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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
GERUZA ZAPELINI DA SILVA
AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS EM RATOS
WISTAR ADULTOS SUBMETIDOS À MENINGITE PNEUMOCÓCICA
CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2009
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GERUZA ZAPELINI DA SILVA
AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS EM RATOS
WISTAR ADULTOS SUBMETIDOS À MENINGITE PNEUMOCÓCICA
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde para obtenção do título de Mestre em
Ciências da Saúde.
Orientadora: Profa. Dra. Tatiana Barichello
Co-Orientador: Prof. Dr. João Luciano de
Quevedo
CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2009
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DEDICO
A minha filha, Larissa
A minha mãe, Glória
A minha irmã, Graziela
A minha cunhada, Marja
Ao meu irmão, Filipe
Feche os seus lindos olhos e escute bem o que eu vou lhe dizer
O que sou o que tenho, e o que faço na vida, eu dedico a você
Meu sorriso, meu pranto, meus versos, meu canto, minha grande paixão
Meus abraços, meus beijos, e o meu coração, eu dedico a você
Eu dedico a você
Mesmo estando sozinha, sem ter seu carinho, eu não vou lhe esquecer
Pois o que sou, o que tenho, e o que faço na vida, eu dedico a você
Eu dedico a você
Eu dedico a você
AGRADECIMENTO ESPECIAL
A minha orientadora, Tatiana Barichello,
Primeiramente pela oportunidade de ser componente
do seu grupo de pesquisa;
Por me ensinar sobre tudo;
Por me mostrar que o conhecimento não tem limites
e que buscar informações depende de cada um de nós;
Por me dar espaço para aprender dentro do laboratório;
Por confiar em mim e me delegar responsabilidades;
Por ser amiga, incentivadora, companheira;
Você é uma das pessoas mais inteligentes que eu conheço e
Que merece as melhores oportunidades, vitórias e alegrias.
Enfim, você é a maior responsável por esta conquista.
Serei eternamente grata a você.
Muito obrigada!!!
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pelo dom da vida;
Ao pai da minha filha que sem a ajuda dele não chegaria até aqui;
Ao prof. João Quevedo, pela oportunidade de trabalhar
com modelo animal de comportamento;
A Larissa e a Cristiane, pela amizade, por estar sempre disposta a ajudar, pela
compreensão, pelo carisma, pelas conversas, pelos ensinamentos, enfim, obrigada
por tudo;
A Geovana por ser companheira e por dividir seus conhecimentos comigo;
A todas as alunas de IC pelas conversas;
A Ana Lúcia, Joana, Cíntia, Alexandre, Gisele e Fabrícia
pela disponibilidade em ajudar;
Aos professores do PPGCS pelos ensinamentos;
A Paula , a Francine, a Veronica e a Kátia pela descontração;
A Janieri, que apesar da distância continua sendo uma grande amiga;
A toda minha família pela confiança e por estarem sempre presentes;
Enfim, agradeço a todos que direta ou indiretamente me ajudaram a subir mais um
degrau e conquistar mais uma vitória.
TOCANDO EM FRENTE
Almir Sater
Ando devagar
Porque já tive pressa
Levo esse sorriso
Porque já chorei demais
Hoje me sinto mais forte
Mais feliz quem sabe
Só levo a certeza
De que muito pouco eu sei
Eu nada sei
Conhecer as manhas e as manhãs
O sabor das massas e das maçãs
É preciso amor pra poder pulsar
É preciso paz pra poder sorrir
É preciso a chuva para florir
Penso que cumprir a vida
Seja simplesmente
Compreender a marcha
Ir tocando em frente
Todo mundo ama um dia
Todo mundo chora um dia
A gente chega e o outro vai embora
Cada um de nós Compõe a sua história
Cada ser em si carrega o dom se ser capaz
De ser feliz
RESUMO
A meningite bacteriana ocasionada pelo Streptococcus pneumoniae é associada
com uma significativa taxa de mortalidade incluindo seqüelas neurológicas
persistentes, déficit sensorial-motor, convulsões e prejuízo de aprendizagem e
memória. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho cognitivo
em ratos que sobreviveram à meningite bacteriana causada por S. pneumoniae 10,
30 e 60 dias após a indução e verificar se a administração precoce do antibiótico
evita prejuízo cognitivo. Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando entre 300-
350g. Os animais foram submetidos à inoculação na cisterna magna, e receberam
10L de salina estéril como placebo ou um volume equivalente de uma suspensão
de S. pneumoniae na concentração de 5x10
9
UFCol/mL, o tratamento antibiótico
iniciou dezesseis horas após a indução (ceftriaxona, 100 mg/kg duas vezes ao dia,
ip, durante sete dias). Os animais foram submetidos a seis testes comportamentais
10, 30 e 60 dias após a indução: (a) habituação ao campo aberto, (b) esquiva
inibitória, (c) esquiva inibitória de múltiplos treinos, (d) reconhecimento de objetos,
(e) labirinto em cruz elevado e (f) nado forçado. Outro grupo experimental foi iniciado
o tratamento com antibiótico 8 e 16 horas após a indução da meningite e os animais
foram submetidos ao teste de habituação ao campo aberto. Nós demonstramos que
os animais sobreviventes 10 dias após a indução da meningite, apresentaram
prejuízo no teste de habituação ao campo aberto, na esquiva inibitória, na esquiva
inibitória múltiplos treinos, no reconhecimento de objetos, no labirinto em cruz
elevado e no nado forçado. Após 30 dias da indução da meningite, os animais
sobreviventes mantiveram prejuízo na habituação ao campo aberto, no
reconhecimento de objetos e no nado forçado. No entanto, após 60 dias os animais
não apresentaram prejuízo cognitivo. No outro grupo experimental, a administração
precoce de antibióticos (8h após a indução), quando comparado à administração de
antibiótico tardio (16h após a indução) preveniu o prejuízo cognitivo ocasionado pela
meningite pneumocócica. Nossos resultados verificaram prejuízo de aprendizagem e
memória, demonstrados 10 dias após a indução da meningite, persistindo até 30
dias após a indução. As alterações cognitivas não persistiram nos animais induzidos
após 60 dias. Sugerindo, que este modelo pode auxiliar na compreensão dos
mecanismos biológicos associados com a meningite. Verificamos também que a
administração precoce de antibióticos é uma estratégia eficaz para evitar prejuízo
cognitivo a longo prazo, em um modelo animal de meningite.
Palavras-chave: Meningite; Aprendizagem; Memória; Depressão; Ansiedade;
Sistema nervoso central.
ABSTRACT
Bacterial meningitis due to Streptococcus pneumoniae is associated with a
significant mortality rate and persisting neurologic sequelae including sensory-motor
deficits, seizures, and impairments of learning and memory. Thus, the aim of this
study was to o evaluate the cognitive performance in rats that survived to bacterial
meningitis caused by S. pneumoniae after 10, 30 and 60 days after induction and
verified early antibiotic administration prevents cognitive impairment induced by
meningitis in rats. Male Wistar rats, weighing 300-350 g, underwent a magna cistern
tap receiving either 10 µL sterile saline as a placebo or an equivalent volume of a S.
pneumoniae suspension at the concentration 5x10
9
cfu/mL and followed by the
initiation of the antibiotic treatment at sixteen hours after inoculation (ceftriaxone 100
mg/Kg twice a day, i.p.). The animals underwent six behavioral tasks 10, 30 and 60
days after surgery: (a) habituation to the open field, (b) inhibitory avoidance task, (c)
continuous multiple trials step-down inhibitory avoidance task, (d) object recognition,
(e) elevated plus-maze and (f) forced swimming test. Other group was started 8 and
16 h treatment with antibiotics after induction and the animals were followed for 10
days to the determination of long-term cognitive outcomes. We demonstrated that
survivors presented 10 days after meningitis induction deficits on the habituation to
the open field, step down inhibitory avoidance, continuous multiple-trials step-down
inhibitory avoidance, object recognition, elevated plus-maze and forced swimming.
The animals were submitted to the habituation of an open-field as an index of long-
term cognitive function. After 30 days from meningitis induction, survivors maintained
deficits on the habituation to the open field, object recognition and forced swimming.
However, after 60 days all behavior deficits were reversed. Early antibiotic
administration (8 h after inoculation) when compared to late antibiotic administration
(16 h after inoculation) prevented cognitive impairment induced by pneumococcal
meningitis in Wistar rats. These results indicate that the impairment of learning and
memory, demonstrated 10 days after the induction of meningitis, persists up to 30
days. The cognitive impairments did not persist up to 60 days, suggesting that this
model can help in the understanding of the biological mechanisms associated with
meningitis induced sickness behavior and suggest that early antibiotic administration
is an effective strategy to prevent long-term cognitive impairment in a meningitis
animal model.
Key words: Meningitis; Learning; Memory; Depression; Anxiety; Central
nervous system.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Mecanismos de Patogenicidade.................................................................17
Figura 2: Barreira Hematoencefálica..........................................................................19
Figura 3: Mecanismo de invasão da BHC (Transcelular)...........................................20
LISTA DE ABREVIATURAS
ACTH – Hormônio adrenocorticotrófico
BDNF - Fator neurotrófico derivado do cérebro
DA - Dopamina
DPI - Doença pneumocócica invasiva
HHA – Eixo hipotálamo-hipófise-adrenal
Hib - Haemophilus influenzae b
IL-1 - Interleucina-1
IL-6 - Interleucina-6
LCR – Líquido cefalorraquidiano
MBs - Meningites bacterianas
Meningococo - Neisseria meningitidis
NE – Noradrenalina
PAF - Fator ativador de plaquetas
RNS - Espécies reativas do nitrogênio
ROS - Espécies reativas de oxigênio
SNC - Sistema nervoso central
TNF- - Fator de necrose tumoral alfa
5HT - Serotonina
SUMÁRIO
PARTE I - INTRODUÇÃO.........................................................................................11
1. Meningite...............................................................................................................11
1.2. Epidemiologia.....................................................................................................12
1.3. Sinais e sintomas da meningite..........................................................................12
2. Streptococcus pneumoniae ...................................................................................14
2.1. Colonização........................................................................................................17
2.2. Barreira hematoencefálica..................................................................................18
3. Danos no Sistema Nervoso Central ......................................................................20
3.1. Memória .............................................................................................................21
3.2. Ansiedade e Depressão .....................................................................................23
4. Testes Comportamentais ......................................................................................26
5. Objetivos ...............................................................................................................30
5.1. Objetivo Geral ....................................................................................................30
5.2. Objetivos Específicos .........................................................................................30
PARTE II RESULTADOS..........................................................................................31
Artigo 1 :....................................................................................................................31
Artigo 2 :....................................................................................................................66
PARTE III - DISCUSSÃO..........................................................................................70
CONCLUSÃO ...........................................................................................................76
REFERÊNCIAS.........................................................................................................77
PARTE I - INTRODUÇÃO
1. Meningite
A meningite bacteriana é uma infecção do sistema nervoso central (SNC),
caracterizada por uma forte reação inflamatória no espaço subaracnóide e
ventricular, considerada a mais severa e freqüente infecção do SNC (Grandgirard et
al., 2007), gerando complexos cerebrais (espécies reativas de oxigênio (ROS),
espécies reativas do nitrogênio (RNS)) que causam prejuízos neuropsicológicos e
cognitivos, através de uma reação inflamatória, incluindo apoptose hipocampal e
necrose cortical (Leib et al.,1996; Koedel & Pfister, 1999; Nau et al.,1999; Irazuzta et
al., 2005). A inflamação no espaço ventricular e subaracnóide da meningite
bacteriana é aparentemente responsável por muitas das conseqüências
fisiopatológicas da doença (Toumanen, 1994; Pfister et al., 1999). Os danos
causados pela meningite afetam múltiplas áreas do cérebro com uma distribuição
heterogênea afetando-as em diferentes tempos (Kim et al., 1995). A falta de
uniformidade nos danos ocorridos gera uma dificuldade para avaliar a severidade e
o grau dos danos neuronais (Irazuzta et al., 2000a), dificultando quantificar os danos
cerebrais, especialmente imediatamente após a lesão, criando obstáculos nas novas
terapias (Irazuzta et al., 2001). A terapia com antimicrobiano é parcialmente efetiva
na prevenção de morte e desenvolvimento de seqüelas neurológicas em pacientes
com a meningite bacteriana (Daoud et al., 1995; Goetghebuer et al., 2000; Leib et
al., 2003).
1.2. Epidemiologia
A incidência anual da meningite bacteriana é de 4-6 por 100.000 adultos,
sendo uma importante doença que acomete o mundo inteiro. Estudos realizados em
diversas áreas do mundo indicam que três tipos de bactérias são responsáveis por
mais de 90% das meningites bacterianas fora do período neonatal, o Haemophilus
influenzae b (Hib), a Neisseria meningitidis (meningococo) e o Streptococcus
pneumoniae. O S. pneumoniae e a N. meningitidis são os causadores de 80% dos
casos. Sendo que a taxa de mortalidade da meningite pneumocócica é em torno de
26% e a meningite meningocócica em torno de7% (Hoogman et al., 2007).
Atualmente, cerca de 5% a 40% das crianças ainda morrem em decorrência de
meningite bacteriana, na dependência, entre outros fatores, da idade do paciente e
do patógeno envolvido (Mantese et al., 2002).
No Brasil, um estudo retrospectivo da incidência de meningite no estado
do Paraná desde 2002, mostrou que os principais agentes etiológicos da meningite
bacteriana aguda são o S. pneumoniae e a N. meningiidis, sendo que, o S.
pneumoniae registrado nesse período, teve a maior letalidade (32%), demonstrando
que o S. pneumoniae é um dos principais agentes de infecções do trato respiratório,
meningite e sepse (Rossoni et al., 2008).
1.3. Sinais e sintomas da meningite
Segundo estudos de Honda & Warren (2009), as manifestações clínicas e
físicas em pacientes com meningites são consideravelmente variadas. A
apresentação clínica de pacientes com meningite inclui rápido aparecimento de
febre, dor de cabeça, fotofobia, rigidez da nuca, letargia, indisposição, apreensão, ou
vômito.
Em casos graves de meningite bacteriana, os pacientes podem
apresentar coma, convulsões e déficits neurológicos, que são associados com um
desfavorável prognóstico. A gravidade dos sintomas pode ser influenciada por
alguns fatores do hospedeiro, como idade, anormalidades anatômicas, doenças
concomitantes, sistema imune e patógenos causador. A avaliação de um paciente
com suspeita de meningite deve incluir um exame neurológico completo, além de
exames gerais, com ênfase na cabeça, ouvido, nariz e orofaringe (Honda & Warren,
2009).
O diagnóstico da meningite bacteriana deve ser precoce e bem
estabelecido devido à elevada morbi-mortalidade da doença (Romanelli et al., 2001).
Quando o diagnóstico da meningite não pode ser feito com base em história e física,
a punção lombar é o procedimento de escolha para uma melhor avaliação. Nos
casos fulminantes que clinicamente evidencia a meningite, o líquido
cefalorraquidiano (LCR) é analisado podendo servir para identificação de espécies
de organismos causadores e orientar uma futura escolha da antibioticoterapia. A
punção lombar para coleta do LCR e a coleta de sangue para o diagnóstico
laboratorial devem ser realizadas logo após a suspeita clínica de meningite,
preferencialmente antes do início do tratamento com antibiótico. O material deve ser
coletado em meio estéril e ser processado no laboratório local para orientação da
conduta médica (Mantese et al., 2002).
O diagnóstico laboratorial das meningites é realizado através do estudo
do LCR. A punção do LCR é freqüentemente realizada na região lombar, entre as
vértebras L1 e S1, sendo mais indicados os espaços L3-L4, L4-L5 ou L5-S1. Uma
das contra-indicações para a punção lombar é a existência de infecção no local da
punção (Brasil, 2005). O LCR é freqüentemente identificado por um número elevado
de leucócitos, juntamente com alguns achados clínicos, permitindo determinar: a
intensidade do processo inflamatório; o agente etiológico; os anticorpos específicos,
os quais informam indiretamente a etiologia da infecção (Menezes et al., 2009).
2. Streptococcus pneumoniae
O S.pneumoniae é um diplococo Gram positivo, patógeno freqüentemente
encontrado em enfermidades infecciosas na comunidade em geral, sendo o principal
agente de pneumonia, meningite, otite média e sinusite ocorrendo em todas as
idades (Gil-Setas et al., 2004).
O S. pneumoniae reside na superfície da mucosa do trato respiratório
superior, o microrganismo pode ser cultivado da nasofaringe de seres humanos.
Embora a colonização neste local pareça ser assintomática, se o organismo ganha
acesso à via aérea normalmente uma rápida resposta inflamatórias acontece
resultando na doença (Kadioglu et al., 2008). Atualmente mais de 90 sorotipos de
pneumococos são conhecidos, baseados nas diferenças estruturais e antigênicas
dos polissacarídeos capsulares (Kadioglu et al., 2008; Jansen et al., 2009). A
cápsula bacteriana do S.pneumoniae é o fator de virulência mais importante, sendo
a base da classificação dos sorotipos desta bactéria.
A virulência do S.pneumoniae está associada com sua capacidade de
resistir à fagocitose e morte por células fagocitárias, essa resistência está
relacionada com a cápsula polissacarídica do microrganismo (Kadioglu et al., 2008).
A cápsula de polissacarídio forma a camada mais externa das células do S.
pneumoniae, esta se liga covalentemente à superfície externa da parede celular do
peptideoglicano. A produção de cápsula é indispensável para a virulência do
pneumococo e é fortemente anti-fagocitária.
No nível molecular, as paredes celulares do S. pneumoniae induzem
células endoteliais cerebrovasculares, microglia, e inflamação das células da
meninge liberando citocinas, quimiocinas (Scheld et al., 2002), ROS, RNS e
peroxidonitrito em grande quantidade durante a meningite pneumocócica (klein et
al., 2007).
As paredes celulares bacterianas possuem uma macromolécula chamada
peptideoglicano, essa macromolécula é altamente complexa e essencial para as
paredes das células bacterianas, permitindo que as bactérias resistam à pressão
osmótica. Embora, tenha sido freqüentemente considerada como uma estrutura
inerte circundante das bactérias, a camada de peptideoglicano é uma
macromolécula altamente dinâmica e muito bem regulada, estando esta
constantemente remodelada para permitir o crescimento e divisão celular (Boneca,
2005).
A toxina mais importante do S. pneumoniae é a pneumolisina (Meli et al.,
2002; Braun et al., 2007). A pneumolisina é uma proteína citoplasmática bacteriana
multifuncional que possui propriedades citotóxicas e pró-inflamatórias. Os efeitos
pró-inflamatórios da pneumolisina incluem ativação do complemento, ativação de
neutrófilos, e aumento da produção de mediadores pró-inflamatórios, como fator de
necrose tumoral alfa (TNF), interleucina-1 (IL-1) e óxido nítrico (Braun et al.,
2007). A pneumolisina pertence à família das citolisinas colesterol dependente, esta
toxina liga-se ao colesterol das membranas das células eucarióticas formando
grandes poros e destruindo a integridade da membrana ocasionando morte celular
(El-Rachkidy et al., 2008).
Na meningite pneumocócica, a pneumolisina causa danos cocleares com
posterior perda de audição. Independentemente da resposta inflamatória, a
pneumolisina também ocasiona perda neuronal na região do giro denteado
hipocampal e apoptose. Os pneumococos vivos causam a morte celular neuronal
por induzir um rápido aumento intracelular nos níveis de ROS e cálcio (Ca
2+
),
seguidos pelos primeiros danos mitocondriais. A perda potencial da membrana
mitocondrial precede a todos os sinais morfológicos de apoptose, condensação
nuclear e encolhimento celular (Braun et al., 2007).
Figura 1 - Mecanismos de Patogenicidade
Fonte: (Figura adaptada de Jedrzejas, 2001).
2.1. Colonização
O S. peumoniae é um colonizador comum da nasofaringe, em humanos é
uma das principais causas invasoras de infecções bacterianas, como meningite e
bacteremia, também chamada de doença pneumocócica invasiva (DPI). O potencial
de invasão do S. pneumoniae tem sido sugerido estar relacionado com a
composição da cápsula de polissacarídio, ou seja, o sorotipo ou sorogrupo
pneumocócico (Jansen et al., 2009).
O S. pneumoniae é uma bactéria que pode ser encontrada como um
comensal do trato respiratório superior em humanos (Martner et al., 2008), e a
colonização assintomática ocorre em até 100% da população normal. A doença
invasiva é sucedida pela colonização nasofaríngea (Brouwer et al., 2009), seguida
por bacteremia e invasão do SNC, no qual esse é protegido por um complexo
mecanismo que interpõe entre o sangue e o LCR denominada barreira
hematoencefálica (Meli et al., 2002).
2.2. Barreira hematoencefálica
A barreira hematoencefálica (fig. 2) é uma barreira estrutural e funcional
que é formada através de células endoteliais microvasculares do cérebro, astrócitos
e pericitos. Ela mantém a homeostase do SNC, regulando a passagem de moléculas
para dentro e fora do cérebro, protegendo o cérebro de toxinas e microrganismos
que estão circulando no sangue (Maisey et al., 2008; Kim, 2008).
As células endoteliais microvasculares do cérebro têm características
distintas, tais como apertado entroncamentos e baixas taxas de pinocitoses. Os
astrócitos e os pericitos ajudam a manter as propriedades das células endoteliais
microvasculares da barreira cerebral, mas as suas contribuições da passagem da
barreira microbiana permanecem incompreendidas (Kim, 2008).
Figura 2 - Barreira hematoencefálica.
Fonte: (Figura adaptada de Kim, 2008).
Segundo Kim (2008), patógenos podem atravessar a barreira
hematoencefálica por três mecanismos: transcelular, paracelular e cavalo de Tróia.
O S. pneumoniae atravessa a barreira hematoencefálica através do mecanismo de
invasão transcelular (fig. 3), no qual o patógeno atravessa a barreira sem evidência
de dano celular. A travessia da barreira se dá em parte, através de interações entre
células da parede celular e o receptor do fator ativador de plaquetas, (PAF) (Maisey
et al., 2008; Kim, 2008).
Figura 3- Mecanismo de invasão da BHC (Transcelular)
Fonte: (Figura adaptada de Kim et al., 2008).
3. Danos no Sistema Nervoso Central
Os danos neurológicos causados na meningite por S. pneumoniae não é
apenas infecção nas meninges, mas também comprometimento da vascularização
cerebral, edema cerebral, necrose cerebral e hidrocefalia. A infecção pode causar
hemorragia intracraniana como uma das complicações vasculares, em alguns casos,
causando meningoencefalite (Davis & Greenlee, 2003).
Desta forma o dano cerebral do resultado da meningite é similar a outras
causas de danos cerebrais, uma combinação de danos primários e secundários,
sendo os danos secundários alvos das maiores intervenções terapêuticas. Há uma
seqüência de processos fisiológicos e bioquímicos que exacerbam o resultado inicial
do dano (Kochanek et al., 2000).
A lesão neurológica é causada pelo microrganismo e também pela
resposta inflamatória (Weisfelt et al., 2006a). Estudos experimentais ao longo dos
últimos anos têm aumentado à compreensão dos mecanismos moleculares
subjacentes que levam a danos cerebrais durante a meningite. O dano necrótico no
córtex cerebral é parcialmente mediado por isquemia e formação de ROS e,
portanto, oferece um alvo promissor para a intervenção terapêutica adjuvante. A
apoptose neuronal no hipocampo pode ser o principal responsável pelo dano
cognitivo e dificuldades de aprendizagem em sobreviventes de meningite
bacterianas, no entanto, os mecanismos envolvidos não foram totalmente elucidados
(Meli et al., 2002).
3.1. Memória
Izquierdo, 1989 sugere que o hipocampo é especializado, de fato, no
reconhecimento de ambientes, mais do que no reconhecimento de qualquer
estímulo. A lesão do hipocampo afeta profundamente, e talvez especificamente, a
capacidade de localização espacial. É provável que o reconhecimento da novidade
ou não de determinadas ou de todas as situações em geral, por parte do hipocampo,
envolva, primariamente, o reconhecimento do contexto espacial de cada estímulo ou
configuração de estímulos em particular.
A ativação do hipocampo por experiências novas e ou por ambientes
novos e ou por experiências dentro de ambientes novos tem duas conseqüências.
Por um lado, o hipocampo informa a seus sítios de projeção: amígdala, hipotálamo,
secundariamente através do hipotálamo a diversos núcleos talâmicos associativos
que se trata realmente de uma experiência ou ambiente novo. Por outro lado,
através do fórnix, o hipocampo ativa neurônios -endorfinérgicos localizados no
hipotálamo medial basal. Esses neurônios, por sua vez, projetam ao septum medial
(podendo, assim, fechar um círculo), à amígdala e a outros núcleos vinculados com
a modulação dos processos de memória (Izquierdo, 1989; Izquierdo et al., 2002).
As principais complicações das meningites bacterianas são perda da
audição, distúrbios de linguagem, retardo mental, anormalidade motora e distúrbios
visuais (Brasil, 2005). A meningite bacteriana é responsável também pela maioria
das seqüelas neurológicas em adolescentes e crianças acometidas pela meningite,
mesmo com a recuperação aparentemente satisfatória, freqüentemente acontece
prejuízo cognitivo, podendo apresentar na fase adulta déficit de atenção, agitação
motora, lentidão de resposta auditiva, déficit de memória e lentidão na localização
sonora (Hoogman et al., 2007).
A memória é base inicial de todo o comportamento que vem a ser
executado, no qual esta controla o comportamento futuro pela experiência (Klinke &
Silbernagl, 2006) é a aquisição, a formação, a conservação e a evocação de
informações, também chamada de aprendizagem, por que só se grava aquilo que foi
aprendido (Izquierdo et al., 2002; Zardo, 2006). Certamente, é mais fácil, para
alguns, de lembrar-se de certas coisas, sendo que para outros, apesar de grandes
esforços, é quase que impossível, e com o tempo isso fica mais inusitado (Klinke &
Silbernagl, 2006).
Não é possível medir memórias em forma direta. Só é possível avaliá-las
medindo o desempenho em testes de evocação. Nos animais, a evocação se
expressa através de mudanças comportamentais; no homem, a evocação pode
também ser medida através do reconhecimento de pessoas, palavras, lugares ou
fatos. É evidente que a evocação de uma alteração comportamental implica num
prévio reconhecimento, e que todo reconhecimento implica numa alteração
comportamental real ou potencial (Izquierdo, 1989; Izquierdo et al., 2002).
3.2. Ansiedade e Depressão
Na multiplicação de discursos sobre o cérebro e as doenças a ele
associadas, alguns temas aparecem com maior preeminência, caso da depressão e
da ansiedade; estas doenças, nos termos da leitura biomédica contemporânea que
se faz delas, surgem com uma roupagem que pouco tem em comum com as
explicações de ordem psicanalítica ou com a leitura do sistema humoral (Azize,
2008).
A ansiedade, apesar de ser um fenômeno universal, vivenciado por todo
ser humano, inúmeras vezes ao longo de sua vida, ainda não possui uma definição
exata. Existe pouca concordância entre o que os vários estudiosos chamam de
ansiedade, chegando mesmo a ser considerada como irredutível e indefinível.
Embora ainda sem uma definição exata, a ansiedade pode ser facilmente notada
(Gama, 2008).
De acordo com Gama, 2008 no homem, a ansiedade é percebida como
uma emoção caracterizada por um alerta tenso e fisicamente exaustivo, focalizado
em um perigo ou emergência iminente e inevitável, embora não objetivamente
aparente, com uma incerteza dolorosa sobre a possibilidade de se resolver a
situação, em dois conceitos distintos: a ansiedade-estado, referente a um estado
emocional transitório, caracterizado por sentimentos subjetivos de tensão que
podem variar em intensidade ao longo do tempo, e a ansiedade-traço, a qual se
refere a uma disposição pessoal, relativamente estável, a responder com ansiedade
a situações estressantes e uma tendência a perceber um maior número de situações
como ameaçadoras.
A ansiedade é mantida pela falta de controle sobre o meio ambiente,
dessa forma, pessoas ansiosas consideram-se incapazes e com poucos recursos
para enfrentar ameaças. No caso da ansiedade, o medo decorrente de uma situação
na qual não há perigo, denuncia, distorções no processo cognitivo e indica a
necessidade de intervenção. O tratamento consiste em eliminar padrões de
funcionamento desadaptado, ou seja, o medo das sensações físicas e as
"estratégias de segurança" desenvolvidas pelo indivíduo (Annicchino & Matos,
2007).
A depressão é uma doença comum, freqüentemente crônica, recorrente e
familiar, cujo início ocorre, muitas vezes na infância e na adolescência. A depressão
em crianças e adolescentes aparenta estar aumentando e iniciando cada vez mais
precocemente, constituindo atualmente uma das principais preocupações de saúde
pública. Pela razão de constituir doença grave e que normalmente prediz sua
continuação ou recorrência na idade adulta, sua abordagem terapêutica é de
extrema importância. O atendimento adequado da depressão em crianças e
adolescentes é realizado com uma aproximação multidisciplinar, envolvendo
basicamente recursos psicosociais (Bahls et al., 2003).
Os sintomas básicos de um episódio depressivo maior são os mesmos
em adultos, adolescentes e crianças, embora existam dados sugerindo que a
predominância de sintomas característicos pode mudar com a idade e que o
comportamento e a cognição podem ser afetados assim como, o humor e os
sentimentos (Bahls, 2002).
De acordo com Lafer, (2000), a depressão relacionada à doença não se
refere apenas a alterações do humor, mais também a alterações cognitivas e
psicomotoras. As principais teorias relativas à base biológica da depressão situam-
se nos estudos sobre neurotransmissores cerebrais e seus receptores, embora
outras áreas também estejam sob investigação. As monoaminas constituem-se na
principal hipótese envolvendo os neurotransmissores cerebrais. Subdividem-se em
catecolaminas: dopamina (DA) e noradrenalina (NE), e na indolamina: serotonina
(5HT). A hipótese das monoaminas baseia-se no conceito da deficiência das aminas
biogênicas, particularmente NE, 5HT e DA, como a causa das depressões, surgindo
posteriormente a hipótese serotonérgica (Bahls, 1999).
Na neuroanatomia do transtorno depressivo maior são implicadas redes
fronto-subcorticais (tais como as áreas pré-frontal, tálamo, gânglios basais,
hipocampo, etc). Estas estruturas podem atrofia o que explicaria a persistência ou
cronicidade de alguns dos sintomas cognitivos da depressão. Alterações na
memória explícita, declarativa ou recolha, de particular importância, uma vez que
são mais freqüentemente encontrados em indivíduos com um ou mais episódios
depressivos maiores, ea estrutura cerebral que é mais directamente correlacionadas
com alterações na memória de armazenamento explícito é o hipocampo (Rizzo,
2008).
Em conseqüência dos estudos de neuroimagem estrutural e funcional é
possível localizar certas áreas cerebrais predominantemente alteradas em pacientes
com depressão maior. Encontra-se redução de volume e hipometabolismo nos lobos
frontais, gânglios da base e estruturas mediais e temporais do cérebro, envolvendo
essencialmente conexões entre os gânglios da base, os lobos frontais e o sistema
límbico. O sistema límbico é intimamente ligado aos gânglios da base e ao
hipotálamo lateral. Postula-se então, esquematicamente, que a disfunção no sistema
límbico seja responsável pelas emoções alteradas; a disfunção nos gânglios da base
envolva as alterações motoras; a disfunção no córtex pré-frontal anterolateral
esquerdo responda pelo prejuízo cognitivo; a disfunção hipotalâmica seja a causa
das alterações de sono, apetite, comportamento sexual, endocrinológicas,
imunológicas e cronobiológicas na depressão. Chega-se assim à hipótese da
heterogeneidade dos quadros depressivos, baseada na ruptura em diferentes
regiões do circuito cerebral gânglios da base – tálamo-cortical (Bahls, 1999).
4. Testes Comportamentais
Estudos de meningite em humanos são difíceis devido à severidade da
doença, a necessidade de intervenções terapêuticas imediatas e a heterogeneidade
dos pacientes. Assim, modelos animais têm sido utilizados extensivamente para
explorar o comportamento, a patogênese e gerar dados pré-clínicos de intervenções
terapêuticas.
Os testes comportamentais mais utilizados são seis: (1) Memória de
habituação ao campo aberto (Open-Field); (2) Esquiva inibitória de treinos simples
(Inhibitory Avoidance Task); (3) Esquiva inibitória de treinos múltiplos (CMIA); (4)
Memória de reconhecimento de objetos (Object Recognition); (5) Teste do nado
forçado (Forced Swimming Test) e (6) Labirinto em cruz elevado (Elevated Plus-
Maze).
No teste de habituação ao campo aberto é utilizado o termo atividade
exploratória. Embora seja ainda de difícil definição, o termo “atividade exploratória” é
amplamente utilizado em pesquisas relacionadas ao comportamento animal. Num
sentido geral, refere-se a todas as atividades relacionadas à obtenção de informação
acerca do ambiente, as quais abrangem não só respostas reflexas atencionais
imediatas, como também as respostas voluntárias típicas. A adoção desse tipo de
teste apresenta uma clara conveniência pela facilidade de registro comportamental,
quando comparado ao estudo no ambiente natural. O pressuposto básico envolvido
em estudos de confinamento em um novo ambiente é que no intuito de explorar o
ambiente, o animal precisa locomover-se nele. Dessa forma, a quantidade de
movimento passa a ser um indicador de atividade exploratória. A resposta
exploratória de levantar-se nas patas traseiras (rearing) é também muito comum em
roedores e tem sido utilizada como medida do nível de excitabilidade uma vez que
esse comportamento freqüentemente se correlacionam com outras atividades como
a auto-limpeza corporal (grooming). No teste de habituação ao campo aberto são
avaliadas a atividade motora, exploratória e memória de habituação do animal
(Vianna et al., 2000)
Outro teste utilizado é o teste de esquiva inibitória de treino simples,
nesse teste mede-se o tempo que o animal leva para descer com as quatro patas de
uma plataforma. Esse tempo é denominado latência. A latência é um parâmetro
clássico de retenção de memória (Izquierdo et al., 1998; Bevilaqua et al, 2003).
Nesse teste é avaliado a memória aversiva do animal, ou seja a memória a dor.
No teste de esquiva inibitória de treinos múltiplos como no teste anterior
avalia a memória aversiva e também a aprendizagem do animal.
No teste de memória de reconhecimento de objetos conta-se o tempo que
o animal explora cada objeto. Este teste avalia as memórias de curta e longa
duração do animal (Lima et al., 2005).
Os modelos animais de depressão vêm sendo estudados há mais de 20
anos (Katz, 1982; Mineur et al., 2006) e buscam reproduzir, em animais, os sintomas
desencadeados pela depressão em humanos. O teste do nado forçado é realizado
pela análise dos parâmetros de imobilidade do animal, movimentos para nadar e
esforço para manter-se fora da água (Porsolt et al., 1977; Detke et al., 1995). O teste
de nado forçado avalia os parâmetros semelhantes à depressão.
No teste de labirinto em cruz elevado os parâmetros avaliados são:
número de entradas e tempo de permanência no braço aberto e fechado, e número
total de entradas em ambos (Pellow et al.,1985). Animais não tratados apresentam
uma nítida preferência pelos braços fechados. O mecanismo subjacente seria um
conflito entre comportamentos inatos com a tendência à exploração de ambientes
novos, que seria um estímulo a exploração dos braços abertos, de um lado e a
aversão aos espaços abertos e à novidade do aparelho do outro, que consistiria em
um estímulo à redução da exploração dos braços abertos (Handley & Mithani, 1984;
Pellow et al., 1985; Treit et al., 1993). O teste de labirinto em cruz elevado avalia os
parâmetros semelhantes à ansiedade.
5. Objetivos
5.1. Objetivo Geral
Avaliar os parâmetros comportamentais 10, 30 e 60 dias após indução da meningite
pneumocócica em ratos Wistar adultos.
5.2. Objetivos Específicos
Avaliar a memória de habituação em ratos Wistar adultos induzidos à meningite
pneumocócica através do teste de habituação ao campo aberto.
Avaliar a memória aversiva de ratos Wistar adultos induzidos à meningite
pneumocócica através do teste de esquiva inibitória de treino simples.
Avaliar a memória aversiva e aprendizagem de ratos Wistar adultos induzidos à
meningite pneumocócica através do teste de esquiva inibitória de treinos múltiplos.
Avaliar os parâmetros de ansiedade de ratos Wistar adultos induzidos à meningite
pneumocócica através do teste labirinto em cruz elevado.
Avaliar o comportamento semelhante à depressão de ratos Wistar adultos induzidos
à meningite pneumocócica através do teste de nado forçado.
Avaliar a memória de curta e longa duração de ratos Wistar adultos induzidos à
meningite pneumocócica através do teste de reconhecimento de objetos novos.
Avaliar o uso do antibiótico na prevenção do dano cognitivo em ratos Wistar adultos
induzidos à meningite pneumocócica.
PARTE II RESULTADOS
Artigo 1 :
Título: Time-dependent behavioral recovery after pneumococcal meningitis in rats.
Nomes: Tatiana Barichello, Geruza Z. Silva, Joana Torquato, Geovana D. Savi,
Gustavo Feier, Fernanda V. Hermani, Clarissa M. Comim, and João Quevedo.
Artigo submetido no periódico: Intensive Care Medicine.
Artigo 2 :
Título: Early antibiotic administration prevents cognitive impairment induced by
meningitis in rats.
Nomes: Tatiana Barichello, Geruza Z. Silva, Ana L. Batista, Geovana D. Savi,
Gustavo Feier, Clarissa M. Comim, João Quevedo, Felipe Dal-Pizzol.
Artigo publicado no periódico: Neuroscience Letters 465 (2009) 71 - 73.
PARTE III - DISCUSSÃO
Este estudo teve como finalidade avaliar os parâmetros comportamentais
em ratos sobreviventes à meningite pneumocócica nos tempos de 10, 30 e 60 dias
após a indução da meningite.
A meningite pneumocócica em indivíduos adultos possui uma alta taxa
de mortalidade de até 30% e persiste com seqüelas neurológicas, déficit sensorial
motor, convulsões, prejuízo de aprendizagem e memória em até 50% dos
sobreviventes (Bellac et al., 2007).
No presente trabalho nós verificamos que os animais testados 10 dias
após a indução da meningite apresentaram prejuízo de memória e aprendizagem,
sintomas semelhantes à ansiedade e depressão. Após 30 dias os animais
apresentaram um desempenho normal nos testes de esquiva inibitória de treinos
simples e múltiplos e no labirinto em cruz elevado, demonstrando então, prejuízo na
memória de habituação, na memória de curta e longa duração e nos parâmetros
semelhantes à depressão, os animais testados após 60 dias apresentaram
normalidade em todos os testes comportamentais, demonstrando que 60 dias após
a indução não houve prejuízo em nenhum dos testes realizados.
O dano cognitivo ocorre freqüentemente após a meningite bacteriana
(Grimwood et al., 1995; Braun et al., 1999; Leib et al., 2001; Van De Beek et al.,
2006). Van de Beek et al. (2002) em outros estudos mostraram que pacientes
adultos recuperados da meningite pneumocócica apresentaram anormalidades
neuropsicológicas. O principal prejuízo destes pacientes foi a perda da agilidade
cognitiva. A lentidão cognitiva foi relatada nas funções diárias. Este prejuízo
cognitivo foi encontrado em 27% dos pacientes após a meningite pneumocócica e
4% após a meningite meningocócica. Em estudos realizados com adultos que
sobreviveram à meningite bacteriana foram descritos lentidão cognitiva, prejuízo
psicomotor, prejuízo na visão e depressão (Bohr et al., 1985; Merkelbach et al.,
2000; De Gans & Van De Beek, 2002).
Em autópsia de pacientes que morreram de meningite foi observado dano
no sistema nervoso central caracterizado por necrose nos tecidos corticais e por
apoptose nas células do giro denteado hipocampal (Nau et al., 1999).
Diferentes modelos têm sido utilizados para verificar a fisiopatologia do
dano cerebral da meningite bacteriana. Em um modelo animal utilizando coelhos a
apoptose hipocampal foi predominantemente encontrado como o principal dano
neuronal na meningite pneumocócica (Zysk et al., 1996; Braun et al., 1999).
Grandgirard et al. (2007), verificaram em um modelo animal de meningite com
camundongos jovens, que ocorreu apoptose no giro denteado hipocampal com o
pico máximo de dano 30 horas após a indução e retornando a normalidade em 48
horas.
Isto sugere que a apoptose neuronal no hipocampo representa o principal
processo neuropatológico responsável pelo prejuízo cognitivo em sobreviventes da
meningite bacteriana (Weisfelt et al., 2006b), estando o dano hipocampal
relacionado aos processos de memória (Squire & Zola-Morgan, 1991; Jarrard, 1995).
Além disso, alguns autores tem demonstrado a redução da densidade de células
neuronais no córtex pré-frontal, córtex e hipocampo, onde as lesões são conhecidas
por levar a distúrbios de orientação e causar prejuízos em tarefas complexas (Save
& Poucet, 2000; Mogensen et al., 2005).
O S. pneumoniae é um patógeno que está associado a uma vigorosa
resposta imune, paradoxalmente esta resposta pode ser mais patogênica que o
próprio microrganismo. Quando o microrganismo invade SNC pode liberar
pneumolisina, uma exotoxina que causa morte celular neuronal através de dano na
membrana mitocondrial e apoptose em neurônios (Braun et al., 2007), além disso
replica-se rapidamente e ao mesmo tempo ocorre lise bacteriana que leva a
liberação de componentes como polissacarídeo, ácido teicóico, peptidioglicano, os
quais estimulam a liberação de moléculas neuroinflamatórias e outras proteínas pró-
inflamatórias do hospedeiro (Waggener, 1974; Van De Beek, 2009). As moléculas
neuroinflamatórias estimulam a microglia, o endotélio capilar cerebral e ocorre a
produção de citocinas como TNF-, IL-1β e interleucina IL-6 (IL-6) (Van De Beek,
2009).
A meningite pode ter um crítico impacto a longo prazo sobre a psíquico e
a estabilidade do humor (Twamley et al., 2004; Bremner et al., 2004), podendo
induzir a depressão, a ansiedade e sintomas parecidos com os efeitos negativos
sobre a cognição (Penick et al., 1994). Estes distúrbios cognitivos diretos e indiretos
são difíceis de distinguir de danos primários causados pela doença em si.
Nossos resultados mostram que ratos sobreviventes a meningite
pneumocócica nos tempos de 10, 30 e 60 dias após a indução, apresentaram
sintomas semelhantes à depressão até trinta dias da indução, com aumento no
tempo de imobilidade no teste de nado forçado sugerindo um “comportamento do
tipo depressivo”, mas, como se trata de um modelo animal, não se pode afirmar que
apresentem depressão.
Estudos mais apropriados são necessários para analisar se os animais
sobreviventes a meningite pneumocócica possuem ou não parâmetros de
depressão, talvez, verificando parâmetros como anedonia, perda de peso, aumento
da glândula adrenal, aumento dos níveis circulantes de hormônio
adrenocorticotrófico (ACTH) e cortisol e ainda, diminuição dos níveis de BDNF,
poderemos afirmar que ratos sobreviventes a meningite pneumocócica apresentam
ou não parâmetros relacionados à depressão.
Nosso grupo em outro estudo verificou o aumento dos níveis de TNF-α 6
horas após a indução da meningite no hipocampo, córtex frontal e LCR (Barichello et
al., 2009a). Existem vários estudos descrevendo o potencial das citocinas na
patogênese da depressão. Pacientes com depressão parecem ativar as vias
inflamatórias com aumento de citocinas e proteínas de fase aguda e moléculas de
adesão (Raison et al., 2006; Kim et al., 2007; Yang et al., 2007).
Sobre os sintomas de ansiedade, observamos nessa dissertação que os
sintomas de ansiedade persistiram somente até 10 dias após a indução, no entanto,
não houve estudos que apresentaram sintomas semelhantes aos da ansiedade em
seres humanos ou modelo animal de meningite. Neste contexto, o nosso modelo
apresentado imita vários aspectos do quadro clínico e poderiam ser um instrumento
importante na compreensão dos mecanismos de prejuízos comportamentais e
recuperação de sobreviventes de meningite. Assim, em nosso modelo, não
estudamos todos esses possíveis mecanismos responsáveis pelas alterações a
longo prazo em humanos, mas apenas o efeito isolado da meningite no prejuízo
cognitivo e isto pode explicar porque os animais tinham uma faixa de recuperação,
diferindo do observado em humanos.
Recentemente, verificamos que ocorreu uma diminuição da atividade da
creatina quinase 24 horas após a indução da meningite bacteriana por S.
pneumoniae no córtex, córtex pré-frontal, hipocampo, cerebelo e estriado de ratos
Wistar (Barichello et al., 2009b). A morte ou qualquer alteração celular parece ser
responsável pelos prejuízos na aprendizagem e na memória de pacientes que
sobrevivem à doença (Leib et al., 2001; Nau et al., 1999).
Até o momento, algumas estratégias experimentais foram publicadas com
o objetivo de diminuir o prejuízo cognitivo após a indução da meningite. A utilização
da hipotermia reduziu a permeabilidade da barreira hematoencefálica e também
diminuiu a atividade da mieloperoxidase em modelo experimental com coelhos
induzidos a meningite pneumocócica (Irazuzta et al., 2000a), o uso da
dexametasona preveniu dano auditivo e neurológico em meningite ocasionada por
H. influenza (Mcintyre et al., 1988) porém Leib et al. (2003) descreveram que ratos
induzidos a meningite pneumocócica que utilizaram a dexametasona no tratamento
tiveram apoptose hipocampal na região do giro denteado. Irazuzta et al. (2008)
mostraram que a inibição da atividade da caspase diminuiu seqüelas neurológicas
em modelo de meningite.
Dentro desse contexto, nós demonstramos que a utilização de uma
estratégia simples e viável, utilizando a administração precoce de antimicrobiano, 8
horas após a indução da meningite preveniu dano cognitivo quando comparado com
o tratamento 16 horas após a indução da meningite pneumocócica em ratos Wistar
adultos. Sendo que os animais tratados 16 horas após a indução apresentaram
prejuízo na memória de habituação e os animais tratados 8 horas não apresentaram
nenhum dano.
CONCLUSÃO
Em conclusão, podemos dizer que o modelo de meningite pneumocócica
apresentado pode ser uma ferramenta útil para estudar o prejuízo cognitivo,
depressão e ansiedade após a meningite, e os mecanismos associados com a
recuperação destas funções.
A compreensão, mesmo que ainda não definitiva, dos fenômenos
neurobiológicos envolvidos no dano cognitivo em sobreviventes a meningite
aumentaram sobremaneira nesta última década. Os conceitos, contudo, não foram
alterados; ocorreu, de fato, um aprofundamento do entendimento de seu substrato
biológico. Os resultados nesta dissertação mostram uma pequena fração de novos
conhecimentos sobre a incapacidade cognitiva. O novo desafio é compreender os
mecanismos que levam ao dano cognitivo em sobreviventes a meningite e o
surgimento de novas terapias que possam impedir este dano a curto e longo-prazo.
O tratamento precoce preveniu dano cognitivo e vacinas efetivas existem, e podem
com sucesso ser integradas ao programa de imunização nacional, uma vez que o
microrganismo S. pneumoniae é a maior causa de meningite no mundo todo.
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