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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE NEUROQUÍMICA MOLECULAR E CELULAR
Atividade citotóxica de lignanas dibenzilbutirolactonas de Ficus
citrifolia (Moraceae) em células C6 de glioma de rato
Ana Cristina Baetas Gonçalves
Belém- 2008
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Ana Cristina Baetas Gonçalves
Atividade citotóxica de lignanas dibenzilbutirolactonas de Ficus
citrifolia (Moraceae) em células C6 de glioma de rato
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Ciências Biológicas da Universidade Federal do
Pará, como requisito parcial para obtenção do grau
de doutor em Neurociência e Biologia Celular. Área
de concentração: Biologia Celular.
Orientador: Prof. Dr. José Luiz Martins do
Nascimento
Co-orientador: Profa. Dra. Mara Sílvia Pinheiro
Arruda
Belém- 2008
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Ana Cristina Baetas Gonçalves
Atividade citotóxica de lignanas dibenzilbutirolactonas de Ficus
citrifolia (Moraceae) em células C6 de glioma de rato
Belém, 22 de agosto de 2008
BANCA EXAMINADORA:
___________________________________
Prof. Dr. José Luiz Martins do Nascimento
Orientador
___________________________________
Profa. Dra. Mara Sílvia Pinheiro Arruda
Co- orientador
___________________________________
Prof. Dr. Renato Augusto Damatta
___________________________________
Prof. Dr. Adolfo Henrique Müller
(CESUPA)
___________________________________
Prof. Dr. Alberto Cardoso Arruda
___________________________________
Prof. Dr. Fernando Alan de Farias Rocha
AGRADECIMENTOS
Mais árduo que realizar este trabalho é encontrar palavras certas para agradecer às
pessoas especiais que fazem parte da minha vida, e sem as quais eu jamais teria chegado até
aqui. Através destas páginas simbólicas, deixo registrado meu profundo agradecimento:
A Deus, pela vida, proteção e por proporcionar-me diferentes caminhos, dando-me
sempre oportunidades de escolha e guiando-me através delas.
Aos meus pais, Antonio Baetas Oliveira e Iraneide Baetas, pela contribuição na
formação do meu caráter, pelo amor incondicional, apoio, incentivo e dedicação da vida toda.
A minha filha, Ana Camila, pela alegria sem fim que sua existência proporciona em
minha vida, pela oportunidade de me fazer sentir o valor de ser mãe, pela agradável
convivência, pelos beijinhos e sorrisos, que tantas vezes abrandaram o meu cansaço e me
deram forças para continuar. Na verdade um presente que Deus, em Sua imensa bondade,
colocou na minha vida. “Seja sempre o meu melhor presente”.
Ao meu marido, Wander Gonçalves, pela compreensão nos momentos em que minha
ausência era necessária, pela confiança depositada, pela paciência, bondade e apoio durante
todos esses anos.
Ao meu grande amigo Manuel Joaquim Oliveira, pela amizade incondicional, pela
valiosa ajuda nos problemas encontrados na área de informática e por todo o apoio durante a
realização deste trabalho.
As amigas Lívia Trindade Lobo, Mariana Sarkis Müller e Maria do Socorro Oliveira,
pela amizade sincera, dias agradáveis de convivência e pelo ombro amigo nos momentos
difíceis.
Aos meus irmãos pelo apoio e incentivo a continuar esta jornada.
Ao Prof. Dr. José Luiz Martins do Nascimento, pela orientação, paciência e
aprendizado científico.
A Prof.ª Dra. Mara Sílvia Pinheiro Arruda, pela orientação, ensinamento, amizade e
principalmente pelo incentivo e apoio para que este trabalho fosse realizado.
A Prof.ª Dra. Eliana Ozela, pela grande amizade nesses últimos anos, pela convivência
inesquecível e maravilhosa no laboratório e pelo grande incentivo durante toda a elaboração
deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Alberto Cardoso Arruda, pela ajuda na elaboração do projeto, amizade,
incentivo e ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Rommel Burbano, pelos ensinamentos, pela disponibilidade do
Microscópio de fluorescência.
Ao Prof. Dr. Anderson Herculano, pelos ensinamentos, amizade e valiosas
contribuições, que fizeram grandes diferenças na realização dos experimentos.
A Prof.ª Dra. Edilene Oliveira da Silva, pela disponibilidade e apoio em atividades
desenvolvidas em seu laboratório, pelo incentivo e ajuda nos experimentos de Microscopia
eletrônica.
Aos professores: Dr. Adolfo Henrique Müller, Dra. Giselle M. S. Pinheiro Guilhon,
Dr. Lourivaldo da Silva Santos, Dr. Milton N. da Silva pelos ensinamentos que me foram
transmitidos ao longo da minha formação.
Ao funcionário e amigo Marçal de Souza Luna pela obtenção dos espectros.
Ao amigo Luis Antonio Maués, pelos ensinamentos transmitidos para realização deste
trabalho, pela amizade e grande ajuda na realização dos experimentos.
Aos bolsistas de iniciação científica, hoje farmacêuticos, Renne Roberto Soares Vieira
e Luis Fabio dos Santos Gomes, pela ajuda incondicional na realização deste trabalho, pela
grande amizade construída nesses anos e pela agradável companhia.
As amigas Karen Renata Matos de Oliveira e Barbarella de Matos Macchi, pela
convivência e momentos inesquecíveis no laboratório.
A amiga Ana Paula Drummond Rodrigues, pela grande ajuda com os experimentos de
Microscopia eletrônica.
A todos os funcionários, amigos e colegas do Laboratório de Neuroquímica Celular e
Molecular e do Laboratório de Química Pesquisa, pela colaboração no desenvolvimento deste
trabalho.
Ao Laboratório de Neuroquímica Celular e Molecular e Laboratório de Química
Pesquisa, Laboratório de Biologia Celular e Laboratório de Microscopia Eletrônica, pela
disponibilidade da estrutura para realização de parte deste trabalho.
Ao Programa de Pós Graduação em Biologia da Universidade Federal do Pará, por ter
proporcionado a realização desta minha formação acadêmica e científica.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e ao
FUNTEC pelo apoio financeiro.
E, finalmente, agradeço a todas as pessoas que, embora não citadas, me
acompanharam durante a realização deste trabalho.
Muito obrigada!
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Antonio e Iraneide Baetas; pelo amor eterno e inigualável, estímulo a
continuar abrindo caminhos na minha vida; pela dedicação sem limites e carinho sem
comparação; pelos exemplos de caráter, bondade e perseverança. A vocês dedico este
trabalho, pela imensurável felicidade e satisfação que vocês me proporcionam, simplesmente
em serem como são. Serei eternamente agradecida ao grande apoio durante toda essa jornada.
À Prof.ª Dra. Mara Sílvia Pinheiro Arruda; pelo exemplo de dedicação profissional na
minha vida acadêmica; pelo grande apoio e estímulo; pelas sábias palavras de conforto, que
por muitas vezes abrandaram as dificuldades do percurso. Como diz Santuza Abras: “Ser
professor é importar-se com o outro, numa dimensão de quem cultiva uma planta muito rara
que necessita de atenção, amor e cuidado... é ter a capacidade de sair de cena, sem sair do
espetáculo”.
Muito obrigada!
Jamais considere seus estudos como uma
obrigação, mas como uma oportunidade
invejável para aprender a conhecer a
influência libertadora da beleza do reino
do espírito, para seu próprio prazer
pessoal e para proveito da comunidade à
qual seu futuro trabalho pertencer.
Albert Einstein
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.........................................................................................
LISTA DE TABELAS........................................................................................
LISTA DE QUADROS.......................................................................................
LISTA DE ABREVIATURAS, SIMBOLOS E SIGLAS................................
RESUMO.............................................................................................................
ABSTRACT.........................................................................................................
1 INTRODUÇÃO................................................................................................
22
1.1 Considerações sobre o gênero Ficus.......................................................
26
1.1.1 Atividades Biológicas no gênero.......................................................
33
1.2 Ficus citrifolia...........................................................................................
34
1.2.1 Classificação botânica da espécie.....................................................
35
1.2.2 Características botânicas..................................................................
35
1.2.3 Habitat...............................................................................................
37
1.2.4 Usos....................................................................................................
37
1.3 Considerações sobre a classe de substâncias isoladas (lignóides)..........
38
1.3.1 Atividades biológicas de algumas lignanas.......................................
38
1.3.2 Metabolismo secundário e biossíntese de lignanas...........................
45
1.4 Câncer e apoptose....................................................................................
50
1.5 Gliomas.....................................................................................................
66
2 OBJETIVOS....................................................................................................
70
2.1 Geral..........................................................................................................
70
2.2 Específicos.................................................................................................
70
3 PARTE EXPERIMENTAL............................................................................
71
3.1 Materiais e métodos...................................................................................
71
3.2 Avaliação Fitoquímica
73
3.2.1 Coleta e identificação da planta........................................................
73
3.2.2 Obtenção dos extratos brutos............................................................
73
3.2.3 Fracionamento do extrato diclorometânico das folhas de Ficus
ciitrifolia................................................................................................................
74
3.2.3.1 Estudo da fração EDFFC-3........................................................
75
3.2.3.2 Estudo da fração EDFFC-6 .......................................................
75
3.2.4 Obtenção de derivados.......................................................................
78
3.2.4.1 Acetilação de S2 arctigenina......................................................
78
3.3 Avaliação Biológica..................................................................................
78
3.3.1 Cultivo da linhagem C6 de glioma de rato........................................
78
3.3.2 Cultivo da cultura primária de astrócito de rato...............................
79
3.3.3 Plaqueamento das células C
6
.............................................................
79
3.3.4 Tratamento com as substâncias isoladas...........................................
80
3.3.5 Avaliação do Efeito antiproliferativo (Método: Incorporação de
3
H-
Timidina)...............................................................................................................
80
3.3.6 Teste de Viabilidade Celular .............................................................
81
3.3.7 Caracterização da Morfologia Nuclear.............................................
82
3.3.8 Avaliação da linhagem C6 por Microscopia eletrônica de
transmissão...........................................................................................................
82
3.3.9 Análise Estatística.............................................................................
83
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES..................................................................
84
4.1 Resultados obtidos na avaliação fitoquímica
84
4.1.1 Determinação e identificação estrutural das substâncias isoladas...
84
4.1.1.1 Determinação estrutural de S1 (arctiina).....................................
84
4.1.1.2 Determinação estrutural de S2 (arctigenina)...............................
93
4.1.1.3 Determinação estrutural de S3 (matairesinol).............................
102
4.2 Resultados obtidos na avaliação biológica.............................................
109
4.2.1 Determinação do efeito antiproliferativo através do método da
incorporação de
3
H-timidina.................................................................................
109
4.2.2 Determinação da atividade citotóxica através da viabilidade celular
110
4.2.2.1 Atividade citotóxica em cultura de células C6 (glioma de rato)..
110
4.2.2.2 Atividade citotóxica em células normais (astrócitos).................
112
4.2.3 Análise da morfologia celular (Hoechst 33342)................................
115
4.2.4 Análise Ultraestrutural de células C6 de glioma de rato através de
Microscopia Eletrônica de Transmissão...............................................................
117
4.2.4.1 Análise Ultraestrutural de células C6 de glioma de rato, tratadas
com arctigenina......................................................................................................
117
4.2.4.2 Análise Ultraestrutural da Linhagem C6 de Glioma de rato tratada
com matairesinol........................................................................................
120
1
5 CONCLUSÕES................................................................................................
122
6 ANEXOS..........................................................................................................
124
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................
171
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1.
Estrutura química das substâncias isoladas.......................................
26
FIGURA 2.
Constituintes químicos isolados de Ficus asprima, Ficus hispida e
Ficus carica.......................................................................................
27
FIGURA 3.
Constituintes químicos isolados de Ficus eriobtroyoides, Ficus
cunnghamii e Ficus sycomorus........................................................
28
FIGURA 4.
Constituinte químico isolado de Ficus insipida................................
28
FIGURA 5.
Constituintes químicos isolados de Ficus infectoria.........................
29
FIGURA 6.
Constituintes químicos isolados de Ficus maxima ...........................
30
FIGURA 7.
Constituintes químicos isolados de Ficus gomelleira ......................
32
FIGURA 8.
Constituintes químicos isolados de Ficus septica.............................
33
FIGURA 9.
Ficus citrifolia...................................................................................
34
FIGURA 10.
Folhas, caule, látex e frutos de Ficus citrifolia.................................
36
FIGURA 11.
Localização geográfica da espécie Ficus citrifolia nas Américas.....
37
FIGURA 12.
Estrutura química de algumas lignanas com atividades biológicas
comprovadas..................................................................................
39
FIGURA 13.
Estrutura química de algumas substâncias consideradas
fitoestrogênicas................................................................................
42
FIGURA 14.
Estrutura química do estradiol ........................................................
42
FIGURA 15.
Esquema de transformação de lignanas vegetais em lignanas
primárias de mamíferos por bactérias no intestino............................
43
FIGURA 16.
Via do ácido chiquímico para biossíntese de α-aminoácidos............
46
FIGURA 17.
Principais compostos fenólicos derivados da enzima fenilalanina
amônio liase (PAL)............................................................................
47
FIGURA 18.
Formação dos álcoois p-cumarílico, coniferílico e sinapílico, a partir
do ácido cinâmico....................................................................
48
FIGURA 19.
Formação de unidades radicalares que darão origem às lignanas e
neolignanas........................................................................................
48
FIGURA 20.
Rota Biosintética para as lignanas arctiina, arctigenina e
matairesinol.......................................................................................
49
FIGURA 21.
Célula eucariótica normal..................................................................
50
FIGURA 22.
Etapas de formação de tumor............................................................
51
FIGURA 23.
Metástase..........................................................................................
52
FIGURA 24.
Estrutura do DNA..............................................................................
53
FIGURA 25.
Mecanismos de morte celular: necrose e apoptose...........................
57
FIGURA 26.
As duas principais vias apoptóticas...................................................
60
FIGURA 27.
Estruturas químicas de substâncias encontradas em produtos naturais
e que são capazes de induzir apoptose.................................
61
FIGURA 28.
Tipos de câncer mais incidentes, estimados para 2008, na população
brasileira, sem pele não melanoma..................................
62
FIGURA 29.
Estrutura química de fármacos com atividade antitumoral...............
65
FIGURA 30.
Neurônio e células que formam a glia: astrócitos, microglia,
oligodendrócitos e epêndima............................................................
66
FIGURA 31.
Histologia de gliomas........................................................................
68
FIGURA 32.
Fluxograma de obtenção dos extratos brutos das folhas de Ficus
citrifolia.............................................................................................
76
FIGURA 33.
Fluxograma do fracionamento do extrato diclorometânico das folhas
de Fícus citrifolia....................................................................
77
FIGURA 34.
Esqueleto básico de lignanas dibenzilbutirolactonas........................
86
FIGURA 35.
Esqueletos de estruturas prováveis para S1, S2 e S3, com base nos
possíveis padrões de oxidação dos anéis aromáticos........................
86
FIGURA 36.
Prováveis estruturas para S1..............................................................
87
FIGURA 37.
Estrutura da Arctiina (S1)..................................................................
89
FIGURA 38.
Prováveis estruturas para S2..............................................................
94
FIGURA 39.
Estrutura da arctigenina acetilada (S2Ac).........................................
96
FIGURA 40.
Estrutura da Arctigenina (S2)............................................................
97
FIGURA 41.
Prováveis estruturas para S3..............................................................
104
FIGURA 42.
Estrutura do matairesinol (S3)...........................................................
105
FIGURA 43.
Gráfico da incorporação
3
H-timidina pela linhagem de C6, após
tratamento com matairesinol e arctigenina, nas concentrações de
1µM e 10µM, no tempo de 24 horas.................................................
109
FIGURA 44.
Gráfico da viabilidade celular de C6, intoxicadas com matairesinol e
arctigenina, em diferentes concentrações.......................................
110
FIGURA 45.
Gráfico da viabilidade celular de C6, intoxicadas com matairesinol e
arctigenina, em diferentes intervalos de tempo..............................
112
FIGURA 46.
Gráfico da viabilidade celular de astrócitos de rato, intoxicados com
arctigenina e matairesinol, em diferentes concentrações........
113
FIGURA 47.
Gráfico de comparação da viabilidade celular entre a cultura de
astrócitos (córtex de rato) e linhagem C6 de glioma de rato,
intoxicadas com arctigenina, em diferentes concentrações
114
FIGURA 48.
Gráfico de comparação da viabilidade celular entre a cultura de
astrócitos (córtex de rato) e linhagem C6 de glioma de rato,
intoxicadas com matairesinol, em diferentes concentrações.................
114
FIGURA 49.
Visualização dos núcleos da linhagem C6 de glioma de rato,
marcados com Hoechst 33342...........................................................
116
FIGURA 50
Análise, em Microscopia Eletrônica de Transmissão, de células da
linhagem C6............
118
FIGURA 51
Análise, em Microscopia Eletrônica de Transmissão, de células da
linhagem C6 tratados com 50 e 250µM de arctigenina......................
119
FIGURA 52
Análise, em Microscopia Eletrônica de Transmissão, de células da
linhagem C6 tratados com 50 e 250 µM de matairesinol.....................
121
FIGURA 53.
Espectro de RMN
1
H (300 MHz, CD
3
OD) da arctiina (S1)..............
124
FIGURA 54.
Expansão do espectro de RMN
1
H (300 MHz, CD
3
OD) da arctiina
(S1).......................................................................................................
125
FIGURA 55.
Expansão do espectro de RMN
1
H (300 MHz, CD
3
OD) da arctiina
(S1).......................................................................................................
126
FIGURA 56.
Espectro de RMN
13
C (75 MHz, CD
3
OD) da arctiina (S1).................
127
FIGURA 57.
Expansão do Espectro de RMN
13
C (75 MHz, CD
3
OD) da arctiina
(S1)....................................................................................................
128
FIGURA 58.
Espectro de DEPT (75 MHz, CD
3
OD) da arctiina (S1)....................
129
FIGURA 59.
Espectro de HETCOR (
1
J
HC
) de arctiina (S1)...................................
130
FIGURA 60.
Expansão do espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctiina (S1)..............
131
FIGURA 61.
Expansão do espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctiina (S1)..............
132
FIGURA 62.
Expansão do espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctiina (S1).............
133
FIGURA 63.
Espectro de COSY
1
H x
1
H da arctiina (S1)......................................
134
FIGURA 64.
Expansão do espectro de COSY
1
H x
1
H da arctiina (S1).................
135
FIGURA 65.
Expansão do espectro de COSY
1
H x
1
H da arctiina (S1).................
136
FIGURA 66.
Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctiina (S1).................
137
FIGURA 67.
Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctiina (S1).................
138
FIGURA 68.
Espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctiina (S1).....................................
139
FIGURA 69.
Espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) da arctigenina (S2)........
140
FIGURA 70.
Expansão do espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) da arctigenina
(S2)...................................................................................
141
FIGURA 71.
Espectro de RMN
13
C (75 MHz, CDCl
3
) da arctigenina (S2)............
142
FIGURA 72.
Espectro de DEPT da arctigenina (S2)..............................................
143
FIGURA 73.
Espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctigenina (S2).............................
144
FIGURA 74.
Expansão do espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctigenina (S2).........
145
FIGURA 75.
Expansão do espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctigenina (S2).........
146
FIGURA 76.
Espectro de COSY
1
H x
1
H da arctigenina (S2)................................
147
FIGURA 77.
Expansão do espectro de COSY
1
H x
1
H da arctigenina (S2)...........
148
FIGURA 78.
Expansão do espectro de COSY
1
H x
1
H da arctigenina (S2)..........
149
FIGURA 79.
Espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3)
da arctigenina acetilada
(S2Ac)................................................................................................
150
FIGURA 80.
Espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctigenina (S2)................................
151
FIGURA 81.
Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctigenina (S2)...........
152
FIGURA 82.
Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctigenina (S2)...........
153
FIGURA 83.
Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctigenina (S2)...........
154
FIGURA 84.
Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctigenina (S2)...........
155
FIGURA 85.
Espectro de NOE diff da arctigenina (S2), com irradiação no sinal
das metoxilas em δ
H
3,81.................................................................
156
FIGURA 86.
Espectro de NOE diff da arctigenina (S2), com irradiação no sinal do
hidrogênio H-2’ em δ
H
6,62........................................................
157
FIGURA 87.
Espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) do matairesinol (S3)......
158
FIGURA 88.
Expansão do espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) do
matairesinol (S3)...............................................................................
159
FIGURA 89.
Expansão do espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) do
matairesinol (S3)...............................................................................
160
FIGURA 90.
Espectro de RMN
13
C (75 MHz, CDCl
3
) do matairesinol (S3).........
161
FIGURA 91.
Espectro de COSY
1
H x
1
H do matairesinol (S3)..............................
162
FIGURA 92.
Expansão do espectro de COSY
1
H x
1
H do matairesinol (S3)........
163
FIGURA 93.
Espectro de NOE diff do matairesinol (S3).....................................
164
FIGURA 94.
Espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) do matairesinol (S3)............................
165
FIGURA 95.
Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) do matairesinol (S3).
166
FIGURA 96.
Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) do matairesinol (S3).
167
FIGURA 97.
Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) do matairesinol (S3).
168
FIGURA 98.
Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) do matairesinol (S3).
169
FIGURA 99.
Espectro de HETCOR (
1
J
HC
) do matairesinol (S3)............................
170
LISTA DE TABELAS
TABELA 1.
63
TABELA 2.
64
TABELA 3.
90
TABELA 4.
91
TABELA 5.
92
TABELA 6.
98
TABELA 7.
99
TABELA 8.
100
TABELA 9.
101
TABELA 10.
106
TABELA 11.
107
TABELA 12.
108
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1.
Classificação botânica de Ficus citrifolia...................................
35
QUADRO 2.
Alguns exemplos de lignanas com atividades biológicas
comprovadas................................................................................
39
QUADRO 3.
Atividades biológicas, já comprovadas cientificamente, das lignanas
isoladas.........................................................................
44
QUADRO 4
Grupos de frações obtidas da CCDC do extrato diclorometânico das
folhas de Ficus citrifolia............................
74
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS
AIF
Fator Indutor de Apoptose
CCDC
Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
CCDP
Cromatografia em Camada Delgada Preparativa
CCVU
Cromatografia de Coluna por Via Úmida
COSY
Correlated Spectroscopy
d
Dupleto
dd
Duplo dupleto
DEPT
Distortionless Enhancement by Polarization Tranfer
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium
DMSO
Dimetilsulfóxido
DNA
Ácido desoxirribonucléico
EDFFC
Extrato Diclorometânico das Folhas de Ficus citrifolia
EDTA
Ácido etilenodiaminotetracético
et al
e colaboradores (et alii)
Fig.
Figura
g
Grama
GST
Genes Supressores de tumor
h
Hora
HETCOR
Heteronuclear Correlation Spectroscopy
HIV
Human Immunodeficiency Vírus
HL-60
Linhagem de células leucêmicas
HMBC
Heteronuclear Multiple Bond Correlation
Hz
Hertz
IAP
Inhibitor of Apoptosis Protein (Proteína Inibidora de Apoptose)
INCA
Instituto Nacional do Câncer
J
Constante de acoplamento
m
Multipleto
Me
Metila
MHz
Megahertz
mM
Milimolar
MTT
3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium
NOE
Nuclear Overhauser Enhancement (Efeito Overhauser Nuclear)
OMe
Metoxila
p.
Página
PAL
Fenilalanina Amônia Liase
PBS
Phosphate Buffer Solution (Tampão fosfato)
POP
2,5 difenioxazole
POPOP
1,4 bis[2-(5-feniloxazolil)]benzeno
Pyr-D5
Piridina deuterada
q
Quarteto
RMN
Ressonância Magnética Nuclear
RMN
1
H
Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio 1
RMN
13
C
Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
s
Singleto
TAL
Tirosina Amônia Liase
TBS
Tris Buffer Solution (Tampão Tris)
TNF
Tumor necrosis factor (Fator de necrose tumoral)
TNFR
Tumor necrosis factor receptor (Receptor do fator de necrose tumoral)
UDPG
Difosfato de glicosil uridina
UV
Ultravioleta
µM
Micromolar
µL
Microlitro
δ
Deslocamento Químico
°C
Graus Celsius
Ci
Microcurie
RESUMO
O presente trabalho descreve o primeiro estudo fitoquímico da espécie Ficus citrifolia
(Moraceae) e a atividade citotóxica das substâncias isoladas. As espécies do gênero Ficus são
conhecidas vulgarmente com o nome de figueiras. Este gênero é constituído por cerca de 750-
800 espécies, distribuídas principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, e
destas, 64 são referidas para o Brasil. A investigação fitoquímica do extrato diclorometânico
das folhas deste espécime, forneceu três lignanas já conhecidas na literatura, a arctiina, a
arctigenina e o matairesinol, identificadas pela primeira vez em espécies do gênero Ficus. A
escolha do extrato foi feita com base no relato da literatura de que o mesmo demonstra
apresenta potencial terapêutico importante para melhorar a eficácia da quimioterapia de
câncer e ainda, com base na análise dos espectros de RMN
1
H dos extratos obtidos da planta,
onde o extrato diclorometano se mostrou o mais promissor, pela presença de sinais de
hidrogênios aromáticos. As substâncias foram isoladas e purificadas por meio de técnicas
cromatográficas convencionais e a identificação estrutural foi feita com base nos métodos
espectroscópicos usuais, RMN
1
H e RMN
13
C, além de DEPT, NOE diff, HETCOR, COSY
1
H x
1
H e HMBC. As estruturas foram confirmadas também por comparação com dados
obtidos da literatura. A atividade citotóxica foi avaliada através da viabilidade celular pelo
método do MTT, em linhagem celular C6 de glioma de rato e em astrócitos corticais de rato,
nas concentrações de 50, 100, 250 e 500µM, no tempo de 72h. O parâmetro de avaliação foi a
percentagem de morte celular. Os resultados demonstraram que tanto o matairesinol como a
arctigenina, reduzem a viabilidade celular de maneira significativa na linhagem tumoral. Na
avaliação da citotoxidade das lignanas em cultura de astrócitos corticais de rato, observou-se
uma redução bem menor na viabilidade celular, quando comparadas à linhagem C6,
mostrando que a linhagem de células normais, apresenta-se menos sensível à morte do que a
linhagem tumoral, nas mesmas concentrações e no mesmo intervalo de tempo. Para análise da
morfologia nuclear das células da linhagem C6, após tratamento com as lignanas matairesinol
e arctigenina, na concentração de 250µM, por 48 horas, utilizou-se o marcador de DNA
Hoechst 33342. Em seguida as células marcadas foram observadas em microscópio de
fluorescência e fotografadas. Os resultados sugerem que as lignanas induzem a morte celular,
provavelmente, por apoptose. Para análise do possível tipo de morte celular, as células
tratadas com as lignanas, nas concentrações de 50 e 250µM, por 72 horas, foram analisadas
por Microscopia Eletrônica de Transmissão. Os resultados confirmam o tipo de morte celular
por apoptose.
Palavras-chave: Ficus citrifolia; Lignanas; Atividade citotóxica; Apoptose
ABSTRACT
The present work describes the first phytochemical study of the species Ficus citrifolia
(Moraceae) and the cytotoxic activity of the isolated substances. The species of the genus
Ficus are commonly known by the name of figs. This genus is constituted for about 750-800
species, distributed in the tropical and subtropical regions in the world, from these amount, 64
are referred to Brazil. The phytochemical investigation on the CH
2
Cl
2
extract of the leaves
afforded three lignans already known in literature, the arctiin, the arctigenine and the
matairesinol, identified for the first time in species of the genus Ficus. The substances have
been isolated and purified by means of conventional chromatographic techniques and the
structural identification has been made according to spectroscopics usual methods, RMN
1
H
and RMN
13
C, besides DEPT, NOE diff, HETCOR, COSY
1
H x
1
H and HMBC. The
structures were also confirmed by comparison with literature data. The cytotoxic activity has
been evaluated through the cell viability by MTT method, in C6 rat glioma cell and rat
cortical astrocytes, in the concentrations of 50, 100, 250 and 500µM, in a period of 72 hours.
The evaluation parameter was the percentage of cell death. The results demonstrated that as
much the matairesinol as the arctigenine, they reduce the cell viability in a significant way in
the tumor lines. Refering to the evaluation of the lignan’s cytotoxicity in cultured rat’s cortical
astrocytes, a very smaller reduction was observed in the cell viability, as compared to the C6
line, showing that the line of normal cells, comes less sensitive to the death than the tumor
line, in the same concentrations and in the same interval of time. For analysis of the nuclear
morphology of the cells of the rat glioma cell C6, after treatment with the lignans matairesinol
and arctigenine, in the concentration of 250µM, for 48 hours, the DNA marker Hoechst 33342
was used. Soon afterwards the marked cells were observed in fluorescence microscopy and
photographed. The results suggest that the lignans induces the cell death, probably, for
apoptose.
22
1 INTRODUÇÃO
O homem, pela própria necessidade e carência de outras fontes, sempre buscou na
natureza a solução de seus males. O uso de plantas e o conhecimento de algumas de suas
propriedades terapêuticas é algo que tem acompanhado o homem desde os primórdios de sua
história, portanto a utilização de produtos naturais, no tratamento dos mais diversos tipos de
enfermidade é, provavelmente, tão antiga quanto à própria humanidade, porém sem que
fossem conhecidos os verdadeiros responsáveis por suas ações terapêuticas.
A natureza, grande celeiro para o avanço de pesquisas, é uma atrativa fonte de novas
substâncias, podendo ser encontrada uma enorme diversidade química em milhões de
espécies de plantas, animais, organismos marinhos e microorganismos de interesse biológico
ou não (PINTO et al., 2002).
O arsenal terapêutico do reino vegetal é incalculável e, no momento, somente uma
pequena porcentagem dos compostos naturais é conhecida. Estas substâncias podem ser
utilizadas diretamente, na forma como são isoladas; podem sofrer algumas modificações para
aumentar seu potencial terapêutico ou ainda podem ser usadas simplesmente como modelos
para a síntese de novos princípios ativos, que se tornam úteis em vários tipos de tratamento.
O potencial desses produtos tem sido reconhecido, como já mencionado, desde a
antiguidade, porém sua elucidação estrutural bem como o seu papel nas interações biológicas
com organismos e com os ecossistemas, está sendo entendido apenas nas últimas décadas
(BANERJI, 1992; DOMINGO LÓPEZ-BREA, 2003).
Há uma grande quantidade dessas plantas, em todas as partes do mundo, que são
utilizadas há milhares de anos para o tratamento de doenças, através de mecanismos na
maioria das vezes desconhecidos. Devido às capacidades bioquímicas especializadas que
essas plantas apresentam, elas são capazes de sintetizar e acumular uma vasta linha de
metabólitos primários e secundários (OJALA, 2001), a maioria relacionada com o fenol e
seus derivados (DOMINGO LÓPEZ-BREA, 2003), úteis na defesa da própria planta
contra fatores de estresse. Esses compostos tornam muitas plantas úteis para seres humanos,
tanto na dieta como em medicamentos (OJALA, 2001), portanto o estudo desses mecanismos
de ação e o isolamento do princípio ativo (a substância ou conjunto delas que é responsável
pelos efeitos terapêuticos) da planta é um dos eixos de pesquisa importantes da biologia,
química e farmacologia.
23
As pesquisas nesta área são extremamente necessárias, pois ainda nos tempos atuais,
mesmo com o grande avanço tecnológico, muitas plantas ainda são utilizadas de forma
caseira pela população, do mesmo modo como eram utilizadas a milhares de anos, ou seja,
sem nenhum conhecimento necessário sobre a toxicidade das mesmas ou, pelo menos, se as
ações terapêuticas são realmente verdadeiras.
Todos os povos no mundo fizeram e/ou fazem uso de plantas com intuito medicinal.
Essas tradições populares de tratamento acabaram servindo como base para a farmacologia
moderna. Por outro lado, criou-se o termo fitoterapia (em grego: phyton - planta; therapia -
tratamento) para caracterizar o uso medicinal das plantas. A combinação entre os avanços no
estudo da farmacologia das plantas e a ocorrência de efeitos colaterais de medicamentos
convencionais, fez o interesse mundial pela fitoterapia crescer nos últimos anos. Vale
mencionar que boa parte das substâncias utilizadas pela indústria farmacêutica convencional
tem sua origem, direta ou indireta, em plantas.
Portanto, a evolução da tecnologia tem facilitado a busca, cada vez mais intensa, de
novas fontes naturais de substâncias com propriedades farmacológicas úteis, pois tem
permitido maior avanço na obtenção de dados sobre compostos orgânicos, aperfeiçoando a
interpretação de fatos, com base na quimiossistemática e favorecendo assim a expansão da
fitoterapia. Além disso, o estudo fitoquímico também fornece vários dados para que as
plantas sejam agrupadas, de tal modo que sua semelhança de composição química, em
conjunto com outros dados, forneça uma classificação adequada para os mais diversos tipos
de plantas existentes.
Tradicionalmente, os produtos naturais de plantas têm provido a indústria
farmacêutica, sendo uma de suas mais importantes fontes de compostos “modelos” e acima
de 40% das drogas modernas são derivadas de fontes naturais usando a própria substância
natural ou a versão sintetizada (JASSIM NAJI, 2003). Além do mais, produtos naturais
são reconhecidos amplamente, na indústria farmacêutica, não só por sua diversidade
estrutural, como também, seu largo espectro de atividades farmacológicas (OJALA, 2001).
Assim, identificar os constituintes químicos de plantas, encontrando seus princípios
ativos, bem como seus possíveis efeitos terapêuticos e tóxicos, é de relevada importância se
for levado em consideração que, uma grande parcela da população realmente utiliza-se de
vegetais, e ainda, se atentarmos para o impacto que tal uso poderá causar nos aspectos de
saúde, econômico e social.
24
O Brasil tem uma das maiores reservas de vegetais do planeta com cerca de 55.000
espécies, ou seja, 22% do total de registro do planeta (FERREIRA et al., 1998; PINTO et al.,
2002), sendo que milhares delas possuem propriedades medicinais, porém muitas ainda têm
o seu uso difundido apenas com base em observações, pelo uso que a população nativa
sempre fez delas (etnofarmacologia), sem se conhecer, contudo, a natureza química das
substâncias bioativas.
Com vista à descoberta ou a certificação de possíveis atividades, principalmente de
plantas, os estudo químico e farmacológico vem despertando ao longo da história o interesse
de médicos, farmacêuticos, químicos, biólogos, agrônomos e mais recentemente até de
leigos.
A planta selecionada para este projeto foi a espécie Ficus citrifolia, pertencente à
família Moraceae. A família apresenta cerca de 50 gêneros e aproximadamente 1500
espécies distribuídas, principalmente, nos trópicos e sub-trópicos do mundo todo. No Brasil
são encontrados 27 gêneros e aproximadamente 250 espécies (SOUZA LORENZI, 2005).
Quimicamente, esta família apresenta uma rica variedade de constituintes químicos micro-
moleculares, tais como: flavonóides, cumarinas, derivados do ácido cinâmico, xantonas,
derivados benzofuranos, ácidos graxos, terpenóides, alcalóides e ciclitóis. (PEREIRA et al.,
1986).
Ficus citrifolia, espécie vegetal brasileira, está sendo estudada pela primeira vez do
ponto de vista fitoquímico, neste trabalho, visando com isso contribuir para o conhecimento
da química da espécie, bem como do gênero e da família, pretendendo-se também identificar
as substâncias que apresentem atividade biológica. Através de levantamento bibliográfico,
verificamos que a espécie já teve alguns de seus extratos testados, entre eles o etanólico
(ANTOUN et al., 2001), e o diclorometânico (SIMON et al., 2001). Os resultados com o
extrato diclorometânico demonstram que Ficus citrifolia apresenta importante papel no
aperfeiçoamento da quimioterapia do câncer. Estas informações motivaram o interesse no
estudo fitoquímico da espécie, bem como a busca das substâncias que provavelmente
apresentam atividade antitumoral. No estudo foi possível isolar e identificar substâncias da
classe das lignanas, grupo com comprovadas atividades biológicas, tais como: sedativa,
antibacteriana, antifúngica e antitumoral (AGRAWAL THAKUR, 1988).
A descoberta de novas drogas com atividade antitumoral tornou-se alvo de inúmeros
estudos, pois os tumores malignos, de acordo com as estatísticas, são a segunda principal
causa de morte pôr doença no Brasil, atrás apenas dos males relacionados ao sistema
circulatório (INCA, 2007). Poucas são as drogas que apresentam eficácia no combate aos
25
cânceres. Acredita-se que os motivos estejam relacionados ao fato de que, poucas são as
drogas realmente eficazes e todas são tóxicas para as células normais. Além disso, outra
dificuldade encontrada é que, as células cancerígenas podem adquirir resistência ao
quimioterápico, por isso, quanto mais drogas forem descobertas, maiores as chances de
sobrevida do paciente, o que torna as pesquisas, nesta área, de extrema importância.
A natureza apresenta uma variedade de compostos químicos produzidos pelo imenso
laboratório que é o reino vegetal, sendo esta, uma das principais fontes de novos fármacos
antineoplásicos (YOUNES et al., 2007). A tecnologia envolvida no entendimento dos
processos bioquímicos, angiogênicos e apoptóticos, têm auxiliado na identificação de novas
moléculas-alvo, e tem um papel decisivo na identificação de novas drogas antineoplásicas. O
Brasil, sendo o país que possui a mais alta biodiversidade, em termos de organismos vegetais
e animais, está na posição de ser um dos líderes na pesquisa de produtos naturais.
É claro que o aproveitamento de plantas que apresentam potencial químico para a
produção de novos fármacos, não se faz sem a colaboração estreita e harmônica entre áreas
afins, que associadas têm mostrado resultados satisfatórios que certamente representarão
melhorias substanciais na qualidade de vida e padrões de saúde da população.
Neste estudo, após o isolamento e identificação das diferentes substâncias químicas
encontradas na planta selecionada, foi investigada a atividade citotóxica em células tumorais.
Para esta finalidade foi utilizado um modelo in vitro de cultura de células de glioma de rato,
a C6, e para comparação dos possíveis efeitos em células normais, foi utilizada a cultura
primária de astrócitos. Investigamos nestas linhagens a presença de morte celular
programada (apoptose), após tratamento com as substâncias isoladas.
É importante ressaltar que as três lignanas isoladas do extrato diclorometânico das
folhas (Fig. 1, p. 26), conhecidas como arctiina, arctigenina e matairesinol, representam o
único registro da classe para o gênero, sendo as primeiras substâncias isoladas e relatadas
para Ficus citrifolia.
26
R
1
= Me; R
2
= Glc (arctiina)
R
1
= Me; R
2
= H (arctigenina)
R
1
= H; R
2
= H (matairesinol)
O
O
OR
2
R
1
O
MeO
OMe
Figura 1- Estruturas químicas das substâncias isoladas.
1.1 Considerações sobre o gênero Ficus
O gênero Ficus é constituído por cerca de 750-800 espécies, distribuídas
principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. Aproximadamente 500-550
espécies são da Ásia e da região da Austrália, 100 da África e 100-120 da região Neotropical.
Destas 100 a 120 espécies neotropicais, 64 são referidas para o Brasil (BERG, 2001; BERG
VILLAVICENCIO, 2004).
As figueiras, como são conhecidas as plantas do gênero Ficus, são árvores que se
caracterizam pela beleza que irradiam e pela sombra que propiciam. Talvez essas plantas
estejam entre as primeiras cultivadas pelo homem. Desde a antigüidade as figueiras fizeram
parte da alimentação da humanidade, sendo as folhas e o látex utilizados na medicina
popular (MENDONÇA-SOUZA, 2006), e ao longo do tempo, pelas mãos de viajantes,
naturalistas, comerciantes e aventureiros, as figueiras foram se dispersando por todo o
mundo, sendo parte integrante de um sistema ecológico muito rico e variado. Os figos fazem
parte da alimentação de alguns animais, que acabam se tornando também responsáveis pela
dispersão das sementes dessas figueiras (CARAUTA, 1989).
Estudos fitoquímicos vêm sendo realizados com espécies de Ficus e revelam a
presença de cumarinas (OLIVEIRA et al, 2003; CHANG et al., 2005), terpenóides (LI
27
KUO, 1998; SAEEB SABIR, 2002), esteróides, flavonóides livres e glicosilados
(LORENZI MATOS, 2002), alcalóides (BAUMGARTNER et al., 1990) e taninos
(OGUNGBAMILA et al., 1997).
Algumas espécies de Ficus estudadas fitoquimicamente, revelaram um perfil químico
típico da família Moraceae, entre elas destacamos: Ficus insipida (LOPES et al., 1993),
Ficus septica (BAUMGARTNER et al.; 1990), Ficus eriobtroyoides, Ficus cunnghamii,
Ficus sycomorus (EL-KHRISY, 1985), Ficus asprima, Ficus hispida, Ficus carica (EL-
KHRISY et al., 1980), Ficus infectoria (JAIN YADAVA, 1994), Ficus maxima
(MUÑOZ, 1997), Ficus gomelleira (AMARAL, 2000), das quais foram isoladas as
substâncias apresentadas nas figuras 2 a 8, encontradas nas páginas 27 a 33, respectivamente.
R
1
= OCH
3
; R
2
= H (xantotoxina)
R
1
= OH; R
2
= H (xantotoxol)
R
1
= H; R
2
= OH (bergaptol)
R
1
= H; R
2
= OCH
3
(bergapteno)
R
1
= R
2
= H (psoraleno)
O O O
R
1
R
2
marmesina
O O O
OH
-amirina
HO
H
H
H
HO
HH
sitosterol
Figura 2- Constituintes químicos isolados de Ficus asprima, Ficus hispida e Ficus carica.
28
R
1
= R
2
= H (psoraleno)
R
1
= H; R
2
= OCH
3
(bergapteno)
R
1
= R
2
= OCH
3
(isopimpinelina)
R
1
= OCH
3
; R
2
= H (xantotoxina)
O O O
R
1
R
2
marmesina
O O O
OH
R = OCH
3
(herniarina)
O OR
R = OH (umbeliferona)
Figura 3- Constituintes químicos isolados de Ficus eriobtroyoides, Ficus cunnghamii e Ficus sycomorus.
moretenolactona
O
O
Figura 4- Constituinte químico isolado de Ficus insipida.
29
sorbelina-6-O-[-L-arabinopiranosil-(1 2)--Dglucopiranosídeo]
HO
HO
HO
OH
OH
OH
O
O
O
MeO
OH
O
O
O
sitosterol
HO
HH
Figura 5- Constituintes químicos isolados de Ficus infectoria.
30
O
O
R
1
'
R
2
'
R
3
'
R
1
R
2
R
3
R
4
R
1
= R
3
= H; R
2
= R
4
= R
1
' = R
2
' = R
3
' = OMe (5,7,3',4',5'-pentametoxiflavona)
R
1
= H; R
2
= R
3
= R
4
= R
1
' = R
2
' = R
3
' = OMe (5,6,7,3',4',5'-hexametoxiflavona)
R
1
= R
2
= R
4
= R
1
' = R
2
' = R
3
' = OMe; R
3
= H (5,7,8,3',4',5'-hexametoxiflavona)
5,6,7,3',5'-pentametoxi-4'-(3",3"-dimetilaliloxi)flavona
O
O
O
OMe
MeO
OMe
OMe
MeO
OMe
O
O
O
O
OMe
MeO
R
1
R
1
= H (5,7,5'-trimetoxi-3',4'-metilenodioxiflavona)
R
1
= OMe (5,6,7,5'-tetrametoxi-3',4'-metilenodioxiflavona)
Figura 6- Constituintes químicos isolados de Ficus maxima.
31
Figura 6- continuação
R
1
OMe
R
2
MeO
R
1
= OMe; R
2
= H (1,3,5-trimetoxibenzeno)
R
1
= OH; R
2
= OMe (3,4,5-trimetoxifenol)
lupeol
HO
sitosterol
HO
HH
R
1
= R
2
= OH (5,4'-dihidroxi-8,3',5'-trimetoxi-6,7-(2",2"dimetilpirano)flavona
R
1
= R
2
= OMe (5,8,3',4',5'-pentametoxi-6,7-(2",2"-dimetilpirano)flavona
O
O
R
1
OMe
R
2
OMe
OMe
O
32
O
O
R
1
'
R
2
'
R
3
'
R
1
R
2
R
3
R
4
R
1
= H; R
2
= R
3
= R
4
= R
1
' = R
2
' = R
3
' = OMe (5,6,7,3',4',5'-hexametoxiflavona)
R
1
= H; R
2
= R
3
= R
1
' = R
3
' = OMe; R
4
= R
2
' = OH (5-4'-dihidroxi-6,7,3',5'-tetrametoxiflavona)
R
1
= R
2
= R
2
' = R
3
' = OMe; R
3
= R
1
' = H; R
4
= OH (5-hidroxi-7,8,3',4'-tetrametoxiflavona)
5-hidroxi-8,3',4',5'-tetrametoxi-6,7(2",2"-dimetilpirano)flavona
O
O
OH
OMe
OMe
OMe
OMe
O
5-hidroxi-7,5'-dimetoxi-3',4'-metilenodioxiflavona
O
O
OMe
MeO
OH
O
O
Figura 7- Constituintes químicos isolados de Ficus gomelleira.
33
N
OMe
MeO
N
OMe
MeO
MeO
ficuseptina
autofina
Figura 8- Constituintes químicos isolados de Ficus septica.
1.1.1 Atividades Biológicas do gênero
O conhecimento de plantas e suas propriedades terapêuticas vêm sendo acumulados
durante séculos, contribuindo para a seleção e incorporação de espécies vegetais como
plantas medicinais eficazes e direcionando os estudos detalhados para a obtenção de novos
medicamentos (DI STASI, 1996). Ao longo das últimas décadas, tem-se comprovado que as
plantas produzem substâncias químicas com propriedades terapêuticas.
Estudos já realizados comprovam o potencial farmacológico em algumas espécies de
Ficus, como no tratamento de úlceras gastroentéricas (KUNLE et al., 1999) e sugerem a
presença de compostos com influência no catabolismo lipídico (PEREZ et al., 1999). Na
região amazônica este gênero de plantas tem sido usado como agente anti-helmíntico e anti-
reumático (CARAUTA, 1989; LOPES et al., 1993; VAN DEN BERG, 1982) e em outras
regiões como agente antifúngico, antibacteriano, antiulcerativo, antiinflamatório e ainda,
usado no tratamento de leucorréia (EL-KHRISY et al., 1980; EL-KHRISY, 1985;
BAUMGARTNER et al.; 1990; JAIN YADAVA, 1994).
Extratos de Ficus sycomorus, F. benghalensis, F. religiosa, F. racemosa e F.
benjamina (Moraceae) revelaram ação antibacteriana (MOUSA et al., 1994; CARAUTA
DIAZ, 2002). Efeitos anti-helmínticos também foram observados em espécies de Ficus, mais
precisamente, no látex das espécies Ficus carica e Ficus insipida (AMORIN et al., 1999).
34
1.2 Ficus citrifolia
Figura 9- Ficus citrifolia. Disponível em http://bio.fiu.edu/trees/sp_pages/Ficus_citrifolia.html. Acesso em: 04
de maio de 2008
35
A espécie Ficus citrifolia (Fig. 9, p. 34) é conhecida pelos nomes populares de
figueira ou gameleira preta. É uma espécie variável (polifórmica), com uma taxonomia
incerta e que se encontra esparsa através de uma área extensa (FRANCIS, 1994).
1.2.1 Classificação botânica da espécie (Quadro 1)
Quadro 1: Classificação Botânica de Ficus citrifolia (FRANCIS, 1994).
Divisão
Magnoliophyta
Subdivisão
Magnoliaceae
Classe
Magnoliopsida
Subclasse
Hamamelidae
Ordem
Urticales
Subordem
Malvifloraeae
Família
Moraceae
Subfamília
Artocarpoideae
Gênero
Ficus
Espécie
Ficus citrifolia
1.2.2 Características botânicas (Fig. 10, p. 36)
Árvore de 10-15 m de altura, com raízes aéreas abundantes, às vezes arbusto com a
copa de cor verde escuro brilhante, e os ramos jovens calvos de cor marrom amarelado ou
marrom, descamando-se. Estípulas calvas de 1-1,5 cm de comprimento. Folhas do tipo
alongadas-ovais ou alongadas-elípticas, de 12-22 x 4,5-9 cm, de base arredondada ou
atenuada, margem inteira e ápice acuminado. Pecíolo de 2-8 cm de largura, calvo. Frutos em
pares, pedunculados, com pedúnculos calvos de 5-10 mm de largura e receptáculos globosos,
de 1-1,5 cm de diâmetro, calvos, esverdeado, com o ostíolo ligeiramente proeminente
(GONZALES, 2001).
36
Figura 10- Folhas, caule, látex e frutos de Ficus citrifolia (Disponível em:
http://pick5.pick.uga.edu/mp/20q?search=Ficus+citrifolia, http://www.regionalconservation.org,
http://pick5.pick.uga.edu/mp/20q?search=Ficus+citrifolia. Acesso em: 4 de maio de 2008.
37
1.2.3 Habitat
A espécie está distribuída nas Américas, do sul da Flórida ao sul do México,
passando por toda América Central e na América do Sul até o Paraguai (Fig. 11). Ocorre em
todo o território brasileiro (MENDONÇA-SOUZA, 2006). Seu crescimento acontece em
florestas subtropicais secas, porém crescem abundantemente em florestas subtropicais
úmidas e ocasionalmente em florestas subtropicais muito úmidas (FRANCIS, 1994).
Figura 11- Localização geográfica da espécie Ficus citrifolia nas Américas
Fonte: http://www.fs.fed.us/global/iitf/Ficuscitrifolia.pdf >. Acesso em 17 de janeiro 2003
1.2.4 Usos
Suas árvores são usadas como postes vivos e ocasionalmente como ornamento e local
de sombra. Sua madeira é usada de modo limitado para combustível, carpintaria e
instrumentos musicais. Seu fruto, quase sem sabor, é comestível para o homem e fonte muito
importante de alimento para os pássaros (FRANCIS, 1994).
38
1.3 Considerações sobre a classe de substâncias isoladas (lignóides)
As classes de metabólitos secundários tradicionalmente mais importantes são os
alcalóides, os terpenóides e os flavonóides. Entretanto, a classe dos lignóides destaca-se pela
ampla distribuição no reino vegetal (COLE WIEDHOPH, 1978). Existem mais de 500
lignóides conhecidos, dos quais em torno de 90% se distribuem entre os grupos das lignanas
e neolignanas (KUROSHIMA, 2002).
O termo lignóide é uma designação genérica, que caracteriza micromoléculas, cujo
esqueleto é formado exclusivamente pelo grupo fenilpropânico (C
6
-C
3
)
n
, sendo n restrito a
poucas unidades (GOTTILIEB YOSHIDA, 1984). Quando o esqueleto é do tipo (C
6
-C
3
)
2
,
ou seja, formando substâncias bis-arilpropanóidicas, os lignóides podem ser classificados em
dois grupos: as lignanas e as neolignanas. As lignanas, grupo isolado neste trabalho, são
dímeros formados através do acoplamento oxidativo de álcoois cinamílicos entre si ou destes
com ácidos cinâmicos (SANTOS, 2004).
O termo lignana foi introduzido por Harworth em 1942 (GOTTILIEB YOSHIDA,
1984) para descrever o grupo de produtos naturais apresentando duas unidades
,
ligadas
através de um carbono central (carbono β) da cadeia lateral das unidades C
6
-C
3
.
O elevado número de lignanas e neolignanas, leva a suposição de que as propriedades
biológicas dessas substâncias sejam essenciais, ao desenvolvimento do próprio vegetal e ao
controle deste sobre a vida circunjacente, estando envolvidas em interações entre plantas,
plantas com fungos e ainda com insetos (BARBOSA-FILHO, 2003). Por isso, não é de se
admirar que também essas substâncias possam ser aproveitadas diretamente pelo homem, ou
ainda, possam servir de modelo para a síntese de novos fármacos.
1.3.1 Atividades biológicas de algumas lignanas
As lignanas possuem uma variedade de tipos estruturais e ocupam lugar de destaque
no que diz respeito a variedade de atividades biológicas (SETCHELL et al., 1980; AYRES
LOIKE, 1990) e por isso passaram a despertar grande interesse da comunidade científica.
Diferentes atividades, em mais de 200 lignanas, já foram encontradas (GOTTILIEB
YOSHIDA, 1984; MACRAE TOWERS, 1984).
39
No quadro 2, são listadas algumas lignanas com suas respectivas atividades
biológicas. Na figura 12 são exibidas as estruturas dessas substâncias.
Quadro 2 - Alguns exemplos de lignanas com atividades biológicas comprovadas.
Substâncias
Atividades
Podofilotoxina
Antimicótica / antineoplásica (GOTTILIEB YOSHIDA,
1984)
Esteganacina
Antileucêmica (GOTTILIEB YOSHIDA, 1984)
Olivil e ciclolivil
Antioxidante e anticancerígena (LEE et al., 1998)
Americanina
Antioxidante (SU et al., 2005)
Hidroximatairesinol
Antitumoral (SAARINEN et al., 2000)
Trachelogenina
Anti HIV (SCHRODER et al., 1990)
Traxillagenina
Neuroprotetora (JANG et al., 2001)
Sesamina
Sinergística de inseticida (GOTTILIEB YOSHIDA, 1984)
Cobusina
Larvicida (GOTTILIEB YOSHIDA, 1984)
Esteganacina
Podofilotoxina
O
O
O
OH
O
OMe
OMe
MeO
O
O
O
O
OMeMeO
MeO
AcO
Figura 12- Estrutura química de algumas lignanas com atividades biológicas comprovadas.
40
Figura 12- continuação
OH
OMe
HO
MeO
OH
OH
OH
O
OH
OH
OMe
HO
OH
OMe
Olivil
Ciclolivil
O
R
1
R
2
O
OMe
OR
4
O
R
5
R
6
R
3
R
1
= R
3
= MeR
2
= Me; R
4
= R
5
= R
6
= H (traxillagenina)
R
1
= OMe; R
2
= Me; R
3
= R
4
= R
5
= H; R
6
= OH (trachelogenina)
R
1
= OMe; R
2
= R
3
= R
4
= R
6
= H; R
5
= OH (hidroximatairesinol)
R
1
= OMe; R
2
= Me; R
3
= H; R
4
= -
D-(3-O-caffeoyl)-glucopyranosyl; R
5
= R
6
= H (americanina)
R
1
= R
2
= H (cobusina)
R
1
-R
2
= CH
2
(sesamina)
H
H
O
O
O
O
OR
2
OR
1
41
Estudos anteriores sugerem que as lignanas do tipo dibenzilbutirolactona, classe de
substâncias isoladas neste trabalho, tem um efeito preventivo contra tipos de câncer
hormônio dependentes como mama, próstata e colón (ADLERCREUTZ, 2002); são agentes
citostáticos potentes contra células leucêmicas humanas HL-60 (HIRANO, 1994);
apresentam atividade antiviral, mostrando-se potentes inibidoras do HIV tipo-1 Integrase
(EICH et al., 1996; YANG et al., 1996), são antitumorais (MORITANI et al., 1996;
TAKASAK et al., 2000), fitoestrogênios (MEAGHER et al., 1999) e apresentam, ainda,
propriedades imunoreguladoras (CHO et al., 1999), neuroprotetoras (JANG et al., 2001;
JANG et al., 2002), antioxidativa (WILLFÖR et al., 2003; JIN et al., 2005), antiinflamatória
(CHO et al., 2002; JIN et al., 2005), antiestrogênica (KATO et al., 1998), antifúngica,
antiasmática e hipolipidêmica (CHARLTON, 1998; WARD, 1999).
A investigação das ações biológicas de lignanas é relativamente recente, sendo o
maior interesse dirigido às ações antitumorais, onde encontramos alguns derivados da
podofilotoxina comercializados (GOTTLIEB YOSHIDA, 1984; WARD, 1997).
As lignanas arctiina, arctigenina e matairesinol (Fig. 1, p.24), isoladas no presente
trabalho, apresentam suas estruturas bastante funcionalizadas, contendo anéis lactônicos,
grupos hidroxila e metoxila, o que concede a elas inúmeras atividades biológicas, já
comprovadas, como mostra o quadro 3 (p. 44), e inclusive sendo alguns de seus
representantes considerados fitoestrogênios.
Fitoestrogênios (Fig. 13, p. 42), são compostos existentes em plantas, essencialmente
sob três formas isoflavonas (genisteína), coumestanos (coumestrol) e lignanas (pinoresinol,
lariciresinol, secoisolariciresinol, matairesinol), com estruturas e funcionalidades
semelhantes ao hormônio estradiol (Fig. 14, p. 42), um dos hormônios produzidos pelo
ovário. Essas substâncias vêm despertando, nos últimos anos, interesse da classe científica,
por serem possíveis alternativas naturais à terapia de reposição hormonal na menopausa. Os
fitoestrogênios encontrados em várias plantas comestíveis podem ter efeito estrogênico fraco
e antiestrogênico, o que conduziu a hipótese de que estes possuem efeitos protetores nas
células contra o câncer de mama e próstata, que são tecidos relacionados a hormônio.
Estudos, comparando a população asiática versus ocidental, têm sido interpretados no
sentido de que uma dieta rica em fitoestrogênios melhoraria os sintomas da menopausa e
protegeria contra certos tipos de câncer, perda óssea e doenças cardiovasculares, sendo
incentivado assim o consumo dessas substâncias (CLAPAUCH et al.; 2002).
42
matairesinol
secoisolariciresinol
lariciresinol
pinoresinol
Coumestrol
genisteína
O
OMe
OH
MeO
HO
O
OH
OH
OMe
MeO
OH
HO
O
HH
OMe
HO
OMe
OH
HO
O
O
OMe
OH
HO
OMe
O
O
OHO
OH
O
OH
HO
OH
O
Figura 13- Estrutura química de algumas substâncias consideradas fitoestrogênicas.
OH
HO
estradiol
Figura 14- Estrutura química do estradiol.
43
As lignanas fitoestrogênicas estão presentes nas plantas, como constituintes da parede
celular. Os precursores dessas lignanas encontram-se nas películas que recobrem os cereais,
e que nos processos de refinamento são removidas. São encontradas, portanto, nos legumes,
vegetais, grãos integrais e sementes. Entre os principais óleos extraídos de sementes,
encontramos o óleo de linhaça, onde as pesquisas atuais, todavia, têm se concentrado, mais
especificamente, nos compostos associados a fibras (lignanas). As duas lignanas primárias de
mamíferos, enterodiol e seu produto oxidado, enterolactona, são formados no trato intestinal
pela ação bacteriana sobre lignanas vegetais (SETCHELL et al., 1980). A linhaça é a fonte
mais rica de precursores de lignana de mamíferos (THOMPSON et al., 1991).
Por serem estruturalmente similares, tanto aos estrogênios sintéticos, como aos de
ocorrência natural, e por mostrarem possuir atividade estrogênica e antiestrogênica,
enterodiol e enterolactona, podem desempenhar um papel na prevenção de cânceres
dependentes de estrogênio, pois essas lignanas se acoplam aos receptores de estrógeno, e
mimetizam a ação do hormônio. E por possuírem uma ação fraca em relação ao estrógeno,
não apresentam ação negativa sobre o tecido mamário. Assim sendo, a lignana é uma
substância importante na prevenção do câncer de mama, por neutralizar a ação do estrógeno
sobre esse tecido.
Inicialmente, dentro da classe das lignanas presentes em plantas, somente o
secoisolariciresinol e o matairesinol, eram considerados precursores de enterolignanas
(lignanas de mamíferos), porém mais recentemente novos precursores como lariciresinol e
pinoresinol foram identificados. O matairesinol ao ser ingerido na dieta, é convertido em
enterolactona por bactérias presentes no intestino (Fig. 15, p. 43).
lariciresinol secoisolariciresinol matairesinol
OH
HO
OH
OH
enterodiol
O
O
OH
HO
enterolactona
pinoresinol
Figura 15- Esquema de transformação de lignanas vegetais em lignanas primárias de mamíferos por bactérias
no intestino.
44
Quadro 3- Atividades biológicas, já comprovadas cientificamente, das lignanas isoladas.
Atividades Biológicas
Lignana
Ação fitoestrogênica
Matairesinol
Efeito inibidor potente na replicação do vírus da
imunodeficiência humana (HIV) em células
linfocitárias H9.
Arctiina ((YANG et al., 1996)
Arctigenina (SCHRODER et al.,1990)
Matairesinol (ISHIDA et al., 2001)
Atividade inibidora potente da caseína kinase I
Matairesinol (YOKOYAMA et al.,
2003)
Atividade neuroprotetora relevante contra a
toxicidade induzida por glutamato em cultura de
células corticais de rato
Arctiina (JANG et al., 2001)
Arctigenina (JANG et al., 2001; JANG
et al., 2002; CHO et al., 2004).
Atividade antiproliferativa potente contra células
MH60, provavelmente devido a apoptose
Arctigenina (MATSUMOTO et al.,
2006)
Citotoxidade frente a larvas de Artemia salina
Arctigenina (FERREIRA et al., 2006)
Agente antitumoral com a habilidade de eliminar
a tolerância de células cancerígenas frente a
supressão de nutrientes
Arctigenina (AWALE et al., 2006)
Agentes citostáticos potentes contra células
leucêmicas humanas HL-60
Arctigenina (HIRANO et al., 1994)
É biossintetizada como fitoalexina, sugerindo
apresentar papel importante em interações
alelopáticas
Arctigenina (LIMA et al., 1997)
45
1.3.2 Metabolismo secundário e biossíntese de lignanas
Durante muito tempo, não se sabia exatamente qual a função dos metabólitos
secundários, e por isso eram considerados simplesmente produtos de excreção vegetal, com
estruturas químicas e algumas propriedades biológicas interessantes. Atualmente, entretanto,
sabe-se que muitas dessas substâncias estão diretamente relacionadas aos mecanismos que
permitem a adequação do seu produtor ao meio ambiente. E embora esse metabolismo nem
sempre seja essencial para o organismo que o produz, ele garante vantagens para sua
sobrevivência e para perpetuação de sua espécie, pois seus produtos desempenham inúmeras
funções, como por exemplo, a defesa contra herbívoros e microorganismos; a proteção contra os
raios UV e mudanças de temperatura e a atração de organismos benéficos como polinizadores e
dispersores de semente. Além disso, apresentam uma elevada capacidade biossintética, tanto em
relação a espécies diferentes quanto a diversidade numa mesma espécie (SANTOS, 2004).
Nas plantas, a síntese dos metabólitos secundários - que podem ser encontrados na
forma livre, sendo denominados genericamente de agliconas ou estar ligado a uma ou mais
unidades de açúcar formando o que se denomina heterosídeos (SANTOS, 2004) - deriva,
principalmente, do metabolismo da glicose através de três rotas principais: a via dos
aminoácidos, a via do acetato e a via do ácido chiquímico.
As lignanas são sintetizadas a partir de uma rota metabólica principal, já mencionada:
a via do ácido chiquímico. Como pode ser observado (Fig. 16, p. 46), o ácido chiquímico é
formado pela condensação de dois metabólitos da glicose, o fosfoenolpiruvato e a eritrose-4-
fostato. Ao ácido chiquímico formado, se junta uma molécula de fosfoenolpiruvato,
originando o ácido corísmico, que por sua vez gera os aminoácidos aromáticos, tirosina,
fenilalanina e triptofano, que intermediam a biossíntese de um grande numero de compostos
naturais em plantas superiores (SHIMID AMRHEIN, 1995; DEWICK, 1997) entre eles,
os alcalóides, taninos, lignanas, ligninas e cumarinas.
46
H
H
HO
2
C
PO
H
O
HO H
PO
HO
OH
HO OH
CO
2
H
COOH
O
OH
COOH
CH
2
COOH
NH
2
Ácido chiquímico
Ácido corísmico
Ácido antranílico
Ácido prefênico
NH
2
COOH
OH
CH
2
COCOOHHOOC
OH
NH
2
COOH
Tirosina
Fenilalanina
COOH
NH
2
Triptofano
Eritrose-4-fosfato
Fosfoenolpiruvato
+
Figura 16- Via do ácido chiquímico para biossíntese de α-aminoácidos. Uma importante enzima nessa via é a
fenilalanina amônio liase (PAL) a qual produz o ácido cinâmico.
47
Contudo, um dos primeiros grupos de compostos fenólicos formados a partir do ácido
corísmico são os fenilpropanóides, que são os metabólitos mais comuns da via chiquimato. A
eliminação de amônia, a partir da fenilalanina ou da tirosina, catalisada por amônialiases
[PAL] ou [TAL], produz respectivamente, o ácido cinâmico ou o ácido p-cumárico (Fig. 17).
A fenilalanina amônio liase (PAL), se destaca como uma enzima chave e regulatória da rota
de biossíntese dos fenilpropanóides e seus derivados.
Caminho da
maioria das
plantas
Ácido p-cumárico
Ácido Cinâmico
Tirosina
Fenilalanina
[Só em gramíneas]
[O]
TAL
L-Tirosina Amônia
Liase
L-Fenilalanina
Amônia Liase
PAL
COOH
NH
2
HO
COOH
COOH
HO
COOH
NH
2
Figura 17- Principais compostos fenólicos derivados da enzima fenilalanina amônio liase (PAL).
A formação do ácido cinâmico é o primeiro passo para a formação dos compostos
fenilpropanóides (ArC
3
), que ainda origina compostos do tipo ArC
2
, ArC
1
e ArC
3
(C
2
)n,
sendo todos conhecidos como metabólitos do chiquimato (CHENG et al., 2001). Uma
seqüência de reações de hidroxilações e metilações, sofridas pelo ácido cinâmico, dão
origem aos ácidos p-cumárico, ferúlico e sinápico (Fig.18, p. 48). Estes por sua vez formam,
respectivamente, os álcoois p-cumarílico, coniferílico e sinápilico, que segundo Birch e
Liepa (1978), são os precursores diretos das lignanas.
48
Ácido p-cumárico
Ácido Cinâmico
COOH
COOH
HO
CH
2
OH
HO
Álcool p-cumarílico Ácido cafeico
COOH
HO
HO
O
2
NADPH
COOH
HO
MeO
Ácido ferúlico
NADPH
Hidroxilação
Álcool coniferílico
CH
2
OH
HO
MeO
COOH
HO
MeO
OH
[O]
NADPH
SAM
COOH
HO
MeO
OMe
Ácido sinápico
SAM
O
2
O
2
Álcool sinapílico
CH
2
OH
HO
MeO
OMe
Figura 18- Formação dos álcoois p-cumarílico, coniferílico e sinapílico, a partir do ácido cinâmico.
OH
OH
MeO
álcool coniferílico
OH
O
MeO
H
e
OH
MeO
OH
O
MeO
O
O
MeO
OH
A B C
D
Figura 19- Formação de unidades radicalares que darão origem às lignanas e neolignanas.
49
O acoplamento oxidativo entre unidades radicalares (Fig. 19, p. 48), leva a formação
dos diferentes tipos de lignanas e neolignanas. As lignanas do tipo dibenzilbutirolactonas
isoladas neste trabalho, formam-se a partir do acoplamento de duas unidades radicalares do
tipo D (Fig. 20).
arctiina
arctigenina matairesinol
secoisolariciresinol
pinoresinol
O
OMe
OGlc
MeO
MeO
O
O
OMe
OH
MeO
MeO
O
HO
OH
OMe
OH
HO
OMe
O
OMe
OH
MeO
HO
O
O
MeO
OH
HO
O
MeO
D
D
HO
O
MeO
OH
O
MeO
O
O
OMe
OH
HO
OMe
OH
OMe
HO
MeO
OH
OH
UDPG
Figura 20- Rota biosintética para as lignanas arctiina, arctigenina e matairesinol.
50
1.4 Câncer e apoptose
Com poucas exceções, muitas das populações celulares de um organismo adulto são
diferenciadas e não proliferam por muito tempo. Células normais são perfeitamente
sintonizadas com o ambiente em que elas se encontram e respondem a sinais reguladores
externos que podem estimular ou inibir a proliferação celular (BERTRAM, 2001).
Na busca pela manutenção das necessidades do organismo como um todo, células
normais (Fig. 21) se dividem, amadurecem e morrem periodicamente, renovando-se a cada
ciclo. Esse ciclo é cuidadosamente regulado, mantendo assim a integridade e o correto
funcionamento dos diversos órgãos. A quebra dos mecanismos que regulam esse
comportamento normal de uma célula, origina uma célula defeituosa inicial, que cresce e se
reproduz de maneira descontrolada dando origem ao câncer.
Figura 21: Célula eucariótica normal. Disponível em: http://www.webciencia.com/11_03celula.htm. Acesso em
05 de maio de 2008.
Câncer, cancro ou displasia maligna, são nomes dados a um grupo de doenças que
têm em comum este crescimento desordenado e descontrolado de uma população de células
e que surge por divisão imprópria de uma célula mãe original (INCA, 2007). Estas células
perdem o seu “cronômetro”, que normalmente determina sua vida útil, e por isso seguem se
reproduzindo indefinidamente, invadindo e destruindo os tecidos adjacentes e órgãos (Fig.
22, p. 51), podendo espalhar-se para outras regiões do corpo (JUNQUEIRA CARNEIRO,
2000; BORGES ROBINSON, 2001; ALISSON, 2002).
51
Figura 22- Etapas de formação de tumor (1- Tecido normal, 2- Início da proliferação, 3- Proliferação, 4-
Invasão de tecidos vizinhos). Disponível em: http://pdf.rincondelvago.com/cancer_2.html. Acesso em 05 de
maio 2008.
Células normais que apresentam seu mecanismo de controle alterado e passam a
dividir-se de maneira acelerada, formam os chamados tumores. Tumor é um termo genérico
utilizado para indicar aumento anormal de uma parte ou da totalidade de um tecido,
resultante da proliferação de células defeituosas e pode ser classificado em benigno ou
maligno. Um tumor benigno ou não invasivo, citologicamente, não se diferencia muito de
suas células normais; mantêm-se confinado ao seu local de origem geralmente separado do
tecido normal por uma espécie de membrana que forma uma cápsula de tecido conjuntivo;
não invade o tecido normal vizinho; não se espalha para locais distintos do corpo e não
necessariamente avança para malignidade; embora alguns desses tumores sejam capazes de
se tornarem malignos. Já um tumor maligno ou invasivo ao contrário do anterior, apresenta
numerosas anormalidades citológicas; não se “encapsula”, por isso pode invadir o tecido
normal circunvizinho se espalhando pelo corpo através dos sistemas circulatório ou linfático
(metástases), o que cria disfunções nos órgãos invadidos e reações imunitárias às lesões que
levam a insuficiência de órgãos vitais e a morte. Somente tumores malignos são chamados
cânceres. A metástase (Fig. 23, p. 52) é um tumor secundário que se origina da disseminação
de células cancerosas procedentes de um primeiro tumor (JUNQUEIRA CARNEIRO,
2000; BORGES ROBINSON, 2001; COOPER, 2001).
52
Figura 23- Metástase (as células cancerosas invadem tecidos e vasos vizinhos, são transportadas pelo sistema
circulatório a outras partes do corpo, onde invadem e começam a proliferar formando um novo tumor).
Disponível em: http://pdf.rincondelvago.com/cancer_2.html. Acesso em 05 de maio 2008.
O câncer tem sido considerado, dentre outros fatores uma doença do ciclo celular
onde a compreensão dos mecanismos moleculares que produzem proliferação inapropriada,
pode conduzir a identificação de alvos que poderiam ser manipulados terapeuticamente no
combate a tumores (PINES, 1999). Por isso, o câncer precisa ser compreendido nos níveis
molecular e celular, e os incríveis avanços nesta área permitiram uma melhor compreensão
do mesmo, pois ele é o resultado de uma série de transformações nos genes que controlam o
comportamento celular. São essas modificações no material genético, que alteram os
comandos de divisão, diferenciação e morte celular, é que permitem a multiplicação
desenfreada das células cancerosas. Essas células deixam de responder ao mecanismo de
controle do organismo, duplicam-se continuamente para criar os tumores. A ocorrência e a
falta de controle das alterações gênicas nas células cancerosas são objeto de pesquisas
53
intensas em todo o mundo. Assim, estudos sobre o câncer contribuem significativamente
para a nossa compreensão da regulação normal das células e vice-versa.
O câncer é uma enfermidade de caráter genético, pois no inicio de todo processo está
uma alteração no DNA de uma única célula. Essas alterações denominadas mutações são
inevitáveis e mais comuns do que se pensa, pois o DNA (Fig. 24) não é uma molécula
totalmente estável, sendo suas cadeias frágeis e facilmente modificadas. Em vista disso os
seres vivos desenvolveram mecanismos que tentam corrigir esses erros naturais, uma espécie
de sistema de reparo, que é responsável pelo fato do câncer não ser mais freqüente
(RIEGER, 2004).
Figura 24- Estrutura do DNA.
Fonte: Disponível em: http://pt.pandapedia.com/wiki/Imagem:DNA_Overview.png.Acesso em 18 de maio de
2008
A maioria das mutações ocorre no momento da divisão celular, pois quando o DNA
está sendo duplicado, as chances de erro tornam-se maiores. Essas mutações acontecem em
todos os seres vivos e são consideradas como um processo fundamental para a evolução e
diversidade das espécies. Muitas delas não implicam em mudanças na atividade metabólica e
por isso passam despercebidas. Apenas um pequeno número, que ocorrem em genes
específicos, pode determinar o crescimento desordenado das células. Porém para gerar um
tumor são necessárias varias alterações que não causem a morte celular e sim uma
desregulação no mecanismo de crescimento e multiplicação (RIEGER, 2004).
Nenhuma célula se torna cancerosa apenas com uma mutação, então para que o
câncer se instale, é necessário que mutações genéticas se acumulem em nossas células, ou
seja, é necessário tempo. Considerando-se então que o corpo humano contém trilhões de
54
células, bilhões das quais se dividem em determinado tempo, é possível que qualquer uma
delas mude sua composição, porém, como dito anteriormente, uma transformação maligna
requer mais que uma simples alteração genética. O desenvolvimento da malignidade é um
processo de varias etapas. Após se tornar cancerosa a célula acumula mutações, alterando suas
propriedades e fazendo-se mais agressiva. Sua progressão não é nada mais que a inativação de
determinados genes e a hiperexpressão de outros dando origem a células totalmente
independentes. Essas mutações podem originar-se de fatores ambientais/externos (alguns
vírus, substâncias químicas e agentes físicos) e de predisposição genética ou ainda associação
de ambos, ou seja, o câncer é o resultado de agressões genéticas em um indivíduo suscetível
(MACLEOD, 2000; RIEGER, 2004).
Numerosos genes estão envolvidos na carcinogênese e são importantes no estudo dos
tumores, entre eles os protooncogenes, oncogenes (protooncogenes mutados) e genes
supressores de tumor.
Os protooncogenes, são genes que em seu estado natural, codificam proteínas com
várias atividades funcionais, comandando assim a divisão celular de forma ordenada e
fisiológica, sendo um dos muitos tipos de genes responsáveis pelo controle do ciclo celular.
São genes importantes para as células e quando adequadamente regulados não provocam
transtornos no crescimento celular. Sofrem alterações através de mutações, rearranjos,
translocações, entre outras, transformando-se em oncogenes (MACLEOD, 2000).
Os oncogenes são genes mutantes resultantes, como já mencionados, de alterações
ocorridas nos protooncogenes e que se encontram ativados em células cancerígenas,
fornecendo a elas novas propriedades e como conseqüência aumentando a proliferação
celular. Atuam como aceleradores, induzindo uma proliferação anormal, pois codificam
proteínas que ocasionam a perda do controle do crescimento celular, pois seu produto de
expressão (oncoproteína) altera a cascata de eventos do ciclo, promovendo crescimento e
divisão hiperativa, proteção contra morte celular programada, perda do controle dos limites
teciduais entre outras. Os oncogenes são dominantes, basta uma copia do oncogene no
genoma para causar a transformação de célula normal para cancerosa (RIBEIRO et al., 2003;
SILVA et al.; 2003; CROCE, 2008).
Os genes supressores de tumor (GST) ou “antioncogenes” são genes que estão
envolvidos em pontos estratégicos da cadeia de eventos do ciclo celular, e que em seu estado
normal, codificam proteínas que controlam o crescimento e a diferenciação celular, evitando a
multiplicação celular desordenada caso sejam detectadas anormalidades, mantendo assim a
integridade celular. Ora agem interrompendo o ciclo celular, ora levando a célula a apoptose.
55
Os produtos dos GST atuam na verdade como “freios” da divisão celular prevenindo assim o
desenvolvimento de neoplasias. Agem de maneira a estabilizar o genoma criando um
mecanismo de reparo do DNA e ainda inibindo os oncogenes. A perda de sua função, em
decorrência de mutações, está relacionada com a formação de tumores, pois estas mutações
fazem com que a célula ignore um ou mais componentes da rede de sinais inibitórios
resultando em um ritmo descontrolado do crescimento celular. Essas mutações têm caráter
recessivo, ou seja, devem provocar perda de função dos dois alelos para induzir o câncer.
Quando um único alelo é mutado ele não é capaz de induzir neoplasia a não ser que se associe
a eventos adicionais promotores de tumor. Essa perda de um alelo, do gene supressor de
tumor, pode ser herdada ou adquirida (MACLEOD, 2000; HOEIJMAKERS, 2001; KUROSE
et al., 2002; LEVITT HICKSON, 2002; SIMÃO et al., 2002; RIBEIRO et al., 2003;
SILVA et al.; 2003).
Como exemplo de GST podemos citar o gene p53. O gene p53, entre todos os GST, é
o que tem sido estudado mais exaustivamente, pois sua forma mutada está presente em cerca
de 50% dos cânceres humanos. Em sua forma não mutada apresenta um importante papel no
controle do ciclo celular, pois é ativado em resposta a sinais de dano celular. Essa resposta
resulta em um bloqueio do ciclo celular em G
1
, antes de ocorrer a duplicação gênica, para
que possa haver o reparo no DNA. Em caso de dano não reparado, a célula é induzida a
entrar em apoptose. Quando o p53 sofre mutações, as células com danos no DNA,
permanecem no ciclo celular e se tornam possíveis fontes iniciadoras da carcinogênese
(FETT-CONTE SALLES, 2002).
Além dos genes citados, existem ainda os Genes de Reparo do DNA. Esses genes
atuam assegurando que cada informação genética seja copiada de maneira correta durante a
divisão celular, ou seja, entram em ação para reparar os defeitos produzidos após uma
modificação no DNA. Quando a lesão é reparada, a célula continua com seu genótipo e
fenótipo normais. Porém, se o sistema de reparo falha devido a uma inativação do gene por
mutação, ocorre então um aumento na freqüência de outras mutações, causando uma
instabilidade genética que se propaga nas gerações seguintes e pode ser capaz de induzir
transformações neoplásicas (RIEGER, 2004).
Existem ainda os Genes para a apoptose, que são essenciais para regular a população
celular normal em um individuo. Esses genes são numerosos e controlam a morte celular
programada, sendo uns estimuladores e outros inibidores do processo, que assume grande
importância na gênese das neoplasias (NUSSBAUM, 2000).
56
Apoptose ou morte celular programada (Fig. 25, p. 57), por definição, é um
mecanismo pelo qual a célula promove a autodestruição geneticamente mediada, necessária
para eliminar células supérfluas ou defeituosas. Tem papel importante em diversos processos
biológicos vitais, tais como embriogênese, homeostasia celular, renovação de tecidos,
regressão de tumores, desenvolvimento do sistema imune, maturação e a diferenciação
celular, estando relacionada com a homeostase do organismo (DERAKHSHAN, 2007;
PAPALIAGKAS et al., 2007). Entretanto, a apoptose também ocorre em várias situações
patológicas (ZIMMERMANN et al., 2002). É um processo totalmente controlado pela célula
e fundamental para os seres vivos, pois controla o crescimento do organismo; remodela
tecidos; remove células desnecessárias, danificadas, envelhecidas, redundantes ou
potencialmente perigosas como as células tumorais, as infectadas ou as autorreativas (DE
ROBERTIS, 2001; PAPALIAGKAS et al., 2007). Apoptose é um termo cientifico de certa
forma recente, criado para distingui-la de outro processo de morte celular, a necrose.
A necrose (Fig. 25, p.57), por sua vez, é um processo de morte celular passivo,
acidental e sempre patológico, causado por fatores externos como, temperaturas extremas,
radiação, traumas, produtos tóxicos, falta de oxigênio ou ainda fatores biológicos como nas
infecções causadas por vírus ou bactérias (DERAKHSHAN, 2007). É caracterizada por
desequilíbrio osmótico, que faz com que íons normalmente bombeados para fora, fluam
livremente para o interior da célula, levando a um entumecimento da célula e das organelas.
Este entumecimento culmina no rompimento membranar, com liberação de seu conteúdo,
rico em proteases e outras substâncias tóxicas, para o meio extracelular, provocando a
inflamação (PAPALIAGKAS et al., 2007). Este processo, sem gasto de energia, é a
manifestação final de uma célula que sofreu lesões irreversíveis (CUMMINGS et al., 1997;
GUIDUGLI-NETO, 1997).
57
Figura 25- Mecanismos de morte celular: necrose e apoptose. Disponível em: http://www.bioagency.com.br.
Acesso em 03 de maio de 2008.
Ao contrário da necrose, a apoptose apresenta uma característica marcante, ela é
silenciosa, não há, como na necrose, o processo da inflamação, pois as células apoptóticas
são logo reconhecidas por macrófagos e ingeridas antes que se desintegrem, evitando o
derrame do conteúdo celular (SAVILL FADOK , 2000). É um processo ativo com gasto
de energia (HENGARTNER, 2000; DERAKHSHAN, 2007) e que apresenta várias
características morfológicas, bioquímicas e fisiológicas que a distinguem da necrose.
A célula em apoptose diminui de tamanho (encolhe e condensa); o citoesqueleto sofre
colapso, se desorganiza e faz com que a célula perca contato com as células vizinhas ou com
a matriz extracelular, tornando-se esférica; ocorre condensação da cromatina e o DNA sofre
fragmentação, levando a uma fragmentação do núcleo, que se separa, espalhando-se pelo
citoplasma na forma de pequenas esferas de cromatina compacta; a membrana citoplasmática
e as organelas mantêm-se íntegras, mas há formação de vacúolos (KERR et al., 1972;
SAVILL FADOK, 2000; DERAKHSHAN, 2007; PAPALIAGKAS et al., 2007).
Apoptose é um processo rápido e desencadeado por uma cascata de aspartato-cisteína
proteases (caspases), que se encontram solúveis no citoplasma, no espaço intermembrana
mitocondrial e na matriz nuclear de todas as células (DERAKHSHAN, 2007) e quando
58
ativadas desencadeiam um conjunto de alterações funcionais e morfológicas que conduzem a
morte celular. As caspases são proteases de citocinas que existem no citoplasma na forma
inativa denominada de procaspases. Cada procaspase sofre clivagem proteolítica por outros
membros da família de caspases. Ao ser ativada, uma caspase ativa outras procaspases, até
gerar um pequeno número de procaspases denominadas “iniciadoras”, que em outras
seqüências de clivagem geram as caspases “executoras”. Estas destroem proteínas essenciais
a célula e que protegem a mesma da apoptose, clivam a lâmina nuclear e ativam proteínas
tóxicas. Todos os casos levam a morte celular. Em regra, a apoptose é uma resposta celular a
variações que podem ser originadas tanto no seu interior, como no meio externo
(THORNBERRY LAZEBNIK, 1998; DERAKHSHAN, 2007).
A apoptose desencadeada por sinais celulares internos (Fig. 26, p.60), ou seja,
mediada pela via mitocondrial, é regulada pelos membros pró e anti-apoptóticos da
superfamília Bcl-2. O estresse celular induz a translocação de membros pró-apoptóticos
encontrados no citosol, para a superfície da mitocôndria, induzindo a liberação do citocromo
c. Enquanto isso, proteínas anti-apoptóticas da mesma família, trabalham para prevenir a
saída do citocromo c da mitocôndria e preservar a sobrevivência celular (ZIMMERMANN et
al., 2002). Esta interação faz com que ocorra a perda de função por parte das proteínas anti-
apoptóticas. Assim sendo, as proteínas pró-apoptoticas promovem a formação de poros na
membrana mitocondrial, com conseqüente liberação da proteína citocromo c e dos Fatores
Indutores da Apoptose (AIF’s). O citocromo c, uma vez liberado, ativa uma proteína
citoplasmática denominada Apaf-1, a qual recruta e ativa a procaspase 9, formando um
complexo protéico denominado de apoptossoma (ZIMMERMANN et al. 2002;
DERAKHSHAN, 2007). A caspase 9, na sua função de “caspase iniciadora”, irá requerer e
ativar a caspase 3 “executora”, a qual degradará proteínas importantes para a viabilidade
celular e também outras caspases. Já os Fatores Indutores da Apoptose (AIF's), são proteínas
que se situam no espaço intermembranar da mitocôndria e quando liberadas migram para o
núcleo, ligam-se ao DNA, desencadeando sua destruição e conseqüente morte celular.
Outro grupo de proteínas, importante na apoptose desencadeada por sinais celulares
internos, são as proteínas da família IAP (proteínas inibidoras da apoptose), que agem de
duas maneiras: ligam-se as procaspases, inibindo sua ativação ou ligam-se as caspases
inibindo sua atividade, bloqueando assim o processo apoptótico. Contudo, uma proteína
liberada pela mitocôndria junto com o citocromo c, associa-se as IAPs e inibe sua ação,
permitindo a ativação da caspase 9 e favorecendo a apoptose.
59
Um outro caminho existente para que ocorra apoptose, é desencadeado por fatores
externos (Fig. 26, p.60). Estes fatores são determinados “sinais” recebidos ao nível da
superfície celular, por receptores especializados, onde encontramos a família TNFR,
conhecidos como receptores de morte (COULTAS STRASSER, 2003; PAPALIAGKAS
et al., 2007), entre esses se incluem o TNFR1, Fas/CD95 e o TRAIL. Esta via exige sempre
que um determinado ligante, por exemplo o FasL, interaja com o seu receptor, que através de
suas porções citoplasmáticas recrutam proteínas adaptadoras, que se ligam e interagem com
a procaspase 8, que imediatamente clivam originando a caspase 8. Esta, depois de ativada,
torna-se capaz de ativar uma série de caspases executoras que induzem a apoptose. Por
exemplo, a ativação do Fas pelo Fas ligante, resulta no recrutamento da proteína FADD, e
por sua vez, a ligação TNF ao respectivo receptor leva ao recrutamento da proteína
adaptadora TRADD (CHINNAAIYAN et al, 1995; HSU et al, 1995; KUMAR, 2007;
PAPALIAGKAS et al., 2007).
A apoptose pode ainda decorrer da convergência das duas vias, e por ser
indispensável à vida, como vimos, segue um plano meticuloso e totalmente controlado.
Qualquer distúrbio da sua regulação, tanto a ativação quanto a repressão errônea podem levar
a sérios danos no organismo, o que pode provocar uma variedade de doenças. A apoptose
excessiva pode causar doenças neurodegenerativas, como o mal de Alzheimer e o mal de
Parkinson (PAPALIAGKAS et al., 2007); lesões isquêmicas (RENEHAN et al., 2001) ;
hepatites virais (KIM et al, 1998); lesões hepáticas associadas ao álcool (PATEL, 2000);
entre outras. Já a apoptose insuficiente leva ao surgimento de doenças como o câncer,
doenças auto-imunes, algumas infecções virais e ainda a SIDA (WYLLIE et al., 1999;
RENEHAN et al, 2001; MIURA KOYANAGI, 2005 e PAPALIAGKAS et al., 2007).
60
Figura 26- As duas principais vias apoptóticas. Fonte: Disponível em:
http://www.nature.com/nature/journal/v407/n6805/images/407770ac.0.1pg. Acesso em 03 de maio de 2008.
Atualmente existem inúmeras pesquisas na área da apoptose, cujo objetivo é
identificação de moléculas-alvo sobre as quais se deverá atuar farmacologicamente, no
sentido de impedir, retardar ou ainda induzir a mesma. Sabe-se, no entanto, que o
conhecimento dos mecanismos que levam a apoptose é fundamental para se entender e,
posteriormente, se desenvolver terapias que possam eventualmente controlar o desequilíbrio
do processo que é o gerador de tantas doenças. Por isso torna-se de grande importância
pesquisas na área de produtos naturais, pois determinadas substâncias encontradas na
natureza, já demonstram ser capazes de induzir apoptose (Fig. 27, p. 61), como o panaxydol
(HAI et al., 2007), resveratrol (MICHELS et al., 2006), apigenina (CHIANG et al., 2006), 7-
hidroximatairesinol (BYLUND et al, 2005) entre outros, procurando-se dessa maneira
caminhos para a cura de doenças como o câncer.
61
OH
O
panaxydol
HO
OH
OH
resveratrol
7-hidroximatairesinol
O
O
OH
HO
MeO
OMe
OH
apigenina
OHO
OH
OH
O
Figura 27- Estruturas químicas de substâncias encontradas em produtos naturais e que são capazes de induzir
apoptose.
Encontrar uma eficiente terapia para o câncer sem prejudicar os tecidos normais é um
dos maiores desafios da ciência. Sabe-se que poucas moléculas podem induzir a morte de
células cancerígenas sem, no entanto atacar as células saudáveis do organismo.
Pesquisadores tentam encontrar meios para introduzir nos tecidos, moléculas que ataquem
apenas as células tumorais. E embora todas as pesquisas tenham resultado em um marcante
conhecimento das bases celulares e moleculares do câncer, seu benefício ainda é muito
pequeno, quer na prevenção ou ainda no aumento da sobrevida da maioria dos pacientes.
62
O câncer pode afetar pessoas de todas as idades, mas o risco para a maioria dos tipos
de câncer aumenta com o aumento da idade. O câncer causa cerca de 13% de todas as mortes
no mundo, sendo os cânceres de pulmão, estômago, fígado, cólon/reto e mama os que mais
matam (SAVAGE, 2003). E sem duvida o câncer de pulmão é responsável por cerca de 30%
de todas as mortes por câncer. Para se ter uma idéia nos últimos dados publicados sobre a
taxa de mortalidade a que se tem acesso, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima que
cerca de quase um milhão de novos casos de câncer surgirão em 2008 (Fig. 28) e 2009, ou
seja, 466 mil a cada ano (INCA, 2007). A expectativa é a de que haja um aumento na
incidência de todos os tipos de tumores, com exceção dos localizados no estômago e no colo
do útero. O problema é que, enquanto nos países desenvolvidos a incidência aumenta e a
mortalidade diminui, no Brasil a ocorrência e a letalidade estão aumentando (INCA, 2007).
Fig. 28– Tipos de câncer mais incidentes, estimados para 2008, na população brasileira, sem pele não
melanoma. (Fonte: MS/ Instituto Nacional do Câncer – INCA).
No Brasil as estimativas para 2008 apontam que ocorrerá cerca de 470 mil novos
casos de câncer, sendo 231.860 esperados para o sexo masculino e 234.870 para o sexo
feminino. Destes, o câncer de pele do tipo não melanoma será o mais incidente na população
brasileira com 115 mil, mama feminina com 49 mil, pulmão 27 mil, colón e reto 27 mil,
estômago 22 mil e colo de útero 19 mil (INCA, 2007).
63
Os tumores mais incidentes para o sexo masculino (Tab. 1) serão os relacionados ao
câncer de pele não melanoma, com 56 mil casos novos e, esperam-se 49 mil casos de câncer
de próstata, 18 mil de pulmão, 14 mil de estômago e 12 mil cólon e reto. Para o sexo
feminino (Tab. 2, p. 64), destacam-se os tumores de pele não melanoma com 59 mil casos
novos, mama com 49 mil, colo do útero com 19 mil, cólon e reto com 14 mil e pulmão com
9 mil (INCA, 2007).
Tabela 1- Estimativas para o ano 2008 das taxas brutas de incidência por 100.000 e de número de casos novos
por câncer, em homens, segundo localização primária.*
Localização Primária
Neoplasia maligna
Estimativa dos Casos Novos
Estado
Capital
Casos
Taxa Bruta
Casos
Taxa Bruta
Próstata
49.530
52,43
13.990
67,81
Traquéia, Brônquio e Pulmão
17.810
18,86
5.150
24,91
Estômago
14.080
14,92
3.590
17,42
Cólon e Reto
12.490
13,23
4.360
20,99
Cavidade Oral
10.380
11,00
3.000
14,45
Esôfago
7.900
8,35
1.640
7,84
Leucemias
5.220
5,52
1.460
7,06
Pele Melanoma
2.950
3,09
830
3,80
Outras Localizações
55.610
58,87
17.010
82,32
Subtotal
175.970
186,29
51.030
246,97
Pele não Melanoma
55.890
59,16
13.230
64,02
Todas as Neoplasias
231.860
245,47
64.260
310,93
*Números arredondados para 10 ou múltiplos de 10
(Fonte: MS/ Instituto Nacional do Câncer – INCA).
64
Tabela 2- Estimativas para o ano 2008 das taxas brutas de incidência por 100.000 e de número de casos novos
por câncer, em mulheres, segundo localização primária.*
Localização Primária
Neoplasia maligna
Estimativa dos Casos Novos
Estado
Capital
Casos
Taxa Bruta
Casos
Taxa Bruta
Mama Feminina
49.400
50,71
17.400
76,04
Colo do Útero
18.680
19,18
5.620
24,49
Cólon e Reto
14.500
14,88
5.450
23,80
Traquéia, Brônquio e Pulmão
9.460
9,72
3.070
13,49
Estômago
7.720
7,93
2.380
10,30
Leucemias
4.320
4,44
1.340
5,89
Cavidade Oral
3.780
3,88
1.140
4,83
Pele Melanoma
2.970
3,03
930
3,69
Esôfago
2.650
2,72
620
2,30
Outras Localizações
62.270
63,93
22.530
98,39
Subtotal
175.750
180,43
60.480
264,11
Pele não Melanoma
59.120
60,70
14.140
61,73
Todas as Neoplasias
234.870
241,09
74.620
325,77
*Números arredondados para 10 ou múltiplos de 10
(Fonte: MS/ Instituto Nacional do Câncer – INCA).
O câncer é uma doença que pode surgir de várias causas distintas ou associadas, mas
o aumento da expectativa de vida da população brasileira, aliada a uma maior exposição a
fatores de risco, aumentam sua incidência. A tendência é a de que, com o envelhecimento da
população, ele passe a ser a principal causa de morte, como já acontece em alguns países
europeus.
Devido ao impacto que causa na sociedade e da grande esperança em que se possa
desenvolver sua cura, todas as pesquisas desenvolvidas ao longo das décadas, embora
tenham resultado em marcante conhecimento das bases celulares e moleculares do câncer,
apresentam um benefício ainda muito pequeno, quer na prevenção, quer no aumento da
sobrevida da maioria dos pacientes.
65
Alguns fármacos utilizados atualmente para o tratamento do câncer (Fig. 29) se
originam de produtos naturais. São usados da maneira como são isolados ou apresentam
algumas modificações. Entre eles, podemos citar, o paclitaxel (Taxol), isolado a partir da
Taxus brevifolia; a vincristina (Oncovin), isolado de Catharantus roseus; a camptotecina,
isolada da planta Camptotheca acuminata e a podofilotoxina, isolado da Podophyllum
peltatum (OBERLIES KROLL, 2004).
O
OH
NHO O
O
O
O
OH
OH
O
O
O
O
paclitaxel
N
H
N
OH
N
N
HO
COOMe
OCOMeMeO
CHO
vincristina
N
N
O
O
O
OH
camptotecina
MeO
OMe
OMe
O
O
O
O
OH
Podofilotoxina
Figura 29- Estrutura química de fármacos com atividade antitumoral.
66
1.5 Gliomas
No sistema nervoso central (SNC), diversos tipos celulares atuam de forma integrada
para o adequado funcionamento do organismo. Essas células se dividem em dois grupos: as
células neuronais e as células gliais, que são os astrócitos, microglia, oligodendrócitos, e
epêndima (Fig. 30). Recentemente, reconhece-se que a glia modula a função neuronal de
forma dinâmica, em condições fisiológicas e patológicas, e tem como função principal dar
suporte nutricional, sanguíneo além de exercer uma função de suporte ao funcionamento
dessas células (BROCH, 2004).
Figura 30- Neurônio e células que formam a glia: astrócitos, microglia, oligodendrócitos e epêndima. Fonte:
Disponível em: http://www.northland.cc.mn.us/biology/AP2Online/Nervous/images/neuroglia_cell_types.gif.
Acesso em 18 maio de 2008
67
Embora sejam considerados como uma doença rara, os tumores de cérebro vêm
ganhando importância no cenário da epidemiologia do câncer devido ao aparente aumento da
sua incidência e por sua alta letalidade. Mais de 90% dos tumores que atingem o sistema
nervoso ocorrem no cérebro ou nas suas proximidades. Raramente são observados tumores
nas células nervosas propriamente ditas, eles se desenvolvem, principalmente, nas células da
glia (Fig. 30, p. 66). Entre os adultos, os tumores intracranianos mais freqüentes são
meningiomas, neuromas e gliomas (PEREIRA KOIFMAN, 2001).
Glioma é o termo utilizado para designar os tumores originários das células da glia
encefálica, essas células se encontram ao redor dos neurônios assim como em meio aos
axônios neuronais. E, seguindo a mesma nomenclatura das células que formam a glia, os
gliomas podem ser divididos em quatro grandes grupos, de acordo com a semelhança
histológica (Fig. 31, p. 68) entre as suas células e as células gliais, e podem ser: astrocitomas,
glioblastomas, oligodendromas e ependimonas (PEREIRA KOIFMAN, 2001).
Os gliomas, na grande maioria dos casos, se originam de uma mutação espontânea
em genes que controlam o ciclo celular ou divisão celular, porém os fatores desencadeantes
para tal mutação não são ainda bem conhecidos para a maioria dos casos. Homens e
mulheres são afetados igualmente, porém a idade adulta é mais afetada. São os tumores
primários mais comuns que afetam o cérebro, representando 50 a 60% dos tumores cerebrais
e a maioria surge ocasionalmente e não tem caráter hereditário; entretanto, pacientes com
gliomas freqüentemente têm uma história familiar de diversos tipos de câncer. Os tumores
cerebrais primários raramente formam metástases, porém, muitos cânceres metastatizam para
o cérebro, fazendo com que tumores cerebrais metastáticos sejam mais comuns do que
tumores cerebrais primários (MARRONE, 2002).
Uma das principais características dos gliomas é o seu alto poder invasivo e a
destruição do tecido normal localizado ao redor do cérebro (RAO et al., 2001). O tratamento
de primeira linha para os tumores cerebrais consiste em cirurgia associada a radioterapia,
seguida ou não de quimioterapia, e apesar do tratamento, gliomas malignos recorrem cedo,
levando a uma sobrevida média inferior a 12 meses (BURGER et al., 1985; BRANDES et
al., 1999). As causas da recorrência parecem ser, principalmente, a alta proliferação, a
invasividade e a resistência à radiação apresentada por estas células tumorais
(AVGEROPOULOS BATCHELOR, 1999).
68
Fig. 31- Histologia de gliomas. (A) Astrocitomas, (B) Glioblastomas, (C) Oligodendroglioma, (D)
Ependimona. Disponível em: http://www.fcm.unicamp.br/deptos/anatomia/taneugliomas.html. Acesso em
23 de maio de 2007.
Como se sabe, a cirurgia raramente remove todo o tumor, e a maioria dos pacientes é
tratada com radioterapia pós-operatória, geralmente aplicada em pequenas frações diárias
(LAWS SHAFFREY, 1999), e embora não sendo curativa, ela melhora os sintomas e
aumenta a sobrevida dos pacientes (WALKER et al., 1980). Estes benefícios justificam o uso
contínuo de radiação pós-operatória em tumores malignos (WEISS, 1995).
A quimioterapia, entretanto, não muda substancialmente a prognose. Quando
empregada como medida de precaução, faz com que a recorrência seja diminuída e a duração
média de sobrevida prolongada, apenas levemente. Mas apesar da quimioterapia adjuvante
não apresentar resultados muito animadores no tratamento de gliomas malignos, estudos
clínicos têm demonstrado a eficácia de um grande número de fármacos, quando combinados
com radioterapia (MARRONE, 2002).
Nos últimos anos, muitos mecanismos moleculares têm sido explorados como novos
alvos para o desenvolvimento de drogas, na esperança de uma maior atividade antitumoral e
A
B
C
D
69
menor toxicidade no tratamento ao paciente, em relação ao que ocorre com os medicamentos
atualmente utilizados. Entretanto, a instabilidade do tumor que pode levar à resistência, é um
problema que cresce, e ainda carece de estudos que verifiquem se estas novas drogas vão
oferecer vantagens de sobrevivência aos pacientes (AVGEROPOULOS et al., 1999; GIBBS,
2000). Por isso, modelos experimentais de gliomas são desenvolvidos em várias espécies de
animais com a finalidade de estudar tanto a biologia tumoral como a eficiência de novas
drogas e novos tratamentos em gliomas malignos humanos. Portanto, uma grande variedade
de modelos experimentais foi estabelecida em neuroncologia durante as últimas décadas
(MICHAILOWSKY et al., 2003).
Algumas linhagens celulares de glioma em ratos foram induzidas por injeções
sistêmicas ou transplacentárias de nitrosuréias; destas, a linhagem 9L e a C6 (utilizada neste
trabalho), são as mais empregadas para o desenvolvimento de tumores experimentais
(MICHAILOWSKY et al., 2003).
70
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Estudar fitoquimicamente a espécie Ficus citrifolia e investigar em linhagens
celulares as atividades biológicas das substâncias isoladas.
2.2 Específicos
Estudar espécies amazônicas com potencial ação biológica, que apresentem utilização
na medicina popular.
Contribuir para o inventário das espécies do gênero Ficus.
Promover o isolamento e a purificação dos compostos majoritários da planta através
de métodos cromatográficos.
Promover a identificação estrutural dos compostos isolados através de métodos
espectrométricos.
Realizar, se necessário, modificações estruturais nos compostos isolados.
Avaliar o efeito antiproliferativo das substâncias isoladas, na linhagem C6 de glioma
de rato, através do método de incorporação da
3
H-Timidina
Avaliar a citotoxidade na linhagem C6 e na cultura astrocitária, pela técnica de MTT,
após intoxicação com as substâncias a serem testadas, em diferentes concentrações e
diferentes tempos.
Caracterizar a morfologia nuclear através do marcador de DNA Hoechst 33342, para
avaliar do tipo de morte celular.
Analisar a ultraestrutura celular da linhagem C6, após intoxicação com as substâncias
isoladas, através da Microscopia Eletrônica de Transmissão, para avaliar o tipo de
morte celular.
71
3 PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Materiais e métodos
Os solventes comerciais utilizados na preparação dos extratos brutos vegetais, na
cromatografia em coluna por via úmida (CCVU), cromatografia em camada delgada
comparativa (CCDC) e cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) foram:
hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol das marcas Merck, Grupo Química, Synth,
Quimex e Nuclear; PA e/ou tratados na sala de destilação da Faculdade de Química da
Universidade Federal do Pará.
A evaporação dos solventes foi realizada à pressão reduzida utilizando-se
evaporadores rotativos da marca Büchi, modelo 461 e Quimis, modelo Q-344-2 a
temperaturas em geral de 40 a 60ºC.
Para as solubilizações das substâncias isoladas, objetivando o preparo das soluções a
serem testadas, utilizou-se clorofórmio da marca Merck e no preparo da solução mãe, para os
testes de atividade biológica, utilizou-se DMSO da marca Sigma.
Nas separações por CCVU empregou-se colunas de vidro com diâmetro e altura
variando em função da quantidade de amostra e como fase estacionária, sílica gel 60H (70-
230 mesh) da Merck com diâmetro de partícula aproximado de 15m, obedecendo a relação
de 30g de sílica por grama de amostra.
Nas CCDC foram utilizadas placas de vidro 5x10 ou 10x20cm, preparadas com sílica
gel 60 GF
254
da Merck e com 0,5mm de espessura, as quais foram ativadas em estufa a
100ºC por 1h.
Em camada delgada preparativa (CCDP) foram utilizadas placas de vidro de 20x20
cm, preparadas com camada de sílica gel 60 PF
254=366
da Merck com 0,5 mm de espessura.
As placas de CCDP foram reveladas por irradiação com luz UV (254 e 365nm),
enquanto que as placas de CCDC foram reveladas com luz UV e sulfato cérico.
Os espectros de RMN foram obtidos na UFPA, em espectrômetro Varian, modelo
Mercury 300, operando a 300 MHz para hidrogênio e 75 MHz para carbono e utilizando
como solventes CDCl
3
, CD
3
OD e Pyr-D
5
da marca Merck, Sigma e Aldrich.
As amostras foram pesadas em balança analítica Sartorius BP2105.
Para os testes aplicados com as substâncias isoladas, foram utilizadas duas linhagens
celulares: C6 de Glioma de rato cedida pelo Laboratório de Morfogênese Celular da
72
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) e Astrócitos isolados do córtex cerebral de
ratos do tipo Wistar e obtidas no próprio Laboratório de Neuroquímica Celular e Molecular
(UFPA).
Para todos os experimentos com linhagens celulares utilizou-se o meio de cultura
DMEMF12 (Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumHam’s F12 1:1) da Gibco,
suplementado com 10% de soro fetal bovino e 40000U/L de penicilina/estreptomicina.
Para a realização dos testes, as substâncias isoladas foram diluídas para uma solução
mãe a 2 mM em DMEMF-12 e a partir desta foram preparadas as concentrações utilizadas
nos experimentos (50, 100, 250 e 500 M). Como grupo controle utilizou-se apenas meio
contendo soro e como veículo 0,25 e 0,50% de DMSO em DMEMF-12 com soro,
quantidades essas, semelhantes às apresentadas no tratamento com a maior concentração de
droga, conforme o experimento realizado.
Em todas as lavagens realizadas nas culturas utilizou-se tampão de sódio fosfato
(phosphate buffer solution-PBS).
Para degradar as proteínas de adesão celular e descolar as células das garrafas,
utilizou-se tripsina com 0,05% EDTA.
Para incubação das culturas utilizou-se estufa de CO
2
da Lab-line com 95% de ar e
5% de CO
2
em 37ºC de temperatura.
A contagem das células para os experimentos foi realizada em Câmara de Newbauer,
a partir de uma amostra diluída 5 vezes com azul tripan (corante). Essa contagem é
necessária para se obter uma relação de quantidade de células em 1mL de ressuspenso.
Para observação das células utilizou-se Microscópio invertido da marca Nikon,
modelo TMS-F.
Nas centrifugações utilizou-se centrífuga Excelsa baby - FANEM, modelo 208-N.
Para o método de incorporação da
3
H-timidina, utilizou-se solução de
3
H-timidina (0,5
µCi/mL), SDS 0,1% (dodecil sulfato de sódio) e papel de Boro silicato (SIGMA). A leitura de
incorporação de
3
H-Timidina foi feita através de um cintilador líquido, sendo o liquido de
cintilação, formada por Tolueno e POP (2,5 difeniloxazolil) mais POPOP (1,4 bis[2-(5-
feniloxazolil)]benzeno).
Para o teste da Viabilidade celular utilizou-se o corante MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-
2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), um sal de cor amarela na forma oxidada e que se
torna reduzido e de coloração azul em células ditas viáveis. Essa coloração é produzida nas
mitocôndrias por desidrogenases mitocôndrias. A absorvância, no ensaio do MTT, foi
73
medida no comprimento de onda de 570 nm em um espectrofotômetro do tipo Spekol 1100-
Zeiss.
Na análise da morfologia nuclear utilizou-se o corante Hoechst 33342 (SIGMA).
Para análise ultraestrutural das células em Microscópio Eletrônico de Transmissão,
foram utilizados: glutaraldeido tipo II, paraformaldeído, sacarose, tampão cacodilato de
sódio 0.1 M, pH 7.2, tetróxido de ósmio, ferrocianeto de potássio 0,8%, acetona, resina
Epon. Para o corte dos blocos polimerizados foi utilizado ultramicrótomo (Leica EM UC6) e
os cortes obtidos contrastados com acetato de uranila 5%, e citrato de chumbo. A observação
das células foi feita em Microscópio da marca LEO 906 E.
3.2 Avaliação Fitoquímica
A avaliação fotoquímica foi realizada no Laboratório de Produtos Naturais, Instituto
de Química, Universidade Federal do Pará.
3.2.1 Coleta e identificação da planta
As folhas de um espécime de Ficus citrifolia (Moraceae) foram coletadas na reserva
da Embrapa-PA e identificadas por um especialista da mesma. A exsicata da planta foi
catalogada sob o n164987 e encontra-se depositada no Herbário da instituição.
3.2.2 Obtenção dos extratos brutos
Após a coleta, as folhas foram secas em estufa de circulação de ar a 45C, e
pulverizadas em moinho de facas, resultando num total de 3,1 Kg de material vegetal. Esse
pulverizado foi submetido à extração a frio, sucessivamente, com solventes em ordem
crescente de polaridade: hexano, diclorometano e metanol. As soluções resultantes foram
concentradas sob vácuo em evaporadores rotativos, obtendo-se, com esse procedimento, os
respectivos extratos com 55,8; 30,6 e 32,5g (Fig. 32, p. 76). Após a análise dos extratos por
RMN de
1
H, observou-se a presença de compostos aromáticos no extrato diclorometânico,
fato que direcionou a investigação fitoquímica.
74
3.2.3 Fracionamento do extrato diclorometânico das folhas de Ficus citrifolia (Fig. 33, p. 77)
Uma alíquota do extrato diclorometânico (20,0 g) foi fracionado através de coluna
cromatográfica por via úmida (CCVU), utilizando-se como fase móvel hexano, acetato de
etila e metanol, puros e em graus crescentes de polaridade. Foram coletadas 56 frações, com
aproximadamente 200mL cada e que, após monitoramento via CCDC e revelação com
sulfato cérico, foram reunidas em 8 grupos, aquelas que apresentavam o mesmo perfil
cromatográfico, e codificadas de acordo com o quadro 4. Os grupos de frações EDFFC-3
(3,15g) e EDFFC-6 (1,17g), após análise por RMN
1
H, foram submetidos a novos
fracionamentos cromatográficos e a purificações.
Quadro 4. Grupos de frações obtidas da CCDC do extrato diclorometânico das folhas de Ficus citrifolia
Código
Frações
reunidas
Massa (g)
Sistema de solvente
Substância isolada
EDFFC-1
1-13
3,87
Hexanoacetato 5%
Não trabalhada
EDFFC-2
14-27
2,92
Hexanoacetato 25%
“
EDFFC-3
28-29
3,15
Hexanoacetato 50%
Arctigenina
Matairesinol
EDFFC-4
30-33
0,76
Acetato
Não trabalhada
EDFFC-5
34-38
0,35
Acetatometanol 5%
“
EDFFC-6
39-43
1,17
Acetatometanol 25%
Arctiina
EDFFC-7
44-50
2,81
Acetatometanol 50%
Mistura complexa de
substâncias polares
(não trabalhada)
EDFFC-8
51-56
1,35
Metanol
“
75
3.2.3.1 Estudo da fração EDFFC-3 (3,15g).
A CCVU do grupo EDFFC-3 sob sílica gel 60H, eluída com hexano, acetato de etila
e metanol, puros e com gradientes crescentes de polaridade, forneceu 142 frações, todas
monitoradas via CCDC, reveladas com sulfato cérico e reunidas aquelas que apresentavam
mesmo perfil. As frações 48-53 (306,7 mg), obtidas desta coluna, foram reunidas e
refracionadas também em CCVU, eluída com diclorometano e metanol em diferentes
proporções, fornecendo 211 frações, das quais se isolou a lignana arctigenina (52,3 mg), que
após acetilação forneceu a arctigenina acetilada. As frações 58-65 foram purificadas por
CCDP e após serem analisadas por RMN
1
H chegou-se a conclusão de tratar-se da lignana
matairesinol (49,2 mg).
3.2.3.2 Estudo da fração EDFFC-6 (1,17g).
A fração EDFFC-6 foi submetida a CCVU, usando-se como eluente hexano,
diclorometano e metanol, puros e com gradientes crescentes de polaridade, obtendo-se 123
frações, das quais, as frações 60-65 após CCDC e análise por RMN
1
H foram reunidas,
submetidas a um novo fracionamento de onde se isolou a lignana arctiina (89,11 mg).
76
Figura 32- Fluxograma de obtenção dos extratos brutos das folhas de Ficus citrifolia.
Extração à frio com metanol
Material botânico
seco e moído
(folhas)
3,1Kg
Solução
hexânica
Resíduo
Extrato hexânico
55,8 g
Solução
diclorometânica
Extrato
metanólico
32,5 g
Resíduo
Solução
metanólica
Extrato
diclorometânico
30,6 g
Resíduo
Concentração em Evaporador
rotativo
Concentração em Evaporador
rotativo
Concentração em Evaporador
rotativo
Extração à frio com hexano
Extração à frio com diclorometano
77
CCVU
Hexano/ acetato / metanol
56 frações (200mL)
CCVU
Hexano/acetato/ metanol Hexano/diclorometano/metanol
142 frações 123 frações
CCVU CCDP
CH
2
Cl
2
/ CH
3
OH
Acetilação
Figura 33- Fluxograma do fracionamento do extrato diclorometânico das folhas de Ficus citrifolia.
EDFFC-3
3,15 g
Fr. 58-65
Lignana
Arctigenina
52,3 mg
(52,3mg)
Fr. 48-53
306,7 mg
Lignana
matairesinol
(49,2 mg)
Arctigenina
acetilada
EDFFC-6
1,17 g
Fr. 60-65
Lignana
arctiina
(89,1 mg)
Extrato diclorometânico das
folhas de Ficus citrifolia
20,0 g
78
3.2.4 Obtenção de derivados
3.2.4.1 Acetilação de S2 (arctigenina).
A um balão de fundo redondo contendo 10 mg da substância arctigenina foram
adicionados 0,2 mL de anidrido acético e 0,2 ml de piridina deixando a mistura em repouso e à
temperatura ambiente, durante 24 horas. Após a completa reação, transferiu-se a mistura para
um funil de separação contendo 20 mL de água gelada e a solução resultante, foi submetida á
extração com 20 mL de diclorometano. Após total separação da fase orgânica, esta foi lavada
com 10 mL de solução de ácido clorídrico à 10%, para eliminar a piridina presente; esse
processo repetiu-se por 3 vezes e em seguida a fase orgânica foi lavada com água. A solução foi
filtrada e seca com sulfato de sódio anidro. O solvente foi evaporado fornecendo S2Ac.
3.3 Avaliação Biológica
A avaliação biológica foi realizada no Laboratório de Neuroquímica Molecular e
Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará.
3.3.1 Cultivo da linhagem C6 de glioma de rato
A linhagem C6, constituída de células tumorais de ratos, é freqüentemente utilizada
como modelo de função glial, por ser um modelo apropriado para o estudo da biologia do
câncer e para pesquisa de novos agentes com atividades terapêuticas (MICHAILOWSKY et
al., 2003). As células congeladas em nitrogênio líquido, aproximadamente 10
6
células por
mL, foram descongeladas rapidamente em banho-maria a 37ºC, e adicionadas a 9 mL de
meio DMEM-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 40000U/L de
penicilina/estreptomicina, e em seguida centrifugadas a 1500 rpm, por 5 minutos. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado de células re-suspendido, mecanicamente, em 2
mL de meio. Em seguida, foram lançadas em garrafa de 25 cm
2
, com 3 mL de meio,
mantidas em estufa com atmosfera de 5% de CO
2
e 95% de ar a 37ºC, e efetuando-se a troca
do meio a cada dois dias. Após uma semana as células de uma garrafa foram retiradas da
79
mesma utilizando-se tripsina, em seguida divididas e lançadas em novas garrafas até a
realização dos experimentos.
3.3.2 Cultivo da cultura primária de astrócito de rato
Os Astrócitos foram isolados em meio de cultura DMEM-F12 (GIBCO). O cérebro
de ratos tipo Wistar foi dissecado, tendo as meninges retiradas e o córtex cerebral separado
das outras estruturas e transferido para uma solução de tripsina com 0,05% de EDTA e
picotado por 5 minutos em temperatura ambiente. Após esse tempo, adicionou-se à solução
DMEM-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (2,5 mL/L de penicilina e 2,5
mL/L de estreptomicina) para inativar a tripsina. Deixou-se então, a solução decantar por 10
minutos, coletou-se o sobrenadante, deixando o mesmo decantar por mais dez minutos. Após
nova coleta do sobrenadante, este foi centrifugado por 5 minutos a 3000 rpm. Descartou-se
em seguida o sobrenadante e o Pelet formado foi ressuspendido em 5 mL do mesmo meio de
cultura (DMEM F-12 com soro) e lançado em garrafas de 25 cm
2
. A incubação foi feita a
37ºC em atmosfera de 5% de CO
2
, trocando-se o meio a cada 24 horas. Ao atingir a
confluência desejada (de 10 a 14 dias de cultivo), os astrócitos foram retirados da garrafa de
cultura e lançados em placas de 24 poços numa densidade de aproximadamente 50.000
células por poço. Esta cultura foi utilizada somente para testes de viabilidade celular.
3.3.3 Plaqueamento das células C
6
Ao atingirem uma confluência apropriada para o trabalho, as garrafas contendo as
células da linhagem C
6
foram lavadas duas vezes com 5 mL de tampão de sódio fosfato
(PBS), e tripsinizadas com 2 mL de tripsina 0,05% / EDTA em PBS por 5 minutos e após
esse tempo, adicionou-se 3 mL de meio com soro para inativação da tripsina. As células
foram em seguida centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos. Descartou-se, então, o
sobrenadante e o precipitado de células foi ressuspenso em 4 mL de meio, efetuando-se a
contagem das células que é realizada utilizando-se a câmara de Newbauer, a partir de uma
amostra diluída 5 vezes com azul tripan.
Após contagem, foram lançadas cerca de 50.000 células por poço, em placa de 24
poços, com volume final de 500 L por poço, sendo mantidas em estufa com uma atmosfera
80
de 5% de CO
2
a 37ºC, com meio de cultura trocado a cada 24 horas até atingirem
confluência adequada para o tratamento com as substâncias.
3.3.4 Tratamento com as substâncias isoladas.
Ao atingirem densidade apropriada, as células contidas nas placas foram tratadas com
as substâncias arctigenina e matairesinol. Essas foram diluídas para o preparo de uma
solução mãe a 2 mM em DMEM-F12, contendo 2% de DMSO. A partir desta solução foi
realizado o tratamento nas culturas, com as concentrações de 50, 100, 250 e 500 µM por 72
horas (sem troca de meio), para determinação de uma curva de concentração com a linhagem
C6 e com a cultura de astrócitos, posteriormente com 250 µM nos tempos de 18, 36, 54 e 72
horas, para a construção de uma curva de tempo somente com a linhagem C6; ambos os
experimentos em meio DMEM-F12 com soro. Como grupo controle foi utilizado apenas
meio contendo soro e como veículo (grupo controle do uso do DMSO) foram utilizados
0,5% para a curva de concentração e 0,25% de DMSO em DMEM-F12 com soro, para a
curva de tempo, quantidades essas semelhantes às apresentadas no tratamento com a maior
concentração de droga, conforme o respectivo experimento. Em todos os grupos foram
utilizados n=4.
3.3.5 Avaliação do Efeito antiproliferativo (Método: Incorporação de
3
H- Timidina).
Esse método foi utilizado para avaliar a proliferação celular, fazendo-se a
monitoração de DNA genômico, pois a proliferação celular depende de sua síntese. A
3
H-
Timidina incorporada ao DNA tem sido usada como marcador de replicação.
Neste experimento foram utilizados quatro grupos (n=4) para cada substância
sendo: controle; veículo e dois grupos tratados com arctigenina e matairesinol. O grupo
controle era constituído somente com meio de cultura DMEMF-12 suplementado com 10%
FBS e antibióticos (2,5 mL/L de penicilina e 2,5 mL/L de estreptomicina), o grupo do
veículo apresentava meio de cultura mais 0,5% de DMSO, e os dois outros grupos foram
tratados com 1 µM e 10 µM de arctigenina e matairesinol durante 24 horas.
Seis horas antes do término do tratamento com as substâncias, adicionou-se ao
meio de cultura 15 µL de solução de
3
H-timidina (0,5 µCi/mL). Após esse tempo o meio de
cultura foi retirado e as células foram lisadas na presença de 0,1% de SDS (dodecil sulfato de
sódio), em seguida colocadas sobre papel de Boro silicato (SIGMA) e levado à estufa na
81
temperatura de 100°C. Após secagem, o papel de boro silicato contendo o material celular,
foi colocado em tubos de cintilação contendo 5 mL de líquido de cintilação, formada por
Tolueno e POP mais POPOP, em seguida, a radioatividade foi medida por cintilação líquida.
3.3.6 Teste de Viabilidade Celular.
O ensaio de viabilidade celular foi realizado para verificar o efeito das drogas
arctigenina e matairesinol, nas diversas concentrações, previamente estabelecidas, na
linhagem C6 de glioma de rato e na cultura de astrócitos (córtex de rato). Os parâmetros de
avaliação observados são a porcentagem de morte celular. Utilizou-se para o experimento
seis grupos para cada substância, sendo: controle, veículo, e quatro grupos com diferentes
concentrações de arctigenina e matairesinol. Para avaliar a citotoxicidade, após o término do
tratamento com as substâncias, utilizou-se o método de análise fotocolorimétrica com o
corante MTT (thiazolyl blue), isto é, ensaio de viabilidade celular proposta por Tim
Mosmann (1983) com alterações. Esta técnica consiste na redução do composto MTT por
enzimas desidrogenases mitocondriais presentes somente em células metabolicamente ativas.
Esse composto em sua forma oxidada possui coloração amarela, mas adquire coloração azul
em sua forma reduzida, levando à formação de um composto insolúvel no interior das células
viáveis, o formazam, o qual pode ser lido em espectrofotômetro com λ=570 nm.
Ao término das 72 h de incubação com as substâncias, as células foram lavadas com
PBS. Adicionou-se em cada poço 500 µL de PBS e 50 µL da solução de 5 mg/mL de MTT,
sendo a placa mantida em estufa com atmosfera de 5% de CO
2
a 37ºC ao abrigo de luz, pelo
período de 4 horas.
Após esse período, foi adicionado a cada poço 50 µL de uma solução de álcool
isopropílico, com a finalidade de solubilizar os cristais de formazan, sendo as células
raspadas, homogeneizadas e assim então efetuada a leitura em espectrofotômetro,
calibrando-se o aparelho com uma amostra contendo 500 µL de PBS, 50 µL de MTT a 5
mg/mL e 50 µL da solução alcoólica.
Os resultados foram analisados através da absorvância de cada poço. Os
experimentos foram realizados em triplicatas.
82
3.3.7 Caracterização da Morfologia Nuclear
Para observação da forma nuclear e visualização das alterações cromáticas típicas de
apoptose (fragmentação e condensação), após o tratamento da linhagem C6 com arctigenina
e matairesinol, utilizou-se o marcador de DNA Hoechst 33342 (Sigma), um corante
específico excitável a luz UV e capaz de ligar-se as bases A-T. Foram preparadas 4 laminas
para cada substância: grupo controle (DMEM-F12 com soro), controle positivo (DMEM-F12
com soro exposto a luz ultravioleta por 15 minutos em aparelho transiluminador a fim de se
ter um padrão de fragmentação de DNA), veículo (DMEM-F12 com soro e 0,5% de DMSO)
e um grupo tratado com cada uma das substâncias na concentração de 250 µM por 48 horas.
As células foram incubadas à 37ºC em meio DMEM-F12 com 10% de Soro Bovino
Fetal. Após atingirem a confluência desejada, foram tratadas com as substâncias durante 48
horas na concentração de 250 µM. Após o tratamento, as células foram lavadas com PBS e
fixadas com paraformoldeído 4% em PBS durante 30 minutos, lavadas com PBS por quatro
vezes e incubadas com 300 µL de Hoechst 33342 (2µg/mL em PBS), durante 30 minutos,
em temperatura ambiente. Ao final desse tempo, o marcador foi retirado e as células fixadas
sobre as lâminas com N-propil-galato como substância de adesão. Os núcleos corados foram
visualizados em microscópio de Fluorescência e fotografados. Os filtros utilizados foram de
365 nm de excitação e 420 nm de emissão.
3.3.8 Avaliação da linhagem C6 por Microscopia eletrônica de transmissão
Células C6 de glioma de rato foram cultivadas em placas de cultura de 24 poços
como descrito no item 3.3.1. Um grupo das mesmas foi exposto a luz UV, durante 15 minutos
em aparelho transiluminador, para obtenção de um controle positivo. O outro grupo foi
tratado por 72 horas nas concentrações de 50 e 250 µM. Posteriormente, os dois grupos de
células foram fixados em uma solução contendo 2,5% de glutaraldeido tipo II, 4% de
paraformaldeído, 2.5% de sacarose, em tampão cacodilato de sódio 0.1 M, pH 7.2, Após a
fixação as células foram lavadas 3 vezes em Tampão cacodilato 0.1 M e posteriormente
incubadas em solução contendo: 1% tetróxido de ósmio, ferrocianeto de potássio 0,8% por 1
hora à temperatura ambiente. As células foram lavadas três vezes em tampão cacodilato 0.1 M
e então desidratadas em série crescente de acetona durante 10 minutos à temperatura
ambiente. Após desidratação as células foram lentamente impregnadas em resina Epon nas
83
seguintes concentrações: 2:1, 1:1 e 1:2 (acetona 100%: Epon - 12 horas em cada etapa). A
seguir o material foi colocado em Epon puro por 6 horas e depois no suporte para
polimerização a 60
o
C por 48 horas. Os blocos polimerizados foram cortados em
ultramicrótomo (Leica EM UC6) e os cortes obtidos foram contrastados durante 20 minutos
com acetato de uranila 5%, e posteriormente durante 5 minutos com citrato de chumbo (DE
SOUZA, et al., 1998) e observados em Microscópio Eletrônico de Transmissão LEO 906 E.
3.3.9 Análise Estatística
A análise dos resultados foi efetuada utilizando-se o aplicativo Microsoft Excel 2003.
Para a análise estatística, foi utilizada a análise de variância de uma via (ANOVA), um
critério seguido pelo teste Bonferroni, com a p˂0,05, utilizando como ferramenta o
aplicativo BioEstat 4.0.
84
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Resultados obtidos na Avaliação Fitoquímica
4.1.1 Determinação e identificação estrutural das substâncias isoladas
O estudo do extrato diclorometânico das folhas de um espécime de Ficus citrifolia,
levou ao isolamento de três lignanas do tipo dibenzilbutirolactona arctiina S1, arctigenina S2
e matairesinol S3. A escolha do extrato foi feita com base no relato da literatura de que o
mesmo demonstra possuir potencial terapêutico importante para melhorar a eficácia da
quimioterapia de câncer (SIMON et al., 2001) e ainda, com base na análise dos espectros de
RMN
1
H dos extratos obtidos da planta, onde ele se mostrou o mais promissor, pela presença
de sinais de hidrogênios aromáticos, visando o isolamento de compostos fenólicos. Para
determinação estrutural de todas as substâncias, foram feitas análises de RMN
1
H e RMN
13
C, além de DEPT, NOE diff, HETCOR, COSY
1
H x
1
H e HMBC. As estruturas foram
confirmadas também por comparação com dados obtidos da literatura.
4.1.1.1 Determinação estrutural de S1 (arctiina)
A substância S1 (89,1mg) foi isolada na forma de um óleo de coloração amarela,
solúvel em metanol.
Para a determinação estrutural foram obtidos espectros de RMN
1
H, RMN
13
C,
DEPT, HETCOR, COSY
1
H x
1
H e HMBC que, aliados aos dados existentes na literatura
(Rahman et al, 1990), permitiram atribuir para S1
a estrutura de uma lignana.
O espectro de RMN
1
H obtido a 300 MHz em metanol deuterado (Fig. 53, p. 124/
Tab. 3, p. 90), auxiliado pela respectiva expansão (Fig. 54, p. 125), revelou a presença de
sinais entre δ
H
6,50 e 7,10, atribuídos a hidrogênios ligados a anéis aromáticos, com padrão
de substituição do tipo orto, orto/meta e meta. Estes sinais são:
Dois dubletos (δ
H
7,04 e 6,82) com constantes de acoplamento características de
hidrogênios orto relacionados (J= 8,2 e 8,5 Hz).
Dois duplos dubletos (δ
H
6,64 e 6,59) com constantes de acoplamento típicas de
hidrogênios orto/meta relacionados (J= 8,2/1,8 e 8,5/1,9 Hz).
85
Dois dubletos (δ
H
6,74 e 6,58) com constantes de acoplamento de hidrogênios meta
relacionados (J= 1,8 e 1,9 Hz).
A existência de uma unidade butirolactônica, ligada aos anéis benzílicos, foi
observada pela presença dos seguintes sinais (Figs. 53-55, pp. 124-126): δ
H
4,19 (dd, J = 9,0
e 7,1 Hz, H-9a), δ
H
3,94 (dd, J = 9,0 e 7,4 Hz, H-9b); δ
H
2,91 (dd, J = 13,7 e 5,5 Hz, H-7’a),
δ
H
2,82 (dd, J = 13,7 e 7,1 Hz, H-7’b); δ
H
2,68 (~q, J = 6,0 Hz, H-8’); δ
H
2,40-2,60 (m, H-
7/H-8).
Na região de δ
H
3,20 a 5,00 foram observados sinais de hidrogênios ligados a
carbonos oxidados, atribuídos a uma unidade de açúcar (Fig. 53, p. 124).
Foram observados ainda dois sinais, um de maior intensidade em δ
H
3,80 e outro em
δ
H
3,79, atribuídos a três metoxilas ligadas a anel aromático.
O espectro de RMN
13
C obtido a 75 MHz em metanol deuterado (Fig. 56, p. 127/
Tab. 4, p. 91), auxiliado por sua expansão (Fig. 57, p. 128), revelou a presença de 27 sinais
de carbono, que tiveram seu padrão de hidrogenação atribuído através da análise do espectro
DEPT (Fig. 58, p. 129). A avaliação conjunta desses espectros, auxiliada ainda pelos sinais
observados no espectro de HETCOR (Fig. 59, p. 130/ Tab. 5, p. 92) e expansão (Fig. 60, p.
131), permitiu confirmar a presença de dois anéis benzênicos, visto que foram observadas
correlações dos sinais de carbono, com os correspondentes sinais no espectro de RMN
1
H, na
região de δ
H
6,50 a 7,10, característica de compostos aromáticos. Além desses sinais, foi
observado ainda, um sinal em δ
C
181,3, assinalado a carbono carbonílico de anel lactônico, e
um outro sinal em δ
C
102,9, característico de carbono anomérico, que confirma a presença da
unidade de açúcar.
Levando-se em consideração a análise dos dados espectrométricos acima citados,
chegou-se a conclusão que S1 tratava-se de uma lignana do tipo dibenzilbutirolactona
(Fig.34, p.86).
86
I
3
O
O
7
8
9
8
'
9
'
4
'
6
'
A
B
5
2
'
Figura 34- Esqueleto básico de lignanas dibenzilbutirolactonas.
Com base no padrão de substituição orto, orto/meta e meta para os anéis aromáticos
(dois conjuntos) observados no espectro de RMN
1
H, S1 poderia apresentar oxidações para
os anéis A e B, respectivamente, nos carbonos 2/4 e 2'/4'; 2/4 e 3'/4', 3/4 e 2'/4' e ainda 3/4 e
3'/4', resultando nas possibilidades estruturais apresentadas na figura 35.
9
'
8
'
9
8
7
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
7
8
9
8
'
9
'
II
III
V
IV
9
'
8
'
9
8
7
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
7
8
9
8
'
9
'
7
'
7
'
7
'
7
'
Figura 35- Esqueletos de estruturas prováveis para S1, S2 e S3 com base nos possíveis padrões de oxidação dos
anéis aromáticos.
87
Pela análise dos sinais no espectro de HMBC (Fig. 66, p.137, Tab. 5, p. 92), foi
possível confirmar que os duplos dubletos a δ
H
2,91 e δ
H
2,82 são relativos aos hidrogênios
7', pois foi observada uma correlação
3
J dos mesmos com o carbono carbonílico. Confirmado
assim os sinais para os hidrogênios 7', concluiu-se que as posições 2' e 6', no anel B, não
estavam oxidadas, pois estes sinais, mostravam uma correlação, a
3
J, com os sinais de
carbono em δ
C
114,8 e em δ
C
123,0, atribuídos por DEPT a carbonos CH aromáticos,
descartando assim as possibilidades estruturais II e IV, e atribuindo esses valores de
deslocamento químico aos carbonos 2' e 6'. Para o anel A, observou-se correlações a
3
J dos
hidrogênios 7 com sinais de carbono, que exibiram deslocamentos químicos em δ
C
113,0 e
δ
C
122,1, também atribuídos por DEPT a carbonos CH
aromáticos, sendo estes assinalados
aos carbonos 2 e 6, respectivamente. Através dessas análises descartou-se então a
possibilidade estrutural III.
Concluiu-se então que S1, possui oxidações nos carbonos 3/4, no anel A e 3'/4' no
anel B, havendo as seguintes possibilidades estruturais (Fig. 36):
O
O
OMe
MeO
MeO
GlcO
GlcO
MeO
MeO
OMe
O
O
MeO
MeO
OMe
O
O
OGlc
O
O
OMe
MeO
MeO
GlcO
7
8
9
8
'
9
'
4
'
6
'
VIII
VII
IX
VI
2
5
Figura 36- Prováveis estruturas para S1.
88
Através da análise do espectro COSY
1
H x
1
H (Fig. 63, p. 134/ Tab. 5, p. 92) e sua
expansão (Fig. 65, p. 136) e de acordo com o padrão de substituição orto, orto/meta e meta,
foi possível distinguir os sinais relativos aos hidrogênios aromáticos 5, 5', já que com base no
espectro de HMBC tinha sido possível atribuir os sinais de carbono para os dois grupos 2, 6 e
2', 6', e baseado no espectro de HETCOR (Fig. 60, p. 131) correlacionar os mesmos com os
respectivos sinais de hidrogênio em δ
H
6,58 (d); 6,59 (dd); 6,74 (d) e 6,64 (dd). Os sinais de
deslocamento químico dos hidrogênios 6, 6', no espectro de COSY
1
H x
1
H (Fig. 65, p. 136),
aparecem correlacionados com sinais em δ
H
6,82 (d) e 7,04 (d), atribuídos portanto aos
hidrogênios 5 e 5', respectivamente. Essas análises confirmaram quais os sinais, na região de
aromáticos, eram relacionados a cada anel.
Para determinar os tipos de substituintes em cada anel aromático, foram utilizadas
como ferramenta, as expansões do espectro de HMBC. Os sinais de hidrogênios metoxílicos,
mostravam correlação
3
J com os sinais de carbono em δ
C
150,7; 150,5 e 149,2 (Fig. 68, p.
139); logo, como restava apenas um sinal (δ
C
146,8) característico de carbono aromático
oxidado, este pode ser atribuído ao carbono substituído por uma unidade de açúcar. Como o
sinal em δ
H
6,82 foi atribuído, através do espectro de COSY
1
H x
1
H (Fig. 65, p. 136), a H-5,
foi possível identificar quais eram os substituintes do anel A, pois foram observadas
correlações (Fig. 67, p. 138) desse sinal a
3
J e
2
J, com os sinais em δ
C
150,7 ou 150,5 e δ
C
149,2; atribuídos a dois carbonos aromáticos substituídos por grupos OMe; uma correlação a
2
J com o sinal a δ
C
122,1 (C-6); e ainda uma correlação
3
J com um sinal a δ
C
132,7, atribuído
a C-1. O hidrogênio da posição 2, que exibe dubleto meta em δ
H
6,58, apresentou correlação
3
J com o carbono em δ
C
38,9, atribuído a C-7; também correlações
3
J e
2
J com os sinais a δ
C
150,7 ou 150,5 e δ
C
149,2; e ainda uma correlação
3
J com o sinal a δ
C
122,1, já atribuído a
C-6 do anel A. Não foi possível definir quais os sinais, no espectro de RMN
1
H, eram
relativos às metoxilas das posições 3 e 4.
Com base nas análises feitas acima, confirmou-se que as posições 3 e 4, eram
oxidadas, tendo como substituintes duas metoxilas, e descartando-se assim as possibilidades
estruturais VIII e IX.
O anel B, portanto, estava substituído por uma metoxila e uma unidade de açúcar,
possibilitando ainda duas prováveis estruturas para S1, VI e VII. Para definir qual dessas era
a estrutura de S1, utilizou-se novamente o espectro de HMBC (Fig. 67, p. 138). Observou-se
que o hidrogênio 6' (δ
H
6,64) mostrava uma correlação
3
J, com um sinal em δ
C
35,4 atribuído
ao carbono 7'; uma correlação
3
J com um sinal em δ
C
114,8 atribuído ao carbono 2' e uma
89
correlação
3
J com o sinal em δ
C
146,8. A observação desta última correlação foi importante
para confirmar que a unidade de açúcar encontrava-se na posição 4' e assim permitir
descartar a possibilidade estrutural VII.
Levando-se em consideração a análise dos dados espectrométricos, a rota
biossintética das lignanas (Fig. 20, p. 49) e ainda os dados da literatura (Rahman et al., 1990
e Tundis et al., 2000/ Tabs. 3 e 4, pp. 90 e 91), foi possível atribuir para S1 a estrutura da
lignana dibenzilbutirolactona arctiina (Fig. 37).
6
'
6
4
'
9
'
8
'
9
8
7
4
GlcO
MeO
MeO
OMe
O
O
Figura 37- Estrutura da Arctiina (S1)
Como citado anteriormente, através das análises de HMBC (Fig. 66, p. 137), foi
possível atribuir para os carbonos 7 e 7', os sinais de deslocamento químico em δ
C
38,9 e δ
C
35,4, respectivamente. Estes por sua vez, mostram no espectro de HETCOR (Fig. 62, p.
133), correlações com os sinais de hidrogênios em δ
H
2,91/2,82 e δ
H
2,40-2,60,
respectivamente, porém os metilenos H-7 e H-7' mostram correlações a
3
J e
2
J com os dois
sinais de carbonos em δ
C
47,6 e δ
C
42,5, ficando difícil fazer uma correta atribuição para os
carbonos das posições 8 e 8'. Isso só foi resolvido através da análise do espectro COSY
1
H x
1
H (Fig. 64, p. 135), pois os duplos dubletos característicos de 7' em δ
H
2,82 e 2,91
mostravam correlação com o sinal a δ
H
2,68 (~q), atribuído portanto a H-8', e que por sua
vez, mostrava correlação no espectro de HETCOR (Fig. 62, p. 133) com o sinal δ
C
47,6.
Ficou claro assim, que o sinal em δ
C
42,5 estava relacionado ao carbono 8, e que este
mostrava correlação no espectro HETCOR com o sinal multipleto entre δ
H
2,40-2,60.
Os hidrogênios H-9, tiveram seus sinais confirmados em δ
H
3,94 e δ
H
4,19 pois estes,
mostravam correlação entre si no espectro de COSY
1
H x
1
H (Fig. 64, p. 135) e, no espectro
de HETCOR (Fig. 61, p. 132), ambos mostravam correlação com o sinal em δ
C
72,9 (C-9).
90
A unidade de glicose presente na estrutura, teve os assinalamentos de seus carbonos
feitos através de comparação com dados da literatura (Tundis et al., 2000) e através da
análise do espectro de DEPT (Fig. 58, p. 129) como sendo: δ
C
102,9 (CH), 78,2 (CH), 77,8
(CH), 74,9 (CH), 71,3 (CH) e 62,5 (CH
2
).
Todas as análises acima confirmam a estrutura da lignana do tipo
dibenzilbutirolactônica conhecida como arctiina (Fig. 37, p. 89).
TABELA 3- Dados de RMN
1
H (300 MHz, CD
3
OD) de S1, e comparação com dados da
literatura para arctiina (RAHMAN et al., 1990).
H
δ
H
S1
δ
H
Arctiina
(250 MHz, DMSO)
2
6,58 (d, J = 1,9 Hz)
6,66 sl
2’
6,74 (d, J = 1,8 Hz)
6,78 (d, J = 1,6 Hz)
5
6,82 (d, J = 8,5 Hz)
6,83 (d, J = 8,1 Hz)
5’
7,04 (d, J = 8,2 Hz)
6,99 (d, J = 8,3 Hz)
6
6,59 (dd, J = 8,5/1,9 Hz)
6,60 (dd, J = 8,2/1,8
Hz)
6’
6,64 (dd, J = 8,2/1,8 Hz)
6,67 (dd, J = 8,5/1,7
Hz)
7
2,40-2,60 (m)
7’
2,82 (dd, J = 13,7/7,1 Hz)
2,91 (dd, J = 13,7/5,5 Hz)
2,8 (m)
8
2,40-2,60 (m)
8’
2,68 (q, J= 6,0)
9
3,94 (dd, J = 9,0/7,4 Hz)
4,19 (dd, J = 9,0/7,1 Hz)
3,87 (dd, J = 8,3/8,4
Hz) 4,10 (dd, J =
8,8/7,1 Hz)
OMe
3,80
3,72
3,80
3,71
3,79
3,71
Glc -1”
4,82
4,84 (d, J = 7,2 Hz)
Obscurecido por solvente
91
TABELA 4- Dados de RMN
13
C (75 MHz, CD
3
OD) de S1, e comparação com dados da
literatura para arctiina (TUNDIS et al., 2000).
C
δ
C
S1
δ
C
Arctiina
(75 MHz, CD
3
OD)
1
132,7
132,7
1’
134,2
134,2
2
113,6
113,0
2’
114,8
113,6
3
150,7
150,4
3’
150,5
150,6
4
149,2
149,1
4’
146,8
146,8
5
113,0
114,7
5’
117,9
117,8
6
122,1
122,1
6’
123,0
123,0
7
38,9
38,9
7’
35,4
35,4
8
42,5
42,5
8’
47,6
47,6
9
72,9
72,9
9’
181,3
181,3
OMe
56,5
55,4
56,5
56,4
56,7
56,7
Glc-1”
102,9
102,9
Glc-2”
74,9
74,9
Glc-3”
77,8
77,8
Glc-4”
71,3
71,3
Glc-5”
78,1
78,1
Glc-6”
62,5
62,5
92
TABELA 5- Dados de HETCOR, HMBC e COSY
1
H x
1
H de S1 (300/ 75 MHz, CD
3
OD)
ARCTIINA (S1)
HETCOR
(
1
H →
13
C)
HMBC (
1
H →
13
C)
COSY
(
1
H →
1
H)
H
δH
1
J
2
J
3
J
1
_
_
_
_
_
2
6,58 (d, J = 1,9 Hz)
113,6
C-3
C-4/ C-6/ C-7
_
3
_
_
_
_
_
4
_
_
_
_
_
5
6,82 (d, J = 8,5 Hz)
113,0
C-6
C-1/ C-3
H-6
6
6,59 (dd, J = 8,5/1,9 Hz)
122,1
C-1/ C-5
H-5
7
2,40-2,60 (m)
38,9
C-1/ C-8
C-2/ C-6/ C-9
_
8
2,40-2,60 (m)
42,5
_
_
_
9
3,94 (dd, J = 9,0/7,4 Hz)
72,9
C-8
C-7
H-9
4,19 (dd, J = 9,0/7,1 Hz)
72,9
_
C-9’
H-9
1′
_
_
_
_
_
2′
6,74 (d, J = 1,8 Hz)
114,8
C-1’/ C-3’
C-4’/C-6’/ C-7’
_
3′
_
_
_
_
_
4′
_
_
_
_
_
5′
7,04 (d, J = 8,2 Hz)
117,9
C-4’
C-1’/C-3’
H-6’
6′
6,64 (dd, J = 8,2/1,8 Hz)
123,0
_
C-2’/ C-4’/ C-7’
H-5’
7′
2,82 (dd, J = 13,7/7,1 Hz)
35,4
C-1’/ C-8’
C-2’/ C-6’/ C-9’/ C-
8
H-7’H-8’
2,91 (dd, J = 13,7/5,5 Hz)
35,4
C-1’
C-2’/ C-6’/ C-9’
H-7’/H-8’
8′
2,68 (q, J= 6,0)
47,6
C-8/ C-9’
_
H-7’
9′
_
_
_
_
_
OMe
3,80
56,5
C-3’
_
3,80
56,5
C-3
_
3,79
56,7
C-4
_
93
4.1.1.2 Determinação estrutural de S2 (arctigenina).
A substância S2 (52,3mg) foi isolada como um óleo de coloração amarela igualmente
ao que é relatado na literatura (RAHMAN et al., 1990).
Ao serem analisados os sinais no espectro de RMN
1
H (Fig. 69, p. 140/ Tab. 6, p. 98)
e expansão (Fig. 70, p. 141), chegou-se a conclusão que a substância S2 tratava-se de uma
lignana do tipo dibenzilbutirolactona, semelhante a S1. No referido espectro foi possível
observar a presença dos seguintes sinais:
Dois dubletos (δ
H
6,82 e 6,74) com constantes de acoplamento características de
hidrogênios orto relacionados (J=7,9 e 8,1 Hz).
Dois dubletos (δ
H
6,62 e 6,45) com constantes de acoplamento características de
hidrogênios meta relacionados (J=1,9 e 2,0 Hz).
Dois duplos dubletos (δ
H
6,60 e 6,54) com constantes de acoplamento características
de hidrogênios orto/meta relacionados (J=7,9/1,9 e 8,1/2,0 Hz).
Dois duplos dubletos, um a δ
H
4,13 (J=9,1/6,9 Hz) e outro a δ
H
3,88 (J=9,1/7,1 Hz)
atribuídos aos dois hidrogênios H-9 do anel lactônico.
Dois duplos dubletos, um a δ
H
2,95 (J=13,8/5,2 Hz) e outro a δ
H
2,88 (J=13,8/6,0
Hz) atribuídos aos hidrogênios benzílicos H-7’.
Um multipleto complexo a δ
H
2,55, atribuído aos hidrogênios benzílicos H-7,
juntamente com os hidrogênios H-8 e H-8’ do anel lactônico.
Dois singletos, um a δ
H
3,85, de menor intensidade, e outro a δ
H
3,81, de maior
intensidade, caracterizando a presença de três grupos metoxílicos aromáticos.
O espectro de RMN
13
C obtido a 75 MHz, em clorofórmio deuterado, (Fig. 71, p.
142/ Tab. 7, p. 99), revelou a presença de 19 sinais de carbono, que tiveram seu padrão de
hidrogenação atribuído através da análise do espectro DEPT (Fig. 72, p. 143).
Após a análise dos dados espectrométricos, e pelo padrão de substituição orto,
orto/meta e meta para os hidrogênios aromáticos, chegou-se a conclusão que S2 apresentava
as mesmas possibilidades de oxidações observadas para os anéis benzênicos de S1 (Fig. 35,
p.86).
Para atribuição correta dos sinais de cada anel, foram observadas as correlações no
espectro de HMBC (Fig. 80, p. 151/ Tab. 8, p. 100). Os sinais duplos dubletos dos
hidrogênios benzílicos H-7' (Fig. 81, p. 152), mostram uma correlação
3
J com o carbono
94
carbonílico C-9', confirmando o assinalamento dos mesmos. Além disso, observa-se uma
correlação
2
J de H-7' com um sinal de carbono em
δ
C
129,5 (C-1'), uma correlação
3
J com
um sinal a δ
C
122,0 (C-6') e uma outra com o sinal a δ
C
111,6 (C-2’). Estas observações
confirmaram que a estrutura não era oxidada nas posições 2' e 6' do anel B, descartando
assim as possibilidades estruturais II e IV (Fig. 35, p. 86).
Para o anel A, observou-se uma correlação
2
J do sinal dos hidrogênios 7 (Fig. 81, p.
152), que estão mais desprotegidos no multipleto em δ
H
2,55, com o sinal a δ
C
130,5 (C-1),
uma correlação a
3
J com o sinal a δ
C
120,6 (C-6) e uma outra com o sinal a δ
C
111,9,
atribuído ao carbono 2. Ficava claro assim que o anel A também não apresentava oxidações
nas posições 2 e 6, descartando assim a possibilidade estrutural III (Fig. 35, p. 86).
Com base nas análises feitas a partir da estrutura restante V (Fig. 35, p. 86), foi
possível atribuir para S2, 4 possibilidades estruturais com oxidações nas posições 3/4 e 3'/4'
como mostra a figura 38.
5
'
2
'
8
'
9
7
4
6
XIIIXII
XIX
OMe
MeO
MeO
OH
O
O
OMe
MeO
HO
OMe
O
O
O
O
OMe
OH
MeO
MeO
O
O
OMe
HO
MeO
OMe
Figura 38- Prováveis estruturas para S2.
95
Como os sinais a δ
C
122,0 e 120,6 foram relacionados, através da análise do espectro
HMBC (Fig. 81, p. 152), respectivamente, aos carbonos 6’ e 6, foi possível atribuir os
respectivos sinais de hidrogênio através do espectro de HETCOR (Fig. 75, p. 146, Tab. 8, p.
100), que mostrou correlações daqueles sinais de carbono com sinais a δ
H
6,60 e 6,54,
respectivamente. Estes por sua vez, exibiram no espectro de COSY
1
H x
1
H (Fig. 77, p. 148,
Tab. 8, p. 100), correlações com os sinais a δ
H
6,82 e 6,74, atribuídos, portanto, aos
hidrogênios 5' e 5, respectivamente, e ainda uma correlação de H-6 com um sinal em δ
H
6,45, que foi atribuído a H-2. Assim os sinais relativos aos hidrogênios de cada anel estavam
definidos.
Foi possível ainda, através da análise do HETCOR (Fig. 73, p. 144), atribuir os
valores de deslocamento químico para os carbonos 5, 2' e 2, valores estes muito próximos,
em aproximadamente δ
C
111. Porém a expansão do espectro (Fig. 75, p. 146) mostrou
claramente as correlações dos sinais δ
C
111,4 (C-5); 111,6 (C-2’) e 111,9 (C-2) com os
respectivos sinais em δ
H
6,74 (H-5), 6,62 (H-2') e 6,45 (H-2).
Foi necessário, no entanto, identificar de que maneira os substituintes estavam
dispostos na estrutura. Para isso foram feitas análises, novamente, nas expansões do espectro
de HMBC. Os sinais de hidrogênios metoxílicos (Fig. 82, p. 153), mostraram correlação
3
J
com os sinais de carbono em δ
C
149,0; 147,9 e 146,7. Estas correlações indicaram que,
dentre os sinais de carbonos oxidados, por exclusão, uma hidroxila encontrava-se ligada ao
carbono com deslocamento químico em δ
C
144,5. Sabendo-se que o sinal a δ
H
6,74 era
referente a H-5, foi possível constatar quais eram os substituintes do anel A, pois foram
observadas correlações (Fig. 84, p.155) desse sinal a
3
J ou
2
J com o sinal em δ
C
149,0 (C-3
ou C-4) e a
3
J com o sinal em δ
C
130,5 (C-1). O hidrogênio H-2, mostrou uma correlação
3
J
ou
2
J com o sinal de carbono em δ
C
147,9 e uma correlação a
3
J com o sinal a δ
C
120,6 (C-6).
Para definir qual a atribuição correta para os valores de deslocamento químico dos carbonos
3 e 4, observou-se uma correlação a
3
J do sinal de hidrogênio da posição 6 (δ
H
6,54) com o
sinal de carbono em δ
C
147,9, típica de carbono oxidado e que só poderia ser C-4, logo o
sinal em δ
C
149,0 era referente a C-3. Assim foi possível constatar que o anel A apresentava
duas metoxilas como substituintes, descartando assim as possibilidades X e XII.
O anel B apresentava como substituintes uma metoxila e uma hidroxila,
possibilitando ainda duas prováveis estruturas para S2, XI e XIII. Não foi possível definir as
posições corretas dos substituintes neste anel através de HMBC, pois os sinais de H-2' e H-6'
encontravam-se sobrepostos no espectro, dificultando assim uma correta atribuição.
96
A substância S2 foi então acetilada (Fig. 39), objetivando confirmar a estrutura da
lignana, visto que, a presença de um grupo acetil ligado a um dos anéis aromáticos, deveria
provocar deslocamentos dos sinais de hidrogênios vizinhos, permitindo localizar o grupo OH.
Assim, a reação foi realizada com sucesso e observamos modificações no espectro de RMN
1
H (Fig. 75, p. 135/ Tab. 9, p. 101) de S2Ac (Estrutura XIV- 8mg).
XIV
3
9
7
6
'
5
'
2
'
7
'
OAc
O
O
OMe
MeO
MeO
5
Figura 39- Estrutura da arctigenina acetilada (S2Ac).
Os deslocamentos mais significativos (Tab. 9, p. 101) foram dos seguintes sinais: O
dubleto atribuído a H-2’ passou de δ
H
6,62 para δ
H
6,74 (Δ = 0,12 ppm); o dubleto atribuído a
H-5’ passou de δ
H
6,83 para δ
H
6,93 (Δ = 0,10 ppm); o duplo dubleto atribuído a H-6' passou
de δ
H
6,60 para δ
H
6,66 (Δ = 0,06 ppm); e ainda o sinal atribuído a uma metoxila passou de δ
H
3,80 para δ
H
3,76 (Δ = 0,04 ppm). Além disso, é possível observar que os dois sinais duplos
dubletos relativos aos hidrogênios 7’, alteram sua multiplicidade e passam a apresentar
somente um dubleto para ambos os hidrogênios. Isso, segundo Rahman (1990), acontece
porque esses dois hidrogênios se tornam magneticamente equivalentes, indicando que o grupo
hidroxila está locado em C-4’ e não em C-4.
Para uma atribuição mais correta da verdadeira estrutura de S2, foram realizados
espectros de NOE diff. Após a realização do espectro, foi possível descartar com segurança a
possibilidade estrutural XIII, pois ao ser irradiado o sinal a δ
H
3,81 relativo a duas metoxilas,
foi observado efeito apenas sobre os hidrogênios H-2 e H-2’(Fig. 85, p. 156), e ao ser
irradiado o sinal do hidrogênio H-2’, para confirmação, foi observado efeito somente com o
sinal da metoxila em δ
H
3,81 (Fig. 86, p. 157) determinando assim a posição da mesma em 3’.
97
Concluiu-se através da análise desses dados, associadas com informações da literatura
(RAHMAN et al., 1990, Tabs. 6 e 7, pp. 98 e 99), que a estrutura de S2 tratava-se da lignana
dibenzilbutirolactona arctigenina (Fig. 40).
MeO
MeO
OH
OMe
O
O
Figura 40- Estrutura da Arctigenina (S2).
98
TABELA 6- Dados de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) de S2, e comparação com dados da
literatura para arctigenina (RAHMAN et al., 1990).
H
δ
H
S2
δ
H
Arctigenina
(250 MHz, CDCl
3
)
2
6,45 (d, J = 2,0 Hz)
6,46 (d, J = 1,9 Hz)
2’
6,62 (d, J = 1,9 Hz)
6,63 (d, J = 1,7 Hz)
5
6,74 (d, J = 8,1 Hz)
6,65 (d, J = 8,1 Hz)
5’
6,82 (d, J = 7,9 Hz)
6,83 (d, J = 7,8 Hz)
6
6,54 (dd, J = 8,1/2,0 Hz)
6,55 (dd, J = 8,1/2,0 Hz)
6’
6,60 (dd, J = 7,9/1,9 Hz)
6,61 (dd, J = 8,2/1,9 Hz)
7
2,55 (m)
2,50 (m)
7’
2,88 (dd, J = 13,8/6,0 Hz)
2,95 (dd, J = 13,8/5,2 Hz)
2,93 (2 x dd)
8
2,55 (m)
2,50 (m)
8’
“
“
9
3,88 (dd, J = 9,1/7,1 Hz)
4,13 (dd, J = 9,1/6,9 Hz)
3,89 (dd, J = 9,3/7,1 Hz)
4,15 (dd, J = 9,3/6,7 Hz)
OMe
3,85 (s)
3,85 (s)
3,81 (s)
3,81 (s)
3,81 (s)
3,81 (s)
99
TABELA 7- Dados de RMN
13
C (75 MHz, CDCl
3
) de S2, e comparação com dados da
literatura para arctigenina (RAHMAN et al., 2000).
C
δ
C
S2
δ
H
Arctigenina
(62,5 MHz, DMSO)
1
130,5
131,8
1’
129,5
128,8
2
111,9
112,3
2’
111,6
113,4
3
149,0
148,6
3’
146,7
147,3
4
147,9
147,3
4’
144,5
146,0
5
111,4
111,8
5’
114,1
115,2
6
120,6
120,3
6’
122,0
121,5
7
38,1
36,8
7’
34,5
33,6
8
40,9
40,7
8’
46,5
45,6
9
71,2
70,6
9’
178,7
178,3
OMe
55,8
55,3
55,8
55,4
55,9
55,4
100
TABELA 8- Dados de HETCOR, HMBC e COSY
1
H x
1
H de S2 (300/ 75 MHz, CDCl
3
)
ARCTIGENINA (S2)
HETCOR
(
1
H →
13
C)
HMBC (
1
H →
13
C)
COSY
(
1
H →
1
H)
H
δH
1
J
2
J
3
J
1
_
_
_
_
_
2
6,45 (d, J = 2,0 Hz)
111,9
C-4/ C-6/ C-7
H-6
3
_
_
_
_
_
4
_
_
_
_
_
5
6,74 (d, J = 8,1 Hz)
111,4
_
C-1/ C-3
H-6
6
6,54 (dd, J = 8,1/2,0 Hz)
120,6
_
C-2/ C-4/ C-7
H-5/ H-2
7
2,55 (m)
38,1
C-1/ C-8
C-2/ C-6/ C-9
_
8
2,55 (m)
40,9
C-7/ C-8’/ C-9
C-1
H-9/ H-9
9
3,88 (dd, J = 9,1/7,1 Hz)
72,2
_
_
H-9/H-8
4,13 (dd, J = 9,1/6,9 Hz)
72,2
_
_
H-9/ H-8
1′
_
_
_
_
_
2′
6,62 (d, J = 1,9 Hz)
111,6
*
*
_
3′
_
_
_
_
_
4′
_
_
_
_
_
5′
6,82 (d, J = 7,9 Hz)
114,1
_
C-1’/C-3’
H-6’
6′
6,60 (dd, J = 7,9/ 1,9 Hz)
122,0
*
*
H-5’
7′
2,88 (dd, J = 13,8/6,0 Hz)
34,5
C-1’/ C-8’
C-2’/ C-6’/ C-9’/
C-8
H-8’
2,95 (dd, J = 13,8/5,2 Hz)
34,5
C-1’/ C-8’
C-2’/ C-6’/ C-9’/
C-8
H-8’
8′
2,55 (m)
46,5
C-8/ C-9’
C-7
H-7’
9′
_
_
_
_
_
OMe
3,85
55,8
_
C-4
_
3,81
55,8
_
C-3
_
3,81
55,9
_
C-3’
_
* sinais sobrepostos
101
TABELA 9- Dados de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) de S2Ac, e comparação com dados da
literatura para arctigenina acetilada (RAHMAN et al., 1990).
H
δ
H
S2Ac
δ
H
Arctigenina acetilada
(250 MHz, CDCl
3
)
2
6,50 (d, J = 1,9 Hz)
6,50 (d, J = 1,9 Hz)
2’
6,75 (d, J = 1,9 Hz)
6,75 (d, J = 1,7 Hz)
5
6,76 (d, J = 8,2 Hz)
6,77 (d, J = 8,2 Hz)
5’
6,93 (d, J = 8,0 Hz)
6,94 (d, J = 8,0 Hz)
6
6,54 (dd, J = 8,1/2,0 Hz)
6,54 (dd, J = 8,1/2,0 Hz)
6’
6,66 (dd, J = 8,0/1,9 Hz)
6,66 (dd, J = 8,0/1,9 Hz)
7
2,58 (m)
2,60 (m)
7’
2,97 (d, J = 5,8)
2,97 (d, J = 5,8)
8
2,58 (m)
2,60 (m)
8’
“
“
9
3,90 (dd, J = 9,1/7,5 Hz)
4,17 (dd, J = 9,1/7,0 Hz)
3,90 (dd, J = 9,2/7,5 Hz)
4,15 (dd, J = 9,0/6,8 Hz)
OMe
3,76 (s)
3,76 (s)
3,82 (s)
3,82 (s)
3,85 (s)
3,85 (s)
Ac
2,30 (s)
2,30 (s)
102
4.1.1.3 Determinação estrutural de S3 (matairesinol)
A identificação estrutural de S3
foi feita, assim como em S1 e S2, com base em
análises espectrométricas. S3 foi isolada na forma de um óleo de coloração amarela, solúvel
em clorofórmio.
As primeiras análises mostraram que S3 tratava-se também de uma lignana
dibenzilbutirolactona, semelhante a S1 e S2.
No espectro de RMN
1
H (Fig. 87, p. 158/ Tab. 10, p. 106) e expansão (Fig. 88, p.
159), obtido em clorofórmio deuterado, foi possível observar os seguintes sinais:
Dois dubletos (δ
H
6,81 e 6,79) com constantes de acoplamento características de
hidrogênios orto relacionados (J=8,4 e 8,0 Hz).
Dois dubletos (δ
H
6,60 e 6,40) com constante de acoplamento característica de
hidrogênios meta relacionados (J=2,0 e 1,9 Hz).
Dois duplos dubletos (δ
H
6,59 e 6,50) com constantes de acoplamento características
de hidrogênios orto/meta relacionados (J=8,4/2,0 e 8,0/1,9 Hz).
Dois duplos dubletos, um a δ
H
4,15 (J=9,1/7,0 Hz) e outro a δ
H
3,88 (J=9,1/6,9 Hz),
atribuídos aos dois hidrogênios H-9 de anel lactônico.
Dois duplos dubletos, um a δ
H
2,95 (J=14,0/5,2 Hz) e outro a δ
H
2,86 (J=14,0/6,7
Hz), atribuídos aos hidrogênios benzílicos H-7'.
Um multipleto complexo a δ
H
2,53, atribuído aos hidrogênios benzílicos H-7,
juntamente com os hidrogênios H-8 e H-8’ do anel lactônico.
Um singleto a δ
H
3,80 integrando para seis hidrogênios, relativos a duas metoxilas
aromáticas.
O espectro de RMN
13
C obtido a 75 MHz, em clorofórmio deuterado, (Fig. 90, p.
161/ Tab. 11, p. 107), revelou a presença de 18 sinais de carbono.
De acordo com o padrão de substituição orto, orto/meta e meta dos anéis aromáticos
observados no espectro de RMN
1
H, o número de metoxilas e o sinal referente a hidroxila,
foi possível considerar que S3, assim como S1 e S2, apresentava 4 possibilidades de
oxidações em sua estrutura (Fig. 35, p. 86).
103
Através da análise dos sinais no espectro de HMBC (Fig. 94, p.165, Tab. 12, p. 108)
e expansão (Fig. 95, p.166), foi possível confirmar que os duplos dubletos a δ
H
2,95 e δ
H
2,86
são relativos aos hidrogênios 7', pois foi observada uma correlação
3
J dos mesmos com o
carbono carbonílico em δ
C
178,7. Confirmado assim os sinais para os hidrogênios 7',
concluiu-se que as posições 2' e 6', no anel B, não estavam oxidadas, pois estes sinais,
mostravam uma correlação a
3
J com os sinais de carbono em δ
C
111,6 e em δ
C
122,1,
características de carbonos aromáticos não oxidados, descartando assim as possibilidades
estruturais II e IV, e atribuindo esses valores de deslocamento químico aos carbonos 2' e 6',
em comparação com os resultados para as substâncias S1 e S2. Para o anel A observou-se
correlações a
3
J dos hidrogênios 7 com sinais de carbono, que exibiram deslocamentos
químicos em δ
C
111,0 e δ
C
121,4, também característicos de carbonos
aromáticos não
oxidados, sendo estes assinalados aos carbonos 2 e 6, respectivamente, e assim como para o
anel B, sendo comparados também aos resultados de S1 e S2. Através dessas análises
descartou-se então a possibilidade estrutural III.
Concluiu-se então que S3, possui oxidações nos carbonos 3/4, no anel A e
3'/4' no anel B. Com o padrão de oxidação proposto e ainda sabendo-se que S3 apresentava
como substituintes 2 metoxilas e 2 hidroxilas, foi possível atribuir 6 possibilidades
estruturais para S3 (Fig. 41, p. 104).
104
MeO
MeO
OH
OH
O
O
XV
O
O
HO
HO
OMe
OMe
XVI
MeO
HO
OH
OMe
O
O
XVII
6
4
7
9
8
'
2
'
5
'
OMe
MeO
HO
OH
O
O
XVIII
6
4
7
9
8
'
2
'
5
'
XIX
MeO
HO
OH
OMe
O
O
XX
OMe
MeO
HO
OH
O
O
Figura 41- Prováveis estruturas para S3
Após a realização do espectro de NOE diff (Fig. 93, p. 164), foi possível descartar as
possibilidades estruturais XV, XVI, XVIII, XIX e XX, pois ao ser irradiado o sinal a δ
H
3,80
relativo as duas metoxilas, foi observado efeito apenas sobre os hidrogênios H-2 e H-2’,
determinando assim a posição das mesmas em 3 e 3’.
Através da análise dos espectros de COSY (Fig. 91, p.162, Tab. 12, p. 108) e
expansão (Fig. 92, p. 163), HETCOR (Fig. 99, p.170, Tab. 12, p. 108), HMBC (Fig. 94,
105
p.165, Tab. 12, p. 108) e suas expansões (Figs. 95-98, pp.166-160 respectivamente), foi
possível confirmar a estrutura e as atribuições feitas tanto para os hidrogênios como para os
carbonos. E com base na análise de todos os dados espectroscópicos e ainda por comparação
com dados obtidos da literatura (Rahman et al., 1990/ Tabs. 10 e 11, pp. 106 e 107), chegou-
se a conclusão que S3 tratava-se da lignana dibenzilbutirolactona denominada matairesinol
(Fig. 42).
HO
MeO
OH
OMe
O
O
2
6
2
'
5
'
Figura 42- Estrutura do matairesinol (S3)
106
TABELA 10- Dados de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) de S3, e comparação com dados da
literatura para matairesinol (Rahman et al., 1990).
H
δ
H
S3
δ
C
Matairesinol
(250 MHz, DMSO)
2
6,40 (d, J= 1,9)
6,40 (d, J = 1,9 Hz)
2’
6,60 (d, J= 2,0)
6,60 (sl)
5
6,79 (d, J= 8,0)
6,79 (d, J = 8,2 Hz)
5’
6,81 (d, J= 8,4)
6,81 (d, J = 8,0 Hz)
6
6,50 (dd, J= 8,0/ 1,9)
6,50 (dd, J = 8,0/1,9 Hz)
6’
6,59 (dd, J= 8,4/ 2,0)
6,59 (dd, J = 8,0/1,9 Hz)
7
2,53 (m)
2,50 (m)
7’
2,86 (dd, J= 14,0/ 6,7)
2,95 (dd, J= 14,0/ 5,2)
2,87 (dd, J = 14,1/6,9 Hz)
2,95 (dd, J = 14,1/5,2 Hz)
8
2,53 (m)
2,50 (m)
8’
2,53 (m)
″
9
3,88 (dd, J= 9,1/ 6,9)
4,15 (dd, J= 9,1/ 7,0)
3,89 (dd, J = 9,1/7,2 Hz)
4,15 (dd, J = 9,0/7,1 Hz)
OH
5,29
5,64 (s)
OMe
3,80 (s)
3,80 (s)
3,80 (s)
3,80 (s)
107
TABELA 11- Dados de RMN
13
C (75 MHz, CDCl
3
) de S3, e comparação com dados da
literatura para matairesinol (Rahman et al., 2000).
C
δ
C
S3
δ
C
Matairesinol
(62,5 MHz, CD
3
OD)
1
129,8
129,5
1’
129,6
128,8
2
111,0
112,6
2’
111,6
113,4
3
146,6
147,3*
3’
146,6
147,4*
4
144,8
144,9
4’
144,8
145,0
5
114,4*
115,2*
5’
114,5*
115,3*
6
121,4
120,6
6’
122,1
121,5
7
38,3
36,8
7’
34,6
33,6
8
41,0
40,8
8’
46,6
45,6
9
71,3
70,6
9’
178,7
178,4
OMe
55,9
55,5
55,8
55,5
* Sinais intercambiáveis
108
TABELA 12- Dados de HETCOR, HMBC e COSY
1
H x
1
H de S3 (300/ 75 MHz, CDCl
3
)
MATAIRESINOL (S3)
HETCOR
(
1
H →
13
C)
HMBC (
1
H →
13
C)
COSY
(
1
H →
1
H)
H
δH
1
J
2
J
3
J
1
_
_
_
_
_
2
6,40 (d, J = 1,9 Hz)
111,0
C-3
C-4/ C-6/ C-7
_
3
_
_
_
_
_
4
_
_
_
_
_
5
6,79 (d, J = 8,0 Hz)
114,4*
_
C-1/ C-3
H-6
6
6,50 (dd, J = 8,0/ 1,9 Hz)
121,4
C-2/ C-4/ C-7
H-5/ H-2
7
2,53 (m)
38,3
*
*
_
8
2,53 (m)
41,0
*
*
9
3,88 (dd, J = 9,1/ 6,9 Hz)
71,3
_
_
H-9/H-8
4,15 (dd, J = 9,1/ 7,0 Hz)
71,3
_
_
H-9/ H-8
1′
_
_
_
_
_
2′
6,60 (d, J = 2,0 Hz)
111,6
*
C-6’
_
3′
_
_
_
_
_
4′
_
_
_
_
_
5′
6,81 (d, J = 8,4 Hz)
114,5*
_
C-1’/C-3’
H-6’
6′
6,59 (d, J = 8,4/ 2,0 Hz)
122,1
*
C-2’
H-5’
7′
2,86 (dd, J = 14,0/ 7,0 Hz)
34,6
C-1’/ C-8’
C-2’/ C-6’/ C-9’/
C-8
H-8’
2,95 (dd, J = 14,0/ 5,2 Hz)
34,6
C-1’/ C-8’
C-2’/ C-6’/ C-9’/
C-8
H-8’
8′
2,53 (m)
46,6
*
*
H-7’
9′
_
_
_
_
_
OMe
3,80
55,5
_
C-4
_
3,80
55,5
_
C-4’
_
OH
5,29
_
_
_
_
* Não foi possível fazer atribuição correta, pois os sinais de deslocamento químico desses hidrogênios
encontram-se como um só multipleto;.
109
4.2 Resultados obtidos na Avaliação Biológica
4.2.1 Determinação do efeito antiproliferativo através do método da incorporação de
3
H-
timidina.
Para avaliação de inibição da proliferação celular em cultura C6, induzida pelas
lignanas matairesinol e arctigenina, após tratamento com diferentes concentrações durante
24h, utilizou-se o método de incorporação de
3
H-timidina. Essa inibição de proliferação foi
demonstrada pela redução do crescimento celular em relação ao controle.
Os resultados indicam que, após tratamento com a lignana matairesinol, ocorreu uma
diminuição na incorporação de
3
H-timidina pela cultura C6 em 18% ± 6,6 na concentração
de 1µM, e redução de 13% ± 1,6 na concentração de 10µM, quando comparados ao grupo
controle (Fig. 43).
A lignana arctigenina inibiu a incorporação em 14% ± 6,3, quando tratada na
concentração de 1µM, e em 32% ± 1,4 na concentração de 10µM, quando comparados ao
grupo controle (Fig. 43).
Esses resultados evidenciam um possível efeito antiproliferativo por diminuição da
incorporação de
3
H-timidina pela cultura, no intervalo de concentração de 1µM e 10µM.
0
20
40
60
80
100
120
Controle Veículo 1µM 10µM
Matairesinol
Arctigenina
Incorporação de
3
H-timidina por células C6 tratadas
com matairesinol e arctigenina
Incorporação de
3
H-timidina (% do controle)
*
*
*
*
Figura 43- Gráfico da incorporação de
3
H-timidina pela linhagem C6, após tratamento com matairesinol e
arctigenina, nas concentrações de 1µM e 10µM, no tempo de 24 horas. *p<0,05 em relação ao controle
(ANOVA, teste de Bonferroni).
110
4.2.2 Determinação da atividade citotóxica através da viabilidade celular
4.2.2.1 Atividade citotóxica em cultura de células C6 (glioma de rato)
Foi realizado um estudo, in vitro, da citotoxidade causada pelas lignanas matairesinol
e arctigenina, em células C6 de glioma de rato, nas concentrações de 50, 100, 250 e 500µM,
durante 72h. A viabilidade celular foi analisada pelo método MTT. Foi possível observar
que, as células que foram submetidas ao tratamento com diferentes concentrações das
lignanas, indicam uma citotoxicidade dose-dependente.
Quando as células foram tratadas com a lignana matairesinol, na concentração de
50µM observou-se redução de aproximadamente 15% ± 4,5 na população celular e na
concentração de 100µM a redução foi de 34% ± 2,8. Além disso, a lignana ocasionou morte
celular em mais de 67% ± 3,9 das células na concentração de 250µM e 78% ± 2,6 de morte
na concentração de 500µM, quando comparadas ao grupo controle (Fig. 44). Já a lignana
arctigenina, apresentou efeito citotóxico pronunciado, diminuindo a viabilidade celular em
45% ± 2,7; 64% ± 2,9; 70% ± 2,6 e 80% ± 1,5; nas concentrações de 50, 100, 250 e 500µM,
respectivamente, quando comparadas ao grupo controle (Fig. 44).
0
20
40
60
80
100
120
Controle Veículo 50µM 100µM 250µM 500µM
Matairesinol
Arctigenina
Viabilidade de C6 tratados com Matairesinol e
Arctigenina por 72 horas
Viabilidade Celular (% do controle)
*
*
*
*
*
*
*
*
Figura 44- Gráfico da viabilidade celular de C6, intoxicadas com matairesinol e arctigenina, em diferentes
concentrações. O efeito citotóxico foi avaliado pelo método MTT, por 72 horas, com 50, 100, 250 e 500µM.
*p<0,05 em relação ao controle (ANOVA, teste de Boferroni).
111
Com a finalidade de analisar a influência que o tempo de exposição às drogas,
matairesinol e arctigenina, causava no comportamento celular de C6, foram realizados
estudos do efeito citotóxico, utilizando o mesmo método anterior, na concentração de
250µM, nos tempos de 18h, 36h, 54h e 72h.
Na intoxicação com matairesinol, observou-se uma redução de 24% ± 3,4 na
viabilidade celular após 18h de tratamento, 41% ± 3,0 depois de 36h, 69% ± 3,6 no tempo de
54h e, após exposição por 72h houve redução de 81% ± 1,8, quando comparados ao grupo
controle. (Fig. 45, p. 112). Em 18h de incubação com a arctigenina, houve uma redução na
viabilidade celular de 23% ± 6,0; de 60% ± 6,0 depois de 36h, 79% ± 3,0 no tempo de 54h e
após exposição por 72h, houve redução de 85% ± 1,0, quando comparados ao grupo controle
(Fig. 45, p. 112).
Foi possível observar que, nas concentrações de 50, 100 e 250µM (Fig. 44, p 110) a
lignana arctigenina exerce um efeito de redução na viabilidade celular bem maior que o
matairesinol.
No gráfico tempo-resposta (Fig. 45, p. 112), a partir de 36h a lignana arctigenina
reduz a viabilidade celular em um proporção maior que o matairesinol.
Os resultados da viabilidade celular do veículo, ou seja, células submetidas ao
tratamento de DMSO, na concentração utilizada para dissolver os compostos, não mostraram
diferença comparando-se com os resultados obtidos com células sem tratamento.
Durante os experimentos, não foi observado crescimento celular, somente redução no
número de células, indicando assim um efeito dependente da concentração e do tempo.
112
Viabilidade de C6 após diferentes intervalos de tempo de
exposição ao Matairesinol e à Arctigenina
0
20
40
60
80
100
120
Controle Veículo 18h 36h 54h 72h
Viabilidade celular (% do controle)
Matairesinol
Arctigenina
*
*
*
*
*
*
*
*
4.2.2.2 Atividade citotóxica em células normais (astrócitos)
Para avaliar o possível efeito tóxico que as lignanas arctigenina e matairesinol
poderiam causar em células normais, foram realizados experimentos de viabilidade celular
pelo método MTT, com astrócitos corticais de rato (Fig. 46, p. 113). Para isso as células
foram submetidas ao mesmo tratamento oferecido à cultura C6 de glioma de rato.
Figura 45- Gráfico da viabilidade celular de C6, intoxicadas com matairesinol e arctigenina, em
diferentes intervalos de tempo. O efeito citotóxico foi avaliado pelo método MTT, por 72 horas, com
250µM. *p<0,05 em relação ao controle (ANOVA, teste de Boferroni).
*p<0,05 em relação ao controle (ANOVA teste de Bonferroni).
1
113
0
20
40
60
80
100
120
Controle Veículo 50µM 100µM 250µM 500µM
Viabilidade Celular (% do controle)
Actigenina
Matairesinol
*
*#
*
*#
*#
*
*
*
Comparação de resultados de viabilidade celular entre astrócitos corticais
de rato tratados com arctigenina e matairesinol
É possível observar na figura 46, que a redução na viabilidade celular no tratamento
com arctigenina após 72h ficou em média de 7% nas concentrações de 50µM, 100µM e
250µM e no grupo tratado com 500µM, foi observado redução de 18% ± 8, quando
comparado ao grupo controle (100% de células viáveis). No tratamento com a lignana
matairesinol, os grupos intoxicados nas concentrações de 50µM, 100µM e 250µM, tiveram
uma média de redução na viabilidade celular em torno de 15%, e no grupo tratado com
500µM de matairesinol foi observado morte de 53% ± 8, quando comparada ao grupo
controle.
Após a realização dos experimentos, foi possível fazer uma comparação dos efeitos
causados pelas lignanas arctigenina (Fig. 47, p. 114) e matairesinol (Fig. 48, p. 114), nas
duas culturas, C6 de glioma de rato e astrócitos de rato. Observa-se que tanto a arctigenina
quanto o matairesinol, exercem um efeito tóxico muito maior na cultura C6 do que na cultura
de astrócitos. E ainda que, a arctigenina produz uma menor redução na viabilidade celular de
astrócitos quando comparada ao matairesinol.
Figura 46- Gráfico da viabilidade celular de astrócitos de rato, intoxicados com arctigenina e matairesinol, em
diferentes concentrações. O efeito citotóxico foi avaliado pelo método MTT, por 72 horas, com 50, 100, 250 e
500µM. *p<0,05 em relação ao controle e
#
p<0,05 em relação aos astrócitos tratados na mesma concentração
(ANOVA, teste de Boferroni).
114
Comparação de resultados de viabilidade celular entre astrócitos
corticais de rato e células C6 de glioma de rato, tratadas com
arctigenina
0
20
40
60
80
100
120
Controle Veículo 50µM 100µM 250µM 500µM
Viabilidade Celular (% do controle)
Astrócito
C6
*#
*#
*#
*#
*
*
*
*
0
20
40
60
80
100
120
Controle Veículo 50µM 100µM 250µM 500µM
Viabilidade Celular (% do controle)
Astrócito
C6
*
*#
*
*
*
*#
*#
*#
Comparação de resultados de viabilidade celular entre astrócitos
corticais de rato e células C6 de glioma de rato, tratadas com
matairesinol
Figura 47- Gráfico de comparação da viabilidade celular entre a cultura de astrócitos (córtex de rato) e linhagem C6 de
glioma de rato, intoxicadas com arctigenina, em diferentes concentrações. O efeito citotóxico foi avaliado pelo método
MTT, por 72 horas, com 50, 100, 250 e 500µM. *p<0,05 em relação e ao controle e
#
p<0,05 em relação aos astrócitos
tratados na mesma concentração (ANOVA teste de Bonferroni).
Figura 48- Gráfico de comparação da viabilidade celular entre a cultura de astrócitos (córtex de rato) e linhagem C6 de
glioma de rato, intoxicadas com matairesinol, em diferentes concentrações. O efeito citotóxico foi avaliado pelo método MTT,
por 72 horas, com 50, 100, 250 e 500µM. *p<0,05 em relação e ao controle e
#
p<0,05 em relação aos astrócitos tratados na
mesma concentração (ANOVA teste de Bonferroni).
115
4.2.3 Análise da morfologia celular (Hoechst 33342).
Para análise da morfologia nuclear das células da linhagem C6, após tratamento com
as lignanas matairesinol e arctigenina, na concentração de 250µM, por 48 horas, utilizou-se o
marcador de DNA Hoechst 33342. Em seguida as células marcadas foram observadas em
microscópio de fluorescência e fotografadas.
Observou-se que no grupo controle (Fig. 49-A, p. 116), assim como no grupo veículo
(Fig. 49-B, p. 116) os núcleos observados estavam íntegros. O grupo controle positivo (Fig.
49-C, p. 116), apresentou uma intensa mudança na morfologia do núcleo, que se mostrou
fragmentado e com cromatina condensada. Nos grupos de células tratadas com matairesinol
(Fig. 49-D, p. 116) e arctigenina (Fig. 49-E, p. 116) observa-se que, ocorreram deformações
no núcleo celular, havendo picnose em alguns pontos, ou seja, contração e condensação da
cromatina deixando o núcleo pequeno e heterogêneo. Foram observados também pontos em
que ocorreram fragmentação nuclear.
Esses fatos sugerem que o tipo de morte provocada pelo matairesinol e pela
arctigenina, seja provavelmente por apoptose.
116
A
B
C
D
E
Figura 49- Visualização dos núcleos da linhagem C6 de glioma de rato, marcados com Hoechst 33342, após tratamento com as
lignanas e observado em microscópio de fluorescência (Fotografias na objetiva 100x). (A) Controle. (B) Veículo 0.5% DMSO. (C)
Controle positivo, fragmentação nuclear e condensação cromática induzida por radiação de UV. (D) C6 tratadas por 48h com
matairesinol na concentração de 250µM. (E) C6 tratadas com arctigenina na concentração de 250µM. Setas indicam fragmentação
nuclear e observa-se também condensação da cromatina, um indicativo de que a morte possa ser por apoptose.
117
4.2.4 Análise Ultraestrutural de células C6 de glioma de rato através de Microscopia
Eletrônica de Transmissão.
4.2.4.1 Análise Ultraestrutural de células C6 de glioma de rato, tratadas com arctigenina.
As observações realizadas ao microscópio eletrônico permitiram a análise
ultraestrutural das células da linhagem C6 de glioma de rato, assim como as alterações
causadas após tratamento com a droga arctigenina nas concentrações de 50 e 250µM.
Foi possível observar que células não tratadas apresentaram morfologia normal, com
núcleo, membrana citoplasmática e organelas sem alterações. A cromatina apresentou-se
homogeneamente distribuída pelo núcleo (Fig. 50 A-B, p. 118).
As células tratadas com a mesma concentração de DMSO, utilizada para diluição da
droga, não apresentou nenhuma alteração significativa com relação às não tratadas (Fig. 50 C,
p. 118).
Células do grupo controle positivo (células expostas a luz UV), apresentaram
alterações morfológicas significativas quando comparadas com o controle não tratado (Fig. 50
(D), p. 118). A célula apresenta-se com formato arredondado, condensação da cromatina e
presença de numerosos vacúolos de tamanhos variados.
Após tratamento com 50μM da droga arctigenina, observa-se que as células começam
a perder a forma alongada, ocorre condensação da cromatina nuclear sendo que a membrana
nuclear permaneceu intacta, observa-se tumefação e arredondamento mitocondrial com
desorganização das cristas, indicando dano na organela (Fig. 50 A-B, p. 119). Em maior
aumento, é possível visualizar de maneira mais clara as alterações significativas nas
mitocôndrias quando comparadas com o controle não tratado (Fig. 50 B, p. 119).
No tratamento com 250μM da droga são observadas características semelhantes as
encontradas no tratamento com 50μM.
118
Figura 50. Análise, em Microscopia Eletrônica de Transmissão, de células da linhagem C6. (A) Controle sem
tratamento. Observar célula com morfologia alongada, apresentando núcleo, membrana citoplasmática e
organelas sem alterações. (B) Maior aumento de (A) mostrando detalhes das mitocôndrias sem alterações
(cabeças de setas). (C) Célula tratada com a mesma concentração de DMSO, utilizada para diluição da droga.
Observar células sem alterações. (D) Célula exposta à luz UV (Controle positivo). Observar célula com formato
arredondado, condensação da cromatina e presença de vacúolos, alterações características de apoptose. N-
Núcleo.
119
Figura 51. Análise, em Microscopia Eletrônica de Transmissão, de células da linhagem C6 tratadas com 50 e
250µM de arctigenina. (A) Célula tratada com 50 µM. Observar mudança na morfologia celular com
condensação da cromatina nuclear e tumefação mitocondrial (cabeça de setas). (B) Maior aumento de (A)
mostrando detalhes das mitocôndrias com desorganização das cristas (cabeças de setas). (C) Célula tratada com
250 µM. Observar célula com morfologia alterada, condensação da cromatina nuclear e alteração nas
mitocôndrias, com desorganização das cristas. (cabeças de setas). N- Núcleo.
120
4.2.4.2 Análise Ultraestrutural da Linhagem C6 de Glioma de rato tratada com matairesinol
Observações foram realizadas ao microscópio eletrônico na ultraestrutura das células
da linhagem C6 de glioma de rato, assim como as alterações causadas nas mesmas após
tratamento com a droga matairesinol nas concentrações de 50 e 250µM. O tratamento foi o
mesmo realizado com a droga arctigenina (Item 3.3.8, p. 82), e os resultados para as células
sem tratamento, células tratadas com DMSO e aquelas expostas a luz UV são os mesmos
citados na pagina 117 e mostrados na figura 50 (p.118).
No tratamento com a droga matairesinol na concentração de 50 μM observa-se
morfologia celular arredondada, condensação da cromatina e localização desta junto à
periferia do núcleo, tumefação e arredondamento mitocondrial com desorganização das
cristas, indicando dano na organela (Fig. 52 A-B, p. 121). Observam-se em maior aumento, as
alterações significativas nas mitocôndrias quando comparadas com o controle não tratado
(Fig. 52 B, p. 121).
As células tratadas com 250 μM da droga exibem morfologia arredondada, com
condensação da cromatina nuclear e presença de numerosos vacúolos de tamanhos variados. É
possível observar a formação de corpos apoptóticos (Fig. 52 C-D, p. 121).
121
Figura 52. Análise, em Microscopia Eletrônica de Transmissão, de células da linhagem C6 tratadas com 50 e 250
µM de matairesinol. (A) Célula tratada com 50 µM. Observar mudança na morfologia celular com condensação
da cromatina nuclear e tumefação mitocondrial (cabeças de setas). (B) Maior aumento de (A) mostrando detalhes
das mitocôndrias com desorganização das cristas (setas), quando comparadas ao grupo controle sem tratamento
(Fig. 50 A-B). (C) Célula tratada com 250 µM. Observar célula com morfologia arredondada, condensação da
cromatina nuclear, presença de numerosos vacúolos de tamanhos variados e corpos apoptóticos. (D) Maior
aumento de (C) mostrando detalhes da formação de corpos apoptóticos (cabeças de setas). N- Núcleo. (*)
Vacúolos.
122
5 CONCLUSÕES
A investigação fitoquímica do extrato diclorometânico das folhas de Ficus citrifolia,
levou ao isolamento de três lignanas, arctiina, arctigenina e matairesinol. Todas as lignanas
são do tipo dibenzilbutirolactona e estão sendo isoladas pela primeira vez no gênero Ficus.
A espécie Ficus citrifolia tem perfil químico que se enquadra na família Moraceae,
porém apresentou uma ligeira diferenciação em relação às substâncias normalmente
presentes no gênero Ficus, que são os flavonóides. Assim, o presente trabalho contribuiu
para um conhecimento maior do gênero, além do conhecimento da composição química da
espécie, visto que este é o primeiro estudo fitoquímico de Ficus citrifolia.
Os resultados dos testes de incorporação de
3
H-timidina demonstraram que as
lignanas apresentam um possível efeito antiproliferativo.
Na avaliação do efeito citotóxico, na linhagem C6 de glioma de rato, nossos
resultados demonstraram que tanto o matairesinol como a arctigenina, em diferentes
concentrações (50, 100, 250 e 500µM) e por 72h, reduzem a viabilidade celular de maneira
significativa.
Na avaliação do efeito citotóxico em astrócitos de rato, os resultados demonstram que
tanto o matairesinol como a arctigenina, em diferentes concentrações (50, 100, 250 e
500µM) e por 72h, também reduzem a viabilidade celular de maneira significativa.
Quando comparados os resultados da viabilidade celular entre a cultura C6 de glioma
de rato e a cultura de astrócitos de rato, é possível observar uma maior redução na
viabilidade celular da linhagem C6, mostrando que as células normais, apresenta-se menos
sensível à morte, nas mesmas concentrações e no mesmo intervalo de tempo.
A menor toxicidade causada pelas lignanas em cultura de astrócitos, principalmente a
arctigenina, é de extrema relevância, uma vez que células neoplásicas possuem uma
proliferação maior do que células normais, e as duas lignanas mostraram induzir morte
preferencialmente nas células tumorais.
A técnica de marcação nuclear com corante Hoechst 33342, para avaliação da
morfologia nuclear, demonstrou que as lignanas induzem a morte celular, provavelmente,
por apoptose.
Os resultados obtidos através das análises feitas por Microscopia Eletrônica de
Transmissão, em células tratadas com as drogas arctigenina e matairesinol, indicaram
alterações significativas nas mitocôndrias as quais sofreram tumefação, arredondamento e
123
desorganização das cristas. Além disso, foi possível observar condensação da cromatina,
formação de numerosos vacúolos de tamanhos variados e formação de corpos apoptóticos,
características essas que sugerem morte celular por apoptose.
124
6 ANEXOS
Figura 53- Espectro de RMN
1
H (300 MHz, CD
3
OD) da arctiina (S1).
125
Figura 54- Expansão do espectro de RMN
1
H (300 MHz, CD
3
OD) da arctiina (S1).
126
Figura 55- Expansão do espectro de RMN
1
H (300 MHz, CD
3
OD) da arctiina (S1).
127
Figura 56- Espectro de RMN
13
C (75 MHz, CD
3
OD) da arctiina (S1).
128
Figura 57- Expansão do Espectro de RMN
13
C (75 MHz, CD
3
OD) da arctiina (S1).
129
Figura 58- Espectro de DEPT (75 MHz, CD
3
OD) da arctiina (S1).
130
Figura 59- Espectro de HETCOR (
1
J
HC
) de arctiina (S1).
131
Figura 60- Expansão do espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctiina (S1).
132
Figura 61- Expansão do espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctiina (S1).
133
Figura 62- Expansão do espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctiina (S1).
134
Figura 63- Espectro de COSY
1
H x
1
H da arctiina (S1).
135
Figura 64- Expansão do espectro de COSY
1
H x
1
H da arctiina (S1).
136
Figura 65- Expansão do espectro de COSY
1
H x
1
H da arctiina (S1).
137
Figura 66- Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctiina (S1).
138
Figura 67- Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctiina (S1).
139
Figura 68- Espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctiina (S1).
140
Figura 69- Espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) da arctigenina (S2).
141
Figura 70- Expansão do espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) da artigenina (S2).
142
Figura 71- Espectro de RMN
13
C (75 MHz, CDCl
3
) da artigenina (S2).
143
Figura 72- Espectro de DEPT da arctigenina (S2).
144
Figura 73- Espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctigenina (S2).
145
Figura 74- Expansão do espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctigenina (S2).
146
Figura 75- Expansão do espectro de HETCOR (
1
J
HC
) da arctigenina (S2).
147
Figura 76- Espectro de COSY
1
H x
1
H da arctigenina (S2).
148
Figura 77- Expansão do espectro de COSY
1
H x
1
H da arctigenina (S2).
149
Figura 78- Expansão do espectro de COSY
1
H x
1
H da arctigenina (S2).
150
Figura 79- Espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3)
da arctigenina acetilada (S2Ac).
151
Figura 80- Espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctigenina (S2).
152
Figura 81- Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctigenina (S2).
153
Figura 82- Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctigenina (S2).
154
Figura 83- Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctigenina (S2).
155
Figura 84- Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) da arctigenina (S2).
156
Figura 85: Espectro de NOE diff da arctigenina (S2), com irradiação no sinal das metoxilas em δ
H
3,81.
157
Figura 86: Espectro de NOE diff da arctigenina (S2), com irradiação no sinal do hidrogênio H-2’ em δ
H
6,62.
158
Figura 87- Espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) do matairesinol (S3).
159
Figura 88- Expansão do espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) do matairesinol (S3).
160
Figura 89- Expansão do espectro de RMN
1
H (300 MHz, CDCl
3
) do matairesinol (S3).
161
Figura 90- Espectro de RMN
13
C (75 MHz, CDCl
3
) do matairesinol (S3).
162
Figura 91- Espectro de COSY
1
H x
1
H do matairesinol (S3).
163
Figura 92- Expansão do espectro de COSY
1
H x
1
H do matairesinol (S3).
164
Figura 93: Espectro de NOE diff do matairesinol (S3).
165
Figura 94- Espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) do matairesinol (S3).
166
Figura 95- Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) do matairesinol (S3).
167
Figura 96- Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) do matairesinol (S3).
168
Figura 97- Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) do matairesinol (S3).
169
Figura 98- Expansão do espectro de HMBC (
2,3
J
HC
) do matairesinol (S3).
170
Figura 99- Espectro de HETCOR (
1
J
HC
) do matairesinol (S3).
171
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADLERCREUTZ, H. Phyto-oestrogens and cancer.The Lancet oncology, v. 3, n. 6, p. 364-
373, 2002.
AGRAWAL, P.K. THAKUR, R. S.:
13
C NMR Spectroscopy of Lignan and Neolignan
Derivatives. Magnetic Resonance in Chemistry. v. 23, p. 6, p. 389-418, 1988.
ALISSON, M. R. The cancer handbook. 1 ed. New Jersey John. Wiley Sons, 2002.
AMARAL, D.F. Flavonóides de Ficus gomelleira, Dissertação de Mestrado, Universidade
Federal do Pará, 2000.
AMORIN A.; BORBA H. R.; CARAUTA J. P. P.; LOPES D.; KAPLAN M. A. C.
Anthelmintic activity of the latex of Ficus species. Journal of Ethnopharmacology. v. 64, n.
3, p. 255–258, 1999.
ANTOUN, M.D.; RAMOS, Z. VAZQUEZ, J; OQUENDO, I.; PROCTOR, G. R.; GERENA,
L.; FRANZBLAU, S.G.: Evaluation of the flora of Puerto Rico in vitro antiplasmodial and
antimycobacterial activities. Phytotherapy Research. v. 15, n. 7, p. 638-642, 2001.
AVGEROPOULOS, N. G. BATCHELOR, T. T. New treatment strategies for malignant
gliomas. The oncologist. v. 4, n. 3, p. 209-224, 1999.
AWALE, S.; LU, J.; KALAUNI, S. K.; KURASHIMA, Y.; TEZUKA, Y.; KADOTA, S.;
ESUMI H. Identification of arctigenin as na antitumor agent having the ability to Eliminate
the tolerance of cancer cells to nutriente starvation. Câncer Research. v. 66, n. 3, p. 1751-
1757, 2006.
AYRES, D. C.; LOIKE, J. D. Lignan: Chemical, Biological and Clinical roperties:
Cambridge University Press: Cambridge, 1990.
BANERJI, A. Biotechnical potential of natural products. Bioelectrochemistry and
Bioenergetics. v. 27, n. 2, p. 105-113, 1992.
172
BARBOSA FILHO, J.M. Lignanas, neo-lignanas e seus análogos. In: SIMÕES,
C.M.O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 1ed. Porto
Alegre/Florianópolis: Editora da Universidade/UFRGS/Ed. Da UFSC, cap.22,
p.471-488. 2002.
BAUMGARTNER, B. et al. An antimicrobial alkaloid from Ficus septica. Phytochemistry.
v. 29, n. 10, p.3327-3330, 1990.
BERG, C.C. Moreae, Artocarpeae and Dorstenia (Moraceae) with introductions to the family
and Ficus and with additions and corrections to Flora Neotropica Monograph 7. In:
Organization for Flora Neotropica, ed., Flora Neotropica Monograph. v. 83, 1-346, 2001.
BERG, C.C. VILAVICENCIO, X. Taxonomic studies on Ficus (Moraceae) in the West
Indies, extra-Amazonian Brazil, and Bolivia. Ilicifolia. v. 5, p. 1-177, 2004.
BERTRAM, J. S. The molecular biology of cancer. Molecular Aspects of Medicine. v. 21, p.
167-223, 2001.
BIRCH, A. J. LIEPA, A. J. ; Biosintenses. In: RAO, C. B. S.; Chemistry of Lignans.
Andhra Pradesh, India, Andhra University Press, p. 307, 1978.
BORGES-OSÓRIO, M.R.; ROBINSON, W.M. Genética Humana. 2 ed. Porto Alegre.
Editora Artmed, 2001.
BRANDES, A. A.; ERMANI, M.; TURAZZI, S.; SCELZI, E.; BERTI, F.; AMISTA, P.;
ROTILIO, A.; LICATA, C.; FIORENTINO, M. V. Procarbazine and high-dose tamoxifen as
a second-line regimen in recurrent high-grade gliomas: a phase II study. Journal of Clinical
Oncology. v.17, n. 2, p. 645-650, 1999.
BROCH, M. C. J. Vias de Sinalização Celular ativadas por Receptores Purinérgicos em
Astrócitos Normais e Gliomas. Tese de doutorado. Universidade Federal do Rio Grande do
Sul, Porto Alegre, 2004.
BURGER, P. C.; VOGEL, F. S.; GREEN, S. B.; Strike T. A. Glioblastoma multiforme and
anaplastic astrocytoma: Pathologic criteria and prognostic implications. Câncer. v. 56, n. 5, p.
1106-1111, 1985.
173
BYLUND, A.; SAARINEN, N.; ZHANG, J.; BERGH, A.; WIDMAR, A.; JOHANSSON, A.;
LUNDIN, E.; ADLERCREUTZ, H.; HALLMANS, G.; STATTIN, P.; MÄKELA, S.
Antcancer Effects of a Plant Lignan 7-Hydroxymatairesinol on a Prostate Cancer Model. Exp
Biol Med. v. 230, p. 217-223, 2005.
CARAUTA, J.P.P. Ficus (Moraceae) no Brasil: conservação e taxonomia. Albertoa. v. 2, p.
1-36, 1989.
CARAUTA, J.P.P. DIAZ, B.E. Figueiras no Brasil. Editora UFRJ, Rio de Janeiro. 2002.
CHANG M-S.; YANG Y-C.; KUO Y-C.; KUO Y-H.; CHANG C,; CHEN C-M.; LEE T-H.
Furocoumarin glycosides from the leaves of Ficus ruficaulis Merr. var. antaoensis. Journal
of Natural Products. v. 68, n. 1, p.11-13, 2005.
CHARLTON, J. M. Antiviral activity of lignans (Reviews). Journal of Natural Products. v.
61, n. 11, p. 1447-1451, 1998.
CHENG, S-H., SHEEN, J., GERRISH, C., Bolwell, P. Molecular identification of
phenylalanine ammonia-lyase as a substrate of a specific constitutively active Arabdopsis
CDPK expressed in maize protoplasts. FEBS Letters. v. 503(2/3), p.185-188, 2001.
CHIANG, L-C.; NG, L. T.; LIN, I-C.; KUO, P-L.; LIN, C-C. Anti-proliferative effect of
apigenin and its apoptotic induction in human Hep G2 cells. Cancer Letters. V. 237, n. 2, p.
207-214, 2006.
CHINNAIYAN, A. M.; O’ROURKE K.; TEWARI M.; DIXIT V.M. FADD, a novel death
domain-containing protein, interacts with the death domain of Fas and initiates apoptosis.
Cell. v. 81, p. 505–512, 1995.
CHO, J. Y.; KIM, A. R.; YOO, E. S.; BAIK, K. U.; PARK, M. H. Immunomodulatory Effect
of Arctigenin, a Lignan Compound, on Tumour Necrosis Factor-α and Nitric Oxide
Production, and Lymphocyte Proliferation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. v. 51,
n. 11, p. 1267-1273, 1999.
CHO, M. K.; PARK, J. W.; JANG, Y. P.; KIM, Y. C.; KIM, S. G.; Potent inhibition of
lipopolysaccharide-inducible nitric oxide synthase expression by dibenzylbutyrolactone
lignanas through inhibition of I- B α phosphorylation and of p65 nuclear translocation in
macrophages. International Immunopharmacology. 2(1), p. 105-116, 2002.
174
CHO, M K.; JANG, Y. P.; KIM, Y. C.; KIM, S. G. Arctigenin, a phenylpropanoid
dibenzylbutyrolactone lignan, inhibits MAP kinases and AP-1 activation via potent MKK
inhibition: the role in TNFalpha inhibition. International Immunopharmacology. v. 4, n.
10-11, p. 1419-1429, 2004.
CLAPAUCH, R.; MEIRELLES, R. M. R.; JULIÃO, M. A. S. G.; LOUREIRO, C. K. C.;
GIARODOLI, P. B.; PINHEIRO, S. A.; HARRIGAN, A. R.; SPRITZER, P. M.; PARDINI,
D. P.; WEISS, R. V.; ATHAYDE, A.; RUSSO, L. A.; POVOA, L C. Fitoestrogênios:
posicionamento do Departamento de Endocrinologia Feminina da Sociedade Brasileira de
Endocrinologia e Metabologia. Arquivo Brasileiro de Endocrinologia e Metabologia. v. 46,
n. 6, p. 679-695, 2002.
COLE, J.R. WIEDHOPF, R. M.; Distribuition. In: Chemistry of Lignans; Rao, C. B. S.,
ed. Andhra University Press and Publications Waltair: Visakhapatnam. v. 149, p. 39-64, 1978.
COOPER, G. M. A Célula- Uma Abordagem Molecular. 2ª ed. Artmed, 2001.
COULTAS L. STRASSER A. The role of the Bcl-2 protein family in cancer. Seminars in
Cancer Biology. v. 13, n. 2, p.115–123, 2003.
CROCE, M. C.; Review Article. Molecular Origins of Cancer. Oncogenes and Cancer. The
New England Journal of Medicine. v. 358, n. 5, p. 502-511, 2008.
CUMMINGS, M. C., WINTERFORD, C. M., WALKER, N. I.; Apoptosis. American
Journal of Surgical Pathology. v. 21, n. 1, p. 88-101, 1997.
DE SOUZA, W. et al. Técnicas básicas de microscopia eletrônica aplicadas às ciências
biológicas. 1aed., Departamento de Editoração Eletrônica da Universidade Estadual do Norte
Fluminense, Sociedade Brasileira de Microscopia Eletrônica, Rio de Janeiro, 1998.
DERAKHSHAN, M. Apoptosis at a glance: death or life? Review Article. Pakistan Journal
Medical Sciences. v. 23, n. 6, p. 979-982, 2007 (part-II).
175
DE ROBERTIS - HIB - Bases da Biologia Celular e Molecular, 3ª edição, Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2001.
DEWICK, P. M. Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach. Ed. Jonh Willey
e Sons Ltd, New York, 2001.
DI STASI, L.C. Plantas Medicinais: arte e ciência. Ed. Unesp, São Paulo, 1996.
DOMINGO, D. LÓPEZ-BREA, M. Plantas con acción antimicrobiana. Revista Española
de Quimioterapia, v. 16, n. 4, p. 385-393, 2003.
EICH, E.; PERTZ, H.; KALOGA, M.; SCHULTZ, J.; FESEN, M. R.; MUZUNDER, A.;
POMMIER, Y. Journal of Medical Chemistry. v. 39, n. 1, p. 86-95, 1996.
EL- KHRISY, E. A. M.; KHATTABA A. A.; ABU- MUSTAFA, E. A.; Constituents of Ficus
asprima, F. híspida and F. carica. Fitoterapia, v. 51, n. 5, p. 269-272, 1980.
EL- KHRISY, E. A. M.; The Constituents of Ficus eriobtryoides, Ficus cunnghanii and Ficus
sycomuros. Fitoterapia. v. 56, n. 3, p. 184-185, 1985.
FERREIRA, S. H.; BARATA, L. E. S.; SALES, S. L. M.; QUEIROZ, S. R. R.; HELUY
NETO, N. E.; CORAZZA, R. e FARIAS, R. C. Medicamentos a partir de Plantas
Medicinais no Brasil, Academia Brasileira de Ciências, Rio de Janeiro, 1998.
FERREIRA, A.A.; OLIVEIRA, P.M.; EVANGELISTA, E.A.; ALVES, R.B.; PIZZIOLLO,
V.R.; BRASILEIRO, B.G.; RODRIGUES, F.M.O.; SILVEIRA, D.; RASLAN, D.S. Atividades
biológicas das partes aéreas de Ipomoea cairica (Convolvulaceae). Revista Brasileira de
Plantas Medicinais, Botucatu, v.8, n.2, p.14-18, 2006
FETT-CONTE A. S. SALLES A. B. C. F. A importância do Gene p53 na carcinogênese
humana. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. v. 24, n. 2, p. 85-89, 2002.
FRANCIS, J. K. Ficus citrifolia P. Miller. Jagüey blanco, New Orleans, 1994. Disponivel
em : < http://www.fs.fed.us/global/iitf/Ficuscitrifolia.pdf >. Acesso em 17 de janeiro 2003
176
GIBBS, J. B. Mechanism-Based Target Identification and Drug Discovery in Cancer
Research. Science. v. 287, n. 5460, p. 1969-1973, 2000.
GONZALEZ, T. Ficus citrifolia P. Miller, Costa rica, 2001. Disponível em :
<http://www.inbio.ac.cr/bims/ubi/plantas/ubiespejo/ubiid=257&-find.html>. Acesso em 17 de
janeiro 2003.
GOTTILIEB, O. R. YOSHIDA, M.; Lignóides com atenção especial à química das
neolignanas. Química Nova. v.7, p.250-273, 1984.
GUIDUGLI-NETO, J. Elementos da Patologia Geral. São Paulo: Livraria Santos Editora,
1997.
HAI, J.; LIN, Q.; LU, Y.; ZHANG, H.; YI, J. Induction of apoptosis in rat C6 glioma cells by
panaxydol. Cell Biology International, v. 31, n. 7, p. 711-715, 2007.
HENGARTNER, M.O. The biochemistry of apoptosis. Nature. v. 407, p. 770–776, 2000.
HIRANO, T.; GOTOH, M.; OKA, K. Natural flavonoids and lignans are potent cytostatic
agents against human leukemic HL-60 cells. Life Science, v. 55, p. 1061-1069, 1994.
HOEIJMAKERS, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. v.
411, p. 366-374, 2001.
HSU H.; XIONG J.; GOEDDEL D. V. The TNF receptor 1-associated protein TRADD
signals cell death and NF-kappa B activation. Cell. v. 81, p. 495–504, 1995.
INCA- Instituto Nacional do cancer. Estimativas para 2008 e 2009: Incidências de Câncer
no Brasil. Disponível em:
<http://www.inca.gov.br/estimativa/2005/index.asp?link=conteudo_view.asp&id=5>.Acesso
em: 14 de abril de 2008.
ISHIDA, J.; WANG, H-K.; OYAMA, M.; COSENTINO, M. L.; HU, C-Q.; LEE, K-H. Anti-
Aids agents. 46. Anti-HIV activity of Harman, an anti-HIV principle from synplocos
setchuensis, and its derivatives. Journal of Natural Products. v. 64, n. 7, p. 958–960, 2001.
177
JAIN, N. YADAVA, R. N.; Flavonoids of the Leaves of Ficus infectoris. Fitoterapia,
1994, v. 65, n. 1, p. 94, 1994.
JANG, Y. P.; KIM, S. R.; KIM, Y. C. Neuroprotective dibenzylbutyrolactone lignans of
Torreya nucifera. Planta Medica. v. 67, n. 5, p. 470-472, 2001.
JANG, Y. P.; KIM, S. R.; CHOI, Y. H.; KIM, J.; KIM, S. G.; MARKELONIS, G. J.; OH, T.
H.; KIM, Y. C. Arctigenin protects cultured cortical neurons from glutamate-induced
neurodegeneration by binding to kainate receptor. Journal of Neuroscience Research. v. 68,
n. 2, p. 233-240, 2002.
JASSIM, S.A.A.; NAJI, M.A. Novel Antiviral Agents: a Medicinal Plant Perspective.
Journal of Applied Microbiology. v. 95, p. 412-427, 2003.
JIN, D. Q.; LIM, C. S.; HWANG, J. K,; HA, I.; HAN, J. S. Anti-oxidant and anti-
inflammatory activities of macelignan in murine hippocampal cell line and primary culture of
rat microglial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. v. 331, n. 4,
p. 1264-1269, 2005.
JUNQUEIRA, L.C. CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 8 ed. Rio de Janeiro:
Editora Guanabara. p. 292-295, 2005.
KATO, T.; HIROSE, M.; TAKAHASHI, S.; HASEGAWA, R.; HOHNO, T.; NISHIBE, S.;
KATO, K.; SHIRAI, T. Effects of the lignan, arctiin, on 17-beta ethinyl estradiol promotion
of preneoplastic liver cell foci development in rats. Anticancer Research. v. 18, n. 2A, p.
1053-1057, 1998.
KERR, J. F. R.; WYLLIE, A. H.; CURRIE, A. R. Apoptosis, a basic biological phenomenon
with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. v. 26, n. 4, p.
239-257, 1972.
KIM H.; LEE H.; YUN Y. X-gene product of hepatitis B virus induces apoptosis in liver
cells. The Journal of Biological Chemistry. v. 273, n. 1, p. 381-385, 1998.
KUMAR, S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death and Differentiation. v.
14, p. 32-43, 2007.
178
KUNLE, O. O.; SHITTU, A.; NASIPURI, R. N.; KUNLE, O. L.; WAMBEBE, C.; AKAH, P.
A.. Gastrointestinal activity of Ficus sur. Fitoterapia. v. 70, n. 6, p. 542-547, 1999.
KUROSE K, GILLEY K, MATSUMOTO S, WATSON PH, ZHOU XP, ENG C. Frequent
somatic mutations in PTEN and TP53 are mutually exclusive in the stroma of breast
carcinomas. Nat Genet. v. 32, n. 3, p. 355-357, 2002.
KUROSHIMA K. N. Estudos químicos e farmacológicos das plantas Virola oleifera e
Hyeronima alchorneoides. Tese de doutorado. Universidade Federal de Santa Catarina.
Florianópolis, 2002.
LAWS, J. R. E.R. SHAFFREY, M. E. The inherent invasiveness of cerebral gliomas:
implications for clinical management. Internatinal Journal of Developmental
Neuroscience. v. 17, n. 5-6, p. 413-420, 1999.
LEE, S. K.; MBWAMBO, Z. H.; CHUNG, H.; LUYENGI, L.; GAMEZ, E. J., MEHTA; R.
G.; KIMGHOM, A. D.; PEZZUTO, J. M.; Comb. Chem & high throughput screen. v. 1, p.
35,1998.
LEVITT, N. C. HICKSON, I. D. Carataker tumor suppressor genes that defend genoma
integrity. Trends Mol Med. p. 179-186, 2002.
LI, Y.C. KUO, Y.H. A monoterpenoid and two simple phenols from hearthood of Ficus
microcarpa. Phytochemistry, v.49, p. 2417-2419, 1998.
LIMA, O.O.A. BRAZ-FILHO, R. Dibenzylbutyrolactones lignans and coumarins from
Ipomoea cairica, Journal of Brazillian Chemical Society, v.8, p.235-238, 1997.
LOPES, D.; VELLELA, V. T.; KAPLAN, M. A. C.; CARAUTA, J. P. P.; Moretenolactone, a
- lactone hopanoid from Ficus insipida. Phytochemistry. v. 34 n. 1, p. 279-280, 1993.
LORENZI, H. MATOS, F.J.A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. Instituto
Plantarum de Estudos da Flora, Nova Odessa, 2002. 155p.
179
MACLEOD, K. Tumor suppressor genes. Current Opinion Genetics Development v. 10,
n. 1, p. 81-93, 2000.
MACRAE, W.D. TOWERS, G.H.N. Biological activities of lignans. Phytochemistry,
v.23, n. 6, p.1207-1220, 1984.
MATSUMOTO T.; HOSONO-NISHIYAMA K.; YAMADA H. Antiproliferative e apoptotic
effects of butyrolactone lignans Arctium lappa on leukemic cells. Planta medica. v. 72, n. 3,
p. 276-278, 2006.
MEAGHER, L. P.; BEECHER, G. R.; FLANAGAN, V. P.; LI, B. W. Isolation and
characterization of the lignans, isolariciresinol and pinoresinol, in flaxseed Meal. Journal of
Agricultural and Food Chemistry. v. 47, n.8, p. 3173-3180, 1999.
MENDONÇA-SOUZA, L. R. M. Dissertação (Mestrado em Biodiversidade Vegetal e Meio
Ambiente). Ficus (Moraceae) no Estado de São Paulo. 2006.
MICHAILOWSKY, C.; NIURA, F. K.; VALLE, A. C.; SONOHARA, S.; MENEGUIN, T. A.;
TSANACLIS, A. M. C. Tumores experimentais do sistema nervoso central: Padronização de
modelo em roedores utilizando a linhagem 9L . Arquivos de Neuropsiquiatria. v. 61, n.2A, p.
234-240, 2003.
MICHELS, G.; WÄTJEN, W.; WEBER, N.; NIERING, P., CHOVOLOU, Y.;
KAMPKÖTTER, A.; PROKSCH, P.; KAHL, R. Resveratrol induces apoptotic cell death in
rat H4IIE hepatoma cells but necrosis in C6 glioma cells. Toxicology. v. 225, n. 2-3, p. 173-
182, 2006.
MIURA, Y. KOYANAGI Y. Death ligand-mediated apoptosis in HIV infection. Reviews
in Medical Virology. v. 15, n. 3, p. 169-178, 2005.
MORITANI, S.; NOMURA, M.; TAKEDA Y, MIYAMOTO, K. Citotoxic components of
bardanae fructus (goboshi). Biological . Pharmaceutical Bulletin. v. 19, n. 11, p. 1515-
1517, 1996.
180
MORRONE, F. B. Estudo da proliferação e síntese de DNA induzidos por nucleotídeos e
nucleosídeos em linhagens celulares de gliomas. Dissertação. Universidade do Rio Grande do
sul. Porto Alegre 2002.
MOSMANN, T., Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to
proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. v. 65, p. 55-63,
1983.
MOUSA, O.; VUORELA, P.; KIVIRANTA, J.; WAHAB, S. A.; HILTUNEM, R.
VUORELA, H. Bioactivity of certain Egyptian Ficus species. Journal of
Ethnopharmacology. v. 41, n. 1-2, p.71-76, 1994.
MUÑOZ, G.D. Constituintes Químicos de Ficus maxima, Dissertação (Mestrado em
Química), Universidade Federal do Pará, 1997.
NUSSBAUM, R. L.; MCLNNES, R. R.; WILLARD, H. F. Thompson Thompson.
Genética Médica. 6ª Ed. Editora Guanabara-Koogan, Rio de Janeiro, 2000.
OBERLIES, N. H. KROLL, D. J. Camptothecin and Taxol: Historic chievements in natural
products research. Invited Reviews. Journal of Natural Products. v. 67, n. 2, p. 129-135,
2004
OGUNGBAMILA, F.O.; ONAWUNMI, G. O.; IBEWUIKE, J. C.; FUNMILAYO, K. A.
Antibacterial Constituents of Ficus barteri Fruits. International Journal of
Pharmacognosy, v.35, n. 3, p.185-189, 1997.
OJALA, T. Biological Screening of Plant Coumarins. Academic Dissertation, University of
Helsinki, Helsinki 2001.
OLIVEIRA, R.B.; GODOY, S. A. P.; COSTA, F. B. Plantas tóxicas: Conhecimento e
prevenção de acidentes. Ribeirão Preto, Editora Holos, 2003.
PAPALIAGKAS, V.; ANOGIANAKI A.; ANOGIANAKIS G.; ILONIDIS G. The proteins
and the mechanisms of apoptosis: A mini-review of the fundamentals. Review Article.
Hippokratia. v. 11, n. 3, p. 108-113, 2007.
181
PATEL, T. Apoptosis in hepatic pathophysiology. Clinics in liver disease. v. 4, n. 2, p. 295-
317, 2000.
PECKOLT, T. & PECKOLT, G. História das plantas medicinais e úteis do Brasil. Rio de
Janeiro: Laemmert Cia. v. 3, p. 798-819, 1890.
PEREIRA, V.; DAMASCENO, S. M.; BARREIROS, E. L.; KAPLAN, M. A. C. e
GOTTILIEB, O. R.; 38ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência
(SBPC), Curitiba- PR, 1986, 38 (7), p. 608.
PEREIRA, R. A. KOIFMAN, S. Associação entre fatores da dieta e tumores de cérebro em
adultos: uma revisão da literatura. Caderno de Saúde Pública, Rio de Janeiro, 17(6), p. 1313
1334, 2001.
PEREZ, C.; CANAL, J. R.; CAMPILLO, J. E.; ROMERO, A.; TORRES, M. D.;
Hypotriglyceridae activity of Fícus. Phytoterapia Research, v. 13, n. 3, p. 188-191, 1999.
PINES, J. Four-dimensional control of the cell cycle. Nature Cell Biology. v. 1, n. E73-E79,
1999.
PINTO, A.C.; SIQUEIRA, D.H.; BOLZANI, V.S.; LOPEZ, N.P.; EPIFANIO, R.A. Produtos
Naturais: Atualidade, Desafios e Perspectivas. Química Nova. v. 25, p. 45- 61, 2002.
RAHMAN, M. M. A., DEWICK, P. M.; JACKSON, D. E. AND LUCAS, J. A.;
Lignans of Forsythia intermedia. Phytochemistry. v. 29, n. 6, p. 1971-1980, 1990.
RAO, C. N.; LAKKA, S. S.; KIN, Y.; KONDURI, S. D.; FULLER, G. N.; MOHANAM, S.;
RAO, J. S. Expression of tissue factor pathway inhibitor 2 inversely correlates during the
progression of human gliomas. Clinical Cancer Research. v. 7, n. 3, p. 570–576, 2001.
RENEHAN A. G.;, BOOTH, C.; POTTEN C. S. What is apoptosis, and why is it important?
BR Med J. v. 322, n. 7301, p. 1536-1538, 2001.
RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K. Mutagênese Ambiental. 1 Ed,
Editora Ulbra, Canoas, Rio Grande do Sul, 2003.
182
RIEGER, P. T., The biology of cancer genetics. Seminars in Oncology Nursing. v. 20, n. 3,
p. 145-154, 2004.
SAARINEN N.M.; WARRI A.; MAKELA SI, ECKERMAN C, REUNANEN M,
AHOTUPA M, SALMI SM, FRANKE AA, KANGAS L, SANTTI R. Hydroxymatairesinol,
a novel enterolactone precursor with antitumor properties from coniferous tree (Picea abies).
Nutrition and Cancer. v. 36, n. 2, p.207-216, 2000.
SAEEB, M.A. SABIR, A.W. Irritant potential of triterpenoids from Ficus carica leaves.
Fitoterapia. v.73, n.5, p.417-20, 2002.
SANTOS, R.I dos. Metabolismo Básico e Origem dos Metabólitos Secundários.
In: SIMÕES, C.M.O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento.
PortoAlegre/Florianópolis: Editora da Universidade/UFRGS/Ed. da UFSC, 2004.
SAVAGE, P. D. Base molecular das neoplasias humanas: um guia. In: Shils, M. E.; Olson, J.
Á.; Hos, A. K. Tratado de nutrição moderna na saúde e na doença. 9 ed., Editora Monelle,
2003.
SAVILL, J. FADOK, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. v.
407, p. 784–878, 2000.
SCHMID, J. AMRHEIN, N. Molecular Organization of the Shikimate Pathway in Higher
Plants. Phytochemistry. v. 39, n. 4, p. 737-749, 1995.
SCHRODER, H.C.; MERZ, H.; STEFFEN, R.; MÜLLER, W. E., SARIN, P. S.; TRUMM,
S., et al. Differential in vitro anti-HIV activity of natural lignans. Zeitschrift für
Naturforschung. v. 45, n. 11/12, p.1215-21, 1990.
SETCHELL, K. D. R.; LAWSON, A. M.; MITCHELL, F. L.; ADLERCREUTZ, H.; KIRK,
D. N.; AXELSON, M. Lignans in man and animal species. Nature. v. 287, n. 5784, p. 740-
742, 1980.
SETCHELL, K. D. R.; LAWSON, A. M.; BORRIELLO S. P.; Harkness, S. P.; Gordon, H.;
Morgan, D. M. L.; Kirk, D. N.; Andersun, L. C.; Adlercreutz, H.; Axelson, M. Lignan
formation in man–microbial involvement and possible roles in relation to cancer. Lancet. v.
2, p. 4-7, 1981.
183
SILVA, J.; ERDTMANN, B. HENRIQUES, J. A. P. Genética Toxicológica. ! Ed. Porto
Alegre (RS), Alcance. p. 328-329, 2003.
SIMÃO, T. A.; RIBEIRO, F. S.; AMORIM, L. M.; ALBANO, R. M.; ANDRADA-SERPA,
M. J.; CARDOSO, L. E.; et al. TP53 mutations in breast cancer tumors of patients from Rio
de Janeiro, Brazil: association with risk factors and tumor characteristcs. Int J Cancer. v.
101, n. 1, p. 69-73, 2002.
SIMON, P. N.; CHABOUD, A.; DARBOUR, N.; DI PIETRO, A.; DUMONT, C.; LUREL,
F.; RAYNAUD, J.; BARRON, D. Modulation of cancer cell multidrug resistance. Anticancer
Research. v. 21, n. 2A, p. 1023-1027, 2001.
SOUZA, V.C. LORENZI, H. Botânica sistemática: guia ilustrado para identificação das
famílias de angiospermas da flora brasileira, baseado em APG II. São Paulo, Instituto
Plantarum, 2005.
SU, B-N.; PAWLUS, A. D.; JUNG, H-A.; KELLER, W. J.; MCLAUGHLIN, J. L.; A
DOUGLAS KINGHORN, A. D.; Chemical constituents of the fruits of Morinda citrifolia
(Noni) and their antioxidant activity. Journal of Natural Products. v. 68, n. 4, p. 592-595,
2005.
TAKASAKI, M.; KONOSHIMA, T; KOMATSU, K.; TOKUDA, H.; NISHINO, H. Anti-
tumor-promoting activity of lignans from the aerial part of Saussurea medusa. Cancer
Letters. v. 158, p. 53-59, 2000.
THORNBERRY, N. A. LAZEBNIK, Y. Caspases: Enemies within. Science. v. 281, n.
5381, p. 1312-1316, 1998.
THOMPSON L. U.; ROBB P.; SERRAINO M.; CHEUNG F. Mammalian lignan production
from various foods. Nutrition and cancer. v. 16, n. 1, p. 43-52, 1991.
TUNDIS, R., STATTI, G., MENICHINI, F., MONACHE, F.D. Arctiin and onopordopicrin
from Carduus micropterus ssp. perspinosus, Fitoterapia. v. 71, n. 5, p. 600-601, 2000.
184
VAN DEN BERG, M. E.; Plantas Medicinais da Amazônia, Contribuição ao Conhecimento
Sistemático, Belém, CNPq-PTU, 1982.
WALKER, M. D.; GREEN, S. B.; BYAR, D. P.; ALEXANDER, E. J.; BATZDORF, U.;
BROOKS, W. H.; et al. Randomised comparisons of radiotherapy and nitrosoureas for the
treatment of malignant glioma after surgery. The New Englend Journal of Medicine. v. 303,
n. 23, p. 1323-1329, 1980.
WARD, R. S.; Lignans, neolignans and related compouds. Nat. Prod. Rep. v. 14, p. 43-74,
1997.
WARD, R. S. Lignans, neolignans and related compouds. Nat. Prod. Rep. v. 16, p. 75-96,
1999.
WEISS, H. D. Neoplasmas. In: Samuels MA. Manual of Neurologic Therapeutics. 5 ed.
Boston: Little, Brown and Company. p. 224-249, 1995.
WILLFÖR, S.M.; AHOTUPA, M.O.; HEMMING, J.E.; REUNANEN, M.H.T.; EKLUND,
P.C.; SJÖHOLM, R.E.; ECKERMAN, C.S.E.; POHJAMO, S.P.; HOLMBOM, B.R.
Antioxidant activity of knotwood extractives and phenolic compouds of selected tree species.
Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 51, p. 7600-7606, 2003.
WYLLIE, A. H.; BELLANY, C. O.; BUBB V. J.; CLARKE, A. R.; CORBERT, S.; CURTIS,
L.; HARRISON, D. J.; HOOPER, M. L.; TOFT, N.; WEBB, S.; BIRD, C.C. Apoptosis and
Carcinogenesis. Br J Cancer. v. 80, n. 1, p. 34-37, 1999.
YANG, L. M.; LIN, S. J.; YANG, T. H.; LEE, K. H. Synthesis and anti-HIV activity of
dibenzylbutyrolactone lignans. Bioorganic Medicinal Chemistry. v. 6, n. 8, p. 941-944,
1996.
YOKOYAMA, T., OKANO, M., NOSHITA, T., FUNAYAMA, S., OHTUSKI, K., Biol.
Pharm. Bull. v. 26, p. 371–374, 2003.
YOUNES, R. N.; VARELLA, A. D.; SUFFREDINI, I. B. REVIEW. Discovery of new
antitumoral and antibacterial drugs from brazilian plant extracts using high throughput
screening. Clinics.v. 62, n. 6, p. 763-8, 2007.
185
ZIMMERMANN K. C.; RICCI J. E.; DROIN N. M.; GREEN D. R. The role of ARK in
stress-induced apoptosis in Drosophila cells. The Journal of Cell Biology, v. 156(6), pp.
1077–1087, 2002.
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