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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
DESENVOLVIMENTO DE UMA ESTRATÉGIA DE FUSÃO GÊNICA VISANDO
À LOCALIZAÇÃO DE PROTEÍNAS EM PLANTAS
Ricardo Gargaro de Souza
Biólogo/UNESC
Dissertação apresentada como um dos
requisitos à obtenção do Grau de
Mestre em Fitotecnia
Área de concentração Fitossanidade
Porto Alegre (RS), Brasil
Março de 2006
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iii
Aos meus pais, Roberto Barbosa de
Souza e Célia Maria Gargaro de Souza, verdadeiros mestres nas
ciências da dignidade e ternura. Pessoas que, do alto da sua nobreza e
simplicidade, legaram-me a herança mais preciosa - seu amor - transcrito
em palavras e exemplos, os quais busco traduzir em ações, nos meus
pequenos feitos de cada dia.
À minha jóia mais preciosa, Laís Gargaro de
Souza, que, ao longo deste trabalho, mostrou maturidade sabendo abrir
mão da atenção do pai, mesmo em momentos delicados da sua tenra
existência.
iv
AGRADECIMENTOS
Aos professores Luís Alexandre Campos, Isabel Alves dos
Santos, Jairo José Zocche, Mári Stela Campos, Vanilde Citadini Zanete e
Zenaide Pais Topanotti, da Universidade do Extremo Sul Catarinense –
UNESC, pelo apoio e incentivo, fundamentais desde o início deste trabalho;
Aos professores do Departamento de Fitossanidade da
Faculdade de Agronomia da UFRGS, pelo convívio e por seus preciosos
ensinamentos;
Aos colegas e amigos do Laboratório de Fitopatologia
molecular, Doutorandas Adriana Corrent e Caren Cavichioli Lamb, Mestrandos
Flávia Vanina Ferreira, Marcos Vinícius de Souza e Sandra Maria de Souza,
amigos e profissionais de valor inestimável;
Aos bolsistas de iniciação científica Alex da Silva Corrêa,
Elisângela Aquino de Souza, Jeferson Mateus Dariva, Johannes Humbertus
Falcade e Mônica da Silva Medeiros, por todo o auxílio e convivência
prazerosa.
À secretária do programa de Pós-Graduação em
Fitotecnia, Sra. Marisa Carvalho Bello, profissional dedicada e amiga.
Aos funcionários do Laboratório de Diagnóstico
Fitossanitário e Departamento de Fitossanidade, em especial, Marisa, Miguel,
Tony, e Valmor.
À amiga Grasiela Agnes, pelos momentos de
confraternização e descontração junto ao grupo.
v
À Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS,
pelo ensino gratuito e da mais alta qualidade, modelo em serviço público e
motivo de orgulho da minha terra gaúcha.
Ao Prof. Dr. Marcelo Gravina de Moraes, exemplo de
integridade e dedicação, a quem tenho profundo respeito e gratidão pela
orientação, compreensão e companheirismo.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior – CAPES, pelo auxílio financeiro através da bolsa de estudos que
viabilizou a realização deste trabalho.
vi
DESENVOLVIMENTO DE UMA ESTRATÉGIA DE FUSÃO GÊNICA
VISANDO À LOCALIZAÇÃO DE PROTEÍNAS EM PLANTAS
1/
Autor: Ricardo Gargaro de Souza
Orientador: Marcelo Gravina de Moraes
RESUMO
Uma significativa quantidade de proteínas vegetais apresenta-se
compartimentalizada nas diversas estruturas celulares. A sua localização pode
conduzir à elucidação do funcionamento dos processos biossintéticos e
catabólicos e auxiliar na identificação de genes importantes. A fim de localizar
produtos gênicos relacionados à resistência, foi utilizada a fusão de cDNAs de
arroz (Oryza sativa L.) ao gene da proteína verde fluorescente (GFP). Os
cDNAs foram obtidos a partir de uma biblioteca supressiva subtrativa de genes
de arroz durante uma interação incompatível com o fungo Magnaporthe grisea.
Estes cDNAs foram fusionados a uma versão intensificada de gfp e usados
para transformar 500 plantas de Arabidopsis thaliana. Outras 50 plantas foram
transformadas com o mesmo vetor, porém sem a fusão (vetor vazio). Foram
obtidas aproximadamente 25.500 sementes oriundas das plantas
transformadas com as fusões EGFP::cDNAs e 35.000 sementes das
transformadas com o vetor vazio, produzindo, respectivamente, 750 e 800
plantas tolerantes ao herbicida glufosinato de amônio. Após a seleção,
segmentos foliares das plantas foram analisados por microscopia de
fluorescência, visando o estabelecimento do padrão de localização de EGFP.
Foram observadas 18 plantas transformadas com a fusão EGFP::cDNAs e 16
plantas transformadas com o vetor vazio apresentando expressão detectável
de GFP. Uma planta transformada com uma fusão EGFP::cDNA apresentou
localização diferenciada da fluorescência, notadamente nas células guarda dos
estômatos e nos tricomas. Após seqüenciamento do cDNA fusionado, foi
verificado que esta planta apresentava uma inserção similar a uma seqüência
codificante de uma quinase, uma classe de enzimas envolvidas na transdução
de sinais em resposta à infecção por patógenos.
____________
1/
Dissertação de Mestrado em Fitotecnia. Faculdade de Agronomia,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil. (58 p.)
Março, 2006.
vii
DEVELOPMENT OF A GENE FUSION STRATEGY IN PLANTS TO LOCATE
PROTEINS IN PLANTS
1
Author: Ricardo Gargaro de Souza
Adviser: Marcelo Gravina de Moraes
ABSTRACT
A significant amount of plant proteins is compartmentalized in
different cellular structures. The location of such proteins is essential to
understand the function of biosynthetic and catabolic processes and also to
help the identification of important genes. To identify the location of gene
products related to resistance, rice (Oryza sativa) cDNAs were fused to a gene
coding a GFP protein (green fluorescent protein). The cDNAs were obtained
from a suppressive subtractive library of rice plants during an incompatible
interaction with Magnaporthe grisea fungus. The cDNAs were fused to an
enhanced version of gfp and they were used to transform 500 Arabidopsis
thaliana plants, yielding 25.500 T1 seeds. Other 50 plants were transformed
with the same vector, but without the EGFP::cDNA fusion (empty vector),
yielding 35.000 T1 seeds. Seven hundred and fifty and 800 plants were
generated from T1 seeds of the EGFP::cDNA fusions and empty vector
transformations, respectively. Following herbicide selection, detached leaves
were analyzed under a fluorescence microscope to evaluate the pattern of
EGFP localization. It was observed that 18 plants transformed with EGFP:cDNA
fusion and 16 plants transformed with empty vector showed detectable EGFP
accumulation. One plant transformed with EGFP::cDNA showed a unique
localization of the fluorescent signal. In this plant, the EGFP expression was
predominantly visible at the stomata guard cells and trichomes. After, cDNA
sequencing, the cDNA from this plant has shown insert similarity to kinase
protein sequence, an enzyme class frequently related to signal transduction in
response to pathogenic infections.
____________
1
Master of Science dissertation in Agronomy. Faculdade de Agronomia,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (58 p.)
March, 2006.
viii
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................... 4
2.1 O arroz ................................................................................................. 4
2.1.1 A importância do arroz.............................................................. 4
2.2 Genômica ............................................................................................. 5
2.2.1 A genômica estrutural do arroz................................................. 5
2.2.2 O arroz como modelo genômico............................................... 5
2.2.3 O seqüenciamento genômico do arroz ..................................... 6
2.2.4 Genômica funcional .................................................................. 8
2.3 Fusão de proteínas em estudos de localização.................................... 8
2.4 O endereçamento polipeptídico em nível subcelular ......................... 10
2.5 As proteínas autofluorescentes .......................................................... 11
2.5.1 A proteína verde fluorescente................................................. 11
2.5.2 GFP em plantas...................................................................... 13
2.6 Transformação genética de plantas ................................................... 15
2.6.1 Transformação via A. tumefaciens.......................................... 15
2.7 A. thaliana como planta modelo em transformações genéticas ......... 16
2.7.1 Transformação floral............................................................... 17
2.8 Visualização de estruturas celulares através de GFP ........................ 19
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 21
3.1 Material vegetal .................................................................................. 21
3.2 Transformação de A. thaliana............................................................. 21
3.3 Análises fenotípicas............................................................................ 22
3.3.1 Seleção de plantas transformadas de A. thaliana................... 22
3.3.2 Microscopia de epifluorescência............................................. 23
3.4 Biblioteca de cDNAs........................................................................... 24
3.5 Digestão dos cDNAs .......................................................................... 25
3.6 Digestão e desfosforilação do vetor pEGAD ...................................... 26
3.7 Reação de ligação dos cDNAs ao vetor pEGAD................................ 28
3.8 Transformação genética de A. tumefaciens ....................................... 28
3.9 Identificação de colônias de A. tumefaciens contendo plasmídeos
recombinantes........................................................................................ 29
3.10 Preparo das culturas de A. tumefaciens para transformação de
plantas......................................................................................................31
3.11 Análises moleculares.......................................................................... 31
ix
3.11.1 Reação de seqüenciamento ................................................... 33
3.11.2 Análise de similaridade das seqüências ................................. 33
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 34
4.1 Construção do vetor de fusão e transformação de A. tumefaciens.... 34
4.2 Transformação floral de A. thaliana.................................................... 37
4.3 Análises fenotípicas............................................................................ 38
4.3.1 Seleção das plantas apresentando tolerância ao herbicida.... 38
4.3.2 Seleção das plantas apresentando expressão de EGFP........ 39
4.3.3 Plantas T1 transformadas com o vetor vazio.......................... 40
4.3.4 Plantas T2 oriundas de plantas transformadas com o vetor
vazio........................................................................................................41
4.3.5 Plantas transformadas com os cDNAs fusionados ao vetor ... 42
4.4 Análises moleculares.......................................................................... 48
4.4.1 Extração de DNA e PCR......................................................... 48
4.4.2 Seqüenciamento dos cDNAS fusionados ............................... 49
5. CONCLUSÃO .............................................................................................. 52
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 53
x
RELAÇÃO DE TABELAS
Página
1 – Eficiência de transformação e expressão de GFP............................... 43
xi
RELAÇÃO DE FIGURAS
Página
1. Transformação floral de plantas de A. thaliana por aspersão de inóculo
contendo A. tumefaciens recombinantes em suspensão........................ 22
2. Seleção de sementes T1 oriundas de plantas de A. thaliana,
transformadas por A. tumefaciens recombinantes, em meio contendo
herbicida glufosinato de amônio.............................................................. 23
3. Representação esquemática de seqüências do vetor pEGAD................ 28
4. Representação esquemática da região de anelamento dos
oligonocluteotídeos iniciadores ao vetor pEGAD para a amplificação
do inserto................................................................................................. 30
5. Produto da digestão por Rsa I da biblioteca de cDNAs de O.
sativa....................................................................................................... 36
6. Eletroforese em gel de agarose de produto de PCR, demonstrando
padrão dos fragmentos de cDNAs inseridos em pEGAD........................ 37
7. Imagem de células de tecido foliar de planta controle de A. thaliana
não submetida à transformação, visualizadas por microscopia de
fluorescência............................................................................................ 40
8. Imagens de células de tecido foliar de plantas de A. thaliana geração
T1, transformadas com vetor vazio, visualizadas por microscopia de
fluorescência............................................................................................ 41
9. Imagens de células de tecido foliar de plantas de A. thaliana geração
T2, transformadas com vetor vazio, visualizadas por microscopia de
fluorescência............................................................................................ 42
10. Imagens de células de tecido foliar de planta de A. thaliana geração
T1, transformadas com vetor possuindo inserção de cDNAs de arroz,
visualizadas por microscopia de fluorescência........................................ 47
11. Eletroforese em gel de agarose de produto de PCR a partir de
extração de DNA de A. thaliana.............................................................. 49
1. INTRODUÇÃO
O arroz é a principal fonte nutricional de aproximadamente metade
da população mundial, sendo o alimento cultivado mais importante para a
humanidade. O fato de possuir um pequeno genoma e de apresentar uma
estreita relação sintênica com outras espécies de cereais de importância
agronômica, além de apresentar disponível grande quantidade de mapas
genéticos de alta definição, bem como uma extensa coleção de cDNAs, fazem
do arroz um modelo para o estudo de genômica de monocotiledôneas. O atual
conhecimento sobre a genética molecular do arroz facilitou o progresso do seu
seqüenciamento genômico (Oryza sativa L. ssp. japonica cv Nipponbare) com
mais de 99,99% de confiabilidade utilizando estratégia de seqüenciamento por
clonagem baseada em mapa. Outros grupos de pesquisa relataram
recentemente esboços de seqüências do genoma de Oryza sativa L. ssp.
indica e Oryza sativa L. ssp. japonica. Porém, enquanto a determinação da
seqüência genômica proporciona uma abundância de informações, a função da
maioria destes genes permanece desconhecida.
Um grande desafio na era pós-genômica é o conhecimento da
função de todos os genes de uma determinada espécie. A genômica funcional,
através de métodos de análise, tanto in vitro quanto in vivo, tem por objetivo
elucidar o papel de cada gene de um organismo no processo biológico, e
2
metodologias nesse sentido têm exigido estudos de localização celular e
caracterização de função molecular.
O método de localização de proteínas através da visualização de
estruturas celulares utilizando fluorescência tem sido empregado com sucesso
na investigação da funcionalidade de genes. Esse método tem feito uso de um
gene marcador de fácil análise em tecidos vegetais vivos. O gene gfp foi
isolado a partir da água-viva Aequorea victoria, que atua através de uma
enzima bioluminescente, a proteína verde fluorescente (GFP), a qual confere a
este organismo a propriedade da luminescência verde. O sucesso na
expressão de GFP através da bactéria Escherichia coli no nematóide
Caenorhabditis elegans recebeu ampla atenção da comunidade científica nos
campos da biologia celular e evolutiva. Com algumas modificações visando à
melhoria da expressão, a GFP também tem mostrado ser um excelente
cromóforo em células vegetais. A habilidade na introdução de um robusto
cromóforo através de uma seqüência genética, combinada com métodos de
alta sensibilidade e resolução da microscopia de fluorescência, tem
possibilitado à GFP sua aplicação em uma ampla gama de estudos biológicos.
O método de visualização de proteínas de fusão empregando GFP
apresenta várias vantagens em relação a outros métodos de localização de
produtos protéicos, como aqueles baseados em ensaios histoquímicos. Em
vegetais, inicialmente, o endereçamento celular de proteínas era investigado
por duas técnicas. A primeira, por fusão utilizando a proteína ß-glucoronidase,
tendo sido empregada tanto em transformações transitórias quanto estáveis,
visualizadas in situ por microscopia e coloração histoquímica. A outra, por
imunofluorescência indireta, proporcionando uma boa resolução espacial,
3
porém dependente de anticorpos específicos e requerendo a fixação,
combinada com a secção de tecidos ou digestão da parede celular para facilitar
o acesso do anticorpo ao antígeno. A detecção de proteínas baseada em
fusões de cDNAs com GFP apresenta a vantagem de que células vivas podem
ser visualizadas em tempo real e evita os artefatos da fixação. A emissão de
luz verde da GFP, quando excitada com luz ultravioleta (UV), permite detecção
de fluorescência em células vegetais vivas com alta sensibilidade.
Experimentos com o uso de GFP têm apresentado considerável
êxito em Arabidopsis. O vasto conhecimento da estrutura genômica dessa
planta, aliado às facilidades operacionais dos métodos de transformação
genética e da aplicação de técnicas moleculares, têm evidenciado sua
importância como espécie vegetal modelo em estudos biológicos. Isto inclui a
expressão de proteínas de fusão com GFP oriundas de outras espécies.
O presente estudo teve como objetivo a clonagem de cDNAs de
arroz em um vetor de fusão visando a análise funcional destes fragmentos
através da localização do produto protéico resultante dessas seqüências. O
método utilizado foi a transformação floral de A. thaliana via A. tumefaciens
através da aspersão de colônias recombinantes sobre plantas em
florescimento. A avaliação fenotípica dos indivíduos transformantes foi feita
através da análise da tolerância das plantas ao herbicida glufosinato de amônio
e do padrão de localização de GFP. A avaliação genotípica foi feita através da
análise dos cDNAs inseridos.
4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O arroz
O arroz (Oryza sativa L.) é originário da Índia, sendo hoje cultivado
em países de clima subtropical e tropical. É uma espécie pertencente à divisão
Angiosperma, classe Monocotiledônea, ordem Poales, família Poaceae,
subfamília Oryzoideae, tribo Oryzeae e gênero Oryza (Lu, 1999). O gênero
Oryza inclui muitas espécies distribuídas em todos os continentes, as quais
abrigam uma grande variabilidade de hábitos e formas e são encontradas
desde em lagos de águas profundas até florestas densas e savanas. Além de
O. sativa, também é cultivada a espécie O. glaberrima Steud., que é o arroz
domesticado no oeste da África (Watanabe, 1997).
2.1.1 A importância do arroz
O arroz representa uma das espécies cultivadas mais importantes
para a humanidade. Ele alimenta aproximadamente metade da população
mundial e contribui com mais de 50% do total de suas calorias ingeridas
(Maclean et al., 2002). Apesar de a produção ter duplicado nos últimos 30
anos, devido à introdução de novas variedades de alto rendimento e à melhoria
das práticas de cultivo, ainda é insuficiente para atender à demanda global em
constante crescimento (Fischer et al., 2000). É necessário o desenvolvimento
de variedades de alto rendimento associado à minimização das perdas
5
decorrentes de estresses bióticos e abióticos. Atualmente, com o
desenvolvimento de mecanismos moleculares, o melhoramento genético de
plantas pode contar com uma minuciosa compreensão dos aspectos celulares
e funcionais da planta, os quais são estabelecidos por sua constituição
genética. Assim, é possível que as informações decorrentes da identificação de
todos os genes e suas correlações, com a compreensão de suas funções,
sejam úteis ao processo de melhoramento genético. Esta idéia evoca o
interesse de pesquisadores que contribuem para o desenvolvimento dos
estudos em arroz (Tyagi et al., 2004).
2.2 Genômica
2.2.1 A genômica estrutural do arroz
Além da sua fundamental importância como espécie cultivada em
nível mundial, o arroz também é uma excelente planta modelo para a
genômica, assim como Arabidopsis (Izawa & Shimamoto, 1996). Entre os
cereais, o arroz é o possuidor do menor genoma, com um tamanho próximo a
430 mega pares de bases (Mpb), quando comparado a genomas de tamanho
significativamente maior como sorgo, milho, cevada e trigo, os quais possuem
aproximadamente 750, 3.000, 5.000 e 16.000 Mpb, respectivamente.
2.2.2 O arroz como modelo genômico
Alguns resultados indicam a existência de 50.000 genes no genoma
do arroz, distribuídos em seus 12 cromossomos, refletindo a densidade
aproximada de um gene para cada 8,6 Kpb. Essa densidade gênica é
considerada alta quando comparada à de outros cereais, pois o milho
6
apresenta um gene para cada 100 Kpb, e o trigo um gene para cada 500 Kpb
(Yu et al., 2002). Além disso, o arroz possui uma quantidade relativamente
menor de DNA repetitivo (Moore et al., 1995; Gale & Devos, 1998). Outros
fatores que recomendam o emprego do arroz como espécie vegetal modelo,
incluem o fato de que ele pode ser regenerado a partir de protoplastos.
Também pode ser transformado por DNA exógeno, pela utilização de métodos
de transformação envolvendo Agrobacterium tumefaciens ou bombardeamento
de partículas, o que o torna um fácil alvo de manipulações genéticas entre os
cereais (Tyagi & Mohanty, 2000). O arroz também possui uma vasta coleção de
germoplasma, tanto de espécies selvagens quanto de cultivadas (Nakagahra et
al. 1997).
Através dos estudos que vêm sendo realizados em gênomica do
arroz, considerável número de marcadores genéticos foi identificado visando o
desenvolvimento de mapas genéticos e físicos deste cereal (Chen et al., 2002).
Tais informações também têm sido usadas para estudos de mapeamento
comparativo, os quais estabelecem que a ordem gênica é significativamente
conservada entre cromossomos de arroz e outros cereais cultivados. Portanto,
o arroz é considerado um importante modelo entre as plantas cultivadas,
permitindo comparações à dicotiledônea modelo A. thaliana e às
monocotiledôneas cultivadas como o milho, o trigo e a cevada (Schmit, 2000).
2.2.3 O seqüenciamento genômico do arroz
Adicionalmente à relevância da espécie como modelo entre as
plantas cultivadas, a publicação de quatro versões da seqüência genômica de
7
duas subespécies de O. sativa em um curto espaço de tempo (Delseny, 2003)
colocou o arroz no primeiro plano dos estudos genômicos.
O conhecimento da seqüência do genoma do arroz, por si só,
entretanto, não é o objetivo final da pesquisa genômica. É importante a
compreensão das implicações do genoma no funcionamento do organismo. A
genômica funcional surge para esclarecer este aspecto (Arber, 2002). As
seqüências de DNA do genoma podem ser investigadas visando à identificação
de estruturas abertas de leitura (ORFs) ou de sinais para sua regulação.
Entretanto, para a determinação de sua função, são necessários estudos de
genética clássica e, principalmente, genética reversa. Os resultados podem,
então, ser comparados aos de outros organismos através de busca por
seqüências homólogas, seguidas da função apropriada e análise de expressão
(Harris, 2002). Essa informação é um importante pré-requisito para aplicações
biotecnológicas, particularmente para o melhoramento através da engenharia
de plantas cultivadas (Tyagi, et al., 2004).
O grande acúmulo de dados de seqüências gênicas cuja função não
é conhecida motivou o desenvolvimento de técnicas de bioinformática que
pudessem transformar as informações do seqüenciamento em informação
biológica útil, um processo denominado anotação (Lewis et al., 2000). Em
geral, a anotação descreve o genoma por identificar vários sítios e segmentos
ao longo da seqüência envolvida no funcionamento do genoma. O objetivo
principal é o posicionamento de genes e de elementos relacionados ao
funcionamento destes genes ou de seus produtos (Rouzé et al., 1999).
Procedimentos automatizados envolvendo mínima quantidade de análises
manuais foram utilizados para a geração da maioria dos dados disponíveis do
8
arroz (Schoof & Karlowski, 2003), permitindo assim a anotação das
seqüências.
2.2.4 Genômica funcional
Para a compreensão dos dados rapidamente gerados e acumulados,
assim como para o entendimento do funcionamento celular em nível global há
a necessidade de uma ferramenta que permita análises de genômica funcional
em larga escala. Hieter & Boguski (1997) descreveram o termo “genômica
funcional” como o desenvolvimento e a aplicação de métodos experimentais de
capacidade de análise em grande escala em nível genômico para avaliar a
função dos genes. Os avanços das estratégias de análise funcional podem ser
verificados através de técnicas in vitro de análise de acumulação de mRNAs e
técnicas de análise genética direta e reversa in vivo (Rensink & Buell, 2004).
Nesse contexto, ferramentas como marcadores moleculares, silenciamento
gênico, inativação de genes por inserção de elementos genéticos móveis,
indução de mutagênese através da transferência de T-DNA e ensaios de
localização de proteínas de fusão utilizando métodos baseados em genes
marcadores de fluorescência, constituem mecanismos para o descobrimento
da função biológica das seqüências geradas (Waterhouse, 2002; Waterhouse &
Helliwell, 2003; Jones et al., 2004).
2.3 Fusão de proteínas em estudos de localização
A fusão de proteínas tem sido amplamente utilizada para a avaliação
da expressão de um determinado gene de interesse através de sua ligação a
outro gene denominado marcador ou repórter. Marcador é a denominação
9
dada àquele gene que codifica um produto que pode ser facilmente
quantificado após sua fusão a seqüências gênicas de interesse. O mecanismo
marcador pode ser baseado na detecção da atividade enzimática, como o gene
gus ou gusA, que codifica a enzima -glucoronidase (GUS), ou então, detecção
de fluorescência ou intensidade colorimétrica ou luminescente, como o gene
LucA, que codifica a proteína luciferase, que requer um luminômero para a
mensuração da sua atividade. Outros genes marcadores são os genes neo ou
nptII, que codifica a proteína neomicina fosfotransferase II (NPTII) e o gene cat,
da proteína cloranfenicol acetiltransferase, que requerem radioisótopos para
sua detecção. Cada um destes mecanismos gera dados que podem ser
mensurados e quantificados (Albano et al., 1998).
Na sua maioria, os processos celulares estão espacialmente
delimitados a regiões definidas da célula. Mecanismos geralmente elaborados
existem para assegurar que proteínas individuais e complexos protéicos sejam
endereçados e transportados a locais pré-definidos, freqüentemente em
tempos pré-determinados. Portanto, a localização subcelular é uma
característica que delimita sua possível função. Entretanto, a localização da
maioria das proteínas não foi determinada experimentalmente e os bancos de
dados estão repletos de informações em nível de predição. Muitos esforços
têm sido empregados no desenvolvimento de sistemas eficazes para a
localização de proteínas. A imunolocalização tem sido o método empregado
com maior freqüência na determinação de produtos gênicos. Enquanto este
método apresenta vantagens como alta especificidade, sensibilidade, resolução
e flexibilidade, seus custos excluem sua aplicação imediata em análises
genômicas de grande escala. A localização sistemática de proteínas pode ser
10
obtida em uma escala global através da expressão de proteínas fusionadas a
marcadores fluorescentes, usados para o monitoramento tanto da localização
quanto do movimento em células vivas (Koroleva et al., 2005).
2.4 O endereçamento polipeptídico em nível subcelular
Uma típica célula vegetal possui entre 5.000 e 10.000 seqüências
polipeptídicas diferentes e bilhões de moléculas protéicas individuais. Para seu
adequado funcionamento, ela depende do endereçamento correto destas
proteínas ao compartimento subcelular alvo, que pode ser único ou em
múltiplos locais da célula. Este endereçamento é definido pelos domínios
freqüentemente localizados nas extremidades amino-terminal (N-terminal) da
seqüência polipeptídica, podendo também estar na extremidade carbóxi-
terminal (C-terminal) ou em qualquer outro local da seqüência (Buchanan et al.,
2000). Embora o domínio de endereçamento seja essencial para o transporte
da proteína, ele pode não ser parte da proteína ativa. Assim, proteases
freqüentemente são responsáveis pela remoção deste domínio polipeptídico no
local alvo, criando um segmento maduro e funcional. Esses domínios
apresentam elevado índice de seqüências conservadas entre os vegetais, o
que possibilita a utilização de seqüências de endereçamento de uma espécie
em experimentos de transformação em outra, pois proteínas encontradas em
uma organela celular de uma determinada planta apresentam a mesma
localização subcelular em organismos de outras espécies vegetais. Utilizando
esta propriedade de conservação de seqüências, associada à fusão gênica
com marcadores autofluorescentes, Tzfira et al. (2005) demonstraram a
eficiência da técnica em estudos de localização através da expressão de
11
proteínas de A. thaliana e pepino em plantas de Nicotiana tabacum via A.
tumefaciens.
2.5 As proteínas autofluorescentes
As proteínas autofluorescentes (autofluorescent proteins - AFPs)
têm se destacado como uma das mais, ou talvez, a mais poderosa ferramenta
para a visualização de estruturas em nível celular, localização de proteínas
intra e intercelulares, monitoramento da expressão gênica, estudos de
interações protéicas in vivo e de dinâmica celular, assim como outros
experimentos de semelhante importância biológica (Tzfira et al., 2005). Além
disso, os avanços observados no campo da microscopia tornaram esta
metodologia mais acessível para estudos de muitos processos celulares (Tzfira
et al., 2005). A versatilidade e utilidade das AFPs avançaram em decorrência
do desenvolvimento de diferentes espectros de emissão e excitação,
permitindo seu uso simultâneo para a detecção de diferentes proteínas na
mesma célula sem a ocorrência da alteração das características originais
destes produtos gênicos, como localização subcelular. Redução de tempo de
análise e principalmente minimização de custos são fatores que têm tornado o
uso de AFPs especialmente atraente quando comparados aos métodos
tradicionais de estudos de localização de produtos protéicos envolvendo fusão
de proteínas.
2.5.1 A proteína verde fluorescente
A green fluorescent protein – GFP ou proteína verde fluorescente é o
produto de um gene marcador relativamente recente que está causando
12
impacto em muitos aspectos da ciência em função das grandes vantagens que
possui sobre outros genes marcadores (Albano et al., 1998). A GFP foi
descoberta no início da década de sessenta do último século (Shimomura et
al., 1962) na água-viva Aequorea victoria. A GFP é caracterizada por uma
estrutura individual composta por 238 aminoácidos. Cada monômero possui
uma forma tridimensional contendo uma α-hélice central, circundada por um
domínio semelhante a um cilindro, formado por 11 fitas, compondo as β–folhas.
O sítio ativo da proteína encontra-se ao centro da estrutura e a fluorescência
resulta da coordenação de processos de oxidação e ciclização autocatalítica,
com a formação de uma série de ligações duplas nos aminoácidos
componentes do fluoróforo. A proteína absorve luz ultravioleta ou azul,
apresentando espectro de excitação compreendido entre os comprimentos de
onda que vão de 395 a 470 nm. O pico predominante é observado a 395 nm e
a emissão da luz verde fluorescente é observada a 509 nm (Albano et al.,
1998). A detecção de proteínas ocorre através do uso de uma fonte simples de
luz UV com longo comprimento de onda. Estas são as propriedades que
permitem à GFP ser utilizada como ferramenta na expressão de proteínas
recombinantes, tanto como marcador fenotípico em células procarióticas
quanto em células eucarióticas (Albano et al., 1998, Cha et al., 2000, Chae et
al., 2000, Chalfie et al., 1994, Cheng et al., 1996, DeLisa et al., 1999). Assim, o
uso de GFP facilita a construção de marcadores citológicos para o estudo
biológico de células vivas através de uma proteína quimérica, formada pela
fusão da GFP com uma proteína de interesse (Chalfie et al., 1994, Tsien,
1998). A GFP tem vantagens sobre outras marcações fluorescentes tais como
a luciferase. Ela é uma pequena molécula de 26,9 kDa que não requer
13
quaisquer co-fatores para sua expressão e dispensa qualquer técnica de
fixação que possa causar danos às células (Jones et al., 2004). Além disso,
quantidades moderadas obtidas em plantas transformadas com esta proteína
não possuem relato de interferência significativa nas taxas de transformação,
regeneração e crescimento de organismos transformantes.
2.5.2 GFP em plantas
O uso de marcadores autofluorescentes também está se expandindo
rapidamente para muitas áreas da pesquisa em plantas (Hanson & Kohler,
2001), indo desde a localização de proteínas e interações protéicas à
marcação global de produtos gênicos integrais in planta (Tian et al., 2004). Há
dois principais empregos de GFP em plantas: monitoramento da expressão
gênica e localização de proteínas com alta resolução, mostrando ser um
marcador genético de fácil quantificação em vegetais vivos. A GFP pode ser
empregada como substituta da ß-glucoronidase, a qual é comumente usada
como repórter em fusões genéticas vegetais. Ela permite visualização direta de
fluorescência no produto gênico em células vivas sem a necessidade de
procedimentos destrutivos, como no caso de colorações histoquímicas. Além
disso, a expressão da GFP pode ser facilmente quantificada pelo uso de luz
UV, caso níveis razoáveis de intensidade de fluorescência possam ser obtidos
das plantas transformadas (Haseloff & Amos, 1995).
O uso da GFP como marcador permite a fácil localização subcelular
de fusões de proteínas in vivo, facilitando em muito os estudos em biologia
celular (Escobar et al., 2003). Fusões de fragmentos genômicos ou de cDNAs
às extremidades 5’ ou 3’ do gene codificante da GFP permitiram o
14
desenvolvimento de métodos de análise em larga escala em biologia celular
voltados para a localização de produtos de expressão ectópica em genes de
levedura e genes de mamíferos (Misawa et al., 2000). Mais recentemente, uma
estratégia de captura de proteínas, na qual o gene gfp é conduzido por um
éxon artificial móvel, através de um elemento de transposição, foi utilizado para
localizar proteínas integrais interrompidas, expressadas a partir de seus loci
endógenos em Drosophila (Morin et al., 2001). Em plantas, fragmentos de
cDNAs randômicos, fusionados à extremidade 3’ do gene gfp foram
transformados em massa em A. thaliana através de A. tumefaciens para
localizar produtos gênicos vegetais (Cutler et al., 2000). Em muitos casos, a
localização apresentada por uma proteína vegetal tem uma relação direta com
a sua função, determinando seu papel dentro do processo celular.
Considerando este fato, diversos métodos de pesquisa vêm sendo empregados
para a elucidação da função dos genes de plantas através da localização dos
seus respectivos produtos protéicos nos diversos compartimentos subcelulares.
Estes métodos têm mostrado efetividade em cloroplastos e membrana
plasmática devido ao fato destes poderem ser facilmente fracionados. O uso de
fusões com GFP para localizações in vivo oferece a perspectiva de uma
resolução subcelular muito mais precisa, podendo ser especialmente útil para
produtos gênicos localizados em compartimentos que não podem ser
facilmente fracionados. Estes benefícios tornam válida essa estratégia, mesmo
que as proteínas de fusão expressadas não apresentem viabilidade como as
formas nativas (Escobar et al., 2003).
15
2.6 Transformação genética de plantas
A transformação genética de plantas ocorre pela introdução de
DNA em células vegetais. Os métodos mais comuns utilizam a bactéria A.
tumefaciens ou biobalística, que consiste na intensa propagação de
microprojéteis de tungstênio recobertos por DNA (Birch, 1997; Hansen &
Wright, 1999). Outros métodos como eletroporação, microinjeção e o uso de
vetores virais também têm sido explorados. A fim de permitir a seleção das
células transformadas com sucesso, o DNA de interesse é normalmente
inserido na adjacência de um gene marcador de seleção, como nptII, que
codifica para resistência ao antibiótico canamicina (Bent, 2000).
A transformação genética pode ser transitória ou estável, e as
células transformadas podem ou não dar surgimento a gametas que irão
transferir o material genético às gerações subseqüentes. As transformações
transitórias de protoplastos, calos celulares em cultura ou células vegetais são
simples e rápidas, podendo ser usadas em estudos da função gênica em curto
prazo (Gelvin & Schilperoort, 1998). Devido à grande capacidade de geração
de seqüências, esses ensaios em curto prazo são extremamente importantes
(Bent, 2000).
2.6.1 Transformação via A. tumefaciens
A transformação em plantas mediante A. tumefaciens é o método
mais utilizado na introdução de genes exógenos em células vegetais com
subseqüente regeneração de plantas transgênicas (Batra & Kumar, 2003). A
transformação gênica mediante A. tumefaciens em monocotiledôneas não era
possível, quando métodos eficientes e reproduzíveis foram estabelecidos para
16
muitas monocotiledôneas como arroz (Hiei et al., 1994, Cheng et al., 1998),
(Cheng et al., 1997) e milho (Ishida et al., 1996). Transformações com êxito,
também foram relatadas em várias outras espécies, como cevada (Tingay et
al., 1997), cana-de-açúcar (Arencibia et al., 1998, Enriquez-Obregon et al.,
1998), banana (May et al., 1995), Asparagus officinalis (Delbreil et al. 1993),
Agapanthus praecox (Suzuki et al., 2001). A facilidade com que as
transformações são efetuadas e a incorporação de menor número de cópias do
transgene, o que é um importante fator na sua preservação através das
gerações subseqüentes, são algumas das vantagens do método de
transformação mediante A. tumefaciens em relação aos demais métodos.
2.7 A. thaliana como planta modelo em transformações
genéticas
Embora a transformação de plantas seja rotina para muitas espécies
vegetais, ainda há uma eficiência baixa do processo em algumas espécies
importantes. Assim, estudos relacionados à determinação da função de genes
ainda apresentam limites em certas espécies e devem, quando possível, ser
conduzidos em plantas modelo. Neste sentido a escolha da planta modelo é de
fundamental importância (Aragão et al., 2002).
A habilidade na introdução de DNA em um organismo com a
conseqüente alteração do seu fenótipo é essencial tanto para a biologia
molecular básica quanto para a aplicada. A transformação é uma tarefa simples
em Escherichia coli ou Saccharomyces cerevisiae, mas ainda complexa em
eucariotos multicelulares, e pode ser particularmente desafiante em algumas
espécies vegetais de importância agrícola (Bent, 2000). A facilidade com a qual
17
Arabidopsis pode ser transformada por Agrobacterium tem facilitado a
produção de grande número de linhas transgênicas independentes. Além disso,
Arabidopsis tem células grandes, permitindo uma fácil visualização de suas
estruturas celulares ao microscópio (Cutler et al., 2000).
Procedimentos de transformação floral utilizando Agrobacterium têm
apresentado grande êxito em Arabidopsis. Tais êxitos, acompanhados das
recentes informações sobre os tecidos transformados deste gênero, devem
inspirar uma renovação de esforços em adaptar esses métodos à
transformação de outras espécies vegetais (Bent, 2000). Os benefícios são
claros: transformação sem necessidade de cultura de tecidos pode
proporcionar um método de alta capacidade de análise requerendo mínimos
esforços, custos e habilidade para ser executado. Além disso, são minimizados
os riscos de variação somaclonal, decorrentes da eliminação desta etapa. E o
fator mais importante é representado pelos protocolos de transformação
simplificados, que facilitam os procedimentos intensivos deste processo,
reduzindo o esforço requerido pelos testes de uma determinada construção de
transformação de DNA em plantas (Bent, 2000).
2.7.1 Transformação floral
A ocorrência de modificações no DNA é um fenômeno indesejado
que acompanha a transformação de células vegetais. O evento está
relacionado com o estresse imposto pelos atuais procedimentos de
transformação empregados, todos dependentes da diferenciação vegetal
resultante da cultura celular in vitro (Labra et al., 2004). Larkin & Scowcroft
(1981) definiram variação somaclonal como “o resultado de alterações
18
genéticas e epigenéticas que ocorrem na progênie clonal de um único clone
vegetal parental e que são herdados de forma estável pela progênie clonal e
sexual”. O método mediado por Agrobacterium baseado na infiltração da flor in
planta é singular no que se refere ao fato de não requerer cultura celular in vitro
(Bechtold et al., 1993), além disso, não exige a posterior eliminação das células
bacterianas do sistema de transformação. Isto leva à captura direta do DNA
plasmidial bacteriano pelas células-ovo (ou suas células progenitoras) e à
integração do DNA exógeno ao DNA nuclear das sementes transgênicas
recuperadas (Clough & Bent, 1998; Desfeux et al., 2000).
Os resultados observados não apresentam alterações genômicas
estatisticamente relevantes em plantas transgênicas obtidas por este método,
quando comparados com plantas controle não transformadas. Entretanto,
alterações genômicas foram observadas em plantas de A. thaliana derivadas
de calos. Dessa forma, os resultados verificados em plantas de A. thaliana
sugerem que a variação somaclonal está relacionada com o estresse imposto
pela cultura celular in vitro, e não pela integração do DNA exógeno (Labra et
al., 2004). Assim, através de um ponto de vista prático, a escolha do protocolo
de transformação é relevante para a estabilidade do genoma. O método de
transformação floral demonstra evitar ou reduzir as alterações do DNA a níveis
não detectáveis. Não há razão para que esse método não possa ser estendido
a outras plantas, incluindo àquelas de relevância agronômica (Labra et al.,
2004).
19
2.8 Visualização de estruturas celulares através de GFP
Muito do atual conhecimento que possuímos da estrutura celular
deriva do uso de métodos que criam imagens estáticas ou de uma estrutura
obscura de células individuais, tais como a análise de amostras de tecidos
fixados ou constituintes celulares fracionados. Modelos mais representativos de
informação que permitam a dinâmica e estrutura celular ser analisadas em
seus estados nativos podem ser obtidos a partir da observação de células
vivas. A expressão de marcadores aleatórios de localização em células vivas
pode permitir a pesquisa de proteínas com base em propriedades dinâmicas
pré-definidas, tais como a redistribuição destes marcadores em resposta a
sinais como ferimentos, infecções ou hormônios vegetais (Cutler et al., 2000).
A localização de proteínas como ferramenta em genômica funcional
representa um importante avanço. Assim, em função do uso limitado de
análises computacionais em estudos de localização, a proteômica requererá
avanços adicionais na predição de localização de proteínas em células
vegetais. Para facilitar isso, muito mais evidências experimentais são
necessárias para a verdadeira localização de produtos gênicos em
compartimentos celulares, baseadas na sua expressão por fusão com a GFP
ou detecção imunológica usando anticorpos (Tanaka et al., 2004).
Uma chave para a compreensão dos mecanismos que regem o
desenvolvimento de um organismo é a detecção das dinâmicas alterações da
expressão gênica em seus diferentes territórios. O esclarecimento da função de
um gene também requer o conhecimento da localização subcelular de seu
produto protéico. Embora anticorpos específicos que reconhecem uma proteína
20
proporcionem uma grande quantidade de informações, sua confecção requer
informações moleculares sobre o gene, além disso, somente podem ser
empregados em tecidos fixados. Expressão ectópica de versões marcadas da
proteína, em particular fusões com marcações autofluorescentes como a GFP
(Chalfie et al., 1994) e suas variantes espectrais, permite um estudo dinâmico
do comportamento do produto da fusão em células e tecidos vivos, não fixados
(Morin et al., 2001).
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
As sementes de A. thaliana (ecótipo Columbia) foram
gentilmente cedidas pela Profª. Carla Andréa Delatorre, do Laboratório de
Biologia Molecular do Departamento Plantas de Lavoura - UFRGS. Essas
sementes foram submetidas à quebra de dormência por estratificação, por 4
dias no escuro a 4 C, em substrato composto por solo e vermiculita expandida
de granulometria fina, na proporção 1:1. A semeadura foi realizada em alvéolos
de bandejas de isopor flutuantes em água destilada. Após esse período, as
bandejas contendo as sementes foram transferidas para câmaras de
crescimento climatizadas a 24 C com luminosidade constante (24h/dia), onde
permaneceram até o período de florescimento, o qual ocorreu entre 30 e 50
dias desde o início da germinação.
3.2 Transformação de A. thaliana
Plantas de A. thaliana em estádios iniciais de florescimento (30%
a 40% do total de inflorescências abertas) foram aspergidas com o inóculo
contendo células transformadas de A. tumefaciens. Como dispositivo de
aspersão foi empregado um pulverizador plástico de 500 mL contendo 100 mL
de suspensão bacteriana (Figura 1). Esta suspensão foi aplicada a uma
distância de 30 cm das plantas, sendo distribuída uniformemente sobre a
22
superfície das flores. As bandejas contendo as plantas aspergidas foram
incubadas por 20 horas em câmaras plásticas internamente borrifadas com
água destilada. Em seguida, as plantas foram removidas das câmaras plásticas
e mantidas em câmaras de crescimento climatizadas a 24 C com
luminosidade constante (24h/dia). Após 10 dias, o processo de inoculação foi
repetido nas mesmas plantas, sendo essas mantidas nas mesmas condições
citadas anteriormente. Após o período de incubação em câmaras plásticas, as
plantas foram acondicionadas em câmaras de crescimento até a coleta total de
sementes maduras. Os mesmos procedimentos foram empregados em um lote
de plantas de A. thaliana transformadas somente com o vetor de fusão, sem a
inserção dos cDNAs (vetor vazio). Um lote de plantas de A. thaliana não
submetidas a quaisquer eventos de transformação foi mantido em câmara de
crescimento nas mesmas condições descritas para plantas transformadas.
FIGURA 1 – Transformação floral de plantas de A. thaliana por aspersão de
inóculo contendo A. tumefaciens recombinantes em suspensão.
Porto Alegre, RS, UFRGS, LFM, 2005.
3.3 Análises fenotípicas
3.3.1 Seleção de plantas transformadas de A. thaliana
Após a coleta, as sementes maduras provenientes das plantas de A.
thaliana foram submetidas à quebra de dormência através de estratificação, por
23
4 dias a 4 C, isentas de luminosidade, em substrato composto por solo e
vermiculita expandida de granulometria fina, na proporção de 1:1. A semeadura
foi realizada em alvéolos de bandejas de isopor flutuantes em água destilada
na presença de 7,5 mg/L do herbicida glufosinato de amônio (Finale). As
bandejas contendo as sementes foram transferidas para câmaras climatizadas
a 24 C com luminosidade constante (24h/dia) (Figura 2). As plantas foram
avaliadas quanto à tolerância ao herbicida 10 dias após a emergência.
FIGURA 2 – Seleção de sementes T1 oriundas de plantas de A. thaliana,
transformadas por A. tumefaciens recombinantes, em meio
contendo herbicida glufosinato de amônio. Porto Alegre, RS,
UFRGS, LFM, 2005.
3.3.2 Microscopia de epifluorescência
Fragmentos foliares de plantas de A. thaliana foram analisados
através de visualização por microscopia convencional de epifluorescência para
identificar estruturas celulares expressando níveis detectáveis de GFP. Plantas
com aproximadamente 20 dias desde a germinação, apresentando 50% do
tamanho final da roseta, tiveram um fragmento com tamanho aproximado de 5
mm² da região central da folha destacados para a avaliação por microscopia.
Foi utilizado um microscópio de fluorescência modelo BX 41 TF (Olympus),
equipado com sistema óptico UIS (sistema de infinito universal) e iluminação do
24
tipo Koehler. Foi preparada ao menos uma lâmina a partir de cada planta
sobrevivente à seleção pelo herbicida. O fragmento removido de folhas jovens
foi posicionado com a adição de uma gota de água destilada entre a lâmina e a
lamínula de vidro sob leve pressão, e visualizado em sua face adaxial, com
aumento de 100 a 1000 vezes. A visualização com aumento de 1000 vezes foi
realizada com imersão da objetiva em óleo apropriado. As imagens das
amostras foram registradas através de uma câmera fotográfica digital Nikon
COOLPIX 4500 (4.0 mega pixels 4 x zoom).
3.4 Biblioteca de cDNAs
No presente trabalho, foi utilizado o método de fusão de proteínas
visando à determinação da localização de produtos gênicos de cDNAs em
estruturas subcelulares de A. thaliana. Através da localização das proteínas
codificadas por estas seqüências gênicas é possível a obtenção de
informações relevantes para o esclarecimento da sua função. Foram utilizados
clones de cDNAs obtidos a partir de uma biblioteca subtrativa supressiva de
arroz (Lamb et al., 2005) cedida por Caren R. C. Lamb e Johannes H. Falcade,
do Laboratório de Fitopatologia Molecular – LFM do Departamento de
Fitossanidade - UFRGS. Estes cDNAs são resultantes de um estudo de
expressão gênica de resistência de amplo espectro de um determinado cultivar
desta espécie à infecção por M. grisea. Os fragmentos diferenciais foram
isolados através da subtração de cDNAs induzidos após a inoculação de duas
linhas quase isogênicas (NILs), ambas submetidas ao isolado LFM 193.1.1 de
M. grisea: cDNAS induzidos em C101A51 que possui o gene de resistência Pi-
1 (interação incompatível) menos os cDNAs induzidos no cultivar recorrente
25
suscetível CO39 (interação compatível). Para a análise da expressão
diferencial, as plantas de arroz foram inoculadas com conídios de M. grisea e a
doença foi avaliada após 15 dias desde a inoculação. A partir do mRNA
extraído das plantas correspondentes à NIL C101A51, foi gerada a biblioteca
de cDNAs de fita dupla, contendo os genes induzidos na resposta de
resistência, conferida pelo gene Pi-1.
3.5 Digestão dos cDNAs
Os cDNAs da biblioteca foram digeridos com a enzima de restrição
Rsa I, que reconhece a seqüência específica de quatro nucleotídeos 5´ GT↓AC
3´ e fez o polimento dos fragmentos gerando extremidades cegas. A reação foi
composta por 2,5 µg de cDNA, tampão REact® 1 10x (Invitrogen) concentração
final 1x (50mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl
2
), 5 U da enzima Rsa I
(Invitrogen), 3,5 µL de H
2
O ultrapura, no volume final de 10 µL. O tempo de
incubação da reação foi de 2 horas a 37 C. A inativação da atividade da
enzima Rsa I foi feita pela elevação da temperatura (desnaturação) a 65 C por
20 minutos. O tamanho dos fragmentos e a concentração de cDNAs foram
estimados pela análise do perfil eletroforético visualizado em gel de agarose
1% (TBE 1x) com o auxílio dos marcadores de massa molecular λ Hind III
(Promega) e 1kb DNA Ladder (Invitrogen). O gel foi visualizado sob luz
ultravioleta e fotografado através do sistema de fotodocumentação
computadorizado EDAS 120 (Kodak Sciences 2d).
26
3.6 Digestão e desfosforilação do vetor pEGAD
O vetor de fusão EGFP::cDNA (Cormack et al., 1996) utilizado na
clonagem dos cDNAs foi construído a partir do plasmídeo binário pEGAD
(Genbank acesso No. AF218816), o qual possui tamanho de 12.594 pb (Cutler
et al., 2000). O vetor pEGAD contém o gene que confere resistência ao
antibiótico canamicina, para seleção de bactérias A. tumefaciens
transformadas, e o gene que confere tolerância ao herbicida glufosinato de
amônio (Finale), para seleção de plantas transformadas. Este vetor apresenta
um sítio de clonagem para a enzima de restrição Sma I, localizado na
extremidade 3’ do gene codificante da GFP (Figura 3). Pela ausência de códon
de terminação de transcrição à jusante gene codificante da GFP, a seqüência
de interesse a ele fusionada encontra-se sob a orientação do promotor CaMV
35S, de expressão constitutiva, localizado à montante da fusão cDNA::EGFP.
Entretanto a seqüência polipeptídica sinalizadora existente na seqüência de
interesse é o fator determinante da localização da expressão do produto
protéico da construção gênica. O resultado é a diferenciação da localização da
expressão do peptídeo resultante desta fusão. O vetor foi digerido com a
enzima de restrição Sma I, que reconhece a seqüência específica de seis
nucleotídeos 5´ CCC↓GGG 3´, resultando em uma molécula de DNA linear de
extremidades cegas, compatíveis com as extremidades dos cDNAs, após sua
digestão. A reação foi composta por 15 µg de DNA, 20mM Tris-HCl pH 7,4, 5
mM MgCl
2
, 50 mM KCl, 30 U da enzima Sma I (Gibco BRL®) e 9,0 µL de H
2
O
ultrapura, em um volume final de 15 µL. O tempo de incubação da reação foi de
1 hora a 30 C. Imediatamente após a reação de digestão, o vetor foi
desfosforilado pela adição de 0,03 U da enzima fosfatase alcalina (Promega) e
27
5’ CaMV 35S EGFP Sma I CaMV 35S Gene de resistência
ao herbicida 3’
5 mM Tris-HCl pH 9,3, 0,1 mM MgCl
2
, 0,01 mM ZnCl
2
e 0,1 mM espermidina),
em um volume final de 25 µL. A reação foi incubada por 15 minutos a 37°C,
seguida de 15 minutos a 56°C, processos que foram repetidos após nova
adição de 0,03 U da enzima fosfatase alcalina. O produto foi purificado pela
adição de 10% do volume da reação de acetato de amônio 7,5 M (2,5 µL) e
250% do volume da reação (após adição de acetato de amônio 7,5 M) de
etanol 100% (68,7 µL). O material foi homogeneizado e precipitado a –20°C por
1 hora, seguido de centrifugação a 16.000 x g por 20 minutos a 4 °C. A fase
superior foi descartada e o precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 70%,
sendo centrifugado a 16.000 x g por 5 minutos a 4 °C e ressuspenso em 20 µL
de H
2
O ultrapura. O tamanho dos fragmentos e a concentração do vetor foram
estimados pela análise do perfil eletroforético visualizado em gel de agarose
1% (TBE 1x), com o auxílio dos marcadores de massa molecular λ Hind III
(Promega) e 1kb DNA Ladder (Invitrogen). O gel foi visualizado sob luz
ultravioleta e fotografado através do sistema de fotodocumentação
computadorizado EDAS 120 (Kodak Sciences 2d).
FIGURA 3 – Representação esquemática de seqüências do vetor pEGAD
(adaptado de Cutler & Ehrhardt: http://deepgreen.stanford.edu).
Porto Alegre, RS, UFRGS, LFM, 2004.
28
3.7 Reação de ligação dos cDNAs ao vetor pEGAD
Os cDNAs digeridos foram ligados ao vetor de fusão pEGAD,
digerido e desfosforilado, na razão molar inserto:vetor de 3:1. A reação de
ligação foi composta por 6,5 ng de DNA do inserto (cDNAs), 77 ng de DNA do
vetor de fusão (pEGAD), 1 U de T4 DNA ligase (Invitrogen), 50 mM de Tris-HCl
pH 7,6, 10 mM MgCl
2
, 1,0 mM ATP, 1,0 mM DTT, 25% (v/v) polietilenoglicol
8000, e 4,2 µL de H
2
O ultrapura. O volume final da reação de ligação foi de 15
µL e a mesma foi incubada durante 20 horas a 14°C. O produto da reação de
ligação foi purificado pela adição de 10% do volume da reação de acetato de
amônio 7,5 M (1,5 µL) e 250% do volume da reação (adicionada do acetato de
amônio 7,5 M) de etanol 100% (41,2 µL). O material foi homogeneizado e
precipitado a –20 °C por 1 hora, seguido de centrifugação a 16.000 x g por 20
minutos a 4 °C. A fase superior foi descartada e o precipitado foi lavado com 1
mL de etanol 70%, sendo centrifugado a 16.000 x g por 5 minutos a 4 °C e
ressuspenso em H
2
O ultrapura, no volume final de 3 µL.
3.8 Transformação genética de A. tumefaciens
O produto da reação de ligação entre os fragmentos de cDNAs e o
vetor foi utilizado para transformação de células de A. tumefaciens. Foram
utilizadas células da linhagem desarmada LBA 4404, possuidoras em seu
cromossomo único, do gene que confere resistência ao antibiótico rifampicina,
que permite a seleção de bactérias transformadas. Estas células foram
gentilmente fornecidas por Norma Paniego, do Instituto Nacional de Tecnologia
Agropecuária (INTA) de Castelar, Argentina, e no presente trabalho, foram
tornadas eletrocompetentes conforme descrito no manual de instruções do
29
eletroporador Micro Pulser
TM
(Bio-Rad). Três microlitros (aproximadamente 100
ng) do produto da reação de ligação foram adicionados a 20 L de células
eletrocompetentes. Essas células foram transformadas geneticamente por
choque elétrico (eletroporação) de acordo com as instruções do fabricante do
eletroporador (Micro Pulser
TM
, Bio-Rad). Em seguida, as células foram
ressuspensas em 1 mL de meio de cultura líquido Luria-Bertani - LB (1%
triptona, 0,5% extrato de levedura, 1% NaCl - pH 7,5, esterilizado por
autoclavagem). As células foram então incubadas por 3 horas a 28 °C com
agitação de 250 rpm. Após, o meio contendo as células bacterianas foi
centrifugado a 3.000 x g por 5 minutos e ressuspensas em 200 L. A seleção
das colônias recombinantes (colônias positivas) foi realizada através da
distribuição das bactérias em placas de Petri contendo meio seletivo. As
células foram distribuídas em placas de Petri contendo meio de cultura sólido
LB (adicionado de ágar 1,6% p/v) com os antibióticos rifampicina (100 g/mL) e
canamicina (100 g/mL). As placas foram incubadas em estufa a 28 °C por 48
horas até o momento da visualização das colônias bacterianas recombinantes.
3.9 Identificação de colônias de A. tumefaciens contendo
plasmídeos recombinantes
A avaliação da transformação bacteriana foi realizada através da
análise do padrão da massa molecular do fragmento do vetor amplificado
através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Foi realizada PCR de
amostras coletadas de 100 colônias (20%) do total das colônias individuais
crescidas em placa de Petri visando a identificação de células de A.
tumefaciens possuidoras dos plasmídeos recombinantes. Foram utilizados os
30
oligonucleotídeos iniciadores A5A For (5’ - CTC GGC ATG GAC GAG CTG –
3’) e EGAD Rev (5’ - TCC TCG AGA TCA GTT ATC TAG – 3’), baseados nas
seqüências de nucleotídeos do vetor pEGAD, flanqueadoras dos cDNAs
inseridos (Figura 4). A PCR foi composta por 0,15 mM de cada dNTP (dATP,
dTTP, dCTP, dGTP) (Invitrogen), 1 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 20
mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl, 3,75 mM MgCl
2
, 0,5 µM de cada
oligonucleotídeo iniciador e 0,1 L de cada colônia bacteriana amostrada,
totalizando um volume final de 20 µL. A PCR foi realizada em um termociclador
PTC - 100 (MJ Research, Inc.), sob os seguintes parâmetros: desnaturação
inicial a 94 °C por 10 minutos; 30 ciclos constituídos de desnaturação a 94 °C
por 1 minuto, anelamento a 50 °C por 1 minuto, extensão a 72 °C por 1 minuto,
seguido de uma extensão final a 72 °C por 10 minutos. O produto da reação foi
analisado através do perfil eletroforético obtido em gel de agarose 3% contendo
tampão TBE 1x, com o auxílio do marcador de massa molecular 100 bp DNA
Ladder (Gibco BRL), seguido da exposição em solução contendo brometo de
etídio (0,5 g/mL). O gel foi visualizado sob luz UV e fotografado através do
sistema de fotodocumentação computadorizado EDAS 120 (Kodak Sciences
2d).
FIGURA 4 – Representação esquemática da região de anelamento dos
oligonocluteotídeos iniciadores ao vetor pEGAD para a
amplificação do inserto (adaptado de Cutler & Ehrhardt:
http://deepgreen.stanford.edu). Porto Alegre, RS, UFRGS,
LFM, 2004.
31
3.10 Preparo das culturas de A. tumefaciens para
transformação de plantas
Visando o estabelecimento de uma estratégia para utilização em
larga escala que suprimisse a etapa de seleção de colônias transformadas por
vetor recombinante através de PCR, um pré-inóculo foi preparado a partir da
coleta total das colônias bacterianas crescidas em placa de Petri. As bactérias
foram multiplicadas em meio de cultura líquido LB, adicionado dos antibióticos
seletivos rifampicina (100 g/mL) e canamicina (100 g/mL) e incubadas a 28
C, 150 rpm por 12 horas. Foi utilizada a proporção de uma colônia bacteriana
recombinante para cada 1 mL de meio, no volume final de 500 mL. O inóculo
foi composto por 1 mL de pré-inóculo para cada 49 mL de meio de cultura
líquido LB adicionado dos antibióticos seletivos citados, no volume final de 250
mL, incubado a 28 C, 150 rpm por 12 horas. A concentração bacteriana da
suspensão foi estimada por leitura em espectrofotômetro (Smart Spec
TM
Bio-
Rad) (~2,0 = OD
600
). A suspensão bacteriana foi transferida para tubos Falcon
e centrifugada a 3000 x g por 20 minutos a 4 °C. O precipitado foi ressuspenso
em uma solução de sacarose a 5%, surfactante Silwet® L-77 Ag a 0,05%, no
volume final de 100 mL de água destilada e autoclavada.
A concentração
bacteriana do inóculo foi estimada por leitura em espectrofotômetro (Smart
Spec
TM
Bio-Rad) (~2,0 = OD
600
).
3.11 Análises moleculares
As plantas de A. thaliana foram submetidas a análises moleculares
a partir de 100 mg de tecido vegetal que foi extraído e triturado na presença de
N
2
líquido em um tubo de microcentrífuga (1,5 mL). Em seguida, foram
32
adicionados 750 L de tampão de extração CTAB (CTAB, 55 mM; Tris, 100 mM
pH 8,0; EDTA, 10 mM; NaCl, 0,7 M) e 15 L de 2-mercaptoetanol. A mistura foi
homogeneizada vigorosamente por 2 minutos, incubada a 65ºC durante 15
minutos e posteriormente, acrescentados 520 L de clorofórmio:álcool
isoamílico (24:1 v:v). A mistura foi novamente homogeneizada vigorosamente
por 1 minuto e centrifugada por 10 minutos a 18.400 x g em temperatura
ambiente. A fase líquida sobrenadante foi transferida para um novo tubo, à qual
foi adicionado igual volume de isopropanol (500 L) e 50% do volume de
acetato de amônio 7,5 M (250 L). Em seguida, foi centrifugada por 10 minutos
a 18.400 x g em temperatura ambiente. A fase sobrenadante foi desprezada e
o precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 70% por duas vezes, centrifugado
por 5 minutos a 18.400 x g, seco a 65 C e solubilizado em 100 L de H
2
O
ultrapura. A quantidade e qualidade do DNA foram estimadas em
espectrofotômetro (Smart Spec
TM
Bio-Rad) (OD
260
) e o material extraído foi
armazenado a –20 ºC. Todas as extrações foram realizadas em duplicata.
A verificação da transformação genética das plantas de A. thaliana
foi realizada através da amplificação da seqüência inserida no vetor através de
PCR, da mesma forma anteriormente descrita para a identificação de células
de A. tumefaciens. O tamanho dos fragmentos foi estimado pela análise do
perfil eletroforético visualizado em gel de agarose 2% (TBE 1x) com o auxílio
do marcador de massa molecular 1kb DNA Ladder (Invitrogen). O gel foi
visualizado sob luz ultravioleta e fotografado através do sistema de
fotodocumentação computadorizado EDAS 120 (Kodak Sciences 2d).
33
3.11.1 Reação de seqüenciamento
O seqüenciamento foi realizado no Laboratório de Biologia
Genômica e Molecular da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do
Sul), PUC/RS, através do sistema “DYEnamic ET Dye Terminator Cycle
Sequencing kit for MegaBACE DNA Analysis Systems” no seqüenciador
automático MegaBACE (Amersham Biosciences), utilizando 100 ng do produto
de PCR e 2,5 mM do oligonucleotídeo iniciador EGAD antisenso (5’- TCC TCG
AGA TCA GTT ATC TAG -3’), seguindo as instruções do fornecedor.
3.11.2 Análise de similaridade das seqüências
Os eletroferogramas obtidos do seqüenciamento foram analisados
através do programa Chromas Lite (Technelysium pty Ltd.). Após, foi realizada
a comparação das seqüências obtidas com as seqüências de nucleotídeos
(BLASTN) depositadas no GenBank - National Center of Biology Information
(NCBI, Bethesda, MD, USA), através do programa BLAST
[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (Altschul et al., 1997)].
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Construção do vetor de fusão e transformação de A.
tumefaciens
Os cDNAs de arroz foram digeridos com a enzima de restrição Rsa I,
gerando extremidades cegas e permitindo sua inserção no vetor de fusão
pEGAD (Genbank acesso No. AF 218846). Após a reação de digestão, foram
obtidos fragmentos apresentando tamanho estimado entre 300 e 900 pb
(Figura 5) que foram inseridos no vetor de fusão pEGAD. As fusões
cDNA::EGFP foram introduzidas em células eletrocompetentes de A.
tumefaciens por eletroporação. Foram selecionadas aproximadamente 500
colônias de A. tumefaciens resistentes, após 48 horas de crescimento. Entre
estas, foram identificadas quatro colônias recombinantes apresentando
fragmentos de tamanhos aproximados a 600, 650, 700 e 800 pb (Figura 6). As
demais colônias crescidas apresentaram um fragmento de 117 pb referente à
amplificação da seqüência do vetor pEGAD sem inserto (vetor vazio), conforme
estudo relatado por Cutler et al. (2000). Desse modo foi estimada a quantidade
de 20 colônias possuindo o vetor recombinante em relação ao total de colônias
bacterianas obtidas. O índice de 4% de colônias bacterianas transformadas
com o vetor recombinante, possivelmente está associado à ocorrência de uma
etapa incompleta durante o preparo do vetor para a clonagem dos cDNAs. A
grande quantidade de colônias amostradas apresentando 117 pb, quando
35
comparada ao número de colônias apresentando vetor recombinante, sugere
que a transformação destas células tenha ocorrido somente com o vetor vazio,
como resultado da pouca eficiência da etapa de digestão deste plasmídeo. Isto
explica a ocorrência da grande quantidade de colônias resistentes ao meio
seletivo, porém sem a inserção dos cDNAs. As bactérias crescidas em placas
foram aspergidas sobre as plantas de A. thaliana através de uma suspensão
composta por sacarose, adicionada do surfactante Silwet® L-77. Foram
testadas diferentes concentrações do surfactante, assim como diferentes
intervalos entre a primeira e segunda aspersão. Observou-se que
concentrações do surfactante superiores a 0,05% resultaram em um aumento
significativo de regiões necrose das plantas, a partir das bordas foliares,
levando ao aumento de indivíduos mortos no prazo de sete dias. Os resultados
mais eficientes foram obtidos com a utilização do surfactante na concentração
máxima de 0,05% associada ao intervalo de dez dias entre as duas aspersões.
Dessa forma, foi observada menor quantidade de indivíduos mortos, menores
regiões de necrose nas plantas sobreviventes e maior quantidade de sementes
provenientes dessas plantas.
Clough & Bent (1998) relataram que um inóculo composto por A.
tumefaciens apresentando a concentração de 0,15 a 1,75 (OD
600
) não altera a
taxa de eficiência da transformação. No estudo realizado por Cutler et al.,
(2000), no qual uma biblioteca de cDNAs foi introduzida em A. thaliana através
de A. tumefaciens, a densidade óptica do inóculo foi de aproximadamente 0,5
(OD
600
). Entretanto, no estudo de Martínez-Trujillo et al. (2004), foi
demonstrado que 2,0 (OD
600
) elevou a eficiência da transformação em mais
que o dobro que aquela produzida com 0,8 (OD
600
). Esta elevação no índice de
36
transformação possivelmente está relacionada com a existência de maior
quantidade de células bacterianas viáveis sobre a superfície das plantas,
apresentando a capacidade de transferir as seqüências de interesse para o
interior das células vegetais. Visando a obtenção de maior eficiência no índice
de transformação floral em relação ao estudo relatado por Clough & Bent
(1998), a leitura da densidade óptica da cultura bacteriana do inóculo aplicado
em plantas de A. thaliana foi de aproximadamente 2,0 (OD
600
).
FIGURA 5 – Produto da digestão da biblioteca de cDNAs de O. sativa por
Rsa I. Gel de agarose 2% demonstrando padrão dos
fragmentos separados por eletroforese. 1 - cDNAS; M -
marcador de peso molecular. Porto Alegre, RS, UFRGS, LFM,
2004.
1 M
2.036 pb
1.018 pb
506, 517 pb
298 pb
201 pb
37
FIGURA 6 – Eletroforese em gel de agarose 3% de produto de PCR
utilizando oligonucleotídeos iniciadores A5A (FOR) e EGAD
(REV), demonstrando padrão dos fragmentos de cDNAs
inseridos em pEGAD, a partir de colônias de A. tumefaciens
transformadas. (a) 1 e 7 – amplificação de fragmento de
cDNA inserido no vetor; 2 a 5 – vetor vazio; 6 – controle
negativo; M – marcador de peso molecular. (b) 8 e 12 –
amplificação de fragmento de cDNA inserido no vetor; 9, 10,
11 e 13 – vetor vazio; M – marcador de peso molecular.
Porto Alegre, RS, UFRGS, LFM, 2005.
4.2 Transformação floral de A. thaliana
De modo a serem minimizadas as alterações indesejáveis do DNA
observadas em processos de transformação de células vegetais, decorrentes
da utilização de protocolos convencionais (Labra et al., 2004), neste trabalho foi
utilizado o método de transformação floral, no qual os óvulos representam o
alvo da transformação via A. tumefaciens (Desfeux et al., 2000). Foram
utilizadas 550 plantas de A. thaliana para a transformação genética. As plantas
foram conduzidas sob condições controladas desde a germinação até estádios
iniciais de florescimento, a partir do qual foram submetidas a dois diferentes
tipos de tratamento. Foi conduzido também, um lote de 20 plantas controle de
A. thaliana, que foram mantidas sob as mesmas condições descritas para as
plantas transformadas, porém não foram submetidas a quaisquer eventos de
transformação. Essas plantas foram mantidas como padrão comparativo nos
experimentos de localização de GFP e análises moleculares.
1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 M
b)
a)
300 pb
600 pb
2000 pb
1500 pb
600 pb
100 pb
300 pb
100 pb
38
Um estudo realizado por Clough & Bent (1998), demonstrou que no
estádio de desenvolvimento caracterizado pela existência de brotos
secundários apresentando dimensões de 2 a 10 cm (poucas flores abertas), a
planta encontra-se mais suscetível à transformação. Assim, as plantas de A.
thaliana em estádios iniciais de florescimento, distribuídas em dois lotes
distintos (50 e 500 plantas), foram submetidas à transformação em duas etapas
de aspersão, no intervalo de dez dias. Cinqüenta plantas receberam o inóculo
composto por A. tumefaciens contendo o vetor pEGAD vazio (sem a inserção
dos cDNAs), através do mesmo método utilizado nas plantas transformadas
com o vetor recombinante. As demais 500 plantas receberam o inóculo obtido a
partir de 500 colônias de A. tumefaciens recombinantes crescidas em placa de
Petri. Essas colônias foram obtidas por transformação dos clones de cDNAs,
provenientes da biblioteca subtrativa supressiva de arroz, anteriormente citada,
fusionados ao vetor pEGAD. Ambos os lotes foram acondicionados em
câmaras de crescimento até a coleta de aproximadamente 35.000 sementes
maduras, provenientes de plantas transformadas com o vetor vazio e 25.500
sementes maduras, provenientes de plantas transformadas com os cDNAs
fusionados ao vetor.
4.3 Análises fenotípicas
4.3.1 Seleção das plantas apresentando tolerância ao
herbicida
As sementes das plantas transformadas foram submetidas à
germinação em lotes distintos nas condições citadas anteriormente, com a
adição de agente seletivo composto por glufosinato de amônio. A partir das
39
35.000 sementes maduras, provenientes de plantas transformadas com o vetor
vazio, foi observado o desenvolvimento de aproximadamente 800 plantas de A.
thaliana (2,28% das sementes) apresentando tolerância ao meio seletivo.
A partir das 25.500 sementes maduras, provenientes de plantas
transformadas com os cDNAs fusionados ao vetor, foram obtidas 750 plantas
T1 (2,94% das sementes) apresentando tolerância ao meio seletivo. Estes
resultados são similares ao índice de transformação relatado por Cutler et al.
(2000), no qual 0,5 a 4% das plantas T1 eram transgênicas.
4.3.2 Seleção das plantas apresentando expressão de EGFP
Foi realizada a visualização por microscopia de fluorescência das
plantas de A. thaliana transformadas. O material foliar coletado a partir de
folhas destacadas foi analisado quanto à expressão de EGFP sob luz UV e
comparado ao material extraído de plantas controle, representado por plantas
não transformadas (Figura 7). O tecido foi extraído de folhas jovens e
visualizado na sua face adaxial sob luz UV. As imagens de microscopia obtidas
de fragmentos foliares retirados após duas horas das plantas apresentaram
perda de brilho do sinal fluorescente, ocasionando maior dificuldade na
definição da localização da GFP em nível subcelular. Este fato, possivelmente,
é decorrente da oxidação do fluoróforo e conseqüente degradação da proteína.
De modo a serem evitadas interpretações errôneas dos resultados, amostras
removidas após quatro horas foram desconsideradas em função da acentuada
perda de qualidade das imagens. As imagens válidas foram registradas e
armazenadas por método digital.
40
FIGURA 7 – Imagem de células de tecido foliar de planta controle de A.
thaliana não transformada, visualizada por microscopia de
fluorescência. O padrão de cor vermelha corresponde ao
reflexo da cor verde da clorofila visualizada à luz
ultravioleta. Aumento de 1000 vezes. Barra representa 20
m. Porto Alegre, RS, UFRGS, LFM, 2005.
4.3.3 Plantas T1 transformadas com o vetor vazio
De um total de 800 plantas apresentando tolerância ao
herbicida, correspondendo à geração T1 de plantas transformadas com o vetor
vazio, 16 (2%) apresentaram níveis detectáveis de expressão de EGFP quando
comparado às plantas controle de A. thaliana. As imagens apresentaram um
padrão de distribuição generalizado do sinal fluorescente nos diversos
compartimentos subcelulares, conforme o esperado para plantas
transformadas com o vetor vazio (Figura 8 a,b).
41
FIGURA 8 – Imagens feitas através de microscopia de fluorescência de
células de tecido foliar de plantas geração T1 de A. thaliana
transformadas com vetor vazio exibindo expressão de EGFP
distribuída de forma generalizada através das células. a -
visualização da expressão de GFP sob ajuste normal da
objetiva; b - visualização da expressão de GFP sob ajuste fino
da objetiva. Aumento de 1000 vezes. Barras representam 20
m. Porto Alegre, RS, UFRGS, LFM, 2005.
4.3.4 Plantas T2 oriundas de plantas transformadas com o
vetor vazio
As plantas T1 transformadas com o vetor vazio foram
autofecundadas, gerando sementes que foram conduzidas até a geração T2.
As plantas T2 foram avaliadas quanto à estabilidade da transformação. A partir
de 500 sementes coletadas de 16 plantas da geração T1, foram obtidas 267
(53,4% das sementes) plantas T2 apresentando tolerância ao herbicida, das
quais 168 (62,92%) apresentaram níveis detectáveis de expressão de EGFP.
As imagens apresentaram um padrão de distribuição generalizado do sinal
fluorescente nos diversos compartimentos subcelulares, conforme esperado de
plantas transformadas com vetor vazio (Figura 9). Através da tolerância ao
herbicida, observado pela exposição ao meio seletivo e da presença da
fluorescência, visualizada por microscopia, foi confirmada a estabilidade da
transformação na progênie, esperada para a geração de plantas T2. Assim, as
características observadas na geração T2 atestam a integridade das
a)
b)
42
seqüências inseridas na geração T0, herdadas de forma estável nas gerações
subseqüentes até a segunda geração transformada.
FIGURA 9 – Imagens feitas através de microscopia de fluorescência de
células de tecido foliar de plantas geração T2 de A. thaliana
transformadas com vetor vazio exibindo expressão de EGFP
distribuída de forma generalizada através das células. a -
visualização da expressão de GFP sob ajuste normal da
objetiva; b - visualização da expressão de GFP sob ajuste fino
da objetiva. Aumento de 1000 vezes. Barras representam 20
m. Porto Alegre, RS, UFRGS, LFM, 2005.
4.3.5 Plantas transformadas com os cDNAs fusionados ao
vetor
De um total de 750 plantas apresentando tolerância ao herbicida,
correspondendo à geração T1 de plantas transformadas com os cDNAs
fusionados ao vetor, 18 (2,40%), apresentaram níveis detectáveis de expressão
de GFP (Tabela 1). Estes resultados foram um pouco superiores ao índice de
fluorescência relatado por Cutler et al. (2000), onde 0,1 a 1% das plantas
apresentou níveis detectáveis de expressão de EGFP quando comparado às
plantas controle de A. thaliana.
b)
a)
43
TABELA 1 – Eficiência de transformação e expressão de GFP. Porto Alegre,
RS, UFRGS, LFM, 2005.
Sementes obtidas
de plantas
transformadas
Plantas tolerantes
ao herbicida
Plantas tolerantes
expressando GFP
Geração T1
transformada
com pEGAD
vazio
35.000
800 (2,28 % das
sementes)
16 (2 % das
plantas
tolerantes)
Geração T2
transformada
com pEGAD
vazio
500
267 (53,4 % das
sementes)
168 (62,92 % das
plantas
tolerantes)
Geração T1
transformada
com pEGAD
recombinante
25.500
750 (2,94 % das
sementes)
18 (2,4 % das
plantas
tolerantes)
Foi observada uma discrepância entre o número de plantas
tolerantes ao herbicida e plantas apresentando níveis detectáveis de expressão
de GFP. Esta diferença se manteve constante tanto em plantas T1 e T2
transformadas com o vetor vazio quanto em plantas transformadas com o vetor
recombinante. Este fato pode estar associado a danos na seqüência
codificante da GFP ocorridos durante os processos de preparação do DNA e
transformação de bactérias e plantas. Além disso, somente as plantas
apresentando tolerância ao herbicida foram submetidas à detecção do sinal
fluorescente, o que pode justificar o constante maior número de plantas
tolerantes em relação ao número de fluorescentes. Assim como as sementes
não germinadas, não foram contabilizadas as plantas germinadas e mortas
antes de apresentar dimensões mínimas que permitissem retiradas de tecido
para visualização por microscopia. Considerando que a GFP apresenta certo
grau de toxicidade, plantas não tolerantes ao herbicida contendo elevada
44
quantidade desta proteína podem ter morrido antes de ser analisadas e
contabilizadas. De outra forma, plantas tolerantes contendo níveis baixos e não
detectáveis de GFP não foram consideradas fluorescentes. Podendo assim, ter
elevado o índice observado de diferença entre tolerantes e fluorescentes.
No presente trabalho foram introduzidos cDNAs de arroz
diferencialmente expressos em resposta a M. grisea. Os cDNAs foram
inseridos no vetor pEGAD, na extremidade 3’ de uma variante do gene EGFP.
Através deste método foi esperada a tradução de aproximadamente uma em
cada seis fusões GFP::cDNA na pauta correta de leitura e com a possibilidade
de alterar a localização inespecífica do sinal fluorescente. Este fato é
decorrente de três possibilidades diferentes de inserção para cada uma das
duas orientações possíveis de cada fragmento, em função das extremidades
cegas geradas nos clones de cDNAs e vetor. No estudo realizado por Cutler et
al. (2000), uma biblioteca de cDNAs de A. thaliana foi introduzida em plantas
da mesma espécie. O índice de eficiência esperado para o endereçamento da
proteína foi de um em três, uma vez que os cortes feitos nos fragmentos
geraram extremidades coesivas, permitindo a sua inserção orientada. No
presente trabalho foi observada a distribuição generalizada de GFP em 17
plantas transformadas por A. tumefaciens com vetor fusionado aos cDNAs. Foi
observada uma planta apresentando expressão diferenciada do sinal
fluorescente em relação às demais fluorescentes, representando o índice de
eficiência de fusão de 0,13% das plantas transformadas apresentando uma
distribuição subcelular localizada da fusão de proteínas, caracterizada pela
expressão de GFP. O grande número de plantas apresentando distribuição
generalizada, comparado ao número de plantas apresentando distribuição
45
localizada de GFP, possivelmente está relacionado ao maior número de
inserções de cDNAs fora da pauta de leitura esperada. Este fato é decorrente
da clonagem não orientada do fragmento em função das enzimas de restrição
utilizadas tanto no vetor, quanto nos cDNAs. As enzimas utilizadas geraram
fragmentos passíveis de formação de concatâmeros, o que pode ter
aumentado o número de insertos incapazes de orientar o endereçamento
correto do peptídeo fusionado ao gene EGFP. Além disso, a enzima Rsa I,
utilizada na digestão dos cDNAS, é considerada de corte freqüente pelo fato de
reconhecer uma seqüência de quatro nucleotídeos. Esta propriedade pode
resultar na geração de grande quantidade de fragmentos sem uma seqüência
mínima funcionalmente capaz de endereçar corretamente o peptídeo ao
compartimento subcelular esperado, conforme descrito no estudo realizado por
Cutler et al. (2000). Considerando que o endereçamento correto do peptídeo
está condicionado tanto à integridade quanto a uma quantidade mínima de
aminoácidos que permitam sua funcionalidade, os endereçamentos
inespecíficos observados podem ser resultado do pouco conteúdo informativo
existente nos cDNAs, em função de seus reduzidos tamanhos. Estas restrições
podem ser futuramente minimizadas pela utilização de enzimas de restrição de
corte coesivo e de menor freqüência.
No estudo realizado por Oard & Enright (2006), foi observada a
atividade antimicrobiana de peptídeos codificados por genes que foram
introduzidos em A.thaliana. A fusão com EGFP demonstrou a acumulação da
proteína β-Purotionina em tricomas da planta pelo redirecionamento do sinal
fluorescente. A proteína quimérica deteve o desenvolvimento de um fungo
patogênico na superfície foliar e estômatos, demonstrando atividade
46
semelhante à observada in vitro. No presente trabalho, as estruturas da planta
que apresentaram maior acúmulo de fluorescência foram células-guarda
estomáticas e tricomas (Figura 10 a - h). Foi observado menor índice de
fluorescência na região de contato entre as demais células quando comparado
às imagens obtidas de células de plantas transformadas com o vetor vazio Este
fenótipo pode ser decorrente do direcionamento de EGFP a determinadas
localizações pela fusão de seu gene codificante ao produto protéico dos cDNAs
de arroz. As seqüências dos cDNAs utilizados no presente estudo não eram
conhecidas. Entretanto, a planta que apresentou expressão diferenciada de
EGFP pode ter tido o endereçamento do sinal fluorescente orientado pelo
domínio localizado na extremidade N-terminal do peptídeo quimérico, o que era
esperado, resultando em uma maior expressão de EGFP em células-guarda
estomáticas e nos tricomas, como anteriormente citado. As imagens relatadas
neste trabalho foram realizadas através de microscopia de epifluorescência
convencional. Entretanto, grande quantidade de estudos realizados visando
localização de proteínas de fusão têm utilizado microscopia confocal.
Considerando os estudos anteriormente citados, podemos inferir que a
utilização de microscópio confocal de fluorescência neste trabalho poderia ter
permitido a observação de imagens subcelulares com maior profundidade e
resolução.
47
FIGURA 10 – Imagens de células de tecido foliar de planta de A. thaliana,
geração T1, transformadas com vetor contendo fusões
EGFP::cDNAs. a – d - expressão de GFP apresentando
maior concentração em estômatos; e – h - expressão de
GFP apresentando maior concentração em tricomas. a – g -
aumento de 1000 vezes, h - aumento de 100 vezes. Barras
representam 20 m. Porto Alegre, RS, UFRGS, LFM, 2005.
c)
f)
g)
h)
b)
d
)
a)
e)
48
4.4 Análises moleculares
4.4.1 Extração de DNA e PCR
Das 750 plantas da geração T1 de A. thaliana transformadas por A.
tumefaciens contendo os cDNAs fusionados ao vetor pEGAD, 18 foram
submetidas a análises moleculares a partir da extração de DNA.
A verificação da transformação das plantas foi realizada através da
amplificação da seqüência inserida no vetor pEGAD, através de PCR com o
uso dos oligonucleotídeos iniciadores A5A For e EGAD Rev, da mesma forma
descrita anteriormente para a identificação de células de A. tumefaciens
recombinantes. Das 18 plantas apresentando tolerância ao herbicida e
expressão de GFP, foram observadas duas apresentando inserções de
tamanhos estimados em 750 e 800 bp (Figura 11). A amostra que apresentou o
fragmento de 750 pb corresponde à planta que apresentou expressão
diferenciada do sinal fluorescente nos estômatos e nos tricomas. A localização
diferenciada do sinal fluorescente observada sugere que o cDNA, fusionado ao
gene repórter, tenha sido conduzido às localizações subcelulares observadas,
redirecionando a localização da expressão da GFP. A amostra que apresentou
fragmento de 800 pb corresponde a uma planta que apresentou expressão
generalizada do sinal fluorescente. Apesar de a fusão gênica entre o cDNA e
GFP ter sido comprovada por eletroforese, não foi observado o
redirecionamento da localização da proteína fluorescente, quando comparado
às imagens obtidas de expressões do vetor vazio. Este resultado pode estar
associado à ausência de conteúdo informativo no cDNA que permitisse o
endereçamento da fusão cDNA::GFP ao compartimento subcelular adequado.
As demais amostras apresentaram fragmentos de tamanhos estimados em 117
49
pb, constituindo plantas transformadas com vetores não recombinantes.
Considerando que os oligonucleotídeos iniciadores utilizados na PCR
amplificaram 117 pb do vetor pEGAD, as amostras apresentando fragmentos
correspondem efetivamente a 633 e 683bp. Este padrão é tido como esperado,
uma vez que os fragmentos observados após a digestão da biblioteca de
cDNAs apresentaram tamanhos estimados entre 300 e 900 pb, conforme
anteriormente citado.
FIGURA 11 – Eletroforese em gel de agarose 2% de produto de PCR,
utilizando oligonucleotídeos iniciadores A5A (FOR) e EGAD
(REV), a partir de extração de DNA de planta T1 de A. thaliana
transformada por A. tumefaciens. M – marcador de peso
molecular; 1 – controle negativo; 2 e 4 – amplificação de
cDNAs inseridos no vetor; 3 – vetor vazio. Porto Alegre, RS,
UFRGS, LFM, 2006.
4.4.2 Seqüenciamento dos cDNAS fusionados
Foi realizado o seqüenciamento a partir de 100 ng do produto de
PCR referente às amostras que apresentaram o cDNA inserido no vetor
pEGAD. As seqüências obtidas foram comparadas às seqüências depositadas
no Genbank através do programa BLASTN. No presente trabalho, a seqüência
M 1 2 3 4
1.018 pb
506, 517 pb
298 pb
201 pb
154 pb
50
obtida através do clone referente ao fragmento de 683 pb apresentou
similaridade pouco significativa à seqüência codificante da proteína encontrada
no organismo Drosophila melanogaster, com escore de 42.1 e valor de E de
0,78. A mesma não apresentou similaridade significativa à seqüência de arroz
ou de outro organismo quando analisada por este algorítmo. Considerando
esses valores, podemos inferir que este fragmento não corresponde
efetivamente à seqüência de Drosophila. Possivelmente tenha resultado da
inserção do cDNA fora da estrutura leitura esperada, onde o peptídeo gerado
mostrou similaridade aleatória e não significativa à seqüência depositada no
banco de dados. Entretanto, a seqüência referente ao fragmento de 633 pb,
que corresponde à planta que apresentou expressão localizada de GFP,
mostrou similaridade significativa à seqüência do cromossomo 12 de arroz,
com escore de 202 e valor de E de 2e
-48
, quando submetida ao BLASTN. Este
clone também apresentou uma seqüência de 280 pb apresentando similaridade
de 92%, escore 202, valor de E de 2e
-48
à seqüência que codifica uma proteína
quinase (GenBank Acesso No. DP 000011). Estas proteínas, juntamente com
cálcio citosólico, respondem pelas duas principais rotas de transdução de
sinais encontradas em células vegetais, constituindo uma rede de alta
complexidade. Consideradas elementos primários na transdução de sinais, as
quinases são enzimas responsáveis pela percepção de estímulos
extracelulares através de receptores localizados na membrana plasmática e
parede celular. Freqüentemente alteram a atividade das proteínas-alvo pela
fosforilação da região C-terminal, que se encontra do lado de dentro da célula,
de proteínas receptoras transmembrana. As quinases possuem sua atividade
contrabalançada pela ação de proteínas fosfatase específicas, que removem o
51
fosfato de outras proteínas. Uma molécula protéica de quinase pode fosforilar
várias centenas de proteínas alvo, e, portanto, amplificar em muito sinais
fracos. A ativação de uma quinase está implicada em resposta a estresses
abióticos, reguladores de crescimento, limitação de nutrientes e ataque de
patógenos. Estudos sobre resistência de plantas à patógenos demonstram que
fluxos de íons são pré-requisitos para a ativação de proteínas quinase de
ativação mitótica específica (MAPK) e a geração de oxigênio reativo, que por
sua vez, é responsável pela ativação de numerosos genes envolvidos na
defesa da planta a patógenos. Uma quinase, identificada por He et al. (1999),
mostrou envolvimento com a transdução de sinais na interação entre M. grisea
e arroz, sugerindo um papel crucial desta classe de proteínas com relação à
resistência. Considerando o fato de que a seqüência identificada através deste
trabalho foi obtida a partir de cDNAs de arroz diferencialmente expressos
quando submetidos ao fungo M. grisea, pode ser importante a futura avaliação
do papel deste gene na defesa da planta a este patógeno.
5. CONCLUSÃO
Através da observação dos resultados obtidos no presente trabalho,
conclui-se que:
O vetor pEGAD é capaz de direcionar a acumulação de EGFP e
EGFP::cDNAs de arroz em estruturas celulares de plantas de A. thaliana
transformadas via A. tumefaciens.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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