electrospray
conforme apresenta a Figura 9
, o
pode ser visualizado na
14
Figura 9 – Utilização da espectrometria de massas em diferentes áreas do
conhecimento. Todos os dados foram obtidos de pesquisa realizada no endereço
eletrônico www.isiknowledge.com, no período de 1993 a 2004, considerando as 500
primeiras citações de cada ano. No gráfico aparecem apenas áreas que atingiram mais
de 1%.
(15)
15
Figura 10 – Número total de artigos publicados envolvendo as técnicas de ionização
mais utilizadas. Baseado nos dados obtidos de pesquisa realizada no endereço
eletrônico www.isiknowledge.com, no período de 1993 a 2004.
(15)
Atualmente, na cromatografia líquida ocorreram avanços devido o acoplamento
do espectrômetro de massas, isso foi um grande desafio superado pelos cientistas,
remover a grande quantidade de fase móvel proveniente do cromatógrafo bem como a
transformar moléculas termolábeis em íons gasosos para serem analisados a vácuo. E
nesse contexto surgiu a fonte de ionização electrospray.
(16)
O sistema de ESI-MS pode ser definido com um circuito elétrico que encaminha
os íons formados em solução para a fase gasosa, conforme ilustrado na Figura 11.
Nesse processo, o analito, inicialmente em solução, forma íons carregados em solução
que posteriormente serão analisados de acordo com suas respectivas razões
massa/carga no MS.
(14)
Figura 11 – Ilustração da fonte de electrospray.
(14)
16
O ESI é um dos métodos de ionização mais brandos, visto que são analisadas
amostras que possuem interações como proteína-proteína, ou ainda entre ligantes
metálicos em complexos orgânicos.
(14)
No electrospray, o eluente proveniente do sistema cromatográfico, composto
pelo solvente e o analito ionizado, são inseridos no espectrômetro de massas, numa
vazão adequada, que é no máximo de 400 µL/min, através de um capilar de aço que é
aplicado um alto potencial, em torno de 4 KV, essa voltagem faz com que as cargas
provenientes da solução em analise sejam separadas, isso ocorre por volta de 1% do
analito. O gás de nebulização é normalmente o nitrogênio. O líquido carregado
eletricamente sai pelo capilar de aço forma um cone (cone de Taylor), que em seguida
passa a ser um fino filamento que se dispersa em gotículas carregadas que serão
secas através do gás de nebulização e da alta temperatura, e por fim serão analisadas
no MS.
(9, 14)
Dois modelos explicam a formação dos íons na fase gasosa: o de carga residual
(charged residue model, CRM) e o de evaporação de íons (ion evaporation model,
IEM). No primeiro, as gotículas vão evaporando-se de tal modo que as densidades das
cargas vão aumentando, assim começa a ocorrer uma repulsão eletrostática que leva a
explosão da gotícula, essa explosão é chamada de explosão de Rayleigh
(Coulombica), acarretando na formação de gotas menores, carregadas até o ponto que
o solvente seja totalmente evaporado. No IEM, as gotículas carregadas vão
evaporando-se até ao ponto onde as cargas presentes começam a sofrer repulsão
eletrostática ocasionando a evaporação dos íons.
(14)
17
1.4.2.2 Analisador Quadrupolar
O analisador de íons quadrupolar é o mais utilizado, sua composição é feita por
quatro barras metálicas paralelas conforme ilustrado na Figura 12.
(9)
Figura 12 – Ilustração do analisador quadrupolar.
A aplicação de uma combinação de potenciais tempo-independente (dc) e
tempo-dependente (ac), faz com que os íons sejam separados no analisador
quadrupolar, essa aplicação de potenciais é demonstrada na Figura 13. Quando se
aplica um potencial ac e dc, os íons sofrem efeitos sobre a trajetória nos eixos x-z e y-
z, respectivamente. Na Figura 14 apresenta a ilustração os eixos nos quais os íons
sofrem esses efeitos. O potencial aplicado no eixo x-z é de mesma intensidade do
aplicado no eixo y-z, mas os sinais são opostos.
(17)
Figura 13 – Demonstração da aplicação dos potencias.
18
Figura 14 – Ilustração dos eixos nos quais sofrem influência dos potenciais aplicados.
Na aplicação de um potencial ac, e na falta de um potencial dc, o potencial fica
oscilando entre positivo e negativo. Caso a análise ocorra com íons positivamente
carregados, eles irão para os eixos e em direção ao detector, mas quando forem
negativos, os íons colidem com as barras ou saem do analisador e assim não
alcançando o detector conforme ilustrado na Figura 15 e Figura 16. Esses processos
são influenciados por diversos fatores incluindo a magnitude instantânea do potencial
negativo aplicado nos eletrodos e também o tempo que fica aplicado, a posição, a
velocidade, e relação m/z da partícula analisada.
(17)
19
Figura 15 – Ilustração da trajetória dos íons.
Figura 16 – Esquema do separador quadrupolo.
Quando utilizamos a espectrometria de massas seqüencial o íon precursor é
selecionado e da origem a um espectro de massas convencional, os íons filhos são
obtidos da fragmentação espontânea ou induzidos do íon precursor. Quando
analisamos misturas complexas, os íons filhos fornecem informações inequívocas da
presença de um determinado composto, e no caso de compostos desconhecidos, eles
fornecem muitas informações estruturais.
(18)
A Figura 17 demonstra o funcionamento de um espectrômetro de massas triplo
quadrupolar. Uma mistura de íons é inserida no quadrupolo Q1, liberando apenas um
íon precursor. O segundo estágio q2 o íon precursor colide com as moléculas de N
2
ou
Ar em uma pressão de aproximadamente 10
-8
a 10
-6
bar e se fragmenta formando os
íons filhos. O quadrupolo Q3 atua como um segundo filtro, permitindo que somente
determinados íons filhos passem para o detector.
(9)
Figura 17 –
Demonstração do espectrômetro de massas triplo quadrupolar.
1.4.2.2.1 Simbologia dos Experimentos de Espectrometria de Massas Seqüencial
Logo abaixo na F
igura
Meurer
e colaboradores para descrever experimentos
de massas de múltiplos estágios.
Figura 18 –
(a) Representação dos símbolos utilizados em um experimento (b) MS
c) MS
3
.
Na Figura 18a, o
círculo vazio representa o analisador de massas no modo
varredura,
onde são analisadas
dele. Já o círculo cheio representa um analisador de massas onde é selecionado um
íon de determinada razão
m/z
de colisão onde pode ocorrer ganho e perda de massa. A F
Demonstração do espectrômetro de massas triplo quadrupolar.
1.4.2.2.1 Simbologia dos Experimentos de Espectrometria de Massas Seqüencial
igura
18, estão
demonstradas as simbologias definidas por
e colaboradores para descrever experimentos
seqüenciais em espectrômetro
de massas de múltiplos estágios.
(14)
(a) Representação dos símbolos utilizados em um experimento (b) MS
círculo vazio representa o analisador de massas no modo
onde são analisadas
as razões m/z dos
íons que são transmitidos através
dele. Já o círculo cheio representa um analisador de massas onde é selecionado um
m/z
e a seta indica o fluxo dos íons através de uma câmara
de colisão onde pode ocorrer ganho e perda de massa. A F
igura
20
Demonstração do espectrômetro de massas triplo quadrupolar.
1.4.2.2.1 Simbologia dos Experimentos de Espectrometria de Massas Seqüencial
demonstradas as simbologias definidas por
seqüenciais em espectrômetro
(a) Representação dos símbolos utilizados em um experimento (b) MS
2
e
círculo vazio representa o analisador de massas no modo
íons que são transmitidos através
dele. Já o círculo cheio representa um analisador de massas onde é selecionado um
e a seta indica o fluxo dos íons através de uma câmara
igura
18b demonstra a
21
representação utilizada em experimentos de MS
2
, onde o quadrupolo Q1 é utilizado na
seleção e o quadrupolo Q3 está analisando os produtos formados na reação com uma
molécula neutra em q2.
1.4.3. Acoplamento da Cromatografia Líquida à Espectrometria de Massas (LC-
MS/MS)
A cromatografia pode ser combinada a vários sistemas de detecção, pois se
trata de uma técnica muito utilizada e de excelente desempenho. O acoplamento da
cromatografia líquida com a espectrometria de massas soma as vantagens da
cromatografia, alta seletividade e eficiência na separação, com as do espectrômetro de
massas, informações estruturais, massa molar e adicional seletividade.
(19)
Durante o acoplamento das duas técnicas, é necessário que as características
das duas sejam consideradas e respeitadas.
(19)
Quando se faz o acoplamento da cromatografia líquida com a espectrometria de
massas, são encontradas algumas incompatibilidades com relação à vazão utilizada na
LC e o sistema de vácuo e a fonte de íons do MS. A vazão do eluente da LC é muito
grande, na ordem de 1,0 mL/mim, de maneira que não é possível que esse eluente vá
diretamente para o MS onde se trabalha com pressões de cerca de 1,3 x 10
-4
Pa
2
. Para
que esse acoplamento seja eficaz, é necessário uma fonte de ionização que faça a
remoção de toda ou de uma parte significativa da fase móvel.
(19)
Os compostos analisados pela LC são relativamente pouco voláteis e/ou
sensíveis a temperatura, dessa forma não é possível a utilização das fontes de
ionização mais comumente aplicadas a MS, assim se tornou necessário o
desenvolvimento de formas alternativas de ionização. Dentro desse contexto, surgiu o
electrospray.
(19)
É necessário um tratamento prévio das amostras para que estas sejam
analisadas através da técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de
massas.
22
1.4.4 Tratamento de Amostras
O tratamento da amostra é de fundamental importância para a cromatografia
líquida, pois nesta etapa prepara-se a amostra para que tenha a menor quantidade de
interferentes possíveis para que assim não danifique a coluna cromatográfica e seja
compatível com o eluente utilizado. Essa etapa é a mais demorada de um método
bionalítico e onde pode ocorrer o maior número de erros.
(10)
Para materiais biológicos, como soro, urina ou plasma, existem vários tipos de
preparo de amostras, entre eles estão à extração líquido-líquido e a precipitação de
proteínas. A presença de compostos endógenos pode comprometer a análise
desejada, visto que as concentrações encontradas nessas matrizes são muito baixas,
na ordem de ng/mL.
(10)
No caso da extração líquido-líquido, é feita a transferência de um soluto
presente em uma matriz complexa para uma fase mais simples como o solvente
orgânico, esse tratamento tem como objetivo isolar ou concentrar o analito desejado ou
até mesmo separá-lo de interferentes. Comumente é feito a extração de uma solução
aquosa com solventes orgânicos, como: éter dietílico, acetato de etila, tolueno e
hexano, pois estes têm uma polaridade e densidade diferentes da fase aquosa, isso faz
com que os solventes orgânicos permaneçam em uma fase separada da fase aquosa.
Essa extração só pode ser realizada se o analito tiver uma lipofilicidade adequada para
ser extraída por um solvente orgânico.
(9)
Outro tipo de preparo de amostra é a precipitação de proteínas contidas na
matriz a ser analisada. A droga e/ou metabólitos ligam-se a proteínas, entretanto esta
ligação pode ser quebrada através da precipitação. Esta pode ser realizada através de
vários métodos, entre eles, aquecimento, tratamento com ácidos, bases ou solventes
orgânicos que são miscíveis com a água, como o metanol, acetonitrila e o etanol. Após
o processo de precipitação, faz-se uma centrifugação para separar o precipitado, e o
sobrenadante é injetado diretamente no cromatógrafo ou submetido a um processo de
extração líquido-líquido.
(10)
Na extração da amostra, o principal objetivo é a obtenção do analito com o
menor número de interferentes possíveis, busca-se uma alta recuperação, precisão e
23
exatidão do método. Deve-se verificar a solubilidade do composto analisado bem como
o grau de pureza do solvente extrator.
(10)
Como a maioria dos fármacos são compostos ionizáveis, deve-se levar também
em consideração o pH da matriz biológica. É muito utilizada a adição de um acido ou
uma base para a neutralização do analito e posteriormente ser extraído com um
solvente orgânico.
(10)
Através de uma validação feita seguindo os critérios aceitos pelas legislações
vigentes, ANVISA ou FDA, confirma-se que o método é adequado para a quantificação
do fármaco.
24
2. OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia bioanalítica
para determinação de Zolpidem em plasma humano utilizando Cromatografia Líquida
com detecção por Espectrometria de Massas Seqüencial (LC-MS/MS), empregando
Diazepam como padrão interno.
25
3. REVISÃO DA LITERATURA
Acerca de uma extensa pesquisa bibliográfica na literatura, foram encontrados
alguns trabalhos que fizeram a quantificação de Zolpidem em várias matrizes, urina
(20,
21)
, fluido oral
(22, 23)
, soro
(24)
e plasma humano
(25, 26, 27, 28, 29, 30, 31)
, cabelo
(32,33, 29)
, tecido
cerebral
(34)
. Para quantificação nessas matrizes foi utilizada cromatografia líquida e
gasosa acoplada à espectrometria de massas.
As analises com urina foram feitas em dois trabalhos; em Quintela e
colaboradores
(20)
foi utilizado extração em fase sólida e um limite de quantificação foi
de 0,02 ug/mL, já em Laluop e colaboradores
(21)
, foi feita a quantificação em sangue e
cabelo, além da urina, para o sangue encontrou-se um LQ variando entre 1 ng/mL a 2
ng/mL, em cabelo de 0,5 pg/mg a 10 pg/mg e em urina de 10 ng/mL a 25 ng/mL.
Em fluido oral, Kintz e colaboradores
(22)
, utilizaram extração líquido-líquido e
obtiveram um LQ de 0,2 ng/mL, já em Concheiro e colaboradores
(23)
, foi feita uma
extração em fase sólida para um várias drogas.
Em Hopkins e colaboradores
(34)
, para a estudar a saturação dos receptores de
atuação do Zolpidem, foi feita a análise em tecido cerebral. A quantificação em cabelo
foi feita para análises forenses em dois trabalhos
(32,33)
e também para a essa mesma
finalidade foi feito em plasma humano
(25, 28, 31)
.
A cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas foi utilizada em
dois trabalhos
(24, 30)
, em Maresova e colaboradores
(24)
foi determinado em soro humano
para o estudo de drogas de abuso, para isso utilizaram uma extração líquido-líquido
com derevatização. Já em Stanke e colaboradores
(30)
, foi feito em plasma humano e
também foi feito uma extração líquido-líquido, porém não foi feito a derevatização, esse
estudo teve a finalidade de avaliar a farmacocinética e também a toxicologia.
Em estudo de bioequivalência farmacêutica, foram encontrados dois trabalhos,
o primeiro de Bhatt e colaboradores
(26)
, foi feito uma extração em fase sólida, um LQ de
2,5 ng/mL, tempo total de corrida foi de 3,2 minutos. No outro, Couture e
colaboradores
(27)
, foi feito uma extração líquido-líquido, LQ de 1,0 ng/mL e um tempo
total de corrida de 3,5 minutos.
26
4. MATERIAS E MÉTODOS
4.1 Método Bioanalítico
O princípio desta metodologia foi a extração líquido-líquido do plasma humano
do Zolpidem juntamente com seu padrão interno, Diazepam, utilizando o
hexano/acetato (50:50 v/v) como líquido extrator. E posteriormente analisados por
cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa.
4.1.1 Equipamentos e Materiais
Durante o desenvolvimento e validação da metodologia, utilizamos alguns
equipamentos e materiais como: pipetas automáticas Gilson de 1000 e 200 uL;
ponteiras de pipeta descartáveis Axygen; mesa agitadora Fine PCR; misturador
Phoenix; balança analítica Precisa CP 225 D SARTORIUS; espectrômetro de massas
Micromass / Quatro Micro; cromatógrafo líquido Shimatzu; programa de gerenciamento
dos dados MassLynx 4.1; diversos reagentes (acetonitrila, ácido fórmico, hidróxido de
amônio, hexano, acetato de etila e água purificada Milli-Q) e também plasma humano
normal, lipêmico e hemolisado.
4.1.2 Preparo das Soluções
Durante a validação do método foram utilizadas algumas soluções de Zolpidem
e Diazepam. Para o Zolpidem, preparou-se uma solução de 500 ug/mL e para o
Diazepam 100 ug/mL. Estás foram devidamente armazenadas em frasco adequado,
rotuladas e armazenadas em geladeira a +4
o
C, e substituídas de acordo com os prazos
de validade.
4.1.3 Fase Móvel
A fase móvel utilizada foi acetonitrila / hidróxido de amônio 0,1 M / ácido fórmico
88% (60:40:0,1% v/v/v), está foi preparada de acordo com a necessidade e substituída
diariamente.
27
4.1.4 Preparo dos Padrões da Curva de Calibração e das Amostras Controle de
Qualidade
Após uma pesquisa bibliográfica determinou-se a concentração plasmática
máxima (C
máx
) para a dose a ser administrada, em seguida determinou-se a
concentrações dos pontos da curva de calibração e também dos controles de
qualidade. Foram definidos oito pontos na curva de calibração além da amostra branca
(matriz biológica sem o fármaco e padrão interno) e amostra zero (matriz biológica sem
o fármaco e com o padrão interno), conforme legislação vigente. O primeiro ponto da
curva é o LQ e o último seria aproximadamente o dobro do C
máx
, os demais pontos são
distribuídos entres esses dois, ficando mais próximos do C
máx
. Na tabela 1 estão
demonstrados os pontos da curva de calibração.
Tabela 1 – Pontos da curva de calibração.
Amostra Concentração no Plasma (ng/mL)
Branco 0
Zero 0
Zolpidem 1,0
Zolpidem 10,0
Zolpidem 20,0
Zolpidem 50,0
Zolpidem 100,0
Zolpidem 300,0
Zolpidem 500,0
Os controles de qualidade foram determinados de acordo com a legislação
vigente. Nesta o controle de qualidade baixo (CQB) é determinado como sendo três
vezes a concentração do limite de quantificação (LQ), o controle de qualidade alto
(CQA), como sendo de 75-90% do ponto mais alto da curva e o controle de qualidade
médio (CQM) seria a média aproximada do CQB e CQA.
28
Na tabela 2 estão demonstrados os valores determinados dos controles de qualidade
Tabela 2 – Controles de qualidade.
Amostra
Concentração no Plasma (ng/mL)
CQB 3,0
CQM 200,0
CQA 400,0
Após o preparo dos pontos da curva de calibração e controles de qualidade,
estes foram aliquotados em frações de 200 uL e armazenados a -70
o
C
4.1.5 Parâmetros do Cromatógrafo Líquido
Foi utilizada uma coluna analítica Polaris C18 (3u, 50 mm x 2,0 mm), com um
fluxo de 0,25 mL/mim, um volume de injeção de 3 uL e um tempo total de corrida de 2
minutos. O tempo de retenção para o Zolpidem foi de 0,84 mim e para o Diazepam de
1,13 mim.
4.1.6 Parâmetros do Espectrômetro de Massas
Os parâmetros do equipamento que foram utilizados para o monitoramento do
Zolpidem e Diazepam são: fonte de ionização por electrospray operando em modo
positivo (ESI+) e MRM 308,32 > 235,32 e 285,11 > 154,07 para monitoramento do
Zolpidem e Diazepam respectivamente, a temperatura da fonte foi de 110ºC e
dessolvatação de 500º C, o fluxo dos gases do cone e dessolvatação foram de 30 e
600 L/h, respectivamente, os valores de voltagem do capilar, cone e energia de colisão
foram, respectivamente, 3,0 kV, 33,0 V e 30,0 eV para Zolpidem e 3,0 kV, 30,0 v e 25,0
eV para Diazepam, tendo como pressão de argônio para a dissociação 6,16 x 10
-3
mbar.
4.1.7 Preparo de Amostras
Foi utilizado no preparo da amostra, o procedimento de extração descrito em
seguida. Este procedimento foi aplicado durante o desenvolvimento e validação do
29
método tanto para os pontos da curva de calibração quanto para os controles de
qualidade.
1. Primeiramente em tubos eppendorff colocou-se 200 uL de plasma humano e 50
uL da solução de Diazepam na concentração de 1,0 µg/mL em acetonitrila.
2. Em seguida, adicionou-se 1000 uL de hexano / acetato de etila (50:50 v/v) e
agitou-se por 5 minuto em mesa agitadora.
3. Após agitação, centrifugou-se as amostras a 13200 rpm, durante 10 minutos, à
4°C.
4. Depois transferiu-se 700 uL do sobrenadante para tubos eppendorff, evaporou-
se o solvente sob fluxo de ar comprimido, ressuspendeu-se o resíduo em 200 uL
de acetonitrila e agitou-se por 2 minuto na mesa agitadora.
5. Finalmente, transferiu-se as amostras para inserts de vidro descartáveis e, em
seguida, injetou-se alíquotas de 3 uL no sistema cromatográfico.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Desenvolvimento
5.1.1 Iniciando o Desenvolvimento
O Zolpidem é uma molécula solúvel em água, assim esse é um fármaco que
pode ter um pouco de dificuldade para ser extraído do plasma humano. Conforme
verificamos na Figura 01, o Zolpidem é um fármaco que contém funções básicas,
aminas e amidas, o que fez com que utilizamos o modo positivo para a análise no
espectrômetro de massas. Diante da basicidade apresentada pela molécula de
Zolpidem, as soluções iniciais de trabalho foram preparadas em metanol/água e
acetonitrila/água com a adição de um modificador orgânico, como o ácido fórmico, para
facilitar a protonação da molécula. A utilização de um solvente orgânico e água polar
são muito importantes, o primeiro ajuda na secagem do spray e o segundo é devido à
ionização ser facilitada em água. A proporção utilizada pode variar bastante, o que é
influenciada pela solubilidade do composto a ser analisado.
30
5.1.2 Iniciando a Obtenção do Espectro no modo MS e Ionização
Para iniciarmos a obtenção do espectro de MS, foi escolhida uma faixa de
massa molecular que compreendia o Zolpidem. Após isso, foram colocadas as
condições padrões para o início do desenvolvimento no modo positivo (ESI+: resolução
do primeiro quadrupolo 15 V, energia de saída do íon do primeiro quadrupolo 1 V,
entrada no quadrupolo de colisão 50 V, energia de colisão 1 V, saída do quadrupolo de
colisão 50 V, resolução do terceiro quadrupolo 15 V, saída do terceiro quadrupolo 3 V,
detector multiplicador de elétrons 950 V). Depois de serem carregadas essas
condições pelo software de gerenciamento do espectrômetro de massas, iniciamos a
infusão das soluções feitas em diversos solventes com um fluxo variando de 10 uL/mim
a 50uL/mim. Após este processo, verificou-se que o solvente mais adequado foi a
acetonitrila/água com ácido fórmico; conforme demonstramos na Figura 19 os
espectros de massas do íon mais intenso.
Figura 19 - Espectro de massas do Zolpidem.
Após o solvente mais adequado ter sido escolhido, foi infundido de forma on-line
uma solução de 1 ug/mL Zolpidem para a otimização das voltagens que inclui capilar,
cone, extrator, lente rf, temperatura do bloco e de gás de dessolvatação, bem como de
fluxo de gás de cone e dessolvatação. Essa primeira otimização é chamada de
“grosseira”, tendo em vista que ela não leva em consideração a cromatografia líquida,
Zolpidem1 ug/mL
m/z
100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350
%
0
100
Desenvolvimento_10 52 (0.524) Cm (44:67) Scan ES+
1.14e7
308.205
102.082
163.308
141.275
114.064
126.178
159.225
185.283
171.410
279.263
309.178
31
pois nesta são utilizados fluxos maiores (100 a 600 uL/mim). Na Figura 20, pode-se
observar os parâmetros otimizados.
Figura 20 – Ilustração dos parâmetros otimizados no modo positivo (ESI+).
Os parâmetros foram otimizados individualmente, visando o aumento da
corrente iônica para a espécie em questão e também a estabilidade do íon.
A obtenção do espectro de massas no modo MS é muito importante, pois
possibilita a verificação da degradação do padrão que está sendo utilizado e se não
ocorreu erro durante o preparo da solução.
5.1.3 Iniciando a Obtenção do Espectro no modo MS/MS
As condições utilizadas na obtenção do espectro de massas no modo MS/MS
foram quase todas iguais as do modo MS, diferindo a voltagem de entrada na cela de
colisão para -1, a energia de colisão para um valor maior que 0 V e energia de saída do
quadrupolo de colisão para 1 (o gás de colisão foi aberto com uma pressão inicial na
cela de 3x10
-3
Torr), essas condições aumentam a intensidade dos sinais no espectro
de MS/MS. Essas fazem com que selecionamos a massa do íon precursor no primeiro
32
quadrupolo; enquanto no segundo quadrupolo é feito a fragmentação através do gás de
colisão (argônio) e no terceiro quadrupolo a varredura do íon precursor.
Em seguida foram otimizados a voltagem de colisão e a pressão na cela de
colisão, mas agora observando o íon precursor. Na Figura 21, está demonstrado o
espectro de MS/MS e na Figura 22 a fragmentação proposta.
Figura 21 – Espectro de MS/MS do Zolpidem.
Figura 22 – Fragmentação proposta para o Zolpidem.
Zolpidem1 ug/mL
m/z
70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350
%
0
100
Desenvolvimento_12 52 (0.524) Cm (36:87) Daughters of 308ES+
1.58e6
235.317
235.188
221.230
92.134
236.346
263.236
248.311
308.147
33
5.1.4 Acoplamento da cromatografia líquida ao espectrômetro de massas
No acoplamento, foi utilizada a fase móvel com a composição dos solventes
igual à utilizada no modo MS e também a menor coluna cromatográfica disponível
(Polaris 3 C18 50 x 2,0 mm).
A função MRM (monitoramento de reação múltipla), que é gerada pelo espectro
de MS/MS, é utilizada para o monitoramento dos compostos iônicos que emergem da
coluna cromatográfica, para o Zolpidem o MRM foi de 308,32 > 235,32 (energia do
cone 33V e energia de colisão de 30V). Esta função é utilizada quando é feito o
acoplamento do espectrômetro de massas a cromatografia líquida, pois promove o
máximo de seletividade e sensibilidade. A energia do cone e colisão foram otimizadas
para aumentar a intensidade do sinal.
Com a função MRM pronta, foram otimizados tanto a fonte como os
analisadores, o que chamamos de sintonia fina.
Em seguida foram feitos ajustes no sistema cromatográfico como lavagem da
agulha e ajuste do volume de injeção para minimizar o efeito de carry-over.
5.1.5 Padrão interno
A escolha do padrão interno segue a linha de raciocínio onde o ideal é uma
molécula muito parecida com o Zolpidem, mas com massa molecular diferente. O
próprio analito deuterado seria a melhor escolha se o seu preço não fosse tão elevado,
diante disso escolhem-se compostos com estrutura similar, que tenha as mesmas
características de solubilidade e também suas funções orgânicas. Diante disso o
Diazepam foi o padrão interno escolhido, sua estrutura é demonstrada na Figura 23.
34
Figura 23 – Estrutura do Diazepam.
O Diazepam foi utilizado para corrigir ou constatar algum possível problema na
metodologia de extração, visto que ele tem concentração fixa e está em um canal
diferente do analito. Como nosso método de quantificação é feito através da razão
entre a área do nosso analito e do seu padrão interno, através do desvio padrão
conseguimos verificar se ocorreu algum erro e se este foi corrigido pelo padrão interno.
Após a escolha do Diazepam, foram procedidos as mesmas etapas do MS,
MS/MM e MRM para o padrão interno.
Com as funções MRM do Zolpidem e do Diazepam prontas, foi feita a
contaminação cruzada, onde é verificado após injeção se um está contaminando o
canal do outro.
5.1.6 Tratamento da amostra
Utilizamos para a extração de amostras, plasma branco, plasma branco com
padrão interno e plasma com concentrações de LQ, CQB, CQM e CQA. Foram
verificadas possíveis contaminações nos solventes e aparatos de extração além de
interferentes endógenos e recuperação.
O volume de matriz biológica utilizada foi de 200 uL, chegamos a esse volume
após otimização, esse é o melhor pois demonstra ser melhor agitado em tubos de 2
mL.
35
A adição do padrão interno deve levar alguns fatos em consideração, o volume
deve ser adequado para que não ocorra precipitação de proteínas muito pronunciada, o
que dificulta a homogeneização. Diante disso, o volume adicionando foi de 50 uL de
uma solução de 4 ug/mL de Diazepam.
O líquido extrator é utilizado para extrair o fármaco e seu padrão interno da
matriz aquosa para o solvente orgânico. A volume de 1000 uL é adequado (5 vezes o
volume de plasma humano) pois uma volume menor do que esse pode ser saturado
com o Zolpidem e um volume maior pode não ter homogeneização adequada. O
solvente orgânico que apresentou melhores resultados de reprodutibilidade e
recuperação foi o hexano/acetato de etila (50:50 v/v).
Por fim este método foi testado através da análise de uma exatidão e submetido
à validação analítica conforme a RE 899 da ANVISA.
5.2 Validação do Método Bioanalítico
A partir deste ponto, serão apresentados os resultados obtidos durante a
validação da metodologia bioanalítica de Zolpidem em plasma humano utilizando como
padrão interno o Diazepam.
Estes resultados foram preparados para contemplar a validação pré-estudo que
inclui os parâmetros de seletividade, linearidade, precisão, exatidão e recuperação,
além de definir parâmetros de estudos como: limite de quantificação, concentração dos
padrões de calibração e das amostras de controle de qualidade, e também determinar
a estabilidades das amostras tanto em solução quanto em plasma humano.
5.2.1. Validação Pré-estudo
Os padrões de referência utilizados durante esta validação estavam dentro do
prazo de validade permitido pelo fabricante.
5.2.2 Seletividade
Para o teste da seletividade foram feito análises de amostra de plasma branco
de seis indivíduos, sendo quatro amostras normais, uma lipêmica e outra hemolisada,
36
com os respectivos lotes: 10427/4; 42931/6; 48934/6; 52536/3; 55295/1 E 17591/11,
obtidos no Hospital Universitário São Francisco (HUSF).
As amostras foram analisadas através do procedimento de extração e condições
cromatográficas adequadas, no intuito de identificar a presença de interferentes no
tempo de retenção do Zolpidem (0,84 min.) e do Diazepam (1,13 min.), quando
comparados com uma solução aquosa do fármaco na concentração próxima ao limite
de quantificação e do padrão interno próximo da sua concentração final.
Logo abaixo serão demonstrados os cromatogramas de um plasma normal
(Figura 24), um lipêmico (Figura 25) e um hemolisado (Figura 26).
A)
B)
Figura 24 – A) Plasma branco normal lote 10427/4, cromatograma referente ao
zolpidem. B) plasma branco normal lote 10427/4, cromatograma referente ao padrão
interno.
10:01:26
11-Mar-2008
Lote: 10427/4
Time
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
%
0
100
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
%
0
100
Seletividade_01 Sm (Mn, 3x2) 1: MRM of 1 Channel ES+
308.211 > 235.317
255
Area
Seletividade_01 Sm (Mn, 3x2) 2: MRM of 1 Channel ES+
285.11 > 154.07
85.2
Area
37
A)
B)
Figura 25 – A) Plasma branco lipêmico lote 55295/1, cromatograma referente ao
zolpidem. B) Plasma branco lipêmico lote 55295/1, cromatograma referente ao padrão
interno.
10:12:02
11-Mar-2008
Lipemico: 55295/1
Time
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
%
0
100
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
%
0
100
Seletividade_05 Sm (Mn, 3x2) 1: MRM of 1 Channel ES+
308.211 > 235.317
150
Area
Seletividade_05 Sm (Mn, 3x2) 2: MRM of 1 Channel ES+
285.11 > 154.07
86.6
Area
38
A)
B)
Figura 26 – A) Plasma branco hemolisado lote 17591/11, cromatograma referente ao
zolpidem. B) Plasma branco hemolisado lote 17591/11, cromatograma referente ao
padrão interno.
Figura 27 – Solução aquosa de Zolpidem na concentração de 1,0 ng/ml (concentração
do limite de quantificação).
10:14:41
11-Mar-2008
Hemolisado: 17591/11
Time
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
%
0
100
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
%
0
100
Seletividade_06 Sm (Mn, 3x2) 1: MRM of 1 Channel ES+
308.211 > 235.317
140
Area
Seletividade_06 Sm (Mn, 3x2) 2: MRM of 1 Channel ES+
285.11 > 154.07
94.4
Area
10:28:15
11-Mar-2008Zolpidem 1 ng/mL
Time
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
%
0
100
Solucao_LQ_02 Sm (Mn, 3x2) 1: MRM of 1 Channel ES+
308.211 > 235.317
1.06e3
Area
0.88
146
39
Figura 28 – Solução aquosa de Diazepam na concentração de 250,0 ng/ml
(concentração final de padrão interno na amostra extraída).
Os cromatogramas demonstraram que não foram encontradas interferências
significativas nos tempos de retenção do Zolpidem e do Diazepam.
5.2.3 Determinação do limite de quantificação (LQ)
A determinação do limite de quantificação foi feita levando em consideração a
sensibilidade, seletividade, precisão e exatidão pretendidas para o método bioanalítico.
Isso foi feito através da análise de concentrações decrescentes do fármaco até o
menor nível quantificável com precisão e exatidão adequados para o método
bioanalítico.
O limite de quantificação foi definido seguindo alguns parâmetros.
A resposta de pico para o LQ deve ser no mínimo de 5 vezes maior do que
qualquer interferente presente na amostra branco no mesmo tempo de retenção. O
pico resposta do Zolpidem de LQ deve ser identificável e reprodutível com uma
precisão de até 20% e uma exatidão entre 80-120% em relação à concentração
nominal, isso deve ser analisado com no mínimo cinco amostras de padrões.
Seguindo esses critérios, chegamos que o nosso limite de quantificação foi de
1,0 ng/mL.
10:44:14
11-Mar-2008
Diazepam 250 ng/mL
Time
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
%
0
100
Solucao_PI_03 Sm (Mn, 3x2) 2: MRM of 1 Channel ES+
285.11 > 154.07
6.36e4
Area
1.13
11691
40
5.2.4. Linearidade
Alguns parâmetros foram seguidos para a determinação da linearidade.
O desvio deve ser menor ou igual a 20% em relação à concentração nominal do
LQ em pelo menos duas das triplicatas e, menor ou igual a 15% em relação à
concentração nominal das demais concentrações da curva e também em pelo menos
duas das triplicatas. Das seis concentrações da curva de calibração, quatro devem
obedecer aos parâmetros acima descritos, incluindo o LQ e o ponto de maior
concentração da curva. E por último, o coeficiente de correlação deve ser maior ou
igual a 0,98.
As médias dos valores das linearidades estão representadas na Figura 29 e as
curvas de calibração na Tabela 3.
Figura 29 – Resultados da média das linearidades.
Tabela 3 – Equações da curva de calibração das três linearidades:
EQUAÇÃO DA CURVA DE
CALIBRAÇÃO
Equação da curva de calibração 1 y = 0,0070314x + 0,00112405 r = 0,997056
Equação da curva de calibração 2 y = 0,00700969x +
0,000441207 r = 0,997472
Equação da curva de calibração 3 y = 0,00662828x +
0,00155335 r = 0,996869
41
5.2.5 Precisão e exatidão
Na avaliação da precisão e exatidão foram analisadas quatro concentrações
diferentes dentro da faixa de linearidade. Elas também foram analisadas dentro de um
mesmo lote (intra-lote) e em lotes diferentes (inter-lotes).
5.2.5.1 Intra-lote
Para a avaliação da precisão e exatidão intra-lote foi utilizado um lote que
continha uma curva de calibração e cinco controles de cada.
Para ser considerado aprovado, o coeficiente de variação (CV) dos controles de
qualidade alto (CQA), médio (CQM) e baixo (CQB) não deve exceder 15% e para o LQ,
não mais que 20%.
Os resultados para o plasma normal estão apresentados na Figura 30, para o
plasma lipêmico na Figura 31 e para o hemolisado na Figura 32.
Figura 30 – Resultados das análises intra-lote em plasma normal.
42
Figura 31 – Resultados das análises intra-lote em plasma lipêmico.
Figura 32 – Resultados das análises intra-lote em o plasma hemolisado.
43
5.2.5.2 Inter-lotes
Foram utilizados os mesmo critérios de avaliação da intra-lote.
Os resultados das análises inter-lote estão apresentados na Figura 33.
Figura 33 – Resultados das análises inter-lote.
5.2.6 Validação da diluição
A validação da diluição tem por finalidade garantir que pontos que acima do
ponto mais alto da curva de calibração apresentem resultados precisos e exatos. Para
avaliar isso, foram feitos controles de qualidades diluídos com plasma branco na
proporção de 1:1 (v/v).
As Figuras 34 e 35 apresentam os resultados da exatidão intra e inter lote
respectivamente. Avaliados pelos mesmos parâmetros da precisão e exatidão,
podemos verificar que os resultados estão dentro dos limites aceitáveis.
44
Figura 34 – Resultados das análises intra-lote.
Figura 35 – Resultados das análises inter-lote.
5.2.7 Recuperação
A recuperação é calculada através da comparação das áreas dos picos do
fármaco (controles de qualidade alto, médio e baixo) das amostras extraídas do plasma
com as áreas dos picos do fármaco preparados em solução. O mesmo procedimento é
feito para o padrão interno, onde foi utilizada uma solução de 250,0 ng/mL.
45
A Figura 36 demonstra a recuperação encontrada para o Zolpidem e o Diazepam.
Figura 36 – Resultados da recuperação.
5.3 Estabilidades
Os critérios utilizados para a avaliação das estabilidades são os mesmos da
precisão e exatidão.
5.3.1 Estabilidade de curta duração
5.3.1.1 Estabilidade no tempo e condições de análise
Para este teste, as amostras foram mantidas dentro do auto-injetor e mantidas a
temperatura ambiente de 22,9
o
C, os controles de qualidade (CQA, CQM e CQB) foram
analisados em triplicata nos tempos 0, 2, 4, 6, 8 e 10 horas.
Os resultados apresentados na Figura 37, demonstra as variações dos controles
de qualidades entre o tempo de 0 e 10 horas de análise.
46
Figura 37 – Resultados da estabilidade em tempo e condições de análise entre o
tempo 0 h e 10 h.
5.3.1.2. Estabilidade do fármaco em ciclos de congelamento e degelo
Para a avaliação da estabilidade do Zolpidem durante o congelamento e degelo
da amostra, foram analisadas cinco amostras de cada controle de qualidade da
seguinte maneira: as amostras foram congeladas a -70
o
C e mantidas por 24 horas,
após isso elas foram submetidas ao descongelamento natural a temperatura ambiente,
em seguida, extraídas e analisadas, caracterizando o degelo 1; o mesmo procedimento
foi repetido mais duas vezes, caracterizando o degelo 2 e 3.
Os resultados das variações das médias dos controles de qualidades para cada
ciclo de degelo estão demonstrados na Figura 38.
47
Figura 38 – Resultados da estabilidade entre os ciclos de degelo.
5.3.1.3 Estabilidade das amostras de plasma não processadas
Nesta estabilidade foram analisadas amostras de controle de qualidade recém-
preparadas e outras após seis horas de bancada a temperatura ambiente. Os
resultados das variações dos controles de qualidades estão demonstrados na Figura
39.
48
Figura 39 – Resultados da estabilidade das amostras não processadas.
5.3.1.4 Estabilidade de soluções padrão
Para a estabilidade das soluções padrão, foi utilizada uma solução de 100,0
ng/mL para o Zolpidem e Diazepam, elas foram analisadas recém-preparadas, após
seis horas a temperatura ambiente e depois de sete dias de preparo armazenadas em
geladeira, após isso foram comparadas as áreas dos picos do Zolpidem e Diazepam.
A variação encontrada nos controles de qualidade após essas três análises são
demonstradas na Figura 40.
49
Figura 40 – Resultados da estabilidade das soluções padrão para Zolpidem e
Diazepam.
5.3.1.5 Estabilidade de longa duração
Para a avaliação da estabilidade de longa duração, o tempo de armazenamento
de exceder o intervalo de tempo que compreenda a primeira coleta de amostra, que foi
em 07/09/07, e a análise da última amostra de voluntários, que foi em 25/03/08. Foram
analisados os controles de qualidades após 201 dias de armazenamento a -70°C. Na
Figura 41, esta demonstrada a variação dos controles de qualidade.
50
Figura 41 – Resultados da estabilidade de longa duração.
51
6. CONCLUSÃO
A metodologia desenvolvida demonstrou-se adequada para análise de Zolpidem
em plasma humano. Durante a validação pode ser verificado que a extração se
mostrou eficiente para a extração de Zolpidem em plasma humano. Como em estudos
de farmacocinética e bioequivalência são analisadas muitas amostras, necessita-se de
um método rápido, e com o tempo tal de 2,00 minutos de corrida esse se demonstrou
adequado.
A validação da metodologia preencheu todos os critérios estabelecidos pela RE
nº 899, de 29 de maio de 2003.
Na seletividade não ocorreram interferências nos tempos de retenção do
fármaco ou estas foram menores que 20% da resposta do padrão LQ e para o padrão
interno foram menores que 5% que a concentração utilizada nos teste. Quanto a
sensibilidade, a menor concentração da curva de calibração foi aceito com um CV <
20%. Para a precisão o coeficiente de variação (CV) encontrado para os controles de
qualidade CQB, CQM e CQA foram inferiores ou iguais a 15% e inferiores ou iguais a
20% para o controle de qualidade LQ. No caso da exatidão, foi encontrado para o
controle de qualidade LQ e para os controles de qualidade CQB, CQM e CQA
apresentaram valores compreendidos dentro do desvio de ±20% e ±15%,
respectivamente, em relação ao valor nominal.
Para as estabilidades no tempo e condições de análise, os resultados obtidos
estão inferiores ao desvio permitido de ±15% para os três controles de qualidade
analisados e, portanto, as amostras permaneceram estáveis dentro do auto-injetor
durante o período de 10 horas. Durante a estabilidade do fármaco em ciclos de
congelamento e degelo, foram analisados controles de qualidade, diante disso o
Zolpidem analisado no plasma humano é estável nos três ciclos de congelamento e
degelo quando armazenadas a -70
o
C pois os CV se mostraram inferiores ao permitido
na legislação. A estabilidade das amostras de plasma não processadas, após 6 horas a
temperatura ambiente foi verificado que sua variação não foram superiores a 15%,
sendo assim, as amostras permaneceram estáveis.
52
Conclui-se que esse método é adequado para a análise de Zolpidem em plasma
humano, visto que o mesmo cumpriu todos os parâmetros estabelecidos pela
legislação vigente.
53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Genéricos. Disponível em <www.progenericos.org.br>. Acesso em 30 de agosto
de 2009 a 20 horas.
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o
135. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária
aprova “Regulamento Técnico Para Medicamentos Genéricos”. Diário Oficial da
União, Poder Executivo, Brasília, 29 mai. 2003
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Fármacos e Medicamentos. Universidade de São Paulo. São Paulo/SP. 2005.
8. PEREIRA, A. S.; BICALHO, B.; LILLA, S.; NUCCI, G.; Desafios Da Química
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Vol. 28, Suplemento, S107-S111, 2005.
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